CN102924585A - 神经胚素变体 - Google Patents

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Abstract

公开了在选定的氨基酸残基具有取代的变体神经胚素多肽。在一或多个选定的氨基酸残基的取代减少变体神经胚素多肽的肝素结合并增加其血清暴露。还公开了利用变体神经胚素多肽治疗疾病以及活化哺乳动物中的RET受体的方法。

Description

神经胚素变体
本申请是中国申请200580035922.5的分案申请，该母案于2005年8月18日以国际申请号PCT/US2005/029637提交，于2007年4月19日进入中国国家阶段，本分案采用了与该母案一致的发明名称。
相关申请的交叉参考
本申请要求2004年8月19日提交的临时申请60/602,825以及2005年6月24日提交的临时申请60/694,067的优先权。这些优先权文本的全部内容包含在本文作为参考。
技术领域
本发明涉及蛋白质化学，分子生物学和神经生物学。
背景技术
神经胚素也已知为Artemin和Enovin,其为24-kDa同源二聚体分泌型蛋白，促进外周和中央神经系统神经元诸如多巴胺能神经元的存活(Baudet etal.,2000,Development,127:4335;Rosenblad et al.,2000,Mol.Cell Neurosci.,15(2):199;GenBank AF120274)。编码神经胚素的基因已经被克隆并测序(Roseblad et al.,2000,Mol.Cell Neurosci.,15(2):199;Baloh et al.,Neuron,21:1291)。
神经胚素是胶质细胞来源的神经细胞营养因子(GDNF)配体家族成员。在细胞水平，GDNF成员活化受体酪氨酸激酶RET。RET结合共同受体GDNF家族受体alpha(GFRalpha)，其为糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接型膜蛋白，提供对RET的配体特异性。已知四种GFRalpha(GFRalpha1-4)。神经胚素结合GFRalpha3，与RET一起形成三元信号复合体(Baudet et al.2000,Development,127:4335;Baloh et al.,1998,Neuron,21:1291),其主要定位于痛觉感觉神经元上(Orozco et al.,2001,Eur.J.Neurosci.,13(11):2177)。这些神经元检测痛觉和损伤。因此，神经胚素在临床上可用于神经病的一般治疗并更具体地用于治疗神经病性疼痛。
神经胚素和其它GDNF家族成员是转化型生长因子beta(TGF beta)超家族成员，并由此其特征在于存在7个具有相似间隔的保守的半胱氨酸残基，其形成半胱氨酸结的结构(Saarma,1999,Microsc.Res.Tech.,45:292)。每个单体含有这样的两个二硫键，其形成封闭的环结构，包绕第三个二硫键以形成紧实的结状结构。每个单体中所含的第七个半胱氨酸形成分子间二硫键，其共价连接所述单体形成最终的二聚体产物(Rattenholl et al 2000,J.Mol.Biol.,305:523)。
TGF beta家族成员作为前原蛋白合成，所述蛋白在切割信号肽和原结构域以后最终作为成熟同源二聚体分泌(见例如Rattenholl,et al.,2000,J.Mol.Biol.,305:523;Fairlie et al.,2001,J.Biol.Chem.,276(20):16911)。信号肽和原结构域介导TGF beta家族成员的正确分泌(Rattenholl et al.,2000,J.Mol.Biol.,305:523;Rattenholl et al.,2001,Eur.J.Biochem.,268:3296)。
发明内容
本发明至少部分基于以下发现：神经胚素结合硫酸肝素以及神经胚素多肽中的特定氨基酸残基对该结合事件有贡献。发现所选氨基酸残基的取代减少变体神经胚素多肽与肝素的结合并增加该变体的生物活性和生物利用度。
一方面，本发明的特征在于这样的多肽，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少80％同一性的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1包含至少一处氨基酸取代，所述氨基酸选自下组:氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置48的相应位置的精氨酸(例如，精氨酸被非保守氨基酸残基诸如谷氨酸取代);氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置49的相应位置的精氨酸(例如，精氨酸被非保守氨基酸残基诸如谷氨酸取代);和氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置51的相应位置的精氨酸(例如，精氨酸被非保守氨基酸残基诸如谷氨酸取代)。所述多肽在二聚化时结合含有GFRalpha3和RET的复合体。
一些实施方案中，所述氨基酸序列含有这样的氨基酸，其不同于位于与SEQ ID NO:1的位置48和49相对应位置的精氨酸。例如，SEQ ID NO:1的位置48的精氨酸和位置49的精氨酸可被非保守氨基酸(例如谷氨酸)取代。
一些实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少90％，至少95％或至少98％的同一性。
还公开了含有SEQ ID NO:2的氨基酸15-113,SEQ ID NO:3的氨基酸15-113,SEQ ID NO:4的氨基酸15-113,SEQ ID NO:5的氨基酸15-113,SEQID NO:8的氨基酸15-113,或SEQ ID NO:9的氨基酸15-113的多肽。一些实施方案中,所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸10-113,SEQ ID NO:3的氨基酸10-113,SEQ ID NO:4的氨基酸10-113,SEQ ID NO:5的氨基酸10-113,SEQ ID NO:8的氨基酸10-113,或SEQ ID NO:9的氨基酸10-113。一些实施方案中,所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列,SEQ ID NO:3的氨基酸序列,SEQ ID NO:4的氨基酸序列,SEQ ID NO:5的氨基酸序列,SEQ IDNO:8的氨基酸序列,或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
还公开了包含与SEQ ID NO:1的氨基酸15-113具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1包含至少一处氨基酸取代，所述氨基酸选自下组:(i)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置20的相应位置的丝氨酸(例如，丝氨酸被非保守氨基酸残基取代);(ii)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置21的相应位置的谷氨酰胺(例如，谷氨酰胺被非保守氨基酸残基取代);(iii)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置32的相应位置的组氨酸(例如，组氨酸被非保守氨基酸残基取代)；(iv)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置33的相应位置的精氨酸(例如精氨酸被非保守氨基酸残基取代);(v)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置39的相应位置的精氨酸(例如精氨酸被非保守氨基酸残基取代);(vi)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置46的相应位置的丝氨酸(例如丝氨酸被非保守氨基酸残基取代);(vii)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置68的相应位置的精氨酸(例如精氨酸被非保守氨基酸残基取代);(viii)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置72的相应位置的甘氨酸(例如甘氨酸被非保守氨基酸残基取代);(ix)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置73的相应位置的丝氨酸(例如丝氨酸被非保守氨基酸残基取代);和(x)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置94的相应位置的缬氨酸(例如缬氨酸被非保守氨基酸残基取代)。所述多肽在二聚化时结合含有GFRalpha3和RET的复合体。一些实施方案中,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少90％，至少95％或至少98％同一性。
还公开了包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1包含至少一处氨基酸取代，所述氨基酸选自下组:(i)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置7的相应位置的精氨酸(例如精氨酸被非保守氨基酸残基诸如谷氨酸取代);(ii)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置9的相应位置的精氨酸(例如精氨酸被非保守氨基酸残基诸如谷氨酸取代);和(iii)氨基酸，其不同于位于SEQID NO:1的位置14的相应位置的精氨酸(例如精氨酸被非保守氨基酸残基诸如谷氨酸取代)。所述多肽在二聚化时结合含有GFRalpha3和RET的复合体。一些实施方案中,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％，至少95％或至少98％的同一性。
本发明还涉及包含偶联物，其包含偶联于非天然存在的聚合物的本发明所述多肽。示例性聚合物是水溶性合成聚合物诸如聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)。
本发明还涉及融合蛋白，其包含本发明所述的多肽以及异源氨基酸序列。
本发明还涉及二聚体，其包含本文所述的多肽、偶联物或融合蛋白的两种。
本发明还涉及药物组合物，其包含本发明所述的多肽，二聚体，偶联物或融合蛋白，并包含可药用的载体或赋形剂。
还公开了包含编码本文所述多肽的序列的核酸，包含所述核酸的表达载体，以及含有所述表达载体的细胞。
还公开了制备多肽的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供细胞，其包含含有编码本文所述多肽的核酸的表达载体，和(ii)在允许所述核酸表达的条件下培养所述细胞。
本发明还涉及治疗或预防哺乳动物中的神经系统疾病的方法，其通过给药哺乳动物治疗有效量的本发明所述多肽、二聚体、偶联物、融合蛋白或药物组合物来进行。
本发明还涉及治疗哺乳动物中的神经病性疼痛的方法，其通过给药哺乳动物治疗有效量的本发明所述多肽、二聚体、偶联物、融合蛋白或药物组合物来进行。
本发明还涉及活化哺乳动物中的RET受体的方法，其通过给药哺乳动物有效量的本发明所述多肽、二聚体、偶联物、融合蛋白或药物组合物来进行。
本发明所选变体神经胚素的优点在于它们与野生型神经胚素相比肝素结合能力降低。降低的肝素结合导致变体多肽的体内清除率降低。
出人意料的发现具有在氨基酸位置48和49的取代的变体神经胚素多肽与单个氨基酸突变体和/或野生型神经胚素相比具有大大降低的肝素结合能力以及大大增加的效力和生物利用度。例如，发现双突变体与野生型神经胚素相比显示血清暴露增加大约185倍。此外，发现该双突变体与野生型神经胚素相比显示体外表达增加超过5倍，由此促进蛋白的大规模制备。
变体神经胚素多肽的优势以及出人意料的性质允许利用低剂量的蛋白治疗受试者和/或允许给药之间的间隔时间延长(与利用野生型蛋白的治疗相比)。
更具体地，本发明涉及：
1.包含与SEQ ID NO:1的氨基酸15-113具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1包含至少一处氨基酸取代，所述氨基酸选自下组:
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置48的相应位置的精氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置49的相应位置的精氨酸;和
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置51的相应位置的精氨酸,
其中所述多肽在二聚化时结合含有GFRalpha3和RET的复合体。
2.项1的多肽，其中所述氨基酸序列包括这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置48的相应位置的精氨酸。
3.项2的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ ID NO:1的位置48的精氨酸残基。
4.项2的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置48的精氨酸残基。
5.项1的多肽，其中所述氨基酸序列包括这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置49的相应位置的精氨酸。
6.项5的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ ID NO:1的位置49的精氨酸残基。
7.项5的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置49的精氨酸残基。
8.项1的多肽，其中所述氨基酸序列包括这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置51的相应位置的精氨酸。
9.项8的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ ID NO:1的位置51的精氨酸残基。
10.项8的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置51的精氨酸残基。
11.项1的多肽，其中所述氨基酸序列包含这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置48和位置49的相应位置的精氨酸。
12.项11的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ ID NO:1的位置48的精氨酸残基以及位置49的精氨酸残基。
13.项11的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置48的精氨酸残基以及位置49的精氨酸残基的每一个。
14.项1-13之一的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少90％的同一性。
15.项1-13之一的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少95％的同一性。
16.项1-13之一的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少98％的同一性。
17.多肽，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸15-113,SEQ ID NO:3的氨基酸15-113,SEQ ID NO:4的氨基酸15-113,SEQ ID NO:5的氨基酸15-113,SEQ ID NO:8的氨基酸15-113,或SEQ ID NO:9的氨基酸15-113。
18.项17的多肽，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸10-113,SEQ ID NO:3的氨基酸10-113,SEQ ID NO:4的氨基酸10-113,SEQ ID NO:5的氨基酸10-113,SEQ ID NO:8的氨基酸10-113,或SEQ ID NO:9的氨基酸10-113。
19.项17的多肽，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列,SEQ ID NO:3的氨基酸序列,SEQ ID NO:4的氨基酸序列,SEQ ID NO:5的氨基酸序列,SEQ ID NO:8的氨基酸序列,或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
20.二聚体，其包含项1－19中任一项的两个多肽。
21.偶联物，其包含偶联于非天然存在聚合物的项1－19之一的多肽。
22.融合蛋白，其包含项1－19之一的多肽以及异源氨基酸序列。
23.药物组合物，其包含项1－19之一的多肽，项20的二聚体，项21的偶联物，或项22的融合蛋白，并包含可药用的载体或赋形剂。
24.核酸，其包含编码项1－19之一的多肽的序列。
25.表达载体，其包含项24的核酸。
26.细胞，其包含项25的表达载体。
27.制备多肽的方法，所述方法包括：
提供项26的细胞，和
在允许所述核酸表达的条件下培养所述细胞。
28.治疗或预防哺乳动物中的神经系统疾病的方法，所述方法包括给药哺乳动物治疗有效量的项23的药物组合物。
29.治疗哺乳动物中的神经病性疼痛的方法，所述方法包括给药哺乳动物治疗有效量的项23的药物组合物。
30.活化哺乳动物中的RET受体的方法，所述方法包括给药哺乳动物有效量的项1－19之一的多肽，项20的二聚体，项21的偶联物，项22的融合蛋白，或项23的药物组合物。
31.多肽，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸15-113具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1包含至少一处氨基酸取代，所述氨基酸选自下组:
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置20的相应位置的丝氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置21的相应位置的谷氨酰胺;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置32的相应位置的组氨酸；
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置33的相应位置的精氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置39的相应位置的精氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置46的相应位置的丝氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置68的相应位置的精氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置72的相应位置的甘氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置73的相应位置的丝氨酸;和
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置94的相应位置的缬氨酸,
其中所述多肽在二聚化时结合含有GFRalpha3和RET的复合体。
32.项31的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少90％的同一性。
33.项31的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少95％的同一性。
34.项31的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少98％的同一性。
35.多肽，包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1包含至少一处氨基酸取代，所述氨基酸选自下组:
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置7的相应位置的精氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置9的相应位置的精氨酸;和
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置14的相应位置的精氨酸,
其中所述多肽在二聚化时结合含有GFRalpha3和RET的复合体。
36.项35的多肽，其中所述氨基酸序列包含这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置7的相应位置的精氨酸。
37.项36的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ ID NO:1的位置7的精氨酸残基。
38.项36的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置7的精氨酸残基。
39.项35的多肽，其中所述氨基酸序列包含这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置9的相应位置的精氨酸。
40.项39的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ ID NO:1的位置9的精氨酸残基。
41.项39的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置9的精氨酸残基。
42.项35的多肽，其中所述氨基酸序列包含这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置14的相应位置的精氨酸。
43.项42的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ ID NO:1的位置14的精氨酸残基。
44.项42的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置14的精氨酸残基。
45.项35－44之一的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性。
46.项35－44之一的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性。
47.项35－44之一的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少98％的同一性。
48.二聚体，其包含项31－47中任一项的两个多肽。
49.偶联物，其包含偶联于非天然存在聚合物的项31－47之一的多肽。
50.融合蛋白，其包含项31-47之一的多肽以及异源氨基酸序列。
51.药物组合物，其包含项31－47之一的多肽，项48的二聚体，项49的偶联物，或项50的融合蛋白，并包含可药用的载体或赋形剂。
52.核酸，其包含编码项31－47之一的多肽的序列。
53.表达载体，其包含项52的核酸。
54.细胞，其包含项53的表达载体。
55.制备多肽的方法，所述方法包括：
提供项54的细胞，和
在允许核酸表达的条件下培养所述细胞。
56.治疗或预防哺乳动物中的神经系统疾病的方法，所述方法包括给药哺乳动物治疗有效量的项51的药物组合物。
57.治疗哺乳动物中的神经病性疼痛的方法，所述方法包括给药哺乳动物治疗有效量的项51的药物组合物。
58.活化哺乳动物中的RET受体的方法，所述方法包括给药哺乳动物有效量的项31－47之一的多肽，项48的二聚体，项49的偶联物，项50的融合蛋白，或项51的药物组合物。除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解一样。但类似或等同于本文所述方法和材料的那些可用于本发明的实践和检测，示例性方法和材料在下文描述。所有公开出版物，专利公开，专利和本文所述的其他参考文献的全文包含在此作为参考。如有冲突，以本申请，包括定义为准。所述材料，方法和实例仅仅为了举例说明，并非意图限制。
本发明的其他特征和优点从下面的详细描述以及权利要求明显可见。
附图简述
图1是野生型人(SEQ ID NO:10),小鼠(SEQ ID NO:11),和大鼠(SEQID NO:12)前原神经胚素多肽的比对。左侧和右侧上方的线分别表示成熟113氨基酸和104氨基酸形式的起点。RRXR肝素结合基序带有框。
图2A图示了野生型神经胚素(峰D)和三种单Arg-到-Glu取代突变体(峰A，B和C)的阳离子洗脱图谱(斜线表示从柱洗脱的给定体积的理论氯化钠浓度)。数据表示洗脱样品的OD280值。
图2B图示了野生型神经胚素(峰H)和三种单Arg-到-Glu取代突变体(峰E，F和G)的肝素琼脂糖洗脱图谱(斜线表示从柱洗脱的给定体积的理论氯化钠浓度)。数据表示洗脱样品的OD280值。
图3A-3B图示野生型神经胚素在存在(2A)或缺失(2B)肝素的条件下进行阴离子层析后的SDS/PAGE。
图4图示神经胚素CHO细胞结合实验的结果。SDS/PAGE和光密度分析(desitometry)之后,利用神经胚素野生型和Arg48E突变体的带的OD值相对于每种样品中的肝素浓度的作图。
图5图示利用野生型人NBN113,野生型人NBN104,Arg48E,Arg49E,Arg51E,和Arg48,49E进行肝素结合ELISA的结果。
图6图示野生型大鼠NBN113,Arg51E,Arg48E,Arg49E,和大鼠NBN113的KIRA分析的结果。
图7A图示野生型人神经胚素和Arg48,49E突变体人神经胚素(113氨基酸形式)的KIRA分析结果。
图7B图示野生型人神经胚素,Arg48,49E突变体人神经胚素(104氨基酸形式),Arg48,51E人神经胚素(113氨基酸形式),和Arg49,51E人神经胚素(113氨基酸形式)的KIRA分析结果。
图8图示野生型人神经胚素,Arg48E,Arg49E,Arg51E,Arg48,49E,和Arg48,49,51E神经胚素形式的三元复合体分析结果。
图9图示野生型神经胚素,Arg48E,Arg49E,Arg51E,Arg48,49E,和Arg48,49,51E神经胚素形式的三元复合体分析结果。
图10图示单次药团8mg/kg皮下注射后(神经胚素血浆浓度利用神经胚素检测ELISA测定)，野生型神经胚素和Arg48,49E的药物动力学分析的结果。
图11图示单次药团1mg/kg静脉内注射后(神经胚素血浆浓度利用神经胚素检测ELISA测定)，野生型神经胚素和Arg48,49E的药物动力学分析的结果。
图12图示单次药团7mg/kg皮下注射后(所示数据外推到1mg/kg)，2X10K PEG化的Arg48,49E神经胚素的药物动力学分析的结果，以及以1mg/kg静脉内给药(神经胚素血浆浓度利用神经胚素检测ELISA测定)2X10KPEG化的Arg48,49E神经胚素的药物动力学分析的结果。
图13图示用编码野生型神经胚素或Arg48,49E的质粒转染的CHO细胞中相对神经胚素表达水平。
图14图示用前导(leading)Arg48，49E双突变体转染的CHO细胞系以及前导野生型神经胚素转染的CHO细胞系中的相对神经胚素表达水平。
发明内容
本发明提供在选定的氨基酸残基具有取代的变体神经胚素多肽。如实施例中所述，发现野生型神经胚素多肽中的具体残基对于肝素结合而言是重要的。由于据信肝素结合对于神经胚素的体内清除率有贡献，预期在一或多个这些具体残基的取代降低变体多肽的肝素结合并由此增加其血清暴露。
变体神经胚素多肽
成熟野生型人神经胚素长度为113个氨基酸并其具有以下氨基酸序列:AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG(SEQ ID NO:1)。
本发明公开了在神经胚素多肽的一或多个选定的氨基酸残基具有取代的多肽。预期一或多个这些残基的突变导致变体神经胚素多肽与野生型神经胚素相比具有降低的或缺失的肝素结合能力。变体神经胚素多肽相对于SEQID NO:1包含氨基酸取代，所述取代位于(i)位置48，49和/或51中的一或多个位置的精氨酸残基，和/或(ii)Ser 46,Ser 73,Gly 72,Arg 39,Gln 21,Ser20,Arg 68,Arg 33,His 32,Val 94,Arg 7,Arg 9,或Arg 14中的一或多个。除非另有说明，本发明中关于神经胚素氨基酸残基的位置编号的任何指代指相对于SEQ ID NO:1的残基的编号。
指定为取代的神经胚素氨基酸残基(例如位置48，49和/或51的精氨酸)可被非保守氨基酸残基(例如谷氨酸)或保守氨基酸残基取代。如实施例中详细描述的，利用非保守氨基酸取代Arg48,Arg 49,和/或Arg 51产生的变体神经胚素多肽的肝素结合活性降低但神经胚素生物活性得以保持(或甚至增强)。可取代本文鉴定的氨基酸残基(例如位置48，49和/或51的精氨酸残基)的示例性氨基酸包括谷氨酸，天冬氨酸和丙氨酸。
生物活性变体神经胚素多肽在二聚化时结合包含GFRalpha3和RET的三元复合体。用于检测与该复合体的结合的方法可用于评估变体神经胚素多肽的生物活性。检测变体神经胚素多肽的三元复合体结合能力的示例性实验描述于WO00/01815和实施例7。
也可评估变体神经胚素多肽激发神经胚素信号级联的能力。例如，实施例6中所述的激酶受体活化(KIRA)实验可用于评估变体神经胚素多肽诱导RET自发磷酸化的能力(也见，Sadick et al.,1996,Anal.Biochem.,235(2):207)。
除了本文鉴定的具体氨基酸取代，变体神经胚素多肽也可在其它氨基酸位置包含一或多个添加，取代，和/或缺失，如下文具体所述。
除了具有本文所述的一或多个氨基酸取代，变体神经胚素多肽的长度还可变。尽管成熟人神经胚素多肽(SEQ ID NO:1)由前原神经胚素的羧基末端的113个氨基酸组成，不需要所有113个氨基酸实现有用的神经胚素生物活性。氨基末端截短是容许的。因此，变体神经胚素多肽可含有本文所描述的一或多个氨基酸取代，其在如下背景中：SEQ ID NO:1的羧基末端99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,或113个氨基酸(即其长度可为99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,或113个)氨基酸)。
变体神经胚素多肽除了具有本文所述的一或多处氨基酸取代(并可选具有本文所述的截短)之外，其序列还可有变化。具体地，一些氨基酸取代可被引入神经胚素序列而不会明显丧失神经胚素生物活性。在示例性实施方案中，多肽(i)含有本文所述的一或多处个氨基酸取代，且(ii)与SEQ ID NO:1具有至少70%,80%,85%,90%,95%,98%或99%同一性(或与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少70%,80%,85%,90%,95%,98%或99%同一性)。与SEQ ID NO:1的序列不同的变体神经胚素多肽(或与SEQ ID NO:1的氨基酸15-113的序列不同)可包括一或多处保守氨基酸取代，一或多处非保守氨基酸取代，和/或一或多处缺失或插入。
图1是野生型人,小鼠,和大鼠前原神经胚素多肽的比对。图1中的垂直线表示神经胚素成熟113个氨基酸形式(左侧垂直线)和104氨基酸形式(右侧垂直线)的起始。RRXR肝素结合基序加框。天然存在的生物活性形式的神经胚素多肽的比对显示可被取代而不消除生物活性的具体的示例性残基(即在人、小鼠和大鼠形式中不保守的那些)。
氨基酸序列之间的百分比同一性可利用BLAST 2.0程序测定。序列比较可利用无缺口的比对并利用默认常数进行(Blossom 62矩阵,缺口存在成本为11,每个残基缺口成本为1,以及lambda比值为0.85)。用于BLAST程序中的数学算法描述于Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Research25:3389-3402。
保守取代是用具有同一性质的一种氨基酸取代另一氨基酸。保守取代包括在下组内进行的取代：缬氨酸,丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸，缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸，半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。阳性带电(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述极性、碱性或酸性组中某一成员被相同组中其它成员的任意取代可认为是保守取代。
非保守性取代包括这样的取代，其中(i)具有带阳电侧链的残基(例如,Arg,His或Lys)取代带阴电的残基(例如,Glu或Asp)或被后者取代,(ii)亲水残基(例如,Ser或Thr)取代疏水残基(例如,Ala,Leu,Ile,Phe或Val)或被后者取代,(iii)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它残基或被后者取代或(iv)具有较大体积疏水或芳香侧链的残基(例如,Val,Ile,Phe或Trp)取代具有较小侧链(例如,Ala,Ser)或不具有侧链(例如,Gly)的残基或被后者取代。
示例性变体神经胚素多肽公开于表1。与相应野生型位置相比发生突变的变体神经胚素多肽的氨基酸残基是粗体并且加下划线的。此外，用作取代背景的神经胚素多肽(113,99,或104个氨基酸长度)显示于表1。
表1:变体神经胚素多肽
Figure BDA00002276829700151
Figure BDA00002276829700161
可选变体神经胚素多肽与聚合物(例如聚烷基醇部分诸如聚乙二醇部分)偶联。一些实施方案中,所述聚合物在神经胚素多肽N末端的位置偶联于多肽。一些实施方案中,变体神经胚素多肽相对于SEQ ID NO:1(或相对于SEQID NO:1的氨基酸15－113)而言包括至少一处氨基酸取代，其提供可偶联聚合物的内部聚合物偶联位置。一些实施方案中,所述聚合物在选自下组的位置的残基偶联于变体神经胚素多肽：位置14，位置39，位置68和位置95。提供内部聚合物偶联位置的示例性神经胚素变体描述于WO02/060929和WO04/069176(其内容包含在此作为参考)。
除包含变体神经胚素多肽以外，多肽可选包含异源氨基酸序列。本文中“异源”用于氨基酸序列时，指这样的序列，其源自对于具体的宿主细胞而言异源的来源，或如果来自相同宿主细胞，为对其原始形式进行了修饰的。示例性异源序列包括异源信号序列(例如天然大鼠白蛋白信号序列，修饰的大鼠信号序列，或人生长激素信号序列)或用于纯化变体神经胚素多肽的序列(例如组氨酸标记)。
神经胚素多肽可利用本领域已知的方法分离。天然存在的神经胚素多肽可利用标准蛋白纯化技术从细胞或组织来源分离。可选，突变的神经胚素多肽可利用标准肽合成技术通过化学方法合成。短氨基酸序列的合成是肽领域已知的。见例如,Stewart,et al.,Solid Phase Peptide Synthesis(2d ed.,1984)。
一些实施方案中,变体神经胚素多肽通过重组DNA技术制备。例如，编码变体神经胚素多肽的核酸分子可插入载体，例如表达载体，核酸可引入细胞。适宜细胞包括例如哺乳动物细胞(诸如人细胞或CHO细胞)，真菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞，以及细菌细胞。当在重组细胞中表达时，细胞优选在允许变体神经胚素多肽表达的条件下培养。如合意，变体神经胚素多肽可收获自细胞悬液。本文中“回收的”指将突变的多肽从回收过程以前其存在其中的细胞的那些组分或培养基中取出。回收过程可包括一或多个再折叠或纯化步骤。
变体神经胚素多肽可利用本领域已知的任何多种方法构建。一种所述方法是定点诱变，其中具体的核苷酸(或如合意为少量特定核苷酸)被改变以改变编码的变体神经胚素多肽中的单个氨基酸(或如果合意为少量预先确定的氨基酸残基)。许多定点诱变试剂盒是可购得的。一种所述试剂盒是ClontechLaboratories(Palo Alto,CA)出售的"Transformer Site Directed MutagenesisKit"。
药物组合物
可将变体神经胚素多肽掺入药物组合物，所述药物组合物中含有治疗有效量的多肽以及一或多种佐剂，赋形剂，载体和/或稀释剂。可接受的稀释剂，载体和赋形剂通常不对受试者的动态平衡(例如电解质平衡)产生不良影响。可接受的载体包括生物相容的，惰性的或生物可吸收的盐，缓冲剂，寡糖或聚糖，聚合物，提高粘性的药剂，防腐剂等。一种示例性载体是生理盐水(0.15M NaCl,pH7.0-7.4)。另一种示例性载体是50mM磷酸钠,100mM氯化钠。配制和给药药物组合物的技术的其它细节可见于例如REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Maack Publishing Co.,Easton,Pa.)。
包含变体神经胚素多肽的药物组合物的给药可为系统或局部的。药物组合物可配制成适于胃肠外和/或非胃肠外给药。具体的给药方式包括皮下，静脉内，肌内，腹腔内，透皮，鞘内，口服，经直肠，经颊，局部，经鼻，经眼，关节内，动脉内，经蛛网膜，经支气管，经淋巴，经阴道，以及经子宫内给药。
适于胃肠外给药的配制剂方便地含有变体神经胚素多肽的无菌含水制备物，其优选与接受者的血样等张(例如生理盐水溶液)。配制剂可为单位剂量或多剂量的形式。
示例性配制剂含有本文所述的变体神经胚素多肽以及以下缓冲组分:琥珀酸钠(例如,10mM);NaCl(例如,75mM);和L-精氨酸(例如,100mM)。
适于口服给药的配制剂可作为离散的单位存在，例如胶囊，扁囊，片剂或锭剂，每种含有预定量的变体神经胚素多肽；或水性液体或非水性液体中的悬液，诸如糖浆，酏剂，乳液或顿服药。
治疗有效量的药物组合物可以以本领域技术人员可确定的剂量方案给药需要其的受试者。例如，组合物可以以下方式给药受试者，例如以剂量0.01μg/kg-1000μg/kg受试者体重每剂系统性给药。另一实例中，剂量可为1μg/kg-30μg/kg受试者体重每剂，例如3μg/kg-10μg/kg受试者体重每剂。
为了优化治疗效力，首先将变体神经胚素多肽以不同剂量方案给药。单位剂量和方案有赖于这样的因子，其包括例如哺乳动物的种类，其免疫状态，哺乳动物的体重。通常组织中的蛋白质水平利用适宜筛选实验作为临床检验方法的一部分来监测，例如，测定给定治疗方案的效力。
变体神经胚素多肽的给药频率是本领域技术人员已知的，并且可由医师进行临床判断。通常，给药方案由临床实验确定，其可确立最佳给药参数。但是，操作者可根据受试者的年龄，健康，体重，性别和医疗状态来改变所述给药。给药频率也可在神经病的急性和慢性治疗之间改变。此外，剂量频率可根据治疗是预防性的还是治疗性的而改变。
治疗方法
变体神经胚素多肽可用于调节神经或神经元细胞的代谢，生长，分化或生存。具体地，变体神经胚素多肽可用于治疗或缓解生存动物例如人的疾病或病症，所述疾病或病症应答于于神经营养因子的活性。
本文公开的变体神经胚素多肽(以及包含其的药物组合物)可用于治疗特征在于感觉神经元或视网膜神经节细胞的损伤的疾病的方法中，包括背根神经节神经元以及以下任何组织中的神经元：膝状神经节，岩状(petrosal)和结状(nodose)神经节;第八脑神经的前庭耳蜗复合体(the vestibuloacousticcomplex of the eighth cranial nerve);三叉神经结上下颌叶的腹外侧极(theventrolateral pole of the maxillomandibular lobe of the trigeminal ganglion);和中脑三叉神经核(the mesencephalic trigeminal nucleus)。
一些实施方案中,可治疗感觉和/或自主系统神经元。具体地，痛觉和机械性刺激感受神经元可被治疗，更具体地为A-delta纤维，C-纤维和A-beta纤维神经元。此外，自主系统的交感和副交感神经元也可被治疗。
一些实施方案中,运动神经元疾病诸如肌萎缩性侧索硬化(amyotrophiclateral sclerosis)("ALS")和脊椎肌肉萎缩(spinal muscular atrophy)可被治疗。其它实施方案中,变体神经胚素多肽可用于促进外伤后的神经恢复。可选或此外，可使用具有含有与神经胚素多肽偶联的聚合物的神经引导通道(nerveguidance channel),或突变的神经胚素多肽的融合物或偶联物。所述神经引导通道公开于例如美国专利5,834,029。
一些实施方案中,变体神经胚素多肽(以及含有其的药物组合物)用于治疗眼的各种疾病，包括患有黄斑变性，色素性视网膜炎，青光眼，以及类似疾病的患者中的视网膜光受体缺失。
一些实施方案中,变体神经胚素多肽(以及含有其的药物组合物)用于治疗神经病性疼痛，用于治疗触觉异常性疼痛(tactile allodynia),用于减轻与神经病相关的痛觉敏感性丧失，用于治疗病毒感染以及病毒相关的神经病，用于治疗痛性糖尿病性神经病，以及用于治疗神经系统疾病。所述方法在以下部分中详细讨论。
1.神经病性疼痛的治疗
本发明公开的变体神经胚素多肽(以及含有其的药物组合物)可用于治疗受试者中的神经病性疼痛的方法中，所述方法包括给药受试者治疗有效量的单独的变体神经胚素多肽，或也给药该受试者有效量的麻醉诱导化合物，所述麻醉诱导化合物选自下组：类罂粟碱，类罂粟碱，局部麻醉药，抗惊厥药，抗抑郁药，皮质类固醇以及非类固醇性抗炎药(NSAIDS)。一个实施方案中，麻醉诱导药物是抗惊厥药。另一实施方案中，麻醉诱导药物是加巴喷丁(gabapentin)((1-氨甲基)醋酸环己烷)或普加巴林(pregabalin)(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。
本文公开的变体神经胚素多肽(以及含有其的药物组合物)可用于治疗与外周神经病相关的疼痛。可治疗的外周神经病包括外伤诱导的神经病，例如物理损伤或疾病状态导致的那些，脑的物理损伤，脊髓的物理损伤，与脑损伤相关的发作综合征，以及与神经变性相关的神经疾病。
本文公开的变体神经胚素多肽(以及含有其的药物组合物)可用于治疗多种外周神经病，包括:(a)外伤诱导的神经病,(b)化疗诱导的神经病,(c)毒素诱导的神经病(包括但不限于酒精中毒，维生素B6中毒，六碳化合物(hexacarbon)中度，胺碘酮,氯霉素,双硫仑,异烟肼,金,锂,甲硝唑,醚醇硝唑,呋喃妥因诱导的神经病),(d)药物诱导的神经病，包括治疗性药物诱导的神经病性疼痛(诸如抗癌药物诱导的那些，具体是选自下组的抗癌药物：紫杉醇,泰索帝(taxotere),顺铂(cisplatin),诺考达唑(nocodazole),长春新碱(vincristine),长春地辛(vindesine)和长春碱(vinblastine);以及诸如抗病毒药剂诱导的那些，具体是选自下组的抗病毒药剂：ddI,DDC,d4T,膦甲酸(foscarnet),氨苯砜(dapsone),甲硝唑,和异烟肼),(e)维生素缺乏诱导的神经病(包括但不限于维生素B12缺乏，维生素B6缺乏，以及维生素E缺乏),(f)特发性神经病,(g)糖尿病性神经病,(h)病原诱导的神经损伤,(i)炎症诱导的神经损伤,(j)神经变性,(k)遗传性神经病(包括但不限于弗里德赖希共济失调,家族性淀粉样多神经病,丹吉尔病,法布里病),(l)代谢性疾病(包括但不限于肾功能不全和甲状腺机能减退),(m)感染性和病毒性神经病(包括但不限于与麻风病，莱姆病相关的神经病性疼痛，与病毒具体是选自下组的病毒的感染相关的神经病性疼痛：疱疹病毒(例如带状疱疹病毒，其可导致疱疹后神经痛),人免疫缺陷病毒(HIV),和乳头瘤病毒),(n)自身免疫性神经病(包括但不限于格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome),慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatory de-myelinating polyneuropathy),意义未定的单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy of undeterminedsignificance)和多发性神经病),(o)三叉神经痛和陷夹综合征(包括但不限于腕管综合征(Carpel tunnel)),以及(p)其它神经病性疼痛综合征，包括外伤后神经痛，(post-traumatic neuralgia),假性肢痛,多发性硬化痛,复杂型局部疼痛综合征(complex regional pain syndromes)(包括但不限于交感反射性营养不良,灼性神经痛),肿瘤形成相关性疼痛,脉管炎/血管病性(angiopathic)神经病,和坐骨神经痛。神经病性疼痛可表现为异常性疼痛,痛觉过敏,自发性疼痛或幻痛。
2.触觉异常性疼痛的治疗
本文公开的变体神经胚素多肽(以及含有其的药物组合物)可用于治疗受试者中的触觉异常性疼痛(tactile allodynia)。术语“触觉异常性疼痛”通常指受试者中的疼痛是由通常无害的皮肤刺激(例如接触)激发的情形。
一些实施方案中,触觉异常性疼痛通过给药受试者药物有效量的变体神经胚素多肽来治疗。相关实施方案中，触觉异常性疼痛可通过给药受试者有效量的单独的变体神经胚素，或给药受试者有效量的变体神经胚素以及有效量的麻醉诱导化合物来治疗，所述麻醉诱导化合物选自下组：类罂粟碱,抗心率失常,局部镇痛药,局部麻醉剂,抗惊厥剂,抗抑郁药,皮质激素和NSAIDS。一个实施方案中，所述麻醉诱导化合物是抗惊厥剂。另一优选实施方案中，所述麻醉诱导化合物是加巴喷丁((1-氨甲基)醋酸环己烷)或普加巴林(S-(+)-4-氨基-3-(2-甲基丙基)丁酸)。
一些实施方案中,将变体神经胚素多肽与治疗剂一同给药，包括但不限于抗癌药剂或抗病毒药剂。抗癌药剂包括但不限于紫杉醇,泰索帝，顺铂,诺考达唑,长春新碱,长春地辛和长春碱。抗病毒药剂包括但不限于ddI,DDC,d4T,膦甲酸,氨苯砜,甲硝唑,和异烟肼。
3.痛觉敏感性缺失的减轻治疗
另一实施方案中，本发明公开的变体神经胚素多肽(以及含有其的药物组合物)可用于减轻患有神经病的受试者中的痛觉敏感性缺失的方法中。一个实施方案中，所述神经病是糖尿病性神经病。一些实施方案中，痛觉敏感性缺失是热痛觉敏感性缺失。所述方法包括预防和治疗性治疗。
预防性治疗中,将变体神经胚素多肽给药可能患痛觉敏感性缺失的受试者(预期所述受试者是患有早期神经病的受试者)。在所述情况下利用变体神经胚素多肽的治疗将预防性治疗有患病风险的患者。
治病性治疗中,将变体神经胚素多肽给药由于患有神经病而经历痛觉敏感性缺失的受试者(预期所述受试者患有晚期神经病)。在所述情况下利用变体神经胚素多肽的治疗将挽救受试者中适当的痛觉敏感性。
4.病毒感染以及病毒相关的神经病的治疗
涉及感染性和病毒性神经病的预防性治疗。预防性治疗在确定病毒感染之后、神经病性疼痛开始之前进行。在治疗过程中，给药变体神经胚素多肽以预防神经病性疼痛的出现，包括但不限于与麻风病，莱姆病相关的神经病性疼痛，与病毒具体是选自下组的病毒的感染相关的神经病性疼痛：疱疹病毒(和具体是带状疱疹病毒，其可导致疱疹后神经痛),人免疫缺陷病毒(HIV),和乳头瘤病毒)。在可选实施方案中，给药变体神经胚素多肽以减轻可能出现的神经病性疼痛的严重度。
急性病毒感染的症状通常包括出疹。其它症状包括，例如，机体受影响部位的持续性疼痛的出现，其是带状疱疹病毒感染(带状疱疹(shingles))的共同并发症。疱疹后神经痛可持续一个月或更长时间，并且可在任何皮疹样症状消失之后出现数个月。
5.痛性糖尿病性神经病的治疗
涉及痛性糖尿病性神经病的预防性治疗。糖尿病性神经病的预防性治疗将在确定糖尿病或糖尿病相关症状的最初诊断之后、神经病性疼痛开始之前进行。疼痛性糖尿病性神经病的预防性治疗也可在确定受试者可能患有糖尿病或糖尿病相关症状时开始。在治疗过程中，给药变体神经胚素多肽以防止神经病性疼痛的出现。在可选实施方案中，给药变体神经胚素多肽以减轻已经出现的神经病性疼痛的严重度。
6.神经系统疾病的治疗
本文公开的变体神经胚素多肽(以及含有其的药物组合物)可用于治疗或预防受试者(诸如人)中的神经系统疾病，其通过给药需要其的受试者治疗有效量的变体神经胚素多肽，包含变体神经胚素多肽的组合物，或包含偶联于聚亚烷基部分诸如PEG的稳定水溶性偶联型变体神经胚素多肽的复合体来进行。
神经系统疾病可为外周神经系统疾病，诸如外周神经病或神经病性疼痛综合征。人是治疗的优选受试者。
变体神经胚素多肽可用于治疗神经元中的缺陷，包括但不限于缺陷的神经元和受到外伤的神经元。经历外伤的外周神经元包括但不限于髓质(medulla)或脊髓的神经元。变体神经胚素多肽可用于治疗神经变性疾病，例如大脑缺血性神经元损伤；神经病，例如外周神经病，阿尔茨海默病，亨廷顿病，帕金森氏病，肌萎缩侧索硬化(ALS)。所述变体神经胚素多肽可用于治疗受损的记忆，例如与痴呆相关的记忆受损。
以下是实施本发明的实施例。不将它们理解成从任意方面对本发明的限制。
实施例
实施例1:变体神经胚素多肽的设计和合成
使人神经胚素结晶，其结构显示硫酸根离子的三分体(triad)，其与以下互相紧密相邻的四个神经胚素残基相互作用：Arg14,Arg48,Arg49,和Arg51。基于该三分体的存在以及它们互相之间的相对距离，推定神经胚素的该区域可为潜在的硫酸肝素结合结构域。随后，将已经确定的硫酸肝素结构在硫酸根三分体的位置对接(in-silico)于神经胚素。硫酸肝素恰好适合该位置，提示神经胚素内的该位置具有硫酸肝素结合潜力。
神经胚素结晶体数据也显示以下氨基酸残基提供与硫酸根离子三分体或同神经胚素反应的三个其它硫酸根离子中的一或多个的补充(supplementary)反应:Ser 46,Ser 73,Gly 72,Arg 39,Gln 21,Ser 20,Arg 68,Arg 33,His 32,和Val 94。除了晶体结构显示的硫酸根结合位置，神经胚素含有位于其N末端的残基3－9的硫酸肝素结合位置共有序列(GPGSRAR)。该区域在晶体结构中无序(unstructured)但一旦结合葡糖胺聚糖则变得有序。该区域很可能在空间上邻近晶体结构中观察到的三个硫酸根的簇(Arg14对于主要集中在蛋白铰链区的肝素结合位置有贡献)。
为了研究潜在的硫酸肝素结合结构域的生物相关性，在成熟113氨基酸人神经胚素(SEQ ID NO:1)中进行三个分别的单个氨基酸残基的取代。分别位于位置48(变体名称为“Arg48E”;SEQ ID NO:2),位置49(变体名称为“Arg49E”;SEQ ID NO:3),和位置51(变体名称为“Arg51E”;SEQ ID NO:4)的精氨酸被谷氨酸盐取代(即制备三种不同的单个氨基酸变体构建体)，其目的在于改变残基的电荷使其从吸引硫酸盐的残基变为排斥硫酸盐的残基，以有效稳定周围的精氨酸残基的残基。重新折叠蛋白质并从大肠杆菌包涵体纯化(见WO04/069176)。对每种神经胚素变体进行分析以证实结构完整性并确认正确的残基取代。所有三种突变体在结构上与人神经胚素是可比的。
实施例2:阳离子和肝素琼脂糖层析
对变体神经胚素多肽进行进一步的生物化学分析以确定每种突变对于肝素结合的影响。肝素琼脂糖和阳离子层析均被采用。由于野生型人神经胚素是表观pI为11.31的碱性蛋白，神经胚素有效地结合基于阳离子的树脂。精氨酸到谷氨酸的单个转变使得表观pI降低到10.88。但是，不期望该低pI明显改变阳离子树脂结合也不期望其改变突变体与野生型对照相比的洗脱图谱。
对每种突变体(以及野生型神经胚素对照)进行阳离子层析。将样品加载于位于含有5mM磷酸盐pH6.5和150mM氯化钠的缓冲液中的树脂，然后利用150mM到1M氯化钠的线性盐梯度进行洗脱。野生型神经胚素在～800mM氯化钠(图2A;峰D)洗出，而三种突变体的每一种在大约500mM的盐范围内洗出，由此反应它们的较低的pI。Arg49E和Arg51E(图2A;峰B和C)在稍高于洗出Arg48E(图2A;峰A)所需的盐浓度(分别为520mM vs490mM)洗出。差异表明Arg48的表面更易接近并且其对于阳离子结合的贡献比其它两种突变更高。
为了确定Arg-to-Glu取代是否对肝素结合有影响，对三种突变体的每一种(以及野生型人神经胚素)进行肝素琼脂糖层析(图2B)。结合和洗脱条件类似于用于阳离子洗脱的那些条件。但是，观察到的洗脱图谱与阳离子树脂洗脱图谱明显不同。野生型神经胚素在大约720mM氯化钠洗出(图2B;峰H)而Arg51E,Arg49E,和Arg48E分别在570mM(图2B;峰G),510mM(图2B;峰F),和450mM(图2B;峰E)氯化钠洗出。Arg48E显示对于肝素结合具有特别剧烈的影响。总而言之，这些层析图谱提示每种突变都降低神经胚素对肝素的表观亲和力。
实施例3:阳离子层析
在标准pH条件6.5和氯化钠浓度150mM,神经胚素不结合阴离子树脂。反之，硫酸肝素在相同条件下不结合阴离子树脂。
当神经胚素以1：1摩尔比与16-kDa-硫酸肝素预混合并利用上述条件加载到阴离子基质上，神经胚素结合并被600mM氯化钠洗出(图3B,泳道标记“FT”),提示神经胚素通过其与硫酸肝素的相互作用结合阴离子基质。缺乏肝素时，神经胚素不结合阴离子树脂(图3A,泳道标记“FT”)并且没有神经胚素被600mM氯化钠洗出(图3A,泳道标记“洗脱”)。这些数据提供神经胚素结合肝素的能力的进一步的数据。
实施例4:中国仓鼠卵巢细胞结合研究
以前显示神经胚素非特异性结合中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的表面。建立神经胚素CHO细胞结合实验以确定该反应是否至少部分由神经胚素与细胞表面硫酸肝素分子的结合介导。
将野生型人神经胚素(40ug)或Arg48E突变体与CHO细胞(106细胞)以充分结合两种神经胚素形式并增加16kDa硫酸肝素的量的细胞密度预混合，37°C保温4小时。保温后，通过离心沉淀细胞，对上清中保留的非结合神经胚素进行SDS/PAGE分析。通过光密度分析法定量每种蛋白的带以后，用所得的光密度值相对于每种样品中的肝素浓度作图(图4)。
在两个较低的肝素浓度，野生型和突变体神经胚素形式具有相同量的在上清中鉴定的蛋白。但是，随肝素浓度增加到0.5ug/ml以上，在上清中鉴定的野生型神经胚素多于Arg48E突变体。该观察提示肝素可与细胞表面结合的肝素竞争野生型神经胚素结合(即肝素与野生型神经胚素的结合导致其从细胞表面去除)，而肝素不能轻易竞争过Arg48E突变体。在最高的肝素浓度(50ug/ml),Arg48E突变体开始从细胞表面洗出，提示肝素和Arg48E突变体之间的阳离子相互作用可能导致该观察结果。
实施例5:野生型神经胚素和变体神经胚素多肽的肝素结合
为了进一步研究鉴定的精氨酸三分体作为神经胚素肝素结合位置的作用，建立肝素结合型ELISA。简而言之，将抗神经胚素单克隆抗体包被于96孔板，然后洗涤并加入一种神经胚素形式。随后将生物素化的肝素加入板。另外的洗涤步骤之后，利用链霉抗生物素-HRP偶联物以及化学发光底物鉴定神经胚素/肝素复合体。利用该肝素结合型比较野生型人神经胚素113氨基酸(SEQ ID NO:1)和104氨基酸(SEQ ID NO:1的氨基酸10-113)形式与含有单个氨基酸取代(Arg48E,Arg49E,和Arg51E;SEQ ID NOS:2-4)以及双取代(Arg48,49E;SEQ ID NO:5)的变体神经胚素多肽。
两种形式的野生型神经胚素形式以EC50～1ng/ml肝素(图5)结合肝素。Arg49E和Arg51E的结合效率较低，表观EC50为～10ng/ml,但最大结合保持相同(图5)。在三种单个点突变中，Arg48E对肝素结合的影响最大，表观EC50为～100ng/ml,但与未经修饰的神经胚素形式相比仍获得相同的最大肝素结合值(图5)。Arg48E突变体与未经修饰的神经胚素形式相比其结合肝素的效力由此小100倍，并且与其它单取代突变体相比其效力低10倍。当Arg48和Arg49都被谷氨酸取代，肝素结合基本上消除，导致最大肝素结合降低7倍，但是EC50保持在单个点突变体的范围内。这些结果提示，由于其定位在推定的肝素结合位置的中央，Arg48在肝素结合中起重要作用。
实施例6:野生型神经胚素和肝素结合突变体的激酶受体活化分析
为了确定肝素结合位置突变对于基于细胞的生物测定中的神经胚素受体信号是否有影响，对突变神经胚素形式以及野生型神经胚素形式进行激酶受体活化(KIRA)分析。
每种单Arg-到-Glu取代突变体显示就KIRA活性而言与未经修饰的对照相同，提示这些突变体在结构上类似野生型并能活化神经胚素受体以及信号级联(图6)。此外，这些数据提示肝素与神经胚素的结合可能不需要受体活化。
当对Arg48,49E双突变体(SEQ ID NO:5;113氨基酸形式)进行KIRA时，其表观EC50向左偏移大约一个数量级，其最大受体活化与野生型人神经胚素对照相比增加(图7A)。类似地,Arg48,49E双突变体(SEQ ID NO:7;104氨基酸形式)与野生型神经胚素相比也显示增加的效力(图7B)。Arg48,51E和Arg49,51E双突变体(分别为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:8;113氨基酸形式)显示就KIRA活性而言与未经修饰的神经胚素对照相似(图7B)。
实施例7:三元复合体分析
利用两种稍微不同的方案，对野生型人神经胚素以及每种肝素突变体进行三元复合体分析、第一种方案将神经胚素的受体组分(GFRalpha3和RET)以及神经胚素在池中组合，然后将其加入利用捕获抗体包被的ELISA板(图8)。第二种方案将这些组分依次加入ELISA板，先加入GFRalpha3，然后加入神经胚素,然后加入RET(图9)。
当将组分加入作为池，利用Arg48E和Arg48,49E实现最大结合，提示这些神经胚素形式对其受体具有最高亲和力。野生型神经胚素显示其结合亲和力与Arg49E突变体相似，而Arg51E和三重突变体(Arg48,49和51都取代为谷氨酸)显示最弱的受体结合。
当依次加入受体组分，Arg48E显示最佳的受体结合。但是在这些条件下，双突变体与其受体结合较弱，亲和力似乎与Arg51E突变体相似。Arg49E和野生型神经胚素的受体亲和力在观察到的最大和最小结合之间。三重突变体在这些条件下不结合。总而言之，这些数据提示Arg48在影响神经胚素的受体亲和力中起关键作用。
实施例8:近和远UV CD分析
为了进一步研究双突变体对神经胚素的二级和三级结构的影响，对Arg48,49E双突变体进行近和远UV CD分析。尽管在二级和三级结构中检出细微差异，双突变体的构象与野生型神经胚素的非常接近。
实施例9:神经胚素Arg48,49E双突变体的药物动力学分析
人神经胚素在经静脉内(IV)或皮下(SC)给药时显示较差的药物动力学(PK)，总体生物利用度小于1％。基于肝素的清除率是该低生物利用度的一个原因。为了测定基于肝素的清除率是否与人神经胚素从大鼠的快速清除有关，对Arg48,49E双突变体(以及野生型对照)进行PK分析。
以7mg/kg SC将两种形式分开给药。从1小时起开始收集血清样品，直到第96小时为止，并分析神经胚素(图10)。观察到野生型神经胚素的曲线下面积(AUC)是～109，而观察到的双突变体的AUC是20,145。这代表双突变体AUC增加185倍(与野生型神经胚素相比)，并且血清暴露明显增加。
IV给药(1mg/kg)之后也对野生型和双突变神经胚素进行PK分析。注射后5分钟最初的双突变体血浆浓度(菱形)比野生型对照(方形)的高大约6倍，但在1小时之内迅速接近野生型水平(图11)。这些数据提示神经胚素中的双突变有助于增加血清暴露但是不影响总清除率。
将SC观察汇总在一起，肝素结合似乎在SC给药后特别相关，可能导致储药池(depot)样效应。一旦神经胚素进入循环，双突变体和野生型分析清除的速率大约相同。
为了说明大鼠中神经胚素从循环清除的速率，利用基于SPA的偶联化学方法，用10kDaPEG将野生型和双突变体形式的神经胚素PEG化。由于神经胚素是没有天然赖氨酸残基的同源二聚体，10kDa部分特异性标记每个单体的氨基末端。将2X10K PEG化人双突变体神经胚素纯化到均质，并在PK分析之前进行结构和生物分析。
将2X10K PEG Arg48,49E双突变体IV(1mg/kg)或SC(7mg/kg)注入大鼠，在分析的各个时间点收集血清。IV给药后,2X10K PEG双突变体实现理论Cmax10ug/ml(菱形)，其具有常规的alpha和beta期(图12)。SC给药PEG化的双突变体显示注射24小时的Cmax为40ng/ml(图12)。一旦药物进入循环，表观清除率与IV剂量的平行。该构建体的生物利用度与非PEG化的或PEG化的野生型人神经胚素相比降低大约10％。
实施例10:神经胚素肝素结合型突变体在中国仓鼠卵巢细胞中的表达
编码野生型和突变体神经胚素的质粒在CHO细胞中表达，分泌的可溶蛋白的量通过ELISA测定。这些实验中所用的质粒构建体编码含有人生长激素信号肽(SigPep)的融合蛋白(该质粒中包含或不包含内含子)，该肽融合于(i)野生型人神经胚素羧基末端的104个氨基酸,或(ii)Arg48,49E双突变体(104氨基酸形式)。
以下是用于这些实验的神经胚素融合蛋白的氨基酸序列。神经胚素序列是上面情况(upper case)的类型。人生长激素信号肽序列在下方。信号肽和神经胚素序列的连接通过加字符(∧)标示。位置48和49的氨基酸加下划线。
SigPep-NBN(野生型):matgsrtslllafgllclswlqegsa∧AAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG(SEQ ID NO:13)。
SigPep-NBN(Arg48,49E):matgsrtslllafgllclswlqegsa∧AAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCEEARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG(SEQ IDNO:14)。
CHO细胞利用编码每种前述神经胚素形式的质粒转染并在384孔板中培养。数周之后，含有生长细胞的孔转移到96孔板。通过ELISA分析经调节的培养基测定可溶神经胚素的滴度。检测每种受试质粒的累积吸光度(平均值，以一个标准离差作为误差条(error bar))。
利用编码Arg48,49E双突变体的质粒转染CHO细胞导致与利用编码野生型神经胚素的质粒转染的细胞相比，显示高重组蛋白表达水平的细胞系明显增加(图13)。
进一步扩增来自每次转染的前导细胞系。培养固定数目的细胞3天，测定总细胞计数，生存力和滴度。从前导Arg48,49E双突变体细胞系表达的神经胚素的滴度比前导野生型神经胚素细胞系的那些高大约5倍(图14)。
其它实施方案
虽然本发明根据其详细的说明书进行了描述，前述的说明意图说明而不是限制所附权利要求限定的本发明的范围。其它方面，优点以及修饰在权利要求的范围内。
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Claims (55)

1.包含与SEQ ID NO:1的氨基酸15-113具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1包含至少一处氨基酸取代，所述氨基酸选自下组:
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置48的相应位置的精氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置49的相应位置的精氨酸;和
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置51的相应位置的精氨酸,
其中所述多肽在二聚化时结合含有GFRalpha3和RET的复合体。
2.权利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列包括这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置48的相应位置的精氨酸。
3.权利要求2的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ ID NO:1的位置48的精氨酸残基。
4.权利要求2的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置48的精氨酸残基。
5.权利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列包括这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置49的相应位置的精氨酸。
6.权利要求5的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ ID NO:1的位置49的精氨酸残基。
7.权利要求5的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置49的精氨酸残基。
8.权利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列包括这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置51的相应位置的精氨酸。
9.权利要求8的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ IDNO:1的位置51的精氨酸残基。
10.权利要求8的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置51的精氨酸残基。
11.权利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列包含这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置48和位置49的相应位置的精氨酸。
12.权利要求11的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ IDNO:1的位置48的精氨酸残基以及位置49的精氨酸残基。
13.权利要求11的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置48的精氨酸残基以及位置49的精氨酸残基的每一个。
14.权利要求1-13之一的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少90％的同一性。
15.权利要求1-13之一的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少95％的同一性。
16.权利要求1-13之一的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸15－113具有至少98％的同一性。
17.多肽，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸15-113,SEQ ID NO:3的氨基酸15-113,SEQ ID NO:4的氨基酸15-113,SEQ ID NO:5的氨基酸15-113,SEQ ID NO:8的氨基酸15-113,或SEQ ID NO:9的氨基酸15-113。
18.权利要求17的多肽，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸10-113,SEQ IDNO:3的氨基酸10-113,SEQ ID NO:4的氨基酸10-113,SEQ ID NO:5的氨基酸10-113,SEQ ID NO:8的氨基酸10-113,或SEQ ID NO:9的氨基酸10-113。
19.权利要求17的多肽，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列,SEQ IDNO:3的氨基酸序列,SEQ ID NO:4的氨基酸序列,SEQ ID NO:5的氨基酸序列,SEQ ID NO:8的氨基酸序列,或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
20.二聚体，其包含权利要求1－19中任一项的两个多肽。
21.偶联物，其包含偶联于非天然存在聚合物的权利要求1－19之一的多肽。
22.融合蛋白，其包含权利要求1－19之一的多肽以及异源氨基酸序列。
23.药物组合物，其包含权利要求1-19之一的多肽，权利要求20的二聚体，权利要求21的偶联物，或权利要求22的融合蛋白，并包含可药用的载体或赋形剂。
24.核酸，其包含编码权利要求1-19之一的多肽的序列。
25.表达载体，其包含权利要求24的核酸。
26.细胞，其包含权利要求25的表达载体。
27.制备多肽的方法，所述方法包括：
提供权利要求26的细胞，和
在允许所述核酸表达的条件下培养所述细胞。
28.治疗或预防哺乳动物中的神经系统疾病的方法，所述方法包括给药哺乳动物治疗有效量的权利要求23的药物组合物。
29.治疗哺乳动物中的神经病性疼痛的方法，所述方法包括给药哺乳动物治疗有效量的权利要求23的药物组合物。
30.活化哺乳动物中的RET受体的方法，所述方法包括给药哺乳动物有效量的权利要求1－19之一的多肽，权利要求20的二聚体，权利要求21的偶联物，权利要求22的融合蛋白，或权利要求23的药物组合物。
31.多肽，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸15-113具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1包含至少一处氨基酸取代，所述氨基酸选自下组:
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置20的相应位置的丝氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置21的相应位置的谷氨酰胺;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置32的相应位置的组氨酸；
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置33的相应位置的精氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置39的相应位置的精氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置46的相应位置的丝氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置68的相应位置的精氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置72的相应位置的甘氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置73的相应位置的丝氨酸;和
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置94的相应位置的缬氨酸,
其中所述多肽在二聚化时结合含有GFRalpha3和RET的复合体。
32.多肽，包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1包含至少一处氨基酸取代，所述氨基酸选自下组:
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置7的相应位置的精氨酸;
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置9的相应位置的精氨酸;和
氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置14的相应位置的精氨酸,
其中所述多肽在二聚化时结合含有GFRalpha3和RET的复合体。
33.权利要求32的多肽，其中所述氨基酸序列包含这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置7的相应位置的精氨酸。
34.权利要求33的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ IDNO:1的位置7的精氨酸残基。
35.权利要求33的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置7的精氨酸残基。
36.权利要求32的多肽，其中所述氨基酸序列包含这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置9的相应位置的精氨酸。
37.权利要求36的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ IDNO:1的位置9的精氨酸残基。
38.权利要求36的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置9的精氨酸残基。
39.权利要求32的多肽，其中所述氨基酸序列包含这样的氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:1的位置14的相应位置的精氨酸。
40.权利要求39的多肽，其中用非保守氨基酸残基取代在SEQ IDNO:1的位置14的精氨酸残基。
41.权利要求39的多肽，其中用谷氨酸取代在SEQ ID NO:1的位置14的精氨酸残基。
42.权利要求32-41之一的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ IDNO:1具有至少90％的同一性。
43.权利要求32－41之一的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ IDNO:1具有至少95％的同一性。
44.权利要求32－41之一的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ IDNO:1的氨基酸15－113具有至少98％的同一性。
45.二聚体，其包含权利要求31－44中任一项的两个多肽。
46.偶联物，其包含偶联于非天然存在聚合物的权利要求31－44之一的多肽。
47.融合蛋白，其包含权利要求31－44之一的多肽以及异源氨基酸序列。
48.药物组合物，其包含权利要求31－44之一的多肽，权利要求45的二聚体，权利要求46的偶联物，或权利要求47的融合蛋白，并包含可药用的载体或赋形剂。
49.核酸，其包含编码权利要求31－44之一的多肽的序列。
50.表达载体，其包含权利要求49的核酸。
51.细胞，其包含权利要求50的表达载体。
52.制备多肽的方法，所述方法包括：
提供权利要求51的细胞，和
在允许核酸表达的条件下培养所述细胞。
53.治疗或预防哺乳动物中的神经系统疾病的方法，所述方法包括给药哺乳动物治疗有效量的权利要求48的药物组合物。
54.治疗哺乳动物中的神经病性疼痛的方法，所述方法包括给药哺乳动物治疗有效量的权利要求48的药物组合物。
55.活化哺乳动物中的RET受体的方法，所述方法包括给药哺乳动物有效量的权利要求31－44之一的多肽，权利要求45的二聚体，权利要求46的偶联物，权利要求47的融合蛋白，或权利要求48的药物组合物。
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