ES2270465T3 - Ligando 3 ret para estimular el crecimiento neural y renal. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN UN LIGANDO RET (RETL9), ASI COMO A LOS PROCEDIMIENTOS PARA ESTIMULAR EL CRECIMIENTO NEURAL Y RENAL POR TRATAMIENTO DE CELULAS Y SUJETOS MAMIFEROS CON ADN O PROTEINA DEL RETL. LA INVENCION PROPORCIONA UNA MOLECULA AISLADA Y PURIFICADA DE ADN QUE CODIFICA UN RETL, QUE TIENE LA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS DE CUALQUIER RETL, PERO INCLUYE ESPECIFICAMENTE EL ADNC DEL RETL1 DE LA RATA (SEQ ID NO:1), EL ADNC DEL RETL1 HUMANO PARCIAL (SEQ ID NO:8), EL ADNC DEL RETL1 HUMANO CON TODA SU LONGITUD (SEQ ID NO:10), EL ADNC DEL RETL2 HUMANO (SEQ ID NO:12), EL ADNC DEL RETL3 DE RATON (SEQ ID NO:12) O EL ADNC DEL RETL3 HUMANO (SEQ ID NO:16), EL ADNC DEL RETL3 HUMANO PARCIAL (SEQ ID NO:18) O EL ADNC DEL RETL3 HUMANO (SEQ ID NO:20). LA INVENCION PROPORCIONA ADEMAS UNA PROTEINA RETL, CON UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS QUE COMPRENDE LA DEL RETL1 DE LA RATA (SEQ ID NO:2), EL RETL1 HUMANO PARCIAL (SEQ ID NO:9), EL RETL HUMANO DE LONGITUD COMPLETA (SEQ ID NO:11), EL RETL2 HUMANO (SEQ ID NO:13), EL RETL3 DE RATON (SEQ ID NO:17), EL RETL3 HUMANO PARCIAL (SEQ ID NO:19) O EL RETL3 HUMANO (SEQ ID NO:21).

Description

Ligando 3 Ret para estimular el crecimiento neural y renal.

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con secuencias de nucleótidos que codifican a un ligando Ret (RetL), así como con métodos para estimular el crecimiento neural y renal por medio del tratamiento de las células con el ADN de RetL o una proteína.

Antecedentes de la invención

Uno de los éxitos de la investigación actual en señalización celular y en la activación del receptor es la de permitir la modulación terapéutica de los procesos involucrados en el crecimiento y en la supervivencia de las células. Tales procesos determinan el éxito en diversas condiciones médicas, incluidas la falla orgánica, el desarrollo fetal y el crecimiento de tumores, entre otros. Cada una de estas condiciones es de importancia clínica a escala mundial, y tiene opciones de tratamiento de eficacia limitada. Un objetivo de la invención es la de proveer composiciones y métodos para promover la regeneración o la supervivencia del tejido dañado, así como composiciones para el tratamiento de desordenes que involucran el crecimiento y desarrollo aberrante de tejidos.

La pérdida de tejido o una falla orgánica terminal afectan a millones de personas en todo el mundo cada año y contribuyen sustancialmente a los costos del cuidado de la salud. La pérdida de órganos o de tejidos se trata usualmente por medio de transplante de órganos de donantes, por medio de reconstrucción quirúrgica, o con dispositivos mecánicos. Cada uno de estos recursos tiene sus defectos. Los transplantes están limitados por la escasez de donantes, la reconstrucción quirúrgica pude crear otros problemas a largo plazo, y los dispositivos mecánicos no pueden realizar todas las funciones de un único órgano, y por lo tanto no pueden evitar un deterioro progresivo. Por lo tanto, existe una necesidad médica real por nuevas soluciones a estos problemas.

Los factores proteicos que afectan el crecimiento, la diferenciación y/o la supervivencia de las células pueden ser útiles en el tratamiento de desordenes de órganos que contienen células sensibles. Los factores o los ligandos que interactúan con los receptores de la familia de la proteína receptora de la tirosina quinasa (PRTQ) son de interés particular en este sentido. Estos receptores están involucrados en muchos programas celulares incluidos el crecimiento y la diferenciación celular, y en la génesis de muchas neoplasias. Por lo tanto, los factores o los ligandos que interactúan con estos receptores pueden probar ser útiles en el tratamiento de desordenes de ciertos órganos donde los tejidos han sido dañados. Alternativamente, puede ser útil bloquear la interacción de estos factores con sus receptores con el propósito de bloquear el crecimiento tumoral.

El protooncogén Ret codifica a un receptor de tirosina quinasa que se expresa durante el desarrollo en una variedad de tejidos, incluidos los sistemas nerviosos central y periférico y el riñón. Las anormalidades presentes en los ratones nulos en ret sugieren que Ret es crítico para la migración y la inervación de neuronas entéricas hacia el intestino caudal, y para la proliferación y ramificación del epitelio uretral germinal durante el desarrollo del hígado (Nature 367, 380-383, 1994). La búsqueda de un componente clave de la ruta de señalización de Ret, el ligando Ret, ha sido un área de intensa investigación.

Resumen de la invención

La invención provee un ácido nucleico aislado que codifica a un polipéptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de RetL3 de murino (SEQ ID NO: 17) y RetL3 humano (SEQ ID NO: 21), en donde dicho polipéptido interactúa con el Ret de una proteína receptora para disparar la dimerización del Ret para la proteína receptora o la autofosforilación de un dominio de tirosina quinasa del Ret de la proteína receptora. En una modalidad, este ácido nucleico aislado retiene al menos el 80% de las cisteínas cuando se alinean con la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 21.

En otra modalidad, el polipéptido codificado tiene al menos una identidad de secuencia del 90% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID NO: 21. El polipéptido codificado puede ser la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 21. La invención proporciona además un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste del ADNc de retL3 murino (SEQ ID NO: 16) y ADNc de retL3 humano (SEQ ID NO: 20).

La invención provee además un vector que comprende un inserto que comprende a cualquiera de los ácidos nucleicos mencionados anteriormente, o a una célula huésped que contiene a tal vector. También se incluye un método para producir un polipéptido, que comprende las etapas de cultivar dicha célula huésped y recuperar al polipéptido expresado a partir del inserto dentro de dicha célula huésped.

En otra modalidad de la invención, también está cubierto un polipéptido codificado por uno de dichos ácidos nucleicos, así como un anticuerpo monoclonal que se une a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de aminoácido de RetL3 murino parcial (SEQ ID NO: 15), aminoácido de RetL3 murino (SEQ ID NO: 17), aminoácido de RetL3 humano parcial (SEQ ID NO: 19) y aminoácido de RetL3 humano (SEQ ID NO: 21). La invención se relaciona además con una composición que contiene a dicho anticuerpo asociado a una toxina, a un compuesto que puede formar una imagen o un radionúclido.

La invención se relaciona además con una proteína de fisión que contiene a dicho polipéptido codificado por uno de los ácidos nucleicos de la invención fusionado a una inmunoglobulina, a una toxina, a un compuesto que puede formar una imagen o a un radionúclido. Finalmente, cualquiera de los ácidos nucleicos, polipéptidos, vectores, anticuerpos, o proteínas de fusión de la invención puede ser utilizada en terapia o diagnóstico.

Se divulga una molécula aislada y purificada de ADN que codifica a una RetL que tiene la secuencia de nucleótidos de cualquier RetL, pero que incluye específicamente al ADNc de retL1 de rata (SEQ ID NO: 1), al ADNc de retL1 humano parcial (SEQ ID NO: 8), al ADNc completo de retL1 humano (SEQ ID NO: 10), al ADNc de retL2 humano (SEQ ID NO: 12), al ADNc de retL3 murino (SEQ ID NO: 16), al ADNc de retL3 humano parcial (SEQ ID NO: 18) o al ADNc de retL3 humano (SEQ ID NO: 20). Se revela además a una proteína RetL, con una secuencia de aminoácidos que comprende a aquella del RetL1 de rata (SEQ ID NO: 2), al RetL1 humano parcial (SEQ ID NO: 9), al RetL1 humano completo (SEQ ID NO: 11), al RetL2 humano (SEQ ID NO: 13), al RetL3 murino (SEQ ID NO: 17), al RetL3 humano parcial (SEQ ID NO: 19), al RetL3 humano (SEQ ID NO: 21).

También se describe una secuencia de ADN que abarca la secuencia (de ADNc de retL1 humano parcial (SEQ ID NO. 8)) del ADN de inserción del clon HRL20, que es ATCC No. 97604, o la secuencia del ADN de inserción del clon #230-5A-86-17 (ADNc del retL1 de rata (SEQ ID NO: 1)), que es ATCC No. 98047.

Además, se revela una molécula de ADN aislada y purificada para ser usada en el aseguramiento de la expresión en una célula huésped procariota o eucariota de un producto polipéptido que tiene al menos una parte de la conformación estructural primaria y la actividad biológica de RetL; el ADN puede ser a) una molécula de ADN que contiene ADNc de retL1 de rata, ADNc de retL1 humano parcial, ADNc de retL1 humano completo, ADNc de retL2 humano, ADNc de retL3 murino o ADNc de retL3 humano, o la hebra complementaria del ADNc de retL1 de rata, ADNc de retL1 humano parcial, ADNc de retL1 humano completo, ADNc de retL2 humano, ADNc de retL3 murino o ADNc de retL3 humano, b) moléculas de ADN que hibridan bajo condiciones estrictas hasta las moléculas de ADN definidas en a) o fragmentos de las mismas; o c) moléculas de ADN que, por la degeneración del código genético, hibridarían hasta las moléculas de ADN definidas en a) y en b). También se describe una molécula de ADN aislada y purificada que codifica a un fragmento o variante de polipéptido de un RetL humano que tiene la actividad biológica de un
RetL.

Cualquiera de las moléculas de ADN recombinante mencionadas anteriormente puede ser operativamente enlazada a una secuencia de control de expresión.

También están incluidos los vectores y sistemas de entrega que abarcan a las moléculas o construcciones de ADN definidas en otra parte en esta descripción detallada. El vector puede abarcar una molécula de ADN que codifica a un RetL o a una variante de un RetL.

La invención incluye células huésped procariotas o eucariotas transformadas en forma estable o transfectadas por medio de un vector que contiene una molécula de ADN que codifica a un RetL nativo o variante.

Se revela específicamente un RetL humano aislado y purificado sustancialmente libre de otras proteínas humanas, ya que es un proceso para la producción de un producto polipéptido que tiene parte o toda la conformación estructural primaria y la actividad biológica de un RetL. Tal proceso puede incluir las etapas de cultivo, bajo condiciones adecuadas, de células huésped eucariotas y procariotas transformadas o transfectadas con cualquier molécula de ADN revelada aquí, en una forma que permita la expresión de tal producto polipéptido, y recuperar un RetL. También se incluye el producto polipéptido de la expresión en una célula huésped eucariota o procariota de un ADN.

También se revelan proteínas y fragmentos de proteína, variantes y derivados, ya sea solubles o unidos a la membrana. En algunos casos, la proteína tiene una secuencia de aminoácidos que contiene RetL1 de rata, RetL1 parcialmente humano, RetL1 completamente humano, RetL2 humano, RetL3 murino, o RetL3 humano, o es una variante de una de estas secuencias. En otros casos, la proteína es una proteína de fusión incluida Ret o un RetL, fusionado a otra molécula o fragmento molecular, tal como una inmunoglobulina, toxina, un compuesto que puede formar una imagen o un radionúclido. También se incluyen moléculas quiméricas de RetL.

También se revelan anticuerpos monoclonales específicos para un RetL de la invención. Tal anticuerpo puede estar asociado con una toxina, con un compuesto que puede formar una imagen o un radionúclido. Tales anticuerpos se pueden producir por medio de líneas celulares de hibridoma, incluidas AA.FF9, AA.HE3, AF.E9, BA.B1, BB.BE, AA.GE7, CD.F11, AH.E3, CD.G4, AG.E7, BD.G6 y BH.G8, así como subclones de estos hibridomas. También se describen los anticuerpos producidos por estos hibridomas o subclones de estos hibridomas.

La divulgación incluye además el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que interactúa con Ret celular y por lo tanto induce la autofosforilación de Ret para promover el crecimiento de tejido nuevo, o promover la supervivencia del tejido dañado en un individuo. El compuesto puede ser RetL1, RetL2 o RetL3, un fragmento de un RetL completo, o un anticuerpo que se une a Ret. El compuesto se puede administrar concurrentemente con una cantidad terapéuticamente activa de un segundo compuesto, tal como GDNF, neurturina o una molécula relacionada con GDNF. Mientras que los tejidos de interés pueden incluir a cualquier tejido, los tejidos preferidos incluyen tejido renal, tejido neural, de corazón, estómago, intestino delgado, médula espinal, o pulmón. En una modalidad, el RetL es un RetL soluble. El individuo anterior puede ser humano.

En otro uso divulgado, la transducción de señal de Ret entre una primera célula que expresa a un RetL y una segunda célula se inhibe poniendo en contacto a la primera célula con una proteína soluble de Ret o con un anticuerpo para el RetL. La proteína soluble de Ret puede ser una proteína de fusión.

También se describe un método para dirigir una toxina, un compuesto capaz de formar una imagen o un radionúclido hacia una célula que expresa Ret, que incluye poner en contacto a la célula con una proteína de fusión de RetL o un anticuerpo anti-Ret conjugado con una toxina, un compuesto capaz de formar una imagen o un radionúclido. El RetL puede ser RetL1, RetL2 o RetL3. En otro método, se suprime el desarrollo de una célula tumoral que expresa Ret, donde una etapa del método consiste en poner en contacto a la célula con una proteína de fusión de un RetL y una toxina o radionúclido, o un anticuerpo anti-Ret conjugado con una toxina o radionúclido. La célula puede estar dentro d un individuo, y la proteína o el anticuerpo conjugado se administran al individuo.

También se revela un método para dirigir una toxina, un compuesto capaz de formar una imagen o un radionúclido a una célula que expresa a un RetL, que comprende poner en contacto a la célula con una proteína de fusión que contiene Ret y una toxina, un compuesto capaz de formar una imagen o un radionúclido, o un anticuerpo anti-RetL conjugado con una toxina, un compuesto capaz de formar una imagen o un radionúclido. Otra modalidad incluye el método de suprimir el desarrollo de una célula tumoral que expresa a un RetL, que comprende poner en contacto a la célula con una proteína de fusión de Ret y a una toxina o radionúclido o con un anticuerpo anti-RetL conjugado con una toxina o radionúclido; la célula puede estar dentro de un individuo, y la proteína administrada al individuo.

El RetL revelado es RetL1, RetL2 o RetL3, o una variante o fragmento de RetL1, RetL2 o RetL3.

También se describe el uso de las sustancias reveladas para terapia génica. Una modalidad es el uso de un vector que contiene una molécula de ADN que codifica a un RetL para tratar a un individuo con un desorden de metabolismo por Ret, así como el uso para promover el crecimiento de nuevo tejido en un individuo. Otra modalidad incluye el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector que codifica a un RetL para promover la supervivencia de tejido dañado en un individuo.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1a y 1b son una secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 1) y una secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de RetL1 de rata. La secuencia de nucleótidos se extiende desde el par de bases 201 hasta el par de basas 1700 de la SEQ ID NO: 1, y contiene el marco de lectura abierta completo.

La Figura 2A es una secuencia parcial de ADNc (SEQ ID NO: 8) y una secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de RetL1 humano. Esta secuencia es aquella del inserto del clon HRL20, depositado como ATCC No. 97604.

La Figura 2B es una secuencia completa de ADN de un compuesto (SEQ ID NO: 10) y una secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO. 11) de RetL1 humano.

La Figura 3A es una comparación de la secuencia de nucleótidos de RetL1 humano (línea superior e la secuencia) con aquella de la secuencia de RetL1 de rata (línea inferior de la secuencia). Las líneas verticales entre nucleótidos muestran identidad en una posición, mientras que un punto indica un vacío en esa posición.

La Figura 3B es una comparación de la secuencia de aminoácidos de RetL1 humano (línea superior de la secuencia) con aquella de la secuencia de RetL1 de rata (línea inferior de la secuencia). Las líneas verticales entre aminoácidos correspondientes muestran la identidad en un residuo, mientras que un punto indica una sustitución conservadora en ese residuo.

La Figura 4A es un diagrama esquemático de un posible papel para Ret y para RetL en la interacción entre una célula de mesénquima metanéfrico y una célula germinal uretral.

La Figura 5 es un diagrama esquemático que nuestra construcción de los plásmidos utilizados para expresar a la proteína de fusión Ret/IgG de rata.

La Figura 6 es un diagrama esquemático que nuestra construcción de los plásmidos utilizados para expresar a la proteína de fusión Ret/IgG humana.

La Figura 7 es una secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 12) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de retL2 humano, como se encuentra en el clon DSW240. El marco de lectura de la proteína está contenido dentro de los nucleótidos 25 a 141b.

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La Figura 8 es una comparación de la secuencia de aminoácidos de RetL2 humano (línea superior de la secuencia) con aquella de la secuencia RetL1 humana (línea inferior de la secuencia). Las líneas verticales entre aminoácidos muestran identidad en una posición, mientras que un punto indica un vacío en esa posición.

La Figura 9 es una secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 16) y una secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 17) de RetL3 murino.

La Figura 10 es una secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 20) y una secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 21) de RetL3 humano.

Descripción detallada de la invención Números de Identificación de Secuencia

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos a que se hace referencia en las especificaciones se les ha dado los siguientes números de identificación de secuencia:

SEQ ID NO: 1 - ADNc de retL1 de rata

SEQ ID NO: 2 - RetL1 aa de rata

SEQ ID NO: 3 - oligómero kid-13

SEQ ID NO: 4 - oligómero kid-14

SEQ ID NO: 5 - oligómero kid-15

SEQ ID NO: 6 - ADNc de ret de rata ADNc

SEQ ID NO: 7 - Ret aa extracelular de rata

SEQ ID NO: 8 - ADNc de retL1 humano parcial

SEQ ID NO: 9 - RetL1 aa humano parcial

SEQ ID NO: 10 - ADNc de retL1 humano

SEQ ID NO: 11 - RetL1 aa humano

SEQ ID NO: 12 - ADNc de retL2 humano

SEQ ID NO: 13 - RetL2 aa humano

SEQ ID NO: 14 - ADNc de retL3 murino parcial (EST AA50083)

SEQ ID NO: 15 - RetL3 aa murino parcial

SEQ ID NO: 16 - ADNc de retL3 murino

SEQ ID NO: 17 - RetL3 aa murino

SEQ ID NO: 18 - ADNc de retL3 humano parcial

SEQ ID NO: 19 - RetL3 aa humano parcial

SEQ ID NO: 20 - ADNc de retL3 humano parcial

SEQ ID NO: 21 - retL3 aa humano

Definiciones

Como se lo utiliza aquí, el término "RetL" significa cualquier proteína que interactúe específicamente con la proteína receptora Ret, y que cuando interactúa con Ret dispara la dimerización de Ret y/o la autofosforilación el dominio de la tirosina quinasa de Ret. Las secuencias de ADN que codifican para RetL y para Ret son llamadas "retL" y "ret", respectivamente. Un ligando puede ser soluble, por estar presente como una molécula unida a la membrana sobre la misma o sobre una célula diferente como la molécula Ret para la cual se dispara la autofosforilación. En ciertos usos o interacciones con Ret, el ligando puede requerir de moléculas adicionales para disparar la autofosforilación. Los ligandos incluyen coreceptores o cofactores accesorios del ligando. Los ligandos incluyen además mAbs anti-Ret que actúan como antagonistas de Ret, disparando la dimerización de Ret y la autofosforilación. El ligando puede ser también modificado en diferentes formas, tales como ser incorporado como una porción de una proteína de fusión, tal como con una toxina o un radionúclido.

Por "alineación de secuencias" se entiende el posicionamiento de una secuencia, ya sea de nucleótido o de aminoácido, con otra secuencia, para permitir una comparación de la secuencia de porciones relevantes entre ellas. Un ejemplo de un método de este procedimiento se da en Needleman y colaboradores (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970). El método se puede implementar convenientemente por medio de programas de computador tales como el programa Align (Enastar, Inc). Como lo comprenderán aquellos entrenados en el arte, las secuencias homólogas o funcionalmente equivalentes incluyen disposiciones funcionalmente equivalentes de los residuos de cisteína dentro del esqueleto conservado de cisteína, incluyendo inserciones o supresiones de aminoácidos que alteran la disposición lineal de estas cisteínas, pero no imparten materialmente su relación en la estructura plegada de la proteína. Por lo tanto, los vacíos internos y las inserciones de aminoácidos en la secuencia candidata son ignorados para los propósitos de calcular el nivel de homología o de identidad en la secuencia aminoácidos entre las secuencias candidata y de referencia. Una característica frecuentemente utilizada para establecer la homología de proteínas es la similitud en el número y la ubicación de los residuos de cisteína entre una proteína y en la otra.

Por "clonación" se entiende el uso in vitro de técnicas recombinantes para insertar un gen particular u otra secuencia de ADN dentro de una molécula de un vector. Con el propósito de clonar exitosamente un gen deseado, es necesario emplear métodos para generar fragmentos de ADN, para unir los fragmentos a las moléculas del vector, para introducir la molécula compuesta de ADN dentro de una célula huésped en la cual se pueda replicar, y para seleccionar el clon que tiene al gen objetivo entre las células huésped receptoras.

Por "ADNc" se entiende un ADN complementario o una copia producida a partir de un patrón de ARN por medio de la acción de la ADN polimerasa que depende del ARN (transcriptasa inversa). Por lo tanto, un "clon de ADNc" significa una secuencia de ADN doble complementaria a una molécula de ARN de interés, transportada en un vector para clonación.

Por "librería de ADNc" se entiende una colección de moléculas de ADN recombinante que contienen insertos de ADNc que juntos comprenden una representación de las moléculas de ARNm presentes en un organismo completo con un tejido, dependiendo de la fuente de los patrones de ARN. Tal librería de ADNc se puede preparar por medio de métodos conocidos por aquellos capacitados, y descritos, por ejemplo, en Maniatis y colaboradores, Molecular cloning: A Laboratory Manual, supra. Generalmente, el ARN se aísla primero a partir de las células de un organismo a partir de cuyo genoma se desea clonar a un gen particular. Se prefiere para los propósitos de la presente invención a las líneas celulares de mamífero, y particularmente de humano. Alternativamente, el ARN se puede aislar a partir de una célula tumoral, derivada de un tumor animal, y preferiblemente a partir de un tumor humano. Por lo tanto, una biblioteca se puede preparar a partir, por ejemplo, de un tumor adrenal humano, pero se puede utilizar cualquier tumor.

Como se lo utiliza aquí, término "polimorfismo de ADN" se refiere a la condición en la cual dos o más secuencias diferentes de nucleótidos pueden existir en un sitio particular en el ADN.

El "vector de expresión" incluye vectores que son capaces de expresar secuencias de ADN contenidas allí, esto es, las secuencias de codificación es tan operativamente enlazadas a otras secuencias capaces de llevar a cabo su expresión. Se sobreentiende, aunque no está establecido explícitamente, que estos vectores de expresión deben ser replicables en los organismos huéspedes ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosomal. Un elemento útil, pero no necesariamente, de un vector efectivo de expresión es una secuencia que codifica a un marcador, que es una secuencia que codifica a una proteína que resulta en una propiedad fenotípica (por ejemplo, resistencia a la tetraciclina) de las células que contienen a la proteína que les permite a ese células ser fácilmente identificadas. En resumen, al "vector de expresión" se le da una definición funcional, y cualquier secuencia de ADN que sea capaz de llevar a cabo la expresión de un código contenido en el ADN especificado está incluida en este término, como se aplica a la secuencia especificada. Tales vectores están frecuentemente en la forma de plásmidos, así que "plásmido" y "vector de expresión" son a menudo utilizados en forma intercambiable. Sin embargo, la invención pretende incluir a tales otras formas de vectores de expresión, incluidos los fagos, que sirven funciones equivalentes y que pueden de cuando en cuando pasar a ser conocidos en el estado del arte.

En forma similar, un "derivado funcional" de un gen de cualquiera de las proteínas de la presente invención se entiende que incluye "fragmentos", "variantes", y "análogos" del gen, que puede ser "sustancialmente similar" en la secuencia de nucleótidos, y que codifica a una molécula que posee actividad similar.

Una "molécula relacionada con GDNF" quiere decir cualquier molécula que sea al menos 40% homóloga ya sea a GDNF o a la neurturina, y que sea capaz también de unirse específicamente a RetL.

Este término "gen" significa una secuencia de polinucleótidos que codifica a un péptido.

Por "homogéneo" se entiende, cuando se refiere a una secuencia de un péptido o de ADN, que la estructura molecular primaria (esto es, la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos) sustancialmente de todas las moléculas presentes en la composición en consideración, es idéntica.

El término "oligonucleótido" como se lo utiliza aquí se refiere a sondas, fragmentos de oligómeros para ser detectados, controles de oligómero, oligómeros de bloqueo no marcados e iniciadores para amplificación de secuencias, se define como una molécula que contienen más de tres desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen del uso o función última del oligonucleótido.

El término "sonda" se refiere a un ligando de cualidades conocidas capaz de unirse selectivamente a un antiligando objetivo. Como se aplica a los ácidos nucleicos, el término "sonda" se refiere a una cadena de ácidos nucleicos que tiene una secuencia base complementaria a la cadena objetivo.

"Células huésped recombinantes" se refiere a las células que han sido transformadas con vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante. Como se define aquí, el anticuerpo o modificación del mismo producido por medio de una célula huésped recombinante está, en virtud de esta transformación, en vez de en esas cantidades más pequeñas, o más comúnmente, en cantidades menos detectables, a las que serían producidas por el huésped no transformado.

Como se los utiliza aquí, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas restricción" se refieren a enzimas bacteriales cada una de las cuales corta al ADN bicatenario en o cerca de una secuencia especifica de nucleótidos.

Como se lo utiliza aquí, el término ``polimorfismo a lo largo del fragmento de restricción ("PLFR") se refiere a las diferencias entre los individuos en las longitudes de un fragmento de restricción particular.

Se dice que una molécula es "sustancialmente similar" a otra molécula, si la secuencia de aminoácidos en ambas moléculas es sustancialmente la misma, y si ambas moléculas poseen una actividad biológica similar. Por lo tanto, dado que dos moléculas poseen una actividad similar, ellas se consideran como variantes ya que el término se lo utiliza aquí aún si una de las moléculas contiene residuos adicionales de aminoácidos que no se encuentran en la otra, o si la secuencia de residuos de aminoácidos no es idéntica. Como se lo utiliza aquí, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando contienen fracciones químicas adicionales que no hacen parte normalmente de la molécula. Tales acciones pueden mejorar la solubilidad de la molécula, la absorción, la vida biológica media, etc. Las fracciones pueden disminuir alternativamente la toxicidad de la molécula, eliminar atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Las fracciones capaces de mediar tales efectos se divulgan, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

Por "vector" se entiende una molécula de ADN, derivada de un plásmido o bacteriófago, dentro del cual los fragmentos de ADN se pueden insertar poco clonar. Un vector contendrá uno o más sitios de restricción únicos, y puede ser capaz de replicación autónoma en un huésped definido u organismo de vehículo de tal manera que la secuencia clonada sea reproducible.

Por "sustancialmente pura" se entiende cualquier proteína de la presente invención, o cualquier gen que codifique a cualquiera de tales proteínas, que esté esencialmente libre de otras proteínas o genes, respectivamente, o de otros concomitantes con los cuales se pueda encontrar normalmente en la naturaleza, y como tal existe en una forma que no se encuentra en la naturaleza.

Compuestos de la invención

La invención incluye ADNc que codifica para un RetL, tal como la secuencia de nucleótidos del ADNc de retL3 murino o el ADNc de retL3 humanos. Además, los compuestos de la invención incluyen secuencias que incluyen a las secuencias anteriores, o se derivan de una de ésas secuencias. La invención también incluye vectores, liposomas y otros vehículos portadores que abarcan a una de estas secuencias o a un derivado de una de estas secuencias. La invención también incluye proteínas transcritas y traducidas a partir del ADNc de retL3 murino o del ADNc de retL3 humano, que incluye pero no se limita a RetL3 murino, o RetL3 humano, y sus derivados y variantes.

Una modalidad de la invención incluye variantes solubles de un RetL. Las variantes solubles carecen al menos de una porción de la sección intramembrana del RetL nativo. En algunos ejemplos, la variantes solubles carece de enlace fosfofatidilinositol glicano del RetL nativo. Las variantes solubles incluyen proteínas de fusión que abarcan derivados de RetL que carecen de un motivo fosfofatidilinositol.

Las variantes pueden diferir del RetL de ocurrencia natural en la secuencia de aminoácidos o en formas que no involucran a la secuencia, o en ambas. Las variantes en la secuencia de aminoácidos se producen cuando uno o más de los aminoácidos en el RetL de ocurrencia natural se sustituye por un aminoácido natural diferente, un derivado de aminoácido o un aminoácido no nativo. Se prefieren particularmente las variantes que incluyen RetL de ocurrencia natural, o a los fragmentos biológicamente activos del RetL de ocurrencia natural, cuyas secuencias difieren de la secuencia de tipo silvestre en una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos, que típicamente tienen influencia mínima sobre la estructura secundaria y la naturaleza hidrófoba de la proteína o del péptido. Las variantes pueden también tener secuencias que difieren en una o más sustituciones no conservadoras de aminoácidos, supresiones o inserciones que no eliminan la actividad biológica de RetL. Las sustituciones conservadoras típicamente incluyen la sustitución de un aminoácido por otro con similares características que las sustituciones dentro de los siguientes grupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

Otras sustituciones conservadoras se pueden tomar de la tabla que viene a continuación, y aún otras son descritas por Dayhoff en el Atlas of Protein Sequence and Structure (1988).

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TABLA 1 Reemplazo conservador de aminoácidos

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TABLA 1 (continuación)

2

Otras variantes dentro de la invención son aquellas con modificaciones que incrementan la estabilidad del péptido. Tales variantes pueden contener, por ejemplo, una o más uniones no peptídicas (que reemplazan a las uniones del péptido) en la secuencia del péptido. También están incluidas: las variantes que incluyen residuos diferentes a los L-aminoácidos de ocurrencia natural, tales como los D-aminoácidos o los aminoácidos sintéticos o los de ocurrencia no natural tales como los aminoácidos beta o gama y las variantes cíclicas. La incorporación de D-aminoácidos en vez de L-aminoácidos dentro del polipéptido puede incrementar su resistencia a las proteasas. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.219.990.

Los péptidos de esta invención se pueden modificar también por medio de diferentes cambios tales como inserciones, supresiones y sustituciones, ya sea conservadoras o no conservadoras en donde tales cambios pueden proveer ciertas ventajas en su uso. Se incluyen específicamente las variantes de empalme en la invención.

Adicionalmente a los polipéptidos sustancialmente de longitud completa, la presente invención provee fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos. Un polipéptido RetL o fragmento es biológicamente activo si exhibe actividad biológica de RetL de ocurrencia natural. Tales actividades biológicas incluyen la capacidad de unirse específicamente a la porción extracelular de Ret, con una afinidad que es al menos del 50% de, y preferiblemente al menos igual a, la afinidad de RetL de ocurrencia natural para la porción extracelular de Ret. Otra actividad biológica es la capacidad de unirse a un anticuerpo que se dirige a un epítopo que está presente sobre el RetL de ocurrencia natural.

En otras modalidades, las variantes con sustituciones de aminoácidos que son menos conservadoras, pueden resultar también en derivados deseados, por ejemplo, causando cambios en la carga, la conformación y en otras propiedades biológicas. Tales sustituciones incluirían por ejemplo, la sustitución de un residuo hidrofílico por un residuo hidrófobo, la sustitución de una cisteína o de una prolina por otro residuo, la exclusión de un residuo que tenga una cadena lateral pequeña por un residuo que tenga una cadena lateral voluminosa, o la sustitución de un residuo que tenga una carga neta positiva por un residuo que tenga una carga neta negativa. Cuando el resultado de una sustitución dada no se pueda predecir con certeza, los derivados de pueden analizar fácilmente de acuerdo con los métodos revelados aquí para determinar la presencia o la ausencia de las características deseadas.

Generalmente, las sustituciones que se pueden esperar para inducir cambios en las propiedades funcionales de los polipéptidos Ret son aquellas en las cuales: (i) un residuo hidrofílico, por ejemplo, serina o treonina, se sustituye por un residuo hidrófobo, por ejemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina, o alanina; (ii) un residuo de cisteína se sustituye por (o con) cualquier otro residuo; (iii) un residuo que tenga una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisina, arginina o histidina, se sustituye por (o con) un residuo que tenga una carga electronegativa, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico; o (iv) un residuo que tenga una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o con) una que no tenga tal cadena lateral, por ejemplo, glicina.

Las variantes reveladas aquí incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tienen al menos sesenta por ciento de homología con RetL1 de rata (SEQ ID NO: 2), RetL1 parcialmente humano (SEQ ID NO: 9), RetL1 completamente humano (SEQ ID NO: 11), RetL2 humano (SEQ ID NO: 13), RetL3 murino (SEQ ID NO: 17), RetL3 parcialmente humano (SEQ ID NO: 19), o RetL3 humano (SEQ ID NO: 21). Más preferiblemente, la homología de secuencia es de al menos ochenta, de al menos noventa por ciento, o de al menos noventa y cinco por ciento. Para los propósitos de determinar la homología, la longitud de las secuencias que se comparan será al menos de 8 residuos de aminoácidos, usualmente al menos 20 residuos de aminoácidos. Las variantes de los compuestos de la invención incluyen también a cualquier proteína 1) que tenga una secuencia de aminoácidos que sea al menos cuarenta por ciento homóloga a una proteína RetL de la invención, y también que 2) después del ser colocada en una alineación óptima con la secuencia de RetL (como se describe para RetL1 y RetL2 en la Figura 8), tenga al menos 80% de sus residuos de cisteína alineados con las cisteínas en la proteína RetL de la invención.

En la medida en que es posible reemplazar a los sustituyes del andamio, es posible también sustituir a los grupos funcionales que se unen al andamio con grupos caracterizados por rasgos similares. Tales modificaciones no alteran la secuencia primaria. Éstas serán inicialmente conservadoras, esto es, el grupo de reemplazo tendrá aproximadamente el mismo tamaño, la misma forma, la misma hidrofobicidad y carga que el grupo original. Las modificaciones que no son de secuencia pueden incluir, por ejemplo, derivatización química in vivo o in vitro de porciones de RetL de ocurrencia natural, así como cambios en acetilación, mutilación, fosforilación, carboxilación o glicosilación.

También se incluyen dentro de la invención a los agentes que se unen específicamente a una proteína de la invención, o a un fragmento de tal proteína. Estos agentes incluyen proteínas de fusión Ig y anticuerpos (que incluyen cadena sencilla, cadena doble, fragmentos Fab, y otros, ya sean nativos, humanizados, privatizados o quiméricos). Las descripciones adicionales de estas categorías de agentes se encuentran en la solicitud PCT 95/16709.

Procedimiento experimental Visión de Conjunto de la Estrategia

La estrategia general utilizada para clonar RetL1 se muestra en las Figuras 4A y 4B. Nuestra estrategia se basó en la premisa de que al menos un RetL se expresa sobre el mesénquima metanéfrico del riñón en desarrollo como una proteína de membrana (aunque es posible que el ligando se exprese también en una forma soluble; Figura 4A). El RetL interactúa con el receptor de Ret sobre la célula germinal uretral, activando dominio citoplásmico de tirosina quinasa y enviando una señal al núcleo, que a su vez activa a los genes involucrados en el crecimiento y la ramificación de la terminación uretral. Por lo tanto, las proteínas que contienen al dominio extracelular de Ret fusionadas ya sea a la porción F_{c} de la inmunoglobulina humana G1 (IgG1) o de la fosfatasa alcalina (AF) se pueden utilizar como parte de una estrategia para clonar a RetL como se muestra en la Figura 4B. Las proteínas de fusión, las bibliotecas de expresión y otros reactivos utilizados en la clonación de RetL se describen más adelante.

Primero aislamos un ADNc para RetL1 de rata y luego se lo utiliza como sonda para aislar un ADNc para RetL1 humano. Los ADNc se aíslan posteriormente para RetL2 y RetL3.

Generación de Reactivos Requeridos para Expresión Directa de la Clonación de los Ligandos de Ret 1. Aislamiento del ADNc que Codifica al Dominio Extracelular de Ret de Rata

Para identificar a RetL1, se generan proteínas de fusión que consisten de los dominios extracelulares ya sea de Ret humano o de rata, fusionados a una proteína, en un ejemplo la porción Fc humana de IgG, y en otro ejemplo la fosfatasa alcalina. Ambos socios de fusión pueden ser fácilmente analizados para detectar a las células que expresan al ligando como el ilustrado en la Figura 4B.

Ya que nunca se ha divulgado un ADNc que codifique Ret de rata, aislamos un ADNc que codifica al dominio extracelular del receptor Ret de rata utilizando el método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa-Transcriptasa Inversa (PCR-RT). Comparamos las dos secuencias de nucleótidos para ret humano (números de acceso del Genbank M57464 y X15262) y de murino (número de acceso del Genbank X67812) y diseñamos los iniciadores oligonucleótidos de regiones de alta identidad entre las dos secuencias. Se escoge un oligómero sentido llamado kid-013 (SEQ ID NO: 3, que contiene los nucleótidos 150-169 de la secuencia del Genbank X15262) a partir del extremo 5' de la secuencia de ADNc de ret humano que se superpone al codón de inicio ATG. Incluye a los nucleótidos sobre su extremo 5' que codifican al sitio de restricción NotI para los propósitos de clonación.

Se escogen dos oligómeros antisentido llamados kid-014 (SEQ ID NO: 4, que contiene al complemento de los nucleótidos 1819-1839 de la secuencia del Genbank M57464) y kid-015 (SEQ ID NO: 5, que contiene al complemento de los nucleótidos 1894-1914 de la secuencia del Genbank X67812), respectivamente, a partir de las secuencias de ADNc humano y de murino inmediatamente 5' a las secuencias que codifican a los dominios transmembrana. Los oligómeros kid-014 y kid-015 contienen nucleótidos adicionales en sus extremos 5' que codifican a un sitio de restricción SalI para el propósito de clonación.

El ARN total se aísla a partir del riñón embrionario de rata el día 14 y el ARNm se purifica utilizando cromatografía oligo-dt. El ARNm se convierte a ADNc utilizando transcriptasa inversa AMV y el ADNc se convierte en ADNc bicatenario y se amplifica utilizando Taq polimerasa en una reacción estándar en cadena de la polimerasa con los oligómeros kid-013 y kid-015. La síntesis de un fragmento por PCR de 1942 pb se confirma corriendo una alícuota de la reacción por PCR sobre un gel de agarosa al 1%. El resto del fragmento por PCR se digiere con NotI y SalI y se clona dentro de pSAE132 previamente digerido con NotI y SalI. El plásmido resultante se llama pJC011. El inserto completo del plásmido pJC011 contenido entre los sitios NotI y SalI se secuencia, y se muestra como ADNc extracelular de ret de rata SEQ ID NO: 6. Una traducción de esta secuencia revela la secuencia del péptido (SEQ ID NO: 7) para el Ret extracelular de rata. Debido a que los oligómeros para PCR se escogieron a partir de secuencias de ret de humano y de ratón, es posible que la secuencia de nucleótidos mostrada como aquella del ADNc extracelular del Ret de rata, y la secuencia de péptidos mostrada como aquella de Ret extracelular de rata, puedan diferir del nucleótido natural de ret de rata y de las secuencias del péptido Ret en las regiones de las secuencias de kid-013 y de kid-015. Posteriormente, se aíslan los clones de ADNc de ret a partir de la biblioteca de ADNc de riñón embrionario de rata el día 18, y se observan nuevos pocos cambios de nucleótidos en las regiones del iniciador que resultan en dos cambios de aminoácidos. Un cambio es en la secuencia señal (arginina en la posición 5 para treonina) y un cambio está cerca del extremo del dominio extracelular (ácido glutámico en la posición 633 para alanina). Ambos cambios no afectarán la unión del ligando.

2. Proteínas de Fusión Ret/IgG

Las proteínas de fusión que se generan consisten de los dominios extracelulares de los receptores de Ret humano (residuos de aa #1-636) y de rata (residuos de aa #1-637) fusionados a la porción Fc de IgG1 humana.

La construcción de los plásmidos utilizados para expresar a la proteína de fusión Ret/IgG de rata se muestra esquemáticamente la Figura 5. Con el propósito de construir un gen que codifique a la proteína de fusión Ret/IgG de rata, digerimos pJC011 (descrito anteriormente) que contenía el dominio extracelular Ret de rata con SalI, y lo ligamos a un fragmento de Sal de 700 pb del plásmido 2-4, para crear al plásmido pJC012. Este fragmento de SalI contiene parte del dominio Fc de IgG1 humana originalmente derivada de plásmido pSAB144. El plásmido 2-4 se creó previamente a través de una ligación de tres vías: un fragmento de NotI-SalI generado por medio de PCR que contenía al dominio extracelular del receptor TGF-beta tipo II de conejo; un fragmento de SalI-NotI de 693 pb de pSAB144 que contenía parte del dominio Fc de la IgG1 humana; y pSAB132 digerido con NotI. Como se muestra en la Figura 5, se puede liberar un fragmento que contiene al dominio Fc del plásmido 2-4 un fragmento de SalI de 700 pb. pJC012 se transfecta dentro de células COS y la proteína de fusión Ret/IgG de rata se purifica a partir del medio 48 horas después de utilizar cromatografía sobre Sefarosa-Proteína A. Con el propósito de elaborar una línea celular estable que produzca a la proteína Ret/IgG de rata, se aísla y se clona al fragmento de NotI de 2612 pb a partir de pJC012 que contiene a la proteína de fusión entera de Ret/IgG de rata, dentro del sitio NotI de expresión del vector pMDR901. El plásmidos resultante se llama pJC022. El plásmido pJC022 se transfecta dentro de células CHO para generar líneas celulares estables. La línea celular de producción más alta se adapta por suspensión. Los rendimientos típicos para la línea celular CHO de Ret/IgG de rata son 75 mg/L.

La construcción de los plásmidos utilizados para expresar a la proteína de fusión Ret/IgG humana se muestra esquemáticamente en la Figura 6. Por el propósito de construir un gen que codifique a la proteína de fusión Ret/IgG humana, obtuvimos un plásmidos que contiene un ADNc que codifica al receptor Ret humano a partir del Dr. M. Takahashi (Departamento de Patología, Universidad de Nagoya. Escuela de Medicina. Nagoya, Japón). Se genera un fragmento PCR a partir de este plásmido utilizando los oligómeros kid-013 y kid-014. En fragmento PCR se trata con un fragmento Klenow seguido por digestión con NotI para producir un fragmento PCR con un extremo cohesivo de NotI y un extremo romo. Este fragmento se clona dentro del vector pGEM11zf(+) previamente digerido con EcoR1, tratado con un fragmento Klenow, y digerido con NotI, con el propósito de generar un extremo cohesivo de NotI y un extremo romo. El plásmido resultante se llama pJC013. El fragmento de NotI-SalI de 1916 pb de pJC013 se aísla después de una digestión completa con NotI y una digestión parcial con SalI, y se liga al fragmento de SalI-NotI de 693 pb de pSAB144 que contiene parte del dominio Fc de la IgG1 humana, y al vector de expresión pSAB132 digerido con NotI. El plásmido resultante se llama pJC015. El inserto en el plásmido pJC013 se secuencia y se encuentra que contiene una diferencia sencilla de nucleótidos que cambia un aminoácido en el dominio extracelular de Ret humano (secuencia M57464 del Genbank que tiene un C en posición 812, mientras que pJC013 tiene un T en la posición correspondiente; esto resulta en un cambio de aminoácidos, de alanina a valina en la posición 294 de la secuencia de la proteína Ret). Éste nucleótido se corrige de nuevo por el residuo C especificado por la secuencia M57464 del Genbank por medio de mutagénesis específica del sitio del plásmido pJC013, produciendo al plásmido pJC023. Un fragmento de BstE2 de 585 pb de pJC023 que contiene a la secuencia reparada de nucleótidos se aísla y se clona dentro del plásmido pJC015 a partir del cual se ha removido el fragmento de BstE2 de 585 pb que contiene al nucleótido de la variante. Es nuevo plásmido se llama pJC024. El fragmento de NotI de 2609 pb de pJC024. El fragmento de NotI de 2609 pb de pJC024 que contiene a la proteína de fusión Ret/IgG humana entera, se aísla y se clona dentro del sitio NotI del vector de expresión pMDR901. Es plásmido resultante se llama pJC025. El plásmido pJC025 se transfecta dentro de células CHO para generar líneas celulares estables. La línea celular de más alta producción se adapta por suspensión. Los rendimientos típicos para la línea CHO de Ret/IgG humana son de 6 mg/L.

Los detalles adicionales sobre la producción de los vectores empleados en los métodos de la inversión se dan en las solicitudes PCT 94/01456 y 92/02050, cuyas especificaciones se incorporan aquí por referencia.

3. Bioactividad de las Proteínas de Fusión Ret/IgG

Para determinar si las proteínas de fusión Ret/IgG que producimos son bioactivas y por lo tanto serían buenos reactivos de protección para la renovación de un RetL, llevamos a cabo diferentes análisis de cultivo de órganos por la bioactividad. El ensayo de cultivo de órganos consiste en el desarrollo de riñones de embrión de rata de 13-14 días en un cultivo de órganos durante 3-5 días en presencia de la proteína de fusión Ret/IgG en una concentración de 50 \mug/ml. Los riñones se cultivan también en presencia de LFA-3TIP/IgG o de un vehículo amortiguador. Después del período de cultivo, algunos de los riñones se colorean con lectina fluorescente Aglutinina Biflorus Dólica (lectina DB) que tiñe a los tejidos con conductos colectores, que son células epiteliales derivadas de la gémula uretral. Estas células positivas "DB" marcan a las células positivas con Ret, ya que Ret se expresa en la gémula uretral y en sus derivados epiteliales. Esto provee una evaluación tosca de la proteína de fusión Ret/IgG sobre el cultivo y desarrollo del riñón embrionario. Existe una clara diferencia en la morfología del conducto colector y el desarrollo entre riñones que han sido cultivados con LFA-3TIP y aquellos cultivados con la proteína de fusión Ret/IgG de rata. Los riñones tratados con Ret/IgG tienen conductos colectores que muestran significativamente menos ramificaciones y son típicamente más pequeñas en conjunto.

Las secciones de parafina se preparan a partir de otros riñones para examen histológico. Los riñones de embriones se tratan con amortiguador de control o con Ret/IgG, luego se colorean con hematoxilina y eosina. Los riñones de embriones tratados con Ret/IgG, exhiben menos ramificaciones de los conductos colectores que los riñones de embriones tratados con amortiguador de control. Además, los riñones tratados con Ret/IgG tienen más pocos conductos. Hemos observado también este efecto con la proteína de fusión Ret/IgG humana. Estas observaciones son consistentes con las proteínas de fusión que bloquean la señal inductiva entre el mesénquima y la gémula uretral. Por lo tanto concluimos que la proteína de fusión es un buen reactivo para clonar a un RetL.

4. Proteína de Fusión de la Fosfatasa Alcalina/Ret

Las proteínas de fusión de la fosfatasa alcalina (AF)/receptor han sido utilizadas exitosamente para identificar y clonar ligandos para el c-kit (Cell 63:185, 1990), ligandos para los miembros de la familia eph de receptores huérfanos (Cell 83:1263, 1995). Se construyen los plásmidos que codifican a la proteína de fusión Ret/AF de rata y se produce la proteína Ret/AF en células COS7 en las fábricas celulares. Posteriormente, se genera una línea celular NIH3T3 que expresa un promedio de 10 mg/L de proteína de fusión. Los análisis por SDS-PAGE de la proteína Ret/AF de rata indican que su tamaño es consistente con el peso molecular predicho, y los análisis de muestreo por gel indican que se produce como un dímero. La purificación parcial se logra por medio de cromatografía de afinidad sobre una columna anti-AF.

5. Anticuerpos Anti-Ret

Se genera un anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína de fusión Ret/IgG de rata. El anticuerpo menciona sobre transferencias de Western, los análisis FACS de líneas celulares positivas de RET, e inmunohistoquímica de secciones de riñón embrionario.

Se genera panel de anticuerpos monoclonales Ret antirata de hámster. La proteína de fusión Ret/IgG de rata, acoplada a Sefarosa-Proteína A, se utiliza para inmunizar hámsteres armenios. Se obtienen 316 clones después de la fusión y selección que su habilidad para unirse a las proteínas de fusión Ret de rata y/o IgG humana en un ensayo de ELISA. 11 clones producen anticuerpos que se unen únicamente a Ret/IgG de rata (y Ret/AF de rata), pero no a IgG humana. La reactividad cruzada con Ret humano se analiza por medio de FACS; cuatro clones producen anticuerpos que se pueden unir a la línea celular humana positiva de Ret THP-1. La siguiente tabla resume las propiedades enlazantes de Ret de doce anticuerpos monoclonales.

Clon	ELISA de Ret/Ig	FACS de THP-1
	de rata	humano
AA.FF9.5	+	-
AA.HE3.7	+	+
AF.E9.5	+	-
BA.B1.16	+	-
BB.B6	+	-
AA.GE7.3	+	-
CD.F11.2	+	-
AH.E3.11	+	+
CD.G4.2	+	+
AG.E7.9	+	-
BD.G6	+	+
BH.G8	-	-

6. Bibliotecas de Expresión de ADNc

Preparamos bibliotecas de ADNc a partir de riñón embrionario de rata, una en el vector CDM8 se utiliza a LA cepa SV40 para amplificación, y otra en el vector InVitrogen modificado, pCEP4, se utiliza la cepa EBV para amplificación. Este vector modificado, CH269, tiene a la secuencia génica de EBNA-1, removida. La proteína EBNA-1 interactúa con la cepa EBV, pero no se necesita al gen sobre el vector cuando se utilizan las células que expresan en forma estable a la proteína EBNA. La biblioteca en el vector CDM8 contiene 1,5 x 10^{6} clones con un tamaño promedio por inserto de 1,18 kb, mientras que la biblioteca en el vector CH269 contiene aproximadamente 1 x 10^{6} clones con un tamaño promedio por inserto de 1,5 kb.

Clonación de la Expresión de RetL1 del Ligando Ret A. Clonación de RetL1 del Ligando Ret 1. Intentos Iniciales de Clonación de la Expresión de RetL1 del Ligando Ret

Se han intentado una cierta cantidad de métodos de expresión directa para clonar a RetL1. Todos estos métodos se basan en el concepto ilustrado en la Figura 4B. Los ADNc de una biblioteca de ADNc se introducen en células de mamífero; las células que reciben RetL1 se pueden identificar utilizando las proteínas de fusión Ret. Aunque las tres aproximaciones descritas más adelante no fueron exitosas, se adquirió importante conocimiento y experiencia, que fue desplegada en una aproximación posterior exitosa.

a.

Método de Movimiento Panorámico con Ret/IgG - La proteína de fusión Ret/IgG de rata se utiliza en un intento por aislar RetL1 por medio de clonación con expresión directa utilizando un método de movimiento panorámico (Aruffo y Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8753-8757 (1987)). Se utiliza una biblioteca de ADNc de riñón embrionario de rata de 18 días en CDM8 para el esfuerzo de movimiento panorámico. Se introducen reservas de los ADNc de esta biblioteca (5.000-10.000 ADNc por reserva) en células COS utilizando el método DEAE-dextrano. Después de 48 horas, se remueven las células las placas con EDTA, se incuban con la proteína de fusión, y posteriormente se hace un paneo sobre placas recubiertas con anticuerpo IgG_{1} antihumano. Se recupera el ADN de las células que lo adhirieron, transformado nuevamente en E. coli, y posteriormente aislado para una segunda vuelta de paneo. Somos incapaces de ver a ninguna célula unida después de la tercera vuelta de paneo, y se obtienen muy pocos clones después de la transformación del ADN de Hirt nuevamente en E. coli. Un ADNc de VCAM, utilizado junto con un anticuerpo monoclonal anti-VCAM como control positivo, solamente podría ser diluido en una proporción de 1:100 y aún ser detectado, indicando que los tamaños de nuestras reservas son probablemente muy grandes. Los análisis de algunos de los clones que se obtienen después de la segunda vuelta de paneo, indican que los clones experimentan reordenamiento y supresión.

b.

Método FACS Preparativo con Ret/IgG - Se introducen 80.000 clones de ADNc de biblioteca de riñón embrionario de rata de 18 días (vector CDM8) en células COS7 y se los somete a FACS preparativo utilizando la proteína Ret/IgG de rata seguido por un anticuerpo secundario etiquetado con fluorita. Los valores más altos de 0,5% y 0,9% de células que fluorescen se recolectan y se recupera el ADN del plásmido por medio de lisis de Hirt. Se electropora el ADN nuevamente en E. coli: se obtienen 228 clones para el 0,5% de la reserva y 752 clones para el 0,9% de la reserva. Se recupera el ADN de los clones bacteriales y se realiza una segunda vuelta de FACS preparativo. Los plásmidos recuperados de los clones bacteriales al final de la segunda vuelta se analizan y se encuentra que contienen grandes supresiones y reordenamientos.

c.

Método de Detección Colorimétrica con Ret/AP - Se transfectan las células COS con 400 reservas de los clones de ADNc (1.000 clones por reserva) a partir de la biblioteca de ADNc de riñón embrionario de rata de 18 días (vector CDM8) y se colorean con la proteína Ret/AP y un sustrato colorimétrico para fosfatasa alcalina. Las células transfectadas se inspeccionan bajo un microscopio para señales positivas. En un experimento, se analizaron nuevamente cinco potenciales positivos, pero todos fueron negativos.

Como control para la proteína Ret/AP, se produce una proteína VCAM/AP funcionando los primeros dos dominios de VCAM humano con el N-terminal de AP placentario. (VCAM se une a la integrina VLA4, que se compone de dos cadenas, alfa-4 y beta-1). La transfección transitoria de células COS produce suficiente proteína VCAM/AP para experimentos de control. La proteína VCAM/AP se compara con VCAM/IgG directamente acoplado a AP, y a VCAM/IgG más un anticuerpo secundario acoplado a AP, con el propósito de evaluar su capacidad para detectar a VLA4 sobre las células COS transfectadas con el ADNc de la cadena alfa-4 (las células COS ya expresan la cadena beta-1). Los resultados muestran que mientras la proteína VCAM/AP podría detectar VLA4 sobre células transfectadas, la mejor detección se produce por medio de la proteína VCAM/IgG en combinación con un anticuerpo secundario acoplado a AP.

d.

Conclusiones Metodológicas:

Tres principales conclusiones surgidas de estos esfuerzos iniciales de clonación:

1)

Los métodos que requieren que el ADN del plásmido sea recuperado para vueltas posteriores (esto es, paneo y FACS preparativo) no son adecuados cuando la abundancia del ADNc objetivo es baja, debido a reordenamientos y supresiones que ocurren durante estas vueltas posteriores. Con base en la baja expresión de Ret, existe una buena razón para sospechar que en la expresión de RetL1 también es baja. La aproximación preferida es la de transfectar en reservas y utilizar un método de detección que permita identificar a una reserva positiva. La reserva original puede ser descompuesta entonces, sin necesidad de recuperar al ADN expresado en forma transitoria a partir de las células transfectadas.

2)

Cuando la proteína Ret/IgG se acopla a un reactivo secundario produce una mejor capacidad de detección que la proteína Ret/AP.

3)

Los experimentos de control con una proteína de control VCAM/IgG (y un anticuerpo secundario acoplado a AP) y el ADNc de integrina alfa-4 (diluido dentro de vector CDM8 y transfectado dentro de células COS) indican que nuestra capacidad de detección es apenas de uno en mil (esto es, el tamaño de la reserva no puede exceder de 1000 clones). Para lograr un mejor nivel de sensibilidad, cambiamos de un vector basado en el origen de SV40 (expresado en células COS) a un vector basado en el origen de EBV (expresado líneas celulares positivas de EBNA). Los vectores basados en el origen de EBV se mantienen como episomas y no son tan tóxicos para célula como los vectores basados en el origen de SV40 después de amplificación. Quiste considerable evidencia de que los genes se pueden expresar en niveles más altos en estos vectores y que los ADNc se pueden diluir mucho más (esto es hasta 1 en 80.000) y aún ser detectados.

2. Selección de Reservas a partir de la Biblioteca de ADNc con Base en el origen de EBV

Seleccionamos las reservas de clones a partir la biblioteca de ADNc de riñón embrionario de rata de 18 días (vector CH269 con el origen de EBV) con la proteína de fusión Ret/IgG de rata. En un experimento, se generan 256 reservas, cada una conteniendo 5.000 clones de la biblioteca. En resumen, se titula una alícuota de la biblioteca del ADN, se siembran en placa 5.000 células (256 veces), y se les permite crecer durante la noche. Las colonias se raspan en el medio: parte del cultivo se utiliza para generar existencias de glicerol para la reserva (almacenado a -70) y parte se utiliza para una preparación de plásmido. Los ADNc de las 256 reservas se transfectan individualmente dentro de células 293/EBNA (8 x 10^{5} sobre una placa de 60 mm) utilizando el método de lipofección. Después de 48 horas se lavan las células dos veces con amortiguador HBHA (0,5 mg/ml de BSA, NaN_{3} al 0,1%, HEPES 20 mM (pH 7,0)) y se incuba con 20 \mug/ml de Ret/IgG de rata en suero fisiológico amortiguado con Tris más MgCl_{2} 1 mM y CaCl_{2} durante 60-90 minutos a temperatura ambiente. Después que esta incubación, las células se lavan cuatro veces con amortiguador HBHA y luego se fijan con acetona al 60%/formaldehído al 3%/HEPES 20 mM (pH 7,0) durante 30 segundos. Después de dos lavadas con amortiguador HBS (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM (pH 7,0)), se incuban las células con un anticuerpo secundario acoplado con AP (F(ab') específico para Fc gama de IgG antihumano de cabra), (Jackson Immuno Research Laboratories; catálogo # 109-056-098; dilución 1:5000 en solución fisiológica amortiguada con Tris más MgCl_{2} y CaCl_{2}) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavan entonces dos veces con amortiguador HBS y dos veces con amortiguador para sustrato de AP (Tris-HCl 100 mM (pH 9,5), NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM) que contiene supresor 2X Pierce Immuno Pure® Phosfatase (catálogo #350002). La última lavada se deja durante 15 minutos. Se añaden entonces los sustratos de AP, NBT (0,33 mg/ml) y BCIP (0,17 mg/ml) en amortiguador para sustrato de AP que contiene al inhibidor Pierce de AP y se incuba con las células durante 5-20 minutos. Las placas se lavan entonces dos veces con agua. Se inspeccionan entonces las placas bajo un microscopio de disección por la presencia de células teñidas de color púrpura.

A partir de un análisis de las 256 reservas, se identifican 17 reservas positivas en la selección primaria. El ADN de cada reserva positiva se transfecta nuevamente dentro de células 293/EBNA y se repite el anterior procedimiento junto con algunos experimentos adicionales de control para confirmar que la coloración observada es específica para Ret/IgG. 10 por fuera de las 17 reservas positivas solamente muestran coloración con la proteína de fusión Ret/IgG y no con otra proteína de fusión IgG.

3. Descomposición de la Reserva #230

Como ejemplo, una de las reservas positivas anteriormente descrita, designada como #230, se descompone en subreservas más pequeñas con el propósito de identificar al ADNc dentro de la reserva que confiere la unión con la proteína de fusión Ret/IgG. 600 células de las existencias de glicerol para la reserva #230 se siembran sobre placa (10 veces) y se cultivan durante la noche. Las colonias sobre estas placas se raspan sobre el medio: una décima parte del cultivo se utiliza para generar una existencia de glicerol y la porción restante se utiliza para una preparación del ADN. Las 10 subreservas de 600 clones se designan como 230-1A hasta 230-5A y 230-1B hasta 230-5B. Los ADN de estas subreservas se transfectan dentro de las células 293/EBNA y se repite el procedimiento descrito anteriormente para la coloración con la proteína de fusión Ret/IgG. Una subreserva #230-5A es positiva para coloración con la proteína Ret/IgG.

Se descompone además la reserva #230-5A con el propósito de identificar al ADNc con esta subreserva que confiere la unión con la proteína de fusión Ret/IgG. Las células de las existencias de glicerol de la reserva 250-5A se siembran sobre placa y se cultivan durante la noche. Las colonias se recogen dentro de los pozos de siete Bioblocks® de 96 pozos y se cultivan durante la noche. De cada Bioblock de 96 pozos, se elaboran 4 reservas de 20 clones y 1 reserva de 16 clones. Por lo tanto, se generan 35 reservas de los siete Bioblocks® designadas como 230-5A-71 hasta 230-5A-105. Se preparan los ADN de cada una de estas reservas y se transfectan dentro de células 293/EBNA y se analizan nuevamente con la proteína de fusión Ret/IgG como se describió anteriormente. La reserva #230-5A-86 es positiva.

La reserva #230-5A-86 se descompone devolviéndose al Bioblock e identificando los 20 clones que fueron mezclados para elaborar esta reserva. Los ADN se elaboran a partir de los veinte clones y se transfectan individualmente dentro de células 293/EBNA y se analizan nuevamente por Ret/IgG como se describió anteriormente. Se encuentra que la reserva #230-5A-86-17 es positiva.

4. Caracterización del Clon #230-5A-86-17

El clon #230-5A-86-17 (llamado retL-17 o clon 17 y depositado como ATCC 98047) se analiza además por medio de secuenciación de ADN. La secuencia completa de nucleótidos del inserto de este clon es SEQ ID NO: 1 (ADNc del retL1 de rata), y parte de la secuencia de nucleótidos se muestra en la Figura 1. Dentro de esta secuencia de nucleótidos, encontramos un marco de lectura que codifica para una proteína de 468 aminoácidos (RetL1 de rata). La proteína predicha tiene una secuencia de señal con una escisión predicha después del aminoácido 24 (Von Heijne y colaboradores, Nucl. Acid Res. 14:14683 (1986)). El C-terminal hidrófobo índica que la proteína puede ser enlazada a la célula a través de un enlace fosfatidilinositol glicano. Existen tres sitios predichos de glicosilación N-enlazada. Estas propiedades son consistentes con aquellas esperadas para un ligando para Ret.

Podemos expresar las formas solubles de la proteína RetL1 de rata truncando al gen antes del C-terminal hidrófobo. Por ejemplo, esto podría hacerse por truncamiento después de la Lisina 435 (RetL1 de rata). El truncamiento secuencia arriba de este aminoácido debe resultar también en la expresión de una forma soluble de la proteína RetL1 de rata. La proteína soluble RetL1 de rata se puede expresar por si misma o como parte de una fusión con inmunoglobulina humana, una etiqueta de histidina, o un epítopo pequeño que se reconoce por medio de un anticuerpo.

B. Clonación de RetL1 del Ligando Ret Humano

Una biblioteca de ADNc de riñón embrionario humano en el vector lambda gt10 se adquiere de Clontech (catálogo #HL5004A). Un millón de unidades formadoras de placa de la existencia de fagos se siembran sobre 10 placas Nunc^{TM}. Las elevaciones de los duplicados de placa se hacen sobre filtros Optitran^{TM} de Schleicher y Schuell.

Se genera una sonda por medio de la digestión del plásmido RetL1 de rata con la enzima de restricción PvuII, seguido por aislamiento sobre gel de agarosa de un fragmento de 1,34 kb que corresponde a nt 242-1582 de la secuencia de nucleótidos de RetL de rata (ADNc de retL1 de rata). Esta sonda de la región de codificación está marcada con P^{32} por medio de imprimación aleatoria (Feinberg y Vogelstein, Anal. Biochem. 137:266-267. 1984). Los filtros se hibridan durante la noche en 300 ml de amortiguador PBS para muestreo de placa (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 1 M, pirofosfato de sodio al 0,1%, PVP al 0,2%, y Ficoll al 0,2%) que contiene sulfato de dextrano al 10%, 100 \mug/ml de ARNt, y 6,7 x 10^{7} CPM de la sonda de rata, a 55ºC. Ellos se lavan dos veces con amortiguador para el filtro de placa y dos veces con 2XSSC/SDS al 10% a 55ºC y se expone a una película a -70ºC con un muestreo de intensificación.

Los duplicados positivos se remueven de la parte central de las placas maestras en SM (NaCl 100 mM, SO_{4} 10 mM, Tris 50 mM pH 7,5) más gelatina. 24 de estos positivos son purificados de la placa. El ADN de minipreparados lambda de las placas candidatas purificadas se digiere con NotI, se lo somete a electroforesis sobre gel de agarosa al 1% y se hacen transferencias de Southern. La transferencia de Southern se hibrida con la sonda de la región de codificación de RetL de rata. El clon HRL20 tiene el inserto más largo (4,4 kb) que hibrida intensamente a la sonda de rata. La secuencia de ADN (ADNc de retL1 humano parcial; SEQ ID NO: 8; Figura 2A) y la secuencia deducida del péptido (RetL1 humano parcial) ha sido obtenida a partir de este clon, confirmando que es el homólogo humano. Este clon codifica a la mayor parte de la región de codificación, incluido el extremo 3' de la región de codificación.

Para obtener el extremo 5' del ADNc humano, se adquiere un kit de ADNc Maratón-Ready^{TM} de riñón fetal humano de Clontech (catálogo #7423-1). Se sintetizan los oligonucleótidos antisentido Kid-155, que corresponden al complemento de los nucleótidos 62-81 de la SEQ ID NO: 8 (ADNc de retL1 humano parcial) y Kid-154, que corresponden al complemento de los nucleótidos 17-43 de la SEQ ID NO: 8(ADNc de retL1 humano parcial). Se lleva a cabo la PCR utilizando el kit PCR de ADNc Advantage^{TM} (Clontech catálogo #8417-1) combinado con los reactivos de ADNc Marathon^{TM} y los oligonucleótidos Kid-155 o Kid-154. La primera reacción PCR se realiza como sigue: 35,5 \mul de H_{2}O; 5,0 \mul de 10X Klen Taq Buffer: 1,0 \mul de mezcla de dNTP 10 mM, 1,0 \mul de mezcla de Klen Taq Polymerase Advantage^{TM}. Estos reactivos se combinan y se mezclan. Luego se añaden 5,0 \mul de ADNc de Riñón Fetal Maratón-Ready^{TM}, 1,0 \mul de iniciador AP1 10 \muM y 1,5 \mul de Kid-155 6,4 \muM (volumen final = 50 \mul). La PCR se lleva a cabo en un Ciclizador Térmico de ADN modelo 480 de Perkin-Elmer Cetus, con las siguientes condiciones de ciclo: 1 ciclo de 94ºC durante 1 minuto; 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 4 minutos. Se efectúa un PCR anidado utilizando el producto de la primera reacción PCR. Primero, se diluyen 5 \mul del producto PCR #1 50 veces con TE (volumen final 250 \mul). La reacción PCR anidada contiene 35,5 \mul de H_{2}O; 5,0 \mul de 10X Klen Taq Buffer; 1,0 \mul de mezcla de dNTP 10 mM; 1,0 \mul de mezcla Klen Taq Polymerase Advantage^{TM} 50X. Estos reactivos se mezclan como anteriormente. 5,0 \mul el producto PCR #1 diluido: se añaden luego 1,0 \mul de iniciador AP2 10 mM y 1,5 \mul de Kid-154 6,9 \muM. Las condiciones del ciclo son las mismas anteriores. El producto resultante de aproximadamente 700 pb se purifica sobre gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% y extraído con fenol. El ADN purificado se clona dentro del sitio EcoR5 de pZErO^{TM} (catálogo Invitrogen #K2510-01). La información de la secuencia se obtiene a partir de aislados múltiples, incluidos los clones llamados HRL7G6 y HRL7G8.

Se encuentra que la secuencia obtenida a partir del clon HRL7G8 se superpone con la secuencia del clon HRL20 (ADNc de RetL1 humano parcial) y se la utiliza para generar una secuencia completa de RetL1 humano (ADNc de retL1 humano completo), como se muestra en la Figura 2B. La secuencia de nucleótidos obtenida a partir del clon HRL7G8 representa a los nucleótidos 1 a 502 del ADNc de retL1 humano completo, la secuencia de nucleótidos el clon HRL20 representa a los nucleótidos 460 a 1682 del ADNc de retL1 humano completo. La secuencia del clon HRL7G8 se conforma por medio de la secuenciación de otro clon de ADNc (GJ102) aislado de la biblioteca de ADN lambda gt10 de riñón embrionario humano descrito anteriormente, utilizando una sonda derivada del clon HRL7G6. Los nucleótidos 118 a 1497 contienen al marco de lectura de la proteína de ADNc de retL1 humano completo.

La secuencia completa de aminoácidos del RetL1 humano también se muestra en la Figura 2B. Como se muestra por medio del análisis BESTFIT descrito en la Figura 3A, el ADNc de retL1 humano es 82% idéntico al ADNc de retL1 de rata. La comparación del péptido (Figura 3B) muestra que la secuencia del péptido putativo humano es 93,3% idéntica, y 97,2% similar, a aquella de la rata.

Clonación de RetL2 del Ligando Ret A. Clonación de RetL2 Humano

La secuencia del péptido de RetL1 de rata (RetL1 de rata) se utiliza para buscar la base de datos en el Genbank con el programa BLAST con el propósito de identificar a las proteínas relacionadas (esto es, isólogas). BLAST o la Basic Local Alignment Search Tool, utilizan el método de Altschul y colaboradores (J. Mol. Biol 215:403-410, 1990) para investigar las similitudes entre una secuencia en duda y todas las secuencias en la base de datos de secuencia. La secuencia en duda y la base de datos que va a ser buscada puede ser o bien un péptido o un nucleótido en cualquier combinación. Cuando la secuencia del péptido RetL1 de rata es preguntada contra la base de datos de nucleótidos Expressed Sequence Tag (EST), se obtienen dos coincidencias significativas. Una es con el Acceso #R02249 del Genbank, una EST de 229 pb de una biblioteca combinada de ADNc de bazo y de hígado fetal humano, y la otra es con el Acceso #H12981 del Genbank, una EST de 521 pb de una biblioteca de ADNc de cerebro de niño humano. Las dos EST comparten 99% de identidad en una región de superposición indicando que ellas son del mismo ADNc. Los oligonucleótidos se generan a partir de la EST H12981: KID-228 (GAA TGA CAA CTG CAA GAA GCT GCG CTC CTC; correspondiente a los nucleótidos 38-67 y también a los nucleótidos 534-563 de la SEQ ID N0: 12), y al oligonucleótido antisentido KID-229 (GTG TAC TCG CTG GGC ACC CG: correspondiente al complemente de los nucleótidos 156-175 y también al complemento de los nucleótidos 652-671 de la SEQ ID NO: 12).

1 x 10^{6} unidades formadoras de placa de una biblioteca de ADNc lambda GT10 Stretch Plus de Hígado Fetal Humano 5' de Clontech (catálogo #HL5003a) se muestrea por duplicado sobre filtros OPTITRAN^{TM}. Los filtros se hibridan con los oligonucleótidos KID-228 y KID-229 marcados con ^{32}P en 400 ml de amortiguador para muestrear la placa (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 1 M, pirofosfato de sodio al 0,1%, polivinilpirrolidina al 0,2% y Ficoll al 0,2%) que contiene sulfato de dextrano al 10% y 100 \mug/ml de ARNt y 80 pmoles de cada oligonucleótido marcado con ^{32}P a 65ºC durante la noche. Ellos se lavan dos veces con 2X SSC/SDS al 1% y dos veces con 1X SSC/SDS al 1% y se exponen a una película. Se purifican 11 duplicados positivos. El ADN de cada uno de estos clones se analiza por medio de digestión con enzima de restricción seguido por electroforesis sobre gel de agarosa y transferencias de Southern. Los filtros se hibridan a KID-228 y KID-229 para confirmar que los insertos hibridan a la sonda. El inserto del clon DSW240 s secuencia completamente (ADNc de retL2 humano, SEQ ID NO: 12) y se muestra en la Figura 7.

Los nucleótidos 25-1416 contienen al marco de lectura de la proteína del ADNc de retL2 humano, que codifica a una proteína de 464 aminoácidos (RetL2 humano; SEQ ID NO: 13), y se muestra en la Figura 7. Como se muestra por medio del análisis BESFIT descrito en la Figura 8, la proteína de RetL humano es 49,1% idéntica y 63,7% similar a la proteína de RetL1 humano. Comparte en común con RetL1 humano un N-terminal hidrófobo indicativo de una secuencia señal y un C-terminal hidrófobo indicativo de un motivo de enlazamiento fosfatidilinositol glicano. Además, se conservan 30 cisteínas por fuera de las 31 que están presentes en cada proteína.

B. Demostración de que RetL2 es un Ligando para Ret

Demostramos que RetL2 es un ligando para Ret por medio de la transfección de células 293/EBNA con un plásmido de expresión que contiene al inserto del clon DSW240 y mostrando que las células pueden unir a una proteína soluble de fusión Ret/IgG.

El inserto de DSW240 se remueve utilizando NotI y se clona dentro del vector de expresión CH269 que contiene un origen de EBV y permite una alta expresión en líneas celulares positivas de EBNA. Las digestiones de restricción se llevan a cabo para identificar clones que tengan la orientación correcta. El ADN de plásmido se prepara a partir de un clon que tenga la orientación correcta.

Los ADN de plásmido (el plásmido de expresión de retL2, un plásmido de expresión de retL1 para un control positivo, y un plásmido de expresión que contiene una proteína no relacionada para un control negativo) se transfectan dentro de células 293/EBNA (8 x 10^{5} sobre una placa de 60 mm) utilizando el método de lipofección. Después de 48 horas, las células se lavan dos veces con amortiguador HBHA (0,5 mg/ml de BSA, NaN_{3} al 0,1%, HEPES 20 mM (pH 7,0)) y se incuban con 20 \mug/ml de Ret/IgG de rata en solución fisiológica amortiguada con Tris más MgCl_{2} 1 mM y CaCl_{2} durante 60-90 minutos a temperatura ambiente. Después de esta incubación, las células se lavan cuatro veces con amortiguador HBHA y luego se fijan con acetona al 60%/formaldehído al 3%/HEPES 20 mM (pH 7,0) durante 30 segundos. Después de dos lavados con amortiguador HBS (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM (pH 7,0)), las células se incuban con un anticuerpo secundario acoplado a AP (F(ab') específico para Fc gama de IgG antihumano de cabra), (Jackson Immuno Research Laboratories; catálogo # 109-056-098; dilución 1:5000 en solución fisiológica amortiguada con Tris más MgCl_{2} y CaCl_{2}) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavan entonces dos veces con amortiguador HBS y dos veces con amortiguador para sustrato de AP (Tris-HCl 100 mM (pH 9,5), NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM) que contiene supresor 2X Pierce Immuno Pure® Phosfatase (catálogo #350002). La última lavada se deja durante 15 minutos. Se añaden entonces los sustratos de AP, NBT (0,33 mg/ml) y BCIP (0,17 mg/ml) en amortiguador para sustrato de AP que contiene al inhibidor Pierce de AP y se incuba con las células durante 5-20 minutos. Las placas se lavan entonces dos veces con agua. Se inspeccionan entonces las placas bajo un microscopio de disección por la presencia de células teñidas de color púrpura. La presencia de células teñidas de color púrpura indica que la proteína de fusión Ret se ha unido a las células y que la proteína RetL2 es un ligando para Ret. Las células teñidas de color púrpura se observan también después de la transfección con el vector de expresión retL1 pero no con el vector de control negativo.

Clonación de RetL3 del Ligando Ret A. RetL3 Murino

Una búsqueda de la base de datos EST con la secuencia de aminoácidos de RetL1 de rata revela dos EST murinos con homología con los ligandos Ret. Estos EST son AA049894, y AA050083 (que es un ADNc de retL3 murino parcial, SEQ ID NO: 14). Los plásmidos que codifican a estos EST se obtienen de Genome Systems Inc. (Catálogo #475791 y #475497) como bandas bacteriales. El ADN de plásmido se prepara a partir de colonias sencillas obtenidas formando franjas con las bandas sobre placas LB Amp. Los insertos de estos plásmidos se secuencian en su totalidad. La comparación de las dos secuencias demuestra que AA049894, que tiene un inserto de 1,4 kb, está contenida dentro de AA050083, que tiene un inserto de 1,9 kb. La traducción de la secuencia de ADN de AA050083 indica que existe un marco continuo de lectura abierta desde NT205 hasta NT1242 (RetL3 murino parcial; SEQ ID NO: 15). Este ORF tenía 37,5% de identidad con aquella de retL1 de rata y 40,2% de identidad con retL2 de rata. Sin embargo, el marco de lectura abierta no codifica a un Met o a una secuencia de señal en el extremo 5'. Examinamos a los ORF 5' secuencia arriba de esta región y encontramos un Met en el contexto de una secuencia de consenso Kozak para la iniciación de la traducción y una secuencia potencial de señal para expresión/secreción superficial. Este ORF está fuera del marco con los ORF secuencia abajo indicando que EST AA050083 contiene una mutación potencial, tal como una inserción, una supresión, un intrón o un artefacto de clonación, en su extremo 5'.

Con el propósito de obtener el extremo 5' correcto, empleamos RACE de Maratón. El ADNc de embrión de ratón de 11 días de Maratón-Ready^{TM} (catálogo #7458-1) y un kit Advantage^{TM} (catálogo #8417-1) se adquieren de Clontech. Se sintetizan los oligonucleótidos antisentido, Kid-366, correspondientes al complemento de los nucleótidos 847-866 de la SEQ ID NO: 14 y de Kid-365, correspondiente al complemento de los nucleótidos 589-615 de la SEQ ID NO: 14. La PCR se realiza utilizando un kit PCR de ADNc Advantage^{TM} (Clontech catálogo #8417-1) combinada con los reactivos ADNc de Marathon^{TM} y el oligonucleótido Kid-366. La primera reacción PCR se realiza como sigue: 35,5 \mul de H_{2}O; 5,0 \mul de 10X Klen Taq Buffer: 1,0 \mul de mezcla de dNTP 10 mM, 1,0 \mul de mezcla Klen Taq Polymerase 50X de Advantage^{TM}. Estos reactivos se combinan y se mezclan. Luego se añaden 5,0 \mul de ADNc de embrión de ratón de 11 días de Maratón-Ready^{TM}; 1,0 \mul de iniciador AP1 10 \muM y 1,7 \mul de Kid-366 5,88 \muM (volumen final = 50 \mul). La PCR se lleva a cabo en un Ciclizador Térmico de ADN modelo 480 de Perkin-Elmer Cetus, con las siguientes condiciones de ciclo: 1 ciclo de 94ºC durante 1 minuto; 5 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 4 minutos; 5 ciclos de 92ºC durante 30 segundos, 70ºC durante 4 minutos; 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 4 minutos. Se efectúa un PCR anidado utilizando el producto de la primera reacción PCR. Primero, se diluyen 5 \mul del producto PCR #1 50 veces con TE (volumen final 250 \mul). La reacción PCR anidada contiene 35,5 \mul de H_{2}O; 5,0 \mul de 10X Klen Taq Buffer; 1,0 \mul de mezcla de dNTP 10 mM; 1,0 \mul de mezcla Klen Taq Polymerase Advantage^{TM} 50X. Estos reactivos se mezclan como anteriormente. 5,0 \mul el producto PCR #1 diluido; se añaden luego 1,0 \mul de iniciador AP2 10 mM y 3,6 \mul de Kid-365 2,8 \muM. Las condiciones del ciclo son las mismas anteriores. El producto resultante de aproximadamente 665 pb se purifica sobre gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% y extracto de Qiaex II (Qiagen catálogo #20021). El ADN purificado se clona dentro de pNoTA/T7^{TM} utilizando el sistema de clonación PRIME PCR CLONER^{TM} (5 Prime->3 Prime catálogo #1-725029). La información de la secuencia se obtiene a partir de aislados múltiples, incluidos los clones llamados DSW252 y DSW253.

Se encuentra que la secuencia de DSW252 se superpone con la SEQ ID NO: 14 excepto que una T adicional está presente entre NT252 y NT 253 de la secuencia SEQ ID NO: 14. Esta T también está presente en los otros aislados DSW251 y DSW253. La inserción de esta base adicional corrige al ORF de tal manera que se obtiene un ORF sencillo de 1191 pb (contando desde la primera Met) que codifica 397 aminoácidos. Este ORF codifica a una Met en el contexto de una secuencia consenso de iniciación de traducción canónica (Kozak) e incluye una secuencia señal para expresión/secreción superficial.

Para obtener un clon murino completo que sea capaz de ser expresado, se purifica un fragmento NotI-BamHI de 630 pb de DSW252 y un fragmento BamHI-NotI de 1308 pb de AA050083 y se liga al vector de expresión CH269 digerido con NotI. La ligación se transforma dentro de E. coli XL1-Blue (Strategene catálogo #200236). Las mini preparaciones Quiawell Ultra se realizan sobre los transformantes resultantes. Estas se analizan por medio de digestión de restricción y de electroforesis en gel para el tamaño correcto y para la orientación. Esta construcción se llama DSW254. Se secuencia el inserto de DSW254 en su totalidad (retL3 murino; SEQ ID NO: 16) y se confirma que ORF codifica a una proteína de 397 aminoácidos (RetL3 murino; SEQ ID NO: 17). Estas secuencias también se muestran en la Figura 9. El C-terminal de RetL3 es hidrófobo e indicativo de un motivo de enlazamiento fosfatidilinositol
glicano.

B. RetL3 Humano

Con el propósito de encontrar una fuente del tejido candidato para clonar RetL3 humano, utilizamos transferencias de Northern de tejidos de ratón para determinar el patrón de expresión de RetL3 murino. De los tejidos estudiados, la expresión de RetL3 es más alta en tejido cardíaco. La biblioteca de ADNc de corazón de un adulto humano en el vector lambda gt10 se adquiere con Clontech (catálogo #HL3026a). Un millón de unidades formadoras de placa de la existencia de fagos se siembran sobre 10 placas Nunc. Las elevaciones de los duplicados de placa se hacen sobre filtros Optitran^{TM} de Schleicher y Schuell.

Se genera una sonda por medio de PCR con los iniciadores Kid-366 y Kid-367, que corresponde a los nucleótidos 397-420 de la secuencia AA050083. La reacción PCR se realiza como sigue: Se mezclan 10 \mul de Amortiguador PFU 10X. 2,0 \mul de mezcla de dNTP 10 mM, 72,1 \mul de H_{2}O, 3,1 \mul de Kid-367 13,2 \muM, 6,8 \mul de Kid-366 5,88 \muM, 5,0 \mul de ADN de AA050083 de 0,1 \mug/\mul y 2,0 \mul de PFU de 2,5 Unidades/\mul (Strategene catálogo #600154). La PCR se lleva a cabo en un Ciclizador Térmico de ADN modelo 480 de Perkin-Elmer Cetus, con las siguientes condiciones: 25 ciclos de 94ºC durante 1 minuto; 53ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 4 minutos. El producto se purifica por medio de extracción con fenol, cloroformo, alcohol isoamilo 50:49:1 seguido de electroforesis sobre gel de agarosa de bajo punto de fusión y purificación con QiaexII del fragmento cortado. Esta sonda de la región de codificación se marca con ^{32}P por medio de imprimación aleatoria (Feinberg y Vogelstein). Los filtros se hibridan durante la noche en 200 ml de amortiguador para muestreo de Placa que contiene sulfato de dextrano al 10%, 100 \mug/ml de ARNt y 1,8 x 10^{8} de CPM de la sonda de ratón a 65ºC. Ellos se lavan dos veces con amortiguador para muestreo de placa, dos veces con 2XSSC/SDS al 1%, dos veces con 1XSSC/SDS al 1% a 65ºC y se expone a una película a -70ºC con un muestreo de intensificación. Los duplicados positivos se purifican en placa. El ADN de minipreparados lambda de las placas candidatas purificadas se digiere con EcoR1, se lo somete a electroforesis sobre gel de agarosa al 1% y se hacen transferencias de Southern. La transferencia de Southern se hibrida con la sonda de ratón. El clon GJ128, que tiene un inserto de 1,3 kb, hibrida intensamente a la sonda de la región de codificación de ratón. La secuencia de ADN (ADNc de retL3 humano parcial; SEQ ID NO: 18) y la secuencia deducida del péptido (RetL3 humano parcial, SEQ ID NO: 19) se obtiene a partir de este clon, confirmando que este es el homólogo humano. Este clon codifica a la mayor parte de la región de codificación, incluido el extremo 3' de la región de codificación.

El inserto de 1,3 kb de GJ128 se purifica, se marca con P^{32} y se lo utiliza para muestrear la biblioteca de corazón humano adulto de Clontech con el propósito de obtener un clon con el extremo 5'. No se obtienen clones que contengan el extremo 5' en un muestreo de 2 x 10^{6} placas de esta biblioteca. Los análisis Northern de transferencia de ARNm de tejido adulto humano (Clontech catálogo #7760-1, 7759-1 y 7767-1) que hibridan con la misma sonda, utilizando protocolos suministrados por el fabricante, indican que RetL3 humano se expresa en médula espinal de adulto humano, estómago, corazón, páncreas, intestino delgado, colon, próstata y testículos. Una biblioteca de ADNc de médula espinal de adulto humano de Clontech (catálogo #5001a) se muestrea con el inserto GJ128. 3 clones independientes se purifican y se secuencia el más largo, GJ135. La secuencia del inserto de GJ135 se superpone con el inserto de GJ128, permitiendo la generación de una secuencia compuesta del ADNc de retL3 humano completo (SEQ ID NO: 20) y la determinación de RetL3 humano completo (SEQ ID NO: 21). Estas secuencias se muestran también en la Figura 10. El RetL3 humano es 34,3% y 34,9% idéntico a RetL1 humano y a RetL2 humano, respectivamente. Tiene 76,8% de identidad con RetL3 murino.

Usos terapéuticos de los compuestos de la invención

Los RetL nativo y variante, los anticuerpos anti-RetL, los anticuerpos anti-Ret y las proteínas de fusión de Ret y de los RetL pueden tener utilidad terapéutica en situaciones en donde es deseable bloquear o activar la ruta de señalización de Ret, para estimular el crecimiento celular neuronal y/o renal o la supervivencia en situaciones de enfermedad en donde estas células se pierden o se dañan, o para suprimir el crecimiento de, o matar a las células indeseables tales como las células tumorales que expresan Ret o a un RetL.

En general, los compuestos de la invención que se unen a Ret, que inducen dimerización y/o autofosforilación de Ret, son útiles para estimular el crecimiento de, o limitar el daño para los tejidos que expresan Ret. Los compuestos de la invención son útiles para estimular el crecimiento de tejido renal y/o la supervivencia, el soporte de la función renal, y en minimizar el daño para el tejido renal después de diferentes maltratos. Las condiciones particulares que pueden tratarse en forma benéfica con los compuestos de la invención incluyen falla renal aguda, nefritis aguda, falla renal crónica, síndrome nefrótico, defectos del conducto renal, trasplantes de riñón, daños tóxicos, lesiones hipóxicas, y trauma. Los defectos en el conducto renal incluyen a aquellos de tipo hereditario o de naturaleza adquirida, tales como enfermedad renal policística, enfermedad cística medular, espongiosis medular renal. Este listado no se encuentra limitado, y puede incluir muchos otros desordenes renales (ver, por ejemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine, 13^{ava} edición, 1994).

En otras aplicaciones, los genes y las proteínas de la invención se pueden utilizar para tratar condiciones en las cuales es deseable el crecimiento y la regeneración neural. Esto incluiría cualquier condición que involucre desordenes de degeneración neural, tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Tourette, la esclerosis lateral amiotrófica, así como enfermedades motoras neuronales, enfermedades desmielinizantes tales como la esclerosis múltiple, enfermedades bacteriales tales como meningitis, abscesos, o empiema, enfermedades virales tales como mielopatía asociada con el VIH, enfermedades de priones incluida la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. También se encuentran incluidos los desordenes de daño al tejido neuronal, ya sea causado por intromisión neoplásica, trauma, o eventos cerebrovasculares tales como hemorragia o embolia. Se incluyen específicamente enfermedades de los nervios craneales y de la médula espinal, incluidos los desordenes que involucran etiologías traumática, inflamatoria, congénita o vascular que afectan al sistema nervioso autónomo. También se incluyen los desordenes de desarrollo neural, tales como el retardo mental, autismo, síndrome de alcoholismo fetal, el síndrome de Down, y parálisis cerebral. Los compuestos de la invención pueden ser utilizados también para tratar síndromes que involucran al sistema nervioso periférico. Estos desordenes incluyen a aquellos causados por cualquiera de los factores previamente enlistados, e incluyen específicamente a la enfermedad de Lyme, neuropatías asociadas con el VIH, polimiositis, distrofia muscular, y miastenia grave.

Los anticuerpos anti-RetL y las proteínas de fusión Ret de la invención, que específicamente se unen a la proteína de RetL3 murino o RetL3 humano, o a fragmentos de esas proteínas, son útiles en diferentes métodos. Los compuestos pueden utilizarse terapéuticamente para inhibir o bloquear la señalización del receptor Ret, tal como el bloqueo en el crecimiento de tumores que depende de la activación de la señalización de Ret por el crecimiento. Estos agentes pueden fusionarse también para marcadores detectables, tales como sustancias fluoroscópicamente o radiográficamente opacas, y administrarse a un individuo para permitir la formación de imágenes de los tejidos que expresan un RetL. Los agentes pueden unirse también a sustancias, tales como peroxidasa de rábano, que pueden ser utilizadas como manchas inmunocitoquímicas para permitir la visualización de áreas de células positivas para RetL sobre secciones histológicas. Un anticuerpo específico podría ser utilizado solamente en esta forma, y los sitios en donde se une se pueden visualizar en un ensayo tipo sándwich utilizando un anticuerpo antiinmunoglobulina que por si mismo se une a un marcado detectable. Los anticuerpos específicos para cualquier RetL también son útiles en inmunoensayos para cuantificar la sustancia para la cual un anticuerpo dado tiene especificidad. Los anticuerpos específicos para un RetL se pueden unir también a soportes sólidos, tales como granulados o cápsulas, y utilizados para remover al ligando de una solución, ya sea para utilizarlos en la purificación de la proteína o para aclararla de la solución. Cada una de estas técnicas es de rutina para aquellos capacitados en las artes inmunológicas.

Otros métodos de la invención incluyen la modulación de las señales de Ret-RetL poniendo en contacto a Ret con un anticuerpo monoclonal anti-Ret. El efecto de tal contacto mAb-Ret puede ser ya sea para bloquear o para estimular la activación de la ruta de señalización de Ret, dependiendo de las características de la interacción de cada mAb particular con Ret. Ciertos mAb interactúan con Ret como agonistas, con la unión agonista mAb-Ret disparando la dimerización y la autofosforilación de Ret. Otros mAb actúan como antagonistas de Ret. La interacción de Ret con un antagonista mAb evita la activación de la señalización de Ret por medio de otros RetL, o por medio de complejos que contienen RetL, que de lo contrario activarían la ruta de señalización de Ret.

Un RetL y/o los anticuerpos para Ret o para una proteína de fusión de Ret se pueden utilizar para permitir la formación de imágenes de los tejidos que expresan Ret, o en los métodos inmunohistológicos o preparativos descritos anteriormente para los anticuerpos para un RetL.

Las proteínas de fusión que abarcan a un RetL y/o a anticuerpos anti-Ret se pueden utilizar para terapias médicas específicamente dirigidas contra canceres y tumores que expresan Ret. Tales tumores pueden incluir a varios fenotipos diferentes de tumores que han sido asociados a mutaciones en Ret (N. Engl. J. Med. 335:943-951, 1996; Nature 367: 319-320. 1996; Trends Gen. 12:138-144, 1996). Las intervenciones terapéuticas contra neoplasias que expresan a un RetL utilizan proteínas de fusión que incorporan Ret y/o anticuerpo anti-RetL. El anticuerpo anti-Ret o el anticuerpo anti-RetL pueden ser efectivos por si mismos a través de citólisis dependiente de anticuerpo y dependiente de complemento mediado por el dominio Fc. Tales ligandos híbridos y anticuerpos pueden hacerse más efectivos como terapias para el cáncer por medio del uso de ellos como vehículos para el suministro de drogas antineoplásicas, toxinas y radionúclidos citocidales, tales como el Itrio 90. Las células citotóxicas efectoras pueden dirigirse a células tumorales utilizando anticuerpos heteroconjugados, donde un anticuerpo específico ya sea para Ret o para un RetL expresado por un tumor se acopla, en forma covalente a un anticuerpo dirigido contra una proteína de superficie sobre células efectoras citotóxicas, tales como células NK o las CTL.

Un ejemplo de un anticuerpo anti-Ret u de una terapia con RetL es para conjugar a la cadena tóxica A de ricino o a una forma modificada de ricino de tamaño natural (que no se pueden enlazar más a las células) de un RetL o de un anticuerpo dirigido contra el polipéptido Ret expresado sobre la superficie de células malignas. En otra modalidad, una toxina se conjuga con Ret o con un anticuerpo anti-RetL para dirigir selectivamente y matar a las células RetL positivas, tales como un tumor que expresan a un RetL. Tal aproximación ha probado ser exitosa con conjugados bloqueados de ricino a un anticuerpo monoclonal contra el antígeno CD19 expresado sobre la mayoría de las células neoplásica neoplásicas (Grossbard y colaboradores, Blood 79:576, 1992). Otras toxinas son igualmente útiles, como lo saben aquellos capacitados en la técnica. Tales toxinas incluyen, pero no se limitan a, exotoxinas pseudomonas, toxina de la difteria, y saponina. Esta aproximación probaría ser aún más exitosa utilizando un RetL o un anticuerpo anti-Ret, en contraste con la aproximación conocida de antígeno anti-CD19, debido a que Ret se expresan en un número muy limitado de tejidos.

Las aproximaciones anteriores, utilizando fusiones de ricino o de otras toxinas, son igualmente aplicables a los conjugados tóxicos de RetL o de un anticuerpo anti-Ret; estas son útiles para dirigir selectivamente y matar células Ret positivas, tales como las células tumorales que expresan Ret.

Otra aproximación a tales terapias médicas es el uso de RetL marcado con radioisótopos o de anticuerpos anti-Ret. Tales compuestos radiomarcados dirigirán en forma preferencial la radioactividad a los sitios tumorales en las células que expresan Ret, en tejidos poco normales. Dependiendo de los radioisótopos empleados, la radiación emitida a partir de un anticuerpo radiomarcado unido a una célula tumoral puede matar también a las células tumorales malignas de las cercanías que no expresan Ret. Se pueden utilizar una variedad de radionúclidos. Los isótopos que emiten partículas \beta (por ejemplo, ^{131}I) han sido exitosos cuando se emplean con anticuerpos monoclonales contra CD20 presente sobre linfomas de células B (Kaminski y colaboradores, N. Engl. J. Med. 329: 459 (1993); Press y colaboradores, N. Engl. J. Med. 329: 1219 (1993). Los radionúclidos que emiten partículas \beta generan emisiones radioactivas que son tumoricidas sobre distancias que se extienden a través de varios diámetros de célula, permitiendo la erradicación de células negativas para antígeno y la disminución de las consecuencias de la deposición no homogénea de anticuerpo o ligando en tumores.

También se pueden emplear radionúclidos que emiten partículas. La tasa de irradiación con bajas dosis, generadas por RetL marcado con radionúclidos o con anticuerpos anti-Ret, puede ser terapéuticamente más efectiva que la irradiación instantánea suministrada externamente en una terapia de radiación convencional. La tasa de irradiación con baja dosis puede inducir apoptosis (muerte celular programada) en ciertas líneas celulares (Macklis y colaboradores, Radiat. Res. 130: 220 (1992); Maklis y colaboradores, Radiopharm. 5: 339 (1992).

Los compuestos de la invención se administran en cantidades terapéuticamente efectivas, lo que significa una cantidad de un compuesto que produce un resultado médicamente deseable o que ejerce una influencia sobre la condición particular que está siendo tratada.

El término "individuo" utilizado aquí quiere decir cualquier mamífero al cual se le puede administrar un gen o un ligando Ret. Los individuos específicamente deseados para tratamiento con el método de la invención incluyen a humanos, así como a primates no humanos, ovejas, caballos, ganado, cabras, cerdos, perros, gatos, conejos, conejillos de indias, hámsteres, jerbos, ratas y ratones, así como los órganos, tumores, y células derivadas u originadas a partir de estos huéspedes.

Uso de los Compuestos de la Invención en Terapia Génica

Los genes RetL de la invención se introducen en el tejido dañado para estimular la producción de un RetL por las células transfectadas, para promover el crecimiento celular y/o la supervivencia de las células que expresan Ret.

En una modalidad específica de una terapia génica, el uso de un gen para RetL se puede introducir dentro de un tejido renal o neuronal objetivo de escogencia. Un RetL se expresaría entonces en forma estable y estimularía a las células positivas para el receptor Ret, a crecer, a dividirse, a diferenciarse, y/o a potenciar la supervivencia celular. Además, los genes para RetL se pueden introducir en una célula objetivo utilizando una variedad de métodos bien conocidos que utilizan estrategias tanto virales como no virales.

Los métodos no virales incluyen electroporación, fusión a la membrana con liposomas, bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos con ADN, incubación con precipitado de ADN en fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, y microinyección dirigida dentro de células unitarias. Por ejemplo, un gen para RetL se puede introducir dentro de una célula por medio de coprecipitación con fosfato de calcio (Pillicer y colaboradores, Science, 209: 1414-1422 (1980); microinyección mecánica y/o aceleración de partículas (Anderson y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5399-5403 (1980); transferencia de ADN con base en liposomas (por ejemplo, transfección mediada por LIPOFECTIN - Fefgner y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 84: 471-477,1987; Gao y Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179: 280-285, 1991; transfección mediada por DEAE Dextrano; electroporación (patente estadounidense No. 4.956.288); o métodos basados en poli lisina en los cuales el ADN se conjuga para suministrar ADN preferencialmente a hepatocitos del hígado (Wolff y colaboradores, Science, 247: 465-468,1990; Curiel y colaboradores, Human Gene Therapy 3: 147-154,1992).

Las células objetivo se pueden transfectar con los genes de la invención por medio de transferencia génica directa. Ver, por ejemplo, Wolff y colaboradores, "Direct Gene Transfer Into Moose Muscle In Vivo", Science 247:1465-68, 1990. En muchos casos, la transfección mediada por vector será deseable. Se puede utilizar cualquiera de los métodos conocidos en el arte para la inserción de secuencias de polinucleótido en un vector. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y Ausubel y colaboradores. Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY (1992). La activación del promotor puede ser específica para el tejido o inducible por medio de un producto metabólico o de una sustancia administrada. Tales promotores/reforzadores incluyen, pero no se limitan a, el promotor nativo de RetL, el promotor/reforzador inmediato temprano del citomegalovirus (Karasuyama y colaboradores, J. Exp. Med., 169: 13 (1989)); el promotor de beta-actina humana (Gunning y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84: 4831 (1987); el promotor inducible por glucocorticoide presente en la repetición terminal larga del virus de tumor mamario de ratón (MMTV LTR) (Klessig y colaboradores, Mol. Cell. Biol., 4: 1354 (1984)); las largas secuencias de repetición terminal del virus de leucemia murina de Moloney (MuLV LTR) (Weiss y colaboradores. RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. NY (1985)); el promotor de la región temprana de SV40 (Bernoist y Chambon, Nature, 290:304 (1981)); el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) (Yamamoto y colaboradores, Cell, 22:787 (1980)); el promotor de timidita quinasa del virus del herpes simple (HSV) (Wagner y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 78: 1441 (1981)); el promotor del adenovirus (Yamada y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82: 3567 (1985)).

Los genes de RetL también se pueden por medio de vectores virales específicos para ser usados en sistemas de transferencia génica que están bien establecidos ahora. Ver por ejemplo: Madzak y colaboradores, J. Gen. Virol., 73: 1533-36, 1992 (papovavirus SV40); Berkner y colaboradores, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-61, 1992 (adenovirus); Hofmann y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. 92:10099-10103,1995 (baculovirus); Moss y colaboradores, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38, 1992 (virus Vaccinia); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123, 1992 (virus adeno asociado); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 67-93, 1992 (virus del herpes simple (HSV) y virus Epstein-Barr (HBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 1-24,1992 (retrovirus); Brandyopadhyay y colaboradores, Mol. Cell. Biol., 4: 749-754, 1984 (retrovirus); Miller y colaboradores, Nature, 357: 455-450, 1992 (retrovirus); Anderson, Science, 256: 808-813, 1992 (retrovirus), Current Protocols in Molecular Biology: Sections 9.10-9.14 (Ausubel y colaboradores, Eds.), Greene Publishing Associates, 1989.

Los vectores preferidos son virus de ADN que incluyen adenovirus (preferiblemente vectores basados en Ad-2 o Ad-5), baculovirus, virus del herpes (preferiblemente vectores basados en el virus del herpes simple), y parvovirus (preferiblemente vectores basados en parvovirus no autónomo o "defectuoso", más preferiblemente vectores basados en virus adeno-asociados, más preferiblemente vectores basados en AAV-2). Ver, por ejemplo, Ali y colaboradores, Gene Therapy 1:367-384, 1994; patente estadounidense No. 4.797.368 y 5.399.346 y la discusión que viene a continuación.

La escogencia de un sistema vector particular para transferir, por ejemplo, una secuencia RetL dependerá de una variedad de factores. Un factor importante es la naturaleza de la población celular objetivo. Aunque los vectores retrovirales han sido extensamente estudiados y utilizados en un cierto número de aplicaciones de terapia génica, ellos son generalmente inadecuados para infectar células que no se dividen pero pueden ser útiles en terapia para el cáncer ya que solamente integran y expresan sus genes en células replicantes. Ellos son útiles para aproximaciones ex vivo y son atractivos en este sentido debido a su integración estable dentro del genoma celular objetivo.

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Los adenovirus son virus de ADN eucariota que se pueden modificar para suministrar eficientemente un transgén terapéutico o reportero a una variedad de tipos celulares. Los adenovirus generales tipos 2 y 5 (Ad2 y Ad5, respectivamente), que causan enfermedad respiratoria en humanos, están siendo actualmente desarrollados para terapia génica de Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) y Fibrosis Cística (FC). Tanto Ad2 como Ad5 pertenecen a una subclase de adenovirus que no está asociado con afecciones humanas. Los vectores adenovirales son capaces de proveer niveles extremadamente altos de suministro transgénico virtualmente para todos los tipos de células, sin reparar en el estado mitótico. Se pueden generar fácilmente altos títulos de virus recombinante (10^{13} unidades formadoras de placa/ml) en células 293 (una línea celular de riñón embrionario humano de complementación, transformada por adenovirus: ATCC CRL 1573) y crío almacenada para períodos más largos sin perdidas apreciables. La eficacia de este sistema en el suministro de un transgén terapéutico in vivo que complemente un desequilibrio genético ha sido demostrado en modelos animales de diferentes desordenes. Ver, Y. Watanabe, Atherosclerosis, 36:261-268 (1986); K. Tanzawa y colaboradores, FEBS Letters. 118(1):81-84 (1980); J.L. Golasten y colaboradores, New Engl.J. Med., 309 (11983): 288-296 (1983); S. Ishibashi y colaboradores, J. Clin. Invest., 92: 883-893 (1993); y S. Ishibashi y colaboradores, J. Clin. Invest., 93: 1889-1893 (1994). En realidad, el adenovirus defectuoso para replicación recombinante que codifica a un ADNc para el regulador transmembrana de la fibrosis cística (RTFC) ha sido aprobado para ser usado en al menos dos ensayos clínicos de Fc humana. Ver, por ejemplo, J. Wilson, Nature, 365: 691-692 (Oct., 21, 1993). El soporte adicional de la seguridad de los adenovirus recombinantes para terapia génica, es la extensa experiencia de las vacunas de adenovirus vivo en poblaciones humanas.

Los adenovirus humanos se componen de un genoma lineal de ADN bicatenario aproximadamente de 36 kb, que se divide en 100 unidades map (u.m.), cada una de las cuales es de 360 pb de longitud. El ADN contiene repeticiones terminales invertidas cortas (RTI) en cada extremo del genoma que se requiere para replicación viral del ADN. Los productos génicos se organizan en regiones temprana (E1 hasta E4) y tardía (L1 hasta L5), con base en la expresión antes o después de la iniciación de la síntesis viral de ADN. Ver, por ejemplo, Horwitz, Virology, 2da edic., ed. B.N. Fields, Raven Press Ltd., Nueva York (1990).

Los adenovirus deficientes en replicación, recombinantes de primera generación que han sido desarrollados por terapia génica de DMD y otros desordenes heredados contienen supresiones de la región E1a completa y parte de la región E1b. Este virus de replicación defectuosa se desarrolla en células 293 que contienen un gen E1a funcional de adenovirus que provee una proteína E1a de transacción. Los virus con E1 suprimido son capaces de replicación y de producir virus infecciosos en las células 293, que proveen productos génicos en la región E1a y E1b en trans. El virus resultante es capaz de infectar muchos tipos de células y puede expresar al gen introducido (con la condición de que porte su propio promotor), pero no se puede replicar en una célula que no porte al ADN de la región E1 a menos que la célula se infecte con una multiplicidad muy alta de infección. Los adenovirus tienen la ventaja de que ellos tienen un amplio espectro hospedador, pueden infectar en forma estable o terminal a células diferenciadas tales como neuronas, y parecer esencialmente no oncogénicos. Los adenovirus no parecen integrarse en el genoma huésped. Ya que ellos existen en forma extracromosomal, el riesgo de mutagénesis por inserción se reduce grandemente. Ali y colaboradores, supra, en 373. Los adenovirus recombinantes (rAdV) producen títulos muy altos, las partículas virales son moderadamente estables, los niveles de expresión son altos, y un amplio rango de células puede ser infectado. Sus células huésped naturales están en el epitelio de las vías respiratorias, de tal manera que son útiles para terapia de cánceres de pulmón.

La transferencia mediada por baculovirus tiene diferentes ventajas. La transferencia génica baculoviral puede ocurrir en células replicantes y no replicantes, y puede ocurrir en células renales, así como en hepatocitos, en células neurales, en el bazo, la piel, y el músculo. El baculovirus es no replicante y no patogénico en células de mamífero. Los humanos carecen de anticuerpos preexistentes para baculovirus recombinante que pudiera bloquear la infección. Además, el baculovirus es capaz de incorporar y transducir insertos muy grandes de ADN.

Los virus adeno asociados (VAA) también han sido empleados como vectores para terapia génica somática. El VAA es un pequeño virus con ADN de una sola cadena (ss) con una organización genómica simple (4,7 kb) que lo hacen un sustrato ideal para ingeniería genética. Dos marcos de lectura abierta codifican una serie de polipéptidos rep y cap. Los polipéptidos rep (rep78, rep68, rep62 y rep40) están involucrados en la replicación, el rescate y la integración del genoma del VAA. Las proteínas cap (VP1, VP2 y VP3) de la cápside del virión. Flanqueando a los marcos de lectura abierta de rep y de cap en los extremos 5' y 3' están las repeticiones terminales invertidas (RTI) de 145 pb, los primeros 125 pb de las cuales son capaces de formar estructuras dobles con forma de Y o de T. De importancia para el desarrollo de los vectores VAA, los dominios completos de rep y de cap se pueden cortar y reemplazar con un transgén terapéutico o reportero. Ver, B.J. Carter, en Handbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser, CRC Press, páginas 155-168 (1990). Se ha mostrado que los RTI representan la secuencia mínima requerida para replicación, rescate, empaquetamiento, e integración del genoma del VAA.

El ciclo de vida de los VAA es bifásico, compuesto tanto de episodios latentes como líticos. Durante una infección latente, los viriones del VAA entran en una célula como un ADNss encapsulado, y al instante después de eso son liberados a los núcleos donde el ADN del VAA se integra en forma estable dentro de un cromosoma huésped aparentemente sin la necesidad de una división celular del huésped. En ausencia de un virus auxiliar, el genoma integrado del VAA permanece latente pero capaz de ser activado y rescatado. La fase lítica del ciclo de vida comienza cuando una célula que hospeda a un provirus del VAA es retado con una infección secundaria por un virus de herpes o adenovirus que codifica funciones auxiliares que son restablecidas por el VAA para ayudar en su excisión de la cromatina huésped (B.J. Carter, supra). El ADNss parental que infecta se expande hasta una forma de replicación (FR) dúplex de los ADN en una forma dependiente de rep. Los genomas rescatados del VAA se empacan dentro de las cápsides preformadas de proteína (simetría icosaédrica aproximadamente de 20 mm de diámetro) y se liberan como viriones infecciosos que tienen genomas de ADNss empacados ya sea + o - después de lisis celular.

Los virus adeno asociados (VAA) tienen un potencial significativo en terapia génica. Las partículas virales son muy estables y los VAA recombinantes (VAAr) tienen características "tipo droga" ya que los VAAr se pueden purificar por medio de tableteado o por medio de marcación con gradiente de CsCl. Son estables al calor y se pueden liofilizar hasta un polvo y rehidratar para actividad completa. Sus ADN se integran en forma estable dentro de los cromosomas huésped para que la expresión sea de largo plazo. Su espectro hospedador es amplio y el VAA causa una enfermedad desconocida de modo que los vectores recombinantes son no tóxicos.

Una vez introducido dentro de la célula objetivo, se pueden identificar las secuencias de interés por medio de métodos convencionales tales como la hibridación con ácido nucleico utilizando sondas que contienen secuencias que son homólogas/complementarias a las secuencias el gen insertado del vector. En otra aproximación, la(s) secuencia(s)
se puede(n) identificar por medio de la presencia o la ausencia de una función génica "marcadora" (por ejemplo, actividad de timidita quinasa, resistencia a los antibióticos, y similares) causada por la introducción del vector de expresión dentro de la célula objetivo.

Formulaciones y Administración

Los compuestos de la invención se pueden administrar en cualquier forma que sea médicamente aceptable. Esto puede incluir inyecciones, por rutas parenterales tales como intravenosa, intravascular, intraarterial, subcutánea, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural, y otras así como oral, nasal, oftálmica, rectal, o tópica. La administración para liberación sostenida está incluida también en forma específica en la invención, por medios tales como inyecciones de depósito o implantes erosionables. Se contempla particularmente el suministro localizado, por medios tales como el suministro a través de un catéter a una o más arterias, tal como la arteria renal o un vaso que abastece a un tumor localizado.

El término "portador farmacéuticamente aceptable" significa uno o más ingredientes orgánicos o inorgánicos, naturales o sintéticos, con los cuales se combina el protooncogén mutante o la oncoproteína mutante para facilitar su aplicación. Un portador adecuado incluye suero fisiológico estéril, aunque aquellos ordinariamente entrenados en la técnica conocen otras soluciones estériles isotónicas acuosas y no acuosas y suspensiones estériles conocidas por ser farmacéuticamente aceptables. En este sentido, el término "portador" abarca liposomas y a la proteína tat del VIH-1 (Ver, Chen y colaboradores, Anal. Biochem. 227: 168-175, 1995) así como cualquier plásmido y vectores de expresión viral. Una "cantidad efectiva" se refiere a aquella cantidad que es capaz de aliviar o demorar el progreso de la condición enfermiza, degenerativa o deteriorada. Una cantidad efectiva puede se puede determinar en forma individual y se basará, en parte, en la consideración de los síntomas que son tratados y en los resultados buscados. Una cantidad efectiva la puede determinar alguien normalmente entrenado en la técnica empleando a tales factores y utilizando no más que experimentación de rutina.

El sistema liposomal puede ser cualquier variedad de vesículas unilamelares, vesículas multilamelares, o vesículas plurilamelares estables, y se puede preparar y administrar de acuerdo a métodos bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica, por ejemplo de acuerdo con las enseñanzas de las patentes estadounidenses Nos. 5.169.637, 4.762.915, 5.000.958 ó 5.185.154. Además, puede ser deseable expresar a los nuevos polipéptidos de esta invención, así como otros polipéptidos seleccionados, como lipoproteínas, con el propósito de mejorar su unión a los liposomas. Como ejemplo, el tratamiento de falla renal aguda en humanos con RetL encapsulado en liposomas, se puede llevar a cabo in vivo por medio de la introducción de un RetL dentro de las células que necesiten de tal tratamiento utilizando liposomas. Los liposomas se pueden suministrar a través de un catéter para la arteria renal. La proteína RetL recombinante se purifica, por ejemplo, a partir de células CHO por medio de cromatografía de inmunoafinidad o cualquier otro método conveniente, luego se mezcla con liposomas y se incorpora dentro de ellas con alta eficiencia. La proteína encapsulada se puede analizar in vitro para cualquier efecto sobre la estimulación en el crecimiento celular.

Esta invención también contempla que los polipéptidos nuevos de esta invención se puedan administrar a un animal por medio de un sistema de suministro por liposomas con el propósito de mejorar su estabilidad y/o inmunogenicidad. El suministro de los polipéptidos nuevos a través de liposomas puede ser particularmente ventajoso debido a que se puede introducir el liposoma por medio de células fagocíticas en el animal tratado. Tales células, por ingestión de la membrana liposomal y posteriormente presentación de los polipéptidos al sistema inmunológico junto con otras moléculas requeridas para producir una fuerte respuesta inmunológica.

Cualquiera de los nuevos polipéptidos RetL de esta invención puede ser utilizado en la forma de una al farmacéuticamente aceptable. Los ácidos y las bases adecuadas que son capaces de formar sales con los polipéptidos de la presente invención son bien conocidos por aquellos capacitados en la técnica, e incluyen ácidos y bases orgánicas e inorgánicas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: doherty, jodi

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: título de la solicitud de la patente de biogen

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 21

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DIRECCIÓN: Biogen, Inc.

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(B)

CALLE: 14 Cambridge Center

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(C)

CIUDAD: Cambridge

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(D)

ESTADO: MA

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(E)

PAÍS: Estados Unidos

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02142

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(iv)

FORMA QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B)

COMPUTADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

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(vi)

DATOS DE LA SOLICTUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 DE MAYO DE 1997

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICTUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/999.999

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 1 DE ENERO DE 1996

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Levine, Leslie M.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 35.245

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DEL EXPEDIENTE: A008 PCT CIP

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE LAS TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 617-679-2400

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 617-679-2838

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3616 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 257..1660

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 468 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGCGAAGGC GACGTCCGG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCTCGTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCGCATC ACA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1926 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 10..1920

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 637 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1223 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1038

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 346 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1682 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 118..1497

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

22

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 460 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1888 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 25..1416

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 464 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1878 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 205..1242

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 346 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1889 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 41..1231

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

38

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 397 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1271 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 2..946

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 315 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1699 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

UBICACIÓN: 175..1374

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 400 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

50

\newpage

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: BIOGEN, INC.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Ligando Ret (RetL) para Estimular el Crecimiento Neural y Renal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 21

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Biogen, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 14 Cambridge Center

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Cambridge

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: MA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02142

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICTUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 DE MAYO DE 1997

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICTUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/999.999

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 1 DE ENERO DE 1996

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Levine, Leslie M.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 35.245

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DEL EXPEDIENTE: A008 PCT CIP

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE LAS TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 617-679-2400

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 617-679-2838

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3616 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 257..1660

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 468 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGCCAAGGC GACGTCCGG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCTCGTC GCA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCGCATC ACA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1926 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 10..1920

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

57

58

59

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 637 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

61

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1223 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1038

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

63

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 346 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

65

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1682 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 118..1497

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

67

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 460 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1888 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 25..1416

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

72

73

74

75

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 454 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

76

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1878 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 205.1242

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

78

79

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 346 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

81

82

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1889 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 41..1231

\vskip0.500000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

83

84

85

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 397 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

86

87

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1271 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 2...946

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

88

89

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 315 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

91

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1699 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 175..1374

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

93

94

95

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 400 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

96

Claims (14)

1. Un ácido nucleico aislado que codifica a un polipéptido con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID NO: 21, en donde dicho polipéptido interactúa con el Ret para una proteína receptora para disparar la dimerización del Ret para una proteína receptora o la autofosforilación de un dominio de tirosina quinasa del Ret para una proteína receptora.

2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos del péptido codificado retiene al menos 80% de las cisteínas cuando se alinean con la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 21.

3. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el polipéptido codificado tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID NO: 21.

4. El ácido nucleico de la reivindicación 3, en donde el polipéptido codificado es la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 21.

5. Un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 20.

6. Un vector que comprende un inserto que contiene al ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Una célula huésped que contiene al vector de acuerdo a la reivindicación 6.

8. Un método para producir un polipéptido, que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped de acuerdo a la reivindicación 7; y recuperar al polipéptido expresado a partir del inserto dentro de dicha célula huésped.

9. Un polipéptido codificado por el ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

10. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 21.

11. El anticuerpo de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo se une al polipéptido de la SEQ ID NO: 19 o la SEQ ID NO: 21.

12. Una composición que contiene: (a) un anticuerpo de acuerdo a las reivindicaciones 10 u 11, asociado a (b) una toxina, un compuesto que puede formar una imagen o un radionúclido.

13. Una proteína de fusión que contiene a un polipéptido de acuerdo a la reivindicación 9, fusionado a una inmunoglobulina, una toxina, un compuesto que puede formar una imagen, o un radionúclido.

14. El ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el polipéptido de acuerdo a la reivindicación 9, el vector de acuerdo a la reivindicación 6, el anticuerpo de acuerdo a las reivindicaciones 10 u 11, la composición de acuerdo a la reivindicación 12, o la proteína de fusión de acuerdo a la reivindicación 13 para ser usados en terapia o en diagnóstico.