MX2007002029A

MX2007002029A - Variantes de neublastina.

Info

Publication number: MX2007002029A
Application number: MX2007002029A
Authority: MX
Inventors: R Blake Pepinsky; Anthony Rossomando; Laura Silvian
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 2004-08-19
Filing date: 2005-08-18
Publication date: 2007-03-28
Also published as: EP2335713A2; JP2008510468A; KR101215697B1; EA200700460A1; WO2006023781A2; PT1786454E; SI1786454T1; HRP20100474T1; CA2577755C; NZ553431A; CY1111136T1; EP2335713A3; US20130096065A1; EP2238983B1; ZA200701395B; EP1786454A4; EP1786454B1; WO2006023781A3; EA013565B1; PL1786454T3

Abstract

La presente invencion se refiere a polipeptidos de Neublastina variables que tienen substituciones en residuos de aminoacidos seleccionados. La substitucion en uno o mas residuos de aminoacidos seleccionados reduce la aglutinacion de la heparina e incrementa la exposicion al suero de los polipeptidos de Neublastina variables. Tambien se describen metodos de uso de los polipeptidos de Neublastina variables para tratar trastornos y activar el receptor de RET en un mamifero.

Description

VARIANTES DE NEUBLASTINA Campo de la Invención La invención se refiere a la química de las proteínas, a la biología molecular, y a la neurobiología. Antecedentes de la Invención La Neublastina, también conocida como Artemina y Enovina, es una proteína secretada homodimérica de 24-kDa que promueve la supervivencia de las neuronas del sistema nervioso periférico y central tales como las neuronas dopaminérgicas (Baudet et al., 2000, Development, 127:4335; Rosenblad et al., 2000, Mol. Cell Neurosci . , 15(2) : 199; GenBank AF120274) . La Neublastina que codifica el gen ha sido clonada y secuenciada (Roseblad et al., 2000, Mol. Cell Neurosci., 15(2): 199; Baloh et al., Neuron, 21:1291). La Neublastina es un miembro de la familia del ligando del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF (por sus siglas en inglés) ) . Al nivel celular, los miembros de GDNF activan la tirosina cinasa del receptor, RET (por sus siglas en inglés) . La RET se asocia con un co-receptor, el receptor alfa de la familia de GDNF (GFRalfa) , una proteína de la membrana enlazada al glicosilfosfatidil inositol (GPI) que proporciona una especificidad del ligando para RET. Ya se conocen cuatro GFRalfas (GFRalfal-4) . La Neublastina se aglutina a GFRalfa3 junto con RET formando un complejo de señalización ternario (Baudet et al., 2000, R?f .179819 Development, 127:4335; Baloh et al., 1998, Neuron, 21:1291), el cual está localizado predominantemente sobre las neuronas sensoras nociceptivas (Orozco et al., 2001, Eur. J. Neurosci., 13 (11) : 2177) . Estas neuronas detectan el dolor y las lesiones. Por consiguiente, la Neublastina tiene aplicación clínica en el tratamiento general de la neuropatía y más específicamente en el tratamiento del dolor neuropático . La Neublastina y los otros miembros de la familia de GDNF son miembros de la superfamilia del factor beta del crecimiento de transformación (TGF beta) y por consiguiente, están caracterizados por la presencia de siete residuos de cisteína conservados con un espaciado semejante que forma la estructura de un nudo de cisteína (Saarma, 1999, Microsc. Res. Tech., 45:292). Cada monómero contiene dos enlaces de disulfuro que forman una estructura de bucle cerrado que circunda el tercer disulfuro para formar una estructura de nudo ceñido. La séptima cisteína contenida dentro de cada monómero forma un enlace de disulfuro intermolecular, que enlaza covalentemente los monómeros para formar el producto del dímero final (Rattenholl et al 2000, J. Mol. Biol., 305:523) . Los miembros de la familia de TGF beta son sintetizados como pre pro proteínas que eventualmente son secretadas como un homodímero maduro después de la segmentación del péptido de la señal y el pro-dominio (véase, por ejemplo Rattenholl, et al., 2000, J. Mol. Biol., 305:523; Fairlie et al., 2001, J. Biol. Chem., 276 (20) : 16911) . Tanto el péptido de la señal como el pro-dominio tienen un papel de mediación de la secreción apropiada para los miembros de la familia de TGF beta (Rattenholl et al., 2000, J. Mol. Biol., 305:523; Rattenholl et al., 2001, Eur. J. Biochem., 268:3296) . Breve Descripción de la Invención La invención está basada, al menos en parte, en el descubrimiento de que la Neublastina se aglutina al sulfato de heparina y en que los residuos de aminoácidos particulares en el polipéptido de Neublastina contribuyen a este evento de aglutinación. La substitución de los residuos de aminoácidos seleccionados se encontró que reduce la aglutinación de la heparina por los polipéptidos de Neublastina variables e incrementa la bioactividad y la biodisponibilidad de las variantes . En un aspecto, la invención caracteriza un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO:l, en donde la secuencia de aminoácidos contiene al menos una substitución de aminoácidos, con relación a la SEC ID NO:l, seleccionada del grupo que consiste de: (i) un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 48 de la SEC ID N0:1 (por ejemplo, la arginina está substituida con un residuo de aminoácido no-conservador tal como el ácido glutámico) ; (ii) un aminoácido diferente que la arginina en la posición correspondiente a la posición 49 de la SEC ID N0:1 (por ejemplo, la arginina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador tal como el ácido glutámico) ; y (iii) un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 51 de la SEC ID NO : 1 (por ejemplo, la arginina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador tal como el ácido glutámico) . El polipéptido, cuando es dimerizado, se aglutina a un complejo que contiene GFRalfa3 y RET. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos contiene los aminoácidos diferentes de la arginina en las posiciones correspondientes a la posición 48 y la posición 49 de la SEC ID NO:l. Por ejemplo, el residuo de arginina en la posición 48 y el residuo de arginina en la posición 49 de la SEC ID NO:l pueden estar substituidos con los residuos de aminoácidos no conservadores (por ejemplo, el ácido glutámico) . En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos es de al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO:l. También se describe un polipéptido que contiene los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 2, los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO : 3 , los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO : 4 , los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 5, los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 8, o los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 9. En algunas modalidades, el polipéptido contiene los aminoácidos 10-113 de la SEC ID NO : 2 , los aminoácidos 10-113 de la SEC ID NO: 3, los aminoácidos 10-113 de la SEC ID NO: 4, los aminoácidos 10-113 de la SEC ID NO : 5 , los aminoácidos 10-113 de la SEC ID NO: 8, o los aminoácidos 10-113 de la SEC ID NO: 9. En algunas modalidades, el polipéptido contiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 8, o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 9. También se describe un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO:l, en donde la secuencia de aminoácidos comprende al menos una substitución de aminoácidos, con relación a la SEC ID NO:l, seleccionada del grupo que consiste de: (i) un aminoácido diferente de la serina en la posición correspondiente a la posición 20 de la SEC ID NO:l (por ejemplo, la serina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador) ; (ii) un aminoácido diferente de la glutamina en la posición correspondiente a la posición 21 de la SEC ID N0:1 (por ejemplo, la glutamina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador) ; (iii) un aminoácido diferente de la histidina en la posición correspondiente a la posición 32 de la SEC ID N0:1 (por ejemplo, la histidina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador) ; (iv) un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 33 de la SEC ID N0:1 (por ejemplo, la arginina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador) ; (v) un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 39 de la SEC ID NO:l (por ejemplo, la arginina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador) ; (vi) un aminoácido diferente de la serina en la posición correspondiente a la posición 46 de la SEC ID NO:l (por ejemplo, la serina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador) ; (vii) un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 68 de la SEC ID NO:l (por ejemplo, la arginina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador) ; (viii) un aminoácido diferente de la glicina en la posición correspondiente a la posición 72 de la SEC ID NO : 1 (por ejemplo, la glicina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador) ; (xi) un aminoácido diferente de la serina en la posición correspondiente a la posición 73 de la SEC ID NO : 1 (por ejemplo, la serina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador) ; y (x) un aminoácido diferente de la valina en la posición correspondiente a la posición 94 de la SEC ID N0:1 (por ejemplo, la valina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador) . El polipéptido, cuando es dimerizado, se aglutina a un complejo que contiene GFRalfa3 y RET. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos es al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO:l. También se describe un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a la SEC ID NO:l, en donde la secuencia de aminoácidos comprende al menos una substitución de aminoácido, con relación a la SEC ID NO:l, seleccionada del grupo que consiste de: (i) un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 7 de la SEC ID NO:l (por ejemplo, la arginina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador tal como el ácido glutámico) ; (ii) un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 9 de la SEC ID NO:l (por ejemplo, la arginina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador tal como el ácido glutámico) ; y (iii) un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 14 de la SEC ID NO:l (por ejemplo, la arginina está substituida con un residuo de aminoácido no conservador tal como el ácido glutámico) . El polipéptido, cuando está dimerizado, se aglutina a un complejo que contiene GFRalfa3 y RET. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos es al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idéntica a la SEC ID NO:l. La invención también caracteriza conjugados que contienen un polipéptido descrito aquí, conjugado con un polímero que no está presente de manera natural. Un polímero ejemplar es un polímero sintético soluble en agua tal como un polialquilenglicol (por ejemplo, polietilenglicol). La invención también caracteriza una proteína de fusión que contiene un polipéptido descrito aquí y una secuencia de aminoácidos heterólogos . La invención también caracteriza un dímero que contiene dos de los polipéptidos, conjugados, o proteínas de fusión descritos aquí. La invención también caracteriza una composición farmacéutica que contiene un polipéptido, dímero, conjugado, o proteína de fusión descrita aquí y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. También se describe un ácido nucleico que contiene una secuencia que codifica un polipéptido descrito aquí, un vector de expresión que contiene el ácido nucleico, y una célula que contiene el vector de expresión. También se describe un método de fabricación de un polipéptido, el método incluye las siguientes etapas: (i) proporcionar una célula que contiene un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito aquí, y (ii) cultivar la célula bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico. La invención también caracteriza un método de tratamiento o prevención de un trastorno del sistema nervioso en un mamífero por la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido, dímero, conjugado, proteína de fusión, o una composición farmacéutica descrita aquí . La invención también caracteriza un método de tratamiento del dolor neuropático en un mamífero por la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido, dímero, conjugado, proteína de fusión, o una composición farmacéutica descrita aquí. La invención también caracteriza un método de activación del receptor de RET en un mamífero por la administración al mamífero de una cantidad efectiva de un polipéptido, dímero, conjugado, proteína de fusión, o una composición farmacéutica descrita aquí. Una ventaja de los polipéptidos de Neublastina variables, seleccionados, descritos aquí, es que los mismos tienen una capacidad reducida de aglutinación a la heparina cuando se compara con una Neublastina del tipo silvestre. La aglutinación reducida a la heparina conduce a una depuración reducida del polipéptido variable in vivo. Un polipéptido de Neublastina variable que tiene substituciones en las posiciones 48 y 49 de los aminoácidos se encontró inesperadamente que tiene una capacidad de aglutinación a la heparina ampliamente reducida y una potencia y biodisponibilidad incrementadas ampliamente cuando se compara con los mutantes de un solo aminoácido y/o la Neublastina del tipo silvestre. Por ejemplo, el mutante doble se encontró que exhibe un incremento de aproximadamente 185 veces en la exposición al suero cuando se compara con la Neublastina del tipo silvestre. Además, este doble mutante se encontró que exhibe un incremento arriba de cinco veces en la expresión in vitro cuando se compara con la Neublastina del tipo silvestre, por lo cual se facilita la producción a gran escala de la proteína. Las ventajas y propiedades inesperadas de los polipéptidos de Neublastina variables permiten el tratamiento de los sujetos utilizando dosis inferiores de proteína y/o permiten intervalos prolongados entre las administraciones (cuando se compara con los tratamientos con la proteína del tipo silvestre) . A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en el arte a la cual pertenece la invención. Aunque los métodos y materiales semejantes o equivalentes a aquellos descritos aquí pueden ser utilizados en la práctica o en la prueba de la presente invención, los métodos y materiales ejemplares son descritos posteriormente. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes, y otras referencias mencionadas aquí, son incorporadas para referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente solicitud, incluyendo las definiciones, tendrá el control. Los materiales, métodos, y ejemplos son solamente ilustrativos y no están propuestos para ser limitativos. Otras características y ventajas de la invención llegarán a ser evidentes de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es una alineación de los polipéptidos de pre pro Neublastina del ser humano (SEC ID NO: 10), del ratón (SEC ID NO: 11), y de la rata (SEC ID NO:12) del tipo silvestre. Las líneas verticales izquierda y derecha indican, respectivamente, el inicio de las formas del aminoácido 104 y del amino 113 maduro. La porción de aglutinación de heparina RRXR está encerrada en un cuadro. La figura 2A muestra un perfil de elución catiónica de Neublastina del tipo silvestre (Pico D) y de tres mutantes de substitución única Arg hasta Glu (Picos A, B y C) (la línea de la pendiente representa la concentración teórica de cloruro de sodio para cualquier volumen dado eluído desde la columna) . Los datos son una representación de los valores OD280 de la muestra eluída. La figura 2B muestra un perfil de elución de Heparina Sepharose de la Neublastina del tipo silvestre (Pico H) y tres mutantes de substitución única Arg hasta Glu (Picos E, F, y G) (la línea de la pendiente representa la concentración teórica de cloruro de sodio para cualquier volumen dado eluído desde la columna) . Los datos son una representación de los valores OD280 de la muestra eluída. La figura 3A y la figura 3B son fotografías que muestran SDS/PAGE de la Neublastina del tipo silvestre después de la cromatografía aniónica en la presencia (2A) o ausencia (2B) de la heparina. La figura 4 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de aglutinación de las células de CHO de Neublastina. Después de SDS/PAGE y densitometría, los valores de OD de las bandas del mutante de Arg48E y del tipo silvestre de Neublastina fueron graficados contra la concentración de la heparina en cada muestra. La figura 5 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de ELISA de aglutinación de la heparina utilizando NBN113 humano del tipo silvestre, NBN104 humana del tipo silvestre, Arg48E, Arg49E, Arg51E, y Arg48,49E. La figura 6 es una gráfica que muestra los resultados del análisis de KIRA de NBN113 de la rata del tipo silvestre, Arg51E, Arg48E, Arg49E, y NBN113 de la rata. La figura 7A es una gráfica que muestra los resultados del análisis de KIRA de la Neublastina humana del tipo silvestre y la Neublastina humana mutante de Arg48,49E (forma de 113 aminoácidos) . La figura 7B es una gráfica que muestra los resultados del análisis de KIRA de la Neublastina humana del tipo silvestre, la Neublastina humana mutante de Arg48,49E (forma de 104 aminoácidos) , la Neublastina humana de Arg48,51E (forma de 113 aminoácidos), y la Neublastina humana de Arg49,5lE (forma de 113 aminoácidos). La figura 8 es una gráfica que muestra los resultados del análisis complejo ternario de la Neublastina humana del tipo silvestre, y las formas de Neublastina Arg48E, Arg49E, Arg5lE, Arg48,49E, y Arg48 , 49 , 51E . La figura 9 es una gráfica que muestra los resultados del análisis complejo ternario de la Neublastina del tipo silvestre, y las formas de Neublastina Arg48E, Arg49E, Arg5lE, Arg48,49E, y Arg48, 9 , 51E. La figura 10 es una gráfica que muestra los resultados del análisis farmacocinético de la Neublastina del tipo silvestre y Arg48,49E después de una inyección subcutánea de 7 mg/kg en el bolo, única (las concentraciones en el plasma de Neublastina fueron determinadas utilizando el ensayo de ELISA de detección de Neublastina) . La figura 11 es una gráfica que muestra los resultados del análisis farmacocinético de la Neublastina del tipo silvestre y Arg48,49E después de una inyección intravenosa de 1 mg/kg en el bolo, única (las concentraciones en el plasma de Neublastina fueron determinadas utilizando el ensayo de ELISA de detección de Neublastina) . La figura 12 es una gráfica que muestra los resultados del análisis farmacocinético de Neublastina de Arg48,49E PEGilada 2X10K después de una inyección de 7 mg/kg subcutánea en el bolo, única (los datos presentados son extrapolados descendiendo hasta 1 mg/kg) y Neublastina de Arg48,49E PEGilada 2X10K administrada intravenosamente a 1 mg/kg (las concentraciones en el plasma de Neublastina fueron determinadas utilizando el ensayo de ELISA de detección de Neublastina) . La figura 13 es una gráfica que muestra los niveles de expresión de Neublastina relativos en las células de CHO transfectadas con los plásmidos que codifican la Neublastina del tipo silvestre o Arg48,49E. La figura 14 es una gráfica que muestra los niveles de expresión de Neublastina relativos en las líneas celulares de CHO transfectadas, mutantes, dobles, de Arg48,49E, delanteras, y una línea celular de CHO transfectada con Neublastina del tipo silvestre, delantera. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona polipéptidos de Neublastina variables que tienen substituciones en residuos de aminoácidos seleccionados. Como se describe en los Ejemplos anexos, los residuos específicos en el polipéptido de Neublastina del tipo silvestre se ha encontrado que son importantes para la aglutinación de la heparina. A causa de que la aglutinación de heparina se cree que contribuye a la depuración de neublastina in vivo, las substituciones en uno o más de estos residuos específicos se espera que reduzcan la aglutinación de la heparina y por esto incrementen la exposición del suero del polipéptido variable. Polipéptidos de Neublastina Variables La Neublastina humana del tipo silvestre, madura, es de 113 aminoácidos de longitud y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASL LGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG (SEC ID NO : 1 ) . Se describen aquí polipéptidos que tienen substituciones en uno o más residuos de aminoácidos seleccionados del polipéptido de Neublastina. Las mutaciones en uno o más de estos residuos se espera que conduzcan a un polipéptido de Neublastina variable que tiene una capacidad de aglutinación a la heparina reducida o ausente cuando se compara con la Neublastina del tipo silvestre. Un polipéptido de Neublastina variable contiene una substitución de aminoácidos, con relación a la SEC ID N0:1, en (i) un residuo de arginina en una o más de las posiciones 48, 49, ó 51, y/o (ii) uno o más de Ser 46, Ser 76, Gly 72, Arg 39, Gln 21, Ser 20, Arg 68, Arg 33, His 32, Val 94, Arg 7, Arg 9, o Arg 14. A menos que se establezca de otra manera, cualquier referencia aquí a un residuo de aminoácidos de Neublastina por el número de la posición se refiere a la numeración de los residuos con relación a la SEC ID NO:l. Un residuo de aminoácido de Neublastina designado para la substitución (por ejemplo, un residuo de arginina en las posiciones 48, 49, y/o 51) puede estar substituido con un residuo de aminoácido no conservador (por ejemplo, ácido glutámico) o un residuo de aminoácido no conservador. Como se detalla en los Ejemplos que se anexan, la substitución de Arg48, Arg 49, y/o Arg 51 con un aminoácido no conservador puede conducir a un polipéptido de Neublastina variable que ha reducido la actividad de la aglutinación de la heparina pero retuvo (o aún mejoró) la actividad biológica de Neublastina. Los aminoácidos ejemplares que pueden ser substituidos con un residuo de aminoácido identificado aquí (por ejemplo, un residuo de arginina en las posiciones 48, 49, y/o 51) incluyen ácido glutámico, ácido aspártico, y alanina. Un polipéptido de Neublastina variable activo biológicamente, cuando es dimerizado, se aglutina a un complejo ternario que contiene GFRalfa3 y RET. Cualquier método para detectar la aglutinación a este complejo puede ser utilizado para evaluar la actividad biológica de un polipéptido de Neublastina variable. Los ensayos ejemplares para detectar la capacidad de aglutinación a un complejo ternario de un polipéptido de Neublastina variable son descritos en WO00/01815 y en el Ejemplo 7. Un polipéptido de Neublastina variable también puede ser ensayado para evaluar su capacidad para desencadenar la cascada de señalización de Neublastina. Por ejemplo, el ensayo de Activación del Receptor de Cinasa (KIRA) descrito en el Ejemplo 6 puede ser utilizado para evaluar la capacidad de un polipéptido de Neublastina variable para inducir la autofosforilación de RET (Véase también, Sadick et al., 1996, Anal. Biochem., 235(2) :207). Además de las substituciones de aminoácidos específicos identificadas aquí, un polipéptido de Neublastina variable también puede contener una o más adiciones, substituciones, y/o deleciones en otras posiciones de los aminoácidos, como se detalla en las siguientes secciones. Un polipéptido de Neublastina variable, además de tener una o más de las substituciones de aminoácidos descritas aquí, también puede variar en su longitud. Aunque el polipéptido de Neublastina humano, maduro (SEC ID N0:1) consiste de los aminoácidos carboxi terminales 113 de la pre pro Neublastina, no todos los 113 aminoácidos son requeridos para lograr la actividad biológica de Neublastina útil. Un corte amino terminal es permisible. Por consiguiente, un polipéptido de Neublastina variable puede contener una o más de las substituciones de aminoácidos descritas aquí en el contexto de 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, ó 113 aminoácidos carboxi terminales de la SEC ID NO:l (es decir, su longitud puede ser de 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, ó 113 aminoácidos) . Un polipéptido de Neublastina variable, además de tener una o más de las substituciones de aminoácidos descritas aquí (y opcionalmente teniendo un corte como se describió aquí), también puede variar en su secuencia. En particular, ciertas substituciones de aminoácidos pueden ser introducidas en la secuencia de Neublastina sin una pérdida apreciable de una actividad biológica de Neublastina. En las modalidades ejemplares, un polipéptido (i) contiene una o más de las substituciones de aminoácidos descritas aquí, y (ii) es al menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ó 99 % idéntica a la SEC ID NO:l (o 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ó 99 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID N0:1). Un polipéptido de Neublastina variable que difiere en la secuencia de la SEC ID N0:1 (o que difiere en la secuencia de los aminoácidos 15-113 de la SEC ID N0:1) puede incluir una o más substituciones de aminoácidos conservadores, una o más substituciones de aminoácidos no conservadores, y/o una o más deleciones o inserciones. La figura 1 es una alineación de los polipéptidos de pre pro Neublastina del ser humano, del ratón, y de la rata, del tipo silvestre. Las líneas verticales en la figura 1 indican el inicio de la forma de 113 aminoácidos, madura (línea vertical izquierda) y la forma de 104 aminoácidos (línea vertical derecha) de la Neublastina. El motivo de aglutinación de la heparina RRXR está encerrada en un cuadro. Esta alineación de las formas bioactivas, que están presentes de manera natural, de la Neublastina, indica residuos ejemplares específicos (es decir, aquellos que no están conservados entre las formas del ser humano, del ratón, y de la rata) que pueden ser substituidos sin eliminar la bioactividad. La identidad porcentual entre las secuencias de aminoácidos puede ser determinada utilizando el programa BLAST 2.0. La comparación de secuencias puede ser efectuada utilizando una alineación sin huecos y utilizando los parámetros de falla (matriz Blossom 62, -costo de existencia del hueco de 11, costo de hueco por residuo de 1, y una relación de lambda de 0.85) . El algoritmo matemático utilizado en los programas BLAST es descrito en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25:3389-3402. Una substitución conservadora es la substitución de un aminoácido por otro con características semejantes. Las substituciones conservadoras incluyen substituciones dentro de los siguientes grupos: valina, alanina y glicina; leucina, valina, e isoleucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina, cisteína, y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Los aminoácidos hidrofóbicos no polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Cualquier substitución de un miembro de los grupos polares, básicos o ácidos, mencionados anteriormente, por otro miembro del mismo grupo, puede ser considerada como una substitución conservadora . Las substituciones no conservadoras incluyen aquellas en las cuales (i) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva (por ejemplo, Arg, His o Lys) está substituido con, o por, un residuo electronegativo (por ejemplo, Glu o Asp) , (ii) un residuo hidrofílico (por ejemplo, Ser o Thr) está substituido con, o por, un residuo hidrofóbico (por ejemplo, Ala, Leu, lie, Phe o Val) , (iii) una cisteína o prolina está substituida con, o por, cualquier otro residuo, o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral aromática o hidrofóbica voluminosa (por ejemplo, Val, lie, Phe o Trp) está substituido con, o por, uno que tiene una cadena lateral más pequeña (por ejemplo, Ala, Ser) o ninguna cadena lateral (por ejemplo, Gly) . Los polipéptidos de Neublastina variables, ejemplares, son descritos en la Tabla 1. Los residuos de aminoácidos de los polipéptidos de Neublastina variables que son mutados cuando se compara con la posición del tipo silvestre correspondiente están escritos con negritas y subrayados. Además, el polipéptido de Neublastina (de 113, 99, ó 104 aminoácidos de longitud) utilizado como la base para la substitución, es mostrado en la Tabla 1.

Tabla 1. Polipéptidos de Neublastina Variables Un polipéptido de Neublastina variable puede ser acoplado opcionalmente a un polímero (por ejemplo, una porción de polialquilenglicol tal como una porción de polietilenglicol). En algunas modalidades, el polímero está acoplado al polipéptido en un sitio sobre el polipéptido de Neublastina que está en una terminación N. En algunas modalidades, el polipéptido de Neublastina variable incluye al menos una substitución de aminoácido con respecto a la SEC ID N0:1 (o con respecto a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID N0:1), que proporciona un sitio de conjugación del polímero interno al cual un polímero puede ser conjugado. En algunas modalidades, el polímero está acoplado al polipéptido de Neublastina variable en un residuo (numerado de acuerdo con la secuencia de SEC ID NO:l) seleccionado del grupo que consiste de la posición 14, posición 39, posición 68, y la posición 95. Las variantes de Neublastina ejemplares que proporcionan sitios de conjugación del polímero interno son descritas en WO 02/060929 y WO 04/069176 (los contenidos de las cuales son incorporados aquí para referencia) . Un polipéptido puede contener opcionalmente secuencias de aminoácidos heterólogos además de un polipéptido de Neublastina variable. "Heterólogos", cuando se utilice con referencia a una secuencia de aminoácidos, se refiere a una secuencia que se origina desde una fuente extraña con respecto a la célula hospedera particular, o, si de la misma célula hospedera, está modificada desde su forma original. Las secuencias heterólogas ejemplares incluyen una secuencia de señal heteróloga (por ejemplo, la secuencia de la señal de albúmina de la rata, natural, una secuencia de la señal de la rata, modificada, o una secuencia de la señal de la hormona del crecimiento humana) , o una secuencia utilizada para la purificación de un polipéptido de Neublastina variable (por ejemplo, una etiqueta de histidina) . Los polipéptidos de Neublastina pueden ser aislados utilizando los métodos conocidos en el arte. Los polipéptidos de Neublastina que están presentes de manera natural pueden ser aislados de las células o las fuentes de tejidos utilizando técnicas de purificación de proteína estándares. Alternativamente, los polipéptidos de Neublastina mutados pueden ser sintetizados químicamente utilizando técnicas de síntesis de péptidos estándares. La síntesis de las secuencias cortas de aminoácidos está bien establecida en el arte de los péptidos. Véase, por ejemplo, Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2/a. edición, 1984) . En algunas modalidades, los polipéptidos de Neublastina variables son producidos por técnicas de ADN recombinantes. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de Neublastina variable puede ser insertada en un vector, por ejemplo, un vector de expresión, y el ácido nucleico puede ser introducido en una célula. Las células adecuadas incluyen, por ejemplo, células de mamífero (tales como células humanas o células de CHO) , células fungosas, células de levadura, células de insecto, y células bacterianas. Cuando se exprese en una célula recombinante, la célula es cultivada preferentemente bajo condiciones que permiten la expresión de un polipéptido de Neublastina variable. El polipéptido de Neublastina variable puede ser recuperado de una suspensión celular si se desea. Cuando se utilice aquí, "recuperado" significa que el polipéptido mutado es removido de aquellos componentes de una célula o un medio de cultivo en el cual el mismo está presente, previo al proceso de recuperación. El proceso de recuperación puede incluir una o más etapas de purificación o de repliegue. Los polipéptidos de Neublastina variables pueden ser construidos utilizando cualquiera de varios métodos conocidos en el arte. Uno de tales métodos es la mutagénesis dirigida al sitio, en la cual un nucleótido específico (o, si se desea un número pequeño de nucleótidos específicos) es cambiado para cambiar un aminoácido único (o, si se desea, un número pequeño de residuos de aminoácidos predeterminados) en el polipéptido de Neublastina variable codificado. Muchos kits de mutagénesis dirigida al sitio están disponibles comercialmente. Uno de tales kits es el "Transformer Site Directed Mutagenesis Kit" vendido por Clontech Laboratories (Palo Alto, CA) .

Composiciones Farmacéuticas Un polipéptido de Neublastina variable puede ser incorporado en una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido y uno o más adyuvantes, excipientes, portadores, y/o diluyentes. Los diluyentes, portadores y excipientes aceptables típicamente no afectan adversamente una homeostasis del receptor (por ejemplo, el balance de electrólitos) . Los portadores aceptables incluyen sales biocompatibles, inertes o bioabsorbibles, agentes amortiguadores, oligo o polisacáridos, polímeros, agentes mejoradores de la viscosidad, conservadores y semejantes. Un portador ejemplar es una solución salina fisiológica (NaCl 0.15 M, pH 7.0 a 7.4). Otro portador ejemplar es fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 100 mM. Los detalles adicionales sobre las técnicas para la formulación y administración de las composiciones farmacéuticas pueden ser encontrados por ejemplo, en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishing Co . , Easton, Pa) . La administración de una composición farmacéutica que contiene un polipéptido de Neublastina variable puede ser sistémica o local. Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas de tal modo que las mismas sean adecuadas para la administración parenteral y/o no parenteral. Las modalidades de la administración específica incluyen la administración subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal transdérmica, intratecal, oral, rectal, bucal, tópica, nasal, oftálmica, intra-articular, intra-arterial, sub-aracnoidea, bronquial, linfática, vaginal, e intra-uterina. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral contienen convenientemente una preparación acuosa estéril del polipéptido de Neublastina variable, que preferentemente es isotónica con la sangre del receptor (por ejemplo, una solución salina fisiológica) . Las formulaciones pueden ser presentadas en la forma de una sola dosis o de dosis múltiples. Una formulación ejemplar contiene un polipéptido de Neublastina variable descrito aquí y los siguientes componentes amortiguadores: succinato de sodio (por ejemplo, 10 mM) ; NaCl (por ejemplo, 75 mM) ; y L-arginina (por ejemplo, 100 mM) . Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden ser presentadas como unidades discretas, tales como cápsulas, sellos, tabletas, o grageas, cada una conteniendo una cantidad predeterminada de un polipéptido de Neublastina variable; o una suspensión en un licor acuoso o un líquido no acuoso, tal como un jarabe, elixir, una emulsión, o un breba e . Las cantidades efectivas terapéuticamente de una composición farmacéutica pueden ser administradas a un sujeto que tenga la necesidad de la misma en un régimen de dosificación que puede ser averiguado por una persona con experiencia en el arte. Por ejemplo, una composición puede ser administrada al sujeto, por ejemplo, sistémicamente a una dosificación desde 0.01 µg/kg hasta 1000 µg/kg del peso corporal del sujeto, por dosis. En otro ejemplo, la dosificación es desde 1 µg/kg hasta 100 µg/kg del peso corporal del sujeto, por dosis. En otro ejemplo, la dosificación es desde 1 µg/kg hasta 30 µg/kg del peso corporal del sujeto, por dosis, por ejemplo desde 3 µg/kg hasta 10 µg/kg del peso corporal del sujeto, por dosis. Para optimizar la eficacia terapéutica, un polipéptido de Neublastina variable es administrado primero en diferentes regímenes de dosificación. La dosis unitaria y el régimen dependen de factores que incluyen, por ejemplo, la especie de mamífero, su estado inmune, el peso corporal del mamífero. Típicamente, los niveles de proteína en los tejidos son verificados utilizando ensayos de selección apropiados como parte de un procedimiento de prueba clínica, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La frecuencia de la dosificación para un polipéptido de Neublastina variable está dentro de la experiencia y juicio clínico de los médicos. Típicamente, el régimen de administración es establecido por ensayos clínicos que pueden establecer parámetros de administración óptimos. Sin embargo, el médico especialista puede hacer variar tales regímenes de administración de acuerdo con la edad, la salud, el peso, el sexo y el estado médico del sujeto. La frecuencia de la dosificación también puede variar entre tratamientos agudos y crónicos para neuropatía. Además, la frecuencia de la dosificación se puede hacer variar dependiendo de que si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Métodos de Tratamiento Los polipéptidos de Neublastina variables son útiles para modular el metabolismo, el crecimiento, la diferenciación, o la supervivencia de una célula nerviosa o neuronal. En particular, los polipéptidos de Neublastina variables pueden ser utilizados para tratar o aliviar un trastorno o enfermedad, de un animal viviente, por ejemplo, un ser humano, tal trastorno o enfermedad se activa en respuesta a la actividad de un agente neurotrófico. Los polipéptidos de Neublastina variables descritos aquí (y las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos) pueden ser utilizados en los métodos para el tratamiento de un trastorno caracterizado por el daño a las neuronas sensoriales o las células de los ganglios retínales, incluyendo las neuronas en los ganglios de la raíz dorsal o en cualquiera de los siguientes tejidos: los ganglios geniculado, petrosal y nodoso; el complejo vestibuloacústico del octavo nervio craneal; el polo ventrolateral del lóbulo maxilomandibular del ganglio trigeminal; y el núcleo trigeminal mesencefálico. En algunas modalidades, se pueden tratar las neuronas del sistema sensorial y/o autónomo. En particular, se pueden tratar las neuronas nociceptivas y mecanorreceptivas, más particularmente las neuronas de la fibra A-delta, la fibra C y la fibra A-beta. Además, las neuronas del sistema simpático y parasimpático del sistema autónomo pueden ser tratadas. En algunas modalidades, las enfermedades de las neuronas motoras tales como la esclerosis lateral amiotrófica ("ALS" (por sus siglas en inglés)) y la atrofia músculo-espinal pueden ser tratadas. En otras modalidades, los polipéptidos de Neublastina variables pueden ser utilizados para mejorar la recuperación nerviosa después de la lesión traumática. Alternativamente, o de manera adicional, un canal para la guía de los nervios con una matriz que contiene polipéptidos de Neublastina conjugados con un polímero, o la fusión o los conjugados de los polipéptidos de Neublastina mutados, pueden ser utilizados. Tales canales para la guía de los nervios son descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos de América No. 5,834,029. En algunas modalidades, los polipéptidos de Neublastina variables (y las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos) son utilizados en el tratamiento de varios trastornos de los ojos, incluyendo la pérdida de fotorreceptores en la retina en los pacientes afligidos con la degeneración macular, retinitis pigmentosa, glaucoma, y enfermedades semejantes. En algunas modalidades, los polipéptidos de Neublastina variables (y las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos) son utilizados para el tratamiento del dolor neuropático, para el tratamiento de la alodinia táctil, para reducir la pérdida de sensibilidad del dolor asociada con la neuropatía, para el tratamiento de infecciones virales y las neuropatías asociadas virales, para el tratamiento de la neuropatía diabética dolorosa, y para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso. Los métodos son descritos con detalle en las siguientes subsecciones . 1. Tratamiento del Dolor Neuropático Los polipéptidos de Neublastina variables descritos aquí (y las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos) pueden ser utilizados en los métodos para el tratamiento del dolor neuropático en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva de un polipéptido de Neublastina variable ya sea solo, o también por la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un compuesto inductor de la analgesia seleccionado del grupo que consiste de opioides, anti-arrítmicos, analgésicos tópicos, anestésicos locales, anticonvulsivos, antidepresivos, corticosteroides y fármacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAIDS (por sus siglas en inglés) ) . En una modalidad, el compuesto inductor de la analgesia es un anticonvulsivo. En otra modalidad, el compuesto inductor de la analgesia es la gabapentina (ácido (1-aminometil) ciciohexano acético) o la pregabalina (ácido S- (+) -4-amino-3- (2-metilpropil) butanoico) . Los polipéptidos de Neublastina variables descritos aquí (y las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos) pueden ser utilizados en el tratamiento del dolor asociado con las neuropatías periféricas. Entre las neuropatías periféricas que pueden ser tratadas están las neuropatías inducidas por el trauma, por ejemplo, aquellas provocadas por la lesión física o un estado de enfermedad, el daño físico al cerebro, el 'daño físico a la médula espinal, los ataques asociados con el daño al cerebro, y los trastornos neurológicos relacionados con la neurodegeneración . Los polipéptidos de Neublastina variables descritos aquí (y las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos) pueden ser utilizados én el tratamiento de un número de neuropatías periféricas, incluyendo: a) neuropatías inducidas por un trauma, b) neuropatías inducidas por quimioterapia, (c) neuropatías inducidas por toxina (incluyendo pero sin estar limitadas a neuropatías inducidas por alcoholismo, intoxicación con vitamina B6, intoxicación con hexacarbonos, amiodarona, cloranfenicol, disulfiram, isoniazida, oro, litio, metronidazol, misonidazol, nitrofurantoína) , (d) neuropatías inducidas por un fármaco, incluyendo el dolor neuropático inducido por un fármaco terapéutico (tal como el provocado por agentes anti-cáncer, particularmente agentes anti-cáncer seleccionados del grupo que consiste de taxol, taxótero, cisplatina, nocodazol, vincristina, vindesina y vinblastina; y tal como el provocado por agentes anti-virales, particularmente agentes antivirales seleccionados del grupo que consiste de ddl, DDC, d4T, foscarnet, dapsona, metronidazol, e isoniacida) , (e) neuropatías inducidas por una deficiencia de vitaminas (incluyendo pero sin estar limitadas a la deficiencia de la vitamina B12 , la deficiencia de la vitamina B6, y la deficiencia de la vitamina E) , (f) neuropatías idiopáticas, (g) neuropatías diabéticas, (h) daño nervioso inducido por patógenos, (i) daño nervioso inducido por inflamación, (j) neurodegeneración, (k) neuropatía hereditaria (incluyendo pero sin estar limitada a ataxia de Friedreich, polineuropatía amiloide familiar, enfermedad de Tangier, enfermedad de Fabry) , (1) trastornos metabólicos (incluyendo pero sin estar limitados a insuficiencia renal e hipotiroidismo) , (m) neuropatías infecciosas y virales (incluyendo pero sin estar limitadas a dolor neuropático asociado con la lepra, enfermedad de Lyme, dolor neuropático asociado con la infección provocada por un virus, particularmente un virus seleccionado del grupo que consiste de un virus del herpes (por ejemplo, herpes Zoster que puede conducir a neuralgia post-herpética) , un virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , y un virus de papiloma) , (n) neuropatías auto-inmunes (incluyendo pero sin estar limitadas al síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía desmielinante inflamatoria crónica, gamopatía monoclonal de significado indeterminado y polineuropatía) , (o) neuralgia trigeminal y síndromes de captura (incluyendo pero sin estar limitado al túnel de Carpel) , y (p) otros síndromes de dolor neuropático incluyendo neuralgia post-traumática, el dolor de extremidad fantasma, dolor de esclerosis múltiple, síndromes de dolor regional complejo (incluyendo pero sin estar limitados a distrofia simpática de reflejo, causalgia) , dolor asociado con neoplasia, neuropatía vasculítica/angiopática, y ciática. El dolor neuropático puede ser manifestado como alodinia, hiperalgesia, dolor espontáneo o dolor por extremidad fantasma . 2. Tratamiento de la Alodinia Táctil Los polipéptidos de Neublastina variables descritos aquí (y las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos) pueden ser utilizados en el tratamiento de la alodinia táctil en un sujeto. El término "alodinia táctil" típicamente se refiere a la condición de un sujeto en donde el dolor es evocado por la estimulación de la piel (por ejemplo por el tacto), que normalmente es inocuo. En algunas modalidades, la alodinia táctil es tratada por la administración al sujeto de una cantidad efectiva farmacéuticamente de un polipéptido de Neublastina variable. En una modalidad relacionada, la alodinia táctil puede ser tratada por la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un polipéptido de Neublastina variable ya sea solo, o por la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un polipéptido de Neublastina variable con una cantidad efectiva de un compuesto inductor de la analgesia seleccionado del grupo que consiste de opioides, anti-arrítmicos, analgésicos tópicos, anestésicos locales, anticonvulsivos, antidepresivos, corticosteroides y NSAIDS. En una modalidad, el componente inductor de la analgesia es un anticonvulsivo. En otra modalidad preferida, el compuesto inductor de la analgesia es la gabapentina (ácido (1-aminometil) ciciohexano acético) o pregabalina (ácido S-(+)-4-amino-3- (2-metilpropil)butanoico) . En algunas modalidades, un polipéptido de Neublastina variable es administrado en asociación con un agente terapéutico, incluyendo pero sin estar limitado a un agente anti-cáncer o un agente anti-viral. Los agentes anti-cáncer incluyen, pero no están limitados a, taxol, taxótero, cisplatina, nocodazol, vincristina, vindesina y vinblastina. Los agentes anti-virales incluyen, pero no están limitados a, ddl, DDC, d4T, foscarnet, dapsona, metronidazol, e isoniazida. 3. Tratamiento para la Reducción de la Pérdida de Sensibilidad al Dolor En otra modalidad, los polipéptidos de Neublastina variables descritos aquí (y las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos) pueden ser utilizados en un método para reducir la pérdida de sensibilidad al dolor en un sujeto afligido con una neuropatía. En una modalidad, la neuropatía es la neuropatía diabética. En algunas modalidades, la pérdida de sensibilidad al dolor es la pérdida en la sensibilidad al dolor térmico. Este método incluye el tratamiento tanto profiláctico como terapéutico. En el tratamiento profiláctico, un polipéptido de Neublastina variable es administrado a un sujeto que está en riesgo de desarrollar la pérdida de sensibilidad al dolor (tal sujeto se podría esperar que sea un sujeto con una neuropatía en la etapa inicial) . El tratamiento con un polipéptido de Neublastina variable bajo tales circunstancias podría servir para tratar a los pacientes que están en riesgo de manera preventiva . En el tratamiento terapéutico, un polipéptido de Neublastina variable es administrado a un sujeto que ha experimentado la pérdida de sensibilidad al dolor como resultado de la aflicción con una neuropatía (tal sujeto se podría esperar que sea un sujeto con una neuropatía en la etapa final) . El tratamiento con un polipéptido de Neublastina variable bajo tales circunstancias podría servir para rescatar la sensibilidad al dolor, apropiada, en el sujeto. 4. Tratamiento de Infecciones Virales y Neuropatías Asociadas con las Infecciones Virales El tratamiento profiláctico de las neuropatías infecciosas y virales está contemplado. El tratamiento profiláctico está indicado después de la determinación de la infección viral y antes del inicio del dolor neuropático. Durante el tratamiento, un polipéptido de Neublastina variable es administrado para prevenir la aparición del dolor neuropático incluyendo pero sin estar limitado al dolor neuropático asociado con la lepra, la enfermedad de Ly e, el dolor neuropático asociado con la infección por un virus, particularmente un virus seleccionado del grupo que consiste de un virus del herpes (y más particularmente por un virus del herpes Zoster, que puede conducir a neuralgia post-herpética) , un virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , y un virus de papiloma. En una modalidad alternativa, un polipéptido de Neublastina variable es administrado para reducir la severidad del dolor neuropático, en el caso de que el mismo aparezca. Los síntomas de la infección viral aguda frecuentemente incluyen la aparición de un salpullido. Otros síntomas incluyen, por ejemplo, el desarrollo del dolor persistente en el área afectada del cuerpo, que es una complicación común de una infección por herpes Zoster (herpes) . La neuralgia post-herpética puede durar un mes o más, y puede aparecer varios meses después de que cualesquiera síntomas semejantes al salpullido han desaparecido . 5. Tratamiento de la Neuropatía Diabética Dolorosa El tratamiento profiláctico de la neuropatía diabética dolorosa está contemplado. El tratamiento profiláctico de las neuropatías diabéticas podría comenzar después de la determinación del diagnóstico inicial de la diabetes o los síntomas asociados con la diabetes y antes del inicio del dolor neuropático. El tratamiento profiláctico de la neuropatía diabética dolorosa también puede comenzar durante la determinación de que un sujeto está en riesgo de desarrollar diabetes o síntomas asociados con la diabetes. Durante el tratamiento, un polipéptido de Neublastina variable es administrado para prevenir la aparición del dolor neuropático. En una modalidad alternativa, un polipéptido de Neublastina variable es administrado para reducir la severidad del dolor neuropático que ya ha aparecido. 6. Tratamiento de los Trastornos del Sistema Nervioso Los polipéptidos de Neublastina variables descritos aquí (y las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos) pueden ser utilizados en el tratamiento o prevención de un trastorno del sistema nervioso en un sujeto (tal como un ser humano) , por la administración a un sujeto que tenga la necesidad del mismo de una cantidad efectiva terapéuticamente de un polipéptido de Neublastina variable, una composición que contiene un polipéptido de Neublastina variable, o un complejo que incluye un polipéptido de Neublastina variable, conjugado, soluble, acuoso, estable, acoplado a una porción de polialquileno tal como, por ejemplo, PEG. El trastorno del sistema nervioso puede ser un trastorno del sistema nervioso periférico, tal como una neuropatía periférica o un síndrome de dolor neuropático. Los seres humanos son los sujetos preferidos para el tratamiento. Un polipéptido de Neublastina variable es útil para el tratamiento de un defecto en una neurona, incluyendo sin limitación las neuronas lesionadas y las neuronas traumatizadas. Los nervios periféricos que experimentan traumas incluyen, pero no están limitados a los nervios de la médula o de la espina dorsal. Los polipéptidos de Neublastina variables son útiles en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, el daño neuronal isquémico cerebral; neuropatía, por ejemplo, neuropatía periférica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) . Tales polipéptidos de Neublastina variables pueden ser utilizados en el tratamiento de la memoria dañada, por ejemplo, el daño de la memoria asociado con la demencia. Los siguientes son ejemplos de la práctica de la invención. Los mismos no van a ser interpretados como limitativos del alcance de la invención de ninguna manera. Ejemplos Ejemplo 1: Diseño y Síntesis de Polipéptidos de Neublastina Variables La Neublastina humana fue cristalizada y su estructura reveló una tríada de iones de sulfato que interactúan con los siguientes cuatro residuos de Neublastina en proximidad estrecha entre sí: Argl4, Arg48, Arg49 y Arg51. Basado en la presencia de esta tríada y su espaciado relativo entre sí, se postuló que esta región de Neublastina podría ser un dominio de aglutinación del sulfato de la heparina, potencial. Subsiguientemente, una estructura de sulfato de heparina resulta previamente fue registrada (en sílice) son respecto a la Neublastina en el sitio de la tríada del sulfato. El sulfato de heparina se ajusta de manera precisa en esta posición, sugiriendo que esta región dentro de la Neublastina tiene el potencial para la aglutinación del sulfato de heparina. Los datos de cristalización de la Neublastina también revelaron que los siguientes residuos de aminoácidos proporcionan interacciones suplementarias con ya sea la tríada de iones sulfato o con uno o más de tres de los otros iones sulfato que interactúan con la Neublastina: Ser 46, Ser 73, Gly 72, Arg 39, Gln 21, Ser 20, Arg 68, Arg 33, His 32, y Val 94. Además de los sitios de aglutinación del sulfato revelados por la estructura cristalina, la Neublastina contiene una secuencia de consenso del sitio de aglutinación del sulfato de heparina (GPGSRAR) en los residuos 3-9 en su terminación N. Esta región no fue estructurada en la estructura cristalina pero puede llegar a ser ordenada durante la aglutinación de los glucosaminoglicanos . La región es probable que se cierre en su espacio hasta los grupos de tres sulfatos observados en la estructura cristalina (Argl4 contribuye al sitio de aglutinación de la heparina que está centrado principalmente en la región de articulación de la proteína) . Para investigar la relevancia biológica del dominio de aglutinación del sulfato de heparina potencial, se hacen tres substituciones de residuos de aminoácidos únicas, individuales, dentro de la Neublastina humana de 113 aminoácidos, madura (SEC ID NO:l). Los residuos de arginina en cada neurona de la posición 48 (variante llamada "Arg48E"; SEC ID N0:2), la posición 49 (variante llamada "Arg49E"; SEC ID N0:3), y la posición 51 (variante llamada "Arg5lE"; SEC ID NO: 4) fueron reemplazadas por el glutamato (es decir, tres diferentes construcciones variables de un solo aminoácido fueron preparadas) con la intención de cambiar la carga del residuo desde una que podría atraer el sulfato hasta una que podría repelerlo, y para estabilizar potencialmente los residuos de arginina circundantes. Las proteínas se volvieron a plegar y se purificaron a partir de los cuerpos de inclusión de E. Coli. (véase WO 04/069176). Cada variante de Neublastina fue sometida a análisis para verificar la integridad estructural y para confirmar la substitución del residuo correcto. La totalidad de los tres mutantes fueron comparables estructuralmente con la Neublastina humana del tipo silvestre. Ejemplo 2: Cromatografía de Heparina Sepharose y Catiónica Los polipéptidos de Neublastina variables fueron sometidos a análisis bioquímico adicional para determinar el efecto que cada mutación tuvo sobre la aglutinación de la heparina. La cromatografía catiónica y de Heparina Sepharose fueron ambas empleadas. Puesto que la Neublastina humana del tipo silvestre es una proteína básica con una pl aparente de 11.31, la Neublastina se aglutina eficientemente a las resinas de base catiónica. Una conversión única de arginina a glutamato reduce la pl aparente a 10.88. Sin embargo, esta pl inferior no se espera que altere dramáticamente la aglutinación de la resina catiónica ni se espera que altere el perfil de elución de los mutantes comparado con aquel del control del tipo silvestre. Cada uno de los mutantes (en compañía del control de Neublastina del tipo silvestre) fue sometido a cromatografía catiónica. Las muestras fueron cargadas sobre la resina en un amortiguador que contiene fosfato 5 mM de pH 6.5 y cloruro de sodio 150 mM seguido por elución con un gradiente de sal lineal que empieza en 150 M y que finaliza con cloruro de sodio 1M. La Neublastina del tipo silvestre eluyó en cloruro de sodio (800 mM (figura 2A; pico D) ; mientras que cada uno de tres mutantes eluyó dentro de un intervalo de la sal de aproximadamente 500 mM, reflejando así su pl inferior. Arg49E y Arg51E (figura 2A; picos B y C) eluyeron con una sal ligeramente más elevada que la que fue requerida para eluir Arg48E (figura 2A; pico A) (520 mM contra 490 mM, respectivamente) . Esta diferencia sugirió que Arg48 es más accesible superficialmente y contribuye más a la aglutinación catiónica que aquella de las otras dos mutaciones. Para determinar si las substituciones de Arg hasta Glu tienen un efecto sobre la aglutinación de la heparina, cada uno de los tres mutantes (en compañía de la Neublastina humana del tipo silvestre) fue sometido a cromatografía de Heparina Sepharose (figura 2B) . Las condiciones de aglutinación y elución fueron semejantes a aquellas utilizadas para la cromatografía catiónica. Sin embargo, el perfil de elución observado fue significativamente diferente del perfil de elución de la resina catiónica. La Neublastina del tipo silvestre eluyó en aproximadamente 720 mM de cloruro de sodio (figura 2B; pico H) mientras que Arg5lE, Arg49E, y Arg48E eluyeron a 570 mM (figura 2B; pico G) , 510 mM (figura 2B; pico F) , y 450 mM (figura 2B; pico E) del cloruro de sodio, respectivamente. Arg48E parece que tiene un efecto particularmente dramático sobre la aglutinación a la heparina. Tomados juntos, estos perfiles cromatográficos sugieren que cada mutación reduce la afinidad aparente de Neublastina hacia la heparina. Ejemplo 3: Cromatografía Aniónica A las condiciones de pH estándares de 6.5 y una concentración de cloruro de sodio de 150 mM, la Neublastina no se aglutina a las resinas aniónicas. En contraste, el sulfato de heparina no se aglutina a las resinas aniónicas bajo estas mismas condiciones. Cuando la Neublastina fue premezclada a una proporción molar de 1:1 con sulfato de heparina de 16 kDa y se aplicó a una matriz aniónica utilizando las condiciones anteriores, la Neublastina unida y eluida con cloruro de sodio 600 mM (figura 3B, fajas marcadas como "FT"), sugirieron que la Neublastina se estuvo aglutinando a la matriz aniónica por medio de su interacción con sulfato de heparina. En la ausencia de heparina, la Neublastina no se aglutina a la resina aniónica (figura 3A, fajas marcadas como "FT") y nada de Neublastina eluyó con cloruro de sodio 600 mM (figura 3A, fajas marcadas "elución"). Estos datos proporcionan evidencia adicional de la capacidad de la Neublastina para aglutinarse a la heparina. Ejemplo 4: Estudios de Aglutinación de las Células de los Ovarios del Hámster Chino La Neublastina se ha mostrado previamente que se aglutina no específicamente a la superficie de las células de los ovarios del hámster chino (CHO) . Un ensayo de aglutinación de las células de CHO de Neublastina fue establecido para determinar si esta interacción está mediada, al menos en parte, por medio de la aglutinación de la Neublastina a las moléculas de sulfato de heparina superficiales de la célula. La Neublastina humana del tipo silvestre (40 ug) o el mutante de Arg48E fueron premezclados con las células de CHO (106 células) a una densidad celular que se aglutina completamente a ambas formas de Neublastina en compañía de cantidades crecientes de sulfato de heparina de 16 kDa y se incubaron a 37 °C durante 4 horas. Después de la incubación, las células fueron convertidas en pelotillas por centrifugación y la Neublastina no unida restante en el sobrenadante fue sometida a análisis de SDS/PAGE. Después de la cuantificación de cada banda de proteína por densitometría, el valor de la densidad óptica resultante fue graficado contra la concentración de la heparina en cada muestra (figura 4) . En las dos concentraciones de heparina inferiores, las formas de Neublastina tanto del tipo silvestre como mutante tuvieron iguales cantidades de proteína identificada en el sobrenadante. Sin embargo, cuando la concentración de la heparina se incrementó a 0.5 ug/ml y más elevada, una cantidad mayor de Neublastina del tipo silvestre fue identificada en el sobrenadante que aquella del mutante de Arg48E. Esta observación sugirió que la heparina puede competir con la heparina unida a la superficie celular para la aglutinación de la Neublastina del tipo silvestre (es decir, la aglutinación de la heparina a la Neublastina del tipo silvestre conduce a su eliminación de la superficie celular) , mientras que la heparina no puede competir tan fácilmente fuera del mutante de Arg48E. A una concentración de heparina más elevada (50 ug/ml), el mutante de Arg48E empieza a eluir fuera de la superficie celular, sugiriendo que una interacción iónica entre la heparina y el mutante de Arg48E podría ser responsable de esta observación.

Ejemplo 5: Aglutinación de Heparina de la Neublastina del Tipo Silvestre y Polipéptidos de Neublastina Variable Para investigar adicionalmente el papel de la tríada de argininas identificadas como un sitio de aglutinación de la heparina de la Neublastina, se estableció un ensayo de ELISA de aglutinación a la heparina. En resumen, un anticuerpo monoclonal de anti- Neublastina fue recubierto sobre una placa de 96 cavidades, seguido por el lavado y la adición de una de las formas de Neublastina. La heparina biotinilada fue agregada entonces a la placa. Después de una etapa de lavado adicional, el complejo de Neublastina/heparina fue identificado utilizando un conjugado de Estreptavidina-HRP con un substrato quimioluminiscente. Este ensayo de ELISA de aglutinación de heparina fue utilizado para comparar la forma de 113 aminoácidos de Neublastina humana del tipo silvestre (SEC ID NO:l) y la forma de 104 aminoácidos (aminoácidos 10-113 de la (SEC ID NO:l) con respecto a los polipéptidos de Neublastina variables que contienen una substitución de un solo aminoácido (Arg48E, Arg49E, y Arg5lE; SEC ID NOS: 2-4) así como una doble substitución (Arg48,49E; SEC ID NO:5). Ambas formas del tipo silvestre de la Neublastina se aglutinaron a la heparina con una EC50 de (1* ng/ml de heparina (figura 5) . La Arg49E y Arg51E se aglutinan menos eficientemente, con una EC50 aparente de (10 ng/ml, pero la aglutinación máxima permaneció idéntica (figura 5) . De las mutaciones de tres puntos únicos, la Arg48E tuvo el efecto más dramático sobre la aglutinación de la heparina, con una EC50 aparente de (100 ng/ml, pero todavía logró el mismo valor de aglutinación de heparina máximo cuando se compara con las formas de Neublastina no modificadas (figura 5). El mutante de Arg48E fue así cien veces menos eficiente en la aglutinación a la heparina cuando se compara con las formas de Neublastina no modificadas y diez veces menos eficiente cuando se compara con los otros mutantes de una sola substitución. Cuando tanto la Arg48 como la Arg49 fueron substituidas con el glutamato, la aglutinación de la heparina fue casi eliminada, conduciendo a una reducción de siete veces en la aglutinación de la heparina máxima, pero la EC50 permaneció dentro del intervalo de los mutantes de un solo punto. Estos resultados sugieren que la Arg48 desempeña un papel importante en la aglutinación de la heparina debido a su localización central en el sitio de aglutinación de heparina supuesto. Ejemplo 6: Análisis de Activación del Receptor de Cinasa de los Mutantes de Aglutinación de Heparina y de Neublastina del Tipo Silvestre Para determinar si las mutaciones del sitio de aglutinación de la heparina tienen un efecto sobre la señalización del receptor de Neublastina en un bioensayo a base de células, las formas de Neublastina mutantes en compañía de la Neublastina del tipo silvestre fueron sometidas al Análisis de Activación del Receptor de Cinasa (KIRA) . Cada uno de los mutantes de substitución de Arg hasta Glu únicos, parecieron idénticos al control no modificado con respecto a la actividad de KIRA, sugiriendo que estos mutantes son estructuralmente semejantes al del tipo silvestre y son capaces de activar el receptor de Neublastina y la cascada de señalización (figura 6) . Además, estos datos sugieren que la aglutinación de heparina a la Neublastina puede no ser requerida para la activación del receptor. Cuando el doble mutante de Arg48,49E (SEC ID NO: 5; forma de 113 aminoácidos) fue sometido al análisis de KIRA, su EC50 aparente fue desplazada a la izquierda en aproximadamente un orden de magnitud con un incremento en su activación máxima del receptor cuando se compara con el control de Neublastina humana del tipo silvestre (figura 7A) . De manera semejante, el doble mutante de Arg48,49E (SEC ID NO: 7; forma de 104 aminoácidos) también exhibió una potencia incrementada cuando se compara con la Neublastina del tipo silvestre (figura 7B) . Cada uno de los dobles mutantes de Arg48,51E y Arg49,5lE (SEC ID NO : 9 y (SEC ID NO: 8, respectivamente; formas de 113 aminoácidos) pareció semejante al control de Neublastina no modificado con respecto a la actividad de KIRA (figura 7B) . Ejemplo 7: Análisis Complejo Ternario La Neublastina humana del tipo silvestre y cada uno de los mutantes de heparina fueron sometidos al análisis complejo ternario utilizando dos protocolos ligeramente diferentes. El primer protocolo combinó los componentes del receptor de Neublastina (GFRalfa3 y RET) en compañía de la Neublastina en una agrupación antes de la adición a una placa de ELISA recubierta con el anticuerpo de captura (figura 8) . El segundo protocolo agregó estos componentes secuencialmente a una placa de ELISA con el GFRalfa3 agregado primero, seguido por Neublastina, y luego RET (figura 9) . Cuando los componentes fueron agregados conjuntamente como una agrupación, la aglutinación máxima fue lograda tanto como Arg48E como Arg48,49E, sugiriendo que estas formas de Neublastina tuvieron una afinidad más elevada hacia su receptor. La Neublastina del tipo silvestre parece que se aglutina con una afinidad semejante a aquella del mutante de Arg49E, mientras que la Arg5lE y un mutante triple (Arg48, 49 y 51 todas substituidas con glutamato) demostró una aglutinación más débil al receptor. Cuando los componentes del receptor fueron agregados secuencialmente, la Arg48E mostró la mejor aglutinación al receptor. Sin embargo, bajo estas condiciones, el doble mutante se aglutinó débilmente a su receptor con una afinidad que parecía semejante a la del mutante de Arg5lE. Arg49E y la Neublastina del tipo silvestre tuvieron una afinidad hacia el receptor que estuvo a la mitad del camino entre la aglutinación máxima y mínima observadas . El mutante triple no se aglutinó bajo estas condiciones. En total, estos datos sugieren que la Arg48 desempeña un papel oscilante en la afectación de la afinidad de la Neublastina hacia su receptor. Ejemplo 8: Análisis de CD de UV Próximo y Lejano Para investigar adicionalmente los efectos de las dobles mutaciones sobre la estructura secundaria y terciaria de la Neublastina, el doble mutante de Arg48,49E fue sometido a análisis de CD de UV tanto próximo como lejano. Aunque se detectaron diferencias sutiles en las estructuras secundaria y terciaria, la conformación del doble mutante fue muy cercana a aquella de la Neublastina del tipo silvestre. Ejemplo 9: Análisis Fármacocinético del Doble Mutante de Arg48,49E de Neublastina La Neublastina humana exhibe características farmacocinéticas pobres (PK) cuando es administrada a las ratas intravenosamente (IV) o subcutáneamente (SC) , con una biodisponibilidad total de menos de 1 % . La depuración a base de heparina puede ser una de las razones para esta biodisponibilidad baja. Para determinar si la depuración a base de heparina participa en la depuración rápida de la Neublastina humana de la rata, el doble mutante de Arg48,49E (en compañía del control del tipo silvestre) fue sometido a análisis de PK. Ambas formas fueron administradas separadamente en las ratas a 7 mg/kg SC. Las muestras del suero fueron colectadas empezando en 1 hora, se completaron a las 96 horas, y se analizaron para verificar la Neublastina (figura 10) . El área bajo la curva observada (AUC) para la Neublastina del tipo silvestre fue de -109 mientras que la AUC observada para el doble mutante fue de 20,145. Esto representó un incremento de 185 veces en AUC para el doble mutante (comparado con la Neublastina del tipo silvestre) y un incremento significativo en la exposición del suero. Tanto la Neublastina de doble mutante como la del tipo silvestre también fueron sometidas al análisis de PK después de la administración IV (1 mg/kg) . La concentración del plasma inicial del doble mutante fue aproximadamente seis veces más elevada (diamantes) que aquella del control del tipo silvestre (cuadrados) a los cinco minutos después de la inyección pero se aproximó rápidamente a los niveles del tipo silvestre dentro del transcurso de una hora (figura 11) . Estos datos sugieren que la doble mutación de la Neublastina ayuda a incrementar la exposición del suero pero no afecta la velocidad de depuración total.

Tomado junto con la observación de SC, la aglutinación de la heparina parece que va a ser especialmente relevante después de la administración SC, quizás conduciendo a un efecto semejante a un depósito. Una vez que la Neublastina entra en circulación, la velocidad a la cual las moléculas del tipo silvestre y de mutantes dobles son depuradas, aproximadamente es la misma. Para saber la velocidad a la cual la Neublastina es depurada de la circulación en la rata, las formas tanto del tipo silvestre como de mutante doble de la Neublastina fueron PEGiladas con PEG de 10 kDa utilizando la química de acoplamiento a base de SPA. Puesto que la Neublastina es un homo-dímero sin residuos de lisina naturales, las porciones de 10 kDa son etiquetadas específicamente en la terminación amino de cada monómero. La Neublastina de doble mutante, humana, PEGilada de 2X10K fue purificada hasta la homogeneidad, y se somete al análisis estructural y biológico previo al análisis de PK. El doble mutante de Arg48,49E de PEG de 2X10K fue inyectado ya sea IV (1 mg/kg) o SC (7 mg/kg) en las ratas y el suero se colectó en varios instantes del tiempo para el análisis. Después de la administración IV, el doble mutante de PEG 2X10K logró la Cmax teórica de 10 ug/ml (diamantes) con las fases alfa y beta típicas (figura 12). La administración SC del doble mutante PEGilado demostró una Cmax de 40 ng/ml a las 24 horas de la inyección (figura 12) . Una vez que el fármaco alcanzó la circulación, la velocidad aparente de depuración fue paralela a aquella de la dosis IV. La biodisponibilidad de esta construcción fue de aproximadamente 10 % comparada con menos de 1 % para la Neublastina humana del tipo silvestre PEGilada o no PEGilada. Ejemplo 10: Expresión de un Mutante de Aglutinación a la Heparina de Neublastina en la Célula de los Ovarios del Hámster Chino Las construcciones del plásmido que codifican la Neublastina mutante y del tipo silvestre fueron expresadas en las células CHO y la cantidad de la proteína soluble secretada fue medida por ELISA. Las construcciones del plásmido utilizadas en estos experimentos codificaron una proteína de fusión que contiene el péptido de la señal de la hormona del crecimiento humana (SigPep) (con o sin un intrón incluido en el plásmido) fusionado a: i) los 104 aminoácidos carboxi terminales de la Neublastina humana del tipo silvestre, o (ii) el doble mutante de Arg48,49E (forma de 104 aminoácidos) . Las siguientes son secuencias de aminoácidos de las proteínas fusión de Neublastina utilizadas en estos experimentos. Las secuencias de Neublastina están escritas con letras mayúsculas. Las secuencias del péptido de la señal de la hormona del crecimiento están escritas con minúsculas.

La unión del péptido de la señal y de las secuencias de Neublastina está indicada con un quilate ( ) . Los aminoácidos en las posiciones 48 y 49 están subrayados. SigPep-NBN (tipo silvestre) : matgsrtslllafgllclswlqe gsaAAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGA LRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG (SEC ID NO: 13) . SigPep-NBN (Arg48,49E): matgsrtslllafgllclswlqegsa?A AGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCEEARSPHDLSLASLLGAGALRPPP GSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG (SEC ID NO: 14). Las células de CHO fueron transfectadas con los plásmidos que codifican cada una de las formas precedentes de Neublastina y se cultivaron en placas de 384 cavidades. Después de varias semanas, las cavidades que contuvieron las células en crecimiento fueron transferidas a placas de cultivo de 96 cavidades frescas. El medio acondicionado fue analizado por ELISA para medir la concentración de la Neublastina soluble. Los datos de absorbancia acumulativa para cada plásmido probado (valor promedio con una desviación estándar como barras de error) fueron detectados. La transfección de las células de CHO con los plásmidos que codifican el doble mutante de Arg48,49E condujo a un número incrementado significativamente de líneas celulares que exhiben niveles de expresión elevada de la proteína recombinante, cuando se compara con las células transfectadas con los plásmidos que codifican la Neublastina del tipo silvestre (figura 13). Las líneas celulares delanteras de cada transfección fueron expandidas adicionalmente. Los números fijos de las células fueron cultivados durante tres días y se determinaron el conteo de células totales, la viabilidad, y la concentración. Las concentraciones de Neublastina expresadas de las líneas celulares de doble mutante de Arg48,49E delanteras fueron aproximadamente cinco veces más grandes que aquellas de una línea celular de Neublastina del tipo silvestre (figura 14) . Otras Modalidades Aunque la invención ha sido descrita en conjunción con la descripción detallada de la misma, la descripción precedente está propuesta para ilustrar y no para limitar el alcance de la invención, el cual está definido por el alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance en las siguientes reivindicaciones . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un polipéptido, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 1, en donde la secuencia de aminoácidos comprende al menos una substitución de aminoácido, con relación a la SEC ID NO: 1, seleccionada del grupo que consiste de: un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 48 de la SEC ID NO: 1; un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 49 de la SEC ID NO: 1; y un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 51 de la SEC ID NO: 1, en donde el polipéptido, cuando está dimerizado, se aglutina a un complejo que contiene GFRalfa3 y RET.
2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos comprende un aminoácido diferente que la arginina en la posición correspondiente a la posición 48 de la SEC ID NO: 1.
3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 48 de la SEC ID NO: 1 está substituido con un residuo de aminoácido no conservador.
4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 48 de la SEC ID NO: 1 está substituido con ácido glutámico.
5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos comprende un aminoácido diferente que la arginina en la posición correspondiente a la posición 49 de la SEC ID NO: 1.
6. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 49 de la SEC ID NO: 1 está substituido con un residuo de aminoácido no conservador.
7. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 49 de la SEC ID NO: 1 está substituido con ácido glutámico.
8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos comprende un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 51 de la SEC ID NO : 1.
9. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 51 de la SEC ID NO: 1 está substituido con un residuo de aminoácido no conservador.
10. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 51 de la SEC ID NO: 1 está substituido con ácido glutámico.
11. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos comprende los aminoácidos diferentes que la arginina en las posiciones correspondientes a la posición 48 y la posición 49 de la SEC ID NO : 1.
12. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 48 y el residuo de arginina en la posición 49 de la SEC ID NO : 1 están substituidos con residuos de aminoácidos no conservadores .
13. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 48 y el residuo de arginina en la posición 49 de la SEC ID NO: 1 están substituidos cada uno con ácido glutámico.
14. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos 90 % idéntica con respecto a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 1.
15. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos 95 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 1.
16. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos 98 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 1.
17. Un polipéptido, caracterizado porque comprende los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 2, los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO : 3, los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 4, los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 5, los aminoácidos de la 15-113 de la SEC ID NO: 8, o los aminoácidos de 15-113 de la SEC ID NO: 9.
18. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende los aminoácidos 10-113 de la SEC ID NO : 2, los aminoácidos 10-113 de la SEC ID NO: 3, los aminoácidos 10-113 de la SEC ID NO: 4, los aminoácidos 10-113 de la SEC ID NO: 5, los aminoácidos 10-113 de la SEC ID NO: 8, o los aminoácidos 10-113 de la SEC ID NO: 9.
19. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 8, o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 9.
20. Un dímero caracterizado porque comprende dos polipéptidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
21. Un conjugado, caracterizado porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 19, conjugado con un polímero que no está presente de manera natural .
22. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y una secuencia de aminoácidos heterólogos.
23. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, el dímero de conformidad con la reivindicación 20, el conjugado de conformidad con la reivindicación 21, o la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 22 y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
24. Un ácido nucleico, caracterizado porque comprende una secuencia que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
25. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 24.
26. Una célula, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 25.
27. Un método de fabricación de un polipéptido, caracterizado porque comprende: proporcionar la célula de conformidad con la reivindicación 26, y cultivar la célula bajo condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico.
28. Un método de tratamiento o prevención de un trastorno del sistema nervioso en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 23.
29. Un método de tratamiento del dolor neuropático en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 23.
30. Un método de activación del receptor de RET en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, el dímero de conformidad con la reivindicación 20, el conjugado de conformidad con la reivindicación 21, la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 22, o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 23.
31. Un polipéptido, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 1, en donde la secuencia de aminoácidos comprende al menos una substitución de aminoácido, con relación a la SEC ID NO: 1, seleccionado del grupo que consiste de: un aminoácido diferente de la serina en la posición correspondiente a la posición 20 de la SEC ID NO: 1; •un aminoácido diferente de la glutamina en la posición correspondiente a la posición 21 de la SEC ID NO: 1 ; un aminoácido diferente de la histidina en la posición correspondiente a la posición 32 de la SEC ID NO: 1; un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 33 de la SEC ID NO: 1; un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 39 de la SEC ID NO: 1; un aminoácido diferente de la serina en la posición correspondiente a la posición 46 de la SEC ID NO: 1; un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 68 de la SEC ID NO: 1; un aminoácido diferente de la glicina en la posición correspondiente a la posición 72 de la SEC ID NO: 1; un aminoácido diferente de la serina en la posición correspondiente a la posición 73 de la SEC ID NO: 1; y un aminoácido diferente de la valina en la posición correspondiente a la posición 94 de la SEC ID NO: 1, en donde el polipéptido, cuando es dimerizado, se aglutina a un complejo que contiene GFRalfa3 y RET.
32. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 1.
33. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos 95 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 1.
34. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos 98 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO : 1.
35. Un polipéptido, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a la SEC ID NO: 1, en donde la secuencia de aminoácidos comprende al menos una substitución de aminoácido, con relación a la SEC ID NO: 1. seleccionada del grupo que consiste de: un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 7 de la SEC ID NO: 1; un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 9 de la SEC ID NO: 1; y un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 14 de la SEC ID NO: 1, en donde el polipéptido, cuando es dimerizado, se aglutina a un complejo que contiene GFRalfa3 y RET.
36. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la secuencia de aminoácido comprende un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 7 de la SEC ID NO: 1.
37. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 7 de la SEC ID NO: 1 está substituido con un residuo de aminoácido no conservador.
38. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 7 de la SEC ID NO: 1 está substituido con ácido glutámico.
39. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos comprende un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 9 de la SEC ID NO: 1.
40. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 9 de la SEC ID NO: 1 está substituido con un residuo de aminoácido no conservador.
41. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 9 de la SEC ID NO: 1 está substituido con ácido glutámico.
42. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos comprende un aminoácido diferente de la arginina en la posición correspondiente a la posición 14 de la SEC ID NO: 1.
43. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 14 de la SEC ID NO: 1 está substituido con un residuo de aminoácido no conservador.
44. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el residuo de arginina en la posición 14 de la SEC ID NO: 1 está substituido con ácido glutámico.
45. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-44, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos 90 % idéntica a la. SEC ID NO: 1.
46. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-44, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos 95 % idéntica a la SEC ID NO: 1.
47. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-44, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es al menos 98 % idéntica a los aminoácidos 15-113 de la SEC ID NO: 1.
48. Un dímero, caracterizado porque comprende dos polipéptidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 47.
49. Un conjugado, caracterizado porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 47, conjugado con un polímero que no está presente de manera natural.
50. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 47, y una secuencia heteróloga de aminoácidos .
51. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 47, el dímero de conformidad con la reivindicación 48, el conjugado de conformidad con la reivindicación 49, o la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 50 y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
52. Un ácido nucleico, caracterizado porque comprende una secuencia que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 47.
53. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 52.
54. Una célula, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 53.
55. Un método de fabricación de un polipéptido, caracterizado porque comprende: proporcionar la célula de conformidad con la reivindicación 54, y cultivar la célula bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico.
56. Un método de tratamiento o prevención de un trastorno del sistema nervioso en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 51.
57. Un método de tratamiento del dolor neuropático en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 51.
58. Un método de activación del receptor de RET en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 47, el dímero de conformidad con la reivindicación 48, el conjugado de conformidad con la reivindicación 49, la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 50, o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 51.