EA013565B1 - Варианты полипептидов нейбластина, способы их получения и их применение - Google Patents
Варианты полипептидов нейбластина, способы их получения и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA013565B1 EA013565B1 EA200700460A EA200700460A EA013565B1 EA 013565 B1 EA013565 B1 EA 013565B1 EA 200700460 A EA200700460 A EA 200700460A EA 200700460 A EA200700460 A EA 200700460A EA 013565 B1 EA013565 B1 EA 013565B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- variant
- amino acid
- neublastin
- agde
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 102100026376 Artemin Human genes 0.000 title claims abstract description 239
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 67
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 63
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 55
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 55
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 121
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 101
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 78
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 76
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 76
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 35
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 33
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 25
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 23
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 claims description 22
- 208000021722 neuropathic pain Diseases 0.000 claims description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 15
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 9
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 9
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102100027881 Tumor protein 63 Human genes 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 claims description 7
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims 3
- 235000018734 Sambucus australis Nutrition 0.000 claims 1
- 244000180577 Sambucus australis Species 0.000 claims 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 60
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 39
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 6
- 108091008551 RET receptors Proteins 0.000 abstract 1
- 101000785776 Homo sapiens Artemin Proteins 0.000 description 152
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 69
- 102000050671 human ARTN Human genes 0.000 description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 27
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 24
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 24
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 18
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 17
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 16
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 12
- AUZONCFQVSMFAP-UHFFFAOYSA-N disulfiram Chemical compound CCN(CC)C(=S)SSC(=S)N(CC)CC AUZONCFQVSMFAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 11
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 10
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 9
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 9
- 208000004454 Hyperalgesia Diseases 0.000 description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 8
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 8
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 230000008533 pain sensitivity Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 8
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 7
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- 229960002563 disulfiram Drugs 0.000 description 6
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 6
- 229940076085 gold Drugs 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 6
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 6
- 229960001078 lithium Drugs 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 5
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 5
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- UGJMXCAKCUNAIE-UHFFFAOYSA-N Gabapentin Chemical compound OC(=O)CC1(CN)CCCCC1 UGJMXCAKCUNAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 4
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 4
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 4
- ZJAOAACCNHFJAH-UHFFFAOYSA-N phosphonoformic acid Chemical compound OC(=O)P(O)(O)=O ZJAOAACCNHFJAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 4
- 230000010556 Heparin Binding Activity Effects 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 206010036376 Postherpetic Neuralgia Diseases 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000001044 sensory neuron Anatomy 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 3
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-15-(4-hydroxy-18-methoxycarbonyl-5,18-seco-ibogamin-18-yl)-16-methoxy-1-methyl-6,7-didehydro-aspidospermidine-3-carboxylic acid methyl ester Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CJLHTKGWEUGORV-UHFFFAOYSA-N Artemin Chemical compound C1CC2(C)C(O)CCC(=C)C2(O)C2C1C(C)C(=O)O2 CJLHTKGWEUGORV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- MQJKPEGWNLWLTK-UHFFFAOYSA-N Dapsone Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MQJKPEGWNLWLTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 2
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 2
- KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N Nocodazole Chemical compound C1=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=CC=C1C(=O)C1=CC=CS1 KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- 208000004983 Phantom Limb Diseases 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 2
- CGWVBPMMLKULCR-UHFFFAOYSA-N acetic acid;cyclohexylmethanamine Chemical compound CC(O)=O.NCC1CCCCC1 CGWVBPMMLKULCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001773 anti-convulsant effect Effects 0.000 description 2
- 239000003416 antiarrhythmic agent Substances 0.000 description 2
- 229940125681 anticonvulsant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 2
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 2
- 229960003965 antiepileptics Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 210000003403 autonomic nervous system Anatomy 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 2
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 2
- 229960000860 dapsone Drugs 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 229960005102 foscarnet Drugs 0.000 description 2
- 229960002870 gabapentin Drugs 0.000 description 2
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229960000282 metronidazole Drugs 0.000 description 2
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 2
- 230000003040 nociceptive effect Effects 0.000 description 2
- 229950006344 nocodazole Drugs 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 208000027232 peripheral nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- AYXYPKUFHZROOJ-ZETCQYMHSA-N pregabalin Chemical compound CC(C)C[C@H](CN)CC(O)=O AYXYPKUFHZROOJ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 229960001233 pregabalin Drugs 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 2
- 229940063683 taxotere Drugs 0.000 description 2
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004355 vindesine Drugs 0.000 description 2
- UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N vindesine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(N)=O)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1N=C1[C]2C=CC=C1 UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- ITPDYQOUSLNIHG-UHFFFAOYSA-N Amiodarone hydrochloride Chemical compound [Cl-].CCCCC=1OC2=CC=CC=C2C=1C(=O)C1=CC(I)=C(OCC[NH+](CC)CC)C(I)=C1 ITPDYQOUSLNIHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001718 Amyloid-beta protein Proteins 0.000 description 1
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 description 1
- 101710205806 Artemin Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N Aspartic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000001387 Causalgia Diseases 0.000 description 1
- 208000023890 Complex Regional Pain Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 208000013586 Complex regional pain syndrome type 1 Diseases 0.000 description 1
- 206010062346 Congenital neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 208000024720 Fabry Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000034846 Familial Amyloid Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- 208000024412 Friedreich ataxia Diseases 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010019889 Hereditary neuropathic amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035154 Hyperesthesia Diseases 0.000 description 1
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007839 Kleinhovia hospita Species 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 208000035719 Maculopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010060880 Monoclonal gammopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002774 Paraproteinemias Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 206010056238 Phantom pain Diseases 0.000 description 1
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 101000930457 Rattus norvegicus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091005682 Receptor kinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000001947 Reflex Sympathetic Dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010038910 Retinitis Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 208000008765 Sciatica Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 208000001163 Tangier disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 208000003056 Vitamin B6 deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010047631 Vitamin E deficiency Diseases 0.000 description 1
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 206010053552 allodynia Diseases 0.000 description 1
- 229960005260 amiodarone Drugs 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000004339 autoimmune neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000003295 carpal tunnel syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000003986 cell retinal photoreceptor Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 208000014439 complex regional pain syndrome type 2 Diseases 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000007862 dimeric product Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- -1 elixir Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 208000033699 familial Guillain-Barre syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 150000002307 glutamic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 1
- 230000002989 hypothyroidism Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000007654 ischemic lesion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000412 mechanoreceptor Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000584 nodose ganglion Anatomy 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000005034 parasympathetic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 1
- 230000007824 polyneuropathy Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000018406 regulation of metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 210000003994 retinal ganglion cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000010572 single replacement reaction Methods 0.000 description 1
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 1
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000012956 testing procedure Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 201000007905 transthyretin amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000000427 trigeminal ganglion Anatomy 0.000 description 1
- 206010044652 trigeminal neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000001170 unmyelinated nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000000752 vestibulocochlear nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 208000002670 vitamin B12 deficiency Diseases 0.000 description 1
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920003170 water-soluble synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/4756—Neuregulins, i.e. p185erbB2 ligands, glial growth factor, heregulin, ARIA, neu differentiation factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
Раскрыты варианты полипептида нейбластина, несущие аминокислотные замены в определенных позициях. Замены в одной или более аминокислотных позициях снижают связывание с гепарином и увеличивают сывороточную экспозицию вариантов полипептида нейбластина. Также раскрыты способы использования вариантов полипептида нейбластина для лечения заболеваний и активации рецептора RET у млекопитающих.
Description
Изобретение относится к химии белков, молекулярной биологии и нейробиологии.
Предшествующий уровень техники
Нейбластин, также известный как артемин и эновин, представляет собой гомодимерный секретируемый белок массой 24 кДа, обеспечивающий выживание нейронов периферической и центральной нервной системы, таких как допаминэргические нейроны (Байбе! е! а1., 2000, Осгс1ортсп1. 127:4335; ВокепЫаб е! а1., 2000, Мо1. Се11 Шигока., 15 (2):199; СепБапк АЕ120274). Ген, кодирующий нейбластин, был проклонирован и отсеквенирован (ВокеЫаб е! а1., 2000, Мо1. Се11 ШигоксГ 15 (2):199; Ва1ой е! а1., Ыеитои, 21:1291).
Нейбластин является членом семейства лигандов, полученного из глиальной клеточной линии нейротрофического фактора (ΟΌΝΓ). На клеточном уровне члены семейства ΟΌΝΓ активируют рецепторную тирозинкиназу ВЕТ. ВЕТ ассоциируется с корецептором - рецептором семейства ΟΌΝΕ-альфа (СЕВа1рйа), связанным с гликозилфосфатидилинозитолом (СР1) мембранным белком, обеспечивающим лигандную специфичность для ВЕТ. Известны четыре рецептора СЕВа1рйа (СЕВа1рйа 1-4). Нейбластин связывается с СЕВа1рйа3 и ВЕТ, формируя трехкомпонентный сигнальный комплекс (Ваибе! е! а1., 2000, Беуе1ортеи!, 127:4335; Ва1ой е! а1., 1998, Штоп, 21:1291), локализующийся преимущественно на ноцицептивных сенсорных нейронах (Огохсо е! а1., 2001, Еиг. 1. ШигоксГ 13 (11):2177). Данные нейроны детектируют боль и повреждения. Таким образом, нейбластин потенциально может быть применен для лечения нейропатии, в особенности для лечения нейропатической боли.
Нейбластин и другие члены семейства ΟΌΝΕ входят в суперсемейство трансформирующего фактора роста-бета (ТСЕ-бета) и, таким образом, характеризуются наличием семи консервативных остатков цистеина со сходным расположением, формирующих структуру цистеинового узла (8аагта, 1999, М1сто8С1. Век. Тесй., 45:292). Каждый мономер содержит две дисульфидные связи, формирующие закрытую петлевую структуру, охватывающую третью дисульфидную связь и таким образом формирующую структуру тугого узла. Седьмой цистеин в каждом из мономеров формирует межмолекулярную дисульфидную связь, ковалентно связывая мономеры и формируя конечный димерный продукт (Ва!!епйо11 е! а1., 2000, 1. Мо1. Вю1., 305:523).
Члены семейства ТСЕ-бета синтезируются в виде про-пробелков, секретируемых в виде зрелого гомодимера после отщепления сигнального пептида и про-домена (см., к примеру, Ва!!епйо11 е! а1., 2000, 1. Мо1. Вю1., 305:523; ЕанВе е! а1., 2001, 1. Вю1. Сйет., 276 (20):16911). Как сигнальный пептид, так и про-домен обеспечивают правильную секрецию членов семейства ТСЕ-бета (Ва!!епйо11 е! а1., 2000, 1. Мо1. Вю1., 305:523; Ва!!епйо11 е! а1., 2001, Еиг. 1. Вюсйет., 268:3296).
Краткое изложение сущности изобретения
Изобретение основано, по крайней мере отчасти, на открытии связывания нейбластина с сульфатом гепарина, и определенные аминокислотные остатки полипептида нейбластина обеспечивают данное связывание. Замещение определенных аминокислотных остатков приводило к снижению связывания полученного модифицированного нейбластина с гепарином, а также к увеличению биоактивности и биодоступности модифицированных полипептидов.
В одном из аспектов данное изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, по крайней мере на 80% идентичную аминокислотам 15-113 в последовательности 8 ЕС ΙΌ N0:1, где аминокислотная последовательность полипептида содержит по крайней мере одну аминокислотную замену по сравнению с 8ЕС ΙΌ N0:1, выбранную из группы, состоящей из:
(ί) аминокислоты, отличной от аргинина в положении, соответствующем позиции 48 в 8ЕС ΙΌ N0:1 (к примеру, аргинин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток, такой как глутаминовая кислота);
(ίί) аминокислоты, отличной от аргинина в положении, соответствующем позиции 49 в 8ЕС ΙΌ N0:1 (к примеру, аргинин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток, такой как глутаминовая кислота); и (ίίί) аминокислоты, отличной от аргинина в положении, соответствующем позиции 51 в 8ЕС ΙΌ N0:1 (к примеру, аргинин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток, такой как глутаминовая кислота).
После димеризации полипептид связывается с комплексом, содержащим СЕВа1рйа3 и ВЕТ.
В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность содержит аминокислоты, отличные от аргинина в позициях 48 и 49 в 8ЕС ΙΌ N0:1. К примеру, остатки аргинина в позициях 48 и 49 в 8ЕС ΙΌ N0:1 могут быть замещены на неконсервативные аминокислотные остатки (например, глутаминовую кислоту).
- 1 013565
В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность по крайней мере на 90%, по крайней мере на 95% или по крайней мере на 98% идентична аминокислотам 15-113 в последовательности БЕР ΙΌ N0:1.
Также раскрывается полипептид, содержащий аминокислоты 15-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:2, аминокислоты 15-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:3, аминокислоты 15-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:4, аминокислоты 15-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:5, аминокислоты 15-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:8 или аминокислоты 15-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:9.
В некоторых воплощениях полипептид содержит аминокислоты 10-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:2, аминокислоты 10-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:3, аминокислоты 10-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:4, аминокислоты 10-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:5, аминокислоты 10-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:8, аминокислоты 10-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:9.
В некоторых воплощениях полипептид содержит аминокислотную последовательность, приведенную в БЕр ΙΌ N0:2, аминокислотную последовательность, приведенную в БЕр ΙΌ N0:3, аминокислотную последовательность, приведенную в БЕр ΙΌ N0:4, аминокислотную последовательность, приведенную в БЕр ΙΌ N0:5, аминокислотную последовательность, приведенную в БЕр ΙΌ N0:8, или аминокислотную последовательность, приведенную в БЕр ΙΌ N0:9.
Также раскрывается полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по крайней мере на 80% идентичную аминокислотам 15-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:1, где аминокислотная последовательность полипептида содержит по крайней мере одну аминокислотную замену по сравнению с БЕр ΙΌ N0:1, выбранную из группы, состоящей из:
(ί) аминокислоты, отличной от серина в положении, соответствующем позиции 20 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, серин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток);
(й) аминокислоты, отличной от глутамина в положении, соответствующем позиции 21 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, глутамин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток);
(ίίί) аминокислоты, отличной от гистидина в положении, соответствующем позиции 32 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, гистидин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток);
(ίν) аминокислоты, отличной от аргинина в положении, соответствующем позиции 33 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, аргинин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток);
(ν) аминокислоты, отличной от аргинина в положении, соответствующем позиции 39 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, аргинин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток);
(νί) аминокислоты, отличной от серина в положении, соответствующем позиции 46 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, серин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток);
(νίί) аминокислоты, отличной от аргинина в положении, соответствующем позиции 68 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, аргинин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток);
(νίίί) аминокислоты, отличной от глицина в положении, соответствующем позиции 72 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, глицин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток);
(ίχ) аминокислоты, отличной от серина в положении, соответствующем позиции 73 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, серин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток); и (х) аминокислоты, отличной от валина в положении, соответствующем позиции 94 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, валин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток).
После димеризации полипептид связывается с комплексом, содержащим 0ЕВа1рйа3 и ВЕТ. В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность по крайней мере на 90%, по крайней мере на 95% или по крайней мере на 98% идентична аминокислотам 15-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:1.
Также раскрывается полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по крайней мере на 80% идентичную аминокислотам 15-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:1, где аминокислотная последовательность содержит по крайней мере одну аминокислотную замену по сравнению с БЕр ΙΌ N0:1, выбранную из группы, состоящей из:
(ί) аминокислоты, отличной от аргинина в положении, соответствующем позиции 7 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, аргинин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток, такой как глутаминовая кислота);
(ίί) аминокислоты, отличной от аргинина в положении, соответствующем позиции 9 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, аргинин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток, такой как глутаминовая кислота); и (ίίί) аминокислоты, отличной от аргинина в положении, соответствующем позиции 14 в БЕр ΙΌ N0:1 (к примеру, аргинин замещается на неконсервативный аминокислотный остаток, такой как глутаминовая кислота). После димеризации полипептид связывается с комплексом, содержащим 0ЕВа1рйа3 и ВЕТ.
В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность по крайней мере на 90%, по крайней мере на 95% или по крайней мере на 98% идентична аминокислотам 15-113 в последовательности БЕр ΙΌ N0:1.
- 2 013565
Изобретение также относится к конъюгатам, содержащим описанный в настоящем тексте полипептид, конъюгированный с неприродным полимером. Примером подобного полимера может служить водорастворимый синтетический полимер, такой как полиалкиленгликоль (к примеру, полиэтиленгликоль).
Изобретение также относится к слитым белкам, содержащим описанный в настоящем тексте полипептид и гетерологичную аминокислотную последовательность.
Изобретение также относится к димеру, содержащему два полипептида, конъюгата или слитых белка, описанных в настоящем тексте.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей описанный в настоящем тексте полипептид, димер, конъюгат или слитый белок и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
Также раскрывается нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую описанный в настоящем тексте полипептид, содержащий нуклеиновую кислоту экспрессионный вектор и клетка, содержащая экспрессионный вектор.
Также раскрывается способ получения полипептида, включающий в себя следующие этапы:
(ί) подготовка клетки, содержащей экспрессионный вектор, в свою очередь содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую описанный в настоящем тексте полипептид; и (ίί) культивирование клетки в условиях, способствующих экспрессии нуклеиновой кислоты.
Изобретение также относится к способу лечения или профилактики заболевания нервной системы у млекопитающих, предполагающему введение млекопитающему терапевтически эффективных количеств описанных в настоящем тексте полипептида, димера, конъюгата, слитого белка или фармацевтической композиции.
Изобретение также относится к способу лечения нейропатической боли у млекопитающих, предполагающему введение млекопитающему терапевтически эффективных количеств описанных в настоящем тексте полипептида, димера, конъюгата, слитого белка или фармацевтической композиции.
Изобретение также относится к способу активации рецептора КЕТ у млекопитающих, предполагающему введение млекопитающему эффективных количеств описанных в настоящем тексте полипептида, димера, конъюгата, слитого белка или фармацевтической композиции.
Преимущество описанных в настоящем тексте выбранных вариантов полипептида нейбластина заключается в сниженной по сравнению с нейбластином дикого типа способности связывать гепарин. Снижение связывания с гепарином приводит к снижению клиренса модифицированных полипептидов ίη νίνο.
Неожиданно было найдено, что вариант полипептида нейбластина, имеющий замещенные аминокислотные остатки в позициях 48 и 49, обладает значительно меньшей способностью связывать гепарин и значительно большей эффективностью и биодоступностью по сравнению с мутантными полипептидами, несущими одну аминокислотную замену, и/или нейбластином дикого типа. К примеру, было найдено, что двойной мутант демонстрирует приблизительно 185-кратное увеличение сывороточной экспозиции (кегит ехрокиге) по сравнению с нейбластином дикого типа. Помимо этого, было найдено, что данный двойной мутант демонстрирует более чем 5-кратное повышение уровня экспрессии ίη νίίτο по сравнению с нейбластином дикого типа, за счет чего облегчается получение белка в больших количествах.
Преимущества и неожиданные возможности нейбластина позволяют использовать его для лечения индивидов с использованием меньших доз белка и/или удлиненными интервалами между введениями (по сравнению с белком дикого типа).
Все технические и научные термины, встречающиеся в данном тексте, используются в тех значениях, в каких они обычно понимаются специалистами в данной области, если не указано иное. Хотя материалы и методы, сходные или эквивалентные описанным в данном тексте, могут быть использованы в практической реализации или тестировании настоящего изобретения, поясняющие материалы и методы приведены ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие упомянутые в данном тексте ссылки полностью включены в данный текст посредством ссылок. В случае конфликта будет использоваться настоящее описание, включая определения. Материалы, методы и примеры носят только иллюстративный характер и не являются ограничивающими.
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из нижеследующего детального описания и формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 изображено выравнивание пре-про-полипептидов нейбластина дикого типа человека (8ЕО ΙΌ N0:10), мыши (8Е0 ΙΌ N0:11) и крысы (8Е0 ΙΌ N0:12). Левая и правая вертикальные линии обозначают старт зрелых аминокислотных форм длиной в 113 и 104 аминокислоты соответственно. Гепаринсвязывающий домен ККХК заключен в рамку.
На фиг. 2А изображен катионный элюционный профиль нейбластина дикого типа (пик Ό) и трех мутантов с замещением Агд на 01и (пики А, В и С; наклонная линия представляет собой теоретическую концентрацию хлорида натрия для каждого из элюированных с колонки объемов). Данные представлены в виде показателей 0Ό280 для различных проб.
- 3 013565
На фиг. 2В изображен элюционный профиль (колонка с гепарин-сефарозой) нейбластина дикого типа (пик Н) и трех мутантов с замещением Агд на С1и (пики Е, Е и С; наклонная линия представляет собой теоретическую концентрацию хлорида натрия для каждого из элюированных с колонки объемов). Данные представлены в виде показателей ΘΌ280 для различных проб.
На фиг. 3А, 3В изображены фотографии 8О8/РАСЕ-электрофоретических гелей нейбластина дикого типа после анионной хроматографии в присутствии (2А) и в отсутствии (2В) гепарина.
На фиг. 4 изображена диаграмма, описывающая результаты анализа связывания на клетках СНО. После 8О8-РАСЕ-электрофореза и денситометрии значения ΟΏ нейбластина дикого типа и Агд48Емутанта были соотнесены с концентрациями гепарина в каждой пробе.
На фиг. 5 приведена диаграмма, описывающая результаты ЕЫ8А-теста на связывание гепарина с использованием человеческого ΝΒΝ113 дикого типа, человеческого ΝΒΝ140 дикого типа, а также мутантов Агд48Е, Агд49Е, Агд51Е и Агд48, 49Е.
На фиг. 6 приведена диаграмма, описывающая результаты КГКА-анализа крысиного ΝΒΝ113 дикого типа, Агд51Е, Агд48Е, Агд49Е и крысиного ΝΒΝ113.
На фиг. 7 А приведена диаграмма, описывающая результаты КГКА-анализа человеческого нейбластина дикого типа, а также мутантного человеческого нейбластина (113-аминокислотная форма) Агд48, 49Е.
На фиг. 7В приведена диаграмма, описывающая результаты КГКА-анализа человеческого нейбластина дикого типа, а также мутантных форм человеческого нейбластина Агд48, 49Е (104-аминокислотная форма), Агд48, 51Е (113-аминокислотная форма) и Агд49, 51Е (113-аминокислотная форма).
На фиг. 8 приведена диаграмма, описывающая результаты анализа тройного комплекса, проведенного с использованием человеческого нейбластина дикого типа, а также мутантных форм нейбластина Агд48Е, Агд49Е, Агд51Е, Агд48, 49Е и Агд48, 49, 51Е.
На фиг. 9 приведена диаграмма, описывающая результаты анализа тройного комплекса, проведенного с использованием нейбластина дикого типа, а также мутантных форм нейбластина Агд48Е, Агд49Е, Агд51Е, Агд48, 49Е и Агд48, 49, 51Е.
На фиг. 10 приведена диаграмма, описывающая результаты фармакокинетического анализа нейбластина дикого типа и Агд48, 49Е после одной подкожной болюсной инъекции в количестве 7 мг/кг (концентрации нейбластина в плазме определяли при помощи ЕЬГ8А-теста для детекции нейбластина).
На фиг. 11 приведена диаграмма, описывающая результаты фармакокинетического анализа нейбластина дикого типа и Агд48, 49Е после одной внутривенной болюсной инъекции в количестве 1 мг/кг (концентрации нейбластина в плазме определяли при помощи ЕЬГ8А-теста для детекции нейбластина).
На фиг. 12 приведена диаграмма, описывающая результаты фармакокинетического анализа 2Х10К ПЭГилированного Агд48, 49Е после одной подкожной болюсной инъекции в количестве 7 мг/кг (приведенные данные экстраполированы на 1 мг/кг), а также после внутривенного введения 1 мг/кг (концентрации нейбластина в плазме определяли при помощи ЕЬГ8А-теста для детекции нейбластина).
На фиг. 13 приведена диаграмма относительных уровней экспрессии нейбластина в СНО-клетках, трансфицированных плазмидами, кодирующими нейбластин дикого типа или Агд48, 49Е.
На фиг. 14 приведена диаграмма относительных уровней экспрессии нейбластина в лидирующих линиях СНО-клеток, трансфицированных двойными мутантами Агд48, 49Е или нейбластином дикого типа.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к вариантам полипептида нейбластина, содержащим аминокислотные замены в определенных позициях. Согласно раскрытому в сопроводительных примерах было найдено, что определенные остатки полипептида нейбластина дикого типа важны для связывания с гепарином. Поскольку считается, что связывание с гепарином влияет на клиренс нейбластина ίη νίνο, авторы ожидали, что замена одного или нескольких подобных остатков приведет к снижению связывания с гепарином и в соответствии с этим - к увеличению сывороточной экспозиции модифицированного полипептида.
Полипептиды модифицированного нейбластина.
Зрелый человеческий нейбластин дикого типа состоит из 113 аминокислот и имеет следующую аминокислотную последовательность:
АббРбЗКАКААСАВССКЬЙЗОЪУРУКАЪбЬСНКЗОЕЬУКРКРСЗСЗСКРАЙЗРНОЬЗЬ
АЗЬЬОАСАЬКРРРбЗЕРУЗОРССРРТКУЕАУЗГМОУЫЗТИК^ОКЪЗАТАСОСЬО (3ΕΩ ΙΟ N0: 1) .
В настоящем изобретении раскрыты полипептиды с замещением одного или более определенных аминокислотных остатков в полипептиде нейбластина. Авторы ожидали, что мутации одного или более из подобных аминокислотных остатков должны привести к снижению или полному отсутствию связывания полученных вариантов полипептида нейбластинина с гепарином (по сравнению с нейбластином дикого типа). По сравнению с 8Е0 ГО ΝΟ:1 вариант полипептида нейбластина содержит замену (ί) остатка аргинина в одной или более из следующих позиций: 48, 49 или 51, и/или (ίί) одного или более остатка 8ег 46, 8ег 73, СГу 72, Агд 39, С1п 21, 8ег 20, Агд 68, Агд 33, Н18 32, Уа1 94, Агд 7, Агд 9 или Агд 14. В на
- 4 013565 стоящем тексте любое упоминание номера аминокислотной позиции в последовательности нейбластина относится к нумерации аминокислотных остатков в последовательности ЗЕО ΙΌ N0:1, если не указано иное.
Аминокислотный остаток в последовательности нейбластина, предназначенный для замещения (к примеру, остаток аргинина в позиции 48, 49 и/или 51), может быть замещен неконсервативным аминокислотным остатком (к примеру, глутаминовой кислотой) либо консервативным аминокислотным остатком. Согласно детализированному в сопроводительных примерах замещение Агд48, Агд 49 и/или Агд 51 на неконсервативную аминокислоту может привести к получению варианта полипептида нейбластина со сниженной гепаринсвязывающей активностью, однако сохраненной (либо даже повышенной) биологической активностью нейбластина. Примеры аминокислот, которые могут быть использованы для замены идентифицированных аминокислотных остатков (к примеру, остатка аргинина в позиции 48, 49 и/или 51), включают в себя глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту и аланин.
После димеризации биологически активный вариант полипептида нейбластина связывается с трехкомпонентным комплексом, содержащим СЕКа1рйа3 и КЕТ. Любой метод детекции связывания этого комплекса может быть использован для изучения биологической активности варианта полипептида нейбластина. Примеры аналитических методов детекции способности вариантов полипептида нейбластина связывать трехкомпонентный комплекс описаны в \У0 00/01815 и примере 7.
Вариант полипептида нейбластина также может быть проанализирован на способность к запуску нейбластинового сигнального каскада. К примеру, анализ активации рецепторной киназы (К1КА), описанный в примере 6, может быть использован для анализа способности варианта полилептида нейбластина индуцировать аутофосфорилирование КЕТ (см. также ЗаФск е! а1., 1996, Апа1. Вюсйет., 235 (2):207).
Помимо идентифицированных специфических аминокислотных замен, вариант полипептида нейбластина также может содержать одну или более добавочных аминокислот, одну или более аминокислотную замену и/или делецию в других аминокислотных позициях в соответствии с описанным в нижеследующих разделах.
Помимо одной или более аминокислотных замен, описанных в настоящем тексте, варианты полипептида нейбластина могут иметь различную длину. Несмотря на то что зрелый полипептид человеческого нейбластина состоит из 113 С-концевых аминокислот пре-про-нейбластина, не все из 113 аминокислот необходимы для достижения достаточной биологической активности. Возможно концевое укорочение. Таким образом, модифицированный полипептид нейбластина может содержать одну или более из описанных в настоящем тексте аминокислотных замен в контексте 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 или 113 С-концевых аминокислот в последовательности ЗЕО ΙΌ N0:1 (т.е. длина полипептида составляет 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 или 113 аминокислот).
Помимо одной или более аминокислотных замен, описанных в настоящем тексте (и необязательно описанного выше укорочения), варианты полипептида нейбластина могут отличаться по аминокислотной последовательности. В частности, некоторые аминокислотные замены могут быть введены в последовательность нейбластина без сколь-нибудь значимой потери биологической активности нейбластина. В типичных воплощениях полипептид (1) содержит одну или более из описанных в настоящем тексте аминокислотных замен и (и) по крайней мере на 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичен последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 (либо на 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичен аминокислотам 15-113 в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1). Вариант полипептида нейбластина, последовательность которого отличается от 8Е0 ΙΌ N0:1 (либо отличается от аминокислот 15-113 8Е0 ΙΌ N0:1), может содержать одну или более замену консервативных аминокислот, одну или более замену неконсервативных аминокислот и/или одну или более делецию или инсерцию.
На фиг. 1 изображено выравнивание последовательностей пре-про-полипептида нейбластина человека, мыши и крысы. Вертикальные линии на фиг. 1 обозначают старт зрелой 113-аминокислотной формы (левая вертикальная линия) и 104-аминокислотной формы (правая вертикальная линия) нейбластина. Гепаринсвязывающий мотив ККХК заключен в рамку. Данное выравнивание природных биоактивных форм нейбластина выявляет специфические типичные остатки (т.е. неконсервативные у человека, мыши и крысы), которые могут быть замещены без элиминирования биоактивности.
Процент идентичности между аминокислотными последовательностями может быть рассчитан при помощи программы ВЬАЗТ 2.0. Сравнение последовательностей может быть проведено при помощи безразрывного выравнивания с параметрами по умолчанию (матрица - В1оббот 62, оценка значимости разрыва в гомологии = 11, оценка значимости разрыва в гомологии на один остаток = 1 и соотношение лямбда = 0,85). Математический алгоритм, используемый в программе ВЬАЗТ, описан в публикации А115сйи1 е! а1., 1997, №.1с1ею Ас1бб Кекеагсй, 25:3389-3402.
Консервативная замена представляет собой замену одной аминокислоты на другую со схожими характеристиками. Консервативные замены включают в себя замены, произведенные в пределах следующих групп: валин, аланин и глицин; лейцин, валин и изолейцин; аспарагиновая и глутаминовая кислоты; аспарагин и глутамин; серин, цистеин и треонин; лизин и аргинин; фенилаланин и тирозин. Неполярные
- 5 013565 гидрофобные аминокислоты включают в себя аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают в себя глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные аминокислоты) включают в себя аргинин, лизин, и гистидин. Негативно заряженные (кислые) аминокислоты включают в себя аспарагиновую и глутаминовую кислоты. Любая замена одной аминокислоты из вышеперечисленных групп полярных, основных или кислых аминокислот на другую аминокислоту из той же группы может рассматриваться как консервативная.
Неконсервативные замены включают в себя замены, при которых (ί) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь (к примеру, Агд, Ηίκ или Ьук), замещает либо замещается на электроотрицательный остаток (к примеру, С1и или Акр);
(ίί) гидрофильный остаток (к примеру, Бег или ТЬг) замещает либо замещается на гидрофобный остаток (к примеру, А1а, Ьеи, Не, РЬе или Уа1);
(ίίί) цистеин или пролин замещает или замещается на любой другой остаток либо (ίν) остаток с объемной гидрофобной или ароматической боковой цепью (к примеру, Уа1, Не, РЬе или Тгр) замещает либо замещается на остаток с меньшей боковой цепью (к примеру, А1а, Бег) либо без таковой (к примеру, С1у).
Примеры полипептидов модифицированного нейбластина раскрыты в таблице. Аминокислотные остатки полипептидов модифицированного нейбластина, мутированные по отношению к соответствующей позиции в полипептиде дикого типа, выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. Помимо этого, в таблице продемонстрированы полипептиды нейбластина (длиной 113, 99 и 104 аминокислоты), использованные в качестве основ для аминокислотных замен.
Полипептиды модифицированного нейбластина
| ЗЕ$ Ιϋ ΝΟ | Замедленная позиция | Длина полипептида | Аминокислотная последовательность |
| 2 | Агд4 8 | 113 | АбСРСЗЙАЙААбАЕССКЬВЗОЬУРУКАЬСЬ БНКЗОЕЬУКЕ’ЕГСЗБЗСЕЕАВЗРНОЬЗЬАЗ ЬЬСАСАЬЙРРРСЗКРУЗОРССКРТКУЕАУЗ ГМСУЫЗТНКТУОКЬЗАТАСССЫЗ |
| 3 | Агд49 | 113 | АБСРеЗКАЕААБАКССВЬКЗОЬУРУВАЬБЬ СНЕЗОЕЬУКРКЕСЗСЗСВЕАЕЗРНОЬЗЬАЗ ЬЬеАБАЬВРРРБЗКРУЗОСРССКРТВУЕАУ 3 ЕМОУИЗТИКТУОКЬЗАТАСБСЬС |
| 4 | Агд51 | 113 | АОБРБЗКАКААЗАКБСКЬВЗОЬУРУКАЬБЬ СНВЗОЕЬУКГКРСЗСЗСКйАЕЗРНОЬЗЬАЗ ЬЬБАСАЬВРРРСЗВРУЗОРССВРТВУЕАУЗ ГМОУИЗТИЕТУОКЬЗАТАСеСЬе |
| 5 | Агд48 и Агд4 9 | 113 | АБСРБЗКАКААЙАКССКЬКЗаЬУРУКАЬБЬ СНКЗОЕЬУКГКГСЗСЗСЕЕАВЗРНОЪЗЬАЗ ЬЬСАСАЬКРРРеЗКРУЗОРССВРТКУЕАУЗ ГМЕУМЗТИКТУОКЬЗАТАСССЬС |
| 6 | Агд4 8 и Агд4 9 | 99 | БСЕЬВЗОЪУРУВАЬСЪСНВЗОЕЬУВГКРСЗ СЗСЕЕАВ.ЗРН01.,ЗЬАЗЬЬСА.САЬР.РРРСЗР. РУЗОРССКРТКУЕАУЗГМОтаЗТИКТУОКЬ ЗАТАСбСЬС |
| 7 | Агд48 и Агд4 9 | 104 | ААБАВССКЬКЗОЬУРУКАЬБЬбНКЗ ОЕЬУК ГКГС8С5СЕКАК5₽Н0Ь51АЗЫ.5А6АЬКР РРЗЗВРУЗОРССКРТВУЕАУЗГМОУЫЗТНН ТУЕКЬЗАТАСбСЬС |
| а | Агд49 и Агд51 | 113 | ЛееРбЗКАКААбАВБСКЬВЗОЬУРУКАЪСЬ СНЕЗОЕЬУКРЕГСЗСЗСВЕАЕЗРНОЬЗЬАЗ ЬЬСАСАЬВРРРСЗКРУЗСРССКРТКУЕАУЗ РМОУИЗТИВТУОВЬЗАТАСССЬЙ |
| 9 | Агд48 и Агд51 | 113 | АББРбЗВАКААЕАКССКЬКЗОЬУРУЕАЬБЬ ЕНВЗОЕЬУКРКГСЗСЗСЕВАЕЗРНОЬЗЬАЗ ЬЬСАЙАЕКРРРСЗВРУЗОРССКРТВУЕАУЗ ЕМОУИЗТИВТУОКЕЗАТАСйСЕй |
- 6 013565
Варианты полипептида нейбластина могут быть необязательно связаны с полимером (к примеру, с полиалкиленгликолем, таким как полиэтиленгликоль). В некоторых воплощениях полимер связан с полипептидом по сайту, соответствующему Ν-концу полипептида нейбластина. В некоторых воплощениях вариант полипептида нейбластина содержит по крайней мере одну аминокислотную замену по сравнению с последовательностью 8ЕО ΙΌ N0:1 (либо по сравнению с аминокислотами 15-113 в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1), предоставляющую полученному полипептиду внутренний сайт для конъюгирования полимера. В некоторых воплощениях полимер связан с вариантом полипептида нейбластина по остатку в позиции (нумерация в соответствии с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:1), выбранной из группы, содержащей позицию 14, позицию 39, позицию 68 и позицию 95. Примеры модификаций нейбластина, содержащих внутренний сайт для конъюгации с полимером, описаны в XV0 02/060929 и XV0 04/069176 (содержание которых включено в данное описание посредством ссылки).
Помимо вышеописанных аминокислотных замен в варианте полипептида нейбластина, полипептид также может необязательно содержать гетерологичные аминокислотные последовательности. Термин гетерологичная в отношении аминокислотной последовательности относится к последовательности, происходящей из источника, отличающегося от данной конкретной клетки-хозяина, либо в случае происхождения этой клетки является модифицированной по отношению к изначальной форме. Примеры гетерологичных последовательностей включают в себя гетерологичные сигнальные последовательности (к примеру, сигнальная последовательность нативного крысиного альбумина, модифицированная крысиная сигнальная последовательность либо сигнальная последовательность человеческого гормона роста), либо последовательности, используемые для очистки варианта полипептида нейбластина (к примеру, гистидиновый тэг).
Полипептиды нейбластина могут быть выделены при помощи известных в данной области способов. Природные полипептиды нейбластина могут быть выделены из клеточных или тканевых источников при помощи стандартных методов очистки белков. Альтернативно, мутированные полипептиды нейбластина могут быть синтезированы при помощи стандартных методов пептидного синтеза. Синтез коротких аминокислотных последовательностей широко известен в данной области. См., к примеру, 81еетаг1, с1 а1., δοϊίά Рйаке Рерббе 8уи1йек1к (2иб еб., 1984).
В некоторых воплощениях варианты полипептида нейбластина могут быть получены при помощи технологии рекомбинантной ДНК. К примеру, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант полипептида нейбластина, может быть вставлена в вектор, к примеру экспрессионный вектор, и нуклеиновая кислота может быть введена в клетку. Подходящие клетки включают в себя клетки млекопитающих (такие как человеческие клетки или клетки СНО), клетки грибов, дрожжей, насекомых или бактерий. В случае экспрессии в рекомбинантной клетке последняя предпочтительно культивируется в условиях, способствующих экспрессии варианта полипептида нейбластина. Вариант полипептида нейбластина может быть при необходимости получен из клеточной суспензии. Используемый в настоящем тексте термин получен означает, что мутантный полипептид очищается от компонентов клеток или культуральной среды, в которых он находился до процесса выделения. Процесс получения может включать в себя один или более этапов рефолдинга или очистки.
Варианты полипипептида нейбластина могут быть сконструированы любыми известными в данной области методами. Одним из подобных методов является сайт-направленный мутагенез, при котором определенный нуклеотид (или при желании - небольшое число определенных нуклеотидов) замещается с целью изменения соответствующей аминокислоты (или при желании - небольшого числа соответствующих аминокислотных остатков) в кодируемом полипептиде модифицированного нейбластина. Множество наборов для сайт-направленного мутагенеза являются коммерчески доступными. Один из подобных наборов - ТгаикГогтег 8йе И1гес1еб Ми1адеиекщ Κίΐ (С1ои1есй ЬаЬога1опек, Ра1о А11о, СА).
Фармацевтические композиции.
Варианты полипептида нейбластина могут быть включены в фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество полипептида и один или более адъювантов, наполнителей, носителей и/или разбавителей. Приемлемые разбавители, носители и наполнители обычно не оказывают негативных эффектов на гомеостаз реципиента (к примеру, на электролитный баланс). Приемлемые носители включают в себя биосовместимые, инертные или биоабсорбируемые соли, буферные агенты, олиго- или полисахариды, полимеры, агенты, увеличивающие вязкость, консерванты и т. д. Примером носителя может служить физиологический раствор соли (0,15 М №С1, рН 7,0-7,4). Другими примерами носителя могут служить 50 мМ фосфата и 100 мМ №С1. Дальнейшие воплощения по применению и введению фармацевтических композиций могут быть найдены, к примеру, в книге ΚΕΜΙΝΟΤ0Ν’8 РНАЯМАСЕиТ1САЬ 8С^СЕ8 (Мааск РиЬ11кЫи§ Со., Еайои, Ра.).
Введение фармацевтической композиции, содержащей вариант полипептида нейбластина, может быть системным или местным. Фармацевтические композиции могут быть приготовлены таким образом, чтобы быть применимыми для парентерального и/или непарентерального введения. Характерные способы введения включают в себя подкожное, внутривенное, внутримышечное, чрескожное, внутрибрюшинное, интратекальное, пероральное, ректальное, буккальное, топическое, интраназальное, офтальмическое, внутрисуставное, внутриартериальное, субарахноидальное, лимфатическое, вагинальное и внутри
- 7 013565 уретральное введение.
Композиции, пригодные для парентерального введения, содержат стерильный водный препарат варианта полипептида нейбластина, предпочтительно изотонический с кровью реципиента (к примеру, физиологический раствор соли). Композиции могут быть приготовлены в виде форм для однократного либо многократного введения.
Типичная композиция согласно настоящему изобретению содержит описанный в настоящем тексте вариант полипептида нейбластина и следующие буферные компоненты: сукцинат натрия (к примеру, 10 мМ); №1С1 (к примеру, 75 мМ) и Ь-аргинин (к примеру, 100 мМ).
Композиции, пригодные для перорального введения, могут быть приготовлены в виде дискретных дозировочных единиц, таких как капсулы, крахмальные капсулы, таблетки или пастилки, содержащих заданное количество варианта полипептида нейбластина; либо подобные композиции могут быть приготовлены в виде суспензии в водной или неводной жидкости - в виде сиропа, эликсира, эмульсии либо иного жидкого лекарства.
Терапевтически эффективные количества фармацевтической композиции могут быть введены индивиду, нуждающемуся в подобном лечении, в дозировочном режиме, установленном специалистом в данной области. К примеру, композиция может быть введена индивиду, например, системно в дозировке от 0,01 до 1000 мкг/кг массы тела индивида в расчете на одну дозу. В другом примере дозировка составляет от 1 до 1000 мкг/кг массы тела индивида в расчете на одну дозу. В другом примере дозировка составляет от 1 до 30 мкг/кг массы тела индивида в расчете на одну дозу, к примеру от 3 до 10 мкг/кг массы тела индивида в расчете на одну дозу.
Для оптимизации терапевтической эффективности вначале вариант полипетид нейбластина вводится в различных дозировочных режимах. Единица и режим дозировки зависят от факторов, включающих в себя, к примеру, вид млекопитающего, иммунный статус и массу тела млекопитающего. В типичном случае уровни белка в тканях подвергаются мониторингу при помощи подходящих скрининговых методов в рамках процедуры клинического тестирования, к примеру определения эффективности режима лечения.
Определение частоты введения варианта полипептида нейбластина находится в рамках компетенции и клинической экспертизы врачей-клиницистов. В типичном случае режим введения определяется в клинических испытаниях, определяющих оптимальные параметры введения. Тем не менее в реальной практике допустимо варьирование определенных режимов в соответствии с возрастом, здоровьем, весом, полом и медицинским статусом индивида. Частота введения также может варьироваться в зависимости от типа нейропатии - острой либо хронической. Помимо этого, частота введения также может варьироваться в зависимости от цели введения - профилактической или терапевтической.
Способы лечения.
Варианты полипептида нейбластина применимы для регулировки метаболизма, дифференцировки и выживания нерва или нейрональной клетки. В частности, варианты полипептида нейбластина могут быть применены для лечения или частичного облегчения симптомов нарушения/расстройства или заболевания живого существа, к примеру человека, в случае, если данное нарушение/расстройство или заболевание отвечает на лечение нейротрофическим агентом.
Раскрытые в настоящем тексте варианты полипептида нейбластина (и содержащие их фармацевтические композиции) могут быть использованы в лечении нарушений, характеризующихся повреждением сенсорных нейронов или ганглиозных клеток сетчатки, в том числе ганглиозных нейронов заднего корешка спинного мозга, либо нейронов любой из нижеследующих тканей: коленчатый, каменистый и нодозный ганглий; вестибуло-акустический комплекс восьмого черепно-мозгового нерва; вентролатеральный полюс челюстной доли тройничного ганглия, тройничное мезенцефалическое ядро.
В некоторых воплощениях воздействие может оказываться на сенсорные нейроны и/или нейроны автономной нервной системы. В частности, может быть оказано воздействие на ноцицептивные и механорецептивные нейроны, в частности на А-дельта волокна, С-волокна и А-бета волокна. Помимо этого, воздействие может оказываться на симпатические и парасимпатические нейроны автономной нервной системы.
В некоторых воплощениях лечебное воздействие может оказываться при заболеваниях моторных нейронов, таких как боковой амиотрофический склероз (БАС) и спинальная мускульная атрофия. В других воплощениях варианты полипептида нейбластина могут быть использованы для улучшения восстановления нервов после повреждения в результате травмы. Альтернативно либо помимо этого, может быть использован канал направления нерва с матрицей, содержащей конъюгированные с полимером варианты полипептида нейбластина, либо слитые продукты или конъюгаты вариантов полипептида нейбластина. Подобные каналы направления нервов раскрыты, к примеру, в патенте США № 5834029.
В некоторых воплощениях варианты полипептида нейбластина (и содержащие их фармацевтические композиции) могут быть использованы для лечения различных заболеваний глаза, в том числе характеризующихся потерей фоторецепторов сетчатки у пациентов, страдающих дистрофией желтого пятна, пигментным ретинитом, глаукомой и другими подобными заболеваниями.
- 8 013565
В некоторых воплощениях варианты полипептида нейбластина (и содержащие их фармацевтические композиции) могут быть использованы для лечения: нейропатической боли, тактильной аллодинии, потери болевой чувствительности, ассоциированной с нейропатией, вирусных инфекций и вирусассоциированной нейропатии, боли, ассоциированной с диабетической нейропатией, и заболеваний нервной системы.
Данные способы лечения детально описаны в нижеследующих подразделах.
1. Лечение нейропатической боли.
Раскрытые в настоящем тексте варианты полипептида нейбластина (и содержащие их фармацевтические композиции) могут быть использованы в способах лечения нейропатической боли у индивида, включающих в себя введение индивиду эффективного количества варианта полипептида нейбластина в виде монотерапии либо вместе с эффективным количеством обезболивающего препарата, выбранного из группы, состоящей из опиатов, антиаритмических препаратов, топических анальгетиков, местных анальгетиков, антиконвульсантов, антидепрессантов, кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных препаратов (НСПВП). В одном из воплощений обезболивающим препаратом является антиконвульсант. В другом воплощении обезболивающим препаратом является габапентин ((1-аминометил)циклогексануксусная кислота) либо прегабалин (8-(+)-4-амино-3-(2-метилпропил)бутановая кислота).
Раскрытые в настоящем тексте варианты полипептида нейбластина (и содержащие их фармацевтические композиции) могут быть использованы в лечении нейропатической боли, ассоциированной с периферическими нейропатиями. Среди периферических нейропатий, в лечении которых могут применяться варианты полипептида нейбластина, можно отметить нейропатии, ассоциированные с травмой, к примеру вызванные физическим повреждением или болезненным состоянием, физические повреждения головного или спинного мозга, инсульт, ассоциированный с повреждением головного мозга, и неврологические нарушения, связанные с нейродегенерацией.
Раскрытые в настоящем тексте варианты полипептида нейбластина (и содержащие их фармацевтические композиции) могут быть использованы в лечении множества нейропатий, включающих в себя:
(a) нейропатии, индуцированные травмой;
(b) нейропатии, индуцированные химиотерапией;
(c) токсин-индуцированные нейропатии (включающие в себя, но не ограниченные нейропатиями, индуцированными интоксикацией алкоголем, витамином В6, гексакарбоновой интоксикацией, интоксикацией амиодароном, хлорамфениколом, дисульфирамом, изониазидом, золотом, литием, метронидазолом, мизонидазолом, нитрофурантоином);
(б) нейропатии, в том числе нейропатическая боль, индуцированные лекарственными препаратами (такими как противоопухолевые агенты, в особенности выбранные из группы, состоящей из таксола, таксотера, цисплатина, нокодазола, винкристина, виндезина и винбластина; а также такими как противовирусные препараты, в особенности выбранные из группы, состоящей из ббГ, ЭЭС, 64Т, фоскарнета, дапзона, метронидазола и изониазида);
(е) нейропатии, индуцированные дефицитом витаминов (включая, без ограничений, дефицит витамина В12, дефицит витамина В6, дефицит витамина Е);
(!) идиопатические нейропатии;
(д) диабетические нейропатии;
(к) патоген-индуцированные повреждения нервов;
(ί) воспалительные повреждения нервов;
(ί) нейродегенерации;
(k) врожденные нейропатии (включающие, без ограничений, атаксию Фридрейха, семейную амилоидную полинейропатию, болезнь Танжье, болезнь Фабри);
(l) метаболические нарушения (включающие, без ограничений, почечную недостаточность и гипотиреоз);
(т) инфекционные и вирусные нейропатии (включающие, без ограничений, нейропатии, ассоциированные с лепрой, болезнью Лайма, нейропатические боли, ассоциированные с вирусной инфекцией, в частности с инфицированием вирусом, выбранным из группы, содержащей герпесвирус (к примеру, Ьегрез /О51ег инфекция которого может приводить к постгерпетической невралгии), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и папилломавирус);
(п) аутоиммунные нейропатии (включающие, без ограничений, синдром Гийена-Барре, хроническую воспалительную демиелинизирующую нейропатию, моноклональную гаммапатию неизвестной этиологии и полинейропатию;
(о) невралгию тройничного нерва и синдромы защемления (включающие, без ограничения, синдром запястного канала) и (р) другие синдромы, сопровождающиеся нейропатической болью, в том числе посттравматическую невралгию, фантомные боли в ампутированных конечностях, боли при рассеянном склерозе, комплексные синдромы региональной боли (включающие, без ограничений, рефлекторную симпатическую дистрофию, каузалгию), боли при онкологических заболеваниях, нейропатии при васкулите/ангиопатии,
- 9 013565 ишиалгию.
Нейропатическая боль может проявляться в виде аллодинии, гиперальгезии, в виде спонтанных или фантомных болей.
2. Лечение тактильной аллодинии.
Раскрытые в настоящем тексте варианты полипептида нейбластина (и содержащие их фармацевтические композиции) могут быть использованы при лечении тактильной аллодинии у индивида.
В типичном случае термин тактильная аллодиния относится к состоянию индивида, при котором боль провоцируется стимуляцией кожи (к примеру, прикосновением), в норме не вызывающей боли.
В некоторых воплощениях тактильная аллодиния может лечиться путем введения индивиду фармацевтически эффективных количеств варианта полипептида нейбластина. В родственном воплощении тактильная аллодиния может лечиться путем введения индивиду фармацевтически эффективных количеств варианта полипептида нейбластина в виде монотерапии либо вместе с эффективным количеством обезболивающего препарата, выбранного из группы, состоящей из опиатов, антиаритмических препаратов, топических анальгетиков, местных анальгетиков, антиконвульсантов, антидепрессантов, кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных препаратов (НСПВП). В одном из воплощений обезболивающим препаратом является антиконвульсант. В другом воплощении обезболивающим препаратом является габапентин ((1-аминометил)циклогексануксусная кислота либо прегабалин (З-(+)-4-амино-3-(2метилпропил)бутановая кислота).
В некоторых воплощениях вариант полипептида нейбластина вводится совместно с терапевтическим агентом, включающим, без ограничений, противоопухолевый препарат или противовирусный агент. Противораковые агенты включают в себя, без ограничений, таксол, таксотер, цисплатин, нокодазол, винкристин, виндезин и винбластин. Противовирусные агенты включают в себя, без ограничений, άάΙ, ΌΌΟ, 64Т, фоскарнет, дапзон, метронидазол и изониазид.
3. Лечение снижения потери болевой чувствительности.
В другом воплощении раскрытые в настоящем тексте варианты полипептида нейбластина (и содержащие их фармацевтические композиции) могут быть использованы в способах лечения потери болевой чувствительности у индивида, страдающего нейропатией. В одном воплощении нейропатией является диабетическая нейропатия. В некоторых воплощениях потеря болевой чувствительности представляет собой потерю температурной болевой чувствительности. Данные способы включают в себя как профилактическое, так и терапевтическое лечение.
При профилактическом лечении вариант полипептида нейбластина вводится индивиду, входящему в группу высокого риска по развитию потери болевой чувствительности (в отношении подобного индивида ожидается, что у последнего - ранняя стадия нейропатии). В этом случае лечение вариантом полипептида нейбластина служит в качестве превентивного лечения у пациентов высокого риска.
При терапевтическом лечении вариант полипептида нейбластина вводится индивиду, страдающему потерей болевой чувствительности в результате нейропатии (в отношении подобного индивида ожидается, что у последнего - поздняя стадия нейропатии). В этом случае лечение вариантом полипептида нейбластина служит для восстановления у индивида адекватной болевой чувствительности.
4. Лечение вирусных инфекций и вирус-ассоциированных нейропатий.
Рассмотрено профилактическое лечение инфекционных и вирусных нейропатий.
Профилактическое лечение показано в случае диагностированной вирусной инфекции до появления нейропатической боли. В ходе лечения вариант полипептида нейбластина вводится для предотвращения появления нейропатической боли, в том числе, без ограничений, нейропатической боли, ассоциированной с лепрой, болезнью Лайма, нейропатической боли, ассоциированной с вирусной инфекцией, в частности с вирусом, выбранным из группы, содержащей герпесвирус (и более конкретно, йегреб хоб1ег. инфекция которым может приводить к постгерпетической невралгии), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и папилломавирус. В альтернативном воплощении вариант полипептида нейбластина вводится для уменьшения нейропатической боли в случае ее появления.
Симптомы острой вирусной инфекции часто включают в себя появление сыпи. Другие симптомы включают в себя, к примеру, развитие персистирующей боли в пораженной области тела, что является распространенным последствием инфекции вирусом йегреб хоб1ег (опоясывающий лишай). Постгерпетическая невралгия может длиться несколько месяцев и более, а также может появиться спустя несколько месяцев после исчезновения сыпи и других подобных симптомов.
5. Лечение боли при диабетической нейропатии.
Рассмотрено профилактическое лечение боли при диабетической нейропатии.
Профилактическое лечение диабетических нейропатий должно быть назначено после первичного диагноза диабета или ассоциированных с диабетом симптомов и до появления нейропатической боли. Профилактическое лечение боли при диабетической нейропатии может быть также назначено после отнесения индивида к группе риска по развитию диабета или ассоциированных с диабетом симптомов. В ходе лечения вариант полипептида нейбластина вводится для предотвращения появления нейропатической боли. В альтернативном воплощении вариант полипептида нейбластина вводится для уменьшения нейропатической боли в случае ее появления.
- 10 013565
6. Лечение нарушений нервной системы.
Раскрытые в настоящем тексте варианты полипептида нейбластина (и содержащие их фармацевтические композиции) могут быть использованы для лечения или предотвращения нарушения нервной системы у индивида (такого как человек) путем введения индивиду, нуждающемуся в подобном лечении, терапевтически эффективного количества варианта полипептида нейбластина, фармацевтической композиции, содержащей вариант полипептида. нейбластина, либо комплекса, включающего стабильный водорастворимый конъюгат варианта полипептида нейбластина, связанного с полиалкиленовым фрагментом, таким как ПЭГ.
Нарушением нервной системы может быть нарушение периферической нервной системы, такое как периферическая нейропатия или нейропатический болевой синдром. Люди являются предпочтительными субъектами для проведения лечения.
Вариант полипептида нейбластина может быть применен для лечения нейронального дефекта, включая, без ограничений, повреждения и травмы нейронов. Периферические нервы, подвергающиеся травме, включают, без ограничений, нервы спинного мозга. Варианты полипептида нейбластина могут быть использованы для лечения нейродегенеративных заболеваний, к примеру ишемических поражений нейронов коры головного мозга; нейропатии, к примеру периферической нейропатии, болезни Альцгеймера, болезни Хантингтона, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического селероза (БАС). Подобные варианты полипептида нейбластина могут быть использованы для лечения нарушений памяти, к примеру, ассоциированных с деменцией.
Ниже следуют примеры практических воплощений изобретения. Данные примеры не должны быть интерпретированы как каким-либо образом ограничивающие спектр практических воплощений изобретения.
Примеры
Пример 1. Конструирование и синтез вариантов полипептида нейбластина.
Человеческий нейбластин был получен в виде кристалла, и анализ его структуры выявил триаду сульфат-ионов, связывающихся со следующими четырьмя аминокислотными остатками нейбластина в тесной близости друг к другу: Агд 14, Агд 48, Агд 49 и Агд 51. На основании их взаимного расположения, а также на основании присутствия данной триады было предположено, что данный регион нейбластина может быть потенциальным гепарин-связывающим сайтом. Далее, решенная ранее структура гепаринсульфата была протестирована ш кШсо на связывание с нейбластином в области сульфатной триады последнего. Гепаринсульфат связывался точно в области сульфатной триады нейбластина, что говорит о потенциальной гепарин-связывающей функции данного региона нейбластина.
Данные, полученные в результате анализа кристаллической структуры нейбластина, также выявили наличие следующих аминокислотных остатков, предоставляющих дополнительные сайты связывания для триады сульфат-ионов либо для одного или более из трех других сульфат-ионов, связывающихся с нейбластином: 8ег 46, 8ег 73, С1у 72, Агд 39, С1п 21, 8ег 20, Агд 68, Агд 33, Ηίκ 32 и Уа1 94. Помимо сульфат-связывающих сайтов нейбластина, выявленных в ходе анализа кристаллической структуры, нейбластин также содержит консенсусную последовательность гепаринсульфат-связывающего сайта (СРС8ВАВ) - с 3 по 9 аминокислотный остаток на Шконце. В кристаллической структуре данный регион был неструктурирован, однако он может быть структурирован в результате связывания с гликозаминогликанами. Данный регион, вероятно, пространственно близок к трехсульфатному кластеру, наблюдаемому в кристалле (Агд 14 относится к гепарин-связывающему сайту, локализованному главным образом в шарнирном участке белка).
Для изучения биологической значимости потенциального гепарин-связывающего домена, было выполнено замещение трех индивидуальных аминокислотных остатков в зрелом 113-аминокислотном нейбластине человека (8ЕС ΙΌ N0:1). Остатки аргинина в каждой из позиций 48 (модификация Агд 48Е; 8ЕС ΙΌ N0:2), 49 (модификация Агд 49Е; 8ЕС ΙΌ N0:3) и 51 (модификация Агд 51Е; 8ЕС ΙΌ N0:4) были замещены на глутамат (т. е. были получены три различных модифицированных конструкта с одной аминокислотной заменой - каждый) с целью замены остатка, заряженного таким образом, что он притягивает сульфат-ион, на остаток, заряженный таким образом, что он отталкивает сульфат-ион, а также с целью потенциальной стабилизации окружающих остатков аргинина. Белки были подвергнуты рефолдингу и выделены из телец включения Е.сой (см. патент \У0 04/069176). Каждый из вариантов нейбластина был подвергнут анализу для верификации структурной целостности и наличия правильной аминокислотной замены. Все три мутанта были структурно сопоставимы с человеческим нейбластином дикого типа.
Пример 2. Катионная хроматография и хроматография на гепарин-сефарозе.
Варианты полипептида нейбластина были подвергнуты дальнейшему биохимическому анализу для выяснения влияния каждой из мутаций на связывание с гепарином. Были использованы катионная хроматография и хроматография на гепарин-сефарозе.
Поскольку человеческий нейбластин дикого типа является основным белком с наблюдаемой рI 11,31, нейбластин эффективно связывается с катионными смолами. Единичная замена аргинина на глутамат приводила к снижению наблюдаемой рI до 10,88. Однако авторы не ожидали от подобного сниже- 11 013565 ния ρΙ значительного влияния ни на связывание с катионной смолой, ни на элюционный профиль мутантов по сравнению с контролем дикого типа.
Каждый из мутантов (вместе с контрольным нейбластином дикого типа) был подвергнут катионной хроматографии. Пробы были помещены на смолу в буфере, содержащем 5 мМ фосфата, рН 6,5 и 150 мМ хлорида натрия, после чего была проведена элюция линейным градиентом соли, начиная со 150 мМ и заканчивая 1 М хлорида натрия. Нейбластин дикого типа элюировался при ~800 мМ хлорида натрия (фиг. 2А; пик Ό), в то время как каждый из мутантов элюировался при концентрации соли в районе 500 мМ, что отражает их сниженное значение ρΙ. Агд 49Е и Агд 51Е (фиг. 2А; пики В и С) элюировались при несколько более высокой концентрации соли, нежели была необходима для элюции Агд 48Е (фиг. 2А; пик А) (520 против 490 мМ соответственно). Данное различие может отражать более доступную поверхность Агд 48 и ее больший вклад в катионное связывание по сравнению с другими остатками аргинина, замещенными в других мутантах.
Для выяснения эффекта замен Агд на С1и на связывание с гепарином каждый из трех мутантов (вместе с контрольным нейбластином дикого типа) был подвергнут хроматографии на гепарин-сефарозе (фиг. 2В). Условия связывания со смолой и элюции были аналогичны таковым для катионной хроматографии. Однако элюционный профиль значительно отличался от такового, полученного при катионной хроматографии. Нейбластин дикого типа элюировался при концентрации хлорида натрия около 720 мМ (фиг. 2В; пик Н), в то время как Агд 51Е, Агд 49Е и Агд 48Е элюировались при 570 мМ (фиг. 2В; пик 6), 510 мМ (фиг. 2В; пик Е) и 570 мМ (фиг. 2В; пик Е) хлорида натрия соответственно. Замена Агд 48Е оказывала в особенности сильное влияние на связывание с гепарином. В целом, данные хроматографические профили указывают на то, что каждая из мутаций снижает наблюдаемую аффинность связывания нейбластина с гепарином.
Пример 3. Анионная хроматография.
При стандартных условиях - рН 6,5 и концентрации хлорида натрия 150 мМ - нейбластин не связывается с анионными смолами. Напротив, гепаринсульфат в данных условиях связывается с анионными смолами.
В случае, когда нейбластин был смешан с 16 кДа-гепаринсульфатом в молярном соотношении 1:1 и помещен на анионный матрикс при вышеуказанных условиях, нейбластин связывался и элюировался 600 мМ хлоридом натрия (фиг. 3В, дорожки ЕТ), что указывает на то, что нейбластин связывается с анионным матриксом опосредованно за счет связывания с гепаринсульфатом. В отсутствие гепарина нейбластин не связывался с анионной смолой (фиг. 3А, дорожки ЕТ) и нейбластин не детектировался во фракции, элюированной 600 мМ хлоридом натрия (фиг. 3А, дорожки Элюция). Полученные данные предоставляют еще одно доказательство способности нейбластина связывать гепарин.
Пример 4. Исследования связывания клеток яичника китайского хомячка.
Ранее было показано, что нейбластин неспецифично связывается с поверхностью клеток яичников китайского хомячка (СНО-клетки). Анализ связывания нейбластина с СНО-клетками проводился с целью определения, является ли это связывание опосредованным, по крайней мере отчасти, связыванием нейбластина с молекулами гепаринсульфата на поверхности клеток. Человеческий нейбластин дикого типа (40 мкг) либо Агд 48Е-мутант смешивали с СНО-клетками (106 клеток) при плотности последних, обеспечивающей полное связывание обеих форм гепарина, вместе с увеличивающимися количествами 16 кДа-гепаринсульфата и инкубировали при 37°С 4 ч. После инкубации клетки осаждали центрифугированием и несвязывавшийся нейбластин в супернатанте определяли δΌδ/РАСЕ-анализом. После денситометрической количественной оценки полосы белка полученные значения оптической плотности соотносили с соответствующими концентрациями гепаринсульфата в каждой из проб (фиг. 4).
При двух наименьших концентрациях гепарина количества идентифицированных в супернатантах мутантного нейбластина и нейбластина дикого типа были равны. Однако при увеличении концентрации гепарина до 0,5 мкг/мл и выше количество идентифицированного в супернатанте нейбластина дикого типа было выше, нежели таковое Агд 48Е-мутанта. Данное наблюдение указывает на то, что гепарин в супернатанте может конкурировать с гепарином, связанным с клеточной поверхностью, за связывание с нейбластином дикого типа (т.е. связывание гепарина в супернатанте с нейбластином приводит к удалению последнего с клеточной поверхности), в то время как гепарин не может столь же легко конкурировать за связывание с Агд 48Е-мутантом. При наибольшей концентрации гепарина (50 мкг/мл) Агд 48Емутант начинает элюироваться с клеточной поверхности, что указывает на то, что ионные взаимодействия между гепарином и Агд48Е-мутантом могут быть причиной явления, лежащего в основе данного наблюдения.
Пример 5. Связывание нейбластина дикого типа и вариантов полипептида нейбластина с гепарином.
С целью дальнейшего изучения роли идентифицированной аргининовой триады в качестве гепарин-связывающего сайта нейбластина был разработан основанный на методе ЕЫ8А тест на связывание с гепарином.
Краткое описание: моноклональные антитела к нейбластину иммобилизовали в лунках 96-луночных планшет, после чего планшеты промывали и добавляли одну из форм нейбластина. После
- 12 013565 этого добавляли биотинилированный гепарин, вновь промывали и комплексы гепарина с нейбластином детектировали при помощи конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена и хемилюминесцентного субстрата. Данный ЕЫБА-тест на связывание с гепарином использовали для сравнения 113-аминокислотной формы (8ЕО ΙΌ N0:1) и 104-аминокислотной формы (аминокислоты 10-113 в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1) человеческого нейбластина дикого типа с вариантами полипептида нейбластина, содержащими единичные аминокислотные замены (Агд 48Е, Агд 49Е и Агд 51Е; 8Е0 ΙΌ N0:2-4), а также с полипептидом, содержащим двойную замену (Агд 48, 49Е; 8Е0 ΙΌ N0:5).
Обе формы нейбластина дикого типа связывались с гепарином с ЕС50~1 нг/мл гепарина (фиг. 5). Агд 49Е и Агд 51Е связывались менее эффективно с наблюдаемой ЕС50~10 нг/мл, однако максимальное связывание оставалось таким же (фиг. 5). Среди трех единичных точечных мутаций Агд 48Е оказывала наиболее яркий эффект на связывание с гепарином, с наблюдаемой ЕС50~100 нг/мл, однако максимальное связывание с гепарином все еще достигало значений, идентичных таковым для немодифицированных форм нейбластина (фиг. 5). Таким образом, Агд 48Е-мутант связывал гепарин в 100 раз менее эффективно по сравнению с немодифицированными формами нейбластина и в 10 раз менее эффективно по сравнению с другими мутантами с единичными заменами. В случае двойного замещения Агд 48 и Агд 49 на глутамат гепарин-связывающая активность оказывалась почти полностью элиминированной, с семикратным снижением максимального связывания с гепарином, однако значение ЕС50 оставалось в пределах, характерных для мутантов с единичными заменами. Данные результаты указывают на то, что Агд 48 играет важную роль в связывании гепарина возможно в силу центральной локализации предполагаемого гепарин-связывающего сайта.
Пример 6. Анализ активации киназного рецептора нейбластином дикого типа и вариантами полипептида нейбластина с мутациями в гепарин-связывающем сайте.
Для определения влияния мутаций в гепарин-связывающем сайте на сигнальный путь через рецептор нейбластина в клеточном анализе мутантные формы нейбластина и нейбластин дикого типа были исследованы при помощи анализа активации киназного рецептора (КГКА-анализа).
Все мутанты с единичным замещением Агд на 01и в данном анализе демонстрировали идентичную немодифицированному контролю КГКА-активность, что указывает на структурное сходство с полипептидом дикого типа и способность активировать рецептор нейбластина и ассоциированный сигнальный каскад (фиг. 6). Более того, полученные данные указывают на то, что для активации рецептора не требуется связывание с гепарином.
Двойной мутант Агд 48, 49Е (8Е0 ΙΌ N0:5; 113-аминокислотная форма) в КЖА-анализе демонстрировал сдвиг наблюдаемой ЕС50 приблизительно на порядок влево с повышением максимальной активации рецептора по сравнению с контрольным человеческим нейбластином дикого типа (фиг. 7А). Подобный же эффект повышения активности по сравнению с контрольным человеческим нейбластином дикого типа демонстрировал двойной мутант Агд 48, 49Е (8Е0 ΙΌ N0:7; 104-аминокислотная форма) (фиг. 7В). Каждый из двойных мутантов Агд 48, 51Е и Агд 49, 51Е (8Е0 ΙΌ N0:9 и 8Е0 ΙΌ N0:8 соответственно; 113-аминокислотные формы) демонстрировал КГКА-активность, схожую с немодифицированным контрольным нейбластином.
Пример 7. Анализ тройного комплекса.
Человеческий нейбластин дикого типа и каждый из мутантов в гепарин-связывающем сайте были проанализированы при помощи двух несколько различающихся протоколов. В первом протоколе компоненты рецептора нейбластина (0ЕКа1рйа3 и КЕТ) комбинировали с нейбластином в единый пул и добавляли в лунки планшеты для ЕЫБА с иммобилизованными антителами (фиг. 8). Во втором протоколе данные компоненты последовательно добавляли в лунки планшеты для ЕЫБА в следующей последовательности: СЕКа1р11а3. нейбластин и КЕТ (фиг. 9). В эксперименте по протоколу, предусматривающему пулирование реагентов, максимальное связывание было достигнуто как с Агд 48Е, так и с Агд 48, 49Е, что указывает на то, что данные формы нейбластина обладают наивысшей аффинностью к своему рецептору. Нейбластин дикого типа связывался с аффинностью, схожей с таковой Агд 49Е-мутанта, в то время как Агд 51Е и тройной мутант (с замещенными на глутамат аминокислотными остатками Агд 48, 49 и 51) демонстрировали наихудшее связывание с рецептором.
В эксперименте по протоколу, предусматривающему последовательное добавление компонентов, наилучшее связывание с рецептором демонстрировал Агд 48Е. В то же время при данных условиях двойной мутант связывался с рецептором слабо с аффинностью, близкой к таковой Агд 51Е-мутанта. Агд 49Е и нейбластин дикого типа демонстрировали аффинность к рецептору, промежуточную между наблюдаемыми максимумом и минимумом связывания. Тройной мутант в данных условиях не связывался. В целом полученные данные указывают на то, что Агд 48 оказывает наибольшее влияние на аффинность связывания нейбластина с его рецептором.
- 13 013565
Пример 8. Исследование кругового дихроизма в ближнем и дальнем УФ-диапазонах.
Для дальнейшего изучения эффектов двойного мутирования на вторичную и третичную структуры были изучены спектры кругового дихроизма двойного Агд 48, 49-мутанта в ближнем и дальнем УФ-диапазонах. Хотя незначительные отличия во вторичной и третичной структурах этих полипептидов были детектированы, конформация двойного мутанта была очень близка к таковой нейбластина дикого типа.
Пример 9. Фармакокинетический анализ Агд 48, 49Е-двойного мутанта человеческого нейбластина.
Человеческий нейбластин демонстрирует неудовлетворительную фармакокинетику (ФК) при введении крысам внутривенно (в/в) или подкожно (п/к) с общей биодоступностью менее 1%. Клиренс за счет связывания с гепарином может быть одной из причин столь низкой биодоступности. Для ответа на вопрос, является ли клиренс за счет связывания с гепарином участником быстрого процесса выведения человеческого нейбластина из организма крысы, Агд 48, 49Е-двойной мутант (вместе с контролем дикого типа) были изучены в ФК-анализе.
Обе формы вводили отдельно крысам в дозировке 7 мг/кг п/к. Пробы сывороток крови собирали начиная с 1 ч и заканчивая 96-м и анализировали на нейбластин (фиг. 10). Наблюдаемая площадь под кривой (АИС) для нейбластина дикого типа составляла ~109, в то время как наблюдаемая площадь под кривой (АИС) для двойного мутанта составляла 20145. Это соответствует 185-кратному увеличению АИС двойного мутанта (по сравнению с нейбластином дикого типа) и значительному увеличению сывороточной экспозиции.
Нейбластин дикого типа и двойной мутант нейбластина также были изучены в ФК-анализе в условиях в/в введения (1 мг/кг). Начальная концентрация двойного мутанта в плазме была приблизительно в 6 раз выше (ромбы) таковой контроля дикого типа (квадраты) спустя 5 мин после инъекции, однако в течение 1 ч быстро сравнивалась с концентрацией полипептида дикого типа (фиг. 11). Полученные данные указывают на то, что двойное мутирование увеличивает сывороточную экспозицию, однако не оказывает эффекта на общую скорость выведения.
Вместе с результатами ФК-анализа в условиях п/к введения полученные данные указывают на то, что связывание с гепарином в особенности релевантно в условиях подкожного введения, что, возможно, приводит к подобию эффекта депо. Как только нейбластин поступает в циркуляцию, скорость выведения молекул дикого типа и двойного мутанта приблизительно одинаковы.
Для изучения скорости выведения нейбластина из циркуляции в организме крысы двойная мутантная форма нейбластина, а также нейбластин дикого типа были подвергнуты ПЭГилированию 10 кДа ПЭГ с использованием основанной на ЗРА конъюгационной химии. Поскольку нейбластин представляет собой гомодимер без нативных остатков лизина, 10 кДа фрагменты специфично метят №конец каждого из мономеров. 2Х10К ПЭГилированный человеческий нейбластин с двойным мутированием был очищен до гомогенности и проанализирован с использованием структурных и биологических методов до ФК-анализа.
2Х10К ПЭГилированный Агд 48, 49Е-двойной мутант вводили крысам в/в (1 мг/кг) или п/к (7 мг/кг) и в разные временные точки собирали сыворотку для анализа. После в/в введения концентрация 2Х10К ПЭГилированного двойного мутанта достигала теоретической Стах=10 мкг/мл (ромбы) с типичными альфа- и бета-фазами (фиг. 12). П/к введение ПЭГилированного двойного мутанта демонстрировало Стах=40 мкг/мл спустя 24 ч после инъекции (фиг. 12). После поступления препарата в циркуляцию наблюдаемая скорость клиренса соответствовала таковой при в/в введении. Биодоступность данного конструкта составляла приблизительно 10% по сравнению с менее чем 1% неПЭГилированного или ПЭГилированного человеческого нейбластина дикого типа.
Пример 10. Экспрессия мутантного нейбластина со сниженной гепарин-связывающей активностью в клетках яичника китайского хомячка.
Плазмидные конструкты, кодирующие человеческие мутантный нейбластин и нейбластин дикого типа, экспрессировали в СНО-клетках и количества секретируемого растворимого белка измеряли методом ЕЫЗА. Использованные в данных экспериментах плазмидные конструкты кодируют слитый белок, содержащий сигнальную последовательность человеческого гормона роста (З1дРер) (с включением интрона в плазмиду или без него), соединенную с (1) 104 С-концевыми аминокислотами человеческого нейбластина дикого типа, либо (и) Агд 48, 49Е-двойной мутант боиЫе ти1ап1 (104-аминокислотная форма).
Ниже следуют последовательности слитых белков нейбластина, использованных в данных экспериментах. Последовательности нейбластина напечатаны прописными буквами. Последовательности сигнального пептида человеческого гормона роста напечатаны строчными буквами. Соединения последовательностей сигнального пептида и нейбластина отмечено значком Л. Аминокислоты в позициях 48 и 49 подчеркнуты.
- 14 013565
51дРер-МВЫ (дикий тип):
ша1:дзг1:5111а£д11с1зм1дедзалААСАКССКЬР30Ь7РУ
ВАЬСЬбНКЗОЕЬУКЕНЕСЗСЗСВВАКЗРНОЬЗЬАЗЬЬбАСАЬКРРРбЗНРУЗдРССКРТКУЕА ν8ΕΜϋνΝ8№ΤνρηΣ8ΑΤΑ00αΐ6 (ЗЕ<2 Ю N0:13).
З^дРер-ИВЫ (Агд48, 49Е) :
таЬдзгЪз1иа£д11с1зи1дедзалААСАКССЕЬКЗ<2Е7Р
УКАЬСЬСЯКЗОЕЬУКГКГСЗСЗСЕЕАКЗРНОЪЗЬАЗЬЬСАеАЪКРРРСЗКРУЗСРССКРТКУЕ
А73П'40’Л13ТИР;Т70КЬ£АТАС0СЬС (ЗЕО 10 N0:14).
СНО-клетки трансфицировали плазмидами, кодирующими каждую из вышеупомянутых форм нейбластина, и культивировали в 384-луночных планшетах. Спустя несколько недель, растущие клетки пересаживали в свежие 96-луночные планшеты. Для определения титра растворимого нейбластина культуральную среду анализировали методом ЕЬГ8А и определяли данные кумулятивного поглощения (среднее значение и величину ошибки, соответствующую одному стандартному отклонению), соответствующие каждой из протестированных плазмид.
По сравнению с плазмидами, кодирующими нейбластин дикого типа, трансфекция СНО-клеток плазмидами, кодирующими Агд 48, 49Е-двойной мутант, приводила к значительному увеличению числа клеточных линий, демонстрирующих высокую экспрессию рекомбинантного белка (фиг. 13).
Лидирующие клеточные линии из каждой трансфекции дополнительно подращивали. Фиксированное число клеток культивировали на протяжении 3 дней, после чего определяли общее число клеток, их жизнеспособность и титр нейбластина. Титры нейбластина, экспрессированного в лидирующих клеточных линиях, содержащих Агд 48, 49Е-двойной мутант, были приблизительно в 5 раз выше таковых в лидирующих клеточных линиях, экспрессирующих нейбластин дикого типа.
Другие воплощения.
Хотя изобретение было описано в комплексе с его детализированным описанием, вышеупомянутое описание носит иллюстративный характер и не предполагает ограничения объема данного изобретения, который определен объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации включены в объем притязаний нижеследующей формулы изобретения.
- 15 013565
Список последовательностей <110> Входеп Гс1ес МА 1пс.
<12 0> ВАРИАНТЫ НЕЙБЛАСТИНА <130> 13751-065ИО1 <140> РСТ/Ы32005/029637 <141> 2005-08-18 <150> 03 60/602,825 <151> 2004-08-19 <150> ОЗ 60/694,067 <151> 2005-06-24 <160> 14 <170> ГазЕЗЕО £ог ИТпйоиз Уегзхоп 4.0 <210> 1 <211> 113 <212> РКТ <213> Ното зарАепз <400> 1
| А1а | 61у | С1у | Рго | 61у | Зег | Агд | А1а | Агд | А1а | А1а | б1у | А1а | Агд | 61у | Суз |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Агд | Ьеи | Агд | Зег | 61п | Ьеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Агд | А1а | Ьеи | 61у | Ьеи | 61у | Н18 |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Агд | Зег | Азр | 61и | Ьеи | Уа1 | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Суз | Зег | 61 у | Зег | Суз | Агд |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Агд | А1а | Агд | Зег | Рго | Нхз | Азр | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи | 61 у | А1а |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| С1у | А1а | Ьеи | Агд | Рго | Рго | Рго | 61у | Зег | Агд | Рго | Уа1 | Зег | 61п | Рго | Суз |
70 75 80
Суз Агд Рго ТЬг Агд Туг 61и А1а 7а1 Зег РЬе МеЕ Азр Та1 Азп Зег
90 95
| ТЬг Тгр Агд ТЬг Уа1 Азр Агд Ьеи Зег А1а ТЬг А1а Суз 61у Суз Ьеи | ||
| 100 | 105 | 110 |
| 61у |
<210> 2 <211> 113 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Иллюстративный вариант полипептида человеческого нейбластина <400> 2
| А1а 1 | 61У | 61у | Рго 61у Зег Агд А1а Агд А1а А1а 31 у А1а Агд 61у Суз | ||||||||||||
| 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
| Агд | Ьеи | Агд | Зег | 61П | Ьеи | νβΐ | Рго | Уа1 | Агд | А1а | Ьеи | 61 у | Ьеи | 61у | Нхз |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Агд | Зег | Азр | 61и | Ьеи | Уа1 | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Суз | Зег | 61у | Зег | Суз | 61и |
| 35 | 40 | 45 |
- 16 013565
| Агд А1а | Агд 5ег | Рго | Н1з Азр Ьеи Зег Ьеи А1а Зег | Ьеи Ьеи | 61у | А1а | |||||||||
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| 61у | А1а | Ьеи | Агд | Рго | Рго | Рго | С1у | Зег | Агд | Рго | Уа1 | Зег | 61П | Рго | Суз |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Суз | Агд | Рго | ТЬг | Агд | Туг | В1и | А1а | Уа1 | Зег | РЬе | МеЬ | Азр | Уа1 | Азп | Зег |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| ТЬг | Тгр | Агд | ТЬг | Уа1 | Азр | Агд | Ьеи | Зег | А1а | ТЬг | А1а | Суз | Й1у | Суз | Ьеи |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| 61у |
<210> 3 <211> 113 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Иллюстративный вариант полипептида человеческого нейбластина <400> 3
| А1а | Шу | С1у | Рго | Й1у | Зег | Агд | А1а | Агд | А1а | А1а | Й1у | А1а | Агд | С1у | Суз |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Агд | Ьеи | Агд | Зег | б1п | Ьеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Агд | А1а | Ьеи | Й1у | Ьеи | 61у | Н1з |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Агд | Зег | Азр | 61и | Ьеи | Уа1 | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Суз | Зег | С1у | Зег | Суз | Агд |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| С1и | А1а | Агд | Зег | Рго | ΗΪ3 | Азр | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи | С1у | А1а |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| С1у | А1а | Ьеи | Агд | Рго | Рго | Рго | Й1у | Зег | Агд | Рго | 7а1 | Зег | 61п | Рго | Суз |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Суз | Агд | Рго | ТЬг | Агд | Туг | Б1и | А1а | Уа1 | Зег | РЬе | МеЬ | Азр | Уа1 | Авп | Зег |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| ТЬг | Тгр | Агд | ТНг | Уа1 | Авр | Агд | Ьеи | Зег | А1а | ТЬг | А1а | Суз | С1у | Суз | Ьеи |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| 61у |
<210> 4 <211> 113 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Иллюстративный вариант полипептида человеческого нейбластина <400> 4
| А1а | С1у | С1у | Рго | Й1у | Зег | Агд | А1а | Агд | А1а | А1а | 61у | А1а | Агд | 61у | Суз |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Агд | Ьеи | Агд | Зег | Й1п | Ьеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Агд | А1а | Ьеи | 61у | Ьеи | Й1у | Шз |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Агд | Зег | Азр | Й1и | Ьеи | Уа1 | Агд | РНе | Агд | РЬе | Суз | Зег | 61у | Зег | Суз | Агд |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Агд | А1а | С1и | Зег | Рго | Н1з | Азр | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи | 61у | А1а |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| 61у | А1а | Ьеи | Агд | Рго | Рго | Рго | С1у | Зег | Агд | Рго | Уа1 | Зег | С1п | Рго | Суз |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Суз | Агд | Рго | ТНг | Агд | Туг | 61и | А1а | 7а1 | Зег | РНе | МеЬ | Авр | Уа1 | Авп | Зег |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| ТЬг | Тгр | Агд | ТНг | Уа1 | Азр | Агд | Ьеи | Зег | А1а | ТНг | А1а | Суз | С1у | Суз | Ьеи |
| 100 | 105 | 110 |
- 17 013565
С1у <210> 5 <211> 113 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Иллюстративный вариант полипептида человеческого нейбластина <400> 5
| А1а | б1у | 61у | Рго | С1у | Зег | Агд | А1а | Агд | А1а | А1а | Иу | А1а | Агд | 01у | Суз |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Агд | Ьеи | Агд | Зег | <31п | Ьеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Агд | А1а | Ьеи | С1у | Ьеи | 61у | Нхз |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Агд | Зег | Азр | С1и | Ьеи | Уа1 | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Суз | Зег | 61 у | Зег | Су® | 61и |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| С1и | А1а | Агд | Зег | Рго | ΗΪ5 | Азр | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи | 61у | А1а |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| 61у | А1а | Ьеи | Агд | Рго | Рго | Рго | 61у | Зег | Агд | Рго | Уа1 | Зег | 61п | Рго | Суз |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Суз | Агд | Рго | ТЬг | Агд | Туг | С1и | А1а | Уа1 | Зег | РЬе | МеЕ | Азр | Уа1 | Азп | Зег |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| ТЬг | Тгр | Агд | ТЬг | Уа1 | Азр | Агд | Ьеи | Зег | А1а | ТЬг | А1а | Суз | 61у | Суз | Ьеи |
| 100 | 105 | 110 |
С1у <210> 6 <211> 99 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Иллюстративный вариант полипептида человеческого нейбластина <400> 6
| 61у | Суз | Агд | Ьеи | Агд | Зег | 61п | Ьеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Агд | А1а | Ьеи | С1у | Ьеи |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| 61у | Нхз | Агд | Зег | Азр | 61и | Ьеи | Уа1 | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Су® | Зех | 61у | Зег |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Суз | 61и | 61и | А1а | Агд | Зег | Рго | Нхз | Азр | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| 61у | А1а | 61у | А1а | Ьеи | Агд | Рго | Рго | Рго | С1у | Зег | Агд | Рго | Уа1 | Зег | 61п |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Рго | Суз | Суз | Агд | Рго | ТЬг | Агд | Туг | 61и | А1а | Уа1 | Зег | РЬе | МеЕ | Аар | Уа1 |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Азп | Зег | ТЬг | Тгр | Агд | ТЬг | 7а1 | Азр | Агд | Ьеи | Зег | А1а | ТЬг | А1а | Суз | С1у |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Суз | Ьеи | С1у |
<210> 7 <211> 104 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Иллюстративный вариант полипептида человеческого нейбластина
- 18 013565 <400> 7
| А1а | А1а | 61у | А1а | Агд | 31 у | Суз | Агд | Ьеи | Агд | Зег | 61п | Ьеи | Ча1 | Рго | Ча1 |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Агд | А1а | Ьеи | 61у | Ьеи | 61у | Н1з | Агд | Зег | Азр | С1и | Ьеи | Ча1 | Агд | РЬе | Агд |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| РЬе | Суз | Зег | 61у | Зег | Суз | С1и | С1и | А1а | Агд | Зег | Рго | Наз | Азр | Ьеи | Зег |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи | С1у | А1а | Б1у | А1а | Ьеи | Агд | Рго | Рго | Рго | С1у | Зег |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Агд | Рго | Ча1 | Зег | (31п | Рго | Суз | Суз | Агд | Рго | Ткг | Агд | Туг | 61и | А1а | Ча1 |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Зег | РЬе | Мек | Азр | Уа1 | Азп | Зег | ТЫ | Тгр | Агд | ТЫ | Ча1 | Азр | Агд | Ьеи | Зег |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| А1а | ТЬг | А1а | Суз | С1у | Суз | Ьеи | 61у | ||||||||
| 100 |
<210> 8 <211> 113 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Иллюстративный вариант полипептида человеческого нейбластина <400> 8
| А1а | 61у | (31у | Рго | 61у | Зег | Агд | А1а | Агд | А1а | А1а | 51у | А1а | Агд | С1у | Суз |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Агд | Ьеи | Агд | Зег | 61п | Ьеи | Ча1 | Рго | Уа1 | Агд | А1а | Ьеи | 61у | Ьеи | 61у | Н1з |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Агд | Зег | Азр | С1и | Ьеи | Ча1 | Агд | Рке | Агд | Рке | Суз | Зег | С1у | Зег | Суз | Агд |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| С1и | А1а | С1и | 8ег | Рго | Нгз | Азр | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи | В1у | А1а |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| С1у | А1а | Ьеи | Агд | Рго | Рго | Рго | С1у | Зег | Агд | Рго | Ча1 | Зег | С1п | Рго | Суз |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Суз | Агд | Рго | ТЬг | Агд | Туг | 61и | А1а | Ча1 | Зег | РЬе | Мек | Азр | Ча1 | Азп | Зег |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| ТЬг | Тгр | Агд | Ткг | Уа1 | Азр | Агд | Ьеи | Зег | А1а | Ткг | А1а | Суз | С1у | Суз | Ьеи |
| 100 | 105 | 110 |
61у <210> 9 <211> 113 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Иллюстративный вариант полипептида человеческого нейбластина <400> 9
| А1а | (51у | С1у | Рго | Б1у | 8ег | Агд | А1а | Агд | А1а | А1а | Б1у | А1а | Агд | 61у | Суз |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Агд | Ьеи | Агд | Зег | 01п | Ьеи | Ча1 | Рго | Ча1 | Агд | А1а | Ьеи | <31у | Ьеи | 61у | Ягз |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Агд | Зег | Азр | Б1и | Ьеи | ν31 | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Суз | Зег | С1у | Зег | Суз | С1и |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Агд | А1а | С1и | Зег | Рго | Н18 | Азр | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи | С1у | А1а |
| 50 | 55 | 60 |
- 19 013565
| СЬу | А1а | Ьеи | Агд | Рго | Рго | Рго | СЬу | Зег | Агд | Рго | Уа1 | Зег | С1п | Рго | Суз |
| 65 | 70 | 75 | 60 | ||||||||||||
| Суз | Агд | Рго | ТНг | Агд | Туг | С1и | АЬа | Уа1 | Зег | РЬе | МеД | Азр | Уа1 | Азп | Зег |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| ТЬг | Тгр | Агд | ТЬг | Уа1 | Азр | Агд | Ьеи | Зег | АЬа | ТЬг | А1а | Суз | СЬу | Суз | Ьеи |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| 61у |
<210> 10 <211> 220 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <400> 10
| МеД 61и 1 | Ьеи СЬу Ьеи 61у СЬу Ьеи Зег ТЬг | Ьеи Зег | Н1з | Суз | Рго 15 | Тгр | |||||||||
| 5 | 10 | ||||||||||||||
| Рго | Агд | Агд | С1п | Рго | АЬа | Ьеи | Тгр | Рго | ТЬг | Ьеи | АЬа | А1а | Ьеи | АЬа | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ьеи | Зег | Зег | Уа1 | А1а | СЬи | АЬа | Зег | Ьеи | СЬу | Зег | А1а | Рго | Агд | Зег | Рго |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| АЬа | Рго | Агд | С1и | СЬу | Рго | Рго | Рго | УаЬ | Ьеи | АЬа | Зег | Рго | АЬа | СЬу | Н1з |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ьеи | Рго | СЬу | СЬу | Агд | ТЬг | А1а | Агд | Тгр | Суз | Зег | С1у | Агд | АЬа | Агд | Агд |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Рго | Рго | Рго | С1п | Рго | Зег | Агд | Рго | А1а | Рго | Рго | Рго | Рго | АЬа | Рго | Рго |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Зег | АЬа | Ьеи | Рго | Агд | СЬу | С1у | Агд | АЬа | АЬа | Агд | АЬа | СЬу | СЬу | Рго | СЬу |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Зег | Ахд | А1а | Агд | АЬа | АЬа | СЬу | АЬа | Агд | СЬу | Суз | Агд | Ьеи | Адд | Зег | С1п |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ьеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Агд | АЬа | Ьеи | СЬу | Ьеи | СЬу | ΗΪ3 | Агд | Зег | Азр | СЬи | Ьеи |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| УаЬ | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Суз | Зег | СЬу | Зег | Суз | Агд | Агд | АЬа | Агд | Зег | Рго |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ηίβ | Азр | Ьеи | Зег | Ьеи | АЬа | Зег | Ьеи | Ьеи | СЬу | АЬа | <31 у | АЬа | Ьеи | Агд | Рго |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Рго | Рго | С1у | Зег | Агд | Рго | УаЬ | Зег | СЬп | Рго | Суз | Суз | Агд | Рго | ТЬг | Агд |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Туг | С1и | АЬа | Уа1 | Зег | РЬе | Мед | Азр | УаЬ | Азп | Зег | ТЬг | Тгр | Агд | ТЬг | УаЬ |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Азр | Агд | Ьеи | Зег | АЬа | ТЬг | АЬа | Суз | СЬу | Суз | Ьеи | СЬу | ||||
| 210 | 215 | 220 |
<210> 11 <211> 224 <212> РКТ <213> Миз тизсиЬиз <400> 11
| МеД | СЬи | Ьеи | СЬу | Ьеи | АЬа | СЬи | Рго |
| 1 | 5 | ||||||
| Рго | Агд | Тгр | СЬп | Зег | АЬа | Тгр | Тгр |
| 20 | |||||||
| Ьеи | Зег | Суз | УаЬ | ТЬг | СЬи | АЬа | Зег |
| 35 | 40 | ||||||
| АЬа | АЬа | Агд | Азр | СЬу | Рго | Зег | Рго |
| 50 | 55 | ||||||
| Ьеи | Рго | СЬу | СЬу | НЬз | ТЬг | АЬа | ΗΪ3 |
| ТЬг АЬа | Ьеи | Зег | Н1з | Суз | Ьеи 15 | Агд | |
| 10 | |||||||
| Рго 25 | ТЬг | Ьеи | АЬа | УаЬ | Ьеи 30 | А1а | Ьеи |
| Ьеи | Азр | Рго | МеД | Зег 45 | Агд | Зег | Рго |
| УаЬ | Ьеи | АЬа | Рго 60 | Рго | ТНг | Азр | НЬз |
| Ьеи | Суз | Зег | СЬи | Агд | ТНг | Ьеи | Агд |
- 20 013565
| ¢5 | 70 | 75 | 60 | ||||||||||||
| Рго | Рго | Рго | С1п | Зег | Рго | 51п | Рго | А1а | Рго | Рго | Рго | Рго | Б1у | Рго | А1а |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Ьеи | С1п | Бег | Рго | Рго | А1а | А1а | Ьеи | Агд | С1у | А1а | Агд | А1а | А1а | Агд | А1а |
| 100 | 105 | НО | |||||||||||||
| С1 у | ТЬг | Агд | Зег | Зег | Агд | А1а | Агд | ТЬг | ТЬг | Азр | А1а | Агд | С1у | Суз | Агд |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ьеи | Агд | Бег | 61п | Ьеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Зег | А1а | Ьеи | Е1у | Ьеи | 61у | ΗΪ3 | Зег |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Зег | Азр | 61и | Ьеи | Не | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Суз | Зег | 51У | Бег | Суз | Агд | Агд |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | Агд | Бег | 61п | Н1з | Азр | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи | 01 у | А1а | 51 у |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| А1а | Ьеи | Агд | Бег | Рго | Рго | 61у | Бег | Агд | Рго | Не | Бег | 51п | Рго | Суз | Суз |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Агд | Рго | ТЬг | Агд | Туг | С1и | А1а | Уа1 | Зег | РЬе | МеЬ | Азр | Уа1 | Азп | Бег | ТЬг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Тгр | Агд | ТЬг | Уа1 | Азр | ΗΪΞ | Ьеи | Бег | А1а | ТЬг | А1а | Суз | 61у | Суз | Ьеи | 61у |
| 210 | 215 | 220 |
| <210> 12 <211> 224 <212> РКТ <213> Рабби; | 5 по^едГсиз | ||||||||||||||
| <400> 12 | |||||||||||||||
| МеЬ | 61и | Ьеи | 51у | Ьеи | С1у | С1и | Рго | ТЬг | А1а | Ьеи | Зег | Н1з | Суз | Ьеи | Агд |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Рго | Агд | Тгр | С1п | Рго | А1а | Ьеи | Тгр | Рго | ТЬг | Ьеи | А1а | А1а | Ьеи | А1а | Ъеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ьеи | Зег | Зег | Уа1 | ТЬг | 51 и | А1а | Зег | Ьеи | Азр | Рго | МеЬ | Зег | Агд | Зег | Рго |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| А1а | Зег | Агд | Азр | Уа1 | Рго | Зег | Рго | Уа1 | Ьеи | А1а | Рго | Рго | ТЬг | Азр | Туг |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ьеи | Рго | 61у | 61у | НЬз | ТЬг | А1а | Н15 | Ьеи | Суз | Бег | 61и | Агд | А1а | Ьеи | Агд |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Рго | Рго | Рго | 61п | Зег | Рго | С1п | Рго | А1а | Рго | Рго | Рго | Рго | 51 у | Рго | А1а |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Ьеи | 61п | Зег | Рго | Рго | А1а | А1а | Ьеи | Агд | 51у | А1а | Агд | А1а | А1а | Агд | А1а |
| 100 | 105 | НО | |||||||||||||
| 51 у | ТЬг | Агд | Зег | Зег | Агд | А1а | Агд | А1а | ТЬг | Азр | А1а | Агд | С1у | Суз | Агд |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ъеи | Агд | Зег | 61П | Ъеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Зег | А1а | Ьеи | 61 у | Ъеи | 51у | Н1з | Зег |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Зег | Азр | 61и | Ьеи | Не | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Суз | Зег | 51у | Зег | Суз | Агд | Агд |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | Агд | Зег | Рго | Н±з | Азр | Ьеи | Бег | Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи | 51 у | А1а | 61 у |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| А1а | Ьеи | Агд | Бег | Рго | Рго | 61у | Зег | Агд | Рго | 11е | Зег | С1П | Рго | Суя | Суз |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Агд | Рго | ТЬг | Агд | Туг | 51и | А1а | УаЬ | Зег | РЬе | МеЬ | Азр | Уа1 | Азп | Зег | ТЬг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Тгр | Агд | ТЬг | Уа1 | Азр | Н1з | Ьеи | Зег | А1а | ТЬг | А1а | Суз | 51у | Суз | Ьеи | 51у |
210 215 220 <210> 13 <211> 130 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность
- 21 013565 <220>
<223> Синтетически полученный пептид <400> 13
| МеЬ А1а 1 | ТЬг С1у | Зег Агд 5 | ТЬг | Зег | Ьеи | Ьеи 10 | Ьеи АЬа РЬе | 61у | Ьеи 15 | Ьеи | |||||
| Суз | Ьеи | Зег | Тгр | Ьеи | 51п | С1и | СЬу | Зег | АЬа | А1а | АЬа | 01у | АЬа | Агд | СЬу |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Суз | Агд | Ьеи | Агд | Зег | 61п | Ьеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Агд | АЬа | Ьеи | 61у | Ьеи | 51у |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ηί з | Агд | Зег | Азр | С1и | Ьеи | Уа1 | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Суз | 5ег | С1у | Зег | Суз |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Агд | Агд | АЬа | Агд | Зег | Рго | НЬз | Азр | Ьеи | Зег | Ьеи | А1а | Зег | Ьеи | Ьеи | 51у |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| А1а | СЬу | А1а | Ьеи | Агд | Рго | Рго | Рго | С1у | Зег | Агд | Рго | УаЬ | Зег | С1п | Рго |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Суз | Суз | Агд | Рго | ТЬг | Агд | Туг | С1и | А1а | Уа1 | Зег | РЬе | МеЬ | Азр | Уа1 | Азп |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Зег | ТЬг | Тгр | Агд | ТЬг | Уа1 | Азр | Агд | Ьеи | Зег | АЬа | ТЬг | АЬа | Суз | С1у | Суз |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ьеи | (51у | ||||||||||||||
| 130 |
| <210> 14 | ||||||||||||||
| <211> 130 | ||||||||||||||
| <212> РКТ | ||||||||||||||
| <213> Искусственная | последовательность | |||||||||||||
| <220> | ||||||||||||||
| <223> Синтетически полученных пептид | ||||||||||||||
| <400> 14 | ||||||||||||||
| МеЪ АЬа | ТЬг | СЬу | Зег | Агд | ТЬг | Зег | Ьеи | Ьеи | Ьеи | А1а | РЬе | С1у | Ьеи | Ьеи |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Суз Ьеи | Зег | Тгр | Ьеи | СЬп | 51и | С1у | Зег | А1а | А1а | АЬа | Б1у | А1а | Агд | СЬу |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Суз Агд | Ьеи | Агд | Зег | 61п | Ьеи | Уа1 | Рго | Уа1 | Агд | АЬа | Ьеи | 61у | Ьеи | СЬу |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Н1з Агд | Зег | Азр | 61и | Ьеи | Уа1 | Агд | РЬе | Агд | РЬе | Суз | Зег | СЬу | Зег | Суз |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| С1и С1и | АЬа | Агд | Зег | Рго | НЬе | Азр | Ьеи | Зег | Ьеи | АЬа | Зег | Ьеи | Ьеи | С1у |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||
| АЬа СЬу | А1а | Ьеи | Агд | Рго | Рго | Рго | С1у | Зег | Агд | Рго | Уа1 | Зег | 61п | Рго |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||
| Суз Суз | Агд | Рго | ТЬг | Агд | Туг | 51и | АЬа | Уа1 | Зег | РЬе | Мек | Азр | Уа1 | Азп |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||
| Зег ТЬг | Тгр | Агд | ТЬг | Уа1 | Азр | Агд | Ьеи | Зег | А1а | ТЬг | АЬа | Суз | 51 у | Суз |
115 120 125
Ьеи 61у
130
Claims (56)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Вариант полипептида нейбластина, содержащий аминокислотную последовательность, по крайней мере на 80% идентичную аминокислотам 15-113 последовательности БЕр ΙΌ N0:1, где аминокислотная последовательность содержит замещенную аминокислоту, отличную от аргинина в положении 48 и в положении 49 аминокислотной последовательности БЕр ΙΌ N0:1; причем указанный вариант полипептида после димеризации связывается с комплексом, содержащим СЕВо.3 и ВЕТ, и где указанный вариант полипептида обладает значительно меньшей способностью связывать гепарин по сравнению с полипептидом нейбластина дикого типа с аминокислотной последовательностью БЕр ΙΌ N0:1.
- 2. Вариант полипептида по п.1, где остаток аргинина в положении 48 и остаток аргинина в положении 49 аминокислотной последовательности БЕр ΙΌ N0:1 замещены неконсервативными аминокислотными остатками.
- 3. Вариант полипептида по п.1, где остаток аргинина в положении 48 и остаток аргинина в положении 49 аминокислотной последовательности БЕр ΙΌ N0:1 замещены глутаминовой кислотой.
- 4. Вариант полипептида по любому из пп.1-3, содержащий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 90% идентична аминокислотам 15-113 последовательности БЕр ΙΌ N0:1.
- 5. Вариант полипептида по любому из пп.1-3, содержащий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична аминокислотам 15-113 последовательности БЕр ΙΌ N0:1.
- 6. Вариант полипептида по любому из пп.1-3, содержащий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 98% идентична аминокислотам 15-113 последовательности БЕр ΙΌ N0:1.
- 7. Вариант полипептида нейбластина, содержащий аминокислоты 15-113 последовательности БЕр ΙΌ N0:5.
- 8. Вариант полипептида нейбластина, содержащий аминокислоты 10-113 последовательности- 22 013565 <Τ) ΙΌ N0:5.
- 9. Вариант полипептида нейбластина, содержащий аминокислотную последовательность <Τ) ΙΌ N0:5.
- 10. Вариант полипептида нейбластина, состоящий из аминокислот 15-113 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:5.
- 11. Вариант полипептида нейбластина, состоящий из аминокислот 10-113 последовательности <Т) ΙΌ N0:5.
- 12. Вариант полипептида нейбластина, состоящий из аминокислотной последовательности <Т) ΙΌ N0:5 или <Т) ΙΌ N0:7.
- 13. Димер, содержащий два любых варианта полипептида нейбластина по любому из пп.1-12.
- 14. Конъюгат, содержащий вариант полипептида нейбластина по любому из пп.1-12, который связан с неприродным полимером.
- 15. Конъюгат по п.14, в котором неприродный полимер представляет собой полиалкиленгликоль.
- 16. Конъюгат по п.15, в котором полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль.
- 17. Конъюгат по любому из пп.14-16, в котором неприродный полимер связан с вариантом полипептида нейбластина на его аминоконце.
- 18. Конъюгат по любому из пп.14-16, в котором неприродный полимер связан с вариантом полипептида нейбластина по внутреннему сайту для конъюгирования полимера.
- 19. Слитый белок, содержащий вариант полипептида нейбластина по любому из пп.1-12 и гетерологичную аминокислотную последовательность.
- 20. Фармацевтическая композиция, содержащая вариант полипептида нейбластина по любому из пп.1-12, димер по п.13, конъюгат по любому из пп.14-18 или слитый белок по п.19, а также фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
- 21. Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую вариант полипептида нейбластина по любому из пп.1-12.
- 22. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.21.
- 23. Клетка, содержащая экспрессирующий вектор по п.22.
- 24. Способ получения варианта полипептида нейбластина, включающий получение клетки по п.23 и культивирование клетки в условиях, способствующих экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида нейбластина.
- 25. Способ лечения или предотвращения заболевания или нарушения нервной системы у млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества варианта полипептида нейбластина по любому из пп.1-12, димера по п.13, конъюгата по любому из пп.14-18 или слитого белка по п.19.
- 26. Способ лечения нейропатической боли у млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества варианта полипептида нейбластина по любому из пп.1-12, димера по п.13, конъюгата по любому из пп.14-18 или слитого белка по п.19.
- 27. Способ активации рецептора КЕТ у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества варианта полипептида нейбластина по любому из пп.1-12, димера по п.13, конъюгата по любому из пп.14-18 или слитого белка по п.19.
- 28. Способ по любому из пп.25-27, в котором млекопитающее является человеком.
- 29. Вариант полипептида нейбластина, содержащий аминокислотную последовательность, по крайней мере на 80% идентичную аминокислотам 15-113 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1, которая содержит по крайней мере одну замещенную аминокислоту по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0:1, выбранную из группы, состоящей из аминокислоты, отличной от серина в положении 20 8Е0 ΙΌ N0:1;аминокислоты, отличной от глутамина в положении 21 8Е0 ΙΌ N0:1;аминокислоты, отличной от гистидина в положении 32 8Е0 ΙΌ N0:1;аминокислоты, отличной от аргинина в положении 33 8Е0 ΙΌ N0:1;аминокислоты, отличной от аргинина в положении 39 8Е0 ΙΌ N0:1;аминокислоты, отличной от серина в положении 46 8Е0 ΙΌ N0:1;аминокислоты, отличной от аргинина в положении 68 8Е0 ΙΌ N0:1;аминокислоты, отличной от глицина в положении 72 8Е0 ΙΌ N0:1;аминокислоты, отличной от серина в положении 73 8Е0 ΙΌ N0:1; и аминокислоты, отличной от валина в положении 94 8Е0 ΙΌ N0:1, причем указанный полипептид после димеризации связывается с комплексом, содержащим СЕК/.3 и КЕТ.
- 30. Вариант полипептида по п.29, содержащий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 90% идентична аминокислотам 15-113 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1.
- 31. Вариант полипептида по п.29, содержащий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична аминокислотам 15-113 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1.- 23 013565
- 32. Вариант полипептида по п.29, содержащий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 98% идентична аминокислотам 15-113 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:1.
- 33. Вариант полипептида нейбластина, содержащий аминокислотную последовательность, по крайней мере на 80% идентичную последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:1, которая содержит по крайней мере одну замещенную аминокислоту по сравнению с 8ЕЦ ΙΌ N0:1, выбранную из группы, состоящей из аминокислоты, отличной от аргинина в положении 7 8ЕЦ ΙΌ N0:1;аминокислоты, отличной от аргинина в положении 9 8ЕЦ ΙΌ N0:1; и аминокислоты, отличной от аргинина в положении 14 8ЕЦ ΙΌ N0:1, причем указанный полипептид после димеризации связывается с комплексом, содержащим СЕКо.3 и КЕТ.
- 34. Вариант полипептида по п.33, содержащий отличную от аргинина аминокислоту в положении 7 8ЕО ΙΌ N0:1.
- 35. Вариант полипептида по п.34, где указанная аминокислота представляет собой неконсервативную аминокислоту.
- 36. Вариант полипептида по п.34, где указанная аминокислота представляет собой глутаминовую кислоту.
- 37. Вариант полипептида по п.33, содержащий отличную от аргинина аминокислоту в положении 9 8ЕО ΙΌ N0:1.
- 38. Вариант полипептида по п.37, где указанная аминокислота представляет собой неконсервативную аминокислоту.
- 39. Вариант полипептида по п.37, где указанная аминокислота представляет собой глутаминовую кислоту.
- 40. Вариант полипептида по п.33, содержащий отличную от аргинина аминокислоту в положении 14 8ЕО ΙΌ N0:1.
- 41. Вариант полипептида по п.40, где указанная аминокислота представляет собой неконсервативную аминокислоту.
- 42. Вариант полипептида по п.40, где указанная аминокислота представляет собой глутаминовую кислоту.
- 43. Вариант полипептида по любому из пп.33-42, содержащий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 90% идентична последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:1.
- 44. Вариант полипептида по любому из пп.33-42, содержащий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:1.
- 45. Вариант полипептида по любому из пп.33-42, содержащий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 98% идентична аминокислотам 15-113 последовательности 8ЕО ΙΌ N0:1.
- 46. Димер, содержащий два любых варианта полипептида нейбластина по любому из пп.29-45.
- 47. Конъюгат, содержащий вариант полипептида нейбластина по любому из пп.29-45 и неприродный полимер.
- 48. Слитый белок, содержащий вариант полипептида нейбластина по любому из пп.29-45 и гетерологичную аминокислотную последовательность.
- 49. Фармацевтическая композиция, содержащая вариант полипептида нейбластина по любому из пп.29-45, димер по п.46, конъюгат по п.47 или слитый белок по п.48, а также фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
- 50. Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую вариант полипептида нейбластина по любому из пп.29-45.
- 51. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.50.
- 52. Клетка, содержащая экспрессирующий вектор по п.51.
- 53. Способ получения варианта полипептида нейбластина, включающий получение клетки по п.52 и культивирование клетки в условиях, способствующих экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида нейбластина.
- 54. Способ лечения или предотвращения заболевания или нарушения нервной системы у млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.49.
- 55. Способ лечения нейропатической боли у млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.49.
- 56. Способ активации рецептора КЕТ у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества варианта полипептида нейбластина по любому из пп.29-45, димера по п.46, конъюгата по п.47, слитого белка по п.48 или фармацевтической композиции по п.49.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US60282504P | 2004-08-19 | 2004-08-19 | |
| US69406705P | 2005-06-24 | 2005-06-24 | |
| PCT/US2005/029637 WO2006023781A2 (en) | 2004-08-19 | 2005-08-18 | Neublastin variants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200700460A1 EA200700460A1 (ru) | 2007-10-26 |
| EA013565B1 true EA013565B1 (ru) | 2010-06-30 |
Family
ID=35968235
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200700460A EA013565B1 (ru) | 2004-08-19 | 2005-08-18 | Варианты полипептидов нейбластина, способы их получения и их применение |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8263553B2 (ru) |
| EP (3) | EP1786454B1 (ru) |
| JP (2) | JP4852545B2 (ru) |
| KR (2) | KR20110126732A (ru) |
| CN (1) | CN102924585A (ru) |
| AT (1) | ATE474586T1 (ru) |
| AU (1) | AU2005277226B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0514534A (ru) |
| CA (1) | CA2577755C (ru) |
| CY (1) | CY1111136T1 (ru) |
| DE (1) | DE602005022457D1 (ru) |
| DK (1) | DK1786454T3 (ru) |
| EA (1) | EA013565B1 (ru) |
| GE (1) | GEP20115196B (ru) |
| HK (1) | HK1103991A1 (ru) |
| HR (1) | HRP20100474T1 (ru) |
| IL (2) | IL181311A (ru) |
| MX (1) | MX2007002029A (ru) |
| NO (1) | NO20071449L (ru) |
| NZ (1) | NZ553431A (ru) |
| PL (1) | PL1786454T3 (ru) |
| PT (1) | PT1786454E (ru) |
| RS (1) | RS51453B (ru) |
| SI (1) | SI1786454T1 (ru) |
| UA (1) | UA92590C2 (ru) |
| WO (1) | WO2006023781A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200701395B (ru) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7442370B2 (en) | 2001-02-01 | 2008-10-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Polymer conjugates of mutated neublastin |
| US7276580B2 (en) | 2001-03-12 | 2007-10-02 | Biogen Idec Ma Inc. | Neurotrophic factors |
| JP4571776B2 (ja) * | 2002-11-05 | 2010-10-27 | Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 | 潤滑油組成物 |
| NZ543365A (en) | 2003-04-18 | 2009-02-28 | Biogen Idec Inc | Polymer-conjugated glycosylated neublastin |
| US8722862B2 (en) * | 2004-08-19 | 2014-05-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Refolding transforming growth factor beta family proteins |
| EA013565B1 (ru) | 2004-08-19 | 2010-06-30 | Байоджен Айдек Ма Инк. | Варианты полипептидов нейбластина, способы их получения и их применение |
| TWI501774B (zh) | 2006-02-27 | 2015-10-01 | Biogen Idec Inc | 神經性病症之治療 |
| EP1993590B1 (en) * | 2006-03-01 | 2013-12-25 | Biogen Idec MA Inc. | Compostions and methods for administering gdnf ligand family proteins |
| TWI445544B (zh) | 2007-05-01 | 2014-07-21 | Biogen Idec Inc | 增進血管形成之組合物及方法 |
| US20110135648A1 (en) * | 2007-08-08 | 2011-06-09 | Biogen Idec Ma Inc. | Anti-neublastin antibodies and uses thereof |
| WO2015042580A1 (en) | 2013-09-23 | 2015-03-26 | Biogen Idec Ma Inc. | Compositions and methods for treatment of neuropathic pain |
| WO2016022800A1 (en) | 2014-08-07 | 2016-02-11 | Biogen Ma Inc. | Characterization of cystine knot superfamily proteins |
| JP2022516053A (ja) * | 2018-12-21 | 2022-02-24 | グロリアーナ・セラピューティクス・ソシエテ・ア・レスポンサビリテ・リミテ | 哺乳動物細胞培養物によって生産されるニューブラスチン抗体 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6284540B1 (en) * | 1998-09-29 | 2001-09-04 | Washington University | Artemin, a novel neurotrophic factor |
| US20040242472A1 (en) * | 2000-12-22 | 2004-12-02 | Shelton David L. | Use of artemin, a member of the gdnf ligand family |
Family Cites Families (78)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4352883A (en) | 1979-03-28 | 1982-10-05 | Damon Corporation | Encapsulation of biological material |
| US4353888A (en) | 1980-12-23 | 1982-10-12 | Sefton Michael V | Encapsulation of live animal cells |
| US4407957A (en) | 1981-03-13 | 1983-10-04 | Damon Corporation | Reversible microencapsulation of a core material |
| US5525464A (en) | 1987-04-01 | 1996-06-11 | Hyseq, Inc. | Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes |
| US4883666A (en) | 1987-04-29 | 1989-11-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders |
| US5158881A (en) | 1987-11-17 | 1992-10-27 | Brown University Research Foundation | Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments |
| US5283187A (en) | 1987-11-17 | 1994-02-01 | Brown University Research Foundation | Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion |
| DE3829766A1 (de) | 1988-09-01 | 1990-03-22 | Akzo Gmbh | Verfahren zur herstellung von membranen |
| DE3829752A1 (de) | 1988-09-01 | 1990-03-22 | Akzo Gmbh | Integrale asymmetrische polyaethersulfonmembran, verfahren zur herstellung und verwendung zur ultrafiltration und mikrofiltration |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| US5194596A (en) | 1989-07-27 | 1993-03-16 | California Biotechnology Inc. | Production of vascular endothelial cell growth factor |
| US5350836A (en) | 1989-10-12 | 1994-09-27 | Ohio University | Growth hormone antagonists |
| GB8927546D0 (en) | 1989-12-06 | 1990-02-07 | Ciba Geigy | Process for the production of biologically active tgf-beta |
| US5084350A (en) | 1990-02-16 | 1992-01-28 | The Royal Institution For The Advance Of Learning (Mcgill University) | Method for encapsulating biologically active material including cells |
| US5618531A (en) | 1990-10-19 | 1997-04-08 | New York University | Method for increasing the viability of cells which are administered to the brain or spinal cord |
| WO1992019195A1 (en) | 1991-04-25 | 1992-11-12 | Brown University Research Foundation | Implantable biocompatible immunoisolatory vehicle for delivery of selected therapeutic products |
| DE69233690T2 (de) | 1991-07-02 | 2008-01-24 | Nektar Therapeutics, San Carlos | Abgabevorrichtung für nebelförmige Medikamente |
| GEP20002243B (en) | 1991-09-20 | 2000-09-25 | Amgen Inc | Glial Derived Neurotrophic Factor |
| US5939524A (en) | 1991-12-09 | 1999-08-17 | The Scripps Research Institute | Platelet GPIII P1A1 and P1A2 epitopes, their preparation and use |
| US5414135A (en) | 1991-12-30 | 1995-05-09 | Sterling Winthrop Inc. | Vinyl sulfone coupling of polyoxyalkylenes to proteins |
| US5785049A (en) | 1994-09-21 | 1998-07-28 | Inhale Therapeutic Systems | Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments |
| ATE220327T1 (de) | 1992-09-29 | 2002-07-15 | Inhale Therapeutic Syst | Pulmonale abgabe von aktiven fragmenten des parathormons |
| US5349056A (en) | 1992-10-09 | 1994-09-20 | Regeneron Pharmaceuticals | Modified ciliary neurotrophic factors |
| CA2092271C (en) | 1993-03-09 | 2009-10-13 | Eddie Reed | Use of g-csf for treating taxol side-effects |
| WO1995005452A2 (en) | 1993-08-12 | 1995-02-23 | Cytotherapeutics, Inc. | Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules |
| DE4339605A1 (de) | 1993-11-20 | 1995-05-24 | Beiersdorf Ag | Desodorierende Wirkstoffkombinationen auf der Basis von alpha, omega-Alkandicarbonsäuren und Fettsäurepartialglyceriden |
| US5834029A (en) | 1994-07-20 | 1998-11-10 | Cytotherapeutics, Inc. | Nerve guidance channel containing bioartificial three-dimensional hydrogel extracellular matrix derivatized with cell adhesive peptide fragment |
| US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US5795716A (en) | 1994-10-21 | 1998-08-18 | Chee; Mark S. | Computer-aided visualization and analysis system for sequence evaluation |
| US5770577A (en) | 1994-11-14 | 1998-06-23 | Amgen Inc. | BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol |
| US5780014A (en) | 1995-04-14 | 1998-07-14 | Inhale Therapeutic Systems | Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder alpha 1-antitrypsin |
| US5654007A (en) | 1995-06-07 | 1997-08-05 | Inhale Therapeutic Systems | Methods and system for processing dispersible fine powders |
| US5739307A (en) | 1995-08-28 | 1998-04-14 | Washington University | Polynucleotide encoding neurturin neurotrophic factor |
| US5733729A (en) | 1995-09-14 | 1998-03-31 | Affymetrix, Inc. | Computer-aided probability base calling for arrays of nucleic acid probes on chips |
| US6063757A (en) | 1995-11-29 | 2000-05-16 | Urso; Richard G. | Wound treatment method with nerve growth factor |
| US5641749A (en) | 1995-11-29 | 1997-06-24 | Amgen Inc. | Method for treating retinal ganglion cell injury using glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF) protein product |
| EP0943690B1 (en) | 1995-12-21 | 2006-11-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for refolding human activin a |
| US6299895B1 (en) | 1997-03-24 | 2001-10-09 | Neurotech S.A. | Device and method for treating ophthalmic diseases |
| US6677135B1 (en) | 1996-05-08 | 2004-01-13 | Biogen, Inc. | Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth |
| US5754524A (en) | 1996-08-30 | 1998-05-19 | Wark; Barry J. | Computerized method and system for analysis of an electrophoresis gel test |
| US6083725A (en) | 1996-09-13 | 2000-07-04 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein |
| JP2001501093A (ja) | 1996-09-26 | 2001-01-30 | メディカル リサーチ カウンシル | シャペロン断片 |
| KR100195886B1 (ko) | 1996-11-01 | 1999-06-15 | 김상조 | 당뇨병 치료용 의약조성물 |
| US6653098B1 (en) | 1998-02-23 | 2003-11-25 | G. D. Searle & Co. | Method of producing mouse and human endostatin |
| US6593133B1 (en) | 1998-07-06 | 2003-07-15 | Nsgene A/S | Neurotrophic factors |
| US20020055467A1 (en) * | 1998-07-06 | 2002-05-09 | Johansen Teit E. | Novel neurotrophic factors |
| US7067473B1 (en) | 1998-07-14 | 2006-06-27 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Neurotrophic growth factor |
| HU226073B1 (en) | 1998-07-14 | 2008-04-28 | Janssen Pharmaceutica Nv | Neurotrophic growth factor |
| CA2344277A1 (en) | 1998-09-22 | 2000-03-30 | University Of Maryland, Baltimore | Cystine knot growth factor mutants |
| US6361771B1 (en) | 1999-04-06 | 2002-03-26 | Neurotech S.A. | ARPE-19 as a platform cell line for encapsulated cell-based delivery |
| JP2003525916A (ja) | 1999-04-22 | 2003-09-02 | エイドゲントシッシュ テクニーシェ ホッシュール チューリッヒ | モディファイドタンパク質マトリクス |
| CA2385929A1 (en) | 1999-10-29 | 2001-05-03 | Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh | Use of gdnf for treating corneal defects |
| CA2327208A1 (en) | 2000-11-30 | 2002-05-30 | The Government Of The United States Of America | Methods of increasing distribution of therapeutic agents |
| JP4259868B2 (ja) * | 2001-02-01 | 2009-04-30 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | ニューブラスチンのポリマー結合体および同様の使用方法。 |
| US7442370B2 (en) | 2001-02-01 | 2008-10-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Polymer conjugates of mutated neublastin |
| US7276580B2 (en) | 2001-03-12 | 2007-10-02 | Biogen Idec Ma Inc. | Neurotrophic factors |
| NZ529126A (en) * | 2001-03-28 | 2010-07-30 | Biogen Idec Inc | Use of neublastin polypeptides for treating allodynia, hyperalgesic pain and phantom pain |
| US20040077543A1 (en) | 2001-03-28 | 2004-04-22 | Sah Dinah W. Y. | Treatment using neublastin polypeptides |
| JP2004527573A (ja) | 2001-04-24 | 2004-09-09 | パーデュー・リサーチ・ファウンデーション | 哺乳類の神経組織損傷の治療のための方法及び組成物 |
| US7164007B2 (en) | 2001-06-20 | 2007-01-16 | Genentech, Inc. | Anti-PR020044 antibodies |
| US20040028613A1 (en) | 2001-06-25 | 2004-02-12 | Nastech Pharmaceutical Company Inc | Dopamine agonist formulations for enhanced central nervous system delivery |
| US7129085B2 (en) | 2001-10-11 | 2006-10-31 | Bristol-Myers Squibb Company | Polynucleotides encoding a human leucine-rich repeat domain containing protein, HLLRCR-1 |
| GB0205022D0 (en) | 2002-03-04 | 2002-04-17 | Univ Cambridge Tech | Materials and methods for the treatment of cns damage |
| JP4310608B2 (ja) | 2002-04-25 | 2009-08-12 | 東洋紡績株式会社 | Ｈｓｐ７０ファミリータンパク質基質結合ドメインフラグメントの利用方法 |
| NZ543365A (en) | 2003-04-18 | 2009-02-28 | Biogen Idec Inc | Polymer-conjugated glycosylated neublastin |
| EP1636260B1 (en) | 2003-06-10 | 2009-02-18 | Nsgene A/S | Improved secretion of neublastin |
| US7598059B2 (en) | 2003-10-02 | 2009-10-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Neublastin expression constructs |
| WO2005072764A2 (en) | 2004-01-16 | 2005-08-11 | Novocell, Inc. | Fibrin-bound angiogenic factors to stimulate vascularization of transplant site of encapsulated cells |
| ES2376332T3 (es) | 2004-06-23 | 2012-03-13 | Tissuegene, Inc. | Regeneración de nervios. |
| US7598356B2 (en) | 2004-07-08 | 2009-10-06 | Board of Regents of the University of Nebraska by and on behalf of the University of Nebraska Medical Center | Method for purifying a protein of the cystine-knot superfamily |
| EA013565B1 (ru) | 2004-08-19 | 2010-06-30 | Байоджен Айдек Ма Инк. | Варианты полипептидов нейбластина, способы их получения и их применение |
| US8722862B2 (en) | 2004-08-19 | 2014-05-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Refolding transforming growth factor beta family proteins |
| EP1937295A2 (en) | 2005-10-11 | 2008-07-02 | NS Gene A/S | Treatment of retinopathies using gfr 3 agonists |
| TWI501774B (zh) | 2006-02-27 | 2015-10-01 | Biogen Idec Inc | 神經性病症之治療 |
| EP1993590B1 (en) | 2006-03-01 | 2013-12-25 | Biogen Idec MA Inc. | Compostions and methods for administering gdnf ligand family proteins |
| DK2019683T4 (da) | 2006-04-25 | 2022-08-29 | Univ California | Indgivelse af vækstfaktorer til behandling af CNS-lidelser |
| TWI445544B (zh) | 2007-05-01 | 2014-07-21 | Biogen Idec Inc | 增進血管形成之組合物及方法 |
-
2005
- 2005-08-18 EA EA200700460A patent/EA013565B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-08-18 RS RSP-2010/0386A patent/RS51453B/en unknown
- 2005-08-18 DE DE602005022457T patent/DE602005022457D1/de active Active
- 2005-08-18 MX MX2007002029A patent/MX2007002029A/es active IP Right Grant
- 2005-08-18 EP EP05789285A patent/EP1786454B1/en active Active
- 2005-08-18 PT PT05789285T patent/PT1786454E/pt unknown
- 2005-08-18 EP EP10170146.4A patent/EP2238983B1/en not_active Not-in-force
- 2005-08-18 CA CA2577755A patent/CA2577755C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-08-18 US US11/573,773 patent/US8263553B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-08-18 NZ NZ553431A patent/NZ553431A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-08-18 AU AU2005277226A patent/AU2005277226B2/en not_active Ceased
- 2005-08-18 DK DK05789285.3T patent/DK1786454T3/da active
- 2005-08-18 SI SI200531099T patent/SI1786454T1/sl unknown
- 2005-08-18 KR KR1020117022960A patent/KR20110126732A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-08-18 GE GEAP20059928A patent/GEP20115196B/en unknown
- 2005-08-18 PL PL05789285T patent/PL1786454T3/pl unknown
- 2005-08-18 BR BRPI0514534-1A patent/BRPI0514534A/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-08-18 KR KR1020077005926A patent/KR101215697B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-08-18 EP EP10181609A patent/EP2335713A3/en not_active Withdrawn
- 2005-08-18 CN CN2012104009059A patent/CN102924585A/zh active Pending
- 2005-08-18 JP JP2007528061A patent/JP4852545B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-08-18 UA UAA200702764A patent/UA92590C2/ru unknown
- 2005-08-18 AT AT05789285T patent/ATE474586T1/de active
- 2005-08-18 WO PCT/US2005/029637 patent/WO2006023781A2/en active Application Filing
-
2007
- 2007-02-13 IL IL181311A patent/IL181311A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-02-16 ZA ZA2007/01395A patent/ZA200701395B/en unknown
- 2007-03-19 NO NO20071449A patent/NO20071449L/no not_active Application Discontinuation
- 2007-11-16 HK HK07112571.5A patent/HK1103991A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-04-19 IL IL205201A patent/IL205201A0/en unknown
- 2010-08-31 HR HR20100474T patent/HRP20100474T1/hr unknown
- 2010-10-20 CY CY20101100936T patent/CY1111136T1/el unknown
-
2011
- 2011-05-13 JP JP2011108760A patent/JP2011155987A/ja not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-07-03 US US13/541,302 patent/US20130096065A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6284540B1 (en) * | 1998-09-29 | 2001-09-04 | Washington University | Artemin, a novel neurotrophic factor |
| US20040242472A1 (en) * | 2000-12-22 | 2004-12-02 | Shelton David L. | Use of artemin, a member of the gdnf ligand family |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA013565B1 (ru) | Варианты полипептидов нейбластина, способы их получения и их применение | |
| CN101123978B (zh) | 神经胚素变体 | |
| US7119066B2 (en) | Modified ciliary neurotrophic factor (CNTF) | |
| EP1993590B1 (en) | Compostions and methods for administering gdnf ligand family proteins | |
| CN109134664B (zh) | 一种经修饰的生长分化因子及其制备方法和应用 | |
| EP3909974A1 (en) | Human hepatocyte growth factor mutant and uses thereof | |
| EP1395279A2 (en) | Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain | |
| AU2002250203A1 (en) | Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain | |
| WO2022026468A1 (en) | Ngf variants, production, compositions, and therapeutic uses | |
| AU754982B2 (en) | Compositions for promoting nerve regeneration | |
| WO2015042580A1 (en) | Compositions and methods for treatment of neuropathic pain | |
| US20050256039A1 (en) | Novel fibroblast growth factors and methods of use thereof | |
| EP1626696A2 (en) | Novel fibroblast growth factors and methods of use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |