PT1786454E - Variantes de neublastina - Google Patents
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Description
ΕΡ1786454
DESCRIÇÃO
VARIANTES DE NEUBLASTINA
Referência cruzada dos pedidos relacionados
Este pedido reivindica a prioridade do pedido provisório número 60/602,825, depositado em 19 de Agosto de 2004, e do pedido provisório número 60/694,067, depositado em 24 de Junho de 2005.
Campo técnico A invenção refere-se à química de proteína, biologia molecular e neurobiologia.
Antecedentes A neublastina, também conhecida como artemina e enovina, é uma proteína homodimérica secretada de 24-kDa que estimula a sobrevivência dos neurónios do sistema nervoso central e periférico, como os neurónios dopaminérgicos (Baudet et al., 2000, Development, 127:4335; Rosenblad et al., 2000, Mot Cell Neurosci., 15(2) :199; GenBank AF120274) . O gene codificador da neublastina foi clonado e sequenciado (Roseblad et al., 2000, Mot Cell Neurosci., 15(2): 199; Baloh et al., Neuron, 21:1291). A neublastina é um membro da família de ligantes do factor neurotrófico derivado de linhagem de célula glial (GDNF) . Ao nível celular, os membros do GDNF activam o receptor tirosina quinase, RET. RET associa-se a um co- 1 ΕΡ1786454 receptor, um receptor alfa da família GDNF (GFRalfa), uma proteína de membrana acoplada a glicosil-fosfatidilinositol (GPI), que fornece especificidade do ligante para RET. São conhecidos quatro GFRalfa (GFRalfal-4). As ligações da neublastina com o GFRalfa3 e com RET formam um complexo de sinalização ternário (Baudet et al. 2000, Development, 127:4335; Baloh et al., 1998, Neuron, 21:1291), o qual está localizado predominantemente nos neurónios sensoriais nociceptivos (Orozco et al., 2001, Eur. J. Neurosci., 13(11):2177). Esses neurónios detectam dores e ferimentos. Portanto, a neublastina possui aplicação clinica no tratamento geral de neuropatias e, mais especificamente, no tratamento de dores neuropáticas. A neublastina e os outros membros da família GDNF são elementos da superfamilia do factor de crescimento transformador beta (TGF beta) e, por isso, são caracterizados pela presença de sete resíduos de cisterna conservados com o mesmo espaçamento, formando a estrutura de nó cisteína (Saarma, 1999, Microsc. Res. Tech., 45:292). Cada monómero contém duas pontes dissulfeto que formam uma estrutura em "loop", envolvendo o terceiro dissulfeto para formar uma estrutura de nó. A sétima cisteína contida em cada monómero forma uma ponte dissulfeto intermolecular, unida por ligação covalente aos monómeros para formar o produto dímero final (Rattenholl et al 2000, J. MoL Biol., 305:523).
Os membros da família beta TGF são sintetizados como pré-pro proteínas, que são consequentemente secretadas na forma de um homodímero maduro após a clivagem do peptídeo sinal e do pró-domínio (ver exemplo Rattenholl, et al., 2000, J. MoL Biol., 305:523; Fairlie et al., 2001, J. Biol. Chem., 2 ΕΡ1786454 276(20):16911). Tanto o peptídeo sinal como o pró-domínio medeiam a secreção própria dos membros da família beta TGF (Rattenholl et al., 2000, J. Mol. Biol., 305:523; Rattenholl et al., 2001, Eur. J. Biochem., 268:3296).
Sumário A invenção baseia-se, pelo menos parcialmente, na descoberta de que a neublastina se liga ao sulfato de heparina, e que os resíduos de aminoácidos peculiares ao polipeptídeo de neublastina contribuem para esse evento de ligação. A substituição dos resíduos de aminoácidos seleccionados foi descoberta para diminuir a ligação a heparina usando-se polipeptídeos de neublastina variante e para aumentar a bioactividade e a biodisponibilidade dos variantes.
Num aspecto, a invenção mostra um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos que tem, no mínimo, 80% de semelhança com os aminoácidos 15-113 da SEQ ID N°:l, na qual a sequência de aminoácidos contem um aminoácido diferente da arginina na posição 25, correspondendo às posições 48 e 49 da SEQ ID N°:l (por exemplo, a arginina é substituída por um resíduo de aminoácido não conservador, como o ácido glutâmico), na qual o polipeptídeo, quando dimerizado, se liga a um complexo contendo GFRalfa3 e RET, e na qual o polipeptídeo exibe menor ligação a heparina, conforme a comparação com a proteína neublastina no estado natural da SEQ ID N°:1.
Por exemplo, os resíduos de arginina nas posições 48 e 49 da SEQ ID N°:l podem ser substituídos por resíduos de 3 ΕΡ1786454 aminoácidos não conservadores (por exemplo, o ácido glutâmico).
Nalgumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem, no minimo, 90%, 95% ou 98% de semelhança com os aminoácidos 15-113 da SEQ ID N°:l.
Divulga-se também um polipeptídeo contendo os aminoácidos 15-113 da SEQ ID N°:5. Nalgumas modalidades, o polipeptídeo contem os aminoácidos 10-113 da SEQ ID N°:5. Em certas modalidades, o polipeptídeo contém a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°:5. A invenção também mostra conjugados contendo um polipeptídeo, aqui descrito, ligado a um polímero de ocorrência não natural. Um exemplo de polímero é o polímero sintético solúvel em água, como o polialquileno glicol (por exemplo, o polietilenoglicol). A invenção também mostra uma proteína de fusão contendo um polipeptídeo, aqui descrito, bem como uma sequência de aminoácidos heteróloga. A invenção também mostra um dímero contendo pares de polipeptídeos, conjugados ou proteínas de fusão aqui descritos. A invenção também mostra uma composição farmacêutica contendo um polipeptídeo, um dímero, um conjugado ou uma proteína de fusão, aqui descrito, bem como um portador ou um excipiente farmaceuticamente aceite. É também divulgado um ácido nucleico contendo uma 4 ΕΡ1786454 sequência que codifica um polipeptídeo aqui descrito, um vector de expressão contendo o ácido nucleico, e uma célula contendo o vector de expressão. É também divulgado um método de criação de um polipeptídeo, incluindo as seguintes etapas: (i) fornecimento de uma célula com vector de expressão contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo aqui descrito, e (ii) cultura da célula sob condições que permitam a expressão do ácido nucleico. A invenção também mostra um polipeptídeo, um dímero, um conjugado, uma proteína de fusão ou uma composição farmacêutica, aqui descrito, para uso no tratamento ou prevenção de algum distúrbio do sistema nervoso num mamífero. A invenção também mostra um polipeptídeo, um dímero, um conjugado, uma proteína de fusão ou uma composição farmacêutica, aqui descrito, para uso no tratamento de dor neuropática num mamífero. A invenção também mostra um polipeptídeo, um dímero, um conjugado, uma proteína de fusão ou uma composição farmacêutica, descrito aqui, para uso na activação do receptor RET num mamífero por meio de administração.
Uma das vantagens dos polipeptídeos de neublastina variantes seleccionados, aqui descritos, é que estes diminuíram a capacidade de ligação a heparina em comparação com a neublastina no estado natural. A diminuição da ligação a heparina resulta numa diminuição da depuração do polipeptídeo variante in vivo. 5 ΕΡ1786454
Um polipeptídeo de neublastina variante contendo substituições de aminoácidos nas posições 48 e 49 foi descoberto inesperadamente não possuindo qualquer capacidade de ligação a heparina, e um grande aumento de potência e de biodisponibilidade em relação aos mutantes de aminoácido simples e/ou à neublastina no estado natural. Por exemplo, foi descoberto um mutante duplo exibindo um aumento de aproximadamente 185 vezes em exposição ao soro, comparado à neublastina em estado natural. Além disso, o mutante duplo foi descoberto exibindo um aumento superior a 5 vezes em expressão in vitro, comparado à neublastina em estado natural, facilitando assim a produção em larga escala da proteína.
As vantagens e as propriedades inesperadas dos polipeptídeos de neublastina variantes permitem o tratamento de indivíduos através de doses reduzidas de proteína e/ou intervalos prolongados entre administrações (em comparação aos tratamentos com a proteína no estado natural) . Salvo indicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui usados possuem o mesmo significado compreendido pelos peritos na técnica a que pertence esta invenção. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou no teste desta invenção, descrevem-se abaixo exemplos de métodos e materiais. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo as definições, prevalecerá. Os materiais, métodos e exemplos são meramente ilustrativos e não limitativos.
Outras características e vantagens desta invenção ressaltarão da descrição pormenorizada que se segue, assim 6 ΕΡ1786454 como nas reivindicações.
Breve descrição das figuras A figura 1 é um alinhamento de pré-pro polipeptideos de neublastina de humano em estado natural (SEQ ID N°:10), de rato (SEQ ID N°:ll) e de ratazana (SEQ ID N°:12). As linhas verticais esquerda e direita indicam, respectivamente, a origem das formas amina 113 e do aminoácido 104. O tema da ligação a heparina RRXR é reservado. A figura 2A mostra um perfil de eluição catiónica de neublastina em estado natural (Pico D) e três mutantes de substituição Arg-to-Glu simples (Picos A, B e C) (a linha inclinada representa a concentração teórica de cloreto de sódio para cada volume eluído mostrado na coluna). Os dados são uma representação dos valores 0D280 da amostra eluída. A figura 2B mostra um perfil de eluição de heparina-sefarose de neublastina em estado natural (Pico H) e três mutantes de substituição Arg-to-Glu simples (Picos E, F e G) (a linha inclinada representa a concentração teórica de cloreto de sódio para cada volume eluido mostrado na coluna). Os dados são uma representação dos valores OD280 da amostra eluída.
As figuras 3A-3B são fotografias ilustrando SDS/PAGE de neublastina em estado natural seguindo o uso de cromatografia aniónica na presença (2A) ou ausência (2 B) de heparina. 7 ΕΡ1786454 A figura 4 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de ligação celular de neublastina CHO. Seguindo o uso de SDS/PAGE e desitometria, os valores OD de neublastina em estado natural e das bandas mutantes Arg48E foram plotados de acordo com a concentração de heparina em cada amostra. A figura 5 é um gráfico que mostra os resultados de uma ligação de heparina ELISA usando-se humano em estado natural NBNI 13, humano em estado natural NBN104,
Arg48E, Arg49E, Arg51E e Arg48, 49E. A figura 6 é um gráfico que mostra os resultados da análise KIRA da ratazana em estado natural NBN113,
Arg51E, Arg48E, Arg49E, e da ratazana NBN113. A figura 7A é um gráfico que mostra os resultados da análise KIRA da neublastina humana em estado natural e do mutante de neublastina humana Arg48,49E (forma de aminoácido 113). A figura 7B é um gráfico que mostra os resultados da análise KIRA do humano em estado natural neublastina, mutante da neublastina humana Arg48,49E (forma de aminoácido 104), neublastina humana Arg48,51E (forma de aminoácido 113) e neublastina humana Arg49,51E (forma de aminoácido 113). A figura 8 é um gráfico que mostra os resultados da análise do complexo ternário da neublastina humana em estado natural, das formas neublastinas Arg48E, Arg49E, 8 ΕΡ1786454
Arg51E, Arg48,49E e Arg48,49,51E. A figura 9 é um gráfico que mostra os resultados da análise do complexo ternário da neublastina em estado natural, das formas neublastinas Arg48E, Arg49E, Arg51E, Arg48,49E e Arg48,49,51E. A figura 10 é um gráfico que mostra os resultados da análise farmacocinética da neublastina em estado natural e do Arg48,49E, aplicando-se uma injecção subcutânea de bolus simples de 7 mg/kg (as concentrações de plasma de neublastina foram determinadas pelo uso da detecção de neublastina ELISA). A figura 11 é um gráfico que mostra os resultados da análise farmacocinética da neublastina em estado natural e do Arg48,49E, aplicando-se uma injecção intravenosa de bolus simples de 1 mg/kg (as concentrações de plasma de neublastina foram determinadas pelo uso da detecção de neublastina ELISA). A figura 12 é um gráfico que mostra os resultados da análise farmacocinética da neublastina 2X10K PEGylated Arg48,49E, aplicando-se uma injecção subcutânea de bolus simples de 7mg/kg (os dados apresentados são excedidos em 1 mg/kg) e neublastina 2X10K PEGylated Arg48,49E administrada de forma intravenosa a lmg/kg (foram determinadas concentrações de plasma de neublastina pelo uso da detecção de neublastina ELISA).
A figura 13 é um gráfico que mostra os niveis de expressão relativos de neublastina em células CHO 9 ΕΡ1786454 transfectadas com plasmídeos e codificadas com neublastina em estado natural ou Arg48,49E. A figura 14 é um gráfico que mostra os níveis de expressão relativos de linhas celulares principais CHO do mutante duplo Arg48,49E transfectado, e uma linha celular principal CHO de neublastina em estado normal transfectada.
Descrição Detalhada A presente invenção fornece polipeptídeos de neublastina variantes com substituições em resíduos de aminoácidos correspondentes às posições 48 e 49 do SEQ ID N°:l. Conforme divulgado nos exemplos anexos, o resíduo específico no polipeptídeo de neublastina em estado natural foi descoberto para efectuar ligações a heparina. Dado que a ligação a heparina contribui para a depuração da neublastina in vivo, espera-se que as substituições num ou mais desses resíduos específicos diminuam a ligação a heparina e, assim, aumentem a exposição do polipeptídeo variante ao soro.
Polipeptídeos de neublastina variantes
A neublastina humana em estado natural madura é um aminoácido 113 em extensão e possui a seguinte sequência de aminoácidos: AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHR SDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAV 25 SFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG (SEQ ID N°:l).
Divulgam-se aqui os polipeptídeos que possuem 10 ΕΡ1786454 substituições num ou mais resíduos de aminoácidos do polipeptídeo de neublastina seleccionados. As mutações num ou mais desses resíduos devem resultar num polipeptídeo de neublastina variante, possuindo capacidade de ligação de heparina ausente ou reduzida em comparação com a neublastina no estado natural. Um polipeptídeo de neublastina variante contem uma substituição de aminoácido, relativa à SEQ ID N°:l, (i) num resíduo de arginina nas posições 48 e 49.
Salvo disposição em contrário, qualquer referência a um número de posição de aminoácidos de neublastina irá se referir a numeração ilustrada na SEQ ID N0:1. 0 resíduo de aminoácido de Neublastina designado para substituição (por exemplo, um resíduo de arginina na posição 48, 49, e/ou 51) pode ser substituído por um resíduo de aminoácido não-conservante (por exemplo, o ácido glutâmico) ou um resíduo de aminoácido ou conservador. Conforme detalhado nos Exemplos em anexo, a substituição de Arg48, Arg 49, e/ou Arg 51, por um aminoácido não-conservador não pode resultar em um polipeptídeo variante de neublastina que tem actividade reduzida da ligação de heparina mas manteve (ou mesmo reforçada) a actividade biológica de neublastina. Os aminoácidos exemplares que podem ser substituídos num resíduo de aminoácido identificado aqui (por exemplo, um resíduo de arginina na posição 48, 49, e/ou 51) incluem o ácido glutâmico, ácido aspártico e alanina.
Um polipeptídeo biologicamente activo da neublastina variante, quando dimerizado, liga-se a um complexo ternário contendo GFRalpha3 e RET. Qualquer método para a detecção de ligação a este complexo pode ser usado para avaliar a 11 ΕΡ1786454 actividade biológica de um polipeptídeo variante da neublastina. Os ensaios exemplares para detectar a capacidade da ligação do complexo ternário de um polipeptídeo variante de neublastina são descritos em W000/01815 e no Exemplo 7.
Um polipeptídeo variante de neublastina também pode ser avaliado pela sua capacidade de desencadear a cascata de sinalização da neublastina. Por exemplo, a activação do receptor quinase (KIRA) descrito no Exemplo 6 pode ser utilizado para avaliar a capacidade de um polipeptídeo variante de neublastina para induzir a autofosforilação de RET (Ver também, Sadick et al. 1996, Anal. Biochem., 268:3296) .
Além das substituições específicas de aminoácidos aqui identificados, um polipeptídeo variante de neublastina também pode conter uma ou mais adições, substituições e/ou supressões em outras posições de aminoácidos, como detalhado nas secções seguintes.
Um polipeptídeo variante da neublastina pode, além de ter as substituições de aminoácidos aqui descritas, variar também em comprimento. Embora o polipeptídeo da neublastina humano (SEQ ID N0:1) consista no terminal carboxi de aminoácido 113 de pré e pró neublastina, nem todos os 113 aminoácidos são necessários para atingir a actividade biológica da neublastina útil. A truncagem do terminal amino é admissível. Assim, um polipeptídeo variante de neublastina pode conter uma ou mais das substituições de aminoácidos descritas neste contexto no terminal carboxi 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, ou 113 aminoácidos de SEQ ID NO:l (ou seja, seu comprimento pode ser 12 ΕΡ1786454 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, ou 113 aminoácidos).
Um polipeptídeo variante da neublastina pode, além de ter as substituições de aminoácidos aqui descritas (e opcionalmente com uma truncagem aqui descrita) pode variar também em comprimento. Em particular, algumas substituições de aminoácidos podem ser introduzidas na sequência de neublastina sem perda significativa de actividade biológica da neublastina. Em modalidades exemplares, um polipeptídeo (i) contem as substituições de aminoácidos aqui descritas, e (ii) pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idênticos aos SEQ ID NO:1 (ou 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idênticos aos aminoácidos 15-113 de SEQ ID N0:1). Um polipeptídeo variante de neublastina diferente na sequência da SEQ ID NO: 1 (ou diferente, em sequência de aminoácidos 15-113 de SEQ ID NO:l) pode incluir uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras, uma ou mais substituições de aminoácidos não-conservadoras e/ou um ou mais exclusões ou inserções. A figura 1 é um alinhamento humano do tipo selvagem, ratinho, rato e pré e pró polipeptídeos de neublastina. As linhas verticais na Figura 1 indicam o início da forma de aminoácido 113 (à esquerda da linha vertical) e 104 da forma de aminoácidos (linha vertical à direita) da neublastina. O tema da ligação a heparina RRXR é reservado. Este alinhamento de ocorrência natural, as formas bioactivas de resíduos específicos de neublastina indicam resíduos exemplares específicos (isto é, aqueles que não estão conservados entre os humanos, ratinhos e ratos) que podem ser substituídos sem eliminar bioactividade. 13 ΕΡ1786454 A percentagem de identidade entre as sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o programa BLAST 2.0. A comparação da sequência pode ser feita através de um alinhamento e usando os parâmetros padrão (matriz 62 Blossom, o custo existência de espaço de 11, por custo de espaço de resíduos 1, e uma proporção de 0,85 lambda). O algoritmo matemático utilizado nos programas BLAST é descrito em Altschul et al. 1997, Nucleic Acids Research 25:3389-3402.
Uma substituição conservadora é a substituição de um aminoácido por outro com características semelhantes. Substituições conservadoras incluem substituições dentro dos seguintes grupos: valina, alanina e glicina, leucina, valina e isoleucina, ácido aspártico e ácido glutâmico, asparagina e glutamina, serina, cisteína e treonina, lisina e arginina, fenilalanina e tirosina. Os aminoácidos hidrofóbicos não-polares incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos positivamente carregados (básico) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem o ácido aspártico e ácido glutâmico. Qualquer substituição de um membro dos grupos básicos ou ácidos polares mencionado acima por outro membro do mesmo grupo pode ser considerada uma substituição conservadora.
As substituições não-conservadoras incluem as substituições em que (i) um resíduo com uma cadeia lateral electropositiva (por exemplo, Arg, His ou Lys) é substituída por, ou, resíduo electronegativo Na (por exemplo, Glu e Asp), (ii) um resíduo hidrofílico (por exemplo, Ser ou Thr) é 14 ΕΡ1786454 substituído por, ou por um resíduo hidrofóbico (por exemplo, Ala, Leu, Ile, Phe e Vai) , (iii) a cisteína e prolina é substituída por, ou por qualquer outro resíduo ou (iv) um resíduo com uma cadeia lateral hidrofóbica volumosa ou aromática (por exemplo, Vai, Ile, Phe ou Tip) é substituída por, ou, uma delas com uma cadeia de lateral menor (por exemplo, Ala, Ser) ou cadeia lateral (por exemplo, Gly).
Os polipeptídeos variantes da neublastina do exemplo são divulgados na Tabela 1. Os resíduos de aminoácidos dos polipeptídeos variantes da neublastina que são transformados em comparação com a posição do tipo selvagem correspondente estão em negrito e sublinhado. Além disso, o polipeptídeo da neublastina (aminoácidos 113, 99, ou 104 de comprimento), utilizado como fundamento para a substituição é descrito na Tabela 1.
Tabela 1: Polipeptídeos Variantes de Neublastina SEQ ID NOs:2, 3, 4, 8 e 9 são sequências de referência 15
SEQ ID No. Posição substituída Comprimento do Polipeptídeo Sequência de aminoácidos 2 Arg 4 8 113 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRA LGLGHRSDELVRFRFCSGSCERARSPHD LSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPT RYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGC LG 3 Arg 4 9 113 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRA LGLGHRSDELVRFRFCSGSCREARSPHD LSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPT RYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGC LG 4 Arg 51 113 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRA LGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRAESPHD LSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPT RYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGC LG 5 Arg 48 e Arg 4 9 113 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRA LGLGHRSDELVRFRFCSGSCEEARSPHD LSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPT RYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGC LG 6 Arg 48 e Arg 4 9 99 GCRLRS QLVPVRALGLGHRS DELVRFRF CSGSCEEARSPHDLSLASLLGAGALRPPP GSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTW RTVDRLSATACGCLG 7 Arg 48 e Arg 4 9 104 AAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDE LVRFRFCSGSCEEARSPHDLSLASLLGA GALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFM DVNSTWRTVDRLSATACGC LG 16
8 Arg 49 e Arg 51 113 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRA LGLGHRSDELVRFRFCSGSCREAESPHD LSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPT RYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGC LG 9 Arg 48 e Arg 51 113 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRA LGLGHRSDELVRFRFCSGSCERAESPHD LSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPT RYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGC LG
Um polipeptídeo variante de neublastina pode ser opcionalmente acoplado a um polímero (por exemplo, uma fracção de polialquileno glicol como uma molécula de polietilenoglicol). Nalgumas modalidades, o polímero é acoplado ao polipeptídeo num sítio sobre o polipeptídeo de neublastina que é um terminal N. Nalgumas modalidades, o polipeptídeo variante de neublastina inclui pelo menos uma substituição de aminoácido em relação ao SEQ ID N0:1 (ou no que diz respeito aos aminoácidos 15-113 de SEQ ID N0:1), que prevê um sítio de conjugação interna de qual o polímero pode ser conjugado. Nalgumas modalidades, o polímero é acoplado a um polipeptídeo variante da neublastina num resíduo (numerado de acordo com a sequência SEQ ID N0:1) selecionado do grupo constituído por posição 14, posição 39, posição 68, e posição 95. As variantes de neublastina que fornecem sítios de conjugação interna de polímero são descritos no WO WO 02/060929 e 04/069176.
Um polipeptídeo pode opcionalmente conter sequências de aminoácidos heterólogos, além de um polipeptídeo variante de neublastina. "Heterólogo", utilizado quando se refere a uma 17 sequência de aminoácidos, refere-se a uma sequência que se origina de uma fonte externa à célula hospedeira particular, ou, no caso da célula hospedeira mesmo, é modificado a partir de sua forma original. As sequências heterólogas do exemplo incluem uma sequência de sinais heterólogos (por exemplo, sequência de sinal de albumina com rato nativo, uma sequência de sinal modificado do rato, ou uma sequência de sinal da hormona de crescimento humano) ou uma sequência utilizada para a purificação de um polipeptídeo variante da neublastina (por exemplo, uma marca histidina).
Polipeptideos de neublastina podem ser isolados utilizando métodos conhecidos na técnica. Polipeptideos de neublastina de ocorrência natural podem ser isolados a partir de células ou fontes de tecidos por um esquema de purificação adequado através de técnicas de purificação de proteína padrão. Alternativamente, polipeptideos de neublastina mutantes podem ser sintetizados quimicamente através de técnicas de síntese de peptídeos padrão. A síntese de sequências de aminoácidos curtas está bem estabelecida na técnica de peptídeo. Ver, por exemplo, Stewart et al. Solid Phase Peptide Synthesis (2nd ed., 1984).
Nalgumas modalidades, os polipeptídeos variantes da neublastina são produzidos por técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de neublastina mutante pode ser inserida em um vector, por exemplo, um vector de expressão, e o ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula. 0 ácido nucleico pode ser introduzido na célula. Células adequadas incluem, por exemplo, células de mamíferos (como as células humanas ou 18 células CHO), células de fungos, células de leveduras, células de insectos, e células bacterianas. Quando expressa numa célula recombinante, a célula é preferencialmente cultivada sob condições que permitam a expressão de um polipeptideo de neublastina variante. 0 polipeptídeo de neublastina variante pode ser recuperado a partir de uma suspensão de células, se desejado. Como usado aqui, "recuperado" significa que o polipeptideo mutante é removido daqueles componentes de uma célula ou de um meio de cultura em que está presente antes do processo de recuperação. 0 processo de recuperação pode incluir uma ou mais etapas de purificação ou redobramento.
Polipeptideos de neublastina variantes podem ser construídos usando qualquer dos vários métodos conhecidos na técnica. Um tal método é a mutagénese sítio direccionada, na qual um nucleotídeo específico (ou, se desejado um pequeno número de nucleotídeos específicos) é alterada a fim de mudar um único aminoácido (ou, se preferido, um pequeno número de resíduos de aminoácidos predeterminados) no polipeptídeo de neublastina variante codificado. De facto, muitos kits da mutagénese sítio direccionada estão disponíveis comercialmente. Um desses kit é o "Transformer Site Directed Mutagenesis Kit" vendido pelo Clontech Laboratories (Paio Alto, Calif.).
Composições farmacêuticas
Um polipeptídeo de neublastina variante pode ser incorporado numa composição farmacêutica contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo, e um ou mais adjuvantes, excipientes, transportadores e/ou diluentes. 19
Os diluentes aceitáveis, transportadores e excipientes normalmente não afectam negativamente a homeostase de um destinatário (por exemplo, o equilíbrio electrolítico). Os transportadores aceitáveis incluem biocompatíveis, inertes ou sais bioabsorvíveis, agentes tampão, oligo- ou polissacarídeos, polímeros, agentes de viscosidade, conservantes e afins. Um transportador exemplar é salina fisiológica (NaCl 0,15 M, pH 7,0-7,4). Outro exemplar é transportador exemplar é sódio 50 mM, 100 mM de cloreto de sódio. Mais detalhes sobre as técnicas de formulação e administração de composições farmacêuticas podem ser encontradas em, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishing Co., Easton, Pa.). A administração de uma composição farmacêutica contendo um polipeptídeo variante de neublastina pode ser sistémica ou local. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de tal forma que sejam adequadas para via parenteral e/ou a administração não-parenteral. A administração específica inclui a administração subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal transdérmica, intratecal, oral, rectal, oral, tópica, nasal, oftálmica, intra-articular, intra-arterial administração, sub-aracnóide, brônquios linfático, vaginal e intra-uterina.
As formulações adequadas para administração parenteral conveniente incluem uma preparação aquosa estéril do polipeptídeo de neublastina variante, que é de preferência isotónica com o sangue do receptor (por exemplo, solução salina fisiológica). As formulações podem ser apresentadas em forma de dose unitária ou dose múltipla. 20
Uma formulação exemplar contem um polipeptídeo variante de neublastina aqui descrito e os elementos de tampão seguinte: succinato de sódio (por exemplo, 10 mm); NaCI (por exemplo, 75 mm) e L-arginina (por exemplo, 100 mm).
As formulações adequadas para administração oral podem ser apresentados como unidades distintas, tais como cápsulas, comprimidos ou pastilhas, cada uma contendo uma quantidade predeterminada do polipeptídeo variante de neublastina, ou uma suspensão num licor aquoso ou num líquido não aquoso, tal como um xarope, um elixir, uma emulsão, ou uma dose.
As quantidades terapeuticamente eficazes de uma composição farmacêutica podem ser administradas a um sujeito em necessidade de um regime de dosagem determinável por um perito na técnica. Por exemplo, uma composição pode ser administrada ao sujeito, por exemplo, sistematicamente, com uma dose de 0,01 pg/kg a 1000 pg/kg de peso corporal do sujeito, por dose. Noutro exemplo, a dosagem é de 1 pg/kg a 100 pg/kg de peso corporal do sujeito, por dose. Noutro exemplo, a dosagem é de 1 pg/kg a 30 pg/kg do peso corporal do sujeito, por dose, por exemplo, a partir de 3 pg/kg a 10 pg/kg de peso corporal do sujeito, por dose.
Para optimizar a eficácia terapêutica, um polipeptídeo variante de neublastina é administrado primeiro em diferentes regimes de dosagem. A dose unitária e regime dependem de factores que incluem, por exemplo, as espécies de mamíferos, o seu estado imunológico, o peso do corpo do mamífero. Normalmente, os níveis de proteína no tecido são monitorizados com testes de rastreio adequados, como parte de um processo de testes clínicos, por exemplo, para determinar 21 a eficácia de um regime de tratamento dada. A frequência de administração de um polipeptídeo variante de neublastina está dentro das competências e julgamento de peritos na técnica. Normalmente, o regime de administração é estabelecido por ensaios clínicos que possam estabelecer parâmetros de gestão ideal. No entanto, o perito na técnica pode variar de administração de acordo com a idade do sujeito, saúde, peso, sexo e estado de saúde. A frequência de administração pode também variar entre os tratamentos agudos e crónicos para a neuropatia. Além disso, a frequência de administração pode variar dependendo de o tratamento ser profilático e terapêutico.
Usos médicos
Os polipeptídeos variantes de neublastina são úteis para modular metabolismo, crescimento, diferenciação, ou a sobrevivência de um nervo ou da célula neuronal. Em particular, os polipeptídeos variantes de neublastina podem ser usados para tratar ou aliviar um distúrbio ou doença de um animal vivo, por exemplo, um ser humano, cuja desordem ou doença é uma resposta à actividade de um agente neurotrófico. Os polipeptídeos variantes de neublastina aqui divulgados (e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos) podem ser usados em métodos para tratar uma desordem caracterizada por danos aos neurónios sensoriais ou as células ganglionares da retina, incluindo os neurónios do gânglio da raiz dorsal ou em qualquer um dos tecidos que se seguem: gânglio geniculado, petroso e nodoso; complexo vestíbulo-acústico do oitavo nervo craniano; pólo ventrolateral do lobo maxilomandibular do gânglio trigeminal e núcleo mesencefálico trigeminal. 22
Nalgumas modalidades, os neurónios do sistema autónomo e/ou sensorial podem ser tratados.
Em particular, neurónios nociceptivos e mecanoreceptivos podem ser tratados, mais particularmente, fibras A-delta, fibras C e neurónios de fibras A-beta. Além disso, os neurónios simpáticos e parassimpáticos do sistema nervoso autónomo podem ser tratados.
Nalgumas modalidades, as doenças do neurónio motor, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA) e atrofia muscular espinhal podem ser tratadas. Noutras modalidades, os polipeptideos variantes da neublastina podem ser utilizados para reforçar a recuperação do nervo após uma lesão traumática. Alternativamente, ou adicionalmente, um canal de orientação do nervo com uma matriz contendo polipeptideos de neublastina conjugados a polímeros ou fusão ou conjugados de polipeptideos mutantes da neublastina podem ser usados. Esses canais de orientação dos nervos são divulgados, por exemplo, Patente US 5.834.029.
Nalgumas modalidades, os polipeptídeos variantes da neublastina (e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos) são utilizados no tratamento de várias doenças nos olhos, incluindo a perda de fotorreceptores na retina nos pacientes com degeneração macular, retinose pigmentar, glaucoma e doenças similares.
Nalgumas modalidades, os polipeptídeos variantes da neublastina (e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos) são utilizados para tratar a dor neuropática, para o tratamento da alodinia táctil, para reduzir a perda de 23 sensibilidade à dor associada à neuropatia, para tratar infecções virais e neuropatias associadas ao vírus, para tratar dor neuropatia diabética, e para tratar distúrbios do sistema nervoso. Os usos são discutidos em pormenor nas subsecções que se seguem. 1. Tratamento da dor neuropática
Os polipeptídeos variantes da neublastina aqui divulgados (e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos) podem ser usados para tratar a dor neuropática em um sujeito compreendendo a administração de uma quantidade eficaz a um sujeito de um polipeptídeo variante da neublastina isoladamente, ou também pela administração de uma quantidade eficaz a um sujeito de um composto induzido por analgesia selecionado do grupo consistindo de opióides, anti-arrítmicos, analgésicos tópicos, anestésicos locais, anticonvulsivos, antidepressivos, corticóides e drogas anti-inflamatórias não-esteróides (ΑΙΝΕ). Numa modalidade, o composto induzido por analgesia é um anticonvulsivo. Em outra modalidade, o composto induzido por analgesia é a gabapentina (ácido acético(1-aminometil)ciclohexano) ou pregabalina (ácido S—(+)—4—amino-3- (2-metilpropil) butanóico.
Os polipeptídeos variantes da neublastina aqui divulgados (e composições farmacêuticas que compreendem os mesmos) podem ser usados no tratamento da dor associada com neuropatias periféricas. Entre as neuropatias periféricas que podem ser tratadas são: neuropatias induzidas por trauma, por exemplo, aquelas causadas por lesões físicas ou estado de doença, dano físico ao cérebro, danos físicos à medula espinhal, acidente vascular cerebral associado a lesões 24 cerebrais e doenças neurológicas relacionadas com a neurodegeneração.
Os polipeptideos variantes da neublastina aqui divulgados (e composições farmacêuticas que compreendem os mesmos) podem ser usados no tratamento de uma série de neuropatias periféricas, incluindo: (a) neuropatias induzidas por trauma, (b) neuropatias induzidas por quimioterapia, (c) neuropatias induzidas por toxinas (incluindo, entre outros, neuropatias induzidas pelo alcoolismo, intoxicação por vitamina B6, intoxicação por hexacarbono, amiodarona, cloranfenicol, dissulfiran, isoniazida, ouro, litio, metronidazol, misonidazol, nitrofurantoina), (d) neuropatias induzidas por drogas, incluindo dor neuropática induzida por drogas terapêuticas (tal como provocado por agentes anti- câncer, particularmente agentes anti-câncer seleccionados do grupo consistindo em Taxol, Taxotero, cisplatina; nocodazol, vincristina e vinblastina e vindesina; e as provocadas por agentes anti-virais, particularmente agentes anti-virais seleccionados do grupo consistindo em ddl, DDC, d4T, foscarnet, dapsona, metronidazol e isoniazida), (e) neuropatias induzidas por deficiência de vitamina (incluindo, entre outros, deficiência de vitamina B12, deficiência de vitamina B6 e deficiência de vitamina E) , (f) neuropatias idiopáticas, (g) neuropatias diabéticas, (h) dano no nervo induzido por patógeno, (i) lesão do nervo induzida por inflamação, (j) neurodegeneração, (k) neuropatia hereditária (incluindo, entre outros, ataxia de Friedreich, polineuropatia amiloidótica familiar, doença de Tangier, doença de Fabry) (1), distúrbios metabólicos (incluindo, entre outros, insuficiência renal e hipotireoidismo), (m) neuropatias infecciosas e virais (incluindo, entre outros, 25 dor neuropática associada à hanseníase, doença de Lyme, dor neuropática associada à infecção por um virus, um vírus em particular selecionado do grupo constituído por um vírus do herpes (por exemplo, herpes zoster, que pode levar à neuralgia pós-herpética), um vírus de imunodeficiência humana (HIV) e vírus do papiloma), (n) neuropatias auto-imune (incluindo, entre outros, síndrome de Guillain-Barré, polineuropatia inflamatória crónica de-mielinizante, gamopatia monoclonal de significado indeterminado e polineuropatia), (o) , neuralgia trigeminal e síndromes de encarceramento (incluindo entre outros, túnel carpal) e (p) , outras síndromes de dor neuropática, incluindo neuralgia pós-traumática, dor do membro fantasma, dor de esclerose múltipla, síndromes de dor regional complexa (incluindo, entre outros, distrofia simpático-reflexa, causalgia), dor associada à neoplasia, neuropatia angiopática/vasculítica e ciática. A dor neuropática pode ser manifestada como alodinia, hiperalgesia, dor espontânea ou dor fantasma. 2. Tratamento da alodinia táctil
Os polipeptídeos variantes da neublastina aqui divulgados (e composições farmacêuticas que compreendem os mesmos) podem ser usados no tratamento de alodinia táctil em um sujeito. 0 termo "alodinia táctil" refere-se normalmente à condição em um sujeito onde a dor é evocada pela estimulação da pele (por exemplo, tacto) que é normalmente inócuo.
Nalgumas modalidades, a alodinia táctil é tratada pela administração ao sujeito de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um polipeptídeo variante da neublastina. Numa modalidade relacionada, a alodinia táctil pode ser tratada 26 através da administração de uma quantidade eficaz a um sujeito de um polipeptídeo variante da neublastina isoladamente ou pela administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um polipeptideo variante da neublastina com uma quantidade eficaz de um composto induzido por analgesia selecionado do grupo consistindo de opióides, anti-arrítmicos, analgésicos tópicos, anestésicos locais, anticonvulsivos, antidepressivos, corticóides e anti-inflamatórios não-esteróides. Numa modalidade, o composto induzido por analgesia é um anticonvulsivo. Noutra modalidade preferida, o composto induzido por analgesia é a gabapentina (ácido acético(1-aminometil)ciclohexano) ou pregabalina (ácido S—(+)-4—amino—3— (2-metilpropil) butanóico.
Nalgumas modalidades, um polipeptideo variante da neublastina é administrado em associação com um agente terapêutico, incluindo, entre outros, um agente anti-câncer ou um agente antiviral. Os agentes anti-cancerigenos incluem, entre outros, taxol, taxotero, cisplatina, nocodazol, vincristina, vinblastina e vindesina. Os agentes anti-virais incluem, entre outros, dd, DDC, d4T, foscarnet, dapsona, metronidazol e isoniazida. 3. Tratamento para redução da perda de sensibilidade à dor
Noutra modalidade, os polipeptideos variantes da neublastina aqui divulgados (e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos) podem ser usados para reduzir a perda de sensibilidade à dor em um indivíduo com uma neuropatia. Numa modalidade, a neuropatia é a neuropatia diabética. Nalgumas modalidades, a perda da sensibilidade à dor é uma perda de sensibilidade à dor térmica. Estes métodos 27 incluem o tratamento profilático e terapêutico.
No tratamento profilático, um polipeptídeo variante da neublastina é administrado a um sujeito em risco de desenvolvimento da perda de sensibilidade à dor (tal sujeito poderia ser um sujeito com uma neuropatia na fase inicial). 0 tratamento com um polipeptídeo variante da neublastina em tais circunstâncias serviria para tratar os pacientes em risco de forma preventiva.
No tratamento profilático, um polipeptídeo variante da neublastina é administrado a um sujeito que passou por perda de sensibilidade à dor como resultado da aflição com uma neuropatia (tal sujeito poderia ser um sujeito com uma neuropatia na fase posterior). 0 tratamento com um polipeptídeo variante da neublastina em tais circunstâncias poderia servir para resgatar a sensibilidade à dor adequada no sujeito. 4. Tratamento de infecções virais e Neuropatias associadas ao vírus É contemplado o tratamento profilático de neuropatias infecciosas e virais. 0 tratamento profilático é indicado após a determinação da infecção virai e antes do início da dor neuropática. Durante o tratamento, um polipeptídeo variante da neublastina é administrado para evitar aparecimento de dor neuropática, incluindo, entre outros, dor neuropática associada à hanseníase, doença de Lyme, dor neuropática associada à infecção por um vírus, um vírus em particular selecionado do grupo constituído por um vírus do herpes (e, mais particularmente por um vírus herpes zoster, 28 que pode levar a neuralgia pós-herpética), um vírus de imunodeficiência humana (HIV) e papiloma vírus). Numa modalidade alternativa, um polipeptídeo variante da neublastina é administrado para reduzir a gravidade da dor neuropática que poderia aparecer.
Os sintomas de infecção virai aguda, muitas vezes, incluem o aparecimento de uma erupção. Outros sintomas incluem, por exemplo, o desenvolvimento de dor persistente na área afectada do corpo, que é uma complicação comum de uma infecção por herpes zoster (cobreiro). A Neuralgia pós-herpética pode durar um mês ou mais, e pode aparecer alguns meses após os sintomas como prurido, desapareceram. 5. Tratamento da neuropatia diabética dolorosa É contemplado o tratamento profilático da neuropatia diabética dolorosa. 0 tratamento profilático de neuropatias diabéticas terá início após a determinação do diagnóstico inicial de diabetes ou sintomas associados ao diabetes e antes do início da dor neuropática. 0 tratamento profilático da neuropatia diabética dolorosa pode começar também mediante a determinação de que um sujeito está em risco de desenvolver diabetes ou sintomas associados ao diabetes. Durante o tratamento, um polipeptídeo variante da neublastina é administrado para evitar aparecimento de dor neuropática. Numa modalidade alternativa, um polipeptídeo variante da neublastina é administrado para reduzir a gravidade da dor neuropática que já apareceu. 29 6. Tratamento de distúrbios do sistema nervoso
Os polipeptideos variantes da neublastina aqui divulgados (e composições farmacêuticas que compreendem os mesmos) podem ser usados no tratamento ou prevenção de um distúrbio do sistema nervoso num sujeito (como um humano), pela administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo variante da neublastina, uma composição contendo um polipeptídeo variante da neublastina ou um complexo que inclui um polipeptídeo variante da neublastina conjugado com fluido aquoso estável acoplado a uma molécula de polialquileno, como, por exemplo, PEG. 0 distúrbio do sistema nervoso pode ser um distúrbio do sistema nervoso periférico, como uma neuropatia periférica ou uma síndrome de dor neuropática. Os seres humanos são sujeitos preferidos para o tratamento.
Um polipeptídeo variante da neublastina é útil para tratar um defeito em um neurónio, incluindo, sem limitação neurónios lesados e neurónios traumatizados. Os nervos periféricos, que incluem a experiência do trauma, entre outros, nervos da medula ou do cordão espinhal. Os polipeptideos variantes de neublastina são úteis no tratamento de doenças neurodegenerativas, por exemplo, dano neuronal isquémico cerebral, neuropatia, por exemplo, neuropatia periférica, doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (ELA). Tais polipeptideos variantes da neublastina podem ser usados no tratamento da memória prejudicada, por exemplo, perda de memória associada à 30 demência.
Seguem-se exemplos da prática da invenção. Não devem ser, de modo nenhum, interpretados como limitativos do escopo da invenção.
Exemplos
Exemplo 1: Design e Síntese de Polipeptídeos Variantes da Neublastina A neublastina humana foi cristalizada e a sua estrutura revelou uma tríade de iões de sulfato gue interagem com os quatros resíduos seguintes da neublastina próximos uns dos outros: Argl4, Arg48, Arg49 e Arg51. Com base na presença dessa tríade e o seu espaçamento em relação um ao outro, foi postulado que esta região de neublastina poderia ser um domínio de ligação de sulfato de heparina. Posteriormente, uma estrutura de sulfato de heparina foi presa (em sílica) a neublastina no sítio da tríade de sulfato. 0 sulfato de heparina cabe precisamente nessa posição, sugerindo que esta região dentro de neublastina tem potencial para a ligação de sulfato de heparina.
Os dados de cristalização da neublastina também revelaram que os seguintes resíduos de aminoácidos proporcionam interacções complementares, tanto à tríade de iões de sulfato ou com um ou mais dos outros três iões de sulfato que interagem com neublastina: Ser 46, 73 Ser, Gly 72, Arg 39, Gin, 21 de Ser 20, 68 Arg, Arg 33, seus 32, e Vai 94. Além dos sítios de ligação de sulfato revelados pela estrutura do cristal, a neublastina contem uma sequência de 31 consenso do sítio de ligação do sulfato de heparina (GPGSRAR) com resíduos 3-9 no seu terminal N. Esta região foi desestruturada na estrutura de cristal, mas pode se tornar ordenada em ligações de glicosaminoglicanos. A região provavelmente aproximar-se-á do espaço para os três aglomerados de sulfato observados na estrutura do cristal (Argl4 contribui para o sítio de ligação de heparina que está centrado principalmente na região da dobradiça da proteína).
Para investigar a relevância biológica do domínio de ligação de sulfato de heparina potencial, três substituições de resíduos de aminoácidos únicos foram feitas no aminoácido 113 maduro de neublastina humana (SEQ ID N0:1). Os resíduos de arginina em cada ou na posição 48 (variante denominada "Arg48E"; SEQ ID NO:2), a posição 49 (variante denominada "Arg49E"; SEQ ID NO:3), e posição 51 (variante denominada "Arg5lE"; SEQ ID NO:4) foram substituídos por glutamato (ou seja, três construtos das variantes de aminoácidos diferentes foram preparados) com a intenção de mudar a carga de um resíduo que atrairia um sulfato que se repeliria e potencialmente estabilizar o entorno de resíduos de arginina. As proteínas foram reabertas e purificada de corpos de inclusão de E. coli (ver WO 04/069176). Cada variante de neublastina foi submetida à análise para verificar a integridade estrutural e confirmar a substituição correcta de resíduos. Todos os três mutantes foram estruturalmente comparáveis à neublastina humana do tipo selvagem.
Exemplo 2: Cromatografia de heparina-sefarose e catiónica
Os polipeptídeos variantes da neublastina foram submetidos a análise bioquímica adicional para determinar o 32 efeito de que cada mutação tinha na ligação de heparina. A cromatografia catiónica e heparina-sefarose foram utilizadas. Já que a neublastina humana do tipo selvagem é uma proteína básica com um pi aparente de 11,31, a neublastina liga-se eficazmente às resinas catiónicas. A conversão simples da arginina para glutamato diminui o pi aparente para 10,88. No entanto, o pl menor não era esperado alterar drasticamente a ligação da resina catiónica nem alterar o perfil de eluição dos mutantes em relação ao do controlo de tipo selvagem.
Cada um dos mutantes (juntamente com o controlo de neublastina do tipo selvagem) foi submetido a cromatografia catiónica. As amostras foram carregadas de resina em tampão contendo fosfato 5 mM pH 6,5 e 150 mM de cloreto de sódio, seguido por eluição com um gradiente linear de sal a partir de 150 mM e terminando com 1M de cloreto de sódio. A neublastina do tipo selvagem a -800 mM de cloreto de sódio (Figura 2A; Pico D) , enquanto cada um dos três mutantes eluídos dentro de um intervalo de sal de aproximadamente 500 mm, o que reflecte o seu pl menor. Arg49E e Arg51E (Fig. 2A; Peaks B e C) eluídos com sal ligeiramente maior do que o necessário para eluir Arg48E (Fig. 2A; Peak A) (520 mM versus 490 mM, respectivamente). Esta diferença sugere que Arg48 é de superfície mais acessível e contribui mais para a ligação catiónica do que as outras duas mutações.
Para determinar se as substituições de Arg-a-Glu tiveram um efeito sobre a ligação de heparina, cada um dos três mutantes (juntamente com a neublastina humana do tipo selvagem) foi submetido à cromatografia heparina-sefarose (Figura 2B) . As condições de eluição e eluição eram semelhantes às utilizadas para cromatografia catiónica. No 33 entanto, o perfil de eluição observado foi a diferença significativa do perfil de eluição de resina catiónica. A neublastina do tipo selvagem eluiu a aproximadamente 720 mM de cloreto de sódio (Figura 2B; Peak H) , enquanto Arg51E, Arg49E e Arg48E eluidos a 570 mm (Figura 2B; Pico G), 510 mm (Figura 2B; Pico F), e 450 mm (Figura 2B; Pico E) de cloreto de sódio, respectivamente. Arg48E parece ter um efeito particularmente dramático na ligação de heparina. Tomados em conjunto, esses perfis de cromatografia sugeriram que cada mutação diminui a afinidade aparente da neublastina para heparina.
Exemplo 3: Cromatografia aniónica
Em condições padrão de pH entre 6,5 e uma concentração de cloreto de sódio de 150 mm, a neublastina não se liga às resinas aniónicas. Em contraste, o sulfato de heparina não se liga às resinas aniónicas nestas mesmas condições.
Quando a neublastina for pré-misturada na proporção de 1:1 molar com sulfato de heparina de 16 kDa e aplicada a uma matriz aniónica usando as condições acima, a ligação de neublastina e eluida com 600 mM de cloreto de sódio (Figura 3B, pistas marcadas "FT"), sugerindo que a neublastina estava vinculada à matriz aniónica através de sua interacção com o sulfato de heparina. Na ausência de heparina, a neublastina não se liga à resina aniónica (Figura 3A, pistas marcadas "FT") e nenhuma neublastina eluida com 600 mM de cloreto de sódio (Figura 3A, pistas marcadas com "eluição"). Estes dados fornecem mais provas de capacidade de neublastina de se ligar à heparina. 34
Exemplo 4: Estudos de Ligação de Célula de ovário de hamster chinês
Demonstrou-se previamente que a neublastina se liga de forma não-específica à superfície das células do ovário de hamster chinês (CHO). 0 ensaio de ligação celular de CHO da neublastina foi estabelecido para determinar se esta interacção é mediada, pelo menos em parte, através da ligação de neublastina às moléculas de sulfato de heparina da superfície celular. A neublastina humana do tipo selvagem (40 ug) ou o Arg48E mutante foi pré-misturado com células CHO (106 células) com uma densidade celular que se liga completamente às formas de Neublastina juntamente com quantidades crescentes de sulfato de heparina de 16 kDa e incubadas a 37°C por 4 horas. Após a incubação, as células foram peletizadas por centrifugação e a neublastina não-vinculada remanescente no sobrenadante foi submetida à análise de SDS/PAGE. Após a quantificação de cada banda de proteína por densitometria, o valor de densidade óptica resultante foi colocado em relação à concentração de heparina em cada amostra (Figura 4).
Nas duas concentrações mais baixas de heparina, tanto as formas de neublastina do tipo selvagem como as formas de neublastina mutantes tinham quantidades iguais de proteínas identificadas no sobrenadante. No entanto, conforme a concentração de heparina aumentou para 0,5 pg/nulo e mais, a neublastina do tipo selvagem foi identificada mais no sobrenadante do que o Arg48E mutante. Esta observação sugeriu que a heparina pode competir com a heparina ligada à 35 superfície celular para a ligação de neublastina do tipo selvagem (isto é, ligação da heparina com os resultados de neublastina do tipo selvagem na sua remoção, a partir da superfície da célula), enquanto que a heparina não pode facilmente competir fora do Arg48E mutante. A maior concentração de heparina (50 yg/ml), o Arg48E mutante começou a eluir fora da superfície celular, sugerindo uma interacção iónica entre a heparina e o mutante Arg48E pode ser responsável por essa observação.
Exemplo 5: A ligação de heparina da neublastina do tipo selvagem e Polipeptídeos variantes da neublastina
Para investigar o papel da tríade arginina identificada como um sítio de ligação de heparina de neublastina, uma ligação de heparina ELISA foi estabelecida. Em suma, um anticorpo monoclonal anti-neublastina foi revestido em uma placa de 96 poços, seguido de lavagem e a adição de uma das formas de neublastina. A heparina biotinilada foi então adicionada à placa. Após uma etapa de lavagem adicional, o complexo de neublastina/heparina foi identificado utilizando um conjugado Estrepavidina-HRP com um substrato quimioluminescente. Esta ligação de heparina ELISA foi utilizada para comparar o aminoácido 113 da neublastina do tipo selvagem (SEQ ID N0:1) e aminoácido 104 (aminoácidos 10-113 de SEQ ID NO:l) formas de polipeptídeos variantes da neublastina contendo uma única substituição do aminoácido (Arg48E, Arg49E e Arg5lE; SEQ ID NOS:2-4), bem como a substituição dupla (Arg48, 49E, SEQ ID NO:5).
Ambas as formas do tipo selvagem de neublastina ligada à heparina com um EC50 de -1 ng/ml de heparina (Figura 5) . 36
Arg49E e Arg51E se liga de forma menos eficiente, com uma aparente EC50 de -lOng/ml, mas a ligação máxima permaneceu a mesma (Figura 5). Das três mutações de ponto único, Arg48E teve o efeito mais dramático sobre a ligação de heparina, com EC50 aparente de -100 ng/ml, mas ainda alcançou o valor máximo de ligação de heparina, quando comparados às formas de neublastina inalteradas (Figura 5) . O mutante Arg48E foi assim cem vezes menos eficiente na ligação de heparina em comparação com as formas inalteradas de neublastina e dez vezes menos eficiente em comparação com os outros mutantes de substituição simples. Quando ambos Arg48 e Arg49 foram substituídos com o glutamato, a ligação de heparina foi quase eliminada, resultando numa diminuição de sete vezes na ligação de heparina máxima, mas o EC50 permaneceu dentro da escala dos mutantes únicos. Estes resultados sugerem que Arg48 desempenha um papel importante na ligação de heparina devido à sua localização central no possível sítio de heparina.
Exemplo 6: Análise de Activação do receptor quinase de neublastina de tipo selvagem e mutantes de ligação de heparina
Para determinar se as mutações do sítio de ligação da heparina tem um efeito sobre a sinalização do receptor de neublastina em um bioensaio com base em células, as formas mutantes de neublastina juntamente com a neublastina do tipo selvagem foram submetidas à activação da análise do receptor quinase (KIRA).
Cada um dos mutantes de substituição Arg-a-Glu pareciam idênticos para ao controlo não-modifiçado em relação à 37 actividade KIRA, sugerindo que esses mutantes são estruturalmente semelhantes ao do tipo selvagem e são capazes de activar o receptor neublastina e cascata de sinalização (Figura 6). Além disso, estes dados sugerem que a ligação de heparina à neublastina pode não ser necessária para activação do receptor.
Quando o mutante duplo Arg48, 49E (SEQ ID NO:5, forma de aminoácidos 113) foi submetido à análise KIRA, seu EC50 aparente foi deslocado para a esquerda por cerca de uma ordem de magnitude, com um aumento na sua activação do receptor máximo, quando comparado com o controlo de neublastina humana do tipo selvagem (Figura 7A) . Da mesma forma, o Arg48, 49E mutante duplo (SEQ ID N0:7, forma de aminoácidos 104), também exibiu uma potência aumentada em relação a neublastina do tipo selvagem (Figura 7B) . Cada um dos Arg48, 51E e Arg49, 51E mutantes duplos (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 8, respectivamente, formas de aminoácidos 113) pareciam semelhantes ao controlo de neublastina inalterada em relação à actividade KIRA (Fig. 7B).
Exemplo 7: Análise do complexo ternário A neublastina humana do tipo selvagem e cada um dos mutantes heparina foram submetidos à análise do complexo ternário usando dois protocolos ligeiramente diferentes. O primeiro protocolo combinado com componentes do receptor de neublastina (GFRalpha3 e RET), juntamente com neublastina num "pool" antes da adição de uma placa de ELISA revestida com anticorpo de captura (Figura 8) . O segundo protocolo adicionada desses componentes sequencialmente para uma placa de ELISA com GFRalpha3 adicionado em primeiro lugar, seguido 38 por neublastina e, em seguida RET (Fig. 9).
Quando os componentes foram adicionados em conjunto, como um "pool", a ligação máxima foi obtida com ambos Arg48E e Arg48, 49E, sugerindo que estas formas de neublastina têm maior afinidade para o seu receptor. A neublastina do tipo selvagem pareceu se vincular com uma afinidade semelhante à do mutante Arg49E, enquanto o Arg51E e triplo mutante (Arg48, 49 e 51 todos substituídos ao glutamato), demonstrou ligação mais fraca ao receptor.
Quando os componentes do receptor foram adicionados sequencialmente, Arg48E apresentou a melhor ligação ao receptor. No entanto, sob essas condições, o mutante duplo se liga de forma mais fraca ao seu receptor com uma afinidade que parecia similar ao Arg51E mutante. Arg49E e neublastina do tipo selvagem tinha uma afinidade para o receptor que era do meio caminho entre a ligação máxima e mínima observada. 0 triplo mutante não liga nessas condições.
Em geral, estes dados sugerem que Arg48 desempenha um papel fundamental no que afecta a afinidade de neublastina para seu receptor.
Exemplo 8: Análise UV CD Próxima e Distante
Para investigar os efeitos das mutações duplas na estrutura secundária e terciária da neublastina, o Arg48,49E duplo mutante foi submetido a análise UV CD Próxima e Distante. Apesar de subtis diferenças serem detectadas nas estruturas secundárias e terciárias, a conformação do mutante duplo foi muito próxima ao da neublastina do tipo selvagem. 39
Exemplo 9: Análise farmacocinética da neublastina Arg48, 49E de Mutante Duplo A neublastina Humana exibe farmacocinética pobre (PK) , quando administrada a ratos por via intravenosa (IV) ou subcutânea (SC), com uma biodisponibilidade total inferior a 1%. A remoção da heparina pode ser a base para uma das razões para esta baixa biodisponibilidade.
Para determinar se a remoção de heparina participa na remoção da neublastina humana do rato, o Arg48,49E mutante duplo (junto com o controlo do tipo selvagem) foi submetido à análise de PK.
Ambas as formas são administrados separadamente em ratos com 7 mg/kg SC. As amostras de soro foram colectadas após uma hora, completadas em 96 horas, e analisadas para neublastina (Figura 10). A área observada sob a curva (AUC) para neublastina do tipo selvagem foi de -109 enquanto que AUC observado para o mutante duplo foi de 20.145. Isso representou um aumento de 185 vezes em AUC para o mutante duplo (em comparação com a neublastina do tipo selvagem) e um aumento significativo da exposição do soro.
Tanto a neublastina do tipo selvagem e mutante duplo foram submetidos à análise PK seguinte administração IV (1 mg/kg). A concentração plasmática inicial do mutante duplo foi de aproximadamente seis vezes mais (diamantes) do que o controlo do tipo selvagem (quadrados) , cinco minutos após a injecção, mas rapidamente níveis do tipo selvagem dentro de uma hora (Figura 11). Estes dados sugerem que a mutação dupla em neublastina, ajuda no aumento de exposição do soro, mas 40 não afecta a taxa de remoção geral.
Tomados em conjunto com a observação de SC, a ligação de heparina parece ser especialmente relevante após a administração SC, talvez resultando em um efeito semelhante ao depósito. Uma vez que a neublastina entra em circulação, a taxa na qual o mutante duplo e as moléculas do tipo selvagem são apurados é aproximadamente a mesma.
Para tratar a taxa na qual a neublastina é eliminada da circulação em ratos, tanto as formas mutantes duplas e do tipo selvagem de neublastina foram PEGuiladas com PEG de 10 kDa usando acoplamento químico com base em SPA. Já que a Neublastina é um homo-dímero, sem resíduos de lisina nativa, as fracções de 10 kDa, especificamente marcadas com o terminal amino de cada monómero. A neublastina de mutante duplo humano PEGuilado 2X10K foi purificada à homogeneidade, e submetida a análise estrutural e biológica antes da análise PK. O mutante duplo 2X10K PEG Arg48, 49E foi injectado, quer em ratos IV (1 mg/kg) quer SC (7 mg/kg) e o soro recolhido em vários pontos do tempo para análise. Após a administração IV, o mutante duplo 2X10K PEG atingiu o Cmax teórico de 10 ug/ml (diamantes) com fases alfa e beta típicos (Figura 12) . A administração de SC do mutante duplo PEGuilado demonstrou um Cmax de 40 ng/ml em 24 horas da injecção (Figura 12). Uma vez que a droga chegou a circulação, a taxa aparente de remoção paralela da dose de azoto. A biodisponibilidade deste construto foi de aproximadamente 10% em comparação a menos de 1% para a neublastina humana do tipo selvagem PEGuilada. 41
Exemplo 10: Expressão de um Mutante de ligaçao heparina neublastina em células do ovário de hamster chinês
Os construtos plasmidiais que codificam a neublastina mutante e tipo selvagem foram expressos em células CHO e a quantidade de proteínas solúveis secretadas foi medida por ELISA. Os construtos plasmidiais utilizados nos experimentos codificados por uma proteína de fusão com o peptídeo de sinal de hormona de crescimento humano (SigPep) (com ou sem um intron incluído no plasmídeo) fundido a (i) o terminal carboxi do aminoácido 104 da neublastina humana do tipo selvagem, ou (ii) mutante duplo Arg48, 49E (forma de aminoácido 104). A seguir estão as sequências de aminoácidos das proteínas de fusão da neublastina utilizadas nesses experimentos. As sequências de neublastina são do tipo maiúsculas. As sequências de peptídeos de sinal da hormona de crescimento humano estão em minúsculas. A junção do peptídeo de sinal e sequências de neublastina é indicada com um quilate (A) . Os aminoácidos nas posições 48 e 49 estão sublinhados.
SigPep-NBN (tipo selvagem): matgsrtsIllafglIclswlqegsaAAAGARGCRLRSQLVPV RAL,GLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG (SEQ ID NO:13).
SigPep-NBN (Arg48, 49E): matgsrtsIllafglIclswlqegsaAAAGARGCRLRSQLVP VRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCEEARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQP CCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG (SEQ ID NO:14). 42
As células CHO foram transfectadas com plasmídeos que codificam cada uma das formas de neublastina e cultivadas em placas de 384 poços. Depois de várias semanas, os poços que continham células cultivadas foram transferidos para placas de 96 poços frescos de cultura. 0 meio condicionado foi analisado por ELJSA para medir a titulação da neublastina solúvel. Os dados de absorção cumulativa para cada plasmídeo testado (valor médio com um desvio-padrão como barras de erro) foram detectados. A transfecção de células CHO com plasmídeo que codifica Arg48, 49E mutante duplo resultou em um número significativamente de linhas celulares maiores que exibem níveis elevados de expressão de proteínas recombinantes, em comparação com células transfectadas com plasmídeos que codificam a neublastina do tipo selvagem (Figura 13).
As linhas celulares principais de cada transfecção foram ampliadas. Números fixos de células foram cultivados por três dias e a contagem de células total, viabilidade e títulos foram determinados. As titulações de neublastina expressas a partir de Arg48,49E de linhas de células mutantes duplas foram de cerca de cinco vezes maior do que aquelas de uma linha celular da neublastina do tipo selvagem (figura 14).
Lisboa, 10 de Agosto de 2010 43
Claims (32)
- REIVINDICAÇÕES 1. Polipeptídeo, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% idêntica aos aminoácidos 15-113 da SEQ ID NO:l, onde a sequência de aminoácidos compreende um aminoácido que não seja arginina substituída nas posições correspondentes a posição 48 e posição 49 de SEQ ID NO:l, onde os polipeptídeos, quando dimerizados, se ligam a um complexo contendo GFRalfa3 e RET e, no qual o polipeptídeo exibe diminuição da ligação de heparina em comparação com a proteína da neublastina do tipo selvagem de SEQ ID NO:l.
- 2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o resíduo de arginina na posição 48 e resíduo de arginina na posição 49 da SEQ ID NO:l serem substituídos com resíduos de aminoácidos não-conservantes.
- 3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o resíduo de arginina na posição 48 e resíduo de arginina na posição 49 da SEQ ID NO:l serem substituídos por ácido glutâmico cada um deles.
- 4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a sequência de aminoácidos ser pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 15-113 de SEQ ID NO:1.
- 5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a sequência de aminoácidos ser pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 15-113 de SEQ ID NO:1.
- 6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 1 a 3, caracterizado por a sequência de aminoácidos ser pelo menos 98% idêntica aos aminoácidos 15-113 de SEQ ID NO: 1.
- 7. Polipeptídeo, caracterizado por compreender aminoácidos 15-113 da SEQ ID N0:5.
- 8. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o polipeptídeo compreender aminoácidos 10-113 de SEQ ID NO:5.
- 9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5. dodu -L U.U
- 10. Polipeptídeo, de caracterizado por o polipeptídeo compreender aminoácidos 15-113 de SEQ ID NO:5.
- 11. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o polipeptídeo compreender aminoácidos 10-113 de SEQ ID NO:5.
- 12. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5 ou 7.
- 13. Dímero, caracterizado por compreender dois polipeptídeos de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12.
- 14. Conjugado, caracterizado por compreender o polipeptídeo de qualquer das reivindicações 1-12 conjugado com um polímero de ocorrência natural. 2
- 15. Conjugado, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o polímero de ocorrência não-natural ser um polialquileno glicol.
- 16. Conjugado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o polialquileno glicol ser polietileno glicol.
- 17. Conjugado, de acordo com qualquer das reivindicações 14-16, caracterizado por o polímero de ocorrência natural ser acoplado ao polipeptídeo no terminal amino.
- 18. Conjugado, de acordo com qualquer das reivindicações 14-16, caracterizado por o polímero de ocorrência natural ser acoplado ao polipeptídeo no sítio de conjugação do polímero interno.
- 19. Proteína de fusão, caracterizada por compreender o polipeptídeo de qualquer das reivindicações 1 a 12 e uma sequência de aminoácido heteróloga.
- 20. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o polipeptídeo de qualquer das reivindicações 1 a 12, o dímero de reivindicação 13, o conjugado de qualquer uma das reivindicações 14 a 18, ou a proteína de fusão da reivindicação 19 e um transportador farmaceuticamente aceitável ou excipiente.
- 21. Polipeptídeo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender o dímero da reivindicação 13, o conjugado de qualquer das reivindicações 14 a 18, a proteína de fusão da reivindicação 19 ou a 3 composição farmacêutica da reivindicação 20 para uso como medicamento. compreender uma de qualquer das
- 22. Ácido nucleico, caracterizado por sequência que codifica o polipeptídeo reivindicações 1 a 12.
- 23. Vector de expressão, caracterizado por compreender o ácido nucleico da reivindicação 22.
- 24. Célula, caracterizada por compreender o vector de expressão da reivindicação 23.
- 25. Método de fabricação de um polipeptídeo, caracterizado por compreender: fornecer uma célula da reivindicação 24, e cultura da célula em condições que permitam a expressão do ácido nucleico.
- 26. Uso do polipeptídeo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender o dímero da reivindicação 13, o conjugado de qualquer das reivindicações 14 a 18, a proteína de fusão da reivindicação 19 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção da desordem do sistema nervoso em um mamífero.
- 27. Uso do polipeptídeo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender o dímero da reivindicação 13, o conjugado de qualquer das 4 reivindicações 14 a 18, a proteína de fusão da reivindicação 19 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento da dor neuropática em um mamífero.
- 28. Uso do polipeptídeo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender o dímero da reivindicação 13, o conjugado de qualquer das reivindicações 14 a 18, a proteína de fusão da reivindicação 19 para a preparação de uma composição farmacêutica para a activação do receptor RET em um mamífero.
- 29. Polipeptídeo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender o dímero da reivindicação 13, o conjugado de qualquer das reivindicações 14 a 18, a proteína de fusão da reivindicação 19 para a preparação de uma composição farmacêutica da reivindicação 20 para uso no tratamento ou prevenção da desordem do sistema nervoso em um mamífero.
- 30. Polipeptídeo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender o dímero da reivindicação 13, o conjugado de qualquer das reivindicações 14 a 18, a proteína de fusão da reivindicação 19 ou a composição farmacêutica da reivindicação 20 para o tratamento da dor neuropática em um mamífero.
- 31. Polipeptídeo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender o dímero da reivindicação 13, o conjugado de qualquer das reivindicações 14 a 18, a proteína de fusão da reivindicação 19 ou a composição farmacêutica da reivindicação 20 para a activação do receptor RET em um mamífero. 5
- 32. Uso, polipeptídeo, dímero, conjugado, proteína de fusão ou composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 26 a 31, caracterizado por o mamífero ser um humano. Lisboa, 0 de Agosto de 2010 6
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