CZ296516B6 - Nukleová kyselina kódující ligand c-Ret, polypeptid kódovaný touto nukleovou kyselinou a zpusob jeho prípravy - Google Patents

Abstract

Resení poskytuje cistou a izolovanou molekulu DNA, která kóduje polypeptid mající alespon 80% sekvencní identitu se sekvencí aminokyselin vybranou zeskupiny sestávající z mysího RetL3 (sekvence id. c. 17) a lidského RetL3 (id. c. 21), pricemz polypeptid vytvárí interakci s receptorovým proteinem Ret, která spoustí dimerizaci receptorového proteinu Ret nebo autofosforylaci tyrosinkinázové domény receptorového proteinu Ret. Dále poskytuje polypeptid, který je kódován molekulou DNA a zpusob prípravy tohoto polypeptidu s vyuzitím hostitelských bunek, které exprimují DNA podle vynálezu, vlozenou do hostitelských bunek pomocí vektoru.

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká nukleotidových sekvencí, které kódují ligand Ret (RetL), a příslušného polypeptidu, který je využitelný při léčení nebo diagnostice onemocnění nervových a ledvinných tkání.

Dosavadní stav techniky

Jedním z cílů současného výzkumu buněčné signalizace a receptorové aktivace je umožnit léčebnou modulaci procesů zapojených do buněčného růstu a přežívání. Tyto procesy určují výsledek různých zdravotních stavů, včetně orgánového selhání, vývoje plodu a nádorového růstu, a dalších. Každý z těchto stavů je celosvětově klinicky významný a možnosti účinného léčení jsou omezené. Cílem vynálezu je poskytnout přípravek a způsoby pro podporování regenerace nebo přežívání poškozené tkáně, a také pro léčení poruch zahrnujících odchylný růst a vývoj tkání.

Ztráta tkáně a konečné stádium orgánového selhání zasahují každý rok miliony lidí na celém světě a podstatně přispívají k výdajům na zdravotní péči. Ztráta tkán nebo orgánů se obvykle léčí transplantací orgánů od dárců, chirurgickou rekonstrukcí nebo mechanickými zařízeními. Každý z těchto léčebných postupů má nedostatky. Transplantace je omezena nedostatkem dárců, chirurgická rekonstrukce může vytvořit další dlouhodobé problémy a mechanická zařízení nemohou provádět všechny funkce jednoho orgánu a proto nemohou zabránit postupné degeneraci. Proto existuje reální zdravotní potřeba pro nová řešení těchto problémů.

Proteinové faktory, které ovlivňují růst, diferenciaci a/nebo přežívání buněk, mohou být použitelné při léčení poruch orgánů obsahujících responzivní buňky. Faktory nebo ligandy, které interagují s receptory rodiny proteinového receptoru tyrozinkinázy (RPTK) jsou v tomto ohledu hodné obzvláštního zájmu. Tyto receptory jsou zapojeny v mnoha buněčných programech včetně buněčného růstu a diferenciace včetně geneze mnoha novotvarů. Tak se mohou faktory nebo ligandy, které interagují s těmito receptory, prokázat jako použitelné pro léčení poruch určitých orgánů, při kterých byla poškozená tkáň. Jako alternativa, aby se blokoval růst nádorů, mohou být použitelné pro blokádu interakce těchto faktorů se svými receptory.

Protoonkogen Ret kóduje receptor tyrozinkinázy, které je exprimován během vývoje v různých tkáních, včetně periferního a centrálního nervového systému a ledvin. Abnormality přítomné u myší, které Ret postrádají („ret null mice“), svědčí pro to, že Ret je kritický pro migraci a inervaci střevních neuronů do zadního střeva, a pro proliferaci a větvení epitelu ureterového pupenu během vývoje ledvin (Nátuře 367, 380-383, 1994). Hledání klíčové složky signální dráhy Ret, ligandu Ret, je oblast intenzivního výzkumu.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje purifikovanou a izolovanou molekulu DNA kódující RetL, která má nukleotidovou sekvenci jakéhokoliv RetL, ale specificky zahrnuje cDNA krysího retLl (sekvence s identifikačním číslem (id. č.) 1), částečnou cDNA lidského retLl (sekvence id. č. 8), nezkrácenou cDNA lidského retLl (sekvence id. č. 10), cDNA lidského retL2 (sekvence id. č. 12), cDNA myšího retL3 (sekvence id. č. 16), částečnou cDNA lidského retL3 (sekvence id. č. 18) nebo cDNA lidského retL3 (sekvence id. č. 20). Vynález dále poskytuje protein RetL, s aminokyselinovou sekvencí zahrnující sekvenci krysího RetLl (sekvence id. č. 2), částečnou sekvenci lidského RetLl (sekvence id. č. 9), nezkrácenou sekvenci lidského RetLl (sekvence id. č. 11), lidského RetL2 (sekvence č. 13), myšího RetL3 (sekvence id. č. 19) nebo lidského RetL3 (sekvence id. č. 21).

V dalším provedení vynálezu zahrnuje sekvenci DNA, která obsahuje sekvenci (částečnou cDNA lidského retLl (sekvence id. č. 8)) inzertu DNA klonu HRL20, který má ATCC č. 97604, nebo sekvenci inzertu DNA klonu č. 230-5A-86-17 (cDNA krysího retLl (sekvence id. č. 1)), který má ATCC č. 98047.

V dalším provedení vynálezu má purifikovaná a izolovaná molekula DNA propoužití v bezpečné expresi polypeptidového produktu v prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňce přinejmenším část primární strukturální konformace a biologické aktivity RetL, DNA může být a) molekula DNA, která obsahuje cDNA krysího retLl, částečnou cDNA lidského retLl, nezkrácenou cDNA lidského retLl, cDNA lidského retl2, cDNA myšího retL3 nebo cDNA lidského retL3, nebo komplementární vlákno cDNA krysího retLl, částečné cDNA lidského retLl, nezkrácené cDNA lidského retLl, cDNA lidského retL2, cDNA myšího retL3 nebo cDNA lidského retL3, b) molekuly DNA, které hybridizují za stringentních (přísných) podmínek s molekulami DNA definovanými v a) nebo jejich fragmenty, nebo c) molekuly DNA, které by díky degeneraci genetického kódu hybridizovaly s molekulami DNA definovanými v a) nebo b). Předmětem vynálezu je také purifikovaná a izolovaná molekula DNA kódující polypeptidový fragment nebo variantu lidského RetL mající biologickou aktivitu RetL.

Každá rekombinantní molekula DNA vynálezu může být operativně spojena s expresní kontrolní sekvencí.

Do vynálezu také patří vektoiy a systémy pro podávání, které obsahují molekuly DNA nebo konstrukty definované na jiném místě tohoto popisu. Vektor může obsahovat molekulu DNA kódující RetL nebo jeho variantu.

Vynález zahrnuje prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky trvale transformované nebo transfekované vektorem obsahujícím molekulu DNA kódující nativní RetL nebo jeho variantu.

Purifikovaný a izolovaný lidský RetL v podstatě bez dalších lidských proteinů je specifický pro vynález, a také způsob přípravy polypeptidového produktu, který má částečnou nebo úplnou primární strukturní konformaci a biologickou aktivitu RetL. Takový způsob může zahrnovat kroky pěstování, za vhodných kultivačních podmínek, prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk transformovaných nebo transfekovaných jakoukoliv molekulou DNA podle vynálezu způsobem umožňujícím expresi tohoto polypeptidového produktu, a opětovné získání RetL. Vynález také zahrnuje polypeptidový produkt exprese DNA v prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňce.

Vynález poskytuje také proteiny a proteinové fragmenty, varianty a deriváty, buď rozpustné nebo vázané na membráně. Ve vybraných provedeních má protein aminokyselinovou sekvenci, která zahrnuje krysí RetLl, lidský RetL2, myši RetL3 nebo lidský RetL3 nebo je variantou jedné z těchto sekvencí. V dalších provedeních je protein fúzní protein obsahující Ret nebo RetL, fúzovaný k další molekule nebo molekulovému fragmentu, jako je imunoglobulin, toxin, zobrazovací sloučenina (pro detekci zobrazovacími technikami) nebo radionuklid. Patří sem také chimérické molekuly RetL.

Další provedení vynálezu zahrnuje specifické monoklonální protilátky kRetL podle vynálezu. Tato protilátka může být spojena stoxinem, zobrazovací sloučeninou nebo radionuklidem. Vynález také zahrnuje hybridomové buněčné linie, které produkují specifické protilátky k Ret, včetně AA.FF9, AA.HE3, AF.E9, BA.B1, BB.B6, AA.GE7, CD.F11, AH.E3, CD.G4, AG.E7, BD.G6 a BH.G8, a také subklony těchto hybridomů a protilátky tvořené těmito hybridomy nebo subklony těchto hybridomů.

-2CL 29b51b B6

Vynález dále zahrnuje způsob podporování růstu nové tkáně nebo podporování prožívání poškozené tkáně pacienta, včetně podávání pacientovi léčebně účinné množství sloučeniny, která interaguje s buněčným Ret, a tím indukuje autofosforylaci Ret. Sloučenina může být RetLl, RetL2, nebo RetL3, fragment nezkráceného RetL nebo protilátka, která se váže na Ret. Sloučenina může být podávána současně s léčebně účinným množstvím druhé sloučeniny, jako je GDNF, neurturin nebo molekula příbuzná s GDNF. Zatímco cílové tkáně pro tyto způsoby léčení mohou zahrnovat jakoukoliv tkáň, preferované tkáně zahrnují tkáň ledvin, nervovou tkáň, srdce, žaludek, tenké střevo, míchu nebo plíce. V jednom provedení je RetL rozpustný RetL. Subjektem způsobů léčení může být člověk.

V dalším způsobu podle vynálezu je inhibována signální transdukce (přenos signálu) Ret mezi první buňkou exprimující RetL a druhou buňkou kontaktem první buňky s rozpustným proteinem Ret nebo s protilátkou k RetL. Rozpustný protein Ret může být fúzní protein.

Vynález také zahrnuje způsob cílení toxinu, zobrazovací sloučeniny nebo radionuklidu na buňku exprimující Ret, způsob zahrnuje kontakt buňky s fúzním proteinem RetL nebo protilátkou antiRet konjugovanou stoxinem, zobrazovací sloučeninou nebo radionuklidem. RetL může být RetLl, RetL2 nebo RetL3. V dalším způsobu podle vynálezu je potlačen růst nádorové buňky, která exprimuje Ret, krokem způsobuje kontakt buňky s fúzním proteinem RetL s toxinem nebo radionuklidem, nebo s protilátkou anti-Ret konjugovanou s toxinem nebo radionuklidem. Buňka může přitom být v těle pacienta a protein nebo konjugovaná protilátka se podává pacientovi. Ve vynálezu je také zahrnut způsob cílení toxinu, zobrazovací sloučeniny nebo radionuklidu na buňku exprimující RetL, zahrnující kontakt buňky s fúzním proteinem obsahujícím Ret a toxin, zobrazovací sloučeninu nebo radionuklid, nebo protilátku anti-RetL konjugovanou s toxinem, zobrazovací sloučeninou nebo radionuklidem. Další provedení zahrnuje způsob potlačení růstu nádorové buňky, která exprimuje RetL, způsob obsahuje kontakt buňky s fúzním proteinem Ret s toxinem nebo radionuklidem, nebo s protilátkou anti-RetL konjugovanou s toxinem nebo radionuklidem, přitom buňka může být v těle pacienta a protein nebo konjugovaná protilátka se podává pacientovi. RetL pro kterýkoliv za způsobů vynálezu může být RetLl, RetL2 nebo RetL3, nebo varianta či fragment RetLl, RetL2 nebo RetL3.

Vynález dále poskytuje způsoby genové terapie. Jedno provedení je způsob léčení pacienta s poruchou metabolismu Ret, zahrnující podávání pacientovi vektor obsahující molekulu DNA kódující RetL, a také způsob podporování růstu nové tkáně v těle pacienta, zahrnující podávání takového vektoru pacientovi. Další provedení zahrnuje způsob podporování přežívání poškozené tkáně v těle pacienta, jedním krokem způsobuje podávání terapeuticky účinného množství vektoru kódujícího RetL pacientovi.

Popis obrázků

Obrázek 1 je sekvence cDNA (sekvence id. č. 1) a zní odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 2) krysího RetLl. Nukleotidová sekvence zasahuje od páru bází 201 po pár bází 1700 se sekvence id. č. 1 a obsahuje celý otevřený čtecí rámec.

Obrázek 2A je částečná sekvence cDNA (sekvence id. č. 8) a z ní odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id č. 9) lidského RetLl. Tato sekvence je ta, která je vložena do klonu HRL20, deponovaného jako ATCC č. 97604.

Obrázek 2B je složená úplná sekvence DNA (sekvence id. č. 10) a odvozené aminokyselinové sekvence (sekvence id. č. 11) lidského RetLl.

Obrázek 3A je srovnání nukleotidové sekvence lidského RetLl (horní řádek sekvence) skrysi sekvencí RetLl (spodní řádek sekvence). Vertikální řádky mezi nukleotidy ukazují identitu v dané pozici, zatímco tečka vyznačuje v této pozici mezeru.

-3CZ 296516 B6

Obrázek 3B je srovnání aminokyselinové sekvence lidského RetLl (homí řádek sekvence) s krysí sekvencí RetLl (spodní řádek sekvence). Vertikální řádky mezi odpovídajícími aminokyselinami ukazují ve zbytku identitu, zatímco tečka vyznačuje v tomto zbytku konzervativní substituci.

Obrázek 4A je schematické zobrazení možné role pro Ret a RetL v interakci nebo metanefrogenní mezenchymovou buňkou a buňkou ureterového pupenu.

Obrázek 4B je schematické zobrazení způsobu testování transfektant z knihovny cDNA na přítomnost kloubů, které exprimují RetL. Přítomnost exprimovaného RetL u transfektant je detekována stanovením vazby těchto transfektant buď na fuzní protein Ret/IgG nebo fuzní protein Ret/alkalická fosfatáza.

Obrázek 5 je schematické zobrazení ukazující konstrukci plazmidů použitých k expresi lidského fuzního proteinu Ret/IgG.

Obrázek 6 je schematické zobrazení ukazující konstrukci plazmidů použitých k expresi lidského fuzního proteinu Ret/IgG.

Obrázek 7 je sekvence cDNA (sekvence id. č. 12) a odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 13) lidského RetL2 v klonu DSW240. Proteinový čtecí rámec je obsažen mezi nukleotidy 25 až 1416.

Obrázek 8 je srovnání aminokyselinové sekvence lidského RetL2 (homí řádek sekvence) se sekvencí lidského RetLl (spodní řádek sekvence). Vertikální řádky mezi aminokyselinami ukazují identitu v dané pozici, zatímco tečka vyznačuje v téže pozici mezeru.

Obrázek 9 je sekvence cDNA (sekvence id. č. 16) a zní odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 17) myšího RetL3.

Obrázek 10 je sekvence cDNA (sekvence id. č. 20) a zní odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 21) lidského RetL3.

Podrobný nopis vynálezu

Identifikační čísla sekvencí

Nukleotidovým a aminokyselinovým sekvencím zmiňovaným ve specifikaci byla dána následující identifikační čísla (id. Č.) sekvencí:

sekvence id. č. 1 - cDNA krysího retLl sekvence id. č. 2 - aminokyselinová sekvence krysího retLl sekvence id. č. 3 - oligomer kid-13 sekvence id. č. 4 - oligomer kid-14 sekvence id. č. 5 - oligomer kid-15 sekvence id. č. 6 - cDNA extracelulámího krysího ret sekvence id. č. 7 - aminokyselinová sekvence krysího Ret sekvence id. č. 8 - částečná cDNA lidského retLl sekvence id. č. 9 - částečná aminokyselinová sekvence lidského RetLl sekvence id. č. 10 - cDNA lidského retLl sekvence id. č. 11 - aminokyselinová sekvence lidského RetLl

-4sekvence id. č. 12 - cDNA lidského retL2 sekvence id. č. 13 - aminokyselinová sekvence lidského RetL2 sekvence id. č. 14 - částečná cDNA myšího retL3 (EST AA 50083) sekvence id. č. 15 - částečná aminokyselinová sekvence myšího RetL3 sekvence id. č. 16 - cDNA myšího retL3 sekvence id. č. 17 - aminokyselinová sekvence myšího RetL3 sekvence id. č. 18 - částečná cDNA lidského retL3 sekvence id. č. 19- částečná aminokyselinová sekvence lidského RetL3 sekvence id. č. 20 - cDNA lidského retL3 sekvence id. č. 21 - aminokyselinová sekvence lidského RetL3

Definice termínů

V popisu vynálezu termín „RetL“ znamená každý protein, který specificky interaguje s receptorovým proteinem Ret, a který, když interaguje s Ret, spouští dimerizaci Ret a/nebo autofosforylaci tyrozinkinázové domény Ret. Sekvence DNA, které kódují RetL a Ret, jsou nazývány „retL“ a „ret“, v uvedeném pořadí. Ligand může být rozpustný, nebo přítomný jako molekula navázaná na membránu a na téže nebo jiné buňce, jako je molekula Ret, pro kterou spouští autofosforylaci. Při určitých použitích nebo interakcích s Ret, může ligand vyžadovat ke spouštění autofosforylace další molekuly. Ligandy vynálezu zahrnují společné receptory nebo přídatné kofaktory ligandu. Ligandy vynálezu dále zahrnují monoklonální protilátky (mAbs) anti-Ret, které působí jako antagonisté Ret spouštějící dimerizaci a autofosforylaci Ret. Ligand může být také různými způsoby modifikován, například inkorporován jako část fuzního proteinu, například s toxinem nebo radionuklidem.

„Porovnáním sekvencí“ se míní srovnání pozic jedné sekvence, buď nukleotidové nebo aminokyselinové, s další sekvencí, aby se umožnilo srovnání sekvence relevantních částí jedné s toutéž částí druhé. Příklad této metody popsal Needleman et al. (J. Mol. Biol., 48, 443-453, 1970). Metoda může být použita pohodlně počítačovými programy jako je program Align (DNAstar, lne.). Odborníkům je známo, že homologní nebo funkčně ekvivalentní sekvence zahrnují funkčně ekvivalentní uspořádání cysteinových zbytků v konzervovaném cysteinovém skeletu, včetně aminokyselinových inzercí nebo delecí, které poměňují lineární uspořádání těchto cysteinů, ale podstatně nemění svůj vztah ve složené (uspořádané) struktuře proteinu. Pro vnitřní mezery a aminokyselinové inzerce v uvažované sekvenci jsou ignorovány za účelem kalkulace stupně sekvenční homologie aminokyselinové sekvence nebo identity mezi uvažovanou a referenční sekvencí. Jedna charakteristika často používaná při stanovení homologie proteinů je podobnost počtu a lokaliziace cysteinových zbytků mezi jedním a druhým proteinem.

„Klonováním“ se míní použití in vitro rekombinantních technik pro vložení konkrétního genu nebo jiné sekvence DNA do molekuly vektoru. Aby se požadovaný gen mohl úspěšně klonovat, je nezbytné použít metody pro vznik fragmentů DNA, pro spojování fragmentů s molekulami vektoru, pro zavedení složené molekuly DNA do hostitelské buňky, ve které se může replikovat, a pro výběr klonu, který obsahuje cílový gen, z příjemcových hostitelských buněk.

„cDNA“ se míní komplementární DNA nebo kopie DNA tvořená z templátu RNA činností DNA polymerázy závislé na RNA (reverzní transkriptázy). Tedy „klon cDNA“ znamená dvojitou sekvenci DNA komplementární ke zkoumané molekule RNA nesenou v klonovacím vektoru.

„Knihovou cDNA“ se míní soubor rekombinantních molekul DNA obsahujících inzerty DNA, které dohromady reprezentují úplný souboru molekul RNA přítomných v celém organismu nebo tkáni, v závislosti na zdroji templátů RNA. Taková knihovna cDNA může být připravena způsoby odborníkům známými, jak jsou popsány např. vManiatis et al., Molecular Cloning: A Labora

-5CZ 296516 B6 tory Manual, výše. Obecně se RNA nejdříve izoluje z buněk organismu, z jehož genomu je žádoucí klonovat konkrétní gen. Pro tento účel jsou podle předkládaného vynálezu výhodně savčí, a obzvláště lidské, buněčné linie. Jako alternativa může být RNA izolována z národové buňky, pocházející ze zvířecího nádoru, a výhodně z lidského národu. Tak může být připravena knihovna například z lidského nádoru nadledvinek, ale může být použit jakýkoliv nádor.

Termín „polymorfismus DNA“ se týká stavu, kdy mohou existovat dvě nebo více odlišných nukleotidových sekvencí v konkrétním místě v DNA.

„Expresní vektor“ popisuje vektory, které jsou schopné exprese sekvencí DNA v nich obsažených, tj. kódující sekvence jsou operativně spojeny s dalšími sekvencemi schopnými uskutečnit jejich expresi. Je jasné, ačkoliv ne vždy vyjádřeno explicitně, že tyto expresní vektory musí být replikovatelné v hostitelském organismu buď jako episomy nebo jako integrální část chromozómové DNA. Užitečný, í když ne nezbytný, prvek účinné exprese vektoru je sekvence kódující markér - značku, což je sekvence kódující protein, který má za následek určitou fenotypovou vlastnost (např. tetracyklinovou rezistenci) buněk protein obsahujících, což umožňuje, že tyto buňky jsou snadno identifikovatelné. Tedy termín „expresní vektor“ je dán funkční definicí a jakákoliv sekvence DNA, která je schopná uskutečnit expresi specifického obsaženého DNA kódu je v tomto termínu zahrnuta, jak je to aplikováno na sekvence v tomto popisu. Tyto vektory jsou často ve formě plazmidů, takže „plazmid“ a „expresní vektor“ jsou často používány zaměnitelně. Avšak vynález zahrnuje i další formy expresních vektorů, včetně fága, které mají ekvivalentní funkci a které jsou v oboru známé.

Podobně „funkční derivát“ genu kteréhokoliv z proteinů podle předkládaného vynálezu zahrnuje „fragmenty“ „varianty a „analogy“ genu, které mohou být „podstatně podobné“ v nukleotidové sekvenci, a které kódují molekulu mající podobnou aktivitu.

„Molekula příbuzná GDNF“ znamená každou molekulu, která je alespoň ze 40 % homologní s buď GNDF nebo neurturinem, a je také schopna specificky vázat RetL.

Termín „gen“ znamená polynukleotidovou sekvenci kódující peptid.

„Homogenním“ se míní při odkazu na peptidovou nebo DNA sekvenci, že primární molekulární struktura (tj. sekvence aminokyselin nebo nukleotidů) v podstatě všech molekul přítomných v daném přípravku je totožná.

Termín „oligonukleotid“, jak se zde používá pro molekulové sondy DNA, oligomerové fragmenty, které mají být detekovány, oligomerové kontroly, neznačené blokující oligomery a příměry pro amplifikaci sekvencí DNA, je definován jako molekula složená z více než tří deoxyribonukleotidů nebo ribonukleotidů. Přesná velikost oligonukleotidu závisí na mnoha faktorech, které zase závisí na konečné funkci nebo použití oligonukleotidu.

Termín „sonda“ obecně označuje ligand známých kvalit schopný selektivní vazby na cílový antiligand. Při aplikaci na nukleové kyseliny se termín „sonda“ týká vlákna nukleové kyseliny, která má sekvencí bází komplementární k cílovému vláknu.

Termín „rekombinantní hostitelské buňky“ se týká buněk, které byly transformovány vektory konstruovanými za použití technik rekombinantní DNA. Jak je zde definováno, protilátka nebo její modifikace tvořená rekombinantní hostitelskou buňkou je výsledkem této transformace, neboť netransformovaný hostitel by tvořil spíše malá množství, menší než detekovatelná.

Termíny „restrikční endonukleáza“ a „restrikční enzym“ se týkají bakteriálních enzymů, každý z nich štěpí dvojvláknovou DNA ve specifické nukleotidové sekvenci nebo blízko ní.

-6CZ 296516 B6

Termín „polymorfismus délky restrikčních fragmentů“ („RFLP“) se týká odlišností mezi jednotlivci v délce konkrétního restrikčního fragmentu.

O molekule se říká, zeje „podstatně podobná“ jiné molekule, jestliže je sekvence aminokyselin v obou molekulách v podstatě stejná, a jestliže obě molekuly mají podobnou biologickou aktivitu. Tak za předpokladu že dvě molekuly mají podobnou aktivitu, se považují za varianty, jak je tento termín používaný zde dokonce i když jedna z molekul obsahuje další aminokyselinové zbytky nenalezené v druhé, nebo když sekvence aminokyselinových zbytků není totožná. O molekule se říká, zeje „chemický derivát“ jiné molekuly, když obsahuje další chemické skupiny, které normálně nejsou částí molekuly. Takové skupiny mohou zlepšit molekulovou rozpustnost, absorpci, biologický poločas atd. Skupiny mohou alternativně snižovat toxicitu molekuly, eliminovat nebo zeslabovat každý nežádoucí vedlejší účinek molekuly atd. Skupiny schopné zprostředkovat takové účinky jsou popsány například v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 16. vyd., Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1980.

„Vektorem“ se míní molekula DNA, odvozená z plazmidu nebo bakteriofága, do které mohou být vloženy nebo klonovány fragmenty DNA. Vektor obsahuje dvě nebo více jedinečných restrikčních míst, a je schopen autonomní replikace v definovaném hostiteli nebo nosičském organismu tak, že klonovaná sekvence je reprodukovatelná.

Termínem „v podstatě čistý“ se míní každý protein podle předkládaného vynálezu nebo každý gen kódující takový protein, který je v podstatě bez dalších proteinů nebo genů, nebo bez jiných kontaminujících sloučenin, se kterými může být normálně nalezen v přírodě, a jako takový existuje ve formě v přírodě nenalezené.

Sloučeniny podle vynálezu

Vynález zahrnuje cDNA kódující RetL, jako je nukleotidová sekvence cDNA krysího retLl, částečná cDNA lidského retLl, nezkrácená cDNA lidského retLl, cDNA lidského retL2, cDNA myšího retL3 nebo cDNA lidského retL3. Kromě toho sloučeniny vynálezu zahrnují sekvence, které obsahují výše uvedené sekvence nebojsou deriváty jedné z těchto sekvencí. Vynález také zahrnuje vektory, lipozomy a další vehikula vhodná pro přenos, která obsahují jednu z těchto sekvencí nebo derivát jedné z těchto sekvencí. Vynález také zahrnuje proteiny transkribované a translatované z cDNA krysího retLl, částečné cDNA lidského retlLl, úplné cDNA lidského retLl, cDNA lidského retL2, cDNA myšího retL3 nebo cDNA lidského retL3, což zahrnuje, ale není omezeno na, krysí RetLl, částečnou sekvenci lidského RetLl, úplný lidský RetLl, lidský RetL2, myší RetL3 nebo lidský RetL3, a jejich deriváty a varianty.

Jedno provedení vynálezu se týká rozpustné varianty RetL. Rozpustné varianty postrádají přinejmenším úsek intramembránové části nativního RetL. V některých příkladech rozpustná varianta postrádá fosfatidylinozitolglykanovou vazbu nativního RetL. Rozpustné varianty zahrnují fúzní proteiny, které obsahují deriváty RetL, které postrádají fosfatidylinozitolový motiv.

Varianty se mohou lišit od přirozeně se vyskytujícího RetL v aminokyselinové sekvenci nebo způsobem, který nepostihuje sekvenci, nebo oběma možnostmi. Varianty v aminokyselinové sekvenci se tvoří, když je jedna nebo více aminokyselin v přirozeně se vyskytujícím RetL substituována odlišnou přirozenou aminokyselinou, derivátem aminokyseliny nebo jinou než nativní aminokyselinou. Obzvláště výhodné varianty zahrnují přirozeně se vyskytující RetL nebo biologicky aktivní fragmenty přirozeně se vyskytujícího RetL, jejichž sekvence se liší od sekvence divokého typu substitucemi jedné nebo více konzervativní aminokyseliny, které mají typicky minimální vliv na sekundární strukturu a hydrofobní povahu proteinu nebo peptidu. Varianty mohou také mít sekvence, které se liší substitucemi, delecemi nebo inzercemi jedné nebo více nekonzervativní aminokyseliny, které neruší biologickou aktivitu RetL. Konzervativní substituce typicky zahrnují substituce jedné aminokyseliny druhou s podobnými vlastnostmi uvnitř následujících skupin: valin, glycin; glycin, alanin; valin, isoleucin; kyselina aspartová, kyselina glutamo

-7CZ 296516 B6 vá; asparagin, glutamin; serin, threonin; lysin, arginin; a fenylalanin, tyrosin. Nepolární (hydrofobní) aminokyseliny zahrnují alanin, leucin, isoleucin, valin prolin, fenylalanin, tryptofan amethionin. Polární neutrální aminokyseliny zahrnují glacin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. Pozitivně nabité (bazické) aminokyseliny zahrnují arginin, lysin a histidin. 5 Negativně nabití (kyselé) aminokyseliny zahrnují kyselinu aspartovou a kyselinu glutamovou.

Další konzervativní substituce mohou být vybrány z následující tabulky, a ještě další popsal Dayhoff v Atlas of Protein Sequence and Structireu (1988).

Tabulka 1: Náhrady konzervativních aminokyselin

Aminokyselinu	Kód	Nahraď jakoukoliv z:
Alanin	A	D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginin	R	D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Om, D-Orn
Asparagin	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Kyselina aspartová	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin D-Gln
Cystein	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamin	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Kyselina glutamová	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycin	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Beta-ala, Acp
Isoleucin	I	D-He, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucin	L	D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met
Lysin	K	D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-He, Om, D-Om
Methionin	M	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu
Fenylalanin	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans 3,4 or 5-fenylprolin cis 3,4 or 5-fenylprolin
Prolin	P	D-Pro, kyselina L-I-thioazo lidin-4-karboxylová kyselina Dnebo L-l-oxazolidin—4—karboxylová
Serin	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Threonin	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met)O, D-Met(O), Val, D-Val
Tyrosin	Y	D-Tyr, Phe, L-Dopa, His, D-His
Valin	v	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

Další varianty vynálezu jsou takové modifikace, které zvyšují peptidovou stabilitu. Tyto varianty mohou obsahovat například jednu nebo více nepeptidových vazeb (které nahrazují peptidové vazby) v sekvenci peptidu. Patří sem také varianty, které obsahují zbytky jiných než přirozeně se vyskytujících L-aminokyselin, jako jsou D-aminokyseliny nebo aminokyseliny nevyskytující se přirozeně či syntetické aminokyseliny, jako jsou beta nebo gamma aminokyseliny a cyklické varianty. Inkorporace D- místa L- aminokyselin do polypeptidů může zvýšit jeho rezistenci 20 k proteázám. Viz například patent USA 5 219 990.

Peptidy podle vynálezu mohou být také modifikovány různými změnami, jako jsou inzerce, delece a substituce, a to buď konzervativní nebo nekonzervativní, pokud takové změny mohou poskytnout určité výhody při jejich použití. Ve vynálezu jsou specificky zahrnuty také sestřihové 25 („splice“) varianty.

Kromě peptidů v podstatě nezkrácených poskytuje předkládaný vynález biologicky aktivní fragmenty polypeptidů. Polypeptid RetL nebo fragment je biologicky aktivní, jestliže projevuje biologickou aktivitu přirozeně se vyskytujícího RetL. Tyto biologické aktivity zahrnují schopnost

-8CZ zy&51(> B6 specificky vázat extracelulámí část Ret s afinitou, která je alespoň 50%, a výhodně je alespoň stejná, jako afinita přirozeně se vyskytujícího RetL, pro extracelulámí část Ret. Další biologická aktivita je schopnost vázat se na protilátku, která je namířena proti epitelu, který je přítomný na přirozeně se vyskytujícím RetL.

V dalších provedeních také varianty se substitucemi aminokyselin, které jsou méně konzervativní, mohou poskytnou požadované deriváty, např. způsobem změn v náboji, konformaci a dalších biologických vlastnostech. Tyto substituce by zahrnovaly například substituci hydrofilního zbytku hydrofobním, substituci cysteinu nebo prolinu jiným zbytkem, substituci zbytku, který má malý postranní řetězec zbytkem s rozsáhlým postranním řetězcem, nebo substituci zbytku, který má čistý pozitivní náboj zbytkem s čistým negativním nábojem. Když nemůže být výsledek dané substituce s jistotou předpovězen, mohou být deriváty snadno otestovány způsoby zde popsanými pro určení výskytu nebo chybění požadovaných vlastností.

Obecně substituce, u kterých se očekává, že vyvolají změny ve funkčních vlastnostech polypeptidů Ret, jsou ty, ve kterých:

I) hydrofílní zbytek, např. serin nebo threonin, je nahrazen hydrofobním zbytkem, např. leucinem, isoleucinem, fenylalaninem nebo alaninem,

Π) cysteinový zbytek je nahrazen j akýmkoliv j iným zbytkem nebo nahradí j akýkoliv zbytek,

ΙΠ) zbytek, který má elektropozitivní postranní řetězec, např. lysin, arginin nebo histidin, nahradí zbytek (nebo je nahrazen zbytkem), který má elektronegativní náboj, např. kyselina glutamová nebo kyselina aspartamová, nebo

IV) zbytek, který má rozsáhlý postranní řetězec, např. fenylalanin, nahradí zbytek (nebo je nahrazen zbytkem), který takový postranní řetězec nemá, např. glycin.

Varianty podle vynálezu zahrnují proteiny a peptidy s aminokyselinovými sekvencemi, které mají přinejmenším šedesát procent homologie se sekvencí krysího RetLl (sekvence id. č. 2), částečnou sekvenci lidského RetLl (sekvence id. č. 9), částečnou sekvenci lidského RetLl (sekvence id. č. 9), nezkrácenou sekvenci lidského RetLl (sekvence id. č. 11), lidského RetL2 (sekvence id. č. 13), myšího RetL3 (sekvence id. č. 17), částečnou sekvenci lidského RetL3 (sekvence Id. č. 19) nebo lidského RetL3 (sekvence id č. 21). Výhodněji je sekvenční homologie alespoň osmdesát, alespoň devadesát nebo alespoň devadesát pět procent. Pro účely určování homologie je obecně délka srovnávaných sekvencí alespoň 8 aminokyselinových zbytků, obvykle alespoň 20 aminokyselinových zbytků. Varianty sloučenin vynálezu také zahrnují každý protein, který

1) má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze čtyřiceti procent homologní k proteinu RetL vynálezu, a také která

2) při optimální shodě se sekvencí RetL (jak je zobrazeno pro RetLl a RetL2 na obrázku 8), má alespoň 80 % svých cysteinových zbytků ve shodě s cysteiny v proteinu RetL vynálezu.

Právě tak, jak je možné nahradit substituenty kostruje také možné substituovat funkční skupiny, které jsou navázány na kostře, skupinami charakterizovanými podobnými vlastnostmi. Takové modifikace nemění primární sekvenci. Tyto budou zpočátku konzervativní, tj. skupina, která nahrazuje, bude mít přibližně stejnou velikost, tvar, hydrofobnost a náboj jako původní skupina. Nesekvenční modifikace mohou zahrnovat například in vivo nebo in vitro chemickou derivatizaci částí přirozeně se vyskytujícího RetL, a také změny v acetylaci, metylaci, fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci.

-9CZ 296516 B6

Vynález se také týká látek, které se specificky vážou na protein vynálezu nebo fragment takového proteinu. Tyto látky zahrnují fuzní proteiny Ig a protilátek (včetně jednoduchého řetězce, dvojitého řetězce, fragmentů Fab, a jiných protilátek, ať už nativních, humanizovaných, primatizovaných nebo chimérických). Další popisy těchto skupin látek lze najít k přihlášce PCT 5 95/16709, na jejíž popis se zde odkazujeme.

Příklady provedení vynálezu ío Experimentální postupy

Přehled strategie

Všeobecná strategie použitá ke klonování RetLl je ukázána na obrázcích 4A a 4B. Naše strategie 15 byla založena na předpokladu, že RetL je přinejmenším exprimován v metanefrogenním mesenchymu vyvíjející se ledviny jako membránový protein (ačkoliv je možné, že ligand je také exprimován v rozpustné formě, obrázek 4A). RetL interaguje s receptorem Ret na buňce ureterového pupenu, aktivuje její cytoplazmatickou doménu tyrozinkinázy a posílá jádru signál, který následně aktivuje geny zapojené do růstu a větvení ureterového pupenu. Proto proteiny obsahující 20 extracelulámí doménu Ret fúzovanou buď k části Fc lidského imunoglobulinu G1 (IgGl) nebo alkalické fosfatázy (AP) mohou být použity jako část strategie ke klonování RetL, jak je ukázáno na obrázku 4B. Fúzní proteiny, expresní knihovny a další reagencie použité při klonování RetLl jsou popsány níže.

Nejdříve jsme izolovali cDNA krycího RetLl, a poté ji použili jako sondu pro izolaci cDNA lidského RetLl. Následně byla izolována cDNA pro RetL2 a RetL3.

Příprava reagencií požadovaných pro přímé expresní klonování ligandů Ret

1. Izolace cDNA kódující extracelulámí doménu krysího Ret

Pro identifikaci RetLl byly vytvořeny fuzní proteiny, které se skládaly z extracelulámích domén buď krysího nebo lidského Ret fúzovaných k proteinu, a sice části Fc lidského IgGl v jednom příkladu, a alkalické fosfatáze v jiném příkladu. Obě fuzní partnerské molekuly mohou být snad35 no testovány na detekci buněk, které exprimují ligand, jak je vyznačeno na obrázku 4B.

Protože cDNA kódující krysí Ret nebyla nikdy objevena, izolovali jsme cDNA kódující extracelulámí doménu krysího receptoru Ret za použití metody užívající reverzní transkriptázu s následnou polymerázovou řetězovou reakcí (RT-PCR). Srovnali jsme nukleotidové sekvence pro 40 lidský (přístupová čísla v Genbank M57464 a XI5262) a myší (přístupové číslo Genbank x67812) ret a navrhli oligonukleotidové příměry pro oblasti s vysokou identitou mezi těmito dvěma sekvencemi. „Sensa“ oligomer (souhlasný se směrem transkripce), nazvaný kid-013 (sekvence id. č. 3, obsahuje nukleotidy 150-169 ze sekvence z Genbank č. X15262) je vybrán z 5'-konce lidské sekvence cDNA ret, která překrývá iniciační kodon ATG. Na svém 5'-konci zahrnuje 45 nukleotidy kódující restrikční místo Notl pro účel klonování. Dva „antisense“ oligomery (orientované proti směru transkripce), nazvané kid-014 (sekvence id. č. 4, obsahuje komplementární sekvenci nukleotidů 1819 až 1839 ze sekvence Genbank č. M57464) a kid-015 (sekvence id. č. 5, obsahuje komplementární sekvenci nukleotidů 1894 až 1914 ze sekvence Genbank č. X67912) jsou vybrány, v uvedeném pořadí, z lidské a myší sekvence cDNA bezprostředně souvi50 sející s 5'-koncem sekvencí, které kódují transmembránové domény. Oligomery kid-014 a kid015 obsahují přídatné nukleotidy na svých 5-koncích, které kódují restrikční místo Sáli pro účely klonování.

Celková RNA se izolovala z krysí ledviny 14 denního embrya a mRNA se purifíkovala za použití 55 oligo-dT chromatografíe. mRNA se přeměnila na cDNA za použití reverzní transkriptázy AMV

-10CZ 296516 B6 a cDNA se přeměnila na dvojvláknovou cDNA a amplifikovala se za použití polymerázy Taq ve standardní polymerázové řetězové reakci soligomery kid-013 a kid—015. Syntéza fragmentu PCR o velikosti 1942 bp byla potvrzena analýzou alikvotu z reakce PCR na 1% agarózovém gelu. Zbytek PCR fragmentu se štěpit Notl a Sáli a klonoval se do pSAB132 předem naštěpeného Notl a Sall. Výsledný plazmid byl nazván pJCOl 1. Celý inzert plazmidu pJCOl 1 obsažený mezi místy Notl a Sáli se sekvencoval a je zde uveden jako extracelulámí cDNA krysího ret, sekvence s id. č. 6. Translace této sekvence poskytla peptidovou sekvenci (sekvence id. č. 7) pro extracelulámí krysí Ret. Protože oligomery pro PCR byly vybrány z lidské a myší sekvence ret, je možné, že nukleotidová sekvence uvedená jako sekvence extracelulámí cDNA krysího ret a peptidová sekvence uvedená jako sekvence extracelulámího krysího Ret, se mohou lišit od přirozené nukleotidové sekvence krysího ret a peptidové sekvence Ret v oblastech sekvencí kid-013 a kid015. Následně byly izolovány klony krysí cDNA ret z knihovny cDNA z 18 denních krysích ledvin a bylo pozorováno několik nukleotidových změn v oblastech primerů, které mají za následek dvě změny aminokyselin. Jednaje v signální sekvenci (arginin v pozici 5 na threonin) a jedna změna je blízko konce extracelulámí domény (kyselina glutamová v pozici 633 na alanin). Obě tyto změny by neměly ovlivnit vazbu ligandu.

2. Fúzní proteiny Ret/IgG

Byly vytvořeny fúzní proteiny, které se skládaly z extracelulámí domény krysího (aminokyselinové zbytky 1 až 637) a lidského (aminokyselinové zbytky 1 až 636) receptoru Ret fúzovaného k části Fc lidského IgGl.

Konstrukce plazmidů používaných k expresi krysího fúzního proteinu Ret/IgG je ukázána schematicky na obrázku 5. Pro konstrukci genu kódujícího krysí fuzní protein Ret/IgG, jsme štěpili pJCOl 1 (popsaný výše), obsahující extracelulámí doménu krysího Ret, se Sall, a ligovali jsme ho k fragmentu Sall o velikosti 700 bp z plazmidu 2-4, a vytvořili jsme plazmid pJCOl 2. Tento fragment Sall obsahuje část domény Fc lidského IgGl pocházejícího původně z plazmidu pSAB144. Plazmid 2-4 byl vytvořen předem třístupňovou ligací: fragment Notl-Sall vzniklý metodou PCR obsahující extracelulámí doménu králičího receptoru TGF-beta typu Π; Notl-Sall fragment o velikosti 693 bp zpSAB144 obsahující část domény Fc lidského IgGl; a pSAB132 štěpený Notl. Jak je ukázáno na obrázku 5, fragment obsahující doménu Fc může být uvolněn z plazmidu 2-4 jako fragment Sall o velikosti 700bp. pJCOl2 byl transfekován do buněk COS a krysí fúzní protein Ret/IgG byl purifikován ze živného média 48 hodin později za použití chromatografie na Sepharose protein-A. Aby se vytvořila stabilní buněčná linie produkující protein Ret/IgG, byl izolován fragment Notl o velikosti 2612 bp z pJCOl2 obsahující celý krysí fúzní protein Ret/IgG a byl klonován do místa Notl expresního vektoru pMDR901. Výsledný plazmid byl nazván pJC022. Plazmid pJC022 pak byla transfekován do buněk CHO, aby vznikly stabilní buněčné linie. Nejvíce produkující buněčná linie byla upravena na suspenzní kulturu. Typické zisky pro linii CHO krysího Ret/IgG jsou 75 mg/1.

Konstrukce plazmidů užitých k expresi lidského fúzního proteinu Ret/IgG je schematicky ukázána na obrázku 6. Aby se vytvořil gen kódující lidský fuzní protein Ret/IgG, získali jsme plazmid obsahující cDNA kódující lidský receptor Ret od Dr. M. Takahashino (Department of Pathology, Nagoya University, Scholl of Medicine, Nagoya, Japonsko). Z tohoto plazmidu vznikl fragment PCR za použití oligomerů kid-013 a kid—014. PCR fragment byl ošetřen enzymem Klenowovým fragmentem, pak následovala digesce s Notl za vzniku PCR fragmentu s lepivým koncem Not I a jedním tupým koncem. Tento fragment byl klonován do vektoru pGEMl 1 zf(+) předem naštěpeného EcoRI, ošetřeného Klenowovým fragmentem a naštěpeného Notl, aby se vytvořil lepivým konec Notl a jeden tupý konec. Výsledný plazmid byl nazván pJCOl 3. Fragment Notl-Sall o velikosti 1916 bpd z pJCOl3 byl izolován po kompletním štěpení s Notl a částečném štěpení se Sall a ligován k fragmentu Sall-Notl o velikosti 693 bp z pSAB144 obsahujícím část domény Fc lidského IgGl a k expresnímu vektoru pSAB132 naštěpenému Notl. Výsledný plazmid byl nazván pJC015. Inzert v plazmidu pJC013 byl sekvencován a zjistilo se, že obsahuje jednu nukleotidovou odchylku, která mění jednu aminokyselinu v extracelulámí doméně lidského Ret

-11 CZ 296516 B6 (sekvence z Genbank M57464 má C v pozici 812, zatímco pJC013 má T v odpovídající pozici, to má za následek změnu aminokyselin z alaninu na valin v pozici 294 proteinové sekvence lidského Ret). Tento nukleotid byl zpětně opraven na zbytek C specifikovaný sekvencí z Genbank č. M57464 místně cílem mutagenezí plazmidu PJC013, čímž byl vytvořen plazmid pJC023. Byl izolován fragment BstE2 o velikosti 585 bp zpJC023 obsahující opravenou nukleotidovou sekvenci a zaklonován do plazmatu pJC015, ze kterého byl odstraněn fragment BstE2 o velikosti 585 bp obsahující variantní nukleotid. Nový plazmid byl nazván pJC024. Byl izolován fragment Notl o velikosti 2609 bp z pJC024 obsahující celý lidský fuzní protein Ret/IgG a byl zaklonován do místa Notl expresního vektoru pMDR901. Výsledný plazmid byl nazván pJC025. Plazmid pJC025 byl transfekován do buněk CHo, aby vznikly stabilní buněčné linie. Nejvíce produkující buněčná linie byla upravena na suspenzní kulturu. Typické zisky pro linii CHO lidského Ret/IgG jsou 6 mg/1.

Další detaily vytváření vektorů použitých ve způsobech podle vynálezu jsou uvedeny v přihlášce PCT 94/01456 a 92/02050, na jejichž popis se zde odkazuje.

3. Biologická aktivita fúzních proteinů Ret/IgG

Aby se určilo, jestli fuzní proteiny Ret/IgG, které jsme vytvořili, jsou biologicky aktivní, a tudíž by byly dobré testovací reagencie pro klonování RetL, provedli jsme několik orgánových kultivačních testů na biologickou aktivitu. Orgánový kultivační test se skládal z pěstování krysích ledvin 13-14 dnů starého embrya v orgánové kultuře po 3-5 dnů v přítomnosti fuzního proteinu Ret/Ig v koncentraci 50 pg/ml. Ledviny se také pěstovaly v přítomnosti LFA-3TIP/IgG nebo nosičového pufru. Po kultivačním období, jsou některé ledviny obarveny fluorescenčním lektinem Dolichos Biflorus Agglutinin (DB lektin), který obarví tkáně sběracího kanálku, což jsou epitelové buňky ureterového pupenu a jeho epitelových derivátech. To poskytuje hrubé vyhodnocení vlivu fuzního proteinu Ret/IgG na růst a vývoj embryonálních ledvin. Je zde jasná odlišnost v morfologii a růstu sběracího kanálku mezi ledvinami, které byly pěstovány s LFA-3TIP a těmi, které byly pěstovány s krysím fúzním proteinem Ret/IgG. Ledviny ošetřené Ret/IgG mají sběrací kanálky, které vykazují významně menší větvení a jsou typicky celkově menší.

Z dalších ledvin byly připraveny parafínové řezy pro histologické vyšetření. Embryonální ledviny byly ošetřeny kontrolním pufrem nebo s Ret/IgG, a poté obarveny hematoxylinem a eosinem. Embryonální ledviny ošetřené Ret/Ig projevovaly menší větvení sběracích kanálků, než kontrolní embryonální ledviny ošetřené pufrem. Kromě toho ledviny ošetřené Ret/IgG měly méně kanálků. Tento účinek jsme také pozorovali u ošetření lidským fúzním proteinem Ret/IgG. Tato pozorování jsou v souladu s fúzními proteiny blokujícími induktivní signál mezi mezenchymem a ureterovým pupenem. Proto uzavíráme, že fuzní protein je vhodný pro klonování RetL.

4. Fúzní protein Ret/Alkalická fosfatáza

Fúzní proteiny receptor/alkalická fosfatáza (AP) byly úspěšně použity pro identifikaci a klonování ligandů pro c-kit (Cell, 63, 185, 1990), ligandů pro členy rodiny eph receptorů (Cell, Z9, 157, 1994) a nedávno ke klonování receptoru pro leptin, produkt genu bp (Cell, 83, 1263, 1995). Plazmidy kódující krysí fúzní protein Ret/AP byly zkonstruovány a krysí protein Ret/AP byl tvořen v buňkách COS7 v buněčných fermentorech. Následně byla vytvořena stabilní buněčná linie NIH3T3 exprimující průměrně 10mg/l fuzního proteinu. Analýza krysího proteinu Ret/AP metodou SDS-PAGE naznačuje, že jeho velikost je konzistentní s předpověděnou molekulovou hmotností a analýza gelovou filtrací indikuje, že se tvoří jako dimer. Částečné purifíkace je dosaženo afínitní chromatografií na koloně anti-aP.

-12CL Z9051Ó B6

Protilátky anti-Ret

Byla připravena králičí polyklonální protilátka proti krysímu fuznímu proteinu Ret/IgG. Protilátka je funkční při westernovém přenosu, analýze buněčných linií Ret-pozitivních pomocí 5 FACS a při imunohistochemickém vyšetření řezů embryonálních ledvin.

Byl vytvořen panel křeččích monoklonálních anti-krysích protilátek Ret. K imunizaci arménských křečků je použit krysí fúzní protein Ret/IgG připojený k sefaróze s proteinem A (Protein-A Sepharose). Po fúzi se získalo 316 klonů a testovalo se na schopnost vázat krysí fuzní proteiny ío Ret a/nebo lidské IgG v testu ELIS A. 11 klonů tvořilo protilátky, které se vázaly pouze na krysí Ret/IgG (a krysí Ret/AP), ale ne na lidský IgG. Zkřížená reaktivita k lidskému Ret se testovala pomocí FACS, čtyři klony tvořily protilátky, které se mohly vázat na Ret-pozitivní lidskou buněčnou linii THP-1. Následující tabulka shrnuje vazebné vlastnosti kRet dvanácti monoklonálních protilátek.

Klon	ELISA Krysí Ret/Ig	FACS lidský THP-1
AA.FF9.5	+	-
AA.HE3.7	+	4-
AF.E9.5	+	-
BA.BI.16	4-	-
BB.B6	4-	-
AA.GE7.3	+	-
CD.F11.2	+	-
AH.E3.il	+	+
CD.G4.2	4“	+
AG.E7.9	4·	-
BD.G6	+	+
BH.G8	-	-

6. Expresní knihovny cDNA

Připravili jsme knihovny cDNA z krysích embryonálních ledvin, jednu ve vektoru CDM8, který používá pro amplifíkaci replikační počátek SV40, a jednu v modifikovaném vektoru InVitrogen 20 pCEP4, který pro amplifíkaci používá replikační počátek EBV. Modifikovaný vektoru CH269 má odstraněnou genovou sekvenci EBNA-1. Protein EBNA-1 interaguje s replikačním počátkem EBV, ale tento gen není ve vektoru potřebný, když jsou použity buňky, které trvale exprimují protein EBNA. Knihovna ve vektoru CDM8 obsahuje 1,5x10⁶ klonů s průměrnou velikostí inzertu 1,18 kb, zatímco knihovna ve vektoru CH269 obsahuje přibližně lxlO⁶ klonů s průměr25 nou velikostí inzertu 1,5 kb.

-13CZ 296516 B6

Expresní klonování RetLl, ligandu Ret

A. Klonování krysího RetLl, Ret ligandu

1. Počáteční pokusy expresního klonování Ret ligandu RetLl

Pro klonování retLl bylo vyzkoušeno několik metod přímé exprese. Všechny tyto metody jsou založeny na myšlence ilustrované na obr. 4B. CDNA z knihovny cDNA jsou vloženy do savčích buněk, buňky obsahující RetLl je pak možné identifikovat pomocí fúzních proteinů Ret. Ačkoliv tři dále popsané metody nebyly úspěšné, pomohly k získání zkušeností a důležitých znalostí, které vedly k úspěchu při použití další metody.

A) Metoda „rýžování“ pomocí Ret/IgG

Krysí fúzní protein Ret/IgG byl použit v pokusu o izolaci RetLl pomocí přímého expresního klonování metodou „rýžování“ (Aruffo a Seed, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8753-8757, 1987). Pro tento pokus byla užita CDM8 knihovna cDNA z krysích 18denních embryonálních jater. Soubory (tzv. „pool“) cDNA z této knihovny (5000 až 10 000 cDNA v jednom souboru) byly vneseny do COS buněk DEAE-dextranovou metodou. Po 48 hodinách se buňky odstranily z misek s EDTA, inkubovaly se s fuzním proteinem a pak se rozetřely na misky pokryté antilidskou protilátkou IgGl. Z buněk, které se přichytily, se izolovala DNA, zpětně se transformovala do E. coli a pak se znovu izolovala ve druhém kole „rýžování“. Po třetím kole „rýžování“ nebyly vidět už žádné buňky a po transformaci Hirtovy frakce DNA zpět do E. coli lze pozorovat jen několik málo klonů. VCAM cDNA, konjugovaná s monoklonální protilátkou anti-VCAM, použitá jako pozitivní kontrola, se mohla ředit až 1:100 a stále se dala detekovat, což ukazuje, že použité soubory byly asi moc velké. Analýza několika klonů získaných po druhém kole „rýžování“ ukazuje, že v klonech dochází k reorganizaci a delecím.

B) Preparativní použití FACS s Ret/IgG

000 klonů z knihovny cDNA z krysích 18denních embryonálních jater (vektor CDM8) bylo vneseno do buněk COS7 a pak analyzováno preparativně pomocí FACS s využitím proteinu Ret/IgG z krysy následovaného druhého protilátkou označenou fluorescenční značkou. Vrcholy 0,5 a 0,9% fluoreskujících buněk byly odebrány a DNA z nich byla izolována Hirtovou lyží. Elektroporací pak byla DNA vnesena zpět do E. coli, čímž bylo získáno 228 klonů pro 0,5 % souboru a 752 klonů pro 0,9% soubor. Z klonů byla získána DNA a pak podrobena druhému kolu preparativní analýzy FACS. Plazmidy získané z bakteriálních klonů na konci druhého kola byly analyzovány, ale bylo zjištěno, že obsahují velké genové reorganizace a delece.

C) Kolorimetrická detekční metoda s Ret/AP

Buňky COS byly transfekovány 400 souboru cDNA klonů (1000 klonů v každém souboru) z knihovny cDNA z krysích 18denních embryonálních jater (vektor CDM8) a pak byly buňky obarveny pomocí proteinu Ret/AP a kolorimetrickým substrátem pro alkalickou fosfatázu. Transfekované buňky se pak vyšetřovaly pod mikroskopem na pozitivní signál. V jednom pokusu bylo nalezeno 5 potenciálně pozitivních buněk, ale při opakované analýza byly negativní.

Jako kontrola k proteinu Ret/AP byl připraven protein VCAM/AP fúzí prvních dvou domén lidské VCAM k N-konci AP z placenty (VCAM se váže k integraci VLA4, který je složen ze dvou řetězců, a sice alfa-4 a beta-1). Přechodný transfekce COS buněk poskytla dostatek proteinu VCAM/AP pro kontrolní pokusy. Protein VCAM/AP se porovnal s VCAm/IgG přímo navázaným na AP, a také s VCAM/IgG se sekundární protilátkou s navázanou ABp, aby se vyhodnotila jejich schopnost detekovat VLA4 na COS buňkách transfekovaných alfa-4 řetězcem cDNA (cos již exprimují řetězec beta-1). Výsledky ukazují, že zatímco protein VCAM/AP může

-14CZ. Z7O510 BO detekovat VLA4 na transfekovaných buňkách, nej lepší detekci umožňuje protein VCAM/IgG v kombinaci se sekundární protilátkou s navázanou AP.

D) Metodologické závěry.

Hlavní závěry vyplývající ztěchto úrovních klonovacích pokusů jsou následující:

1) Metody, které vyžadují, aby se plazmidy znovu izolovaly pro následující kolo („rýžováni“ nebo preparativní FACS) nejsou vhodné pokud je hledané cDNA málo, protože během těchto metod se objevují genové reorganizace a delece. Vzhledem k nízké úrovni exprese Ret je opodstatněné se domnívat, že exprese RetLl je také nízká. Výhodný způsob je transfekovat pomocí souborů a pak užít takovou metodu, která dovoluje detekovat pozitivní soubor. Původní souboru pak může být rozdělen, aniž by se izolovala přechodně exprimovaná DNA z transfekovaných buněk.

2) Protein Ret/IgG má, pokud je navázán na sekundární reagens, lepší detekční schopnost než protein Ret/AP.

3) Kontrolní pokusy s kontrolním proteinem VCAM/IgG (a sekundární protilátkou s navázanou AP) a cDNA pro integrin alfa-4 (vloženou do vektoru CDM8 a transfekovanou do buněk COS) ukazují, že detekční možností jsou asi jedna ku tisíci (tzn. že velikost souboru nemůže přesahovat 1000 klonů). Abychom dosáhli zlepšené úrovně citlivosti, změnili jsme vektor založený na SV40 (exprimovaný v COS buňkách) na vektor založený na EBV (exprimovaný v buněčných liniích pozitivních na EBNA). Vektory založené na EBV se udržují jako epizomy a nejsou pro buňky tak toxické jako vektory založené na SV40 po namnožení. Existují významné důkazy, že geny mohou být těmito vektory exprimovány ve vyšší hladině a že cDNA může mnohem víc ředěna (tj. na 1:80 000) a je stále možněji detekovat.

2. Screening souborů z knihovny cDNA založené na EBV

Soubory klonů z cDNA knihovny z krysích 18denních embryonálních ledvin (vektor CH269 odvozený z EBV) byly podrobeny screeningu s fúzním proteinem Ret/IgG. V jednom pokusu vzniklo 256 souborů, z nich každý obsahoval 5000 klonů z knihovny. Stručně řečeno, alikvotní díl z knihovny cDNA se titroval, 5000 buněk se vyselo (256x) a nechaly se narůst přes noc. Kolonie pak byly setřeny do média, část kultury byla použita k vytvoření glycerolového zásobního roztoku každého souboru (byly uloženy v -70 °C) a část byla použita k izolaci plazmidu. DNA z 256 souborů se jednotlivě transfekovalo do buněk EBNA293 (8x10⁵ buněk na 60mm misce) lipofectinovou metodu. Po 48 hodinách se buňky opláchly dvakrát pufřem HBHA (0,5 mg/ml BSA, 0,1% NaN₃, 20mM HEPES, pH 7,0) a inkubovaly se s 20 pg/ml krysího proteinu Ret/IgG vpufřovaném solném roztoku s lmM MgCl₂ a CaCl₂ asi 60 až 90 minut při teplotě místnosti. Po této inkubaci byly buňky 4x opláchnuty v HBHA pufru a pak 30 sekund fixovány roztokem 60% aceton/3% formaldehyd/20mM HEPES (pH 7,0). Po dvou promytích v pufru HBS (150mM NaCl, 20mM HEPES, pH 7,0, byly buňky inkubovány se sekundární protilátkou s navázanou AP (kozí anti-lidský IgG F(ab')2 specifický pro Fc-gama (Jackson Immuno Research Laboratories, katalog. Č. 109-056-098, ředění 1:5000 v solném roztoku pufrovaném fosfátem s lmM MgCl₂ a CaCl₂) po 60 minut při teplotě místnosti. Buňky pak byly promyty dvakrát v HBS pufru a dvakrát substrátovým pufřem pro AP (lOOmM Tris-HCl, pH 9,5, lOOmM NaCl, 5mM MgCl₂), obsahujícím 2x supresor fosfatázy Imuno Pure^(R) (Pierce, katalog, č. 35002). Poslední lázeň byly ponechána 15 minut. Substráty AP NBT (0,33 mg/ml) aBCIP (0,17 mg/ml) byly přidány vAP substrátovém pufru obsahujícím AP inhibitor (Pierce) a byly inkubovány s buňkami po 5 až 20 minut. Destičky pak byly opláchnuty dvakrát vodou. Pak byly destičky vyšetřovány pod mikroskopem na přítomnost purpurově zbarvených buněk.

Analýzou 256 souborů bylo nalezeno 17 pozitivních souborů v průběhu primárního screeningu. DNA z každého pozitivního souboru byla znovu transfekována do buněk 293/EBNA a celý

-15CZ 296516 B6 postup se znovu opakoval s dalšími dodatečnými kontrolními pokusy pro potvrzování toho, že pozorované obarvení je specifické pro Ret/igG. 10 ze 17 pozitivních souborů vykazovalo barvení pouze s fůzním proteinem Ret/igG, ale nikoliv s jinými fúzními proteiny IgG.

3. Rozdělení souboru č. 230

Jako příklad byl jeden z výše popsaných pozitivních souborů, označený č. 230, rozdělen na menší podsoubory, aby bylo možné v rámci souboru identifikovat cDNA, která zodpovídá za vazbu k fuznímu proteinu Rett/IgG. 600 buněk z glycerolového zásobního roztoku soboru č. 230 bylo vyseto (lOx) a pěstováno přes noc. Kolonie z těchto misek byly setřeny do média: jedna desetina kultury byla použita k přípravě glycerolového zásobního roztoku a zbylá část byla použita pro izolaci DNA. Těchto 10 podsouborů bylo označeno 230-1A až 230-5A a 230-1B až 230-5B. DNA z těchto podsouborů byla transfekována do buněk 293/ENA a byl opakován celý postup barvení pomocí fuzního proteinu Ret/igG popsaný dříve. Jeden podsoubor č. 230-5A byl pozitivní při barvení na protein Ret/igG.

Podsoubor č. 230-5A byl ještě dále rozdělen, aby bylo možné ještě v rámci podsouborů identifikovat cDNA, která zodpovídá za vazbu k fuznímu proteinu Ret/igG. Buňky z glycerolového zásobního roztoku souboru č. 230-5A byly vysety a pěstovány přes noc. Kolonie byly sebrány do jamek sedmi 96jamkových destiček záření Bioblock^(R) a pěstovány přes noc. Z každých 96 jamek v zařízení Bioblock^(R) byly vytvořeny 4 soubory po 20 klonech a jeden soubor s 16 klony. Takže ze sedmi zařízení Bioblock^<R) bylo vytvořeno celkem 35 souborů označených 230-5A-71 až 230-5A-105. Z každého souboru byly izolovány DNA a transfekována do buněk 293/EBNA a znovu testována s fůzním proteinem Ret/igG, jak již bylo dříve popsáno. Soubor č. 230-5A-86 byl pozitivní.

Souboru č, 230-5A-96 byl rozdělen a bylo identifikováno všech 20 klonů, které byly při vytváření tohoto souboru smíchány. Z každého z těchto dvaceti klonů byla izolována DNA a jednotlivě transfekována do buněk 293/EBNA a znovu testována s fůzním proteinem Ret/igG, jak již bylo dříve popsáno. Soubor č. 230-5A-86-17 byl pozitivní.

4. Charakterizace klonu č. 230-5A-86-17

Klon č. 23O-5A-86-17 (zvaný též retL-17 nebo klon 17, deponovaný jako č. ATCC 98047) byl dále analyzován sekvencováním DNA. Celá nukleotidová sekvence inzertu tohoto klonu je zde uvedena jako sekvence id. č. 1 (krysí cDNA retLl), a část nukleotidové sekvence je také ukázána na obr. 1. V této sekvenci byl nalezen čtecí rámec kódující protein složený z 468 aminokyselin (krysí RetLl). Předpovězený protein má signální sekvenci s předvídaným štěpným místem po 24. aminokyselině (Von Heijne et al., Nucl. Acid. Res. 14: 14683, 1986). Hydrofobní C-konec ukazuje, že protein by mohl být navázán na buňku prostřednictvím fosfatidylinositolglykanové vazby. Jsou zde předpovězena tři N-glykosylační místa. Tyto vlastnosti odpovídají tomu, co se dá pro ligand proteinu Ret očekávat.

Rozpustné formy krysího proteinu RetLl je možné exprimovat tak, že se gen zkrátí před hydrofobním C-koncem. Např. by se to mohlo udělat zkrácením za lysinem 435 (v krysích RetLl). Zkrácení proti směru transkripce od této aminokyseliny může vést k expresi rozpustné formy krysího proteinu RetLl. Rozpustný krysí protein může být exprimován buď sám nebo jako část fuzního proteinu s lidským imunoglobulinem, histidinovou značkou nebo malým epitopem, který je rozpoznáván protilátkou.

B. Klonování lidského RetL 1, ligandu Ret

Knihovna cDNA z lidských embryonálních ledvin ve vektoru lambda gtlO byla získána od firmy Clontech (katalog, č. HL5004A). Jeden milion jednotek tvořících plaky ze zásobního roztoku byl vyset na misky 10 Nunc™. Byly vytvořeny otisky plaků v duplikátu na filtry Opitran™ firmy

-16VZ. 4VO3IO BO

Schleicher and Shuell. Sonda byla vytvořena naštěpením plazmidu nesoucího krysí retLl restrikčním enzym PvuII, po kterém následovala izolace fragmentu velikosti 1,34 kb zagarózového gelu, a tento fragment odpovídal nukleotidům 242 až 1582 sekvence krysího RetL (krysí cDNA retLl). Tato sonda z kódujícího úseku byla označena pomocí ³²P za pomocí náhodných příměrů (Feinberg a Vogelstein, Anal. Biochem. 137: 266-267, 1984). Filtry byly hybridizovány přes noc při 55 °C ve 300 ml pufru pro screening plaků PSB (50mM Tris pH 7,5, 1M NaCl, 0,1% pyrofosforečnan sodný, 0,2% PVP a 0,2% Ficoll) obsahujícím 10% dextransulfát, 100 pg/ml tRNA a6,7xl0⁷ CPm krysí sondy. Pak byly filtry dvakrát opláchnuty vpufřu PSB a dvakrát ve 2xSSC/l% SDAS při 55 °C a film byl exponován při teplotě-70 °C s intenzifikačním stínítkem.

Duplikáty pozitivních plaků byly přeneseny do média SM (100 mM NaCl, lOmM SO₄, 50mM Tris pH 7,5) se želatinou. 24 z těchto pozitivních plaků bylo purifikováno. Lambda DNA získaná minipreparací z těchto vybraných plaků byla štěpena Notl, rozdělena elektroforézou na 1% agaróze a pak analyzována Southemovým přenosem. V Southemově hybridizaci byla použita sonda kódujícího úseku krysího RetLl. Klon HRL20 měl nejdelší inzert (4,4 kb), který hybridizoval intenzivně s krysí sondou. Sekvence DNA (částečně cDNA lidského retLl, sekvence id. č. 8, obr. 2A) a dedukovaná sekvence peptidu (částečná sekvence lidského RetLl, sekvence id. č. 9, obr. 2A) byly získány z tohoto klonu, což potvrzuje, že se jedna o lidský homolog. Tento klon obsahuje většinu kódujících úseků včetně 3'-konce kódujícího úseku.

Pro přípravu 5'-konce lidské cDNA byla získána souprava cDNA z lidských fetálních ledvin Marathon-Ready™ (Clontech, katalog, č. 7423-1). Antisense nukleotidy (tj. nukleotidy s orientací proti smyslu normální transkripce) Kid-155, odpovídající komplementární sekvenci k nukleotidům 62 až 81 sekvence id. č. 8 (částečná cDNA lidského retLl), a Kid-154, odpovídající nukleotidů 17 až 43 sekvence id č. 8 (částečná cDNA lidského retLl) byly syntetizovány. PCR byla provedena pomocí soupravy Advantage™ cDNA PCR (Clontech katalog, č. 8417-1) kombinované s některými činidly ze soupravy Marathon™ cDNA a pomocí oligonukleotidů Kid-155 a Kid-154. První reakce PCR byla sestavena následovně: 35,5 μΐ H₂O, 5,0 μΐ lOx pufř pro enzym Klen Taq, 1,0 pg směsi lOmM dNTP, 1,0 μΐ 50x směs polymeráz Klen Taq Advantage™. Tyto reagencie byly smíchány a směs promíchána. Pak bylo přidáno 5,0 μΐ cDNA z fetálních jater Marathon-Ready™, 1,0 μΐ 10 μΜ příměru API a 1,5 μΐ 6,4 μΜ Kid-155 (celkový objem reakce 50 μΐ). PCR byla provedena v cyklovacím termostatu Perkin-Elmer Cetus DNA Cycler 480 s následujícím nastavením cyklů: 1 cyklus 94 °C po 1 minutu, 30 cyklů 94 °C po 30 sekund, 55 °C 30 sekund, 68 °C po 4 minuty. S produktem první PCR byla následně proveden „hnízdová“ PCR („nested PCR“). Nejdříve bylo 5 μΐ produktu z první reakce naředěno 50 x v TE (celkový objem 250 μΐ). Hnízdová PCR obsahovala 35,5 μΐ H₂O, 5,0 pL 50x směs polymeráz Klen Taq Advantage™. Reagencie byly smíchány stejně jak bylo popsáno pro předchozí reakci, pak bylo přidáno 5 μΐ naředěného produktu první reakce, 1,0 μΐ 10 μΜ primeru AP2 a 1,5 μΐ 6,9 μΜ příměru Kid-154. Podmínky cyklování byly stejné jak bylo již popsáno v předchozí reakci. Výsledný produkt přibližně velikosti 700 bp byl purifikován v 1% agaróze s nízkým bodem tání a extrahován fenolem. Purifikovaná DNA byla klonována do místa EcoRV plazmidu pZErO™ (Invitrogen, katalog, č. K2510-01). Zopakovaných izolací, obsahujících klony HRL7G6 a HRL7G8, byla získána informace o sekvenci.

Sekvence získaná z klonu HRL7G8 se částečně překrývá se sekvencí z klonu HRL20 (částečná cDNA lidského retLl) a byla proto použita k vytvoření úplného lidského RetLl (cDNA plné délky lidského RetLl), jak je ukázáno na obr. 2B. Nukleotidová sekvence získaná z klonu HRL7G8 představuje nukleotidy 1 až 520 z úplné cDNA RetLl, zatímco sekvence klonu HRL20 představuje nukleotidy 460 až 1682 z úplné lidské cDNA RetLl. Sekvence získaná z klonu HRL7G8 byla ještě potvrzena sekvencováním jiného klonu cDNA (GJ102) izolovaného z knihovny cDNA z lidských embryonálních ledvin ve vektoru lambda gtlO, která již byla popsána výše, pomocí sondy odvozené z klonu HRL7G6. Nukleotidy 118 až 1497 obsahují proteinový čtecí rámec úplné cDNA pro lidský RetLl.

- 17CZ 296516 B6

Úplná sekvence aminokyselin lidského RetLl je ukázána na obr. 2B. Jak ukázala analýza BESTFIT uvedená na obr. 3A, lidská cDNA retLl je z 88,2 % identická s krysí cDNA retLl. Srovnání peptid (obr. 3B) ukazuje, že předpokládaná lidská proteinová sekvence je z 93,3 % identická a z 97,2 % podobná, s krysí sekvencí.

Klonování ligandu RetL2

A. Klonování lidského RetL2

Peptidová sekvence krysího RetLl byla použita k prohledání databáze GenBank pomocí programu Glast, aby se identifikovaly příbuzné proteiny (tj. isology). Program BLAT (Basic Local Alignmet Search Tool) používá metodu, kterou publikovali Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990), k vyhledávání podobnosti mezi požadovanou sekvencí a všemi sekvencemi v databázi. Požadovaná sekvence a sekvence v prohledávané databázi mohou být buď peptidová nebo nukleotidové sekvence v libovolné kombinaci. Když byla peptidová sekvence krysího RetLl porovnávána s nukleotidovou databází klonů EST, byla nalezeny dvě významné shody. Jeden klon byl klon vedený v GenBack pod číslem R02249, což je EST klon velikosti 229 bp z kombinované knihovny cDNA z lidských fetálních jater a sleziny, a druhý byl klon GenBank Č.H12981, což byl EST klon velikosti 521 bp z knihovny cDNA z lidského dětského mozku. Oba EST klony sdílejí 99% identitu v překrývající se oblasti, což ukazuje, že jsou ze stejné cDNA. Z EST klonu H12981 byly vytvořeny oligonukleotidy KID-228 (GAA TGA CAA CTG CAA GAA GAA GCT GCG CTC CTC, odpovídající nukleotidům 38 až 67, a tedy nukleotidům 534 až 563 sekvence id. č. 12) a antisense nukleotid KID-229 (GTG TAC TCG CTG GGC ACC CG, odpovídající komplementární sekvenci k nukleotidům 156 až 175, a také komplementární sekvenci k nukleotidům 652 až 671 sekvence id. č. 12).

lxlO⁶ jednotek tvořící plaky z knihovny cDNA z lidských fetálních jater 5'-Stretch Plus Lambda GT10 (Clontech, katalog č. HL5003a) bylo podrobeno screeningu na duplikátech na filtrech Optitran™. Filtry byly hybridizovány přes noc při 65 °C s oligonukleotidy KID-229 a KID-228 značenými ³²P ve 400 ml pufru pro screening plaků (50mM Tris pH 7,5, 1M NaCl, 0,1% polyfosforečnan sodný, 0,2% PVP a 0,2% Ficoll) obsahujícím 10% dextransulfát, 100 pg/ml tRNA 80 pmol každého značeného oligonukleotidu. Pak byly filtry dvakrát opláchnuty 2xSSC/l%SDS a dvakrát v lxSSC/l%SDS a film byl exponován. 11 duplikátů pozitivních plaků bylo purifikováno. DNA z každého z těchto klonů byla analyzována tak, že byla naštěpena restrikčním enzymem, pak rozdělena elektroforézou a pak podrobena Southemovu přenosu. Filtry pak byly hybridizovány s KID-228 a KID-229 pro potvrzení toho, že inzerty hybridizují se sondou. Inzert klonu DSW240 byl úplně sekvencován (lidský retL2, sekvence id. č. 12) a je ukázán na obr. 7.

Nukleotidy 25 až 1416 obsahují proteinový čtecí rámec pro lidskou cDNA retL2, který kóduje protein 464 aminokyselin (lidský RetL2, sekvence id č. 13) a je ukázán na obr. 7. Jak ukázala analýza BESTFIT uvedená na obr. 8, lidský protein RetL2 je z 49,1 % identický a z 63 % podobný lidskému proteinu RetLl. Sdílí společně sRetLl hydrofobní N-konec, což ukazuje n signální sekvenci, a také hydrofobní C-konec, což ukazuje na fosfatidylinositolglykanový vazebný motiv. Kromě toho je konzervováno 30 cysteinových zbytků z 31 přítomných v každém proteinu.

B. Důkaz toho, že RetL2 je ligandem Ret

Ukázali jsme, že RetL2 je ligandem Ret tak, že buňky 293/EBNA byly transfekovány expresním plazmidem, obsahujícím inzert klonu DSW240 a pak bylo ukázáno, že tyto buňky vážou rozpustný fúzní protein Ret/IgG.

Inzert DSW240 byl vyjmut pomocí Notl a klonován do expresního vektoru CH269 obsahujícího počátek EBV, který umožňuje expresi v EBNA pozitivních buněčných liniích. Bylo provedeno

-18CZ. ZVO31O BO restrikční štěpení pro identifikaci klonů se správnou orientací. Z plazmidů se správnou orientací byla připravena DNA.

Plazmidové DNA (expresního plazmidů retL2, expresního plazmidů retLl jako pozitivní kontroly a expresního plazmidů obsahujícího nepříbuznou sekvenci jako negativní kontroly) byly transfekovány do buněk 293/EBNA (8x10⁵ buněk na 60mm misce) metodou s Lipofectinem. Po 48 hodinách byly buňky opláchnuty dvakrát vHBHA pufru (0,5 mg/ml BSA, 0,1% NaN₃, 20mM HEPES pH 7,0) a inkubovány s 20 pg/ml Ret/IgG v solném roztoku pufrovaném Tris s 1 mM MgCl₂ a CaCl₂ po 60 až 90 minut při teplotě místnosti. Po této inkubaci byly buňky opláchnuty dvakrát v pufru HBHA a pak fixovány roztokem 60% aceton/3% formaldehyd/20mM HEPES (pH 7,0) po 30 sekund, po dvou opláchnutích HBS (150mM NaCl, 20mM HEPES, pH 7,0) byly buňky inkubovány se sekundární protilátkou s navázanou AP (kozí protidiský IgG F(ab)2 specifický pro Fc-gamma, Jackson Immuno Research Laboratories, katalog, č. 109-056098, ředění 1:5000 v solném roztoku pufrovaném fosfátem s lmM MgCl₂ a CaCl₂) po 60 minut při teplotě místnosti. Buňky pak byly dvakrát opláchnuty pufrem HBS a dvakrát substrátovým pufrem pro AP (lOOmM Tris-HC-1, pH 9,5, lOOmM NaCl, 5mM MgCl₂) obsahujícím 2x supresor fosfatázy Immuno Pure^(R) (Pierce, katalog, č. 35002). Poslední lázeň byla ponechána 15 minut. Substráty AP NBT (0,33 mg/ml) a BCIP (0,17 mg/ml byly přidány v AP substrátovém pufru obsahujícím AP inhibitor (Pierce) a byly inkubovány s buňkami po 5 až 20 minut. Destičky pak byly opláchnuty dvakrát vodou. Pak byly destičky vyšetřovány pod mikroskopem na přítomnost pufrově zbarvených buněk. Přítomnost pufrově zbarvených buněk ukazuje na to, že tužní protein Ret se navázal na buňky a že protein RetL2 je ligandem Ret. Purpurově zbarvené buňky byly pozorovány po transfekci expresním vektorem retLl, ale nikoliv po transfekci vektorem negativní kontroly.

Klonování ligandu RetL3

A. Myší RetL3

Prohledávání databáze EST pomocí aminokyselinové sekvence krysího RetLl vedlo k objevení dvou klonů EST homologních s ligandy Ret. Jedná se o EST klony AA049894 a AA050083 (což je částečná myší cDNA retL3, sekvence id. č. 14). Plazmidy obsahující tyto ESTT klony byly získány od firmy Genome Systems lne. (katalog, č. 475791 a 475497) jako bakteriální kultury očkované jehlou. Plazmidová DNA byla připravena z jednotlivých kolonií získaných po naočkování misek s médiem LB AMP. Celé inzerty z těchto plazmidů byly sekvencovány. Porovnání dvou sekvencí ukázalo, že AA049894, který obsahoval inzert velikosti 1,4 kb, je obsažen v AA050083, který obsahuje inzert velikosti 1,9 kb. translace sekvence DNA z AA050083 ukázala, že je zde souvislý otevřený čtecí rámec (ORF) od nukleotidu 205 po nukleotid 1412 (částečná myší RetL3, sekvence id. č. 15). Tento ORF měl 37,5 % identitu sORF krysího retrLl a 40,2% identitu s krysím retL2. Avšak tento otevřený čtecí ráme nekóduje Mt nebo signální sekvenci na 5'-konci. Byly prozkoumány čtecí rámci proti směru transkripce v tomto úseku a byl nalezen Met v kontextu Kozákovy konsensuální sekvence pro iniciaci translace a potenciální signální sekvence pro povrchovou expresi/sekreci. Tento ORF nesouvisí s rámcem ORF ležícím po směru transkripce, což ukazuje, že klon EST AA050083 obsahuje na svém 5'-konci potenciální mutaci, jako např. inzerci deleci, intron nebo artefakt vzniklý při klonování.

Aby se získala správná sekvence 5'-konce, bylo použito soupravy Marathon RACE. Myší embryonální cDNA Marathon-Ready™ (katalog, č. 7458-1) a souprava Advantage™ (katalog, č. 8417-1) byly získány od firmy Clontech. Byly syntetizovány antisense nukleotidy Kid-366, odpovídající komplementární sekvenci k nukleotidům 847 až 866 sekvence id. č. 14, a Kid-365, odpovídající komplementární sekvenci k nukleotidům 589 až 615 sekvence id. č. 14.

PCR byla provedena pomocí soupravy Advantage™ cDNA PCR (Clontech katalog, č. 8417-1) kombinované s některými činidly ze soupravy Marathon™ cDNA a oligonukleotidem Kid-366. První reakce PCR byla sestavena následovně: 35,5 μΐ H2O, 5,0 μΐ 10x pufř pro enzym Klen Taq,

-19CZ 296516 B6

1,0 μΐ směsi lOmM dNTP, 1,0 μΐ 50x směs polymeráz Klen TAq Advantage™. Tyto reagencie byl smíchány a směs promíchána. Pak bylo přidáno 5,0 μΐ cDNA Marathon-Ready™ z 11 denního myšího embrya, 1,0 μΐ 10μΜ primeru API a 1,7 μΐ 5,88 μΜ Kid-366 (celkový objem reakce 50 μΐ). PCR byla provedena v cyklovacím termostatu Perkin-Elmer Cetus DNA Cyclec 480 s následujícím nastavením cyklů: lcyklus 94 °C po 1 minutu, 5 cyklů 94 °C po 30 sekund, 72 °C po 4 minuty, 5 cyklů 94 °C po 30 sekund, 70 °C po 4 minuty, 25 cyklů 94 °C po 30 sekund, 68 °C po 4 minuty. S produktem první PCR byla následně provedena „hnízdová“ PCR. Nejdříve bylo 5 μΐ produktu z první reakce naředěno 50 x v TE (celkový objem 250 μΐ). Hnízdová PCR obsahovala 35,5 μΐ H₂O, 5,0 μΐ lOx pufr pro enzym Klen Taq, 1,0 μΐ směsi lOmM dNTP, 1,0 μΐ 50x směs polymeráz Klen Taq Advantage™. Reagencie byly smíchány stejně jak bylo popsáno pro předchozí reakci, pak bylo přidáno 5 μΐ naředěného produktu první reakce, 1,0 μΐ 10 μΜ primeru AP2 a 3,6 μΐ 2,8 μΜ primeru Kid-365. Podmínky cyklování byly stejné jak bylo již popsáno v předchozí reakci. Výsledný produkt přibližně velikosti 665 bp byl purifíkován v 1% agaróze s nízkým bodem tání a extrahován pomocí Qiaex II (Qiagen, katalog, č. 20021). Purifikovaná DNA byla klonována do plazmidu pNoTA/T7™ pomocí klonovací soupravy PRIME PCR CLONER™ (5prime-3Prime, katalog, č. 1-725029). Z opakovaných izolací, obsahujících klony DSW252 a DSW253, byla získána informace o sekvenci.

Bylo zjištěno, že sekvence DSW252 se částečně překrývá se sekvencí id. č. 14 kromě dodatečného T přítomného v poloze mezi nukleotidy 252 a 253 sekvence id č. 14. Tento T je přítomen v ostatních izolátech DSW251 a DSW253. Vložení této dodatečné báze upravuje otevřený čtecí ráme tak, že dostáváme jediný čtecí rámec velikosti 1191 bp (počítáno od prvního Met) kódující 397 aminokyselin. Tento ORF kóduje Met v kontextu s kanonickou konsensuální sekvencí (Kozák) iniciace translace a zahrnuje také signální sekvenci pro povrchovou expresi/sekreci.

Pro získání myšího kolonu plné délky, který by mohl být exprimován, byly purifíkovány fragmenty Notl-BamHI velikosti 630 bp zDSW252 a BamHI-Notl velikosti 1308 bp z AA050083 a vloženy do expresního vektoru CH269 naštěpeného Notl. Ligační směs byla transformována do E. coli XLl-Blue (Stratgene, katalog, č. 200236). Pak byla provedena minipreparace plazmidové DNA z transformovaných bakterií pomocí Qiawell Ultra Minipreps. DNA pak byly analyzovány restrikčním štěpením a gelovou elektroforézou, aby se ověřila správná velikost a orientace inzertu. Konstrukt byl nazván DSW254. Inzert DSW254 byl úplně sekvencován (myší retL3, sekvence id. č. 16) a byl potvrzen ORF, kódující protein z 397 aminokyselin (myší RetL3, sekvence id. č. 17). Tyto sekvence jsou ukázány také na obr. 9. C-konec RetL3 je hydrofobní zdá se, že jde o fosfatidylinositolglykanový vazebný motiv.

B. Lidský RetL3

Aby byla nalezena vhodná tkáň jako zdroj pro klonování lidského RetL3, byl užit northemový přenos vzorků myších tkání pro stanovení expresního vzorce myšího RetL3. Ze všech zkoumaných tkání nejvyšší expresi RetL3 vykazovala srdeční tkáň. Knihovna cDNA z lidského dospělého srdce ve vektoru lambda gtlO byla získána od firmy Clontech (katalog, č. HL3026a). Jeden milion jednotek tvořících plaky ze zásobního roztoku byl vyset na misky 10 Nunc™. Byly vytvořeny otisky plaků v duplikátu na filtry Opitran™ firmy Schleicher and Shuell.

Pomocí PCR byla připravena sonda s primeiy Kid-36 a Kid-367, odpovídající nukleotidům 397 až 420 sekvence AA050083. PCR byla sestavena tak, že bylo smícháno následující: 10,0 μΐ lOx pufr PFU, 2,0 μΐ směsi lOmM dNTP, 72,1 μΐ H2O, 3,1 μΐ 13,2 μΜ primeru Kid-367 a 6,8 μΐ 5,88 μΜ Kid-366, 5 μΐ DNA AA050083 koncentrace 0,1 μg/μl a 2,0 μΐ PFU polymerázy koncentrace 2,5 U/μΙ (Stratagene, katalog, č. 600154). PCR byla provedena v cyklovacím termostatu Perkin-Elmer Cetus DNA Cycler 480 s následujícím nastavením cyklů: 25 cyklů 94 °C po 1 minutu, 53 °C po 1 minutu, 72 °C po 4 minuty. Produkt PCR byl purifíkován extrakcí fenolem, chloroformem a isiamylalkoholem v poměru 50:49:1 a pak rozdělen elektroforézou na gelu z agarózy s nízkým bodem tání, vyříznutý fragment byl následně purifíkován pomocí QiaexII.

-20CZ Z90510 B6

Tato sonda pro kódující úsek byla značena ³²P metodou náhodných primerů (Feinberg a Vogelstein).

Filtry byly hybridizovány přes noc při 65 °C ve 200 ml pufru pro screening plaků obsahujícím 10% dextransulfát, 100 pg/ml tRNA a Ι,χΙΟ⁸ cpm myší sondy. Pak byly filtry dvakrát opláchnuty 2xSSC/l%SDS a dvakrát v lxSSC/l%SDS a film byl exponován při -70 °C s intenzifikačním stínítkem. DNA z duplikátů pozitivních plaků byla purifikována. Lambda DNA připravená minipreparací z každého z těchto plaků byla analyzována tak, že byla naštěpena restrikčním enzymem EcoRI, pak rozdělena elektroforézou na 1% agarózovém gelu a pak podrobena Southemovu přenosu. Filtry se Southemovým přenosem pak byly hybridizovány s myší sondou. Klon GJ128, který obsahoval inzert velikosti 1,3 kb, hybridizoval intenzivně s myší sondou pro kódující úsek. Sekvence DNA (částečná cDNA lidského retL3, sekvence id. č. 18) a dedukovaná peptidová sekvence (částečná sekvence lidského RetL3, sekvence id. č. 19) byly získány z tohoto klonu a potvrdilo se tak, že se jedná o lidský homolog. Tento klon obsahuje většinu kódujícího úseku včetně 3'-konce kódujícího úseku.

Inzert velikosti 1,3 kb zGJ128 byl purifikován, označen ³²P a použit pro screening knihovny cDNA z lidského dospělého srdce (Clontech) pro získání klonu obsahujícího 5'-konec. Screeningem 2xl0⁶ plaků z této knihovny nebyly získány žádné klony obsahující 5'-konec. Northemové analýzy membrán s northemovým přenosem mRNA z lidských dospělých tkání (Clontech, katalog, č. 7760-1, 7759-1 a 7767-1) hybridizovaných se stejnou sondou podle protokolu dodaného výrobce, ukázaly, se lidský RetL3 je nejsilnější exprimován ve tkáni dospělé míchy, žaludku, srdce, pankreatu, tenkého střeva, tlustého střeva, prostaty a varlat. Knihovna cDNA z dospělé lidské míchy (Clontech, katalog, č. 5001a) byla podrobena screeningu s inzertem GJ128. 3 nezávislé klony byly purifikovány a nejdelší z nich GJ135, byl sekvenován. Sekvence inzertu GJ135 se částečně překrývá s inzertem GJ128, což umožnilo vytvořit složenou sekvenci cDNA plné délky lidského retL3 (sekvence id č. 20) a stanovit tak úplnou sekvenci lidského RetL3 (sekvence id. č. 21). Tyto sekvence jsou také ukázány na obr. 10. Lidský RetL3 je z 34,3 % identický s lidským RetLl a z 34,9 % identický s lidským RetL2. Je také ze 76,8 % identický s myším RetL3.

Použití sloučenin podle vynálezu pro léčení

Nativní proteiny RetL a jejich varianty, protilátky anti-RetL, protilátky anti-Ret a fúzní proteiny s Ret a RetL se mohou použít pro léčení v situaci, kdy je třeba blokovat nebi aktivovat signální dráhu Ret, stimulovat růst ledvinných buněk neb neuronů nebo jejich přežívání v případě nemoci, při kterém jsou tyto buňky poškozeny anebo odumírají, nebo kde je třeba potlačit růst nebo usmrtit nežádoucí buňky jako jsou např. nádorové buňky exprimující Ret nebo RetL.

Obecně jsou sloučeniny podle vynálezu, které s váží na Ret a indukují dimerizaci a/nebo autofosforylaci Ret, užitečné pro stimulaci růstu nebo omezení poškození tkáně exprimující Ret. Sloučeniny podle vynálezu jsou užitečné pro stimulaci růstu ledvinové tkáně a/nebo přežívání, podporu funkce ledvin a minimalizaci poškození ledvinné tkáně po různých zraněních. Sloučeniny podle vynálezu jsou zvláště výhodné pro léčení stavů, které zahrnují akutní selhání ledvin, akutní nefritidu, chronické selhání ledvin, nefrotický syndrom, poruchy ledvinných kanálků, transplantaci ledvin, toxické poškození, poškození hypoxií a úrazy. Nemoci ledvinných kanálků zahrnují jak dědičné, tak získané poruchy, jako je např. polycystická ledvina, cystické onemocnění dřeně a cystická (houbovitá) ledvina. Možný výčet však není takto omezen a může obsahovat i mnoho dalších poruch ledvin (viz Harrisone Principles of Intemal Medicine, 13. vydání, 1994, na kteroužto publikaci se tímto plně odkazuje).

Při jiných aplikacích lze geny a proteiny podle vynálezu použít při léčení stavů, kdy je třeba, aby neurony rostly nebo regenerovaly. Sem patří nervová degenerativní onemocnění jako je Alzheimerova nemoc, Parkinsonova nemoc, Huntingtonova choroba, Tourettův syndrom, amyotrofní laterální skleróza a onemocnění motorických neuronů, a také demyelinizační onemocnění je sclerosis multiplex, také bakteriální nemoci jak je meningitida, absces nebo empyem, virové choroby jako je myelopatie spojená s HIV, nebo prionová onemocnění včetně CreutzfeldtJakobovy nemoci. Patří sem také poruchy v důsledku poškození nervové tkáně, ať už neoplastickým působením nebo úrazem, a také cerebrovaskulámí příhody, jako krvácení nebo embolie. Zejména sem také patří nemoci kreniálních nervů a míchy, včetně vrozených poruch a poruch v důsledku úrazu nebo zánětu a poruch cévní etiologie, jako jsou např. poruchy ovlivňující autonomní nervový systém. Také sem patří vývojové nervové poruchy jako je mentální retardace, autismus, fetální alkoholový syndrom, Downův syndrom a cerebrální paresa, Sloučeniny podle vynálezu se také mohou použít pro léčení syndromů zahrnujících periferní nervový systém. K takovým poruchám patří poruch způsobené kterýmkoliv fyktorem z dříve vyjmenovaných a zejména Lymská nemoc, neuropathie spojená s HIV, polymyositis, svalová dystrofie a myasthenia gravis.

Protilátky anti-RetL a fuzní proteiny Ret podle vynálezu, které se specificky váží na krysí protein RetLl, částečný lidský protein RetLl, úplný lidský protein RetLl, lidský RetL2, myší RetL3 nebo lidský RetL3, nebo fragmenty těchto proteinů, se mohou využít v mnoha metodách. Sloučeniny se mohou terapeuticky použít k blokování nebo inhibici signální dráhy receptoru Ret, např. pro blokování růstu nádorů, jejichž růst je závislý na signální dráze Ret. Tato agens se také mohou fúzovat s detekovatelnými značkami, jako jsou např. látky zobrazitelné fluoroskopicky nebo radiograficky a podávat subjektu, což umožní zobrazit tkáně, které exprimují RetL. Tato agens lze také navázat na látky, jako je např. křenová peroxidáza, kterou lze užít jako imunohistochemické barvivo, které umožňuje vizualizaci buněk pozitivních na RettL v histologických preparátech. Specifické protilátky pro tento účel se mohou použít samotné, a místa kam se váží lze pak vizualizovat v sendvičovém testu použitím anti-imunoglobulinové protilátky s navázaným detekovatelným markérem. Specifické protilátky proti kterémukoliv RetL jsou užitečné v imunotestech pro kvantifikaci látky, pro kterou má daná protilátka specifičnost. Specifické protilátky proti RetL se také mohou navázat na pevnou fázi, jako např. mikroperly nebo misky, a pak využít k odstranění ligandu z roztoku, buď s cílem vyčistit protein nebo ho odstranit z roztoku. Všechny tyto způsoby jsou v podstatě rutinou pro odborníka v imunologii. Další metody podle vynálezu zahrnují modulaci signální dráhy Ret-RetL tím, že se na Ret naváže monoklonální protilátka anti-Reb. Efekt takového kontaktu mAb-Ret může být buď blokující nebo stimulující pro aktivaci signální dráhy Ret, v závislosti na vlastnostech interakce konkrétní monoklonální protilátky mAB s Ret. Některé mAb reagují s Ret jako agonisté, takové agonistické navázání vede ke spuštění dimerizace a autofosforylace Ret. Jiné mAB působí jako antagonisté. Interakce Ret s antagonistickou mAb zabraňuje aktivaci signální dráhy Ret jinými RetL nebo komplety obsahujícími Ret, které by jinak signální dráhu Ret aktivovaly.

RetL nebo protilátky proti Ret nebo fúzních proteinům Ret se mohou použít ke zobrazení tkání, které exprimují Ret, nebo pro imunohistologické nebo preparativní metody popsané v předchozím textu pro protilátky RetL.

Fúzní proteiny obsahující RetL a/nebo protilátky anti-Ret se mohou použít ke speciálnímu cílení protinádorové terapie proti nádorům exprimujícím Ret. Takové nádory mohou zahrnovat několik nádorových fenotypů, které jsou spojeny s mutacemi v Ret (N. Engl. J. Med. 335: 943-951, 1996, Nátuře 367, 319-320, Trends in Genetics 12: 138-144, 1996). Terapeutická intervence proti nádorům exprimujícím RetL využívá fuzní proteiny obsahující Ret a/nebo protilátku antiRet. Protilátka anti-Ret nebo anti-RetL může být sama účinná vzhledem k cytolýze závislé na kompletu a protilátce zprostředkované doménou Fc. Takové hybridní ligandy a protilátky se mohou stát terapeuticky ještě účinnějšími pokud se použijí jako nosiče protinádorových léků, toxinů nebo cytocidních radionuklidů, jako je yttrium90. Cytotoxické efektorové buňky se mohou zacílit na nádorové buňky pomocí heterokonjugátů protilátek, kde protilátka specifická buď pro Ret nebo RetL exprimovaná nádorem je kovalentně navázána na protilátku namířenou proti povrchovému proteinu cytotoxické efektorové buňky jako jsou buňky NK nebo CTL.

Jedním příkladem protilátky anti-Ret nebo terapie pomocí Ret je konjugace toxického řetězce A ricinu nebo modifikované úplné formy ricinu (který se již nemůže vázat na buňky) s RetL nebo

-22protilátkou namířenou proti polypeptidu Ret, které jsou exprimovány na povrchu maligní buňky. V jiném provedení je toxin konjugovaný s Ret nebo protilátkou anti-RetL, aby selektivně zacílil a usmrtil RetL-pozitivní buňky, jako jsou např. nádorové buňky exprimující RetL. Takový přístup se osvědčil s blokovaným ricinem konjugovaným s monoklonální protilátkou proti antigenu CD19, který exprimuje většina nádorových buněk (Grossbard et al., Blood 79: 576, 1992). Ostatní toxiny jsou zrovna tak užitečné, jak je odborníkům známo. K takovým toxinům patří např. exotoxin pseudomonád, difterický toxin a saporin, přičemž možnosti nejsou omezeny pouze na tyto toxiny. Tento přístup by měl být dokonce mnohem účinnější při použití RetL nebo protilátky anti-RetL ve srovnání se známým využitím antigenu CD 19, protože Ret je exprimován pouze ve velmi omezeném počtu tkání.

Výše uvedené přístupy využívají fúzi ricinu nebo jiného toxinu, jsou zrovna tak využitelné pro toxinové konjugáty RetL nebo protilátek anti-RetL, které jsou užitečné pro selektivní cílení a usmrcení Ret-pozitivních buněk, jako jsou nádorové buňky exprimující Ret.

Jiným přístupem v terapii je použití RetL nebo protilátek označených radioizotopem. Takové radioaktivně značené sloučeniny mohou výhodně směrovat radioaktivitu do míst nádorů exprimujících Ret, přičemž ušetří normální tkáň. V závislosti na použitém izotopu radiace emitovaná ze značené protilátky navázané na nádorovou buňku může usmrtit také sousední nádorové maligní buňky, které neexprimují Ret. Mohou být využity různé radionuklidy. Izotopy emitující β-částice (např. ¹³¹I) byly úspěšně použity ve spojení s monoklonálními protilátkami proti CD20, který je přítomen na B-buňkách lymfomu (Kaminski et al., N. Engl. J. Med. 329: 459, 1993, Press et al., N. Engl. J. Med. 329: 1219, 1993). Radionuklidy emitující částice β vytvářejí tumoricidní radioaktivitu na vzdálenost přesahující průměr několika buněk, což dovoluje zahubit i buňky, které nenesou antigen a eliminovat tak následky nehomogenního uložení protilátky nebo ligandu v nádoru.

Je také možné využít radionuklidů emitujících α-záření. Nízká dávka ozáření způsobená RetL nebo protilátkou anti-RetL značenou takovým radionuklidem může být terapeuticky účinnější než okamžité externí ozáření při konvenční radiační terapii. Nízké dávky ozáření mohou způsobovat apoptózu (tj. programovanou buněčnou smrt) v určitých buněčných liniích (Macklis et al., Radiat. Res. 130: 220, 1992, Macklis et al., Radipharm. 5: 339, 1992).

Sloučeniny podle vynálezu se podávají v terapeuticky účinné množství, což znamená takové množství sloučeniny, které vede k medicínsky žádoucímu výsledku nebo ovlivní zvláštní situaci, která má být ošetřena.

Termín „subjekt“ zde použitý znamená jakéhokoliv savce, kterému lze podat ligand Ret nebo gen Ret. Zvláště výhodnými subjekty pro použití vynálezu jsou lidé, ale také ostatní primáti, ovce, koně, dobytek, kozy, prasata, psi, kočky, králíci, morčata, křečci, pískomilové, krysy a myši, a také orgány, nádory a buňky pocházející zvýše uvedených hostitelů.

Použití sloučenin podle vynálezu pro genovou terapii

Geny RetL podle vynálezu se mohou zavést do poškozené tkáně, aby stimulovaly produkci RetL transfekovaných buněk a k tomu, aby podporovaly růst a přežívání buněk, které exprimují Ret.

Ve zvláštním provedení způsobu genové terapie se gen RetL zavede do vybrané cílové nervové tkáně nebo tkáně ledvin. RetL se pak stabilně exprimuje a stimuluje buňky pozitivní na receptory Ret k růstu, dělení a diferenciaci a/nebo podporuje přežívání těchto buněk. Geny retL se mohou vložit do cílových buněk pomocí mnoha známých metod založených na použití buď virových nebo nevirových strategií.

Nevirové metody zahrnují elektroporaci, fúzi membrány s liposomy, bombardování mikroprojektily pokrytými DNA, inkubaci s precipitátem kalciumfosfát-DNA, transfekci zprostředkovanou

-23CZ 296516 B6

DEAE-dextranem a také přímé mikroinjekce do jednotlivých buněk. Např. gen retL může být vnesen do buňky komprecipitací s kalciumfosfátem (Pillicer et al., Science 209: 1414-1422, 1980), mechanickou mikroinjekcí a/nebo bombardováním mikročásticemi (Anderson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 5399-5403, 1980), přenosem DNA pomocí liposomů (např. transfekcí zprostředkovanou LIPOFECTINEM, Fefgner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 471-477, 1987 Gao a Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm. 179: 280-285,1991), transfekcí zprostředkovanou DEAE-dextranem, elektroporací (Patent USA 4 956 288) nebo metodou užívající polylysin, kde je DNA konjugována tak, že je přednostně transportována do hepatocytů jater (Wolf et al., Science 247: 465-468,1990, Curiel et al., Human Gene Therapy 3: 147-154, 1992).

Cílové buňky mohou být transfekovány geny podle vynálezu přímým přenosem genů (viz např. Wolff et al., „Direct gene Transfer Into Moose Muscle Muscle In Vivo“, Science 247, 1465-68, 1990. V mnoha případech však bude žádoucí přenos zprostředkovaný vektorem. Kterákoliv vhodná metoda pro vložení polynukleotidové sekvence do vektoru v oboru známá se může použít (viz. např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY, 1992, na obě publikace se tímto plně odkazujeme).

Aktivace promotoru může být tkáňově specifická nebo indukovatelná metabolickým produktem nebo podanou látkou. K takovým promotorům/enhancerům (zesilovačům) patří např. nativní promotor RetL, časný promotor/enhancer cytomegaloviru (Karasuyama et al., J. Exp. Med., 169: 13, 1989), lidský promotor beta-aktinu (Cunning et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84. 4831, 1987, promotor indukovatelný glukokortikoidy přítomný dlouhých terminálních repeticích (LTR) myšího viru MMTV (Klessig et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1354, 1984), sekvence dlouhých terminálních repetic viru Moloneyho myší leukémie (MuLV LTR) (Weiss et al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratoiy, Cold Spring Harbor, NY, 1985), promotor časného úseku SV40 (Bemoist a Chambon, Nátuře 290: 304, 1981, promotor viru Rousova sarkomu (RSV) (Yamamoto et al., Cell 22: 787, 1980), promotor thymidinkinázy z viru herpes simplex (HSV) (Wagner et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA 78: 1441, 1981) a promotor adenoviru (Yamada et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 3567, 1985), přičemž možnosti nejsou omezeny pouze na tyto příklady.

Geny retL mohou být vneseny do buněk také specifickými virovými vektory určenými pro použití v systémech přenosu genů, které jsou již dobře zavedeny. Takové systémy popsali např. Madzak et al., J. Gen. Virol. 73: 1533-36, 1992 (papovirus SV40), Beckner et al., Curr. Top Microbiol. Immunol. 158: 39-61, 1992 (adenovirus), Hofman etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92. 10099-10103, 1995 (bakuloviry), Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 25-38, 1992 (virus vaccinia), Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-123, 1992 (viry asociované s adenovirem), Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 67-93, 1992 (herpes simplex virus (HSV) a virus Epstein-Barrové (HBV)), Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24, 1992 (retrovírus), Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol. 4: 749-754, 1984 (retrovirus), Miller et al., Nátuře 357: 450-455, 1992 (retrovirus), Anderson, Acience 256: 808-813, 1992 (retrovirus), Ausubel et al., Curent Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989, kapitoly 9.10 až 9.14, všechny tyto citace jsou součástí referencí).

Výhodné vektory jsou DNA viry, kam patří adenoviry (výhodně vektory založené na Ad-2 a Ad-5), bakuloviry, herpetické viry (výhodně vektory založené na hepes simplex viru) a parvoviry (výhodně vektory založené na defektivních nebo neautonomních parvovirech, výhodněji vektory založené na virech asociovaných s adenoviry, nejvýhodněji vektory založené na AAV2). Pro další informace k této oblasti viz např. Ali et al., Gene Therapy 1: 367-384, 1994, patenty USA č. 4 797 368, 5 399 346 a také následující diskuse.

Výběr konkrétního vektorového systému pro přenos např. sekvence RetL, je závislý na řadě faktorů. Jedním důležitým faktorem je povaha populace cílových buněk. Ačkoliv retrovirové vektory byly intenzivně zkoumány a jsou používány v mnoha aplikacích genové terapie, obecně nejsou vhodné pro infekci nedělících se buněk, a tak mohou být užitečné pro léčení nádorů,

-24CZ 290516 B6 neboť se integrují a exprimují své geny pouze v replikujících se buňkách. Jsou také užitečné pro využití exi vivo, kde jsou velmi atraktivní vzhledem k jejich stabilní integraci do genomu hostitele.

Adenoviry jsou DNA viry eukaryot, které je možné modifikovat tak, že účinně přenášejí terapeutické nebo reportérové transgeny do buněk mnoha různých typů. Adenoviry obecných typů 2 a 5 (Ad2 a Ad5), které způsobují respirační onemocnění lidí, byly nyní upraveny pro genovou terapii Duchennovy svalové dystrofie (DMD) a cystické fíbrózy (CF). Jak Ad2 tak Ad5 patří do podtřídy adenovirů, které nejsou spojeny s malignitami u lidí. Adenovirové vektory jsou schopné poskytnout extrémně vysokou úroveň přenosu genů prakticky do buněk všech typů, bez ohledu na jejich mitotické stadium. Vysoký titr viru (10¹³ jednotek tvořících plak/ml) lze snadno získat v buňkách „293“ (komplementační linie buněk lidských embryonálních ledvin transformovaných adenovirem, ATCC CRL1573) a uchovávat v kryoprezervovaném stavu po dlouhou dobu bez znatelných ztrát. Účinnost tohoto systému v přenosu terapeutických transgenů in vivo pro komplementaci stavu genové nerovnováhy byly demostrovány pro různé nemoci na zvířecích modelech, viz např. Watanabe, Y., Atherosclerosos 36, 261-268, 1986, Tanzawa, K. et al., FEBS Letters 118 (1): 81-84, 1980, Golasten, J.L. et al., New Engl. J. Med. 309 (11983): 288-296, 1983, Inshibashi, S. et al., J. Clin. Invest. 92: 883-893, 1993 a Ishibashi, S. et al., J. Clin. Invest. 93: 1889-1893, 1994, přičemž všechny uvedené citace jsou zahrnuty v referencích. Rekombinantní replikaČně defektní adenovirus kódující cDNA pro transmembránový regulátor cystické fíbrózy (CTFR) byl skutečně schválen pro použití alespoň ve dvou klinických pokusech na lidské CF (Wilson, J., Nátuře 365: 691-692 (21. říjen 1993). Extenzivní zkušenost s živými adenovirovými vakcínami užívanými v lidské populaci je dalším faktorem svědčícím o bezpečnosti rekombinantních adenovirů pro genovou terapii.

Lidské adenoviry obsahují genom tvořený lineární dvouřetězcovou DNA dlouhou přibližně 36 kb, která je rozdělena do 100 mapových jednotek (m.u.), každá o délce 360 bp.DNA obsahuje krátké terminální investorové repetice (ITR) na každém konci genomu, které jsou nezbytné pro replikaci virové DNA. Genové produkty jsou organizovány do časného (El až E4) a pozdního (LI až L5) úseku, v závislosti na tom, zda jsou geny exprimovány před nebo po iniciaci syntézy virové DNA (viz Horwitz, Virology, 2^nd Et., Fields, B.N. (ed), Raven Press Ltd., New York, 1990.

Rekombinantní replikačně defektní adenoviry první generace které byly připraveny pro genovou terapii DMD a dalších dědičných onemocnění mají odstraněný celý úsek Ela a část úseku Elb. Replikačně defektní virus se množí v buňkách „293“ obsahujících funkční adenovirový gen Ela, který poskytuje tras-působící produkt Ela. Viry s delecí El jsou schopny replikace a produkce infekčních částic v buňkách „293“, které poskytují v trans genové produkty úseků Ela a Elb. Výsledný virus je schopen infikovat buňky mnoha typů a exprimovat vložený gen (za předpokladu že má svůj vlastní promotor), ale není schopen replikace v buňkách, které nemají DNA pro úsek El, pokud buňky nejsou infikovány obrovským nadbytkem infekčního viru. Adenoviry mají výhodu, že mají široké hostitelské spektrum, mohou infikovat klidové nebo diferencované buňky jako jsou např. neurony, a jsou v zásadě neonkogenní. Adenoviry se neintegrují do genomu hostitele. Jelikož existují v buňce extrachromozomálně, je podstatně sníženo riziko inzertní mutageneze Ali et al., supra, 373). Rekombinantní adenoviry (rAdV) tvoří velmi vysoké titry, virové částice jsou přiměřeně stabilní, úroveň exprese je vysoká a mohou infikovat široké spektrum buněk. Jejich přirozeným hostitelem jsou buňky epitelu dýchacích cest, takže jsou vhodné pro terapii plicní rakoviny.

Přenos genů zprostředkovaný bakuloviry má některé výhody. Přenos genů bakuloviry se může uskutečnit jak do replikující se tak i do nereplikující se buňky, také do ledvinné buňky, a stejně tak do hepatocytů, nervových buněk, a buněk sleziny, kůže a svalu. Bakulovirus se nereplikuje v savčích buňkách a není pro ně patogenní. Člověk postrádá protilátky proti rekombinantním bakulovirům, které by mohly zabránit infekci. Navíc jsou bakuloviry schopny inkorporovat a přenášet velmi velké inzerty DNA.

-25CZ 296516 B6

Viry asociované s adenoviry (AAV) byly také využity jako vektory pro somatickou genovou terapii. AAV je malý virus s jednořetězcovou DNA (sDNA) s jednoduše uspořádaným genomem (4,7 kb), což z něho činí ideální substrát pro genové inženýrství. Dva otevřené čtecí rámce kódují série polypeptidů rep a cap. Polypeptidy rep (rep78, rep68, rep62 a rep40) se účastní replikace, uvolnění a integrace genomu AAV.

Životní cyklus AAv je dvoufázový, skládá se z fáze latentní a lytické. V průběhu latentní infekce visiony AAV vstupují do buňky jako enkapsidovaná ssDNA a krátce nato se dostanou k jádru, kde se ssDNA stabilně integruje do hostitelského chromozomu, aniž by k tomu bylo třeba dělení hostitelské buňky. Bez přítomnosti pomocného viru integrovaný virus AAV zůstává latentní, ale je schopen aktivace a uvolnění. Lytická fáze životního cyklu začíná, když buňka nesoucí provirus A V je aktivována sekundární infekcí herpetickým virem nebo adenovirem, které kódují pomocnou funkci, která je využita AW jako pomoc pro vystřižení z hostitelského chromozomu (Carter, B.J. supra). Původní infikující ssDNA se rozvine do dvoušroubovicové replikační formy (RF) DNA způsobem který je závislý na rep. Uvolněné genomy AAV jsou zabaleny do proteinové kapsidy (která má ikosahedrickou symetrii a průměr asi 20 nm) a po buněčné lýze se uvolňují jako infekční viriony, které obsahují genom buď +ssDNA nebo-ssDNA.

AAV viry mají významný potenciál pro genovou terapii. Virové částice jsou velmi stabilní a rekombinantní AAV (rAAV) mají vlastnosti podobné léčivům jako to, že se dají purifikovat peletováním nebo pomocí pásů v gradientu CsCl. Dále jsou teplotně stabilní a mohou se lyofilizovat na prášek a pak rehydratovat, čímž získají opět plnou aktivitu. Jejich DNA se stabilně integruje do chromozomu hostitele, takže exprese je dlouhodobá. Hostitelské spektrum je velmi široké a přitom AAV nezpůsobuje žádnou známo nemoc, takže rekombinantní vektory jsou zcela netoxické.

Po vložení do cílové buňky může být daná sekvence identifikována konvenčními metodami jako je např. hybridizace nukleových kyselin pomocí sond, které obsahují sekvence homologní/komplementámí k sekvencím genů vložených do vektoru. Jiným způsobem se může sekvence identifikovat tím, že je přítomna nebo nepřítomna funkce markerového genu (např. aktivita thymidinkinázy, rezistence k antibiotiku apod.) způsobená zavedením expresního vektoru do cílové buňky.

Formulace a podávání

Sloučeniny podle vynálezu se mohou podávat jakýmkoliv způsobem, který je z lékařského hlediska přijatelný. To zahrnuje např. injekce, např. intravenózní, intarvaskulámí, intraarteriální, subkutánni, intramuskulámí, do nádoru, intraperitoneální, intraventrikulámí nebo intraepidurální, nebo podávání perorální, nazální oftalimické, rektální nebo topické. Systém pro kontinuální podávání je také specificky zahrnut v předkládaném vynálezu např. v podobě depotních injekcí nebo erodovatelných implantátů. Lokalizované podávání je zvláště vhodné, jako např. prostřednictvím katétru do jedné nebo více arterií, jako je např. renální arterie nebo céva zásobující lokalizovaný nádor.

Termín „farmaceuticky přijatelný nosič“ znamená jednu nebo více organických nebo anorganických látek, přírodních nebo syntetických, se kterými je mutovaný protoonkogen nebo mutovaný onkoprotein kombinován pro usnadnění aplikace. Vhodným nosičem je např. sterilní fyziologický roztok, ačkoliv odborníkovi je známa celá řada vodných i nevodných izotonických sterilních roztoků a sterilních suspenzí farmaceuticky přijatelných. Termín „nosič“ v tomto případě zahrnuje i lipozomy a protein tat z HIV-1 (viz Chen et al., Anal. biochem. 227: 168-175, 1995), a také jakýkoliv plazmidový nebo virový expresní vektor. „Účinné množství“ znamená takové množství, které je schopné odstranit nebo zpomalit progresi nemoci nebo degenerativní stav či poškození. Účinné množství je možné stanovit individuálně a je zčásti založeno na zvážení symptomů, které je třeba léčit, a vyžadovaných výsledků. Účinné množství může odborník se znalostí těchto faktorů stanovit rutinním způsobem bez nepřiměřeného experimentování.

-26</. Z903I0 B6

Liposomový systém může být jakýkoliv systém jednovrstevných váčků, mnohavrstevných váčků nebo stabilních několikavrstevných váčků, které se mohou připravit a podávat způsoby, které jsou odborníkovi dobře známy, např. jak se popisuje v patentech USA 5 169 637, 4 762 915, 5 000 958 nebo 5 185 154. Kromě toho se může ukázat potřeba exprimovat nové polypeptidy podle vynálezu a jiné vybrané polypeptidy jako lipoproteiny, aby se zvýšila jejich schopnost vázat se na liposomy. Tak například akutní ledvinné selhání člověka lze léčit in vivo RetL zabaleným v liposomu tak, že se tento RetL zavede do potřebných buněk pomocí liposomů. Liposomy se pak mohou podat renálním katétrem do renální arterie. Rekombinantní protein RetL se purifíkuje, např. z buněk CHO imunoafínitní chromatografií nebo jinou obvyklou metodou, pak se smíchá s liposomy a inkorporuje se do nich s velkou účinností. Obalený protein je možné testovat in vitro libovolným testem na stimulaci buněčného růstu.

Nový polypeptid podle předkládaného vynálezu je možné také podat zvířeti pomocí liposomového systému, čímž se zvýší jeho stabilita a imunogeničnost. Podání nových polypeptidů prostřednictvím liposomů je zvláště výhodné, protože liposomy jsou intemalizovány fagocytujícími buňkami v ošetřovaném zvířeti. Takové buňky poté, co rozloží membránu liposomu prezentují polypeptid imunitnímu systému ve spojení s dalšími molekulami, které jsou nutné k vyvolání silné imunitní odpovědi.

Kterýkoliv z nových polypeptidů podle předkládaného vynálezu může být použit ve formě farmaceuticky přijatelné soli. Vhodné kyseliny a zásady, které jsou schopné vytvářet soli s polypeptidy podle vynálezu jsou odborníkovi dobře známy a patří k nim jak organické tak i anorganické kyseliny a zásady.

Ačkoliv předkládaný vynález byl z důvodu jasnosti a lepšího pochopení podrobně popsán pomocí ilustrací a příkladů, odborníkovu je zřejmé, že v rámci vynálezecké myšlenky je možno provést jisté modifikace, předmět vynálezu je tudíž omezen pouze následujícími nároky.

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3616 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 257...1660

-27CZ 296516 B6 (ix) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

GCGGCCGCAG

CCCGCCCC-GA

ACCCTGGATG ACGCTGAGCT

GTTGGG7CGG

U - VJMXJ 4

GAGCTG.AACT CTCTCCCCGA

AACTGAACCC

TGGCGGCGGT TTGAGTGGCC GACCGGGCGG

CTGAAAGCC-G GGGCGGCAGA AGAGGAGCGC CGGCTTTGGA

GTCCGCCTCC GCGACGGGGA AGTCGCCCGG TTTTGGGGGG

CGCCCTCGCG

GTCTGCTCTC

GGA7CGCTGC GCGGGGACCA

GCTGCGCGGC GGCACC ATG TTC CTA GCC ACT CTG TAC TTC GCG CTG CCA

Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro 15 10

CTC

CTG

GAT

TTG

CTG

ATG

TCC

GCC

GAG

GTG

AGT

GGT

GGA

GAC

CGT

CTG

Leu

Leu

A.sp

Leu

Leu

Met

Ser

Ala

Glu

Val

Ser

Gly

Gly

Asp

Airg

Leu

15

20

25

GAC

TY'*' 4 »

GTG

AAA

GCC

AC-C

C-AT

CAG

TGC

CTG

AAG

GAA

CAG

AGC

TGC

AGC

Asp

Cys

Val

Lys

Ala

Ser

Asp

Gin

Cys

Leu

Lys

Glu

Gin

Ser

Cys

Ser

33

35

40

ACC

· w /»

i At.

CGC

ACA

CTA

AGO

CAG

TGC

GTG

GCG

GGC

AAG

GAA

ACC

AAC

Thr

Lys

íx~

λΧ ζ

Thr

Leu

Arff

Gin

Cys

Val

Ala

Gly

Lys

Glu

Thr

Asn

45

50

55

TTC

AGC

CTG

ACA

TCC

C-C-C

CTT

GAG

GCC

AAG

GAT

GAG

TGC

CGT

AGC

GCC

Phe

Ser

Leu

r*··— «-

Ser

Gly

Leu

Glu

A1 a

Lys

Asp

Glu

Cys

Arg

Ser

Ala

60

65

70

75

ATG

GA.G

GCC

TTG

λλλ

CAG

AAG

TCT

CTG

TAC

AAC

TGC

CGC

TGC

AAG

CC-G

Met

Glu

Ala

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Leu

Tyr

Asn

Cys

Aurg

cys

Lys

Arg

80

85

90

GGC

ATG

AAG

AAA

GAG

AAG

AAT

TGT

CTG

CGT

ATC

TAC

TGG

AGC

ATG

TAC

Gly

Met

Lys

Lys

Glu

Lys

Asn

cys

Leu

Arg

Ile

Tyr

Trp

Ser

Met

Tyr

95

100

105

CAG

AGC

CTG

CAG

GGA

AAT

GAC

CTC

CTG

GAA

GAT

TCC

CCG

TAT

GAG

CCG

Gin

Ser

Leu

Gin

Gly

Asn

Asp

Leu

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro

110

115

120

GTT

AAC

AGC

AGG

TTG

TCA

GAT

ATA

TTC

CGG

GCA

GTC

CCG

TTC

ATA

TCA

Val

Asn

Ser

Arg

Leu

Ser

Asp

Ile

Phe

Arg

Ala

Val

Pro

Phe

Ile

Ser

125

130

135

GAT

GTT

TTC

CAG

CAA

GTG

GAA

CAC

ATT

TCC

AAA

GGG

AAC

AAC

TGC

CTG

Asp

Val

Phe

Gin

Gin

Val

Glu

His

Ile

Ser

Lys

Gly

Asn

Asn

Cys

Leu

140

145

150

155

-28CZ 296516 B6

GAC

GCA

GCC

AAG

GCC

TGC

AAC

CTG

GAC

GAC

ACC

TGT

AAG

AAG

TAC

AGG

Asp

Ala

Ala

Lys

A1 fi

cys

Asn

Leu

ASp

Asp

Thr

Cys

Lys

Lys

Tyr

Arg

160

165

170

TCG C-CC TAC ATC ACC CCC TC-C ACC ACC AGC ATG TCC AAC GAG GTC TGC

Ser Ala Tyr Ile Thr Pro Cys Thr Thr Ser Hec Ser Asn Glu Val Cys 1'5 180 165

AAC

CGC

CGT

AAG

TGC

CAC

AAG

GCC

CTC

AGG

CAG

TTC

TTC

GAC

AAG

GTT

Asn

Arg

Arg

Lys

cys

His

Lys

Ala

Leu

Arg

Gin

Phe

Phe

Asp

Lys

Val

190

195

200

CCG

GCC

AAG

CAC

AGC

TAC

GC-G

ATG

CTC

TTC

TGC

TCC

TGC

CGG

GAC

ATC

Pro

Ala

Lys

His

ser

Tyr

Gly

Met

Leu

Phe

Cys

Ser

Cys

Arg

Asp

Ile

205 210 215

GCC TGC ACC GAG 961

CGG CGG CGA CAG ACT ATC GTC

CCC GTG

TGC TCC

TAT Tyr 235

Ala Cys 220

Thr

Glu

Arg

Arg 225

Arg

Gin

Thr

Ile

Val 230

Pro

Val

Cys

Ser

GAA

GAA

CGA

GAG

AGG

CCC

AAC

TGC

CTG

AGT

CTG

CAA

GAC

TCC

TGC

AAG

1009

Glu

Glu

Arg

Glu

Arg

Pro

Asn

Cys

Leu

Ser

Leu

Gin

Asp

Ser

Cys

Lys

240 245 250

ACC AAT TAC ATC TC-C AGA TCT CGC CTT GCA GAT TTT TTT ACC AAC TGC 1057

Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys

255

260

265

CAG

CCA

GAG

TCA

AGG

TCT

GTC

AGC

AAC

TGT

CTT

AAG

GAG

AAC

TAC

GCA

1105

Gin

Pro

Glu

Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Asn

cys

Leu

Lys

Glu

Asn

Tyr

Ala

270

275

280

GAC

TGC

CTC

CTG

GCC

F— * • Λ —

TCG

GGA

CTG

ATT

GGC

ACA

GTC

ATG

rX 1

CCC

1153

Asp

Cys

Leu

Leu

Ala

Tyr

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Val

Met

Thr

Pro

265

290

295

AAC

TAC

C-TA

GAC

TCC

AGC

AGC

CTC

AGC

GTG

GCA

CCA

TGG

TGT

GAC

1201

Asn

Tyr

Val

Asp

Ser

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

Ala

Pro

Trp

cys

Asp

Cys

300

305

310

315

AGC

AAC

AGC

GGC

AAT

GAC

CTG

GAA

GAC

TGC

TTG

AAA

TTT

CTG

AAT

TTT

1249

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

Asp

Leu

Glu

Asp

Cys

Leu

Lys

Phe

Leu

Asn

Phe

320

325

330

TTT

AAG

GAC

AAT

ACT

TGT

CTC

AAA

AAT

GCA

ATT

CAA

GCC

TTT

GGC

AAT

1297

Phe

Lys

Asp

Asn

Thr

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

Ile

Gin

Ala

Phe

Gly

Asn

335

340

345

GGC

TCA

GAT

GTG

ACC

ATG

TGG

CAG

CCA

GCC

CCT

CCA

GTC

CAG

ACC

ACC

1345

Gly

Ser

Asp

Val

Thr

Met

Trp

Gin

Pro

Ala

Pro

Pro

val

Gin

Thr

Thr

350

355

360

-29CZ 296516 B6

ACT 1393 Thr

GCC ACC

ACT Thr

ACC Thr

ACT Thr

GCC TTC CGG

GTC AAG AAC

AAG CCT CTG

GGG Gly

Lys

Pro

Leu

Ala 365

Thr

Ala 370

Phe

Arg

Val

Lys

Asn 375

CCA

GCA

GGG

TCT

GAG

AAT

GAG

ATC

CCC

ACA

CAC

GTT

TTA

CCA

CCC

TGT

1441

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

Asn

Glu

I le

Pro

Thr

His

Val

Leu

Pro

Pro

Cys

380

385

390

395

GCG

AAT

TTG

CAG

GCT

CAG

AAG

CTG

AAA

TCC

AAT

GTG

TCG

GGT

AGC

ACA

1469

Ala

Asn

Leu

Gin

Ala

Gin

Lys

Leu

Lys

Ser

Asn

Val

Ser

Gly

Ser

Thr

400

405

410

CAC

CTC

TGT

CTT

TCT

GAT

AGT

GAT

TTC

GGA

AAG

GAT

GGT

CTC

GCT

GGT

1537

His

Leu

cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Asp

Phe

Gly

Lys

Asp

Gly

Leu

Ala

Gly

415

420

425

GCC

TCC

AGC

CAC

ATA

ACC

ACA

AAA

TCA

ATG

GCT

GCT

CCT

CCC

AGC

TGC

1585

Ala

Ser

Ser

His

Xle

Thr

Thr

Lys

Ser

Met

Ala

Ala

Pro

Pro

Ser

cys

430

435

440

AGT

CTG

AGC

TCA

CTG

CCG

GTG

CTG

ATG

CTC

ACC

GCC

CTT

C-CT

GCC

CTG

1633

Ser

Leu

Ser

Ser

Leu

Pro

Val

Leu

Met

Leu

Thr

Ala

Leu

Ala

Ala

Leu

445

450

455

TTA

TCT

G7A

TCG

TTG

GCA

GAA

ACG

TCG

TAGCTGCATC CGGGAAAACA

1680

Leu

Ser

Val

Ser

Leu

Ala

Glu

Thr

Ser

460

465

GTATGAAAAG 1740	ACAAAAGAGA	ACCAAGTATT	C7GTCCCTGT	CC7C77C7AT	ATCTGAAAA7
CCAGTTTTAA 1800	AAGCTCCGT?	GAGAAGCAGT	TTCACCCAAC	TC-GAACTCTT	TCCTTG7T7T
TAA.GAAAGCT 1860	TGTGGCCC7C	AGGC-C-CTTCT	GTTGAAGAAC	TGC7ACAC-GG	CTAATTCCAA
ACCCATAAC-G 1920	CTC7GGC-C-CG	TGGTGCGGCT	TAAGGGGACC	ATTTGCACCA	TGTAAAGCAA
GCTGGGCTTA 1980	TCATG7G77T	GATGG7GAGG	ATGGTAGTG-G	TGÁTGATGAT	ggtaatttta
ACAGCTTGAA 2040	CCCTGTTCTC	TCTACTGGTT	AGGAACAGGA	GATACTATTG	ATAAAGATTC
TTCCATGTCT 2100	TACTCAGCAG	CA7TGCCTTC	TGAAGACAGG	CCCGCAGCCT	AGTGTGAATG
ACAAGTGGAG 2160	GTTGGCCTCA	AGAGTGGACT	TGGCAGACTC	TACCTTGTAG	TAATG77CAC
CTTTCCGTGT 2220	ATGGTCTCCA	CAGAGTGTTT	ATGTATTTAC	AGAC7GTTCT	GTGATCCCCC
AACAACAACA	ACCACAAATT	CCTTGG7CAC	CTCCAAATGT	AACCGGTCCT	TTAGCCCAGT

2280

-30CL 296516 B6

AGAGGAGGGT 2340	GGGTGTGGCC	CTGGCACAGC	TCCCGGATTG	T7GATGGGCA	CTCTCCTGAG
CTTTGCTTGA 2400	GTGAGAAGCT	GAA7GTAGCT	GA-AAATCAAC	TCT7C77ACA	CTTCTTACTG
CTTCGTTCAC 2460	TTACGAGGTC	ACATATAGAA	CAAACATCAC	CAACTATTAG	CTTACCGTTA
GCTTCCCAAC 2520	TATTAGC7T7	CTATGTTT7G	AAAGCAGTGT	TGCTGACCCC	ATGTTTTAAT
GATGGTTTAA 2580	TACATGCAGC	CCTTTCCTCT	CATCGGTAAC	ACTAGCTCCA	ACATCAACTT
CATGCATGTG 2640	GCTCTCAAAA	GCAGGCCCCA	AGAAGCCCAG	TTCTTTAGGA	GAAAGCTGCG
TCCTGTTTCT 2700	G7GGACAGGC	AGGAGGAAAC	AGAGCAGCCT	GCCCGTGGTG	TCTTTA7CTG
T7TTGAAA7C 2760	AAGGC7GCCT	G7G7GTAAGG	AATGGT7CAA	TTCTTATAAA	GGGTGCCACT
GTTGATGCCA 2820	CAACTGGCAG	T7GGTCTAGC	TCCAGGACAC	CGGTTTCCAT	GTTGCC7GGC
AGAGACAGCT 2880	T7GATTGGGA	CTGGCTGGCC	ACAAGGGATG	GGATGAAGAT	GTGCTGCCCT
CTCTTTCA.AA 2940	GTTGAGCCC7	GCCAGGGCAC	ATAGAAGCAT	CTTTGC7CCT	GACCA.CAACG
TAGAACAGCT 3000	TGGATTCAAG	G7GATC.AAGC	G7CTCCTG7A	CATTGCTCTG	TGACCTTCAT
AACAGACTGT 3060	CCCGCACAAA	AGGAACGGCA	G77TATGGAT	CTAGAGTGGG	AGCACAGGG7
Z“*Z·“*/-»** V. · * 3120	GAACCC-A7TG	GCAAAATACA	CAGAACAGGA	GGGAGAG7CT	CAAGCCGAGA
CATCTTGCTT 3180	ACTAGCCACA	CACCATCTCC	TGGAGCCCTG	CTCCTGACCT	GGGCAGACCC
TTAGGTGTAT 3240	A7CTA.AAGAC	CTCT7CAA.7G	T7CAGG77CA	GAATCTGTAA	A7GGT7GCGT
CCTGGCACCC 3300	ATTCCTG.AAA	AC7GAACAAA	GGAGAGGATA	TCTTTCCTCC	ATTGAGCCCT
GAAAGTATGA 3360	CTGGCTTCTC	ACCCTCCCAC	AGAGCAGGGA	GCCCTGGTGC	ACACAG7CTC
CTGATATCCT 3420	CCCTGCTCTT	TGAGG7TTGC	CTTGGGAGAA	AATGATTCAC	CTCGGGAGGG
GACGCTTTGG 3480	TGTCTGAAGT	ACGTTTATAT	CGAAA7GTTA	ATGAATACCC	ATG7AAAATA
CTCAATAGCC 3540	ACCT77C77C	CCTTCACAAT	GTTTTCGAGG	GGAATGCATC	CAACATCCAA
G7GTACCTGG	TCAGTGGGAA	GTTCCATGAA	GACTCATACA	TTGAATAAAC	ATATTCGATG

3600

TGCCGAAAGC GGCCGC 3616

-31 CZ 296516 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 468 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

Met 1

Phe

Leu Ala

Thr 5

Leu

Tyr

Phe Ala

Leu 10

Pro

Leu

Leu Asp

Leu 15

Leu

Met

Ser

Ala

Glu

Val

Ser

Gly

Gly

Asp

Arg

Leu

Asp

Cys

Val

Lys

Ala

20

25

30

Ser

Asp

Gin

cys

Leu

Lys

Glu

Gin

Ser

Cys

Ser

Thr

Lys

Tyr

Arg

Thr

35

40

45

Leu

Arg

Gin

Cys

Val

Ala

Gly

Lys

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Leu

Thr

Ser

50

55

60

Gly

Leu

Glu

Ala

Lys

Asp

Glu

cys

Arg

Ser

Ala

Met

Glu

Ala

Leu

Lys

65

70

75

80

Gin

Lys

Ser

Leu

Tyr

Asn

Cys

Arg

Cys

Lvs

Arg

Gly

Met

Lys

Lys

Glu

85

90

95

Lys

Asn

Cys

Leu

kra

Ile

Tyr

Trp

Ser

Met

Tyr

Gin

Ser

Leu

Gin

C-ly

100

105

110

Asn

Asp

Leu

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro

Val

Asn

Ser

Arg

Leu

115

120

125

Ser

Asp

Ile

Phe

Are

Ala

Val

Pro

Phe

Ile

Ser

As o

Val

Phe

Gin

Gin

130

135

140

Val

Glu

His

Ile

Ser

Lys

Gly

Asn

Asn

Cys

Leu

Asp

Ala

Ala

Lys

Ala

145

150

155

160

Cys

Asn

Leu

Asp

Asp

Thr

Cys

Lys

Lys

Tyr

Arg

Ser

Ala

Tyr

Ile

Thr

165

170

175

Pro

Cys

Thr

Thr

Ser

Met

Ser

Asn

Glu

Val

Cys

Asn

Arg

Arg

Lys

Cys

180

185

190

His

Lys

Ala

Leu

Arg

Gin

Phe

Phe

Asp

Lys

Val

Pro

Ala

Lys

His

Ser

195

200

205

Tyr

Gly

Met

Leu

Phe

Cys

Ser

cys

Arg

Asp

Ile

Ala

Cys

Thr

Glu

Arg

210

215

220

Arg

Arg

Gin

Thr

Ile

Val

Pro

val

Cys

Ser

Tyr

Glu

Glu

Arg

Glu

Ara

225

230

235

240

Pro

Asn

cys

Leu

Ser

Leu

Gin

Asp

Ser

Cys

Lys

Thr

Asn

Tyr

Ile

Cys

245

250

255

Arg

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp

Phe

Phe

Thr

Asn

Cys

Gin

Pro

Glu

Ser

Arg

-32CZ zy&516 B6

260 26S 270

Ser

Val

Ser Asn 275

C/S

Leu

Lys Glu Asn 280

Tyr

Ala

Asp

Cys 285

Leu

Leu

Ala

Tyr

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Val

Ket

Thr

Pro

Asn

Tyr

Val

Asp

Ser

290

295

300

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

Ala

Pro

Trp

Cys

Asp

Cys

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

305

310

315

320

ASp

Leu

Glu

Asp

Cys

Leu

Lys

Phe

Leu

Asn

Phe

Phe

Lys

Asp

Asn

Thr

325

330

335

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

Ile

Gin

Ala

Phe

Gly

Asn

Gly

Ser

Asp

Val

Thr

340

345

350

Mec

Trp

Gin

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Gin

Thr

Thr

Thr

Ala

Thr

Thr

Thr

355

360

365

Thr

Ala

Phe

Arg

Val

Lys

Asn

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

370

375

380

Asn

Glu

Tle

Pro

His

Val

Leu

Pro

Pro

Cys

Ala

Asn

Leu

Gin

Ala

385

390

395

400

Gin

Lys

Leu

Lys

Ser

Asn

Val

Ser

Gly

Ser

Thr

His

Leu

Cys

Leu

Ser

405

410

415

Asp

Ser

Asp

Phe

Gly

Lys

Asp

Gly

Leu

Ala

Gly

Ala

Ser

Ser

His

Ile

420

425

430

Thr

Thr

Lys

Ser

Meu

Ala

Ala

Pro

Pro

Ser

Cys

Ser

Leu

Ser

Ser

Leu

435

440

445

Pro

Val

Leu

Leu

Thr

A- ci

Leu

Ala

Ala

Leu

Leu

Ser

Val

Ser

LřS —

450

455

460

Ala

Glu

Thr

Ser

465

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

.. AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGCGAAGGC GACGTCCGG

-33CZ 296516 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCTCGTC GCA 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCGCATC ACA 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1926 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 10...1920

-34CZ ZVOSIO B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

GCGGCCGCC ATG GCG AAG GCG ACG TCC GGC GCC GCA GGG CTG GGG CTG

Hec Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Gly Leu 470

475

480

336

432

624

144

192

240

288

384

480

528

576

672

720

768

AAG

CTG

TTT

TTG

CTG

CTG

CCG

CTA

CTG

GGA

GAA

GCC

CCG

CTG

GGT

CTC

Lys

Leu

Phe

Leu 485

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu 490

Gly

Glu

Ala

Pro

Leu 495

Gly

Leu

TAC

TTC

TCA

AGG

GAT

GCT

TAC

TGG

GAG

AGG

CTG

TAT

GTG

GAC

CAG

CCA

Tyr

Phe

Ser 500

Arg

Asp

Ala

Tyr

Trp 505

Glu

Arg

Leu

Tyr

Val 510

Asp

Gin

Pro

GCT

GGC

ACA

CCT

CTG

CTC

TAT

GTC

CAT

GCC

CTA

CGG

GAT

GCC

CCT

GGA

Ala

Gly 515

Thr

Pro

Leu

Leu

Tyr 520

Val

His

Ala

Leu

Arg 525

Asp

Ala

Pro

Gly

GAA

GTG

CCC

AGC

TTC

CGC

CTG

GGC

CAG

TAT

CTC

TAT

GGC

GTC

TAC

CGC

Glu 530

Val

Pro

Ser

Phe

Arg 535

Leu

Gly

Gin

Tyr

Leu 540

Tyr

Gly

Val

Tyr

Arg 545

ACG

CGT

CTG

CAT

GAG

AAT

GAC

TGG

ATC

CAC

ATC

GAT

GCG

GGC

ACT

GGC

Thr

Arg

Leu

His

Glu 550

Asn

Asp

Trp

Ile

His 555

Ile

Asp

Al a

Gly

Thr 560

Gly

CTC

CTC

TAC

CTC

AAT

CAG

AGC

CTG

GAC

CAT

AGT

TCC

TGG

GAG

CAG

CTC

Leu

Leu

Tyr

Leu 565

Asn

Gin

Ser

Leu

Asp 570

His

Ser

Ser

Trp

Glu 575

Gin

Leu

AGC

ATC

CGA

AAT

GGC

GGC

TTC

CCC

TTG

CTC

ACC

GTC

TTC

CTC

CAG

GTC

Ser

Ile

Arg 580

Asn

Gly

Gly

Phe

Pro 585

Leu

Leu

Thr

Val

Phe 590

Leu

Gin

Val

TTC

CTG

GGG

TCC

ACA

GCC

CAG

AGA

GAG

GGA

GAG

TGT

CAT

TGG

CCA

GGC

Phe

Leu 595

Gly

Ser

Thr

Ala

Gin 600

Arg

Glu

Gly

Glu

Cys 605

His

Trp

Pro

Gly

TGT

GCC

CGT

GTG

TAC

TT^

TCC

TTC

ATC

AAC

GAC

ACC

TTC

CCA

AAT

TGT

Cys 610

Ala

Arg

Val

Tyr

Phe 615

Ser

Phe

Ile

Asn

Asp 620

Thr

Phe

Pro

Asn

Cvs 625

AGC

TCC

TTC

AAA

GCC

CGG

GAT

CTC

TGC

ACC

CCA

GAG

ACG

C-GT

GTG

TCC

Ser

Ser

Phe

Lys

Ala 630

Arg

Asp

Leu

cys

635

Pro

Glu

Thr

Gly

Val 640

Ser

TTC

CGC

ATC

AGsj

GAG

AAC

AGG

CCC

CCT

GGC

ACC

TTC

TAC

CAG

T*7V·

CGC

Phe

Arg

Ile

Arg 645

Glu

Asn

A-rg

Pro

Pro 650

Gly

Thr

Phe

Tyr

Gin 655

Phe

Arg

ATG

CTA

CCT

GTG

CAG

TTC

CTT

TGT

CCT

AAC

ATC

AGT

GTG

AAG

TAC

EeC

Leu

Pro 660

Val

Glr.

Phe

Leu

Cys 6 65

Pro

Asn

Ile

Ser

Val 670

Lys

Tyr

Lys

CTC

TTA

GAA

GGG

GAC

C-GT

CTG

CCC

TTC

CGT

TGT

GAC

CCC

GAC

TGT

CTG

Leu

Leu 675

Glu

Gly

Asp

Gly

Leu 680

Pro

Phe

Arg

Cys

Asp 685

Pro

Asp

cys

Leu

GAG

GTG

AGC

ACG

CGG

TGG

GCA

CTG

GAT

CGG

GAG

CTT

CAG

GAG

AAG

TAT

Glu 690

Val

Ser

Thr

Arg

Trp 695

Ala

Leu

Asp

Arg

Glu 700

Leu

Gin

Glu

Lys

Tyr 705

GTG

CTG

GAG

GCT

GAG

TGC

GCA

GTG

GCA

GGC

CCT

GGA

GCC

AAC

AAG

GAG

Val

Leu

Glu

Ala

Glu 710

Cys

Ala

Val

Ala

Gly 715

Pro

Gly

Ala

Asn

Lys 720

Glu

AAG

GTG

GCC

GTG

TCC

TTC

CCG

GTG

ACG

GTG

TAT

GAT

GAA

GAC

GAC

TCC

816

-35CZ 296516 B6

Lys

Val

Ala

Val 725

Ser

Phe

Pro

V a 1

730

Val

Tyr Asp

Glu

Asp 735

Asp

Ser

CCG

CCC

ACC

TTC

TCC

GGA

GGT

GTG

GGC

ACC

GCC

AGT

GCT

GTG

GTG

GAG

E 64

Pra

?ro

Thr

Phe

Ser

Gly

Gly

Val

Gly

Thr

Ala

Ser

Ala

Val

Val

Glu

740

745

750

TTT

AAG

CGG

AAG

GAG

C-GC

ACT

GTG

GTA

GCC

ACT

CTG

CAG

GTG

TTT

GAT

912

Pr.e

Lys

Arg

Lys

Glu

Gly

Tr.r

Val

Val

Ala

Thr

Leu

Gin

Val

Phe

Asp

755

760

765

GCA

GAT

GTG

GTG

CCA

GCA

TCT

GGG

GAG

CTG

GTG

AGG

CGG

TAC

ACA

AGC

960

Ala

Asp

Val

Val

Pro

Ala

Ser

Gly

Glu

Leu

Val

Arg

Arg

Tyr

Thr

Ser

770

775

780

7S5

ACA

CTA

CTC

TCA

GGG

GAT

TCC

TGG

GCC

CAG

CAG

ACC

TTC

CGG

GTG

GAG

10C8

Thr

Leu

Leu

Ser

Gly

Asp

Ser

Trp

Ala

Gin

Gin

Thr

Phe

Arg

Val

Glu

790

795

800

CAC

ACA

CCC

AAC

GAG

ACC

TTG

GTC

CAG

TCC

AAC

AAC

AAC

TCC

GTG

CGG

1056

His

Thr

Pro

Asn

Glu

Thr

Leu

Val

Gin

Ser

Asn

Asn

Asn

Ser

Val

Arg

805

810

815

GCA

ACC

ATG

CAC

AAT

TAC

AAG

CTG

GTT

CTC

AAC

AGG

AGC

CTG

TCC

ATC

1104

Ala

Thr

Met

His

Asn

Tyr

Lys

Leu

Vel

Leu

Asn

Arg

Ser

Leu

Ser

Ile

820

825

830

TCA

GAG

AGC

CGA

GTC

CTG

CAG

CTA.

GTA.

GTC

CTG

GTC

AAT

GAC

TCA

GAC

1152

Ser

Glu

Ser

Arg

Val

Leu

Gin

Leu

Val

Val

Leu

Val

Asn

A.sp

Ser

Asp

83 5

840

845

TTC

CAG

C-GG

CCT

GGG

TCA

C-GT

GTT

CTC

TTC

CTC

CAT

TTC

AAC

GTG

TCT

12C0

Gin

Gly

Pro

Gly

Ser

Gly

Val

Leu

Phe

Leu

His

Phe

Asn

Vel

Ser

E53

655

860

865

GTG

CTG

CCT

GTC

ACC

CTG

AAC

CTA

CCC

ATG

GCC

TCC

TTC

CCA

GTG

1248

Val

Leu

Pro

Val

Thr

Leu

Asn

Leu

Pro

Met

Ala

Tyr

Ser

Phe

Pro

Val

870

875

880

AAT

AGG

AGA

GCC

CGC

CGT

GCC

CAG

ATT

GGG

AAA

GTT

TGC

GTG

GAG

1296

Asn

Arg

Arg

Ala

Arg

Arg

Tyr

Ala

Glr.

Ile

Gly

Lys

Val

Cys

Val

Glu

£85

890

895

AAC

TGC

CAG

GAG

TTC

AGC

GGT

GTC

TCC

ATC

CAG

TAC

AAG

CTG

CAG

CCC

1344

Asn

Cys

Gin

Glu

Phe

Ser

Gly

Val

Ser

Ile

Gin

Tyr

Lys

Leu

Gin

Pro

900

905

910

7CC

AC-C

ACC

AAC

TGC

AGT

GCC

CTA

GGT

GTG

GTC

ACC

TCA

ACA

GAA

GAC

1392

Ser

Ser

Thr

Asn

Cys

Ser

Ala

Leu

Gly

Val

Val

Thr

Ser

Thr

Glu

Asp

$15

920

925

ACC

TCA

GGG

ACC

CTA

TAT

GTA

AAT

GAC

ACG

GAG

GCC

CTG

CGG

CGA

CCT

1440

-36CZ 290010 136

1488

1536

1584

1632

16S0

1728

1776

1824

1872

1920

Thr 930

Ser

Gly

Tr -

Leu

Tyr 935

Val

Asn

Asp

Thr

Glu 940

Ala

Leu

Arg

Arg

Pro 945

GAG

TGT

ACC

GAG

CTT

CAG

TAC

ACA

GTG

GTA

GCC

ACT

GAC

CGG

CAG

ACC

Glu

Cys

Thr

Glu

Leu 950

Gin

Thr

Val

Val 955

Ala

Thr

Asp

Arg

Gin 960

Thr

CGC

AGG

CAG

ACC

CAA

GCT

TCG

TTA

GTC

GTC

ACA

GTG

GAG

GGG

ACA

TAC

> Arg

Arg

Gin

Thr 965

Gin

Ala

Ser

Leu

Val 970

Val

Thr

Val

Glu

Gly 975

Thr

Tyr

ATT

GCA

GAA

GAA

GTG

GGC

TGC

CCC

AAG

TCC

TGT

GCA

GTA

AAC

AAG

AGG

1 Ile

Ala

Glu 980

Glu

Val

Gly

Cys

Pro 985

Lys

Ser

Cys

Ala

Val 990

Asn

Lys

Arg

CGA

CCT

GAG

TGT

GAG

GAG

TGT

C-GT

GGC

CTG

GGT

TCT

CCA

ACT

GGC

AGA

Arg

Pro 995

Glu

Cys

Glu

Glu

Cys Gly 10C0

Gly

Leu

Gly

Ser Pro 1005

Thr

Gly

Arg

TGT i

GAG

TGG

CGT

CAG

GGA

C-AT

GGT

ΑΛΑ

GGG

ATC

ACC

AGG

AAC

TTC

TCC

Cys Glu 1010

Trp

Arg

Gin

Gly Asp 1015

Gly

Lys

Gly

Ile Thr 1020

Arg

Asn

Phe

Ser 102

ACC •

TGT

TCT

CCT

AGC

ACC

AGG

ACC

TGT

CCT

GAT

GGC

CAC

TGT

GAT

GCT

i Thr

Cys

Ser

Pro

Ser 103:

Thr

Arg

Thr

Cys

Pro Asp 1035

Gly

His

Cys

Asp Ala 1040

CTG

GAG

AGC

CGG

GAT

ATC

AAC

ATT

TGC

CCC

CAG

GAC

TGT

CTC

CC-T

C-GC

Leu

Glu

Ser

Arg 104:

A.sp

Ile

Asn

Ile

Cys Pro 1050

Gin

A.sp

cys

Leu Arg 1055

Gly

ccc

ATT

GTT

GGC

C-GG

CAT

C-.AG

CC-A

C-GG

GAG

CC-C

CAG

C-GG

ATT

AAA

GCC

í Pro

Ile

Val Glv 1060

Gly

His

Glu

Arg Gly 1065

Glu

Arg

Gin

Gly Ile 1070

Lys

Ala

GGC >

TAT

C-GC

ATC

TGT

TTC

CCT

GAT

GAG

AAG

AA.G

TGC

TTC

T-GC

Gly

Tyr 107!

_Gly

Ile

Cys

Asn

Cys Phe 1080

Pro

Asp

Glu

Lys 10SÍ

Lys

Cys

Phe

Cys

GAG i

CCA

GAG

GAC

A>i w

CAG

GGC

CCA

T7G

TGT

GAT

GCG

CTG

TGC

CGC

ACG

i Glu

Pro

Glu

Asp

Ser

Gin

Gly

Pro

Leu

Cys

Asp

Ala

Leu

Cys

Arg

Thr

1090

1100

1095

11C5

GTCGAC

1926 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 637 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

-37CZ 296516 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

Met Ala 1

Lys

Ala

Thr 5

Ser

Gly Ala

Ala

Gly 10

Leu Gly

Leu

Lys

Leu 15

Phe

Leu

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Ala

Pro

Leu

Gly

Leu

Tyr

Phe

Ser

20

25

30

Arg

Asp

Ala

Tyr

Trp

Glu

Arg

Leu

Tyr

Val

Asp

Gin

Pro

Ala

Gly

Thr

35

40

45

Pro

Leu

Leu

Tyr

Val

His

Ala

Leu

Arg

Asp

Ala

Pro

Gly

Glu

Val

Pro

50

55

60

Ser

Phe

Arg

Leu

Gly

Gin

Tyr

Leu

Tyr

Gly

Val

Tyr

Arg

Thr

Arg

Leu

65

70

75

50

His

Glu

Asn

Asp

Trp

Ile

Kis

Ile

Asp

Ala

Gly

Thr

Gly

Leu

Leu

Tyr

55

90

95

Leu

Asn

Gin

Ser

Leu

Asp

His

Ser

Ser

Trp

Glu

Gin

Leu

Ser

Ile

Arg

100

105

110

Asn

Gly

Gly

Phe

Pro

Leu

Leu

Tr.r

Val

Phe

Leu

Gin

Val

Phe

Leu

Gly

115

120

125

Ser

Thr

Ala

Gin

Arg

Glu

Gly

Glu

cys

His

Trp

Pro

Gly

Cys

Ala

Arg

130

135

140

Val

Tyr

Phe

Ser

Phe

Ile

Asn

Asp

Thr

Phe

Pro

Asn

Cys

Ser

Ser

Phe

145

150

155

160

Lys

Ala

Arg

A.sp

Leu

Cys

Thr

Pro

Glu

Thr

Gly

Val

Ser

Phe

Ar o

Ile

165

170

175

Arg

Glu

Asn

Arg

Pro

Pro

Gly

Thr

Phe

Tyr

Gin

Phe

Are

Met

Leu

Pro

150

155

190

Val

Gin

Phe

Leu

cys

Pro

Asn

Ile

Ser

Val

Lys

Tyr

Lys

Leu

Leu

Glu

155

200

205

Gly

Asp

Gly

Leu

Pro

Phe

Arg

Cys

Asp

Pro

Asp

cys

Leu

Glu

Val

Ser

210

215

220

Thr

Arg

Trp

Ala

Leu

Asp

Arg

Glu

Leu

Gin

Glu

Lys

Tyr

Val

Leu

Glu

225

230

235

240

Ala

Glu

Cys

AI a

Val

Ala

Gly

Pro

Gly

Ala

Asn

Lvs

Glu

Lys

Val

Ala

245

250

255

Val

Ser

Phe

Pro

Val

Thr

Val

Tyr

Asp

Glu

Asp

Asp

Ser

Pro

Pro

260

265

270

Phe

Ser

Gly

Gly

Val

Gly

Thr

Ala

Ser

Ala

Val

Val

Glu

Phe

Lys

Arg

275

250

285

Lys

Glu

Gly

Thr

val

Val

Ala

Thr

Leu

Gin

Val

Phe

Asp

Ala

Asp

Val

290

295

300

Val

Pro

Ala

Ser

Gly

Glu

Leu

Val

Arg

Arg

Tyr

Thr

Ser

Thr

Leu

Leu

305

310

315

320

Ser

Gly

Asp

Ser

Trp

Ala

Gin

Gin

Thr

Phe

Arg

Val

Glu

His

Thr

Pro

325

330

335

-38CZ 296516 B6

Asn

Glu

Thr

Leu 34 0

Val

Gin

Ser

Asn

Asn 345

Asn

Ser

Val

Arg

Ala 350

Thr

Met

His

Asn

Tyr

Lys

Leu

Val

Leu

Asn

Arg

Ser

Leu

Ser

Ile

Ser

Glu

Ser

355

360

365

Arg

Val

Leu

Gin

Leu

Val

Val

Leu

Val

Asn

Asp

Ser

Asp

Phe

Gin

Gly

370

375

380

Pro

Gly

Ser

Gly

Val

Leu

Phe

Leu

His

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Leu

Pro

335

390

395

400

Val

Thr

Leu

Asn

Leu

Pro

Xet

Ala

Tyr

Ser

Phe

Pro

Val

Asn

Arg

Arg

4C5

410

415

Ala

Arg

Arg

Tyr

Ala

Gin

Ile

Gly

Lys

Val

Cys

Val

Glu

Asn

Cys

Gin

420

425

430

Glu

Phe

Ser

Gly

Val

Ser

Ile

Gin

Tyr

Lys

Leu

Gin

Pro

Ser

Ser

Thr

435

440

445

Asn

Cys

Ser

Ala

Leu

Gly

Val

Val

Thr

Ser

Thr

Glu

Asp

Thr

Ser

Gly

450

455

460

Thr

Leu

Tyr

Val

Asn

Asp

Thr

Glu

Ala

Leu

Arg

Arg

Pro

Glu

cys

Thr

465

470

475

480

Glu

Leu

Gin

Tyr

Thr

Val

Val

Ala

Thr

Asp

Arg

Gin

Thr

Arg

Arg

Gin

4 8 5

490

495

Thr

Gin

Ala

Ser

Leu

Val

Val

-v

Val

Glu

Gly

Thr

Tyr

Ile

Ala

Glu

500

505

510

Glu

Val

Glv

Cys

Pro

Lys

Ser

Cys

Ala

Val

Asn

Lys

Arg

Arg

Pro

Glu

515

520

525

Cys

Glu

Glu

Cys

Gly

Gly

Leu

Gly

Ser

Pro

Thr

Gly

Arg

Cys

Glu

Trp

530

535

540

Arg

Gin

Gly

Asp

Gly

Lys

Gly

Ile

Thr

Arg

Asn

Phe

Ser

Thr

Cys

Ser

545

550

555

560

Pxo

Ser

Thr

Arg

Thr

Cys

Pro

Asp

Gly

His

Cys

Asp

Ala

Leu

Glu

Ser

565

570

575

Ajrg

Asp

Ile

Asn

Ile

Cys

Pro

Gin

Asp

Cys

Leu

Arg

Gly

Pro

Ile

Val

530

555

590

Gly

Gly

His

C-lu

Arg

Gly

Glu

Arg

Gin

Gly

Ile

Lys

Ala

Gly

Tyr

Gly

595

600

605

Ile

Cys

Asn

Cys

Phe

Pro

As?

Glu

Lys

Lys

Cys

Phe

Cys

Glu

Pro

Glu

610

615

620

Asp

Ser

Gin

Gly

Pro

Leu

cys

Asp

Ala

Leu

Cys

Arg

Thr

625

630

635

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1223 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché ío (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

-39CZ 296516 B6 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 10...1038 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

48	CTG Leu	CTG GAG	GAT Asp	TCC Ser	CCA Pro	TAT Tyr	GAA Glu 645
Leu	Glu 640
	ATA	TTC	CGG	GTG	GTC	CCA	TTC	ATA
96
	Ile	Phe 655	Arg	Val	Val	Pro	Phe 660	Ile
	AAC	AAC	TGC	CTG	GAT	GCA	C-CG	AAG
144
	Asn 670	Asn	Cvs	Leu	Asp	Ala 675	Ala	Lys
	AAG	»♦ a*	TAC	AGG	TCG	GCG	TAC	ATC
192
	Lys	Lys	Tyr		Ser 69C	Ala	Tyr	Ile
	AAC	GAT	GTC	TC-C	AAC	CGC	CGC	» * rj-.vj
240
	Asn	Asp	Val	Cys 705	Asn	Arg	rUC	Lys
		GAC	AAG	GTC	CCG	GCC	AAG	CAC
288
	Phe	Asp	Lys 720	Val	Pro	Ala	Lys	His 725
	TGC	CC-G	GAC	ATC	GCC	CGC	ACA	GA.G
336
	Cys	Arg 735	Asp	Ile	Ala	Cys	740	Glu
	GTG	TGC	TCC	TAT	GAA	GAL·	AGG	GAG
384
	val 750	Cys	Ser	Tyr	Glu	Glu 755	Arg	Glu
	GAC	TCC	TGC	AAG	ACG	AAT	TAC	ATC
432
	Asp	Sejf	Cys	Lys	Thr 770	Asn	Tyr	Ile
	TTT	ACC	AAC	TGC	CAG	CCA	GAG	TCA
480
	Phe	Thr	Asn	Cys 85	Gin	Pro	Glu	Ser
	GAA	AAC	TAC	GCT	GAC	TGC	CTC	CTC
528
	Glu	Asn	Tyr 800	Ala	Asp	Cys	Leu	Leu 805

CCA GTT AAC AGC AGA TTG TCA GAT

Pro Val Asn Ser Arg Leu Ser Asp

650

TCA GTG GAG CAC ATT CCC AAA GGG

Ser Val Glu His Ile Pro Lys Gly

665

GCC TGC AAC CTC GAC GAC ATT TGC

Ala Cys Asn Leu Asp Asp Ile Cys

680685

ACC CCG TGC ACC ACC AGC GTG TCC

Thr Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser

655700

TGC CAC AAG GCC CTC CGG CAGTTC

Cys His Lys Ala Leu Arg GinPhe

710715

AGC TAC GGA ATG CTC TTC TGCTCC

Ser Tvr Gly Hec Leu Phe CvsSer

730

CGG AGG CGA CAG ACC ATC GTGCCT

Arg Arg Arg Gin Thr Ile Val Pro

745

AAG CCC AAC TGT TTG AAT TTG CAG

Lvs Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gin

760765

TGC AGA TCT CGC CTT GCG GATTTT

Cys Arg Ser Arg Leu Ala AspPhe

775780

AGG TCT GTC AGC AGC TGT C7AAAG

Arg Ser Val Ser Ser Cys LeuLys

790795

GCC TAC TCG GGG CTT ATT GGC ACA

Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr

810

-40CZ 296516 B6

576	GTC ATG	ACC CCC AAC	TAC ΑΤΑ	GAC Asp
Thr	Pro Asn	Tyr	Ile 820
Val	Met 815
	TGG	TGT	GAC	TGC	AGC	AAC	AGT	GGG
624
	Trp 820	Cys	Asp	Cys	Ser	Asn 835	Ser	Gly
	TTT	TTG	AAT	TTC	TTC	AAG	GAC	AAT
672
	Phe	Leu	Asn	Phe	Phe 850	Lys	Asp	Asn
	GCC	TTT	GGC	AAT	GGC	TCC	GAT	GTG
720
	Ala	Phe	Gly	Asn 865	Gly	Ser	Asp	Val
	GTA	CAG	ACC	ACC	ACT	GCC	ACT	ACC
768
	Val	Gin	Thr 880	Thr	Thr	Ala	Thr	Thr 885
	AAG	CCC	CTG	GGG	CCA	GCA	GGG	TCT
816
	Lys	Pro 895	Leu	Gly	Pro	Ala	Gly 900	Ser
	TTG	CCA	CCG	TGT	GCA	AAT	TTA	CAG
864
	Leu 910	Pro	Pro	Cys	Ala	Asn 915	Leu	Gin
	TCG	C-GC	A-AT	ACA	CAC	CTC	TG?	* í“ 4 -
912
	Ser	Gly	Asn	Thr	His 930	Leu	Cys	Ile
	C-GT	CTC	GGT	GCT	TCC	AGC	CAC	ATA
960
	Gly	Leu	Gly	Ala 945	Ser	Ser	His	Ile
CCA 1008	AGC	TGT	C-GT	CTG	AC-C	CCA	CTG
	Pro	Ser	Cys 960	Gly	Leu	Ser	Pro	Leu 965
TCC 1058	ACC	CTA	iVV * á m	7CT	TTA	ACA	GAA
	Ser	Thr 975	Leu	Leu	Sex	Leu	Thr 980	Glu

AATATGGACA TGTAAAAAGA CAAAAACCAA 1118

GAAATTCCAG TTTAGGAGCT CAGTTGAGAA 1178

TTTTCCTTTT AAGAAAGCTT CTTGTGATCC 1223

TCC AGT AGC CTC AGT GTG GCCCCA

Ser Ser Ser Leu Ser Val AlaPro

825

AAC GAC CTA GAA GAG TGC TTGAAA

Asn Asp Leu Glu Glu Cys LeuLys

840845

ACA TGT CTT AAA AAT GCA ATTCAA

Thr Cys Leu Lys Asn Ala IleGin

855860

ACC GTG TGG CAG CCA GCC TTCCCA

Thr Val Trp Gin Pra Ala PhePro

870875

ACC ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC

Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn

890

GAG AAT GAA ATT CCC ACT CA? GTT

Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val

905

GCA CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG

Ala Gin Lys Leu Lys Ser Asn Val

920925

TCC AAT GGT A\T TAT GAA AAA GAA

Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu

935940

ACC ACA AAA CCA ATG GCT C-CTCCT

Thr Thr Lys Ser Hec Ala AlaPro

950955

CTG GTG CTG GTG GTA ACC GCT CTG

Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu

970

ACA TCA TAGCTGCATT AAAAAAATAC

Thr Ser

GTTATCTGTT

ACAGTTCCAT

TTCGGGGCTT

TCCTGTTCTC TTGTATAGCT

TCAACTGGAA CATTTTTTTT

CTG TG

-41 CZ 296516 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 346 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein o

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

Leu 1

Leu

Glu

Asp

Ser Pro 5

Tyr

Glu Pro

Val 10

Asn

Ser

Arg

Leu Ser 15

Asp

Ile

Phe

Arg

Val 20

Val Pro

Phe

Ile Ser 25

Val

Glu

His

Ile

Pro Lys 30

Gly

Asn

Asn

Cys 35

Leu

Asp Ala

Ala

Lys Ala 40

Cys

Asn

Leu

Asp 45

Asp Ile

Cys

Lys

Lys 50

Tyr

Arg

Ser Ala

Tyr 55

Ile Thr

Pro

Cys

Thr 60

Thr

Ser val

Ser

Asn 65

Asp

Val

Cys

Asn Arg 70

Arg

Lys Cys

His

Lys 75

Ala

Leu

Arg Gin

Phe 80

Phe

Asp

Lys

Val

Pro Ala 65

Lys

His Ser

Tyr 90

Gly

Met

Leu

Phe Cys 95

Ser

cys

Arg

Asp

Xle 100

Ala Cys

Thr

Glu Arg 105

Arg

Arg

Gin

Thr

Ile Val 110

Pro

Val

cys

Ser 115

Tyr

Glu Glu

Arg

Glu Lvs 120

Pro

Asn

cys

Leu 125

Asn Leu

Gin

Asp

Ser 130

Cys

I.ys

Tyr 135

Ile Cys

Arg

Ser

Arg 140

Leu

Ala Asp

Phe

Phe 145

Thr

Asn

Cys

Gin Pro 150

Glu

Ser Arg

Ser

Val 155

Ser

Ser

Cys Leu

Lys 160

Glu

Asn

Tyr

Ala

Asp Cys 16 5

Leu

Leu Ala

Tyr 170

Ser

Gly

Leu

Ile Gly 175

Thr

Val

Met

Thr

Pro 1B0

Asn Tyr

Ile

Aso Ser 165

Ser

Ser

Leu

Ser

Val Ala 190

Pro

Trp

Cys

Asp 195

Cys

Ser Asn

Ser

Gly Asn 2C0

Asp

Leu

Glu

Glu 205

Cys Leu

Lys

Phe

Leu 210

Asn

Phe

Phe Lys

Asp 215

Asn Thr

Cys

Leu

Lys 220

Asn

Ala Ile

Gin

Ala 225

Phe

Gly

Asn

Gly Ser 230

Asp

Val Thr

Val

Trp 235

Gin

Pro

Ala Phe

Pro 240

Val

Gin

Thr

Thr

Thr Ala 245

Thr

Thr Thr

Thr 250

Ala

Leu

Arg

Val Lys 255

Asn

Lys

Pro

Leu

Gly 260

Pro Ala

Gly

Ser Glu 265

Asn

Glu

Ile

Pro

Thr His 270

Val

Leu

Pro

Pro 275

Cys

Ala Asn

Leu

Gin Ala 280

Gin

Lys

Leu

Lys 285

Ser Asn

Val

-42CZ 296516 B6

Ser

Gly Asn 290

1 ..i

His

Leu

Cys 295

Ile

Ser

Asn Gly Asn 300

Tyr Glu

Lys

Glu

Gly

Leu

Gly

Ala

Ser

Ser

His

Ile

Thr

Thr

Lys

Ser

Met

Ala

Ala

Pro

305

310

315

320

Pro

Ser

Cys

Gly

Leu

Ser

Pro

Leu

Leu

Val

Leu

Val

Val

Thr

Ala

Leu

32S

330

335

Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu

340

Thr Ser

345 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1682 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 118...1497 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

GGGCC-GCCAG AGCAGCACAG CTGTCCGGC-G ATCGCTGCAT GCTGAGCTCC CTCGGCAAGA 60

CCCAGCGGCG GCTCGGG.-.TT TTTTTGGGGG GC-CGGC-GACC AGCCCCGCGC CGGCACC

165

ATG TTC

CTG Leu

C-CG A1& 350

ACC CTG

TAC TTC GCG CTG

CCG CTC TTG

GAC A.sp 360

TTG Leu

CTC Leu

Ke z

Phe

Thr

Leu

Tyr

Phe

Ala 355

Leu

Pro

Leu Leu

CTG

TCG

GCC

GAA

GTG

AGC

C-GC

GGA

GAC

CGC

CTG

GAT

TGC

GTG

AAA

GCC

213

Leu

Ser

Ala

Glu

Val

Ser

Gly

Gly

Asp

Arg

Leu

Asp

Cys

Val

Lys

Ala

365

370

375

AGT

GAT

CAG

TGC

CTG

A—AG

GAG

CAG

AGC

TGC

AGC

ACC

AAG

TAC

CGC

ACG

261

Ser

Asp

Gin

Cys

Leu

Lys

Glu

Gin

Ser

Cys

Ser

Thr

Lys

Tyr

Arg

Thr

300

3S5

390

CTA

AGG

CAG

TGC

GTG

GCG

GGC

AAG

GAG

ACC

AAC

TTC

AGC

CTG

GCA

TCC

309

Leu

Arg

Gin

Cys

Val

Ala

Gly

Lys

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Leu

Ala

Ser

395

400

405

410

GGC

CTG

GAG

GCC

AAG

GAT

GAG

TGC

CGC

AGC

GCC

ATG

GAG

GCC

CTG

AAG

357

Gly

Leu

Glu

Ala

Lys

Asp

Glu

cys

Arg

Ser

Ala

Met

Glu

Ala

Leu

Lys

415

420

425

CAG

AAG

TCG

CTC

TAC

AAC

TGC

CGC

TGC

AAG

CGG

GGT

ATG

AAG

AAG

GAG

405

Gin

Lys

Ser

Leu

Tyr

Asn

Cys

Arg

Cys

Lys

Arg

Gly

Met

Lys

Lys

Glu

-43 CZ 296516 B6

420

435

440

AAG

AAC

4

CTG

CGC

ATT

TAC

í -r j

AGC

ATG

TAC

CAG

AGC

CTG

CAG

Lys

Asn

cys

Leu

Arg

Ile

‘ JT -

Trp

Ser

Met

Tyr

Gin

Ser

Leu

Gin

445

450

455

AAT

GAT

CTG

CTG

GAG

GAT

TCC

CCA

TAT

GAA

CCA

GTT

AAC

AGC

AGA

Asn

Asp

Leu

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro

Val

Asn

Ser

Arg

450

4 6 5

470

TCA

GAT

AT A

TTC

CGG

GTG

GTC

CCA

TTC

ATA

TCA

GTG

GAG

CAC

ATT

Ser

Asp

Ile

Phe

Arg

Val

Val

Pro

Phe

Ile

Ser

Val

Glu

His

Ile

475

430

485

ΑΛΑ

GGG

AAC

AAC

TGC

CTG

GAT

GCA

GCG

AAG

GCC

TGC

AAC

CTC

GAC

Lys

Gly

Asn

Asn

Cys

Leu

Asp

Ala

Ala

Lys

Ala

Cys

Asn

Leu

Asp

4S5

500

505

ATT

TGC

AAG

AAG

TAC

AGG

TCG

GCG

TAC

ATC

ACC

CCG

TGC

ACC

ACC

Ile

Cys

Lys

Lys

Tyr

Arg

Ser

Ala

Tyr

Ile

Thr

Pro

Cys

Thr

Thr

510

515

520

GTG

TCC

A_-C

GAT

GTC

TGC

AAC

CGC

CGC

AAG

TGC

CAC

AAG

GCC

CTC

Val

Ser

Asn

Asp

Val

Cys

Asn

Ar a

Arg

Lys

cys

His

Lvs

Ala

Leu

525

53 Ó

535

CAG

TTC

1 4 —

GAC

* * r* .J

GTC

CCG

GCC

AAG

CAC

AGC

TAC

GGA

ATG

CTC

C-ln

Fhe

Phe

Asp

Lys

Val

Pro

Ala

Lys

His

Ser

Tyr

Gly

Met

Leu

540

54 5

550

TGC

TCC

TGC

CC-G

GAC

ATC

GCC

TGC

ACA

GAG

CC-G

AGG

CGA

CAG

ACC

Cys

Ser

cys

Arg

Asp

Ile

Ala

cys

Thr

Glu

Arg

Arg

Arg

Gin

Thr

555

560

565

GTG

CCT

C-TG

TC-C

TCC

TAT

GAA

GAG

AGG

GAG

AAG

CCC

AAC

TGT

TTG

Val

Pro

Val

Cys

Ser

Tyr

Glu

Glu

Arg

Glu

Lys

Pro

Asn

Cys

Leu

575

530

565

TTG

CAG

GAC

TCC

ACG

A.-.T

TAC

ATC

TGC

AGA

TCT

CGC

CTT

Leu

Gin

Asp

Ser

Cys

Lys

Thr

Asn

Tyr

Ile

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu

550

595

600

GAT

TTT

TTT

ACC

AAC

TC-C

CAG

CCA

GAG

TCA

AGG

TCT

GTC

AGC

AGC

Asp

Phe

Phe

Thr

Asn

Cys

Gin

Pro

Glu

Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Ser

605

610

615

CTA

GA-A

AAC

TAC

GCT

GAC

TGC

CTC

CTC

GCC

TAC

TCG

GGG

CTT

Leu

Lys

Glu

Asn

Τ'/r

Ala

Asp

Cys

Leu

Leu

Ala

Tyr

Ser

Gly

Leu

62 0

625

630

GGC

ACA

GTC

A7G

ACC

CCC

AAC

TAC

ATA

GAC

TCC

AGT

AGC

CTC

AGT

Gly

Thr

Val

Met

Thr

Pro

Asn

Ile

Asp

Ser

Ser

Ser

Leu

Ser

-44CZ 296516 B6

635

640

645

650

GCC

CCA

TGG

TGT

GAC

TGC

AGC

AAC

AGT

GGG

AAC

GAC

CTA

GAA

GAG

TGC

1077

Al &

Pro

Trp

Cys

Asp

Cys

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

Asp

Leu

Glu

Glu

Cys

655

660

665

TTG

AAA

TTT

TTG

AAT

TTC

TTC

AAG

GAC

AAT

ACA

TGT

CTT

AAA

AAT

GCA

1125

Leu

Lys

Phe

Leu

Asn

Phe

?he

Lys

Asp

Asn

Thr

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

670

675

680

ATT

CAA

GCC

TTT

GGC

AAT

GGC

TCC

GAT

GTG

ACC

GTG

TGG

CAG

CCA

GCC

1173

Ile

Gin

Ala

Phe

Gly

Asn

Gly

Ser

Asp

Val

Thr

Val

Trp

Gin

Pro

Ala

685

690

695

TTG

CCA

GTA

CAG

ACC

ACC

ACT

GCC

ACT

ACC

ACC

ACT

GCC

CTC

CGG

GTT

1221

Phe

Pro

Val

Gin

Thr

Thr

Thr

Ala

Thr

Thr

Thr

Thr

Ala

Leu

Arg

Val

700

705

710

AAG

AAC

AAG

CCC

CTG

GGG

CCA

GCA

GGG

TCT

GAG

AAT

GAA

ATT

CCC

ACT

1269

Lys

Asn

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

Asn

Glu

Ile

Pro

Thr

715

720

725

730

CAT

GTT

TTG

CCA

CCG

TGT

GCA

AAT

TTA

CAG

GCA

CAG

AAG

CTG

AAA

TCC

1317

His

Val

Leu

Pro

Pra

Cys

Ala

Asn

Leu

Gin

Ala

Gin

Lys

Leu

Lys

Ser

735

740

745

AAT

GTG

TCG

GGC

AAT

ACA

CAC

CTC

TGT

ATT

TCC

AAT

GGT

AAT

TAT

GAA

1365

Asn

Val

Ser

Gly

Asn

Thr

His

Leu

Cvs

Ile

Ser

Asn

Gly

A.sr.

Tyr

Glu

750

755

760

AAA

GAA

GGT

CTC

GGT

C-CT

TCC

AGC

CAC

ATA

ACC

ACA

AAA

TCA

ATG

GCT

1413

Lys

Glu

Gly

Leu

Gly

Ala

Ser

Ser

His

Ile

i Γ*Χ

Thr

Lys

Ser

Met

Ala

765

770

775

GCT

CCT

CCA

AGC

TGT

GGT

CTG

AGC

CCA

CTG

CTG

GTC

CTG

GTG

C-TA

ACC

1461

Ala

Pro

Pro

Ser

cys

Gly

Leu

Ser

Pro

Leu

Leu

Val

Leu

Val

Val

Thr

760

785

790

GCT

CTG

TCC

ACC

ČTA

TTA

TCT

TTA

ACA

GAA

ACA

TCA

TAGCTGCATT

1507

Ala

Leu

Ser

Thr

Leu

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr

Ser

795

600

805

AAAAAAATAC 1567	AA7ATGGACA	TGTAAAAAGA	CAAAAACCAA	GTTATCTGTT	TCCTGT7CTC
TTGTATAGCT 1627	GAAATTCCAG	TTTAGGAGCT	CAGTTGAGAA	ACAGTTCCAT	TCAACTGGAA
CATTTTTTTT	TTTTCCTTTT	AAGAAAGCTT	CTTGTGATCC	TTCGGGGCTT	CTG TG

1652 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 460 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineami

-45CZ 296516 B6 (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

Met 1

Phe

Leu

Ala

Thr 5

Leu

Tyr

Phe

Ala

Leu 10

Pro

Leu

Leu

Asp

Leu 15

Leu

Leu

Ser

Ala

Glu

Val

Ser

Gly

Gly

Asp

Arg

Leu

Asp

Cys

Val

Lys

Ala

20

25

30

Ser

Asp

Gin

Cys

Leu

Lys

Glu

Gin

Ser

cys

Ser

1 ΠΤ

Lys

Tyr

Arg

Thr

35

40

45

Leu

Arg

Gin

Cys

Val

Ala

Gly

Lys

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Leu

Ala

Ser

50

55

60

Gly

Leu

Glu

Ala

Lys

Asp

Glu

Cys

Arg

Ser

Ala

Met

Glu

Ala

Leu

Lys

65

70

75

80

Gin

Lys

Ser

Leu

Tyr

Asn

Cys

Arg

Cys

Lys

Arg

Gly

Met

Lys

Lys

Glu

85

90

95

Lys

Asn

Cys

Leu

Arg

Ile

Tyr

Trp

Ser

Met

Tyr

Gin

Ser

Leu

Gin

Gly

100

105

110

Asn

Asp

Leu

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro

Val

Asn

Ser

Arg

Leu

115

120

125

Ser

Asp

Ile

Phe

Are

Val

Val

Pro

Phe

Ile

Ser

Val

Glu

His

Ile

Fro

13 0

135

140

Lys

Gly

Asn

Asn

Cys

Leu

Asp

Ala

Ala

Lys

Al d

Cys

Asn

Leu

Asp

Asp

145

150

155

160

Ile

Cys

Lys

Lys

Tyr

Arg

Ser

Tyr

Ile

Thr

Pro

Cys

Thr

Thr

Ser

165

170

17 5

Val

Ser

Asn

Aso

Val

Cys

Asn

Arg

Arg

Lys

Cys

Eis

Lys

Ala

Leu

Arg

1 = 3

185

190

Gin

Phe

Phe

Asp

Lys

Val

Pro

Ala

Lys

His

Ser

Tyr

Gly

Met

Leu

Phe

195

200

205

Cys

Ser

Cys

Arg

As?

Ile

Ala

Cys

Thr

Glu

Arg

Arg

Arg

Gin

Thr

Ile

210

215

220

Val

Pro

Val

Cys

Ser

Tyr

Glu

Glu

Arg

Glu

Lys

Pro

Asn

Cys

Leu

Asn

225

230

235

240

Leu

Gin

Asp

Ser

Cys

Lys

Thr

Asn

Tyr

Ile

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Ala

245

250

255

Asp

Phe

Phe

Thr

Asn

Cys

Gin

Pro

Glu

Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Ser

Cys

260

265

270

Leu

Lys

Glu

Asn

Tyr

Ala

Asp

Cys

Leu

Leu

Ala

Tyr

Ser

Gly

Leu

ile

275

280

285

Gly

Thr

Val

Met

Thr

Pro

Asn

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

290

29S

300

-46CZ 296516 B6

Ala 3C5

Pro

Trp

Cys

Asp

Cys 310

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn 315

Asp

Leu

Glu

Glu

Cys 320

Leu

Lys

Phe

Leu

Asn

Phe

Phe

Lys

Asp

Asn

Thr

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

325

330

335

Ile

Gin

Ala

Phe

Gly

Asn

Gly

Ser

Asp

Val

Thr

Val

Trp

Gin

Pro

Ala

340

345

350

Phe

Pro

Val

Gin

Thr

Thr

Thr

Ala

Thr

Thr

Thr

Thr

Ala

Leu

Arg

Val

355

360

365

Lys

Asn

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Gly

Ser

Glu

Asn

Glu

Ile

Pro

Thr

3 70

375

380

His

Val

Leu

Pro

Pro

cys

Ala

Asn

Leu

Gin

Ala

Gin

Lys

Leu

Lys

Ser

365

390

395

400

Asn

Val

Ser

Gly

Asn

Thr

Hí s

Leu

Cys

Ile

Ser

Asn

Gly

Asn

Tyr

Glu

405

410

415

Lys

Glu

Gly

Leu

Gly

Ala

Ser

Ser

His

Ile

Thr

Thr

Lys

Ser

Met

Ala

420

425

430

Ala

Pro

Pro

Ser

Cys

Gly

Leu

Ser

Pro

Leu

Leu

Val

Leu

Val

Val

Thr

435

440

445

Ala

Leu

Ser

Thr

Leu

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr

Ser

450 455 460 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1888 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 25...1416 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

AAAAAACGGT GGGA7TTATT TAAC A TG ATC TTG GGA AAC GTC TTC TGC CTC

Met Ile Leu Ala Asn Val Phe Cys Leu

465

TTC

TTT

CTA

GAC

GAG

ACC

CTC

CGC

TCT

TTG

GCC

AGC

CCT

TCC

TCC

Phe 470

Phe

Phe

Leu

Asp

Glu 475

Thr

Leu

Arg

Ser

Leu 480

Ala

Ser

Pro

Ser

Ser 485

CTG

CAG

GGC

CCC

GAG

CTC

CAC

GGC

TGG

CGC

CCC

CCA

GTG

GAC

TGT

GTC

Leu

Gin

Gly

Pro

Glu 490

Leu

His

Gly

Trp

Arg 495

Pro

Pro

Val

Asp

cys 500

Val

CGG

GCC

AAT

GAG

CTG

TGT

C-CC

GCC

GAA

TCC

AAC

TGC

AGC

TCT

CGC

TAC

195

-47CZ 296516 Β6

Arg

Ala

Asn Glu 505

Leu

cys

Ala

Ala

Glu S10

Ser

Asn Cys

Ser

Ser 515

Arg

Tyr

CGC

ACT

CTG

CGG

CAG

TGC

CTG

GCA

GGC

CGC

GAC

CGC

AAC

ACC

ATG

CTG

Arg

Thr

Leu 520

Arg

Gin

cys

Leu

Ala 525

Gly

kzg

Asp

Arg

Asn 530

Thr

Met

Leu

GCC

AAC

AAG

GAG

TGC

CAG

GCG

GCC

TTG

GAG

GTC

TTG

CAG

GAG

AGC

CCG

Ala

Asn 535

Lys

Glu

cys

Gin

Ala 540

Ale

Leu

Glu

Val

Leu 545

Gin

Glu

Ser

Pro

CTG

TAC

GAC

TGC

CGC

TGC

AAG

CC-G

GGC

ATG

AAG

AAG

GAG

CTG

CAG

TGT

Leu 550

Tyr

Asp

Cys

Arg

cys 555

Lys

Arg

Gly

Met

Lys S60

Lys

Glu

Leu

Gin

Cys 565

CTG

CAG

ATC

TAC

TC-G

AGC

ATC

CAC

CTG

GGG

CTG

ACC

GAG

C-GT

GAG

GAG

Leu

Gin

Ile

Tyr

Trp 570

Ser

Ile

His

Leu

Gly 575

Leu

Thr

Glu

Gly

Glu 580

Glu

TTC

TAC

GAA

GCC

TCC

CCC

TAT

GAG

CCG

GTG

ACC

TCC

CGC

CTC

TCG

GAC

Phe

Tyr

Glu

Ala 5E5

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro 550

Val

Thr

Ser

Arg

Leu 595

Ser

Asp

ATC

TTC

AGG

CTT

GCT

TCA

ATC

TTC

TCA

GGG

ACA

GGG

GCA

GAC

CCG

GTG

Ile

Phe

Arg 600

Leu

Ala

Ser

Ile

Phe 605

Ser

Gly

Thr

Gly

Ala 610

Asp

Pro

Val

GTC

AGC

GCC

AAG

AGC

AAC

CAT

TGC

CTG

GAT

GCT

GCC

AAG

GCC

TGC

AAC

Val

Ser 615

Ala

Lys

Ser

Asn

His 620

Cys

Leu

ASp

Ala

Ala 625

Lys

Ala

cys

Asn

CTG

AAT

GAC

AAC

TGC

AAG

AAG

CTG

CGC

TCC

TCC

TAC

ATG

TCC

ATC

TGC

Leu 63 0

Asn

Asp

Asn

Cys

Lvs 635

Lys

Leu

Arg

Ser

Ser 640

Tyr

Ile

Ser

Ile

Cvs 645

AAC

CGC

GAG

ATC

TCG

CCC

ACC

GAG

CGC

TGC

AAC

CGC

CGC

AAG

TGC

CAC

Asn

Arg

Glu

Ile

Ser 6 = 0

Pro

Thr

Glu

Arg

Cys 655

Asn

Arg

Arg

Lys

Cys 660

His

AAG

GCC

CTG

CGC

CAG

TTC

TTC

GAC

CGG

GTG

CCC

AGC

GAG

TAC

ACC

TAC

Lys

Ala

Leu

Arg 665

Gin

Phe

Phe

Asp

Arg 670

Val

Pro

Ser

Glu

Tyr 675

Thr

Tyr

CGC

ATG

CTC

TTC

TGC

TCC

TGC

CAA

GAC

CAG

GCG

TGC

GCT

GAG

CGC

CGC

Arg

Met

Leu 6S0

Phe

Cys

Ser

Cys

Gin 6S5

Asp

Gin

Ala

Cys

Ala 690

Glu

Arg

Arg

CGG

CAA

ACC

ATC

CTG

CCC

AGC

TGC

TCC

TAT

GAG

GAC

AAG

GAG

AAG

CCC

Arg

Gin 695

Thr

Ile

Leu

Pro

Ser 700

Cys

Ser

Tyr

Glu

Asp 705

Lys

Glu

Lys

Pro

AAC

TGC

CTG

GAC

CTG

CGT

GGC

GTG

TGC

CGG

ACT

GAC

CAC

CTG

TGT

CGG

-48CZ 296516 B6

Asn

Cys

Leu

Asp

Leu

Arg Gly Val 715

Cys

Arg

Thr 720

Asp

His

Leu

Cys

Arg 725

710

TCC

CGG

CTG

GCC

GAC

TTC

CA

GCC

AAT

TGT

CGA

GCC

TCC

TAC

CAG

ACG

867

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp 730

Phe

His

Ala

Asn

Cys 735

Arg

Ala

Ser

Tyr

Gin 740

Thr

GTC

ACC

AGC

TGC

CCT

GCG

GAC

AAT

TAC

CAG

GCG

TGT

CTG

GGC

TCT

TAT

915

Val

Thr

Ser

cys 745

Pro

Ala

Asp

Asn

Tyr 750

Gin

Ala

Cys

Leu

Gly 755

Ser

Tyr

GCT

GGC

ATG

AT?

GGG

TTT

GAC

ATG

ACA

CCT

AAC

TAT

GTG

GAC

TCC

AGC

963

Ala

Gly

Met 760

Ile

Gly

Phe

Asp

Met 765

Thr

Pro

Asn

Tyr

Val 770

Asp

Ser

Ser

CCC

ACT

GGC

ATC

GTG

GTG

TCC

CCC

TGG

TGC

AGC

TGT

CGT

GGC

AGC

GGG

1011

Pro

Thr 775

Gly

Ile

Val

val

Ser 780

Pro

Trp

Cys

Ser

Cys 785

Arg

Gly

Ser

Gly

AAC

ATG

GAG

GAG

GAG

TGT

GAG

AAG

TTC

CTC

AGG

GAC

TTC

ACC

GAG

AAC

1059

Asn 790

Met

Glu

Glu

Glu

cys 795

Glu

Lys

Phe

Leu

Arg 800

Asp

Phe

Thr

Glu

Asn 805

CCA

TGC

CTC

CGG

AAC

GCC

ATC

CAG

GCC

TTT

GGC

AAC

GGC

ACG

GAC

GTG

1107

Pro

cys

Leu

Asn 810

Ala

Ile

Gin

Ala

Pne 815

Gly

Asn

Gly

Thr

Asp 820

Val

AAC

GTG

TCC

CCA

AAA

C-GC

CCC

TCG

TTC

CAG

GCC

ACC

CAG

GCC

CCT

CGG

1155

Asn

Val

Ser

Pro 825

Lys

C-ly

Pro

Ser

Phe 830

Gin

Ala

Thr

Gin

Ala 835

Pro

Arg

GTG

GAG

AAG

ACG

CCT

TCT

TTG

CCA

GAT

GAC

CTC

AGT

GAC

AGT

ACC

AGC

1203

Val

Glu

Lys 840

i r.r

Pro

Ser

Leu

Pro 845

Asp

Asp

Leu

Ser

Asp 850

Ser

inr

Ser

TTG

GC-G

ACC

AGT

GTC

ATC

ACC

ACC

TGC

ACG

TCT

GTC

CAG

GAG

CAG

GGG

1251

Leu

Glv 855

Thr

Ser

Val

Ile

Thr 860

Thr

Cys

Thr

Ser

Val 865

Gin

Glu

Gin

Gly

CTG

AAG

GCC

AAC

AAC

TCC

AAA

GAG

orr * 1 1 Λ

AGC

ATG

TGC

TTC

ACA

GAG

CTC

1299

Leu 870

Lys

Ala

Asn

Asn

Ser 875

Lys

Glu

Leu

Ser

Met 880

Cys

Phe

Thr

Glu

Leu 885

ACG

ACA

AAT

ATC

ATC

CCA

GC-G

AGT

AAC

AAG

GTG

ATC

AAA

CCT

AAC

TCA

1347

Thr

Thr

Asn

Ile

Ile 890

Pro

Gly

Ser

Asn

Lys 895

Val

Ile

Lys

Pro

Asn 900

Ser

GGC

CCC

AGC

AGA

GCC

AGA

CCG

TCG

GCT

GCC

TTG

ACC

GTG

CTG

TCT

GTC

1395

Gly

Pro

Ser

Arg 905

Ala

Arg

Pro

Ser

Ala 910

Ala

Leu

Thr

Val

Leu 915

Ser

Val

TTG TAGGCTGTGG GAACCGAGTC AGAAGATTTT

CTG ATG CTG AAA CTG GCC 1446

Leu Met Leu Lys Leu Ala Leu

920

-49CZ 296516 B6

AAA G CT AC 15C6	GCAGACAAGA	ACAGCCGCCT	GACGA-AATGG	AAACACACAC	AGACACACAC
ACACCTTGCA 1565		TGTTTTTCCC	ACCTTGTCGC	TGAACC7GTC	TCCTCCCAGG
TTTCTTCTCT 1626	GGAGAAC-TTT	TTGTAAACCA	AACAGACAAG	CAGGCAGC-CA	GCCTGAGAGC
GCrG C C C A CGGG 16 86	GTCCCCTGGC	AGGGG AAAC T	CTGGTGCCGG	GGAC-GGCACG	AGGCTCTAGA
AA7C-CCCTTC 174 6	ACTTTCTCCT	GGTGTTTTTC	TCTCTGGACC	CTTCTGAJ-GC	AGAGACCGGA
CAAGAGCCTG 1806	CAGCGGAAC-G	GACTCTGGGC	TGTC-CCTGAG	GCTC-GCTGGG	GGCAGGACAA
CACAGCTC-CT 1566 GGTCAGCGGG 1556	TCCCCAGGC7 G CA GC G-GGAj C	GCCCACTCTG TG	GGGACCCGCT	GGC-GGCTGGC	AGAGC-GCATC

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 464 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární o

(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

Met 1

Ile Leu

Ala

Asn c

Val

Phe

cys

Leu

Phe 10

Phe

Phe

Leu

Asp

Glu 15

Thr

Leu

Arg

Ser

Leu

Ala

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Gin

Gly

Pro

Glu

Leu

Eis

20

25

30

Gly

Trp

Arg

Pro

Pro

Val

Asp

Cys

Val

Arg

Ala

Asn

Glu

Leu

cys

Ala

35

40

45

Ala

Glu

Ser

Asn

cys

Ser

Ser

Arg

Tyr

Arg

Thr

Leu

Arg

Gin

Cys

Leu

50

55

60

Ala

Gly

Arg

Asp

Arg

Asn

Thr

Met

Leu

Ala

Asn

Lys

Glu

Cys

Gin

Ala

65

70

75

80

Ala

Leu

Glu

Val

Leu

Gin

Glu

Ser

Pro

Leu

Tyr

Asp

cys

Arg

Cys

Lys

85

90

95

Arg

Gly

Met

Lys

Lys

Glu

Leu

Gin

Cys

Leu

Gin

Ile

Tyr

Trp

Ser

Ile

100

105

110

His

Leu

Gly

Leu

Thr

Glu

Gly

Glu

Glu

Phe

Tyr

Glu

Ala

Ser

Pro

Tyr

115

120

125

Glu

Pro

Val

Thr

Ser

Arg

Leu

Ser

Asp

Ile

Phe

Arg

Leu

Ala

Ser

Ile

130

135

140

-50CZ 296516 B6

Phe 145

Ser

Gly

-

Gly

Ala 150

Asp

Pro

Val

Va 1

Ser 155

Ala

Lys

Ser

Asn

His 160

cys

Leu

Asp

Ala

Ala

Lys

Ala

Cys

Asn

Leu

Asn

Asp

Asn

Cys

Lys

Lys

165

170

175

Leu

Arg

Ser

Ser

Tyr

Ile

Ser

Ile

Cys

Asn

Arg

Glu

Ile

Ser

Pro

Thr

160

185

190

Glu

Arg

Cys

Asn

Arg

Arg

Lys

Cys

His

Lys

Ala

Leu

Arg

Gin

Phe

Phe

195

200

205

Asp

Arg

Val

Pro

Ser

Glu

Tyr

Thr

Tyr

Arg

Met

Leu

Phe

Cys

Ser

Cys

210

215

220

Gin

Asp

Gin

Ala

Cys

Ala

Glu

Arg

Arg

Arg

Gin

Thr

Ile

Leu

Pro

Ser

225

230

235

240

Cys

Ser

Tyr

Glu

Asp

Lys

Glu

Lys

Pro

Asn

Cys

Leu

Asp

Leu

Arg

Gly

245

250

255

Val

Cys

Arg

Thr

Asp

His

Leu

cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp

Phe

His

260

265

270

Ala

Asn

Cys

Arg

Ala

Ser

Tyr

Gin

Thr

Val

Thr

Ser

cys

Pro

Ala

Asp

275

260

285

Asn

Tyr

Gin

Ala

Cys

Leu

Gly

Ser

Tyr

Ala

Gly

Met

Ile

Gly

Phe

Asp

290

295

300

Met

Thr

Pro

Asn

Tyr

Val

Asp

Ser

Ser

Pro

Thr

Gly

Ile

Val

Val

Ser

305

310

315

320

Pro

Trp

Cys

Ser

Cys

A-g

Gly

Ser

Gly

Asn

Met

Glu

Glu

Glu

Cys

Glu

325

330

335

Lys

Phe

Leu

Arg

Asp

Phe

Thr

Glu

Asn

Pro

Cys

Leu

Arg

Asn

Ala

Ile

340

345

350

Gin

Ala

Phe

c-iy

Asn

Gly

T Γ; T

Asp

Val

Asn

Val

Ser

Pro

Lys

Gly

Pro

355

3 60

365

Ser

Phe

Gin

Ala

Thr

Gin

Ala

Pro

Arg

Val

Glu

Lys

«V- <_» 4 Ui

Pro

Ser

Leu

370

375

380

Pro

Asp

Asp

Leu

Ser

Asp

Ser

Thr

Ser

Leu

Gly

Thr

Ser

Val

Ile

Thr

365

390

395

400

Thr

Cys

Thr

Ser

Val

Gin

Glu

Gin

Gly

Leu

Lys

Ala

Asn

Asn

Ser

Lys

405

410

415

Glu

Leu

Ser

Met

cys

Phe

Thr

Glu

Leu

Thr

Thr

Asn

Ile

Ile

Pro

Gly

420

425

430

Ser

Asn

Lys

Val

Ile

Lys

Fro

Asn

Ser

Gly

Pro

Ser

Arg

Ala

Arg

Pro

435

440

445

Ser

Ala

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Ser

Val

Leu

Met

Leu

Lys

Leu

Ala

Leu

450

455

460

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1878 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché ío (D) TOPOLOGIE: lineární

-51 CZ 296516 B6 (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 205...1242 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

CGCGGCGCCC AGCGCAGGCA GAGCGCTGTC GCATCCCGGG CGTCCACCCG CCATGGGGCT

CTCCTGGAGC CCGCGACCTC CACTGCTGAT GATCCTGCTA CTGGTGCTGT CGTTGTGGCT 120

GCCACTTGGA GCAGGAAACT CCCTTGCCAC AGAGAACAGG TTTGTGAACA GCTGTACCCA 180

GGCCAGAAAG AAATGCGAGG CTAA TCC CGC TTG CAA GGC TGC CTA CCA GCA 231

Ser Arg Leu Gin Gly Cys Leu Pro Ala

465 470

279

CCT Pro

GGG CTC

CTG CAC CTC CAG TTA

AGC AGG CCG CTG CCC TTA C-AG

GAG Glu

Leu His

Leu Gin Leu 4S0

Ser

Arg

Pro

Leu 485

Pro

Leu

Glu

Gly 475

Leu

TCT

GCC

ATG

TCT

GCA

GAC

TC-C

CTA

GAG

GCA

GCA

GAA

CAA

CTC

AGG

AAC

327

Ser

Ala

Met

Ser

Ala

A.sn

Cys

Leu

Glu

Ala

Ala

Glu

Gin

Leu

Arg

Asn

490

495

500

505

AGC

TCT

CTG

ATA

GAC

TGC

AGG

TGC

CAT

CGG

CGC

ATG

AAG

CAC

CAA

GCT

375

Ser

Ser

Leu

Ile

Asp

Cys

Arg

Cys

His

Arg

Arg

Met

Lys

His

Gin

Ala

510

515

520

ACC

TGT

CTG

GAC

ATT

TAT

TGG

ACC

GTT

CAC

CCT

GCC

CGA

AGC

CTT

GGT

423

Thr

Cys

Leu

Asp

Xle

Tyr

Trp

Thr

Val

His

Pro

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

525

530

535

GAC

TAC

GAG

TTG

GAT

GTC

TCA

CCC

TAT

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC

AGC

AAA

471

Asp

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

540

545

550

CCC

TGG

AAA

ATG

AAT

CTT

AGC

AAG

TTG

AAC

ATG

CTC

AAA

CCA

GAC

TCG

519

Pro

Trp

Lys

Met

Asn

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn

Met

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

555

560

565

GAC

CTC

TGC

CTC

AAA

TTT

C-CT

ATG

CTG

TGT

ACT

CTT

CAC

GAC

AAG

TGT

567

Asp

Leu

Cys

Leu

Lys

Phe

Ala

Met

Leu

Cys

Thr

Leu

His

Asp

Lys

Cys

10

570

575

580

585

-52CZ 296516 B6

615

GAC CGC CTG

CGC Arg

AAG GCC

TAC GGG GAG GCA

TGC Cys

TCA GGG ATC CGC

TGC cys

Tyr

Gly

Glu

Ala 595

Ser

Gly Ile

Arg 600

Asp

Arg Leu

Lys 590

Ala

CAG

CGC

CAC

CTC

TGC

CTA

GCC

CAG

CTG

CGC

TCC

TTC

TTT

GAG

AAG

GCA

663

Gin

Arg

His

Leu

Cys

Leu

Ala

Gin

Leu

Arg

Ser

Phe

Phe

Glu

Lys

Ala

605

610

615

GCA

GAG

TCC

CAC

GCT

CAG

GGT

CTG

CTG

CTG

TGT

CCC

TGT

GCA

CCA

GAA

711

Ala

Glu

Ser

His

Ala

Gin

Gly

Leu

Leu

Leu

cys

Pro

cys

Ala

Pro

Glu

620

625

630

GAT

GCG

GGC

TGT

C-GG

GAG

CGG

CGG

CGT

AAC

ACC

ATC

GCC

CCC

AGT

TC-C

759

Asp

Ala

Gly

cys

Gly

Glu

Arg

Arg

Arg

Asn

Thr

Ile

Ala

Pro

Ser

cys

635 640 645

GCC CTG CCT TCT GTA ACC CCC AAT TGC CTG GAT CTG CGG AGC TTC TGC 807

Ala Leu 650

Pro

Ser Val

Thr 655

Pro

Asn

cys

Leu Asp Leu Arg 660

Ser

Phe

Cys 665

CGT

GCG

GAC

CCT

TTG

TGC

AGA

TCA

CGC

CTG

ATG

GAC

TTC

CAG

ACC

CAC

855

Arg

Ala

Asp

Pro

Leu

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Met

Asp

Phe

Gin

Thr

His

670

675

680

TGT

CAT

CCT

ATG

GAC

ATC

CTT

GGG

ACT

TGT

GCA

ACT

GAG

CAG

TCC

AGA

903

Cys

His

Pro

Met

Asp

Ile

Leu

Gly

-r“ • 4 4 a>

Cys

Ala

Thr

C-lu

Gin

Ser

Arg

685

690

695

TGT

CTG

CGG

GCA

TAC

CTG

GGG

CTG

ATT

GGG

ACT

GCC

AT>j

ACC

CCA

AAC

951

cys

Leu

Arg

Ala

Tyr

Leu

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

?ro

Asn

700

705

710

TTC

ATC

AGC

Λ.-.G

GTC

AAC

ACT

nL a

GTT

GCC

TTA

AC-C

TGC

ACC

TGC

CGA

999

Phe

Ile

Ser

Lys

Val

Asn

Thr

Thr

Val

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr

Cys

Arg

715

720

725

GGC

AGC

GGC

AAC

CTA

CAG

GAC

GAG

TGT

GAA

CAG

CTG

GAA

AGG

TCC

TTC

1047

Gly Ser Gly Asn 730

Leu Gin Asp 735

Glu

Cys

Glu

C-ln 740

Leu

Glu

Arg

Ser

Phe 745

TCC

CAG

AAC

CCC

TGC

CTC

GTG

GAG

GCC

ATT

GCT

AAG

ATG

CGT

TTC

1095

Ser

Gin

Asn

Pro

Cys

Leu

Val

Glu

Ala

Ile

Ala

Ala

Lys

Met

Arg

Phe

750

755

760

CAC

AGA

CAG

CTC

TTC

TCC

CAG

GAC

TGG

GCA

GAC

TCT

ACT

TTT

TCA

GTG

1143

His

Arg

Gin

Leu

Phe

Ser

Gin

Asp

Trp

Ala

Asp

Ser

Thr

Phe

Ser

Val

765

770

775

GTG

CAG

CAG

CAG

fkC

AGC

AAC

CCT

GCT

CTG

AGA

CTG

CAG

CCC

AGG

CTA

1191

Val

Gin

Gin

Gin

Asn

Ser

Asn

Pro

Ala

Leu

Arg

Leu

Gin

Pro

Arg

Leu

780

785

790

-53 CZ 296516 B6

CCC

ATT

ΛΡ-ντ» Cl*

TCT

TTC

TCC

ATC

CTT

CCC

TTG

ATT

CTG

CTG

CAG ACC

CTC

Pro

Ile

Leu

Ser

Phe

ser

Ile

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu

Leu

Gin Thr

Leu

795

8C0

Θ05

TGG 1

TAGCTGGGCT

TCCTCAGGGT CCTTTGTCC'

7 CTCCACCACA

CCCAGACTGA

Trp

810

TTTGCAGCCT 1352	GTGGTGGGAG	AGAAC7CGCC	AGCCTGTGGA	AGAAGACGCA	GCGTGCTACA
CAGCAACCCG 1412	GAACCAACCA	GGCATTCCGC	AGCACATCCC	GTCTGCTCCA	GAAGAGGTCT
TAGAAGTGAG 1472	GGCTGTGACC	CTTCCGATCC	TGAGCGGCTA	GTTTTCAAAC	CTCCCTTGCC
CCTGCTTCCT 1532	TCTGGCTCAG	GCTGCTCCTC	CTTAGGACTT	TGTGGGTCCA	GTTTTGCCTT
CTGTTCTGAT 1592	GGTGATTAC-C	GGCTCACCTC	CAGCGCTTCT	TCCTGTTTCC	CAGGACCACC
CAGAGGCTAA 1652	GGAATCAG7C	ATTCCCTGTT	GCCTTCTCCA	GGAAGGCAGG	CTAAGGGTTC
TGAGGTGACT 1712	.V	TTTCCTTTGT	GTGGAAGGCT	GGTGCTCCAG	CCTCCACGTC
CCTCTGAATG 1772	G ΑΛ GA T AAAA	ACCTGCTGGT	GTCTTGACTG	CTCTGCCAGG	CAATCCTGAA
1832	TGAAGAGCTA	AAGTCITTGG	GTCTTC-TTTA	ACTCCTATTA	C7GTCCCCAA
AT7CCCCTAG 1878	TCCCTTGC-	CATGATTAAA	CATTTTC-ACT	TAAAAA

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 346 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

Ser 1

Arg

Leu

Gin

Gly 5

Cys

Leu

Pro

Ala

Pro 10

Gly

Leu

Leu

His

Leu 15

Gin

Leu

Ser

Arg

Pro 20

Leu

Pro

Leu

Glu

Glu 25

Ser

Ala

Mec

Ser

Ala 30

Asp

Cys

Leu

Glu

Aid 35

Ala

Glu

Gin

Leu

Arg 40

Asn

Ser

Ser

Leu

Ile 45

Asp

cys

Arg

Cys

His 50

Arg

Arg

Met

Lys

His 55

Gin

Ala

Thr

Cys

Leu 60

Asp

Ile

Tyr

*rp

Thr

Val

His

Pro

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asp

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val

Ser

-54CZ 296516 B6

65	70
Pro	Tyr	Glu	Asp	Tr.r £5	Val	Thr	Ser
Lys	Leu	Asn	Met 100	Leu	Lys	Pro	Asp
Met	Leu	Cys 115	Thr	Leu	His	Asp	Lys 120
Gly	Glu 130	Ala	Cys	Ser	Gly	Ile 135	Arg
Gin. 145	Leu	Arg	Ser	Phe	Phe 150	Glu	Lys
Leu	Leu	Leu	Cys	Pro 165	Cys	Ala	Pro
Arg	Arg	Asn	Thr ieo	Ile	Ala	Pro	Ser
Asn	Cys	Leu 155	Asp	Leu	Arg	Ser	Phe 200
Ser	Arg 210	Leu	Met	Asp	Phe	Gin 215	Thr
Gly 225	*·	Cys	Ala	Thr	C-lu 230	Gin	Ser
Leu	Ile	Gly	1Γ.·	Ala 245	Met	Thr	Pro
Thr	Val	Ala	Leu 260	Ser	Cys	Thr	Cys
Glu	Cys	Glu 275	Gin	Leu	Glu	Arg	Ser 280
Glu	Ala 290	Ile	Ala	Ala	Lys	Met 295	A.rg
Asp 3C5	Trp	Aid	Asp	Ser	310	Phe	Ser
Pro	Ala	Leu	Arg	Leu 3 2 5	Gin	Pro	Arg
Leu	Pro	Leu	Ile 340	Leu	Leu	Gin	Tr.r

Leu Trp

345

		75					60
Lys	Pro 90	Trp	Lys	Met	Asn	Leu 95	Ser
Ser 105	Asp	Leu	Cys	Leu	Lys 110	Phe	Ala
Cys	Asp	Arg	Leu	Arg 125	Lys	Ala	Tyr
Cys	Gin	Arg	His 140	Leu	Cys	Leu	Ala
Ala	Ala	Glu 155	Ser	His	Ala	Gin	Gly 160
Glu	Asp 170	Ala	Gly	Cys	Gly	Glu 175	Arg
Cys 165	Ala	Leu	Pro	Ser	Val 190	Thr	Pro
cys	Arg	Ala	Asp	Pro 205	Leu	cys	Arg
His	Cys	His	Pro 220	Met	Asp	Ile	Leu
Arg	Cys	Leu 235	Arg	Ala	Tyr	Leu	G-y 240
Asn	Phe 250	Ile	Ser	Lys	Val	Asn 255	Thr
Arg 265	Gly	Ser	cly	Asn	Leu 270	Gin	Asp
Phe	Ser	Gin	Asn	Pro 265	Cys	Leu	Val
Phe	His	Arg	Gin 300	Leu	Phe	Ser	Gin
Val	Val	C-ln 315	Gin	Gin	Asn	Ser	r·- sn 320
Leu	Pro 330	Ile	Leu	Ser	Phe	Ser 335	Ile

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1889 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

-55CZ 296516 B6 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 41...1231 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

CGCAGGCAGA GCGCTGTCGC ATCCCGGC-CG TCCACCCGCC ATG GGG CTC TCC TGG 55

Met Gly Leu Ser Trp

350

103

AGC CCG CGA CCT

CCA CTG

CTG ATG ATC

CTG CTA

CTG GTG CTG

TCG Ser

TTG Leu

Leu

Val

Leu 365

Ser

Pro

Arg

Pro 355

Pro

Leu

Leu

Met

Ile 360

Leu

Leu

TGG

CTG

CCA

CTT

GGA

C-CA

GGA

AAC

TCC

CTT

GCC

ACA

GAG

AAC

AGG

TTT

151

Trp

Leu

Pro

Leu

Gly

Ala

Gly

Asn

Ser

Leu

Ala

Thr

Glu

Asn

Arg

Phe

370

375

380

GTG

AAC

AGC

TGT

ACC

CAG

GCC

AGA

AAG

AAA

TGC

GAG

GCT

AAT

CCC

GCT

199

Val

Asn

Ser

Cys

Thr

C-ln

Ala

Arg

Lys

Lys

Cys

Glu

Ala

Asn

Pro

Ala

385

390

395

TGC

AAG

GCT

GCC

TAC

CAG

CAC

CTG

GGC

TCC

TGC

ACC

TCC

AGT

TTA

AGC

247

cys

Lys

Ala

Ala

Tyr

Gin

His

Leu

Gly

Ser

cys

Thr

Ser

Ser

Leu

Ser

400

405

410

415

AGG

CCG

CTG

CCC

TTA

GAG

GAG

TCT

GCC

ATG

TCT

GCA

GAC

TGC

CTA

GAG

295

Arg

Pro

Leu

Pro

Leu

Glu

C-lu

Ser

Ala

Met

Ser

Ala

Asp

cys

Leu

Glu

420

42S

430

GC?x

GCA

GAA

CAA

CTC

.-.G-G

AAC

AGC

TCT

CTG

ATA

GAC

TGC

AGG

TGC

CAT

343

Ala

Ala

Glu

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Ser

Leu

Ile

Asp

Cys

Arg

Cys

His

435

440

445

CGG

CGC

ATG

AAG

CAC

CAA

GCT

ACC

TGT

CTG

GAC

ATT

TAT

TGG

ACC

GTT

391

Arg

Arg

Met

Lys

His

Gin

Ala

**

Cys

Leu

Asp

Ile

Τ'γχ

Trp

Thr

Val

450

455

460

CAC

CCT

GCC

CGA

AGC

CTT

C-GT

GAC

TAC

GAG

TTG

GAT

GTC

TCA

CCC

TAT

439

His

Pro

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asp

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val

Ser

Pro

Tyr

465

470

475

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC

AGC

AAA

CCC

TGG

AAA

ATG

AAT

CTT

AGC

AAG

TTG

487

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

Lys

Met

Asn

Leu

Ser

Lys

Leu

480

4S5

490

495

AAC

ATG

CTC

AAA

CCA

GAC

TCG

GAC

CTC

TGC

CTC

AAA

TTT

GCT

ATG

CTG

535

Asn

Met

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

cys

Leu

Lys

Phe

Ala

Met

Leu

500

505

510

TGT

ACT

CTT

CAC

GAC

AAG

TGT

GAC

CGC

CTG

CGC

AAG

GCC

TAC

GGG

GAG

583

Cys

Thr

Leu

His

Asp

Lys

Cys

Asp

Arg

Leu

Arg

Lys

Ala

Tyr

Gly

Glu

515

520

525

-56CZ 296516 B6

631

679

727

775

823

871

919

967

1015

1063

1111

1159

1207

GCA

TGC

TCA

GGG

ATC

CGC

TGC

CAG

CGC

CAC

CTC

TGC

CTA

GCC

CAG

CTG

Ala

cys

Ser

Gly

Ile

Arg

Cys

Gin

Arg

His

Leu

Cys

Leu

Ala

Gin

Leu

530

S35

540

CGC

TCC

TTC

TTT

GAG

AAG

GCA

GCA

GAG

TCC

CAC

GCT

CAG

GGT

CTG

CTG

Arg

Ser

Phe

Phe

Glu

Lys

Ala

Ala

Glu

Ser

His

Ala

Gin

Gly

Leu

Leu

545

550

555

CTG

TGT

CCC

TGT

C-CA

CCA

GAA

GAT

GCG

GGC

TGT

GGG

GAG

CGG

CGG

CGT

Leu

Cys

Fro

Cys

Ala

Pro

Glu

Asp

Ala

Gly

Cvs

Gly

Glu

Arg

A.rg

Arg

560

565

570

575

AAC

ACC

ATC

GCC

CCC

AGT

TGC

GCC

CTG

CCT

TCT

GTA

ACC

CCC

AAT

TGC

Asn

Thr

Ile

Ala

Pro

Ser

Cys

Ala

Leu

Pro

Ser

Val

Thr

Pro

Asn

Cys

580

585

590

CTG

GAT

CTG

CC-G

AGC

TGC

TGC

CGT

GCG

GAC

CCT

TTG

TGC

AGA

TCA

CGC

Leu

Asp

Leu

Arg

Ser

Phe

Cys

Arg

Ala

Asp

Pro

Leu

Cys

Arg

Ser

Arg

595

600

605

CTG

ATG

GAC

TTC

CAG

ACC

CAC

TGT

CAT

CCT

ATG

GAC

ATC

CTT

GGG

ACT

Leu

Met

Asp

Phe

Gin

Thr

His

Cys

His

Pro

Met

Asp

Ile

Leu

Gly

Thr

610

615

620

TGT

GCA

ACT

GAG

CAG

TCC

AGA

TGT

CTG

CGG

GCA

TAC

CTG

GGG

CTG

ATT

Cys

A1 3.

Thr

Glu

Gin

Ser

Arg

Cys

Leu

Arg

Ala

Tyr

Leu

Gly

Leu

Ile

62 5

630

63 5

GGG

ACT

GCC

Λ1 -•J

ACC

CCA

AAC

rrvr.f'·* A *

ATC

AGC

AA.G

GTC

AAC

ACT

ACT

GTT

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro

Asn

Phe

Ile

Ser

Lys

Val

Asn

Thr

Γ'ν v

Val

640

645

650

655

GCC

TTA

AGC

TGC

ACC

GGC

CGA

C-GC

AGC

GGC

AAC

CTA

CAG

GA.C

GAG

TGT

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr

Cys

Arg

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Gin

Asp

C-lu

Cys

660

665

670

GAA

CAG

CTG

GAA

AC-G

TCC

<-ι£Γ·

CAG

AAC

CCC

TGC

CTC

GTG

GAG

GCC

Glu

Gin

Leu

Glu

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

Pro

cys

Leu

Val

Glu

Ala

67 5

680

685

ATT

GCA

C-CT

AAG

ATG

CGT

TTC

CAC

AGA

CAG

CTC

TTC

TCC

CAG

GAC

TGG

Ile

Ala

Ala

Lys

Met

Arg

Phe

His

Arg

Gin

Leu

Phe

Ser

Gin

Asp

Trp

690

695

7Q0

GCA

GAC

TCT

ACT

TTT

TCA

GTG

GTG

CAG

CAG

CAG

AAC

AGC

AAC

CCT

GCT

Ala

ASO

Ser

Thr

Phe

Ser

Val

Val

Gin

Gin

Gin

Asn

Ser

Asn

Pro

Ala

705

710

715

CTG

AGA

CTG

CAG

CCC

AGG

CTA

CCC

ATT

CTT

TCT

TTC

TCC

ATC

CTT

CCC

Leu

Arg

Leu

Gin

Pro

Arg

Leu

Pro

Ile

Leu

Ser

Phe

Ser

Ile

Leu

Pro

720

725

730

735

-57CZ 296516 B6

TTG	ΑΓΤ	CTG	CTG	CAG	ACC	CTC	TGG TAGCTGGGCT TCCTCAGGGT CCTTTGTCC7
1261
Leu	Ile	Leu	Leu	Gin 740	Thr	Leu	Trp

CTCCACCACA 1321	CCCAGACTGA	TTTGCAGCCT	GTGG7GGC-AG	AGAACTCGCC	AGCCTG7GGA
AGAAGACGCA 1381	GCG7C-C7ACA	CAGCAACCCG	GAACCAACCA	GGCATTCCGC	AC-CACATCCC
GTCTGCTCCA 1441	GAAGAGGTCT	m » * » <· rv ♦ Λ* X aa(j a	GGCTGTGACC	CTTCCGATCC	TGAC-CGGCTA
GTTTTCAAAC 1501	CTCCCTTGCC	CCTGCTTCCT	TCTGGCTCAG	GCTGCTCCTC	CTTAGGACTT
TGTGGGTCCA 1561	G7TTTC-CCTT	CTGTTCTGAT	GGTC-ATTAGC	GGCTCACCTC	CAGCGCTTCT
TCCTGTTTCC 1621	CAGGACCACC	CAGAGGCTAA	GGAATCAGTC	ATTCCCTGTT	GCCTTC7CCA
GGAAGGCAGG 1681	CTAAGGG7TC	TGAGGTGACT	GAGAAAAATG	TTTCCTTTGT	GTGGAAGGCT
GGTGCTCCAG 1741	CCTCCACGTC	CCTCTGAATG	GAAGATAAAA	ACCTGCTGGT	GTCTTGACTG
CTCTGCCAC-G 1801	CAATCC7GAA	CATTTC-GC-CA	TGAAGAGCTA	AAGTCTTTGG	GTCTTGTTTA
ACTCCTATTA 1861	CTGTCCCC.-.A	ATTCCCCTAG	TCCCTTGGGT	CATC-ATTAAA	CATTTTGACT
X ΛΑΛΪ^ΛΛΛΛΛ 1689

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 397 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární o

(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

Met 1

Gly

Leu Ser

Trp 5

Ser

Pro

Arg

Pro

Pro 10

Leu

Leu

Met

Ile

Leu 15

Leu

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

Trp

Leu

Pro

Leu

Gly

Ala

Gly

Asn

Ser

Leu

Ala

20

25

30

Thr

Glu

Asn

Arg

Phe

Val

Asn

Ser

Cys

Thr

Gin

Ala

Arg

Lys

Lys

Cys

35

40

45

Glu

Ala

Asn

Pro

Ala

Cys

Lys

Ala

Ala

Tyr

Gin

His

Leu

Gly

Ser

Cys

50

55

60

Thr

Ser

Ser

Leu

Ser

Arg

Pro

Leu

Pro

Leu

Glu

Glu

Ser

Ala

Met

Ser

65

70

75

80

-58CL 296516 B6

Ala Asp

Cys

Leu

Glu 85

Ala Ala Glu

Gin

Leu 90

Arg

Asn

Ser

Ser

Leu 95

Ile

Asp

Cys

Arg

Cys

His

Arg

Arg

Met

Lys

His

Gin

Ala

Thr

cys

Leu

Asp

1C0

105

110

Ile

Tyr

Trp

Thr

Val

His

Pro

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asp

Tyr

Glu

Leu

115

120

125

Asp

Val

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

Lys

Met

130

135

140

Asn

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn

Met

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

cys

Leu

145

150

155

160

Lys

Pne

Ala

Met

Leu

cys

Thr

Leu

His

Asp

Lys

Cys

Asp

Arg

Leu

Arg

165

170

175

Lys

Ala

Tyr

Gly

Glu

Ala

Cys

Ser

Gly

Ile

Arg

Cys

Gin

Arg

His

Leu

180

185

190

Cys

Leu

Ala

Gin

Leu

Arg

Ser

Phe

Phe

Glu

Lys

Ala

Ala

Glu

Ser

His

195

200

205

Ala

Gin

Gly

Leu

Leu

Leu

Cys

Pro

Cys

Ala

Pro

Glu

Asp

Ala

Gly

Cys

210

215

220

Gly

Glu

Arg

Arg

Arg

Asn

Thr

Ile

Ala

Pro

Ser

Cys

Ala

Leu

Pro

Ser

225

230

235

240

Val

Thr

Pro

Asn

Cys

Leu

Asp

Leu

Arg

Ser

Phe

Cys

Arg

Ala

Asp

Pro

245

250

255

Leu

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Met

Asp

Phe

Gin

Thr

His

Cys

His

Pro

Met

260

265

270

Asp

Ile

Lsu

Gly

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin

Ser

Arg

Cys

Leu

Arg

Ala

275

2S0

285

Tyr

Leu

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro

Asn

Phe

Ile

Ser

Lys

250

295

300

Val

Asn

Thr

Thr

Vel

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr

Cys

Arg

Gly

Ser

Gly

Asn

3 05

310

315

320

Leu

Gin

Asp

C-lu

Cys

Glu

Gin

Leu

Glu

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

Pro

325

330

335

Cys

Leu

Val

Glu

Ala

Ile

Ala

Ala

Lys

Met

Arg

Phe

His

Arg

Gin

Leu

340

345

350

Phe

Ser

Gin

Asp

Trp

Ala

Asp

Ser

Thr

Phe

Ser

Val

Val

Gin

Gin

Gin

355

360

365

Asn

Ser

Asn

Pro

Ala

Leu

Arg

Leu

Gin

Pro

Arg

Leu

Pro

Ile

Leu

Ser

370

375

380

Phe

Ser

Ile

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu

Leu

Gin

Thr

Leu

Trp

385 390 395 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1271 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

-59CZ 296516 B6 (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 2...946 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

C GGC TAC TGT GAA ACA CCT C.-A CTC AGG AAC AGC TCT CTG ATA GGC

Gly Tyr Cys Glu Thr Pro Gin Leu Arg Asn Ser Se 405

Leu Ile Gly

410

190

400

142

238

286

334

382

430

473

TGC

ATG

TGC

CAC

CGG

CGC

ATG

AAG

AAC

CAG

GTT

GCC

TGC

TTG

GAC

ATC

cys

Met

Cys

His

Arg

Arg

Met

Lys

Asn

Gin

Val

Ala

Cys

Leu

Asp

Ile

415

420

425

TAT

TGG

ACC

GTT

CAC

CGT

GCC

CGC

AC-C

CTT

GGT

AAC

TAT

GAG

CTG

GAT

Tyr

Trp

Thr

Val

His

Arg

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asn

Tyr

Glu

Leu

Asp

430

4 3 5

440

GTC

TCC

CCC

TAT

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC

AGC

AAA

CCC

TGG

AAA

ATG

AAT

Val

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

Lys

Met

Asn

445

450

455

460

CTC

AC-C

AAA

CTG

AAC

ATG

CTC

Λ---Α

C<_A

GAC

TCA

GAC

CTC

TGC

CTC

AAG

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn

Me t

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

Cys

Leu

Lys

465

470

475

TTT

GCC

ATG

CTG

TG?

2-_^T

CTC

AAT

GAC

AAG

TGT

GAC

CGG

CTG

CGC

AAG

Phe

Ala

Met

Leu

Cys

Thr

Leu

Asn

Asp

Lys

cys

Asp

Arg

Leu

Arg

Lys

4 S 0

485

490

GCC

TAC

GGG

GAG

GCG

GGG

CCC

CAC

TGC

CAG

CC-C

CAC

GTC

TGC

Ala

Tyr

Gly

Glu

Ala

Cys

Ser

Glv

Pro

His

Cys

Gin

Arg

His

Val

Cys

495

500

505

CTC

AGG

CAG

CTG

CTC

ACT

TTC

TTC

GAG

AAG

GCC

GCC

GAG

CCC

CAC

GCG

Leu

Arg

Gin

Leu

Leu

Thr

Fhe

Phe

Glu

Lys

Ala

Ala

Glu

Pro

His

Ala

510

515

520

CAG

GGC

CTG

CTA

CTG

TGC

CCA

TGT

GCC

CCC

AAC

GAC

CGG

GGC

TGC

GGG

Gin

Gly

Leu

Leu

Leu

Cys

Pro

Cys

Ala

Pro

Asn

Asp

Arg

Gly

Cys

Gly

525

530

535

540

GAG

CGC

CGG

CGC

AAC

ACC

ATC

GCC

CCC

AAC

TGC

GCG

CTG

CCG

CCT

GTG

Glu

Arg

Arg

Arg

Asn

ir.r

Ile

Ala

Pro

Asn

Cys

Ala

Leu

Pro

Pro

Val

555

S45

S50

-60CL 296516 B6

526

574

622

670

718

766

814

862

910

956

GCC

CCC

AAC

TGC

CTG

GAG

CTG

CGG

CGC

CTC

TGC

TTC

TCC

GAC

CCG

Ala

Pro

Asn

Cys

Leu

Glu

Leu

Arg

Arg

Leu

Cys

Phe

Ser

Asp

Pro

Leu

560

565

570

TGC

AGA

TCA

CC-C

CTG

GTG

GAT

CAG

ACC

CAC

TGC

CAT

CCC

ATG

GAC

cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Gin

Thr

Eis

Cys

His

Pro

Met

Asp

575

580

585

ATC

CTA

GGA

ACT

TGT

GCA

ACA

GAG

CAG

TCC

AGA

TGT

CTA

CGA

GCA

Ile

Leu

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin

Ser

Arg

Cys

Leu

Arg

Ala

Tyr

590

595

600

CTG

GGG

CTG

ATT

GGG

ACT

GCC

ATG

ACC

CCC

AAC

TTT

GTC

AGC

AAT

GTC

Leu

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro

Asn

Phe

Val

Ser

Asn

Val

605

610

615

620

AAC

ACC

AGT

GTT

GCC

TTA

AGC

TGC

ACC

TGC

CGA

GGC

AGT

GGC

AAC

CTG

Asn

Thr

Ser

Val

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr

Cys

Arg

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

625

630

63 5

CAG

GAG

GAG

TGT

GAA

ATG

CTG

GAA

GGG

TTC

TTC

TCC

CAC

AAC

CCC

TGC

Gin

Glu

Glu

Cys

Glu

Met

Leu

Glu

Gly

Phe

Phe

Ser

His

Asn

Pro

Cys

640

645

650

CTC

ACG

GAG

GCC

ATT

GCA

GCT

AAG

ATG

CGT

TTT

CAC

AGC

CAA

CTC

TTC

Leu

Thr

Glu

Ala

Ile

Ala

Ala

Lvs

Me t

Arg

Phe

His

Ser

Glr.

Leu

Phe

655

660

665

TCC

CAG

GAC

TC-G

CCA

CAC

CCT

ACC

TTT

GCT

GTG

ATG

GCA

CAC

CAG

AAT

Ser

Gin

Asp

Trp

Pro

His

Pro

Thr

Phe

Ala

Val

Met

Ala

His

Gin

Asn

670

675

680

GAA

AAC

CCT

GCT

GTG

AGG

CCA

CAG

CCC

TGG

GTG

CCC

TCT

CTT

TTC

TCC

Glu

Asn

Pro

Ala

Val

Arg

Pro

Gin

Pro

Trp

Val

Pro

Ser

Leu

Phe

Ser

68 5

690

695

7 CO

TGC

ACG

CTT

CCC

TTG

ATT

CTG

CTC

CTG

AGC

CTA

TGG

TAGCTGGACT

Cys

Thr

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu

Leu

Leu

Ser

Leu

Trp

705

710

TCCCCAGGGC

1016

CCTCTTCCCC

TCCACCACAC

CCAGGTGGAC

T7GCAGCCCA

CAAC-GGGTGA

GCAGCAGGA_A

GGAGG7GCAG

TGCGCAGATG

AGGGCACAGG

AG AAGCT AAG

GGTTATGACC

1136

TCCAGATCCT

TACTGGTCCA

G7CCTCATTC

CCTCCACCCC

ATCTCCACTT

CTGATTCA7G

1196

CTGCCCCTCC

TTGGTGGCCA

CAATTTAGCC

ATGTCATCTG

GTGCCTGTGG

ATTCCTAT7A

TTGTCCTAAA

GTCTCTCTGG

CCTTTGACTT ΑΛΑΑΑ 1271

-61 CZ 296516 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 315 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein o

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

Gly 1	Tyr	Cys	Glu	Thr 5	Pro	Gin	Leu
Met	Cys	His	Arg 20	Arg	Met	Lys	Asn
Trp	Thr	Val 35	His	Arg	Ala	Arg	Ser 40
Ser	Pro 50	Tyr	Glu	Asp	Thr	Val 55	Thr
Ser 65	Lys	Leu	Asn	Met	Leu 70	Lys	Pro
Ala	Met	Leu	Cys	Thr 65	Leu	Asn	Asp

Arg	Asn 10	Ser	Ser	Leu	Ile	Gly 15	Cys
Gin 25	Val	Ala	Cys	Leu	Asp 30	Ile	Tyr
Leu	Gly	Asn	Tyr	Glu 45	Leu	Asp	Val
Ser	Lys	Pro	Trp 60	Lys	Met	Asn	Leu
Asp	Ser	Asp 75	Leu	Cys	Leu	Lys	Phe 60
Lys	Cys 90	Asp	Aurg	Leu	Arg	Lys 95	Ala

Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro

100
Arg	Gin	Leu 115	Leu	Thr	Phe	Phe	Glu 120
Gly	Leu 130	Leu	Leu	Cys	Pro	Cys 135	Ala
Arg 145	Arg	Arg	Asn	Thr	Ile 150	Ala	Pro
Pro	Asn	Cys	Leu	Glu 165	Leu	Arg	Arg
Arg	Ser	Arg	Leu 160	Val	Asp	Phe	Gin
Leu	Gly	Thr 195	Cys	Ala	Thr	Glu	Gin 200
Gly	Leu 210	Ile	Gly	Thr	Ala	Met 215	Thr
Thr 225	Ser	Val	Ala	Leu	Ser 230	Cys	Thr
Glu	Glu	Cys	Glu	Met 245	Leu	Glu	Gly
Thr	Glu	Ala	Ile 260	Ala	Ala	Lys	Met

His 105	cys	C-ln	Arg	His	Val 110	Cys	Leu
Lys	Ala	Ala	Glu	Pro 125	His	Ala	Gin
Pro	Asn	Asp	Arg 140	Gly	Cys	Gly	Glu
Asn	Cys	Ala 155	Leu	Pro	Pro	Val	Ala 160
Leu	Cys 170	Phe	Ser	Asp	Pro	Leu 175	Cys
Thr 165	His	Cys	His	Pro	Met 190	Asp	Ile
Ser	Arg	Cys	Leu	Arg 205	Ala	Tyr	Leu
Pro	Asn	Phe	Val 220	Ser	Asn	Val	Asn
Cys	Arg	Gly 235	Ser	Gly	Asn	Leu	Gin 240
Phe	Phe 250	Ser	His	Asn	Pro	Cys 255	Leu
Arg 265	Phe	His	Ser	Gin	Leu 270	Phe	Ser

-62CZ 296516 B6

Gin

Asp

Trp 275

Pro

His

Pro

Thr

Phe 280

Ala

Val

Met

Ala

His 285

Gin

Asn

Glu

Asn

Pro

Ala

val

Arg

Pro

Gin

Pro

Trp

Val

Pro

Ser

Leu

Phe

Ser

Cys

290

295

300

Thr

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu

Leu

Leu

Ser

Leu

Trp

305

310

315

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1699 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 175...1374 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

TGTGGACC-CG CGCTTCGGAG TTGGAGGGCG GCGCCCAGGA CCCTC-GTGGG AGAGTGTGTG 60

CGTCGCGCTG GAGGGCGGC-A GGCC-GGC-GCG GGAC-GTGCCG GTCG.-.GGGAG CCCCGCTCTC 120

AGAGCTCCAG GGGAC-GAGCG AGGC-GAC-CGC GGAGCCCGGC GCCTACAGCT CGCC ATG

177

Met

225

GTG CGC

CCC Pro

CTG Leu 320

AAC Asn

CCG CGA

CCG Pro

CTG Leu 325

CCG Pro

CCC Pro

GTA Val

GTC Val

CTG Leu 330

ATG Met

TTG Leu

Pro

Arg

Val

Arg

CTG

CTG

CTG

CTG

CCG

CCG

TCG

CCG

CTG

CCT

CTC

GGA

C-CC

GGA

GAC

CCC

273

Leu

Leu

Leu

Leu

Pro

Pro

Ser

Pro

Leu

Pro

Leu

Ala

Ala

Gly

Asp

Pro

335

340

345

CTT

CCC

ACA

GAA

AGC

CGA

CTC

ATG

AAC

AGC

TGT

CTC

CAG

GCC

AGG

AGG

321

Leu

Pro

Thr

Glu

Ser

Arg

Leu

Met

Asn

Ser

Cys

Leu

Gin

Ala

Arg

Arg

350

355

360

AAG

TGC

CAG

GCT

GAT

CCC

ACC

TGC

AGT

GCT

GCC

TAC

CAC

CAC

CTG

GAT

369

Lys

Cys

Gin

Ala

Asp

Pro

Thr

Cys

Ser

Ala

Ala

Tyr

His

His

Leu

Asp

365

370

375

380

TCC

TGC

ACC

TCT

AGC

ATA

AGC

ACC

CCA

CTG

CCC

TCA

GAG

GAG

CCT

TCG

417

Ser

Cys

Thr

Ser

Ser

Ile

Ser

Thr

Pro

Leu

Pro

Ser

Glu

Glu

Pro

Ser

385 390 395

-63CZ 296516 B6

GTC

CCT

GCT

GAC

TGC

CTG

GAG

GCA

GCA

CAG

CAA

CTC

AGG

AAC

AGC

TCT

Val

Pro

Ala

Asp

Cys

Leu

Glu

Ala

Ala

Gin

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

Ser

400

405

410

CTG

ATA

GGC

TGC

ATG

TGC

CAC

CGG

CGC

ATG

AAG

AAC

CAG

GTT

GCC

TGC

Leu

Ile

Gly

Cys

Met

cys

His

Arg

Arg

Met

Lys

Asn

Gl.n

Val

Ala

cys

415

420

425

TTG

GAC

ATC

TAT

TGG

ACC

GTT

CAC

CGT

GCC

CGC

AGC

CTT

GGT

AAC

TAT

Leu

Asp

Ile

Tyr

Trp

Thr

Val

His

Arg

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asn

Tyr

430 435 440

GAG

CTG

GAT

GTC

TCC

CCC

TAT

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC

AGC

AAA

CCC

TGG

Glu

Leu

Asp

Val

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

445

450

455

460

AAA

ATG

AAT

CTC

AGC

AAA

CTG

AAC

ATG

CTC

AAA

CCA

GAC

TCA

GAC

CTC

Lys

Met

Asn

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn

Met

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

4£5 470 475

TGC CTC AAG TTT GCC ATG CTG TGT ACT CTC AAT GAC AAG TGT GAC CGG 705

Cys

Leu Lys

Phe 480

Ala

Met

Leu

Cys

Thr 485

Leu

Asn Asp Lys Cys 490

Asp

Arg

CTG

CGC

AAG

GCC

TAC

GGG

GAG

GCG

TC-C

TCC

GGG

CCC

CAC

TGC

CAG

CGC

753

Leu

Arg

Lys

Ala

Tyr

cly

Glu

Ala

cys

Ser

Gly

Pro

His

Cys

Gin

Arg

495

500

505

CAC

GTC

TGC

CTC

AC-G

CAG

CTG

CTC

ACT

TTC

TTC

GAG

AAG

GCC

GCC

GAG

601

His

Val

cys

Leu

Arg

Gin

Leu

Leu

Thr

Phe

Phe

Glu

Lys

Ala

Ala

Glu

S10

515

520

CCC

CAC

GCG

CAG

GC-C

CTG

CTA

CTG

TGC

CCA

TGT

GCC

CCC

AAC

GAC

CC-G

649

Pro

His

Ala

Gin

Gly

Leu

Leu

Leu

Cys

Pro

Cys

Ala

Pro

Asn

Asp

z-.rg

525

530

535

540

GGC

TGC

G-GG

GAG

CGC

CGG

CGC

AAC

ACC

ATC

GCC

CCC

AAC

TGC

GCG

CTG

897

Gly

cys

Gly

G1U

Arg

Arg

Arg

Asn

Thr

Ile

Ala

Pro

Asn

Cys

Ala

Leu

545 550 555

CCG CCT GTG GCC CCC AAC TGC CTG GAG CTG CGG CGC CTC TGC TTC TCC

Pro

Pro Val

Ala 560

Pro Asn Cys

Leu

Glu 565

Leu

Arg Arg

Leu

Cys 570

Phe

Ser

GAC

CCG

CTT

TGC

AGA

TCA

CGC

CTG

GTG

GAT

TTC

CAG

ACC

CAC

TGC

CAT

Asp

Pro

Leu

Cys

Are

Ser

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Gin

Thr

His

Cys

His

575

580

585

CCC

ATG

GAC

ATC

CTA

GGA

ACT

TGT

GCA

ACA

GAG

CAG

TCC

AGA

TG

CTA

Pro

Met

Asp

Ile

Le-J

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin

Ser

Arg

Cys

Leu

590

595

6C0

-64CZ 296516 B6

CGA GCA TAC CTG GGG CTG ATT 1039

Arg Ala Tyr Leu Gly Leu Ile 605 610

AGC AAT GTC AAC ACC AGT GTT 1137

Ser Asn Val Asn Thr Ser Val

625

GGC AAC CTG CAG GAG GAG TGT 1185

Gly Asn Leu Gin Glu Glu Cys 640

AAC CCC TGC CTC ACG GAG GCC 1233

Asn Pro Cys Leu Thr Glu Ala 655

CAA CTC TTC TCC CAG GAC TGG 1281

Gin Leu Phe Ser Gin Asp Trp 670 675

CAC CAG AAT GAA AAC CCT GCT 1329

His Gin Asn Glu Asn Pro Ala

685 690

CTT TTC TCC TGC ACG CTT CCC 1374

Leu Phe Ser Cys Thr Leu Pro

705

GGG ACT GCC ATG ACC CCC AAC TTT GTC

Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Val

615620

GCC TTA AGC TGC ACC TGC CGA GGCAGT

Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg GlySer

630635

GAA ATG CTG GAA GGG TTC TTC TCCCAC

Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe SerHis

645650

ATT GCA GCT AAG ATG CGT TTT CACAGC

Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe HisSer

660665

CCA CAC CCT ACC TTT GCT GTG ATG GCA

Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met Ala

680

GTG AGG CCA CAG CCC TGG GTG CCC TCT

Val Arg Pro Gin Pro Trp Val Pro Ser

695 700

TTG ATT CTG CTC CTG AGC CTA TGG

Leu Ile Leu Leu Leu Ser Leu Trp

710 715

TAGCTGGACT 1434	TCCCCAGGGC	CCTCTTCCCC	TCCACCACAC	CCAGGTC-GAC	T7GCAGCCCA
CAA.GGGGTGA 1494	GGAAAGGACA	GCAGCAGG.AA	GGAGGTGCAG	TGCGCAGATG	AC-GGCACAGG
AGAAGCTAAG 1554	GGTTATGACC	TCCAGATCCT	TACTGGTCCA	GTCCTCATTC	CCTCCACCCC
ATCTCCACTT 1614	C7GAT7CATG	CTGCCCCTCC	TTGGTGGCCA	CAATTTAGCC	ATGTCATCTG
GTGCCTGTGG	GCCT7GCTTT	ATTCCTATTA	TTGTCCTAAA	GTCTCTCTGG	GCTCTTC-GAT

1674

CATGATTAAA CCTTTC-ACTT AAAAA

1699 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 400 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineami (ii) TYP MOLEKULY: protein

-65CZ 296516 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

Met 1

Val

Arg

Pro

Leu 5

Asn

Pro

Arg

Pro

Leu 10

Pro

Pro

Val

Val

Leu 15

Met

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Pro

Pro

Ser

Pro

Leu

Pro

Leu

Ala

Ala

Gly

Asp

20

25

30

Pro

Leu

Pro

Thr

Glu

Ser

Arg

Leu

Met

Asn

Ser

Cys

Leu

Gin

Ala

Arg

3 5

40

45

Arg

Lys

cys

Gin

Ala

Asp

Pro

Thr

Cys

Ser

Ala

Ala

Tyr

His

His

Leu

50

55

60

Asp

Ser

Cys

Thr

Ser

Ser

Ile

Ser

Thr

Pro

Leu

Pro

Ser

Glu

Glu

Pro

65

70

75

80

Ser

Val

Pro

Ala

Asp

Cys

Leu

Glu

Ala

Ala

Gin

Gin

Leu

Arg

Asn

Ser

65

90

95

Ser

Leu

Ile

Glv

Cys

Her

Cys

His

Arg

Arg

Met

Lys

Asn

Gin

Val

Ala

100

105

110

Cys

Leu

Asp

Ile

Tyr

Trp

Thr

Val

His

Arg

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asn

115

120

125

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

Pro

13 0

135

140

Trp

Lys

Met

Asn

Ser

Lys

Leu

Asn

Met

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

145

150

155

160

Leu

Cys

Leu

Lys

rhe

Ai a

Met

Leu

Cys

Thr

Leu

Asn

Asp

Lys

Cys

Asp

165

170

175

λΣ Z

Arg

Lys

A i a

. ·*·

C-ly

Glu

Ala

Cys

Ser

Cly

Pro

His

Cys

Gin

160

165

190

.-.Z g

His

Val

Cys

Le -

•-.rg

Gin

Leu

Leu

Thr

Phe

Phe

Glu

Lys

Ala

Ala

155

200

205

Glu

Pro

His

Ala

Gin

C-iy

Leu

Leu

Leu

Cys

Pro

Cys

Ala

Pro

Asn

Asp

210

215

220

Arg

C-lv

Cys

Cly

Glu

Are

Arg

Arg

Asn

Thr

Ile

Ala

Pro

Asn

Cys

Ala

225

233

235

240

Leu

Pro

Pro

Val

Ala

?ro

Asn

Cys

Leu

Glu

Leu

Arg

Arg

Leu

Cys

Phe

Ξ 4 5

250

255

Ser

Asp

Pro

Leu

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Gin

Thr

His

Cys

250

265

270

His

Pro

Met

A.sp

Ile

Leu

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr

Giu

Gin

Ser

Arg

Cys

275

280

285

Leu

Arg

Ala

Tyr

Leu

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro

Asn

Phe

250

255

300

Val

Ser

Asn

Val

Asn

Thr

Ser

Val

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr

Cys

Arg

Gly

3C5

310

315

320

Ser

Gly

Asn

Leu

Gin

Glu

Glu

Cys

Glu

Met

Leu

Glu

Gly

Phe

Phe

Ser

325

330

335

His

Asn

Pro

Cys

Leu

Thr

Glu

Ala

Ile

Ala

Ala

Lys

Met

Arg

Phe

His

340

345

350

Claims (19)

1. Izolovaná nukleová kyselina, která kóduje polypeptid mající alespoň 80% sekvenční identitu se sekvencí aminokyselin vybranou ze skupiny sestávající ze sekvencí uvedených v popisu jako sekvence id. č. 17 a sekvence id. č. 21, přičemž polypeptid vytváří interakci s receptorovým proteinem Ret, která spouští dimerizaci receptorového proteinu Ret nebo autofosfoiylaci tyrosinkinázové domény receptorového proteinu Ret.

2. Nukleová kyselina podle nároku 1, kde aminokyselinová sekvence kódovaného peptidu zachovává alespoň 80 % cysteinových zbytků při srovnání se sekvencí id. č. 17 nebo sekvencí id. č.21.

3. Nukleová kyselina podle nároku 1, kde kódovaný polypeptid má alespoň 90% sekvenční identitu se sekvencí aminokyselin vybranou ze skupiny sestávající ze sekvence id. č. 17a sekvence id. č. 21.

4. Nukleová kyselina podle nároku 3, kde kódovaný polypeptid je polypeptid se sekvencí id. č. 17 nebo sekvencí id. č. 21.

5. Izolavaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze sekvence id. č. 16 a sekvence id. č. 20.

6. Vektor obsahující inzert obsahující nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.

7. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 6.

8. Způsob přípravy polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se: kultivují buňky podle nároku 7 a izoluje se polypeptid exprimovaný z inzertu v hostitelských buňkách.

9. Polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.

10. Izolovaná monoklonální protilátka, která se může na polypeptid vybraný ze skupiny sestávající z polypeptidů sekvence id. č. 15, sekvence id. č. 17, sekvence id. č. 19 sekvence id.č. 21.

11. Protilátka podle nároku 10, která se váže na polypeptid sekvence id. č. 19 nebo sekvence id. č. 21.

12. Kompozice, vy z n a č uj í c í se t í m , že obsahuje (a) protilátku podle nároku 10 nebo 11, která je asociována s (b) toxinem, zobrazitelnou sloučeninou nebo radionuklidem.

-67CZ 296516 B6

13. Fúzní protein obsahující polypeptid podle nároku 9, který je fúzován s imunoglobulinem, toxinem, zobrazitelnou sloučeninou nebo radionuklidem.

14. Nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 pro použití při léčení nebo diagnostice.

15. Vektor podle nároku 6 pro použití při léčení nebo diagnostice.

16. Polypeptid podle nároku 9 pro použití při léčení nebo diagnostice.

17. Protilátka podle nároku 10 nebo 11 pro použití při léčení nebo diagnostice.

18. Kompozice podle nároku 12 pro použití při léčení nebo diagnostice.

19. Fúzní protein podle nároku 13 pro použití při léčení nebo diagnostice.