HU220795B1 - Gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjék, továbbá berendezések és gyógyászati készítmények idegsejtkárosodás megelőzésére és kezelésére - Google Patents

Gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjék, továbbá berendezések és gyógyászati készítmények idegsejtkárosodás megelőzésére és kezelésére Download PDF

Info

Publication number
HU220795B1
HU220795B1 HU9400717A HU9400717A HU220795B1 HU 220795 B1 HU220795 B1 HU 220795B1 HU 9400717 A HU9400717 A HU 9400717A HU 9400717 A HU9400717 A HU 9400717A HU 220795 B1 HU220795 B1 HU 220795B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gdnf
protein
acid sequence
seq
neurotrophic factor
Prior art date
Application number
HU9400717A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT66137A (en
HU9400717D0 (en
Inventor
Susan Bektesh
Franklin D. Collins
Daniel H. Doherty
Jack Lile
Leu-Fen H. Lin
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of HU9400717D0 publication Critical patent/HU9400717D0/hu
Publication of HUT66137A publication Critical patent/HUT66137A/hu
Publication of HU220795B1 publication Critical patent/HU220795B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/26—Psychostimulants, e.g. nicotine, cocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/839—Nerves; brain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Description

A találmány tárgyát tisztított és izolált, dopaminergneuronokban dopaminfelvételt elősegíteni képes gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjék képezik, amelyek a szekvencialistában a 4. vagy a 6. azonosítószámon megadott szekvenciával azonos aminosavszekvenciát vagy egy, a 4. vagy a 6. azonosítószámon megadott szekvenciával legalább 70%-ban homológ aminosavszekvenciát tartalmaznak. A találmány tárgyát képezik továbbá a gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehéijét kódoló tisztított és izolált nukleinsavszekvenciák, az azokat tartalmazó vektorok és gazdasejtek, továbbá a gazdasejteket tartalmazó, beültethető berendezések. A találmány tárgyát képezik ezenkívül gliasejtvonaleredetű neurotróf faktorfehéijével történt immunizálásával előállított antitestek, az antitesttermelő hibridómák, valamint eljárások gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktor izolálására, előállítására, kimutatására és kvantitatív mérésére.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti fehéijét tartalmazó gyógyászati készítmények. A gyógyászati készítmények előnyösen alkalmazhatók idegsejtek károsodásának, megbetegedésének vagy rendellenes működésének kezelésére vagy megelőzésére, például Parkinson-kór, Alzheimer-kór, lateralsclerosis és egyéb okból létrejött idegsejtkárosodás megelőzésére vagy kezelésére.
A neurotróf faktorok természetes fehéijék, amelyeket az idegrendszerben, illetve az idegrendszer által beidegzett nem idegszövetekben lehet találni, amelyeknek az a funkciójuk, hogy az ideg- és/vagy neurogliasejtek túlélését, valamint a fenotípusos differenciálódását biztosítsák [Varon és Bunge, Ann. Rév. Neuroscience, 1, 327 (1979); Thoenen és Edgár, Science, 229, 238 (1985)]. Ennek a fiziológiai szerepnek a következtében a neurotróf faktorok hasznosak lehetnek az idegsejtek degenerációjának és a differenciálódott funkciók elvesztésének kezelésében, ami számos neurodegeneratív betegségben előfordul.
Ahhoz, hogy egy adott neurotróf faktor potenciálisan használható legyen az idegkárosodás kezelésében, ahhoz az kell, hogy a károsodott idegsejtek osztálya vagy osztályai reagáljanak a faktorra. A különböző neurotróf faktorok tipikusan eltérő osztályba tartozó idegsejteket érintenek. Ennélfogva tanácsos, hogy kéznél legyen számos különböző neurotróf faktor, hogy a sérült neuronok minden egyes osztályát tudjuk kezelni, ami a betegség vagy sérülés különböző formáiban előfordul.
A neurotróf faktorok megőrizhetik a reagáló neuronokat számos, egymáshoz nem kapcsolódó sérüléssel szemben. Például a neurotróf faktor idegnövekedési faktor (NGF) az érzékelő neuronok jelentős részét képes megmenteni a pusztulástól, amit az axonális folyamataik elvágása okoz [Rich et al., J. Neurocytol., 16, 261 (1987); Ottó et al., J. Neurosci., 83, 156 (1987)], az ontogenetikus pusztulástól az embrionális fejlődés során [Hamburger et al., J. Neurosci., 4, 767 (1984)], valamint attól a pusztulástól, amit a taxol és a ciszplatin adagolása okozhat [Apfel et al., Ann. Neurol., 29, 87 (1991)]. A védelemnek ez a látható általánossága vezetett ahhoz a koncepcióhoz, hogy ha egy neurotróf faktor megóvja a reagáló neuronokat a kísérleti pusztulással szemben, akkor hasznos lehet azoknak a betegségeknek a kezelése, amelyek magukba foglalják ezeknek a neuronoknak a károsodását a betegben, még akkor is, ha az etiológia nem ismert.
Egy adott neurotróf faktor, amellett, hogy a helyes neuronális specifitással rendelkezik, elegendő mennyiségben kell hogy hozzáférhető legyen ahhoz, hogy egy gyógyászati kezelésben alkalmazható legyen. Mivel a neurotróf faktorok a szövetekben végtelenül kis mennyiségben fordulnak elő [Hofer and Barde, Natúré, 331, 261 (1988); Lin et al., Science, 246, 1023 (1989)], ezért nagyon kényelmetlen lenne, ha a gyógyászatban alkalmazható mennyiségű neurotróf faktorokat közvetlenül állati szövetekből kellene izolálni. Ennek egy alternatívája az, hogy kívánatos lenne, ha egy neurotróf faktor génjét lokalizálni lehetne, abból a célból, hogy ezen az alapon egy rekombináns expressziós rendszert lehessen létrehozni, amellyel a fehérjét korlátlan mennyiségben elő lehet állítani.
Ennek a találmánynak a feltalálói módszert írnak le, amellyel biológiai mintákat lehet átvizsgálni neurotróf aktivitás szempontjából a feketeállomány dopaminergneuronjainak embrionális prekurzorain, amelyek a Parkinson-kórban degenerálódnak. Ez a neurotróf faktorok azonosítását célzó biológiai vizsgálat, amely hasznos lehet a Parkinson-kór kezelésében, egy korábban leírt vizsgálaton alapul [Friedman et al., Neuro. Sci. Lett., 79, 65-72 (1987), amelyre a továbbiakban referenciaként hivatkozunk], és a jelen találmányban módosításokkal alkalmazunk. Ezt a vizsgálatot használjuk a dopaminergneuronokra irányuló neurotróf aktivitás potenciális forrásainak átvizsgálására. A jelen találmányban egy új neurotróf faktor jellemzését írjuk le, amelyet egy ilyen forrásból izoláltunk, egy glioblasztóma sejtvonál kondicionált tenyészközegéből [Schubert et al., Natúré, 249, 224-227 (1974), amelyre a továbbiakban referenciaként hivatkozunk]. Az ebből a sejtvonalból származó kondicionált tápközegről korábban leírták, hogy dopaminerg neurotróf aktivitással rendelkezik [Bohn et al., Soc. Neurosci. Abs., 15, 277 (1989)]. Ebben a korábbi közleményben a neurotróf aktivitás forrását nem tisztították meg, nem jellemezték kémiailag, illetve nem mutatták ki, hogy a hatás egyetlen, a kondicionált közegben található ágensnek a következménye. Az idegkárosodást olyan körülmények okozzák, amelyek veszélyeztetik egy vagy több idegsejttípus túlélését és/vagy megfelelő működését. Az ilyen idegkárosodások számos különböző okból felléphetnek, amelyek közül néhányat az alábbiakban megemlítünk.
Az idegkárosodás lehet fizikai sérülés következménye, ami az axonális folyamatok és/vagy az idegsejttesteknek a degenerálódását okozza a sérülés helyének közelében. Az idegkárosodás akkor is előfordulhat, ha a vérnek az idegrendszer részeihez való áramlása ideiglenesen vagy véglegesen megszakad, például infarktus következtében. Idegkárosodás akkor is előfordulhat, ha szándékosan vagy véletlenül neurotoxinok hatásának tesszük ki az idegsejteket, például rák vagy AIDS ke2
HU 220 795 Bl moterápiás hatóanyagok hatásának, azaz ciszplatin vagy didezoxi-citidin (ddC) hatásának. Az idegkárosodás akkor is fellép, ha krónikus metabolikus betegségben szenved a beteg, ilyen például a cukorbaj, vagy a rossz veseműködés. Idegkárosodás felléphet neurodegeneratív betegségek következtében is, ilyen például a Parkinson-kór, az Alzheimer-betegség, és a Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), amely specifikus neuronpopulációk degenerációjának következménye.
Ebben a bejelentésben egy új neurotróf faktort írunk le. A neurotróf faktorok természetes fehérjék, amelyek elősegítik specifikus idegsejtek normális működését, és/vagy megvédik ugyanazokat a sejteket a károsodás számos különböző formájával szemben. Ezek azok a tulajdonságok, amelyek azt sugallják, hogy a GDNF hasznos lehet különböző idegkárosodások kezelésében, beleértve azokat, amelyeket az előzőkben specifikusan említettünk.
A Parkinson-kórt egyedi tünetegyüttessel lehet azonosítani, ide tartozik a merevség, a mozgás lassúbbodása, seborrhea, felgyorsult járás, görbült testtartás, nyáladzás, „pirulagörgető” reszketés. A betegség a világ minden embertípusában előfordul, a fellépés átlagos életkora 60. év.
Az egymásnak ellentmondó elméletek, ellentmondások évei után a Parkinson-kór fő okozójaként egy biokémiai alap merült fel [lásd például Bergman, Drug Store News, 12, IP19 (1990)]. A Parkinson-kór megértéséhez lényeges fontosságúak az agynak azok a részei, a feketeállomány, a bazális gangba, és főleg a csíkolt test. A feketeállomány, ami a középagyban pigmentált szürke anyag bilaterálisán páros rétege, vesz részt a dopamin-transzmisszióban, míg a normális bazális ganglionok működése számos kölcsönhatást és visszaható rendszereket foglal magában, amelyek a feketeállománnyal vannak kapcsolatban és részben a dopamin, acetilkolin és más anyagok közvetítik.
A Parkinson-kórban működési zavar van a feketeállomány dopaminerg aktivitásában, amelyet neuronális degenerálódás okoz. Ennek egy eredménye a dopamindeficiencia állapota, és az aktivitás egyensúlyának eltolódása a kolinerg predominancia irányába. Ennélfogva, jóllehet nincs növekedés az acetilkolin koncentrációjában, a központi idegrendszerre gyakorolt izgató hatása (azaz a reszketések) ennek a kolinerg mediátomak meghaladja a lecsökkent dopamingátló hatását.
A Parkinson-kór leghatékonyabb kezelése a mai napig a Levodopa orális beadása. A Levodopa behatol a központi idegrendszerbe, és enzimatikusan dopaminná alakul a ganglionokban. Az az elterjedt vélemény, hogy a Levodopa jótékony hatása az, hogy fokozza a dopamin koncentrációját az agyban. Sajnos azonban sem a Levodopa, sem egyetlen más, kevésbé gyakran használt gyógyszer sem akadályozza meg a betegség előrehaladását, amit a dopaminergneuronok degenerációja okoz.
Más kutatók leírták, hogy különböző biológiai forrásokban dopaminerg aktivitás található. Springer és munkatársai WO91/01739 számú PCT publikációjában dopaminerg neurotróf aktivitást azonosítottak a perifériális idegrendszer sejtjeiből származó kivonatban. Az azonosított aktivitást nem tisztították, hanem hozzárendelték egy faktorhoz, amelynek molekulasúlya 10,000 Daltonnái kevesebb volt. A faktort patkány ülőidegéből izolálták, de láthatóan nem CNTF, amit szintén meg lehet találni az idegben [Lin et al., Science, 246, 1023 (1989)].
Az Appel és munkatársai által bejelentett 5,017,735 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben dopaminerg aktivitást azonosítottak a candatus-putamen szövetben. Ebben az esetben sem tisztították meg azokat a faktorokat, amelyek az aktivitást hordozták, és az aktivitást hordozó frakció látszólagos molekulasúlya viszonylag alacsony volt. [Lásd még Niijima et al., Brain Rés., 258, 151-154 (1990) (felnőtt patkányagy kémiailag afferensmentesített striátuma); Lo et al., Soc. Neurosci. Abstr., 16, 809 (1990) (striátumeredetű neurotróf faktor)]. Emellett más ismert neurotróf faktorról is kimutatták, hogy dopaminergaktivitással rendelkezik, azaz az agyi eredetű neurotróf faktor (BDNF), valamint a savas és bázikus fibroblaszt növekedési faktorok.
A jelen találmány szerinti GDNF-et azon az alapon izoláltuk, hogy képes elősegíteni a patkányembrió középagyából izolált sejtek túlélését és funkcionális aktivitás. Ezek a dopaminerg idegsejtek a felnőtt feketeállományban található dopaminerg idegsejtek embrionális prekurzorai, amelyek a Parkinson-kórban degenerálódnak. Ennélfogva a GDNF hasznos lehet a neuronális degeneráció redukciójában, ami a Parkinson-kór tüneteit okozza.
Emellett a GDNF hasznos lehet humán betegek dopaminerg idegsejtjei egyéb formájú károsodásának vagy helytelen működésének kezelésében. Az ilyen károsodás vagy helytelen működés előfordulhat skizofréniában, illetve egy más formájú pszichózisban. Az ilyen állapotok jelenlegi kezelései gyakran olyan gyógyszereken alapulnak, amelyek a dopaminreceptorokra hatnak, jelezve, hogy az ezeket a receptorhordozó neuronális populációkat beidegző dopaminergneuronok helytelen működése játszhat szerepet a kóros folyamatban.
Az egyéb neurotróf faktorokkal szerzett korábbi tapasztalatok alapján az idegkárosodás új formái, amelyek kezelhetők GDNF-fel, fognak előfordulni, amint többet tudunk azoknak az idegsejteknek a különböző típusairól, amelyek erre a neurotróf faktorra reagálnak. Például az idegnövekedési faktor (NGF) csak azután vált az Alzheimer-betegség potenciálisan hasznos kezelésére alkalmas anyaggá, miután újabban felfedezték, hogy az NGF neurotróf faktorként hat a bazális elóagy kolinerg neuronokra, amelyek az Alzheimer-betegségben degenerálódnak [Williams et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 83, 9231 (1986)]. A jelen találmányban módszereket adunk meg más olyan idegkárosodási formák meghatározására, amelyeket jól lehet kezelni a GDNF-fel.
Patrick Aebischer és munkatársai leírtak egy félig áteresztő, beültethető berendezést, amely jól használható gyógyszerek vagy gyógyhatású anyagok bejuttatására bizonyos körülmények között. Például azt javasolták,
HU 220 795 Β1 hogy olyan sejteket kell kapszulázni, amelyek neurotranszmitter faktorokat szekretálnak, és az ilyen berendezéseket Parkinson-kórban szenvedő betegek agyába kell beültetni [Aebischer et al., 4,892,538 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Aebischer et al., 5,011,472 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Aebischer et al., 5,106,627 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; WO 91/10425 számú PCT bejelentés; WO 91/10470 számú PCT bejelentés; Winn et al., Exper. Neurol., 113, 322-329 (1991); Aebischer et al., Exper. Neurol., 111, 269-275 (1991); Tresco et al., ASAIO, 38, 17-23 (1992)].
A jelen találmány tárgyát egy lényegében tisztítottneuroglia-eredetű neurotróf faktor képezi (GDNF). A jelen találmány egy megvalósítási módja szerint a lényegében tisztított GDNF-et úgy állítjuk elő, hogy specifikus aktivitása legalább 24 000-szer magasabb mint a B489 kondicionált táptalajé. A lényegében tisztított GDNF specifikus aktivitása legalább körülbelül 12 000 TU/pg.
A jelen találmány szerint lényegében tisztított GDNF látszólagos molekulasúlya 31-42 kDa nem redukáló SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézissel, és körülbelül 2023 kDa redukáló SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézissel. Ennek a lényegében tisztított GDNF-nek az N-terminális szekvenciája az alábbi aminosavakat tartalmazza [SEQ ID NO. 1]:
(Ser)-Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-ProArg-Arg-Glu-(Arg)-Asn-()-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala(Ser)-Pro-(Asp)-(Asn).
A patkány-GDNF érett és „pre-pro” formáit a 13. és 14. ábrán mutatjuk be (SEQ ID NO. 3 és SEQ ID NO. 4). A humán érett GDNF aminosavszekvenciáját a 19. ábrán mutatjuk be (SEQ ID NO. 5). A humán-GDNF pre-pro formájának az aminosavszekvenciáját a 19. ábrán (SEQ ID NO. 5) és a 22. ábrán (SEQ ID NO. 8) mutatjuk be.
A találmány tárgya eljárás tisztított GDNF előállítására, ami abban áll, hogy:
1. a B49 glioblasztómasejtek szérummentes növesztő táptalaját állítjuk elő;
2. a kondicionált táptalajt töményítjük;
3. a töményített kondicionált táptalajjal heparin-szefaróz-kromatográfiát végzünk;
4. az említett heparin-szefaróz-kromatográfiából kapott frakciókkal Fást Protein Liquid Chromatography-t végzünk;
5. az említett FPLC-kromatográfiával kapott frakciókkal fordított fázisú nagynyomású kromatográfiát végzünk.
Az egyik megvalósítási mód szerint a tisztított GDNF előállítása az alábbi lépéseket is tartalmazza:
6. a fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával kapott frakciókat preparatív SDS-poli(akrilamid) gélelektroforézisnek vetjük alá; és
7. fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiát végzünk a preparatív SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézis után kapott frakciókkal.
A találmány tárgyát képezi továbbá a patkány GDNF-génjének klónozása a B49 sejtvonalból készített cDNS-könyvtárból. Az érett és pre-pro patkány-GDNFet kódoló nukleinsavszekvenciát a 13. ábrán mutatjuk be (SEQ ID NO. 3). Egy GDNF-et kódoló humán gén előállítását is közöljük. Az érett humán-GDNF-et kódoló nukleinsavszekvenciát a 19. ábrán adjuk meg (SEQ ID NO. 5). A humán-GDNF pre-pro szegmentje első 50 aminosavának nukleinsavszekvenciáját a 22. ábrán adjuk meg (SEQ ID NO. 8).
A jelen találmány tárgyát képezik az olyan gyógyászati készítmények is, amelyek hatásos mennyiséget tartalmaznak a tisztított GDNF-ből, egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban. Leírjuk azt a módszert is, amelylyel az idegkárosodást meg lehet előzni, illetve kezeim lehet, ami abból áll, hogy egy ilyen kezelést igénylő betegnek a GDNF-ből terápiásán hatásos mennyiséget adunk be. Az előnyös megvalósítási módok szerint az idegkárosodás Parkinson-kór, illetve károsodott vagy rosszul működő dopaminerg idegsejt.
A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a GDNF-et rekombináns DNS-módszerrel állítjuk elő, az ismertetett, GDNF-et kódoló gének felhasználásával. A jelen találmány tárgyát képezi egy biológiailag aktív GDNF előállítására szolgáló vektor, amely az érett vagy pre-pro GDNF-et kódoló nukleinsavszekvenciához működés szempontjából hozzákapcsolt expressziós szabályozóelemeket tartalmaz. A találmány tárgya továbbá rekombináns DNS-módszer GDNF előállítására, ami abból áll, hogy: egy GDNF-et kódoló DNSszekvenciát egy expressziós vektorba szubklónozzuk, amely a DNS-szekvencia expresszálásához szükséges szabályozóelemeket tartalmaz; egy gazdasejtet az említett vektorral transzformálunk; a gazdasejteket olyan körülmények között szaporítjuk, amelyek lehetővé teszik a vektor amplifikálódását és a GDNF expresszióját; kinyeijük a GDNF-et.
A találmány tárgya rekombináns DNS-módszer GDNF előállítására, azzal jellemezve, hogy a jelen találmány szerinti gazdasejteket a vektor amplifikálására és expresszálására alkalmas körülmények között szaporítjuk; a GDNF-et kinyeljük.
A találmány tárgyát képezik a GDNF-et felismerő, lényegében tisztított antitestek. A találmány tárgya továbbá eljárás az idegkárosodás megelőzésére vagy kezelésére, ami abban áll, hogy a neurogliaeredetű neurotróf faktort szekretáló sejteket beültetjük egy ilyen kezelésre szoruló betegbe. Végezetül, a jelen találmány tárgya egy készülék idegkárosodás megelőzésére vagy kezelésére, oly módon hogy a készüléket beültetjük egy betegbe; a készülék egy félig áteresztő membrán, és a GDNF-et szekretáló sejtet beültetjük a membránba, és az említett membrán átereszti a GDNF-et, de nem ereszti át azokat a faktorokat a betegből, amelyek káros hatással lennének a sejtekre.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékletben megadott ábrákat.
Az 1. ábrán töményített B49 glioblasztoma sejtek szérummentes növesztő kondicionált táptalaja oldatával végzett heparin-szefaróz-kromatográfia eredményeit mutatjuk be. Az ábrán az eluátum OD290-értéke (folyamatos vonal), vezetőképessége (háromszöggel
HU 220 795 Bl szaggatott vonal) és GDNF-aktivitása TU-ban (körrel szaggatott vonal) látható. A megjelölt frakciókat egyesítjük a további tisztításhoz.
A 2. ábrán az 1. ábrából származó egyesített frakciók FPLC szuperóz kromatográfia eredményei láthatók. Az ábrán az eluátum OD280-értéke (folyamatos vonal) és GDNF-aktivitása látható TU-ban (körrel szaggatott vonal).
A 3. ábrán a 2. ábrából származó 14-es frakció RPHPLC eredményei láthatók. Az ábrán az OD214-értéke látható, és a GDNF-aktivitása TU-ban megadva alatta.
A 4. ábrán a 3. ábra 3-10-es frakciójának ezüsttel festett SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézissel végzett elemzése eredményei láthatók. Az S sáv tartalmazza a molekulasúly-standardokat.
Az 5. ábrán a 4. ábra 5. és 6. frakciójával végzett preparatív SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézis eredményei láthatók. A gélszeletek GDNF-aktivitását (TUban) vizsgáltuk. A gélszeletekben levő anyag molekulasúlyát is meghatároztuk molekulasúly-markerek alkalmazásával (Amersham).
A 6. ábrán az 5. ábra 16-23-as frakcióinak RPHPLC eredményei láthatók. Az A kromatogramm tartalmazza a mintát, a B kromatogramm a kontroll (egyesített gélkivonat az üres sáv megfelelő szeleteiből).
A 7. ábrán láthatók a 6A ábra 3-as csúcsának (1-es sáv) ezüsttel festett SDS-PAGE eredményei, valamint egy molekulasúly-kontroli (az S sáv).
A 8. ábrán a tisztított GDNF-ből kapott N-terminális aminosavszekvencia látható. Az üres zárójelek egy olyan pozíciót mutatnak, amelyben az aminosavat nem lehet az alkalmazott szekvenálási technikával meghatározni. Ahol a maradékokat zárójelben adjuk meg, ott bizonyos bizonytalanság volt a csoport meghatározásában. A teljes helyes aminosavszekvencia a 19. ábrán látható.
A 9. ábrán a tisztított GDNF tripszines emésztésével kapott elegy RP-HPLC-je eredményei láthatók. Az A kromatogramm tartalmazza a mintát, a B kromatogramm a kontroll (csak tripszint tartalmaz).
A 10. ábrán a 9. ábra 37-es csúcsának RP-HPLC-je eredményei láthatók, bróm-ciános hasítás után.
All. ábrán a 10. ábra 1-es csúcsa redukciós termékével végzett RP-HPLC eredményei láthatók.
A 12. ábrán a tisztított GDNF-ből kapott belső aminosavszekvencia látható.
A 13. ábrán egy B49 sejtkönyvtár cDNS-klónból (lambda-ZapII76.1) kapott nukleinsavszekvencia látható. Látható emellett az ebből származtatott aminosavszekvencia is. Az érett GDNF-et kódoló nukleinsavszekvenciát aláhúztuk. A GDNF legelőnyösebb pre-pro formája N-terminális szekvenciáját csillaggal jelöltük.
A 14. ábrán az érett GDNF származtatott aminosavszekvenciája látható.
A 15. ábrán a tisztított B49 sejt GDNF-fel és a humán rekombináns CNTF-fel kapott eredmények láthatók, a csirkeembrió ciliáris ganglionjából származó paraszimpatikus neuronok túlélésének vizsgálatában. Az Y tengelyen a növekvő sűrűség fokozott neurontúlélést jelent. Az X tengelyen az egyes neurotróf faktorok csökkenő koncentrációi láthatók. A kontrollnak jelzett görbe jelentése azonos térfogatú inaktív HPLC-frakciók, közel ahhoz, amely a GDNF-et tartalmazza, amellyel a GDNF-nek jelzett görbét előállítottuk.
A 16. ábrán a tisztított B49 sejt GDNF-fel és a humán rekombináns CNTF-fel kapott eredmények láthatók, a csirkeembrió szimpatikus lánc ganglionjából származó szimpatikus neuronok túlélésének vizsgálatában. Az Y tengelyen a növekvő sűrűség fokozott neurontúlélést jelent. Az X tengelyen az egyes neurotróf faktorok csökkenő koncentrációi láthatók. A kontrollnak jelzett görbe jelentése azonos térfogatú inaktív HPLC-frakciók, közel ahhoz, amely a GDNF-et tartalmazza, amellyel a GDNF-nek jelzett görbét előállítottuk.
A 17. ábrán a COS-sejt kondicionált táptalajával végzett biológiai vizsgálatok eredményei láthatók, amelyben azt vizsgáltuk, hogy képes-e fokozni a középagyi dopaminergneuronok dopaminfelvételét tenyészetben. Az Y tengelyen a felvett radioaktívan jelzett dopamin mennyisége látható, az X tengelyen a töményített COS-sejt-táptalaj növekvő mennyiségével szemben. A B-l-nek jelzett görbe jelenti a GDNF expressziójához megfelelő orientációban GDNF-génnel transzfektált COS-sejtekből származó szérummentes kondicionált táptalajt. A C-1-nek jelzett görbe az ellentétes orientációban (ami megakadályozza az expressziót) transzfektált COS-sejtekből származó szérummentes kondicionált táptalajt jelenti.
A 18. ábrán a COS-sejt kondicionált táptalajával végzett biológiai vizsgálat eredményei láthatók, amely arra irányult, hogy képes-e fokozni a túlélést csirkeembriók szimpatikus láncából származó szimpatikus neuronok tenyészetében. Az Y tengelyen a tenyészetek által redukált MTT festék mennyisége látható, ami a neuronok túlélésével arányos. Az X tengelyen a töményített COS-sejt-táptalaj növekvő hígításai láthatók. A GDNF-fel jelölt görbe a GDNS expresszálása céljából a helyes orientációban GDNF-génnel transzfektált COS-sejtekből származó szérummentes kondicionált táptalajt jelöli. A CONTROL-nak jelzett görbe az ellentétes orientációban (ami megakadályozza az expressziót) transzfektált COS-sejtekből származó szérummentes kondicionált táptalajt jelenti.
A 19. ábrán az alábbi, 2.C. példában leírt módon kapott humán-GDNF nukleinsavszekvencia egy része látható, benne az érett humán-GDNF-et kódoló teljes génnel. Ábrázoljuk az érett humán-GDNF származtatott aminosavszekvenciáját. Az érett humán-GDNF aminosavszekvenciáját aláhúztuk.
A 20. ábrán a GDNF-nek az a képessége látható, hogy serkenti a dopaminfelvételt, és a tirozin-hidroxiláz- (TH) immunfestést a dopaminergneuronokban. A tenyészeteket az l.B. példában leírtak alapján hozzuk létre. A GDNF-et a szélesztés napján adjuk hozzá, majd kilenc nap elteltével in vitro megismételjük.
A. 15 nap elteltével in vitro mérjük a 3H-DA-felvételt.
B. A tenyészeteket 16 nap elteltével fixáljuk in vitro 4%-os paraformaldehiddel, alaposan mossuk, 0,2%-os Triton Χ-100-zal permeabilizáljuk, és poliklonális TH
HU 220 795 Β1 elleni antitesttel festjük (Eugine Tech International, Allendale, NJ). A primer antitestkötődést Vectastatin ABC kittel tesszük láthatóvá (Vector Labs, Burlingame, CA).
A 21. ábrán a GDNF dopaminergneuronok elleni specifitása látható. A tenyészeteket az l.B. példában leírtak alapján hozzuk létre.
A. A 3H-DA-felvételt nyolc nap múlva méljük in vitro.
B. A 14C-GABA-felvételt nyolc nap elteltével mérjük in vitro.
A sejteket a 3H-DA-felvételnél leírt módon inkubáljuk és kezeljük, azzal a különbséggel, hogy a felvételhez alkalmazott puffer Kreb-Ringer-féle foszfátpuffer (pH=7,4), amely 5,6 mmol/1 glükózt, 1,3 mmol/1 EDTA-t, 10 pmol/l amino-oxi-ecetsavat (a GABA lebomlás megakadályozására), 2 mmol/1 β-alanint (hogy megakadályozzuk a neuroglia GABA-felvételét), és 0,1 pmol/l 14GABA-t (150 mCi/mmol, New England Nuclear, Boston, MA), 1 mmol/1 diamino-vajsav (DABA) jelenlétében, amely a 14C-GABA GABA neuronokba való felvételének erős gátlószere, a 14C-felvétel 10%-ra csökken. A DABA jelenlétében mért kontrollértékeket a kísérleti eredményekből kivontuk.
A 22. ábrán a humán-GDNF nukleinsavszekvenciájának egy része látható, amint az alábbi, 2.D. ábrán látható, beleértve a humán pre-pro GDNF 1-50-es aminosavait kódoló szekvenciát. A humán pre-pro GDNF első 50 aminosavának származtatott aminosavszekvenciát is ábrázoljuk. Ez az információ, a 19. ábrán megadott kódolószekvencia-ínformációval együtt megadja a humán pre-pro GDNF teljes kódolószekvenciáját, valamint a humán pre-pro GDNF-fehéqe származtatott aminosavszekvenciáját.
A 23. ábrán a SacI és PstI hasítási helyek térképe látható a pBSSK-lambda3AluI plazmidban, a 2D. példában leírtak alapján.
A 24. ábrán a GDNF dopaminergneuronokkal szemben mutatott specifitása látható. A tenyészeteket az l.B. példában leírtak alapján készítettük. A GDNF-et a szélesztés napján adjuk a tenyészethez, és a felvételt hat nap elteltével in vitro mérjük. Az A görbén a dopaminfelvételt, a B ábrán a szerotoninfelvételt látjuk.
A 25. ábrán Coomassie Blue-val festett SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézis gél látható, amelyet redukáló körülmények között futtattunk. A futtatott frakciók egy baktériumkivonatból származtak, a természetes konformációt fel nem vett GDNF S-Sepharose-oszlopon való futtatása után, a természetes konformáció felvétele előtt (lásd 6.C. példa). A 2-8-as sávok az oszlopról egymás után eluált frakciókat jelentik. A 3-5-ös frakciókat, amelyekben a GDNF feldúsult, a természetes konformáció beállításához egyesítjük. Az 1-es sávban a molekulasúly-standardok láthatók (SDS 70L, Sigma).
A 26. ábrán a GDNF-oldat SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézis Coomassie Blue-val való festését láthatjuk; a természetes konformáció felvétele előtt (6. és
13. sáv), a természetes konformáció felvétele után (2-es sáv), illetve a természetes konformáció felvétele, majd
150 mmol/1 β-merkapto-etanollal való visszaredukálás után (5. sáv). Az anyag a természetes konformáció felvétele előtt, és a visszaredukálás után monomerként fiit, molekulasúlya körülbelül 16 kDa. A természetes konformáció sikeres felvétele után a GDNF (redukció nélkül) dimerként fiit, molekulasúlya körülbelül 30 kDa (lásd 6C. példa). A 15-ös sávban a molekulasúly-standardok láthatók (SDS-70L, Sigma).
A 27. ábrán a természetes konformációt felvett GDNF-fel végzett biológiai vizsgálat eredményei láthatók; a vizsgálatban mértük a GDNF-nek azt a képességét, hogy elősegíti a csirkeembrió szimpatikus neuronok túlélését tenyészetben. A biológiai vizsgálatot a
4.A. példában újuk le. Az X tengelyen látható optikai sűrűséget (amely a túlélő neuronok számával arányos) az X tengelyen látható GDNF-koncentrációval szemben ábrázoljuk (amit Coomassie Blue-val festett SDSpoli(akril-amid) gél lézerdenzitometriás letapogatásával mérünk). A természetes konformációt újra felvett GDNF ED50-értéke a csirkeembrió szimpatikus neuron túlélésére körülbelül 3 ng/ml.
A 28. ábrán a természetes konformációt újra felvett GDNF-fel végzett biológiai vizsgálatok eredményei láthatók; a vizsgálatok során azt mértük, hogy képes-e fokozni a patkány embrionális középagyból származó nigrális dopaminergneuronok dopaminfelvételét. A biológiai vizsgálatot az l.B. példában leírtak alapján végezzük. Az Y tengelyre felvitt dopaminfelvételt az X tengelyre felvitt GDNF-koncentrációval szemben ábrázoljuk. A természetes konformációt újra felvett GDNF ED50-értéke a fokozott dopaminfelvételre ezekben a tenyészetekben körülbelül 3 pg/ml.
Az alábbiakban részletesen hivatkozunk a találmány jelenlegi előnyös megvalósítási módjaira, amelyek a következő példákkal együtt a találmány elveinek magyarázatát szolgálják.
A jelen találmány előtt a GDNF-et nem azonosították diszkrét biológiailag aktív anyagként, illetve nem létezett lényegében tiszta formában. Amint az alábbiakban ismertetjük, a GDNF részletes leírását adjuk meg, amely tartalmazza az alábbiakat: fizikai, kémiai és biológiai jellemzők; alkalmazhatóság; előállítási mód; a GDNF-et kódoló nukleinsavszekvenciák; az ilyen nukleinsavszekvenciákat tartalmazó vektorok; rekombináns technikák az előállítására; valamint a találmány egyéb szempontjai.
A GDNF egy olyan fehéije, amelyet neurogliasejtekben lehet azonosítani, illetve azokból nyerhető ki, és neurotróf aktivitással rendelkezik. Pontosabban, a GDNF egy dopaminerg neurotróf fehérje, amelyet részben azzal lehet jellemezni, hogy képes a dopamin felvételét fokozni a feketeállomány dopaminergneuronjai embrionális prekurzoraiban, valamint azzal, hogy képes elősegíteni a paraszimpatikus és szimpatikus idegsejtek túlélését. A lényegében megtisztított GDNF-t számos különböző módon lehet jellemezni:
1. Specifikus aktivitása legalább körülbelül 12 000 TU/pg.
2. Redukáló SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézissel mérve molekulasúlya körülbelül 20-23 kDa.
HU 220 795 Bl
3. Nem redukáló SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézissel mérve molekulasúlya körülbelül 31-42 kDa.
4. Specifikus aktivitása legalább 24 000-szer magasabb mint a B49 kondicionált táptalaj specifikus aktivitása.
5. Középagytenyészetben képes a tirozin-hidroxiláz immunreaktivitását fokozni.
6. N-terminális aminosavszekvenciája a 8. ábrán látható (SEQ ID NO. 1).
7. Belső aminosavszekvenciája a 12. ábrán látható (SEQ ID NO. 2).
A jelen találmány szerinti GDNF-et az alábbiakban részletesebben ismertetjük. Nyilvánvaló, hogy a találmánynak ez a vonatkozása bármely dopaminerg neurotróf fehérjére vonatkozik, amelynek N-terminális aminosavszekvenciája ugyanaz, vagy lényegében homológ a 8. ábrán megadott szekvenciával (SEQ ID NO. 1.). Ez a találmány vonatkozik bármely dopaminerg neurotróf fehéijére, amelynek belső aminosavszekvenciája ugyanaz, vagy lényegében homológ a 12. ábrán megadottal (SEQ ID NO. 12).
A jelen találmány tárgyát egy új dopaminerg neurotróf fehéije képezi, amelyet az alábbiakban neurogliaeredetű neurotróf faktornak nevezünk (GDNF). A GDNF B49 glioblasztómasejtek szérummentes kondicionált táptalajában azonosítottuk, illetve onnan izoláltuk lényegében megtisztított formában.
A GDNF-et tisztítottuk és jellemeztük, majd a tisztított anyag részleges aminosavszekvenciáját meghatároztuk. A kapott részleges aminosavszekvencia alapján DNS-próbákat terveztünk egy patkány-cDNS-klón előállítására, amelyet a GDNF-rekombinánsok előállításában lehet használni. Az ilyen klón nukleinsavszekvenciáját, valamint a patkány-GDNF ebből következő aminosavszekvenciáját a 13. ábrán (SEQ ID NO. 3) és a
14. ábrán (SEQ ID NO. 4) adjuk meg.
A GDNF N-terminális aminosavszekvenciáját meghatároztuk, ez látható a 8. ábrán (SEQ ID NO. 1). A GDNF belső aminosavszekvenciájának egy részét is meghatároztuk, ez látható a 12. ábrán (SEQ ID NO. 2). A tisztított GDNF látszólagos molekulasúlya körülbelül 31-42 kDa SDS-PAGE-val nem redukáló körülmények között, és körülbelül 2030 kDa SDS-PAGE-val redukáló körülmények között. Jóllehet ilyen elmélet nem korlátoz minket, azt állítjuk, hogy ez az információ konzisztens azzal, hogy a GDNF egy glikozilezett, diszulfidkötésekkel összetartott dimer molekula a természetes állapotában.
Amint azt az alábbi 6.C. példában részletesebben lenjük, a humán-GDNF-gén expressziója egy bakteriális expressziós rendszerben rekombináns humán-GDNF, azaz rhGDNF termelését eredményezi. Az expresszió után izolált anyag lényegében inaktív biológiailag, és monomer formában létezik. A természetes konformáció újrafelvétele után a GDNF biológiailag aktív, diszulfídkötésekkel összetartott dimer formájában létezik. A GDNF tehát egy dlszulfídkötésekkel összetartott dimer molekula a természetes, biológiailag aktív formájában. A jelen találmány azonban a GDNF-nek mind a monomer, mind a dimer formájára, illetve a biológiailag aktív, illetve inaktív formájára is vonatkozik.
Próbákat a patkány-GDNF nukleinsavszekvenciája alapján készítettünk, azzal a céllal, hogy a humánGDNF-et kódoló genomiális DNS-gént klónozzuk. Az érett GDNF-et kódoló humángént és a humán érett GDNF aminosavszekvenciáját a 19. ábrán adjuk meg (SEQIDNO. 5).
A GDNF-et jellemezhetjük azon képessége alapján is, hogy fokozza a dopamin felvételét a feketeállomány dopaminergneuronok embrionális prekurzorain, amint azt az alábbi l.C. példában közöljük. A GDNF-et továbbá azon az alapon is jellemezhetjük, hogy képes elősegíteni a paraszimpatikus és szimpatikus idegsejtek túlélését, amint azt az alábbi 4. példában leújuk.
A GDNF-et emellett azzal is jellemezhetjük, hogy képes fokozni a tirozin-hidroxiláz immunreaktivitását középagytenyészetekben. Ennek a jellemzőnek egy példáját az l.E. példában újuk le, és a 20. ábrán mutatjuk be. Emellett a GDNF-ről kimutattuk, hogy bizonyos specifitása van a dopammergneuronokhoz, általában a neuronokhoz viszonyítva. Ezt például igazolja a GABA-t tartalmazó neuronokbán a gamma-amino-vajsav (GABA) felvételére gyakorolt korlátozott hatása. Ezt is leírjuk az
l.E. példában, és a 21. ábrán mutatjuk be. A GDNF-ről az is kiderült, hogy korlátozott hatással van, ha van ilyen hatás egyáltalán, a szerotonin felvételére a szerotonerg neuronokbán. Ezt az l.E. példában újuk le, és a 24. ábrán mutatjuk be.
A jelen leírásban minden, a neurogliaeredetű neurotróf faktorokra tett hivatkozást úgy kell értelmezni, hogy az bármilyen eredetű olyan neurotróf faktorra vonatkozik, amely lényegében homológ, és biológiailag ekvivalens az alábbiakban ismertetett és leírt GDNFfel. A patkány- és humánfehéijék közötti homológia körülbelül 93%, és mindegyik emlős-GDNF hasonló magas mértékű homológiával rendelkezik. Az ilyen GDNF-ek dimer formában is létezhetnek biológiailag aktív formájukban.
A jelen találmány a GDNF glikozilezett és nem glikozilezett formába, illetve a természetben előforduló vagy rekombináns GDNF csonkított formába is vonatkozik, amint azt ismertetjük. Egy további megvalósítási mód szerint a GDNF-et módosítani lehet egy vagy több polietilén-glikol (PEG), vagy egyéb ismétlődő polimer egység kapcsolásával. A jelen találmány vonatkozik olyan GDNF-re is, amelyet rekombináns úton állítunk elő baktérium expressziós rendszerekben, amelyek N-terminális metionincsoportot tartalmaznak.
A „biológiailag ekvivalens” szakkifejezés a leírásban és az igénypontokban olyan, a jelen találmány szerinti készítményt jelez, amely képes ugyanezeknek a neurotróf tulajdonságoknak néhány vagy összes tulajdonságát demonstrálni, de nem szükségszerűen ugyanolyan mértékben, mint a B49 kondicionált táptalajból származó GDNF. A „lényegében homológ” szakkifejezés a leírásban és az igénypontokban a B49 kondicionált táptalajból izolált GDNF-fel olyan mértékű homológiát jelent, amely jobb, mint amit bármely, korábban közölt GDNF-nél leírtak. A homológia mértéke elő7
HU 220 795 Bl nyösen 70%-nál magasabb, előnyösebb, ha 80%-nál magasabb, és legelőnyösebb ha 90%-nál, 95%-nál vagy 99%-nál magasabb. Az alábbiakban ismertetett homológia százalékát úgy számítjuk ki, hogy a két szekvencia közül a kisebben talált azon aminosavak számát, amelyek illeszkednek a hozzá hasonlított szekvencia megfelelő aminosavaival, számítjuk ki százalékosan, ha az illesztésben 100 aminosav közé négy lukat lehet beépíteni, amint azt Dayhoff közli [Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington D. C.], amely publikációt a továbbiakban referenciának tekintünk. Ide tartoznak, és lényegében homológnak tartjuk azokat a GDNF-eket is, amelyeket azon az alapon lehet izolálni, hogy keresztreaktivitást adnak az ismertetett GDNF-re specifikus antitestekkel, illetve amelyeknek a génjeit hibridizációval lehet izolálni az itt ismertetett GDNFgénnel vagy annak darabjaival.
A jelen találmány szerinti előnyös GDNF-et B49 kondicionált táptalajból izoláljuk, lényegében tiszta formában. Egy további, előnyös GDNF-et rekombináns DNS-technológiával állítjuk elő, így kapunk egy lényegében tiszta formájú GDNF-et. A jelen találmány szempontjából a „tiszta forma” vagy a „lényegében tisztított forma” szakkifejezés a továbbiakban, ha az ismertetett GDNF-re vonatkoztatjuk, akkor olyan készítményt jelent, amely lényegében mentes más fehérjéktől, amelyek nem GDNF-fehérjék. Előnyösen, a jelen találmány szerinti GDNF legalább 50%-os tisztaságú, előnyösen 75%-os tisztaságú, és még előnyösebb, ha 80%os, 95%-os vagy 99%-os tisztaságú. A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint a GDNF-fehérje-készítmény olyan lényegében tisztított formájú, hogy lehetővé teszi egy, a szakterületen jártas szakember számára, hogy meghatározza az aminosavszekvenciának bizonyos részeit, anélkül, hogy először további tisztítási lépéseket kellene végrehajtani.
A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a GDNF-et B49 kondicionált táptalajból tisztítjuk az alábbi 1. példában leírtak alapján. Természetesen, az alábbiakban ismertetett információk alapján a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a GDNF-nek más forrásait is azonosítani lehet, és az ilyen forrásokból származó GDNF tisztítását lényegében az itt ismertetett tisztítási módszerrel végezhetjük.
A tisztítási eljárás megkönnyítésére a GDNF dopaminergaktivitását használjuk. A dopaminerg neurotróf aktivitások biológiai vizsgálatát az alábbi l.B. példában ismertetjük. Röviden, disszociált középagysejtek tenyészetét állítjuk elő, akár szérumban gazdag, akár szérummentes környezetben. A dopaminergaktivitás szempontjából vizsgálandó mintákat sómentesítjük, majd sorozathígításban hozzáadjuk a sejttenyészetekhez, és a lemezeket 6 napig 37 °C-on inkubáljuk nedvesített, 6,5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában. A tenyészeteket, a vizsgálandó anyag jelenlétében azután 37 °C-on inkubáljuk triciált dopaminnal (3H-DA). A dopaminfelvételt leállítjuk, a sejteket mossuk, majd a dopaminfelvételt a tenyészetek által visszatartott trícium alapján szcintillációs számlálóval határozzuk meg.
A GDNF tisztítását az alábbi l.C. példában részletesen ismertetjük. A tisztítási eljárást részletesen az I. táblázatban adjuk meg. A kiindulási anyagként használt kondicionált táptalajt B49 glioblasztómasejtekkel állítjuk elő, oly módon hogy a sejteket két napra szérummentes táptalajba tesszük, azután a kondicionált táptalajt összegyűjtjük, és frissel helyettesítjük. Ezt a ciklust megismételjük, így az egyes B49 sejtsarzsokból háromszor készíthetünk kondicionált táptalajt. A kondicionált táptalajt centrifugáljuk, majd körülbelül tízszeresre töményítjük a további tisztítás előtt.
Ennek a nyers keveréknek, amelyet B49 glioblasztóma szérummentes növesztő táptalajaként definiálunk, a tisztításában az első lépés az, hogy a kondicionált táptalajt Heparin-Sepharose-oszlopra visszük, amelyet 0,15 mmol/1 NaCl-t tartalmazó 50 mmol/1 NaPi pufferrel (pH=8,0) hoztunk egyensúlyba. Egy gradiens pufferoldatot készítünk 1,5 mmol/1 NaCl-t tartalmazó 50 mmol/1 koncentrációjú NaPi-ben (pH=8,0), majd ezt visszük az oszlopra, miután az elúciót stabilizáltuk. Ez ebből a kromatográfiából származó frakcióknak mérjük a GDNF-aktivitását, és azokat a frakciókat, amelyeknek GDNF-aktivitásuk van, a további tisztításhoz egyesítjük.
Az egyesített frakciókat FPLC-kromatográfiának vetjük alá egy Superose-oszlopon, 0,5 mmol/1 NaCl-t tartalmazó 50 mmol/1 koncentrációjú NaPi pufferben (pH=7,4). Ismét meghatározzuk a GDNF-aktivitással rendelkező frakciókat. Ebből az eljárásból egy frakciót azután megsavanyítunk, és egy C-8 fordított fázisú HPLC oszlopra visszük. Azokat a frakciókat, amelyek GDNF-aktivitással rendelkeznek, egyesítjük, a további tisztítás és fehérjeszekvenálás céljára. Amint az az alábbi 1. táblázatban látható, az ebben a pontban kapott GDNF specifikus aktivitása körülbelül 24 000-szer magasabb mint a kondicionált táptalajé. Az ebben a pontban kapott fehéije N-terminális szekvenálásával a 8. ábrán látható N-terminális szekvenciát kapjuk (SEQ ID NO. 1).
A HPLC-ből kapott GDNF további tisztítását a GDNF-aktivitással rendelkező frakciók preparatív SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézisével végezhetjük. A fehérjét tartalmazó frakciókhoz glicerint és SDS-t tartalmazó puffért adunk, majd az oldatot nem redukáló 15%-os SDS-PAGE-vel futtatjuk, az elektroforézist 10 °C-on végezve 40 mA/gél áramerősséggel, 2 óra hosszat. A körülbelül 30-42 kDa molekulasúlynak megfelelő géldarabról biológiai vizsgálattal kiderült, hogy ez tartalmazza a GDNF-aktivitást. Az SDSPAGE-ból izolált anyag második HPLC-kromatográfiájával a GDNF-et egyetlen csúcsban kapjuk, amint az a 6. ábrán látható.
HU 220 795 Bl
1. táblázat
GDNF tisztítása B49 kondicionált táptalajból
Lépés Fehéijék (mg) Biológiai aktivitás (TUxlO-3) Specifikus aktivitás (TU/pg) Tisztítás mértéke Kitermelés (%)
Kond. tápt. 200 94 0,5 (100)
1. Heparin Sepharose 3,1 37 12 24 39
2. FPLC Superose 0,3a 31 103 206 33
3. RP-HPLC 0,0001b 12 12 000 24 000 13
4. Preparatív SDSPAGE n. m. 7 n.m. n.m. 7
5. RP-HPLC 0,00003b 5 17 000 34 000 5
a: az OD280 érték alapján b: a fehéijeszekvenálásból visszanyert fehéije alapján (pikomolokban), és a GDNF-re feltételezett 36 kDa molekulasúly alapján (nem redukáló SDSpoli(akril-amid) gélelektroforézis).
n.m.: nincs meghatározva
A GDNF N-terminális szekvenciáját a HPLC előtti, és SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézis utáni anyagból határoztuk meg. A tisztított GDNF aminosavszekvenciájának meghatározására használt eljárásokat az l.D. példában adjuk meg. Az N-terminális szekvenciákat egy gázfázisú fehérjeszekvenátorral határoztuk meg. A belső szekvenciákat abból az anyagból határoztuk meg, amelyet a HPLC után kaptunk, de még nem vittük SDSpoli(akril-amid) gélelektroforézisre. A belső aminosavszekvenciákat úgy kaptuk, hogy a tisztított GDNF-et tripszinnel inkubáltuk. A tripszinfragmenteket HPLC-vel választottuk el. Egy fragmentről kiderült, hogy a kezeletlen fehéije N-terminális szekvenciájának első 13 aminosavát tartalmazza. Egy második fragmentet CNBr-nal kezeltünk, HPLC-vel tisztítottuk, redukáltuk, majd ismét HPLC-vel kezeltük. A kapott aminosavszekvenciát a 12. ábrán mutatjuk be (SEQ ID NO. 2). A zárójelben levő szekvenciákat bizonytalanul határoztuk meg.
A jelen találmány tárgyát képezi a GDNF-gén klónozása, valamint annak a génnek a klónozása, amelyet GDNF-et klónozónak azonosítottunk. A patkány- és emberi GDNF-gének klónozásának részletes eljárását a
2. példában adjuk meg. Ismételten meg kell jegyeznünk, hogy a szakterületen jártas szakember számára egy ilyen gén klónozására más módszerek is nyilvánvalóak, a leírás felhasználásával. Pontosabban, más fajokból GDNF-gén klónozása egyértelmű az alábbiakban ismertetett eljárás fényében.
Az alábbiakban ismertetett patkány-GDNF-gént B49 sejtekből izolált poliA+ RNS-ből készített cDNSkönyvtárból állítjuk elő, amelyet a tisztított GDNF aminosavszekvenciája alapján készített degenerált oligonukleotidpróbával vizsgálunk át. A cDNS-t standard eljárásokkal állítjuk elő, úgy kezeljük, hogy EcoRI-gyel emészthető linkereket tartalmazzanak, majd a lambdaZap II klónozó vektorba illesztjük. A használt hibridizációs próbát 32P-vel jeleztük, és az alábbi degenerált oligonukleotidot tartalmazta (SEQ ID NO. 7):
5’ CCIGATAAACAAGCIGCIGC 3’
C G G
Számos pozitív kiónt kaptunk, ezek közül egyet (lambda-ZapII76.1) DNS-szekvenálással pozitívan úgy azonosítottunk, mint amely a GDNF egy olyan részét kódolja, amelyet nem használtunk fel a degenerált próba tervezésében.
A lambda-ZapII76.1-ben levő cDNS-klón nukleotidszekvenciájának meghatározását az alábbi, 2.B. példában adjuk meg. A cDNS-klón 5’ vége első 877 bázispárjának nukleotidszekvenciáját meghatároztuk, ezt a 13. ábrán mutatjuk be (SEQ ID NO. 2). A 13. ábrán a kiónban egy 277 aminosavat kódoló nyitott leolvasási keret látható (ORF), amely tartalmazza a tisztított GDNF N-terminálisát, és megegyezik a tisztított GDNF hasításával kapott egy belső peptid szekvenciájával.
A 14. ábrán megadott származtatott aminosavszekvencia (SEQ ID NO. 4) az „érett GDNF” aminosavszekvenciáját mutatja. Az „érett GDNF” szakkifejezés alatt a B49 kondicionált táptalajból kinyert tisztított GDNF szekvenciáját értjük. A tisztított GDNF természetesen dimer vagy egyéb multimer formájában létezhet, és lehet glikozilezve vagy más módon kémiailag módosítva. Az érett GDNF csonkítva lehet a C-terminálisán, különösen a C-terminálistól számítva 5-6. Lys-Arg csoportok proteolítikus emésztése révén. A lambdaZapII76.1 patkányklón nukleinsavszekvenciájának (13. ábra, SEQ ID NO. 2) vizsgálata azt sugallja, hogy a GDNF először egy pre-pro polipeptid formájában transzlálódik, és a szignálszekvencia, valamint a molekula „pro” részének proteolítikus emésztése eredményezi a tisztított GDNF-et, amelynek ugyanaz az érett szekvenciája, mint amit a B49 kondicionált táptalajból kaptunk. Azt állítjuk, hogy a pre-pro GDNF-polipeptid az első ATG-metionint kódoló kodonnál kezdődik a klón 5’ végén (50-es pozíció a 13. ábrán). A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az összes, illetve bármely prepro GDNF-polipeptid, amelyek a 13. ábrán bemutatott
HU 220 795 Bl génről transzlálódhatnak, valamint az összes, illetve bármely pre-pro GDNF-polipeptid, amelyek egy teljesebb kiónról transzlálódnak, amit könnyen előállíthat egy szakterületen jártas szakember, standard laboratóriumi eljárásokat és az alábbiakban ismertetett kiónt alkalmazva.
A 13. ábrán megadott patkány-nukleinsavszekvenciát megnézve (SEQ ID NO. 2) azt láthatjuk, hogy az 518-as és az 538-as pozíció közötti megjósolt aminosavszekvencia Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu, amely megegyezik azzal az aminosavszekvenciával, amelyet a tisztított GDNF egy peptidjéből határoztunk meg az alábbi, 1. példában a belső szekvenciánál leírt módon. A 706-os pozícióban egy TGA stopkodon záqa le az ORF-et. A tisztított GDNF jósolt hossza így 134 aminosav, és ennek a polipeptidnek a jósolt molekulasúlya 14 931. Két potenciális N-kapcsolt glikozilezési hely található a 425-ös és 533-as pozíciókban. Akármelyik, vagy mindkét helyen lejátszódó glikozilezés növeli a molekula molekulasúlyát.
A 281-es pozícióban levő szerint, ami megfelel a tisztított érett GDNF-szekvencia startjának, a Lys-Arg szekvencia előzi meg, ami egy potenciális proteolitikus hasítási hellyel szolgál a GDNF feltételezett prekurzor formájának a processzálására, a molekula olyan alakjának előállításához, amelyet a B49 sejtekből lehet izolálni. Egy potenciális transzlációs iniciációs kodon (ATG) található a szekvenciában az 50-es pozícióban, és ezt szorosan követi egy potenciális szekréciós szignálszekvencia. Az ezt az ATG-t határoló szekvenciák elegendő hasonlósággal rendelkeznek a Kozák konszenzus szekvenciával [Kozák, Nucleic Acids Research, 15, 125-148 (1987)], jelezve ezzel, hogy ez az ATG használható transzlációs iniciációs helyként. Továbbá, ez az ATG az 5’ végen az utolsó ATG a cDNS-klón szekvenciájában. Ezek a tények azt sugallják, hogy ez egy potenciális starthely a GDNF egy prekurzor formája számára.
A patkány-cDNS-klónnak ezek az előzőkben említett tulajdonságai annak a lehetőségét sugallják, hogy a GDNF először egy pre-pro GDNF-polipeptid formájában transzlálódik, és szignálszekvencia, valamint a molekula „pro” részének a proteolitikus processzálása eredményezi a GDNF-nek azt a formáját, amely a B49 sejt kondicionált táptalajából előállítható. A GDNF egyéb formáinak előfordulása is összeegyeztethető a szekvenciaadatokkal. Például két potenciális ATG transzlációs start fordul elő a 681 bázispár méretű ORF-ben: az egyik a 206-os, a másik a 242-es pozícióban. Ezek az ATG-k a tisztított GDNF N-terminális szekvenciája előtt helyezkednek el. Jóllehet az eukariótákban a transzláció általában az mRNS legszélső (5’ vég) ATG-jéről indul [Kozák, Nucleic Acids Research, 15, 125-148 (1987)], vannak példák, amelyekben a transzláció iniciációja egy későbbi ATG-nél fordul elő. Tehát a GDNF alternatív prekurzor formái is előfordulhatnak, az ezeknél az ATG kodonoknál induló transzláció következtében. Ezeknek a polipeptideknek a proteolitikus processzálása a tisztított GDNF-nek ugyanazt a formáját eredményezheti, mint ami a B49 sejt kondicionált táptalajában fordul elő. Emellett a nyitott leolvasási keret a cDNS-klón 5’ végén túlnyúlik. Ennélfogva lehetséges, hogy a transzláció iniciációja a cDNS-klónon nem található, 5’ irányban feljebb levő ATG-nél indul. Ebben az esetben a GDNF egy még nagyobb prekurzor formájában transzlálódna, amely az itt ismertetett aminosavszekvenciát tartalmazza, valamint előtte további szekvenciákat. Egy ilyen hipotetikus forma processzálása is vezethet a GDNF ismertetett tisztított formájának a termelődéséhez. Lehetséges lenne potenciális ATG kodonokat kimutatni 5’ irányban, ha a GDNF-gént tartalmazó mRNS-nek az 5’ végét primer extenzióval szekvenálnánk, reverz transzkriptázzal [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)]. Emellett más cDNS-klónokat is kaphatunk a B49 könyvtárakból, és ezeknek a kiónoknak az 5’ végeit szekvenálhatjuk. Az első ATG előtti 5’ mRNS méretét durván meghatározhatjuk az „SÍ térképezés” módszerével [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)], és/vagy a reverz transzkriptáz reakció primer extenziós termékei méretének meghatározásával. Miközben a tisztított GDNF-et kódolószekvenciákat tartalmazó primer transzlációs termékek számos feltételezett formája képzelhető el, az itt bemutatott, a lambda-ZapII76.1 rekombináns fág által hordozott cDNS-klón részleges DNS-szekvenciái világosan meghatározzák azt a kódolószekvenciát, amely a B49 kondicionáló táptalajból izolált tisztított GDNF-polipeptidet képezik.
Az alábbi 2.C. példában a humán-GDNF-et kódoló gén klónozását írjuk le. Egy humán genomiális könyvtárat vizsgálunk át a 2.B. példában leírt patkány cDNSklónból származó próbával. A humán-GDNF-gén egy genomiális cDNS-klónját azonosítottuk, és az érett humán-GDNF-et kódoló gén szekvenciáját a 19. ábrán adjuk meg (SEQ IDNO. 5).
A 19. ábrán a humán-GDNF-re megadott szekvencia nem tartalmazza a GDNF pre-pro részének teljes kódolószekvenciáját. Azt az eljárást, amellyel a humán pre-pro GDNF első 50 aminosavát kódoló szekvenciát megkapjuk, az alábbi, 2.D. példában ismertetjük. A kapott szekvenciát a 22. ábrán adjuk meg (SEQ ID NO. 8). A pB55K-lambda3AluI plazmid térképét használjuk a 23. ábrán megadott szekvencia meghatározásához.
A találmány tárgyai a GDNF-et kódoló nukleinsavszekvenciák. Viszonylag magas homológiájú, patkány (13. ábra) (SEQ ID NO. 3) és humán (19. ábra) (SEQ ID NO. 5) GDNF-et kódoló szekvenciákat adunk meg az alábbiakban. A találmány oltalmi körébe tartoznak a lényegében hasonló nukleinsavszekvenciák, amelyek ugyanazt az aminosavszekvenciát, illetve azzal erősen homológ aminosavszekvenciát kódolnak. Például ha egy olyan konstrukciót készítünk, amellyel az érett GDNF-et bakteriális expressziós rendszerben, például Escherichia coli-ban akarjuk expresszálni, akkor a 19. ábrán (SEQ ID NO. 5) megadott nukleinsavszekvenciában bizonyos kodonokat helyettesíthetünk olyan kodonokkal, amelyek az Escherichia coli-ban sokkal
HU 220 795 Bl jobban expresszálódnak, a jól ismert és standard eljárások szerint. Az ilyen módosított nukleinsavszekvenciák is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.
A specifikus nukleinsavszekvenciákat a szakterületen jártas szakember módosíthatja. Ennélfogva a jelen találmány azokra a nukleinsavszekvenciákra is vonatkozik, amelyek az érett patkány- és emberi GDNF aminosavszekvenciáit kódolják, amint az a 14. ábrán (SEQ ID NO. 4), valamint a 19. ábrán (SEQ ID NO. 5) látható, illetve a pre-pro patkány-GDNF-et (13. ábra, SEQ ID NO. 3) és a humán pre-pro GDNF-et 19. ábra, SEQ ID NO. 5, valamint 22. ábra, SEQ ID NO. 8) kódolják. A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a nukleinsavszekvenciák, amelyek az összes említett nukleinsavszekvenciával hibridizálnak -, illetve ahol az úgy szükséges, ott a nukleinsavszekvencia komplimentjével - és dopaminerg aktivitással rendelkező polipeptidet kódolnak. A jelen találmány tárgyai olyan nukleinsavszekvenciák is, amelyek olyan polipeptideket kódolnak, amelyek dopaminergaktivitással rendelkeznek, és a GDNF-hez kapcsolódó antitestek felismerik.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a vektorok, amelyek a jelen találmány oltalmi körébe tartozó nukleinsavszekvenciákhoz működés szempontjából hozzákapcsolt expressziós szabályozóelemeket tartalmaznak. A találmány tárgyai továbbá a gazdasejtek - minden variáns - amelyeket a jelen találmány oltalmi körébe tartozó nukleinsavszekvenciákhoz működés szempontjából hozzákapcsolt expressziós szabályozóelemeket tartalmazó vektorral transzformáltunk.
A GDNF COS-sejtekben való expresszióját az alábbiakban az 5. példában írjuk le. A GDNF-et kódoló gént a 13. ábrán mutatjuk be, ezt a pSG5 plazmidvektorba szubklónozzuk, amely vektort klónozott génnek például COS-sejtekben való tranziens expressziójához terveztünk. Azokat a plazmidokat választjuk ki, amelyek a GDNF-gént helyes, illetve helytelen orientációban tartalmazzák, és a DNS-t COS-7-sejtekbe transzfektáljuk. A szaporítást követően a transzformált sejteket kinyeijük. A COS-7 kondicionált táptalajnak megvizsgáljuk a biológiai aktivitását mind a dopaminerg vizsgálattal, mind a szimpatikus ganglion neuron vizsgálattal. Azoknak a sejteknek a kondicionált táptalajában találtunk biológiai aktivitást mindkét módszerrel, amelyek a GDNF-gént a helyes orientációban tartalmazzák, jelezve ezzel, hogy biológiailag aktív GDNF-et sikerült rekombináns DNS-úton előállítanunk.
A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a humán érett GDNF-et rekombináns DNStechnológiával állítjuk elő bakteriális expressziós rendszerben.
A humán-GDNF Escherichia coli-ban való expresszióját az alábbiakban, a 6. példában írjuk le. A humán-GDNF-génnek azt a részét, amely az érett humánGDNF-et kódolja (19. ábra), használjuk egy humánGDNF-konstrukció készítésére. Ezt a konstrukciót egy plazmid vektorba ligáljuk, amit azután Escherichia coli JM107 törzsbe transzformálunk. A transzformált gazdasejtek szaporítása után a GDNF-terméket kinyerjük. A várt molekulasúlyú humán érett GDNF-fehérjét (körülbelül 15 000 Dalton) kapjuk, és az N-terminális aminosavszekvencia-meghatározása megerősítette, hogy a kapott fehétje az érett humán-GDNF.
Az Escherichia coli-ban expresszált humán-GDNF természetes térszerkezetének kialakítását a 6.C. példában írjuk le. A jelen találmány megvalósítási módja szerint az expresszált fehérjét tartalmazó kivonatot részlegesen tisztítjuk, mielőtt a természetes térszerkezetét kialakítjuk, S-Sepharose Fást Flow-gyantán végzett ioncserélő kromatográfiával. A térszerkezet kialakítását a következőképpen végezzük: először ditiotreitolt, majd glutation-dinátrium-sót, végül pedig egy térszerkezetkialakító puffért adunk a GDNF-et tartalmazó kivonathoz. A kialakított térszerkezetű rhGDNF biológiailag lényegében teljesen aktív, és diszulfidhidakkal egymáshoz kapcsolt dimer formában létezik. A térszerkezet kialakítása előtt -, illetve a kialakított térszerkezetű anyag redukálása után - a GDNF monomer formájú, és biológiailag lényegében inaktív.
A GDNF-et más expressziós rendszerekben való expresszióval is előállíthatjuk. Például a 19. ábrán bemutatott, érett humán-GDNF-et kódoló nukleinsavszekvenciával egy, a szakterületen jártas szakember más expressziós rendszerekben is képes GDNF-et előállítani. Azokat a vektorokat, amelyek a jelen találmány oltalmi körébe tartozó nukleinsavszekvenciákhoz működés szempontjából hozzákapcsolt expressziós szabályozóelemeket tartalmazzák, más mikroorganizmusokba is transzformálhatjuk, például Bacillus, Pseudomonas és élesztősejtekbe. Bakulovírus expressziós rendszer is használható.
Amint az előzőkben megjegyeztük, a jelen találmány tárgyát képezik idegsérülésben szenvedő betegekben az idegsérülés kezelésére szolgáló eljárások. Ezek a módszerek abból állnak, hogy a humánfehéijét, a neurogliaeredetű neurotróf faktort (GDNF) az idegsérülésben szenvedő betegnek beadjuk.
Egy betegséget vagy orvosi indikációt akkor kell idegsérülésnek tekinteni, ha az idegsejtek és/vagy axonális folyamataik túlélése vagy funkciója van veszélyben. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az ilyen idegsérülés az alábbi állapotok egyikének következtében áll elő:
1. Fizikai sérülés, amely az axonális folyamatok degenerációját és/vagy a sérülés közelében levő idegsejttestek degenerálódását okozza;
2. Ischhaemia, úgy mint az infarktusban;
3. Neurotoxinokkal való érintkezés, ilyenek lehetnek például az AIDS és kemoterápiás ágensek, a ciszplatin és a didezoxi-citidin (ddC);
4. Krónikus metabolikus betegségek, például a cukorbetegség és a veseműködés zavara; és
5. Neurodegeneratív betegségek, azaz például a Parkinson-kór, Alzheimer-betegség, és az Amyotropic Lateral Sclerosis (ALS), amely a specifikus neuronális populációk degenerálódását okozza.
Azoknak az állapotoknak a nem teljes listája, amelyekben idegsérülés fordul elő, tartalmazza a Parkinson-kórt, az Alzheimer-betegséget, az Amyotropic Lateral Sclerosis-t, az infarktust, a diabéteszes polineuropá11
HU 220 795 Bl tiát, a taxol, ciszplatin vagy vinkrisztin nevű rák kemoterápiás ágensek által okozott toxikus neuropátiát, a ddl vagy ddC AIDS kemoterápiás ágensek által okozott toxikus neuropátiát, valamint az idegrendszer fizikai sérülését, azaz az agy és a gerincvelő fizikai sérülését, valamint a kar és a kéz zúzott vagy vágott sérülését.
A GDNF előállításának módszereit is ismertetjük. Az egyik ismertetett módszer a GDNF különböző forrásokból, például neuroglia-sejtvonal kondicionált táptalajából való izolálására szolgál. Egy második módszer szerint a GDNF-et kódoló gének izolálását, a gén megfelelő vektorokban és sejttípusokban való klónozását és a gén expresszálását tartalmazza GDNF előállítása céljából. Az utóbbi módszer, amely általában a rekombináns DNS-módszerek egy példája, a jelen találmány szerinti előnyös módszer. A rekombináns DNS-módszereket részesítjük előnyben, részben mert ezekkel lehet viszonylag nagyobb mennyiségű fehéqét előállítani nagyobb tisztaságban. A rekombináns humán-GDNF a legelőnyösebb fehérje a gyógyászati készítmények előállításához és az idegsérülés kezeléséhez.
A jelen találmány eszközöket ír le azoknak a géneknek az azonosítására és klónozására, amelyek olyan fehérjéket klónoznak, amelyek a GDNF-fel közös aminosavszekvenciákkal rendelkeznek, valamint az összes ilyen azonosított fehéijét.
Leírtak egy emlősgéncsaládot, amely három neurotróf faktorból áll [Leibrock et al., Natúré, 341, 149-152 (1989); Maisonpierre et al., Science, 247, 1446-1451 (1990)]. Az ebbe a családba tartozó három fehéqe érett formája [idegnövekedési faktor (NGF), agyeredetű neurotróf faktor (BDNF) és a neurotrofin-3 (NT-3) aminosavainak 50%-a közös]. Mindegyik fehérjében pontosan megőrződött a hat ciszteincsoport pozíciója. Jóllehet szerkezetileg hasonlóak, ezek a fehéqék különbözőképpen oszlanak meg a szövetekben [Emfosr et al., Neuron, 5, 511-526 (1990); Maisonpierre et al., Neuron, 5, 501-509 (1990); Phillips et al., Science, 250, 290-294 (1990)], más az in vitro aktivitásuk [Rosenthal et al., Neuron, 4, 767-773 (1990); Whittemore et al., Brain Rés. Rév., 12, 439 (1987)].
A GDNF nem mutat jelentős homológiát egyetlen korábban ismertetett fehérjével sem, de létezhetnek azonosítatlan gének, amelyek lényeges aminosavhasonlósággal rendelkeznek a GDNF-fel, és amelyek képesek in vivő különböző szövetspecifikus eloszlással és/vagy különböző aktivitásspektrummal neurotróf faktorokként működni. Az ilyen fehérjék a neurotróf faktorok GDNF-családjába tartoznak. A patkány- és a humán-GDNF-gének DNS-szekvenciája, amelyet a 13. ábrán (SEQ ID NO. 3) és a 19. ábrán mutatunk be (SEQ ID NO. 5), valamint a 22. ábrán (SEQ ID NO. 8), használható egy ilyen feltételezett „GDNF-géncsalád” új tagjainak az azonosítására.
Egy géncsalád (azaz például az előzőkben említett „NGF-család” vagy a „GDNF-család”) tagjai közötti aminosavszekvencia megőrződésének a következménye a DNS-szintű szekvencia jelentős mértékű megőrződése is. Ennélfogva megfelelő hibridizációs körülmények között, nukleinsav „kereszthibridizáció” léphet fel a család génjei között, azaz a család egyik tagjából származó nukleinsavpróba stabil hibrid duplex molekulát képez a család más tagjának nukleinsavmolekulájával, amely a próbával rokon, de nem azonos szekvenciával rendelkezik [Beltz et al., Methods in Enzymology, 100, 266-285 (1983)]. Érnek következtében kereshetünk a GDNF-fel szekvenciaszinten a GDNF-fel homológ géneket, oly módon hogy egyedi vagy degenerált DNS- (vagy RNS-) próbát készítünk a patkányból, emberből vagy egyéb fajból származó GDNF szekvenciája alapján, és hibridizációs kísérletet végzünk számos különböző cél-DNS-sel (vagy RNS-sel) olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a tökéletlenül párosodó nukleinsavduplexek kialakulását.
Az ilyen hibridizációs körülményeket, amelyeket gyakran „csökkent szigorúságú”-nak neveznek, jól leírták a szakirodalomban [Beltz et al., Methods in Enzymology, 100, 266-285 (1983); [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)], és leggyakrabban a hibridizációs reakció hőmérsékletének csökkentését jelenti, ha vizes oldatban hajtjuk végre a reakciót, és/vagy a formamid koncentrációjának csökkenését jelenti olyan hibridizációs rendszerekben, amelyekben általában 50% formamidot használunk. A hibridizáció szigorúságának csökkentésére egyéb módszereket is ismertettek, és használhatunk [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ezekben a hibridizációs kísérletekben a nukleinsavcélpontok az alábbiak lehetnek:
1. genomiális DNS-könyvtárak, amelyek humán-, patkány- vagy bármely más emlősfaj-eredetüek, illetve bármely más faj DNS-e megfelelő vektorba klónozva, beleértve a bakteriofágokat, plazmidokat, kozmidokat, élesztő mesterséges kromoszómákat, illetve bármely más típusú vektorokat;
2. bármely előzőkben említett szervezetből nyert bármely szövetből, vagy bármely előzőkben említett szervezetből nyert primer sejtek tenyészetéből, vagy bármely, jelenleg létező vagy bármely primer sejttenyészetből előállított stabil sejtvonalból előállított RNS-ből készített cDNSkönyvtárak;
3. az 1. pontban leírt genomiális DNS-ek, amelyeket restrikciós enzimekkel emésztünk, és gélelektroforézissel Southem-blothoz készítünk elő, majd egy szilárd hordozóra viszünk át;
4. a 2. pontban leírt RNS-ek, amelyeket elektroforézisnek vetünk alá, és egy szilárd hordozóra viszünk át Northem-blot-elemzés céljából. Az ilyen RNS lehet összcelluláris RNS, vagy frakcionált poliA+ RNS.
5. Polimeráz láncreakció (PCR) termékei, amely a GDNF-ben előforduló szekvenciát használ oligonukleotidindító molekulaként, és templátként bármely, az 1-4. pontokban ismertetett nukleinsavforrást alkalmaz.
Bármely nukleinsavszekvenciát, amelyről igazolni lehet, hogy hibridizál a GDNF-alapú próbával, kísérleti
HU 220 795 Bl úton meghatározott hibridizációs körülmények között, a szakterületen jártas szakember számára jól ismert számos különböző technikával klónozhatjuk és szekvenálhatjuk, és a szekvenciahomológia mértékét közvetlenül meghatározhatjuk, egy GDNF-család tagjainak azonosítására. Egy ilyen hibridizációs megközelítést alkalmaztak az NT-3 klónozására, egy NGF-alapú hibridizációs próbával [Kaisho et al., FEBS Letters, 266, 187-191 (1990)].
Egy másik módszer a GDNS-család tagjainak azonosítására a polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazása a GDNF-család tagjaiból származó szekvenciák sokszorozására, a sokszorozott szekvenciák klónozásával és elemzésével. A PCR degenerált (vagy nem degenerált) oligonukleotid indítómolekuláit a GDNF-szekvencia alapján szintetizálhatjuk. Mivel a ciszteinek helye konzerválódott, és a ciszteincsoportok közvetlen szomszédságában levő aminosavszekvenciák is konzerválódtak az NGF-családban, az érett GDNF-ben a ciszteinek körül levő régiók a nyilvánvaló jelöltek az indítómolekula szintézisére, de számos más indítómolekula is választható a fehérének mind az érett, mind a pre-pro részéből. PCR reakciókat végezhetünk csökkentett illeszkedési hőmérsékleten, ami lehetővé teszi nemcsak a GDNF-szekvenciák amplifikálását, hanem bármely GDNF-családtag szekvenciaamplifikálását is [Innis et al., PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, Academic Press (1990)]. Az ilyen PCR reakciók termékeit gélelektroforézissel méret szerint el lehet választani, a megfelelő vektorba klónozni lehet, majd a klónozott DNS-t szekvenálni lehet a GDNFcsalád tagjainak azonosítása céljából. Egy másik módszer szerint a kiónokat először egy GDNF-specifikus próbával hibridizáltatjuk, szigorú körülmények között, hogy a GDNF-klónokat azonosítsuk. Azokat a kiónokat, amelyek szigorú körülmények között nem hibridizálnak, azután szekvenáljuk, illetve egy GDNF-próbához hibridizáltatjuk kevéssé szigorú körülmények között, és mindegyik kiónt, amely ilyen körülmények között hibridizál a GDNF-próbával, utána szekvenáljuk.
Egy második megközelítés PCR alkalmazására a GDNF-család tagjainak klónozására az lehet, hogy az előzőkben ismertetett PCR reakció termékeit jelezzük, és ezeket a termékeket használjuk próbaként az előzőkben felsorolt nukleinsavcélpontok átvizsgálására, szigorú és/vagy kevéssé szigorú körülmények között. A hibridizálódó kiónokat vagy nukleinsavszegmenteket azután elemezhetjük az előzőkben leírt módon a GDNFklónok és családtagok azonosítása céljából. Egy ilyen megközelítést használtak az NT-3 klónozására, az NGF és a BDNF szekvenciái alapján [Maisonpierre et al., Neuron, 5, 501-509 (1990); Phillips et al., Science, 250, 290-294 (1990)].
A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint egy GDNF-et tartalmazó terápiás vagy gyógyászati készítményt hatásos mennyiségben adunk be idegsérülésben szenvedő betegnek. A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a GDNF-et terápiásán alkalmazzuk Parkinson-kórban szenvedő betegek kezelésére. A szakterületen jártas szakember számára ismerős a számos különböző vizsgálati módszer, amelyekkel ki lehet mutatni, hogy melyik neuron válaszol a GDNF-re, és más GDNF-re reagáló neuron meghatározása szükségtelen kísérletek nélkül is elvégezhető. A szakterületen jártas szakember könnyen meg tudja határozni, hogy a GDNF hol expresszálódik a testben, és azokban a régiókban a GDNF-fehéije milyen szintet ér el. A szakterületen jártas szakember azt is meg tudja határozni, hogy az idegrendszerben a GDNF hova kötődik. Ez az információ lehetővé teszi a szakterületen jártas szakember számára, hogy meghatározza azokat a neurontípusokat, amelyek valószínűleg reagálnak a GDNF-re, és ennek következtében javasolni tudja ennek a fehéijének a megfelelő klinikai alkalmazásait. Ezután megfelelő sejttenyészet és állati kísérleteket lehet végezni annak meghatározására, hogy mennyi a valószínűsége annak, hogy a GDNF hasznos lehet ilyen területek kezelésében.
A B49 kondicionált táptalajból izolált tisztított GDNF-ről az is kiderült, hogy elősegíti a paraszimpatikus és szimpatikus idegsejtek túlélését tenyészetekben. Ezeket az eredményeket a 4. példában ismertetjük.
Mivel az lehetséges, hogy a GDNF neurotróf funkciója egy vagy több diszkrét, elválasztható szegmenthez kötődik, ezért az is elképzelhető, hogy a jelen találmány szerinti módszer úgy is alkalmazható, hogy egy gyógyászati készítményt, amelynek aktív alkotóeleme az a GDNF-rész (illetve azok a GDNF-részek), amely(ek) szabályozza(zák) a GDNF neurotróf funkcióját.
A jelen találmány szerinti terápiás vagy gyógyászati készítményeket előnyösen parenterálisan injekcióval, illetve közvetlenül a gerincfolyadékba (CSF) adhatjuk folyamatos infúzióval egy beépített szivattyúról. Ezenkívül más hatékony adagolási formák is léteznek, például a parenterális lassan felszabaduló formulák, belélegzett por, orálisan aktív készítmények, illetve kúpok is elképzelhetők. Emellett egy vagy több olyan ágenssel való együttadagolás is elképzelhető, amely képes a GDNF átjutását elősegíteni az agy-vér gáton. Egy előnyös hordozó lehet a fiziológiás sóoldat, de elképzelhető, hogy más gyógyászatilag elfogadható hordozók is használhatók, például a mesterséges CSF. Egy előnyös megvalósítási mód szerint azt is el lehet képzelni, hogy a hordozó és a GDNF fiziológiailag elfogadható, lassan felszabaduló készítmény formájában van. Egy ilyen hordozóban az elsődleges oldószer lehet vizes vagy nemvizes természetű. Emellett a hordozó tartalmazhat más gyógyászatilag elfogadható töltőanyagot is a pH, ozmózisnyomás, viszkozitás, tisztaság, szín, sterilitás, oldódás sebessége, illetve a készítmény szaga módosítása vagy megtartása céljából. Hasonlóképpen, a hordozó tartalmazhat más gyógyászatilag elfogadható töltőanyagokat is, amelyek módosítják vagy fenntartják a GDNF stabilitását, oldódási sebességét, felszabadulását, illetve az agy-vér gáton való átjutást vagy abszorpciót. Az ilyen töltőanyagok olyan vegyületek, amelyeket általában parenterális készítmények dozírozásánál alkalmaznak, akár egységdózis akár többszörös dózis formájában, illetve közvetlenül a CSF-be való infúzióval, egy beépített szivattyú folyamatos vagy periodikus működtetésével.
HU 220 795 Bl
Ha egyszer a terápiás készítményt formuláztuk, akkor steril ampullákban tárolhatjuk oldat, szuszpenzió, gél, emulzió, szilárd vagy dehidrált vagy liofilezett por formájában. Az ilyen készítményeket vagy közvetlen használatra alkalmas formában tárolhatjuk, vagy úgy, hogy közvetlenül a felhasználás előtt még el kell készíteni. Az ilyen készítmények előnyös tárolási módja legalább 4 °C, előnyösen -70 °C.
A GDNF-et tartalmazó készítmények parenterális beadása előnyösen szubkután, intramuszkulárisan, intrathecal úton vagy intracerebrális úton történhet. A GDNF kívánatos dózisának eléréséhez ismételt napi vagy kevésbé gyakori szubkután vagy intramuszkuláris injekciók adhatók be, illetve a GDNF-et folyamatosan vagy periodikusan adhatjuk be infúzióval, egy beépített szivattyúval. A dózis frekvenciája függ a készítményben levő GDNF farmakokinetikai paramétereitől és a használt adagolási módtól.
Ahhoz, hogy a GDNF szükséges dózisát elérjük azoknál a dopaminerg és egyéb roncsolt idegsejteknél, amelyeknek a sejtteste az agyban, illetve a gerincvelőben van, arra van szükség, hogy a GDNF-et az agy vagy a gerincvelő szubarachnoid terébe adjuk be, vagy pedig intracerebroventikulárisan. A beadás lehet folyamatos vagy periodikus, és egy konstans, vagy programozható működésű beépített szivattyúval, illetve periodikus injekciókkal hajthatjuk végre. A beadás történhet olyan ágensekkel együtt, amelyek lehetővé teszik, hogy a GDNF átjusson az agy-vér gáton.
Az is elképzelhető, hogy bizonyos GDNF-et tartalmazó készítményeket orálisan adjunk be. Az ily módon beadott GDNF előnyösen kapszulázva van. A kapszulázott GDNF-et azokkal a hordozókkal, illetve azok nélkül formulázhatjuk, amelyeket szokás szerint használnak a szilárd dózisformák elkészítésénél. A kapszulát előnyösen úgy tervezik, hogy a készítmény aktív részét a gyomor-bél rendszer azon részén engedje ki, ahol a biológiai hozzáférhetőség maximális, és a preszisztémás lebomlás minimális. Más töltőanyagokat is használhatunk, hogy megkönnyítsük a GDNF abszorpcióját. Hígítószerek, illatosítószerek, alacsony olvadáspontú viaszok, növényi olajak, csúsztatóanyagok, szuszpendáló ágensek, tabletta dezintegrációt elősegítő anyagok és kötőanyagok is használhatók.
A beadás módjától függetlenül, a specifikus dózist úgy számítjuk ki, hogy figyelembe vesszük a beteg hozzávetőleges testsúlyát vagy testfelszínét. A számítások finomítását, amelyek ahhoz szükségesek, hogy meghatározzuk a hozzávetőleges dózist az egyes előzőkben említett készítményeknél, a szakterületen jártas szakember rutinszerűen elvégezheti, és a szokásos tevékenységi körébe tartozik, anélkül hogy szükségtelen kísérleteket kellene végeznie, különösen az itt megadott dózisinformációk és vizsgálatok fényében. Ezeket a dózisokat a megfelelő dózishatás adatoknál alkalmazott dózisok meghatározására kialakított vizsgálatokkal igazolhatjuk.
A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint a GDNF-et terápiásán alkalmazhatjuk oly módon hogy a betegekbe olyan sejteket építünk be, amelyek képesek a GDNF egy biológiailag aktív formájának a szintézisére és szekretálására. Az ilyen GDNF-termelő sejtek lehetnek olyan sejtek, amelyek a GDNF természetes termelői (a B49 sejtekkel analógok), illetve lehetnek olyan sejtek, amelyeknek azt a képességét, hogy GDNF-et termel, azáltal éljük el, hogy a GDNF-génnel transzformáljuk, olyan formában, amely elősegíti a GDNF expresszióját és szekrécióját. Abból a célból, hogy egy olyan betegben, akinek egy idegen fajból eredő GDNFet adunk be, minimalizáljuk a potenciális immunológiai reakciót, az az előnyös, ha a természetes GDNF-termelő sejtek humáneredetűek és humán-GDNF-et termelnek. Hasonlóképpen, ha humán-GDNF-et expresszáló sejteket transzformálunk, akkor olyan expressziós konstrukciót használunk, amely humán-GDNF-et kódol, és olyan módszereket használunk, amelyek analógok az alábbi,
5. és 6. példákban alkalmazott módszerekkel.
Azokat a sejteket, amelyek természetesen képesek humán-GDNF-et szekretálni, az alábbi eszközök alkalmazásával azonosíthatjuk:
1. olyan oligonukleotidokat használunk, amelyek a humán-GDNF hírvivő RNS-ének egy részét képviselik, illetve komplementerek a hírvivő RNS egy részével, olyan sejtvonalak felfedezésére, amelyek a humán-GDNF mRNS-t termelik, Northem-blot-elemzés, RNáz-protekció, in situ hibridizáció, polimeráz láncreakció, vagy egyéb, rokon módszerek alkalmazásával;
2. a humán-GDNF-et felismerő poliklonális vagy monoklonális antitesteket használhatunk olyan sejtvonalak felfedezésére, amelyek kivonatai vagy kondicionált táptalaja GDNF-fehérjét tartalmaz, Westem-blot-elemzés, ELISA-vizsgálat, radioimmunológiai vizsgálat, vagy egyéb rokon módszerek alkalmazásával.
Egy előnyös stratégia szerint egy humáneredetű sejtsorozatból származó kondicionált táptalajt humánGDNF elleni antitestekkel vizsgálunk át a fenti 2) módszer szerint, hogy olyan sejteket találjunk, amelyek GDNF-et szekretálnak a táptalajba. Az így termelt GDNF-et a tisztítás és aminosavszekvencia-meghatározás azonosítjuk, ahogy azt a B49 sejtek által termelt és a táptalajba szekretált GDNF-fel tettük. Az alábbi, 7. példában a humán rekombináns GDNF elleni antitestek termelését és izolálását írjuk le.
A GDNF-et természetesen, illetve transzformáció következtében szekretáló sejteket használhatunk betegek kezelésére. Humán- vagy nem humán sejteket építhetünk be betegekbe félig áteresztő polimerburokban, hogy ezzel lehetővé tegyük a GDNF kiáramlását, de megakadályozzuk, hogy a sejteket a beteg immunrendszere elpusztítsa. Egy másik módszer szerint a beteg saját sejtjeit, amelyeket expresszió vivő transzformálunk, hogy GDNF-et termeljenek, közvetlenül beépíthetjük a betegbe, az említett kapszulázás nélkül.
Az élő sejtek membránkapszulázása ismerős a szakterületen jártas szakember számára, és a kapszulázott sejtek készítését, valamint betegekbe való beépítését fölösleges kísérletezés nélkül elvégezheti [4,892,538; 5,011,472; 5,106,627 számú amerikai egyesült államok14
HU 220 795 Bl beli szabadalmi leírás, amelyekre a továbbiakban referenciaként hivatkozunk]. Élő sejtek kapszulázására szolgáló módszert Aebischer és munkatársai írnak le a WO 91/10425 számú PCT-bejelentésben, amelyre a továbbiakban referenciaként hivatkozunk. Lásd még Aebischer et al., WO 91/10470; Winn et al., Exper. Neurol., 113, 322-329 (1991); Aebischer et al., Exper. Neurol., 111, 269-275 (1991); Tresco et al., ASAIO, 38, 17-23 (1992), amelyekre a továbbiakban referenciaként hivatkozunk.
Pontosabban, a GDNF-et szekretáló sejteket Parkinson-kórban szenvedő betegekbe lehet beépíteni a striatumba, hogy ezzel szolgáltassunk GDNF-et a nigrális dopaminergneuronok számára, valamint a nigrába, hogy ezzel biztosítsunk GDNF-et a dopaminerg sejttesteknek. Az ilyen lokálisan alkalmazott GDNF elősegítheti az újranövekedést és az újrabeidegződést a striatum dopaminerg terminálok által, és megakadályozhatja, illetve lelassíthatja a dopaminerg idegsejtek további degenerációját.
A jelen találmány tárgya tehát eljárás idegsérülés megelőzésére vagy kezelésére, oly módon hogy az ilyen kezelést igénylő betegbe sejteket építünk be; az ilyen sejteket vagy azon az alapon szelektáljuk, hogy természetesen képesek GDNF-et termelni, illetve génsebészeti úton változtatjuk meg őket úgy, hogy GDNF-et szekretáljanak. Előnyös, hogy ha a beteg az emberi fajhoz tartozik, akkor a szekretált GDNF érett humánGDNF legyen.
Meg kell jegyeznünk, hogy az alábbiakban ismertetett GDNF-formulációk használhatók állatgyógyászati célokra is és humángyógyászati célokra is, és a „beteg” szakkifejezés nem lehet korlátozó érvényű. Az állatgyógyászati alkalmazások esetében a dózistartományok ugyanazok lehetnek, mint amit az előzőkben specifikáltunk.
Az nyilvánvaló, hogy a jelen találmány kitanításának alkalmazása egy specifikus problémára vagy környezetben a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, az ismertetett kitanítás fényében. A jelen találmány jellemző alkalmazását bemutató példákat ismertetünk az alábbiakban.
Példák
1. példa
A GDNF tisztítása és szekvenálása
Ebben a példában a GDNF biológiai vizsgálatának és tisztításának módszereit ismertetjük. Emellett ismertetjük azokat a módszereket is, amelyekkel a B49 sejtvonal kondicionált táptalaját lehet előállítani, ami a tisztítás kiindulási anyaga. A tisztított GDNF aminosavszekvenciájának, illetve a tisztított fehéijéből kapott részleges aminosavszekvenciák meghatározásának módszerét is ismertetjük.
A. Anyagok: Az időzített terhes patkányok a Zivie Miller Lab-ból származnak (Allison Park, PA, USA). Hacsak nem specifikáljuk, minden reagenst a Sigma Chemical Co.-tól vásárolunk (St. Louis, MO, USA).
B. A dopaminerg neurotröf aktivitás biológiai vizsgálata
Tenyésztési körülmények: Disszociált középagyi sejttenyészeteket készítünk az előzőkben leírt módon [Friedman and Mytilenou, Neurosci. Lett., 79, 75-72 (1987)], minimális módosításokkal. Röviden, Sprague-Dawley-patkányembriók agyából a megtermékenyítés utáni 16. napon csőrszerű középagyi kérget bontunk szét a mikroszkóp alatt steril körülmények között, majd Ca2+- és Mg2+-mentes Dulbecco-féle foszfáttal puffereit sóoldatban (Gibco, Gaithersburg, MD) összegyűjtjük, mechanikailag és enyhe triturálással disszociáljuk. A sejteket bikánként 100 μΐ térfogatban 16 mm átmérőjű szövettenyésztőlukakban (Falcon, Lincoln Park, NJ, 24 lukas lemez) osztjuk el, amelyek 400 μΐ táptalajt tartalmaznak, így kapunk 2,5-3,5xlO5 sejt per luk sejtsűrűséget. A tenyésztőlukakat korábban 0,1 mg/ml koncentrációjú poli-L-omitinnel hoztuk érintkezésbe (10 mmol/1 nátrium-borát pH=8,4 oldatban) 3 óra hosszat 37 °C-on, majd háromszor mostuk milli-Q vízzel és egyszer Earle-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (Gibco). A tápláló közeg (10/10) minimális esszenciális táptalajt (MÉM, Gibco) tartalmaz, amelyet 33 mmol/1 glükózzal, 24,5 mmol/1 nátrium-bikarbonáttal, 2 mmol/1 glutaminnal, 15 mmol/1 HEPES-sel, 5 E/ml penicillin G-vel, 5 pg/ml sztreptomicinnel, 10% hővel maktivált borjúmagzatszérummal (Gibco) és 10% hővel inaktivált lószérummal egészítettünk ki. A tenyészeteket 37 °C-on tartjuk vízzel telített atmoszférában, amely 6,5% szén-dioxidot tartalmaz. Három óra elteltével, amikor a legtöbb sejt hozzátapadt a luk fenekéhez, a táptalajt 500 μΐ friss táptalajjal helyettesítjük. Ebben az időpontban a GDNF-aktivitásra vizsgálandó minta sorozathígítását két párhuzamosban hozzáadjuk az egyes lukakhoz, majd a lemezeket 37 °C-on inkubáljuk egy Inkubátorban. Egy hét elteltével, a tenyészeteket 24 óra hosszat fluor-dezoxl-uridinnel (13 pg/ml) és uridinnel (33 pg/ml) kezeljük, hogy megakadályozzuk a fölösleges neurogliális szaporodást, majd ezt követően az előzőkben említett táptalajjal tápláljuk, borjúmagzatszérum nélkül.
Egy másik módszer szerint a kémiailag definiált szérummentes táptalajt használunk, amelyben a szérumot fehéijék keverékével helyettesítjük; hormonok és sók. A definiált táptalaj MÉM és F12 tápkeverék elegye (mindegyik Gibco, 1:1 térfogatarányban), és tartalmaz 33 mmol/1 glükózt, 2 mmol/1 glutamint, 24,5 mmol/1 NaHCOj-at, 15 mmol/1 HEPES-t, 100 pg/ml transzferrint, 25 pg/ml inzulint, 60 pmol/l putreszcint, 20 nmol/1 progeszteront, 30 nmol/1 nátrium-szelenitet, 5 E/ml penicillint és 5 pg/ml sztreptomicint. A DM ozmotikus nyomását 325-re állítjuk milli-Q víz hozzáadásával (110-125 ml víz/1). A DM alkalmazásával néhány nem neuronális sejt volt evidens, morfológia alapján, illetve a neurogliális fibrilláris savas fehérjére (GFAP) való festés alapján, ami egy asztrocitaspecifikus citoskeletális fehéije. A GDNF aktív a dopaminfelvétel serkentésében mind a szérumot tartalmazó, mind a definiált táptalajban. Mindegyik, az alábbi példákban említett vizsgálatot szérummentes táptalajban végezzük.
HU 220 795 Β1
A dopaminergneuronok funkcionális állapotát ezekben a tenyészetekben vizsgálhatjuk, oly módon, hogy méijük a dopaminergneuronokban a dopaminfelvételt specifikus „tisztogató” transzportereken keresztül, és meghatározzuk azoknak a neuronoknak a számát, amelyek az immunhisztokémiában használt tirozin-hidroxilázra dopamin-szintetizáló enzimre specifikusak. A noradrenergneuronok tenyészeteivel való jelentős fertőzés lehetőségét, amely neuronok szintén transzportálják a dopamint, és szintén tartalmaznak tirozin-hidroxilázt, kizártuk az óvatos szétszedéssel, és annak igazolásával, hogy a dopamintranszporterek farmakológiai profilja jellegzetesen inkább a dopaminerg-, mint a noradrenergneuronokra jellemző. Az ezekben a tenyészetekben lejátszódó dopaminfelvételt a GBR12909 gátolja, amely a monoamin transzporter inhibitora a dopaminergneuronokban, EDjQ-értéke 20 nmol/1. Ezzel szemben legalább 300-szor több desipramin, amely a monoamintranszporter vagy noradrenergneuronok inhibitora, szükséges ahhoz hogy tenyészeteikben a dopaminfelvételt gátolja. Ezek azok az értékek, amelyeket a dopaminergneuronoknál a monoamintranszporterre leírtak.
Mintaelőkészítés: Mielőtt megvizsgáljuk a dopaminerg neurotróf aktivitást a középagyi sejttenyészetekben, mindegyik, az 1-3. tisztítási (lásd az alábbi C. pontot) lépésben kapott mintát az alábbiak szerint sómentesítjük. Száz μΐ 10/10 táptalajt (mint hordozót) adunk egy Centricon-10-hez (Amicon), majd 10 percig hagyjuk ülepedni. A vizsgálandó minta aliquot részeit hozzáadjuk a Centriconhoz, majd 1 ml Dulbecco-féle magas glükóztartalmú módosított Eagle-féle táptalajt adunk hozzá, bikarbónát nélkül, de 10 mmol/1 HEPES (pH=7,2) tartalommal (A oldat), és 7 percig 5000 χ g-vel centrifugáljuk. A retentátot (körülbelül 0,1 ml) 1,1 ml-re töltjük vissza friss A oldattal, és kétszer újrakoncentráljuk. A mintát egy 0,11 6 m-es Ultrafree-MC steril Durapore egységen szüljük át (Millipore, Bedford, MA), mielőtt a tenyészetet tartalmazó lukhoz adjuk.
3H-dopaminfelvétel: A triciált dopamin- (3H-DA) felvételt a korábban leírt módon tenyészetekben a 6. vagy
7. napon végezzük [Friedman and Mytilineou, Neurosc. Lett. 79, 65-72 (1987)], minimális módosításokkal, és mindegyik oldatot 37 °C-on tartjuk. Röviden, a szaporító táptalajt eltávolítjuk, kétszer öblítjük 0,25 ml felvevőpufferrel, amelynek összetétele Krebs-Ringer-féle foszfátpuffer (pH=7,4), amely 5,6 mmol/1 glükózt, 1,3 mmol/1 EDTA-t, 0,1 mmol/1 aszkorbinsavat és 0,5 mmol/1 pargylint tartalmaz (ez egy monoamin-oxidáz inhibitor). A tenyészeteket 0,25 ml 50 nmol/1 3H-DA-val (New England Nuclear, Boston, MA, spec. akt. 36-37 Ci/mmol) 37 °C-on inkubáljuk 15 percig. A 3HDA-felvételt azzal állítjuk le, hogy eltávolítjuk az inkubációs elegyet, majd a sejteket kétszer mossuk 0,5 ml felvevőpufferrel. Abból a célból, hogy a 3H-DA-t felszabadítsuk a sejtekből, a tenyészeteket 0,5 ml 95%-os etanollal inkubáljuk 30 percig 37 °C-on, majd 10 ml EcoLite-hoz adjuk (ICN, Irvine, CA), és szcintillációs számlálóval megszámláljuk. A vakértékeket úgy kapjuk, hogy a felvevőpufferhez 0,5 mmol/1 GBR-12909-et adunk (RBI), ami egy specifikus inhibitora a dopatninneuronok nagyaffinitású pumpájának [Heikkila et al., Eur. J. Pharmacol., 103, 241-48 (1984)], és általában kevesebb mint 5%-a a kezeletlen kontrolltenyészetek 3H-DA-felvételének. A GDNF-aktivitás trofikus egységeinek (TU) számát úgy határozzuk meg, mint annak a hígításnak a reciprok értéke, amely a tenyészet 3H-DA-felvétele maximális serkentésének 50%-át adja. A specifikus aktivitást úgy határozzuk meg, hogy a TU-k számát osztjuk a mintában található fehéije mennyiségével.
C. A GDNF tisztítása
Kiindulási anyag: A B49 glioblasztómasejteket D. Schubert bocsátotta a rendelkezésünkre (Salk Institute, La Jolla, CA) [Schubert et al., Natúré, 249, 224-27 (1974)]. A sejteket addig szaporítjuk, ameddig egybefüggő réteget képeznek DMEM-táptalajban, amely 10% borjúmagzatszérumot, 4 mmol/1 glutamint, 50 E/ml penicillin-G-t és 50 pg/ml sztreptomicint tartalmaz tenyésztő lombikokban (225 cm2, Costar, Cambridge, MA). A szérummentes növekedéskondicionált táptalajt (CM) úgy állítjuk elő, hogy a tenyészetet egyszer mossuk 10 ml szérummentes táptalajjal, majd a sejteket lombikonként 50 ml szérummentes táptalajba tesszük 2 napra. A CM-et összegyűjtjük, majd a sejteknek minden második napon friss szérummentes táptalajt adunk a 6. napig. Az egyes sejtsarzsokról háromszor gyűjtött kombinált CM-et centrifugáljuk (5000xg, 20 perc, 4 °C), hogy eltávolítsuk a sejteket és a törmeléket. A felülúszót körülbelül tízszeresre töményítjük Amicon koncentrátorral (YM10 membrán), majd centrifugáljuk (40,000 χ g, 20 perc, 4 °C). A felülúszót 0,2 μ-os Micro Culture Capsule-n (Gelmen Sciences) szűrjük át. Körülbelül 1 hónapig tárolható 4 °C-on.
1. lépés: Heparin Sepharose-kromatográfia
A fenti készítményt (200 pg fehérje) egy Heparin Sepharose CL-6B oszlopra visszük (1x25 cm) (Pharmacia, Piscataway, NJ), amelyet 50 mmol/1 NaPi pufferrel (pH=8,0,0,15 mol/1 NaCl-t tartalmaz) (A puffer) hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot azután ugyanezzel a pufferrel mossuk, addig, amíg az elfolyó 280 nmen mért optikai sűrűsége (OD280) visszatér az alapvonalra, majd egy 100 ml-es, lineáris gradienssel eluáljuk, amely az A puffertől 50 mmol/1 NaPi (pH=8,0), 1,5 mol/1 NaCl-t tartalmazó pufféiig (B puffer) változik. Két ml-es frakciókat szedünk. A frakcióknak vizsgáljuk a vezetőképességét és a GDNF-aktivitását. Az eluált fehéqék profilját OD280-ban ábrázoljuk. Erre rajzoljuk rá a vezetőképesség és az egyes frakciókban mért GDNF-aktivitás ábráját. A jelölt frakciókat, amelyek csúcs GDNF-aktivitással rendelkeznek (körülbelül 0,6-0,8 mol/1 NaCl) a további elemzéshez egyesítjük.
2. lépés: FPLC Superose-kromatográfia
A fenti egyesített frakciókat 0,4 ml-re töményítjük be Amicon koncentrátorral (Amicon, Beverly, MA, YM10 membrán), majd FPLC-vel kromatografáljuk (Superose 12 oszlop, Pharmacia) 50 mmol/1 NaPi puf16
HU 220 795 Bl ferben (pH=7,4), amely 0,5 mol/1 NaCl-t tartalmaz, az áramlási sebesség 0,5 ml/perc. Az eluálás 14. percében 0,5 ml-es frakciókat szedünk szilikonozott mikrofugacsövekbe, amelyek 5 μΐ 0,4% Tween 20-at tartalmaznak. Az egyes frakciók aliquot részeinek mérjük a GDNF-aktivitását. A 2. ábrán látható egy ilyen kromatográfia az OD280-nal követett fehéqeprofillal, és az erre rárajzolt GDNF-aktivitási mintázattal. Az oszlopra felvitt GDNF-aktivitás 85%-át kinyertük a 12-15-ös frakciókban.
3. lépés: RP-HPLC
Az előző lépés 14-es frakcióját 10 μΐ 25%-os trifluor-ecetsawal (TFA) savanyítjuk. A savanyított anyag felét egy vékony lukú Aquapore Replikáció-300 C-8 fordított fázisú HPLC oszlopra visszük (Brownlee oszlop, Applied Biosystems, San Jose, CA), 2,lc220 mm, majd egy víz/0,1% TFA: 80% acetonitril/0,085% TFA gradienssel eluáljuk. A fehéqetartalmú frakciókat manuálisan szedjük szilikonozott mikrofiigacsövekbe, a 214 nmen mért UV-abszorpció alapján. Az egyes frakciókból származó aliquot részeknek vizsgáljuk a GDNF-aktivitását. A 3. ábrán látunk egy ilyen kromatográfiát, az OD214-en mért fehéqeprofillal, és az alsó részen az aktivitási mintázattal. Az 5. és 6. frakció tartalmazza az RPHPLC-vel kinyert aktivitás körülbelül 90%-át, míg a 7. frakcióban található a maradék 10%-os aktivitás. A 4. ábrán láthatunk egy ezüsttel festett SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézis gélt, a 3. ábrán bemutatott GDNFaktivitás csúcs körül levő frakciókból futtatva.
4. lépés: Preparatív SDS-PAGE
A csúcs GDNF-aktivitást tartalmazó 5. és 6. frakciókat egyesítjük és 20 μΐ-re töményítjük 10 μΐ 0,4% Tween 20 jelenlétében egy speed-vac-on. A mintához 1 μΐ 1 mol/1 TRIS bázist és 5 μΐ 0,2 mol/1 TRIS-HCl-t (pH-6,8) adunk, amely 40% glicerint és 5% SDS-t tartalmaz, majd nemredukáló 15%-os SDS-poli(akrilamid) gélelektroforézissel futtatjuk [Laemmli, Natúré, 277, 680-684 (1970)] (0,075x14x11,5 cm, 20 lukas fésű, 0,074 x 0,4 x 2,8 cm/mintaluk). Az elektroforézist 10 °C-on végezzük 40 mA/gél paraméterrel 2 óra hosszat. A gélcsíkot 1,14 mm-es szeletekre vágjuk. Mindegyik szeletet 2 kisebb részre vágjuk, majd eluáljuk, háromszor cserélve rajta a 25 μΐ NaPi (pH=6,7), 0,01% Tween 20 összetételű puffért, egy húszórás időtartam alatt, 4 °C-on, folyamatos rázatás közben. Az eluált anyag három aliquot részét egyesítjük, és vizsgáljuk a GDNF-aktivitását (5. ábra), majd a legnagyobb aktivitást mutató eluátumot (a 16-23-as géldarabokból, ami az 5. ábrán 30-42 kDa-nak felel meg) egyesítjük. Egy üres géldarabot (amire az elektroforézis előtt csak az SDS-PAGE mintapuffer volt felvive) a kontrolihoz hasonló módon dolgozunk fel.
5. lépés: RP-HPLC
Az egyesített géleluátumokat körülbelül 150 μΐ-re töményítjük egy speed-vac berendezésben, 20 μΐ 25%os TFA-val savanyítjuk, majd a 3. lépésben leírt módon RP-HPLC-n futtatjuk. A fehérjetartalmú frakciókat manuálisan szedjük szilikonozott mikrofiigacsövekbe, az OD214 alapján, és vizsgáljuk a GDNF-aktivitásukat. A 6. ábrán láthatjuk egy ilyen kromatográfia eredményeit. Kontrollként hasonló méretű üres géldarabok eluátumait is futtatjuk az RP-HPLC-n. A kontrollprofil fölötti (6. ábra, A panel a B panellel szemben) egyetlen jelentős OD214 csúcs a hármas csúcs, amely a HPLCoszlopra felvitt GDNF-aktivitás 70%-át tartalmazza. A 7. ábrán a hármas csúcs ezüsttel festett SDS-PAGE gélen való futtatását láthatjuk. Az egyetlen látható festődés egy nagyon széles csík 30-42 kDa között, ami egybeesik a preparatív SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézisnél megfigyelt GDNF-aktivitási profillal (5. ábra). Egy tipikus tisztítás összefoglalását az I. táblázatban adjuk meg.
D. A tisztított GDNF aminosavszekvenciája
N-terminális szekvencia:
A 6. ábra hármas csúcsát gázfázisú fehérjeszekvenátorral szekvenáljuk (Applied Biosystems). A kapott szekvenciát a 8. ábrán adjuk meg. A tisztítás 3. lépése utáni csúcs GDNF-aktivitással rendelkező frakciók (5. és 6. frakció a 3. ábrán) szekvenálása szintén egyetlen szekvenciát adott, azonosat a 8. ábrán látottal, amit a tisztított mintával kaptunk. Az egyetlen, ezekben a frakciókban közös anyag a 30-42 kDa között futó kenődés. Ennek következtében, a 30-42 kDa-os régión kívüli szennyező csíkok, amelyek a 4. ábra 5. és 6. frakciója ezüsttel festett géljén láthatók, vagy
a) túl kis mennyiségben fordulnak elő (<1 pikomol) ahhoz, hogy a jelenlegi technológiával szekvenálni lehessen;
b) szekvenciájuk a 30-42 kDa-os kenődés szekvenciájával rokon; vagy
c) blokkolt N-terminálissal rendelkeznek.
Belső szekvencia:
Az előzőkben ismertetett tisztítás 3. lépése utáni GDNF-preparátumot használjuk kiindulási anyagként a belső szekvencia meghatározásához. A 3. ábrán látható 5. és 6. frakciót egyesítjük egy szilikonozott mikrofiigacsóben, amely 9 μΐ 0,4%-os Tween-t tartalmaz, és egy speed-vac-on 40 μΐ-re töményítjük. A mintához 160 μΐ 1%-os NH4HCO3-at adunk, amely 2,5 mol/1 guanidinhidrokloridot és 1 pg tripszint tartalmaz, majd éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. Az elegyet 20 μΐ 25%-os TFAval savanyítjuk, speed-vac-on körülbelül 150 μΐ-re töményítjük, majd a peptideket egy kis lukú Aquapore RP-300-as C8 fordított fázisú HPLC-oszlopon (Brownlee oszlop, 2,1x220 mm) választjuk el, az eluálást víz/0,1% TFA:80% acetonitril/0,085% TFA gradienssel végezzük. A peptidet tartalmazó frakciókat manuálisan szilikonozott mikrofugacsövekbe gyűjtjük, a 214 nm-en mért abszorpció alapján. A 9. ábrán láthatók egy ilyen kromatográfia eredményei. A 9. ábra 10-es csúcsának szekvenciáját azonosnak határoztuk meg a
8. ábrán bemutatott kezeletlen fehéqe N-terminális szekvenciája első 13 aminosavával (SEQ ID NO. 1). A 9. ábrán látható 37-es csúcsot tovább kezeljük CNBr-rel. A mintát 20 μΐ-re töményítjük speed-vac-on. A mintá17
HU 220 795 Bl hoz 7 μΐ 90%-os hangyasavat és 5 mg CNBr-t adunk, majd a mintát szobahőmérsékleten sötétben éjszakán át inkubáljuk. Ezt az elegyet speed-vac-on 20 μΐ-re töményítjük, majd 10 μΐ 0,1 %-os TFA-val hígítjuk, és az előzőkben leírt módon fordított fázisú HPLC-vel választjuk el. A 10. ábrán láthatók egy ilyen kromatográfia eredményei. A 10. ábrán látható 1. csúcsot speed-vacon 20 μΐ-re töményítjük 5 μΐ 0,4%-os Tween 20 jelenlétében. A mintához 10 μΐ 1%-os NH4HCO3-at és 5 μΐ ditiotreitolt adunk, majd a mintát egy óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az elegyet 10 μΐ 25%-os TFA-val savanyítjuk, 100 μΐ-re töményítjük speed-vacon, és fordított fázisú HPLC-vel választjuk el, az előzőkben leírt módon. All. ábrán láthatjuk egy ilyen kromatográfia eredményeit. All. ábrán mind a 33-as, mind a 34-es csúcs azonos szekvenciával rendelkezik (12. ábra) (SEQ ID NO. 2).
E. A GDNF jellemzői
Mobilitás SDS-PAGE-n
A minta bármilyen hőkezelése nélkül, nemredukáló körülmények között a GDNF egy elmosódott csík formájában fiit 31-42 kDa között SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézissel. Ha a mintát 100 °C-ra melegítjük, és 3 percig itt tartjuk redukáló ágens (4%-os β-merkaptoetanol) jelenlétében, akkor a GDNF több különálló csík formájában fut, méretük 20-23 kDa. Mivel a gélre felvitt biológiai aktivitásnak közel az 50%-a kinyerhető az előző (nemredukáló) körülmények között, de az utóbbi (redukáló) körülmények között semmi nem nyerhető ki, a GDNF egy diszulfidhíddal összekötött dimer lehet, és csak dimerként aktív. Mivel egyetlen N-terminális szekvenciát kaptunk, ez azt sugallja, hogy a GDNF preparátum homogén a primer szerkezetet tekintve, ezért a többszörös elmosódott csíkozat arra utal, hogy ez egy heterogén módon glikozilezett fehéije.
Specifikus aktivitás
A tisztított GDNF becsült specifikus aktivitása körülbelül 17 trofikus egység/ng, ami azt mutatja, hogy a dopaminfelvétel maximális serkentésének fele viszonylag alacsony koncentrációnál jön létre, körülbelül 60 pg/ml-nél. A tisztított GDNF mért specifikus aktivitását alulbecsülhetjük valamennyire, a GDNF-tisztítás során fellépő részleges inaktiválódása következtében, ami a fordított fázisú HPLC során használt savas szerves oldószerekkel való érintkezés, és az SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézis során használt denaturáló körülmények következménye.
A GDNF specifitása
A GDNF-et azon az alapon tisztítjuk, hogy képes fokozni a dopamin felvételét a dopaminneuronokban (20A. ábra). Annak meghatározására, hogy a GDNF emellett serkenti-e a túlélési indexet és/vagy a dopaminneuronok érését, a középagyi tenyészetekben a tirozinhidroxiláz immunreaktivitását is mérjük. A TH specifikus markere a dopaminneuronoknak a tenyészetekben. Az immunreaktivitás GDNF által való serkentése a dopaminneuronok fokozott túlélésének és/vagy a TH/dopaminneuron termelés fokozásának következménye. A tisztított GDNF-nek a szélesztés napján való hozzáadása, majd a tenyészetek nyolcadik napon való vizsgálata a nyolcadik napon azt eredményezte, hogy a TH+neuronok száma tízszer magasabb, mint a GDNF-et nem kapott kontrollokban. Ha egy második adag GDNF-et adunk hozzá a 9. napon, és a tenyészeteket hét nappal később vizsgáljuk (16 nap in vitro), akkor a kontrollal szemben hasonló dózisfiiggő fokozódás figyelhető meg (20B. ábra). Tehát a GDNF elősegítheti a dopaminneuronok túlélését és/vagy fokozza a TH-gén expresszióját a középagyi dopaminneuronokban.
Annak igazolására, hogy a GDNF specifikus serkentőhatással rendelkezik a dopaminneuronok érésére és/vagy túlélésére, és nincs általános hatása az összes neuronra, a GDNF gamma-amino-vaj savat (GABA) tartalmazó neuronokra, amelyek szintén jelen vannak a középagyi tenyészetekben, való hatását is vizsgáltuk. A H3-dopamin- (3H-DA) és a 14C-GABA-felvételt is mérjük középagysejtek testvértenyészeteiben, amelyeket különböző koncentrációjú GDNF jelenlétében szaporítottunk 15-16 napig. Amint az előzőkben ismertettük, a GDNF körülbelül 150%-kal fokozta a középagyi dopaminneuronok 3H-DA-felvételét a GDNF-et nem tartalmazó kontrollal szemben (21 A. ábra). A GDNFnek azonban nincs jelentős hatása a GABA-neuronok kapacitására a 14C-GABA-felvételét illetően, mivel a 14C-GABA-felvétele GDNF jelenlétében csak mintegy 20%-kal magasabb mint a kontrolié (21B. ábra). Ezt illusztrálja még a számított 3H-DA/14C-GABA-felvételi arány növekedése (21C. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a dopamin- és GABA középagyi neuronok eltérő módon reagálnak a GDNF jelenlétére, és a GDNF-nek a középagyi tenyészetekben a 3H-DA-felvételre gyakorolt serkentő hatása specifikusan a dopaminés nem a GABA-neuronokra irányul.
Ezek a megfigyelések további fényt vetnek arra, hogy a GDNF-et miért lehet használni a Parkinson-kór, illetve más, a dopaminergneuronokra is vonatkozó kór kezelésére. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a GDNF a dopaminergneuronoknak legalább két érdekes tulajdonságát fokozza: a dopaminfelvételt és a TH enzimszintet. Az eredmények azt is igazolják, hogy a GDNF hatásai legalább részben specifikusak a dopaminergneuronokra, mivel a GABA-neuronokat nem serkenti hasonlóképpen.
A dopaminerg- és GABA-erg neuronok mellett a patkányközépagy-tenyészetekben van más neuronális populáció is, a szerotoninergneuronok. Néhány faktor, azaz például az epidermális növekedési faktor (EGF), amely fokozza a dopaminergneuronok dopaminfelvételét a középagyi tenyészetekben, fokozza a szerotoninergneuronok szerotoninfelvételét is, és a GABA-ergneuronok GABA-felvételét is [Casper et al., J. Neurosci., 30, 372 (1991)]. Ez azt mutatja, hogy ezek a faktorok nem dopaminergneuron-specifikusak.
Ezzel szemben, a GDNF nem képes fokozni a szerotoninergneuronok szerotoninfelvételét. A 3H-szerotoninfelvételt ugyanúgy méljük, mint a 3H-DA-felvételt az l.B. példában, azzal a különbséggel, hogy a fel18
HU 220 795 BI vevőpuffer 50 nm 3H-szerotonint tartalmaz (11 Ci/mol, Amersham, Arlington Heights, IL) a 3H-DA helyett. 10 pmol citalpram jelenlétében (amit Dr. C. Mytilenoutól kaptunk, Mount Sinai School of Medicine), ami egy ismert inhibitora a szerotonin felvételének a szerotoninneuronokban. A 3H-szerotonin felvétele 15%-ra csökkent vissza. A citalpram jelenlétében kapott kontrollértékeket kivonjuk a 24. ábrán látható kísérleti értékekből.
A nemspecifikus faktorokkal, mint például az EGF, szemben, a GDNF nem fokozza a GABA felvételét (21. ábra) és a szerotonin felvételét (24. ábra) olyan körülmények között, amelyek között a dopamin felvételét jelentősen fokozza. Ezek, és egyéb, az előzőkben ismertetett eredmények azt mutatják, hogy a GDNF a középagyi tenyészetekben levő dopaminergneuronokra specifikus, ha az ugyanabban a tenyészetben jelen levő GABA-erg- és szerotoninergneuronokkal hasonlítjuk össze. Az ilyen specifitás fokozza a GDNF használhatóságát a Parkinson-kór kezelésében, amit a középagyi (nigrális) dopaminergneuronokra specifikus betegségnek tekintenek.
2. példa
A GDNF-gén klónozása
A. A GDNF-et kódolópatkánygén cDNS-kópiájának klónozása
Ahhoz, hogy a GDNF-et kódoló gént klónozzuk, egy cDNS-könyvtárat hozunk létre B49 sejtekből izolált poliA+ RNS-ből, és ezt a könyvtárat vizsgáljuk át egy degenerált oligonukleotid próbával, amely a tisztított GDNF aminosavszekvenciája alapján készült. Egy ehhez a próbához hibridizálódó cDNS-klón DNS-szekvenciáját meghatározzuk, olyan kiónt keresve, amely a degenerált oligonukleotidpróbában használt szekvenciától 3’ irányban található, egy, a GDNF-ben található aminosavszekvenciát kódol, és a C-terminális irányában található ahhoz az aminosavszekvenciához képest, amelynek alapján a vizsgáló oligonukleotidpróba készült.
A B49 sejtek tenyésztésének körülményeit részletesen ismertetjük az előző, 1. példában. Az RNS készítéséhez a sejteket közel egybefolyásig növesztjük szérumtartalmú táptalajon, egyszer mossuk szérummentes táptalajjal (DMEM) és 4 napig növesztjük DMEM-ben, két nap elteltével egyszer cserélve a táptalajt. A sejteket azután kinyerjük, és az össz-RNS-t kivonjuk, Chomczynski és Sacchi módszerével (Analytical Biochemistry, 162, 156-159 (1987)]. A poliadenilezett RNS-t ebből az össz-RNS-ből izoláljuk, oly módon, hogy egy oligodetermináns cellulózoszlopon bocsátjuk át, Maniatis és munkatársai leírása szerint [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)].
A cDNS szintézisét M-MLV RNázH reverz transzkriptázzal végezzük (Bethesda Research Láb, Gaithersburg, MD), a gyártó előírásai szerint. Az első szál reakciót egy oligo dT indítómolekulával (Pharmacia) indítjuk, és a reakcióelegy tartalmaz még 8 egység RNasin-t is (Promega, MAdison, WI), 5 pg poliA+ RNS-re számítva. A második lánc szintézisét Escherichia coli DNS polimerázzal, Escherichia coli RNázH-val és Escherichia coli DNS ligázzal (mindegyiket a BRL-től vesszük) végezzük, a gyártó előírásai szerint. A klónozás megkönnyítésére, a cDNS-t T4 DNS polimerázzal (BRL) kezeljük, tompavégek előállítása céljából, majd EcoRImetilázzal (BRL) kezeljük. Ezeket a lépéseket az enzimet szállító cég előírásai szerint hajtjuk végre. A cDNS-t azután kétszer extraháljuk fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével, majd kloroformmal, majd a vizes fázist 1/2 térfogat 7,5 mol/1 NH4Ac-tal és 3 térfogat etanollal szobahőmérsékleten kicsapjuk. A csapadékot centriíugálással nyeljük ki (15 perc, 16,000 xg szobahőmérsékleten), 70%-os etanollal mossuk, vákuumban szárítjuk, és 50 pl 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,6, 10 mmol/1 MgCl2, 1 mmol/1 ATP, 1 mmol/1 DTT, 5% PEG8000 összetételű pufferben szuszpendáljuk, amely 500 pikomol foszforilezett linkért (CCCGAATTCGGG, Pharmacia) (SEQ ID NO. 9) és 3 egység T4 DNS ligázt tartalmaz. A linker reakciót éjszakán át (körülbelül 16 óra) hajtjuk végre 16 °C-on. A reakcióelegyet azután fenol kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, és az előzőkben leírt módon kicsapjuk. A mosott üledéket megszárítjuk, és 50 pl EcoRI emésztési pufferben (100 mmol/1 TRISHC1 pH=7,5, 5 mmol/1 MgCl2, 50 mmol/1 NaCl és 0,025% Triton X-100) szuszpendáljuk, majd 400 egység EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA) adunk hozzá. A reakciót 2 óra hosszat 37 °C-on hagyjuk lejátszódni. A kicsapást követően (a fentiekben leírt módon) az üledéket EcoRI emésztési pufferben szuszpendáljuk, és egy második EcoRI emésztési reakciót is végrehajtunk, az előzőkben leírt módon. Ezt a reakcióelegyet is kicsapjuk, és 40 μΐ 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0, 1 mmol/1 EDTA, 100 mmol/1 NaCl összetételű pufferben szuszpendáljuk. Ezt a cDNS-t, amely most EcoRI-gyel emésztett linkereket tartalmaz, méret szerint frakcionáljuk egy Sephacryl S-3 00-as (Pharmacia) centrifugálóoszlopon való centrifugálással (llOOxg, 5 perc). Az erről az oszlopról lejövő oldatot összegyűjtjük, etanollal az előzőkben leírt módon kicsapjuk, majd 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0, 1 mmol/1 EDTA összetételű pufferben szuszpendáljuk, körülbelül 0,1 pg/μΙ koncentrációban.
Egy cDNS-könyvtárat készítünk a lambda-ZapII (Stratagene, La Jolla, CA) klónozó vektorban. Tipikusan 1 pg EcoRI-gyel emésztett és foszfatázozott vektorkarokat (Stratagene termék) Egálunk 0,1 pg EcoRIgyel linkereit cDNS-sel 5 pl ligálóelegyben, körülbelül 3 Weiss egység T4 DNS ligázt használva 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,6, 7 mmol/1 MgCl2, 1 mmol/1 DTT, 5% PEG8000 és 1 mmol/1 ATP összetételű pufferben. A ligálásokat 16 °C-on végezzük, éjszakán át. A ligálóelegyeket Gigapack Gold pakolókivonatokkal (Stratagene termék) pakoljuk, a gyártó által mellékelt előírások szerint. A könyvtárakat a titer meghatározása céljából szélesztjük, a vizsgálatot a Stratagene által adott XLl-Blue gazdaszervezeten végezzük.
Egy ilyen ligálásból és pakolásból körülbelül 270 000 tarfoltképző egységet kapunk összesen 12,
HU 220 795 Bl
150 mm átmérőjű Petri-csészére szélesztve. Ezekről a lemezekről nitrocellulóz filterre másolatokat készítünk Maniatis és munkatársai leírása szerint [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ezeket a szűrőlapokat hibridizáljuk az alábbi, 32P-vel jelzett degenerált oligonukleotidhoz (SEQ ID NO. 7) (I jelentése mozin):
5’ >CCIGATAAACAAGCIGCIGC > 3’ CCG
Ezt a szekvenciát a tisztított GDNF N-terminálisa körül meghatározott aminosavszekvencia (8. ábra, SEQ ID NO. 1) alapján adjuk meg, amint azt az előző, 1. példában ismertettük:
Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala.
Az oligonukleotidot 32P-ATP-ből származó 32P-vel jelezzük (Amersham, Arlington, Heights, IL), T4 polinukleotid kináz (Pharmacia vagy United States Biochemical, Cleveland, OH). A hibridizációs reakciókat 6X SSPE, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml tRNS (SIGMA, St. Louis, MO), valamint 2X Denhardt (0,4-0,4 mg/ml ficoll, poli(vinil-pirrolidon), BSA V-ös frakció) oldatokkal végezzük, 50 °C-on, éjszakán át (körülbelül 16 óra). A hibridizációs oldat 2-3 χ 106 cpm jelzett oligonukleotidot tartalmaz minden ml oldatban. Az alábbi hibridizáció után a szűrőket kétszer mossuk szobahőmérsékleten 2 χ SSPE, 0,1% SDS összetételű oldatban, valamint kétszer ugyanabban az oldatban, de 50 °C-ra melegítve. A szűrőlapokat hagyjuk levegőn megszáradni, és 7 napig -70 °C-on exponáljuk, erősítőfólia alkalmazásával.
Az előhívott filmeket megvizsgáljuk, hogy tartalmaznak-e olyan tarfoltokat, amelyek a vizsgálóoligonukleotiddal hibridizálódnak. Ebben az elsődleges szűrővizsgálatban 24 feltételezett pozitív kiónt azonosítottunk. A pozitív jelnek megfelelő területeket kivágjuk a könyvtárlemezekből, szuszpendáljuk, és egy második szűrővizsgálathoz újra szélesztjük, amely során az előzőkben leírt hibridizációs eljárást alkalmazzuk. Ebben a második vizsgálatban az eredetileg talált 24 klón közül nyolcat találtunk pozitívnak, míg 16 negatív ered5’> GAG AGG AAC CGG CAA
Ezt a szekvenciát az alábbi aminosavszekvenciára lehet lefordítani (SEQ ID NO. 12):
Glu-Arg-Asn-Arg-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro, ami megegyezik azzal az aminosavszekvenciával, amely a GDNF egy olyan N-terminális régiójában található, amely a vizsgálóoligonukleotid/szekvenáló indítómolekula készítéséhez használt aminosavszekvencia végétől számított 5 aminosawal kezdődik. Ez az eredmény azt igazolja, hogy a lambda-ZapII76.1-ben található cDNS-klón a B49 sejt kondicionált táptalajából származó tisztított GDNF-fehérjének egy részét, vagy egészét kódolja.
B. A lambda-ZapU76.1 cDNS-klón GDNF-et kódoló régiójának nukleinsavszekvenciája ményeket adott. Ezt a nyolc pozitív kiónt trfe tisztítással tisztítjuk 1-2 további hibridizációs lépésben, és ezek közül hatot DNS-szekvenálással tisztítunk, hogy meghatározzuk, vajon tartalmaznak-e olyan DNS-szekvenciákat, amelyek GDNF-et kódolnak.
A lambda-ZapII fág fagemid része, amely a klónozott inszertet tartalmazza, a pBluscript Sk~ jelzést kapta. A pBluescript SK~ fagemidet kihasítjuk azokból a lambda-ZapII rekombinánsokból, amelyek hibridizálnak az oligonukleotidpróbával. Azt az in vivő eljárást, amellyel a lambda-ZapII vektorból a rekombináns pBluescript Sk* plazmidot ki lehet vágni, részletesen megadják a gyártó leírásaiban. Röviden, a lambdaZapII fág és egy Ml3 „segítő” fág együttfertőzése eredményezi a rekombináns pBluescript egy egyszálú DNS másolatának a pakolását egy fertőzőképes M13 virionban. Ha egy ilyen virion egy érzékeny sejtet fertőz meg, akkor az egyszálú DNS kétszálú DNS-sé alakul, és a továbbiakban plazmidként szaporodik. Ennek az eseménynek a szelektálását a pBluescript SK* által kódolt ampicillinrezisztencia teszi lehetővé. Tehát a nyolc pozitív lambda-ZapII kiónból származó, „megmentett” rekombináns pBluescript SK* plazmidot tartalmazó Escherichia coli XLl-Blue származékok könnyen előállíthatok, ha a Stratagene által megadott leírást követjük, és a lambda-ZapII vektor mellé adott „segítő” fágot is használjuk.
A DNS-szekvencia meghatározásához a kétszálú plazmid-DNS-t ezek közül a rekombinánsok közül hatból állítjuk elő, Bimbóim és Doly „miniprep” módszerének alkalmazásával [Bimbóim, Doly, Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)]. Didezoxi-terminációs DNS-szekvenáló reakciókat végzünk ezeknek a tempótoknak a felhasználásával, és a vizsgáló oligonukleotidokat használva indítómolekulaként. A szekvenálási reagenseket az United States Biochemicaltől lehet beszerezni kit formájában (2.0 Sequenase Version), és a szekvenálási eljárást a gyártó által megadott leírás szerint végezzük. Az egyik klón, a pBluescript SK-76.1, amely a lambda-ZapII76.1 klónból származik, az alábbi szekvenciát tartalmazza (SEQ ID NO. 11):
GCA GCT GCC AGC CCA >3’
T AA ΤΑ T A T
A cDNS-klón 5’ végének első 877 bázispárjának nukleotidszekvenciáját határozzuk meg. Erről a régióról kiderült, hogy egy 227 aminosav méretű nyitott leolvasási keretet (ORF) tartalmaz, amelyben megtalálható az az aminosavszekvencia, amelyet a tisztított GDNF N-terminálisánál határoztunk meg, és megegyezik azzal a belső peptiddel, amelyet a tisztított GDNF hasításával kaptunk meg. Az erre az ORF-re kikövetkeztetett C-terminális 134 aminosav tartalmazza a tisztított érett GDNF-fehérje származtatott aminosavszekvenciáját. A megelőző 93 aminosavszekvencia tartalmaz egy potenciális iniciáló ATG-kodont, amelyet egy feltételezett szekréciós szignálszekvencia követ, és egy potenciális proteolítikus processzálási helyet is tartalmaz a fehérje egy „pre-pro” prekurzor formájának a hasítása cél20
HU 220 795 Β1 jából, hogy így az érett, az 1. példában leírt érett, tisztított GDNF-et kapjuk.
A szekvenálási reakciókban használt templát DNSek közé tartoznak a pBluescript SK-76.1 plazmid egyszálú és kétszálú verziói. A kétszálú DNS-t az XL1Blue (pBluescript SK-76.1) tenyészeteiből állítjuk elő a „forralt preparátum” eljárással [Analytical Biochemistry, 114, 193-197], és egy CsCl sűrűségi gradiensen tisztítjuk. Az egyszálú templátot úgy állítjuk elő, hogy az XLl-Blue-t (pBluescript SK-76.1) egy „segítő” M13 fággal fertőzzük, amely segítőfágot a szállító cég (Stratagene) adja, a fággal együtt, megfelelő leírás alapján. A 15-23 nukleotid hosszúságú egyszálú oligonukleotid indítómolekulákat Applied Biosystems (Foster City, CA) DNS-szintetizátorral (380A modell) állítjuk elő, és általában tisztítás nélkül használjuk. A szekvencia meghatározását a didezoxi-láncterminációs módszerrel végezzük. A használt reagensek közé tartozik a Sequenase Version 2.0 kit (United States Biochemical), amelyet a gyártó által mellékelt leírások alapján használunk.
A lambda-ZapII76.1 cDNS-klón 5’ vége első 877 nukleotidjának nukleotidszekvenciája, amely a tisztított érett GDNF-fehéije kódolószekvenciáját tartalmazza, a 13. ábrán mutatjuk be (SEQ ID NO. 3), azzal a származtatott anminosavszekvenciával együtt, amely 681 nukleotid méretű nyitott leolvasási keretnek (ORF) felel meg, és ezen a szekvencián belül található meg. A tisztított, érett GDNF-nek megfelelő szekvencia a 281-es pozícióban indul egy szerincsoporttal, ez a 14. ábrán látható (SEQ ID NO. 4). Az erre a régióra kapott DNS-szekvenciából egy olyan aminosavszekvencia származtatható, amely tökéletesen megfelel a tisztított GDNF N-terminálisánál megfigyelt aminosavszekvencia első 23 aminosavának (lásd 1. példa).
A génnek a 13. ábrán bemutatott analízise alapján az valószínű, hogy a GDNF először pre-pro GDNFpolipeptid alapján transzlálódik, és a szignálszekvencia, valamint a „pro” rész proteolítikus hasítása eredményezi a GDNF-nek azt a formáját, amelyet a B49 sejt kondicionált táptalajából lehet tisztítani. Egy ilyen pre-pro forma transzlációs iniciációjának legvalószínűbb pontja az az ATG-kodon, amely a 13. ábrán látható szekvencia (SEQ ID NO. 3) 50-es pozíciójában található.
C. A GDNF-et kódoló humángén klónozása
Számos neurotróf faktor aminosavszekvenciája erősen megőrződik számos különböző emlősfajban [Hallböök et al., Neuron, 6, 845-858 (1991); McDonald et al., Biochimica et Biophysica Acta, (in press) (1991)]. Az aminosavszekvencia konzerválódásának következménye az, hogy az ezeket a fehérjéket kódoló nukleotidszekvenciák is erősen konzerválódtak. Ennélfogva általában igaz, hogy egy neurotróf faktort egy emlősfajban kódoló gén képes kereszthibridizációra (azaz képes stabil kétszálú DNS-hibridet létrehozni) azokkal a génekkel, amelyek egy másik emlős fajban kódolnak egy ilyen faktort, megfelelő hibridizációs körülmények között. Ezt a tulajdonságot használtuk olyan klónozott humán DNS-szekvenciák azonosítására, amely tartalmazza a GDNF-gént.
A lambda-FIXII vektorban készített humán genomiális könyvtárat vásároltunk a Stratagene-től (katalógusszám #946203), és a GDNF patkány cDNS-klónjából (pBluescript SK-76.1) származó, 32P-vel jelzett próba alkalmazásával vizsgáljuk át, a 2.B. példában leírtak alapján. A próba körülbelül 250 bázispárt tartalmaz az érett GDNF kódolószekvenciájából, és a polimeráz láncreakcióval végzett specifikus amplifikálással állítjuk elő [Saiki et al., (1985); Science, 230, 1350 (1985)], az alábbiak szerint. Egy 50 μΐ-es vagy 100 μΐes PCR reakciót < Ing lambda-ZapII76.1 DNS-sel mint templáttal, és a patkány GDNF-szekvenciája alapján készített két oligonukleotid indítómolekulából 10-20 pmollal végzünk. Az egyik oligonukleotid a „vizsgálóoligonukleotid” (DHD-21 jelzéssel is előfordul), amelyet az előző 2.A. példában írtunk le, míg a második oligonukleotid (DHD-26) (SEQ ID NO. 13) szekvenciája az alábbi:
5’ >AAATTTTTIAAIATTTTATC >3’
GG C GCG ami a GDNF hasításával kapott belső peptidtermék (lásd 1. példa) aminosavszekvenciáján (Asp-Lys-IleLeu-Lys-Asn-Leu) alapul. A reakciót 10 mmol/1 TRISHC1 pH=8,3,25 °C-on, 50 mmol/1 KC1, 1,5 mmol/1 MgCl2,10 pg/ml BSA (Promega R3961), 0,2-0,2 mmol dNTP (Pharmacia) összetételű reakcióelegyben végezzük, 2,5-5 μ polimeráz felhasználásával (USB). A reakció 30 ciklusból áll: a ciklus első lépése 95 °C egy percig, a második lépése 44 °C 1,5 percig, a harmadik lépése 72 °C 1,5 percig. Ennek a reakciónak a termékét agaróz gélelektroforézissel figyeltük meg, körülbelül 250 bp méretű, ami megegyezik a két indítómolekulának a 13. ábrán bemutatott cDNS-szekvencián elfoglalt pozíciójával. Ezt a jelzetlen fragmentet eluáljuk a gélből, egy Ultrafree-MC Filter Unit (Millipore, Bedford, MA) berendezésben, a gyártó által megadott eljárások szerint, és templátként használjuk a további PCR-jelzési reakciókban, amelyet ugyanennek a két oligonukleotid indítómolekulának a felhasználásával végzünk. Ezeket a reakciókat azonos körülmények között végezzük, azzal a különbséggel, hogy a hideg cTP koncentrációját
12.5 pmol/l-re csökkentettük, és a reakcióelegyhez
2.5 pmol/l 3000-5000 Ci/mmol a-32P dCTP-t (Amersham) adtunk. A jelzési reakció termékeit egy Biospin 6 forgatott oszlopon (BioRad, Richmond, CA) bocsátjuk át. Az ezen az oszlopon átfolyó folyadékot használjuk próbaként a humán genomiális könyvtár átvizsgálásában.
A könyvtárat a Stratagene által rendelkezésünkre bocsátott Escherichia coli PLK17 törzsre szélesztjük ki. Huszonnégy darab 150 mm átmérőjű Petri-csészét készítünk, mindegyik körülbelül 50,000 tarfoltot tartalmaz. Az egyes lemezekről nitrocellulózfilter-másolatokat (2-2 db) készítünk, a Maniatis és munkatársai által leírt módszer alkalmazásával [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ezt a negyvennyolc szűrőlapot vizsgáljuk át 250xlO6 cpm PCR próbával (amelyet 0,5 mol/1 NaOH-val denaturáltunk) az előzőkben leírt módon 250 ml 6 x SSPE, 0,1%
HU 220 795 Bl
SDS, 2x Denhardt reagens, 0,1 mg/ml tRNS és 30% formamid (USB) összetételű oldatban, 42 °C-on, éjszakán át (körülbelül 16 óra). A szűrőket azután kétszer mossuk 250 ml SSPE, 0,1% SDS összetételű oldatban szobahőmérsékleten, majd kétszer mossuk 1,6 liter, 50 °C-ra előmelegített 0,1 X SSPE, 0,1% SDS összetételű oldatban. A szűrőlapokat szobahőmérsékleten hagyjuk megszáradni, majd 6 napig filmre exponáljuk -70 °C-on, erősítőfólia alkalmazásával. A filmeket előhívjuk és kiértékeljük. Hat erős pozitív kiónt figyelhettünk meg. A pozitív jelnek megfelelő területeket kivágjuk a lemezekből, szuszpendáljuk, majd újra szélesztjük egy második vizsgálat céljából, az előzőkben leírt vizsgálatot alkalmazva. Mind a hat újravizsgált klón pozitív volt, ezeket tarfolttisztításnak vetettük alá, egy újabb szélesztési és hibridizációs lépés alkalmazásával.
A szakterületen jártas szakember számára rutinműveletek dolga a próbával szomszédos DNS-régió szegmentjeinek szubklónozása és szekvenciájának meghatározása, és ezáltal a humán-GDNF-gén teljes szekvenciájának, vagy annak egy részének meghatározása. Ha ezekben a kiónokban nem lehet a teljes humán-GDNFgént megtalálni, akkor az is rutinművelet a szakterületen jártas szakember számára, hogy „sétáljon” a kromoszómán, és klónozza az ekörül a régió körül található átlapolószegmenteket, hogy ezáltal megkapja és szekvenálja a gén további részét.
Az előzőkben említett eljárás, és számos más eljárás, amelyek nyilvánvalóak a szakterületen jártas szakember számára, használhatók más humángénkönyvtár átvizsgálására. Például az előzőkben ismertetett próba és hibridizációs protokoll alkalmazásával egy humáncDNS-könyvtárat vizsgáltunk át, amelyet a humánputamenből kivont A+ RNS-ből készítettünk. Ezt a könyvtárat, amelyet a lambda-gtlO vektorban készítettek, a Clontechtől vásároltuk (Palo Alto, CA) (katalógusszám #HL1092a, Lót# 1561). Ezt a könyvtárat Escherichia coli LE392 sejtekre szélesztettük [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] (összesen körülbelül 250 000 tarfolt), körülbelül 20 000 tarfolt per lemez sűrűségben, és hibridizációban vizsgáltuk át, az előzőkben leírt körülmények között. A hibridizálást követően a szűrőlapokat kétszer mossuk szobahőmérsékleten 0,2 X SSPE, 0,1% SDS összetételű oldatban, majd kétszer 50 °C-ra előmelegített 0,1 X SSPE, 0,1% SDS összetételű oldatban. A szűrőlapokat hagyjuk a levegőn megszáradni, majd filmre helyezzük. 3 napig exponáljuk -70 °C-on erősítőfóliákkal, majd a filmeket előhívjuk. 8 kettős pozitív kiónt tudtunk azonosítani.
Hat, egy humán genomiális könyvtárból származó lambdaFIXII kiónt azonosítottunk hibridizációval egy patkány GDNF-próba alkalmazásával, és tarfolttisztítással homogenitásig tisztítottuk (lásd az előzőkben). Az egyes fágok lizátumait Maniatis és munkatársai által közölt módszerrel állítjuk elő [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ezekből a klónokból az alábbi módszerrel állítunk elő DNS-t:
annyi DNáz I-et (Pharmacia) és RNáz A-t (Sigma) adunk az egyes tenyészetek 5 ml-éhez, hogy 1 pg/ml legyen a végkoncentrációjuk. Az oldatot 1 óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on. Ezután 5 ml 20%-os polietilénglikolt (Sigma), 2 mol/1 NaCl-t adunk hozzá, és az oldatot 1 óra hosszat 0 °C-on inkubáljuk. A lambda-fágot centrifugálással ülepítjük (12 000xg, 10 perc). A fágüledéket 250 pl TE pufferben (10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4, 1 mmol/1 EDTA) szuszpendáljuk, majd egymás után a következőkkel extraháljuk: a. kloroform; b. fenol; c. fenol:kloroform 1:1 arányú elegye; d. kloroform. Annyi ammónium-acetátot adunk hozzá, hogy a végkoncentrációja 0,25 mol/1 legyen, majd a DNS-t 2 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk, és 10 000 χ g-vel centrifugáljuk. A DNS-üledéket TE-ben szuszpendáljuk.
Minden egyes lambda izolátumból származó DNS-t különböző restrikciós enzimmel emésztünk, majd a fragmenteket agarózgélen végzett elektroforézissel elválasztjuk [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. A DNS-fragmenteket két azonos nejlonmembránra visszük át (Schleicher and Schüll), és patkány-GDNF-ből származó, radioaktívan jelzett próbával hibridizáljuk. A patkány-GDNF-ben van egy EcoRI hasítási hely a 356-os és 357-es nukleotidok között (a 13. ábra számozását követve). Ez belehasít az érett GDNF kódolószekvenciájába. Annak meghatározásához, hogy a humán genomiális kiónok rendelkeznek-e hasítási hellyel egy ezzel homológ pozícióban, a humán kiónok emésztésére használt restrikciós enzimek közül az egyik az EcoRI volt. Specifikusan jelzett próbákat készítünk mind a patkány-GDNF EcoRI hasítási helye előtti régiókra (1-es próba), mind a patkány-GDNF hasítási helye utáni régiókra (2-es próba). Az 1-es próba 268 bázispár hosszúságú, és a patkány-GDNF 5’ nem transzlálódó régiójából 14 bázispárt, valamint a kódolószekvenciából 253 bázispárt tartalmaz (az 1-85-ös aminosavakat). Úgy állítjuk elő, hogy a lambda-ZapII76.1 DNS polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk, a PD1 oligonukleotidot (GACGGGACTCTAAGATG) (SEQ ID NO. 15) és a DHD23-as oligonukleotidot (GCIGCIGC(C/T)TG(T/C)TT(A/G)TCIGG) (SEQ ID NO. 16) használva indítómolekulaként. A fenti próba készítéséhez használt reakciókörülmények ugyanazok, mint amik az előzőkben voltak, azzal a különbséggel, hogy a reakció 30 ciklusból áll:
°C 1 percig, 50 °C 1,5 percig, 72 °C 1,5 percig. A 2-es próba 195 bp hosszúságú, és 17 nukleotidot tartalmaz a patkány GDNF 3’ nem transzlálódó szekvenciájából, valamint 178 bázist a kódolószekvenciából (153-211-es aminosavak). Polimeráz láncreakcióval állítjuk elő, az LF2 oligonukleotid indítómolekula (CGAGACAATGTACGACA) (SEQ ID NO. 17), és a PD2 indítómolekula felhasználásával (CTCTGGAGCCAGGGTCA) (SEQ ID NO. 18) a lambda-ZapPII76.1-et használva DNS-templátként. A reakciókörülmények ugyanazok, mint az 1-es próbánál.
A hat lambda-klónból öt azonos hibridizációs mintázatot adott. Az 1-es próba egy körülbelül 700 bázispár
HU 220 795 Bl méretű EcoRI ffagmenthez hibridizálódott, a 2-es próba egy körülbelül 2,8 kb méretű EcoRI ffagmenthez hibridizálódott. Az a tény, hogy a két próba két különböző EcoRI ffagmenthez hibridizálódott, erősen arra utalt, hogy a humán-GDNF-gén egy homológ EcoRI hasítási helyet tartalmaz. A 700 bp és az 1,8 kb méretű EcoRI fragmenteket egymástól függetlenül pBluescript Sk- plazmidba (Stratagene) szubklónoztuk. Ennek a két fragmentnek a nukleotidszekvenciáját a 2.B. példában leírtak alapján határozzuk meg. Ezeknek a DNSffagmenteknek a szekvenciáját a 19. ábrán mutatjuk be (SEQ ID NO. 5). A szekvenciából világos, hogy létezik egy intron a pre-pro GDNF 52-es aminosava előtt. Nincs intron a génnek abban a részében, amely az érett humán-GDNF-et kódolja. Az érett humán-GDNF származtatott aminosavszekvenciája 93%-ban homológ az érett patkány-GDNF-fel. Ez körülbelül ugyanolyan mértékű aminosavhomoiógia, mint amit az egyéb neurotróf faktoroknál találtak a patkány- és humánfehérjéknél (a patkány- és a humán-CNTF aminosavszekvenciája között 83%-os a homológia, McDonald et al., Biochimica et Biophysica Acta, (1991), in press). A patkány- és a humán-NGF aminosavszekvenciája közötti homológia 95%-os, a BDNF-nél 100%-os, az ΝΤ-3-nál 100%-os [Hallbook et al., Neuron, 6, 845-855 (1991)].
A teljes humán pre-pro GDNF-szekvencia izolálásához egy radioaktívan jelzett hibridizációs próbát használunk, amely a már meghatározott humán-GDNF szekvenciáján alapul, ezzel a szekvenciával humán-cDNSkönyvtárakat vizsgálunk át. Mivel a cDNS-ek a processzált mRNS másolatai, ezért az intronok nincsenek benne, és így a teljes kódolószekvenciát kaphatjuk meg. Egy másik módszer szerint most, hogy az intronnak a kódolószekvenciához viszonyított helyzete ismert, egy olyan hibridizációs próbát készíthetünk a patkány-cDNS-klónból, amely specifikus az intron előtti szekvenciára, és ezt a próbát használhatjuk egy genomiális könyvtár átvizsgálására olyan kiónok izolálása érdekében, amelyek az 5’ exonokat tartalmazzák.
D. A humán pre-pro GDNF első 50 aminosavát kódoló nukleotidszekvencia
Amint azt a 2.C. példában részleteztük, létezik egy intron, amely a humán pre-pro GDNF 51-es aminosavánál vágja el a nukleotidszekvenciát. Abból a célból, hogy meghatározzuk a molekula ezen részének a szekvenciáját, egy humán genomiális könyvtárat vizsgálunk át egy olyan próbával, amely a patkány pre-pro GDNF N-terminális kódolószekvenciájából származik, és egy hibridizálódó kiónt szekvenálunk, amelyről igazoljuk, hogy tartalmazza a humán pre-pro GDNF 1-50-es aminosavainak kódolószekvenciáját, amint az a 22. ábrán látható (SEQ ID NO. 8).
Ehhez a könyvtár átvizsgáláshoz egy PCR próbát szintetizálunk, a 2.C. példában leírtak alapján. A használt oligonukleotid indítómolekulák az alábbiak:
PD1=5’ >CCCGAATTCGACGGGACTCTAAGATG >3’ (SEQ IDNO. 19); LFA=5’ >CGGTGGCCGAGGGAGTGGTCTTC >3’ (SEQ IDNO. 20).
A PCR reakciók körülményei (mind a,,hideg” mind a 32P-jelzés) ugyanazok, mint amit a 2.B. példában leírtunk, azzal a különbséggel, hogy a reakció 25 vagy 30 ciklusból állt: 95 °C 1 percig; 50 °C 1,5 percig és 72 °C 1 percig. Ennek a reakciónak a terméke tartalmazza a patkány pre-pro GDNF kódolószekvencia első 122 bázispáiját, és a feltételezett iniciátor ATG előttről 5’ irányban 14 bázispárt (lásd a 13. ábrát és a SEQ ID NO. 3-at). A humán genomiális könyvtárnak ezzel a próbával való átvizsgálását ugyanúgy végezzük, ahogy a 2.C. példában leírtuk. Az érett humán-GDNF-et hordozó kiónok azonosítására használt szűrőlapokat kétszer 15 percig mossuk forrásig melegített ionmentesített vízben, majd a 2.C. példában leírtak alapján mossuk. A szűrőlapokat 3 napig filmre tesszük -70 °C-on, erősítőfóliákat használva. Előhíváskor számos dupla pozitív figyelhető meg, amelyeknek változik az intenzitásuk. Tizenkét viszonylag erős pozitív kiónt választunk ki, és ezek közül tizet tarfolttisztításnak vetjük alá, több egymást követő hibridizációs lépésben, a vizsgálatnál alkalmazott körülmények között.
Ezeknek a rekombináns fágoknak a klónozott DNS-eit Southem-blot-hibridizálással vizsgáljuk. Egy körülbelül 1000 bp méretű Alul ffagmentet találtunk, amely hibridizál a vizsgálópróbához, ezt a Smal restrikciós enzimmel emésztett pBluescript SK- plazmidba szubklónozzuk, így kapjuk a pBSSK-lambda3AluI plazmidot. Ezt az Alul ffagmentet tovább szubklónozzuk, hogy a megfelelő DNS-ffagment további szekvenálását megkönnyítsük. A tisztított pBSSK-lambda3AluI DNS-t egy sorozat restrikciós enzimmel emésztjük, amelyek a vektorba csak egyszer hasítanak bele (a polilinker régióban), és az emésztési termékeket agaróz gélelektroforézissel elemezzük. Két restrikciós enzimet azonosítottunk így (PstI és SacI), amelyek egyszer vágnak bele a klónozott DNS-be. A 22. ábrán látható a PstI és SacI hasítási térképe. A Southem-blotvizsgálat kiderítette, hogy a klónozott szegmentnek az a régiója, amely a vizsgálópróbával hibridizál, a klónozott Alul szegment SacI és PstI hasítási helye között található. Ennélfogva a szekvenáláshoz a pBSSKlambda3AluI plazmidból két deléciós származékot készítünk. Az egyik példában egy kis, körülbelül 300 bp méretű PstI ffagmentet vágunk ki, az alábbiak szerint: a plazmidot PstI restrikciós enzimmel emésztjük, majd ligáljuk és Escherichia coli-ba transzformáljuk. A transzformánsok között keressük azokat, amelyekből a kis PstI fragment hiányzik. Ezzel párhuzamosan, a 300 bp méretű SacI fragmentet hasonlóképpen kivágjuk a pBSSK-lambda3AluI plazmidból, hogy egy második deléciós származékot állítsunk elő. Ezt a két deléciós plazmidot használjuk templátként a szekvenálási reakciókban. A szekvenálást a 2.B. példában leírtak alapján végezzük.
A 22. ábrán (SEQ ID NO. 8) látható az így kapott szekvencia 233 bázispárja. Ez a szekvencia egy 151 bá23
HU 220 795 Β1 zispár méretű régiót tartalmaz, amely magasfokú homológiát mutat a patkány pre-pro GDNF kódolószekvencia első 151 bázispáijával; 88%-os homológia aminosavszinten és 95%-os homológia DNS-szinten. Ebből azt a következtetést lehet levonni, hogy ez a régió egy olyan exon része, amely a humán pre-pro GDNF 50 N-terminális csoportjának kódolószekvenciáját hordozza, valamint az 51-es aminosav kodonjának az első nukleotidját. A közvetlenül 3’ irányban emellett a 151 bázispáros szekvencia mellett található szekvenciahomológ az emlős intronok 5’ végének konszenzusszekvenciájával [Shapiro and Senapathy, Nucleic Acids Research, 15, 7155-7174 (1987)]. A feltételezett iniciátor ATG mellett közvetlenül 5’ irányban található szekvencia a patkányszekvenciával 28 bázispár hosszan erős homológiát mutat; a 28 csoportból 27 azonos. Ennél a pontnál a 3’ irányban található szekvenciák élesen eltérnek. A divergenciapont körülötti szekvencia jelentős homológiát mutat az emlős intronok 3’ végének konszenzusszekvenciájával [Shapiro and Senapathy, Nucleic Acids Research, 15, 7155-7174 (1987)]. Tehát valószínűnek tűnik, hogy ez egy illesztési pont, jóllehet erre nincs közvetlen bizonyíték. A humán pre-pro GDNF-et tartalmazó nyitott leolvasási keret legalább 27 bázispár hosszan túlnyúlik 5’ irányban az iniciátor ATG-n. Amint azt az előzőkben tárgyaltuk, lehetséges, hogy a pre-pro GDNF egyéb formái is keletkezhetnek, amelyek további aminosavakat tartalmazhatnak 5’ irányban. Ezek a formák is processzálhatok úgy, hogy az az érett GDNF-molekula keletkezzen, amelyet tisztítottunk és szekvenáltunk (lásd 1. példa).
Az itt és a 2.C. példában bemutatott nukleotidszekvenciák egy humán pre-pro GDNF teljes kódolószekvenciáját tartalmazzák, amely jelentős homológiát mutat a patkány pre-pro GDNF-fel, amelyet sikeresen expresszáltunk emlős sejtekben (lásd 5. példa) biológiailag aktív patkány-GDNF előállítása céljából.
3. példa
A GDNF alkalmazása a kísérletes Parkinson-kór megelőzésében
Ebben a példában azokat a módszereket újuk le, amelyekkel majmokban Parkinson-kórt lehet előidézni, ha az állatoknak megfelelően adjuk be az MPTP neurotoxint (l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahidro-piridin). Emellett leírjuk azokat a módszereket is, amelyekkel az MPTP-nek kitett állatoknak GDNF-et adunk be, azzal a céllal, hogy az ilyen állatokban megelőzzük a Parkinson-kór kialakulását.
A. GDNF adagolása kísérletes Parkinson-kór kialakítása céljából MPTP-vel kezelt majmoknak Egy rozsdamentes kanült ültethetünk be a jobb oldali agykamrába, és összekötjük egy bőr alá ültetett ozmotikus minipumpával (Alzet 202). A minipumpa különböző koncentrációjú GDNF-et tartalmaz, illetve negatív kontrollként a hígítószerét. A pumpa 0,5 μΐ/óra mennyiséget adagol 14 napig. Két nappal a kanülpumpa beültetése után a majmok (Cebus apella) 0,6 mg/kg-os MPTP injekciót kapnak a jobb karotid artériába. Hat héttel az indító beültetés után az állatokat sóoldattal perfundáljuk, és agyukat gyorsan eltávolítjuk. Az agyat jégen felboncoljuk, és a caudatus magból valamint a putamentből szövetdarabokat távolítunk el. A feketeállományt rögzítőbe tesszük. A caudatus putamen szövetet HPLC-vel vizsgáljuk dopaminra, a feketeállományt a tirozin-hidroxiláz (TH) immunreaktivitás szempontjából dolgozzuk fel.
B. A GDNF hatásossága
A feketeállomány dopaminerg idegsejtjeinek és a caudatus-putamenbe való axonális projekcióinak a degenerációja kísérletes Parkinson-kórt okoz ebben a majommodellben. Számos kísérleti indikáció mutat arra, hogy a GDNF megelőzheti, illetve csökkentheti ennek a neuronális degenerációnak a súlyosságát. A GDNF például megelőzheti a TH-pozitív sejttestek elvesztését a feketeállományban. Ez azt mutatja, hogy a GDNF megvédi a nigrális dopaminerg idegsejteket az MPTP toxikus hatásaitól. A HDNF megelőzheti a TH-pozitív szálak elvesztését a caudalis-putamenből. Ez azt mutatja, hogy a GDNF megvédi a nigrális dopaminergneuronok axonális projekcióit az MPTP toxikus hatásaitól. A GDNF megelőzheti a dopamintartalom elvesztését a caudatus-putamenből. Ez arra utal, hogy a GDNF megvédi a nigrális dopaminergneuronokból a caudatus-putamenbe kinyúló axonokat és dopamintartalmukat az MPTP káros hatásaitól.
4. példa
A GDNF biológiai aktivitása és potenciális klinikai alkalmazása
A tisztított GDNF fokozza az embrionális középagyi sejtek tenyészeteiben jelenlevő dopaminergneuronok dopaminfelvételét mind dúsított mind kémiailag meghatározott táptalajban, amint azt az 1. példában igazoltuk. Ez azt mutatja, hogy a GDNF egy neurotróf faktora ezeknek a dopaminerg idegsejteknek. Ily módon a GDNF hasznosnak bizonyulhat ezeknek a neuronoknak a Parkinson-kórban előforduló degenerációjának kezelésében. Emellett a GDNF hasznosnak bizonyulhat egyéb agyi dopaminergneuronok helytelen működésének kezelésében. Az ilyen helytelen működés skizofréniában és más, neuroleptikummal való kezelést igénylő rendellenességekben fordul elő.
A. A tisztított GDNF elősegíti a paraszimpatikus és szimpatikus idegsejtek túlélését tenyészetben 1. A neurontúlélés vizsgálata:
Anyagok
A 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromidot (MTT) a SIGMA Chemical Co.-tól (St. Louis, Missouri) vásároljuk. A borjúmagzatszérumot a Hyclone Laboratories-tól vásároljuk (Loga, Utah). A tenyésztő táptalajokat és a sóoldatokat az Irvine Scientific-től vásároljuk (Santa Analizál, Califomia). A szaporítólemezeket a Costartól vásároljuk (Cambridge, Massachusetts). A patogénmentes termékeny csirkeembrió-tojásokat a Spafastól vásároljuk (Roanoke, Illinois).
HU 220 795 Bl
A vizsgálat
A primer csirkeembrió ciliáris ganglionok és szimpatikus lánc ganglionok tenyészetét a már leírt módszerekkel állítjuk elő [Collins, Develop. Biok, 65, 50 (1978); Manthorpe et al., Develop. Brain Rés., 25, 191 (1986)]. Röviden, a ciliáris vagy szimpatikus ganglionokat eltávolítjuk a termékeny, patogénmentes csirketojásokból, amelyeket 8-10 napig inkubáltunk, 38 °Con, nedvesített atmoszférában. A ganglionokat kémiailag választjuk el, oly módon hogy először Hankféle kiegyensúlyozott sóoldattal hozzuk érintkezésbe, amely nem tartalmaz kétértékű kationokat, de tartalmaz 10 mmol/1 HEPES puffért (pH=7,2), a kezelés 10 percig tart 37 °C-on, majd olyan oldattal hozzuk érintkezésbe, amely 0,125% baktotripszin 1:250-et (Difco, Detroit, Michigan) tartalmaz az előzőkben leírt módon módosított Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban; a kezelés 12 percig tart 37 °C-on. A tripszinezést úgy állítjuk le, hogy 10% végkoncentrációban borjúmagzatszérumot adunk a reakcióelegyhez.
Ezután a kezelés után a ganglionokat Dulbecco-féle magas glükóztartalmú módosított Eagle-táptalajra visszük (bikarbónát nélkül), amely 10% boíjúmagzatszérumot és 10 mmol/1 HEPES-t (pH=7,2) tartalmaz, majd mechanikusan szétválasztjuk, oly módon hogy körülbelül tízszer átbocsátjuk egy üveg Pasteur-pipettán, amelynek a nyílását tűzben políroztuk, és olyan átmérőt állítottunk be rajta, hogy 2 másodpercre legyen szükség a pipetta feltöltésére.
A disszociált ganglionokat azután szaporító táptalajra szélesztjük (Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalaj, amelyet 10% borjúmagzatszérummal, 4 mmol/1 glutaminnal, 60 mg/1 penicillin-G-vel és 25 mmol/1 HEPES-sel (pH=7,2) egészítettünk ki) 100 mm átmérőjű szövettenyésztő lemezekre (40 disszociált ganglion lemezenként), három óra hosszat. Ezt az előszélesztést azért végezzük, hogy elválasszuk a nem neuronális sejteket, amelyek a lemezhez tapadnak, az idegsejtektől, amelyek nem tapadnak a lemezhez. Három óra elteltével a nemtapadó idegsejteket centrifugálással kinyerjük, szaporító táptalajban szuszpendáljuk, majd 50 μΐ/luk mennyiségben 96 lukas mikrotiter szövettenyésztő lemez felére osztjuk szét, 1500 idegsejt/luk sűrűségben. A mikrotiterlukakat korábban 1 mg/ml poliL-omitin-oldattal kezeljük 10 mmol/1 borát (pH=8,4) oldatban, éjszakán át, majd desztillált vízzel mossuk és levegőn szárítjuk.
A neurotróf aktivitásra vizsgált minta sorozathígításából tíz μΐ-t adunk az egyes bikákhoz, majd a lemezeket 20 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk 7,5% szén-dioxidot tartalmazó nedvesített atmoszférában. A ciliáris ganglionoknál 18 óra, a szimpatikus ganglionoknál 40 óra elteltével lukanként 15 μΐ, 1,5 mg/ml-es MTT tetrazólium festéket adunk hozzá Dulbecco-féle magas glükóztartalmú módosított Eagle-táptalajban (bikarbónát nélkül), amely 10% borjúmagzatszérumot és 10 mmol/1 HEPES-t (pH=7,2) tartalmaz, majd a tenyészeteket 4 órára 37 °C-on inkubátorba tesszük. Ezután 75 μΐ HCl-oldatot adunk hozzá (6,7 ml 12 mol/1 HC1 egy liter izopropanolban oldva), és az egyes lukak tartalmát harmincszor trituráljuk, hogy feltörjük a sejteket és szuszpendáljuk a festéket. Az egyes lukaknái meghatározzuk a 570 nm-es abszorbanciát a 690 nm-es referenciához viszonyítva, automatikus mikrotiter lemezleolvasó alkalmazásával (Dynatech, Chantilly, Virginia). Azoknak a lukaknak az abszorbanciáját, amelyekbe nem tettünk neurotróf ágenst (negatív kontrollok), kivonjuk a mintát tartalmazó lukak abszorbanciájából. A kapott abszorbancia arányos az egyes lukakban levő élő sejtek számával, mint olyan idegsejteké, amelyek képesek a festéket redukálni. A neurotróf aktivitás trofikus egységeinek számát úgy határozzuk meg mint annak a hígításnak a reciprokát, amely az idegsejtek maximális túlélésének 50%-át adják. A specifikus aktivitást úgy határozzuk meg, hogy a trofikus egységek számát elosztjuk a mintában levő fehéije mennyiségével.
Eredmények
Amint a 15. ábrán látható, a tisztított GDNF elősegíti a csirkeembrió ciliáris ganglionok paraszimpatikus idegsejtjeinek túlélését tenyészetben. Amint az a 16. ábrán látható, a tisztított GDNF elősegíti a csirkeembrió szimpatikus ganglionjaiból származó szimpatikus idegsejtjeinek túlélését tenyészetben.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a GDNF túlélési faktorként hat a szimpatikus és paraszimpatikus neuronokra. Ily módon tehát hasznos lehet az autonóm (azaz paraszimpatikus vagy szimpatikus) idegrendszer idegsérülései különböző formáinak kezelésében. Az ilyen sérülés beállhat metabolikus kondíciók miatt, amilyen például a cukorbetegség vagy a helytelen veseműködés. Az ilyen sérülés bekövetkezhet a betegek különböző kemoterápiás ágensekkel való kezelésének következtében, amilyenek például a rák kemoterápiás ágensekkel, mint például a ciszplatin és vinkrisztin, illetve az AIDS kemoterápiás ágensekkel, mint például a ddlvel és ddC-vel való kezelés következtében. Az ilyen sérülés genetikai állapotok következtében is beállhat, ilyen például a diszautonómia. Az ilyen sérülés traumás sérülés következtében is beállhat.
5. példa
A GDNF expressziója állati sejtekben
A. Rekombináns plazmidok készítése COS-sejtekben való expresszióhoz
A pBluescript SK-76.1 egy körülbelül 1,5 kb méretű Smal fragmentje tartalmazza a teljes GDNF kódolószekvenciáját, ezt szubklónozzuk a pSG5 plazmid vektorban [Green et al., Nucleic Acids Research, 16, 369 (1988)], amelyet arra a célra terveztek, hogy a klónozott gének tranziens módon expresszálódjanak az SV40 T antigént expresszáló sejtekben, amilyenek például a COS-sejtek.
A GDNF-cDNS DNS-szekvenciája (13. ábra) (SEQ ID NO. 3) és restrikciós endonukleázos térképezés egy olyan Smal fragmentet azonosít, amelyet a vektorban levő polilinker Smal hasítási hely (a cDNS-klón 5’ végétől 5’ irányban 18 bázispár távolságban van) és egy másik Smal hasítási hely (körülbelül 1500 bázispár távolságban) határol, amely körülbelül 800 bázispár tá25
HU 220 795 Bl volságban 3’ irányban az érett GDNF kódolószekvenciájának végétől. Ezt a Smal fragmentet pSG5-ben klónozzuk, az alábbiak szerint. A tisztított pSG5 plazmid DNS-t (Stratagene) EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd boíjúbél alkalikus foszfatázzal (CIAP) kezel- 5 jük (Promega), a gyártó előírásai szerint. Ezt követően a vektort elektroforézisnek vetjük alá, majd eluáljuk az agarózgélből. A tisztított pBluescript SK-76.1 plazmidDNS-t EcoRI metilázzal metilezzük, majd Smal restrikciós enzimmel emésztjük, és a 2.A. példában leírtak 10 alapján EcoRI-linker molekulával ligáljuk. Az EcoRIemésztést és agaróz gélelektroforézist követően a számunkra érdekes, körülbelül 1,5 kb méretű Smal fragmentet (amely most EcoRI-metilezve van és linkerrel van ellátva) eluáljuk, és ligáljuk az EcoRI-gyel emész- 15 tett és foszfatázozott pSG5 vektorral. A ligálási termékeket használjuk kompetens Escherichia coli XLl-Blue transzformálására, a CaCl2-eljárás alkalmazásával [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manuai, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Az ampicillinrezisztens transzformánsokat szelektáljuk, és restrikciós endonukleázos emésztéssel majd agaróz gélelektroforézissel vizsgáljuk bennük a rekombináns plazmidokat. Az EcoRI enzimmel való emésztés azt mutatja, hogy a legtöbb 25 transzformáns hordozza a számunkra érdekes inszertet tartalmazó plazmidot. A BamHl restrikciós enzimmel végzett emésztéssel meg lehet határozni a klónozott GDNF-nek a vektorban levő SV40 promoterhez viszonyított orientációját (lásd a BamHl helyet a 15-ös pozí- 30 cióban a 13. ábrán látható szekvenciában). Mindkét orientációt megkaptuk.
Két transzformánst választunk a további elemzéshez; az egyik tartalmazza a pSG5:: rGDNF-7 jelű plazmidot, amely a GDNF-gént a helyes orientációban tar- 35 talmazza ahhoz, hogy az SV40 promoterről RNS-transzkriptumok expresszálódjanak, míg a másik egy olyan plazmidot tartalmaz, amelynek jele pSG5: :rGDNF-4, és a GDNF-gént az ellentétes orientációban tartalmazza; ebben az SV40 promoterről iniciálódó RNS-transz- 40 kriptumokról nem keletkezik GDNF. Mindkét ilyen plazmidnak a tisztított preparátumát CsCl sűrűséggradiens centrifugálással tisztítjuk a COS-sejtekben való expresszió céljából.
B. A GDNF expressziója COS-7-sejtekben
Az ezekből a konstrukciókból származó plazmid DNS-t alkalikus lízis módszerével állítjuk elő, majd CsCl-sűrűséggradiens centrifugálással tisztítjuk [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manuai, 50 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY (1982)]. Ezt a DNS-t transzfektáljuk COS-7-sejtekbe Sompyrac és Dánná módszerével [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78, 7575-7578 (1981)]. Kontrollként ekvivalens COS-sejt-tenyészete- 55 két transzfektálunk a GDNF-inszertet az ellentétes orientációban tartalmazó plazmid vektor-DNS-sel, ami nem teszi lehetővé a GDNF-fehéije expresszióját. 100 mmes tenyésztőlemezenként 30 pg lipofektint és 0,3-1 pg plazmid DNS-t használunk.
órás transzfekció után a táptalajt leszívjuk, és OptiMEM I±3% FCS-sel helyettesítjük. A tenyészeteket 48 óra hosszat inkubáljuk, majd az alábbiak szerint nyerjük ki:
a) a táptalajt (a kondicionált táptalajt vagy CM-et) leszívjuk és -80 °C-on tároljuk;
b) a sejtréteghez 5 ml PBS+2,5 mmol/1 EDTA összetételű oldatot adunk, majd 3 percig 25 °Con tartjuk; azután a sejteket pipettával leszívjuk a lemezről és 5 percig 1000 χ g-vel centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk és a sejtüledéket -80 °C-on tároljuk.
A CM-et Centricon 10 koncentrátorokban koncentráljuk, és vizsgáljuk a biológiai aktivitását. A sejtüledé20 keket ultrahangos besugárzással feltárjuk 500 pl 10 mmol/1 EDTA pH=7,0, plusz 1 mmol/1 benzamidin, 100 pmol/l PMSF, 1 mmol/1 E-amino-N-kapronsav összetételű pufferben. A sejtlizátumokat 14,000 χ g-vel 5 percig centrifugáljuk, majd vizsgáljuk a felülúszók biológiai aktivitását.
C. Az expresszált GDNF biológiai vizsgálata
A GDNF-et expresszáló és kontrollplazmidokkal (ezek a GDNF kódolószekvenciát a helytelen orientációban tartalmazzák) transzfektált COS-sejtekből származó sejtlizátumok és tenyészlevekben vizsgáljuk mind a dopaminfelvétel fokozásának képességét a középagyi neuronokbán (lásd 1. példa) és azt a képességét, hogy fokozza a szimpatikus ganglion neuronok túlélését (lásd 4. példa). A COS-sejt-tenyésztő táptalaj (17. ábra) és a sejtlizátum (nem közölt adatok) fokozza a dopaminfelvételt, amint az a GDNF-től várható. Amint az a 18. ábrán látható, a COS-sejt tenyészetének közege és sejtlizátuma fokozza a szimpatikus láncneuronok túlélését, amint az a GDNF-től várható.
Ezek az eredmények világosan mutatják, hogy a GDNF-gén expressziója egy állati sejtben egy olyan fehérje expresszióját eredményezi, amelynek a biológiai aktivitása ugyanaz, mint a tisztított GDNF-é.
6. példa
A humán-GDNF expressziója Escherichia coli-ban
A. humán-GDNF-et kódoló plazmid készítése
A humán-GDNF-szekvencia információ felhasználásával (2.C. példa) szintetikus oligonukleotidokat készítünk (PD3 és PD4) indítómolekulaként a humánGDNF-gén amplifikálásához, és egy plazmidról való expresszióhoz Escherichia coli-ban. A PD3 (SEQ ID NO. 21) és PD4 (SEQ ID NO. 22) oligonukleotidok szekvenciái a következők:
PD3: 5’ CGCGGATCCAATCGGAGGAAAAAAAATGTCACCAGATAAACAAAT 3’ PD4 : 5’ CGCGGTACCCAGTCTCTGGAGCCCGGA 3’.
HU 220 795 Bl
A PD3 oligonukleotid 46 nukleotid hosszúságú. A 3’ végen levő 17 nukleotid tökéletesen megegyezik a humán-GDNF-génnel, abban a régióban, amelyik az érett fehéije N-terminálisát kódolja. Ezt a 17 nukleotidot egy transzlációs iniciációs kodon (ATG) előzi meg, úgy- 5 hogy az érett humán-GDNF a megfelelő aminosawal kezdődjön Escherichia coli-ban. A többi nukleotidot úgy tervezzük meg, hogy az Escherichia coli-ban a jó expresszióhoz szükséges egyéb szignálokat szolgáltassák, valamint egy BamHI endonukleáz restrikciós hasítási helyet, amely ahhoz kell, hogy egy GDNF expressziós plazmidot készítsünk.
A PD4 oligonukleotid 26 nukleotid hosszúságú.
A 3’ végen található 17 nukleotid tökéletesen illeszkedik a humán-GDNF 3’ végén levő 17 nukleotiddal, a stopkodontól számítva 3’ irányban. Ez az oligonukleotid emellett olyan szekvenciákat is szolgáltat, amelyek ahhoz szükségesek, hogy egy KpnI restrikciós hasítási hely jöjjön létre egy GDNF expressziós plazmid készítésénél.
A humán-GDNF amplifikálásánál használatos reakciókörülmények az alábbiak: a reakciótérfogat összesen 100 pl, és 1 ng olyan lambda-klónt tartalmaz, amelyben benne van a humán-GDNF-gén, 20-20 pmol a PD3 és PD4 oligonukleotidokból, 20 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,8, 10 mmol/1 KC1, 6 mmol/1 ammónium-szulfát,
1,5 mmol/1 MgCl2, és 0,1% Triton X-100 összetételű oldatban. A reakcióelegyet 5 percre 95 °C-ra melegítjük, °C-ra hűtjük, majd 2 egység Pfu DNS polimerázt (Stratagene) adunk hozzá. A reakció 30 ciklusból áll:
°C 1,5 percig, 95 °C 1 percig, és 44 °C 1,5 percig.
A reakció végén MgCl2-t adunk hozzá 10 mmol/1 végkoncentrációban. 5 egység DNS-polimeráz I nagy (Klenow) fragmentet (Promega) adunk hozzá, és a reakcióelegyet 10 percig 37 °C-on inkubáljuk. Ezután 10 μΐ 3 mol/1 nátrium-acetátot és 220 μΐ etanolt adunk hozzá, majd az oldatot 15 percig 12 000 χ g-vel centrifugáljuk a DNS kicsapása céljából. A kicsapott DNS-t 100 μΐ 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8, 50 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 MgCl2, 20 egység BamHI és 20 egység KpNi összetételű oldatban szuszpendáljuk, majd 1 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. Agarózgélen végzett elektroforézis után egy megfelelő méretű DNS-ffagmen10 tét azonosítottunk és tisztítottunk egy Ultrafree-MC Filter Unittal (Millipore). Ezt a fragmentet egy Escherichia coli expressziós vektorba (pT3XI-2) ligáljuk (az alábbiakban ismertetjük). A ligálási körülmények az alábbiak: a reakcióelegy össztérfogata 5 μΐ, és tartal15 máz 10 ng pT3XI-2 DNS-t, amelyet KpnI és BamHI restrikciós enzimmel linearizáltunk, 5 ng az előzőkben ismertetett humán-GDNF DNS-fragmentet, 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,6, 10 mmol/1 MgCl2, 1 mmol/1 ATP, 1 mmol/1 DTT, 5% polietilénglikol-800 és 1 egység 20 T4 DNS ligáz (Bethesda Research Laboratories) összetételű oldatban. A reakciót 2 óra hosszat 14 °C-on inkubáljuk.
A pT3XI-2 vektort az alábbiak szerint állítjuk elő. Ehhez a konstrukcióhoz a kiindulási plazmidot, a 25 pKK223-3-at (Brosius and Holy, 1984) a Pharmaciától vásároljuk. A pKK223-3 plazmid egy részleges tetraciklinrezisztencia-gént tartalmaz. Ezt a nem működő gént helyettesítjük egy, a pBR322 plazmidban levő komplett tetraciklinrezisztencia-génnel. A pKK223-3 30 plazmidot teljesen megemésztjük Sphl enzimmel és részlegesen emésztjük BamHI enzimmel. Egy 4,4 kb méretű fragmentet gélen tisztítunk, majd egy szintetikus adapterrel kombináljuk (SEQ ID No. 23):
5’ GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT 3’
3’ _ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 5’
Bglll Clal valamint egy 539 bázispár méretű DNS-fragment- 40 tel, amely a pBR322 plazmid (PL Biochemicals, 274891-01) tetraciklinrezisztencia-génjének Clal, Sphl emésztményét tartalmazza. A keletkezett plazmid jele pCJl.
Ezután egy New England Biolabs-tól vásárolt Xhol 45 linkért építünk be a pCJl PvuII hasítási helyére, így hozzuk létre a pCJX-1 plazmidot. Ez az inszerció elrontja a ropgént, amely a plazmid kópiaszámát szabályozza. Ezután egy EcoRI fragmentet, amely a lacl gént tartalmazza, tisztítunk a pMC9 plazmidból [Calos et al. (1983)], majd Xhol restrikciós enzimmel beépítjük az EcoRI adapterek Xhol hasítási helyére. A pKK223-3 plazmid polilinker régióját azután egy olyan polilinkerrel helyettesítjük, amely további hasítási helyeket tartalmaz, EcoRI és PstI enzimekkel végzett hasítás után (SEQ ID NO. 24):
5’ AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA 3’ 3’ GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5’.
Az így kapott plazmidvektor jele pCJX-1. Végezetül, a tetraciklinrezisztencia-gént egy hasonló génnel helyettesítjük, amelyben felismerési helyek voltak találhatók a HindlII, BamHI és Sáli enzimek számára, de biszulfit mutagenezissel elroncsoltuk. Az alábbi eljárást használjuk a pBR322 tetraciklinrezisztencia génjének mutáltatására. A pBR322 plazmidot HindlII restrikciós enzimmel emésztjük, majd nátrium-biszulfittal mutagenizáljuk (Shortle and Botstein, 1983). A mutagenizált DNS-t ligáljuk, így kapunk egy cirkuláris DNS-t, majd HindlII-mal emésztjük, hogy minden olyan plazmidot linearizáljunk, amely elkerülte a mutagenezist. Escherichia coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985). Tetraciklinrezisztens plazmidokat izolálunk, és ellenőrizzük, hogy elveszett-e a HindlII hasí60 tási hely a tetraciklinrezisztencia-génből. A sikeresen
HU 220 795 Bl mutagenizált plazmid jele pTl. Hasonló eljárással mutagenizáljuk a BamHI hasítási helyet a pTl plazmidban, így kapjuk a pT2 plazmidot. A pT2 plazmidot azután mutagenizáljuk a Sáli hasítási hely eltávolítása céljából, így kapjuk a pT3 plazmidot. A pT3 plazmidnak egy Clal-StyI fragmentjét, amely a mutált tetraciklinrezisztencia-gént hordozza, izoláljuk, és arra használjuk, hogy a pCJX-1 homológ fragmentjét kicseréljük, így kapjuk a pT3XI-2 plazmidot. A mutált tetraciklinrezisztencia-gén még egy működőképes fehérjét kódol. A tac promoter régió mögé egy polilinkert építünk be, amely egyéb helyek mellett BamHI és KpnI restrikciós hasítási helyeket is tartalmaz, amelyeket arra lehet használni, hogy a géneket Escherichia coli-ban való expresszió céljából klónozzuk.
A vektort két óra hosszat ligáljuk az érett humánGDNF-konstrukcióval, majd 2 pl reakcióelegyet használunk az Eicurean Coli SURE szuperkompetens Escherichia coli transzformálására (Stratagene), a gyártó előírásai szerint. Az egyik rekombináns plazmid DNSszekvenciáját meghatározzuk a 2.B. példában leírtak alapján. A szekvencia megerősítette, hogy ez a plazmid tartalmazza teljes érett humán-GDNF-et kódolószekvenciát.
B. A humán-GDNF expressziója Escherichia coli-ban
A humán-GDNF-et kódoló DNS-szekvenciát hordozó plazmidot Escherichia coli JM107-fí-rMCB0005 törzsbe, a JM107 egy TI rezisztens variánsába [YanischPerron et al. (1985)] transzformáljuk, a Sambrook és munkatársai által leírt [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] CaCl2 módszer alkalmazásával. Az egyik rekombinánst 50 ml LB táptalajon [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] növesztjük 100 pg/ml ampicillin (Sigma) jelenlétében, éjszakán át 37 °C-on rázatva. A következő napon a tenyészetet 1:70 arányban hígítjuk LB táptalajban, amely 100 pg/ml ampicillint tartalmaz, és 5 óra hosszat 37 °C-on rázatjuk. A sejtekből 20 ml-t centrifugálással kinyerünk (centrifugálás 8000xg-vel tíz percig). Az üledéket 4 ml 10 mmol/1 EDTA-ban (pH=7,4) szuszpendáljuk. A sejteket French Press-sel táljuk fel (salmonella Instruments) 124105 hektopaszkál nyomáson. A lizátumot 12 000xg-vei centrifugáljuk 15 percig 4 °C-on. Az üledéket 10 mmol/1 EDTA-ban szuszpendáljuk. Kiderült, hogy viszonylag több GDNF akkumulálódik, ha hagyjuk, hogy a fermentáció 37 °C vagy 30 °C helyett 42 °C-on játszódjon le.
A jelenleg legelőnyösebbnek tartott módszer magas szintű GDNF-expresszióra Escherichia coli-ban, a 6.A. példában ismertetett rekombináns plazmid alkalmazásával (amelyben az érett humán-GDNF-et kódolószekvenciát a pT3XI-2 vektorba klónoztuk) az alábbiak szerint. Egy tízliteres fermentációhoz egy 500 ml-es inokulumot növesztünk LB táptalajban (pH=7), amely 15 pg/ml tetraciklint tartalmaz, 37 °C-on, egy kétliteres, torlóval ellátott rázott lombikban 2-3 közötti A600 optikai sűrűségig. Ezt a tenyészetet használjuk 10 liter szaporító táptalaj oltására, amelynek összetétele: 12 g/1 tripton, 24 g/1 élesztőkivonat, 25 g/1 glicerin, 1,3 g/1 K2HPO4, 0,4 g/1 KH2PO4, 0,1 ml 4:1 arányú keverék Macol 19 :GE60-ból, valamint 15 mg/1 tetraciklin-HCl. Ezt a tenyészetet szaporítjuk körülbelül 12-18 óra hosszat 42 °C-on körülbelül 12-20-as optikai sűrűségig (Α6θο). A fermentáció pH-ját 7,0-n tartjuk, és az oldott oxigént 30%-os telítésen tartjuk. A fermentáció után a tenyészetet 4 °C-ra hűtjük, majd a sejteket centrifugálással kinyerjük.
A humán-GDNF termelése az előzőkben ismertetett plazmidról nem specifikus erre az Escherichia colitörzsre, hanem előállítható bármely alkalmas törzsben is. A plazmidot két másik Escherichia coli-törzsbe is transzformáltuk, az Escherichia coli JM108-ba (Yanisch-Perron et al., 1985), valamint a SURE törzsbe (Stratagene). Mindkét említett törzsben egy új, megfelelő molekulasúlyú fehérjecsík tehető láthatóvá Coomassie Blue festéssel, poli(akril-amid) gélen végzett elektroforézis után.
A szuszpendált anyag egy aliquot részét poli(akrilamid) gélen elektroforetizáljuk. A gélt Coomassie Blue-val festjük. A várt, GDNF-nek megfelelő molekulasúlyú fehétje (15,000 Dalton) csak azokban a tenyészetekben található meg, amelyek a humán rekombináns GDNF-plazmidot tartalmazzák, azokban nem, amelyek csak a pT3XI-2 vektort tartalmazzák. A kinyert fehéijét standard N-terminális szekvenálási eljárásnak vetjük alá, és ennek a fehéijének az első 22 aminosava azonos a 19. ábrán bemutatott humán-GDNF aminosavszekvenciájával, megerősítve ezzel, hogy a humán-GDNF helyesen expresszálódik Escherichia coli-ban.
C. A baktériumok által termelt rekombináns humán-GDNF helyes térbeli szerkezetének kialakítása és biológiai aktivitása
Az anyagok előkészítése a helyes térszerkezet kialakításához
Az Escherichia coli JM107 transzformánst (pT3X12: :huGDNF) stacioner fázisig növesztjük 37 °C-on élesztőkivonat (#0127-01 Difco Laboratories, Detroit, MI) és tripton (#0123-05 Difco Laboratories, Detroit, MI) alapú komplex táptalajban növesztjük (24 g/1 élesztőkivonat, 12 g/1 tripton, 5 g/1 glicerin, 1,3 g/1 K2JPO4, 0,4 g/1 KH2PO4, 0,1 ml/1 Macol 19/GE60 (4:1), 15 mg/1 tetraciklin) IPTG indukció nélkül. A sejteket 16 OOOxg-vel centrifugáljuk JA10 rotorban 4 °C-on 20 percig, majd a sejtpasztát -20 °C-on tároljuk.
A sejteket az alábbiak szerint dolgozzuk fel: 5 g sejtpasztát homogenizálunk 40 ml 10 mmol/1 EDTA-val (pH=7,0) jégen, OCI Instruments homogenizátor felhasználásával. A kapott szuszpenziót French-presszel háromszor feltárjuk 137895 hektopaszkal nyomással, majd 30OOOxg-vel centrifugáljuk JA20 rotorban 1percig 4 °C-on. A felülúszót elöntjük, majd az üledéket homogenizáljuk, és az előzőkben leírt módon centrifugáljuk. Az egyik megvalósítási mód szerint a re-ext28
HU 220 795 Β1 rakcióból származó üledéket 40 ml 25 mmol/l TRISHC1 pH=7,4 pufferrel centrifugáljuk az előzőkben leírt módon, majd a felülúszót elöntjük. Az üledéket 20 ml 50 mmol/l TRIS-HC1 pH=8,0 pufferrel homogenizáljuk, amely 8 mol/1 karbamidot tartalmaz, 30 mmol/l βmerkapto-etanolt hozzáadva, illetve anélkül, majd az előzőkben leírt módon centrifugáljuk és a felülúszót megtartjuk. Ezt a felülúszót nevezzük TU-extraktnak. Az előnyös megvalósítási mód szerint az üledéket homogenizáljuk 40 ml 10 mmol/l TRIS-HC1 pH=8,0 pufferben, amely 1 mmol/l EDTA-t, 1% ΝΡ-40-et tartalmaz, az előzőkben leírt módon centrifugáljuk, és felülúszót elöntjük. Az üledéket szulfonilezéssel visszük oldatba az alábbiak szerint: az üledéket 25 ml 20 mmol/l nátrium-foszfát pH=7,4 pufferben homogenizáljuk, amely 8 mol/1 karbamidot, 100 mmol/l nátrium-szulfitot és 10 mmol/l nátrium-tetrationátot tartalmaz. A szulfonilezést 4 °C-on hagyjuk lejátszódni éjszakán át kevertetve, majd centrifugáljuk, 16 000 χ g-vel 10 percig 4 °C-on, az oldat tisztítása céljából.
A TU-kivonat részleges tisztítása a természetes térszerkezet kialakítása előtt
A TU-kivonatot részlegesen tisztítjuk ioncserélő kromatográfiával S-Sepharose Fást Flow gyantán (Pharmacia). Az oszlopot egyensúlyba hozzuk, majd szobahőmérsékleten futtatjuk 25 mmol/l TRIS-HC1 pH=7,4 pufferben, amely 8 mol/1 karbamidot és 30 mmol/l βmerkapto-etanolt tartalmaz (A puffer). A minta felvitele és A pufferrel az alapvonal optikai sűrűségének eléréséig folytatott mosása után az oszlopot 10% oszloptérfogat per perc sebességgel mossuk 5 oszloptérfogattal, a mosófolyadék összetétele A puffer és 100 mmol/l TRIS-HC1 pH=9,0, amely 8 mol/1 karbamidot 500 mmol/l NaCl-t és 30 mmol/l β-merkapto-etanolt tartalmaz (B puffer). Az oszlopfrakciókat 280 nm-en figyeljük, és SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézissel vizsgáljuk. A GDNF fő fehérjecsúcsként eluálódott a gradiens 60-70%-ánál. A GDNF-ben gazdag frakciókat egyesítjük a természetes térszerkezet kialakításához (25. ábra).
A szulfonilezett kivonat részleges tisztítása a természetes térszerkezet kialakítása előtt A szulfonilezett kivonatot ioncserélő kromatográfiával részlegesen tisztítjuk Q-Sepharose Fást Flow gyantán (Pharmacia). Az oszlopot egyensúlyba hozzuk, majd 4 °C-on 10 mmol/l TRIS-HC1 pH=8,0 pufferrel futtatjuk, amely 4 mol/1 karbamidot tartalmaz (A puffer). A minta felvitele és az A pufferrel alapvonal optikai sűrűségig való mosása után, az oszlopot percenként 5 százalék oszloptérfogat per perc sebességgel eluáljuk összesen 5-5 oszloptérfogatnyi A pufferrel, valamint TRIS-HC1 pH=8,0 pufferrel, amely 4 mol/1 karbamidot és 500 mmol/l NaCl-t tartalmaz (B puffer). Az oszlopfrakciókat 280 nm-en követjük és SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézissel elemezzük. A GDNF fő fehérjecsúcsként a gradiens 50%-nál eluálódik. A GDNF-ben gazdag frakciókat egyesítjük a természetes térszerkezet kialakítása céljából.
A részlegesen tisztított TU-kivonat természetes térszerkezetének kialakítása
A GDNF-nek, amelyet az előzőkben leírt módon részlegesen tisztítottunk, az alábbiak szerint alakítjuk ki a természetes térszerkezetét: 4 ml egyesített oszlopeluátumhoz, amely körülbelül 1 mg/ml koncentrációban tartalmazza a GDNF-et, 5 mmol/l ditiotreitolt adunk. A csövet lezátjuk, hogy kizárjuk a levegőt, majd 15 percig 25 °C-on tartjuk. Ezután oxidált dinátrium-glutation-sót adunk hozzá 15 mmol/l koncentrációban, a csövet ismét lezárjuk, hogy a levegőt kizárjuk, majd 15 percig 25 °C-on tartjuk. Ezt az oldatot azután 14 térfogat térszerkezet kialakító pufferben hígítjuk (100 mmol/l Na2HPO4; 10 mmol/l etanol-amin pH=8,3, amely 4 mol/1 karbamidot tartalmaz; 5% polietilénglikol 300; és 2 mmol/l cisztein), majd 3 napig argon alatt tartjuk 5 °C-on.
A részlegesen tisztított szulfonilezett kivonat természetes térszerkezetének kialakítása Az előzőkben leírt módon részlegesen tisztított
GDNF természetes térszerkezetét az alábbiak szerint alakítjuk ki: az egyesített körülbelül 3 mg/ml koncentrációban GDNF-et tartalmazó oszlopeluátumokat 19 térfogat térszerkezet-kialakító pufferrel hígítjuk (100 mmol/l Na2HPO4; 10 mmol/l etanol-amin pH=8,3, amely mol/1 karbamidot tartalmaz; 5% polietilénglikol 300; és 2 mmol/l cisztein), majd 3 napig argon alatt tartjuk °C-on.
A természetes térszerkezetűvé visszaalakított GDNF elemzése SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézissel A baktériumokból extrahált GDNF, ha előzőleg nem hozzuk érintkezésbe redukáló ágenssel, akkor monomerként vándorol SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézis során, látszólagos molekulasúly körülbelül 16 kDa, a molekulasúly standard fehéijék vándorlásához viszonyítva. Nincs kimutatható GDNF a dimer pozíciójában. Ha a GDNF-et redukálóágens hatásának tesszük ki (30-150 mmol/l β-merkapto-etanol), akár az extrakció során, akár éppen az SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézis előtt, de még a természetes térszerkezet kialakítása előtt, akkor egy olyan pozícióba vándorol, amely megkülönböztethetetlen a nem redukált fehéijétől, látszólagos molekulasúlya körülbelül 16 kDa (26. ábra, 6-os és 13-as sáv). Ez azt mutatja, hogy a baktériumsejtekből preparált GDNF nem dimerizálódik a természetes térszerkezet kialakítása előtt.
A természetes térszerkezetnek az előzőkben leírt módon való kialakítása után, a baktérium által termelt GDNF legnagyobb része a nem redukáló SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézis során látszólagos dimerként vándorol, molekulasúlya körülbelül 30 kDa (26. ábra, 2es sáv). Ha a természetes térszerkezetű GDNF-et az SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézis előtt 150 mmol/l β-merkapto-etanollal redukáljuk, akkor ismét a körülbelül 16 kDa méretű monomer pozíciójába vándorol (23. ábra, 5-ös sáv). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a GDNF természetes térszerkezetének kialakítása azt eredményezi, hogy a fehérje egy diszulfidhíddal
HU 220 795 BI összekötött dimer lesz. Természetes térszerkezetű GDNF-et redukció nélkül SDS-poli(akril-amid) gélelektroforézisnek vetjük alá, majd a gélt a minta futásának hosszában kivágjuk, a kivágott csíkot felszeleteljük, és vizsgáljuk, hogy van-e biológiai aktivitásuk a szimpatikus ganglionneuron túlélési vizsgálatban (lásd alább). Az egyetlen kimutatható aktivitás a dimer pozíciójában volt található, jelezve ezzel, hogy a dimer biológiailag aktív.
A természetes térszerkezetűvé alakított GDNF elemzése fordított fázisú HPLC-vel Az S-Sepharose vagy Q-Sepharose kromatográfiával részlegesen tisztított, de természetes térszerkezetűvé még nem alakított GDNF a fordított fázisú HPLC során, amint azt az alábbiakban bemutatjuk, körülbelül 21 perces retenciós idővel vándorol. A természetes térszerkezet kialakítása után a GDNF azonos körülmények között körülbelül 15 perces retenciós idővel vándorol. A retenciós idő eltolódása várható a GDNF térszerkezetének sikeres kialakításától. A fordított fázisú HPLC vizsgálatoknál a természetes térszerkezet sikeres kialakítása után gyakran látható, hogy a retenciós idő eltolódik.
Ezeknek a mintáknak a fordított fázisú HPLC vizsgálatát az alábbiak szerint végezzük: 1 ml/perc áramlási sebesség mellett: egy 0,46x25 cm-es C-4 oszlopot (Vydac #214TP54) fejlesztünk ki az alábbiak szerint: A oldat=0,1 %-os trifluor-ecetsav (TFA) vízben; B oldat=0,l% TFA acetonitrilben; 0,5-1,5 perc között a B oldat mennyiségét 5%-ról 25%-ra növeljük; 1,5-31,5 perc között a B oldat mennyiségét 25%-ról 55%-ra növeljük.
A természetes térszerkezetűvé alakított GDNF elemzése biológiai vizsgálatokkal A természetes térszerkezetűvé alakított GDNF biológiai vizsgálatát mind csirkeembrió (E10) szimpatikus ganglion neuron túlélési vizsgálatban (4.A. példa), mind a patkányembrió (El6) középagyi tenyészet dopaminfelvétel biológiai vizsgálatában (l.B. példa) vizsgáljuk. A természetes térszerkezet kialakítása előtt ha a GDNF-et 30 mmol/1 β-merkapto-etanol hatásának tesszük ki, és S-Sepharose- vagy Q-Sepharose-kromatográfiával tisztítjuk az előzőkben leírt módon, akkor nem mutat kimutatható biológiai aktivitást a középagyi tenyészet dopaminfelvételének vizsgálata során, és nagyon lecsökkent aktivitást mutat a szimpatikus neuron túlélési vizsgálatban. Az S-Sepharose-zal kromatografált anyag látszólagos ED50-értéke a szimpatikus neuron túlélési vizsgálatban körülbelül 1 pg/ml, ami körülbelül 333-szor alacsonyabb mint a természetes térszerkezetűvé alakított rhGDNF-é (lásd a továbbiakban). A Q-Sepharose-zal kromatografált anyag esetében a látszólagos ED50-érték a szimpatikus neuron túlélési vizsgálatban körülbelül 3 pg/ml, ami körülbelül 100-szor alacsonyabb, mint a természetes térszerkezetűvé alakított rhGDNF-é (lásd az alábbiakban). A természetes térszerkezet kialakítása után, β-merkapto-etanollal érintkezésbe hozva, vagy anélkül, mindkét biológiai vizsgálatban teljesen aktív (27-28. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy A GDNF-nek jelentős biológiai aktivitása lesz a természetes térszerkezet kialakításától, és azt is mutatják, hogy a természetes térszerkezet kialakítása előtti csökkent, vagy hiányzó biológiai aktivitás nem a β-merkapto-etanollal való érintkezés következménye.
A természetes térszerkezetűvé alakított rekombináns humán-GDNF (rhGDNF) ED50-értéke ezekben a biológiai vizsgálatokban hasonló a B49 sejt kondicionált táptalajból izolált patkány-GDNF-nél korábban megfigyelt ED50-értékhez. A szimpatikus neuron túlélési vizsgálatban az rhGDNF ED50-értéke körülbelül 3 ng/ml (27. ábra), a patkány-GDNF ED50-értéke pedig körülbelül 5 ng/ml volt. A középagyi tenyészet dopaminfelvételi vizsgálatában az rhGDNF ED50-értéke körülbelül 30 pg/ml (28. ábra), a patkány-GDNF-é pedig körülbelül 50 pg/ml. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az rhGDNF-nek egy jelentős része sikeresen felvette a természetes térszerkezetet, és biológiailag teljesen aktív lett.
7. példa
GDNF elleni antitestek termelése és izolálása
Az rhGDNF elleni antitesteket az alábbi eljárás szerint állítjuk elő. Az eljárásban hivatkozunk adjuvánsra, immunizációs protokollra és állatfajra, de nem korlátozzuk magunkat ezekre. Emellett a GDNF elleni antitesteket előállíthatjuk a természetes térszerkezetbe vitt, natív GDNF-fel, vagy a denaturált, inaktív fehérjével, amint azt az alábbi eljárásban ismertetjük, illetve a humán vagy állati eredetű GDNF folytonos peptidszakaszaival.
A monoklonális antitesteket a számos standard protokoll egyike szerint állíthatjuk elő [lásd Antibodies, a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1988); ISBN 087969-314-1, szerk. Ed Harlow and Dávid Lane], Röviden, egy ilyen, monoklonális antitestek előállítását célzó eljárás általában, de nem kizárólagosan, magában foglalja a megfelelő állat immunizálását és ezekben az állatokban az immunizáló protokoll hatására létrejövő immunválasz követését, az antitestet termelő sejtek immunizálását, amilyenek például a nyirokszervek egy vagy több reagáló állatban, ezeknek a sejteknek a fuzionáltatását egy megfelelő sejtvonallal, például mielómasejtekkel, hibridómák előállítása céljából, amelyek antitesteket szekretáló örökéletű sejtek, és hibridómák progresszív izolálását, ameddig egysejtes kiónokat kapunk, amelyek a keresett monoklonális antitesteket termelik.
A nyulakban poliklonális antitesteket az alábbiak szerint állítunk elő: Két ml steril sóoldatot, amely 0,005-0,25 mg rhGDNF-et tartalmaz, a RIBI adjuváns MPL-TDM-CWS emulzió (RIBI ImmunoChem Research, Inc.) egy tartóedényébe injektáljuk, majd vortexeljük, ameddig emulzió jön létre (az előállító előírásai szerint). Érzéstelenített New Zealand nőstény fehér nyulakat injekciózunk a RIBI által javasolt immunizációs protokollt követve. Egy ml adjuváns antigén emulziót az alábbiak szerint adunk be:
HU 220 795 Bl
0,30 ml intradermális (0,05 ml hat különböző helyre)
0,40 ml intramuszkuláris (0,20 ml a két hátsó lábba)
0,10 ml szubkután (nyaki régió)
0,20 ml intraperitonálisan.
Az állatokat minden 4-6. héten ugyanezzel a protokollal injekciózzuk, a folyamat fenntartása céljából. Az állatokból vért veszünk az első injekció előtt, és 10-14 nappal az egyes emlékeztető injekciók után, hogy vizsgáljuk az antitest termelődését, egy neutralizációs vizsgálattal vagy egy standard ELISA-val.
A neutralizációs vizsgálatot az alábbiak szerint hajtjuk végre, az E16 középagyi tenyészet felhasználásával. A nyúltesztszérumot Dulbecco-féle minimális esszenciális táptalajban hígítjuk, amely 25 mmol/1 HEPES-sel (pH=7,4) van pufferelve, és 5 mg/ml szarvasmarha-szérumalbumint tartalmaz (a továbbiakban BSA5 néven hivatkozunk rá). Ezután a vizsgálati bikákhoz adjuk 25 pl hígított tesztszérum 500 μΐ szövettenyésztő oldatához, majd 30 percig 37 °C-on inkubáljuk. Ezután 25 μΐ rhGDNF-et adunk hozzá rhGDNF-et tartalmazó 6,32 ng/ml koncentrációjú BSA5 hígított törzsoldatban, 0,316 ng/ml végkoncentrációban. A dopaminfelvételt nyolc nap elteltével métjük tenyészetben, az előzőkben leírt módon. A második emlékeztető injekció után kapott antiszérummal kapott eredményeket az alábbiakban mutatjuk be a neutralizációs vizsgálat során (lásd az alábbi 2. táblázatot).
2. táblázat
Nyúl sorszáma Antigén *Neut. ec50 +ELISA ECjq
1604 természetes konf. rhGDNF 20xl03 25xl03
2257 természetes konf. rhGDNF 12xl03 7x1ο3
2506 természetes konf. rhGDNF 2xl03 3χ103
9380 denaturált rhGDNF 2xl03 2X103
* a GDNF által serkentett dopaminfelvétel 50%-os semlegesítéséhez tartozó antiszérumhigitás + az ELISA-ban mért maximum (plató) jel 50%-ához tartozó antiszérumhigitás
Az antiszérumok GDNS antitest titerét egy standard ELISA-ban is meghatároztuk az alábbi eljárás alkalmazásával: Mikrotiter lemezeket (96 lukas, Nunc maxisorp) borítunk lukanként 100μ1 rhGDNF-fel 1,0 pg/ml 50 mol/1 nátrium-bikarbonát (pH=9,6) pufferben, éjszakán át 4 °C-on. A lemezeket négyszer mossuk lemezmosó pufferrel (PWB, foszfáttal puffereit sóoldat pH=7,2, 0,5% Tween 20-at tartalmaz), majd 2 óra hosszat blokkoljuk 25 °C-on 200 pl per luk 2%-os szarvasmarhaszérumalbuminnal, foszfáttal puffereit fiziológiai sóoldatban (pH=7,2). A lemezeket ismét mossuk PWB-vel, majd a szérummintákat, amelyeknek meg akatjuk határozni a titerét (100 pl 20%-os normál kecskeszérumban és PWB-ben hígítva), hozzáadjuk a lukakhoz. A lemezeket 1,5 óra hosszat inkubáljuk 35 °C-on, majd ismét mossuk PWB-vel. Az alkalikus foszfatázzal konjugált kecske anti-nyúl IgG-t (Jackson Immunochemicals) 1:2500 hígításban hozzáadjuk az egyes lukakhoz (100 pl), majd 1,5 óra hosszat 35 °C-on inkubáljuk. A lemezeket az előzőkben leírt módon PWB-vel mossuk. Ezután p-NPP-szubsztrátot (dinátrium-p-nitrofenil-foszfát; Sigma Cat. No. MP389) adunk az egyes lukakhoz (100 pl 1,0 mg/ml koncentrációjú p-NPP 10%os dietanol-aminban, pH=9,8), majd a lemezt 25 °C-on inkubáljuk. A szín kifejlődését a lemezek 405-490 nmen való leolvasásával követjük, egy lemezleolvasóval (Molecular Devices Enax).
Az antiszérumokat arra is használjuk, hogy a GDNF-et kimutassuk és mennyiségileg meghatározzuk Western blottal, az alábbiak szerint: SDS-poli(akrilamid) gélelektroforézist végzünk az U. K. Laemmli által leírt alapvető eljárás szerint [Laemmli, Natúré, 227, 680-685 (1970)], egy 12,5%-os akril-amid elválasztó gélt és 4,5%-os akril-amid felvivő gélt használva. A géleket (16x14x0,15 cm) elektroforetizáljuk 40 mA állandó áramerősséggel, 3 óra hosszat. A redukcióhoz/denaturáláshoz a mintákat 100 °C-on 10 percig mintafelvivő pufferben melegítjük, amely 1% SDS-t és 150 mmol/1 β-merkapto-etanolt tartalmaz.
A Westem-blotoláshoz a gélt azután Immobilon-P membránra visszük (Millipore Cat. No. IPVH 151 50) 80 mA állandó áramerősséggel, 16 óra alatt, 25 mmol/1 TRIS bázis, 192 mmol/1 glicin, 0,1% SDS és 20% metanol összetételű oldatban, és az alábbiak szerint dolgozzuk fel:
1. A membránt egy óra hosszat blokkoljuk 25 °C-on blokkolópufferben (10 mmol/1 TRIS, pH=7,4; 150 mmol/1 NaCl; 0,05% Tween 20; 4% fölözött tej; és 0,02% nátrium-azid), enyhe rázatás közben.
2. A membránt azután 25 °C-on 2 óra hosszat inkubáljuk enyhe rázatás közben blokkolópufferben, amely hígított primer GDNF elleni antiszérumot tartalmaz.
3. A membránt mossuk (4 ötperces mosás) blokkolópufferben.
4. A membránt ezután 25 °C-on 2 óra hosszat inkubáljuk enyhe rázatás közben blokkolópufferben, amely hígított szekunder antitesteket tartalmaz (alkalikus foszfatázzal konjugált affinitástisztított kecske anti-nyúl IgG; Cappel Cat. No., 59299).
5. A membránt mossuk (4 ötperces mosás) blokkoló pufferrel, amely nem tartalmaz fölözött tejet.
6. A membránt 50 ml előhívópufferben kifejlesztjük (összetétele 100 mmol/1 TRIS-HC1 pH=9,5, 100 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 MgCl2), 165 pl NBT-vel és 83 pl BCIP-vel (Promega kit Cat No. P3771) 25 °C-on enyhe rázatás közben, ameddig a keresett festődést elérjük).
8. példa
GDNF-et szekretáló membránba zárt sejtek készítése és betegekbe való beépítése A GDNF-et szekretáló sejteket félig áteresztő membránokba zárhatjuk, hogy idegsérülésben szenvedő bete31
HU 220 795 Bl gekbe juttassuk be. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a beteg Parkinson-kórban szenved, és a GDNF-et szekretáló sejteket a beteg striátumába juttatjuk be, hogy a dopaminerg-sejttesteket GDNF-fel lássuk el.
A találmány egy megvalósítási módja szerint a 5 GDNF szekretálására megváltoztatott sejteket - azaz azokat, amelyeket az előző, 5. és 6. példában ismertettünk - biológiailag kompatibilis, beépíthető és kivehető polimerburokba viszünk. Ezeket a burkokat úgy tervezhetjük, hogy lehetővé tegyék a szekretálódó GDNF 10 bejutását a beépített sejteket körülvevő szövetekbe, miA SZEKVENCIÁK FELSOROLÁSA
KL 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris FRAGMENSTÍPUS: N-terminális fragmens
AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA közben megakadályozzák, hogy a környező szövetekből olyan faktorok jussanak el a sejtekhez, amelyek károsak a sejtekre.
Azokat a sejteket, amelyeket úgy változtattunk meg, hogy GDNF-et szekretáljanak, félig áteresztő membránokba zárhatunk, a WO 91/10425 számú PCT bejelentésben leírt módszerre, amely a Cell Capsule Extrusion Systems névre hallgat. A membránba zárt sejteket a striátumba építhetjük be, standard sebészeti eljárások alkalmazásával. Az alábbiakban ismertetjük a különböző szekvenciákat.
Ser Pro Asp Lys Gin Alá Alá Alá Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Xaa 16
10 15
Gin Alá Alá Alá Alá Ser Pro Asp Asn 20 25
A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 13 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris FRAGMENSTÍPUS: belső fragmens
A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asp Xaa Ile Leu Lys Asn Leu Gly Arg Val Arg Arg Leu
A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 890 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: patkány-GDNF-et kódoló nukleinsavszekvencia A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCCCCGGGCT GCAGGAATTC GGGG GTC TAC GGA GAC CGG ATC CGA GGT GCC GCC 44
Val Tyr Gly Asp Arg Ile Arg Gly Alá Alá
-90 -85
GCC Al a GGA CGG GAC Gly Arg Asp -80 TCT Ser AAG ATG AAG TTA TGG GAT GTC GTG Val GCT Al a -70 GTC Val TGC Cy s
Lys Me t Lys Leu -75 Trp As p Val
CTG GTG TTG CTG CAC ACC GCG TCT GCC TTC CCG CTG CCC GCC GGT AAG
Leu Va 1 Leu Leu Hi s Thr Al a Ser Alá Phe Pro Leu Pro Al a Gly Lys
-65 -60 -55
HU 220 795 Bl
AGG CTT CTC GAA GCG CCC GCC GAA GAC CAC TCC CTC GGC CAC CGC CGC 188
Arg Leu Leu Glu Alá Pro Alá Glu Asp His Ser Leu Gly His Arg Arg
-50 -45 -40
GTG Val -35 CCC Pro TTC Phe GCG Alá CTG ACC AGT GAC TCC AAT ATG CCC GAA GAT TAT Tyr CCT Pro -20 236
Leu Thr -30 Ser As p Ser Asn Me t -25 Pro Glu As p
GAC CAG TTT GAT GAC GTC ATG GAT TTT ATT CAA GCC ACC ATC AAA AGA 284
Asp Gin Phe Asp Asp -15 Val Me t As p Phe Ile -10 Gin Al a Thr Ile Ly s -5 Arg
CTG AAA AGG TCA CCA GAT AAA CAA GCG GCG GCA CTT CCT CGA AGA GAG 352
Leu Ly s Arg Ser 1 Pro As p Ly s Gin 5 Al a Al a Al a Leu Pro 10 Arg Arg Glu
AGG AAC CGG CAA GCT GCA GCT GCC AGC CCA GAG AAT TCC AGA GGG AAA 380
Arg Asn 15 Arg Gin Al a Al a Al a 20 Al a Ser Pro Glu Asn 25 Ser Arg Gly Lys
GGT CGC AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAT CGG GGG TGC GTC TTA ACT GCA 428
Gly 30 Arg Arg Gly Gin Arg 35 Gly Ly s Asn Arg Gl y 40 Cy s Val Leu Thr Al a 45
ATA CAC TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT TTG GGC TAC GAA ACC AAG GAG 476
Ile Hi s Leu Asn Val 50 Thr As p Leu Gly Leu 55 Gly Tyr Glu Thr Lys 60 Glu
GAA CTG ATC TTT CGA TAT TGT AGC GGT TCC TGT GAA GCG GCC GAG ACA 524
Glu Leu Ile Phe 65 Arg Tyr Cys Ser Gly 70 Ser Cy s Glu Al a Al a 75 Glu Thr
ATG TAC GAC AAA ATA CTA AAA AAT CTG TCT CGA AGT AGA AGG CTA ACA 572
Me t Tyr Asp 80 Lys Ile Leu Lys Asn 85 Leu Ser Arg Ser Arg 90 Arg Leu Thr
AGT GAC AAG GTA GGC CAG GCA TGT TGC AGG CCG GTC GCC TTC GAC GAC 620
Ser As p 95 Lys Val Gly Gin Alá 100 Cy s Cy s Arg Pro Val 105 Al a Phe As p Asp
GAC CTG TCG TTT TTA GAC GAC AGC CTG GTT TAC CAT ATC CTA AGA AAG 668
Asp 110 Leu Ser Phe Leu As p 115 Asp Ser Leu Va 1 Tyr 120 Hi s Ile Leu Arg Lys 125
CAT Hi s TCC Ser GCT Al a AAA Lys CGG Arg TGT Cys GGA Gly TGT Cy s ATC Ile TGA CCCTGGCTCC AGAGACTGCT 718
130
GTGTATTGCA TTCCTGCTAC ACTGCGAAGA AAGGGACCAA GGTTCCCAGG AAATATTTGC 778
CCAGAAAGGA AGATAAGGAC CAAGAAGGCA GAGGCAGAGG CGGAAGAAGA AGAAGAAAAG 830
AAGGACGAAG GCAGCCATCT GTGGGAGCCT GTAGAAGGAG GCCCAGCTAC AG 882
A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 134 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris
HU 220 795 Bl
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: az érett patkány-GDNF kikövetkeztetett aminosavsorrendje A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser 1 Pro Asp Lys Gin 5 Al a Al a Al a Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg
10 15
Gin Al a Al a Al a Al a Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg
20 25 30
Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Al a Ile Hi s Leu
35 40 45
Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile
50 55 60
Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Al a Al a Glu Thr Me t Tyr As p
65 70 75 80
Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys
85 90 95
Val Gly Gin Alá Cys Cys Arg Pro Val Al a Phe Asp Asp Asp Leu Ser
100 105 110
Phe Leu Asp Asp Ser Leu Val Tyr Hi s Ile Leu Arg Lys Hi s Ser Al a
115 120 125
Lys Arg Cys Gly Cy s Ile
130
Az 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 562 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: humán-GDNF-et kódoló nukleinsavszekvencia A 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATTTTCTCTT TTCTTTTTGA ACAGCA AAT ATG CCA GAG GAT TAT CCT GAT CAG 5
Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gin
TTC GAT GAT GTC ATG Me t GAT Asp TTT Phe ATT CAA GCC ACC ATT AAA AGA CTG Leu AAA Lys 101
Phe Asp Asp Val Ile Gin Al a Thr Ile Lys Arg
AGG TCA CCA GAT AAA CAA ATG GCA GTG CTT CCT AGA AGA GAG CGG AAT 149
Arg Ser 1 Pro Asp Ly s Gin 5 Me t Al a Val Leu Pro 10 Arg Arg Glu Arg Asn 15
CGG CAG GCT GCA GCT GCC AAC CCA GAG AAT TCC AGA GGA AAA GGT CGG 197
Arg Gin Al a Al a Al a 20 Al a Asn Pro Glu Asn 25 Ser Arg Gly Ly s Gly 30 Arg
AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAC CGG GGT TGT GTC TTA ACT GCA ATA CAT 245
Arg Gly Gin Arg 35 Gly Lys Asn Arg Gly 40 Cys Val Leu Thr Al a 45 Ile Hi s
TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT CTG GGC TAT GAA ACC AAG GAG GAA CTG 293
Leu Asn Val 50 Thr As p Leu Gly Leu 55 Gly Tyr Glu Thr Ly s 60 Glu Glu Leu
ATT TTT AGG TAC TGC AGC GGC TCT TGC GAT GCA GCT GAG ACA ACG TAC 341
Ile Phe 65 Arg Tyr Cys Ser Gly 70 Ser Cys Asp Al a Al a 75 Glu Thr Thr Tyr
HU 220 795 Bl
389
GAC AAA ATA TTG AAA Lys AAC Asn 85 TTA TCC AGA AAT AGA AGG CTG GTG ACT GAC
Asp 80 Ly s Ile Leu Leu Ser Arg Asn Arg Arg 90 Leu Val Ser Asp 95
AAA GTA GGG CAG GCA TGT TGC AGA CCC ATC GCC TTT GAT GAT GAC CTG
Lys Val Gly Gin Al a Cys Cys Arg Pro Ile Alá Phe Asp Asp Asp Leu
100 105 110
TCG TTT TTA GAT GAT AAC CTG GTT TAC CAT ATT CTA AGA AAG CAT TCC
Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys Hi s Ser
115 120 125
GCT AAA AGG TGT GGA TGT ATC TGA CTCCGGCTCC AGAGACTGCT GTGTATTGCA
Al a Lys Arg Cy s Gly Cys Ile
130
437
485
539
TTCCTGCTAC AGTGCAAAGA AAG
A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 134 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: az érett humán-GDNF kikövetkeztetett aminosavsorrendje A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
562
Ser 1 Pro As p Lys Gin 5 Me t Al a Val Leu Pro 10 Arg Arg Glu Arg Asn 15 Arg
Gin Al a Al a Al a 20 Al a Asn Pro Glu Asn 25 Ser Arg Gly Lys Gly 30 Arg Arg
Gly Gin Arg 35 Gly Lys Asn Arg Gly 40 Cys Val Leu Thr Al a 45 Ile Hi s Leu
Asn Val 50 Thr Asp Leu Gly Leu 55 Gly Tyr Glu Thr Lys 60 Glu Glu Leu Ile
Phe 65 Arg Tyr Cys Ser Gly 70 Ser Cys Asp Al a Al a 75 Glu Thr Thr Tyr Asp 80
Lys Ile Leu Lys Asn 85 Leu Ser Arg Asn Arg 90 Arg Leu Val Ser As p 95 Lys
Val Gly Gin Al a 100 Cys Cys Arg Pro Ile 105 Al a Phe Asp As p Asp 110 Leu Ser
Phe Leu Asp 115 Asp As n Leu Val Tyr 120 Hi s Ile Leu Arg Lys 125 Hi s Ser Al a
Lys Arg Cys Gly Cys Ile 130
A 7. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
HU 220 795 Bl
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: oligonukleotid hibridizációs próba
EGYÉB INFORMÁCIÓ: a 3., 15. és 18. pozícióbanN jelentése: inozin
A 7. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCNGAYAARC ARGCNGCNGC
A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 223 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: humán-GDNF-et kódoló nukleinsavszekvencia A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTCTCTCCCC CACCTCCCGC CTGCCCGCGC A GGT GCC GCC GCG GGA CGG GAC TTT 5 5
Gly Alá Alá Alá Gly Arg Asp Phe
AAG ATG Ly s Me t AAG TTA TGG GAT Asp 5 GTC Val GTG GCT GTC TGC CTG GTG CTG CTC CAC 103
Lys Leu Trp Val Al a Val Cy s 10 Leu Val Leu Leu Hi s 15
1
ACC GCG TCC GCC TTC CCG CTG CCC GCC GGT AAG AGG CCT CCC GAG GCG 151
Thr Al a Ser Al a Phe 20 Pro Leu Pro Al a Gly 25 Lys Arg Pro Pro Glu 30 Al a
CCC GCC GAA GAC CGC TCC CTC GGC CGC CGC CGC GCG CCC TTC GCG CTG 199
Pro Al a Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Al a Pro Phe Alá Leu
40 45
AGC AGT GAC TGTAAGAACC GTTCC 223
Ser Ser Asp
A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 12 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: kapcsoló oligonukleotid („linker”)
A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCCGAATTCG GG
A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 7 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Pro Asp Lys Gin Alá Alá Alá
HU 220 795 BI
All. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 33 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: apBluescript-SK-76.1-ből származó szekvenciarészlet All. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GAG AGG AAC CGG CAA GCT GCW GMW GYM WGM CCW 3 3
A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 11 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Glu Arg Asn Arg Gin Alá Alá Alá Alá Ser Pro
A 13. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: DHD-26-jelű oligonukleotid
EGYÉB INFORMÁCIÓ: a 9. és 12. pozícióbanN jelentése: inozin
A 13. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ARRTTYTTNA RNATYTTRTC 20
A 14. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 7 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 14. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu
A 15. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: PDl-jelű láncindító oligonukleotid A 15. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GACGGGACTC TAAGATG
A 16. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav
HU 220 795 Β1
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: DHD23-jelű láncindító oligonukleotid EGYÉB INFORMÁCIÓ: a 3., 6. és 18. pozícióban N jelentése: inozin
A 16. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCNGCNGCYT GYTTRTCNGG
A 17. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: LF2-jelű láncindító oligonukleotid A 17. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGAGACAATG TACGACA
A 18. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: PD2-jelű láncindító oligonukleotid A 18. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTCTGGAGCC AGGGTCA
A 19. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 26 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: PDl-jelű láncindító oligonukleotid A 19. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCCGAATTCG ACGGGACTCT AAGATG 26
A 20. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: LFA-jelú láncindító oligonukleotid A 20. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGGTGGCCAG AGGGAGTGGT CTTC
HU 220 795 Bl
A 21. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 46 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: PD3-jelű láncindító oligonukleotid A 21. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCGGATCCA ATAAGGAGGA AAAAAAATGT CACCAGATAA ACAAAT 46
A 22. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 26 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: PD4-jelű láncindító oligonukleotid A 22. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCGGTACCC AGTCTCTGGA GCCGGA 26
A 23. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 33 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kétszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: adapter fragmens apCJl-plazmidhoz A 23. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATCTAGAAT TGTCATGTTT GACAGCTTAT CAT 33
A 24. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 37 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kétszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: polilinkerszekvenciaapCJXl-l-plazmidhoz A 24. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA 37

Claims (47)

1. Tisztított és izolált, gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérje, azzal jellemezve, hogy a 4. vagy a 6. azonosítószámon megadott szekvenciával azonos aminosavszekvenciát vagy egy, a 4. vagy a 6. azonosítószámon megadott szekvenciával legalább 70%-ban homológ aminosavszekvenciát tartalmaz, és képes dopaminergneuronokban dopaminfelvételt elősegíteni.
2. Az 1. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy a 4. vagy a 6. azonosítószámon megadott szekvenciával legalább 80%-ban homológ aminosavszekvenciát tartalmaz.
3. Az 1. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy a 6. azonosítószámon megadott aminosavszekvenciát tartalmaz.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy glikozilált.
HU 220 795 Bl
5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy nem glikozilált.
6. Az 1-3. vagy 5. igénypontok bármelyike szerinti fehéqe, azzal jellemezve, hogy aminoterminálisán metionin-aminosavat hordozó aminosavszekvenciát tartalmaz.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti fehéqe, azzal jellemezve, hogy rekombináns technológiával lett előállítva.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy egy vagy több polimer molekularész hozzákapcsolásával módosított.
9. A 8. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy polimer molekularészként polietilénglikol hozzákapcsolásával módosított.
10. Nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerint meghatározott gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjét kódol.
11. Dopaminergneuronokban dopaminfelvételt elősegíteni képes, gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjét kódoló tisztított és izolált nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy
a) a 3. azonosítószámon megadott nukleotidszekvencia 304-705 nukleotidjait vagy az 5. azonosítószámon megadott nukleotidszekvencia 105-506. nukleotidjait tartalmazza; vagy
b) a 4. vagy 6. azonosítószámon megadott aminosavszekvenciát tartalmazó fehéqét kódol, vagy
c) a 4. vagy a 6. azonosítószámon megadott szekvenciával legalább 70%-ban homológ aminosavszekvenciát tartalmazó fehéqét kódol, amely fehéqe képes dopaminergneuronokban dopaminfelvételt elősegíteni; vagy
d) 10., 4. vagy 6. azonosítószámon megadott aminosavszekvenciát kódoló oligonukleotidpróbával komplementer nukleinsavszekvenciával hibridizál.
12. Vektor, azzal jellemezve, hogy a 10. vagy 11. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát és ahhoz működőképesen kapcsolt expressziós szabályozóelemeket tartalmaz.
13. Transzformált vagy transzfektált gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
14. A 13. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy emlőssejt vagy mikroorganizmus.
15. A 14. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy COS-7-sejt vagy E. coli-sejt.
16. A13-15. igénypontok bármelyike szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy alkalmas emberbe történő beültetésre, és gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktort szekretál.
17. A 16. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy ex vivő transzformált vagy transzfektált.
18. A 16. vagy 17. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy emberbe történő beültetésre alkalmas, félig áteresztő membránba bezárt.
19. Transzformált vagy transzfektált gazdasejt, azzal jellemezve, hogy 1-6. igénypontok bármelyike szerinti fehéqét expresszál.
20. Eljárás gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktor előállítására, azzal jellemezve, hogy
i) 13-15 igénypontok bármelyike szerinti gazdasejtet gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktornak a gazdasejt általi expresszálására alkalmas körülmények között tenyésztünk; és ii) adott esetben izoláljuk a gazdasejt által expresszált, gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktort.
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izolált gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktor természetes térszerkezetét helyreállítjuk.
22. Gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktor, azzal jellemezve, hogy a 20. vagy 21. igénypont szerinti eljárással előállított, és az alkalmazott gazdasejtek által poszttranszlációsan módosított.
23. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy 1-9. vagy 22. igénypontok bármelyike szerinti neurotróf fehéqét, vagy a 20. vagy 21. igénypont szerinti eljárással előállított neurotróf fehéqét tartalmaz.
24. A 23. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy idegsejtek károsodásának, megbetegedésének vagy rendellenes működésének kezelésére vagy megelőzésére szolgál.
25. A 24. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy Parkinson-kór megelőzésére vagy kezelésére szolgál.
26. A 24. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy Alzheimer-kór megelőzésére vagy kezelésére szolgál.
27. A 24. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy izomsorvadással járó lateralsclerosis megelőzésére vagy kezelésére szolgál.
28. A 24. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy fizikai sérülés, ischaemia, neurotoxinokkal történt érintkezés, krónikus anyagcserebetegség vagy neurodegeneratív betegség következtében létrejött idegsejt-károsodás vagy -betegség megelőzésére vagy kezelésére szolgál.
29. A 28. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy roham, diabéteszes polineuropátia vagy terápiás hatóanyag által okozott toxikus neuropátia következtében létrejött idegsejt-károsodás megelőzésére vagy kezelésére szolgál.
30. 4. vagy 6. azonosítószámon megadott aminosavszekvenciát tartalmazó, gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérje elleni antitest.
31. A 30. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitest.
32. A 3. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy poliklonális antitest.
33. Berendezés idegkárosodás kezelésére, azzal jellemezve, hogy
a) gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehéqével szemben permeábilis és a sejtekre káros anyagokkal szemben nem permeábilis, beültetésre alkalmas membránt és
b) gliasejtvonal-eredetű, 1. igénypont szerinti fehéqét tartalmazó neurotróf faktorfehéqét expresszáló és szekretáló, membránban kapszulázott, rekombinánsan módosított sejteket tartalmaz.
34. A 33. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a szekretált gliasejtvonal-eredetű neuro40
HU 220 795 Β1 tróf faktor a 6. azonosítószámon megadott aminosavszekvenciát tartalmaz.
35. A 33. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy olyan sejteket tartalmaz, amelyek a 10. vagy 11. igénypontokban definiált nukleinsavszekvencia felhasználásával módosítottak, és ezáltal gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktort képesek szekretálni.
36. Antitesttermelő sejteknek megfelelő sejtvonallal való fuzionáltatásával kapott hibridóma, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestet termel, amely a 4. vagy 6. azonosítószámon megadott aminosavszekvenciát tartalmazó, gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorhoz kötődik.
37. Eljárás gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktor kimutatására vagy kvantitatív mérésére, azzal jellemezve, hogy a faktort a 4. vagy 6. azonosítószámon megadott aminosavszekvenciához specifikusan kötődő antitesttel érintkeztetjük.
38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként monoklonális antitesttel érintkeztetjük a faktort.
39. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként poliklonális antitesttel érintkeztetjük a faktort.
40. Eljárás gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktor izolálására, azzal jellemezve, hogy a faktort az 1. igénypont szerinti fehéréhez specifikusan kötődő antitesttel érintkeztetjük.
41. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként monoklonális antitesttel érintkeztetjük a faktort.
42. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként poliklonális antitesttel érintkeztetjük a faktort.
43. Berendezés páciensbe történő beültetésre, azzal jellemezve, hogy
a) gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjével szemben permeábilis és a sejtekre káros anyagokkal szemben nem permeábilis membránt és
b) gliasejtvonal-eredetű, a 4. vagy 6. azonosítószámon megadott aminosavszekvenciát tartalmazó neurotróf faktort expresszáló és szekretáló, B49-glioblasztómasejtektől különböző sejteket tartalmaz.
44. Eljárás gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktor előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) a fehéije expresszáltatására alkalmas körülmények között gliasejtvonal-eredetű, a 4. vagy 6. azonosítószámon megadott aminosavszekvenciát tartalmazó neurotróf faktorfehérjét kódoló, működőképesen natívtól különböző promoterhez kapcsolt nukleinsavszekvenciát tartalmazó transzformált vagy transzfektált gazdasejtet tenyésztünk, és
b) az expresszáltatott fehéijét, amely képes dopaminergneuronokban dopaminfelvételt elősegíteni, lényegében tisztított formában izoláljuk a gazdasejt tenyészetéből.
45. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expresszáltatott gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérje természetes térszerkezetét helyreállítjuk, és ezáltal abból diszulfidhíddal összekötött dimert hozunk létre.
46. Gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjét kódoló nukleinsavszekvenciát expresszáló transzformált vagy transzfektált gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavszekvencia a 4. vagy 6. azonosítószámon megadott aminosavszekvenciával legalább 70%-ban homológ aminosavszekvenciát tartalmazó, dopaminergneuronokban dopaminfelvételt elősegíteni képes fehéijét kódol, és működőképesen natívtól különböző promoterhez van kapcsolva.
47. A 46. igénypont szerinti, gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehéijét kódoló nukleinsavszekvenciát expresszáló transzformált vagy transzfektált gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavszekvencia a 4. vagy 6. azonosítószámon megadott aminosavszekvenciát tartalmazó, dopaminergneuronokban dopaminfelvételt elősegíteni képes fehéijét kódol, és működőképesen natívtól különböző promoterhez van kapcsolva.
HU9400717A 1991-09-20 1992-09-17 Gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjék, továbbá berendezések és gyógyászati készítmények idegsejtkárosodás megelőzésére és kezelésére HU220795B1 (hu)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76468591A 1991-09-20 1991-09-20
US77410991A 1991-10-08 1991-10-08
US78842391A 1991-11-06 1991-11-06
US85541392A 1992-03-19 1992-03-19
PCT/US1992/007888 WO1993006116A1 (en) 1991-09-20 1992-09-17 Glial derived neurotrophic factor

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9400717D0 HU9400717D0 (en) 1994-06-28
HUT66137A HUT66137A (en) 1994-09-28
HU220795B1 true HU220795B1 (hu) 2002-05-28

Family

ID=27505700

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400717A HU220795B1 (hu) 1991-09-20 1992-09-17 Gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjék, továbbá berendezések és gyógyászati készítmények idegsejtkárosodás megelőzésére és kezelésére
HU95P/P00478P HU211984A9 (en) 1991-09-20 1995-06-28 Neuroglial derived neurothrophic factors

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU95P/P00478P HU211984A9 (en) 1991-09-20 1995-06-28 Neuroglial derived neurothrophic factors

Country Status (21)

Country Link
US (7) US7226758B1 (hu)
EP (2) EP0610254B1 (hu)
KR (1) KR100242093B1 (hu)
AT (1) ATE275197T1 (hu)
AU (2) AU679167B2 (hu)
CA (1) CA2119463C (hu)
DE (1) DE69233407T2 (hu)
DK (1) DK0610254T3 (hu)
ES (1) ES2225819T3 (hu)
FI (1) FI117556B (hu)
GE (1) GEP20002243B (hu)
HK (2) HK1017816A1 (hu)
HU (2) HU220795B1 (hu)
IL (5) IL103223A (hu)
MX (1) MX9205293A (hu)
NO (1) NO321382B1 (hu)
NZ (1) NZ244392A (hu)
PT (1) PT100879B (hu)
SG (1) SG48145A1 (hu)
TW (1) TW401422B (hu)
WO (1) WO1993006116A1 (hu)

Families Citing this family (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5981165A (en) * 1991-07-08 1999-11-09 Neurospheres Holdings Ltd. In vitro induction of dopaminergic cells
CA2170751A1 (en) * 1993-09-01 1995-03-09 Timothy J. Cunningham Neuron regulatory factor for promoting neuron survival
WO1995017203A1 (en) * 1993-12-22 1995-06-29 The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Novel nucleic acid sequences isolated from glial cells
WO1995029237A1 (en) * 1994-04-25 1995-11-02 Genentech, Inc. Cardiotrophin and uses therefor
US7258983B2 (en) 1994-04-25 2007-08-21 Genentech, Inc. Cardiotrophin-1 compositions and methods for the treatment of tumor
US5534615A (en) * 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US6472585B1 (en) 1994-04-25 2002-10-29 Genentech, Inc. Cardiotrophin-1 defective mouse
US5853385A (en) * 1994-08-26 1998-12-29 Cytotherapeutics, Inc. Encapsulated PC12 cell transplants for treatment of Parkinson's disease
US5733875A (en) * 1994-11-15 1998-03-31 Amgen Inc. Methods of using GDNF as a neuroprotective agent
JP3093974B2 (ja) * 1995-06-27 2000-10-03 住友ベークライト株式会社 神経細胞用培養液、その製造方法及びこれを用いる神経細胞の培養方法
US6743628B1 (en) 1995-08-28 2004-06-01 Washington University Method of cell culture using neurturin
US5739307A (en) * 1995-08-28 1998-04-14 Washington University Polynucleotide encoding neurturin neurotrophic factor
US6184200B1 (en) 1995-09-28 2001-02-06 Amgen Inc. Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor
US5731284A (en) * 1995-09-28 1998-03-24 Amgen Inc. Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US5641749A (en) * 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Method for treating retinal ganglion cell injury using glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF) protein product
WO1997019693A1 (en) * 1995-11-29 1997-06-05 Amgen Inc. Method for treating sensory neuropathy using glial cell line-derived neurotrophic factor (gdnf) protein product
US5641750A (en) * 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Methods for treating photoreceptors using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US5905027A (en) * 1995-12-27 1999-05-18 Uab Research Foundation Method of diagnosing and treating gliomas
US5929041A (en) * 1996-02-23 1999-07-27 Amgen Inc. Method for preventing and treating sensorineural hearing loss and vestibular disorders using glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF) protein product
US5837681A (en) * 1996-02-23 1998-11-17 Amgen Inc. Method for treating sensorineural hearing loss using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US6222022B1 (en) 1996-03-14 2001-04-24 Washington University Persephin and related growth factors
WO1997033912A2 (en) 1996-03-14 1997-09-18 Genentech, Inc. Uses of gdnf and gdnf receptor
AU716846B2 (en) 1996-03-14 2000-03-09 Washington University Persephin and related growth factors
US6716600B1 (en) 1996-03-14 2004-04-06 Washington University Persephin and related growth factors
US5741778A (en) * 1996-03-19 1998-04-21 Amgen Inc. Method for treating Huntington's disease using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US6299895B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Neurotech S.A. Device and method for treating ophthalmic diseases
US7138251B1 (en) 1996-04-22 2006-11-21 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a neurotrophic factor receptor
US6455277B1 (en) 1996-04-22 2002-09-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor polypeptides
WO1997039629A1 (en) * 1996-04-25 1997-10-30 Genetic Therapy, Inc. Viral vectors including polynucleotides encoding neurotrophic factors and uses therefor
CA2262884C (en) * 1996-07-29 2004-06-08 Biopharm Gmbh Egf-like factor from chromaffin granules and glia cell-derived neurotrophic factor with survival-promoting activity on daergic neurons
AU6020998A (en) * 1997-01-08 1998-08-03 Life Technologies, Inc. Methods for production of proteins
US6372453B1 (en) 1997-02-18 2002-04-16 Genetech, Inc. Neurturin receptor
US6777196B2 (en) 1997-02-18 2004-08-17 Genentech, Inc. Neurturin receptor
US6025157A (en) 1997-02-18 2000-02-15 Genentech, Inc. Neurturin receptor
US6042579A (en) * 1997-04-30 2000-03-28 Medtronic, Inc. Techniques for treating neurodegenerative disorders by infusion of nerve growth factors into the brain
US6043221A (en) * 1997-07-30 2000-03-28 Amgen Inc. Method for preventing and treating hearing loss using a neuturin protein product
SI1005358T1 (en) * 1997-07-30 2003-06-30 Amgen Inc. Use of a neurturin protein product for preventing and treating hearing loss
CA2299586C (en) * 1997-08-05 2007-09-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Human glial cell line-derived neurotrophic factor promoters, vectors containing same, and methods of screening compounds therewith
NZ506748A (en) 1998-03-23 2002-10-25 Genentech Inc Nucleic acids encoding a GFR alpha 3 polypeptide; host cell and vectors for production of the GRF alpha 3 protein and an assay for detecting GRFalpha 3 production
US7026138B1 (en) 1998-03-23 2006-04-11 Genentech, Inc. Polynucleotides encoding GFRα3
DE19816186A1 (de) * 1998-04-14 1999-10-21 Univ Muenchen L Maximilians GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten
US6593133B1 (en) 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
US20020002269A1 (en) * 1998-09-29 2002-01-03 Jeffrey D. Milbrandt Artemin, a neurotrophic factor
US7060676B2 (en) * 1999-12-20 2006-06-13 Trustees Of Tufts College T. cruzi-derived neurotrophic agents and methods of use therefor
US20040014082A1 (en) * 2000-08-11 2004-01-22 Invitrogen Corporation Highly homogeneous molecular markers for electrophoresis
US6426065B1 (en) * 2000-11-07 2002-07-30 Clairol Incorporated Use of tris(hydroxymethyl)aminomethane in cold permanent waving processes
US7442370B2 (en) 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
US7276580B2 (en) 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
WO2002078730A2 (en) 2001-03-28 2002-10-10 Biogen, Inc. Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain
US20030050273A1 (en) * 2001-08-29 2003-03-13 Keiya Ozawa Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases
US7613491B2 (en) * 2002-05-22 2009-11-03 Dexcom, Inc. Silicone based membranes for use in implantable glucose sensors
US8364229B2 (en) * 2003-07-25 2013-01-29 Dexcom, Inc. Analyte sensors having a signal-to-noise ratio substantially unaffected by non-constant noise
JP2005526838A (ja) * 2002-04-25 2005-09-08 ウイスコンシン　アラムナイ　リサーチ　フオンデーシヨン パーキンソン病および他の神経変性疾患を治療するためのｇｄｎｆ分泌ヒト神経幹細胞の使用
US20060088899A1 (en) * 2002-05-31 2006-04-27 Alvarez Vernon L Combination chemotherapy with chlorotoxin
US7528112B2 (en) 2002-11-15 2009-05-05 Drexel University Small survival-promoting/immunomodulatory peptide for treatment of brain damage, neurodegenerative disorders, and inflammatory disorders
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
KR20060002745A (ko) * 2003-01-13 2006-01-09 마헨드라 에스 라오 치료적 생성물의 전달을 위한 증식성 줄기세포 및전구세포에서의 후보 분자의 지속적 발현
US20050048041A1 (en) * 2003-01-13 2005-03-03 Rao Mahendra S. Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products
US8946151B2 (en) 2003-02-24 2015-02-03 Northern Bristol N.H.S. Trust Frenchay Hospital Method of treating Parkinson's disease in humans by convection-enhanced infusion of glial cell-line derived neurotrophic factor to the putamen
US20040209810A1 (en) * 2003-02-24 2004-10-21 Gill Steven S. Method of treating Parkinson's disease in humans by intraputaminal infusion of glial cell-line derived neurotrophic factor
WO2004094592A2 (en) 2003-04-18 2004-11-04 Biogen Idec Ma Inc. Polymer-conjugated glycosylated neublastin
US7875293B2 (en) * 2003-05-21 2011-01-25 Dexcom, Inc. Biointerface membranes incorporating bioactive agents
AU2004245175C1 (en) 2003-06-10 2010-03-18 Biogen Ma Inc. Improved secretion of neublastin
US9763609B2 (en) 2003-07-25 2017-09-19 Dexcom, Inc. Analyte sensors having a signal-to-noise ratio substantially unaffected by non-constant noise
EP1648298A4 (en) * 2003-07-25 2010-01-13 Dexcom Inc OXYGEN-IMPROVED MEMBRANE SYSTEMS FOR IMPLANTABLE DEVICES
US7591801B2 (en) 2004-02-26 2009-09-22 Dexcom, Inc. Integrated delivery device for continuous glucose sensor
US9135402B2 (en) 2007-12-17 2015-09-15 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
WO2005021065A2 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 New York University Indirect delivery of growth factors into the central nervous system
EP1660659A2 (en) * 2003-09-05 2006-05-31 Licentia, Ltd. Gdnf-related neuropeptides
US7598059B2 (en) 2003-10-02 2009-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin expression constructs
US20060239966A1 (en) * 2003-10-20 2006-10-26 Tornoee Jens In vivo gene therapy of parkinson's disease
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US8093205B2 (en) 2003-12-01 2012-01-10 Medtronic, Inc. Method for treating a stroke by implanting a first therapy delivery element in the CNS and a second therapy delivery element in a damaged tissue of the CNS to promote neurogenesis
US20050123526A1 (en) * 2003-12-01 2005-06-09 Medtronic Inc. Administration of growth factors for neurogenesis and gliagenesis
US7364592B2 (en) * 2004-02-12 2008-04-29 Dexcom, Inc. Biointerface membrane with macro-and micro-architecture
US20050208090A1 (en) * 2004-03-18 2005-09-22 Medtronic, Inc. Methods and systems for treatment of neurological diseases of the central nervous system
GB2414934A (en) * 2004-06-11 2005-12-14 Gill Steven Streatfield Treatment of Parkinson's disease with GDNF
JP2008503590A (ja) * 2004-06-21 2008-02-07 メドトロニック・インコーポレーテッド 組成物を細胞にデリバリーするための医学用システム及び方法
US7654956B2 (en) 2004-07-13 2010-02-02 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
NZ553420A (en) 2004-08-19 2010-02-26 Biogen Idec Inc Refolding transforming growth factor beta family proteins
KR20110126732A (ko) 2004-08-19 2011-11-23 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 뉴블라스틴 변형체
US8133178B2 (en) 2006-02-22 2012-03-13 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US8138148B2 (en) 2005-08-16 2012-03-20 Copenhagen University GDNF derived peptides
US8741260B2 (en) * 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
US8124095B2 (en) * 2005-10-07 2012-02-28 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS
US8142781B2 (en) * 2005-10-07 2012-03-27 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for blood-brain barrier delivery
CA2627543A1 (en) * 2005-10-28 2007-05-03 Ns Gene A/S Implantable biocompatible immttnoisolatory vehicle for delivery of gdnf
CA2633468C (en) * 2005-12-14 2014-02-18 Licentia Ltd Novel neurotrophic factor protein and uses thereof
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
WO2007120381A2 (en) * 2006-04-14 2007-10-25 Dexcom, Inc. Analyte sensor
ES2618787T5 (es) 2006-04-25 2022-10-21 Univ California Administración de factores de crecimiento para el tratamiento de trastornos del SNC
WO2007127839A2 (en) * 2006-04-26 2007-11-08 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for convection enhanced delivery of high molecular weight neurotherapeutics
EP1872790A1 (en) 2006-06-26 2008-01-02 DeveloGen Aktiengesellschaft New formulation for increasing bioavailability of neurturin
CA2661042C (en) 2006-08-18 2012-12-11 Armagen Technologies, Inc. Agents for blood-brain barrier delivery
KR100770440B1 (ko) * 2006-08-29 2007-10-26 삼성전기주식회사 질화물 반도체 발광소자
US8637459B2 (en) 2006-11-08 2014-01-28 Emory University Enhancing a population of insulin releasing cells using GFR-A1 agonists
ES2476253T3 (es) 2007-05-01 2014-07-14 Biogen Idec Ma Inc. P�ptidos de neublastina para su uso en el aumento de la vascularizaci�n en tejido con flujo sanguíneo deteriorado
WO2008137066A1 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases
US20200037875A1 (en) 2007-05-18 2020-02-06 Dexcom, Inc. Analyte sensors having a signal-to-noise ratio substantially unaffected by non-constant noise
US20100210604A1 (en) * 2007-06-13 2010-08-19 Meythaler Jay M Zwitterion solution for low-volume therapeutic delivery
EP2167071B1 (en) 2007-06-13 2020-03-18 Wayne State University Board Of Governors A baclofen solution for low-volume therapeutic delivery
JP5901877B2 (ja) * 2007-07-27 2016-04-13 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 中枢神経系のα−Ｌ−イデュロニダーゼ活性を増加させるための方法および組成物
EP4159114B1 (en) 2007-10-09 2024-04-10 DexCom, Inc. Integrated insulin delivery system with continuous glucose sensor
US8417312B2 (en) 2007-10-25 2013-04-09 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
FI20070808A0 (fi) 2007-10-25 2007-10-25 Mart Saarma GDNF:n silmukointivariantit ja niiden käytöt
US8290559B2 (en) 2007-12-17 2012-10-16 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
GB0803352D0 (en) 2008-02-22 2008-04-02 Ntnu Technology Transfer As Oligopeptidic compounds and uses thereof
WO2009121026A1 (en) 2008-03-28 2009-10-01 Dexcom, Inc. Polymer membranes for continuous analyte sensors
FI20080326A0 (fi) 2008-04-30 2008-04-30 Licentia Oy Neurotroofinen tekijä MANF ja sen käytöt
EP2300045A1 (en) 2008-05-15 2011-03-30 Transmolecular, Inc. Treatment of metastatic tumors
EP2396408B1 (en) 2009-02-12 2017-09-20 CuRNA, Inc. Treatment of glial cell derived neurotrophic factor (gdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to gdnf
JP5873003B2 (ja) 2009-03-18 2016-03-01 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． ＩｇＧデコイ受容体融合タンパク質の血液脳関門送達のための組成物および方法
WO2010144696A1 (en) 2009-06-11 2010-12-16 Burnham Institute For Medical Research Directed differentiation of stem cells
WO2011044542A1 (en) 2009-10-09 2011-04-14 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing iduronate 2-sulfatase activity in the cns
WO2011064437A2 (es) 2009-11-26 2011-06-03 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Vectores virales y procedimientos útiles en la preparación de gdnf
CA2788824C (en) 2010-02-04 2019-03-12 Morphotek, Inc. Chlorotoxin polypeptides and conjugates and uses thereof
CN103097403B (zh) 2010-05-11 2017-04-19 弗雷德哈钦森癌症研究中心 氯毒素变体、缀合物及其使用方法
AU2011336592A1 (en) 2010-12-02 2013-07-11 Neurotech Usa, Inc. Cell lines that secrete anti-angiogenic antibody-scaffolds and soluble receptors and uses thereof
UA112981C2 (uk) 2011-04-11 2016-11-25 Елі Ліллі Енд Компані Варіант людського gdnf
EP2747650B1 (en) 2011-08-26 2023-04-05 Dexcom, Inc. Polymer membranes for continuous analyte sensors
EP2785378B1 (en) 2011-12-02 2020-05-13 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
US9788765B2 (en) 2012-09-28 2017-10-17 Dexcom, Inc. Zwitterion surface modifications for continuous sensors
CN105189540A (zh) 2012-12-10 2015-12-23 弗莱德哈钦森癌症研究中心 含脂质运载蛋白融合伴侣
US10376562B2 (en) 2013-03-15 2019-08-13 The Jackson Laboratory Methods for promoting wound healing and hair growth comprising GDNF administration
US11559580B1 (en) 2013-09-17 2023-01-24 Blaze Bioscience, Inc. Tissue-homing peptide conjugates and methods of use thereof
US10369329B2 (en) 2014-01-30 2019-08-06 Renishaw Plc Neurosurgical apparatus and method
EP3140429B1 (en) 2014-05-05 2020-02-19 Medtronic Inc. Methods for scd, crt, crt-d, or sca therapy identification and/or selection
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
GB201506052D0 (en) 2015-04-09 2015-05-27 Renishaw Plc Movement disorder
JP6850734B2 (ja) 2015-05-27 2021-03-31 ニューロテック ユーエスエー， インコーポレイテッド 眼の障害の処置のためのカプセル化細胞療法の使用
WO2017117468A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Dexcom, Inc. Enzyme immobilized adhesive layer for analyte sensors
CN110461880A (zh) 2016-11-10 2019-11-15 科乐斯疗法公司 Gdnf融合多肽及其使用方法
CA3210177A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Dexcom, Inc. Drug releasing membrane for analyte sensor
WO2023043908A1 (en) 2021-09-15 2023-03-23 Dexcom, Inc. Bioactive releasing membrane for analyte sensor
US20230240589A1 (en) 2022-02-02 2023-08-03 Dexcom, Inc. Sensing systems and methods for diagnosing, staging, treating, and assessing risks of liver disease using monitored analyte data
WO2023164584A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Dexcom, Inc. Sensing systems and methods for providing decision support around kidney health and/or diabetes
US20230389833A1 (en) 2022-06-01 2023-12-07 Dexcom, Inc. Systems and methods for monitoring, diagnosis, and decision support for diabetes in patients with kidney disease
US20240090802A1 (en) 2022-09-02 2024-03-21 Dexcom, Inc. Continuous analyte sensor devices and methods

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4518526A (en) * 1982-12-22 1985-05-21 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
EP0154434B1 (en) 1984-02-17 1993-01-27 Genentech, Inc. Human transforming growth factor and precursor or fragment thereof, cells, dna, vectors and methods for their production, compositions and products containing them, and related antibodies and diagnostic methods
US4886747A (en) 1985-03-22 1989-12-12 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding TGF-β and its uses
US5284763A (en) 1985-03-22 1994-02-08 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding TGF-β and its uses
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5427780A (en) 1985-10-30 1995-06-27 Biogen, Inc. Composition comprising Mullerian inhibiting substance-like polypeptides
EP0233838A3 (en) 1986-02-04 1990-01-31 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Neurite-promoting factor and process for the manufacture thereof
US5187076A (en) * 1986-07-01 1993-02-16 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding BMP-6 proteins
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5324819A (en) 1988-04-08 1994-06-28 Stryker Corporation Osteogenic proteins
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
US5250414A (en) 1988-11-04 1993-10-05 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Diagnostic methods using neurite growth regulatory factors
EP0396719B1 (en) * 1988-11-04 1995-07-05 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5017735A (en) 1989-07-24 1991-05-21 Catalytica, Inc. Selective sorption of 2,6-diisopropylnaphthalene
WO1991002003A1 (en) 1989-08-04 1991-02-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions; purified preparation of neural progenitor regulatory factor
US5215969A (en) 1989-08-11 1993-06-01 Hahnemann University Dopaminergic neurotrophic factor for treatment of Parkinson's disease
WO1991001739A1 (en) * 1989-08-11 1991-02-21 Hahnemann University Dopaminergic neurotrophic factor for treatment of parkinson's disease
WO1991010470A1 (en) 1990-01-08 1991-07-25 Brown University Research Foundation Devices and methods for enhanced delivery of active factors
US5270181A (en) 1991-02-06 1993-12-14 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules

Also Published As

Publication number Publication date
EP0610254A1 (en) 1994-08-17
ES2225819T3 (es) 2005-03-16
IL103223A (en) 2005-06-19
NO321382B1 (no) 2006-05-02
US6093802A (en) 2000-07-25
FI117556B (fi) 2006-11-30
HU211984A9 (en) 1996-01-29
NZ244392A (en) 1995-03-28
HK1047438A1 (zh) 2003-02-21
IL140654A0 (en) 2002-02-10
EP1243652A2 (en) 2002-09-25
AU2681192A (en) 1993-04-27
HK1017816A1 (en) 1999-11-26
NO940922D0 (no) 1994-03-15
US20020197675A1 (en) 2002-12-26
US5935795A (en) 1999-08-10
IL140653A0 (en) 2002-02-10
HUT66137A (en) 1994-09-28
US6015572A (en) 2000-01-18
EP1243652A3 (en) 2003-03-26
AU1900197A (en) 1997-09-18
EP0610254B1 (en) 2004-09-01
US7226758B1 (en) 2007-06-05
AU694387B2 (en) 1998-07-16
CA2119463C (en) 2003-09-16
KR940702505A (ko) 1994-08-20
US6362319B1 (en) 2002-03-26
PT100879B (pt) 1999-08-31
IL147488A0 (en) 2002-08-14
NO940922L (no) 1994-05-19
WO1993006116A1 (en) 1993-04-01
IL121913A0 (en) 1998-03-10
AU679167B2 (en) 1997-06-26
DK0610254T3 (da) 2005-01-10
ATE275197T1 (de) 2004-09-15
SG48145A1 (en) 1998-04-17
IL103223A0 (en) 1993-02-21
CA2119463A1 (en) 1993-04-01
KR100242093B1 (ko) 2000-02-01
HU9400717D0 (en) 1994-06-28
GEP20002243B (en) 2000-09-25
DE69233407D1 (de) 2004-10-07
FI941285A0 (fi) 1994-03-18
EP0610254A4 (en) 1995-05-03
MX9205293A (es) 1993-05-01
FI941285A (fi) 1994-03-18
US6221376B1 (en) 2001-04-24
DE69233407T2 (de) 2005-09-08
TW401422B (en) 2000-08-11
PT100879A (pt) 1994-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU220795B1 (hu) Gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjék, továbbá berendezések és gyógyászati készítmények idegsejtkárosodás megelőzésére és kezelésére
ES2236686T3 (es) Factores mitogenicos gliales, su preparacion y uso.
US5508263A (en) Heterodimeric osteogenic factor
DE60223511T2 (de) Neurotrophe faktoren
JPH06501617A (ja) 新規な神経栄養因子
JPH06500016A (ja) キメラ神経栄養因子
KR100334739B1 (ko) 절단된신경교세포주-유래신경영양성인자단백질산물
KR20060095568A (ko) 파킨슨병의 생체내 유전자 요법
US6511823B1 (en) Heparin binding neurotrophic factor gene sequence
KR20000029912A (ko) 뉴리틴,신경유전자
CA2038208A1 (en) Process for the isolation and expression of the human ciliary neuronotrophic factor by recombinant dna technology
JP2968840B2 (ja) グリア由来神経栄養因子
US20040175795A1 (en) Glial derived neurotrophic factor
FI104424B (fi) Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi
CA2202496C (en) Neurotrophic peptides of activity dependent neurotrophic factor
HU211318A9 (hu) Multitróf és multifunkcionális kiméra neurotróf faktorok és a kimérákát kódoló nukleinsavak és plazmidok Az átmeneti oltalom a(z) 1-34. igénypontra vonatkozik.

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: AMGEN INC., US