PT914339E - Ligando ret (retl) para estimular o crescimento neural e renal - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "LIGANDO RET (RetL) PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO NEURAL E RENAL"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a sequências de nucleó-tidos que codificam um ligando Ret (RetL) , assim como a métodos para estimular o crescimento neural e renal, tratando células com DNA ou proteína de RetL.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Um dos objectivos da investigação em curso sobre a sinalização celular e activação de receptor é permitir a modulação terapêutica de processos envolvidos no crescimento e sobrevivência celulares. Esses processos determinam o resultado em diversos estados médicos, incluindo falha de órgãos, desenvolvimento fetal e crescimento tumoral, entre outros. Cada um destes estados tem uma importância clínica mundial e possui opções limitadas de tratamento eficaz. É um objectivo da invenção proporcionar composições e métodos para promover a regeneração ou sobrevivência de tecido lesionado, assim como composições para tratar distúrbios que envolvem o crescimento aberrante e o desenvolvimento de tecidos. 2 ΡΕ0914339 A perda de tecidos ou a falha de órgãos em estádio final afecta milhões de pessoas mundialmente em cada ano e aumenta substancialmente os custos da saúde pública. A perda de órgãos ou de tecidos é normalmente tratada através de transplante de órgãos de dadores, através de reconstrução cirúrgica, ou com dispositivos mecânicos. Cada um destes remédios tem limitações. A transplantação está limitada pela baixa oferta de dadores, a reconstrução cirúrgica pode criar outros problemas a longo termo e os dispositivos mecânicos não podem desempenhar todas as funções de um único órgão e por isso não podem prevenir a deterioração progressiva. Por isso, existe uma necessidade médica verdadeira para novas soluções para estes problemas.

Factores proteicos que afectam o crescimento, diferenciação e/ou sobrevivência das células podem ser úteis no tratamento de distúrbios de órgãos que contêm células de resposta. Factores ou ligandos que interagem com receptores da família da proteína receptora cinase da tiro-sina (RPTK) são de particular interesse a este respeito. Estes receptores estão envolvidos em muitos programas celulares, incluindo crescimento e diferenciação celular e a génese de muitas neoplasias. Assim, os factores ou ligandos que interagem com estes receptores podem apresentar-se úteis no tratamento de certos distúrbios de certos órgãos em que o tecido foi lesionado. Alternativamente, pode ser útil bloquear a interacção destes factores com os seus receptores, de modo a bloquear o crescimento tumoral. 3 ΡΕ0914339 0 proto-oncogene Ret codifica uma cinase de tiro-sina receptora que é expressa durante o desenvolvimento numa variedade de tecidos, incluindo os sistemas nervosos periférico e central e o rim. As anormalidades presentes em murganhos com Ret anulado sugerem que Ret é crítico para a migração e enervação de neurónios entéricos para o tubo digestivo anterior e para a proliferação e ramificação do epitélio do botão uretérico durante o desenvolvimento renal (Nature 367, 380-383, 1994). A pesquisa de um componente chave para a via de sinalização do Ret, o ligando Ret, tem sido uma área de pesquisa intensa.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um ácido nucleico isolado codificando um polipéptido com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em RetL3 de murídeo (SEQ ID NO: 17) e RetL3 humana (SEQ ID NO: 21), em que o referido polipéptido interage com uma proteína receptora Ret para despoletar a dimerização da proteína receptora Ret ou a autofosforilação de um domínio de cinase de tirosina da proteína receptora Ret. Numa forma de realização, este ácido nucleico isolado retém pelo menos 80% das cisteínas quando alinhado com a SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21.

Noutra forma de realização, o polipéptido codificado possui pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 21. O polipéptido 4 ΡΕ0914339 codificado pode ser SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 21. A invenção proporciona ainda um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada a partir do grupo consistindo em cDNA de retL3 de murideo (SEQ ID NO:18) e cDNA de retL3 humano (SEQ ID NO: 20). A invenção proporciona ainda um vector compreendendo uma inserção compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos acima mencionados, ou uma célula hospedeira compreendendo um tal vector. Está também abrangido um método para produzir um polipéptido, compreendendo os passos de cultivar a referida célula hospedeira e recuperar o polipéptido expresso a partir da inserção na referida célula hospedeira.

Noutra forma de realização da invenção, está também coberto um polipéptido codificado por um dos referidos ácidos nucleicos, como num anticorpo monoclonal isolado que se liga a um polipéptido seleccionado a partir do grupo consistindo em aminoácido de RetL3 parcial de murideo (SEQ ID NO: 15), aminoácido de Ret L3 de murideo (SEQ ID NO: 17), aminoácido de RetL3 parcial humano (SEQ ID NO: 19) e aminoácido de RetL3 humano (SEQ ID NO: 21) . A invenção refere-se ainda a uma composição compreendendo o referido anticorpo associado a uma toxina, um composto visível por imagem ou um radionuclido. A invenção refere-se ainda a uma proteína de fusão compreendendo o referido polipéptido codificado por um dos ácidos nucleicos da invenção fundido com uma imuno- 5 ΡΕ0914339 globulina, uma toxina, um composto visível por imagem, ou um radionuclido. Finalmente, qualquer um dos ácidos nucleicos, polipéptidos, vectores, anticorpos, ou proteínas de fusão da invenção podem ser para utilização em terapia ou diagnóstico. É revelada uma molécula de DNA purificada e isolada codificando para uma RetL, possuindo a sequência de nucleótidos de qualquer RetL, mas incluindo especificamente cDNA de retLl de rato (SEQ ID NO: 1), cDNA de retLl parcial humano (SEQ ID NO: 8), cDNA de retLl de comprimento total humano (SEQ ID NO: 10), cDNA de retL2 humano (SEQ ID NO: 12), cDNA de retL3 de murídeo (SEQ ID NO: 16), cDNA de retL3 parcial humano (SEQ ID NO: 18) , ou cDNA de retL3 humano (SEQ ID NO: 20). É ainda revelada uma proteína RetL com uma sequência de aminoácidos que compreende a de retLl (SEQ ID NO: 2), RetLl parcial humana (SEQ ID NO: 9), RetLl de comprimento total humana (SEQ ID NO: 11), RetL2 humana (SEQ ID NO: 13), RetL3 de murídeo (SEQ ID NO: 17), RetL3 humana parcial (SEQ ID NO: 19), ou RetL3 humana (SEQ ID NO: 21). É também descrita uma sequência de DNA que compreende a sequência (cDNA de retLl parcial humano (SEQ ID NO: 8)) do DNA da inserção do clone HRL20, que é ATCC N° 97604, ou a sequência do DNA da inserção do clone #230-5A-86-17 (cDNA de retLl de rato (SEQ ID NO: 1)), que é ATCC N° 98047 . 6 ΡΕ0914339

Além disso, é revelada uma molécula de DNA purificada e isolada, para utilização na obtenção de expressão numa célula hospedeira procariota ou eucariota de um produto polipeptídico que possui pelo menos uma parte da conformação da estrutura primária e a actividade biológica de RetL; o DNA pode ser a) uma molécula de DNA que compreende cDNA de retLl de rato, cDNA de retLl parcial humana, cDNA de retLl de comprimento total humano, cDNA de retL2 humano, cDNA de retL3 de murideo, ou cDNA de retL3 humano, ou a cadeia complementar de cDNA de retLl de rato, cDNA de retLl parcial humano, cDNA de retLl de comprimento total humano, cDNA de retL2 humano, cDNA de retL3 de murideo, ou cDNA de retL3 humano; moléculas de DNA que hibridam em condições de restringência com as moléculas de DNA definidas em a) ou seus fragmentos; ou c) moléculas de DNA que, salvo para a degeneração do código genético, iriam hibridar com as moléculas de DNA definidas em a) e b) . É também descrita uma molécula de DNA purificada e isolada codificando para um fragmento de polipéptido, ou variante de uma RetL humana possuindo a actividade biológica de uma RetL.

Qualquer uma das moléculas de DNA recombinante acima mencionadas pode ser ligada operacionalmente a uma sequência de controlo de expressão.

Estão também incluídos vectores e sistemas de distribuição que compreendem as moléculas de DNA ou construções definidas algures nesta especificação. 0 vector 7 ΡΕ0914339 pode compreender uma molécula de DNA que codifica uma RetL, ou ma variante de uma RetL. A invenção inclui células hospedeiras procariotas ou eucariotas transformadas de forma estável, ou trans-fectadas por um vector compreendendo uma molécula de DNA que codifica uma RetL nativa ou variante. É especificamente revelada uma RetL humana purificada e isolada, substancialmente livre de outras proteínas humanas, como num processo para a produção de um produto polipeptídico possuindo parte, ou a totalidade, da conformação de estrutura primária e a actividade biológica de uma RetL. Esse processo pode incluir os passos de crescimento, em condições de cultura adequadas, células hospedeiras de procariotas ou eucariotas transformadas ou transfectadas com qualquer molécula de DNA aqui revelada, de um modo a permitir a expressão desse produto polipeptídico e recuperação de uma RetL. 0 produto polipeptídico da expressão de uma DNA numa célula hospedeira procariota ou eucariota está também incluído. São reveladas proteínas e fragmentos de proteínas, variantes e derivados, seja solúveis ou ligados à membrana. Em alguns casos, a proteína possui uma sequência de aminoácidos que compreende RetLl de rato, RetLl parcial humana, RetLl de comprimento total humana, RetL2 humana, RetL3 de murídeo, ou RetL3 humana, ou é uma variante de uma destas sequências. Noutros casos, a proteína é uma proteína ΡΕ0914339 de fusão incluindo Ret, ou uma RetL, fundida com outra molécula ou fragmento de molécula, tal como uma imuno-globulina, toxina, composto visível por imagem, ou radio-nuclido. São também incluídas moléculas quiméricas de retL. São ainda revelados anticorpos monoclonais específicos para uma RetL da invenção. Esse anticorpo pode estar associado a uma toxina, composto visível por imagem ou radionuclido. Esses anticorpos podem ser produzidos por linhas celulares de hibridoma, incluindo AA.FF9, AA.HE3, AF.E9, BA.B1, BB.B6, AA.GE7, CD.F11, AH.E3, CD.G4, AG.E7, BD.G6 e BH.G8, bem como sub-clones destes hibridomas. Também são descrito anticorpos produzidos por estes hibridomas ou sub-clones destes hibridomas. A revelação inclui ainda a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que interage com Ret celular e desse modo induz a autofos-forilação de Ret, para promover o crescimento de tecido novo, ou promover a sobrevivência de tecido lesionado num sujeito. 0 composto pode ser RetLl, RetL2, ou RetL3, um fragmento de uma RetL de comprimento total, ou um anticorpo que se liga a Ret. 0 composto pode ser administrado em simultâneo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um segundo composto, tal como GDNF, neurturina, ou uma molécula relacionada com GDNF. Embora os tecidos de interesse possam incluir qualquer tecido, tecidos preferidos incluem tecido renal, tecido neural, coração, estômago, intestino delgado, espinal medula, ou pulmão. Numa forma de reali- 9 ΡΕ0914339 zação, a RetL é uma RetL solúvel. 0 sujeito acima pode ser um humano.

Noutra utilização revelada, a transdução de sinal de Ret entre uma primeira célula que expressa uma RetL e uma segunda célula é inibindo colocando em contacto a primeira célula com uma proteína Ret solúvel, ou com um anticorpo para a RetL. A proteína Ret solúvel pode ser uma proteína de fusão. É também descrito um método para direccionar uma toxina, composto visível por imagem, ou radionuclido, para uma célula que expressa Ret, compreendendo colocar em contacto a célula com uma proteína de fusão RetL, ou um anticorpo anti-Ret conjugado com uma toxina, composto visível por imagem, ou radionuclido. A RetL pode ser RetLl, RetL2, ou RetL3. Noutro método, o crescimento de uma célula tumoral que expressa Ret é suprimida, sendo um passo do método colocar em contacto a célula com uma proteína de fusão de uma RetL e uma toxina ou radionuclido, ou um anticorpo anti-Ret conjugado com uma toxina, ou radionuclido. A célula pode estar num sujeito e a proteína, ou o anticorpo conjugado, é administrada ao sujeito. É também revelado um método para direccionar uma toxina, composto visível por imagem, ou radionuclido, para uma célula que expressa uma RetL, compreendendo colocar em contacto a célula com uma proteína de fusão compreendendo Ret e uma toxina, composto visível por imagem, ou radionuclido, ou um anticorpo anti-RetL conjugado com uma toxi- 10 ΡΕ0914339 na, composto visível por imagem, ou radionuclido. Outra forma de realização inclui o método de suprimir o crescimento de uma célula tumoral que expressa uma RetL, compreendendo colocar em contacto a célula com uma proteína de fusão de Ret e uma toxina ou radionuclido, ou com um anticorpo anti-RetL conjugado com uma toxina ou radonuclido; a célula pode estar num sujeito e a proteína ser administrada ao sujeito. A RetL revelada é RetLl, RetL2, ou RetL3, ou uma variante ou fragmento de RetLl, RetL2, ou RetL3. São também descritas a utilização das substâncias reveladas para terapia génica. Uma forma de realização é a utilização de um vector compreendendo uma molécula de DNA codificando uma RetL para tratar um sujeito com um distúrbio do metabolismo de Ret, assim como a utilização para promover o crescimento de um novo tecido num sujeito. Outra forma de realização inclui a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vector que codifica uma RetL para promover a sobrevivência de tecido lesionado num sujeito.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIGURA 1 é uma sequência de cDNA (SEQ ID NO: 1) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 2) de RetLl de rato. A sequência de nucleótidos estende-se do par de bases 201 até ao par de bases 1700 da SEQ ID NO: 1 e contém a grelha de leitura aberta completa. 11 ΡΕ0914339 A FIGURA 2A é uma sequência de cDNA parcial (SEQ ID NO: 8) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 9) de RetLl humana. Esta sequência é a da inserção do clone HRL20, depositada como ATCC N° 97604. A FIGURA 2B é uma sequência de DNA de tamanho total composta (SEQ ID NO: 10) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 11) de RetLl humana. A FIGURA 3A é uma comparação da sequência de nucleótidos de RetLl humana (linha superior da sequência) , com a da sequência de RetLl de rato (linha inferior da sequência). As linhas verticais entre nucleótidos apresentam a identidade numa posição, enquanto que um ponto indica um intervalo nessa posição. A FIGURA 3B é uma comparação da sequência de aminoácidos de RetLl humana (linha superior da sequência) com a da sequência de RetLl de rato (81inha inferior da sequência). As linhas verticais entre aminoácidos correspondentes apresentam a identidade num resíduo, enquanto que a linha indica uma substituição conservadora nesse resíduo. A FIGURA 4A é um digrama esquemático de um possível papel para Ret e RetL na interacção entre uma célula do mesênquima metanéfrico e uma célula do botão uretérico. 12 ΡΕ0914339 A FIGURA 4B é um diagrama esquemático de um método de rastreio de transfectantes de uma biblioteca de cDNA para clones que expressam uma RetL. A presença de RetL expressa em transfectantes é detectada por avaliação da ligação por esses transfectantes ou de proteína de fusão Ret/IgG ou de proteína de fusão Ret/fosfatase alcalina. A FIGURA 5 é um diagrama esquemático apresentando a construção dos plasmídeos utilizados para expressar a proteína de fusão Ret de rato/IgG. A FIGURA 6 é um diagrama esquemático apresentando a construção dos plasmídeos utilizados para expressar a proteína de fusão Ret humana/IgG. A FIGURA 7 é uma sequência de cDNA (SEQ ID NO: 12) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 13) de retL2 humana, como encontrada no clone DSW240. A grelha de leitura da proteína está contida nos nucleótidos 25 a 1416. A FIGURA 8 é uma comparação da sequência de aminoácidos de RetL2 humana (linha superior da sequência) com a sequência de RetLl humana (linha inferior da sequência) . As linhas verticais entre os aminoácidos apresentam identidade numa posição, enquanto que um ponto indica um intervalo nessa posição. A FIGURA 9 é uma sequência de cDNA (SEQ ID NO: 16) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 17) de RetL3 de murídeo. 13 ΡΕ0914339 A FIGURA 10 é uma sequência de cDNA (SEQ ID NO: 20) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 21) de RetL3 humana.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Números de Identificação das Sequências

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos referidas na especificação foram desiqnadas pelos seguintes números de identificação de sequências: SEQ ID NO: 1 - cDNA de rtLl de rato SEQ ID NO: 2 - aa de RetLl de rato SEQ ID NO: 3 - oligómero kid-13 SEQ ID NO: 4 - oligómero kid-14 SEQ ID NO: 5 - oligómero kid-15 SEQ ID NO: 6 - cDNA de ret de rato, extracelular SEQ ID NO: 7 - aa de ret de rato, extracelular SEQ ID NO: 8 - cDNA de retLl parcial humana SEQ ID NO: 9 - aa de RetLl parcial humana SEQ ID NO: 10 - cDNA de retLl humana SEQ ID NO: 11 - aa de RetLl humana SEQ ID NO: 12 - cDNA de retL2 humana SEQ ID NO: 13 - aa de RetL2 humana SEQ ID NO: 14 - cDNA de retL3 parcial de murideo AA50083) SEQ ID NO: 15 - aa de RetL3 parcial de murideo SEQ ID NO: 16 - cDNA de retL3 parcial de murideo 14 ΡΕ0914339 SEQ ID NO: 17 - aa de RetL3 de murídeo SEQ ID NO: 18 - cDNA de retL3 parcial humana SEQ ID NO: 19 - aa de retL3 parcial humana SEQ ID NO: 20 - cDNA de retL3 humana SEQ ID NO: 21 - aa de retL3 humana

Definições

Como aqui utilizado, o termo "Ret" significa qualquer proteína que interage especificamente com a proteína receptora Ret e que quando interage com Ret desencadeia a dimerização de Ret e/ou a autofosforilação do domínio da cinase de tirosina de Ret. As sequências que codificam RetL e Ret são denominadas "retL" e "ret", respectivamente. Um ligando pode ser solúvel, ou estar presente como uma molécula de ligação à membrana, na mesma célula ou numa diferente, como a molécula Ret para a qual se desencadeia a autofosforilação. Os ligandos incluem co-receptores ou co-factores de ligando acessórios. Os ligandos incluem ainda mAbs anti-Ret, que actuam como antagonistas de Ret, despoletando a dimerização de Ret e autofosforilação. 0 ligando também pode ser modificado de vários modos, tais como incorporado como uma porção de uma proteína de fusão, tal como com uma toxina ou radionuclido.

Por "alinhamento de sequências" entende-se o posicionamento de uma sequência, seja de nucleótidos ou de aminoácidos, com o de outra, para permitir uma comparação da sequência de porções relevantes de uma com as da outra. 15 ΡΕ0914339

Um exemplo de um método para este procedimento é dado por Needleman et ai. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) . O método pode ser implementado convenientemente através de programas de computador, tais como o programa Align (DNAstar, Inc.). Como será entendido pelos especialistas na técnica, seguências homólogas ou funcionalmente equivalentes incluem arranjos funcionalmente eguivalentes dos resíduos de cisteína no esqueleto de cisteína conservado, incluindo inserções ou deleções de aminoácidos gue alteram o arranjo linear destas cisteínas, mas não impedem materialmente o seu relacionamento na estrutura dobrada da proteína. Por isso, os intervalos internos e as inserções de aminoácidos na seguência candidata são ignorados para efeitos de cálculo do nível de homologia ou identidade de sequência de aminoácidos entre as sequências candidata e de referência. Uma característica frequentemente utilizada no estabelecimento da homologia de proteínas é a semelhança do número e localização dos resíduos de cisteína entre uma proteína e outra.

Por "clonagem" entende-se a utilização de técnicas de recombinação in vitro para inserir um gene particular, ou outra sequência de DNA, numa molécula de vector. De modo a clonar com sucesso um gene desejado, é necessário empregar métodos para criar fragmentos de DNA, unir os fragmentos em moléculas de vector, introduzir a molécula de DNA composta numa célula hospedeira na qual se possa replicar e seleccionar o clone possuindo o gene alvo de entre as células hospedeiras recipientes. 16 ΡΕ0914339

Por "cDNA" entende-se DNA complementar, ou cópia, produzido a partir de um molde de RNA, através da acção de polimerase de DNA dependente de RNA (transcriptase reversa). Assim, um "clone de cDNA" significa uma sequência de DNA de cadeia dupla complementar a uma molécula de RNA de interesse, transportada num vector de clonagem.

Por "biblioteca de cDNA", entende-se uma colecção de moléculas de DNA recombinante, contendo inserções de DNA que, em conjunto, compreendem uma representação das moléculas de mRNA presentes num organismo inteiro ou tecido, dependendo da fonte dos moldes de RNA. Essa biblioteca de cDNA pode ser preparada através de métodos conhecidos pelos especialistas e descritos, por exemplo, em Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra. Geralmente, o RNA é primeiro isolado a partir das células de um organismo de cujo genoma se deseja clonar um gene particular. São preferidas, para os efeitos da presente invenção, linhas celulares de mamíferos e, particularmente, de humanos. Alternativamente, o RNA pode ser isolado a partir de uma célula tumoral, derivada de um tumor animal e preferencialmente de um tumor humano. Assim, a biblioteca pode ser preparada a partir de, por exemplo, um tumor adrenal humano, mas pode ser utilizado qualquer tumor.

Como aqui utilizado, o termo "polimorfismo de DNA" refere-se à condição em que podem existir duas ou mais sequências de nucleótidos diferentes num sítio do DNA particular. 17 ΡΕ0914339 "Vector de expressão" inclui vectores que são capazes de expressar sequências de DNA neles contidas, i.e., as sequências codificantes estão ligadas operacionalmente a outras sequências capazes de realizar a sua expressão. Está implicado, embora nem sempre esteja referido explicitamente, que estes vectores de expressão devem ser replicáveis nos organismos hospedeiros, quer como epissomas ou como uma parte integral do DNA cromossómico. Um elemento útil, mas não necessário, de um vector de expressão eficaz é uma sequência que codifique um marcador, que é uma sequência que codifica uma proteína que resulta numa propriedade fenotípica (e.g., resistência à tetraci-clina) das células que contêm a proteína, o que permite que as células sejam rapidamente identificadas. Em suma, é dado ao "vector de expressão" uma definição funcional e qualquer sequência de DNA que seja capaz de realizar a expressão de um código contido no DNA especificado está incluída neste termo, como é aplicado à sequência especificada. Esses vectores estão frequentemente na forma de plasmídeos, por isso "plasmídeo" e "vector de expressão" são frequentemente utilizados indistintamente. Todavia, a invenção pretende incluir outras formas de vectores de expressão, incluindo fagos, que servem funções equivalentes e que podem, de vez em quando, tornar-se conhecidos na técnica.

De modo semelhante, um "derivado funcional" de um gene de qualquer uma das proteínas da presente invenção pretende incluir "fragmentos", "variantes" e "análogos" do gene, que podem ser "substancialmente semelhantes" na 18 ΡΕ0914339 sequência de nucleótidos, e que codificam uma molécula que possui actividade semelhante. "Molécula relacionada com GDBF" significa qualquer molécula que é pelo menos 40% homóloga quer a GDNF ou a neurturina e é também capaz de se ligar especi-ficamente a RetL. O termo "gene" significa uma sequência polinu-cleotídica codificando um péptido.

Por "homogéneo" entende-se, quando se refere a um péptido ou sequência de DNA, que é a estrutura molecular primária (i.e., a sequência de aminoácidos ou nucleótidos) de substancialmente todas as moléculas presentes na composição em consideração é idêntica. O termo "oligonucleótido", como aqui utilizado em relação a sondas, fragmentos de oligómero a serem detec-tados, controlos de oligómero, oligómeros de bloqueamento não marcados e iniciadores para amplificação de sequências, é definido como uma molécula compreendida por mais de três desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos. O seu tamanho exacto depende de muitos factores, que por sua vez dependem da função, ou utilização final do oligonucleótido. O termo "sonda" refere-se a um ligando de qualidades conhecidas, capaz de se ligar selectivamente a um anti-ligando alvo. Como aplicado a ácidos nucleicos. O termo "sonda" refere-se a uma cadeia de ácido nucleico 19 ΡΕ0914339 possuindo uma sequência de bases complementares a uma cadeia alvo. "Células hospedeiras recombinantes" refere-se a células que foram transformadas com vectores construídos utilizando técnicas de DNA recombinante. Como aqui definido, o anticorpo ou sua modificação produzida por uma célula hospedeira recombinante é em virtude deste transformação, mais do que nessas quantidades menores, ou mais vulgarmente, em quantidades abaixo do detectável, como seria produzido pelo hospedeiro não transformado.

Como aqui utilizados, os termos "endonucleases de restrição" e "enzimas de restrição" referem-se a enzimas bacterianos, cada uma das quais corta DNA de cadeia dupla numa sequência de nucleótidos específica ou próximo desta.

Como aqui utilizado, o termo "polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição" ("RFLP"), refere-se às diferenças entre indivíduos nos comprimentos de um fragmento de restrição particular.

Uma molécula é referida como sendo "substancialmente semelhante" a outra molécula se a sequência de aminoácidos em ambas as moléculas for substancialmente a mesma e se ambas as moléculas possuírem uma actividade biológica semelhante. Assim, desde que duas moléculas possuam uma actividade semelhante, elas são consideradas variantes, na medida em que esse termo é aqui utilizado, mesmo se uma das moléculas contiver resíduos de aminoácidos 20 ΡΕ0914339 adicionais que não se encontrem na outra, ou se a sequência de resíduos de aminoácidos não for idêntica. Como aqui utilizado, uma molécula é referida como sendo um "derivado químico" de outra molécula quando contém porções químicas adicionais, mas normalmente uma parte da molécula. Essas porções podem melhorar a solubilidade da molécula, absorção, semi-vida biológica, etc. As porções podem diminuir alternadamente a toxicidade da molécula, eliminar ou atenuar qualquer efeito colateral indesejável da molécula, etc. As porções capazes de mediar esses efeitos são revelados, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980) .

Por "vector" entende-se uma molécula de DNA, derivada de um plasmídeo ou bacteriófago, no qual os fragmentos de DNA podem ser inseridos ou clonados. Um vector conterá um ou mais sítios de restrição únicos e pode ser capaz de replicação autónoma num organismo hospedeiro ou veículo definido, de modo a que a sequência clonada seja reprodutível.

Por "substancialmente pura" entende-se qualquer proteína da presente invenção, ou qualquer gene que codifica qualquer uma dessas proteínas, que está essencialmente livre de outras proteínas ou genes, respectiva-mente, ou de outros contaminantes com os quais se pode encontrar normalmente da natureza e como tal existe numa forma não encontrada na natureza. 21 ΡΕ0914339

Compostos da Invenção A invenção inclui cDNA que codifica uma RetL, tal como a sequência de nucleótidos de cDNA de retL3 de murideo, ou cDNA de retL3 humana. Adicionalmente, os compostos da invenção incluem sequências que incluem as sequências acima, ou são derivados de uma dessas sequências. A invenção também inclui vectores, lipossomas e outros veículos que compreendem uma destas sequências, ou um derivado de uma destas sequências. A invenção também inclui proteínas transcritas e traduzidas a partir de cDNA de retL3 de murideo, ou cDNA de retL3 humana, incluindo, mas não limitadas a, RetL3 de murideo, ou RetL3 humana, e seus derivados e variantes.

Uma forma de realização da invenção inclui variantes solúveis de uma retL. As variantes solúveis não possuem pelo menos uma porção da secção intramembranar da RetL nativa. Em alguns exemplos, a variante solúvel não tem a ligação fosfatidilinositolglicano da RetL nativa. As variantes solúveis incluem proteínas de fusão que compreendem derivados de RetL que não possuem um motivo de fosfatidilinositol.

As variantes podem diferir de RetL que ocorre naturalmente na sequência de aminoácidos, ou de modos que não envolvem sequência, ou ambos. As variantes na sequência de aminoácidos são produzidas quando um ou mais aminoácidos em RetL que ocorre naturalmente é substituído por um aminoácido natural diferente, um derivado de aminoácido, ou 22 ΡΕ0914339 aminoácido não nativo. Variantes particularmente preferidos incluem RetL que ocorre naturalmente, ou fragmentos biologicamente activos de RetL que ocorre naturalmente, cujas sequências diferem da sequência de tipo selvagem em uma ou mais substituições de aminoácidos conservadas que, tipicamente, possuem influência mínima na estrutura secundária e natureza hidrofóbica da proteína ou péptido. As variantes também podem possuir sequências que diferem em uma ou mais substituições de aminoácidos não conservadoras, deleções ou inserções, que não suprimem a actividade biológica de RetL. As substituições conservadoras incluem tipicamente a substituição de um aminoácido por outro com características semelhantes, tais como substituições nos seguintes grupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina; ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. Os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos carregados negativamente (acídicos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

Podem ser retiradas outras substituições conservadoras a partir da tabela abaixo e ainda outras são descritas por Dayhoff em The Atlas of Protein Sequence and Structure (1988) . 23 ΡΕ0914339

TABELA 1: SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDOS CONSERVADORAS

Para Aminoácido Código Substituir por qualquer um de Alanina A D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys Arginina R D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn Asparagina N D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln Ácido aspártico D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln Cisteína C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr Glutamina Q D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp Ácido glutâmico E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln Glicina G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Beta-Ala, Acp Isoleucina I D-Ile, Vai, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met Leucina L D-Leu, Vai, D-Vai, Met, D-Met Lisina K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn Metionina M D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Vai, D-Val, Norleu Fenilalanina F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans 3,4 ou 5-fenilprolina, cis 3,4 ou 5 fenilprolina Prolina P D-Pro, L-I-tioazolidina-4-ácido carboxílico, D- ou L-l-oxazolidina-4-ácido carboxilico Serina S D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met (0), D-Met(0), Vai, D-Val Treonina T D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met)0, D-Met(0), Vai, D-Val Tirosina Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His Valina V D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met 24 ΡΕ0914339

Outras variantes na invenção são aquelas com modificações que aumentam a estabilidade do péptido. Essas variantes podem conter, por exemplo, uma ou mais ligações não peptídicas (que substituem as ligações peptídicas) na sequência peptídica. São também incluídos: variantes que incluem resíduos para além de L-aminoácidos que ocorrem naturalmente, tais como D-aminoácidos, ou aminoácidos que não ocorrem naturalmente ou sintéticos, tais como aminoácidos beta ou gama e variantes cíclicos. A incorporação de aminoácidos D- em vez de L- no polipéptido podem aumentar a sua resistência a proteases. Ver, e.g., Patente U.S. 5 219 990 .

Os péptidos desta invenção também podem ser modificados por várias alterações, tais como inserções, deleções e substituições, quer conservadoras ou não conservadoras, em que essas alterações podem proporcionar certas vantagens na sua utilização. As variantes de excisão estão especificamente incluídas na invenção.

Adicionalmente aos polipéptidos substancialmente de comprimento total, a presente invenção proporciona fragmentos biologicamente activos dos polipéptidos. Um polipéptido ou fragmento de RetL é biologicamente activo se exibe uma actividade biológica de RetL que ocorre naturalmente. Essas actividades biológicas incluem a capacidade para se ligar especificamente à porção extracelular de Ret, com uma afinidade que é 50% de, e preferencialmente pelo menos igual a, a afinidade de RetL que ocorre naturalmente para a 25 ΡΕ0914339 porção extracelular de Ret. Outra actividade biológica é a capacidade para se ligar a um anticorpo que está dirigido a um epitopo que está presente em RetL que ocorre naturalmente .

Noutras formas de realização, as variantes com substituições de aminoácidos que são menos conservadoras também podem resultar em derivados desejados, e.g., provocando alterações na carga, conformação e outras propriedades biológicas. Essas substituições incluiriam, por exemplo, substituição de resíduo hidrofílico por um resíduo hidrofóbico, substituição de uma cisteína ou prolina por outro resíduo, substituição de um resíduo possuindo uma cadeia lateral pequena por um resíduo possuindo uma cadeia lateral volumosa, ou substituição de um resíduo possuindo uma carga líquida positiva por um resíduo possuindo uma carga líquida negativa. Quando o resultado de uma dada substituição não pode ser prevista com precisão, os derivados podem ser rapidamente ensaiados de acordo com os métodos aqui descritos para determinar a presença ou ausência das características desejadas.

De um modo geral, as substituições que se pode esperar que induzam alterações nas propriedades funcionais dos polipéptidos Ret são aquelas em que: (I) um resíduo hidrofílico, e.g., serina ou treonina, é substituído por um resíduo hidrofóbico, e.g., leucina, isoleucina, fenilalani-na, ou alanina; (ii) um resíduo de cisteína é substituído (ou substitui) qualquer outro resíduo; (iii) um resíduo 26 ΡΕ0914339 possuindo uma cadeia lateral electropositiva, e.g., lisina, arginina ou histidina, é substituída por (ou substitui) um resíduo possuindo uma carga electronegativa, e.g., ácido glutâmico ou ácido aspártico; ou (invenção) um resíduo possuindo uma cadeia lateral volumosa, e.g., fenilalanina, é substituído por (ou substitui) um que não possui essa cadeia lateral, e.g., glicina.

As variantes aqui reveladas incluem proteínas e péptidos com sequências de aminoácidos possuindo pelo menos sessenta porcento de homologia com RetLl de rato (SEQ ID NO: 2), RetLl parcial humana (SEQ ID NO: 9), retLl de comprimento total humana (SEQ ID NO: 11), RetL2 humana (SEQ ID NO: 13), RetL3 de murídeo (SEQ ID NO: 17), RetL3 parcial humana (SEQ ID NO: 19), ou RetL3 humana (SEQ ID NO: 21). Mais preferencialmente, a homologia da sequência é pelo menos oitenta, pelo menos noventa porcento, ou pelo menos noventa e cinco porcento. Para os objectivos de determinar a homologia, o comprimento de sequências de comparação será, de um modo geral, de pelo menos 8 resíduos de aminoácidos, normalmente pelo menos 20 resíduos de aminoácidos. As variantes dos compostos da invenção também incluem qualquer proteína que 1) possui uma sequência de aminoácidos, que é pelo menos quarenta porcento homóloga à proteína RetL da invenção e também que 2) após ser colocada num alinhamento óptimo com a sequência de RetL (como representada para RetLl e RetL2 na Figura 8), possui pelo menos 80% dos seus resíduos de cisteína alinhados com as cisteínas na proteína RetL da invenção. 27 ΡΕ0914339

Tal como é possível substituir substituintes do esqueleto, também é possível substituir grupos funcionais que estão ligados ao esqueleto com grupos caracterizados por características semelhantes. Essas modificações não alteram a sequência primária. Estas serão inicialmente conservadoras, i.e., o grupo de substituição terá aproxi-madamente o mesmo tamanho, forma, hidrofobicidade e carga que o grupo original. Modificações sem ser de sequência podem incluir, por exemplo, derivação química in vivo ou in vitro de porções de RetL que ocorre naturalmente, bem como alterações na acetilação, metilação, fosforilação, carboxi-lação ou glicosilação.

Também são incluídos na invenção agentes que se ligam especificamente a uma proteína da invenção, ou um fragmento dessa proteína. Esses agentes incluem proteínas de fusão Ig e anticorpos (incluindo cadeia única, cadeia dupla, fragmentos Fab e outros, sejam nativos, humanizados, primatizados, ou quiméricos). Descrições adicionais destas categorias de agentes estão no Pedido de PCT 95/16709.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Visão global da Estratégia A estratégia geral utilizada para clonar RetL é apresentada nas Figuras 4A e 4B. A estratégia dos autores foi baseada na premissa de que pelo menos uma RetL é 28 ΡΕ0914339 expressa no mesênquima metanéfrico do rim em desenvolvimento, como uma proteína de membrana (embora seja possível que o ligando também seja expresso numa forma solúvel; Figura 4A). A RetL interage com o receptor Ret na célula do botão uretérico, activando o seu domínio citoplásmico de cinase da tirosina e enviando um sinal para o núcleo, que por sua vez activa genes envolvidos no crescimento e ramificação do botão uretérico. Por isso, as proteínas que contêm o domínio extracelular de Ret fundido quer com a porção Fc da imunoglobulina humana GH-1 (IgGl) ou fosfatase alcalina (AP), podem ser utilizadas como parte de uma estratégia para clonar RetL, como apresentado na Figura 4B. As proteínas de fusão, as bibliotecas de expressão e outros reagentes utilizados na clonagem de RetLl são descritos abaixo.

Os autores primeiro isolaram um cDNA para RetLl de rato e depois utilizaram-no como uma sonda para isolar um cDNA para RetLl humana. Os cDNAs são subsequentemente isolados para RetL2 e RetL3.

Criação de Reagentes Requeridos para Clonagem de Expressão Directa de Liqandos Ret 1. Isolamento de cDNA Codificando o Domínio Extracelular de Ret de Rato.

Para identificar RetLl foram criadas proteínas de fusão consistindo nos domínios nos domínios extracelulares 29 ΡΕ0914339 quer de Ret de rato ou humana fundidos com uma proteína, num exemplo a porção Fc humana de IgGl e noutro exemplo fosfatase alcalina. Ambos os parceiros de fusão podem ser facilmente ensaiados para detectar células que expressam o ligando, como ilustrado na Figura 4B.

Uma vez que nunca foi revelado um cDNA para Ret de rato, os autores isolaram um cDNA codificando o domínio extracelular do receptor Ret utilizando o método de Transcriptase Reversa-Reacção da Polimerase em Cadeia (RT-PCR) . Os autores compararam as duas sequências de nucleótidos para ret humana (Números de Acesso no Genbank M57464 e X15262) e murídeo (número de Acesso no Genbank X67812) e conceberam iniciadores oligonucleotídicos a partir das regiões de elevada identidade entre as duas sequências. Um oligómero de sentido denominado kid-013 (SEQ ID NO: 3; contém os nucleótidos 150-169 da sequência de Genbank X15562) é seleccionado a partir da extremidade 5' da sequência de cDNA de ret humana, sobrepondo o codão de iniciação ATG. Inclui nucleótidos na sua extremidade 5' codificando um sítio de restrição Not I para o objectivo de clonagem. São seleccionados dois oligómeros anti-sentido denominados kid-014 (SEQ ID NO: 4; contém o complemento dos nucleótidos 1819-1830 da sequência do Genbank M57464) e kid-015 (SEQ ID NO: 5; contém o complemento dos nucleótidos 1894-1914 da sequência do Genbank X67812), respectivamente, a partir das sequências de cDNA humana e de murídeo imediatamente a 5' das sequências que codificam os domínios transmembranares. Os oligómeros kid-014 e kid-015 contêm 30 ΡΕ0914339 nucleótidos adicionais nas suas extremidades 5' que codificam um sitio de restrição SalI para o objectivo de clonagem. O RN A total é isolado a partir de rim de rato embrionário de 14 dias e o mRNA é purificado utilizando cromatografia de oligo-dT. O mRNA é convertido em cDNA utilizando transcriptase reversa de AMV e o cDNA é convertido em cDNA de cadeia dupla e amplificado utilizando polimerase Taq e uma reacção de polimerase em cadeia convencional, com os oligómeros kid-013 e kid-015. A síntese de um fragmento de PCR de 1942 pb é confirmada analisando uma alíquota da reacção de PCR num gel de agarose a 1%. O resto do fragmento de PCR é digerido com Not I e SalI e clonado em pSAB132 digerido com Not I e Sall. O plasmídeo resultante é denominado pJCOll. A inserção completa do plasmídeo pJCOll contida entre os sítios Not I e Sall é sequenciada e é apresentada como cDNA de ret extracelular de rato, SEQ ID NO:6. Uma tradução desta sequência revela a sequência de péptidos (SEQ ID NO:7) para Ret extracelular de rato. Devido aos oligómeros para a PCR serem escolhidos a partir de sequências de ret humana e de rato, é possível que a sequência de nucleótidos apresentada como a de cDNA de ret extracelular de rato e a sequência peptídica apresentada como a de Ret extracelular de rato, possam diferir das sequências de nucleótidos de ret e peptídica de Ret de rato naturais nas regiões das sequências de kid-013 e kid-015. Subsequentemente, os clones de cDNA de ret são isolados a partir de uma biblioteca de cDNA de rim 31 ΡΕ0914339 embrionário de rato com 18 dias e são observadas algumas alterações de nucleótidos nas regiões dos iniciadores, resultado em duas alterações de aminoácidos. Uma alteração está na sequência de sinal (arginina na posição 5 para treonina) e uma alteração está próximo da extremidade do domínio extracelular (ácido glutâmico na posição 633 por alanina). Ambas estas alterações não devem afectar a ligação ao ligando.

2. Proteínas de Fusão Ret/IgG São geradas proteínas de fusão consistindo nos domínios extracelulares dos receptores de Ret de rato (resíduos de aa #1-637) e humano (resíduos de aminoácido #1-636), fundidos com a porção Fc de IgGl humana. A construção dos plasmídeos utilizados para expressar a proteína de fusão Ret/IgG é apresentada esquematicamente na Figura 5. De modo a construir um gene codificando a proteína de fusão Ret de rato/IgG, os autores digeriram pJCOll (descrito acima), contendo o domínio extracelular de Ret de rato com Sal I e ligaram-no a um fragmento Sal I de 700 pb do plasmídeo 2-4, para criar o plasmídeo pJC012. Este fragmento Sail contém parte do domínio Fc de IgGl humano, derivado do plasmídeo pSAB144. O plasmídeo 2-4 foi criado previamente através de uma ligação de três ias: um fragmento NotI- Sal I criado por PCR contendo o domínio extracelular do receptor TGF-beta tipo II de coelho; um fragmento Sall-Notl de 693 pb de pSAB144 32 ΡΕ0914339 contendo parte do domínio Fc de IgGl humano; e pSAB132 digerido com NotI. Como apresentado na Figura 5, um fragmento contendo o domínio Fc pode ser libertado do plasmídeo 2-4 como um fragmento SalI de 700 pb. O pJC012 é transfectado para células COS e a proteína de fusão Ret de rato/IgG é purificada a partir do meio 47 horas depois, utilizando cromatografia em Proteína-A Sepharose. De modo a fazer com que uma linha estável produza a proteína Ret de rato/IgG, o fragmento Notl de 2612 pb a partir de pJC012 contendo a proteína de fusão de Ret de rato/IgG inteira é isolado e clonado no sítio Not I do vector de expressão pMDR901. O plasmídeo resultante é denominado pJC022. O plasmídeo pJC022 é transfectado para células CHO para gerar linhas celulares estáveis. A linha celular de produção mais elevada é adaptada para suspensão. Rendimentos típicos para a linha CHO de Ret de rato/IgG são de 75 mg/L. A construção dos plasmídeos utilizados para expressar a proteína de fusão de Ret humana/IgG é apresentada esquematicamente na Figura 6. De modo a construir um gene codificando a proteína de fusão Ret humana/IgG, os autores obtêm um plasmídeo contendo um cDNA codificando o receptor Ret humano do Dr. M. Takahashi (Departamento de Patologia, Universidade de Nagoya, Escola de Medicina, Nagoya, Japão). Um fragmento de PCR é criado a partir deste plasmídeo utilizando os oligómeros kid-013 e kid-014. O fragmento de PCR é tratado com fragmento de Klenow, seguido por digestão com NotI para produzir um fragmento de PCR com uma extremidade protuberante NotI e uma extremidade romba. 33 ΡΕ0914339

Este fragmento é clonado no vector pGEMllzf(+) previamente digerido com EcoRI, tratado com fragmento de Klenow e digerido com NotI, de modo a gerar uma extremidade protuberante NotI e uma extremidade romba. 0 plasmídeo resultante é denominado pJC013. O fragmento NotI-SalI de 1916 pb de pJC013 é isolado após uma digestão completa com NotI e uma digestão parcial com Sall e ligado ao fragmento Sall-Notl de 693 pb de pSAB144 contendo parte do domínio Fc de IgGl humano e o vector de expressão pSABl32 digerido com NotI. 0 plasmídeo resultante é denominado pJC015. A inserção no plasmídeo pJC013 é sequenciada e verificou-se conter uma única diferença de nucleótidos que altera um aminoácido no domínio extracelular de Ret humana (a sequência da Genbank M57464 possui uma C na posição 813, enquanto que o pJC013 possui uma T na posição correspondente; isto resulta numa alteração nos aminoácidos de alanina para valina na posição 294 da sequência da proteína Ret humana). Este nucleótido é de novo corrigido para o resíduo C especificado pela sequência do Genbank M57464 por mutagénese específica para um sítio do plasmídeo pJC013, produzindo o plasmídeo pJC023. Um fragmento BstE2 de 585 pb de pJC023 contendo a sequência de nucleótidos reparada é isolado e clonado no plasmídeo pJC015, a partir do qual o fragmento BstE2 de 585 pb contendo a variante nucleotídica foi removida. 0 novo plasmídeo é denominado pJC024. 0 fragmento NotI de 2609 pb de pJC024 contendo a proteína de fusão Ret humana/IgG é isolado e clonado no sitio Not I do vector de expressão pMDR901. O plasmídeo resultante é denominado pJC025. O plasmídeo pJC025 é transfectado em células CHO para criar 34 ΡΕ0914339 linhas celulares estáveis. A linha celular de produção mais elevada é ajustada para suspensão. Rendimentos típicos para a linha de CHO Ret humana/IgG são de 6 mg/L.

Outros detalhes na produção dos vectores empregues nos métodos da invenção são fornecidos nos pedidos de PCT 94/01456 e 92/02050, cujas especificações são agui incorporadas por referência.

3. Bioactividade das Proteínas de Fusão Ret/IgG

Para determinar se as proteínas de fusão Ret/IgG que foram produzidas são bioactivas e por isso seriam bons reagentes de rastreio para a clonagem de uma RetL, os autores realizaram vários ensaios de cultura de órgão para bioactividade. O ensaio de cultura de órgão consiste em cultivar rins de ratos embrionários de 13-14 dias em cultura de órgão durante 3-5 dias na presença da proteína de fusão Ret/IgG a uma concentração de 50 pg/mL. Os rins são também cultivados na presença de LFA-3TIP/IgG, ou tampão veículo. Após o período de cultura, alguns dos rins são corados com a lectina fluorescente de Aglutinina de Dolichos Biflorus (lectina DB) , que cora os tecidos do dueto de recolha, que são células epiteliais derivadas do botão uretérico. Estas células positivas para "DB" marcam as células positivas para Ret, uma vez que a Ret é expressa no botão uretérico e nos seus derivados epiteliais. Isto proporciona uma avaliação grosseira da proteína de fusão ret/IgG no crescimento e desenvolvimento do rim 35 ΡΕ0914339 embrionário. Existe uma diferença clara na morfologia e crescimento do dueto de recolha entre rins que foram cultivados com LFA-3TIP e aqueles cultivados com a proteína de fusão de Ret de rato/IgG. Os rins tratados com Ret/IgG possuem duetos de recolha que apresentam significativamente menos ramificação e são globalmente tipicamente mais pequenos.

Foram preparados cortes em parafina de outros rins para exame histológico. Os rins embrionários são tratados com tampão de controlo ou com Ret/IgG, depois corados com hematoxilina e eosina. 0 rim embrionário tratado com Ret/Ig exibe menos ramificação dos duetos de recolha do que os rins embrionários tratados com tampão de controlo. Adicionalmente, os rins tratados com ret/IgG possuem menos túbulos. Os autores também observaram este efeito com a proteína de fusão Ret/IgG. Estas observações são consistentes com as proteínas de fusão bloquearem o sinal indutivo entre o mesênquima e o botão uretérico. Por isso, os autores concluem que a proteína de fusão é um bom reagente para a clonagem de uma RetL. 4. Proteína de Fusão Ret/fosfatase alcalina

As proteínas de fusão receptor/fosfatase alcalina (AP) foram utilizadas com sucesso para identificar e clonar ligandos para c-kit (Cell 63:185, 1990), ligandos para membros da família eph de receptores órfãos (Cell 79:157, 1994) e recentemente para clonar um receptor para leptina, 36 ΡΕ0914339 o produto do gene ob (Cell 83:1263, 1995) . Os plasmídeos que codificam a proteína de fusão Ret de rato/AP são construídos e a proteína de Ret de rato/AP é produzida em células C0S7 em fábricas celulares. Subsequentemente, uma linha celular NIH3T3 estável é gerada expressando em média 10 mg/L de proteína de fusão. A análise por SDS-PAGE da proteína Ret de rato/AP indica que o seu tamanho é consistente com o peso molecular previsto e análise por filtração em gel indica que é produzida como um dímero. A purificação parcial é alcançada por cromatografia de afinidade numa coluna anti-AP. 5. Anticorpos Anti-Ret É criado um anticorpo policlonal de coelho contra a proteína de fusão Ret de rato/IgG. O anticorpo funciona em transferências de Western, análise de FACS de linhas celulares positivas para Ret e imuno-histoquímica de secções de rim embrionários. É criado um painel de anticorpos monoclonais anti-Ret de rato de hamster. A proteína de fusão Ret de rato/IgG, acoplada a Proteína A Sepharose, é utilizada para imunizar hamsters Arménios. São obtidos 316 clones após a fusão e rastreados quanto à sua capacidade para se ligar a proteínas de fusão de Ret de rato e/ou IgG humano num ensaio de ELISA. 11 clones produzem anticorpos que se ligam apenas a Ret de rato/IgG (e Ret de rato/AP), mas não IgG humano. A reactividade cruzada com Ret humana é ensaiada 37 ΡΕ0914339 por FACS; quatro clones produzem anticorpos que se podem liqar à linha celular humana positiva para Ret, THP-1. A tabela sequinte sumaria as propriedades de liqação a Ret de doze anticorpos monoclonais.

Clone ELISA Ret de rato/Ig FACS THP-1 humana AA.FF9.5 + — AA.HE3.7 + + AF.E9.5 + _ BA.BI.16 + _ BB.B6 + _ AA.GE7.3 + _ CD.F11.2 + - AH.E3.il + + CD.G4.2 + + AG.E7.9 + - BD. G6 + + BH. G8 - -

6. Bibliotecas de Expressão de cDNA

Os autores prepararam bibliotecas de cDNA de rim embrionário de rato, uma no vector de CDM8 que utiliza a origem de SV40 para amplificação, e uma num vector InVitrogen modificado, pCEP4, que utiliza a origem de EBV para amplificação. Este vector modificado, CH269, possui a 38 ΡΕ0914339 sequência do gene EBNA-1 removida. A proteína EBNA-1 interage com a origem de EBV, mas o gene não é necessário no vector quando são utilizadas células que expressam de forma estável a proteína EBNA. A biblioteca no vector CDM8 contém 1,5 X 106 clones com um tamanho de inserção médio de 1,19 kb, enquanto que a biblioteca no vector CH269 contém aproximadamente 1 X 106 clones com um tamanho de inserção médio de 1,5 kb.

Clonagem de Expressão de Ligando Ret RetLl A. Clonagem de Ligando Ret de Rato RetLl 1. Tentativas Iniciais na Clonagem de Expressão de Ligando Ret RetLl

Foram tentados vários métodos de expressão directa para clonar RetLl. Todos estes métodos são baseados no conceito ilustrado na Figura 4B. Os cDNAs de uma biblioteca de cDNA são introduzidos em células de mamíferos; células que recebem RetLl podem ser identificadas utilizando as proteínas de fusão Ret. Embora as três abordagens descritas abaixo não fossem bem sucedidas, foi adquirido conhecimento e experiência importantes, que foi utilizada numa abordagem subsequente que foi bem sucedida. a. Método de separação com Ret/IgG - A proteína de fusão Ret de rato/IgG é utilizada numa tentativa para isolar RetLl por clonagem de expressão directa, utilizando 39 ΡΕ0914339 um método de separação (Aruffo e Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. 84: 8753-8757 (1987)). Uma biblioteca de cDNA de rim de rato embrionário de 18 dias em CDM8 é utilizada para o esforço de separação. São introduzidas misturas de cDNAs desta biblioteca (5000 - 10000 cDNAs por mistura) em células COS utilizando o método de DEAE-dextrano. Após 48 horas, as células são removidas das placas com EDTA, incubadas com a proteína de fusão e subsequentemente separadas em placas revestidas com anticorpo IgG anti-humano. O DNA é recuperado das células que aderiram, transformadas de novo para E. coli e subsequentemente isoladas para uma segunda ronda de separação. Os autores foram incapazes de observar quaisquer células que se ligam após a terceira ronda de separação e são obtidos muito poucos clones após transformação do DNA de Hirt de novo para E. coli. UM cDNA de VCAM, utilizado em conjunção com um anticorpo monoclonal anti-VCAM como um controlo positivo, pode apenas ser diluído para uma proporção de 1:100 e ainda ser detectado, indicando que os tamanhos dessas misturas são provavelmente muito grandes. A análise de alguns dos clones que são obtidos após a segunda ronda de separação indica que os clones estão a sofrer rearranjo e deleção. b. Método de FACS Preparativo com Ret/IgG - São introduzidos 80000 clones de cDNA da biblioteca de rim de rato embrionário de 19 dias (vector CDM8) em células COS7 e sujeitos a FACS preparativa utilizando a proteína Ret de rato/IgG seguido por um anticorpo secundário marcado com 40 ΡΕ0914339 flúor. Os 0,5% e 0,9% das células fluorescentes de topo são recolhidos e o DNA do plasmideo é recuperado por lise de Hirt. O DNA é electroporado de novo para E. coli: são obtidos 228 clones para a mistura de 0,5% e 752 clones para a mistura de 0,9%. O DNA é recuperado dos clones bacte-rianos e é realizada uma segunda ronda de FACS preparativa. Os plasmideos recuperados de clones bacterianos no final da segunda ronda são analisados e observou-se conterem grandes deleções e rearranjos. c. Método de Detecção Colorimétrico com Ret/AP -As células COS são transfectadas com 400 misturas dos clones de cDNA (1000 clones por mistura) da biblioteca de cDNA de rim embrionário de ratos de 18 dias (vector CDM8) e coradas com a proteína Ret/AP e um substrato colorimétrico para fosfatase alcalina. As células transformadas são inspeccionadas sob um microscópio para sinais positivos. Numa experiência, foram reanalisados cinco potenciais positivos, mas foram todos negativos.

Como um controlo para a proteína Ret/AP, é produzida uma proteína VCAM/AP fundindo os primeiros dois domínios de VCAM humana com o terminal N de AP de placenta. (A VCAM liga-se à integrina VLA4, que é composta de duas cadeias, alfa-4- e beta-1) . As transfecções transientes de células COS produzem proteína VCAM/AP suficiente para experiências de controlo. A proteína VCAM/AP é comparada a VCAM/IgG directamente acoplada a AP e a VCAM/IgG mais um anticorpo secundário acoplado a AP, de modo a avaliar a sua 41 ΡΕ0914339 capacidade para detectar VLA4 em células COS transfectadas com o cDNA da cadeia alfa-4 (as células COS já expressam a cadeia beta-1). Os resultados demonstram que embora a proteína VCAM/AP possa detectar VLA4 em células transfectadas, a melhor detecção é permitida pela proteína VCAM/IgG em combinação com um anticorpo secundário acoplada a AP. d. Conclusões Metodológicas

Surgem três conclusões principais destes esforços de clonagem iniciais: 1) Os métodos que requerem que o DNA plasmídico seja recuperado para rondas subsequentes (i.e. separação e FACS preparativa) não são adequados quando a abundância do cDNA alvo é baixa, devido a rearranjos e deleções que ocorrem durante estas rondas subsequentes. Com base na baixa expressão de Ret, existe uma boa razão para suspeitar que a expressão de RetLl também é baixa. A abordagem preferida é transfectar em misturas e utilizar um método de detecção que permite que uma mistura positiva seja identificada. A mistura original pode ser então dividida, sem a necessidade de recuperar o DNA expresso de forma transiente pelas células transfectadas. 2) A proteína Ret/IgG, quando acoplada a um reagente secundário, permite uma melhor capacidade de detecção do que a proteína Ret/AP. 42 ΡΕ0914339 3) Experiências de controlo com uma proteína de controlo VCAM/IgG (e um anticorpo secundário acoplado a AP) e o cDNA de integrina alfa-4 (diluído para o vector CDM8 e transfectado para células COS) indicam que a presente capacidade de detecção é apenas de cerca de um em mil (i.e. o tamanho da mistura não pode exceder 1000 clones) . Para obter um nível melhorado de sensibilidade, alterou-se de um vector à base de origem de SV40 (expresso em células COS) para um vector à base da origem de EBV (expresso em linhas celulares positivas para EBNA). Os vectores à base de origem de EBV são mantidos como epissomas e não são tão tóxicos quanto os vectores à base de origem de SV40 após amplificação. Existe evidência considerável de que os genes podem ser expressos a níveis mais elevados nestes vectores e que os cDNAs podem ser muito mais diluídos (i.e. até 1 para 80000) e ainda serem detectados.

2. Rastreio de Misturas da biblioteca de cDNAs com Base em Origem de EBV O autores fizeram o rastreio de misturas de clones da biblioteca de cDNA de rim embrionário de rato de 18 dias (vector CH269 com a origem de EBV) com a proteína de fusão Ret de rato/IgG. Numa experiência são criadas 256 misturas, contendo cada uma 5000 clones da biblioteca. Resumidamente, uma alíquota da biblioteca de cDNA é titulada, são plaqueadas 5000 células (256 vezes) e deixadas crescer durante a noite. As colónias são raspadas para 43 ΡΕ0914339 meio: parte da cultura é utilizada para criar um stock de glicerol para a mistura (armazenada a -70) e parte é utilizada para uma preparação de plasmideo. Os DNAs das 256 misturas são transfectados individualmente para células 293/EBNA (8 X 105 numa placa de 60 mm) utilizando o método da lipofecção. Após 40 horas, as células são lavadas duas vezes com tampão HBHA (BSA a 0,5 mg/mL, NaN3 a 0,1%, HEOES a 20 mM (pH 7,0)) e incubadas com Ret de rato/IgG a 20 pg/mL em solução salina tamponada com Tris mais MgCl2 e CaCl2 a 1 mM durante 60-90 minutos à TA. Após esta incubação. As células são lavadas quatro vezes com tampão HBHA e depois fixadas com acetona a 60%/formaldeído a 3%/HEPES a 20 mM (pH 7,0) durante 30 segundos. Após duas lavagens com tampão HBS (NaCl a 150 mM, HEPES a 20 mM (pH 7,0)), as células são incubadas com um anticorpo secundário acoplado a AP (F(ab')2 especifico para Fc-gama de IgG anti-humano de cabra) (Jackson Immuno Research Laboratories; # de catálogo 109-056-098; diluição de 1:5000 em salino tamponado com Tris, mais MgCl2 e CaCl2 a 1 mM) durante 60 min à TA. As células são então lavadas duas vezes com tampão HBS e duas vezes com tampão de substrato de AP (Tris-HCl a 100 mM (pH 9,5), NaCl a 100 mM, MgCl2 a 5 mM) , contendo 2X Pierce Immuno PureR Phosphatase supressor (# de catálogo 35002). A última lavagem é deixada durante 15 min. Os substratos de AP, NBT (0,33 mg/mL) e BCIP (0,17 mg/mL) são então adicionados em tampão de substrato de AP contendo o inibidor de AP da Pierce e incubados com as células durante 5-20 min. As placas são então lavadas duas vezes com água. As placas são então inspeccionadas sob um 44 ΡΕ0914339 microscópio de dissecação para a presença de células coradas de púrpura.

De uma análise das 256 misturas, foram identificadas 17 misturas positivas no rastreio primário. 0 DNA de cada mistura positiva é re-transfectado para células 293/EBNA e o procedimento abaixo repetido juntamente com algumas experiências de controlo adicionais para confirmar que a coloração observada é especifica para Ret/IgG. 10 das 17 misturas positivas apenas apresentam coloração com proteína de fusão Ret/IgG e não com outra proteína de fusão de IgG. 3. Divisão da Mistura #230

Como um exemplo, uma das misturas positivas acima descritas, designada #230, é dividida em sub-misturas mais pequenas para identificar o cDNA na mistura que está a conferir a ligação à proteína de fusão Ret/IgG. Foram plaqueadas 600 células do stock de glicerol para a mistura #230 (10 vezes) e crescidas durante a noite. As colónias nestas placas são raspadas para meio: um décimo da cultura é utilizada para criar um stock de glicerol e a restante porção é utilizada para uma preparação de DNA. As dez sub-misturas de 600 clones foram designadas 230-1A até 230-5A e 230-1B até 230-5B. Os DNAs destas sub-misturas foram transfectados para células 293/EBNA e o procedimento descrito acima para coloração com a proteína de fusão Ret/IgG é repetida. Uma sub-mistura #230-5A é positiva para coloração com a proteína Ret/IgG. 45 ΡΕ0914339 A mistura #230-5A é ainda dividida de modo a identificar o cDNA com esta sub-mistura que confere a ligação à proteína de fusão Ret/IgG. As células do stock de glicerol da mistura 230-5A são plaqueadas e crescidas durante a noite. As colónias são repicadas para os poços de sete Bioblocks® de 96 poços e crescidas durante a noite. De cada Bioblock de 96 poços são preparadas 4 misturas de 20 clones e 1 mistura de 16 clones. Assim são criadas 35 misturas a partir dos sete Bioblocks® designados 230-5A-71 até 230-5A-105. Os DNAs são preparados a partir de cada uma destas misturas e transfectadas em células 293/EBNA e reensaiadas com a proteína de fusão Ret/IgG, como descrito acima. A mistura #230-5A-86 positiva. A mistura #230-5A-86 é dividida passando-a de volta para o Bioblock e identificando os 20 clones que foram misturados em conjunto para preparar esta mistura. Os DNAs são preparados a partir de todos os 20 clones e transfectados individualmente em células 293/EBNA e reensaiadas para Ret/IgG, como descrito acima. A mistura #230-5A-86-17 foi determinada ser positiva. 4. Caracterização do Clone #230-5A-86-17 O clone #230-5A-86-17 (denominado retL-17 ou clone 17 e depositado como ATCC 98047) é ainda analisado por sequenciação de DNA. A sequência de nucleótidos inteira da inserção deste clone é SEQ ID NO:l (cDNA de retL de 46 ΡΕ0914339 rato) e parte da sequência de nucleótidos é apresentada na Figura 1. Nesta sequência de nucleótidos, os autores encontraram uma grelha de leitura codificando uma proteína de 468 aminoácidos (RetLl de rato). A proteína prevista possui uma sequência de sinal com uma clivagem prevista após o aminoácido 24 (Von Heijne et al., Nucl. Acid Res. 14:14683 (1986)). 0 terminal C hidrofóbico indica que a proteína pode estar ligada à célula através de uma ligação de fosfatidilinositolglicano. Existem três sítios de glicosilação ligados a N previstos. Estas propriedades são consistentes com as esperadas para um ligando para Ret.

Os autores podem expressar formas solúveis da proteína RetLl de rato, através de truncagem do gene antes do terminal C hidrofóbico. Por exemplo, isto pode ser realizado truncando após a Lisina 435 (RetLl de rato). A truncagem a montante deste aminoácido também deve resultar na expressão de uma forma solúvel da proteína RetLl de rato. A proteína RetLl solúvel de rato pode ser expressa por si própria, ou como uma parte de uma fusão com imunoglobulina humana, um marcador de histidina, ou um epitopo pequeno que é reconhecido por um anticorpo. B. Clonagem de Ligando de Ret Humano RetLl

Uma biblioteca de cDNA de rim embrionário humano no vector lambda gtlO é adquirido da Clontech (número de catálogo #HL5004A). Um milhão de unidades de formação de placas do stock de fagos são plaqueadas em 10 placas 47 ΡΕ0914339

Nunc™. Os levantamentos de placas em duplicado são realizados em filtros Schleicher and Schuell Opitran™. É criada uma sonda digerindo o plasmídeo de RetLl de rato com a enzima de restrição PvuII, seguido por isolamento em gel de agarose de um fragmento de 1,34 kb, que corresponde a 242-1582 nt da sequência de nucleótidos de RetL de rato (cDNA de retLl de rato) . Esta sonda da região codificante é marcada com P32 por iniciação aleatória (Feinberg e Vogelstein, Anal. Biochem. 137:266-267, 1984) . Os filtros são hibridados durante a noite em 300 mL de tampão PBS de rastreio de placas (Tris a 50 mM pH 7,5, NaCl a 1 M, pirofosfato de sódio a 0,1%, PVP a 0,2% e Ficoll a 0,2%), contendo sulfato de dextrano a 10%, tRNA a 100 pg/mL e 6,7 X 107 CPM da sonda de rato, a 55 °C. Estes foram lavados duas vezes com tampão de rastreio de placa e duas vezes com 2 X SSC/SDS a 1% a 55 °C e expostos a película a -70 °C com um ecrã intensificador.

Os duplicados positivos são removidos das placas principais para SM (NaCl a 100 mM, SO4 a 10 mM, Tris a 50 mM pH 7,5) mais gelatina. Foram purificados da placa 24 destes positivos. O DNA de miniprep de lambda das placas candidatas purificadas é digerido com NotI, sujeito a electroforese em gel de agarose a 1% e transferido por Southern. A transferência de Southern é hibridada com a sonda da região codificante de RetLl de rato. O clone HRL20 possui a inserção mais comprida (4,4 kb) que híbrida intensamente com a sonda de rato. A sequência de DNA (cDNA 48 ΡΕ0914339 de retLl parcial humano; SEQ ID NO: 8; Figura 2A) e sequência de péptidos deduzida (RetLl parcial humana; SEQ ID NO: 9; Figura 2A) foram obtidas deste clone, confirmando que é o homólogo humano. Este clone codifica a maioria da região codificante, incluindo a extremidade 3' da região codificante.

Para obter a extremidade 5' do cDNA humano, um Marathon-Ready™ cDNA kit de rim fetal humano é adquirido da Clontech (número de catálogo #7423-1). São sintetizados os oligonucleótidos anti-sentido Kid-155, correspondendo ao complemento dos nucleótidos 62-81 da SEQ ID NO:8 (cDNA de retLl parcial humano) e Kid-154, correspondendo ao complemento dos nucleótidos 17-43 de SEQ ID NO: 8 (cDNA de retLl parcial humano). A PCR é realizada utilizando o Advantage™ cDNA PCR kit (número de catálogo da Clontech #8417-1) combinado com os reagentes de Marathon™ cDNA e os oligonucleótidos Kid-155 ou Kid-154. A primeira reacção de PCR é preparada como se segue: 35,3 pL de H20; 5,0 pL de tampão 10 X Klen Taq: 1,0 pL de mistura de dNTP a 10 mM; 1.0 pL de mistura 50 X Advantage™ Klen Taq Polymerase. Estes reagentes são combinados e misturados. Depois foram adicionados 5,0 pL de Marathon-Ready™ fetal Kidney cDNA; 1.0 pL de iniciador AP1 a 10 pM e 1,5 pL de Kid-155 a 6,4 pM (volume final = 50 pL) . A PCR é realizada num

Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480 com as seguintes condições de ciclo: 1 ciclo a 94 °C durante 1 minuto; 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 4 minutos. É realizada uma PCR 49 ΡΕ0914339 interna utilizando o produto da primeira reacção de PCR. Primeiro, 5 pL do produto #1 da PCR é diluído 50 vezes com TE (volume final 250 pL) . A reacção de PCR interna contém 35,5 pL de H2O; 5,0 pL de tampão 10 X KlenTaq; 1,0 pL de mistura de dNTP a 10 mM; 1,0 pL de mistura 50 X Advantage™ Klen Taq Polymerase. Estes reagentes são misturados como acima. São então adicionados 5,0 pL de produto de PCR #1 diluído; 1,0 pL de iniciador AP2 a 10 pM e 1,5 pL de Kid-154 a 6,9 pM. As condições de ciclo são as mesmas da reacção acima. O produto resultante de aproximadamente 700 pb é purificado num gel de agarose de baixo ponto de fusão a 1% e extraído com fenol. O DNA purificado é clonado no sítio EcoRV de pZErO™ (catálogo da Invitrogen #K2510-01). A informação da sequência é obtida a partir de isolados múltiplos, incluindo os clones chamados HRL7G6 e HRL7G8.

Verificou-se que a sequência obtida do clone HRL7G8 se sobrepõe com a sequência do clone HRL20 (cDNA de retLl parcial humana) e é utilizada para criar uma sequência de comprimento total de RetLl humana (cDNA de retLl humano de comprimento total), também apresentado na Figura 2B. A sequência nucleotídica obtida a partir do clone HRL7G8 representa os nucleótidos 1 a 502 do cDNA de retLl humano de comprimento total. A sequência do clone HRL20 representa os nucleótidos 46' a 1682 do cDNA de retLl humana de comprimento total. A sequência do clone HRL7G8 é confirmada sequenciando outro clone de cDNA (GJ102) isolado a partir da biblioteca de cDNA em lambda gtlO de rim embrionário humano descrita acima, utilizando uma sonda 50 ΡΕ0914339 derivada do clone HRL7G6. Os nucleótidos 118 a 1497 compreendem a grelha de leitura da proteína do cDNA de retLl humana de comprimento total. A sequência de aminoácidos completa de RetLl humana também é apresentada na Figura 2B. Como apresentado pela análise de BESTFIT apresentada na Figura 3A, o cDNA de retLl humana é 88,2% idêntico ao cDNA de retLl de rato. A comparação do péptido (Figura 3B) demonstra que a sequência peptídica putativa humana era 93,3% idêntica e 97,2% semelhante à de rato.

Clonagem de Ligando Ret RetL2 A. Clonagem de retL2 Humana A sequência peptídica de RetLl de rato (RetLl de rato) é utilizada para pesquisar a base de dados de GenBank com o programa BLAST, de modo a identificar proteínas relacionadas (i.e. isólogos). BLAST, ou Basic Local Alignment Search Tool, utiliza o método de Altschul et al. (j. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990) para pesquisar semelhanças entre uma sequência a comparar e todas as sequências na base de dados de sequências. A sequência a comparar e a base de dados a ser pesquisada podem ser péptidos ou nucleótidos em qualquer combinação. Quando a sequência peptídica da RetLl de rato é comparada contra a base de dados de nucleótidos de Expressed Sequence Tag (EST), são obtidas duas correspondências significativas. Um 51 ΡΕ0914339 é o Número de Acesso de GenBank #R02249, uma EST de 229 pb de uma biblioteca de cDNA de fígado e baço fetal humanos combinados e o outro é o Número de Acesso de Genbank #H12981, uma EST de 521 pb de uma biblioteca de cDNA de cérebro de criança humana. As duas ESTs partilham 99% de identidade numa região de sobreposição indicando que são do mesmo cDNA. Os oligonucleótidos são criados a partir de H12981 EST: KID-228 (GAA TGA CAA CTG CAA GAA GCT GCG CTC CTC; correspondendo aos nucleótidos 38-67 e também aos nucleótidos 534-563 da SEQ ID NO: 12) e oligonucleótido KID-229 de anti-sentido (GTG TAC TCG CTG GGC ACC CG; correspondendo ao complemento dos nucleótidos 156-175 e também ao complemento dos nucleótidos 652-671 da SEQ ID NO:12) . São rastreadas 1 X 106 unidades de formação de placa de uma biblioteca de cDNA em lambda GT10 Clontech Human Liver 5'-Stretch Plus (cat# HL5003a) em duplicado, em filtros OPITRAN™. Os filtros são hibridados com os oligonucleótidos KID-228 e KID-229 marcados com 32P em 400 mis de tampão de rastreio de placas (Tris a 50 mM pH 7,5, NaCl a 1 M, pirofosfato de sódio a 0,1%, Polivinil-pirrolidina a 0,2% e Ficoll a 0,2%) contendo sulfato de dextrano a 10% e tRNA a 100 pg/mL e 80 pmole de cada oligonucleótido marcado com 32P a 65 °C durante a noite. Eles são lavados duas vezes com 2 X SSC/SDS a 1% e duas vezes com 1 X SSC/SDS a 1% e expostas à película. São purificados 11 positivos duplicados. O DNA de cada um destes clones é analisado por digestão com enzima de 52 ΡΕ0914339 restrição, seguido por electroforese em gel de agarose e transferência de Southern. Os filtros são hibridados com KID-228 e KID-229 para confirmar gue as inserções hibridam com a sonda. A inserção do clone DSW240 é completamente seguenciada (cDNA de retL2 humana, SEQ ID NO:12) e é apresentada na Figura 7.

Os nucleótidos 25-1416 compreendem a grelha de leitura da proteína do cDNA de retL2 humana, que codifica uma proteína de 464 aminoácidos (RetL2 humana; SEQ ID NO:13) e é apresentada na Figura 7. Como apresentado pela análise de BESTFIT apresentada na Figura 8, a proteína RetL2 humana é 49,1% idêntica e 63,7% semelhante à proteína RetLl humana. Partilha em comum com a RetLl humana um terminal N hidrofóbico indicativo de uma sequência de sinal e um terminal C hidrofóbico indicativo de um motivo de ligação de fosfatidilinositolglicano. Adicionalmente, 30 cisteínas de 31 que estão presentes em cada proteína são conservadas. B. Demonstração que RetL2 é um Ligando para Ret

Demonstrou-se que retL2 é um ligando para Ret transfectando células 293/EBNA com um plasmídeo de expressão que contém a inserção do clone DSW240 e mostrando que as células se podem ligar a uma proteína de fusão Ret/IgG. A inserção de DSW240 é removida utilizando iVotl e clonada no vector de expressão CH269, que contém uma origem 53 ΡΕ0914339 EBV e permite a expressão elevada em linhas de células positivas para EBNA. As digestões de restrição são realizadas para identificar clones que possuem a orientação correcta. 0 DNA plasmídico é preparado a partir de um clone possuindo a orientação correcta.

Os DNAs de plasmideo (o plasmideo de expressão de retL2, um plasmideo de expressão de retLl para um controlo positivo e um plasmideo de expressão contendo uma proteína não relacionada para um controlo negativo) são trans-fectados para células 293/EBNA (8 X 105 numa placa de 60 mm), utilizando o método da lipofecção. Após 48 horas, as células são lavadas duas vezes com tampão HBHA (BSA a 0,5 mg/mL, NaN3 a 0,1%, HEPES a 20 mM (pH 7,0)) e incubadas com Ret de rato/IgG a 20 pg/mL em solução salina tamponada com Tris mais MgCl2 e CaCl2 a 1 mM durante 60-90 minutos à temperatura ambiente. Após esta incubação, as células são lavadas quatro vezes com tampão HBHA e depois fixadas com acetona a 60%/formaldeído a 3%/HEPES a 20 mM (pH 7,0) durante 30 segundos. Após duas lavagens com tampão HBS (NaCl a 150 mM, HEPES a 20 mM (pH 7,0)), as células são incubadas com um anticorpo secundário acoplado a AP (F(ab')2 específico para Fc-gama de IgG anti-humano de cabra) (Jackson Immuno Research Laboratories; # de catálogo 109-056-098; diluição de 1:5000 em salino tamponado com Tris, mais MgCl2 e CaCl2 a 1 mM) durante 60 min à TA. As células são então lavadas duas vezes com tampão HBS e duas vezes com tampão de substrato de AP (Tris-HCl a 100 mM (pH 9,5), NaCl a 100 mM, MgCl2 a 5 mM) , contendo 2X Pierce 54 ΡΕ0914339

Immuno PureR Phosphatase supressor (# de catálogo 35002). A última lavagem é deixada durante 15 min. Os substratos de AP, NBT (0,33 mg/mL) e BCIP (0,17 mg/mL) são então adicionados em tampão de substrato de AP contendo o inibidor de AP da Pierce e incubados com as células durante 5-20 min. As placas são então lavadas duas vezes com água. As placas são então inspeccionadas sob um microscópio de dissecação para a presença de células coradas de púrpura. A presença de células coradas de púrpura indica que a Ret/proteina de fusão se ligou às células e que a proteína RetL2 é um ligando para Ret. As células coradas de púrpura são também observadas após transfecção com o vector de expressão retLl, mas não com o vector de controlo negativo.

Clonagem de Ligando Ret RetL3 A. RetL3 de Murídeo

Uma pesquisa da base de dados de EST com a sequência de aminoácidos de RetLl de rato revela duas ESTs de murídeo com homologia para ligandos ret. Estas ESTs são AA049894, e AA050083 (que é cDNA de retL3 de murídeo, SEQ ID NO:14) . Os plasmídeos que codificam estas ESTs são obtidos a partir de Genome Systems Inc. (Catálogo #475791 e #475497) como riscados bacterianos. O DNA plasmídico é preparado a partir de colónias isoladas obtidas inoculando os riscados em placas de LB Amp. As inserções destes plasmídeos são sequenciadas na sua totalidade. A comparação das duas sequências demonstra que AA049894, que possui uma 55 ΡΕ0914339 inserção de 1,4 kb, está contida em AA050083, que possui uma inserção de 1,9 kb. A tradução da sequência de DNA de AA050083 indica que existe uma grelha de leitura aberta continua desde NT205 até NT1242 (RetL3 parcial de murídeo; SEQ ID NO:15). Esta ORF possui 37,5% de identidade com a de retLl de rato e 40,2% de identidade com retL2 de rato. Todavia, a grelha de leitura aberta não codifica uma Met ou uma sequência de sinal na extremidade 5'. Os autores examinaram as ORFs 5' a montante desta região e encontraram uma Met no contexto de uma sequência de consenso de Kozak para iniciação de tradução e uma sequência de sinal potencial para expressão/secreção de superfície. Esta ORF está fora de grelha com a ORF a jusante, indicando que a EST AA050083 contém uma mutação pontual, tal como uma inserção, deleção, intrão ou artefacto de clonagem, na sua extremidade 5'.

De modo a obter a extremidade 5' correcta, foi empregue Marathon RACE. O cDNA de embrião de murganho de 11 dias Marathon-Ready™ (cat. #7458-1) e um Advantage™ Kit (cat.#8417-1) é adquirido da Clontech. São sintetizados os oligonucleótidos anti-sentido, Kid-366, correspondendo ao complemento dos nucleótidos 847-866 da SEQ ID NO:14 e Kid- 365, correspondendo ao complemento dos nucleótidos 589-615 de SEQ ID NO: 14. A PCR é realizada utilizando um Advantage™ cDNA PCR kit (Clontech #8417-1) combinado com os reagentes de Marathon™ cDNA e o oligonucleótido Kid- 366. A primeira reacção de PCR é preparada como se segue: 35,3 pL de H20; 5,0 pL de tampão 10 X Klen Taq: 1,0 pL de 56 ΡΕ0914339 mistura de dNTP a 10 mM; 1,0 pL de mistura 50 X Advantage™ Klen Taq Polymerase. Estes reagentes são combinados e misturados. Depois foram adicionados 5,0 pL de cDNA de embrião de murganho de 11 dias Marathon-Ready™; 1,0 pL de iniciador AP1 a 10 μΜ e 1,7 pL de Kid-366 a 5,88 μΜ (volume final = 50 pL) . A PCR é realizada num Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480 com as seguintes condições de ciclo: 1 ciclo a 94 °C durante 1 minuto; 5 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 4 minutos; 5 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 70 °C durante 4 minutos, 25 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 4 minutos. É realizada uma PCR interna utilizando o produto da primeira reacção de PCR. Primeiro, 5 pL do produto #1 da PCR é diluído 50 vezes com TE (volume final 250 pL). A reacção de PCR interna contém 35,5 pL de H2O; 5,0 pL de tampão 10 X KlenTaq; 1,0 pL de mistura de dNTP a 10 mM; 1,0 pL de mistura 50 X Advantage™ Klen Taq Polymerase. Estes reagentes são misturados como acima. São então adicionados 5,0 pL de produto de PCR #1 diluído; 1,0 pL de iniciador AP2 a 10 pM e 3,6 pL de Kid-365 a 2,8 pM. As condições de ciclo são as mesmas da reacção acima. O produto resultante de aproximadamente 665 pb é purificado num gel de agarose de baixo ponto de fusão a 1% e extraído com Qiaex II (Qiagen cat#20021) . O DNA purificado é clonado em pNoTA/T7™ utilizando o sistema de clonagem PRIME PCR CLONAR™ (5 Linha -> 3 Linha cat.#1-725029). A informação da sequência é obtida a partir de isolados múltiplos, incluindo os clones denominados DSW252 e DSW253. 57 ΡΕ0914339

Verificou-se que sequência de DSW252 se sobrepõe a SEQ ID NO: 14, excepto que uma T adicional está presente entre NT 252 e NT 253 da sequência SEQ ID NO: 14. Esta T também está presente nos outros isolados DSW251 e DSW253. A inserção desta base adicional corrige a ORF, de modo a que é obtida uma única ORF de 1191 pb (contado a partir da primeira Met) codificando 397 aminoácidos. Esta ORF codifica uma Met no contexto de uma sequência de consenso de iniciação de tradução canónica (Kozak) e inclui uma sequência de sinal para expressão/secreção de superfície.

Para obter um clone de murídeo de comprimento total que é capaz de ser expresso, é purificado um fragmento Not I -Bamlíl de 630 pb de DSW252 e um fragmento

BamRI-Notl de 1308 pb de AA050083 e ligado ao vector de expressão CH269 digerido com NotI. A ligação é transformada em E. coli XLl-Blue (Stratagene cat. #200236). Foram realizadas minipreps com Qiawell Ultra nos transformantes resultantes. Estes são analisados por digestão de restrição e electroforese em gel para o tamanho correcto e para orientação. Esta construção é denominada DSW254. A inserção de DSW254 é sequenciada na sua totalidade (retL3 de murídeo; SEQ ID NO: 16) e a ORF é confirmada como codificando uma proteína de 397 aminoácidos (RetL3 de murídeo; SEQ ID NO:17). Estas sequências também são apresentadas na Figura 9. O terminal C de RetL3 é hidrofóbico e indicativo de um motivo de ligação fosfatidilinositolglicano. 58 ΡΕ0914339 B. RetL3 Humana

De modo a encontrar uma fonte de tecido candidato para clonar RetL3 humana, foram utilizadas transferências de Northern de tecidos de murganho para determinar o padrão de expressão de retL3 de murideo. Dos tecidos sobreviventes, a expressão de RetL3 é a mais elevada no tecido cardíaco. Uma biblioteca de cDNA de coração de adulto humano no vector lambda gtlO é adquirido a Clontech (catálogo #HL3026a). São plaqueadas um milhão de unidades de formação de placas do stock de fagos em 10 placas Nunc. Os levantamentos de placas em duplicado são preparados em filtros Schleicher and Schuell Opitran™. É gerada uma sonda para PCR com os iniciadores Kid-366 e Kid-367, correspondendo aos nucleótidos 397-420 da sequência AA050083. A reacção de PCR é preparada como se segue: são misturados 10 pL de tampão 10 X PFU, 2,0 pL de mistura de dNTP a 10 mM, 72,1 pL de H20, 3,1 pL de Kid-367 a 13,2 pM, 6,8 pL de Kid-366 a 5,88 pM, 5,0 pL de DNA de AA050083 a 0,1 pg/pL e 2,0 pL de PFU a 2,5 Unidades/pL (catálogo Stratagene #600154). A PCR é realizada num Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480 com as seguintes condições: 25 ciclos de 94 °C durante 1 min, 53 °C durante 1 min, 72 °C durante 4 min. O produto é purificado por extracção com fenol, clorofórmio, álcool isoamílico 50:49:1, seguido por electroforese em gel de agarose de baixo ponto de fusão e purificação com QiaexII do fragmento excisado. Esta sonda da região codificante é marcada com 59 ΡΕ0914339 P32 por iniciação aleatória (Feinberg e Vogelstein). Os filtros são hibridados durante a noite em 200 mL de tampão O de rastreio de Placas, contendo sulfato de dextrano a 10%, tRNA a 100 pg/mL e 1,8 X 108 CPM da sonda de murganho a 65 °C. Estes foram lavados duas vezes com tampão de rastreio de placas, duas vezes com a 2 X SSC/SDS a 1%, duas vezes com 1 X SSC/SDS a 1% a 65 °C e expostos a pelicula a -70 °C com um ecrã de intensificação. Os positivos dos duplicados são purificados de placa. O DNA de miniprep de lambda das placas candidatas purificadas é digerida com

EcoRI, sujeito a electroforese num gel de agarose a 1% e transferência de Southern. A transferência de Southern é hibridada com a sonda de murganho. 0 clone GJ128, que possui uma inserção de 1,3 kb, híbrida intensamente com a sonda da região codificante de murganho. A sequência de DNA (cDNA de retL3 humana parcial; SEQ ID NO:18) e sequência peptídica deduzida (RetL3 humana parcial; SEQ ID NO:19) são obtidos a partir deste clone, confirmando que é o homólogo humano. Este clone contém a maior parte da região codificante, incluindo a extremidade 3' da região codificante. A inserção de 1,3 kb de GJ128 é purificada, marcada com P32 e utilizada para pesquisar a biblioteca de coração de humano adulto da Clontech, de modo a obter um clone com a extremidade 5'. Não foram obtidos clones contendo a extremidade 5'num rastreio de 2 X 106 placas desta biblioteca. A análise de Northern de transferências de mRNA de tecido adulto humano (catálogo Clontech #7760-1, 7759-1 e 7767-1) hibridadas com a mesma sonda, utilizando 60 ΡΕ0914339 protocolos fornecidos pelo fabricante, indica que a RetL3 humana é expressa em espinal medula, estômago, coração, pâncreas, intestino delgado, cólon, próstata e testículos de humano. Uma biblioteca de cDNA da espinal medula de humano adulto da Clontech (catálogo #5001a) é pesquisada com a inserção de GJ128. São purificados 3 clones independentes e o mais comprido, GJ135, é sequenciado. A sequência da inserção de GJ135 sobrepõe-se com a inserção de GJ128, permitindo a criação de uma sequência composta do cDNA de retL3 humano de comprimento (SEQ ID NO:20) e a determinação da RetL3 humana de comprimento total (SEQ ID NO:21). Estas sequências também são apresentadas na Figura 10. A RetL3 humana é 34,3% e 34,9% idêntico a RetLl humana e RetL2 humana, respectivamente. Possui 76,8% de identidade com RetL3 de murídeo.

UTILIZAÇÕES TERAPÊUTICAS DOS COMPOSTOS DA INVENÇÃO

RetLs nativas e variantes, anticorpos anti-RetL, anticorpos anti-Ret e proteínas de fusão de Ret e de RetLs podem possuir utilidade terapêutica em situações, em que é desejável bloquear, ou activar, a via de sinalização de Ret, para estimular o crescimento ou a sobrevivência renal e/ou neuronal em situações de doenças, em que estas células são perdidas ou lesionadas, ou para suprimir o crescimento de, ou matar, células indesejáveis, tais como células tumorais que expressam Ret ou uma RetL.

De um modo geral, os compostos da invenção que se 61 ΡΕ0914339 ligam a Ret, induzindo dimerização e/ou autofosforilação de Ret, são úteis para estimular o crescimento de, ou limitar a lesão a tecidos que expressam Ret. Os compostos da invenção são úteis para estimular o crescimento de tecido renal e/ou sobrevivência, apoiando a função renal e em minimizar a lesão de tecido renal após várias agressões. Condições particulares que podem ser beneficamente tratadas com os compostos da invenção incluem falha renal aguda, nefrite aguda, falha renal crónica, sindrome nefrótica, defeitos do túbulo renal, transplantes de rim, lesão tóxica, lesão hipóxica e trauma. Os defeitos do túbulo renal incluem tanto aqueles que têm natureza hereditária como os que são adquiridos, tais como doença renal poliquistica, doença quistica medular e espongiose medular do rim. Esta lista não é limitada e pode incluir muitos outros distúrbios renais (ver, e.g., Harrison's Principies of Internai Medicine, 13a edição, 1994) .

Noutras aplicações, os genes e proteínas da invenção podem ser utilizados para tratar condições em que é desejável o crescimento e regeneração neural. Isto iria incluir quaisquer condições envolvendo distúrbios de degeneração neural, tal como doença de Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, de Tourette, esclerose lateral amiotrópica, bem como doença neuronal motora, doenças de desmielinização, tais como esclerose múltipla, doenças bacterianas, tais como meningite, abcesso, ou empiema, doenças virais, tais como mielopatia associada a HIV, doenças de prião incluindo doença de Creutzfeldt-Jacob. São 62 ΡΕ0914339 também incluídos distúrbios de lesão do tecido neuronal, quer causado por choque neoplásico, trauma, ou eventos cerebrovasculares, tais como hemorragia ou embolia. São especificamente incluídas doenças dos nervos cranianos e da espinal medula, incluindo distúrbios envolvendo etiologias traumáticas, inflamatórias, congénitas, ou vasculares, assim como distúrbios que afectam o sistema nervoso autónomo. Estão também incluídos distúrbios do desenvolvimento neural, tais como atraso mental, autismo, síndrome alcoólica fetal, síndrome de Down e paralisia cerebral. Os compostos da invenção também podem ser utilizados para tratar síndromes envolvendo o sistema nervoso periférico. Estes distúrbios incluem aqueles que são provocados por qualquer um dos factores previamente listados e, especificamente, incluem doença de Lyme, neuropatia associada a HIV, polimiosite, distrofia muscular e miastenia gravis.

Anticorpos anti-RetL e proteínas de fusão Ret da invenção, que se ligam especificamente à proteína de RetL3 de murídeo, ou RetL3 humana, ou fragmentos destas proteínas, são úteis em vários métodos. Os compostos podem ser utilizados terapeuticamente para inibir ou bloquear a sinalização do receptor Ret, tal como para bloquear o crescimento de tumores, que dependem da activação de sinalização de Ret para crescimento. Estes agentes também podem ser fundidos para marcadores detectáveis, tais como substâncias fluoroscópicas ou radiograficamente opacas e administradas a um sujeito para permitir o tratamento de 63 ΡΕ0914339 imagens de tecidos, que expressam uma RetL. Os agentes também podem ser ligados a substâncias, tais como peroxi-dase de rábanos, que podem ser utilizadas como corantes imuno-histoquimicos, para permitir a visualização de áreas de células positivas para RetL em secções histológicas. Um anticorpo especifico poderia ser utilizado isoladamente deste modo e os sítios em que é ligado pode ser visualizado num ensaio de sanduíche, utilizando um anticorpo anti-imunoglobulina que é, ele próprio, ligado de um modo detectável. Os anticorpos específicos para qualquer RetL são também úteis em imunoensaios para quantificar a substância para a qual um dado anticorpo possui especificidade. Os anticorpos específicos para uma RetL também podem ser ligados a suportes sólidos, tais como esferas ou discos e utilizados para remover o ligando de uma solução, seja para utilização na purificação da proteína, ou para a retirar da solução. Cada uma destas técnicas é rotina para os especialistas nas técnicas imunológicas.

Ouros métodos da invenção incluem modular a sinalização Ret-RetL colocando em contacto Ret com um anticorpo monoclonal anti-Ret. 0 efeito desse contacto mAb-Ret pode ser para bloquear ou para estimular a activação da via de sinalização de Ret, dependendo das características da interacção de cada mAb particular com Ret. Certos mAbs interagem com Ret como agonistas, com a ligação mAb agonista-Ret a despoletar a dimerização e autofosforilação de Ret. Outros mAbs actuam como antagonistas de Ret. A interacção de Ret com um mAb antagonista evita a activação 64 ΡΕ0914339 de sinalização de Ret por outras RetLs, ou por complexos compreendendo RetLs, que de outro modo activariam a via de sinalização de Ret.

Uma RetL e/ou anticorpos para Ret ou para uma proteína de fusão de Ret podem ser utilizados para permitir o processamento por imagem de tecidos que expressam Ret, ou em métodos imuno-histológicos ou preparativos, descritos acima para anticorpos para uma RetL.

As proteínas de fusão compreendem uma RetL e/ou anticorpos anti-Ret podem ser utilizados para direccionar especificamente terapias médicas contra cancros e tumores que expressam Ret. Esses tumores podem incluir os vários fenótipos de tumor diferentes que foram associados a mutações em Ret (N. Engl. J. Med. 335: 943-951, 1996; Nature 367: 319-320, 1996; Trends Gen. 12: 138-144, 1996). As intervenções terapêuticas contra neoplasias que expressam RetL utilizam proteínas de fusão que incorporam ret e/ou um anticorpo anti-RetL. O anticorpo anti-Ret ou anticorpo anti-RetL pode ser eficaz por si próprio através de citólise dependente do anticorpo e dependente do complemento mediada pelo domínio Fc. Esses ligandos híbridos e anticorpos podem ser tornados mais eficazes como terapêuticos para o cancro utilizando-os como veículos de distribuição para fármacos anti-neoplásicos, toxinas e radionuclidos citocidas, tais como ítrio 90. As células citotóxicas efectoras podem ser direccionadas para células tumorais utilizando anticorpos heteroconjugados, em que um 65 ΡΕ0914339 anticorpo específico para ret ou para uma RetL expressa por um tumor é acoplada covalentemente a um anticorpo dirigido contra uma proteína de superfície em células efectoras citotóxicas, tais como células NK ou CTLs.

Um exemplo de uma terapia de anticorpo anti-Ret ou Ret é conjugar a cadeia de tóxico A de rícino, ou uma forma de comprimento total modificada de rícino (que já não se pode ligar a células) a uma RetL ou a um anticorpo direccionado contra o polipéptido de Ret expresso na superfície de células malignas. Noutra forma de realização, uma toxina é conjugada com Ret ou com anticorpo anti-RetL para direccionar selectivamente e matar células positivas para RetL, tais como um tumor expressando RetL. Essa abordagem tem demonstrado ser bem sucedida com rícino bloqueado conjugado a um anticorpo monoclonal contra o antigénio CD19 expresso na maioria das células neoplásicas (Grossbard et al., Blood 79:576, 1992). São igualmente úteis outras toxinas, como é conhecido pelos especialistas na técnica. Essas toxinas incluem, mas não estão limitadas a, exotoxina de pseudomonas, toxina da difteria e saporina. Esta abordagem deveria demonstrar ser ainda mais bem sucedida utilizando uma RetL ou anticorpo anti-Ret, em contraste com a abordagem do antigénio anti-CD19 conhecida, porque Ret é expresso num número de tecidos muito limitado.

As abordagens acima que utilizam fusões de rícino ou outras toxinas são igualmente aplicáveis a conjugados tóxicos de retL, ou de um anticorpo anti-Ret; estes são 66 ΡΕ0914339 úteis para direccionar selectivamente e matando células positivas para Ret, tais como células tumorais expressando Ret.

Outra abordagem para essas terapias médicas é a utilização de RetL ou anticorpos anti-Ret marcados com radiosiótopos. Esses compostos marcados radioactivamente direccionarão preferencialmente a radioactividade aos sítios de tumor em células que expressam Ret, poupando os tecidos normais. Dependendo do radioisótopo empregue, a radiação emitida de um anticorpo marcado radioactivamente ligado a uma célula tumoral também pode matar células tumorais malignas na vizinhança que não expressem Ret. Pode ser utilizada uma variedade de radionuclidos. Isótopos que emitem partículas β (por exemplo 131I) têm sido bem sucedidos quando empregues com anticorpos monoclonais contra CD20 presente em linfornas de células B (Kaminski et al., N. Engl. J. Med. 329:459 (1993); Press et al., N. Engl. J. Med. 329:1219 (1993). Os radionuclidos que emitem partículas β geram emissões radioactivas que são tumoricidas ao longo de distâncias que cobrem vários diâmetros de célula, permitindo a erradicação de células negativas para o antigénio e diminuindo as consequências de deposição não homogénea de anticorpo ou ligando em tumores.

Os radionuclidos que emitem partículas α também podem ser empregues. A baixa taxa de dose de irradiação gerada por RetL ou anticorpos anti-Ret marcados com radionuclidos pode ser mais eficaz terapeuticamente do que 67 ΡΕ0914339 a irradiação instantânea distribuída externamente na terapia de radiação convencional. A irradiação com baixa taxa de dose pode induzir apoptose (morte celular programada) em certas linhas celulares (Macklis et al., Radiat. Res. 130:220 (1992); Maklis et al., Radiopharm. 5:339 (1992).

Os compostos da invenção são administrados em quantidades terapeuticamente eficazes, o que significa que uma quantidade de um composto que produz um resultado medicamente desejável resulta ou exerce uma influência no estado particular a ser tratado. O termo "sujeito", como aqui utilizado, significa qualquer mamífero ao qual o ligando ou gene Ret pode ser administrado. Sujeitos especificamente pretendidos para tratamento com o método da invenção incluem humanos, bem como primatas não humanos, ovelhas, cavalos, bovinos, cabras, porcos, cães, gatos, coelhos, porquinhos da índia, hamsters, gerbilos da Mongólia, ratos e murganhos, bem como órgãos, tumores e células derivadas ou com origem nestes hospedeiros.

Utilização de Compostos da Invenção em Terapia Génica

Os genes de RetL da invenção são introduzidos em tecido lesionado para estimular a produção de uma RetL pelas células transfectadas, para promover o crescimento celular e/ou a sobrevivência das células que expressam Ret. 68 ΡΕ0914339

Numa forma de realização especifica de uma utilização de terapia génica, poder ser introduzido um gene de RetL num tecido alvo renal ou neural de escolha. Uma RetL seria então expressa de forma estável e estimularia as células positivas para receptor Ret para crescer, dividir, diferenciar e/ou potenciar a sobrevivência celular. Além disso, os genes de RetL podem ser introduzidos numa célula alvo utilizando uma variedade de métodos bem conhecidos que utilizam estratégias com base virai ou não virai. Métodos não virais incluem electroporação, fusão de membrana com lipossomas, bombardeamento de elevada velocidade com microprojécteis revestidos com DNA, incubação com precipitado de cálcio-fosfato-DNA, trans-fecção mediada por DEAE-dextrano e micro-injecção directa em células isoladas. Por exemplo, um gene de RetL pode ser introduzido numa célula através de co-precipitação com fosfato de cálcio (Pillicer et al., Science, 209: 1414-1422 (1980); micro-injecção mecânica e/ou aceleração de partículas (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5399-5403 (1980); transferência de DNA à base de lipossomas (e.g., transfecção mediada por LIPOFECTINA -Fefgner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:471-477, 1987; Gao e Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179: 280-285, 1991; transfecção mediada por DEAE Dextrano; electroporação (Patente U.S. 4956288); ou métodos à base de polilisina em que o DNA é conjugado para distribuir DNA preferencialmente aos hepatócitos do figado (Wolff et al., 69 ΡΕ0914339

Science, 247: 465-468, 1990; Curiel et al., Human gene

Therapy 3: 147-154, 1992).

As células alvo podem ser transfectadas com os genes da invenção através de transferência directa de genes. Ver, e.g., Wolff et al., " Direct Gene Transfer Into Moose Muscle In Vivo", Science 247: 1465- 68, 1990 Em muitos casos, a transferência medida por vector será desejável. Pode ser utilizado qualquer um dos métodos conhecidos na técnica para a inserção de sequências polinucleotidicas num vector. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY (1992) . A activação do promotor pode ser especifica para o tecido ou indutivel por um produto metabólico, ou substância administrado. Esses promotores/inten-sificadores incluem, mas não estão limitados a, o promotor da RetL nativa, o promotor/intensificador imediato-precoce de citomegalovirus (Karasuyama et al., J. Exp. Med. , 169: 13 (1989) ) ; o promotor de beta actina humano (Gunning et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84: 4831 (1987); 0 promotor indutivel por glucocorticóides presente na repetição terminal comprida do virus do tumor mamário de murganho (MMTV LTR) (Klessig et al., Mol Cell . Biol., 4 : 1354 (1984)); as sequências de repetição terminal longa do virus da leucemia de murideo de Moloney (MuLV LTR) (Weiss et al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1985)); o promotor da região 70 ΡΕ0914339 precoce de SV40 (Bernoist e Chambon, Nature, 290: 304 (1981)); o promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV) (Yamamoto et al., Cell, 22: 787 (1980)); o promotor da cinase de timidina do vírus de herpes simplex (HSV) (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78: 1441 (1981)); o promotor de adenovírus (Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 3567 (1985)).

Os genes de RetL também podem ser introduzidos por vectores virais específicos para utilização em sistemas de transferência de genes que estão agora bem estabelecidos. Ver por exemplo: Madzak et al., J. Gen. Virol., 73: 1533-36, 1992 (papovavirus SV40); Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 39-61, 1992 (adenovírus);

Hofmann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 92: 10099-10103, 1995 (baculovírus) ; Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38, 1992 (vírus vaccinia); Muzyczka,

Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123, 1992 (vírus adeno-associados); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 67-93, 1992 (vírus herpes simplex (HSV) e vírus Epstein-Barr (HBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 1-24, 1992 (retrovírus); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol., 4: 749-754, 1984 (retrovírus);

Miller et al., Nature, 357: 455-450, 1992 (retrovírus);

Anderson, Science, 256: 808-813, 1992 (retrovírus), Current Protocols in Molecular Biology: Secções 9.10.9.14 (Ausubel et al., Eds.), Greene Publishing Associates, 1989.

Vectores preferidos são vírus de DNA que incluem 71 ΡΕ0914339 adenovírus (preferencialmente vectores à base de Ad-2 ou Ad-5), baculovirus, vírus herpes (8preferencialmente vectores à base de vírus herpes simplex) e parvovírus (preferencialmente vírus à base de parvovírus "defeituosos" ou não autónomos, mas preferencialmente vectores à base de vírus adenoassociados, mais preferencialmente vectores à base de AAV-2) . Ver, e.g. Ali et al. , Gene Therapy 1: 367-384, 1994; Patente U.S. 4797368 3 5399346 3 discussão abaixo. A escolha de um sistema de vector particular para transferência, por exemplo, uma sequência de RetL irá depender de uma variedade de factores. Um factor importante é a natureza da população de células alvo. Embora os vectores retrovirais tenham sido extensivamente estudados e utilizados num número de aplicações de terapia génica, eles são geralmente inadequados para infectar células que não se estão a dividir, mas podem ser úteis ma terapêutica do cancro, uma vez que apenas integram e expressam os seus genes na replicação das células. Eles são úteis para abordagens ex vivo e são atractivos a este respeito, devido à sua integração estável no genoma da célula alvo.

Os adenovírus são vírus de eucariotas que podem ser modificados para distribuir eficientemente um transgene terapêutico ou repórter a uma variedade de tipos de células. Os adenovírus gerais dos tipos 2 e 5 (Ad2 e Ad5, respectivamente) , que provocam doença respiratória em humanos, estão correntemente a ser desenvolvidos para terapia génica de Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) e 72 ΡΕ0914339

Fibrose quística (CF) . Tanto Ad2 como Ad5 pertencem a uma sub-classe de adenovírus que não estão associados a malignidades humanas. Os vectores de adenovírus são capazes de proporcionar níveis extremamente elevados de distribuição de transgene a virtualmente todos os tipos de células, independentemente do estado mitótico. Podem ser facilmente gerados títulos elevados (1013 unidades de formação de placas/mL) de vírus recombinantes em células 293 (uma linha celular de rim embrionário humano de complementação, tansformadas com adenovírus: ATCC CRL1573) e criopreser-vadas durante períodos extensos sem perdas apreciáveis. A eficácia deste sistema na distribuição de um transgene terapêutico in vivo que complementa um desequilíbrio genético foi demonstrada em modelos animais de vários distúrbios. Ver Y. Watanabe, Atherosclerosis, 36: 261-268 (1986); K. Tanzawa et ai., FEBS Letters, 118 (1) : 81-84 (1980) ; J. L. Golasten et al., New Engl. J. Med. , 309 (11983) : 288-296 (1983) ; S. Ishibashi et al., J. Clin.

Invest., 92: 883-893 (1993); e S. Ishibashi et ai., J.

Clin. Invest. , 93 1889-1893 (1994). Na verdade, adenovírus recombinantes deficientes na replicação codificando um cDNA para o regulador de membrana da fibrose quística (CFTR) foram aprovados para utilização em pelo menos dois ensaios clínicos para CF humana. Ver, e.g., J. Wilson, Nature, 365: 691-692 (21 de Out, 1993). Suporte adicional da segurança de adenovírus recombinantes para terapia génica é a experiência extensiva de vacinas de adenovírus vivos em populações humanas. 73 ΡΕ0914339

Os adenovírus humanos são compreendidos por um genoma de DNA de cadeia dupla de aproximadamente 36 kb, linear, que é dividido em 100 unidades de mapa (m.u.), cada uma das quais tem 3 60 pb de comprimento. O DNA contém repetições terminais invertidas curtas (ITR) a cada extremidade do genoma que são necessárias para replicação de DNA virai. Os produtos génicos são organizados em regiões precoce (EI até E4) e tardia (LI até L5) , com base na expressão antes ou após a iniciação da síntese de DNA virai. Ver, e.g., Horwitz, Virology, 2a edição., ed. B.N.

Fields, Raven Press Ltd., Nova Iorque (1990).

Os adenovírus recombinantes de primeira geração, deficientes em replicação, que foram desenvolvidos para terapia génica de DMD e outros distúrbios herdados contêm deleções das regiões Ela inteira e parte da Elb. Este vírus deficiente em replicação é cultivado em células 293 contendo um gene Ela de adenovírus funcional, que proporciona uma proteína de Ela de transacção. Vírus com EI removido são capazes de replicar e produzir vírus infecciosos nas células 293, que proporcionam produtos de gene da região Ela e Elb em trans. O vírus resultante é capaz de infectar muitos tipos de células e pode expressar o gene introduzido (desde que comporte o seu próprio promotor), mas não pode replicar numa célula que não comporta o DNA da região EI a menos que a célula seja infectada a uma multiplicidade de infecção muito elevada. Os adenovírus possuem a vantagem de possuírem um vasto intervalo de hospedeiros, pode infectar células inactivas 74 ΡΕ0914339 ou terminalmente diferenciadas, tais como neurónios e parecem essencialmente não oncogénicos. Os adenovirus não parecem integrar-se no genoma do hospedeiro. Dado que existem extracromossomicamente, o risco de mutagénese insercional é fortemente reduzida. Ali et al., supra, a 373. os adenovirus recombinantes (rAdV) produzem titulos muito elevados. As partículas virais são moderadamente estáveis, os vírus de expressão são elevados e uma vasta variedade de células pode ser infectada. As suas células hospedeiras naturais são o epitélio das vias respiratórias, de modo que são úteis para terapia de cancros do pulmão. A transferência mediada por baculovírus possui várias vantagens. A transferência de genes de baculovírus pode ocorrer em células em replicação e não replicação e pode ocorrer em células renais, bem como em hepatócitos, células neurais, baço, pele e músculo. 0 baculovírus não replica e é não patogénico em células de mamíferos. Os humanos não têm anticorpos pré-existentes para baculovírus recombinantes, que podem bloquear a infecção. Adicionalmente, o baculovírus é capaz de incorporar e traduzir inserções de DNA muito grandes.

Os vírus adeno-associados (AAV) foram também empregues como vectores para terapia génica somática. 0 AAV é um vírus pequeno de DNA(ss) de cadeia simples com uma organização genómica simples (4,7 kb) que o torna um substrato ideal para engenharia genética. Duas grelhas de 75 ΡΕ0914339 leitura aberta codificam uma série de polipéptidos rep e cap. Os polipéptidos rep (rep78, rep68, rep62 e rep40) estão envolvidos na replicação, recuperação e integração do genoma de AAV. As proteínas cap (VP1, VP2 e VP3) formam a cápside do virião. A flanquear as grelhas de leitura aberta de rep e cap nas extremidades 5' e 3' estão repetições terminais invertidas de 145 pb (ITRs), em que os primeiros 125 pb são capazes de formar estruturas em duplex em forma de Y ou T. De importância para o desenvolvimento de vectores AAV, os domínios de rep e cap inteiros podem ser excisados e substituídos com um transgene terapêutico ou repórter. Ver B.J. Cárter, em Handbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser, CRC Press, péptido. 155-168 (1990). Foi demonstrado que os ITRs representam a sequência mínima necessária para replicação, recuperação, empacotamento e integração do genoma de AAV. O ciclo de vida de AAV é bifásico, composto tanto por episódios latentes como líticos. Durante uma infecção latente, os viriões de AAV entram numa célula como um ssDNA encapsulado e muito pouco tempo depois são distribuídos ao núcleo, em que o DNA de AAV se integra de forma estável num cromossoma de hospedeiro sem a aparente necessidade de divisão celular do hospedeiro. Na ausência de um vírus auxiliar, o genoma de AAV integrado permanece latente, mas capaz de ser activado e recuperado. A fase lítica do ciclo de vida começa quando uma célula contendo um pró-vírus de AAV é confrontado com uma infecção secundária por um 76 ΡΕ0914339 herpesvírus ou adenovírus, que codifica funções auxiliares que são recrutadas por AAV para auxiliar na sua excisão a partir de cromatina de hospedeiro (B.J. Cárter, supra). 0 ssDNA parental de infecção é expandido para DNAs na forma de replicação em duplex (RF), de um modo dependente de rep. Os genomas de AAV recuperados são empacotados em cápsides proteicas pré-formadas (de simetria icosaédrica de aproxi-madamente 20 nm de diâmetro) e libertados como viriões infecciosos que empacotaram genomas de ssDNA + ou - após a lise celular.

Os virus adeno-associados (AAV) têm um potencial significativo em terapia génica. As partículas virais são muito estáveis e os AAVs recombinantes (rAAV) possuem caracterí sticas " tipo-f ármaco", em que o rAAV pode ser purificado por sedimentação ou por formação de bandas em gradiente de CsCl. Eles são estáveis ao calor e podem ser liofilizados num pó e re-hidratados para actividade total. O seu DNA integra-se de forma estável nos cromossomas do hospedeiro, por isso a expressão é a longo termo. A sua gama de hospedeiros é vasta e o AAV não provoca doenças conhecidas, de modo que os vectores recombinantes não são tóxicos.

Uma vez introduzidas numa célula alvo, as sequências de interesse podem ser identificadas por métodos convencionais, tais como hibridação de ácido nucleico utilizando sondas compreendendo sequências que são homólo-gas/complementares às sequências genéticas do vector inse- 77 ΡΕ0914339 ridas. Noutra abordagem, a(s) sequência(s) pode ser identificada pela presença ou ausência de uma função de gene "marcador" (e.g., actividade de cinase de timidina, resistência a antibiótico e afins) provocada pela introdução do vector de expressão numa célula alvo.

Formulações e Administração

Os compostos da invenção podem ser administrados de qualquer maneira que seja medicamente aceitável. Isto pode incluir injecções, por vias parentéricas tais como intravenosa, intravascular, intra-arterial, sub-cutânea, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, intraventri-cular, intraepidural, ou outras, tais como oral, nasal, oftálmica, rectal, ou tópica. A administração de libertação sustentada é também especificamente incluída na invenção, por meios como injecções de depósito ou implantes de libertação lenta. A distribuição localizada é particularmente contemplada através de meios tais como distribuição através de um cateter a uma ou mais artérias, tais como artéria renal, ou um vaso, fornecendo um tumor localizado. 0 termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa um ou mais ingredientes orgânicos ou inorgânicos, naturais ou sintéticos, com os quais o proto-oncogene mutante ou oncoproteína mutante é combinado para facilitar a sua aplicação. Um veículo adequado inclui solução salina estéril, embora outras soluções estéreis isotónicas aquosas 78 ΡΕ0914339 e não aquosas e suspensões estéreis conhecidas como sendo farmaceuticamente aceitáveis sejam conhecidas dos especialistas na técnica. A este respeito, o termo "veiculo" compreende lipossomas e a proteína HIV-1 tat (Ver Chen et al., Anal. Biochem. 227: 168-175, 1995) bem como quaisquer vectores de expressão plasmídicos e virais. Uma "quantidade eficaz" refere-se à quantidade que é capaz de melhorar ou retardar a progressão do estado de doença, degeneração ou lesão. Uma quantidade eficaz pode ser determinada numa base individual e será baseada, em parte, tendo em consideração os sintomas a serem tratados e os resultados esperados. Uma quantidade eficaz pode ser determinada por um especialista na técnica empregando esses factores e utilizando nada mais do que experimentação de rotina. 0 sistema de lipossomas pode ser qualquer variedade de vesículas unilamelares, vesículas multilamelares, ou vesículas plurilamelares estáveis e pode ser preparado e administrado de acordo com métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica, por exemplo de acordo com os ensinamentos das Patentes dos Estados Unidos 5169637, 4762915, 5000958, ou 5185154. Adicionalmente, pode ser desejável expressar os novos polipéptidos desta invenção, bem como outros polipéptidos seleccionados, como lipopro-teínas, de modo a aumentar a sua capacidade de ligação a lipossomas. Como um exemplo, o tratamento de falha renal humana com RetL encapsulada em lipossomas pode ser realizada in vivo através da introdução de uma RetL nas células 79 ΡΕ0914339 em necessidade desse tratamento utilizando lipossomas. Os lipossomas podem ser distribuídos através de cateter para a artéria renal. A proteína RetL recombinante é purificada, por exemplo, a partir de células CHO através de cromatogra-fia de imunoafinidade, ou qualquer outro método conveniente, depois misturada com lipossomas e incorporada nestes com elevada eficiência. A proteína encapsulada pode ser testada in vitro para qualquer efeito na estimulação de crescimento celular.

Esta invenção também contempla que o novo poli-péptido desta invenção pode ser administrado a um animal através de sistema de distribuição de lipossoma, de modo a aumentar a sua estabilidade e/ou imunogenicidade. A distribuição dos novos polipéptidos através de lipossomas pode ser vantajosa porque o lipossoma pode ser interiorizado através de células fagocíticas no animal tratado. Essas células, após ingestão da membrana lipossómica e subsequentemente, apresentam os polipéptidos ao sistema imunitário em conjunção com outras moléculas necessárias para provocar uma resposta imunitária forte.

Qualquer um dos novos polipéptidos de RetL desta invenção pode ser utilizado na forma de um sal farmaceuti-camente aceitável. Ácidos e bases adequados que são capazes de formar sais com os polipéptidos da presente invenção são bem conhecidos dos especialistas na técnica e incluem ácidos e bases orgânicas. ΡΕ0914339 80

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: doherty, jodi (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: título do pedido a patente da biogen (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 21

(iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA (A) DESTINATÁRIO Biogen, Inc. (B) RUA: 14 Cambridge Center (C) CIDADE: Cambridge

(D) ESTADO: MA

(A) PAÍS: EUA (B) CÓDIGO POSTAL: 02142 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA DE COMPUTADOR: Patentln Release #1,

Versão #1,30 (vi) DADOS DO PEDIDO CORRENTE: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE ARQUIVO: 07-MAIO-1997 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (D) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/999,999 (E) DATA DE ARQUIVO: 01-JAN-1996

(viii) INFORMAÇÃO DO ADVOGADO/AGENTE (A) NOME: Levine, Leslie M. (B) NÚMERO DE REGISTO: 35,245

(C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE ARQUIVO: A008 PCT CIP (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 617-679-2400 (B) TELEFAX: 617-679-2838 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3616 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla 81 ΡΕ0914339 (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 257...1660 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: eeesccce&G (rrasseroGe ãrctgâaccc ctcasagcsíg sTccmcrce cscecresoe «e CCCÍ3CCCOSA TClOftSTCQC TGSSÇÇSCGOT QBSCSeeaeA OCGACCOSSA GTCTSCTCTC 130

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Ala <32 u Thr Ser 455 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (iii) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGCGAAGGC GACGTCCGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO : 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: 87 ΡΕ0914339 AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCTCGTC GCA 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCGCATC ACA 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1926 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 10..1920 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

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ItocfecMí |§§§|||||f ^ |§§|§1|§Βρ #n«ÇTrrf .aJlilie |||||Í3|||:::írf<^ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 346 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

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3*0 34S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1682 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 118...1497 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: 97 ΡΕ0914339 gsgcggccas AGesscACAe cttíccgsgg atcgctsovt GCTSASCTCC CTCGGCAAaA m cccasoggcs gctcsgoatt tttttísgggg ggcggssacc AGCeececGc oesovec 117 ATS TTC CTS SCG ASC CFG TAC TTC SCG CTG CCS CTC TT« GAC TTG CTC 1SS Pi». Leu Me Tiscr Leu Tyr Pi» Ala Leu Pr© Leu Leu Asp Leu Leu 350 355 358 cm TCQ SCO <3AA GTS AGC CSC GOA SAP osc cro SAT TGC ms AM see 213 Leu Ser Ala Qlli Vai Ser &ly ®Iy «p AXtj Leu A»p Cys Val Lys Ala 355 370 375 sm SAT cm TGC CTS MS GftG CAS AGC TSC AGC í|cc MG me CSC ACS 3Í1 s©r Gin ç>-s Leu Lya Gla Gin :|ex Cys Ser ::!&r Lys Tyr A*3 Thr 380 385 350 GTA AÔ3 íNÍ 8TG GC3 SSC MG OAG Ip MC TTC AGC CTG GCA TCC 309 Leu Arg iilsiii llSpÉI Vai Ale Sly Lya Ciu Thr Asrs Phe iíi|ter Leu Ala S"r 355 400 405 430 CTS #ç QCC A&S GAT GA3 TSC CÕC ASC ::GCG:: ATO GAG GCC CTS: AAO Ϊ57 Gly Leu aiu ϊίί Lys Asp Slu Cye Arg Ser Ala ϊΐβε Gllt Ale Lèti. Ly» 415 42S 425 CAO AAG $M|: cíc TAC aao Ipc CSC TGC AAS CSG S|«T" í#í· AAG MS GAQ 405 «ln Lys Ser Leu yyr Aaa Cya *$| Cys lip» Arg Gly MÊt Lys Ly.e eiu. 430 435 440 AAG ARC TSC CSC ATT s|ac TGG ase ATS mc CAfí AGC CTG CAG m K:: 453 Íífà Aars ::#*: Leu; 'S.' 'TÍ© Tyr Trp Ser |«et: "Vi Gs a sai Leu Gi» G.iy 445 liso 4SS AAT iiiftT CTG CTG GAS GAT TÇÇ CCA TAT «& CCA GTT MC AGC ASA TTG 501 AS» fesp Leu Leu Qlu Aep: ser ?ro Tyr Glu Pr© VAl Asn sar Arg Leu *65 470 TCA GAT ATA TTC CSG GTG CTC CCA TTC ATA TCA GTG GAG CftC ATT COC Ser Aap He PhB Arg Vai Vai Pro Pise lie Ser Vai <SLu Hia lie Pr© *75 480 485 490 A&& ©35 AAC MC TQC CTS CÀT ££& eec AAG sce TGC AAÇ CTC SAC GAC 597 tys GTy Asa Asa Cys Leu Aap Ale Ala Lys Ala Cys AS» Leu !ÁSp Aep *95 508 505 ATT TGC MS AA3 TAC ASA TCG SCG TAC ATC ACC CCCS TSC ACC ACC ABC Ê4S lie Cys Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr 11* Ths Tro Cya Títr Títr Ser S10 SIS 520 98 ΡΕ0914339 CTC w$ RAC GA? G7C T®C "Vai. ser Asa Asp vai Cys Ç»S Txc Pi GAC AAS CTC SlK «ÍSE f&i Ays vai í||q TTC iiifc :§3§ CTC SAÇ ATC eye Ser Cy* Arg Αίψ lia 5SÊ 56C CTC CCT CTC TCC soc TAT Vai ííEaís Vai Cya Sec Tyr 575 TO3 CAG ipsi T--C TCC AAS L8W ÍSln Asg Ses CfS Lys SM illl' ΤΤΓ •TTO ACC AAC TCC ksp Fha The ΪΪ1Γ Rara Cys 40« CTA MAS CAR AAC TAC GCT leo X*ye Sivt Rea TVT Ala £20 TCC ACA. <3TC ATS ACC çeç lli tfer ¥«1 !4ec Th:r Pró £35 £40 CCÇ CCA TTC TTO sac TCC AXb Pro Trp Cya Asp Cys S55 TOS MA TTO ιΊ1»Τιϊ V*S? ÍAM* TOC Xéé Lym Shs it&a Asa Ph* £70 ATO CAA GCC :iÍÍÍ·· ssd AAT íla 31». Ale PAe Ôly Aílíl 6f)5 TOC çc&i <TTA CAC •AiSC ACC JPí)« 9TO Vai iill TAr τΜϊ TOQ AA.G AAÇ AAí? CÇÇ CTS SW: hys ASO: Xys Le« eiy 7.ÍS 723 CAT OTO TOS CCA CCS TST HtB Vai Lau ::1P §'r<? Cya AAC ccc CSÇ: AAG TCC CAÍ Asa Arg 5301 Arg Vys Cys Sis CCS «CC ARS cm ASC TA^ Prs S4S Ala t.ya Mis S«or Tyr 550 CCCT TCC ACA QAG CRO AOO Ala Cy» Tfir Slu Arg S5$ Arg GAA SSÍa ACSB CAS AAO COC @lu SIu Atg da 500 i).ye Pro ACQ RAT TAC ATC TCC ASA Thr Aen fys Ue Cys Ã*§

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 205...1242 106 ΡΕ0914339 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: ccjcmcaçcc agcscaôgca coitg6çgct· «y :|§|«§||§§§^ CS#||Cti®T· CGTCSTQGCT..........................H<5

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;M|PílÍf&3 tiiCTlBSGí? i|ÍÍÍÍÍmftA TAARAA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 346 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15:

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(C) NOME/CHAVE: CDS (D) LOCALIZAÇÃO: 41...1231 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: 110 ΡΕ0914339

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IWiMm AAAAAAASAA AMAAftAA 18SS (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 397 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

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(E) NOME/CHAVE: CDS (F) LOCALIZAÇÃO: 2...94 6 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: e me «et em aer m era se? em m

Sly Tyr Cy& Siu Tisr Prc· Sis Lev &rg Asa. S«*> ser l*au Sie Gly 400: 4 os 43.0 tsc ATS Tés e&e CCG CSC A*TO AJO? AAC •CAQ STF OCC TSC TT3 w AVC 9-1 Cy« Meç Cyg Kis Arg Ast MSt ays Aos 3ln. val AJ.O Cys to* Asp lie 4 3.5 450 425 TrT: Ter* ací: STT CAC CC5T Ht CSC AfiC íttt <30T MC ΓΛΤ sm CTG GAt 142 Tyx| Tte ¥ál Eia ATS AiS arg Sor Leu Qly As τι ?yr GIU Lea ASp Ma 43S 440 CTC TCC cce TM' SÂA <SAC ACA STG ACC AGC MA CCC 'TOS AAA ATS SÃT 1.90 vai SíSif j?r<s Tyr Silí. A»p Tíwr Y»X Tfer Ser Ly» PXO r.tp Aye Ket ASS1 44:|: 450 455 4S0 CÍC ASC AM CTS MC ATG CTC AM CCA SftC TCà OkC CTC tSciC CTC mi 139 £>4U s-er Lya IváU ASS Kèt Leu Lyst Pre- Asg sor A&p L«U Cys Leu t>y$, 445 4 475 TTÍf: SCC ATO WÊÊ IP sor CTC MT eÃC AAG TGT GAC CGS CTS CSC A&Q 200 sial Alá Má 4; L&it Cy£ sto I45U Aan Rjsp Lys cy» ASp Arg Lõu Ars ítys 4*0 465 4»0 occ ?ÃC OGS mo sos TGC ICC •soe CCC CAO TOC CAS esc CAC <5TC TSC 334 Ala Tyr ciy eia Ais Cy» Ser Ol y Pro Sííb Cye GlK Arg Hi.S Vai Cys 4 OS 500 505 CTC AS0 CAS erg etc ACT TTCf TTC mo MS 5CC ©CC GAõ esc me aes M3 Leu Arg C31n LS« L«W Ttir Sfte Phe Glu Lyç Ais Al« 61 u Pro HÍS Alo 510 515 .5*0 CAS <S$C CTG CTA CTS tsc CCA TÇT eee CCC MC SftC COv <?CC TSC G&8 430 GlH eiy Lâu Leu Lea cye Pro cys Alá Pre ASK Asp Arg aly Cy& Gly 5-2S 530 535 540 115 ΡΕ0914339 <sm CSC CSC cec AAC R?C ATC ©a: CCC AAC TGC SC» CTG CCS CCT STG »Xu Ar» Ar» Ar» Asn Thr Xle Ale Pre Asn Cy® Ala Leu Pro Fr o vei 54 S 5$0 5$S GCC ccc AAC TQC CTG QAS CTG CSS CGC CTC TGC «C TCC GAC CCS CPT Ai* Pro Asa Cya Leu »1« Leu &m Ar» Leu Cys S*aé Séx Asp Prw Leu 56» $65 57 Çl TGC ASA TCA CSC CTG GTO SAT rrc CAS ACC CAC WQ CAT CCC ATS SAC §74 Cys Am Ser Ar» Leu Vai Asp Phe »lu Thr EiS cys HiP Pro «et Aep S75 se s ATO CTO »SA ACT tot »CA AÇA G&S CA» TCC ASA TST CTA CGA CGA XAS «22: lie Leu oly Thr cys Ale. Thx Glu Glu ser Arg Cye Leu Arg Ala. «yr S§0 SM 600 GTO 08$ CTG ATT GGG ACT QCC ATS ACC cec AAC TTT QTC ACC AAT srç ¢7¾ Leti Gly Leu lis GXy TSW Ala Met mr Pra Ãrti PSe vai ver Aeo vai ses sis ¢15 sso AAC acc AGT GTT ®ce TTA AGC TGC ACC TGC CGA GGC A3T »»c AAC CTO 716 ASP iiíSSter,. ser vai Ale Leu ser çys The Cye &m Giy ser 03-T Aen Leu 625 S3S S35 SAG GAO GA0 TGT Ma ATS CT3 SAA »Í5G TTC TTC TCC CAC AAC CCC TOC 7SS Sla $Í:U. Oiu Cva »lu i|ps Leu $lu Phe· Phe Ser Ki B Ase Pro Cy» 64ft $4» 65C src AC» CA» GCC Μ*! 8CA SCT AA3 ΑΪΤ3 oer ΤΤΪ' CAC ûC CÃA CTC TTC «24 GlU : :mm Lie Mas Ai a Lya «st Arg Phe Sis Ser fiin Leu Phe S5S «m 65 5 ICC cm GAÇ re» ;|ÍA csMti CCT ACC 7TT SCT GTO ATS GCA CAC CA» AAT «62 Ser SUi Asp Trp: :§TO Sis Pra Tfcr Phe Ala ^al «et Ala SÍ8S Gin Aa» 670 675 ssa 3ÂX AAC CCT SCF STG A»S CCA CAS CCC TOS ST» esc TCT CTT :ϋ! tee ...... 910 Glu ASU Pre Ala Vai Ar» PJCP <21» Pt <? Trp vaX Pro Sex Leu Ser 6B.5 SM; €f|: 7PÕ TOC AC» CTT ccc |H|: ΑΪΤ CTG CTC GTO AOC CTA TOS TA»CT»»ACT 95« Cys Tkf L«i< Pro "tlm Lèu L&u Leu Ser Lssú: ?rp TO5 710 TOCCSftSSCC CCTCTTCCCC TCCACCJwCAC CCAGCTOGAC TTOCAQCCCA CAAâfíGSTÍSA j ois |ί|||||||^ Ma8$f§|^ :1111111¾ ig»ss SSTTATOACe TCC&SATCCt TAeTOSTTOA STOCTCATTC CCTCCACCCC ATCTCCÁOTT 113* i|||§t|Í^^ ^ie^§^§§^t!rm^o llllll"

GCCtTOCTÍT ASTECTATTA TTOTCCTAAA STCtCTCX»» CCTCTTRKSAT CAltíATTAAA 125S 11111111¾ lllll?i (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19: (ii) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (B) COMPRIMENTO: 315 aminoácidos (C) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 116 ΡΕ0914339 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xí) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19:

Éiy Tyr Cys Ulu Thr Pro Sla Leu Ar? Asn S«Í S'-r Leu lie « Cys ! x II 1 iC 15 |s»t ''p : Èii íí ?‘jrg Srg Mat L>"a Asa <Sln Ifài Ala Cys LSU Aap lie Tyy 25 00 Trp Thr Vai BÍS Arg Ala Arg Ser Leu Gly Asa Tyr <SÍU IíBU Asp vai 35 40 4S Ser Pz* Ty* ela Asp Thr val Thr Ser Lys Pr» Trp Lye «ec ASR lasu 50 5S «0 Ser ítfâ Leu Asa 5tet Lèu Lya Pr© Asp Ser Asp Leu Cys Leu Lyn Pfte €5 ?o 75 »3 αχ* L«u cy* Thr s>*« A*«i Asp r.y« ny« Asp Arg Leu Arg Lyw Al A es $0 $5 xyr siy ííixí Ala Cys ser Oly Pre His cys Gin Ãxg ai» Sàl. cy» trfíU ieo 105 uo ftrg gin Leu Leu Thr »he Phe ela bys Al* Ala Olu Pro sis AX» Gin 115 120 135 Gly Leu |§!ÍU Leu cya Pro cyo Al» Pr o Aon Asp Arg GXy ey» Gly Glu 13C 13S 14 Cj Arg **S Arg AS» Tte lis Ala Pr D ASA cys Ai a Leu Prt> Pro Vsi Ai» léS 150 1SS 160 Prts As» Cys 1¾¾ ÇIu Leu Arg Arg iSíiají' '#1' Pb* Ser ASp Piro Léu cys :iss i|| 175 Arg ser A.rg i-sa Vai Aso Phe ela Tiur Kis <# ais Pr© Asp lie 180 lês ISO Leu :^§y Thr Cys Ala Thr elu el». Ser 3# :ϋ§; l45M Arg Alá Tyv Leu tas soo 205 Siy lie Gly ϋϋ Met Thr !PÍÈS:i AS» Phe "al Ser Asa fali Ã3R 2Μ 215 117 ΡΕ0914339 ÍSíx Ser Vftl Ale teu teli: i|$!| :$&r cys Arg <3ly ser M%y AsTí 225 230 235 300 Slu SÃ U: Cye 53'3 teu «3.W s+y L>h« XlVrA i.ii+s-: sej* •jjíjtearv »ro Cye teu 245 350 255 ipLT slu Ά&Α ile Al« Lye Wet Fte Ei» &er G1r teu Pfee Ser 2SC ass 270 Siii AÈp Tsrp Ρϊ« áis iTO 'T&r yte &-À 31- val Keft Ma Si 8 81» AS» tila 375 20:0 Ϊ05· AKii Pro Ala ϋϋΙ ftrg ero Pro T*p Vai Pxo Ser teu í%« Sar Cya 290 im 300 Tte 305 L-OU PXO Ite Lçtí no teu teu Ser teu ‘SfíP 31.5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1699 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(G) NOME/CHAVE: CDS (H) LOCALIZAÇÃO: 175...1374 68- 123 i?·? 225 273 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20: WimÊÊÊÊÈÊiÊÊÊÈx* gcgcccaosa çcctgístgííg asagtgtgts

CSTCSCÍ5CTíS tíAGSOCOSÇA GGASGTSCQS GTCSaSSSJMí CCCC9CTCTC AôAísstsSAs sstess&sca ©sec ato ST3 CSC iiiici CTS AAC CCS CGA ϋΐϋ? CTS CCG CCC GTA GTC CTG ATS TTO Vai Arer Pv£> teu ί||ο Pr* Arg Pre teis. ?KO Ρΐί> VãI Vai l.eu Het teu 320 325 330 CTÍ5 CTS CTS CTS: i|§® csesé TOS ccc CTC3 CCT CTC :|P" .-iCC <5 GA esc CCC teu teu teu teu Pro Ser i_.fp.ia P-f-Tí teu .Ale Ciy &J»P Prp 335 111 34S: CTt ccv ACA GAA AGC 1....... CTC i:|§§ AGC TBT CTC CAͧi t»CC A5K3 AtSG teu £'ro T*w: Olu fíer Ari| teu iiill Ser Cys teu Giti AIãi !;$$* Arg· 1111 355 360 321 - 118 - ΡΕ0914339 AAG TS© CA© GCT OAT ccc TGC AQT GCT GCC TAC CAC CAC CT© OAT 3SÔ - **: Cya cin Ala Aap Pr» Tiir Cya Ser Ala Ala Tyr Hia Kls lau Aep 36.S 1Π1 375 30© tcc T©C ACC TCT AOC ji|ÉA ASC ACC CCA CT© çcc VGA SSG <sm ÇÇT TC© 417 Ser Cya Titis Ser Ser rio Sar Th* Oro Twtío Ore Ser Glu Slu Pro Ser 38S 390 395 ©TC ÇÇT OÉÍÍ SAC TGC €TS GA© GCA :<£Cà CA© CAA CTC AG© ASC TCT 4S5 ÍAI Pro Ala Aap Cys C-SíU 71« Ala AX& ©m Glft leu Ar? Aen Ser Ser «se 4 OS sao CT© ATA «SC TSC AVS TGC «AC ©o© CSC ATS AAC AAC «AS «8Y ©cc tec Si;3 Usu lie Gly Cys Cye Mis; Arg Atg 3ÚÍ& Lys Asm GliR Vai Ala Cys 415 450 4Í5 <3AC ATT “ST TGG ACC ©ΤΪ Cr© ©C© cõc aSG CTT ÕGT AÃC TAT Sé:i iíSfci ASp ϊίβ Τγ£ Tep Tilí V3l Hl» Arg: Ala At? ser Sly Afaii Tyt 4-JO 435 440 gag CTS ©AT GTC siiife ccc TAT GAA ©AC ACA GT© acc AS© m CCC TSS SttS Leu Asp V*1 £e.r PiftS Tyr Glu ASp Tfcr Vã.1 Thr Ser iys ír© ϊτρ 44¾ 4 50 4Sr 490 IMi ATS AAT CTC life·· MA CTG AAC AT© CTC ASA CCA GAC TOA GAC CTC SS7 Lys «et AS» Lwu Ser Lys LéU As» Meê. iLãftd h Pr» Asp Ser Ssp i,e« 4« 5 4 TO 475 TQÇ CTC AAG ÍSÍÉÉl ii§© Ate ©f© s©t &CT CTC AAT ©AC AS© TGT CSC CGG ?0S Cye iièti. Ly« PH* AI» Mít Leu Cys ίΤΪΜΤ leu Asm Asp lye Cys Aap Arg 490 490 ÇTi3 AÀS ©CC CAC ©0© GA© ©CG TGC TCC ©G© ccc CAC T©C CAS C©«: 75:3 LSts &r? &y» Ala Tyr Gly ©la Ala ;§t« Ser Gly Pto HÍS Cys ©!n Ar? 455 soo SOS o%c gfÇ? TGC CTC AOS CA© cr© CTC Wh TTC T?C GA© AAG GCC ©cc GA© 80:5. HiS Vai Cys teu Arg Gin Mea kÈU Tfcr Phe Phe ©iu 3jys Ala Alá GlU S10 5X5 500 ccc CÍ&C G£G CA© SGC CT© CT& CT© if&e CCA TGT CCC CCC AAC GAC CG© 845 Pr o Bis Uet ©1» Gly liSM LêU Léu ey» Pro Cye Ala Pro Α&Π Assp Arg S25 530 S35 $40 ©GC TSC í£fêK3 ©AS cgc CG© CSC AAC Ifec ATC ©CC CCC AAC TSC ©CG ers 537 Gly cys Gly íS.V\i Arg Ar? A-g Aeô S?hsr lie Pr» A»« Cys AXa Leu .$4§| SSO SíS CCG OT STG 8CC cce AAC TSC CTS GÂG CTO CGS CSC C“?C TSC rrc fec 949 Pio Pr» íVei A.1 iA Pr» AiSK Cys Le« il». l<eu Ar§ Arg Lee Cya oAe Ser sso SOE s?» 11 ΡΕ0914339 SAC CCC CXT $φ$ ASA: TCA CGC CTC QTG GAT TTC ISAC! iiiASKf CAC ?cc CAT llllilli: Asp Leu. Cy® teg Ser Sréjf Leu ii¥&i AS^ Pfee ||M ^s; His Cys Hl 3 SVS 5*0 SS6 iifle ATS OAC: iàtâi Φ4 CÕA ACT T&S iiSCA ACA ÍÍSÍJ !1N :ίΙφ·: AGA JSI |ϋ» Pifo Mec ASp |ι I Leu Oly Thr Cys Ale Thr Qiu |i|n £«r Arg Cys Leu 5S0 SOS !||0· OGA s||i TAC etc SíGC c?a ATT esc ACT cec Aaclliç :|e| AAC VTt GTC ii......""ices Arg Ala Tyr :Lél!ÍS Oly Leu 21« Gly rhv Ala Me?, »r |rC:. Aan Phe Vai SOS 63.0 SIS 620 AGC AAT QTC AAC mc Αί3Τ CTT goc TfA ABC tcclii #3:i CGA AGT 1137 Ser ASíi Vai Asn ipsi): Ser Vai Ala LAU ser cys tfer #S·; Aiè) sily· ser 62S $3© $'33 GGC &AC cte CAG GAS ísas t@T CAA ATt3 CTÍ5 CAA STSC ir|c Nc TOS ipie lios G.ly Aso Leu Gin Slu <33 u £y» ci« iHeç.: Sipu Giyi cly Ha Ser Hiç> 640 iijS4§Í ||#s A&C IÊ® TGC CTC A K» ;«R0 55 cc ATT GCA GCT AAG AtC: CCT ITT CAC AGC 1233 .liilii. ilfv Cyfii Leu iíi§§ Glw Ale ililil Ala Ais Lys 5fet Arg p.he :Hia| ser ¢53 sso 6«5 CAA CTC TTC Ni CA3 :<SAS TGS CvA CAC CCT ACC m ίΐέίϊ'ϊ Ít0·: ATC GCA 1281 Ciíi teu Pfce pgiit 5ia Aej» Trp ÍSv Hl 3 ϊ*ΪΓΟ LLr S?fce 11¾)1 Vai Met Ala S70 $?S 660 CAC CAO iilii GAft AAC ©GT SGVi GTS Ά&9 C«A CAC cec TS® «tc eco TC? 1»3$> Kl a íÇIkí Aa» BlV: Asu Fifô Ai® Vai Arg Pro Cia Pro Tvp Vai Aar «Sb 650 695 ?00 CTT rrc TCC TOC ACS ©ΪΤ ecc «TC AST CT3 CTC CTG ASC CTA T®3 1374 Leu Ser Oya Tbr Leis Pr® Lee Ii* Leu Leu Leu Ser Leu Ϊϊρ 7 OS 710 713

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: BIOGEN, INC.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: LIGANDO RET (RetL) PARA ESTIMULAR O CRESCIMENTO NEURAL E RENAL (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 21

(iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA (A) DESTINATÁRIO Biogen, Inc. (A) RUA: 14 Cambridge Center (B) CIDADE: Cambridge

(C) ESTADO: MA

(C) PAÍS: EUA (D) CÓDIGO POSTAL: 02142 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA DE COMPUTADOR: Patentln Release #1,0,

Versão #1,30 (vi) DADOS DO PEDIDO CORRENTE: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (A) DATA DE ARQUIVO: 07-MAIO-1997 (B) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/999,999 (B) DATA DE ARQUIVO: 01-JAN-1996

(viii) INFORMAÇÃO DO ADVOGADO/AGENTE (A) NOME: Levine, Leslie M. (B) NÚMERO DE REGISTO: 35,245

(C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE ARQUIVO: A008 PCT CIP (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 617-679-2400 (B) TELEFAX: 617-679-2838 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3616 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (ix) CARACTERÍSTICA: ΡΕ0914339 122

(A) NOME/CHAVE: CDS (A) LOCALIZAÇÃO: 257...1660 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: «CGSãçcçCftC GTjreosrceQ mctsaaccc ctgawwscsg gtckocctcí; ceccscTcocs 60

CCCQCCCGGA TCTGAGTCQC TGQCOSCCGT GGOGSGCftSA GCmeSSGGGA GTCTfSCTCtC llllllll - ACCCTGGATC <3AGCTSAAÇT TTâ&GTíXíCC AGftGSAGGec AÔTCÔCCCGG «eATcectsc

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(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGCGAAGGC GACGTCCGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (C) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (D) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA ΡΕ0914339 128 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCTCGTC GCA 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO : 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCGCATC ACA 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1926 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 10..1920 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: 48 3 44 eCQGCCGCC ΛΤΰ ©CS AftQ OCS A&í TCC QGC GCC OCA GõO CTÍS «333 CHS «et Ai* Lys Ala Thr ser eiy Ala aís Ciy Leu 6iy Leu 470 415 460 cm wt cm cm ccs cta em qoa gaa ecc ccs cm osr ctc lar» fcfeu Ftaft Iam- Leu Jhre Leu JLeu Cly Giu Ale **rr» 1-¾¾ Cly Leu 485 450 455 ΨΜ WC TCS AKR «Ar «KJT* Tií? *5® ®*β 0*® rt?» ^ Ser Iíç A«p Ala ,3?jne..Tirjf..eiu Ar^ Leu Tif? Vel A&p Sld Pra SOO SOS SilG«cr aca ccr cr» crc tat otc ca*? gcc cta cce qat occ ccr ®ga 193 129 ΡΕ0914339

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GTCSAC 192$ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:637 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: 132 ΡΕ0914339

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(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA 134 ΡΕ0914339

(ix) CARACTERÍSTICA

(C) NOME/CHAVE: CDS (D) LOCALIZAÇÃO: 1...1038 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: ctq «ãa cmMGWMmc a-csc aga to tca gãt

Leu 04¾ Aep Ser Pr« Tyr 01« Pr? Vai Aa?. s«t bcu S*r A*p ,||lllll||!!il|: j||||||||||||| S4 5- 11111111111111111 A|lliiilliÍ||li||sS: «illllllllillÃm .ΜοίΝΝί' ;|||||||||||i| $6 U* Ph* Arg Vai vai pro Phe ILe ser vai Cl» iíis Ile teo L>ys Gly llllllilllllllllll' iiiiiiiiiilllii llllllpeii 1 li^iliiilíipilpÇí .sipliilliiilÁMí Mi· ctij 144· A.SÍ1 àçrs ϋγ& Leu Asp Ala Ala Lys Ais Cy>- Asm U5ij Asp !ié Cya

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lt?B -'ί^ΚίΕΐϊ^ίδ^^ίΐΓίίίίίίΐ^^^^ TT!®G&SÕC^ 13*3 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: 136 ΡΕ0914339 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 346 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

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(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (A) LOCALIZAÇÃO: 118...1497 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

&GCCGGCCAQ AGCaSOiCAG ÇT81\7C&$fíG ATCGCTQCAT GCISAGCTOC ÇICGKírAAGA gocogogaíx aocccoscôc coocacc COCAQCGGCG OCtCfSOÍSftTÍ ATC CTC CK5 CSCfô ACC CTS TAS Hei: The L# Αλα IIo' TJkt L«0 TyjÈiii Éle cto TCC ofc |p:i OTO aco OCC COA Leu Ser Ala 3£S c:m Vai Ser l§y Giy 37-S iui GAT CÃS TG" CTG Â&& CAO Ser ftsp 38tí Ολη Cy* teu Lys aiu 385 0111 m. ÃGG CAG TGC GTC GCG OGC AAG Leu 395 Ar® 01« C$w V*2 Ais 400 01.y Ly* eec CTâ ΟΑϋ occ AAG GAT GAG TGC Sty Leu Oiu XlA i,ye: 415 AS·® Giu Cys CAO AAO TOO ctc TAC AAC TCC CSC Sirt tys Ser Leu Ty* Asn Cys Ar® gcg CTG CCS CTC Tpiiipp: TTG CX Ala 325 teu Pare pó Lèu Afcy Leis kesí: SAC pife 01« CAT TOO GTO Í|AA.: OCC Asp Ar® Lsè|; A«p Cys VaI :|;?5, li Lys |;Í4 :!§Ρ TGÇ ACC AÓC AACJ TAC $GS ACG iS«r Cysi ||βΚ· Tfcr faf Lys Ty* Arg Thr; CAG ACC AAC TTC AGC CTC GCA TCC Clu Ttir A.*e 433 The Ser Leu Ala Ser 41C CGC AÍS“ P«T ATJS GAG GO. CTG AAQ se« o» Ata «et 01« Ata L*W 415 LyS Tac fiA5 OGG CGT AJO AA5 AAG GAC Cye Lys Ar® Gly Het Lys. Lye Gl» eo 111

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 25...1416 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

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(D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 205...1242 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14:

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(A) NOME/CHAVE: CDS 150 ΡΕ0914339 (B) LOCALIZAÇÃO: 41...1231 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: COCAíiQCACA GCGCTGrCGC ATCCOQGÇCC TCCACCCGOC AT© OC-G CTC TCC TGC >í«t oly Leu Ser 3S5 Try ACC eco CÔA ÇCT CCA N· «ίΑ CTS A\EVJ ATC CK3 CTA C7X5 CTS era TCO ΪΤ0 Με' Ps‘o Arg Ρε(? 355 Pt» Leu Leu K«* XX* .3 δ 3 Leu L«u L«u y»i Le^a 365 Leu TGG CTG CC* rvjw ©GA. CCA ÇÇA AAC TC© c**r ι*»,(»·Λι <<·!*·<* ACA SÀ>3::: AAC A©3 "jvys»· Trp Leu Pr© Ley 370 Siy Ala Gly Aan 37S Ser Ala Tkr ©la 3S0 Asn Arg PM GT3 AAC AGC TGT ACC Ctó SCC ASA AAC AAA iígc OAG SCT AAT CCC CCT V&X Asit 305 S©r cys Tbr ©irs Ala ISO Arg Lys Lyg Cys Glu 39S Ale Aen Src Ala 3©C M<5 GCT <SCC TAC CA3 CAC CTG GC-C TCC TSC ACC TCC AGT TTA AfâC CY« <00 Lys Ala Ala Tyx filii m Fíis Ser Cye 410 Cii? Ser Ser Leu Ser 435 *©G COG CTC CCC TTA CAO «AG T-CT WO ATO CCT GCA CAC 3ÍGC CTA CAC llii iiiPT# Leu íjjjjjijrç:; Leu 420 Gltt ©la Ser Ais «et *as Ser A.l.a Asp Cye Leu 939 ©Iw GÇv'. OCA SAA CAA «f© AÍ3C .AjS:£ ACC TCT ctg .ASA iSAC ICC AG© ΦδίΖ CAT Ala £§§& 'illa e!!; 43S Leu &J?f Asis Sar Ser 440 MU iiiilliiiillss c||| Ars 445 Cys Eia OG© CGC ΊΙΙ' "Mi· CAC CAA SCT ACC TGT W*V v^· :*.*< VV41, ATT; S#li:f©Íi ACC sr? Arg Arg Kec 4SÈ f. ys H is ©1« Ala Tixr 41¾ Cys Leu Asp ZIb Tyr 450 i|rp Tijr vai CAO CCT •OwC CGA asc : CfT OOT Çsç iilACii ϋΰ GaIí ;i;©13C'l|ÍA CCC ΤΑΨ íílV.3 Γϊο 455 Alai Arg Set L<ey; Giy 470 Ar.p Tyr Illa X>au Ai*p 47É i|||tl $cr Pru Tyr CAA ©AC AC Ai CTC ACC ACC AAA ccç tgg AAA A'fC AA? :§ϋ ACCii AAG TTS Glu i.P,ú Atrp «ií Vaz *:*i£ Ser 135 Lvs ?TC ::1¾^ iy®i; Set 490 IAsp Laa ser Lys LírJ 493 AAC AtG C’5C' aaa CCA CAC CCC SAC ctc t©C CTC AAA Τ'ΓΤί' AT© CTC Asn «et Leu tys Psrsj SQ0 Asp j&ar Asp Le« Cy.s 505 Leu Lye ?íi*s Ala Met 510 Lau j/ST ACT CTf CAC GAC AAC «VflT GAC CGC CtÔ CGC ΛΑ£- 'iCC TAC «83© ©AG cys Thx Ueti Jíi.St SIS At)p .Ly* Cy^ Αήρ Arg ssa Leu Arg f y<? Ala lyr 525 Çily GUi 195 247 |ss l||

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 2...94 6 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: C GÓC TAC TGT OAA ACA CCT CAA ÇTÇ AÇS AAC ACC TvT CTS ATA ÚQC 4»

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(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 175...1374 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20:

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Lisboa, 26 de Outubro de 2006

Claims (14)

1. ΡΕ0914339 1 REIVINDICAÇÕES 1. Ácido nucleico isolado codificando um poli-péptido com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NO. 17 e SEQ ID NO: 21, em que o referido polipéptido interage com uma proteína receptora Ret para despoletar a dimerização da proteína receptora Ret ou autofosforilação de um domínio de cinase de tirosina da proteína receptora Ret.
2. 2. Ácido nucleico da reivindicação 1, em que a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado retém pelo menos 80% das cisteínas, quando alinhado com a SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21.
3. 3. Ácido nucleico da reivindicação 1, em que o polipéptido codificado possui pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 21.
4. 4. Ácido nucleico da reivindicação 3, em que o polipéptido codificado é SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 21.
5. 5. Ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 20. 2 ΡΕ0914339
6. 6. Vector compreendendo uma inserção compreendendo o ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5.
7. 7. Célula hospedeira compreendendo o vector de acordo com a reivindicação 6.
8. 8. Método para produzir um polipéptido, compreendendo os passos de: cultivar a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 7; e recuperar o polipéptido expresso a partir da inserção na referida célula hospedeira.
9. 9. Polipéptido codificado pelo ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5.
10. 10. Anticorpo monoclonal isolado que se liga a um polipéptido seleccionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 21.
11. 11. Anticorpo da reivindicação 10, em que o anticorpo se liga ao polipéptido da SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 21.
12. 12. Composição compreendendo: (a) um anticorpo de acordo com as reivindicações 10 ou 11, associado a (b) uma toxina, composto detectável por imagem ou radionuclido. 3 ΡΕ0914339
13. 13. Proteína de fusão compreendendo um poli-péptido de acordo com a reivindicação 9, fundida com uma imunoglobulina, uma toxina, um composto detectável por imagem ou um radionuclido.
14. 14. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, polipéptido de acordo com a reivindicação 9, vector de acordo com a reivindicação 6, anticorpo de acordo com as reivindicações 10 ou 11, composição de acordo com a reivindicação 12, ou proteína de fusão de acordo com a reivindicação 13, para utilização em terapia ou diagnóstico. Lisboa, 26 de Outubro de 2006