DE60223511T2

DE60223511T2 - Neurotrophe faktoren

Info

Publication number: DE60223511T2
Application number: DE60223511T
Authority: DE
Inventors: Dinah Wen Cambridge SAH; Teit E. Johansen; Anthony Revere ROSSOMANDO
Original assignee: NsGene AS; Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: NsGene AS; Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 2001-03-12
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2008-10-23
Anticipated expiration: 2022-03-13
Also published as: CA2440767C; PT1373503E; ES2296899T3; CA2440767A1; DK1930439T3; JP3738008B2; EP1373503A2; AU2002240943A2; JP2005198656A; WO2002072826A3; ATE509103T1; SI1373503T1; PT1930439E; JP2004531242A; ATE378353T1; SI1930439T1; CY1111750T1; CN1268744C; DE60223511D1; EP1930439A1

Description

Die Erfindung betrifft neurotropher Faktor Polypeptide, Nukleinsäuren, die neurotropher Faktor Polypeptide kodieren und Antikörper, die spezifisch an neurotrophe Faktoren binden.
Neurotrophe Faktoren stellen natürlich vorkommende Proteine dar, die das Überleben fördern, die phänotypische Differenzierung erhalten, die Degeneration verhindern und die Aktivität neuronaler Zellen und Gewebe erhöhen bzw. verstärken. Neurotrophe Faktoren werden von neuronalem Gewebe und von nicht neuronalem Gewebe isoliert, das durch das Nervensystem inneruiert wird, und wurden in funktionell und strukturell verwandte Gruppen klassifiziert, die ebenfalls als Familien, Superfamilien oder Unterfamilien bezeichnet werden. Unter den Superfamilien der neurotrophen Faktoren befinden sich die Superfamilien des Fibroblasten-Wachstums-Faktors, Neurotrophin und transformierenden Wachstums-Faktor-β (TGF-β). Einzelne Spezies von neurotrophen Faktoren werden durch deren physikalische Struktur, deren Wechselwirkung mit deren zusammengesetzten Rezeptoren, und deren Beeinflussungen bzw. Wirkungen auf verschiedene Typen von Nervenzellen unterschieden. Klassifiziert innerhalb der TGF-β Superfamilie (Massague et al., Trends in Cells Biology 4 (1994), 172–178) sind die von Gliazelllinien abgeleiteten neurotrophen Faktor-Liganden ("GDNF", WO 93/06116 , hier durch Bezugnahme aufgenommen), die GDNF, Persephin ("PSP", Milbrandt et al., Neuron 20 (1998), 245–253, hier durch Bezugnahme aufgenommen) und Neurturin ("NTN", WO 97/08196 , hier durch Bezugnahme aufgenommen) einschließen Die Liganden der GDNF Unterfamilie weisen deren gemeinsame Befähigung auf eine Signalwirkung bzw. Weiterleitung durch die RET Rezeptor-Tyrosin-Kinase zu induzieren. Jene drei Liganden der GDNF Unterfamilie unterscheiden sich in deren relativen Affinitäten für eine Familie von neurotrophen Rezeptoren, den GRFα-Rezeptoren.
Aufgrund der Wirkungen der neurotrophen Faktoren auf Nervengewebe besteht der Bedarf zusätzliche neurotrophe Faktoren zur Diagnose und Behandlung von Störungen des Nervensystems zu identifizieren und zu charakterisieren.
Diese Erfindung betrifft einen neuen neurotrophen Faktor, der hier als "Neublastin" oder "NBN" bezeichnet wird. Neublastin wird in die GDNF Unterfamilie klassifiziert, da es Bereiche von Homologie mit anderen GDNF-Liganden (siehe Tabelle 3 und 4) teilt und wegen seiner Befähigung mit RET (siehe beispielsweise Airaksinen et al., Mol. Cell. Neuroscience 13 (1999), 313–325) zu wechselwirken, wobei Neublastin einen neuen und einzigartigen neurotrophen Faktor darstellt. Unähnlich anderen GDNF-Liganden zeigt Neublastin eine hohe Affinität für den GFRα-RET Rezeptor-Komplex und weist einzigartige Unterbereiche in dessen Aminosäuresequenz auf.
Umfasst werden von der Erfindung NBN Nukleinsäuren und deren kodierten Polypeptide. NBN Polypeptide sind biologisch aktive Dimere und weisen als Monomere eine geringe bis keine Aktivität auf. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein verkürztes Polypeptid von Neublastin bereit, worin dem Amino-Terminus des verkürzten Polypeptids von Neublastin eine oder mehrere aminoterminale Aminosäuren eines reifen Neublastin-Polypeptids fehlen. Vorzugsweise bindet, falls dimerisiert, das verkürzte Polypeptid von Neublastin an ein RET-Polypeptid. Vorzugsweise induziert das verkürzte aktive Neublastin-Polypeptid die Dimerisierung des RET-Polypeptids.
In mehreren Ausführungsformen umfasst das Polypeptid von Neublastin sieben Cysteinreste an Positionen, die Positionen 16, 43, 47, 80, 81, 109 und 111 des Neublastin-Polypeptids von SEQ ID NO. 12 (reife 113 AA) entsprechen, die beispielsweise Positionen 43, 70, 74, 107, 108, 136, 138 von SEQ ID No. 9 entsprechen. SEQ ID No. 9 ist derart durchnummeriert, dass die Reste –80 bis –1 dem prä-pro-Abschnitt des übersetzten NBN-Polypeptids entsprechen, und die Reste 1–140 den 140 Aminosäuren des reifen NBN140 entsprechen. Dieses Nummerierungsschema stellt lediglich eine Sache der Zweckdienlichkeit dar und es sollte daraus kein Rückschluss bezüglich irgendeiner oder mehrerer Formen von hier offenbartem prä-pro-, pro-, reifem oder verkürztem NBN gezogen werden.
Ebenfalls innerhalb der Erfindung befindet sich ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz eines verkürzten Neublastin-Polypeptids umfasst. Die Aminosäuresequenz des verkürzten Neublastin-Polypeptids beträgt in der Länge weniger als 113 Aminosäuren und umfasst eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70% homolog zu den Aminosäuren 28–140 von SEQ ID No. 9 ist.
In mehreren Ausführungsformen beträgt die Aminosäuresequenz des verkürzten Neublastin-Polypeptids mindestens 80% Homologie zu den Aminosäuren 42–140 von SEQ ID No. 9. Noch bevorzugter ist die Aminosäuresequenz des verkürzten Neublastin-Polypeptids mindestens 90% homolog zu den Aminosäuren 42–140 von SEQ ID No. 9. Sogar noch bevorzugter beträgt die Aminosäuresequenz des Neublastin-Polypeptids eine mindestens 95% Homologie zu der Aminosäuresequenz 42–140 von SEQ ID No. 9. In einer weiteren Ausführungsform beträgt die Aminosäuresequenz des Neublastin-Polypeptids mindestens eine 99% Homologie zu den Aminosäuren 42–140 von SEQ ID No. 9. In am meisten bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Aminosäuresequenz des verkürzten Neublastin-Polypeptids die Aminosäuren 42–140 von SEQ ID No. 9. In mehreren Ausführungsformen beinhaltet die Aminosäuresequenz des verkürzten Neublastin-Polypeptids im Wesentlichen 99 Aminosäuren von SEQ ID No. 48.
In mehreren Ausführungsformen weist die Aminosäuresequenz des verkürzten Neublastin-Polypeptids mindestens eine Homologie von 80% zu den Aminosäuren 39–140 von SEQ ID No. 9 auf. Vorzugsweise weist die Aminosäuresequenz des Neublastin-Polypeptids mindestens eine Homologie von 90% zu den Aminosäuren 39–140 von SEQ ID No. 9 auf. Noch bevorzugter weist die Aminosäuresequenz des Neublastin-Polypeptids mindestens eine Homologie von 95% zu den Aminosäuren 39–140 von SEQ ID No 9 auf. In am meisten bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Aminosäuresequenz des verkürzten Neublastin-Polypeptids die Aminosäuren 39–140 von SEQ ID No. 9. In einer weiteren Ausführungsform beträgt die Aminosäuresequenz des Neublastin-Polypeptids mindestens 99% von den Aminosäuren 39–140 von SEQ ID No. 9. In mehreren Ausführungsformen beinhaltet die Aminosäuresequenz des verkürzten Neublastin-Polypeptids im Wesentlichen 102 Aminosäuren von SEQ ID No. 45.
In weiteren Ausführungsformen ist die Aminosäuresequenz des verkürzten Neublastin-Polypeptids identisch zu oder mindestens 80%, 90%, 95% oder 99% homolog zu den Aminosäuren 29–140 von SEQ ID No. 9 und beinhaltet wesentlich 112 Aminosäuren. In alternativen Ausführungsformen der vorstehend erwähnten Identität oder prozentualen Homologie bezieht sich auf die Aminosäuren 30–140 von SEQ ID NO: 9, 31–140 von SEQ ID NO: 9, 32–140 von SEQ ID NO: 9, 33–140 von SEQ ID NO: 9, 34–140 von SEQ ID NO: 9, 35–140 von SEQ ID NO: 9, 36–140 von SEQ ID NO: 9, 37–140 von SEQ ID NO: 9, 38–140 von SEQ ID NO: 9, 40–140 von SEQ ID NO: 9 oder 41–140 von SEQ ID NO: 9. In diesen Ausführungsformen besteht die Aminosäuresequenz des verkürzten Neublastin-Polypeptids wesentlich aus 111, 110, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 101 oder 100 Aminosäuren. In besonderen Ausführungsformen liegt das verkürzte Neublastin-Polypeptid als das Polypeptid von irgendeiner der SEQ ID NOS: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 oder 48 vor.
Das verkürzte Neublastin-Polypeptid kann dadurch erhalten werden, dass ein reifes Neublastin-Polypeptid, wie beispielsweise NBN113 bereitgestellt wird, und das reife Neublastin-Polypeptid mit mindestens einer Protease unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die geeignet sind, um das verkürzte Neublastin-Polypeptid zu erzeugen. Vorzugsweise wird das verkürzte Neublastin-Polypeptid als ein Verdauprodukt von Neublastin-Polypeptid mit einer Exoprotease erzeugt, indem das reife Neublastin-Polypeptid mit mindestens einer Exoprotease in Kontakt gebracht wird. Eine bevorzugte Protease ist irgendeine unter Aminoprotease, Endo Lys C und Trypsin. In mehreren Ausführungsformen umfasst das Verfahren weiterhin ein Inkontaktbringen des Verdauproduktes von Neublastin-Polypeptid der Exoprotease mit einer Dipeptidyl-Peptidase.
In einer Ausführungsform liegt das verkürzte Neublastin-Polypeptid als ein glycosyliertes Polypeptid vor. In einer alternativen Ausführungsform ist das verkürzte Neublastin-Polypeptid nicht glycosyliert.
Von der Erfindung ebenfalls umfasst ist eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid einschließt, das die Aminosäuresequenz eines verkürzten Neublastin-Polypeptids umfasst. In mehreren Ausführungsformen hybridisiert die Nukleinsäure spezifisch unter hohen strin genten Bedingungen einer Hybridisierung in Lösung mit einer Nukleinsäure, die ein abweichendes Neublastin-Polypeptid kodiert.
Die Nukleinsäure, die ein verkürztes Neublastin-Polypeptid kodiert, kann dazu verwendet werden die Nukleinsäure in eine Zelle einzuführen und zu bewirken, dass ein durch die Nukleinsäure kodiertes Polypeptid in der Zelle exprimiert wird. Falls erwünscht, kann das Verfahren den Schritt umfassen von, Verabreichen der Nukleinsäure an ein Tier, und Bewirken, dass das Polypeptid in dem Tier exprimiert wird.
Die Nukleinsäure, die ein verkürztes Neublastin-Polypeptid kodiert, kann als ein Vektor, beispielsweise ein Expressionsvektor bereitgestellt werden. Der Vektor kann verwendet werden, um das kodierte verkürzte Neublastin-Polypeptid zu exprimieren.
Die Erfindung umfasst ebenfalls eine Zelle, die mit einer ein Polypeptid kodierenden Nukleinsäure transformiert ist, welches ein verkürztes Neublastin-Polypeptid einschließt. Die Zelle kann beispielsweise eine Säugerzelle, eine Pilzzelle, eine Hefezelle, eine Insektenzelle und eine Bakterienzelle sein. Eine bevorzugte Säugerzelle ist eine Ovariumzelle des chinesischen Hamsters, oder eine Zelle, die von dem Zentralnervensystem der Säuger abgeleitet ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines verkürzten Neublastin-Polypeptids durch Expression einer Nukleinsäure, die ein verkürztes Neublastin-Polypeptid kodiert. Vorzugsweise umfasst das Verfahren den Schritt von, Kultivieren einer Zelle umfassend die Nukleinsäure in einem Kulturmedium, wodurch die Herstellung des verkürzten Neublastin-Polypeptids ermöglicht wird. Das Verfahren kann ebenfalls den Schritt umfassen von, Rückgewinnen des Polypeptids aus dem Kulturmedium. Durch die Erfindung wird ebenfalls ein verkürztes Neublastin-Polypeptid (beispielsweise ein gereinigtes Protein) bereitgestellt, das durch das Verfahren erhalten wurde.
Ebenfalls durch die Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein verkürzte Neublastin-Polypeptid und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Ebenfalls umfasst von der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine ein verkürztes Neublastin-Polypeptid kodierende Nukleinsäure und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren einer Verabreichung des verkürzten Neublastin-Polypeptids bereit, indem das Polypeptid an eine isolierte Zelle oder in vivo an einen Säuger (wie beispielsweise einen Menschen) abgegeben bzw. zugeführt wird. Vorzugsweise umfasst die Verabreichung in vivo eine systemische Verabreichung. Der Säuger kann an einem Zustand, wie beispielsweise einer ischämischen neuronalen Schädigung, traumatischen Hirnverletzung, peripheren Neuropathie, neuropathischem Schmerz, Alzheimer Erkrankung, Huntington Krankheit, Parkinson Krankheit, amyotrophen Lateralsklerose und Gedächtnisschwäche leiden. In mehreren Ausführungsformen leidet der Säuger an einer neuronalen Störung des peripheren Nervensystems, der Medulla, oder des Rückenmarks.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung oder Störung in einem Säuger bereit, indem dem Säuger eine Nukleinsäure verabreicht wird, die ein verkürztes Neublastin-Polypeptid kodiert.
Durch die Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung oder Störung in einem Säuger bereitgestellt, indem dem Tier das verkürzte Neublastin-Polypeptid verabreicht wird. In einer anderen Ausführungsform fördert die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer peripheren Neuropathie in einem Säuger, umfassend, Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines verkürzte Neublastin-Polypeptids an einen Säuger. Die periphere Neuropathie kann beispielsweise eine oder mehrere durch Trauma induzierte Neuropathien sein, durch Virus induzierte Neuropathien, durch Chemotherapie induzierte Neuropathien, durch Gift induzierte Neuropathien, durch Arzneimittel induzierte Neuropathien, durch Vitamindefizienz induzierte Neuropathien, idiopathische Neuropathien und diabetische Neuropathien. In mehreren Ausführungsformen wird das verkürzte Neublastin-Polypeptid unmittelbar in das bzw. dem Zentralnervensystem abgegeben bzw. zugeführt. In anderen Ausführungsformen wird das verkürzte Neublastin-Polypeptid vorzugsweise systemisch durch subkutane Injektion zugeführt, durch intramuskuläre, intravenöse Verabreichung oder intravenöse Infusion.
Ebenfall befindet sich in der Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von neuropathischem Schmerz in einem Säuger, umfassend, Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines verkürzten Neublastin-Polypeptids an einen Säuger. In mehreren Ausführungsformen ist der neuropathische Schmerz mit einer durch Gift induzierten Nervenschädigung assoziiert, einer durch ein Pathogen induzierte Nervenschädigung, durch eine Entzündung induzierte Nervenschädigung oder Neurodegeneration.
In einer weiteren Ausführungsform fördert die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer peripheren Neuropathie in einem Säuger durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Nukleinsäure an einen Säuger, die verkürztes Neublastin-Polypeptid kodiert. Die periphere Neuropathie ist vorzugsweise eine oder mehrere von durch Trauma induzierte Neuropathien, durch Virus induzierte Neuropathien, durch Chemotherapie induzierte Neuropathien, durch Gift induzierte Neuropathien, durch Arzneimittel induzierte Neuropathien, durch Vitamindefizienz induzierte Neuropathien, idiopathische Neuropathien und diabetische Neuropathien. Vorzugsweise wird die Nukleinsäure, die das verkürzte Neublastin-Polypeptid kodiert unmittelbar in das bzw. dem Zentralnervensystem abgegeben bzw. zugeführt. Vorzugsweise wird die Nukleinsäure, die das verkürzte Neublastin-Polypeptid kodiert systemisch durch subkutane Injektion, intravenöse Verabreichung, oder intravenöse Infusion zugeführt.
Ebenfalls wird durch die Erfindung ein Kit bereitgestellt, der in einem oder mehreren Behältern eine Substanz einschließt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem verkürzten Neublastin-Polypeptid und einer Nukleinsäure, die ein verkürztes Neublastin-Polypeptid kodiert.
Ein wie hier verwendetes "Neublastin-Polypeptid", ist ein Polypeptid, das eine neurotrophe Aktivität (beispielsweise wie in Beispielen 6, 7, 8 und 9 beschrieben) besitzt und jene Polypeptide einschließt, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens 70% Homologie zu den "Neublastin" Polypeptiden des Menschen, dargelegt in A_-95-AA₁₀₅ von SEQ ID No. 2, AA₁-AA₁₀₅ von SEQ ID No. 2, AA_-97-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 4, AA_-41-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 4 ("pro"), AA₁-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 4, A_-80-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 9 ("Wild-Type" prä-pro-NBN), AA_-41-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 9 (pro-NBN), AA₁-AA₁₄₀ von SEQ ID NO:5 (reife 140AA), AA₁-AA₁₁₆ von SEQ ID NO: 6 (reif 116AA), AA₁-AA₁₁₃ von SEQ ID NO: 7 (reif 113AA), AA₁-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 10 (reif 140AA), AA₁-AA₁₁₆ von SEQ ID NO: 11 (reif 116AA), AA₁-AA₁₁₃ von SEQ ID N0: 12 (reif 113AA), und die verkürzten Polypeptide von SEQ ID NOs: 35–48 Varianten und Abkömmlingen davon. Außerdem berücksichtigt die Erfindung jene Polypeptide die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens 70% Homologie zu den "Neublastin" Polypeptiden der Maus aufweisen, dargelegt in AA₁-AA₂₂₄ von SEQ ID NO: 16 oder den Neublastin Polypeptiden der Ratte, dargelegt in AA₁-AA₂₂₄ von SEQ ID No. 34.
Vorzugsweise weist die C-terminale Sequenz der vorstehend identifizierten Neublastin-Polypeptide eine Aminosäuresequenz auf, die wie in AA₇₂-AA₁₀₅ von SEQ ID No. 2 (d. h. AA₁₀₇-AA₁₄₀ von SEQ ID No. 9), noch bevorzugter AA₄₁-AA₁₀₅ von SEQ ID No. 2 (d. h. AA₇₆-AA₁₄₀ von SEQ ID No. 9), oder die Aminosäuresequenz, die in AA₁₉₁-AA₂₂₄ von SEQ ID No. 16 oder 34 dargelegt ist.
Ebenfalls wird bevorzugt, dass das Neublastin-Polypeptid die sieben konservierten Cys-Reste behält, die für die GDNF-Familie und die TGF-beta Superfamilie charakteristisch sind. Die sieben konservierten Cysteinreste sind an den Positionen 16, 43, 47, 80, 81, 109 und 111 von dem Neublastin-Polypeptid von SEQ ID No. 12 (reif 113AA) angeordnet. Diese entsprechen beispielsweise den Positionen 43, 70, 74, 107, 108, 136 und 138 von SEQ ID No. 9, oder beispielsweise Positionen 127, 154, 158, 191, 192, 220 und 222 von SEQ ID No, 16 oder 34.
Vorzugsweise weist das Neublastin-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie auf, die größer als 85% ist, noch bevorzugter mit größer als 90% Homologie, noch bevorzugter mit größer als 95% Homologie, am meisten bevorzugt mit größer als 99% Homologie gegenüber den vorangehenden Sequenzen (beispielsweise A_-95-AA₁₀₅ von SEQ ID N0: 2, AA₁-AA₁₀₅ von SEQ ID NO:2, AA_-97-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 4, AA₁-AA₁₄₀ von SEQ ID N0: 4, AA_-41-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 4, AA_-80-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 9 ("Wild- Type" prä-pro), AA_-41-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 9 (pro), AA₁-AA₁₄₀ von SEQ ID NO:5 (reif 140AA), AA₁-AA₁₁₆ von SEQ ID NO: 6 (reif 116AA), AA₁-AA₁₁₃ von SEQ ID NO: 7 (reif 113AA), AA₁-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 10 (reif 140AA), AA₁-AA₁₁₆ von SEQ ID NO:11 (reif 116AA), AA₁-AA₁₁₃ von SEQ ID NO: 12 (reif 113AA), AA₁-AA₂₂₄ von SEQ ID N0:16 oder 34, und SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 beziehungsweise 48 (verkürztes NBN112 bis NBN99, jeweils).
Eine wie hier verwendete "Neublastin Nukleinsäure" ist ein Polynukleotid, das für ein Neublastin-Polypeptid kodiert. Demgemäß ist eine isolierte Nukleinsäure ein Polynukleotidmolekül, das ein offenes Leseraster von Nukleotidcodonen aufweist, die, falls sie den für die Translation erforderlichen geeigneten Bestandteilen ausgesetzt wird, ein Neublastin-Polypeptid kodieren würde oder dafür kodieren. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure von Neublastin kann RNA oder DNA sein, beispielsweise genomische DNA, oder DNA, die komplementär ist zu einer Neublastin mRNA ("cDNA") und/oder davon transkribiert wurde. Folglich umfasst eine erfindungsgemäße Nukleinsäure von Neublastin weiterhin Polynukleotidmoleküle, die spezifisch, unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Polynukleotid hybridisieren, das für ein Neublastin-Polypeptid kodiert. Die Erfindung betrifft ebenfalls Nukleinsäure-Primer, die bei der Identifizierung, Isolierung und Vermehrung von Polynukleotiden, die Neublastin-Polypeptide oder Fragmente davon kodieren, nützlich sind. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung sind bestimmte jener Primer spezifische Sonden für Neublastin, die zur Hybridisierung an eine Neublastin-Nukleinsäure nützlich sind, jedoch nicht an Nukleinsäuren, die für andere Mitglieder der GDNF-Familie kodieren. Mit "spezifisch", "Spezifität" oder "speziell" ist eine Befähigung bzw. Fähigkeit gemeint an eine Nukleinsäure von Neublastin zu hybridisieren und das Unvermögen mit Nukleinsäuren von Nicht-Neublastin zu hybridisieren, einschließlich eines Unvermögens an Nukleinsäuren zu hybridisieren, die einzig für die anderen GDNF-Liganden (beispielsweise GDNF, Persephin und Neuturin) kodieren.
In einer anderen Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure von Neublastin eine, die als zu einem Polynukleotid komplementär identifiziert wurde, das für ein Neublastin-Polypeptid kodiert, entweder indem es eine komplementäre Nukleinsäuresequenz aufweist oder zeigt, dass es mit Spezifität bei hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Polynukleotid hybridisiert, das für Neublastin kodiert. Besondere Nukleinsäuren von Neublastin umfassen ohne Einschränkung, die Nukleinsäuresequenzen, die hier gezeigt und bezeichnet sind als SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 29 und SEQ ID NO: 30 als auch Primer SEQ ID NOS: 17–28, 31 und 32. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure von Neublastin umfasst weiterhin eine/ein einzigartige/s Unterregion oder Fragment einer Neublastin-Nukleinsäure, einschließlich ohne Einschränkung der in 8 gezeigten Nukleinsäure-Fragmente.
Die Neublastin-Nukleinsäuren der Erfindung können verwendet werden, um ein Neublastin-Polypeptid, beispielsweise durch Expression eines Neublastin-Polypeptids in vivo, oder durch Verabreichen einer Neublastin-Nukleinsäure an ein Tier für eine in vivo Expression, exprimiert werden. Nukleinsäuren von Neublastin können in einen Nukleinsäure-Vektor, beispielsweise einen Expressionsvektor oder einen Klonierungsvektor, eingefügt werden. Eine Nukleinsäure von Neublastin kann, muss jedoch nicht, erhalten, reproduziert, transferiert oder als Teil eines Nukleinsäure-Vektors exprimiert werden. Ein rekombinanter Expressionsvektor, der eine Polynukleotidsequenz von Neublastin beinhaltet, kann in eine Zelle eingefügt und/oder darin erhalten werden. Zellen, die einen Neublastin-Vektor bewirten bzw. beinhalten, können prokaryotisch sein. Alternativ kann eine Neublastin-Nukleinsäure in eine eukaryotische Zelle eingefügt werden, beispielsweise eine eukaryotische Zelle, die die geeigneten Apparate für eine post-translationale Bearbeitung eines Polypeptids in ein reifes Protein aufweisen, und/oder die geeigneten Apparate für ein Sekretieren eines Polypeptids in die extrazelluläre Umgebung der Zelle.
Die Erfindung fördert weiterhin einen Neublastin neurotrophen Faktor, "Neublastin". Neublastin kann in der Form eines Polypeptids vorliegen oder kann ein Multimer von zwei oder mehr Neublastin-Polypeptiden, beispielsweise ein Neublastin-Dimer, sein. Neublastin-Polypeptide sind als Multimere durch intermolekulare strukturelle Assoziationen verbunden, die dem Fachmann, einschließlich, ohne Einschränkung, einer Wechselwirkung von Cystein-Cystein, Disulfidbindungen und monovalente Wechselwirkungen bekannt sind. Besondere Neublastin-Polypeptide umfassen, ohne Einschränkung, eine Aminosäuresequenz, die hier offenbart und bezeichnet ist als SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 34 und SEQ ID NOS: 35–48. Vorzugsweise binden die Neublastin-Polypeptide der vorliegenden Erfindung, falls sie dimerisiert sind, an RET. Noch bevorzugter induzieren die vorliegenden Neublastin-Polypeptide, falls dimerisiert, eine Dimerisierung von RET. Eine RET-Dimerisierung auf der Oberfläche einer Zelle führt zu einer Autophosphorylierung des RET-Dimers und schließlich zu der Aktivierung der durch RET vermittelten intrazellulären Signalkaskade.
Ein Neublastin-Polypeptid der Erfindung ist nützlich für die Behandlung eines Defekts in einem Neuron, einschließlich ohne Einschränkung, verletzte Neuronen und traumatisierte Neuronen. Periphere Nerven, die ein Trauma erfahren, schließen Nerven der Medulla oder des Rückenmarks ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Neublastin-Polypeptide sind bei der Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung, beispielsweise zerebraler ischämischer neuronaler Schädigung nützlich, Neuropathie, beispielsweise peripherer Neuropathie, Alzheimer Krankheit, Huntington Krankheit, Parkinson Krankheit, amyotropher Lateralsklerose (ALS). Neublastin-Polypeptide sind weiterhin zur Verwendung bei der Behandlung von eingeschränktem Gedächtnis vorgesehen, beispielsweise mit Demenz assoziierte Gedächtnisstörung.
Zusätzliche Beispiele von Zuständen oder Erkrankungen sind Störungen des peripheren Nervensystems, der Medulla oder des Rückenmarks, als auch durch Trauma induzierte Neuropathien, durch Chemotherapie induzierte Neuropathien, durch Gift induzierte Neuropathien, durch Arzneimittel induzierte Neuropathien, durch Vitamindefizienz induzierte Neuropathien, idiopathische Neuropathien und diabetische Neuropathien, neuropathischer Schmerz, der mit einer durch Gift induzierten Nervenschädigung, einer durch Pathogen induzierten Nervenschädigung, einer durch Entzündung induzierten Nervenschädigung oder mit Neurodegeneration assoziiert ist. Zusätzliche Beispiele peripherer Neuropathien umfassen durch Trauma induzierte Neuropathien, durch Chemotherapie induzierte Neuropathien, durch Gift induzierte Neuropathien, durch Arzneimittel induzierte Neuropathien, durch Vitamindefizienz induzierte Neuropathien, idiopathische Neuropathien und diabetische Neuropathien.
Wenn nicht anderweitig definiert weisen alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die zu dieser Erfindung dazugehören die gleiche Bedeutung auf, wie sie gewöhnlich durch einen normalen Fachmann verstanden werden. Obwohl Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu jenen hier beschriebene sind, bei der Ausführung oder dem Testen der Erfindung verwendet werden können, werden geeignete Verfahren und Materialien nachfolgend beschrieben. Alle Veröffentlichungen, Patent-Veröffentlichungen, Patente und andere hier erwähnten Referenzen werden hier durch Bezugnahme in deren Ganzheit aufgenommen. Im Falle eines Widerspruchs wird die vorliegende Erfindung, einschließlich der Definitionen, leiten. Außerdem sind die Materialien, Verfahren und Beispiele lediglich darstellend und nicht einschränkend vorgesehen.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und Ansprüchen offenbar werden.
1 ist eine photographische Abbildung von zwei Northern-Blots, die mit ³²P-markierter cDNA von Neublastin untersucht wurden, die relative Spiegel der Expression des Neublastingens in verschiedenen menschlichen Gewebetypen von Erwachsenen (Tafel A) und in verschiedenen Bereichen des erwachsenen menschlichen Gehirn (Tafel B) vergleichen.
2 ist eine photographische Abbildung eines Northern-Blots, der mit ³²P markierter Neublastin-cDNA untersucht wurde, wobei die Menge von Neublastin-cDNA, die in einer nicht transfizierten Zelllinie exprimiert wird, HiB5, mit der Menge von Neublastin-cDNA verglichen wird, die in einer Zelllinie exprimiert wird, die mit Neublastin-cDNA transfiziert wurde und mit einer Zelllinie, die mit GDNF-cDNA transfiziert wurde.
3 ist eine photographische Abbildung von zwei Western-Blots, die den Grad vergleichen mit dem Neublastin-Protein in nicht transfizierten HiB5-Zellen (Spur 1) relativ zu einer mit Neublastin-cDNA (Spur 2) stabil transfizierten HiB5-Zelllinie exprimiert wird, wobei sie mit entweder dem für Neublastin spezifischen Antikörper Ab-2 (linker Blot, Tafel A) oder dem für Neublastin spezifischen Antikörper Ab-1 (rechter Blot, Tafel B) untersucht wurden.
4 ist eine graphische Darstellung der Wirkung von Neublastin auf das Überleben von kultivierten embryonalen, dopaminergen, Neuronen des ventralen Mesencephalon der Ratte und der ChAT-Aktivität in cholinergen Motorneuronen des Kranialnervs in serumfreiem Medium. Insbesondere ist 4 eine Darstellung der Dosis-Antwort-Kurve für rekombinantes GDNF auf ChAT-Aktivität (dpm/Stunde). 4B ist eine Darstellung einer ChAT-Aktivität (dpm/Stunde) unter Verwendung von verdünntem konditioniertem Medium von entweder Neublastin erzeugenden oder GDNF erzeugenden Zellen. 4C ist eine Darstellung der Anzahl von auf Tyrosin-Hydroxylase immunreaktiven Zellen pro Loch.
5 ist eine Darstellung der Wirkung von aus HiB5pUbi1zNBN22-Zellen sekretiertem Neublastin auf die Funktion und das Überleben einer Scheiben- bzw. Schichtkultur von embryonalen dopaminergen Neuronen des ventralen Mesencephalon des Schweins, die mit entweder HiB5pUbi1zNBN22-Zellen (Neublastin) oder HiB5-Zellen (Kontrolle) kokultiviert wurden. 5A und 5B stellen Dopamin dar, das dem Medium an DIV 12 (Dopamin (pmol/ml)-Tag 12) beziehungsweise DIV21 (Dopamin (pmol/ml)-21-Tag) freigesetzt wurde. 5C ist eine Darstellung der Anzahl von auf Tyrosin-Hydroxylase immunreaktive Zellen pro Kultur (TH-ir Zellen pro Kultur) an DIV21.
6 ist eine Darstellung der in vitro Wirkung von durch Lentivirus hergestelltes Neublastin auf nigrale Dopaminneuronen.
7 ist ein schematisches Diagramm der genomischen Struktur des Neublastingens, einschließlich der Nukleinsäure-Primer, die dazu verwendet werden können, das Volllängen-Gen von Neublastin und deren räumliche Orientierung in Bezug auf die genomische Neublastin kodierende Sequenz (d. h. Gen) zu identifizieren.
8 ist eine Darstellung von für Neublastin spezifischen Primern, die verwendet wurden, um den cDNA-Klon zu identifizieren, der das Neublastin-Polypeptid vom Menschen kodiert, das an Nukleinsäuren hybridisiert, die Neublastin-Polypeptide kodieren, jedoch nicht an Nukleinsäuren hybridisieren, die die anderen bekannten GDNF-Familienmitglieder (d. h. GDNF, Persephin und Neuturin) kodieren.
9 stellt die neurotrophe Aktivität an Kulturen von dissoziierten dorsalen Wurzelganglienzellen von unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Ratte mit einem in der vorliegenden Erfindung offenbarten Polypeptid im Vergleich mit jenen dar, die von bekannten neurotrophen Faktoren (0 Kontrollexperiment (in Abwesenheit von Faktoren); 1 in der Anwesenheit von GDNF, 2 in der Anwesenheit von Neurturin, 3 in der Anwesenheit von Neublastin der Erfindung, erhalten wurden, E12 embryonaler Tag 12, E16 embryonaler Tag 16, P0 der Tag der Geburt, P7 Tag 7 nach der Geburt und P15 Tag 15 nach der Geburt).
10 stellt die Produktion von Neublastin von CHO-Zelllinien dar.
11 stellt einen Vergleich einer Bindung von Neublastin und GDNF an GRFα-1 und GRFα-3-Rezeptoren dar.
12 ist eine photographische Abbildung eines Western-Blots, der die Bindung von R30 Anti-Peptid Antikörper und R31 Anti-Peptid Antikörper an Neublastin darstellt.
13 ist ein Bild eines Gels, das die Extraktion von Neublastin durch eine Affinitätsbindung an RETL-3-Ig zeigt.
14 ist eine Plasmidkarte von pET19b-Neublastin zusammen mit der Sequenz des synthetischen Gens für Neublastin.
15 ist eine Plasmidkarte von pMJB164-HisNeublastin zusammen mit der Sequenz des synthetischen Gens für HisNeublastin.
16 stellt einen Vergleich von einer 102 Aminosäuren-Form von verkürztem Neublastin (NBN) und einer 113 Aminosäuren-Form von Neublastin in einem zellulären RET-Aktivierungs-Test dar.
17 stellt einen Vergleich von verschiedenen Formen von Neublastin oder Neublastin-Muteinen in einem zellulären RET-Aktivierungs-Test dar.
18 stellt einen Vergleich von verschiedenen reifen (113 AA) und verkürzten (106 AA, 104 AA oder 99 AA) Formen von Neublastin oder Neublastin R14K-Muteinen in einem zellulären KIRA-ELISA-Test dar.
Die Anmelder identifizierten eine Nukleinsäure, die einen neuen neurotrophen Faktor kodiert, der hier als "Neublastin", oder "NBN" bezeichnet wird. Neublastin ist ein Mitglied der von Gliazelllinien abgeleiteten neurotrophen Faktoren (GDNF), einer Unterklasse der transformierende Wachstums-Faktor-β (TGF-β) Superfamilie von neurotrophen Faktoren. NBN-Polypeptide sind als Dimere biologisch aktiv und weisen als Monomere eine geringe bis keine neurotrophe Aktivität auf. Folglich wird hier eine Bezugnahme auf irgendein Neublastin-Polypeptid der Erfindung so verstanden, dass die homodimere Form des bezeichneten Neublastins, wenn nicht anderweitig spezifiziert, bezeichnet wird.
Die cDNA, die Neublastin kodiert, wurde ursprünglich wie folgt identifiziert. Unter Verwendung des TBLASTN 1.4.11-Algorithmus (Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389–3402) und menschlichem Persephin als Anfrage (GenBank Zugangsnummer AF040962) wurde anfänglich ein 290 Bp umfassendes Fragment in einer Hoch-Durchsatz genomischen Sequenz (HTGS) von zwei menschlichen künstlichen Bakterienchromosomen (BAC) mit den GenBank Eintragungen AC005038 und AC005051 identifiziert. AC005038 besteht ungefähr aus 190.000 Bp von 5 Contigs ungeordneter Sequenzen und AC005051 besteht aus ungefähr 132.000 Bp von 12 Contigs ungeordneter Sequenzen. Es erwies sich, dass das in den zwei BAC-Klonen identifizierte 290 Bp Fragment Bereiche aufweist, die zu einem kodierenden Bereich der cDNA des neurotrophen Faktors, menschlichem Persephin, homolog, jedoch nicht identisch waren.
Von dieser 290 Bp umfassenden Sequenz wurden zwei für Neublastin spezifische PCR-Primer (oberer Strang-Primer (SEQ ID No. 17) und unterer Strang-Primer (SEQ ID No. 18)) synthetisiert. Eine Durchmusterung von einer cDNA-Bibliothek des fötalen Gehirns des Menschen wurde durchgeführt. Das anfängliche Durchmustern umfasste ein 96-Loch PCR basiertes Durchmustern mit zwei PCR-Primern (SEQ ID No. 17 und 18) von einer cDNA-Bibliothek "Master-Platte" von 500.000 cDNA-Klonen, die ungefähr 5.000 Klone/Loch beinhaltet. Eine zweite PCR basierte Durchmusterung wurde an einer cDNA-Bibliothek des fötalen Hirns "Sub-Platte" ausgeführt, die eine Glycerolstammlösung von E. coli mit ungefähr 5.000 Klonen/Loch beinhaltet.
Es wurde ein 102 Bp umfassendes Fragment (SEQ ID No. 13) in den auf PCR basierenden Durchmusterungen von sowohl der Master-Plate als auch der Sub-Platte identifiziert. Ein positiver cDNA-Klon (der das 102 Bp Fragment aufweist) wurde selektioniert, auf zwei LB/Antibiotika beinhaltenden Platten ausplattiert, und über Nacht gezüchtet. Von diesen Platten wurden insgesamt 96 Bakterienkolonien selektioniert und einzeln in den Löchern einer neuen 96-Loch PCR-Platte, die beide PCR-Primer (SEQ ID No. 17 und 18) und die erforderlichen Reagenzien für eine PCR-Amplifikation beinhalteten, angeordnet. Die PCR-Amplifikation wurde dann ausgeführt und die 96 einzelnen PCR-Reaktionen wurden durch eine Elektrophorese mit einem 2% Agarosegel analysiert. Dann wurde die positive Kolonie mit dem Klon, der das 102 Bp umfassende Fragment beinhaltet, identifiziert. Es wurde Plasmid-DNA von der positiven Kolonie erhalten, die das 102 Bp Fragment beinhaltet und sequenziert. Eine anschließende Sequenzanalyse ergab die Anwesenheit einer Volllängen cDNA von 861 Bp (SEQ ID No. 8). Das offene Leseraster (ORF) von 663 Bp, das ebenfalls als der kodierende Bereich (CDS) bezeichnet wird, das in SEQ ID No. 8 identifiziert wurde, kodiert das prä-pro-Polypeptid (bezeichnet "präpro-Neublastin") und wird in SEQ ID No. 9 gezeigt. Basierend auf SEQ ID No. 9 wurden drei Varianten von Neublastin-Polypeptiden identifiziert. Diese Varianten umfassen:

(i) das 140 AA umfassende Polypeptid, das hier als NBN140 bezeichnet wird, welches die als SEQ ID No. 10 bezeichnete Aminosäuresequenz aufweist,
(ii) das 116 AA umfassende Polypeptid, das hier als NBN116 bezeichnet wird, welches die als SEQ ID No. 11 bezeichnete Aminosäuresequenz aufweist, und
(iii) das 113 AA umfassende Polypeptid, das hier als NBN113 bezeichnet wird, welches die als SEQ ID No. 12 bezeichnete Aminosäuresequenz aufweist.

Andere Varianten von Neublastin umfassen verkürzte NBN-Formen. Beispiele von jenen umfassen:

(iv) die 112 AA umfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN112 bezeichnet wird, die die 112 carboxyterminalen Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 29–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID N0: 35) oder Aminosäuren 113–224 von SEQ ID NOs:16 oder 34.
(v) die 111 AA umfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN111 bezeichnet wird, welche die 111 carboxyterminalen Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 30–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 36) oder Aminosäuren 114–224 von SEQ ID NOs:16 oder 34.
(vi) die 110 AA umfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN110 bezeichnet wird, welche die 110 carboxyterminalen Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 31–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 37) oder Aminosäuren 115–224 von SEQ ID NOs:16 oder 34.
(vii) die 109 AA umfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN109 bezeichnet wird, welche die 109 carboxyterminalen Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 32–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ IDNO: 38) oder Aminosäuren 116–224 von SEQ ID NOs: 16 oder 34.
(viii) die 108 AA umfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN108 bezeichnet wird, welche die 108 carboxyterminalen Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 39) oder Aminosäuren 117–224 von SEQ ID NOs:16 oder 34.
(ix) die 107 AA umfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN107 bezeichnet wird, welche die carboxyterminalen 107 Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 34–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 40) oder Aminosäuren 118–224 von SEQ ID NOs:16 oder 34.
(x) die 106 AA umfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN106 bezeichnet wird, welche die carboxyterminalen 106 Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 35–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 41) oder Aminosäuren 119–224 von SEQ ID NOs:16 oder 34.
(xi) die 105 AA unfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN105 bezeichnet wird, welche die carboxyterminalen 105 Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 36–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 42) oder Aminosäuren 120–224 von SEQ ID NOs:16 oder 34.
(xii) die 104 AA unfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN104 bezeichnet wird, welche die carboxyterminalen 104 Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 37–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 43) oder Aminosäuren 121–224 von SEQ ID NOs: 16 oder 34.
(xiii) die 103 AA unfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN103 bezeichnet wird, welche die carboxyterminalen 103 Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 38–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 44) oder Aminosäuren 122–224 von SEQ ID NOs:16 oder 34.
(xiv) die 102 AA unfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN102 bezeichnet wird, welche die carboxyterminalen 102 Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 39–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 45) oder Aminosäuren 123–224 von SEQ ID NOs:16 oder 34.
(xv) die 101 AA unfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN101 bezeichnet wird, welche die carboxyterminalen 101 Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 40–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 46) oder Aminosäuren 124–224 von SEQ ID NOs:16 oder 34.
(xvi) die 100 AA unfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN100 bezeichnet wird, welche die carboxyterminalen 100 Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 41–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 47) oder Aminosäuren 125–224 von SEQ ID NOs:16 oder 34.
(xvii) die 99 AA unfassende Polypeptidsequenz, die hier als NBN99 bezeichnet wird, welche die carboxyterminalen 99 Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids aufweist, beispielsweise Aminosäuren 42–140 von SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 48) oder Aminosäuren 126–224 von SEQ ID NOs: 16 oder 34.

Die hier beschriebenen Neublastin-Polypeptide können in einer beliebigen biologisch aktiven Form bereitgestellt werden, einschließlich der Form von prä-pro-Proteinen, pro-Proteinen, reifen Proteinen, glycosylierten Proteinen, nicht glycosylierten Proteinen, phosphorylierten Proteinen, nicht phosphorylierten Proteinen, verkürzten Formen, oder einem beliebig anders post-translational modifizierten Protein. Es wird angenommen, dass ein biologisch aktives Neublastin für jede NBN-Variante in der dimerisierten Form vorliegt, wobei die Dimerbildung für die Aktivität erforderlich ist. Bei einem monomeren NBN Polypeptid wird eine geringe bis keine neurotrophe Aktivität beobachtet. Ein biologisch aktives Neublastin-Polypeptid umfasst ein dimerisiertes Polypeptid, das in der Anwesenheit eines Co-Faktors (wie beispielsweise GRFα3 oder RET) an GRFα3 oder an einen Komplex von GRFα3 und RET bindet, eine Dimerisierung von RET und eine Autophosphorylierung von RET induziert. Es ist klar, dass die verkürzten Formen von hier offenbartem Neublastin (112 AA, 111 AA, 110 AA, 109 AA, 108 AA, 107 AA, 106 AA, 105 AA, 104 AA, 103 AA, 102 AA, 101 AA, 100 AA oder 99 AA Formen, die in SEQ ID NOs. 35–48 jeweils gezeigt wurden) als auch alle anderen NBN Polypeptide, die vorstehend beschrieben wurden, Dimere sind und dass jedes Dimer eine neurotrophe Aktivität aufweist.
Die gesamte cDNA-Sequenz, die die 782 Bp umfassende 5' nicht translatierte DNA, die 663 Bp umfassende kodierende DNA und die 447 3' nicht translatierte (gesamt 1992 Bp) beinhaltet, wurde bei der GenBank unter der Zugangsnummern AF 120274 eingetragen.
Die genomische Neublastin kodierende Sequenz wurde wie folgt identifiziert: Mit dem Ziel einer Klonierung der das Neublastin kodierenden genomischen Sequenz, wurde ein zusätzlicher Satz von Primern hergestellt. Insbesondere, Primerpaar Nr. 1 umfasst (Sinn gezeigt in SEQ ID No. 23 und Antisinn gezeigt in SEQ ID No. 24) und Primerpaar Nr. 2 umfasst (Sinn gezeigt in SEQ ID No. 25 und Antisinn gezeigt in SEQ ID No. 26).
Unter Verwendung von Primerpaar Nr.2 wurde ein 887 Bp umfassendes DNA Fragment durch PCR von einer Präparation einer genomischen DNA des Menschen amplifiziert und in den pCRII-Vektor (Invitrogen) kloniert und in E. coli transformiert. Das erhaltene Plasmid wurde sequenziert und es wurde eine 861 Bp umfassende mögliche cDNA-Sequenz (kodierend ein hier als Neublastin bezeichnetes Protein) vorausgesagt (wie in SEQ ID No. 3 dargelegt). In ähnlicher Weise wurde unter Verwendung von Primerpaar Nr. 1 ein 870 Bp umfassendes DNA Fragment durch PCR von menschlicher genomischer DNA erhalten. Es wurde im Vergleich zu der 887 Bp umfassenden Sequenz in diesem Fragment eine zusätzliche 42 Bp umfassende Region bei dem 3'-Terminus des offenen Leserasters (ORF) aufgefunden. Diese genomische Struktur des Neublastingens wurde durch Vergleich mit den Sequenzen von Nukleinsäuren anderer neurotropher Faktoren durch Kartieren von Exon-Intron-Grenzen vorausgesagt. Diese Analyse zeigte, dass das Neublastingen mindestens zwei Exons aufweist, die durch ein 70 Bp umfassendes Intron getrennt sind.
Diese Sequenz wurde ebenfalls dazu verwendet, um die GenBank für Neublastin EST-Sequenzen zu durchmustern. Es wurden drei, mit den Genbank-Eintragungen AA844072, AA931637 und AA533512 identifiziert, was anzeigt, dass die Nukleinsäuren von Neublastin in mRNA umgeschrieben werden.
Ein Vergleich der erhaltenen gesamten cDNA Sequenz (AF120274) und der in den Genbank-Eintragungen AC005038 und AC005051 vorhandenen genomischen Sequenz zeigte, dass das Neublastingen aus mindestens 5 Exons (einschließlich drei kodierenden) besteht, die durch vier Introns (siehe beispielsweise 7) getrennt sind. Zusammen weisen die Exons eine vorausgesagte Aminosäuresequenz eines Volllängen-Polypeptids von Neublastin auf. Es sollte ebenfalls angemerkt werden, dass für das 887 Bp umfassende Fragment festgestellt wurde, dass es die/den vollständige(n) kodierende(n) Region bzw. Bereich von pro-Neublastin beinhaltet. Die vorausgesagte cDNA (SEQ ID No. 3) beinhaltet ein offenes Leseraster (ORF), das pro-Neublastin (181 Aminosäurereste) kodiert, das zu den drei bekannten menschlichen Proteinen – Persephin, Neurturin und GDNF eine Homologie zeigte. Siehe Tabelle 3 in den Beispielen.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuren von Neublastin
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Polynukleotide bereit, die die erfindungsgemäßen Polypeptide exprimieren können. Die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen DNA, cDNA und RNA-Sequenzen, als auch Antisinn-Sequenzen und schließen natürlich vorkommende, synthetische, und vorsätzlich manipulierte Polynukleotide ein. Die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen ebenfalls Sequenzen, die als ein Ergebnis des genetischen Codes degeneriert sind, wobei sie jedoch eine Expression für ein Neublastin-Polypeptid kodieren.
Wie hier festgelegt, bezieht sich der Begriff "Polynukleotid" auf eine polymere Form von Nukleotiden von mindestens 10 Basen in der Länge, vorzugsweise mindestens 15 Basen in der Länge. Mit "isoliertem Polynukleotid" ist ein Polynukleotid gemeint, das mit beiden kodierenden Sequenzen mit denen es unmittelbar angrenzend (eines an dem 5'-Ende und eines an dem 3'-Ende) in dem natürlich vorkommenden Genom des Organismus vorliegt, von dem es abgeleitet wurde, nicht unmittelbar angrenzend bzw. zusammenhängend ist. Der Begriff umfasst folglich rekombinante DNA, die in einen Expressionsvektor, in ein autonom replizierendes Plasmid oder Virus, oder in die genomische DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten eingebaut wurde, oder die als ein getrenntes Molekül, beispielsweise eine cDNA unabhängig von anderen Sequenzen vorkommt.
Die Polynukleotide der Erfindung umfassen ebenfalls allelische Varianten und "mutierte Polynukleotide" weisen eine Nukleotidsequenz auf, die von den hier dargestellten Nukleotidsequenzen an einer oder mehreren Nukleotidpositionen verschieden sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Polynukleotid der Erfindung eine Nukleinsäure(DNA)-Sequenz auf, die mit der als SEQ ID No. 1 dargestellten Polynukleotidsequenz, der als SEQ ID No. 3 dargestellten Polynukleotidsequenz, der als SEQ ID No. 8 dargestellten Polynukleotidsequenz oder der als SEQ ID No. 15 dargestellten Polynukleotidsequenz, dessen komplementären Strang oder einer Untersequenz hiervon unter zumindest mittleren, mittleren/hohen, oder hohen Stringenzbedingungen, wie ausführlicher nachfolgend beschrieben, hybridisieren kann.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist das isolierte Polynukleotid der Erfindung eine Nukleinsäure(DNA)-sequenz auf, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, noch bevorzugter mindestens 90%, noch bevorzugter mindestens 95%, am meisten bevorzugt mindestens 99% zu der als SEQ ID No.1 dargestellten Polynukleotidsequenz, der als SEQ ID No. 3 dargestellten Polynukleotidsequenz, der als SEQ ID No. 8 dargestellten Polynukleotidsequenz, oder der als SEQ ID No. 15 dargestellten Polynukleotidsequenz homolog ist.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform weist das Polynukleotid die als SEQ ID No. 1 dargestellte DNA-Sequenz, die als SEQ ID No. 3 dargestellte DNA-Sequenz, die als SEQ ID No. 8 dargestellte DNA-Sequenz, oder die als SEQ ID No. 15 dargestellte DNA-Sequenz auf.
In dieser Erfindung werden ebenfalls neue Primer und DNA-Sequenzen zum Identifizieren, Isolieren und Vermehren bzw. Amplifizieren von Neublastin-Polypeptiden bereitgestellt, die für eine Expression von Neublastin-Polypeptiden oder Fragmenten davon, kodieren. Derartige Primer umfassen die Polynukleotide, die in SEQ ID No. 17–28 und 31–32 dargelegt sind. Außerdem stellt diese Erfindung DNA-Sequenzen von Neublastin bereit, die von jenen Primer erzeugt werden, einschließlich jenen die in SEQ ID No. 13 und 14 dargelegt sind. Weiterhin stellt diese Erfindung DNA-Sequenzen von den 3' und 5' nicht translatierten Regionen ("UTR") in genomischer DNA bereit, die die Neublastinexons flankieren, wobei derartige Sequenzen beim Identifizieren, Isolieren und Amplifizieren von Neublastin-Polynukleotiden nützlich sind, die für eine Expression von Neublastin-Polypeptiden oder Fragmenten davon kodieren.
Erfindungsgemäße 3'-UTR-Sequenzen schließen die Sequenzen ein, die dargelegt sind in:
Nukleotide 721–865 von SEQ ID NO:1,
Nukleotide 718–861 von SEQ ID NO: 3,
Nukleotide 718–861 von SEQ ID NO: 8,
Nukleotide 1647–2136 von SEQ ID NO: 15, und
angrenzende Sequenzen von zwischen 10–25 Nukleotiden, die von den vorstehenden Sequenzen (die beispielsweise als Primer nützlich sind) abgeleitet (d. h. fallen hinein) sind.
Erfindungsgemäße 5' UTR Sequenzen schließen die Sequenzen ein, die dargelegt sind in:
Nukleotide 1–10 von SEQ ID NO: 1,
Nukleotide 1–57 von SEQ ID NO: 8,
Nukleotide 1–974 von SEQ ID NO:15, und
angrenzende Sequenzen von zwischen 10–25 Nukleotiden, die von den vorstehenden Sequenzen (die beispielsweise als Primer nützlich sind) abgeleitet (d. h. fallen hinein) sind.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide können vorzugsweise durch Klonierungsverfahren, beispielsweise beschrieben in "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons, Inc.), erhalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polynukleotid von menschlicher genomischer DNA oder einer cDNA-Bibliothek von menschlichem Gehirn kloniert oder auf der Basis davon erzeugt.
Homologie von DNA-Sequenzen
Die vorstehend genannte DNA-Sequenzhomologie kann als ein Grad von Identität zwischen zwei Sequenzen ermittelt werden, was eine Abstammung bzw. Herkunft der ersten Sequenz von der zweiten anzeigt. Die Homologie kann geeigneter Weise durch im Stand der Technik bekannte Computerprogramme ermittelt werden, wie beispielsweise GAP, das in der GCG-Programmpackung (Needleman, S.B. and Wunsch C.D. Journal of Molecular Biology 48, (1970), 443–453) bereitgestellt wird. Es wird GAP mit den folgenden Einstellungen für einen DNA-Sequenzvergleich verwendet: GAP Erzeugungsstrafe von 5,0 und GAP Erweiterungsstrafe von 0,3, der kodierende Bereich der vorstehend genannten analogen DNA-Sequenzen weisen einen Grad von Identität von vorzugsweise mindestens 70% auf, noch bevorzugter von mindestens 80%, noch bevorzugter von mindestens 90% noch bevorzugter von mindestens 95%, am meisten bevorzugt von mindestens 99%, wobei der CDS(kodierende)-Teil der DNA-Sequenz in SEQ ID No.1 gezeigt wird, oder der CDS(kodierende)-Teil der DNA-Sequenz in SEQ ID No. 3 gezeigt wird, oder der CDS(kodierende)-Teil der DNA-Sequenz in SEQ ID No. 8 gezeigt wird, der CDS(kodierende)-Teil der DNA-Sequenz in SEQ ID No. 15 gezeigt wird.
Der Begriff "Sequenzidentität" bezieht sich auf den Grad, zu dem zwei Polynukleotidsequenzen auf einer Basis von Nukleotid-zu-Nukleotid über einen bestimmten Vergleichsbereich identisch sind. Der Begriff "Prozent Sequenzidentität" wird durch Vergleichen zweier optimal ausgerichteter bzw. abgeglichener Sequenzen über diesen Vergleichsbereich berechnet, wobei die Anzahl von Positionen an denen die identische Nukleinsäurebase (beispielsweise A, T, C, G, U oder I) in beiden Sequenzen auftritt, bestimmt wird, um die Anzahl zusammenpassender Positionen zu erhalten, wobei die Anzahl von zusammenpassenden Positionen durch die Gesamtanzahl von Positionen in dem Vergleichsbereich (d. h. die Fenstergröße) geteilt wird, und wobei das Ergebnis mit 100 multipliziert wird, um die prozentualen Anteil einer Sequenzidentität zu erhalten. Der wie hier verwendete Begriff "wesentlich identisch", bezeichnet eine Eigenschaft einer Polynukleotidsequenz, worin das Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die mindestens 80 Prozent Sequenzidentität aufweist, vorzugsweise mindestens 85 Prozent Identität, und häufig 90 bis 95 Prozent Identität, noch gewöhnlicher mindestens 99 Prozent Sequenzidentität, verglichen zu einer Referenzsequenz über einen Vergleichsbereich. Verfahren zum Bestimmen einer Sequenzidentität sind in Stand der Technik wohl bekannt. Siehe beispielsweise Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 (1970), 443–453.
Hybridisierungsprotokoll
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide weisen eine Nukleinsäuresequenz auf, die mit der als SEQ ID No. 1 dargestellten Polynukleotidsequenz, die mit der als SEQ ID No. 3 dargestellten Polynukleotidsequenz, die mit der als SEQ ID No. 8 dargestellten Polynukleotidsequenz, die mit der als SEQ ID No. 15 dargestellten Polynukleotidsequenz, oder deren komplementären Strang oder einer Untersequenz davon bei mittleren, mittleren/hohen oder hohen stringenten Bedingungen, wie ausführlicher nachfolgend beschrieben, hybridisieren kann.
Geeignete experimentelle Bedingungen zum Bestimmen einer Hybridisierung zwischen einer Nukleotid-Sonde und einer homologen DNA oder RNA-Sequenz, bezieht ein Vor-Durchnässen des Filters ein, der die DNA-Fragmente oder RNA beinhaltet, um in 5 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat, cf. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Cold Spring Harbor Press, NY 1989) für 10 Minuten zu hybridisieren, und eine Vor-Hybridisierung des Filters in einer Lösung von 5 × SSC, 5 × Denhardts-Lösung (cf. Sambrook et al., Op cit.), 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter, mit Ultraschall behandelter, Lachsspermien DNA (cf. Sambrook et al., Op. cit), gefolgt durch eine Hybridisierung in der gleichen Lösung, beinhaltend eine Konzentration von 10 ng/ml einer zufallsmarkierten (Feinberg A P & Vogelstein B, Anal. Biochem. 132 (1983), 6–13) ³²P-dCTP-markierten (spezifische Aktivität > 1 × 10⁹ cpm/μg) Sonde für 12 Stunden bei ungefähr 45°C. Der Filter wurde anschließend zweimal für 30 Minuten in 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei einer Temperatur von mindestens 60°C (mittlere Stringenzbedingungen), vorzugsweise von mindestens 65°C (mittlere/hohe Stringenzbedingungen), noch bevorzugter von mindestens 70°C (hohe Stringenzbedingungen) und sogar noch bevorzugter von mindestens 70°C (sehr hohe Stringenzbedingungen) gewaschen. Moleküle, die unter diesen Bedingungen an die Oligonukleotidsonde hybridisieren, können unter Verwendung eines Röntgenfilms detektiert werden.
Klonierte Polynukleotide
Die erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotide können insbesondere ein kloniertes Polynukleotid sein. Wie hier festgelegt, bezieht sich der Begriff "kloniertes Polynukleotid" auf ein Polynukleotid oder eine DNA-Sequenz, die gemäß standardisierten Klonierungsverfahren, die gegenwärtig in der Gentechnik verwendet werden, kloniert wurde, um ein Segment von DNA, das eine bestimmte cDNA sein kann, d. h. enzymatisch abgeleitet von RNA, von dessen natürlicher Lokalisierung zu einer unterschiedlichen Stelle zu verschieben bzw. zu relocieren, wo sie reproduziert wird. Das erfindungsgemäße klonierte Polynukleotid kann ein beliebiges der hier offenbarten NBN-Polypeptide kodieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die in den SEQ ID No. 2, 4–7, 9–12, 34, und 35–48 gezeigten Polypeptide.
Ein Klonieren kann durch irgendeine geeignete Route ausgeführt werden und kann Techniken, wie beispielsweise die Reverse Transkriptase Technologie, PCR Technologie und dergleichen einbeziehen, als auch Ausschneiden und Isolation des erwünschten DNA-Segments.
Das erfindungsgemäße klonierte Polynukleotid kann alternativ "DNA Konstrukt" oder "isolierte DNA-Sequenz" genannt werden und kann insbesondere eine komplementäre DNA (cDNA) sein.
Biologische Quellen
Das erfindungsgemäße isolierte Polynukleotid kann von einer beliebig geeigneten Quelle erhalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform, bei der das erfindungsgemäße Polynukleotid von einer cDNA-Bibliothek kloniert oder auf der Basis davon erzeugt wurde, beispielsweise einer cDNA-Bibliothek des fötalen oder erwachsenen Gehirns, insbesondere des Vorderhirns, des Hinterhirns, des Kortex, des Striatum, des Amygdala, des Cerebellum, des Nucleus caudatus, des Corpus callosum, des Hippocampus, des thalamischen Nucleus, des Nucleus subthalamicus, des Nucleus olfactorius, des Putamen, der Substantia nigra, der dorsalen Wurzelganglien, des Ganglion trigeminale, die obere Mesenterialarterie, oder des Thalamus, des Rückenmarks, des Herzens, der Plazenta, der Lunge, der Leber, des Skelettmuskels, der Niere, der Leber, des Pankreas, der Eingeweide, des Auges, der Retina, der Zahnpulpa, des Haarfollikels, der Prostata, der Hypophyse, oder der Luftröhre.
Im Handel sind cDNA-Bibliotheken von verschiedenen Geweben sowohl vom Menschen als auch nicht menschliche, beispielsweise von Stratagene und Clontech, erhältlich. Das erfindungsgemäße isolierte Polynukleotid kann durch standardisierte Verfahren, beispielsweise jene in den Arbeitsbeispielen beschriebenen, erhalten werden.
Erfindungsgemäße Neublastin-Polypeptide
Wie vorstehend erwähnt, ist ein wie hier verwendetes "Neublastin-Polypeptid" ein Polypeptid, das eine neurotrophe Aktivität (beispielsweise wie in Beispielen 6, 7, 8 und 9 beschrieben) aufweist und wobei jene Polypeptide eingeschlossen sind, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens eine 70% Homologie zu den "Neublastin"-Polypeptiden aufweisen, die dargelegt sind in: AA_-95-AA₁₀₅ von SEQ ID N0: 2, AA₁-AA₁₀₅ von SEQ ID NO:2, AA_-97-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 4, AA_-41-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 4, AA₁-AA₁₄₀ von SEQ ID N0: 4, AA_-80-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 9 ("Wild-Type" prä-pro), AA_-41-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 9 (pro), AA₁-AA₁₄₀ von SEQ ID NO:5 (reif 140AA), AA₁-AA₁₁₆ von SEQ ID NO: 6 (reif 116AA), AA₁-AA₁₁₃ von SEQ ID NO: 7 (reif 113AA), AA₁-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 10 (reif 140AA), AA₁-AA₁₁₆ von SEQ ID NO:11 (reif 116AA), AA₁-AA₁₁₃ von SEQ ID NO: 12 (reif 113AA), AA₁-AA₂₂₄ von SEQ ID N0:16 (Maus prä-pro), AA₁-AA₂₂₄ von SEQ ID N0: 34 (Ratten prä-pro), verkürzte Form NBN112 bis NBN99 (SEQ ID No. 35–48, jeweils) und Varianten und Abkömmlinge von jedem der Vorstehenden.
Vorzugsweise weist die C-terminale Sequenz der vorstehend identifizierten Neublastin-Polypeptide eine Aminosäuresequenz wie in AA₇₂-AA₁₀₅ von SEQ ID No. 2 (d. h. AA₁₀₇-AA₁₄₀ von SEQ ID No. 9), noch bevorzugter AA₄₁-AA₁₀₅ von SEQ ID No. 2 (d. h. AA₇₆-AA₁₄₀ von SEQ ID No. 9) dargelegt, auf.
Ebenfalls wird bevorzugt, dass das Neublastin-Polypeptid die sieben konservierten Cys-Reste beibehält, die für die GDNF-Familie und die TGF-beta Superfamilie charakteristisch sind.
Vorzugsweise weist das Neublastin-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie größer als 85%, noch bevorzugter eine Homologie größer als 90%, noch bevorzugter eine Homologie größer als 95%, am meisten bevorzugt eine Homologie größer als 99% zu den vorstehenden Sequenzen auf (AA_-95-AA₁₀₅ von SEQ ID N0: 2, AA₁-AA₁₀₅ von SEQ ID NO: 2, AA_-97-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 4, AA_-41-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 4, AA₁-AA₁₄₀ von SEQ ID N0: 4, AA_-80-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 9 ("Wild-Type" prä-pro), AA_-41-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 9 (pro), AA₁-AA₁₄₀ von SEQ ID NO:5 (reif 140AA), AA₁-AA₁₁₆ von SEQ ID NO: 6 (reif 116AA), AA₁-AA₁₁₃ von SEQ ID NO: 7 (reif 113AA), AA₁-AA₁₄₀ von SEQ ID NO: 10 (reif 140AA), AA₁-AA₁₁₆ von SEQ ID NO:11 (reif 116AA), AA₁-AA₁₁₃ von SEQ ID NO: 12 (reif 113AA), AA₁-AA₂₂₄ von SEQ ID N0:16 (Maus prä-pro), AA₁-AA₂₂₄ von SEQ ID N0: 34 (Ratten prä-pro), verkürzte Neublastin-Polypeptide NBN112 bis NBN99 (SEQ ID No. 35–48, jeweils) und wobei vorzugsweise irgendeines der vorstehenden Polypeptide mit einer C-terminalen Sequenz der vorstehend identifizierten Neublastin-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, wie dargelegt in AA₇₂-AA₁₀₅ von SEQ ID No. 2 (d. h. AA₁₀₇-AA₁₄₀ von SEQ ID No. 9), noch bevorzugter AA₄₁-AA₁₀₅ von SEQ ID No. 2 (d. h. AA₇₆-AA₁₄₀ von SEQ ID No. 9) aufweist oder AA₁₉₁-AA₂₂₄ von SEQ ID No. 16 oder 34.
Außerdem sind in dieser Erfindung jene Polypeptide vorgesehen, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens 70% Homologie zu den "Neublastin"-Polypeptiden der Maus, dargelegt in AA₁-AA₂₂₄ von SEQ ID No. 16, oder zu Neublastin-Polypeptiden der Ratte, dargelegt in AA₁-AA₂₂₄ von SEQ ID No. 34, aufweisen.
Unter den bevorzugten erfindungsgemäßen Polypeptiden ist in einer Ausführungsform die prä-pro-Sequenz (wie dargelegt in SEQ ID No. 2, 4, 9, 16 beziehungsweise 34), die pro-Sequenz (wie dargelegt in SEQ ID No. 2 oder AA-41-AA140 von SEQ ID No. 4 beziehungsweise 9), die reife Sequenz (wie dargelegt in SEQ ID No. 5, 6, 7, 10, 11 oder 12, vorzugsweise SEQ ID No. 10, 11, 12) und am meisten bevorzugt die verkürzten Sequenzen (SEQ ID No. 35–48) von Neublastin.
Die Polypeptide der Erfindung umfassen verschiedene bzw. variante Polypeptide. In dem Zusammenhang dieser Erfindung bedeutet der Begriff "variantes Polypeptid" ein Polypeptid (oder Protein), das eine Aminosäuresequenz aufweist, die von der als SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ IDNO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 34 oder SEQ ID NOs: 35–48 dargestellten Sequenz an einer oder mehreren Aminosäure-Positionen verschieden ist. Derartige variante Polypeptide umfassen die vorstehen beschriebenen, modifizierten Polypeptide, als auch konservative Substitutionen, Splice-Varianten, Isoformen, Homologe von anderen Spezies und Polymorphismen.
Wie hier definiert, bedeutet der Begriff "konservierte Substitutionen" die Ersetzung von einem Aminosäurerest durch einen anderen biologisch ähnlichen Rest. Beispielsweise würde erwartet werden, dass konservative Aminosäure-Substitutionen eine geringe oder keine Wirkung auf die biologische Aktivität aufweisen, insbesondere, falls sie weniger als 10 % der gesamten Anzahl von Resten in dem Polypeptid oder Protein darstellen. Vorzugsweise, stellen konservative Substitutionen von Aminosäuren Änderungen in weniger als 5% des Polypeptids oder Proteins dar, am meisten bevorzugt weniger als 2% des Polypeptids oder Proteins (beispielsweise, wird entsprechend mit NBN113 gerechnet, dann würden am meisten bevorzugte konservative Substitutionen weniger als 3 Substitutionen von Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des Wild-Typs darstellen). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt eine einzelne Aminosäure-Substitution in der Sequenz vor, worin sowohl die substituierte als auch die Ersatzaminosäure nicht zyklisch ist.
Andere Beispiele von besonderen konservativen Substitutionen umfassen die Substitution von einem hydrophoben Rest, wie beispielsweise Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin für einen anderen, oder die Substitution von einem polaren für einen anderen, wie beispielsweise Arginin für Lysin, Glutaminsäure für Asparaginsäure, oder Glutamin für Asparagin, und dergleichen.
Der Begriff konservative Substitution umfasst ebenfalls die Verwendung eines substituierten Aminosäurerestes anstelle von einem nicht substituierten Eltern-Aminosäurerest, vorausgesetzt, dass Antikörper, die gegen das substituierte Polypeptid gezüchtet wurden, ebenfalls mit dem nicht substituierten Polypeptid immunreaktiv sind.
Der Begriff "konservative Substitutionsvariante" bezieht sich dementsprechend auf ein Neublastin-Polypeptid, das von einem Wild-Typ oder einem Bezugs-Neublastin-Polypeptid durch die Anwesenheit von mindestens einer konservativen Aminosäure-Substitution verschieden ist.
Modifikationen einer primären Aminosäuresequenz von Neublastin können zu einem Protein führen, das verglichen mit dem nicht modifizierten Gegenstück-Polypeptid eine im Wesentlichen äquivalente Aktivität aufweist und folglich als funktionelles Analog zu den Elternproteinen angesehen werden kann. Derartige Modifikationen können vorsätzlich, beispielsweise, durch ortsgerichtete Mutagenese oder können spontan auftreten und umfassen Splice-Varianten, Isoformen, Homologe von anderen Spezies und Polymorphismen. Derartige funktionelle Analoge sind erfindungsgemäß vorgesehen.
Außerdem können Modifikationen der primären Aminosäuresequenz zu Proteinen führen, die die biologische Aktivität des Elternproteins nicht beibehalten, einschließlich dominant negativer Formen, etc.. Ein dominant negatives Protein kann das Wildtyp-Protein durch Binden an oder anderweitig sequestrierende regulierende Agenzien, wie beispielsweise stromaufwärts gelegene Komponenten, beinträchtigen, die normaler Weise funktionell mit dem Polypeptid interagieren. Derartige dominant negative Formen sind ebenfalls erfindungsgemäß vorgesehen.
Ein "Signalpeptid" ist ein Peptid, das ein neu synthetisiertes Polypeptid, an welchem das Signalpeptid angefügt vorliegt, zur weiteren post-translationalen Bearbeitung und Verteilung zu dem endoplasmatischen Retikulum (ER) leitet.
Ein wie hier in dem Zusammenhang von Neublastin verwendetes "heterologes Signalpeptid" bedeutet ein Signalpeptid, das nicht das Signalpeptid von menschlichem Neublastin ist, wobei gewöhnlich das Signalpeptid von einem anderen Säugerprotein als Neublastin ist.
Dem Fachmann wird klar sein, dass die DNA-Sequenz von Neublastin des Menschen (entweder DNA oder genomische DNA), oder Sequenzen, die von menschlicher Neublastin-DNA aufgrund von stillen Codonänderungen oder wegen Codonänderungen, die konservative Aminosäuresubstitutionen erzeugen, verschieden sind, können verwendet werden, um kultivierte menschliche Zelle genetisch so zu modifizieren, dass sie das Enzym überexprimieren oder sekretieren.
Erfindungsgemäße Polypeptide umfassen ebenfalls chimäre Polypeptide oder spaltbare Fusionspolypeptide, in/an die ein anderes Polypeptid an den N-Terminus oder den C-Terminus des Polypeptids oder Fragments davon fusioniert wurde. Ein chimäres Polypeptid kann durch Fusionieren einer Nukleinsäuresequenz (oder eines Anteils davon), die ein anderes Polypeptid kodiert, an eine Nukleinsäuresequenz (oder einen Anteil davon) der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
Techniken zur Herstellung von chimären Polypeptiden sind Standardverfahren. Derartige Verfahren erfordern normaler Weise ein Verbinden der Sequenzen in einer Weise, dass sie beide in dem gleichen Leseraster vorliegen und die Expression des fusionierten Polypeptids unter der Kontrolle des/der gleichen Promotors(en) und Terminators erfolgt.
Erfindungsgemäße Polypeptide umfassen ebenfalls verkürzte Formen des Neublastin-Polypeptids. In derartigen verkürzten Molekülen wurden eine oder mehrere Aminosäuren von dem N-Terminus oder dem C-Terminus, vorzugsweise dem N-Terminus, entfernt.
Verkürzte Neublastin-Polypeptide umfassen die hier als NBN112 (SEQ ID NO: 35), NBN111 (SEQ ID N0: 36), NBN110 (SEQ ID N0: 37), NBN109 (SEQ ID N0:38), NBN108 (SEQ ID N0:39), NBN107 (SEQ ID NO: 40), NBN106 (SEQ ID NO: 41), NBN105 (SEQ ID NO: 42), NBN104 (SEQ ID NO: 43), NBN103 (SEQ ID NO: 44), NBN102 (SEQ ID NO: 45), NBN101 (SEQ ID NO: 46), NBN100 (SEQ ID NO: 47) und NBN99 (SEQ ID NO: 48) bezeichneten Polypeptide des Menschen, und die entsprechenden Homologe von jenen verkürzten Neublastin-Polypeptiden des Menschen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Neublastin der Ratte und der Maus.
Beispielsweise umfasst die Erfindung ein verkürztes Neublastin-Polypeptid, dessen Amino-Terminus ein oder mehre aminoterminale Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids fehlen. Das heißt, dass das verkürzte Neublastin-Polypeptid die sieben Cystein-Domäne bzw. die sieben Cysteine umfassende Domäne von Neublastin beinhaltet. In mehreren Ausführungsformen umfasst das verkürzte Neublastin-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit mindestens 70% Homologie zu den Aminosäuren 12–113 von SEQ ID No. 12, d. h. NBN102 (SEQ ID No. 45). Vorzugsweise ist das verkürzte Neublastin-Polypeptid zu den Aminosäuren 12–113 von SEQ ID No. 12 zu mindestens 85% homolog. Noch bevorzugter ist das verkürzte Neublastin-Polypeptid zu den Aminosäuren 12–113 von SEQ ID No. 12 zu mindestens 95% homolog. Am meisten bevorzugt ist das verkürzte Neublastin-Polypeptid zu den Aminosäuren 12–113 von SEQ ID No. 12 zu mindestens 99% homolog. Weitere ähnliche Beispiele eines verkürzten Neublastins umfassen, beispielsweise Polypeptide, die die Aminosäuren 42–140 von SEQ ID No. 9, Aminosäuren 113–224 von SEQ ID No. 16, Aminosäuren 113–224 von SEQ ID No. 34 beinhalten. Außerdem umfassen spezifische Beispiele, sind jedoch nicht beschränkt auf NBN99 (SEQ ID NO: 48), NBN100 (SEQ ID NO: 47), NBN101 (SEQ ID NO: 46), NBN102 (SEQ ID NO: 45), NBN103 (SEQ ID NO: 44), NBN104 (SEQ ID NO: 43), NBN105 (SEQ ID NO: 42), NBN106 (SEQ ID NO: 41), NBN107 (SEQ ID NO: 40), NBN108 (SEQ ID N0:39), NBN109 (SEQ ID N0:38), NBN110 (SEQ ID N0: 37), NBN111 (SEQ ID N0: 36) und NBN112 (SEQ ID NO: 35) des Menschen, vorstehend beschrieben, oder Homologen oder Abkömmlingen davon. Verkürzte NBN Polypeptide können synthetisch, können von klonierten DNA-Konstrukten exprimiert oder das Ergebnis einer enzymatischen Spaltung von reifen NBN-Polypeptiden sein.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das verkürzte Neublastin-Polypeptid mindestens die 85 carboxyterminalen Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst es mindestens die carboxyterminalen 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 oder 112 Aminosäuren eines Neublastin-Polypeptids.
In bevorzugten Ausführungsformen bindet das verkürzte Neublastin-Polypeptid an ein RET-Polypeptid, vorzugsweise dort, wo das RET-Polypeptid auf der Oberfläche einer Säugerzelle, wie beispielsweise einem Neuron, exprimiert vorliegt.
Das verkürzte Neublastin kann unter Verwendung einer rekombinanten Expression einer Aminosäure, die ein verkürztes Neublastin-Polypeptid kodiert, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren und hier bereitgestellter Sequenzen hergestellt werden.
Alternativ, kann das verkürzte Neublastin-Polypeptid durch Bereistellen eines reifen Neublastin-Polypeptids, wie beispielsweise NBN113 von SEQ ID No. 12 erhalten werden, und wobei das reife Neublastin-Polypeptid mit mindestens einer Protease unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die geeignet sind das verkürzte Neublastin-Polypeptid herzustellen. Vorzugsweise ist die mindestens eine Protease eine Exoprotease, wobei ein Inkontaktbringen des Neublastin-Polypeptids zur Bildung von Exopeptidase Neublastin-Polypeptid Verdau-Produkt führt, das mit einer Dipeptidyl-Peptidase weiter verdaut werden kann. In alternativen Ausführungsformen ist die Protease eine Aminopeptidase, Endo Lys C oder Trypsin.
Aminosäuresequenzhomologie
Der Grad, zu dem ein Test- bzw. Kandidaten-Polypeptid mit einem Neublastin-Polypeptid der Erfindung eine Homologie teilt, wird als der Grad einer Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen ermittelt. Ein hoher Grad an Sequenzidentität zeigt eine Wahrscheinlichkeit an, dass die erste Sequenz von der zweiten Sequenz abgeleitet ist.
Die Identität wird durch eine Computeranalyse, wie beispielsweise, ohne Einschränkungen, mit dem ClustraIX-Computerausrichtungs-Programm (Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, & Higgins DG: The ClustraIX windows interface: Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools, Nucleic Acids Res. 25 (1997), 4876–4882) und den hier vorgeschlagenen Standardparametern ermittelt. Unter Verwendung dieses Programms zeigt der reife Teil eines Polypeptids, das durch eine analoge DNA-Sequenz der Erfindung kodiert wird, einen Grad von Identität von mindestens 90%, noch bevorzugter mindestens 95%, noch bevorzugter mindestens 98%, am meisten bevorzugt mindestens 99% mit der hier als SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO: 6; SEQID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 47 oder SEQ ID NO: 48 dargestellten der Aminosäuresequenz.
Basierend auf der Homologiebestimmung wurde bestätigt, dass das Neublastin-Polypeptid der Erfindung, das zu der TGF-β Superfamilie gehört, mit der GDNF Unterfamilie verwandt ist, jedoch ein unterschiedliches Mitglied dieser Unterfamilie darstellt.
Biologisch aktive Polypeptide
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann in einer beliebigen biologisch aktiven Form, einschließlich der Form von prä-pro-Proteinen, pro-Proteinen, reifen Proteinen, glycosylierten Proteinen, nicht glycosylierten Proteinen, phosphorylierten Proteinen, nicht phosphorylierten Proteinen, verkürzten Proteinen, oder irgendeinem anderen post-translational modifizierten Protein bereitgestellt werden. Ein biologisch aktives Neublastin-Polypeptid umfasst ein Polypeptid, das, falls dimerisiert vorliegend, alleine oder in der Anwesenheit eines Co-Faktors (wie beispielsweise GRFα3 oder RET) an RET bindet, eine Dimerisierung von RET und eine Autophosphorylierung von RET induziert.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann insbesondere ein N-gycosyliertes Polypeptid sein, welches Polypeptid vorzugsweise an den N-Resten glycosyliert vorliegt, was in der Sequenzliste anzeigt ist.
In einer besonderen Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Polypeptid die als SEQ ID No. 9 dargestellte Aminosäuresequenz auf, die einen glycosylierten Asparagin-Rest bei Position 122 aufweist, die als SEQ ID NO. 10 dargestellte Animosäuresequenz, die einen glycosylierten Asparagin-Rest bei Position 122 aufweist, die als SEQ ID NO. 11 dargestellte Animosäuresequenz, die einen glycosylierten Asparagin-Rest bei Position 98 aufweist, oder die als SEQ ID NO. 12 dargestellte Animosäuresequenz, die einen glycosylierten Asparagin-Rest bei Position 95 aufweist.
In dieser Erfindung sind ebenfalls Fusionsproteine von Neublastin, wie beispielsweise Ig-Fusionen vorgesehen, wie beschrieben, beispielsweise in US-P-5,434,131 , die hier durch Bezugnahme aufgenommen ist, oder Serum-Albumin-Fusionen.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das die als SEQ ID NO. 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 85%, vorzugsweise mindestens ungefähr 90%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 95%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 98% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% zu der als SEQ ID NO. 2 dargestellten Sequenz homolog ist.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 4 aufweist, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 85%, vorzugsweise mindestens ungefähr 90%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 95%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 98% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% zu der als SEQ ID NO. 4 dargestellten Sequenz homolog ist.
In einer dritten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 5 aufweist, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 85%, vorzugsweise mindestens ungefähr 90%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 95%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 98% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% zu der als SEQ ID NO. 5 dargestellten Sequenz homolog ist.
In einer vierten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 6 aufweist, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 85%, vorzugsweise mindestens ungefähr 90%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 95%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 98% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% zu der als SEQ ID NO. 6 dargestellten Sequenz homolog ist.
In einer fünften Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 7 aufweist, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 85%, vorzugsweise mindestens ungefähr 90%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 95%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 98% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% zu der als SEQ ID NO. 7 dargestellten Sequenz homolog ist.
Das Neublastin-Polypeptid der Erfindung umfasst allelische Varianten, beispielsweise die Polypeptide der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO. 5–7, in denen das erste Xaa, Asn oder Thr bezeichnen und das zweite Xaa, Ala oder Pro bezeichnen.
In einer sechsten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 9 aufweist, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 85%, vorzugsweise mindestens ungefähr 90%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 95%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 98% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% zu der als SEQ ID NO. 9 dargestellten Sequenz homolog ist.
In einer siebten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 10 aufweist, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 85%, vorzugsweise mindestens ungefähr 90%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 95%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 98% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% zu der als SEQ ID NO. 10 dargestellten Sequenz homolog ist.
In einer achten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 11 aufweist, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 85%, vorzugsweise mindestens ungefähr 90%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 95%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 98% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% zu der als SEQ ID NO. 11 dargestellten Sequenz homolog ist.
In einer neunten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 12 aufweist, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 85%, vorzugsweise mindestens ungefähr 90%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 95%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 98% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% zu der als SEQ ID NO. 12 dargestellten Sequenz homolog ist.
In einer zehnten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 16 aufweist, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 85%, vorzugsweise mindestens ungefähr 90%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 95%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 98% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% zu der als SEQ ID NO. 16 dargestellten Sequenz homolog ist, die ein pro-Neublastin mit dem Ursprung aus der Maus ist.
In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 35–48 aufweist, oder eine Aminosäuresequenz, die mindestens ungefähr 85%, vorzugsweise mindestens ungefähr 90%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 95%, noch bevorzugter mindestens ungefähr 98% und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% zu irgendeiner der als SEQ ID NO. 35–48 dargestellten Sequenz homolog ist.
In einer anderen Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Polypeptid den Fingerabdruck der GDNF Unterfamilie auf, d. h. die in Tabelle 3 unterstrichenen Aminosäure-Reste, die in den Beispielen gezeigt werden.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, das durch eine Polynukleotidsequenz kodiert wird, die unter hoch stringenten Bedingungen mit der als SEQ ID NO. 1 dargestellten Polynukleotidsequenz, deren komplementären Strang oder einer Untersequenz davon hybridisieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid durch eine Polynukleotidsequenz kodiert, die mindestens 70% homolog zu der als SEQ ID NO. 1 dargestellten Polynukleotidsequenz ist. In dessen am meisten bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polynukleotid durch die als SEQ ID NO. 1 dargestellte Polynukleotidsequenz kodiert.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung neue Polypeptide bereit, die durch eine Polynukleotidsequenz kodiert werden, die unter hoch stringenten Bedingungen mit einer als SEQ ID NO. 3 dargestellten Polynukleotidsequenz, deren komplementären Strang, oder einer Untersequenz davon hybridisieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid durch eine Polynukleotidsequenz kodiert, die zu der als SEQ ID NO. 3 dargestellten Polynukleotidsequenz zu mindestens 70% homolog ist. In deren am meisten bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid durch die als SEQ ID NO. 3 dargestellte Polynukleotidsequenz kodiert.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid die Aminosäuresequenz eines reifen Neublastin-Polypeptids. Noch mehr bevorzugt umfasst die Erfindung die Aminosäuresequenz einer verkürzten Form des Neublastin- Polypeptids, das die sieben konservierten Cysteinreste in der Aminosäuresequenz von Neublastin-Proteinen umfasst.
In einer noch weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung neue Polypeptide bereit, die durch eine Polynukleotidsequenz kodiert werden, die unter hoch stringenten Bedingungen mit der als SEQ ID NO: 8 dargestellten Polynukleotidsequenz, deren komplementären Strang, oder einer Untersequenz davon, hybridisieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid durch eine Polynukleotidsequenz kodiert, die zu der als SEQ ID NO. 8 dargestellten Polynukleotidsequenz mindestens 70% homolog ist. In deren am misten bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid durch die als SEQ ID NO. 8 dargestellte Polynukleotidsequenz kodiert.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung neue Polypeptide bereit, die durch eine Polynukleotidsequenz kodiert werden, die unter hoch stringenten Bedingungen mit der als SEQ ID NO: 15 dargestellten Polynukleotidsequenz, deren komplementären Strang, oder einer Untersequenz davon, hybridisieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid durch eine Polynukleotidsequenz kodiert, die zu der als SEQ ID NO. 15 dargestellten Polynukleotidsequenz mindestens 70% homolog ist. In deren am misten bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid durch die als SEQ ID NO. 15 dargestellte Polynukleotidsequenz kodiert.
Biologischer Ursprung
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können von Säugerzellen, vorzugsweise von einer Zelle des Menschen oder von einer Zelle mit Mausursprung isoliert werden.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Polypeptid von Herzgewebe des Menschen, vom Skelettmuskel des Menschen, vom Pankreas des Menschen, oder Gehirngewebe des Menschen isoliert werden, insbesondere von dem Nucleus caudatus oder vom Thalamus, oder es kann von DNA mit Säugerursprung, wie ausführlicher nachfolgend beschrieben, erhalten werden.
Neurotrophe Aktivität
Neublastin-Polypeptide, einschließlich verkürzten Neublastin-Polypeptiden der Erfindung, sind beim Vermitteln vom Metabolismus, Wachstum, Differenzierung oder Überleben einer Nerven- oder neuronalen Zelle nützlich. Insbesondere sind Neublastin-Polypeptide nützlich, um eine Störung oder Erkrankung eines lebenden Tiers, beispielsweise eines Menschen, dessen Störung oder Erkrankung auf die Aktivität von/eines neurotrophen Mitteln/s reagiert, zu behandeln oder zu lindern.
Antikörper
Neublastin-Polypeptide oder Polypeptidfragmente der Erfindung werden verwendet, um Neublastin spezifische Antikörper herzustellen. Wie hier verwendet, ist ein "Neublastin spezifischer Antikörper" ein Antikörper, beispielsweise ein polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper, der gegenüber einem Neublastin-Polypeptid oder Polypeptidfragment immunreaktiv ist, oder der mit Spezifität an ein Epitop eines Neublastin-Polypeptids bindet.
Die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern ist im Stand der Technik wohl bekannt. Polyklonale Antikörper können insbesondere, wie durch Green et al.,: "Production of Polyclonal Antisera" in Immunochemical Protocols (Manson, Ed.); Humana Press, 1992, Seiten 1–5; by Coligan et al.,: "Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters" in Current Protocols in Immunology. 1992, Abschnitten 2.4.1 und by Ed Harlow and David Lane (Eds.) in "Antibodies; A laboratory manual" Cold Spring Harbor Lab. Press 1988. Diese Protokolle werden hier durch Bezugnahme aufgenommen. Monoklonale Antikörper können insbesondere durch beispielsweise Kohler & Milstein, Nature, 1975,256: 495; Coligan et al., in Current Protocols in Immunology. 1992, Abschnitte 2.5.1–2.6.7; und Harlow et al., in Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, Pub., 1988, Seite 726, beschrieben, erhalten werden, welche Protokolle hier durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Kurz, monoklonale Antikörper können durch Injizieren, beispielsweise von Mäusen, mit einer Zusammensetzung erhalten werden, die ein Antigen umfasst, Prüfen der Anwesenheit einer Antikörperproduktion durch Entnehmen/Entfernen einer Serumprobe, Entfernen der Milz, um B-Lymphozyten zu erhalten, Fusionieren der B-Lymphozyten mit Myelomzellen, um Hybridome zu erzeugen, Klonieren der Hybridome, Selektionieren positiver Klone, die die Antikörper gegen das Antigen herstellen und Isolieren der Antikörper von den Hyridomkulturen.
Monoklonale Antikörper können durch eine Vielzahl gut eingeführter Techniken, einschließlich Affinitätschromatographie mit Protein A Sepharose, Größenausschluss-Chromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie, isoliert und gereinigt werden, siehe beispielsweise Coligan et al., in Current Protocols in Immunology, 1992, Abschnitte 2.7.1–2.7.12 und 2.9.1–2.9.3, und Barnes et al.,: "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", in Methods of Molecular Biology, Humana Press, 1992, Vol. 10, Seiten 79–104. Polyklonale Antikörper können wahlweise, beispielsweise durch Binden an und Eluieren von einer Matrix weiter gereinigt werden, an die das Polypeptid gegen das die Antikörper gezüchtet wurden, gebunden ist.
Antikörper, die an das Neublastin-Polypeptid der Erfindung binden, können unter Verwendung eines intakten Polypeptids oder Fragmenten, die kleine Peptide von Interesse als immunisierendes Antigen beinhalten, präpariert werden. Das zum Immunisieren eines Tieres verwendete Polypeptid kann durch rekombinante DNA-Verfahren oder durch chemische Synthese erhalten und kann wahlweise an ein Trägerprotein konjugiert werden. Gewöhnlich verwendete Trägerproteine, die chemisch an das Peptid gekoppelt werden, umfassen Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke (KLH), Thyroglobulin, Rinder-Serum-Albumin (BSA) und Tetanustoxin. Das gekoppelte Peptid kann anschließend dazu verwendet werden, um das Tier zu immunisieren, das insbesondere eine Maus, eine Ratte, ein Hamster oder ein Kaninchen sein kann.
In einer Ausführungsform werden die Antikörper unter Verwendung der folgenden Peptide hergestellt; Peptid 1: CRPTRYEAVSFMDVNST (Aminosäuren 108–124 von SEQ ID NO: 9), oder Peptid 2: ALRPPPGSRPVSQPC (Aminosäuren 93–107 von SEQ ID NO: 9). Verfahren zur Herstellung von Antikörpern unter Verwendung jener Peptide werden in Beispiel 10 beschrieben.
Polyklonale Antikörper vom Kaninchen wurden ebenfalls gegen die folgenden Peptide erzeugt:
Peptid R27: GPGSRARAAGARGC (Aminosäuren 30–43 von SEQ ID NO: 9);
Peptid R28: LGHRSDELVRFRFC (Aminosäuren 57–70 von SEQ ID NO:9);
Peptid R29: CRRARSPHDLSL (Aminosäuren 74–85 von SEQ ID NO: 9);
Peptid R30: LRPPPGSRPVSQPC (Aminosäuren 94–107 von SEQID N0: 9); und
Peptid R31: STWRTVDRLSATAC (Aminosäuren 123–136 von SEQ ID NO: 9).
Von dieser Gruppe erkannten lediglich die Peptide R30 und R31, relativ nahe an bzw. zu dem C-Terminus, unter reduzierenden Bedingungen auf einem Western-Blot das denaturierte Protein.
Zusätzliche von Neublastin abgeleitete Peptide wurden ebenfalls von dem NBN-Protein, wie nachfolgend ausgeführt, abgeleitet, die basierend auf der bekannten Struktur von GDNF (Eigenbrot and Gerber, Nat. Struct. Biol. 4 (1997), 435–438) vorausgesagte an der Oberfläche ausgesetzte Schleifen darstellen und folglich für eine Antikörperherstellung nützlich sind:
Region 1: CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC (AA43-70 von SEQ ID NO: 9)
Region 2: CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC (AA74-107 von SEQ ID NO: 9)
Region 3: CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC (AA108-136 von SEQ ID N0: 9)
In einer andere Ausführungsform der Erfindung können Antikörper, die spezifisch Neublastin oder von Neublastin abgeleitete Peptide binden, zum Detektieren der Anwesenheit derartiger Neublastin neurotropher Faktoren in verschiedenen Medien verwendet werden und insbesondere für die Diagnose von Bedingungen oder Erkrankungen, die mit den Neublastinmolekülen der Erfindung assoziiert sind. Es sind eine Vielzahl von Protokollen für eine derartige Detektion, einschließlich ELISA, RIA und FACS im Stand der Technik bekannt.
Die Antikörper dieser Erfindung können ebenfalls zum Blockieren der Wirkung des Neublastin neurotrophen Faktors verwendet werden und können insbesondere neutra lisierende Antikörper sein.
Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide
Es wird eine Zelle, die eine DNA-Sequenz umfasst, die ein erfindungsgemäßes Neublastin-Polypeptid kodiert, unter Bedingungen kultiviert, die die Herstellung des Polypeptids gestattet, gefolgt durch, wie nachfolgend ausgeführt, die Rückgewinnung des Polypeptids von dem Kulturmedium. Sollen Zellen für die Zwecke einer Herstellung eines Neublastin-Polypeptids genetisch modifiziert werden, dann können die Zellen durch herkömmliche Verfahren oder durch Genaktivierung modifiziert werden.
Gemäß herkömmlicher Verfahren kann ein DNA-Molekül, das eine cDNA oder genomische DNA Sequenz von Neublastin beinhaltet in einem Expressionskonstrukt beinhaltet sein und durch Standardverfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, durch Liposomen, Polyethylen, oder DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Elektroporation, Kalzium-Phosphat-Präzipitation, Mikroinjektion oder Geschwindigkeit getriebene Mikroinjektion ("Biolistik") in Zellen transfiziert werden. Alternativ kann ein System verwendet werden, das DNA durch einen viralen Vektor zuführt. Viren, die für einen Gentransfer bekannt sind nützlich zu sein, umfassen Adenoviren, Adeno-assoziiertes Virus, Lentivirus, Herpes-Virus, Mumps-Virus, Poliovirus, Retrovirus, Sindbis-Virus und Vaccinia-Virus, wie beispielsweise Kanarienvogel Pocken-Virus, als auch eine Baculovirus-Infektion von Insektenzellen, insbesondere SfP9 Insektenzellen.
Alternativ können die Zellen unter Verwendung einer Genaktivierungs-("GA")Ansatzes, wie beispielsweise beschrieben in den US-P-5,733,761 und 5,750,376 , die jeweils durch Bezugnahem aufgenommen sind, modifiziert werden.
Dementsprechend bedeutet der Begriff "genetisch modifiziert" wie hier in Bezug auf Zellen, Zellen zu umfassen, die ein besonderes Genprodukt folgend auf Einführung eines DNA-Moleküls exprimieren, das das Genprodukt und/oder regulatorische Elemente kodieren, die die Expression einer kodierenden Sequenz für das Genprodukt kontrollieren. Das DNA-Molekül kann durch Gen-Targeting eingefügt werden, was die Einführung des DNA-Moleküls an einer bestimmten genomischen Stelle ermöglicht.
Rekombinante Expressionsvektoren
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der das erfindungsgemäße Polynukleotide umfasst. Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung kann ein beliebig geeigneter eukaryotischer Expressionsvektor sein. Bevorzugte rekombinante Expressionsvektoren sind der den Ubiquitin-Promotor beinhaltende Vektor pTEJ-8 (FEBS Lett. 267 (1990), 289–294) und Derivate hiervon, beispielsweise pUbi1Z. Ein bevorzugter im Handel erhältlicher eukaryotischer Expressionsvektor ist, beispielsweise, der Viruspromotor beinhaltende Vektor pcDNA-3 (verfügbar von Invitrogen). Ein anderer bevorzugter Expressionsvektor verwendet SV40 frühen und Adenovirus major late Promotoren (abgeleitet von dem Plasmid pAD2beta; Norton and Coffin, Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 281).
Diese Erfindung stellt ebenfalls prokaryotische Expressionsvektoren und synthetische Gene (Syngene) mit einer Codonoptimierung für einer prokaryotische Expression bereit. Syngene wurden mit einem geringeren GC-Gehalt und bevorzugten bakteriellen (beispielsweise E. coli) Codons konstruiert. Das Syngen wurde in zwei Vektoren, pET19b und pMJB164, ein Derivat von pET19b, kloniert. Die Konstruktion mit pET19b ist in 14 gezeigt. In diesem Konstrukt ist die Sequenz, die die NBN113 Domäne von Neublastin kodiert unmittelbar an ein initiierendes Methionin fusioniert. Die Konstruktion mit pMJB164 ist in 15 gezeigt.
Produktionszellen
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine genetisch manipulierte Produktionszelle bereit, um die isolierte Polynukleotidsequenz der Erfindung und/oder einen rekombinanten erfindungsgemäßen Expressionsvektor zu umfassen. Die Zelle der Erfindung kann insbesondere genetisch manipuliert sein, um das Polypeptid der Erfindung vorübergehend oder stabil zu exprimieren, zu überexprimieren oder co-exprimieren. Verfahren zum Erzeugen einer vorübergehenden und stabilen Expression sind im Stand der Technik bekannt.
Das erfindungsgemäße Polynukleotide kann in einen Expressionsvektor, beispielsweise ein Plasmid, Virus oder ein anderes Expressionsvehikel eingefügt und durch Ligation an die Expression steuernde Sequenzen in einer Weise betriebsbereit verbunden werden, das eine Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit der Expression der Kontrollsequenzen verträglich sind. Geeignete Kontrollsequenzen der Expression umfassen Promotoren, Enhancer, Transkriptionsterminatoren, Start-Codons, Splicing-Signale für Introns und Stopp-Codons, die alle in dem korrekten Leseraster des erfindungsgemäßen Polynukleotids beibehalten werden, um so eine genaue Übersetzung von mRNA zu ermöglichen. Die Kontrollsequenzen der Expression können ebenfalls zusätzliche Komponenten, wie beispielsweise, Leader-Sequenzen und Fusions-Partnersequenzen einschließen.
Der Promotor kann insbesondere ein konstitutiver oder ein induzierbarer Promotor sein. Werden bakterielle Systeme kloniert, dann können induzierbare Promotoren, wie beispielsweise pL eines Bakteriophagen λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac Hybrid-Promotor) verwendet werden. Werden Säugersysteme kloniert, dann können Promotoren verwendet werden, die von dem Genom von Säugerzellen, beispielsweise dem Ubiquitin-Promotor, dem TK-Promotor oder dem Metallothionin-Promotor oder von Säugerviren abgeleitet sind, beispielsweise der langen terminalen Wiederholung des Retrovirus, dem späten Promotor des Adenovirus oder dem 7.5K Promotor des Vaccinia-Virus. Promotoren, die durch rekom binante DNA oder synthetische Verfahren erhalten wurden, können ebenfalls verwendet werden, um eine Transkription des erfindungsgemäßen Polynukleotids bereitzustellen.
Geeignete Expressionsvektoren umfassen gewöhnlich einen Ursprung der Expression, einen Promotor als auch spezifische Gene, die eine phänotypische Selektion der transformierten Zellen gestatten und Vektoren ähnlich dem T7-basierenden Expressionsvektor zur Expression in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56 (1987). 125), den pTEJ-8, pUbi1Z, pcDNA-3 und pMSXND Expressionsvektoren für eine Expression in Säugerzellen (Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 263 (1988), 3521), von Baculovirus abgeleitete Vektoren zur Expression in Insektenzellen umfassen und den Eizellen-Expressionsvektor PTLN (Lorenz C, Pusch M & Jentsch T.J: Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, (1996), 13362–13366).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Zelle eine eukaryotische Zelle, beispielsweise eine Säugerzelle, beispielsweise eine menschliche Zelle, eine Eizelle oder eine Hefezelle. Die Zelle der Erfindung kann ohne Einschränkung eine embryonale Nierenzelle des Menschen (HEK) sein, beispielsweise eine HEK 293-Zelle, eine BHK21-Zelle, eine Ovariumzelle des chinesischen Hamsters (CHO), eine Eizelle von Xenopus laevis. In einer Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Zelle eine Pilzzelle, beispielsweise eine Zelle eines filamentösen Pilzes. In noch einer anderen Ausführungsform ist die Zelle eine Insektenzelle, am meisten bevorzugt die Sf29 Zelle. Zusätzliche Säugerzellen der Erfindung sind PC12, HiB5, RN33b-Zelllinien, Nerven-Vorläuferzellen des Menschen und andere Zellen, die von menschlichen Zellen, insbesondere Nervenzellen, abgeleitet sind.
Beispiele primärer und sekundärer Zellen umfassen Fibroblasten, Epithelzellen einschließlich Brust- und Darmepithelzellen, Endothelzellen, geformte Elementes des Blutes, einschließlich Lymphozyten und Knochenmarkszellen, Gliazellen, Hepatozyten, Keratinozyten, Muskelzellen, Nervenzellen oder Vorläufer von all jenen Zellen. Beispiele von immortalisierten menschlichen Zelllinien, die in den gegenwärtigen Verfahren nützlich sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Bowes Melanom-Zellen (ATCC Zugangsnr. CRL 9607), Daudi-Zellen (ATCC Zugangsar. CCL 213), HeLa-Zellen und Derivate von HeLa-Zellen (ATCC Zugangsnr. CCL 2, CCL 2.1, und CCL 2.2), HL-60-Zellen (ATCC Zugangsnr. CCL 240), HT-1080-Zellen (ATCC Zugangsar. CCL121), Jurkat-Zellen (ATCC Zugangsar. TIB 152), KB Carcinomzellen (ATCC Zugangsar. CCL 17), K-562 Leukämie-Zellen (ATCC Zugangsar. CCL 243), MCF-7 Brustkrebs-Zellen (ATCC Zugangsnr. BTH 22), MOLT-4 Zellen (ATCC Zugangsnr. 1582), Namalwa-Zellen (ATCC Zugangsnr. CRL1432), Raji-Zellen (ATCC Zugangsnr. CCL 86), RPMI 8226-Zellen (ATCC Zugangsnr. CCL 155), U-937-Zellen (ATCC Zugangsnr. CRL 1593), WI-38VA13 Sublinie 2R4-Zellen (ATCC Zugangsnr. CLL 75.1) und 2780AD ovariale Carcinomzellen (Van der Blick et al., Cancer Res. 48: 5927–5932, 1988), als auch Heterohybridom-Zellen, die durch Fusion von menschlichen Zellen und Zellen einer anderen Spezies erzeugt wurden. Sekundäre Fibrobalsten-Stammkulturen des Menschen, wie beispielsweise WI-38 (ATCC Zugangsnr. CCL 75) und MRC-5 (ATCC Zugangsnr. CCL 171) können ebenfalls verwendet werden.
Ist die Zelle der Erfindung eine eukaryotische Zelle, dann kann die Einfügung des heterologen Polynukleotids der Erfindung insbesondere durch Infektion (verwenden eines viralen Vektors, durch Transfektion (verwenden eines Plasmidvektors) unter Verwendung einer Präzipitation mit Kalzium-Phosphat, Mikroinjektion, Elektroporation, Lipofektion, oder anderer im Stand der Technik bekannter physikalisch-chemischer Verfahren,) ausgeführt werden.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform wird die isolierte Polynukleotidsequenz der Erfindung und/oder ein rekombinanter Expressionsvektor der Erfindung, die/der mindestens ein DNA-Molekül umfasst, das eine zelluläre Immortalisation und/oder Transformation vermitteln kann, in eine Wirtszelle eines Säugetiers, eine Nerven-Vorläuferzelle, eine Astrozytenzelle, eine T-Zelle, eine Hämatopoietische Stammzelle, eine sich nicht teilende Zelle oder ein cerebrale Endothelzelle transfiziert.
Die Aktivierung eines endogenen Gens in einer Wirtszelle kann durch Einfügen regulatorischer Elemente, insbesondere durch das Einfügen eines Promotors erreicht werden, der die Transkription eines endogenen Gens, das das erfindungsgemäße Neublastin-Polypeptid kodiert, beeinflussen kann.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung neue pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids umfassen.
Bei der Verwendung in der Therapie kann das erfindungsgemäße Polypeptid in einer beliebig zweckdienlichen Form verabreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das erfindungsgemäße Polypeptid zusammen mit einem oder mehreren Adjuvantien, Arzneistoffträgern, Trägern und/oder Verdünnungsmitteln, eingefügt in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vor, und wobei die pharmazeutische Zusammensetzung durch den Fachmann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt wird.
Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können das Polypeptid der Erfindung oder Antikörper hiervon umfassen. Die Zusammensetzung kann alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Arzneimitteln oder Hormonen verabreicht werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung kann durch eine beliebige Route, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf intravenöse, intramuskuläre, inter-arterielle, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, transdermale, subkutane, intraperito neale, intranasale, arteriale, topikale, sublinguale, oder rektale Verabreichung, bukkal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intracranial, intraspinal, intraventrikulär, intracisternal, intrakapsulär, intrapulmonär, transmukosal oder via Inhalation verabreicht werden.
Intrapulmonäre Zuführungsverfahren, Vorrichtung und Arzneimittelpräparation werden beispielsweise in US-P-5,785,049 , 5,780,019 und 5,775,320 beschrieben, die jeweils hier durch Bezugnahme aufgenommen werden. Eine Verabreichung kann durch periodische Injektionen eines Bolus der Präparation erfolgen oder kann mehr kontinuierlich durch intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung von einem Reservoire erfolgen, das sich außerhalb (beispielsweise eine IV-Tasche bzw. Beutel) oder innerhalb (beispielsweise biologisch abbaubares Implantat, bioartifizielles Organ, oder eine Kolonie von implantierten Neublastin-Produktionszellen) befindet. Siehe beispielsweise US-P-4,407,957 , 5,798,113 und 5,800,828 , die jeweils hier durch Bezugnahme aufgenommen werden. Die intrapulmonären Zuführungsverfahren und Vorrichtung werden beispielsweise in US-P-5,654,007 , 5,780,014 und 5,814,607 , die jeweils hier durch Bezugnahme aufgenommen werden, beschrieben.
Insbesondere kann eine Verabreichung eines erfindungsgemäßen Neublastin unter Verwendung eines beliebig geeigneten Zuführungsmittels erreicht werden, einschließlich:

(a) Pumpe (siehe beispielsweise Annals of Pharmacotherapy, 27: 912 (1993); Cancer, 41: 1270 (1993); Cancer Research, 44: 1698 (1984), die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind;
(b), Mikroverkapselung (siehe, beispielsweise US-P-4,352,883 ; 4,353,888 ; und 5,084,350 , die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind,
(c) kontinuierliche Freisetzungs-Polymer-Implantate (siehe, beispielsweise Sabel, US-P-4,883,666 , die hier durch Bezugnahme aufgenommen ist,
(d) Makroverkapselung (siehe, beispielsweise US-P-5,284,761 , 5,158,881 , 4,976,859 und 4,968,733 und veröffentlichte PCT-Patentanmeldungen WO 92/19195 , WO 95/05452 , die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind,
(e) nackte oder nicht verkapselte Zelltransplantate an das ZNS (siehe, beispielsweise US-P-5,082,670 und 5,618,531 , die jeweils hier durch Bezugnahme aufgenommen sind;
(f) Injektion entweder subkutan, intravenös, intra-arteriell, intramuskulär oder an eine andere geeignet Stelle,
(g) orale Verabreichung, in Kapsel, Flüssigkeit, Tablette, Pille oder verlängerter Freisetzungsformulierung.

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das Neublastin-Polypeptid unmittelbar in das ZNS zugeführt, vorzugsweise in die Hirnventrikel, das Hirnparenchym, den intrathekalen Raum oder einen anderen geeigneten Ort des ZNS, am meisten bevorzugt intrathekal.
In einer anderen Ausführungsform wird das vorliegende Neublastin-Polypeptid durch eine systemische Zuführung über intramuskuläre Injektion, subkutane Injektion, intravenöse Injektion, oder intravenöse Infusion verabreicht.
Andere nützliche parenterale Zuführungssysteme umfassen Ethylen-Vinylacetat-Co-Polymer-Teilchen, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme, Pumpen-Zuführung, verkapselte Zell-Zuführung, Liposomen-Zuführung, durch eine Nadel zugeführte Injektion, Nadel-lose bzw. Needle-less Injektion, Vernebler, Aerosolbildner, Elektroporation und transdermales Pflaster.
Weitere Einzelheiten über Techniken zur Formulierung und Verabreichung können in der letzten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA) gefunden werden.
Der aktive Bestandteil kann in einer oder mehreren Dosen pro Tag verabreicht werden. Gegenwärtig vorgesehene geeignete Dosierungen liegen zwischen 0,5 ng Neublastin/kg Körpergewicht bis ungefähr 50 μg/kg pro Verabreichung und von ungefähr 1,0 ng/kg bis ungefähr 100 μg/kg täglich. Wird es unmittelbar dem ZNS zugeführt, dann sollte die pharmazeutische Zusammensetzung von Neublastin eine örtliche Konzentration eines neurotrophen Faktors von ungefähr 5 ng/ml Cerebrospinal-Flüssigkeit ("CSF") bis 25 ng/MLL CSF bereitstellen.
Die verabreichte Dosis muss selbstverständlich vorsichtig an das Alter, das Gewicht und den Zustand des behandelten Individuums angepasst werden, als auch die Route einer Verabreichung, Dosierungsform und Regimen und das erwünschte Ergebnis und die exakte Dosierung sollte selbstverständlich durch den Fachmann bzw. praktischen Arzt bestimmt werden.
In weiteren Ausführungsformen kann das Neublastin-Polypeptid der Erfindung durch eine genetische Zuführung unter Verwendung von Zelllinien und Vektoren, wie nachfolgend unter Methoden und Behandlung beschrieben, verabreicht werden. Um derartige therapeutische Zelllinien zu erzeugen, kann das erfindungsgemäße Polynukleotid in einen Expressionsvektor, beispielsweise ein Plasmid, Virus oder anderes Expressionsvehikel eingefügt und wahlweise mit Kontrollsequenzen der Expression durch Ligation in einer Weise betriebsbereit verbunden werden, dass eine Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit der der Kontrollsequenzen der Expression verträglich sind. Geeignete Kontrollsequenzen der Expression umfassen Promotoren, Enhancer, Transkriptionsterminatoren, Start-Codons, Splicing-Signale für Introns und Stopp-Codons, wobei alle in das genaue Leseraster des erfindungsgemäßen Polynukleotids erhalten beleiben, um so eine genaue Übersetzung der mRNA zu ermöglichen. Die Kontrollsequenzen der Expression können ebenfalls zusätzliche Komponenten, wie beispielsweise Leadersequenzen und Fusions-Partnersequenzen umfassen.
Der Promotor kann insbesondere ein konstitutiver oder induzierbarer Promotor sein. Konstitutive Promotoren können synthetisch, von einem Virus oder von dem Genom von Sängerzellen, beispielsweise dem Ubiquitin-Promotor des Menschen, abgeleitet sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die therapeutische Zelllinie eine immortalisierte Nervenzelllinie des Menschen sein, die das erfindungsgemäße Polypeptid exprimiert. Für eine Implantation wird vorgesehen zwischen 10⁵ bis 10¹⁰ Zellen zu implantieren, noch bevorzugter 10⁶ bis 10⁸ Zellen.
Behandlungsverfahren
Die vorliegende Erfindung, die Polynukleotide und Proteine, Polypeptide, Peptidfragmente oder davon hergestellte Derivate betrifft, als auch gegen derartige Proteine, Peptide oder Derivate gerichtete Antikörper, kann zur Behandlung oder Linderung einer Störung oder Erkrankung eines lebenden Tierkörpers, einschließlich eines Menschen, dessen Störung oder Erkrankung auf die Aktivität von neurotrophen Mitteln reagiert, verwendet werden.
Die Polypeptide der Erfindung können; beispielsweise, über injizierte, implantierte oder aufgenommene pharmazeutische Zusammensetzungen unmittelbar verwendet werden, um einen auf die Neublastin-Polypeptide reagierenden pathologischen Vorgang zu behandeln.
Die Polynukleotide der Erfindung, einschließlich der komplementären Sequenzen davon, können für die Expression des erfindungsgemäßen neurotrophen Faktors verwendet werden. Dies kann durch Zelllinien erreicht werden, die derartige Proteine, Peptide oder Derivate der Erfindung exprimieren oder durch virale Vektoren, die derartige Proteine, Peptide oder Derivate der Erfindung kodieren, oder durch Wirtszellen, die derartige Proteine, Peptide oder Derivate exprimieren. Jene Zellen, Vektoren und Zusammensetzungen können Behandlungszielbereichen verabreicht werden, um einen Erkrankungs- oder Störungsvorgang zu beeinflussen, der auf die Neublastin-Polypeptide reagiert.
Geeignete Expressionsvektoren können von den Lentiviren, Retroviren, Adenoviren, Herpes- oder Vaccinia-Viren abgeleitet sein, oder können von verschiedenen bakteriell hergestellten Plasmiden für eine in vivo Zuführung von Nukleotidsequenzen zu einem Gesamtorganismus oder einem Zielorgan, einem Gewebe oder einer Zellpopulation verwendet werden. Andere Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf eine Liposomen-Transfektion, eine Elektroporation, eine Transfektion mit Trägerpeptiden, die nukleäre oder andere Lokalisierungssignale beinhalten und eine Gen-Zuführung über langsam freisetzende Systeme. In einer immer noch anderen Ausführungsform der Erfindung können "antisense" Nukleotidsequenzen, die komplementär zu dem Neublastingen oder Bereichen davon sind, verwendet werden, um eine Expression von Neublastin zu hemmen oder zu erhöhen bzw. zu verstärken.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Linderung einer Störung oder Erkrankung eines lebenden Tierkörpers, einschließlich eines Menschen, dessen Störung oder Erkrankung auf die Aktivität von neurotrophen Mitteln reagiert.
Die Störung oder Erkrankung kann insbesondere eine Schädigung des Nervensystems sein, die durch ein Trauma, einen chirurgischen Eingriff, eine Ischämie, eine Infektion, eine Reperfusion, eine Stoffwechselkrankheit, einen Ernährungsmangel, einen bösartiger Tumor oder ein toxisches Mittel, oder genetische oder idiopathische Prozesse bzw. Vorgänge verursacht wird.
Die Schädigung kann insbesondere an sensorischen Neuronen oder Retinaganglienzellen erfolgt sein, einschließlich Neuronen in dem dorsalen Wurzelganglion oder in einem beliebigen der folgenden Gewebe: den knieförmigen (geniculate), felsigen (petrosal) und knotenförmigen (nodose) Ganglien, dem vestibuloakustischen Komplex des VIII Kranialnerven, dem ventrolateralen Pol des maxillomandibularen Lappen des Trigeminus-Ganglions und dem mesencephalen Nucleus trigeminus.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt die Erkrankung oder Störung als eine neurodegenerative Erkrankung vor, die mit Läsionen versehene oder traumatisierte Neuronen einbezieht, wie beispielsweise traumatisierte Läsionen von peripheren Nerven, der Medulla und/oder dem Rückenmark, cerebraler ischämischer neuronaler Schädigung, Neuropathie und insbesondere peripherer Neuropathie, peripherem Nerventrauma oder Verletzung, ischämischer Schlaganfall, akute Gehirnverletzung, akute Rückenmarksverletzung, Tumoren des Nervensystems, Multiple Sklerose, Exposition gegenüber Neurotoxinen, Stoffwechselerkrankungen, wie beispielsweise Diabetes oder Nierenfehlfunktionen und eine Schädigung, die durch infektiöse Agentien, neurodegenerative Störungen einschließlich der Alzheimer Krankheit, Huntington Krankheit, Parkinson Krankheit, Parkinson-Plus Syndromen, progressiver supranukleärer Lähmung (Steele-Richardson-Olszewski Syndrom), olivopontocerebellare Atrophie (OPCA), Shy-Drager Syndrom (multiple Systematrophie), Guamanian Parkinsonismus-Dementis-Komplex, amyotrophe Lateralsklerose oder eine andere angeborene oder neurodegenerative Erkrankung und Gedächtnismangel verbunden mit Demenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Behandlung des sensorischen und/oder autonomen Nervensystems vorgesehen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine Behandlung von Erkrankungen der Motorneurone, wie beispielsweise der amyotrophen Lateralsklerose ("ALS") und spinaler muskulärer Atrophie vorgesehen. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Verwendung der Neublastin-Moleküle dieser Erfindung vorgesehen, um eine Nervenrückgewinnung bzw. Genesung folgend auf eine traumatische Verletzung zu erhöhen. In einer Ausführungsform ist eine Verwendung eines Nervenführungskanals mit einer Matrix vorgesehen, die Neublastin-Polypeptide beinhaltet. Der artige Nervenführungskanäle sind beispielsweise offenbart in US-P-5,834,029 , die hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
In einer anderen Ausführungsform werden die Polypeptide und Nukleinsäuren dieser Erfindung (und pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gleiche beinhalten) bei der Behandlung von peripheren Neuropathien verwendet. Unter den peripheren Neuropathien, die für die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Molekülen vorgesehen sind, befinden sich durch Trauma induzierte Neuropathien, beispielsweise jene, die durch eine körperliche Verletzung oder einen Erkrankungszustand, körperliche Schädigung des Gehirns, körperliche Schädigung des Rückenmarks, Schlaganfall, der mit einer Hirnschädigung assoziiert ist, und neurologischen Störungen, die auf eine Neurodegeneration bezogen ist, verursacht werden.
Es wird ebenfalls eine Behandlung von durch Chemotherapie induzierten Neuropathien (wie beispielsweise jene, die durch eine Zuführung von chemotherapeutischen Mitteln, beispielsweise Taxol oder Cisplatin verursacht werden) vorgesehen, durch Toxin induzierte Neuropathien, durch Arzneimittel induzierte Neuropathien, durch ein Pathogen (beispielsweise durch Virus induzierte) induzierte Neuropathien, durch einen Vitaminmangel induzierte Neuropathien, idiopathische Neuropathien und diabetische Neuropathien. Siehe beispielsweise US-P-5,496,804 und 5,916,555 , die hier jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Es ist ebenfalls eine Behandlung von Mono-Neuropathien, von Mono-multiplex Neuropathien und Poly-Neuropathien, einschließlich axonaler und demyelinisierender Neuropathien unter Verwendung der erfindungsgemäßen Neublastin-Nukleotide und Polypeptide vorgesehen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Polypeptide und Nukleinsäuren der Erfindung (und pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gleiche beinhalten) bei der Behandlung verschiedener Störungen in dem Auge verwendet, einschließlich eines Verlustes des Photorezeptors in der Retina in Patienten, die an einer Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa, Glaukom und ähnlichen Erkrankungen leiden.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, um die degenerativen Änderungen zu verhindern, die mit den vorstehend erwähnten Erkrankungen und Störungen verbunden sind, indem in ein Säugerhirn menschliche Vektoren oder Zellen implantiert werden, die eine biologisch aktive Form von Neublastin oder einen Vorläufer von Neublastin herstellen können, d. h. ein Molekül, das durch den Körper einfach zu einer biologisch aktiven Form von Neublastin umgesetzt werden kann oder zusätzliche Zellen, die Neublastin sekretieren, können beispielsweise in semipermeable Membranen verkapselt werden.
Geeignete Zellen, einschließlich zur Herstellung von Neublastin konstruierter Zellen, können zur Verwendung in Transplantaten oder zum Anwachsen im Säugergehirn, einschließlich des Menschen, in vitro gezüchtet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Gen, das das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert, in eine geeignete Zelllinie, beispielsweise in eine immortalisierte Nervenstammzelllinie der Ratte HiB5 und RN33b oder in eine immortalisierte Zelllinie von Nervenvorläufern des Menschen transfiziert, wobei die erhaltene Zelllinie in das Gehirn eines lebenden Körpers, einschließlich eines Menschen implantiert wird, um das erfindungsgemäße therapeutische Polypeptid in dem ZNS, beispielsweise unter Verwendung der in der Internationalen Patent Anmeldung WO 98/32869 beschriebenen Expressionsvektoren, zu sekretieren.
Diagnose- und Durchmusterungs-Verfahren
Es kann eine Nukleinsäure von Neublastin verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Individuum prädisponiert ist eine neurologische Störung zu entwickeln, die von einem Fehler in dem Neublastingen herrührt, beispielsweise einem Fehler in einem Neublastinallel, das beispielsweise durch genetische Vererbung, durch eine anormale embryonale Entwicklung oder durch eine erworbene Schädigung der DNA erworben wurde. Die Analyse kann beispielsweise durch ein Detektieren einer/von Deletion(en) oder einer/von Punktmutation(en) in dem Neublastingen erfolgen, oder durch ein Detektieren der Vererbung einer derartigen Prädisposition derartiger genetischer Defekte mit spezifischen Restriktionsverdau-Längenpolymorphismen (RFLPs), durch ein Detektieren der Anwesenheit oder Abwesenheit eines normalen Neublastingens durch Hybridisieren einer Nukleinsäureprobe von dem Patienten mit einer/von Nukleinsäure-Sonde(n), die spezifisch für das Neublastingen sind und Bestimmen der Fähigkeit der Sonde mit der Nukleinsäure zu hybridisieren.
Insbesondere kann eine Nukleinsäure von Neublastin als eine Hybridisierungssonde verwendet werden. Derartige Hybridisierungstests können dazu verwendet werden, um die unterschiedlichen Bedingungen bzw. Zustände, Störungen oder Erkrankungen zu detektieren, prognostizieren, diagnostizieren oder zu überwachen, die mit abweichenden bzw. anormalen Spiegeln der mRNA, die das Neublastin-Protein kodiert, assoziiert sind. Eine Nukleinsäure von Neublastin kann als ein "Marker" für von Neublastin neurotrophem Faktor abhängigen physiologischen Prozesse verstanden bzw. ausgelegt werden. Diese Prozesse umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, "normale" physiologische Prozesse (beispielsweise neuronale Funktion) und pathologische Prozesse (beispielsweise neurodegenerative Erkrankung). Die Charakterisierung einer/von bestimmten Patienten-Unterpopulation(en) mit abweichenden (d. h. erhöhten oder fehlenden) Spiegeln des Neublastin-Proteins und oder der Neublastin kodierenden mRNA können zu neuen Erkrankungsklassifikationen führen. Wie hier definiert, bedeutet "abweichende Spiegel" einen erhöhten oder verringerten Spiegel relativ zu dem einer Kontrollprobe oder einem Individuum, das die Störung nicht aufweist, die durch quantitative oder qualitative Mittel bestimmt wird.
Die Nukleinsäuren und die Polypeptide von Neublastin der Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um Neublastin-Analoge, einschließlich kleiner Moleküle, zu durchmustern und zu identifizieren, die Neublastin nachahmen. In einer vorgesehenen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Test- bzw. Kandidaten-Verbindung bereit, die eine durch Neublastin vermittelte biologische Wirkung induziert, wobei das Verfahren die Schritte umfasst von, Bereitstellen einer Testzelle, die wenn sie mit Neublastin in Kontakt gebracht wird dazu induziert wird ein detektierbares Produkt zu exprimieren, Aussetzen der Zelle einer Testverbindung, und Detektieren des detektierbaren Produkts. Die Expression des detektierbaren Produkts ist bezeichnend für die Fähigkeit der Testverbindung eine durch Neublastin vermittelte biologische Wirkung zu induzieren.
Weiterhin können die Nukleinsäuren und Polypeptide des Neublastins der Erfindung auf einem DNA-Chip oder Protein-Chips, oder in Computerprogrammen verwendet werden, um verwandte neue Gensequenzen und durch sie kodierte Proteine, einschließlich allelischer Varianten und Einzelnukleotid-Polymorphismen ("SNPs") zu identifizieren. Derartige Verfahren sind beispielsweise in US-P-5,795,716 , 5,733,729 , 5,754,524 , 5,800,992 , 5,445,934 , 5,525,464 beschrieben, die hier jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Beispiele
Beispiel 1: Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren von Neublastin
Verfahren 1: Schnelles Durchmustern von fötaler Hirn cDNA des Menschen für das Neublastingen.
Es wurde ein 290 Bp umfassendes Fragment durch dessen Homologie zu menschlichem Persephin in zwei genomischen Hochdurchsatz Sequenzen (HTGS) identifiziert, die der GenBank (Zugangsnr. AC005038 und AC005051) übermittel wurden. Von der Nukleinsäuresequenz des 290 Bp umfassenden Fragments wurden zwei für Neublastin spezifische Primer synthetisiert. Der Neublastin top bzw. obere Strangprimer ("NBNint.-sense") weist die Sequenz 5'-CCT GGC CAG CCT ACT GGG-3' (SEQ ID NO: 17) auf. Der Neublastin bottom bzw. untere Strandprimer ("NBNint.antisense") weist die Sequenz 5'-AAG GAG ACC GCT TCG TAG CG-3' (SEQ ID NO: 18) auf. Mit jenen Primern wurden 96-Loch Reaktionen ausgeführt.
Eine 96-Loch Masterplatte, die Plasmid-DNA von 500.000 cDNA Klonen beinhaltete, wurde mit ungefähr 5.000 Klonen pro Loch geladen. Es wurde eine 96-Loch Unterplatte mit einer Glycerolstammlösung von E. coli DH10B verwendet, die 50 Klone pro Loch beinhaltete.
Eine Nukleinsäure von Neublastin wurde durch drei Runden einer Amplifikation unter Verwendung eines Polymerase-Ketten-Reaktion ("PCR") Verfahrens identifiziert, wobei eine Amplifikation die Anzahl von Kopien der Nukleinsäure in der Probe erhöht.
Durchmusterung der Masterplatte:
Unter Verwendung des vorstehend beschrie benen 96-Loch PCR-Durchmusterungs-Verfahrens wurde eine Masterplatte mit menschlicher fötaler Hirn-cDNA mit den gen-spezifischen Primern durchmustert, um die Neublastin cDNA des Menschen zu isolieren.
Dreißig Nanogramm (30 ng) von menschlicher fötaler Hirn-cDNA (6 ng/μl; Origene Technologies) wurden von dem entsprechenden Loch der Masterplatte erhalten und in einem Gesamtvolumen von 25 μl angeordnet, das die folgenden Reagenzien beinhaltete: 0,2 mM von jedem der zwei vorstehend erwähnten gen-spezifischen Primern (d. h. NBNint.sense und NBNint.antisense), 1 × Standard PCR-Puffer (Puffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTPs (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt bzw. Schmelze (Clontech Laboratories, USA), und 0,5 Einheiten von Taq DNA-Polymerase (5 E/μl), Advanced Biotechnologies, UK)
Die PCR Wärmezyklisierungs-Reaktionen wurden unter Verwendung des folgenden Verfahrens und Bedingungen ausgeführt. Die DNA wurde anfänglich bei 94°C für 3 Minuten denaturiert und anschließend gefolgt durch 35 Zyklen einer Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, Annealing bei 55°C für 1 Minute, eine erste Erweiterung bei 72°C für 90 Sekunden, und eine letzte Erweiterung bei 72°C für 5 Minuten. Das Produkt von 96 einzelnen PCR-Reaktionen wurde durch eine Gelelektrophorese unter Verwendung eines 2% Agarosegels analysiert, das Ethidiumbromidfarbstoff beinhaltete. Es wurde festgestellt, dass das 102 Bp umfassende positive PCR-Produkt, das in einem Loch gesehen wurde einer einzelnen 96-Loch Unterplatte entsprach.
Das 102 Bp umfassende Nukleinsäure-Fragment weist die folgende Sequenz (SEQ ID No. 13) auf: 5'-CCTGGCCAGC CTACTGGGCG CCGGGGCCCT GCGACCGCCC CCGGGCTCCC GGCCCGTCAG CCAGCCCTGC TGCCGACCCA CGCGCTACGA AGCGGTCTCC TT-3'.
Durchmusterung der Unterplatte:
Die 96-Loch Unterplatte mit menschlichem fötalem Hirn wurde durch eine durch PCR vermittelte Amplifikation durchmustert, indem 1 μl der Glycerolstammlösung von dem entsprechenden Unterplattenloch in einem Gesamtvolumen von 25 μl angeordnet wurden, das beinhaltet: 0,2 mM von jedem der zwei genspezifischen Primer, 1 × Standard PCR-Puffer (Puffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTPs (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt bzw. Schmelze (Clontech Laboratories, USA), und 0,5 Einheiten von Taq DNA-Polymerase (5 E/μl), Advanced Biotechnologies, UK).
Es wurden die gleichen Bedingungen für das PCR-Wärmezyklisieren, wie für das Durchmustern der Masterplatte beschrieben, verwendet. Die 96 einzelnen PCR-Reaktionen wurden auf einem 2% Agarosegel analysiert, das Ethidiumbromid beinhaltete, wobei ein positives Loch identifiziert wurde, das das 102 Bp umfassende PCR Fragment ergab.
Kolonie-PCR:
Ein ml der Glycerolstammlösung von dem positiven Loch der Unterplatte wurde 1:100 in Luriabrühe (LB) verdünnt. Ein ml und 10 ml der vorstehend erwähnten Verdünnung wurden dann auf zwei getrennten Agarplatten ausplattiert, die Luriabrühe ("LB") und 100 μl/ml Carbenicillin beinhalteten. Die LB-Platten wurden dann über Nacht bei 30°C inkubiert. Von jenen Platten wurden 96 Kolonien in eine neue 96-Lochplatte gepickt, die beinhaltete: 0,2 mM von jedem der zwei gen-spezifischen Primer, 1 × Standard PCR-Puffer (Puffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTPs (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt bzw. Schmelze (Clontech Laboratories, USA), und 0,5 Einheiten von Taq DNA-Polymerase (5 E/μl), Advanced Biotechnologies, UK) in einem Gesamtvolumen von 25 μl.
Es wurden die gleichen Bedingungen für das PCR Wärmezyklisieren, wie für die Masterplatte beschrieben, verwendet. Die 96 einzelnen PCR-Reaktionen wurden anschließend auf einem 2% Agarosegel, das Ethidiumbromid beinhaltete, analysiert. Es wurde eine positive Kolonie, die das 102 Bp umfassende Fragment beinhaltet, nachfolgend identifiziert.
Sequenzieren der Plasmid-DNA, die von diesem positiven Kolonie erzeugt wurde, ergab eine Volllängen cDNA von 861 Bp (SEQ ID No. 8). Die cDNA kodiert für ein präpro-Neublastin (SEQ ID No. 9). Es wurde eine automatische DNA Sequenzierung unter Verwendung des BigDye^® Terminator Zyklus Sequenzierungs-Kits (PE Applied Biosystems, USA) ausgeführt. Die Sequenzierungs-Gele wurden auf dem ABI-Prism 377 (PE Applied Biosystems, USA) laufen gelassen.
Verfahren 2: Klonieren von Neublastin cDNA vom Gehirn des Menschen:
Ein zusätzliches Verfahren einer Amplifikation der Vollängen-Neublastin cDNA oder des cDNA Fragments kann durch RACE (rapid Amplifikation of cDNA ends) ausgeführt werden, wobei die vorstehend beschriebenen spezifischen Primer von Neublastin NBNint.sense und NBNint.antisense mit Vektorspezifischen oder Adapter-spezifischen Primern, beispielsweise unter Verwendung des Marathon cDNA Amplifikations-Kits (Clontech Laboratories, USA, Kat.-Nr. K1802-1) kombiniert werden.
Es kann gesamte menschliche Hirn Marathon-Ready bzw. Fertig cDNA (Clontech Laboratories, USA, Kat.-Nr. 7400-1) verwendet werden, um die Volllängen cDNA von Neublastin zu amplifizieren. Nützliche Primer für eine Amplifikation umfassen einen Neublastin oberen Strangprimer 5'-ATGGAACTTGGACTTGG-3' (SEQ ID NO: 19) ("NBNext.sense") und einen Neublastin bottom Strangprimer 5'-TCCATCACCCACCGGC-3' (SEQ ID NO: 20) ("NBNext.antisense"), kombiniert mit dem Adapterprimer AP1, der in der Marathon-Ready bzw. Fertig cDNA enthaltet ist. Es wurde ein alternativer top Strangprimer 5'-CTAGGAGCCCATGCCC-3 (SEQ ID NO: 28) verwendet. Einweiterer alternativer bottom Strangprimer 5'-GAGCGAGCCCTCAGCC-3' (SEQ ID NO: 33) kann ebenfalls verwendet werden. In ähnlicher Weise können ebenfalls alternative bottom Strangprimer SEQ ID No. 24 und 25 ebenfalls verwendet werden.
Verfahren 3: Klonieren einer Neublastin cDNA von menschlichem Hirn:
Ein anderes Verfahren zum Klonieren einer Neublastin cDNA besteht im Durchmustern menschlicher erwachsener oder fötaler Hirn-Bibliotheken mit einer oder mehreren Neublastinsonden, die hier beschrieben (und in 1 exemplifiziert wurde) wurden. Diese Bibliotheken umfassen: λgt11 Gehirn des Menschen (Clontech Laboratories, USA, Kat.-Nr. HL3002b), oder λgt11 menschliches fötales Gehirn (Clontech Laboratories, USA, Kat.-Nr. HL3002b).
Verfahren 4: Schnelles Durchmustern von fötaler cDNA der Maus für das Neublastingen
Ein schnelles Durchmusterungsverfahren für das Neublastingen wurde auf die folgende Weise ausgeführt: Eine 96-Loch Masterplatte, die Plasmid-DNA von 500.000 cDNA-Klonen beinhaltete, wurde mit ungefähr 5.000 Klonen pro Loch geladen. Eine 96-Loch Unterplatte wurde mit einer E. coli Glycerolstammlösung verwendet, die 50 Klone pro Loch beinhaltet. Es wurden drei Runden einer durch PCR vermittelten Amplifikation durchgeführt, um ein Gen von Interesse (d. h. Neublastin) zu identifizieren.
Durchmusterung der Masterplatte:
Eine fötale cDNA Masterplatte von der Maus wurde durch eine 96-Loch PCR durchmustert, die gen-spezifische Primer verwendete, um die Neublastin cDNA der Maus zu isolieren. Es wurden die zwei folgenden Primer synthetisiert:

(1) Neublastin C2 Primer (NBNint.sense): 5'-GGCCACCGCTCCGACGAG-3' (SEQ ID NO: 21), und
(2) Neublastin C2as Primer (NBNint.antisense): 5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3' (SEQ ID NO: 22). Unter Verwendung dieser zwei gen-spezifischen Primer wurde ein 220 Bp umfassendes positives PCR-Produkt identifiziert. Die 220 Bp umfassende Nukleinsäure wies die folgende Sequenz (SEQ ID No. 14) auf:

Es wurden dann 96-Loch-Reaktionen in der folgenden Weise ausgeführt. Es wurden dreißig Nanogramm von fötaler Hirn cDNA der Maus (6 ng/μl, Origene Technologies) von dem entsprechenden Loch der Masterplatte erhalten und in einem Gesamtvolumen von 25 μl angeordnet, das ebenfalls beinhaltete: 0,2 mM von jedem der zwei vorstehend erwähnten gen-spezifischen Primer (d. h. C2 Primer NBNint.sense) und Neublastin C2as Primer(NBNint.antisense), 1 × Standard PCR-Puffer (Puffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTPs (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt bzw. Schmelze (Clontech Laboratories, USA), und 0,5 Einheiten von Taq DNA-Polymerase (5 E/μl), Advanced Biotechnologies, UK).
Es wurden die folgenden Bedingungen des PCR-Wärmezyklisierens verwendet: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 3 Minuten, gefolgt durch 35 Zyklen einer Denaturierung bei 94°C für jeweils 1 Minute, Annealing bei 55°C für 1 Minute, eine erste Erweiterung bei 72°C für 90 Sekunden, und eine letzte Erweiterung bei 72°C für 5 Minuten. Die 96 einzelnen PCR-Reaktionen wurden auf einem Ethidiumbromidfarbstoff beinhaltenden 2% Agarosegels analysiert. Das 220 Bp umfassende in einem Loch gesehene positive PCR-Produkt entsprach einer einzelnen 96-Loch Unterplatte. Die 96 einzelnen PCR-Reaktionen wurden dann durch Gelelektrophorese auf einem 2% Agarosegel, das Ethidiumbromidfarbstoff beinhaltet, analysiert. Das 220 Bp umfassende positive PCR-Produkt, das identifiziert wurde, entsprach einem einzelnen Loch der 96-Loch Unterplatte.
Durchmusterung der Unterplatte.
Die 96-Loch Unterplatter von der fötalen Maus wurde durch eine PCR vermittelte Amplifikation durchmustert, indem 1 μl der Glycerolstammlösung von dem entsprechenden Unterplattenloch in einem Gesamtvolumen von 25 μl angeordnet wurde, welches beinhaltete: 0,2 mM von jedem der zwei vorstehend erwähnten gen-spezifischen Primer, 1 × Standard PCR-Puffer (Puffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTPs (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt bzw. Schmelze (Clontech Laboratories, USA), und 0,5 Einheiten von Taq DNA-Polymerase (5 E/μl), Advanced Biotechnologies, UK). Das PCR Wärmezyklisieren wurde entsprechend den für die Durchmusterung der Masterplatte vorstehend beschriebenen Bedingungen, ausgeführt.
Die einzelnen 96 PCR Reaktionen wurden anschließend auf einem 2% Agarosegel analysiert, das Ethidiumbromid beinhaltete, wobei ein Loch identifiziert wurde, das das 220 Bp umfassende Fragment herstellte.
Kolonie-PCR:
Ein ml der Glycerolstammlösung von dem positiven Unterplattenloch wurde in Luriabrühe (LB) 1:100 verdünnt. Ein ml und 10 ml der vorstehend erwähnten Verdünnung wurden anschließend auf zwei getrennten LB-Platten, die 100 μg/ml Carbenicillin beinhalteten, ausplattiert, und bei 30°C über Nacht inkubiert. Insgesamt wurden 96 Kolonien isoliert und auf eine 96-Loch-PCR-Platte übertragen, die beinhaltete: 0,2 mM von jedem der zwei vorstehend erwähnten gen-spezifischen Primer, 1 × Standard PCR-Puffer (Puffer V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 mM dNTPs (Amersham-Pharmacia), 0,1 M GC-Melt bzw. Schmelze (Clontech Laboratories, USA), und 0,5 Einheiten von Taq DNA-Polymerase (5 E/μl), Advanced Biotechnologies, UK) in einem Endvolumen von 25 μl.
Das PCR Wärmezyklisieren wurde entsprechend den vorstehend beschriebenen Bedingungen (siehe "Durchmusterung der Masterplatte") ausgeführt. Die 96 einzelnen PCR- Reaktionen wurden durch Gelelektrophorese auf einem 2% Agarosegel, das Ethidiumbromid beinhaltet, analysiert. Eine positive Kolonie wurde durch die Anwesenheit des 220 Bp umfassenden Fragments identifiziert. Der Klone wurde durch eine automatische DNA-Sequenzierung unter Verwendung des BigDye^® Terminator Zyklus Sequenzierungs-Kits mit Ampli-Taq DNA Polymerase sequenziert. Das Sequenzierungsgel wurde auf dem ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems) laufen gelassen. Die erhaltene Sequenz von diesem Klon ergab eine Volllängen cDNA von 2136 Bp (SEQ ID No. 15) Die cDNA umfasst ein offenes Leseraster mit der vorausgesagten Aminosäuresequenz, die in SEQ ID No. 16 gezeigt ist, die für ein prä-pro-Neublastin-Polypeptid der Maus kodiert.
Beispiel 2: Klonierung von genomischem Neublastin
Wie vorstehend ausgeführt, identifizierten die Anmelder ein 290 Bp umfassendes Nukleinsäure-Fragment in zwei menschlichen BAC-Klonen mit Einträgen in der GenBank (mit den Zugangsnr. AC005038 und AC005051), die Bereiche von Homologie zu Persephin und zu den flankierenden Sequenzen von Persephin aufwiesen. Die Anmelder verwendeten die 861 Bp umfassende, vorstehend beschriebene, vorausgesagte Sequenz, um zusätzliche Primer mit dem Ziel zu gestalten, eine Nukleinsäure unter Verwendung der Lasergene-Software (DNAStar, Inc.,) zu klonieren, die zusätzliche Nukleinsäuren von Neublastin kodiert. Es wurden zwei Primerpaare verwendet, um das Neublastingen unter Verwendung von PCR-Reaktionen an genomischer DNA zu klonieren. Die zwei Primerpaare sind nachfolgend dargestellt.
Unter Verwendung von Primerpaar Nr. 1 wurde ein 887 Bp umfassendes DNA-Fragment von einer Präparation genomischer DNA des Menschen amplifiziert, die von Clontech Laboratories (Kat.-Nr. 6550-1) erworben wurde.
PCR-Protokoll:
Es wurde unter Verwendung des Expand^TM High Fidelity PCR-Systems (Boehringer Mannheim) mit Puffer 1 eine PCR ausgeführt. Das PCR-Reaktionsgemisch wurde mit 5% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 17,5 pmol von jedem dNTP in einem Gesamtvolumen von 50 μl ergänzt. Das Wärmezyklisieren wurde mit einem Vor-Denaturierungsschritt bei 94°C für 2 Minuten ausgeführt, gefolgt durch 35 Zwei-Schritt Zyklen bei 94°C für 10 Sekunden beziehungsweise 68°C für 1 Minute. Die Wärmezyklisierung wurde in einem PTC-225 DNA Engine Tetrad Thermozykler (MJ Research, MA) ausgeführt. Die PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese auf einer 2 % Agarose (FMC) analysiert und anschließend photographiert.
Das von menschlicher genomischer DNA mit Primerpaar Nr. 1 amplifizierte 887 Bp umfassende Fragment wurde in den pCRII-Vektor (Invitrogen) kloniert, und in XL 1-Blue kompetente E. coli-Zellen (Stratagene) transformiert. Das erhaltene Plasmid, bezeichnet als Neublastin-2, wurde unter Verwendung von Thermosequenase (Amersham Pharmacia Biotech) sequenziert. Die Sequenzierungsprodukte wurden durch Elektrophorese auf einem automatisierten Sequenzierer ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech) analysiert.
Die durch eine PCR-Amplifikation von menschlicher genomischer DNA mit dem zweiten Primerpaar (Primerpaar Nr. 1, vorstehend) erhaltenen Fragmente wurden sequenziert, was einen zusätzlichen 42 Bp umfassenden Bereich an dem 3' Ende des offenen Leserasters ergab. Die Volllängen-Sequenz wurde durch einen Vergleich mit den Sequenzen von Nukleinsäuren anderer neurotropher Faktoren analysiert, als auch durch ein Kartieren von Exon-Intron-Grenzen unter Verwendung von Software-Programmen für Gen-Findung, die mögliche Splicestellen und Bereiche hohen kodierenden Potentials unter Verwendung von Netgene und Gene Mark Software (Brunak et al., J. Mol. Biol. 220 (1995), 49–65; Borodovsky et al., Nucl. Acids Res., 23 (1995), 3554–3562) identifizieren. Die Exon-Intron-Grenzen wurden durch die cDNA bestätigt, die von der vorstehend beschriebenen Schnell-Durchmusterung erhalten wurde.
Wie in 7 dargestellt, weist das erhaltene Neublastingen zwei Exons auf, die durch ein 70 Bp umfassendes Intron getrennt vorliegen. Gemeinsam weisen die zwei Exons eine vorausgesagte Aminosäuresequenz eines Volllängen Neublastin-Polypeptids auf. Die vorausgesagte cDNA (SEQ ID No. 3) beinhaltet ein offenes Leseraster (ORF), das 238 Aminosäure-Reste (SEQ ID No. 4) kodiert. Der Klon von Neublastin-2 beinhaltet die vollständige kodierende Sequenz von pro-Neublastin. Die Aminosäuresequenz, die durch das Gen kodiert wird, zeigt eine hohe Homologie zu den drei Proteinen, Persephin, Neuturin und GDNF.
Beispiel 3: Expression der Nukleinsäure von Neublastin
Die Expression von Neublastin mRNA wurde sowohl in Nerven als auch in Nicht-Nervengewebe in Nagetieren und Menschen auf unterschiedlichen entwicklungsgemäß unreifen und erwachsenen Stadien unter Verwendung der nachfolgend beschriebenen Techniken, detektiert.
Verfahren zum Detektieren einer Neublastin RNA-Expression unter Verwendung von RT-PCR:
Basierend auf der als SEQ ID No.1 identifizierten Neublastin DNA-Sequenz, wurden die folgenden Primer synthetisiert:

(1) Neublastin C2 Primer 5'-GGCCACCGCTCCGACGAG-3' (SEQ ID NO: 21), und
(2) Neublastin C2as Primer 5'-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3' (SEQ ID NO: 22).

Dieser Primersatz wurde verwendet, um ein DNA-Fragment von erwachsener und fötaler Gesamt-Gehirn mRNA des Menschen durch RT-PCR zu amplifizieren. Unter den durch diese Reaktion hergestellten DNA Fragmenten befand sich eines von 220 Bp. Die Identifikation dieses 220 Bp umfassenden DNA Fragments bestätigte, dass das Neublastingen in erwachsenem und fötalem Hirngewebe exprimiert wird. Ein 220 Bp umfassendes DNA Fragment wurde ebenfalls von genomischer DNA unter Verwendung jener Primer amplifiziert.
Verfahren zum Detektieren einer Neublastin RNA Expression durch Hybridisierung eines Northern-Blots:
Es wurden Northern-Blots mit Poly-A+ RNA von erwachsenem menschlichem Gewebe von einem gewerblichen Anbieter (Clontech Laboratories, USA) erworben und mit einer ³²P-markierten Neublastin cDNA getestet. Die markierte cDNA von Neublastin wurde gemäß den in Beispiel 1 vorstehend beschriebenen Verfahren präpariert.
Präparation von Sonden:
Ein Nukleinsäure DNA Fragment von Neublastin (Nukleotide 296–819 von SEQ ID No. 8) wurde durch den Rediprime II Markierungs-Kit (Amersham, Kat.-Nr. RPN1633) zur Verwendung als eine Hybridisierungssonde, wie durch den Hersteller empfohlen, markiert. Kurz, die DNA-Probe wurde bis zu einer Konzentration von 2,5–25 ng in 45 μl eines 10 mM TE-Puffers (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA) verdünnt. Die DNA wurde anschließend durch Erhitzen der Probe auf 95–100°C für 5 Minuten in einem kochenden Wasserbad denaturiert, wobei die Probe durch Anordnen auf Eis für 5 Minuten schnell gekühlt wurde, und anschließend kurz zentrifugiert, um den Inhalt auf den Boden des Reaktionsgefäßes zu bringen. Die Gesamtmenge denaturierter DNA wurde zusammen mit 5 μl von Redivue (³²P) dCTP (Amersham Pharmacia Biotech Ltd.) in das Reaktionsgefäß hinzugegeben, das gepufferte eine Lösung von dATP, dGTP, dTTP, Exonuklease freies Klenow-Enzym und Random-Primer in getrockneter stabilisierter Form beinhaltete. Die Lösung wurde durch zweimaliges Auf- und Ab-Pipettieren, Umherbewegen der Pipettenspitze in der Lösung, gemischt, wobei das Reaktionsgemisch bei 37°C für 10 Minuten inkubiert wurde. Die Markierungsreaktion wurde durch Zugabe von 5 μl von 0,1 M EDTA gestoppt. Für eine Verwendung als eine Hybridisierungssonde wurde die markierte DNA durch Erhitzen der DNA-Probe auf 95–100°C für 5 Minuten zu Einzelsträngen denaturiert, anschließend wurde die DNA Probe für 5 Minuten auf Eis snap bzw. schnell gekühlt. Das Gefäß wurde zentrifugiert und dessen Inhalt gut gemischt. Schließlich wurde die einzelsträngige DNA-Sonde unter Verwendung des Nukleotid Entfernungs-Kits (Qiagen) gereinigt.
Hybridisierungsverfahren:
Es wurden präparierte Northern-Blots von einem gewerblichen Anbieter ("Multiple Tissue Northern Blots, Clontech Laboratories, USA, Kat.-Nr. 7760-1 und 7769-1) erworben und wurden entsprechend den Instruktionen des Hersteller unter Verwendung der, wie vorstehend präparierten, ³²P-markierten Sonde von Neublastin, hybridisiert. Für die Hybridisierung wurde ExpressHyb-Lösung (Clontech Laboratories, USA) verwendet, wobei eine Konzentration von ungefähr 3 ng/ml der markierten Sonde verwendet wurde. Die ExpressHyb-Lösung wurde auf 68°C erhitzt und anschließend gerührt, um irgendwelche Präzipitate zu lösen. Jede Northern-Blot-Membran (10 × 10 cm) wurde in mindestens 5 ml von ExpressHyb-Lösung bei 68°C für 30 Minuten in einem Hybaid Hybridisierungsofen entsprechend den Instruktionen des Herstellers vor-hybridisiert. Die ³²P-markierte Sonde von Neublastin wurde bei 95–100°C für 2 Minuten denaturiert und anschließend auf Eis schnell abgekühlt. Vierzehn Mikroliter (14 μl) der markierten Sonde wurden zu 5 ml einer frischen ExpressHyb zugegeben und sorgfältig vermischt. Die bei der Vor-Hybridisierung verwendete ExpressHyb-Lösung wurde durch die 5 ml frische ExpressHyb-Lösung, die die markierte DNA-Sonde beinhaltete, ersetzt, welche gleichmäßig über die Blots verteilt wurde. Die Blots wurden bei 68°C für 1 Stunde in einem Hybaid Hybridisierungsofen inkubiert. Nach Inkubation wurden die Blots mehrere Male bei niedriger Stringenz (2 × SSC-Puffer beinhaltend 0,05% SDS bei Raumtemperatur) gespült und gewaschen, gefolgt durch einen Waschvorgang bei hoher Stringenz (0,1 × SSC, beinhaltend 0,1% SDS bei 50°C) (20 × SSC ist 0,3 M NaCl/0,3 M Na Citrat, pH-Wert 7,0). Die Blots wurden einem Hyperfilm MP (Amersham Pharmacia Ltd.) bei –80°C unter Verwendung von Verstärkerschirmen ausgesetzt.
Die Ergebnisse der Hybridisierungs-Experimente von Northern-Blots werden in 1 dargestellt. 1A (links) und 1B (rechts) sind Northern-Blots von PolyA+-RNA, die mit ³²P-markierter Neublastin cDNA, wie in Beispiel 3 beschrieben, getestet wurden. Die Marker stellen Polynukleotide von 1,35 Kilobasenpaaren ("kB"), 2,4 kB, 4,4 kB, 7,5 kB und 9,5 kB in der Größe dar. Die Membran von 1A wurde mit mRNA hergestellt, die von verschiedenen erwachsenen Geweben des Menschen extrahiert wurden: Aus den Ergebnissen der Hybridisierungsanalyse der Northern-Blots schließen die Anmelder, dass Neublastin mRNA in zahlreichen erwachsenen Geweben des Menschen exprimiert wird. Der höchste Grad einer Neublastin-Expression wird in dem Herzen, in dem Skelettmuskel und in dem Pankreas detektiert. Die Membran von 1B wurde mit RNA hergestellt, die von verschiedenen Bereichen des erwachsenen Gehirns des Menschen extrahiert wurde. In dem Erwachsenen-Gehirn wird der höchste Grad einer Expression in dem Nucleus caudatus und in dem Thalamus gesehen. Ein mRNA-Transkript von ungefähr 5 kB war die vorherrschende Form der in dem Gehirn exprimierten Neublastin mRNA.
Verfahren zum Detektieren einer Neublastin RNA-Expression unter Verwen dung von in-situ Hybridisierung in Geweben:
Die folgenden Verfahren werden verwendet, um die Expression von Neublastin RNA in tierischen Geweben, beispielsweise Nagergeweben mit einer Antisense bzw. Antisinn-Sonde von Neublastin, zu erfassen.
Expression in Mäusen:
Herstellung von Gewebeproben:
Zeitlich trächtige Mäuse (B&K Universal, Stock holm, Schweden) wurden durch Genickbruch am Trächtigkeitstag 13,5 oder 18,5 getötet. Es wurden die Embryonen unter sterilen Bedingungen durch Sezieren entfernt und unmittelbar in einer Lösung von 0,1 M Phosphat-Puffer (PB), der 4% Paraformaldehyd ("PFA") beinhaltet, für 24–30 Stunden eingetaucht und anschließend von dem PFA entfernt und in PBS gelagert. Das Gewebe wurde zur Sektion vorbereitet, indem das Gewebe in einer Lösung von 30% Sucrose eingetaucht und dann in TissueTech (O.C.T. Compound, Sakura Finetek USA, Torrance, CA) eingebettet wurde. Es wurden sechs Serien von koronal und sagittal Sektionen (12 um jeweils) an einem Kryostat geschnitten und auf positiv geladenen Objektträgern Tau bzw. auftauend angebracht. Es wurden Neonatale Köpfe/Gehirne (P1, P7) dem gleichen Protokoll, wie für die Embryonal-Stadien, folgend, angebracht bzw. befestigt und Gewebe Erwachsener wurde seziert, sofort auf Trockeneis gefroren, und an einem Kryostat ohne irgendein vorheriges Einbetten geschnitten.
Herstellung von Ribo-Sonden von Neublastin:
Eine Antisinn Neublastin RNA-Sonde (hiernach eine "Neublastin-Ribo-Sonde") wurde wie folgt hergestellt. Nukleotide 1109–1863 der Neublastin cDNA Sequenz der Maus (SEQ ID No. 15) wurden in dem BlusScript-Vektor (Stratagene) subkloniert. Das erhaltene Plasmid wurde unter Verwendung von der EcoRI Restriktionsendonuklease in lineare DNA geschnitten. Das EcoRI DNA-Fragment wurde mit T3 RNA-Polymerase und dem Digoxigenin ("DIG") RNA-Markierungs-Kit entsprechend den Instruktionen des Herstellers (Boehringer Mannheim) in vitro transkribiert.
Hybridisierung:
Die Kryostat-Schnitte wurden für 10 Minuten in 4% PFA fixiert, für 5 Minuten mit 10 mg/ml Proteinase K behandelt, sequentiell in 70% und 99% Ethanol für 5 beziehungsweise 3 Minuten dehydriert und anschließend an der Luft getrocknet. Der Hybridisierungspuffer (50% deionisiertes Formamid, 10% von einer 50% Dextransulfat-Lösung, 1% Denhardt's Lösung, 250 μg/ml Hefe tRNA, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8), 5 mM EDTA, 10 mM NaPO₄, 1% Sarcosyl), der 1 μg/ml der DIG-markierten Sonde beinhaltete, wurde für 2 Minute auf 80°C erhitzt und auf die Schnitte aufgebracht. Die Schnitte wurden dann mit Parafilm bedeckt und für 16–18 Stunden bei 55°C inkubiert.
Am nächsten Tag wurden die Schnitte mit hoher Stringenz (2 × SSC beinhaltend 50% Formamid) bei 55°C für 30 Minuten gewaschen und anschließend dann in RNase freiem Puffer gewaschen und mit 20 μg/ml von RNase A für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Um die DIG-markierte Sonde zu detektieren, wurden die Schnitte in einer Blockier-Lösung (PBS beinhaltend 0,1% Tween-20 und 10% durch Hitze inaktiviertes Ziegenserum) für 1 Stunden vorinkubiert und dann über Nacht bei 4°C mit einer 1:5.000 Verdünnung eines mit alkalischer Phosphatase gekoppeltem Anti-DIG-Antikörper (Boehringer Mannheim) inkubiert. Am nächsten Tag erhielt jeder Schnitt vier zweistündige Waschvorgänge in PBS beinhaltend 0,1% Tween-20, und anschließend zwei zehnminütige Waschvorgänge in NTMT-Puffer (100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,5), 50 mM MgCl₂, 0,1% Tween-20). Die Schnitte wurden dann in BM-Violett-Substrat für 48 Stunden inkubiert, das 0,5 mg/ml von Levamisol beinhaltet. Die Farbreaktion wurde durch Waschen in PBS gestoppt. Die Schnitte wurden an der Luft getrocknet und mit einem Deckglas mit DPX (KEBO-lab, Schweden) bedeckt.

Die Ergebnisse der in situ Hybridisierungsreaktionen sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Expression von Neublastin in Mäusen

Struktur	E13.5	E18.5	P1	P7	Erwachsen
Vorderhirn	++
Ventrales Mittelhirn	-
Dorsale Wurzelganglien	++
Rückenmark	+
Retina		+++	+++	+
Olfaktorischer Bulbus		++	++	++
Zahnpulpa		++	++	+
Trigeminal Ganglien		++	++	++
Striatum		+	+	++
Cortex		++	++	++	+
Gyrus dentatus				++	+

Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde am Embryonal-Tag 13,5 ("E13,5") Neublastin im Rückenmark und in dem Hinterhirn, und schwach in dem Vorderhirn exprimiert. Die Neublastin-Expression wurde ebenfalls in der sich entwickelnden Retina und in den sensorischen Ganglien (dorsalen Wurzelganglien und trigeminal Ganglien (V)) detektiert. Außerhalb des Nervensystems wurde ein schwaches Signal in der Niere, der Lunge und dem Magendarm-Trakt aufgefunden, was darauf hinweist, dass Neublastin ebenfalls in jenen Geweben exprimiert wird.
Am Embryonal-Tag 18,5 ("E18,5") wurde Neublastin hauptsächlich in den trigeminal Ganglien (V) exprimiert. Eine Neublastin-Expression war ebenfalls in der Retina, dem Striatum, und dem Cortex detektiert worden. Außerdem wurde eine Expression in der Zahnanlage gesehen.
Erneut wurde in Tabelle 1 eine ansteigende Neublastin-Expression von dem E18,5-Zeitpunkt bis zu den Tagen 1 und 7 nach der Geburt in dem Cortex, dem Striatum und den trigeminalen Ganglien (V) beobachtet. Die Neublastin-Expression war in den äußeren Schichten des Cortexes markanter als in den inneren Schichten des Cortexes. An P7 wurde festgestellt, dass eine Expression in den gleichen Strukturen wie an Tag 1 stattfand, wobei jedoch zusätzlich eine Neublastin-Expression in dem Hippocampus, insbesondere im Gyrus dentatus, festgestellt wurde, wobei die Neublastin-Expression in anderen getesteten Geweben sehr gering war oder nicht detektierbare Spiegel aufwies.
Expression in Ratten:
Die folgenden Experimente beschreiben die Hybridisierung von Rattengewebe mit einer mit alkalischer Phosphatase markierten Oligodesoxynukleotid Neublastin Antisinn-Sonde.
Herstellung von Gewebeproben:
Es wurden Rattenembryonen (E14) von trächtigen Wistar-Ratten (Møllegård, Denmark) folgend auf eine Anästhesie mit Pentobarbital, erhalten. Postnatale Ratten (P0, P7, Erwachsen) wurden durch Enthauptung getötet. Sezierte Gehirne und Gesamt-Köpfe wurden unmittelbar in kaltes 0,9% NaCl getaucht, frisch gefroren und mit 20 μm auf einem Kryostat (koronal und sagittal Schnitte, 10 Serien) geschnitten.
In situ-Hybridisierung:
Es wurden unter Verwendung einer mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugierten Antisinn Oligodesoxynukleotid-Sonde (5'-NCA GUT GGT CCG TGG GGG GCG CCA AGA CCG G-3' (SEQ ID NO: 27) Oligo. Nr. 164675, DNA Technology, Denmark) wurden zwei Serien von Schnitten hybridisiert. Diese Sonde ist zu den Basen 1140 bis 1169 der Neublastin cDNA der Maus von SEQ ID No. 15 komplementär.
Vor einer Hybridisierung wurden die Schnitte bei Raumtemperatur luftgetrocknet, für 10 Minuten bei 55°C erhitzt und anschließend mit 96% Ethanol bei 4°C über Nacht behandelt. Die Schnitte wurden dann luftgetrocknet und in Hybridisierungsmedium (5,0 pmol Sonde/ml) über Nacht bei 39°C (Finsen et al., Neurosci. 47 (1992), 105–113; West et al., J. Corp. Neurol. 370 (1996), 11–22) inkubiert.
Die Behandlung nach der Hybridisierung bestand aus vier dreißigminütigen Spülungen in 1 × SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat) bei 55°C, gefolgt von drei zehnminütigen Spülungen in Tris-HCl, pH-Wert 9,5 bei Raumtemperatur bevor der AP-Entwickler aufgebracht wurde. Der AP-Entwickler wurde unmittelbar vor der Verwendung hergestellt und beinhaltet Nitroblautetrazolium (NBT, Sigma), 5-Brom, 4-Chloro, 3-Indolylphosphat (BCIP), Sigma) und Tris-HCl-MgCl₂ Puffer, pH-Wert 9,5 (Finsen et al., Neurosci. 47 (1992), 105–113). Die AP-Entwicklung lief im Dunklen bei Raumtemperatur für 48 Minuten ab. Die Farbreaktion wurde durch Spülen der Schnitte in destilliertem Wasser gestoppt. Die Schnitte wurden in klassiertem Aceton dehydriert, weich gemacht in Xylen-Phenolcreosot (Allchem, UK), geklärt in Xylen und unter Verwendung von Eukitt (Bie & Bernsten, Denmark) mit einem Deckglas versehen.

Kontrollreaktionen bestanden aus (1) einer Vor-Behandlung der Schnitte mit RNase A (50 μg/ml, Pharmacia, Schweden) vor der Hybridisierung, (2) einem Hybridisieren der Schnitte mit einem hundertfachen Überschuss von nicht markierter Sonde und (3) einem Hybridisieren der Schnitte mit Hybridisierungspuffer alleine. Die Ergebnisse der Hybridisierungsreaktionen sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Expression von Neublastin in Ratten

Struktur	E14	P0/P1	P7	Erwachsen
Vorderhirn	++
Ventrales Mittelhirn	-
Dorsale Wurzelganglien	++
Rückenmark	+
Retina	+
Olfaktorischer Bulbus	(+)	++	++
Cerebellum		+	++	+
Trigeminal Ganglien		++	++
Striatum		+	+(+)
Cortex	(+)	++	++	+
Hippocampus		(+)	++	++

An dem Embryonal-Tag 14 (E14) war Neublastin in den Rattenembryonen in dem Vorderhirn, in dem Hinterhirn und in dem Rückenmark schwach exprimiert. Neublastin mRNA war ebenfalls in den Augen (Retina), den dorsalen Wurzelganglien, den trigeminalen Ganglien (V), und den Nieren, den Lungen, dem Herz, der Leber und dem Magen-Darm-Trakt detektiert worden. Neugeborene (P0) Ratten wiesen eine bemerkenswerte Neublastin-Expression in dem Cortex und im Striatum auf. Eine Neublastin-Expression war ebenfalls in dem olfaktorischen Bulbus und in dem Hippocampus detektiert worden. In 7 Tage alten Ratten (P7) war Neublastin in dem Cortex, dem Striatum, dem olfaktorischen Bulbus und in dem Cerebellum exprimiert. Ein merkliches Signal war in dem Hippocampus zu beobachten. In erwachsenen Ratten war die detektierte Neublastin-Expression in den meisten Bereichen des Gehirns sehr niedrig oder nicht detektierbare Spiegel. Schwache Signale wurden in dem thalamischen Nucleus detektiert, wobei eine merkliche Neublastin-Expression in dem Hippocampus detektiert wurde.
Beispiel 4: Neublastin-Polypeptide
Das offene Leseraster, oder der kodierende Bereich (CDS), der in SEQ ID No. 8 identifiziert wurde, kodiert das prä-pro-Polypeptid (bezeichnet "prä-pro-Neublastin"). Die von diesem offenen Leseraster vorausgesagte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID No. 9 gezeigt. Basierend auf SEQ ID No. 9 wurden drei Varianten von Neublastin-Polypeptiden identifiziert. Jene Varianten umfassen: (i) das Polypeptid, das hier als NBN140 bezeichnet wurde, welches die Aminosäuresequenz aufweist, die als SEQ ID No. 10 bezeichnet wird, (ii) das Polypeptid, das hier als NBN116 bezeichnet wird, welches die Aminosäuresequenz aufweist, die als SEQ ID No. 11 bezeichnet wird, und (iii) das Polypeptid, das hier als NBN113 bezeichnet wird, welches die Aminosäuresequenz aufweist, die als SEQ ID No. 12 bezeichnet wird.
In ähnlicher Weise wurden, basierend auf dem kodierenden Bereich (CDS) der als SEQ ID No. 3 identifiziert wurde, der das prä-pro-Polypeptid kodiert und die Amino säuresequenz (bezeichnet als SEQ ID No. 4) aufweist, drei Varianten von Neublastin identifiziert. Diese Varianten umfassen: (i) das Polypeptid, das die als SEQ ID No. 5 bezeichnete Aminosäuresequenz aufweist, (ii) das Polypeptid, das die als SEQ ID No.6 bezeichnete Aminosäuresequenz aufweist, und (iii) das Polypeptid, das die als SEQ ID No. 7 bezeichnete Aminosäuresequenz aufweist.
Basierend auf einer CLUSTAL W (1,75)-basierenden Mehrfach-Sequenzangleichung wurde Neublastin von SEQ ID No. 9 (Linie 2) mit den Aminosäuresequenzen von Neuturin (SEQ ID No. 49, Linie 1), Persephin (SEQ ID No. 50, Linie 3) und GDNF (SEQ ID No. 51, Linie 4) an- bzw. abgeglichen. Die Angleichung ist in Tabelle 3 dargestellt.
Von der in Tabelle 3 gezeigten Aminosäuresequenz-Angleichung kann ersehen werden, dass Neublastin sieben konservierte Cysteinreste an Stellen aufweist, die innerhalb der TGF-β Superfamilie konserviert sind. In einer Ausführungsform beinhaltet das bevorzugte Neublastin-Polypeptid (sieben) Cysteine, die wie in SEQ ID No. 2 bei den Positionen 8, 35, 39, 72, 73, 102 und 103, oder wie in SEQ ID No. 4 und 9 bei Positionen 43, 70, 74, 107, 108, 136 und 138 konserviert sind. Diese sieben konservierten Cysteinreste sind bekannt in der TGF-β Superfamilie drei intramonomere Disulfidbindungen (vorgesehen beispielsweise in SEQ ID No. 2 zwischen Cysteinresten 8–73, 35–101 und 39–103, und beispielsweise in SEQ ID No. 4 und 9 zwischen den Cysteinresten 43–108, 70–136 und 74–138) und einer intermonomeren Disulfidbindung (vorgesehen beispielsweise in SEQ ID No. 2 zwischen den Cysteinresten 72–72 und beispielsweise in SEQ ID No. 4 und 9 zwischen den Cysteinresten 107–107), die zusammen mit dem erweiterten Beta-Strangbereich das konservierte Strukturmotiv für die TGF-β Superfamilie bildet. Siehe beispielsweise Daopin et al., Proteins 17 (1992), 176–192.
Basierend auf dieser Sequenzangleichung wurde gezeigt, dass Neublastin ein Mitglied der GDNF Unterfamilie von neurotrophen Faktoren (LGLG-FR(Y/F)CSGSC-QxCCRP-SAxxCGC, der GDNF Unterfamilien-Fingerabdruck, unterstrichen in Tabelle 3) darstellt.
Die hier beschriebenen verkürzten Neublastin-Polypeptide umfassen vorzugsweise eine Polypeptidsequenz, die die in der Neublastinsequenz konservierten sieben Cysteinreste umfasst. Beispielsweise umfassen die verkürzten Neublastin-Polypeptide die Aminosäuren 15–113 (eine 99 AA NBN Form) von einem NBN113-Polypeptid, oder die Aminosäuren 12–113 des NBN113 Polypeptids (eine 102 AA NBN Form). Diese Aminosäuresequenzen können beispielsweise an Aminosäuren 42–140 der NBN Polypeptidsequenz des Menschen, gezeigt in SEQ ID No. 9 (99 AA NBN Polypeptid, SEQ ID No. 48) beziehungsweise Aminosäuren 39–140 von SEQ ID NO: 9 (102 AA NBN Polypeptid; SEQ ID NO: 45) aufgefunden werden. Die Sequenzen können ebenfalls bei beispielsweise Aminosäuren 126–224 von SEQ ID No. 34 (Ratte 99 AA NBN Polypeptid) und bei Aminosäuren 123–224 von SEQ ID No. 34 (Ratte 102 AA NBN Polypeptid) aufgefunden werden. In ähnlicher Weise sind ebenfalls die verkürzten Neublastinsequenzen von NBN99, NBN100, NBN101, NBN 102, NBN 103, NBN 104, NBN 105, NBN 106, NBN 107, NBN 108, NBN 109, NBN 110, NBN 111 und NBN 112, wie vorstehend definiert, umfasst.

Die Homologie von Neublastin zu anderen Mitgliedern der GDNF-Familie wurde berechnet, wobei die Ergebnisse nachfolgend in Tabelle 4 dargestellt sind. Tabelle 4: Homologie von Neublastin-Polypeptiden zu anderen Mitgliedern der GDNF-Familie

	Reifes Protein NBN140				Reifes Protein NBN113
	Homologie			Homologie von Voll längen-Peptiden	Homologie			Homologie von Vol llängen-Peptiden
Neurotropher Faktor	Identität	Überlappung (aa)	Starke Homologie	Identität	Identität	Überlappung (aa)	Starke Homologie	Identität
GDNF	34% (47/137)	137	48% (67/137)	31,9%	36% (41/111)	111	52% (59/111)	29,5%
NTN	48% (61/127)	127	56% (72/127)	36,9%	49% (56/114)	114	57% (66/114)	44,7%
PSP	44% (55/125)	125	56% (71/125)	36,9%	45% (51/111)	111	57% (65/111)	44,3%
IHA	31% (25/81)	81	-	25,2%	31% (25/81)	81	-	22,5%
TGF-β2	23% (17/73)	73	-	18,5%	23% (17/73)	73	-	20,2%

GDNF = Gliazelllinien abgeleiteter neurotropher Faktor
NTN = Neuturin
PSP = Persephin
IHA = Inhibin-α
TGF-β2 = Transformierender Wachstums-Faktor-β2
Eine starke Homologie zeigt an, dass eine der folgenden "starken" Gruppen konserviert sind: STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW.

Beispiel 5: Herstellung von Neublastin
Neublastin wurde, wie nachfolgend beschrieben, sowohl in eukaryotischen als auch in prokaryotischen Zellen exprimiert.
Expressionsvektoren:
Die Neublastin kodierende cDNA wurde in den eukaryotischen Expressionsvektor pUbi1Z eingefügt. Dieser Vektor wurde durch Klonieren des menschlichen UbC-Promotors in einer modifizierten Version von pcDNA3.1/Zeo hergestellt. Das nicht modifizierte pcDNA3.1/Zeo ist im Handel verfügbar (Invitrogen). Das modifizierte pcDNA3.1/Zeo ist kleiner als der Elternvektor, da das Ampicillingen (von Positionen 3933 bis 5015) und eine Sequenz von Position 2838 bis 3134 entfernt wurden. In dieser modifizierten Version von pcDNA3.1/Zeo wurde der CMV-Promotor durch den UbC-Promotor von pTEJ-8 (Johansen et al., FEBS Lett. 267 (1990), 289–294) ersetzt, was zu pUbi1Z führt.
Expression in Säugetierzellen.
Der pUbi1Z-Vektor, der die Neublastin kodierenden Sequenzen beinhaltet, wurde dann in die Säuger-Zelllinie HiB5 transfiziert, die eine immortalisierte Nervenzelllinie der Ratte (Renfranz et al., Cell (1991), 713–729) darstellt. Es wurden mehrere HiB5-Zelllinien hergestellt, die Neublastin (wie durch RT-PCR bestimmt) stabil exprimieren. In einer jener stabilen Zelllinien wurde eine HiB5pUbi1zNBN22 Expression durch Hybridisieren von Gesamt-RNA auf einem Northern-Blot mit einer ³²P-markierten Neublastin-Sonde bestätigt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in 2 dargestellt. HiB5pUbi1zNBN22 wurde anschließend als eine Quelle von Neublastin für mehrere Untersuchungen einer neurotrophen Aktivität von Neublastin verwendet.
2 zeigt die Expression von Neublastin cDNA in dem HiB5pUbi1zNBN22-Klon (d. h. Northern-Blot getestet mit ³²P-markierter Neublastin cDNA der vorliegenden Erfindung, infra). Der Blot wurde mit Gesamt-RNA hergestellt, die von nicht transfizierten HiB5-Zellen, HiB5pUbi1zNBN22-Zellen beziehungsweise HiB5pUbi1zGDNF14, wie angezeigt, extrahiert wurden. Die Positionen von der 28S und 18S rRNA-Banden, die 4,1 kB beziehungsweise 1,9 kB entsprechen, sind auf dem Blot angezeigt.
Wie in 3 gezeigt, erkennen Antikörper, die gegen von Neublastin abgeleitete Polypeptide gezüchtet wurden ebenfalls ein Protein von ungefähr 13 Kilo-Dalton ("kD") in einem konditionierten Medium von dem HiB5pUbi1zNBN22-Klon, jedoch nicht von nicht transfizierten HiB5-Zellen (cf. Beispiel 6).
Die vorausgesagten Molekulargewichte der nicht modifizierten (d. h. fehlen posttranslationale Modifikationen) Neublastin-Polypeptide NBN140 (SEQ ID No.10), NBN116 (SEQ ID No. 11) und NBN113 (SEQ ID No. 12) wurden bestimmt 14,7 Kilo-Dalton ("kD"), 12,4 kD beziehungsweise 12,1 kD aufzuweisen.
Verfahren:
Es wurde ein Northern-Blot von Gesamt-RNA (10 μg) von nicht transfizierten HiB5-Zellen und dem HiB5pUbi1zNBN22-Klon durch Elektrophorese auf einem 0,8% Formaldehyd-Agarosegel hergestellt und auf eine Nylon-Membran (Duralone, Stratagene) geblottet. Der Blot wurde hybridisiert und wie in Beispiel 1 beschrieben, mit einer 1,3 kB ³²P-markierten Sonde hybridisiert, die durch eine Random-Markierung hergestellt wurde, welche SEQ ID No. 8 und zusätzliche Nukleotide von der 5'UTR und der 3'UTR der Neublastin cDNA abdeckt. Der Blot wurde einem Hyperfilm MP (Amersham) bei –80°C unter Verwendung von Verstärkungsschirmen exponiert.
Ein konditioniertes Medium von HiB5pUbi1ZNBN22 oder nicht transfizierten HiB5-Zellen, die über Nacht in serum-freiem Medium, ergänzt mit N2-Ergänzung (Life Technologies, Kat.-Nr. 17502-048) inkubiert wurden, wurde konzentriert und auf 15% Polyacrylamid-Gelen (Amersham Pharmacia, Biotech, Kat.-Nr. 80-1262-01) aufgetrennt. Die Proteine wurden auf PVDF-Membranen (Amersham Pharmacia Biotech, Kat.-Nr. RPN-303F) übertragen und wobei nicht spezifische Proteinbindungsstellen mit 5% fettarmer Trockenmilch in PBS mit 0,1% Tween-20 blockiert wurden. Die Membranen wurden über Nacht mit einem polyklonalen Neublastin-Antikörper (1:1000) inkubiert, gefolgt durch eine Inkubation mit einem sekundären Anti-Kaninchen IgG-Antikörper (Amersham Pharmacia Biotech, Kat.-Nr. NA 934), der mit Meerrettich-Peroxidase (1:2000) konjugiert ist. Die Immunfärbung wurde unter Verwendung einer verstärkten Chemilumineszenz (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Kat.-Nr. RPN2109) oder ECL+ (Amersham Pharmacia Biotech, Kat.-Nr. RPN2132) entsprechend der Instruktionen des Herstellers (Amersham) sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse dieser Experimente werden in 3 gezeigt. 3A und 3B sind Darstellungen der Expression von Neublastin-Protein in transfizierten HiB5-Zellen. Über Nacht Medium von nicht transfizierten HiB5-Zellen (Spur 1), oder von einem HiB5-Klon, der mit Neublastin cDNA stabil transfiziert ist (Spur 2), wurden, wie infra beschrieben, konzentriert. Das Medium wurde anschließend durch Western-Blot unter Verwendung von zwei unterschiedlichen polyklonalen Antikörpern, Ab-1 und Ab-2, beschrieben in Beispiel 10, die für Neublastin spezifisch sind, analysiert. Es wurde festgestellt, dass in dem von transfizierten Zellen abgeleiteten Medium beide der Antikörper ein Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 15 kDa erkennen. Dieses Protein wurde nicht in nicht transfizierten HiB5-Zellen gesehen.
Die das Neublastin kodierende klonierte cDNA kann ebenfalls in einen anderen eukaryotischen Expressionsvektor, beispielsweise den eukaryotischen Expressionsvektor TEJ-8 (Johansen et al., FEBS Lett. 267 (1990), 289–294) oder pcDNA-3 (Invitrogen) eingefügt werden, wobei das erhaltene Expressionsplasmid in eine alternative Säugerzelllinie, beispielsweise Ovariumzellen des chinesischen Hamsters ("CHO"), die HEK293, die COS, die PC12 oder die RN33b-Zelllinien, oder eine Nervenstammzelllinie des Menschen transfiziert wird. Stabile Zelllinien, die Neublastin exprimieren, werden beispielsweise dazu verwendet, um das Neublastin-Protein zu produzieren.
Expression in CHO-Zellen
Konstruktion von Plasmid pJC070.14
Um die Neublastin cDNA in Ovariumzellen des chinesischen Hamsters zu exprimieren, wurde ein cDNA Fragment, das die prä-pro Form von dem Neublastin des Menschen kodiert, in den Säuger-Expressionsvektor pEAG347 eingefügt, um das Plasmid pJC070.14 zu erzeugen. pEAG347 beinhaltet SV40 frühe und Adenovirus Haupt-späte bzw. major late Promotoren in Tandem (abgeleitet von dem Plasmid pAD2beta; Norton and Coffin, Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 281), eine einzelne NotI Klonierungsstelle, die SV40 späte Transkription-Termination und Poly A-Signale (abgeleitet von dem Plasmid pCMVbeta, MacGregor and Caskey, Nucl. Acids Res. 17 (1989), 2365) folgt. Außerdem beinhaltet pEAG347 ein pUC19 abgeleitetes Plasmidrückgrat und ein pSV2dhfr abgeleitetes dhfr für eine MTX-Selektion und Amplifikation in transfizierten CHO-Zellen.
Das Plasmid pJC070.14 wurde in zwei Schritten erzeugt. Erstens, wurde ein Fragment, das die prä-pro Form von menschlichem Neublastin kodiert, von Plasmid pUbi1ZNBN isoliert, wobei unter Verwendung der Polymerase-Ketten-Reaktion die Oligonukleotide KD2-824 5' AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGAACTTGG ACTTGGAGG 3' (SEQ ID No. 31), KD2-825 5' TTTTTTCCTT GGCGGCCGCT CAGCCCAGGC AGCCGCAGG 3' (SEQ ID No. 32) und PFU Polymerase verwendet werden. Das Fragment wurde in die Srf-1 Stelle von pPCR-Script Amp SK(+) kloniert, um das Plasmid pJC069 zu erzeugen. In dem zweiten Schritt wurde ein teilweiser Not-1 Verdau an dem Plasmid pJC069 ausgeführt, um ein 685 Bp umfassendes Fragment (beinhaltend das Neublastingen) zu erzeugen, das in die Not-1 Stelle von Plasmid pEAG347 kloniert wurde, um das Plasmid pJC070.14 zu erzeugen. Eine Transkription des Neublastingens in Plasmid pJC070.14 wird durch den Adenovirus Haupt spät Promotor kontrolliert.
Herstellung von CHO-Zelllinien, die Neublastin exprimieren
Es wurden 200 μg von pJC070.14 durch Verdau mit der Restriktionsendonuklease Mlu-1 linearisiert. Die DNA wurde mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die linearisierte DNA wurde in 20 mM Hepes pH-Wert 7,05, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na₂HPO₄, 6 mM Dextrose (HEPES) resuspendiert und in ~4E7 CHO dukx B1(dhfr)-Zellen (p23) durch Elektroporation (280V und 960 μF) eingefügt. Nach der Elektroporation wurden die Zellen zu der Kultur in α+ modifiziertes Eagle's Medium (MEM), das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war, für zwei Tage zurückgeführt. Die Zellen wurden dann mit Trypsin behandelt und in 100 mm Kulturschalen (100.000 Zellen/Platte) in αMEM (fehlend Ribo- und Desoxyribonukleoside), das mit 10% dialysiertem FBS ergänzt war, erneut für fünf Tage ausplattiert. Die Zellen wurden anschließend mit einer Dichte von 100.000 Zellen/100 mm Platte aufgeteilt und in 200 mM Methotrexat selektioniert. Resistente Kolonien wurden gepickt und auf bis zu 6 Lochplatten vergrößert bzw. vermehrt, wobei konditioniertes Medium von jedem Klon unter Verwendung eines spezifischen Tests für Neublastin, nachfolgend beschrieben, durchmustert wurde. Die zwölf Klone, die die höchsten Spiegel von Neublastin exprimieren, wurden bis auf T162 Koben bzw. Flaschen vergrößert und anschließend erneut getestet. Wie in 10 gezeigt produzieren die CHO-Zelllinien Neublastin in dem Bereich von 25 bis 50 ng/ml.
Ternärkomplex-Test für Neublastin
Die Anwesenheit von Neublastin wurde in dem Medium von CHO-Zelllinien-Überständen unter Verwendung einer modifizierten Form eines Ternärkomplex-Tests, der durch Sanicola et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 6238) beschrieben wurde, getestet.
In diesem Test kann die Fähigkeit von GDNF-ähnlichen Molekülen auf deren Befähigung eine Bindung zwischen der extrazellulären Domäne von RET und den verschiedenen Co-Rezeptoren, GRFα1, GRFα2 und GRFα3 zu vermitteln, beurteilt werden. Es wurden lösliche Formen von RET und den Co-Rezeptoren als Fusionsproteine erzeugt. Ein Fusionsprotein zwischen der extrazellulären Domäne von Ratten-RET und alkalischer Phosphatase der Plazenta (RET-AP) und einem Fusionsprotein zwischen der extrazellulären Domäne von Ratten-GRFα1 (offenbart in der veröffentlichten Anmeldung WO 97/44356 , am 27. November 1997, die hier durch Bezugnahme aufgenommen ist) und der Fc-Domäne von IgG (rGRFα1-Ig) des Menschen wurde beschrieben (Sanicola et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 6238).
Um ein Fusionsprotein zwischen der extrazellulären Domäne von GRFα3 der Maus und der Fc-Domäne von IgG des Menschen (mGRFα3-Ig) zu erzeugen, wurde ein DNA Fragment, das die Aminosäuren 1–359 von RETL3 der Maus kodiert mit einem Fragment, das die Fc-Domäne von IgG1 des Menschen beinhaltet, ligiert und in den Expressionsvektor pEAG347 kloniert, um das Plasmid pGJ144 zu erzeugen. Das Plasmid pGJ144 wurde in Ovariumzellen des chinesischen Hamsters (CHO) transfiziert, um eine stabile Zelllinie zu erzeugen, die das Fusionsprotein produziert, das auf einer Protein A Sepharose Immunaffinitätssäule unter Verwendung von Standardverfahren gereinigt wurde. Zusammengefasst, falls das GDNF-ähnliche Molekül eine Bindung des Co-Rezeptors an RET in diesem Test vermitteln kann, dann wird das RET-AP-Fusionsprotein an der Platte zurückgehalten, wobei die zurückgehaltene Menge unter Verwendung eines chemilumineszenten Substrats für alkalische Phosphatase erfasst werden kann.
Dynex Microlite-1 ELISA-Platten (Dynex Technologies) wurden mit 1 μg/ml Ziegenantikörper, in 50 mM Bicarbonat/Carbonat, pH-Wert 9,6 für 16 Std., beschichtet, die spezifisch für Fc des Menschen waren. Die Platten wurden entleert und mit 300 μl von 1% I-Block (Tropix) in TBS/0,5% Tween-20 (TEST) für 1 Std. aufgefüllt. Nach dreimaligem Waschen mit TEST wurden die Löcher mit 100 μl von 1 μg/ml rGFRα3-Ig oder mit mGFRα3-Ig gefüllt, die in konditionierten Medien von 293EBNA-Zellen verdünnt wurden, die das RET-AP Fusionsprotein exprimieren. 100 μl der konditionierten Medien der CHO Neublastin-Klone wurden dann dem oberen Loch einer Säule von Löchern zugegeben, und wobei eine 2-fache Verdünnungsreihe jede Reihe von Löchern hinab ausgeführt wurde und bei Raumtemperatur für 1,5 Std. inkubiert wurden. Die Platten wurden anschließend dreimal mit TEST gewaschen und zweimal mit 200 mM Tris pH-Wert 9,8, 10 mM MgCl₂ (CSPD-Puffer). Die Wasch-Lösung wurde dann mit 425 μM CSPD (Tropix) in CSPD-Puffer, beinhaltend 1 mg/ml Saphir Chemilumineszenz-Verstärker (Tropix) ersetzt und für 30' bei Raumtemperatur inkubiert. Die Chemilumineszenz-Ausgabe wurde unter Verwendung eines Luminometers von Dynatech erfasst.
Die anfänglichen Experimente untersuchten, ob durch CHO-Zelllinien hergestelltes Neublastin die Bindung von GFRα1 oder GFRα3 an die extrazelluläre Domäne von RET vermitteln kann. Wie in 11 gezeigt, erzeugte konditioniertes Medium des CHO-Zellklons #53 ein robustes Signal in dem Ternärkomplex-Test, falls das mGFRα3-Ig Fusionsprotein inkubiert wurde, jedoch kein Signal, falls das rGFRα1-Ig Fusionsprotein eingeschlossen wurde, was darauf hinweist, dass Neublastin an GFRα3,, jedoch nicht an GFRα1 bindet. Dieses Verhalten unterscheidet, Neublastin deutlich von GDNF, wie in 11 gezeigt, bindet GDNF an GFRα1, jedoch nicht an GFRα3. Es wurde kein Signal mit beiden Co-Rezeptor-Fusionsproteinen beobachtet, falls konditioniertes Medium von der Eltern-Zelllinie oder reines bzw. unverfälschtes Medium getestet wurde.
Um die Expressionsspiegel von Neublastin in den CHO-Zelllinien zu quantifizieren, wurde unter Verwendung von rGFRα1-Ig und GDNF eine Standardkurve ausgehend von einer Konzentration von 1 ng/ml, erstellt. Es wurden dann Konzentrationen von Neublastin für verschiedene CHO-Zelllinien unter Verwendung dieser Standardkurve berechnet, wobei die durch fünf CHO-Zelllinien hergestellten Spiegel in 10 gezeigt sind. Da diese Abschätzung von der nicht geprüften Annahme abhängig ist, dass die Bindungsaffinität zwischen GDNF und GFRα1 ähnlich der Bindungsaffinität zwischen Neublastin und GFRα3 ist, sind diese Spiegel lediglich gerundet.
Analyse von Neublastin von Überständen von CHO-Zelllinien.
Um weiterhin das durch CHO-Zelllinien hergestellte Neublastin zu analysieren, wurde das Protein unter Verwendung des GFRα3-Ig Fusionsprotein von dem Medium extrahiert und durch Western-Blots mit polyklonalen Antikörpern, die gegen Neublastin-Peptide gezüchtet wurden, analysiert.
In dem ersten Experiment wurde das Neublastin mit an Sepharose-Kügelchen angefügten mGFRα3-Ig extrahiert. Es wurde mGFRα3-Ig unter Verwendung der durch den Hersteller, Pharmacia Inc. vorgeschlagenen Bedingungen an die Sepharose-Kügelchen angefügt. 100 μl von mGFRα3-Ig-Sepharose wurden zu 1,0 ml Proben von konditioniertem Medium von einer Negativkontrolle einer CHO-Zelllinie oder von der Neublastin herstellenden CHO-Zelllinie #16 zugegeben. Die Überstände wurden für zwei Stunden auf einer schaukelnden Bühne inkubiert. Es wurde jede Suspension zentrifugiert und der Überstand entfernt, gefolgt von drei 1 ml Waschvorgängen mit 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,5. Jedes Harz wurde in 100 μl von 2 × reduzierendem Probenpuffer resuspendiert und auf 100°C für 5 Minuten erhitzt. Es wurden 20 μl des Probenpufferüberstandes und 10 μl eine Molekulargewichtsstandards (FMC) jedem Loch eines 10–20% vorher gegossenen SDS-PAGE-Gels (Owl Scientific) aufgebracht. Das Gel wurde bei 40 mA Gleichstrom für 72 Minuten elektrophoretisch aufgetrennt.
Für die Western-Blot-Analyse wurde das Protein auf Nitrocellulose (Schleicher & Schuell) in einem Gerät von Hofer Scientific in 10 mM CAPS, 10% Methanol, 0,05% SDS, pH-Wert 11,2 Puffersystem (45 Minuten bei 400 mA Gleichstrom) elektrogeblotted bzw. elektrisch übertragen. Nach dem Transfer wurde der Nitrocellulosefilter aus der Kassette entfernt und die Molekulargewichtsmarker wurden durch Färben mit einer Lösung von 0,1% Ponceau S in 1% Essigsäure für 60 Sekunden sichtbar gemacht. Die Membran wurde in zwei Abschnitte geschnitten, wobei die überschüssige Farbe durch sanftes Schwenken in destilliertem Wasser entfernt wurde. Die Membranen wurden in 2% fettarmer Trockenmilch in TBS über Nacht bei 4°C blockiert. Die Membranen wurden einzeln mit zwei der affinitätsgereinigten Anti-Neublastin Peptidantikörper (R30 und R31) bei einer Konzentration von 1,0 μg/ml in 2% fettarmer Trockenmilch in TBS) inkubiert. Die Membranen wurden dreimal 10 Minuten in TBS-Tween gewaschen und in einer 1:5.000 Verdünnung von Ziege Anti- Kaninchen IgG-HRP-Konjugat (Biorad) für 30 Minuten inkubiert. Die Membranen wurden dreimal 10 Minuten in TBS-Tween gewaschen und mit ECL-Substrat (Amersham) entwickelt. Wie in 12 gezeigt, wurden verglichen zu den Banden, die in den extrahierten Proteinen von der Negativkontroll-Zelllinie (Spuren 1 und 3) beobachtet wurden, spezifische Banden in den Proteinen detektiert, die von den mit beiden Antikörpern (Spuren 2 und 4) von der Neublastin produzierenden CHO-Zelllinie extrahiert wurden.
Das Molekulargewicht der geringeren Spezies beträgt ungefähr 13 kD und stellt wahrscheinlich die reife Domäne von Neublastin dar, die nach einer Spaltung der pro-Domäne erzeugt wurde. Diese Spaltung kann nach dem Arg-Rest an der vierten Position in irgendeinem der drei Spaltmotive (beispielsweise -RXXR↓-) auftreten, die in dem prä-pro-Neublastin-Protein vorhanden sind, um sowohl 140AA, 116AA als auch 113AA-Formen zu erzeugen, wie jeweils in SEQ ID No. 10, 11 oder 12 dargelegt ist. Die vorausgesagten Molekulargewichte der nicht modifizierten (d. h. fehlen von post-translationalen Modifikationen) Neublastin-Polypeptide NBN140 (SEQ ID No. 10), NBN116 (SEQ ID No. 11) und NBN113 (SEQ ID No. 12) wurden auf jeweils 14,7 kD, 12,4 kD und 12,1 kD bestimmt. Es wird eine weitere Analyse erforderlich sein, um die Struktur dieser Spezies als auch anderer Neublastin spezifischer Banden zu bestätigen.
In dem zweiten Experiment wurde Neublastin mit hGFRα3 extrahiert, das an einer ELISA-Platte gefangen war. Um ein Fusionsprotein zwischen der extrazellulären Domäne von menschlichem GFRα3 (offenbart in der WO 97/44356 , am 27. November 1997, die hier durch Bezugnahme aufgenommen wird) und der Fc-Domäne von IgG1 des Menschen (hGFRα3-Ig) zu erzeugen, wurde ein DNA Fragment, das die Aminosäuren 1–364 von hGFRα3 des Menschen kodiert, an ein Fragment, das die Fc-Domäne des Menschen von IgG1 beinhaltet, ligiert und in den von Sanicola et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 6238) beschriebenen Expressionsvektor CH269 kloniert. Das durch dieses Plasmid kodierte Fusionsprotein wurde in dem 293-Epstein-Barr Virus kodierten nukleären Antigen(EBNA)-Zellen vorübergehend exprimiert und an einer Protein A Sepharose Immunaffinitätssäule unter Verwendung von Standardverfahren gereinigt.
Es wurden 6 Löcher einer 96-Lochplatte über Nacht mit Ziege Anti-Mensch IgG (Fcγ Fragment spezifisch, Jackson Immunologics) mit einer Konzentration von 25 μg/ml in PBS (300 μl/loch) beschichtet. Die Löcher wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 400 μl von 1% BSA in PBS blockiert. Nach 3 Waschvorgängen mit PEST (PBS + 0,05% Tween-20), wurden 300 μl hGFRα3-Ig (10 μg/ml in PBS beinhaltend 0,1% BSA) zu jedem Loch zugegeben. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und um die Bindung zu maximieren sanft (200 Hübe bzw. Takte/Min.) geschüttelt. Die Löcher wurden anschließend entleert und erneut 3-mal mit PEST gewaschen. Es wurden 250 μl eines konditionierten Mediums von einer CHO-Zelllinien-Negativkontrolle oder der Neublastin pro duzierenden CHO-Zelllinie #25 zu jedem von 3 Löchern zugegeben. Die Platte wurde für 3 Std. bei Raumtemperatur inkubiert und sanft (300 Takte/Min.) geschüttelt. Die Löcher wurden dann zweimal mit PEST gewaschen. Es wurden 25 μl eines nicht reduzierenden Laemmli-Ladepuffers zu dem ersten Loch zugegeben und die Platte wurde für 5 Min. schnell geschüttelt, um die gebundenen Proteine (1300 Takte/Min.) zu eluieren. Der Inhalt wurde zu dem nächsten Loch überführt und der Vorgang wurde wiederholt, um die in den zweiten und dritten Löchern gebundenen Proteine zu eluieren. Nach Zugabe von β-Mercaptoethanol (5% End) wurden die Proben für 5 Minuten gekocht und durch ein SDS-PAGE auf einem 10–20% Polyacrylamid-Gel analysiert.
Für eine Western-Blot-Analyse wurden die Proteine auf Nitrocellulose übertragen. Die Membran wurde blockiert und in 5% fettarmer Trockenmilch, PEST getestet und in PEST gewaschen. Neublastin wurde durch Elektrochemilumineszenz nach der Reaktion mit polyklonalen Antikörpern (R30 und R31), die gegen zwei Neublastin-Peptide gezüchtet wurden, gefolgt durch eine Reaktion mit HRP konjugierten Ziege Anti-Kaninchen Antikörpern (Biorad) detektiert. Wie in 13 gezeigt, wurden fünf für Neublastin spezifische Banden in den extrahierten Proteinen von der Neublastin produzierenden CHO-Zelllinie (Spur 2) detektiert. Die zwei geringeren Banden sind zu den in 12 beobachteten Banden sehr ähnlich, wobei erneut die geringere Bande wahrscheinlich die reife Domäne von Neublastin darstellt, das nach Spaltung der pro-Domäne erzeugt wurde.
Eine anschließende Analyse (Daten nicht gezeigt) der Banden in 13 zeigte, dass eine Deglycosylierung mit PGNase F der ungefähr 18 kD Bande jene Bande zu einer Größe verringert, die der geringsten Bande in dem Gel von 13 äquivalent ist. Dies legt nahe, dass Neublastin in Säugerzellen als ein glycosyliertes Protein produziert wird.
Expression von Neublastin in E. coli
Um das Neublastingen in E. coli zu exprimieren, wurden Syngene mit einem geringeren GC-Gehalt konstruiert und E. coli Codons bevorzugt. Das Syngen wird in zwei Vektoren, pET19b und pMJB164, ein Derivat von pET19b, kloniert. Die Konstruktion mit pET19b ist in 14 gezeigt. In diesem Konstrukt ist die NBN113 kodierende Sequenz unmittelbar an das initiierende Methionin fusioniert. Zusätzliche synthetische Genkonstrukte für NBN sind in SEQ ID No. 52–54 gezeigt. Das Konstrukt mit pMJB164 ist in 15 gezeigt. In diesem Konstrukt liegt NBN113 an ein Histidin-Tag (d. h. 10 Histidine) fusioniert vor, das durch eine Enterokinase-Spaltstelle getrennt ist. Zusätzlich synthetische Genkonstrukte für NBN, die an einem Histidin-Tag fusioniert vorliegen, sind in SEQ ID No. 55–57 gezeigt. Das initiierende Methionin geht dem Histidin-Tag voraus.
Neublastin kodierende Nukleotidsequenz in Fig. 14
Nukleotidsequenz, die His-Tag Neublastin in Fig. 15 kodiert
Beispiel 6: Wirkung von Neublastin auf das Überleben von embryonalen dopaminergen Neuronen der Ratte und ChAT-Aktivität.
In dieser Serie von Experimenten wurde die Wirkung von konditioniertem Medium von, vorstehend beschriebenen, Neublastin produzierenden HiB5pUbi1zNBN22-Zellen beurteilt.
Herstellung von Kulturen:
Es wurde das ventrale Mesencephalon oder das Rückenmark aus E14 Embryonen der Ratte in kalter Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) seziert. Gewebestücke wurden in steril gefiltertem 0,1% Trypsin (Worthington) und 0,05% DNase (Sigma) in HBSS bei 37°C für 20 Min. inkubiert. Die Gewebestücke wurden dann viermal in HBSS + 0,05% DNase gespült und unter Verwendung einer 1 ml Automatikpipette getrennt bzw. losgelöst. Die Suspension wurde dann bei 600 Upm für 5 Min. zentrifugiert und das Pellet wurde in mit Serum konditioniertem Medium (SCM, DMEM mit 10% fötalem Rinderserum) resuspendiert. Es wurde durch das Ausschlussverfahren von Tryphanblaufarbe die Gesamtanzahl von Zellen beurteilt und mit einer Dichte von 100.00 Zellen/cm² in mit Polylysin beschichteten Acht-Loch-Kammerobjektträgem (Nunc) ausplattiert, um ein Überleben von dopaminergen Neuronen zu beurteilen oder bei 200.00 Zellen/cm² in 48 Lochplatten (Nunc), um die ChAT-Aktivität zu erfassen. Die Zellen wurden in SCM bei 5% CO₂/95% O₂ und 95% Feuchtigkeit bei 37°C für 24–48 Std. inkubiert, bevor zu serumfreiem Medium (SFM) mit Zugabe von neurotrophen Faktoren gewechselt wurde.
Die Zellen zum Beurteilen eines Überlebens von dopaminergen Neuronen wurden für 5 Tage in SFM + Zugaben von trophischem Faktor gelassen und anschließend für 5 Min. in 4 % PFA fixiert und durch Immunhistochemie auf Tyrosin-Hydroxylase gefärbt.
Die Zellen für die ChAT-Aktivität wurden für 3 Tage in SFM gelassen und anschließend in HBSS + 0,1% Triton X-100 lysiert und unmittelbar auf Trockeneis bis zur Erfassung der ChAT-Aktivität gefroren.
Zugabe trophischen Faktors:
Es wurde konditioniertes Medium einer nicht transformierten HiB5 Kontrolle oder HiB5, die Neublastin (HiB5pUbi1zNBN22) oder GDNF (HiB5pUbi1zGDNF-L17) produziert, gesammelt. HiB5pUbi1zNBN22 produziert ungefähr 20 ng GDNF/24 Stunden/10⁵ Zellen wie durch einen GDNF-EILISA an konditioniertem Medium bestimmt wurde, welches von den Zellen gesammelt wurde. Die entsprechenden Zelllinien wurden über Nacht mit DMEM + 1% FCS inkubiert und der Überstand wurde entnommen und bei –20°C bis zur Verwendung gelagert. Die Überstände wurden 1:50 in SFM verdünnt, wenn sie den Zellen zugegeben wurden. Getrennte Löcher wurden mit Kontrollüberstand von HiB5 (1:50) + gereinigtem rekombinantem Ratten GDNF (von 0,03-10 ng/ml) behandelt.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 4 gezeigt. 4A–4C sind Darstellungen der Wirkung von Neublastin, das von HiB5pUbi1zNBN22-Zellen sekretiert wurde, auf das Überleben von kultivierten embryonalen dopaminergen ventralen Mesencephalon-Neuronen der Ratte und auf die ChAT-Aktivität in cholinergen Motorneuronen des Kranialnervs in serumfreiem Medium, wie infra in Beispiel 5.1 beschrieben.
4A ist eine Darstellung der Dosis-Antwortkurve für rekombinantes GDNF auf die ChAT-Aktivität (dpm/Stunden), die an DIV5 in serumfreien Kulturen erfasst wird, die anfänglich von E14 ventralen Mesencephali (d. h. HiBS; GDNF 0,03 ng/ml; GDNF 0,1 ng/ml, GDNF 0,3 ng/ml; GDNF 1 ng/ml, GDNF 10 ng/ml; GDNF 100 ng/ml) hergestellt wurden.
4B ist eine Darstellung einer ChAT-Aktivität (dpm/Stunde), die an DIV5 in serumfreien Kulturen erfasst wurde, die anfänglich von E14 ventralen Mesencephali hergestellt wurden. Verdünntes konditioniertes Medium von entweder Neublastin produzierenden HiB5pUbi1zMBN22-Zellen (Neublastin) oder GDNF produzierenden HiB5GDNFL-17 (GDNFL-17)-Zellen wurde, wie in der Figur (d. h. Neublastin 1:10, Neublastin 1:50, GDNF L-17 1:50) angezeigt, zugegeben.
4C ist eine Darstellung der Anzahl von den Zellen pro Loch (Nr. TH+ Zellen/Loch) an DIV7 in serumfreien Kulturen, die für Tyrosin-Hydroxylase immunreaktiv sind, welche anfänglich von E14 ventralen Mesencephali der Ratte hergestellt wurden. Verdünntes konditioniertes Medium von entweder nicht transfizierten HiB5-Zellen (HiB5) oder Neublastin produzierenden HiB5pUbi1zNBN22-Zellen (Neublastin) oder rekombinantem GDNF wurden, wie in der Figur (d. h. HiB5 1:10, HiB5 1:40, GDNF 0,1 ng/ml, GDNF 10 ng/ml, GDNF 100 ng/ml, und Neublastin 1:40) angezeigt, in verschiedenen Konzentrationen zugegeben.
Konditioniertes Medium mit Neublastin von transfizierten HiB5-Zellen, das 1:40 verdünnt wurde, erhöhte verglichen zu Kontroll- (nicht transfiziert) HiB5-Zellen signifikant die Anzahl von TH immunreaktiven Zellen pro Loch bei einer äquivalenten und einer geringeren Verdünnung (1:10 und 1:40) (siehe beispielsweise 4B). Die Erhöhung in den TH immunreaktiven Zellen ist zu dem bei einer maximalen GDNF-Konzentration (10 ng/ml) gesehenen Anstieg vergleichbar. Dies zeigt an, dass in das Medium sekretiertes Neublastin eine Wirkung auf das Überleben der dopaminergen Neuronenpopulation von dem embryonalen ventralen Mesencephalon der Ratte aufweist. Dagegen weist unähnlich dem GDNF, das von transfizierten HiB5-Zellen sekretiert wird, das konditionierte Medium von mit Neublastin transfizierten HiB5-Zellen keine Wirkung an einer anderen Neuronenpopulation in der gleichen Kultur, den cholinergen Neuronen (siehe beispielsweise 4A) auf.
Beispiel 7: Wirkung von Neublastin auf das Überleben von Scheiben-Kulturen von embryonalen dopaminergen ventralen Mesencephalon-Neuronen des Schweins
Diese Experimente beurteilen die Wirkung einer Co-Kultur von Neublastin produzierenden HiB5pUbi1zNBN22-Zellen mit Scheiben-Kulturen von ventralen Mesencephali von Schweineembryonen.
Herstellung der Kulturen
Es wurden ventrale Mesencephali (VM) von Schweineembryonen (E28; n = 12) unter sterilen Bedingungen isoliert, in 400 μm Scheiben geschnitten und in abgekühlter Gey's balancierten Salzlösung (GIBCO) mit Glucose (6,5 mg/ml) angeordnet. Die Gewebescheiben wurden durch das Interface-Kulturverfahren, ursprünglich entwickelt durch Stoppi et al., (L. Stoppi, P.A. Buchs, D. Muller, J. Neurosci. Methods 37 (1991), 173–182) kultiviert.
Kurz, die Scheiben wurden auf einer halb-porösen Membran (Millipore, 0,3 μm, 8 Scheiben/Membran entsprechend zu einem VM) als Einsätze in 6-Lochplatten (Costar) mit Serum beinhaltendem Medium (Gibco BRL) angeordnet. Jedes Loch beinhaltete 1 ml Medium (50% Optimem, 2% Pferdeserum, 25% Hank's balancierte Salzlösung (alle Gibco)), ergänzt mit D-Glucose mit einer Endkonzentration von 25 mM. An Tag 0 wurden 7.000 HiB5pUbi1zNBN22 (Neublastin) oder 7.000 nicht transfizierte HiB5-Zellen (Kontrolle) auf jeder Gewebescheibe ausgesät. Die Co-Kulturen wurden zuerst in einem Inkubator bei 33°C für 48 Stunden gezüchtet, wobei die HiB5-Zellen, die mit einem Temperatur empfindlichen Oncogen immortalisiert sind, proliferieren können und wobei sie anschließend in einem Inkubator bei 37°C angeordnet werden, wo die HiB5-Zellen differenzieren. Das Medium wurde zweimal die Woche gewechselt. Auf dieser Stufe wurden keine Antimitotika und Antibiotika verwendet.
Bestimmung von Dopamin durch HPLC:
An Tag 12 und 21 in vitro wurde das Kulturmedium gesammelt und unter Verwendung einer HPLC mit elektrochemischer Detektion auf Dopamin analysiert (W.N. Slooth, J.B.P. Gramsbergen, J. Neurosci. Meth. 60 (1995), 141–149).
Gewebebearbeitung und Immunhistochemie:
An Tag 21 wurden die Kulturen in 4 % Paraformaldehyd in Phosphatpuffer für 60 Min. fixiert, in einer 20% Sucroselösung für 24 Stunden dehydriert, gefroren, im Kryostat bei 20 μm (4 Serien) geschnitten und auf mit Gelatine beschichteten Mikroskop-Objektträgern aufgebracht. Eine Serie von Schnitten wurde für Tyrosin-Hydroxylase (TH) immungefäbt. Kurz, die Schnitte wurden in 0,05 M Tris gepufferter Salzlösung (TBS, pH-Wert 7,4), beinhaltend 1% Triton X-100, für 3 × 5 Min. gewaschen und mit 10% fatalem Rinderserum (FBS, Life Technologies) in TBS für 30 Min. inkubiert. Das Gewebe wurde dann für 24 Stunden bei 4°C mit einem monoklonalen Antikörper (Boehringer Mannheim) inkubiert, der 1:600 in TBS mit 10% FBS verdünnt war. Nach einem Spülen in TBS mit 1% Triton X-100 für 3 × 5 Min. wurden die Schnitte für 60 Min. mit biotinyliertem Anti-Maus IgG Antikörper (Amersham), der 1:200 in TBS mit 10% FBS verdünnt ist, inkubiert. Die Schnitte wurden dann in TBS mit 1% TritonX-100 (3 × 5 Min.) gewaschen und für 60 Min. mit Streptavidin-Peroxidase (Dako), das 1:200 in TBS mit 10% FBS verdünnt ist, inkubiert. Nach dem Waschen in TBS (3 × 5 Min.) wurde der gebundene Antikörper durch eine Behandlung mit 0,05% 3,3-Diaminobenzidin (Sigma) in TBS, beinhaltend 0,01% H₂O₂, sichtbar gemacht. Schließlich wurden die Schnitte in Alkohol dehydriert, in Xylen geklärt und in Eukitt mit einem Deckglas versehen.
Zellzahlen und morphometrische Analyse:
Eine Quantifizierung von immunreaktiven TH-ir Neuronen wurde unter Verwendung einer Hellfeldmikroskopie (Olympus) ausgeführt. Lediglich Zellen, die eine intensive Färbung mit einer wohl erhaltenen zellulären Struktur und einem ausgeprägten bzw. deutlichen Kern zeigen, wurden gezählt. Die Beurteilung basierte auf Zellzählungen in jedem vierten Kulturabschnitt unter Verwendung eines x20 Objektivs. Die Zellzahlen wurden durch Doppelzählung entsprechend zu Abercrombie's Formel (M. Abercrombie, Mat. Res. 94 (1946) 239–247) korrigiert, wobei der durchschnittliche Durchmesser der Kerne in den TH-ir Neuronen (6,6 ± 0,2 μm, n = 30) verwendet wird. Die Größe der Kerne wurde unter Verwendung eines Tracing-Systems für Neuronen (Neurolucida, MicroBrightField, Inc.) beurteilt.
Die Ergebnisse jener Experimente sind in 5 gezeigt. 5A–5C sind Darstellungen der Wirkung von Neublastin, das von HiB5pUbi1zNBN22-Zellen sekretiert wurde, auf die Funktion und das Überleben von Scheibenkulturen von embryonalen dopaminergen ventralen Mesencephalon-Neuronen des Schweins, die mit entweder HiB5pUbi1zNBN22 (Neublastin) oder HiB5-Zellen (Kontrolle), wie infra beschrieben, co-kultiviert wurden.
5A und 5B stellen Dopamin dar, das jeweils in das Medium an DIV 12 (Dopamin (pmol/ml)-Tag 12) und DIV 21 (Dopamin (pmol/ml)-Tag21) freigesetzt wurde. 5C ist eine Darstellung der Anzahl von Tyrosin-Hydroxylase immunreaktiven Zellen pro Kultur (TH-ir Zellen pro Kultur) an DIV 21.
An Tag 12 zeigte eine HPLC-Analyse, das Medium von HiB5-Neublastin Co-Kulturen 84% mehr Dopamin beinhaltet als Medium von HiB5 Co-Kulturen (5A). An Tag 21 betrug der Unterschied 78% (5B) und die Zellzählungen zeigten, dass HiB5-Neublastin Co-Kulturen 66% mehr Tyrosin-Hydroxylase immunreaktive Neuronen beinhalten als HiB5-C Co-Kulturen (P < 0,05) (5C). Dies weist darauf hin, dass Neublastin von dem HiB5pUbi1zNBN22-Klon eine starke Wirkung auf das Überleben von embryonalen dopaminergen Neuronen des Schweins aufweist.
Beispiel 8: Überleben von dorsalen Wurzelganglienzellen in serumfreien Medium
Dieses Beispiel zeigt die neurotrophe Wirkung eines Neublastin-Polypeptids im Vergleich zu bekannten neurotrophen Faktoren.
Trächtige weibliche Mäuse wurden durch Genickbruch getötet. Die Embryonen wurden für die Kultur wie folgt bearbeitet.
Elektrolytisch geschärfte Wolframnadeln wurden verwendet, um dorsale Wurzelganglien von den angezeigten Stadien von C57/B16 Mäusen (Mollegaard Breeding, Denmark) zu sezieren. Embryonale Ganglien wurden für 5 Minuten bei 37°C mit 0,05% Trypsin (Gibco BRL) in von Kalzium und Magnesium freiem Hank's balancierter Salzlösung inkubiert. Postnatale Ganglien wurden mit Collagenase/Dispase 1 mg/ml für 30 bis 45 Minuten behandelt und anschließend Trypsin/DNase 0,25% für 15 Minuten. Nach Entfernen der Trypsin-Lösung wurden die Ganglien einmal mit 10 ml DMEM, beinhaltend 10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum, gewaschen und mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette sanft zerrieben, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
Die Zellen wurden auf 24-Lochplatten (Nunc) ausplattiert, die mit Polyornithin (0,5 mg/ml, über Nacht) und Laminin (20 mg/ml für 4 Std. Gibco BRL) vorher beschichtet wurden. Die Neuronen wurden bei 37°C in einem befeuchteten, 5% CO₂ umfassenden Inkubator in einem definierten Medium, beinhaltend Hams F14 ergänzt mit 2 mM Glutamin, 0,35% Rinderserumalbumin, 60 ng/ml Progesteron, 16 mg/ml Putrescin, 400 ng/ml L-Thyroxin, 38 ng/ml Natriumselenit, 340 ng/ml Triiod-Thyronin, 60 mg/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin, inkubiert.
Nach 48 Stunden Inkubation waren die Neuronen durch deren bipolare Morphologie unter dem Phasenkontrastoptik deutlich zu erkennen. Der Prozentsatz eines Überlebens von Neuronen in der Abwesenheit oder Anwesenheit von trophischen Faktoren (zugegeben zu dem Kulturmedium mit 10 ng/ml bevor die Neuronen ausplattiert wurden) oder von konditioniertem Medium von Neublastin produzierenden HiB5pUbi1zNBN22-Zellen wurde durch Zählen der Neurone in den Löchern bei 48 Stunden beurteilt.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 9 dargestellt, in welcher Figur:
0 das Kontrollexperiment (in Abwesenheit von Faktoren) darstellt;
1 die Experimente in der Anwesenheit von GDNF darstellen;
2 die Experimente in der Anwesenheit von Neuturin darstellen;
3 die Experimente in der Anwesenheit von erfindungsgemäßem Neublastin darstellen.
9 stellt Daten von Experimenten dar, die an DRG-Zellen ausgeführt wurden, die von sich entwickelnden Föten zu den unterschiedlichen Zeitpunkten, wie folgend bezeichnet, isoliert wurden:
E12 stellen Embryonen an Tag 12 dar;
E16 stellen Embryonen an Tag 16 dar;
P0 stellt den Tag der Geburt dar;
P7 stellt Tag 7 nach der Geburt dar; und
P15 stellt Tag 15 nach der Geburt dar.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass der neurotrophe Faktor der Erfindung Aktivitäten zeigt, die zu den etablierten bzw. eingeführten neurotrophen Faktoren vergleichbar oder sogar besser als jene sind.
Beispiel 9: In vivo Wirkungen von Neublastin auf nigrale Dopaminneuronen
Um die Fähigkeit von Neublastin (Neublastin) zu testen, um erwachsene nigrale Dopaminneuronen (DA) vor einer durch 6-Hydroxydopamin induzierte Degeneration zu schützen, wurde ein Rattenmodel der Parkinson Krankheit (Sauer and Oertel, Neuroscience 59 (1994), 401–415) und ein Transfer von Neublastin durch Lentiviren verwendet.
Herstellung von Lentiviren:
Um einen lentiviralen Neublastin kodierenden Transfervektor, pHR'-Neublastin, zu erzeugen, wurde ein 1331 Bp umfassendes BamHI Fragment einer Neublastin cDNA in der BamHI/BglII Stelle von pSL301 (Invitrogen) subkloniert. Von diesem Konstrukt wurde ein 1519 Bp umfassendes BamHi/XhoI Fragment ausgeschnitten und in die BamHI/XhoI Stelle von pHR' ligiert, das ein post-translationales Fragment vom Hepatitisvirus des Murmeltiers (Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ, Woodchuck hepatitis virus posttranslational regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors", J. Virol. 73 (1999), 2886–2892) trägt. Um pHR-GDNF zu erzeugen, wurde ein 701 Bp umfassendes BamHI/XhoI Fragment von pUbi1zGDNF in die BamHI/XhoI Stelle von pHR' ligiert.
Die Herstellung des lentiviralen Vektors wurde beispielsweise durch Zufferey et al., (Zufferey R, Nagy D. Mandel RJ, Naldini L, Trono D: "Multiple attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo, Nat. Biotechnol. 15(9) (1997), 871–875) beschrieben. Kurz, die Transferkonstrukte und die Helfer-Plasmide pR8.91 und pMDG wurden in 293T-Zellen cotransfiziert. In das Medium freigesetzte Virionen wurden zu 48 und 72 Std. nach der Transfektion gesammelt. Um das Virus zu konzentrieren wurden die Medien 1,5 Std. bei 141.000 g zentrifugiert und das Pellet wurde in DMEM gelöst. Der Titer einer Kontrolle, die das Gen für das grün fluoreszierende Protein ("GFP") trägt, wurde auf 108 transformierende Einheiten (TU/ml) durch GFP-Fluoreszenz in 293T-Zellen bestimmt. Eine RNA-Slot-Blot-Technik (von Schwedler U, Song J, Aiken C, Trono D: "Vif is crucial for human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA synthesis in infected cells", J. Virol. 67(8) (1993), 4945–4955) wurde verwendet, um den Titer von Viruspartikeln zu bestimmen. In dem GDNF-Überstand und Neublastin-Überstand befanden sich verglichen zu dem GFP-Überstand 10 mal weniger Partikel.
Chirurgische Verfahren:
Die gesamte Arbeit, die Tiere einbezog, wurde gemäß den Regeln ausgeführt, die durch die Ethikkommission zur Verwendung von Labortieren an der Universität von Lund festgelegt sind.
Insgesamt wurden 21 junge erwachsene weibliche Sprague-Dawley Ratten (B&K Universal, Stockholm, Schweden) verwendet und unter einem 12 Stunden Hell-: Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Rattenfutter und Wasser gehalten. Retrogrades Markieren und 6-OHDA Läsionen wurden 3 Wochen vor einer Läsion gemäß Sauer and Oertel [Sauer and Oertel, Neuroscience 59 (1994), 4001–415] ausgeführt. Kurz, unter einer Anästhesie mit Equithesin (0,3 ml/100 g) wurden die Ratten bilateral mit 0,2 μl einer 2% Lösung (gelöst in 0,9% NaCl) des retrograden Tracers Fluor-Gold (FG, Fluorochrom, Inc., Englewood, CO) injiziert. Die Injektionen wurden unter Verwendung einer 2 μl Hamiltonspritze bei den Koordinaten AP = +0,5 mm; ML = ± 3,4 mm relativ zum Bregma, DV = –5,0 mm relativ zu der Dura und die Schneidzahnschiene bzw. der Inciscor bar wurde auf 0,0 mm eingestellt. Außerdem wurden 0,5 μl/Min. injiziert, wobei weitere 5 Min. verstrichen bevor die Nadel zurückgezogen wurde.
Vierzehn Tage nach den FG-Injektionen erhielten die Tiere insgesamt 5 Depositionen bzw. Absetzungen (1 μl/Deposition) von einem Lentivirus-Vektor, der das Gen für das grün fluoreszierende Protein (GFP), Neublastin oder GDNF trägt. Vier der Depositionen erfolgten in das Striatum entlang von zwei Nadelgebieten bzw. -teilen an/bei den folgenden Koordinaten: AP = +1,0 mm, ML = –2,6 mm, DV₁ = –5,0 mm, DV₂ = –4,5 mm und AP = 0,0 mm, ML = –3,7 mm, DV₁ = –5,0 mm DV₂ = –4,5 mm. Die supranigrale Deposition wurde bei/an AP = –5,2 mm, ML = –2,0 mm, DV₁ = –6,3 mm ausgeführt. Die Zahnschiene wurde bei –2,3 mm eingestellt.
Einundzwanzig Tage nach der retrograden Markierung und 7 Tage nach den Injektionen mit Lentivirus wurden die Tiere erneut anästhetisiert und mit einer 10 μl Hamiltonspritze wurde eine einzelne Deposition von 20 μg 6-OHDA (Sigma, berechnet als freie Base und gelöst in 3 μl eiskalter Salzlösung, die mit 0,02% Ascorbinsäure ergänzt ist) in das rechte Striatum an die gleiche Stelle wie die FG-Depositionen injiziert. Die Injektionsrate betrug 1 μl/Min, was weitere 3 Min. übrig lässt bevor die Nadel zurückgezogen wird.
Gewebebearbeitung.
An Tag 21 nach der 6-OHDA Injektion wurden die Tiere mit Chloralhydrat tief anästhetisiert und mit Salzlösung (pH-Wert 7,4) für eine Min. transkranial perfundiert, gefolgt durch 200 ml eiskalter Formaldehydlösung (4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,4). Die Gehirne wurden seziert und in dem gleichen Fixiermittel für 3–4 Stunden nachfixiert und dann in 25% Sucrose/0,1 M Phosphatpuffer für 48 Stunden überführt. Fünf Serien von 40 μm Schnitten durch das Striatum und die Substantia nigra (SN) wurden an einem Befrostungs-Mikrotom geschnitten.
Quantitative Beurteilung von dopaminergen Neuronen in der SN:
Die Anzahl von FG-markierten in der SN pars compacta wurde durch einen verblindeten Beobachter, wie vorhergehend beschrieben [Sauer and Oertel, Neuroscience 59, (1994), 401–415], beurteilt. Kurz, drei aufeinander folgende Schnitte, die um das Niveau des medialen terminalen Nucleus des akzessorischen optischen Nerven (MTN, –5,3 in dem Atlas von Paxinos and Watson (1997)) zentriert sind, wurden verwendet, wobei alle markierten/gefärbten Neuronen lateral zu dem MTN bei einer 40 × Vergrößerung (n = 6–7/Gruppe) gezählt wurden. FG-markierte Neuronen wurden einbezogen, falls sie unter Epi-Beleuchtung bei 330 nm hell fluoreszierend waren, ein neuronales Profil anzeigten und mindestens einen Neuritenfortsatz erstreckten bzw. verlängerten.
An der Läsionsseite in Tieren, die Injektionen von dem das GFP tragende Lentivirus erhielten war die Anzahl von FG-positiven nigralen Neuronen auf 18% von denen auf der intakten Seite verringert. Im Gegensatz dazu zeigten die mit Lenti-Neublastin injizierten Tiere einen nahezu vollständigen Schutz der Anzahl von FG-positiven nigralen Neuronen (89%). Dies war so wirksam wie Lenti-GDNF behandelte Tiere, wobei 87% der retrograd markierten Neuronen an der verletzten Stelle verblieben. Dies zeigt, dass Neublastin ein starker Überlebensfaktor für verletzte erwachsene nigrale dopaminerge Neuronen ist und das es so stark wie GDNF ist.
6 ist eine Darstellung von der in vivo Wirkung des von Lentivirus produzierten Neublastin auf nigrale Dopaminneuronen. Die Neuronen der SN pars compacta in weiblichen Sprague-Dawley Ratten wurden mit Fluorogold (FG) 3 Wochen vor einer einzelnen Injektion von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) in das rechte Striatum, retrograd markiert. Ein Woche vor der 6-OHDA Injektion erhielten die Tiere Injektionen mit lentiviralen Vektoren, die Neublastin (Neublastin), GDNF (GDNF) oder grün fluoreszierendes Protein (GFP), wie in der Figur angezeigt, exprimieren. Einundzwanzig Tage nach den 6-OHDA Injektionen wurde die Anzahl von FG-markierten Neuronen auf beiden Seiten der Striata bestimmt. Die Figur zeigt den prozentualen Anteil (%FG verletzt/intakt) von FG-markierten Neuronen in der verletzten (rechten) Seite gegenüber der intakten (linken) Seite der Striata der drei Gruppen von Tieren.
Beispiel 10: Herstellung von Antikörpern
Um Antikörper gegen Neublastin herzustellen, wurden zwei Kaninchen mit entweder Peptid 1: CRPTRYEAVSFMDVNST (Aminosäuren 108–124 von SEQ ID NO: 9), oder Peptid 2: ALRPPPGSRPVSQPC (Aminosäuren 93–107 von SEQ ID NO: 9) immunisiert, die in 3 Wochenintervallen an ein Trägerprotein konjugiert wurden. Es wurden zwei Kaninchen für jedes Peptid zu Woche 0, 3, 6 und 10 immunisiert, wobei Blutabnahmen an Woche 7 und 11 gesammelt wurden. Die zweite Blutabnahme wurde über eine Peptidaffinitätssäule affinitätsgereinigt. Die Antikörper wurden entsprechend dem Peptid Ab-1 und Ab-2 genannt.
Western-Blot.
2 × 10⁶ HiB5-Zellen, die stabil mit der cDNA für Neublastin (HiB5pUbi1zNBN22) transfiziert waren, oder nicht transfizierte HiB5-Zellen wurden über Nacht in serumfreiem Medium mit N2-Ergänzung (GIBCO) inkubiert. Das Medium wurde mit kleinen Konzentratoren mit Abschluss-Membranen von 5 kDa (Millipore, Redford, MA) konzentriert. Den konzentrierten Proben wurde 5 × Laemmli-Probenpuffer zugegeben und für 5 Minuten auf 95°C erhitzt. Die Proben wurden durch eine SDS Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese auf 15% Acrylamidgelen aufgetrennt und auf PVDF-Membranen transferiert. Restliche Proteinbindungsstellen wurden mit 5% fettarmer Trockenmilch in PBS mit 0,1 Tween-20 blockiert. Die Membranen wurden über Nacht mit Neublastin-Antikörper (1:1000) inkubiert, gefolgt durch eine Inkubation mit einem sekundären Anti-Kaninchen oder Anti-Maus IgG Antikörper, der an Meerrettich-Peroxidase (1:2000) konjugiert ist.
Eine Immunfärbung wurde unter Verwendung verstärkter Chemilumineszenz Plus (ECL+) entsprechend den Instruktionen des Herstellers (Amersham) sichtbar gemacht. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 3 und Beispiel 5 gezeigt.
Unter Standardverfahren wurden ebenfalls die polyklonalen Antikörper des Kaninchens gegen die folgenden Peptide gezüchtet:
Peptid R27: GPGSRARAAGARGC (Aminosäuren 30–43 von SEQ ID NO: 9);
Peptid R28: LGHRSDELVRFRFC (Aminosäuren 57–70 von SEQ ID NO:9);
Peptid R29: CRRARSPHDLSL (Aminosäuren 74–85 von SEQ ID NO: 9);
Peptid R30: LRPPPGSRPVSQPC (Aminosäuren 94–107 von SEQID N: 9); und
Peptid R31: STWRTVDRLSATAC (Aminosäuren 123–136 von SEQ ID NO: 9).
Lediglich Peptide R30 und R31, relative nahe zu/an dem C-Terminus, erkennen das denaturierte Protein unter reduzierenden Bedingungen auf einem Western-Blot.
Beispiel 11: Biologische Aktivität eines verkürzten Neublastin-Polypeptids der Ratte, das die letzten carboxyterminalen 102 Aminosäuren umfasst
Die Aminosäuresequenz von prä-pro-Neublastin der Ratte wird nachfolgend als SEQ ID No. 34 bereitgestellt:
Jede der nachfolgend beschriebenen Neublastin-Verkürzungen ist oberhalb des entsprechenden Startrestes (fett gedruckt in der oben stehenden Sequenz) gekennzeichnet. Der Start der 113-Aminosäurenform von Neublastin (NBN113) ist ebenfalls markiert.
Die biologische Aktivität einer verkürzten Form von Neublastin, die die 102 carboxyterminalen Aminosäuren des Neublastins der Ratte beinhaltet, wurde in Zellen untersucht. Das verkürzte Neublastin wurde durch Verdau einer 113 Aminosäuren umfassenden Form von Neublastin der Ratte, das die Aminosäuresequenz aufweist, die die Aminosäuren 111–224 (Ratte NBN113, oben unterstrichen) von SEQ ID No. 34 beinhaltet, mit einer nicht spezifischen Aminopeptidase (Sigma, MO) für zwei Stunden bei Raumtemperatur erzeugt. Folgend auf diesen Verdau wurde Neublastin einer Größenausschluss-Chromatographie (SEC) unterzogen, um irgendwelche verunreinigenden Komponenten von dem Protein abzutrennen. Das Molekulargewicht des verkürzten Neublastin (bezeichnet "NBN113 (N-11)") wurde durch Massenspektrometrie bestätigt und auf 10.931 kDa, das vorausgesagte Gewicht des die 102 Aminosäuren umfassenden Polypeptids (NBN102) bestimmt. Als eine Kontrolle wurde Ratten NBN113 parallel mit Enzympuffer (25 mM Tris, pH-Wert 8) alleine behandelt. Es wurde kein Verdau bei dieser Kontrolle beobachtet und das dazugehörige 12.047 kDa Polypeptid wurde identifiziert.
Die biologischen Aktivitäten von NBN113, NBN113 behandelt mit Enzympuffer und NBN113 (N-11) wurden in einem zellulären RET(c-RET)-Aktivierungstest verglichen. Die Neublastin-Aktivität wurde durch dessen Fähigkeit bestimmt eine c-RET-Phosphorylierung in NB41A3-mRL3-Zellen, einer adhärenten Neuroblastom-Zelllinie der Maus zu stimulieren, die stabil mit GFRα3 transfiziert ist und die RET und GFRα3 exprimiert. NB41A3-mRL3-Zellen wurden in DMEM, das mit 10% FBS ergänzt war mit 2 × 10⁵ Zellen pro Loch in 24-Lochplatten ausplattiert und für 18 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Folgend auf Entfernung des Mediums und einer Zellwaschung mit 1 ml PBS pro Loch, wurden die Zellen mit DMEM, beinhaltend entweder NBN113, NBN113, das mit Enzympuffer behandelt wurde oder NBN113 (N-11) für 10 Minuten bei 37°C und 5% CO₂ stimuliert. Um die Aktivität zu stoppen wurde das Medium entfernt und die Zellen mit PBS unmittelbar vor der Lyse mit Tris, pH-Wert 8,0, 0,5% NP40, 0,2% DOC, 50 mM NaF, 0,1 mM Na₃VO₄ und 1 mM PMSF, gewaschen. Nach 1 Stunde Inkubation bei 4°C wurden die Lysate durch wiederholtes Pipettieren vermischt bzw. verrührt und zu einer 96-Loch ELISA-Platte überführt (0,25 ml pro Loch), die mit anti-RET mAb (AA.GE7.3) beschichtet war. Die Löcher wurden bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit Block-Puffer (TEST beinhaltend 1% normales Mausserum und 3% BSA in TBS-Puffer (15 mM Tris pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl)) blockiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit TEST (TBS + 0,5% Tween-20) alleine.
Das phosphorylierte RET wurde durch Inkubieren (2 Stunden) des eingefangenen Rezeptors mit 4G10 (Upstate Biotechnology, NY), einem mit HRP konjugierten Phosphotyrosin-Antikörper (0,2 μg pro Loch) detektiert. Folgend auf die Inkubation wurden die Löcher sechsmal mit TEST gewaschen und die HRP-Aktivität bei 450 nm mit einem kolorimetrischen Test detektiert. Die Absorptionswerte von den mit Lysat oder mit Lyse-Puffer alleine behandelten Löcher wurden erfasst, der Hintergrund korrigiert und die Daten als ein Funktion der Konzentration von Neublastin graphisch dargestellt, das in dem Aktivierungsgemisch vorhanden war. Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt. Die Absorptionswerte von Löchern, die mit Lysat oder mit Lysepuffer behandelt wurden, wurden erfasst, wobei die vom Hintergrund korrigierten Signale als eine Funktion der Konzentration von Neublastin graphisch dargestellt wurden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die aminoterminal verkürzte Form (102 Aminosäuren) von Neublastin eine zelluläre biologische Aktivität zeigt, die von der NBN113 Form von Neublastin nicht zu unterscheiden ist.
Beispiel 12: Biologische Aktivität von drei aminoterminal verkürzten Formen (99, 104 und 106 Aminosäuren) von Neublastin
Die Aktivität von verkürzten Neublastin-Polypeptiden (99 und 106 Aminosäuren) wurde in dem zellulären RET-Aktivierungs-Test untersucht und die Ergebnisse sind in 17 gezeigt. Zusätzlich zu den 99 und 106 Aminosäureformen wurden zwei andere Neublastin-Moleküle zum Vergleich in diesen Test einbezogen: Ratten NBN113, das als eine Referenz diente, und ein 113 Aminosäuren umfassendes Neublastinmutein der Ratte, in dem das Arginin an Position 14 der Ratten NBN113-Sequenz durch einen Lysinrest ("NBN R14K (N)") ersetzt wurde. Dieses Mutein förderte die Herstellung der 99 Aminosäurenform, der die vierzehn aminoterminalen Reste ("NBN R14K (N-14)") fehlen, falls es an dieser Stelle unter Verwendung einer Lysin-spezifischen Protease (Endo Lys C, WAKO, VA) gespalten wird. Die 106 Aminosäurenform, der die sieben aminoterminalen Reste ("NBN 113 (N-7)") fehlen, wurde von dem NBN113 der Ratte durch eine teilweise Proteolyse mit Trypsin (Biozyme, San Diego) erzeugt. Alle verkürzten Produkte wurden, wie vorstehend in Beispiel 11, durch Massenspektrometrie charakterisiert.
Die Aktivitäten von NBN113, NBN R14K (N), NBNR14K (N-14) und NBN113 (N-7) wurden jeweils mit Konzentrationen von 0,005 nM bis 100 nM, 0,05 nM bis 100 nM, 0,006 nM bis 114 nM und 0,05 nM bis 107 nM untersucht. Die Aktivitäten wurden, wie in Beispiel 11 beschrieben, als Absorption bei A_450nm erfasst. Jede Neublastinform zeigte an jeder getesteten Konzentration eine ähnliche Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass die verkürzten Formen von Ratten NBN113, dem entweder die 14 oder 7 aminoterminalen Reste fehlen, so aktiv sind wie Ratten NBN113 in dem KIRA-Aktivierungstest.
Der in 18 gezeigte KIRA-Aktivierungstest, wurde ausgeführt, um die biologische Aktivität einer 104 Aminosäurenform von Neublastin ("NBN104 (N-9)") zu bestimmen. Dieses Polypeptid, dem neun aminoterminale Reste fehlen, die in dem Wildtyp des NBN113-Moleküls der Ratte vorhanden sind, wurde dadurch erzeugt, dass durch CHO exprimiertes NBN113 der Ratte mit Trypsin behandelt wurde. Wie zuvor wurde die Molekularmasse durch Massenspektrometrie bestätigt. Die Aktivität der zwei Polypeptide (NBN104 (N-9) und NBN113) wurde mit Konzentrationen von 0,05 nM bis 115 nM untersucht. Die Aktivität wurde, wie in Beispiel 11 beschrieben, als Absorption bei A_450nm erfasst. Die Aktivität der N-9 Form war mindestens so hoch wie die Aktivität des NBN113 der Ratte. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine verkürzte Form (104 Aminosäuren), der die aminoterminalen 9 Aminosäuren des NBN113 Polypeptids der Ratte fehlen mindestens so aktiv ist wie das Ratten NBN113 in dem KIRA Aktivierungstest.
Tabelle 5 stellt die Beziehung zwischen den offenbarten prä-pro-Neublastin-Polypeptidsequenzen der Erfindung dar. Zeile 1 stellt das Polypeptid von SEQ ID No. 2 bereit, Zeile 2 stellt das Polypeptid von SEQ ID No. 4 bereit und Zeile 3 stellt das Polypeptid von SEQ ID No. 9 bereit. Die sieben konservierten Cysteinreste werden als Symbole ("*", "#", "+", und "|") bezeichnet, um die intramolekularen (*mit*, #mit# und +mit+) und intermolekularen ("|") Disulfidbrücken anzuzeigen, die in dem reifen dimerisierten Neublastin-Liganden gebildet werden. Der Amino-Terminus von jedem verkürzten Neublastin-Polypeptid wird durch "0" jeweils für NBN112 bis NBN99 bezeichnet.
Äquivalente

Von der vorstehenden ausführlichen Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der Erfindung sollte offenbar sein, dass besondere neue Zusammensetzungen und Verfahren, die Nukleinsäuren, Polypeptide, Antikörper, Detektion und Behandlung einbeziehen, beschrieben wurden. Obwohl diese besonderen Ausführungsformen hier ausführlich beschrieben wurden, wurde dies lediglich für beispielhafte Zwecke davon ausgeführt. Insbesondere wird von den Anmeldern vorgesehen, dass verschiedene Substitutionen, Änderungen und Modifikationen routinemäßig durch einen Fachmann ausgeführt werden können. In der Tat können verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen hier beschriebenen dem Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen offenbar werden. Beschreibung der in der Sequenzliste beinhalteten Sequenzen

SEQ ID NO: 1	Nukleinsäure von Neublastin des Menschen	865 Bp
SEQ ID NO: 2	Neublastin-Polypeptid des Menschen von Seq. 1	200 AA
SEQ ID NO: 3	Kodierender Bereich (CDS) eines prä-pro-Polypeptids	861 Bp
	des Menschen
SEQ ID NO: 4	Neublastin-Polypeptid von Seq. 3 des Menschen	238 AA
SEQ ID NO: 5	Variante von Neublastin des Menschen in Seq. 4	140 AA
	(Xaa1 ist Asn oder Thr; Xaa2 ist Ala oder Pro).
SEQ ID NO: 6	Variante von Neublastin des Menschen in Seq. 4	116 AA
	(Xaa1 ist Asn oder Thr; Xaa2 ist Ala oder Pro).
SEQ ID NO: 7	Variante von Neublastin des Menschen in Seq. 4	113 AA
	(Xaa1 ist Asn oder Thr; Xaa2 ist Ala oder Pro).
SEQ ID NO: 8	cDNA von positiver Kolonie PCR von fötaler	861 Bp
	Hirn cDNA des Menschen
SEQ ID NO: 9	fötales Hirn prä-pro Neublastin-Polypeptid ein	221 AA
	schließlich "Stopp" (entspricht Seq. 8)
SEQ ID NO: 10	Variante v. prä-pro-Neublastin (Seq. 9) NBN140, 14,7 kD	140 AA
SEQ ID NO: 11	Variante v. prä-pro-Neublastin (Seq. 9) NBN140, 12,4 kD	116 AA
SEQ ID NO: 12	Variante v. prä-pro-Neublastin (Seq. 9) NBN140, 12,1 kD	113 AA
SEQ ID NO: 13	PCR-Produkt v. Durchmusterung Masterplatte e. fötalen	102 Bp
	Hirn cDNA d. Menschen u. V. SEQ ID NO: 17 und
	18 Primer
SEQ ID NO: 14	PCR-Produkt v. Durchmusterung Masterplatte e. fötalen	220 Bp
	Hirn cDNA d. Maus u. V. SEQ ID NO: 21 und 22 Primer
SEQ ID NO: 15	Neublastin Volllängen cDNA der Maus	2136 Bp
SEQ ID NO: 16	prä-pro Neublastin-Polypeptid der Maus	224 AA
SEQ ID NO: 17	"NBNint.sense" oberer Primer f. NBN von fötaler Hirn	18 Nt
	cDNA des Menschen, die komplem. zu B. 551–568
	v. SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 18	"NBNint.antisense" unterer Primer f. NBN von fötaler Hirn	20 Nt
	cDNA des Menschen, die rev. komplem. zu B. 633–652
	v. SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 19	"NBNint.sense" oberer Primer f. menschl. Gesamt-Gehirn	17 Nt
	mRNA RT-PCR komplem. zu B. 58–74 v. SEQ ID NO: 8
SEQ ID NO: 20	"NBNint.antisense" unterer Primer f. menschl. Gesamt-	16 Nt
	Gehirn mRNA RT-PCR revers komplem. zu B. 850–865 v.
	SEQ ID NO: 8
SEQ ID NO: 21	NBNint.sense" NBN C2 Primer z. Durchmustern fötale	18 Nt
	cDNA Masterplatte d. Maus komplem. zu B. 1398–1415 v.
	SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 22	NBNint.antisense" NBN C2as Primer z. Durchmustern fötale	20 Nt
	cDNA Masterplatte d. Maus revers komplem. zu B. 1598–16	17
	v. SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 23	Primerpaar 1 Sinn PCR Primer f. menschl. genomische DNA	29 Nt
	Amplifikation, komplem. zu B. 60–88 v. SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 24	Primerpaar 1 Antisinn PCR Primer f. menschl. genomische	27 Nt
	DNA Amplifikation, revers komplem. zu B. 835–861 v.
	SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 25	Primerpaar 2 Sinn PCR Primer f. menschl. genomische DNA	35 Nt
	Amplifikation, komplem. zu B. 1–35 v. SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 26	Primerpaar 2 Antisinn PCR Primer f. menschl. genomische	34 Nt
	DNA Amplifikation, revers komplem. zu B. 786–819 v.
	SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 27	Antisinn alkl. Phosphatase konju. Hybridisierungssonde,	30 Nt
	komplem. zu B. 1140–1169 d. Neublastin cDNA d. Maus
SEQ ID NO: 28	"NBNext.sinn" oberer Primer f. ges. menschl. Hirn mRNA	16 Nt
	RT-PCR komplem. zu B. 1–16
SEQ ID NO: 29	Syngen ORF v. Fig. 14 von Neublastin	351 Nt
SEQ ID NO: 30	Syngen ORF v. Fig. 15 von Hisneublastin	414 Nt
SEQ ID NO: 31	Primer z. Isolieren v. Neublastin	39 Nt
SEQ ID NO: 32	Primer z. Isolieren v. Neublastin	39 Nt
SEQ ID NO: 33	"NBNint.Antisinn" NBN Primer, revers komplem. z. B.	16 Nt
	715–730 v. SEQ ID NO: 8
SEQ ID NO: 34	prä-pro-Neublastin der Ratte	224 AA
SEQ ID NO: 35	Neublastin (NBN112) des Menschen	112 AA
SEQ ID NO: 36	Neublastin (NBN111) des Menschen	111 AA
SEQ ID NO: 37	Neublastin (NBN110) des Menschen	110 AA
SEQ ID NO: 38	Neublastin (NBN109) des Menschen	109 AA
SEQ ID NO: 39	Neublastin (NBN108) des Menschen	108 AA
SEQ ID NO: 40	Neublastin (NBN107) des Menschen	107 AA
SEQ ID NO: 41	Neublastin (NBN106, N-7) des Menschen	106 AA
SEQ ID NO: 42	Neublastin (NBN105) des Menschen	105 AA
SEQ ID NO: 43	Neublastin (NBN104, N-9) des Menschen	104 AA
SEQ ID NO: 44	Neublastin (NBN103) des Menschen	103 AA
SEQ ID NO: 45	Neublastin (NBN102) des Menschen	102 AA
SEQ ID NO: 46	Neublastin (NBN101) des Menschen	101 AA
SEQ ID NO: 47	Neublastin (NBN100) des Menschen	100 AA
SEQ ID NO: 48	Neublastin (NBN99, N-14) des Menschen	99 AA
SEQ ID NO: 49	Neurturin – Tabelle 3	197 AA
SEQ ID NO: 50	Persephin – Tabelle 3	156 AA
SEQ ID NO: 51	GDNF – Tabelle 3	211 AA
SEQ ID NO: 52	Synthetisches Gen f. Neublastin	365 Nt
SEQ ID NO: 53	Synthetisches Gen f. Neublastin	365 Nt
SEQ ID NO: 54	Synthetisches Neublastin	114 AA
SEQ ID NO: 55	Synthetisches Gen f. HisNeublastin	442 Nt
SEQ ID NO: 56	Synthetisches Gen f. HisNeublastin	442 Nt
SEQ ID NO: 57	Synthetisches HisNeublastin	135 AA

SEQUENZ-LISTE

Claims

Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Aminosäuren 37–140 von SEQ ID NO: 9 NBN 104); (b) Aminosäuren 39–140 von SEQ ID NO: 9 (NBN 102); und (c) Aminosäuren 42–140 von SEQ ID NO: 9 NBN 99).
Polypeptid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz aus den Aminosäuren 37–140 von SEQ ID NO: 9 (NBN 104) besteht.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, worin das Polypeptid glycosyliert ist.
Nukleinsäure, welche ein Polypeptid nach einem der vorstehenden Ansprüche codiert.
Vektor, welcher die Nukleinsäure nach Anspruch 4 umfasst.
Wirtszelle, welche mit dem Vektor nach Anspruch 5 transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 6, worin die Wirtszelle eine Eizelle eines chinesischen Hamsters ist.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1–3, umfassend: (a) Bereitstellen einer Wirtszelle, welche mit einem Expressionsvektor transformiert ist, welcher eine das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–3 kodierende Nukleinsäure umfasst, (b) Kultivieren der Wirtszelle, und (c) Wiedererhalten des Polypeptids.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–3 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1–3 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer peripheren Neuropathie oder eines neuropathischen Schmerzes in einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 10, worin die Zusammensetzung systemisch verabreicht wird.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–3 zur Verwendung als ein Medikament.