CZ296516B6 - Nukleová kyselina kódující ligand c-Ret, polypeptid kódovaný touto nukleovou kyselinou a zpusob jeho prípravy - Google Patents
Nukleová kyselina kódující ligand c-Ret, polypeptid kódovaný touto nukleovou kyselinou a zpusob jeho prípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ296516B6 CZ296516B6 CZ0361598A CZ361598A CZ296516B6 CZ 296516 B6 CZ296516 B6 CZ 296516B6 CZ 0361598 A CZ0361598 A CZ 0361598A CZ 361598 A CZ361598 A CZ 361598A CZ 296516 B6 CZ296516 B6 CZ 296516B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ret
- sequence
- seq
- human
- leu
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Resení poskytuje cistou a izolovanou molekulu DNA, která kóduje polypeptid mající alespon 80% sekvencní identitu se sekvencí aminokyselin vybranou zeskupiny sestávající z mysího RetL3 (sekvence id. c. 17) a lidského RetL3 (id. c. 21), pricemz polypeptid vytvárí interakci s receptorovým proteinem Ret, která spoustí dimerizaci receptorového proteinu Ret nebo autofosforylaci tyrosinkinázové domény receptorového proteinu Ret. Dále poskytuje polypeptid, který je kódován molekulou DNA a zpusob prípravy tohoto polypeptidu s vyuzitím hostitelských bunek, které exprimují DNA podle vynálezu, vlozenou do hostitelských bunek pomocí vektoru.
Description
Oblast techniky
Tento vynález se týká nukleotidových sekvencí, které kódují ligand Ret (RetL), a příslušného polypeptidu, který je využitelný při léčení nebo diagnostice onemocnění nervových a ledvinných tkání.
Dosavadní stav techniky
Jedním z cílů současného výzkumu buněčné signalizace a receptorové aktivace je umožnit léčebnou modulaci procesů zapojených do buněčného růstu a přežívání. Tyto procesy určují výsledek různých zdravotních stavů, včetně orgánového selhání, vývoje plodu a nádorového růstu, a dalších. Každý z těchto stavů je celosvětově klinicky významný a možnosti účinného léčení jsou omezené. Cílem vynálezu je poskytnout přípravek a způsoby pro podporování regenerace nebo přežívání poškozené tkáně, a také pro léčení poruch zahrnujících odchylný růst a vývoj tkání.
Ztráta tkáně a konečné stádium orgánového selhání zasahují každý rok miliony lidí na celém světě a podstatně přispívají k výdajům na zdravotní péči. Ztráta tkán nebo orgánů se obvykle léčí transplantací orgánů od dárců, chirurgickou rekonstrukcí nebo mechanickými zařízeními. Každý z těchto léčebných postupů má nedostatky. Transplantace je omezena nedostatkem dárců, chirurgická rekonstrukce může vytvořit další dlouhodobé problémy a mechanická zařízení nemohou provádět všechny funkce jednoho orgánu a proto nemohou zabránit postupné degeneraci. Proto existuje reální zdravotní potřeba pro nová řešení těchto problémů.
Proteinové faktory, které ovlivňují růst, diferenciaci a/nebo přežívání buněk, mohou být použitelné při léčení poruch orgánů obsahujících responzivní buňky. Faktory nebo ligandy, které interagují s receptory rodiny proteinového receptoru tyrozinkinázy (RPTK) jsou v tomto ohledu hodné obzvláštního zájmu. Tyto receptory jsou zapojeny v mnoha buněčných programech včetně buněčného růstu a diferenciace včetně geneze mnoha novotvarů. Tak se mohou faktory nebo ligandy, které interagují s těmito receptory, prokázat jako použitelné pro léčení poruch určitých orgánů, při kterých byla poškozená tkáň. Jako alternativa, aby se blokoval růst nádorů, mohou být použitelné pro blokádu interakce těchto faktorů se svými receptory.
Protoonkogen Ret kóduje receptor tyrozinkinázy, které je exprimován během vývoje v různých tkáních, včetně periferního a centrálního nervového systému a ledvin. Abnormality přítomné u myší, které Ret postrádají („ret null mice“), svědčí pro to, že Ret je kritický pro migraci a inervaci střevních neuronů do zadního střeva, a pro proliferaci a větvení epitelu ureterového pupenu během vývoje ledvin (Nátuře 367, 380-383, 1994). Hledání klíčové složky signální dráhy Ret, ligandu Ret, je oblast intenzivního výzkumu.
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje purifikovanou a izolovanou molekulu DNA kódující RetL, která má nukleotidovou sekvenci jakéhokoliv RetL, ale specificky zahrnuje cDNA krysího retLl (sekvence s identifikačním číslem (id. č.) 1), částečnou cDNA lidského retLl (sekvence id. č. 8), nezkrácenou cDNA lidského retLl (sekvence id. č. 10), cDNA lidského retL2 (sekvence id. č. 12), cDNA myšího retL3 (sekvence id. č. 16), částečnou cDNA lidského retL3 (sekvence id. č. 18) nebo cDNA lidského retL3 (sekvence id. č. 20). Vynález dále poskytuje protein RetL, s aminokyselinovou sekvencí zahrnující sekvenci krysího RetLl (sekvence id. č. 2), částečnou sekvenci lidského RetLl (sekvence id. č. 9), nezkrácenou sekvenci lidského RetLl (sekvence id. č. 11), lidského RetL2 (sekvence č. 13), myšího RetL3 (sekvence id. č. 19) nebo lidského RetL3 (sekvence id. č. 21).
V dalším provedení vynálezu zahrnuje sekvenci DNA, která obsahuje sekvenci (částečnou cDNA lidského retLl (sekvence id. č. 8)) inzertu DNA klonu HRL20, který má ATCC č. 97604, nebo sekvenci inzertu DNA klonu č. 230-5A-86-17 (cDNA krysího retLl (sekvence id. č. 1)), který má ATCC č. 98047.
V dalším provedení vynálezu má purifikovaná a izolovaná molekula DNA propoužití v bezpečné expresi polypeptidového produktu v prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňce přinejmenším část primární strukturální konformace a biologické aktivity RetL, DNA může být a) molekula DNA, která obsahuje cDNA krysího retLl, částečnou cDNA lidského retLl, nezkrácenou cDNA lidského retLl, cDNA lidského retl2, cDNA myšího retL3 nebo cDNA lidského retL3, nebo komplementární vlákno cDNA krysího retLl, částečné cDNA lidského retLl, nezkrácené cDNA lidského retLl, cDNA lidského retL2, cDNA myšího retL3 nebo cDNA lidského retL3, b) molekuly DNA, které hybridizují za stringentních (přísných) podmínek s molekulami DNA definovanými v a) nebo jejich fragmenty, nebo c) molekuly DNA, které by díky degeneraci genetického kódu hybridizovaly s molekulami DNA definovanými v a) nebo b). Předmětem vynálezu je také purifikovaná a izolovaná molekula DNA kódující polypeptidový fragment nebo variantu lidského RetL mající biologickou aktivitu RetL.
Každá rekombinantní molekula DNA vynálezu může být operativně spojena s expresní kontrolní sekvencí.
Do vynálezu také patří vektoiy a systémy pro podávání, které obsahují molekuly DNA nebo konstrukty definované na jiném místě tohoto popisu. Vektor může obsahovat molekulu DNA kódující RetL nebo jeho variantu.
Vynález zahrnuje prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky trvale transformované nebo transfekované vektorem obsahujícím molekulu DNA kódující nativní RetL nebo jeho variantu.
Purifikovaný a izolovaný lidský RetL v podstatě bez dalších lidských proteinů je specifický pro vynález, a také způsob přípravy polypeptidového produktu, který má částečnou nebo úplnou primární strukturní konformaci a biologickou aktivitu RetL. Takový způsob může zahrnovat kroky pěstování, za vhodných kultivačních podmínek, prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk transformovaných nebo transfekovaných jakoukoliv molekulou DNA podle vynálezu způsobem umožňujícím expresi tohoto polypeptidového produktu, a opětovné získání RetL. Vynález také zahrnuje polypeptidový produkt exprese DNA v prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňce.
Vynález poskytuje také proteiny a proteinové fragmenty, varianty a deriváty, buď rozpustné nebo vázané na membráně. Ve vybraných provedeních má protein aminokyselinovou sekvenci, která zahrnuje krysí RetLl, lidský RetL2, myši RetL3 nebo lidský RetL3 nebo je variantou jedné z těchto sekvencí. V dalších provedeních je protein fúzní protein obsahující Ret nebo RetL, fúzovaný k další molekule nebo molekulovému fragmentu, jako je imunoglobulin, toxin, zobrazovací sloučenina (pro detekci zobrazovacími technikami) nebo radionuklid. Patří sem také chimérické molekuly RetL.
Další provedení vynálezu zahrnuje specifické monoklonální protilátky kRetL podle vynálezu. Tato protilátka může být spojena stoxinem, zobrazovací sloučeninou nebo radionuklidem. Vynález také zahrnuje hybridomové buněčné linie, které produkují specifické protilátky k Ret, včetně AA.FF9, AA.HE3, AF.E9, BA.B1, BB.B6, AA.GE7, CD.F11, AH.E3, CD.G4, AG.E7, BD.G6 a BH.G8, a také subklony těchto hybridomů a protilátky tvořené těmito hybridomy nebo subklony těchto hybridomů.
-2CL 29b51b B6
Vynález dále zahrnuje způsob podporování růstu nové tkáně nebo podporování prožívání poškozené tkáně pacienta, včetně podávání pacientovi léčebně účinné množství sloučeniny, která interaguje s buněčným Ret, a tím indukuje autofosforylaci Ret. Sloučenina může být RetLl, RetL2, nebo RetL3, fragment nezkráceného RetL nebo protilátka, která se váže na Ret. Sloučenina může být podávána současně s léčebně účinným množstvím druhé sloučeniny, jako je GDNF, neurturin nebo molekula příbuzná s GDNF. Zatímco cílové tkáně pro tyto způsoby léčení mohou zahrnovat jakoukoliv tkáň, preferované tkáně zahrnují tkáň ledvin, nervovou tkáň, srdce, žaludek, tenké střevo, míchu nebo plíce. V jednom provedení je RetL rozpustný RetL. Subjektem způsobů léčení může být člověk.
V dalším způsobu podle vynálezu je inhibována signální transdukce (přenos signálu) Ret mezi první buňkou exprimující RetL a druhou buňkou kontaktem první buňky s rozpustným proteinem Ret nebo s protilátkou k RetL. Rozpustný protein Ret může být fúzní protein.
Vynález také zahrnuje způsob cílení toxinu, zobrazovací sloučeniny nebo radionuklidu na buňku exprimující Ret, způsob zahrnuje kontakt buňky s fúzním proteinem RetL nebo protilátkou antiRet konjugovanou stoxinem, zobrazovací sloučeninou nebo radionuklidem. RetL může být RetLl, RetL2 nebo RetL3. V dalším způsobu podle vynálezu je potlačen růst nádorové buňky, která exprimuje Ret, krokem způsobuje kontakt buňky s fúzním proteinem RetL s toxinem nebo radionuklidem, nebo s protilátkou anti-Ret konjugovanou s toxinem nebo radionuklidem. Buňka může přitom být v těle pacienta a protein nebo konjugovaná protilátka se podává pacientovi. Ve vynálezu je také zahrnut způsob cílení toxinu, zobrazovací sloučeniny nebo radionuklidu na buňku exprimující RetL, zahrnující kontakt buňky s fúzním proteinem obsahujícím Ret a toxin, zobrazovací sloučeninu nebo radionuklid, nebo protilátku anti-RetL konjugovanou s toxinem, zobrazovací sloučeninou nebo radionuklidem. Další provedení zahrnuje způsob potlačení růstu nádorové buňky, která exprimuje RetL, způsob obsahuje kontakt buňky s fúzním proteinem Ret s toxinem nebo radionuklidem, nebo s protilátkou anti-RetL konjugovanou s toxinem nebo radionuklidem, přitom buňka může být v těle pacienta a protein nebo konjugovaná protilátka se podává pacientovi. RetL pro kterýkoliv za způsobů vynálezu může být RetLl, RetL2 nebo RetL3, nebo varianta či fragment RetLl, RetL2 nebo RetL3.
Vynález dále poskytuje způsoby genové terapie. Jedno provedení je způsob léčení pacienta s poruchou metabolismu Ret, zahrnující podávání pacientovi vektor obsahující molekulu DNA kódující RetL, a také způsob podporování růstu nové tkáně v těle pacienta, zahrnující podávání takového vektoru pacientovi. Další provedení zahrnuje způsob podporování přežívání poškozené tkáně v těle pacienta, jedním krokem způsobuje podávání terapeuticky účinného množství vektoru kódujícího RetL pacientovi.
Popis obrázků
Obrázek 1 je sekvence cDNA (sekvence id. č. 1) a zní odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 2) krysího RetLl. Nukleotidová sekvence zasahuje od páru bází 201 po pár bází 1700 se sekvence id. č. 1 a obsahuje celý otevřený čtecí rámec.
Obrázek 2A je částečná sekvence cDNA (sekvence id. č. 8) a z ní odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id č. 9) lidského RetLl. Tato sekvence je ta, která je vložena do klonu HRL20, deponovaného jako ATCC č. 97604.
Obrázek 2B je složená úplná sekvence DNA (sekvence id. č. 10) a odvozené aminokyselinové sekvence (sekvence id. č. 11) lidského RetLl.
Obrázek 3A je srovnání nukleotidové sekvence lidského RetLl (horní řádek sekvence) skrysi sekvencí RetLl (spodní řádek sekvence). Vertikální řádky mezi nukleotidy ukazují identitu v dané pozici, zatímco tečka vyznačuje v této pozici mezeru.
-3CZ 296516 B6
Obrázek 3B je srovnání aminokyselinové sekvence lidského RetLl (homí řádek sekvence) s krysí sekvencí RetLl (spodní řádek sekvence). Vertikální řádky mezi odpovídajícími aminokyselinami ukazují ve zbytku identitu, zatímco tečka vyznačuje v tomto zbytku konzervativní substituci.
Obrázek 4A je schematické zobrazení možné role pro Ret a RetL v interakci nebo metanefrogenní mezenchymovou buňkou a buňkou ureterového pupenu.
Obrázek 4B je schematické zobrazení způsobu testování transfektant z knihovny cDNA na přítomnost kloubů, které exprimují RetL. Přítomnost exprimovaného RetL u transfektant je detekována stanovením vazby těchto transfektant buď na fuzní protein Ret/IgG nebo fuzní protein Ret/alkalická fosfatáza.
Obrázek 5 je schematické zobrazení ukazující konstrukci plazmidů použitých k expresi lidského fuzního proteinu Ret/IgG.
Obrázek 6 je schematické zobrazení ukazující konstrukci plazmidů použitých k expresi lidského fuzního proteinu Ret/IgG.
Obrázek 7 je sekvence cDNA (sekvence id. č. 12) a odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 13) lidského RetL2 v klonu DSW240. Proteinový čtecí rámec je obsažen mezi nukleotidy 25 až 1416.
Obrázek 8 je srovnání aminokyselinové sekvence lidského RetL2 (homí řádek sekvence) se sekvencí lidského RetLl (spodní řádek sekvence). Vertikální řádky mezi aminokyselinami ukazují identitu v dané pozici, zatímco tečka vyznačuje v téže pozici mezeru.
Obrázek 9 je sekvence cDNA (sekvence id. č. 16) a zní odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 17) myšího RetL3.
Obrázek 10 je sekvence cDNA (sekvence id. č. 20) a zní odvozená aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 21) lidského RetL3.
Podrobný nopis vynálezu
Identifikační čísla sekvencí
Nukleotidovým a aminokyselinovým sekvencím zmiňovaným ve specifikaci byla dána následující identifikační čísla (id. Č.) sekvencí:
sekvence id. č. 1 - cDNA krysího retLl sekvence id. č. 2 - aminokyselinová sekvence krysího retLl sekvence id. č. 3 - oligomer kid-13 sekvence id. č. 4 - oligomer kid-14 sekvence id. č. 5 - oligomer kid-15 sekvence id. č. 6 - cDNA extracelulámího krysího ret sekvence id. č. 7 - aminokyselinová sekvence krysího Ret sekvence id. č. 8 - částečná cDNA lidského retLl sekvence id. č. 9 - částečná aminokyselinová sekvence lidského RetLl sekvence id. č. 10 - cDNA lidského retLl sekvence id. č. 11 - aminokyselinová sekvence lidského RetLl
-4sekvence id. č. 12 - cDNA lidského retL2 sekvence id. č. 13 - aminokyselinová sekvence lidského RetL2 sekvence id. č. 14 - částečná cDNA myšího retL3 (EST AA 50083) sekvence id. č. 15 - částečná aminokyselinová sekvence myšího RetL3 sekvence id. č. 16 - cDNA myšího retL3 sekvence id. č. 17 - aminokyselinová sekvence myšího RetL3 sekvence id. č. 18 - částečná cDNA lidského retL3 sekvence id. č. 19- částečná aminokyselinová sekvence lidského RetL3 sekvence id. č. 20 - cDNA lidského retL3 sekvence id. č. 21 - aminokyselinová sekvence lidského RetL3
Definice termínů
V popisu vynálezu termín „RetL“ znamená každý protein, který specificky interaguje s receptorovým proteinem Ret, a který, když interaguje s Ret, spouští dimerizaci Ret a/nebo autofosforylaci tyrozinkinázové domény Ret. Sekvence DNA, které kódují RetL a Ret, jsou nazývány „retL“ a „ret“, v uvedeném pořadí. Ligand může být rozpustný, nebo přítomný jako molekula navázaná na membránu a na téže nebo jiné buňce, jako je molekula Ret, pro kterou spouští autofosforylaci. Při určitých použitích nebo interakcích s Ret, může ligand vyžadovat ke spouštění autofosforylace další molekuly. Ligandy vynálezu zahrnují společné receptory nebo přídatné kofaktory ligandu. Ligandy vynálezu dále zahrnují monoklonální protilátky (mAbs) anti-Ret, které působí jako antagonisté Ret spouštějící dimerizaci a autofosforylaci Ret. Ligand může být také různými způsoby modifikován, například inkorporován jako část fuzního proteinu, například s toxinem nebo radionuklidem.
„Porovnáním sekvencí“ se míní srovnání pozic jedné sekvence, buď nukleotidové nebo aminokyselinové, s další sekvencí, aby se umožnilo srovnání sekvence relevantních částí jedné s toutéž částí druhé. Příklad této metody popsal Needleman et al. (J. Mol. Biol., 48, 443-453, 1970). Metoda může být použita pohodlně počítačovými programy jako je program Align (DNAstar, lne.). Odborníkům je známo, že homologní nebo funkčně ekvivalentní sekvence zahrnují funkčně ekvivalentní uspořádání cysteinových zbytků v konzervovaném cysteinovém skeletu, včetně aminokyselinových inzercí nebo delecí, které poměňují lineární uspořádání těchto cysteinů, ale podstatně nemění svůj vztah ve složené (uspořádané) struktuře proteinu. Pro vnitřní mezery a aminokyselinové inzerce v uvažované sekvenci jsou ignorovány za účelem kalkulace stupně sekvenční homologie aminokyselinové sekvence nebo identity mezi uvažovanou a referenční sekvencí. Jedna charakteristika často používaná při stanovení homologie proteinů je podobnost počtu a lokaliziace cysteinových zbytků mezi jedním a druhým proteinem.
„Klonováním“ se míní použití in vitro rekombinantních technik pro vložení konkrétního genu nebo jiné sekvence DNA do molekuly vektoru. Aby se požadovaný gen mohl úspěšně klonovat, je nezbytné použít metody pro vznik fragmentů DNA, pro spojování fragmentů s molekulami vektoru, pro zavedení složené molekuly DNA do hostitelské buňky, ve které se může replikovat, a pro výběr klonu, který obsahuje cílový gen, z příjemcových hostitelských buněk.
„cDNA“ se míní komplementární DNA nebo kopie DNA tvořená z templátu RNA činností DNA polymerázy závislé na RNA (reverzní transkriptázy). Tedy „klon cDNA“ znamená dvojitou sekvenci DNA komplementární ke zkoumané molekule RNA nesenou v klonovacím vektoru.
„Knihovou cDNA“ se míní soubor rekombinantních molekul DNA obsahujících inzerty DNA, které dohromady reprezentují úplný souboru molekul RNA přítomných v celém organismu nebo tkáni, v závislosti na zdroji templátů RNA. Taková knihovna cDNA může být připravena způsoby odborníkům známými, jak jsou popsány např. vManiatis et al., Molecular Cloning: A Labora
-5CZ 296516 B6 tory Manual, výše. Obecně se RNA nejdříve izoluje z buněk organismu, z jehož genomu je žádoucí klonovat konkrétní gen. Pro tento účel jsou podle předkládaného vynálezu výhodně savčí, a obzvláště lidské, buněčné linie. Jako alternativa může být RNA izolována z národové buňky, pocházející ze zvířecího nádoru, a výhodně z lidského národu. Tak může být připravena knihovna například z lidského nádoru nadledvinek, ale může být použit jakýkoliv nádor.
Termín „polymorfismus DNA“ se týká stavu, kdy mohou existovat dvě nebo více odlišných nukleotidových sekvencí v konkrétním místě v DNA.
„Expresní vektor“ popisuje vektory, které jsou schopné exprese sekvencí DNA v nich obsažených, tj. kódující sekvence jsou operativně spojeny s dalšími sekvencemi schopnými uskutečnit jejich expresi. Je jasné, ačkoliv ne vždy vyjádřeno explicitně, že tyto expresní vektory musí být replikovatelné v hostitelském organismu buď jako episomy nebo jako integrální část chromozómové DNA. Užitečný, í když ne nezbytný, prvek účinné exprese vektoru je sekvence kódující markér - značku, což je sekvence kódující protein, který má za následek určitou fenotypovou vlastnost (např. tetracyklinovou rezistenci) buněk protein obsahujících, což umožňuje, že tyto buňky jsou snadno identifikovatelné. Tedy termín „expresní vektor“ je dán funkční definicí a jakákoliv sekvence DNA, která je schopná uskutečnit expresi specifického obsaženého DNA kódu je v tomto termínu zahrnuta, jak je to aplikováno na sekvence v tomto popisu. Tyto vektory jsou často ve formě plazmidů, takže „plazmid“ a „expresní vektor“ jsou často používány zaměnitelně. Avšak vynález zahrnuje i další formy expresních vektorů, včetně fága, které mají ekvivalentní funkci a které jsou v oboru známé.
Podobně „funkční derivát“ genu kteréhokoliv z proteinů podle předkládaného vynálezu zahrnuje „fragmenty“ „varianty a „analogy“ genu, které mohou být „podstatně podobné“ v nukleotidové sekvenci, a které kódují molekulu mající podobnou aktivitu.
„Molekula příbuzná GDNF“ znamená každou molekulu, která je alespoň ze 40 % homologní s buď GNDF nebo neurturinem, a je také schopna specificky vázat RetL.
Termín „gen“ znamená polynukleotidovou sekvenci kódující peptid.
„Homogenním“ se míní při odkazu na peptidovou nebo DNA sekvenci, že primární molekulární struktura (tj. sekvence aminokyselin nebo nukleotidů) v podstatě všech molekul přítomných v daném přípravku je totožná.
Termín „oligonukleotid“, jak se zde používá pro molekulové sondy DNA, oligomerové fragmenty, které mají být detekovány, oligomerové kontroly, neznačené blokující oligomery a příměry pro amplifikaci sekvencí DNA, je definován jako molekula složená z více než tří deoxyribonukleotidů nebo ribonukleotidů. Přesná velikost oligonukleotidu závisí na mnoha faktorech, které zase závisí na konečné funkci nebo použití oligonukleotidu.
Termín „sonda“ obecně označuje ligand známých kvalit schopný selektivní vazby na cílový antiligand. Při aplikaci na nukleové kyseliny se termín „sonda“ týká vlákna nukleové kyseliny, která má sekvencí bází komplementární k cílovému vláknu.
Termín „rekombinantní hostitelské buňky“ se týká buněk, které byly transformovány vektory konstruovanými za použití technik rekombinantní DNA. Jak je zde definováno, protilátka nebo její modifikace tvořená rekombinantní hostitelskou buňkou je výsledkem této transformace, neboť netransformovaný hostitel by tvořil spíše malá množství, menší než detekovatelná.
Termíny „restrikční endonukleáza“ a „restrikční enzym“ se týkají bakteriálních enzymů, každý z nich štěpí dvojvláknovou DNA ve specifické nukleotidové sekvenci nebo blízko ní.
-6CZ 296516 B6
Termín „polymorfismus délky restrikčních fragmentů“ („RFLP“) se týká odlišností mezi jednotlivci v délce konkrétního restrikčního fragmentu.
O molekule se říká, zeje „podstatně podobná“ jiné molekule, jestliže je sekvence aminokyselin v obou molekulách v podstatě stejná, a jestliže obě molekuly mají podobnou biologickou aktivitu. Tak za předpokladu že dvě molekuly mají podobnou aktivitu, se považují za varianty, jak je tento termín používaný zde dokonce i když jedna z molekul obsahuje další aminokyselinové zbytky nenalezené v druhé, nebo když sekvence aminokyselinových zbytků není totožná. O molekule se říká, zeje „chemický derivát“ jiné molekuly, když obsahuje další chemické skupiny, které normálně nejsou částí molekuly. Takové skupiny mohou zlepšit molekulovou rozpustnost, absorpci, biologický poločas atd. Skupiny mohou alternativně snižovat toxicitu molekuly, eliminovat nebo zeslabovat každý nežádoucí vedlejší účinek molekuly atd. Skupiny schopné zprostředkovat takové účinky jsou popsány například v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 16. vyd., Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1980.
„Vektorem“ se míní molekula DNA, odvozená z plazmidu nebo bakteriofága, do které mohou být vloženy nebo klonovány fragmenty DNA. Vektor obsahuje dvě nebo více jedinečných restrikčních míst, a je schopen autonomní replikace v definovaném hostiteli nebo nosičském organismu tak, že klonovaná sekvence je reprodukovatelná.
Termínem „v podstatě čistý“ se míní každý protein podle předkládaného vynálezu nebo každý gen kódující takový protein, který je v podstatě bez dalších proteinů nebo genů, nebo bez jiných kontaminujících sloučenin, se kterými může být normálně nalezen v přírodě, a jako takový existuje ve formě v přírodě nenalezené.
Sloučeniny podle vynálezu
Vynález zahrnuje cDNA kódující RetL, jako je nukleotidová sekvence cDNA krysího retLl, částečná cDNA lidského retLl, nezkrácená cDNA lidského retLl, cDNA lidského retL2, cDNA myšího retL3 nebo cDNA lidského retL3. Kromě toho sloučeniny vynálezu zahrnují sekvence, které obsahují výše uvedené sekvence nebojsou deriváty jedné z těchto sekvencí. Vynález také zahrnuje vektory, lipozomy a další vehikula vhodná pro přenos, která obsahují jednu z těchto sekvencí nebo derivát jedné z těchto sekvencí. Vynález také zahrnuje proteiny transkribované a translatované z cDNA krysího retLl, částečné cDNA lidského retlLl, úplné cDNA lidského retLl, cDNA lidského retL2, cDNA myšího retL3 nebo cDNA lidského retL3, což zahrnuje, ale není omezeno na, krysí RetLl, částečnou sekvenci lidského RetLl, úplný lidský RetLl, lidský RetL2, myší RetL3 nebo lidský RetL3, a jejich deriváty a varianty.
Jedno provedení vynálezu se týká rozpustné varianty RetL. Rozpustné varianty postrádají přinejmenším úsek intramembránové části nativního RetL. V některých příkladech rozpustná varianta postrádá fosfatidylinozitolglykanovou vazbu nativního RetL. Rozpustné varianty zahrnují fúzní proteiny, které obsahují deriváty RetL, které postrádají fosfatidylinozitolový motiv.
Varianty se mohou lišit od přirozeně se vyskytujícího RetL v aminokyselinové sekvenci nebo způsobem, který nepostihuje sekvenci, nebo oběma možnostmi. Varianty v aminokyselinové sekvenci se tvoří, když je jedna nebo více aminokyselin v přirozeně se vyskytujícím RetL substituována odlišnou přirozenou aminokyselinou, derivátem aminokyseliny nebo jinou než nativní aminokyselinou. Obzvláště výhodné varianty zahrnují přirozeně se vyskytující RetL nebo biologicky aktivní fragmenty přirozeně se vyskytujícího RetL, jejichž sekvence se liší od sekvence divokého typu substitucemi jedné nebo více konzervativní aminokyseliny, které mají typicky minimální vliv na sekundární strukturu a hydrofobní povahu proteinu nebo peptidu. Varianty mohou také mít sekvence, které se liší substitucemi, delecemi nebo inzercemi jedné nebo více nekonzervativní aminokyseliny, které neruší biologickou aktivitu RetL. Konzervativní substituce typicky zahrnují substituce jedné aminokyseliny druhou s podobnými vlastnostmi uvnitř následujících skupin: valin, glycin; glycin, alanin; valin, isoleucin; kyselina aspartová, kyselina glutamo
-7CZ 296516 B6 vá; asparagin, glutamin; serin, threonin; lysin, arginin; a fenylalanin, tyrosin. Nepolární (hydrofobní) aminokyseliny zahrnují alanin, leucin, isoleucin, valin prolin, fenylalanin, tryptofan amethionin. Polární neutrální aminokyseliny zahrnují glacin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. Pozitivně nabité (bazické) aminokyseliny zahrnují arginin, lysin a histidin. 5 Negativně nabití (kyselé) aminokyseliny zahrnují kyselinu aspartovou a kyselinu glutamovou.
Další konzervativní substituce mohou být vybrány z následující tabulky, a ještě další popsal Dayhoff v Atlas of Protein Sequence and Structireu (1988).
Tabulka 1: Náhrady konzervativních aminokyselin
Aminokyselinu | Kód | Nahraď jakoukoliv z: |
Alanin | A | D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys |
Arginin | R | D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Om, D-Orn |
Asparagin | N | D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln |
Kyselina aspartová | D | D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin D-Gln |
Cystein | C | D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr |
Glutamin | Q | D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp |
Kyselina glutamová | E | D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln |
Glycin | G | Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Beta-ala, Acp |
Isoleucin | I | D-He, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met |
Leucin | L | D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met |
Lysin | K | D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-He, Om, D-Om |
Methionin | M | D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu |
Fenylalanin | F | D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans 3,4 or 5-fenylprolin cis 3,4 or 5-fenylprolin |
Prolin | P | D-Pro, kyselina L-I-thioazo lidin-4-karboxylová kyselina Dnebo L-l-oxazolidin—4—karboxylová |
Serin | S | D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val |
Threonin | T | D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met)O, D-Met(O), Val, D-Val |
Tyrosin | Y | D-Tyr, Phe, L-Dopa, His, D-His |
Valin | v | D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met |
Další varianty vynálezu jsou takové modifikace, které zvyšují peptidovou stabilitu. Tyto varianty mohou obsahovat například jednu nebo více nepeptidových vazeb (které nahrazují peptidové vazby) v sekvenci peptidu. Patří sem také varianty, které obsahují zbytky jiných než přirozeně se vyskytujících L-aminokyselin, jako jsou D-aminokyseliny nebo aminokyseliny nevyskytující se přirozeně či syntetické aminokyseliny, jako jsou beta nebo gamma aminokyseliny a cyklické varianty. Inkorporace D- místa L- aminokyselin do polypeptidů může zvýšit jeho rezistenci 20 k proteázám. Viz například patent USA 5 219 990.
Peptidy podle vynálezu mohou být také modifikovány různými změnami, jako jsou inzerce, delece a substituce, a to buď konzervativní nebo nekonzervativní, pokud takové změny mohou poskytnout určité výhody při jejich použití. Ve vynálezu jsou specificky zahrnuty také sestřihové 25 („splice“) varianty.
Kromě peptidů v podstatě nezkrácených poskytuje předkládaný vynález biologicky aktivní fragmenty polypeptidů. Polypeptid RetL nebo fragment je biologicky aktivní, jestliže projevuje biologickou aktivitu přirozeně se vyskytujícího RetL. Tyto biologické aktivity zahrnují schopnost
-8CZ zy&51(> B6 specificky vázat extracelulámí část Ret s afinitou, která je alespoň 50%, a výhodně je alespoň stejná, jako afinita přirozeně se vyskytujícího RetL, pro extracelulámí část Ret. Další biologická aktivita je schopnost vázat se na protilátku, která je namířena proti epitelu, který je přítomný na přirozeně se vyskytujícím RetL.
V dalších provedeních také varianty se substitucemi aminokyselin, které jsou méně konzervativní, mohou poskytnou požadované deriváty, např. způsobem změn v náboji, konformaci a dalších biologických vlastnostech. Tyto substituce by zahrnovaly například substituci hydrofilního zbytku hydrofobním, substituci cysteinu nebo prolinu jiným zbytkem, substituci zbytku, který má malý postranní řetězec zbytkem s rozsáhlým postranním řetězcem, nebo substituci zbytku, který má čistý pozitivní náboj zbytkem s čistým negativním nábojem. Když nemůže být výsledek dané substituce s jistotou předpovězen, mohou být deriváty snadno otestovány způsoby zde popsanými pro určení výskytu nebo chybění požadovaných vlastností.
Obecně substituce, u kterých se očekává, že vyvolají změny ve funkčních vlastnostech polypeptidů Ret, jsou ty, ve kterých:
I) hydrofílní zbytek, např. serin nebo threonin, je nahrazen hydrofobním zbytkem, např. leucinem, isoleucinem, fenylalaninem nebo alaninem,
Π) cysteinový zbytek je nahrazen j akýmkoliv j iným zbytkem nebo nahradí j akýkoliv zbytek,
ΙΠ) zbytek, který má elektropozitivní postranní řetězec, např. lysin, arginin nebo histidin, nahradí zbytek (nebo je nahrazen zbytkem), který má elektronegativní náboj, např. kyselina glutamová nebo kyselina aspartamová, nebo
IV) zbytek, který má rozsáhlý postranní řetězec, např. fenylalanin, nahradí zbytek (nebo je nahrazen zbytkem), který takový postranní řetězec nemá, např. glycin.
Varianty podle vynálezu zahrnují proteiny a peptidy s aminokyselinovými sekvencemi, které mají přinejmenším šedesát procent homologie se sekvencí krysího RetLl (sekvence id. č. 2), částečnou sekvenci lidského RetLl (sekvence id. č. 9), částečnou sekvenci lidského RetLl (sekvence id. č. 9), nezkrácenou sekvenci lidského RetLl (sekvence id. č. 11), lidského RetL2 (sekvence id. č. 13), myšího RetL3 (sekvence id. č. 17), částečnou sekvenci lidského RetL3 (sekvence Id. č. 19) nebo lidského RetL3 (sekvence id č. 21). Výhodněji je sekvenční homologie alespoň osmdesát, alespoň devadesát nebo alespoň devadesát pět procent. Pro účely určování homologie je obecně délka srovnávaných sekvencí alespoň 8 aminokyselinových zbytků, obvykle alespoň 20 aminokyselinových zbytků. Varianty sloučenin vynálezu také zahrnují každý protein, který
1) má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze čtyřiceti procent homologní k proteinu RetL vynálezu, a také která
2) při optimální shodě se sekvencí RetL (jak je zobrazeno pro RetLl a RetL2 na obrázku 8), má alespoň 80 % svých cysteinových zbytků ve shodě s cysteiny v proteinu RetL vynálezu.
Právě tak, jak je možné nahradit substituenty kostruje také možné substituovat funkční skupiny, které jsou navázány na kostře, skupinami charakterizovanými podobnými vlastnostmi. Takové modifikace nemění primární sekvenci. Tyto budou zpočátku konzervativní, tj. skupina, která nahrazuje, bude mít přibližně stejnou velikost, tvar, hydrofobnost a náboj jako původní skupina. Nesekvenční modifikace mohou zahrnovat například in vivo nebo in vitro chemickou derivatizaci částí přirozeně se vyskytujícího RetL, a také změny v acetylaci, metylaci, fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci.
-9CZ 296516 B6
Vynález se také týká látek, které se specificky vážou na protein vynálezu nebo fragment takového proteinu. Tyto látky zahrnují fuzní proteiny Ig a protilátek (včetně jednoduchého řetězce, dvojitého řetězce, fragmentů Fab, a jiných protilátek, ať už nativních, humanizovaných, primatizovaných nebo chimérických). Další popisy těchto skupin látek lze najít k přihlášce PCT 5 95/16709, na jejíž popis se zde odkazujeme.
Příklady provedení vynálezu ío Experimentální postupy
Přehled strategie
Všeobecná strategie použitá ke klonování RetLl je ukázána na obrázcích 4A a 4B. Naše strategie 15 byla založena na předpokladu, že RetL je přinejmenším exprimován v metanefrogenním mesenchymu vyvíjející se ledviny jako membránový protein (ačkoliv je možné, že ligand je také exprimován v rozpustné formě, obrázek 4A). RetL interaguje s receptorem Ret na buňce ureterového pupenu, aktivuje její cytoplazmatickou doménu tyrozinkinázy a posílá jádru signál, který následně aktivuje geny zapojené do růstu a větvení ureterového pupenu. Proto proteiny obsahující 20 extracelulámí doménu Ret fúzovanou buď k části Fc lidského imunoglobulinu G1 (IgGl) nebo alkalické fosfatázy (AP) mohou být použity jako část strategie ke klonování RetL, jak je ukázáno na obrázku 4B. Fúzní proteiny, expresní knihovny a další reagencie použité při klonování RetLl jsou popsány níže.
Nejdříve jsme izolovali cDNA krycího RetLl, a poté ji použili jako sondu pro izolaci cDNA lidského RetLl. Následně byla izolována cDNA pro RetL2 a RetL3.
Příprava reagencií požadovaných pro přímé expresní klonování ligandů Ret
1. Izolace cDNA kódující extracelulámí doménu krysího Ret
Pro identifikaci RetLl byly vytvořeny fuzní proteiny, které se skládaly z extracelulámích domén buď krysího nebo lidského Ret fúzovaných k proteinu, a sice části Fc lidského IgGl v jednom příkladu, a alkalické fosfatáze v jiném příkladu. Obě fuzní partnerské molekuly mohou být snad35 no testovány na detekci buněk, které exprimují ligand, jak je vyznačeno na obrázku 4B.
Protože cDNA kódující krysí Ret nebyla nikdy objevena, izolovali jsme cDNA kódující extracelulámí doménu krysího receptoru Ret za použití metody užívající reverzní transkriptázu s následnou polymerázovou řetězovou reakcí (RT-PCR). Srovnali jsme nukleotidové sekvence pro 40 lidský (přístupová čísla v Genbank M57464 a XI5262) a myší (přístupové číslo Genbank x67812) ret a navrhli oligonukleotidové příměry pro oblasti s vysokou identitou mezi těmito dvěma sekvencemi. „Sensa“ oligomer (souhlasný se směrem transkripce), nazvaný kid-013 (sekvence id. č. 3, obsahuje nukleotidy 150-169 ze sekvence z Genbank č. X15262) je vybrán z 5'-konce lidské sekvence cDNA ret, která překrývá iniciační kodon ATG. Na svém 5'-konci zahrnuje 45 nukleotidy kódující restrikční místo Notl pro účel klonování. Dva „antisense“ oligomery (orientované proti směru transkripce), nazvané kid-014 (sekvence id. č. 4, obsahuje komplementární sekvenci nukleotidů 1819 až 1839 ze sekvence Genbank č. M57464) a kid-015 (sekvence id. č. 5, obsahuje komplementární sekvenci nukleotidů 1894 až 1914 ze sekvence Genbank č. X67912) jsou vybrány, v uvedeném pořadí, z lidské a myší sekvence cDNA bezprostředně souvi50 sející s 5'-koncem sekvencí, které kódují transmembránové domény. Oligomery kid-014 a kid015 obsahují přídatné nukleotidy na svých 5-koncích, které kódují restrikční místo Sáli pro účely klonování.
Celková RNA se izolovala z krysí ledviny 14 denního embrya a mRNA se purifíkovala za použití 55 oligo-dT chromatografíe. mRNA se přeměnila na cDNA za použití reverzní transkriptázy AMV
-10CZ 296516 B6 a cDNA se přeměnila na dvojvláknovou cDNA a amplifikovala se za použití polymerázy Taq ve standardní polymerázové řetězové reakci soligomery kid-013 a kid—015. Syntéza fragmentu PCR o velikosti 1942 bp byla potvrzena analýzou alikvotu z reakce PCR na 1% agarózovém gelu. Zbytek PCR fragmentu se štěpit Notl a Sáli a klonoval se do pSAB132 předem naštěpeného Notl a Sall. Výsledný plazmid byl nazván pJCOl 1. Celý inzert plazmidu pJCOl 1 obsažený mezi místy Notl a Sáli se sekvencoval a je zde uveden jako extracelulámí cDNA krysího ret, sekvence s id. č. 6. Translace této sekvence poskytla peptidovou sekvenci (sekvence id. č. 7) pro extracelulámí krysí Ret. Protože oligomery pro PCR byly vybrány z lidské a myší sekvence ret, je možné, že nukleotidová sekvence uvedená jako sekvence extracelulámí cDNA krysího ret a peptidová sekvence uvedená jako sekvence extracelulámího krysího Ret, se mohou lišit od přirozené nukleotidové sekvence krysího ret a peptidové sekvence Ret v oblastech sekvencí kid-013 a kid015. Následně byly izolovány klony krysí cDNA ret z knihovny cDNA z 18 denních krysích ledvin a bylo pozorováno několik nukleotidových změn v oblastech primerů, které mají za následek dvě změny aminokyselin. Jednaje v signální sekvenci (arginin v pozici 5 na threonin) a jedna změna je blízko konce extracelulámí domény (kyselina glutamová v pozici 633 na alanin). Obě tyto změny by neměly ovlivnit vazbu ligandu.
2. Fúzní proteiny Ret/IgG
Byly vytvořeny fúzní proteiny, které se skládaly z extracelulámí domény krysího (aminokyselinové zbytky 1 až 637) a lidského (aminokyselinové zbytky 1 až 636) receptoru Ret fúzovaného k části Fc lidského IgGl.
Konstrukce plazmidů používaných k expresi krysího fúzního proteinu Ret/IgG je ukázána schematicky na obrázku 5. Pro konstrukci genu kódujícího krysí fuzní protein Ret/IgG, jsme štěpili pJCOl 1 (popsaný výše), obsahující extracelulámí doménu krysího Ret, se Sall, a ligovali jsme ho k fragmentu Sall o velikosti 700 bp z plazmidu 2-4, a vytvořili jsme plazmid pJCOl 2. Tento fragment Sall obsahuje část domény Fc lidského IgGl pocházejícího původně z plazmidu pSAB144. Plazmid 2-4 byl vytvořen předem třístupňovou ligací: fragment Notl-Sall vzniklý metodou PCR obsahující extracelulámí doménu králičího receptoru TGF-beta typu Π; Notl-Sall fragment o velikosti 693 bp zpSAB144 obsahující část domény Fc lidského IgGl; a pSAB132 štěpený Notl. Jak je ukázáno na obrázku 5, fragment obsahující doménu Fc může být uvolněn z plazmidu 2-4 jako fragment Sall o velikosti 700bp. pJCOl2 byl transfekován do buněk COS a krysí fúzní protein Ret/IgG byl purifikován ze živného média 48 hodin později za použití chromatografie na Sepharose protein-A. Aby se vytvořila stabilní buněčná linie produkující protein Ret/IgG, byl izolován fragment Notl o velikosti 2612 bp z pJCOl2 obsahující celý krysí fúzní protein Ret/IgG a byl klonován do místa Notl expresního vektoru pMDR901. Výsledný plazmid byl nazván pJC022. Plazmid pJC022 pak byla transfekován do buněk CHO, aby vznikly stabilní buněčné linie. Nejvíce produkující buněčná linie byla upravena na suspenzní kulturu. Typické zisky pro linii CHO krysího Ret/IgG jsou 75 mg/1.
Konstrukce plazmidů užitých k expresi lidského fúzního proteinu Ret/IgG je schematicky ukázána na obrázku 6. Aby se vytvořil gen kódující lidský fuzní protein Ret/IgG, získali jsme plazmid obsahující cDNA kódující lidský receptor Ret od Dr. M. Takahashino (Department of Pathology, Nagoya University, Scholl of Medicine, Nagoya, Japonsko). Z tohoto plazmidu vznikl fragment PCR za použití oligomerů kid-013 a kid—014. PCR fragment byl ošetřen enzymem Klenowovým fragmentem, pak následovala digesce s Notl za vzniku PCR fragmentu s lepivým koncem Not I a jedním tupým koncem. Tento fragment byl klonován do vektoru pGEMl 1 zf(+) předem naštěpeného EcoRI, ošetřeného Klenowovým fragmentem a naštěpeného Notl, aby se vytvořil lepivým konec Notl a jeden tupý konec. Výsledný plazmid byl nazván pJCOl 3. Fragment Notl-Sall o velikosti 1916 bpd z pJCOl3 byl izolován po kompletním štěpení s Notl a částečném štěpení se Sall a ligován k fragmentu Sall-Notl o velikosti 693 bp z pSAB144 obsahujícím část domény Fc lidského IgGl a k expresnímu vektoru pSAB132 naštěpenému Notl. Výsledný plazmid byl nazván pJC015. Inzert v plazmidu pJC013 byl sekvencován a zjistilo se, že obsahuje jednu nukleotidovou odchylku, která mění jednu aminokyselinu v extracelulámí doméně lidského Ret
-11 CZ 296516 B6 (sekvence z Genbank M57464 má C v pozici 812, zatímco pJC013 má T v odpovídající pozici, to má za následek změnu aminokyselin z alaninu na valin v pozici 294 proteinové sekvence lidského Ret). Tento nukleotid byl zpětně opraven na zbytek C specifikovaný sekvencí z Genbank č. M57464 místně cílem mutagenezí plazmidu PJC013, čímž byl vytvořen plazmid pJC023. Byl izolován fragment BstE2 o velikosti 585 bp zpJC023 obsahující opravenou nukleotidovou sekvenci a zaklonován do plazmatu pJC015, ze kterého byl odstraněn fragment BstE2 o velikosti 585 bp obsahující variantní nukleotid. Nový plazmid byl nazván pJC024. Byl izolován fragment Notl o velikosti 2609 bp z pJC024 obsahující celý lidský fuzní protein Ret/IgG a byl zaklonován do místa Notl expresního vektoru pMDR901. Výsledný plazmid byl nazván pJC025. Plazmid pJC025 byl transfekován do buněk CHo, aby vznikly stabilní buněčné linie. Nejvíce produkující buněčná linie byla upravena na suspenzní kulturu. Typické zisky pro linii CHO lidského Ret/IgG jsou 6 mg/1.
Další detaily vytváření vektorů použitých ve způsobech podle vynálezu jsou uvedeny v přihlášce PCT 94/01456 a 92/02050, na jejichž popis se zde odkazuje.
3. Biologická aktivita fúzních proteinů Ret/IgG
Aby se určilo, jestli fuzní proteiny Ret/IgG, které jsme vytvořili, jsou biologicky aktivní, a tudíž by byly dobré testovací reagencie pro klonování RetL, provedli jsme několik orgánových kultivačních testů na biologickou aktivitu. Orgánový kultivační test se skládal z pěstování krysích ledvin 13-14 dnů starého embrya v orgánové kultuře po 3-5 dnů v přítomnosti fuzního proteinu Ret/Ig v koncentraci 50 pg/ml. Ledviny se také pěstovaly v přítomnosti LFA-3TIP/IgG nebo nosičového pufru. Po kultivačním období, jsou některé ledviny obarveny fluorescenčním lektinem Dolichos Biflorus Agglutinin (DB lektin), který obarví tkáně sběracího kanálku, což jsou epitelové buňky ureterového pupenu a jeho epitelových derivátech. To poskytuje hrubé vyhodnocení vlivu fuzního proteinu Ret/IgG na růst a vývoj embryonálních ledvin. Je zde jasná odlišnost v morfologii a růstu sběracího kanálku mezi ledvinami, které byly pěstovány s LFA-3TIP a těmi, které byly pěstovány s krysím fúzním proteinem Ret/IgG. Ledviny ošetřené Ret/IgG mají sběrací kanálky, které vykazují významně menší větvení a jsou typicky celkově menší.
Z dalších ledvin byly připraveny parafínové řezy pro histologické vyšetření. Embryonální ledviny byly ošetřeny kontrolním pufrem nebo s Ret/IgG, a poté obarveny hematoxylinem a eosinem. Embryonální ledviny ošetřené Ret/Ig projevovaly menší větvení sběracích kanálků, než kontrolní embryonální ledviny ošetřené pufrem. Kromě toho ledviny ošetřené Ret/IgG měly méně kanálků. Tento účinek jsme také pozorovali u ošetření lidským fúzním proteinem Ret/IgG. Tato pozorování jsou v souladu s fúzními proteiny blokujícími induktivní signál mezi mezenchymem a ureterovým pupenem. Proto uzavíráme, že fuzní protein je vhodný pro klonování RetL.
4. Fúzní protein Ret/Alkalická fosfatáza
Fúzní proteiny receptor/alkalická fosfatáza (AP) byly úspěšně použity pro identifikaci a klonování ligandů pro c-kit (Cell, 63, 185, 1990), ligandů pro členy rodiny eph receptorů (Cell, Z9, 157, 1994) a nedávno ke klonování receptoru pro leptin, produkt genu bp (Cell, 83, 1263, 1995). Plazmidy kódující krysí fúzní protein Ret/AP byly zkonstruovány a krysí protein Ret/AP byl tvořen v buňkách COS7 v buněčných fermentorech. Následně byla vytvořena stabilní buněčná linie NIH3T3 exprimující průměrně 10mg/l fuzního proteinu. Analýza krysího proteinu Ret/AP metodou SDS-PAGE naznačuje, že jeho velikost je konzistentní s předpověděnou molekulovou hmotností a analýza gelovou filtrací indikuje, že se tvoří jako dimer. Částečné purifíkace je dosaženo afínitní chromatografií na koloně anti-aP.
-12CL Z9051Ó B6
Protilátky anti-Ret
Byla připravena králičí polyklonální protilátka proti krysímu fuznímu proteinu Ret/IgG. Protilátka je funkční při westernovém přenosu, analýze buněčných linií Ret-pozitivních pomocí 5 FACS a při imunohistochemickém vyšetření řezů embryonálních ledvin.
Byl vytvořen panel křeččích monoklonálních anti-krysích protilátek Ret. K imunizaci arménských křečků je použit krysí fúzní protein Ret/IgG připojený k sefaróze s proteinem A (Protein-A Sepharose). Po fúzi se získalo 316 klonů a testovalo se na schopnost vázat krysí fuzní proteiny ío Ret a/nebo lidské IgG v testu ELIS A. 11 klonů tvořilo protilátky, které se vázaly pouze na krysí Ret/IgG (a krysí Ret/AP), ale ne na lidský IgG. Zkřížená reaktivita k lidskému Ret se testovala pomocí FACS, čtyři klony tvořily protilátky, které se mohly vázat na Ret-pozitivní lidskou buněčnou linii THP-1. Následující tabulka shrnuje vazebné vlastnosti kRet dvanácti monoklonálních protilátek.
Klon | ELISA Krysí Ret/Ig | FACS lidský THP-1 |
AA.FF9.5 | + | - |
AA.HE3.7 | + | 4- |
AF.E9.5 | + | - |
BA.BI.16 | 4- | - |
BB.B6 | 4- | - |
AA.GE7.3 | + | - |
CD.F11.2 | + | - |
AH.E3.il | + | + |
CD.G4.2 | 4“ | + |
AG.E7.9 | 4· | - |
BD.G6 | + | + |
BH.G8 | - | - |
6. Expresní knihovny cDNA
Připravili jsme knihovny cDNA z krysích embryonálních ledvin, jednu ve vektoru CDM8, který používá pro amplifíkaci replikační počátek SV40, a jednu v modifikovaném vektoru InVitrogen 20 pCEP4, který pro amplifíkaci používá replikační počátek EBV. Modifikovaný vektoru CH269 má odstraněnou genovou sekvenci EBNA-1. Protein EBNA-1 interaguje s replikačním počátkem EBV, ale tento gen není ve vektoru potřebný, když jsou použity buňky, které trvale exprimují protein EBNA. Knihovna ve vektoru CDM8 obsahuje 1,5x106 klonů s průměrnou velikostí inzertu 1,18 kb, zatímco knihovna ve vektoru CH269 obsahuje přibližně lxlO6 klonů s průměr25 nou velikostí inzertu 1,5 kb.
-13CZ 296516 B6
Expresní klonování RetLl, ligandu Ret
A. Klonování krysího RetLl, Ret ligandu
1. Počáteční pokusy expresního klonování Ret ligandu RetLl
Pro klonování retLl bylo vyzkoušeno několik metod přímé exprese. Všechny tyto metody jsou založeny na myšlence ilustrované na obr. 4B. CDNA z knihovny cDNA jsou vloženy do savčích buněk, buňky obsahující RetLl je pak možné identifikovat pomocí fúzních proteinů Ret. Ačkoliv tři dále popsané metody nebyly úspěšné, pomohly k získání zkušeností a důležitých znalostí, které vedly k úspěchu při použití další metody.
A) Metoda „rýžování“ pomocí Ret/IgG
Krysí fúzní protein Ret/IgG byl použit v pokusu o izolaci RetLl pomocí přímého expresního klonování metodou „rýžování“ (Aruffo a Seed, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8753-8757, 1987). Pro tento pokus byla užita CDM8 knihovna cDNA z krysích 18denních embryonálních jater. Soubory (tzv. „pool“) cDNA z této knihovny (5000 až 10 000 cDNA v jednom souboru) byly vneseny do COS buněk DEAE-dextranovou metodou. Po 48 hodinách se buňky odstranily z misek s EDTA, inkubovaly se s fuzním proteinem a pak se rozetřely na misky pokryté antilidskou protilátkou IgGl. Z buněk, které se přichytily, se izolovala DNA, zpětně se transformovala do E. coli a pak se znovu izolovala ve druhém kole „rýžování“. Po třetím kole „rýžování“ nebyly vidět už žádné buňky a po transformaci Hirtovy frakce DNA zpět do E. coli lze pozorovat jen několik málo klonů. VCAM cDNA, konjugovaná s monoklonální protilátkou anti-VCAM, použitá jako pozitivní kontrola, se mohla ředit až 1:100 a stále se dala detekovat, což ukazuje, že použité soubory byly asi moc velké. Analýza několika klonů získaných po druhém kole „rýžování“ ukazuje, že v klonech dochází k reorganizaci a delecím.
B) Preparativní použití FACS s Ret/IgG
000 klonů z knihovny cDNA z krysích 18denních embryonálních jater (vektor CDM8) bylo vneseno do buněk COS7 a pak analyzováno preparativně pomocí FACS s využitím proteinu Ret/IgG z krysy následovaného druhého protilátkou označenou fluorescenční značkou. Vrcholy 0,5 a 0,9% fluoreskujících buněk byly odebrány a DNA z nich byla izolována Hirtovou lyží. Elektroporací pak byla DNA vnesena zpět do E. coli, čímž bylo získáno 228 klonů pro 0,5 % souboru a 752 klonů pro 0,9% soubor. Z klonů byla získána DNA a pak podrobena druhému kolu preparativní analýzy FACS. Plazmidy získané z bakteriálních klonů na konci druhého kola byly analyzovány, ale bylo zjištěno, že obsahují velké genové reorganizace a delece.
C) Kolorimetrická detekční metoda s Ret/AP
Buňky COS byly transfekovány 400 souboru cDNA klonů (1000 klonů v každém souboru) z knihovny cDNA z krysích 18denních embryonálních jater (vektor CDM8) a pak byly buňky obarveny pomocí proteinu Ret/AP a kolorimetrickým substrátem pro alkalickou fosfatázu. Transfekované buňky se pak vyšetřovaly pod mikroskopem na pozitivní signál. V jednom pokusu bylo nalezeno 5 potenciálně pozitivních buněk, ale při opakované analýza byly negativní.
Jako kontrola k proteinu Ret/AP byl připraven protein VCAM/AP fúzí prvních dvou domén lidské VCAM k N-konci AP z placenty (VCAM se váže k integraci VLA4, který je složen ze dvou řetězců, a sice alfa-4 a beta-1). Přechodný transfekce COS buněk poskytla dostatek proteinu VCAM/AP pro kontrolní pokusy. Protein VCAM/AP se porovnal s VCAm/IgG přímo navázaným na AP, a také s VCAM/IgG se sekundární protilátkou s navázanou ABp, aby se vyhodnotila jejich schopnost detekovat VLA4 na COS buňkách transfekovaných alfa-4 řetězcem cDNA (cos již exprimují řetězec beta-1). Výsledky ukazují, že zatímco protein VCAM/AP může
-14CZ. Z7O510 BO detekovat VLA4 na transfekovaných buňkách, nej lepší detekci umožňuje protein VCAM/IgG v kombinaci se sekundární protilátkou s navázanou AP.
D) Metodologické závěry.
Hlavní závěry vyplývající ztěchto úrovních klonovacích pokusů jsou následující:
1) Metody, které vyžadují, aby se plazmidy znovu izolovaly pro následující kolo („rýžováni“ nebo preparativní FACS) nejsou vhodné pokud je hledané cDNA málo, protože během těchto metod se objevují genové reorganizace a delece. Vzhledem k nízké úrovni exprese Ret je opodstatněné se domnívat, že exprese RetLl je také nízká. Výhodný způsob je transfekovat pomocí souborů a pak užít takovou metodu, která dovoluje detekovat pozitivní soubor. Původní souboru pak může být rozdělen, aniž by se izolovala přechodně exprimovaná DNA z transfekovaných buněk.
2) Protein Ret/IgG má, pokud je navázán na sekundární reagens, lepší detekční schopnost než protein Ret/AP.
3) Kontrolní pokusy s kontrolním proteinem VCAM/IgG (a sekundární protilátkou s navázanou AP) a cDNA pro integrin alfa-4 (vloženou do vektoru CDM8 a transfekovanou do buněk COS) ukazují, že detekční možností jsou asi jedna ku tisíci (tzn. že velikost souboru nemůže přesahovat 1000 klonů). Abychom dosáhli zlepšené úrovně citlivosti, změnili jsme vektor založený na SV40 (exprimovaný v COS buňkách) na vektor založený na EBV (exprimovaný v buněčných liniích pozitivních na EBNA). Vektory založené na EBV se udržují jako epizomy a nejsou pro buňky tak toxické jako vektory založené na SV40 po namnožení. Existují významné důkazy, že geny mohou být těmito vektory exprimovány ve vyšší hladině a že cDNA může mnohem víc ředěna (tj. na 1:80 000) a je stále možněji detekovat.
2. Screening souborů z knihovny cDNA založené na EBV
Soubory klonů z cDNA knihovny z krysích 18denních embryonálních ledvin (vektor CH269 odvozený z EBV) byly podrobeny screeningu s fúzním proteinem Ret/IgG. V jednom pokusu vzniklo 256 souborů, z nich každý obsahoval 5000 klonů z knihovny. Stručně řečeno, alikvotní díl z knihovny cDNA se titroval, 5000 buněk se vyselo (256x) a nechaly se narůst přes noc. Kolonie pak byly setřeny do média, část kultury byla použita k vytvoření glycerolového zásobního roztoku každého souboru (byly uloženy v -70 °C) a část byla použita k izolaci plazmidu. DNA z 256 souborů se jednotlivě transfekovalo do buněk EBNA293 (8x105 buněk na 60mm misce) lipofectinovou metodu. Po 48 hodinách se buňky opláchly dvakrát pufřem HBHA (0,5 mg/ml BSA, 0,1% NaN3, 20mM HEPES, pH 7,0) a inkubovaly se s 20 pg/ml krysího proteinu Ret/IgG vpufřovaném solném roztoku s lmM MgCl2 a CaCl2 asi 60 až 90 minut při teplotě místnosti. Po této inkubaci byly buňky 4x opláchnuty v HBHA pufru a pak 30 sekund fixovány roztokem 60% aceton/3% formaldehyd/20mM HEPES (pH 7,0). Po dvou promytích v pufru HBS (150mM NaCl, 20mM HEPES, pH 7,0, byly buňky inkubovány se sekundární protilátkou s navázanou AP (kozí anti-lidský IgG F(ab')2 specifický pro Fc-gama (Jackson Immuno Research Laboratories, katalog. Č. 109-056-098, ředění 1:5000 v solném roztoku pufrovaném fosfátem s lmM MgCl2 a CaCl2) po 60 minut při teplotě místnosti. Buňky pak byly promyty dvakrát v HBS pufru a dvakrát substrátovým pufřem pro AP (lOOmM Tris-HCl, pH 9,5, lOOmM NaCl, 5mM MgCl2), obsahujícím 2x supresor fosfatázy Imuno Pure(R) (Pierce, katalog, č. 35002). Poslední lázeň byly ponechána 15 minut. Substráty AP NBT (0,33 mg/ml) aBCIP (0,17 mg/ml) byly přidány vAP substrátovém pufru obsahujícím AP inhibitor (Pierce) a byly inkubovány s buňkami po 5 až 20 minut. Destičky pak byly opláchnuty dvakrát vodou. Pak byly destičky vyšetřovány pod mikroskopem na přítomnost purpurově zbarvených buněk.
Analýzou 256 souborů bylo nalezeno 17 pozitivních souborů v průběhu primárního screeningu. DNA z každého pozitivního souboru byla znovu transfekována do buněk 293/EBNA a celý
-15CZ 296516 B6 postup se znovu opakoval s dalšími dodatečnými kontrolními pokusy pro potvrzování toho, že pozorované obarvení je specifické pro Ret/igG. 10 ze 17 pozitivních souborů vykazovalo barvení pouze s fůzním proteinem Ret/igG, ale nikoliv s jinými fúzními proteiny IgG.
3. Rozdělení souboru č. 230
Jako příklad byl jeden z výše popsaných pozitivních souborů, označený č. 230, rozdělen na menší podsoubory, aby bylo možné v rámci souboru identifikovat cDNA, která zodpovídá za vazbu k fuznímu proteinu Rett/IgG. 600 buněk z glycerolového zásobního roztoku soboru č. 230 bylo vyseto (lOx) a pěstováno přes noc. Kolonie z těchto misek byly setřeny do média: jedna desetina kultury byla použita k přípravě glycerolového zásobního roztoku a zbylá část byla použita pro izolaci DNA. Těchto 10 podsouborů bylo označeno 230-1A až 230-5A a 230-1B až 230-5B. DNA z těchto podsouborů byla transfekována do buněk 293/ENA a byl opakován celý postup barvení pomocí fuzního proteinu Ret/igG popsaný dříve. Jeden podsoubor č. 230-5A byl pozitivní při barvení na protein Ret/igG.
Podsoubor č. 230-5A byl ještě dále rozdělen, aby bylo možné ještě v rámci podsouborů identifikovat cDNA, která zodpovídá za vazbu k fuznímu proteinu Ret/igG. Buňky z glycerolového zásobního roztoku souboru č. 230-5A byly vysety a pěstovány přes noc. Kolonie byly sebrány do jamek sedmi 96jamkových destiček záření Bioblock(R) a pěstovány přes noc. Z každých 96 jamek v zařízení Bioblock(R) byly vytvořeny 4 soubory po 20 klonech a jeden soubor s 16 klony. Takže ze sedmi zařízení Bioblock<R) bylo vytvořeno celkem 35 souborů označených 230-5A-71 až 230-5A-105. Z každého souboru byly izolovány DNA a transfekována do buněk 293/EBNA a znovu testována s fůzním proteinem Ret/igG, jak již bylo dříve popsáno. Soubor č. 230-5A-86 byl pozitivní.
Souboru č, 230-5A-96 byl rozdělen a bylo identifikováno všech 20 klonů, které byly při vytváření tohoto souboru smíchány. Z každého z těchto dvaceti klonů byla izolována DNA a jednotlivě transfekována do buněk 293/EBNA a znovu testována s fůzním proteinem Ret/igG, jak již bylo dříve popsáno. Soubor č. 230-5A-86-17 byl pozitivní.
4. Charakterizace klonu č. 230-5A-86-17
Klon č. 23O-5A-86-17 (zvaný též retL-17 nebo klon 17, deponovaný jako č. ATCC 98047) byl dále analyzován sekvencováním DNA. Celá nukleotidová sekvence inzertu tohoto klonu je zde uvedena jako sekvence id. č. 1 (krysí cDNA retLl), a část nukleotidové sekvence je také ukázána na obr. 1. V této sekvenci byl nalezen čtecí rámec kódující protein složený z 468 aminokyselin (krysí RetLl). Předpovězený protein má signální sekvenci s předvídaným štěpným místem po 24. aminokyselině (Von Heijne et al., Nucl. Acid. Res. 14: 14683, 1986). Hydrofobní C-konec ukazuje, že protein by mohl být navázán na buňku prostřednictvím fosfatidylinositolglykanové vazby. Jsou zde předpovězena tři N-glykosylační místa. Tyto vlastnosti odpovídají tomu, co se dá pro ligand proteinu Ret očekávat.
Rozpustné formy krysího proteinu RetLl je možné exprimovat tak, že se gen zkrátí před hydrofobním C-koncem. Např. by se to mohlo udělat zkrácením za lysinem 435 (v krysích RetLl). Zkrácení proti směru transkripce od této aminokyseliny může vést k expresi rozpustné formy krysího proteinu RetLl. Rozpustný krysí protein může být exprimován buď sám nebo jako část fuzního proteinu s lidským imunoglobulinem, histidinovou značkou nebo malým epitopem, který je rozpoznáván protilátkou.
B. Klonování lidského RetL 1, ligandu Ret
Knihovna cDNA z lidských embryonálních ledvin ve vektoru lambda gtlO byla získána od firmy Clontech (katalog, č. HL5004A). Jeden milion jednotek tvořících plaky ze zásobního roztoku byl vyset na misky 10 Nunc™. Byly vytvořeny otisky plaků v duplikátu na filtry Opitran™ firmy
-16VZ. 4VO3IO BO
Schleicher and Shuell. Sonda byla vytvořena naštěpením plazmidu nesoucího krysí retLl restrikčním enzym PvuII, po kterém následovala izolace fragmentu velikosti 1,34 kb zagarózového gelu, a tento fragment odpovídal nukleotidům 242 až 1582 sekvence krysího RetL (krysí cDNA retLl). Tato sonda z kódujícího úseku byla označena pomocí 32P za pomocí náhodných příměrů (Feinberg a Vogelstein, Anal. Biochem. 137: 266-267, 1984). Filtry byly hybridizovány přes noc při 55 °C ve 300 ml pufru pro screening plaků PSB (50mM Tris pH 7,5, 1M NaCl, 0,1% pyrofosforečnan sodný, 0,2% PVP a 0,2% Ficoll) obsahujícím 10% dextransulfát, 100 pg/ml tRNA a6,7xl07 CPm krysí sondy. Pak byly filtry dvakrát opláchnuty vpufřu PSB a dvakrát ve 2xSSC/l% SDAS při 55 °C a film byl exponován při teplotě-70 °C s intenzifikačním stínítkem.
Duplikáty pozitivních plaků byly přeneseny do média SM (100 mM NaCl, lOmM SO4, 50mM Tris pH 7,5) se želatinou. 24 z těchto pozitivních plaků bylo purifikováno. Lambda DNA získaná minipreparací z těchto vybraných plaků byla štěpena Notl, rozdělena elektroforézou na 1% agaróze a pak analyzována Southemovým přenosem. V Southemově hybridizaci byla použita sonda kódujícího úseku krysího RetLl. Klon HRL20 měl nejdelší inzert (4,4 kb), který hybridizoval intenzivně s krysí sondou. Sekvence DNA (částečně cDNA lidského retLl, sekvence id. č. 8, obr. 2A) a dedukovaná sekvence peptidu (částečná sekvence lidského RetLl, sekvence id. č. 9, obr. 2A) byly získány z tohoto klonu, což potvrzuje, že se jedna o lidský homolog. Tento klon obsahuje většinu kódujících úseků včetně 3'-konce kódujícího úseku.
Pro přípravu 5'-konce lidské cDNA byla získána souprava cDNA z lidských fetálních ledvin Marathon-Ready™ (Clontech, katalog, č. 7423-1). Antisense nukleotidy (tj. nukleotidy s orientací proti smyslu normální transkripce) Kid-155, odpovídající komplementární sekvenci k nukleotidům 62 až 81 sekvence id. č. 8 (částečná cDNA lidského retLl), a Kid-154, odpovídající nukleotidů 17 až 43 sekvence id č. 8 (částečná cDNA lidského retLl) byly syntetizovány. PCR byla provedena pomocí soupravy Advantage™ cDNA PCR (Clontech katalog, č. 8417-1) kombinované s některými činidly ze soupravy Marathon™ cDNA a pomocí oligonukleotidů Kid-155 a Kid-154. První reakce PCR byla sestavena následovně: 35,5 μΐ H2O, 5,0 μΐ lOx pufř pro enzym Klen Taq, 1,0 pg směsi lOmM dNTP, 1,0 μΐ 50x směs polymeráz Klen Taq Advantage™. Tyto reagencie byly smíchány a směs promíchána. Pak bylo přidáno 5,0 μΐ cDNA z fetálních jater Marathon-Ready™, 1,0 μΐ 10 μΜ příměru API a 1,5 μΐ 6,4 μΜ Kid-155 (celkový objem reakce 50 μΐ). PCR byla provedena v cyklovacím termostatu Perkin-Elmer Cetus DNA Cycler 480 s následujícím nastavením cyklů: 1 cyklus 94 °C po 1 minutu, 30 cyklů 94 °C po 30 sekund, 55 °C 30 sekund, 68 °C po 4 minuty. S produktem první PCR byla následně proveden „hnízdová“ PCR („nested PCR“). Nejdříve bylo 5 μΐ produktu z první reakce naředěno 50 x v TE (celkový objem 250 μΐ). Hnízdová PCR obsahovala 35,5 μΐ H2O, 5,0 pL 50x směs polymeráz Klen Taq Advantage™. Reagencie byly smíchány stejně jak bylo popsáno pro předchozí reakci, pak bylo přidáno 5 μΐ naředěného produktu první reakce, 1,0 μΐ 10 μΜ primeru AP2 a 1,5 μΐ 6,9 μΜ příměru Kid-154. Podmínky cyklování byly stejné jak bylo již popsáno v předchozí reakci. Výsledný produkt přibližně velikosti 700 bp byl purifikován v 1% agaróze s nízkým bodem tání a extrahován fenolem. Purifikovaná DNA byla klonována do místa EcoRV plazmidu pZErO™ (Invitrogen, katalog, č. K2510-01). Zopakovaných izolací, obsahujících klony HRL7G6 a HRL7G8, byla získána informace o sekvenci.
Sekvence získaná z klonu HRL7G8 se částečně překrývá se sekvencí z klonu HRL20 (částečná cDNA lidského retLl) a byla proto použita k vytvoření úplného lidského RetLl (cDNA plné délky lidského RetLl), jak je ukázáno na obr. 2B. Nukleotidová sekvence získaná z klonu HRL7G8 představuje nukleotidy 1 až 520 z úplné cDNA RetLl, zatímco sekvence klonu HRL20 představuje nukleotidy 460 až 1682 z úplné lidské cDNA RetLl. Sekvence získaná z klonu HRL7G8 byla ještě potvrzena sekvencováním jiného klonu cDNA (GJ102) izolovaného z knihovny cDNA z lidských embryonálních ledvin ve vektoru lambda gtlO, která již byla popsána výše, pomocí sondy odvozené z klonu HRL7G6. Nukleotidy 118 až 1497 obsahují proteinový čtecí rámec úplné cDNA pro lidský RetLl.
- 17CZ 296516 B6
Úplná sekvence aminokyselin lidského RetLl je ukázána na obr. 2B. Jak ukázala analýza BESTFIT uvedená na obr. 3A, lidská cDNA retLl je z 88,2 % identická s krysí cDNA retLl. Srovnání peptid (obr. 3B) ukazuje, že předpokládaná lidská proteinová sekvence je z 93,3 % identická a z 97,2 % podobná, s krysí sekvencí.
Klonování ligandu RetL2
A. Klonování lidského RetL2
Peptidová sekvence krysího RetLl byla použita k prohledání databáze GenBank pomocí programu Glast, aby se identifikovaly příbuzné proteiny (tj. isology). Program BLAT (Basic Local Alignmet Search Tool) používá metodu, kterou publikovali Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990), k vyhledávání podobnosti mezi požadovanou sekvencí a všemi sekvencemi v databázi. Požadovaná sekvence a sekvence v prohledávané databázi mohou být buď peptidová nebo nukleotidové sekvence v libovolné kombinaci. Když byla peptidová sekvence krysího RetLl porovnávána s nukleotidovou databází klonů EST, byla nalezeny dvě významné shody. Jeden klon byl klon vedený v GenBack pod číslem R02249, což je EST klon velikosti 229 bp z kombinované knihovny cDNA z lidských fetálních jater a sleziny, a druhý byl klon GenBank Č.H12981, což byl EST klon velikosti 521 bp z knihovny cDNA z lidského dětského mozku. Oba EST klony sdílejí 99% identitu v překrývající se oblasti, což ukazuje, že jsou ze stejné cDNA. Z EST klonu H12981 byly vytvořeny oligonukleotidy KID-228 (GAA TGA CAA CTG CAA GAA GAA GCT GCG CTC CTC, odpovídající nukleotidům 38 až 67, a tedy nukleotidům 534 až 563 sekvence id. č. 12) a antisense nukleotid KID-229 (GTG TAC TCG CTG GGC ACC CG, odpovídající komplementární sekvenci k nukleotidům 156 až 175, a také komplementární sekvenci k nukleotidům 652 až 671 sekvence id. č. 12).
lxlO6 jednotek tvořící plaky z knihovny cDNA z lidských fetálních jater 5'-Stretch Plus Lambda GT10 (Clontech, katalog č. HL5003a) bylo podrobeno screeningu na duplikátech na filtrech Optitran™. Filtry byly hybridizovány přes noc při 65 °C s oligonukleotidy KID-229 a KID-228 značenými 32P ve 400 ml pufru pro screening plaků (50mM Tris pH 7,5, 1M NaCl, 0,1% polyfosforečnan sodný, 0,2% PVP a 0,2% Ficoll) obsahujícím 10% dextransulfát, 100 pg/ml tRNA 80 pmol každého značeného oligonukleotidu. Pak byly filtry dvakrát opláchnuty 2xSSC/l%SDS a dvakrát v lxSSC/l%SDS a film byl exponován. 11 duplikátů pozitivních plaků bylo purifikováno. DNA z každého z těchto klonů byla analyzována tak, že byla naštěpena restrikčním enzymem, pak rozdělena elektroforézou a pak podrobena Southemovu přenosu. Filtry pak byly hybridizovány s KID-228 a KID-229 pro potvrzení toho, že inzerty hybridizují se sondou. Inzert klonu DSW240 byl úplně sekvencován (lidský retL2, sekvence id. č. 12) a je ukázán na obr. 7.
Nukleotidy 25 až 1416 obsahují proteinový čtecí rámec pro lidskou cDNA retL2, který kóduje protein 464 aminokyselin (lidský RetL2, sekvence id č. 13) a je ukázán na obr. 7. Jak ukázala analýza BESTFIT uvedená na obr. 8, lidský protein RetL2 je z 49,1 % identický a z 63 % podobný lidskému proteinu RetLl. Sdílí společně sRetLl hydrofobní N-konec, což ukazuje n signální sekvenci, a také hydrofobní C-konec, což ukazuje na fosfatidylinositolglykanový vazebný motiv. Kromě toho je konzervováno 30 cysteinových zbytků z 31 přítomných v každém proteinu.
B. Důkaz toho, že RetL2 je ligandem Ret
Ukázali jsme, že RetL2 je ligandem Ret tak, že buňky 293/EBNA byly transfekovány expresním plazmidem, obsahujícím inzert klonu DSW240 a pak bylo ukázáno, že tyto buňky vážou rozpustný fúzní protein Ret/IgG.
Inzert DSW240 byl vyjmut pomocí Notl a klonován do expresního vektoru CH269 obsahujícího počátek EBV, který umožňuje expresi v EBNA pozitivních buněčných liniích. Bylo provedeno
-18CZ. ZVO31O BO restrikční štěpení pro identifikaci klonů se správnou orientací. Z plazmidů se správnou orientací byla připravena DNA.
Plazmidové DNA (expresního plazmidů retL2, expresního plazmidů retLl jako pozitivní kontroly a expresního plazmidů obsahujícího nepříbuznou sekvenci jako negativní kontroly) byly transfekovány do buněk 293/EBNA (8x105 buněk na 60mm misce) metodou s Lipofectinem. Po 48 hodinách byly buňky opláchnuty dvakrát vHBHA pufru (0,5 mg/ml BSA, 0,1% NaN3, 20mM HEPES pH 7,0) a inkubovány s 20 pg/ml Ret/IgG v solném roztoku pufrovaném Tris s 1 mM MgCl2 a CaCl2 po 60 až 90 minut při teplotě místnosti. Po této inkubaci byly buňky opláchnuty dvakrát v pufru HBHA a pak fixovány roztokem 60% aceton/3% formaldehyd/20mM HEPES (pH 7,0) po 30 sekund, po dvou opláchnutích HBS (150mM NaCl, 20mM HEPES, pH 7,0) byly buňky inkubovány se sekundární protilátkou s navázanou AP (kozí protidiský IgG F(ab)2 specifický pro Fc-gamma, Jackson Immuno Research Laboratories, katalog, č. 109-056098, ředění 1:5000 v solném roztoku pufrovaném fosfátem s lmM MgCl2 a CaCl2) po 60 minut při teplotě místnosti. Buňky pak byly dvakrát opláchnuty pufrem HBS a dvakrát substrátovým pufrem pro AP (lOOmM Tris-HC-1, pH 9,5, lOOmM NaCl, 5mM MgCl2) obsahujícím 2x supresor fosfatázy Immuno Pure(R) (Pierce, katalog, č. 35002). Poslední lázeň byla ponechána 15 minut. Substráty AP NBT (0,33 mg/ml) a BCIP (0,17 mg/ml byly přidány v AP substrátovém pufru obsahujícím AP inhibitor (Pierce) a byly inkubovány s buňkami po 5 až 20 minut. Destičky pak byly opláchnuty dvakrát vodou. Pak byly destičky vyšetřovány pod mikroskopem na přítomnost pufrově zbarvených buněk. Přítomnost pufrově zbarvených buněk ukazuje na to, že tužní protein Ret se navázal na buňky a že protein RetL2 je ligandem Ret. Purpurově zbarvené buňky byly pozorovány po transfekci expresním vektorem retLl, ale nikoliv po transfekci vektorem negativní kontroly.
Klonování ligandu RetL3
A. Myší RetL3
Prohledávání databáze EST pomocí aminokyselinové sekvence krysího RetLl vedlo k objevení dvou klonů EST homologních s ligandy Ret. Jedná se o EST klony AA049894 a AA050083 (což je částečná myší cDNA retL3, sekvence id. č. 14). Plazmidy obsahující tyto ESTT klony byly získány od firmy Genome Systems lne. (katalog, č. 475791 a 475497) jako bakteriální kultury očkované jehlou. Plazmidová DNA byla připravena z jednotlivých kolonií získaných po naočkování misek s médiem LB AMP. Celé inzerty z těchto plazmidů byly sekvencovány. Porovnání dvou sekvencí ukázalo, že AA049894, který obsahoval inzert velikosti 1,4 kb, je obsažen v AA050083, který obsahuje inzert velikosti 1,9 kb. translace sekvence DNA z AA050083 ukázala, že je zde souvislý otevřený čtecí rámec (ORF) od nukleotidu 205 po nukleotid 1412 (částečná myší RetL3, sekvence id. č. 15). Tento ORF měl 37,5 % identitu sORF krysího retrLl a 40,2% identitu s krysím retL2. Avšak tento otevřený čtecí ráme nekóduje Mt nebo signální sekvenci na 5'-konci. Byly prozkoumány čtecí rámci proti směru transkripce v tomto úseku a byl nalezen Met v kontextu Kozákovy konsensuální sekvence pro iniciaci translace a potenciální signální sekvence pro povrchovou expresi/sekreci. Tento ORF nesouvisí s rámcem ORF ležícím po směru transkripce, což ukazuje, že klon EST AA050083 obsahuje na svém 5'-konci potenciální mutaci, jako např. inzerci deleci, intron nebo artefakt vzniklý při klonování.
Aby se získala správná sekvence 5'-konce, bylo použito soupravy Marathon RACE. Myší embryonální cDNA Marathon-Ready™ (katalog, č. 7458-1) a souprava Advantage™ (katalog, č. 8417-1) byly získány od firmy Clontech. Byly syntetizovány antisense nukleotidy Kid-366, odpovídající komplementární sekvenci k nukleotidům 847 až 866 sekvence id. č. 14, a Kid-365, odpovídající komplementární sekvenci k nukleotidům 589 až 615 sekvence id. č. 14.
PCR byla provedena pomocí soupravy Advantage™ cDNA PCR (Clontech katalog, č. 8417-1) kombinované s některými činidly ze soupravy Marathon™ cDNA a oligonukleotidem Kid-366. První reakce PCR byla sestavena následovně: 35,5 μΐ H2O, 5,0 μΐ 10x pufř pro enzym Klen Taq,
-19CZ 296516 B6
1,0 μΐ směsi lOmM dNTP, 1,0 μΐ 50x směs polymeráz Klen TAq Advantage™. Tyto reagencie byl smíchány a směs promíchána. Pak bylo přidáno 5,0 μΐ cDNA Marathon-Ready™ z 11 denního myšího embrya, 1,0 μΐ 10μΜ primeru API a 1,7 μΐ 5,88 μΜ Kid-366 (celkový objem reakce 50 μΐ). PCR byla provedena v cyklovacím termostatu Perkin-Elmer Cetus DNA Cyclec 480 s následujícím nastavením cyklů: lcyklus 94 °C po 1 minutu, 5 cyklů 94 °C po 30 sekund, 72 °C po 4 minuty, 5 cyklů 94 °C po 30 sekund, 70 °C po 4 minuty, 25 cyklů 94 °C po 30 sekund, 68 °C po 4 minuty. S produktem první PCR byla následně provedena „hnízdová“ PCR. Nejdříve bylo 5 μΐ produktu z první reakce naředěno 50 x v TE (celkový objem 250 μΐ). Hnízdová PCR obsahovala 35,5 μΐ H2O, 5,0 μΐ lOx pufr pro enzym Klen Taq, 1,0 μΐ směsi lOmM dNTP, 1,0 μΐ 50x směs polymeráz Klen Taq Advantage™. Reagencie byly smíchány stejně jak bylo popsáno pro předchozí reakci, pak bylo přidáno 5 μΐ naředěného produktu první reakce, 1,0 μΐ 10 μΜ primeru AP2 a 3,6 μΐ 2,8 μΜ primeru Kid-365. Podmínky cyklování byly stejné jak bylo již popsáno v předchozí reakci. Výsledný produkt přibližně velikosti 665 bp byl purifíkován v 1% agaróze s nízkým bodem tání a extrahován pomocí Qiaex II (Qiagen, katalog, č. 20021). Purifikovaná DNA byla klonována do plazmidu pNoTA/T7™ pomocí klonovací soupravy PRIME PCR CLONER™ (5prime-3Prime, katalog, č. 1-725029). Z opakovaných izolací, obsahujících klony DSW252 a DSW253, byla získána informace o sekvenci.
Bylo zjištěno, že sekvence DSW252 se částečně překrývá se sekvencí id. č. 14 kromě dodatečného T přítomného v poloze mezi nukleotidy 252 a 253 sekvence id č. 14. Tento T je přítomen v ostatních izolátech DSW251 a DSW253. Vložení této dodatečné báze upravuje otevřený čtecí ráme tak, že dostáváme jediný čtecí rámec velikosti 1191 bp (počítáno od prvního Met) kódující 397 aminokyselin. Tento ORF kóduje Met v kontextu s kanonickou konsensuální sekvencí (Kozák) iniciace translace a zahrnuje také signální sekvenci pro povrchovou expresi/sekreci.
Pro získání myšího kolonu plné délky, který by mohl být exprimován, byly purifíkovány fragmenty Notl-BamHI velikosti 630 bp zDSW252 a BamHI-Notl velikosti 1308 bp z AA050083 a vloženy do expresního vektoru CH269 naštěpeného Notl. Ligační směs byla transformována do E. coli XLl-Blue (Stratgene, katalog, č. 200236). Pak byla provedena minipreparace plazmidové DNA z transformovaných bakterií pomocí Qiawell Ultra Minipreps. DNA pak byly analyzovány restrikčním štěpením a gelovou elektroforézou, aby se ověřila správná velikost a orientace inzertu. Konstrukt byl nazván DSW254. Inzert DSW254 byl úplně sekvencován (myší retL3, sekvence id. č. 16) a byl potvrzen ORF, kódující protein z 397 aminokyselin (myší RetL3, sekvence id. č. 17). Tyto sekvence jsou ukázány také na obr. 9. C-konec RetL3 je hydrofobní zdá se, že jde o fosfatidylinositolglykanový vazebný motiv.
B. Lidský RetL3
Aby byla nalezena vhodná tkáň jako zdroj pro klonování lidského RetL3, byl užit northemový přenos vzorků myších tkání pro stanovení expresního vzorce myšího RetL3. Ze všech zkoumaných tkání nejvyšší expresi RetL3 vykazovala srdeční tkáň. Knihovna cDNA z lidského dospělého srdce ve vektoru lambda gtlO byla získána od firmy Clontech (katalog, č. HL3026a). Jeden milion jednotek tvořících plaky ze zásobního roztoku byl vyset na misky 10 Nunc™. Byly vytvořeny otisky plaků v duplikátu na filtry Opitran™ firmy Schleicher and Shuell.
Pomocí PCR byla připravena sonda s primeiy Kid-36 a Kid-367, odpovídající nukleotidům 397 až 420 sekvence AA050083. PCR byla sestavena tak, že bylo smícháno následující: 10,0 μΐ lOx pufr PFU, 2,0 μΐ směsi lOmM dNTP, 72,1 μΐ H2O, 3,1 μΐ 13,2 μΜ primeru Kid-367 a 6,8 μΐ 5,88 μΜ Kid-366, 5 μΐ DNA AA050083 koncentrace 0,1 μg/μl a 2,0 μΐ PFU polymerázy koncentrace 2,5 U/μΙ (Stratagene, katalog, č. 600154). PCR byla provedena v cyklovacím termostatu Perkin-Elmer Cetus DNA Cycler 480 s následujícím nastavením cyklů: 25 cyklů 94 °C po 1 minutu, 53 °C po 1 minutu, 72 °C po 4 minuty. Produkt PCR byl purifíkován extrakcí fenolem, chloroformem a isiamylalkoholem v poměru 50:49:1 a pak rozdělen elektroforézou na gelu z agarózy s nízkým bodem tání, vyříznutý fragment byl následně purifíkován pomocí QiaexII.
-20CZ Z90510 B6
Tato sonda pro kódující úsek byla značena 32P metodou náhodných primerů (Feinberg a Vogelstein).
Filtry byly hybridizovány přes noc při 65 °C ve 200 ml pufru pro screening plaků obsahujícím 10% dextransulfát, 100 pg/ml tRNA a Ι,χΙΟ8 cpm myší sondy. Pak byly filtry dvakrát opláchnuty 2xSSC/l%SDS a dvakrát v lxSSC/l%SDS a film byl exponován při -70 °C s intenzifikačním stínítkem. DNA z duplikátů pozitivních plaků byla purifikována. Lambda DNA připravená minipreparací z každého z těchto plaků byla analyzována tak, že byla naštěpena restrikčním enzymem EcoRI, pak rozdělena elektroforézou na 1% agarózovém gelu a pak podrobena Southemovu přenosu. Filtry se Southemovým přenosem pak byly hybridizovány s myší sondou. Klon GJ128, který obsahoval inzert velikosti 1,3 kb, hybridizoval intenzivně s myší sondou pro kódující úsek. Sekvence DNA (částečná cDNA lidského retL3, sekvence id. č. 18) a dedukovaná peptidová sekvence (částečná sekvence lidského RetL3, sekvence id. č. 19) byly získány z tohoto klonu a potvrdilo se tak, že se jedná o lidský homolog. Tento klon obsahuje většinu kódujícího úseku včetně 3'-konce kódujícího úseku.
Inzert velikosti 1,3 kb zGJ128 byl purifikován, označen 32P a použit pro screening knihovny cDNA z lidského dospělého srdce (Clontech) pro získání klonu obsahujícího 5'-konec. Screeningem 2xl06 plaků z této knihovny nebyly získány žádné klony obsahující 5'-konec. Northemové analýzy membrán s northemovým přenosem mRNA z lidských dospělých tkání (Clontech, katalog, č. 7760-1, 7759-1 a 7767-1) hybridizovaných se stejnou sondou podle protokolu dodaného výrobce, ukázaly, se lidský RetL3 je nejsilnější exprimován ve tkáni dospělé míchy, žaludku, srdce, pankreatu, tenkého střeva, tlustého střeva, prostaty a varlat. Knihovna cDNA z dospělé lidské míchy (Clontech, katalog, č. 5001a) byla podrobena screeningu s inzertem GJ128. 3 nezávislé klony byly purifikovány a nejdelší z nich GJ135, byl sekvenován. Sekvence inzertu GJ135 se částečně překrývá s inzertem GJ128, což umožnilo vytvořit složenou sekvenci cDNA plné délky lidského retL3 (sekvence id č. 20) a stanovit tak úplnou sekvenci lidského RetL3 (sekvence id. č. 21). Tyto sekvence jsou také ukázány na obr. 10. Lidský RetL3 je z 34,3 % identický s lidským RetLl a z 34,9 % identický s lidským RetL2. Je také ze 76,8 % identický s myším RetL3.
Použití sloučenin podle vynálezu pro léčení
Nativní proteiny RetL a jejich varianty, protilátky anti-RetL, protilátky anti-Ret a fúzní proteiny s Ret a RetL se mohou použít pro léčení v situaci, kdy je třeba blokovat nebi aktivovat signální dráhu Ret, stimulovat růst ledvinných buněk neb neuronů nebo jejich přežívání v případě nemoci, při kterém jsou tyto buňky poškozeny anebo odumírají, nebo kde je třeba potlačit růst nebo usmrtit nežádoucí buňky jako jsou např. nádorové buňky exprimující Ret nebo RetL.
Obecně jsou sloučeniny podle vynálezu, které s váží na Ret a indukují dimerizaci a/nebo autofosforylaci Ret, užitečné pro stimulaci růstu nebo omezení poškození tkáně exprimující Ret. Sloučeniny podle vynálezu jsou užitečné pro stimulaci růstu ledvinové tkáně a/nebo přežívání, podporu funkce ledvin a minimalizaci poškození ledvinné tkáně po různých zraněních. Sloučeniny podle vynálezu jsou zvláště výhodné pro léčení stavů, které zahrnují akutní selhání ledvin, akutní nefritidu, chronické selhání ledvin, nefrotický syndrom, poruchy ledvinných kanálků, transplantaci ledvin, toxické poškození, poškození hypoxií a úrazy. Nemoci ledvinných kanálků zahrnují jak dědičné, tak získané poruchy, jako je např. polycystická ledvina, cystické onemocnění dřeně a cystická (houbovitá) ledvina. Možný výčet však není takto omezen a může obsahovat i mnoho dalších poruch ledvin (viz Harrisone Principles of Intemal Medicine, 13. vydání, 1994, na kteroužto publikaci se tímto plně odkazuje).
Při jiných aplikacích lze geny a proteiny podle vynálezu použít při léčení stavů, kdy je třeba, aby neurony rostly nebo regenerovaly. Sem patří nervová degenerativní onemocnění jako je Alzheimerova nemoc, Parkinsonova nemoc, Huntingtonova choroba, Tourettův syndrom, amyotrofní laterální skleróza a onemocnění motorických neuronů, a také demyelinizační onemocnění je sclerosis multiplex, také bakteriální nemoci jak je meningitida, absces nebo empyem, virové choroby jako je myelopatie spojená s HIV, nebo prionová onemocnění včetně CreutzfeldtJakobovy nemoci. Patří sem také poruchy v důsledku poškození nervové tkáně, ať už neoplastickým působením nebo úrazem, a také cerebrovaskulámí příhody, jako krvácení nebo embolie. Zejména sem také patří nemoci kreniálních nervů a míchy, včetně vrozených poruch a poruch v důsledku úrazu nebo zánětu a poruch cévní etiologie, jako jsou např. poruchy ovlivňující autonomní nervový systém. Také sem patří vývojové nervové poruchy jako je mentální retardace, autismus, fetální alkoholový syndrom, Downův syndrom a cerebrální paresa, Sloučeniny podle vynálezu se také mohou použít pro léčení syndromů zahrnujících periferní nervový systém. K takovým poruchám patří poruch způsobené kterýmkoliv fyktorem z dříve vyjmenovaných a zejména Lymská nemoc, neuropathie spojená s HIV, polymyositis, svalová dystrofie a myasthenia gravis.
Protilátky anti-RetL a fuzní proteiny Ret podle vynálezu, které se specificky váží na krysí protein RetLl, částečný lidský protein RetLl, úplný lidský protein RetLl, lidský RetL2, myší RetL3 nebo lidský RetL3, nebo fragmenty těchto proteinů, se mohou využít v mnoha metodách. Sloučeniny se mohou terapeuticky použít k blokování nebo inhibici signální dráhy receptoru Ret, např. pro blokování růstu nádorů, jejichž růst je závislý na signální dráze Ret. Tato agens se také mohou fúzovat s detekovatelnými značkami, jako jsou např. látky zobrazitelné fluoroskopicky nebo radiograficky a podávat subjektu, což umožní zobrazit tkáně, které exprimují RetL. Tato agens lze také navázat na látky, jako je např. křenová peroxidáza, kterou lze užít jako imunohistochemické barvivo, které umožňuje vizualizaci buněk pozitivních na RettL v histologických preparátech. Specifické protilátky pro tento účel se mohou použít samotné, a místa kam se váží lze pak vizualizovat v sendvičovém testu použitím anti-imunoglobulinové protilátky s navázaným detekovatelným markérem. Specifické protilátky proti kterémukoliv RetL jsou užitečné v imunotestech pro kvantifikaci látky, pro kterou má daná protilátka specifičnost. Specifické protilátky proti RetL se také mohou navázat na pevnou fázi, jako např. mikroperly nebo misky, a pak využít k odstranění ligandu z roztoku, buď s cílem vyčistit protein nebo ho odstranit z roztoku. Všechny tyto způsoby jsou v podstatě rutinou pro odborníka v imunologii. Další metody podle vynálezu zahrnují modulaci signální dráhy Ret-RetL tím, že se na Ret naváže monoklonální protilátka anti-Reb. Efekt takového kontaktu mAb-Ret může být buď blokující nebo stimulující pro aktivaci signální dráhy Ret, v závislosti na vlastnostech interakce konkrétní monoklonální protilátky mAB s Ret. Některé mAb reagují s Ret jako agonisté, takové agonistické navázání vede ke spuštění dimerizace a autofosforylace Ret. Jiné mAB působí jako antagonisté. Interakce Ret s antagonistickou mAb zabraňuje aktivaci signální dráhy Ret jinými RetL nebo komplety obsahujícími Ret, které by jinak signální dráhu Ret aktivovaly.
RetL nebo protilátky proti Ret nebo fúzních proteinům Ret se mohou použít ke zobrazení tkání, které exprimují Ret, nebo pro imunohistologické nebo preparativní metody popsané v předchozím textu pro protilátky RetL.
Fúzní proteiny obsahující RetL a/nebo protilátky anti-Ret se mohou použít ke speciálnímu cílení protinádorové terapie proti nádorům exprimujícím Ret. Takové nádory mohou zahrnovat několik nádorových fenotypů, které jsou spojeny s mutacemi v Ret (N. Engl. J. Med. 335: 943-951, 1996, Nátuře 367, 319-320, Trends in Genetics 12: 138-144, 1996). Terapeutická intervence proti nádorům exprimujícím RetL využívá fuzní proteiny obsahující Ret a/nebo protilátku antiRet. Protilátka anti-Ret nebo anti-RetL může být sama účinná vzhledem k cytolýze závislé na kompletu a protilátce zprostředkované doménou Fc. Takové hybridní ligandy a protilátky se mohou stát terapeuticky ještě účinnějšími pokud se použijí jako nosiče protinádorových léků, toxinů nebo cytocidních radionuklidů, jako je yttrium90. Cytotoxické efektorové buňky se mohou zacílit na nádorové buňky pomocí heterokonjugátů protilátek, kde protilátka specifická buď pro Ret nebo RetL exprimovaná nádorem je kovalentně navázána na protilátku namířenou proti povrchovému proteinu cytotoxické efektorové buňky jako jsou buňky NK nebo CTL.
Jedním příkladem protilátky anti-Ret nebo terapie pomocí Ret je konjugace toxického řetězce A ricinu nebo modifikované úplné formy ricinu (který se již nemůže vázat na buňky) s RetL nebo
-22protilátkou namířenou proti polypeptidu Ret, které jsou exprimovány na povrchu maligní buňky. V jiném provedení je toxin konjugovaný s Ret nebo protilátkou anti-RetL, aby selektivně zacílil a usmrtil RetL-pozitivní buňky, jako jsou např. nádorové buňky exprimující RetL. Takový přístup se osvědčil s blokovaným ricinem konjugovaným s monoklonální protilátkou proti antigenu CD19, který exprimuje většina nádorových buněk (Grossbard et al., Blood 79: 576, 1992). Ostatní toxiny jsou zrovna tak užitečné, jak je odborníkům známo. K takovým toxinům patří např. exotoxin pseudomonád, difterický toxin a saporin, přičemž možnosti nejsou omezeny pouze na tyto toxiny. Tento přístup by měl být dokonce mnohem účinnější při použití RetL nebo protilátky anti-RetL ve srovnání se známým využitím antigenu CD 19, protože Ret je exprimován pouze ve velmi omezeném počtu tkání.
Výše uvedené přístupy využívají fúzi ricinu nebo jiného toxinu, jsou zrovna tak využitelné pro toxinové konjugáty RetL nebo protilátek anti-RetL, které jsou užitečné pro selektivní cílení a usmrcení Ret-pozitivních buněk, jako jsou nádorové buňky exprimující Ret.
Jiným přístupem v terapii je použití RetL nebo protilátek označených radioizotopem. Takové radioaktivně značené sloučeniny mohou výhodně směrovat radioaktivitu do míst nádorů exprimujících Ret, přičemž ušetří normální tkáň. V závislosti na použitém izotopu radiace emitovaná ze značené protilátky navázané na nádorovou buňku může usmrtit také sousední nádorové maligní buňky, které neexprimují Ret. Mohou být využity různé radionuklidy. Izotopy emitující β-částice (např. 131I) byly úspěšně použity ve spojení s monoklonálními protilátkami proti CD20, který je přítomen na B-buňkách lymfomu (Kaminski et al., N. Engl. J. Med. 329: 459, 1993, Press et al., N. Engl. J. Med. 329: 1219, 1993). Radionuklidy emitující částice β vytvářejí tumoricidní radioaktivitu na vzdálenost přesahující průměr několika buněk, což dovoluje zahubit i buňky, které nenesou antigen a eliminovat tak následky nehomogenního uložení protilátky nebo ligandu v nádoru.
Je také možné využít radionuklidů emitujících α-záření. Nízká dávka ozáření způsobená RetL nebo protilátkou anti-RetL značenou takovým radionuklidem může být terapeuticky účinnější než okamžité externí ozáření při konvenční radiační terapii. Nízké dávky ozáření mohou způsobovat apoptózu (tj. programovanou buněčnou smrt) v určitých buněčných liniích (Macklis et al., Radiat. Res. 130: 220, 1992, Macklis et al., Radipharm. 5: 339, 1992).
Sloučeniny podle vynálezu se podávají v terapeuticky účinné množství, což znamená takové množství sloučeniny, které vede k medicínsky žádoucímu výsledku nebo ovlivní zvláštní situaci, která má být ošetřena.
Termín „subjekt“ zde použitý znamená jakéhokoliv savce, kterému lze podat ligand Ret nebo gen Ret. Zvláště výhodnými subjekty pro použití vynálezu jsou lidé, ale také ostatní primáti, ovce, koně, dobytek, kozy, prasata, psi, kočky, králíci, morčata, křečci, pískomilové, krysy a myši, a také orgány, nádory a buňky pocházející zvýše uvedených hostitelů.
Použití sloučenin podle vynálezu pro genovou terapii
Geny RetL podle vynálezu se mohou zavést do poškozené tkáně, aby stimulovaly produkci RetL transfekovaných buněk a k tomu, aby podporovaly růst a přežívání buněk, které exprimují Ret.
Ve zvláštním provedení způsobu genové terapie se gen RetL zavede do vybrané cílové nervové tkáně nebo tkáně ledvin. RetL se pak stabilně exprimuje a stimuluje buňky pozitivní na receptory Ret k růstu, dělení a diferenciaci a/nebo podporuje přežívání těchto buněk. Geny retL se mohou vložit do cílových buněk pomocí mnoha známých metod založených na použití buď virových nebo nevirových strategií.
Nevirové metody zahrnují elektroporaci, fúzi membrány s liposomy, bombardování mikroprojektily pokrytými DNA, inkubaci s precipitátem kalciumfosfát-DNA, transfekci zprostředkovanou
-23CZ 296516 B6
DEAE-dextranem a také přímé mikroinjekce do jednotlivých buněk. Např. gen retL může být vnesen do buňky komprecipitací s kalciumfosfátem (Pillicer et al., Science 209: 1414-1422, 1980), mechanickou mikroinjekcí a/nebo bombardováním mikročásticemi (Anderson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 5399-5403, 1980), přenosem DNA pomocí liposomů (např. transfekcí zprostředkovanou LIPOFECTINEM, Fefgner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 471-477, 1987 Gao a Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm. 179: 280-285,1991), transfekcí zprostředkovanou DEAE-dextranem, elektroporací (Patent USA 4 956 288) nebo metodou užívající polylysin, kde je DNA konjugována tak, že je přednostně transportována do hepatocytů jater (Wolf et al., Science 247: 465-468,1990, Curiel et al., Human Gene Therapy 3: 147-154, 1992).
Cílové buňky mohou být transfekovány geny podle vynálezu přímým přenosem genů (viz např. Wolff et al., „Direct gene Transfer Into Moose Muscle Muscle In Vivo“, Science 247, 1465-68, 1990. V mnoha případech však bude žádoucí přenos zprostředkovaný vektorem. Kterákoliv vhodná metoda pro vložení polynukleotidové sekvence do vektoru v oboru známá se může použít (viz. např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY, 1992, na obě publikace se tímto plně odkazujeme).
Aktivace promotoru může být tkáňově specifická nebo indukovatelná metabolickým produktem nebo podanou látkou. K takovým promotorům/enhancerům (zesilovačům) patří např. nativní promotor RetL, časný promotor/enhancer cytomegaloviru (Karasuyama et al., J. Exp. Med., 169: 13, 1989), lidský promotor beta-aktinu (Cunning et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84. 4831, 1987, promotor indukovatelný glukokortikoidy přítomný dlouhých terminálních repeticích (LTR) myšího viru MMTV (Klessig et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1354, 1984), sekvence dlouhých terminálních repetic viru Moloneyho myší leukémie (MuLV LTR) (Weiss et al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratoiy, Cold Spring Harbor, NY, 1985), promotor časného úseku SV40 (Bemoist a Chambon, Nátuře 290: 304, 1981, promotor viru Rousova sarkomu (RSV) (Yamamoto et al., Cell 22: 787, 1980), promotor thymidinkinázy z viru herpes simplex (HSV) (Wagner et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA 78: 1441, 1981) a promotor adenoviru (Yamada et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 3567, 1985), přičemž možnosti nejsou omezeny pouze na tyto příklady.
Geny retL mohou být vneseny do buněk také specifickými virovými vektory určenými pro použití v systémech přenosu genů, které jsou již dobře zavedeny. Takové systémy popsali např. Madzak et al., J. Gen. Virol. 73: 1533-36, 1992 (papovirus SV40), Beckner et al., Curr. Top Microbiol. Immunol. 158: 39-61, 1992 (adenovirus), Hofman etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92. 10099-10103, 1995 (bakuloviry), Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 25-38, 1992 (virus vaccinia), Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-123, 1992 (viry asociované s adenovirem), Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 67-93, 1992 (herpes simplex virus (HSV) a virus Epstein-Barrové (HBV)), Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24, 1992 (retrovírus), Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol. 4: 749-754, 1984 (retrovirus), Miller et al., Nátuře 357: 450-455, 1992 (retrovirus), Anderson, Acience 256: 808-813, 1992 (retrovirus), Ausubel et al., Curent Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989, kapitoly 9.10 až 9.14, všechny tyto citace jsou součástí referencí).
Výhodné vektory jsou DNA viry, kam patří adenoviry (výhodně vektory založené na Ad-2 a Ad-5), bakuloviry, herpetické viry (výhodně vektory založené na hepes simplex viru) a parvoviry (výhodně vektory založené na defektivních nebo neautonomních parvovirech, výhodněji vektory založené na virech asociovaných s adenoviry, nejvýhodněji vektory založené na AAV2). Pro další informace k této oblasti viz např. Ali et al., Gene Therapy 1: 367-384, 1994, patenty USA č. 4 797 368, 5 399 346 a také následující diskuse.
Výběr konkrétního vektorového systému pro přenos např. sekvence RetL, je závislý na řadě faktorů. Jedním důležitým faktorem je povaha populace cílových buněk. Ačkoliv retrovirové vektory byly intenzivně zkoumány a jsou používány v mnoha aplikacích genové terapie, obecně nejsou vhodné pro infekci nedělících se buněk, a tak mohou být užitečné pro léčení nádorů,
-24CZ 290516 B6 neboť se integrují a exprimují své geny pouze v replikujících se buňkách. Jsou také užitečné pro využití exi vivo, kde jsou velmi atraktivní vzhledem k jejich stabilní integraci do genomu hostitele.
Adenoviry jsou DNA viry eukaryot, které je možné modifikovat tak, že účinně přenášejí terapeutické nebo reportérové transgeny do buněk mnoha různých typů. Adenoviry obecných typů 2 a 5 (Ad2 a Ad5), které způsobují respirační onemocnění lidí, byly nyní upraveny pro genovou terapii Duchennovy svalové dystrofie (DMD) a cystické fíbrózy (CF). Jak Ad2 tak Ad5 patří do podtřídy adenovirů, které nejsou spojeny s malignitami u lidí. Adenovirové vektory jsou schopné poskytnout extrémně vysokou úroveň přenosu genů prakticky do buněk všech typů, bez ohledu na jejich mitotické stadium. Vysoký titr viru (1013 jednotek tvořících plak/ml) lze snadno získat v buňkách „293“ (komplementační linie buněk lidských embryonálních ledvin transformovaných adenovirem, ATCC CRL1573) a uchovávat v kryoprezervovaném stavu po dlouhou dobu bez znatelných ztrát. Účinnost tohoto systému v přenosu terapeutických transgenů in vivo pro komplementaci stavu genové nerovnováhy byly demostrovány pro různé nemoci na zvířecích modelech, viz např. Watanabe, Y., Atherosclerosos 36, 261-268, 1986, Tanzawa, K. et al., FEBS Letters 118 (1): 81-84, 1980, Golasten, J.L. et al., New Engl. J. Med. 309 (11983): 288-296, 1983, Inshibashi, S. et al., J. Clin. Invest. 92: 883-893, 1993 a Ishibashi, S. et al., J. Clin. Invest. 93: 1889-1893, 1994, přičemž všechny uvedené citace jsou zahrnuty v referencích. Rekombinantní replikaČně defektní adenovirus kódující cDNA pro transmembránový regulátor cystické fíbrózy (CTFR) byl skutečně schválen pro použití alespoň ve dvou klinických pokusech na lidské CF (Wilson, J., Nátuře 365: 691-692 (21. říjen 1993). Extenzivní zkušenost s živými adenovirovými vakcínami užívanými v lidské populaci je dalším faktorem svědčícím o bezpečnosti rekombinantních adenovirů pro genovou terapii.
Lidské adenoviry obsahují genom tvořený lineární dvouřetězcovou DNA dlouhou přibližně 36 kb, která je rozdělena do 100 mapových jednotek (m.u.), každá o délce 360 bp.DNA obsahuje krátké terminální investorové repetice (ITR) na každém konci genomu, které jsou nezbytné pro replikaci virové DNA. Genové produkty jsou organizovány do časného (El až E4) a pozdního (LI až L5) úseku, v závislosti na tom, zda jsou geny exprimovány před nebo po iniciaci syntézy virové DNA (viz Horwitz, Virology, 2nd Et., Fields, B.N. (ed), Raven Press Ltd., New York, 1990.
Rekombinantní replikačně defektní adenoviry první generace které byly připraveny pro genovou terapii DMD a dalších dědičných onemocnění mají odstraněný celý úsek Ela a část úseku Elb. Replikačně defektní virus se množí v buňkách „293“ obsahujících funkční adenovirový gen Ela, který poskytuje tras-působící produkt Ela. Viry s delecí El jsou schopny replikace a produkce infekčních částic v buňkách „293“, které poskytují v trans genové produkty úseků Ela a Elb. Výsledný virus je schopen infikovat buňky mnoha typů a exprimovat vložený gen (za předpokladu že má svůj vlastní promotor), ale není schopen replikace v buňkách, které nemají DNA pro úsek El, pokud buňky nejsou infikovány obrovským nadbytkem infekčního viru. Adenoviry mají výhodu, že mají široké hostitelské spektrum, mohou infikovat klidové nebo diferencované buňky jako jsou např. neurony, a jsou v zásadě neonkogenní. Adenoviry se neintegrují do genomu hostitele. Jelikož existují v buňce extrachromozomálně, je podstatně sníženo riziko inzertní mutageneze Ali et al., supra, 373). Rekombinantní adenoviry (rAdV) tvoří velmi vysoké titry, virové částice jsou přiměřeně stabilní, úroveň exprese je vysoká a mohou infikovat široké spektrum buněk. Jejich přirozeným hostitelem jsou buňky epitelu dýchacích cest, takže jsou vhodné pro terapii plicní rakoviny.
Přenos genů zprostředkovaný bakuloviry má některé výhody. Přenos genů bakuloviry se může uskutečnit jak do replikující se tak i do nereplikující se buňky, také do ledvinné buňky, a stejně tak do hepatocytů, nervových buněk, a buněk sleziny, kůže a svalu. Bakulovirus se nereplikuje v savčích buňkách a není pro ně patogenní. Člověk postrádá protilátky proti rekombinantním bakulovirům, které by mohly zabránit infekci. Navíc jsou bakuloviry schopny inkorporovat a přenášet velmi velké inzerty DNA.
-25CZ 296516 B6
Viry asociované s adenoviry (AAV) byly také využity jako vektory pro somatickou genovou terapii. AAV je malý virus s jednořetězcovou DNA (sDNA) s jednoduše uspořádaným genomem (4,7 kb), což z něho činí ideální substrát pro genové inženýrství. Dva otevřené čtecí rámce kódují série polypeptidů rep a cap. Polypeptidy rep (rep78, rep68, rep62 a rep40) se účastní replikace, uvolnění a integrace genomu AAV.
Životní cyklus AAv je dvoufázový, skládá se z fáze latentní a lytické. V průběhu latentní infekce visiony AAV vstupují do buňky jako enkapsidovaná ssDNA a krátce nato se dostanou k jádru, kde se ssDNA stabilně integruje do hostitelského chromozomu, aniž by k tomu bylo třeba dělení hostitelské buňky. Bez přítomnosti pomocného viru integrovaný virus AAV zůstává latentní, ale je schopen aktivace a uvolnění. Lytická fáze životního cyklu začíná, když buňka nesoucí provirus A V je aktivována sekundární infekcí herpetickým virem nebo adenovirem, které kódují pomocnou funkci, která je využita AW jako pomoc pro vystřižení z hostitelského chromozomu (Carter, B.J. supra). Původní infikující ssDNA se rozvine do dvoušroubovicové replikační formy (RF) DNA způsobem který je závislý na rep. Uvolněné genomy AAV jsou zabaleny do proteinové kapsidy (která má ikosahedrickou symetrii a průměr asi 20 nm) a po buněčné lýze se uvolňují jako infekční viriony, které obsahují genom buď +ssDNA nebo-ssDNA.
AAV viry mají významný potenciál pro genovou terapii. Virové částice jsou velmi stabilní a rekombinantní AAV (rAAV) mají vlastnosti podobné léčivům jako to, že se dají purifikovat peletováním nebo pomocí pásů v gradientu CsCl. Dále jsou teplotně stabilní a mohou se lyofilizovat na prášek a pak rehydratovat, čímž získají opět plnou aktivitu. Jejich DNA se stabilně integruje do chromozomu hostitele, takže exprese je dlouhodobá. Hostitelské spektrum je velmi široké a přitom AAV nezpůsobuje žádnou známo nemoc, takže rekombinantní vektory jsou zcela netoxické.
Po vložení do cílové buňky může být daná sekvence identifikována konvenčními metodami jako je např. hybridizace nukleových kyselin pomocí sond, které obsahují sekvence homologní/komplementámí k sekvencím genů vložených do vektoru. Jiným způsobem se může sekvence identifikovat tím, že je přítomna nebo nepřítomna funkce markerového genu (např. aktivita thymidinkinázy, rezistence k antibiotiku apod.) způsobená zavedením expresního vektoru do cílové buňky.
Formulace a podávání
Sloučeniny podle vynálezu se mohou podávat jakýmkoliv způsobem, který je z lékařského hlediska přijatelný. To zahrnuje např. injekce, např. intravenózní, intarvaskulámí, intraarteriální, subkutánni, intramuskulámí, do nádoru, intraperitoneální, intraventrikulámí nebo intraepidurální, nebo podávání perorální, nazální oftalimické, rektální nebo topické. Systém pro kontinuální podávání je také specificky zahrnut v předkládaném vynálezu např. v podobě depotních injekcí nebo erodovatelných implantátů. Lokalizované podávání je zvláště vhodné, jako např. prostřednictvím katétru do jedné nebo více arterií, jako je např. renální arterie nebo céva zásobující lokalizovaný nádor.
Termín „farmaceuticky přijatelný nosič“ znamená jednu nebo více organických nebo anorganických látek, přírodních nebo syntetických, se kterými je mutovaný protoonkogen nebo mutovaný onkoprotein kombinován pro usnadnění aplikace. Vhodným nosičem je např. sterilní fyziologický roztok, ačkoliv odborníkovi je známa celá řada vodných i nevodných izotonických sterilních roztoků a sterilních suspenzí farmaceuticky přijatelných. Termín „nosič“ v tomto případě zahrnuje i lipozomy a protein tat z HIV-1 (viz Chen et al., Anal. biochem. 227: 168-175, 1995), a také jakýkoliv plazmidový nebo virový expresní vektor. „Účinné množství“ znamená takové množství, které je schopné odstranit nebo zpomalit progresi nemoci nebo degenerativní stav či poškození. Účinné množství je možné stanovit individuálně a je zčásti založeno na zvážení symptomů, které je třeba léčit, a vyžadovaných výsledků. Účinné množství může odborník se znalostí těchto faktorů stanovit rutinním způsobem bez nepřiměřeného experimentování.
-26</. Z903I0 B6
Liposomový systém může být jakýkoliv systém jednovrstevných váčků, mnohavrstevných váčků nebo stabilních několikavrstevných váčků, které se mohou připravit a podávat způsoby, které jsou odborníkovi dobře známy, např. jak se popisuje v patentech USA 5 169 637, 4 762 915, 5 000 958 nebo 5 185 154. Kromě toho se může ukázat potřeba exprimovat nové polypeptidy podle vynálezu a jiné vybrané polypeptidy jako lipoproteiny, aby se zvýšila jejich schopnost vázat se na liposomy. Tak například akutní ledvinné selhání člověka lze léčit in vivo RetL zabaleným v liposomu tak, že se tento RetL zavede do potřebných buněk pomocí liposomů. Liposomy se pak mohou podat renálním katétrem do renální arterie. Rekombinantní protein RetL se purifíkuje, např. z buněk CHO imunoafínitní chromatografií nebo jinou obvyklou metodou, pak se smíchá s liposomy a inkorporuje se do nich s velkou účinností. Obalený protein je možné testovat in vitro libovolným testem na stimulaci buněčného růstu.
Nový polypeptid podle předkládaného vynálezu je možné také podat zvířeti pomocí liposomového systému, čímž se zvýší jeho stabilita a imunogeničnost. Podání nových polypeptidů prostřednictvím liposomů je zvláště výhodné, protože liposomy jsou intemalizovány fagocytujícími buňkami v ošetřovaném zvířeti. Takové buňky poté, co rozloží membránu liposomu prezentují polypeptid imunitnímu systému ve spojení s dalšími molekulami, které jsou nutné k vyvolání silné imunitní odpovědi.
Kterýkoliv z nových polypeptidů podle předkládaného vynálezu může být použit ve formě farmaceuticky přijatelné soli. Vhodné kyseliny a zásady, které jsou schopné vytvářet soli s polypeptidy podle vynálezu jsou odborníkovi dobře známy a patří k nim jak organické tak i anorganické kyseliny a zásady.
Ačkoliv předkládaný vynález byl z důvodu jasnosti a lepšího pochopení podrobně popsán pomocí ilustrací a příkladů, odborníkovu je zřejmé, že v rámci vynálezecké myšlenky je možno provést jisté modifikace, předmět vynálezu je tudíž omezen pouze následujícími nároky.
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3616 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 257...1660
-27CZ 296516 B6 (ix) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
GCGGCCGCAG
CCCGCCCC-GA
ACCCTGGATG ACGCTGAGCT
GTTGGG7CGG
U - VJMXJ 4
GAGCTG.AACT CTCTCCCCGA
AACTGAACCC
TGGCGGCGGT TTGAGTGGCC GACCGGGCGG
CTGAAAGCC-G GGGCGGCAGA AGAGGAGCGC CGGCTTTGGA
GTCCGCCTCC GCGACGGGGA AGTCGCCCGG TTTTGGGGGG
CGCCCTCGCG
GTCTGCTCTC
GGA7CGCTGC GCGGGGACCA
GCTGCGCGGC GGCACC ATG TTC CTA GCC ACT CTG TAC TTC GCG CTG CCA
Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro 15 10
CTC | CTG | GAT | TTG | CTG | ATG | TCC | GCC | GAG | GTG | AGT | GGT | GGA | GAC | CGT | CTG |
Leu | Leu | A.sp | Leu | Leu | Met | Ser | Ala | Glu | Val | Ser | Gly | Gly | Asp | Airg | Leu |
15 | 20 | 25 | |||||||||||||
GAC | TY'*' 4 » | GTG | AAA | GCC | AC-C | C-AT | CAG | TGC | CTG | AAG | GAA | CAG | AGC | TGC | AGC |
Asp | Cys | Val | Lys | Ala | Ser | Asp | Gin | Cys | Leu | Lys | Glu | Gin | Ser | Cys | Ser |
33 | 35 | 40 | |||||||||||||
ACC | · w /» | i At. | CGC | ACA | CTA | AGO | CAG | TGC | GTG | GCG | GGC | AAG | GAA | ACC | AAC |
Thr | Lys | íx~ | λΧ ζ | Thr | Leu | Arff | Gin | Cys | Val | Ala | Gly | Lys | Glu | Thr | Asn |
45 | 50 | 55 | |||||||||||||
TTC | AGC | CTG | ACA | TCC | C-C-C | CTT | GAG | GCC | AAG | GAT | GAG | TGC | CGT | AGC | GCC |
Phe | Ser | Leu | r*··— «- | Ser | Gly | Leu | Glu | A1 a | Lys | Asp | Glu | Cys | Arg | Ser | Ala |
60 | 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
ATG | GA.G | GCC | TTG | λλλ | CAG | AAG | TCT | CTG | TAC | AAC | TGC | CGC | TGC | AAG | CC-G |
Met | Glu | Ala | Leu | Lys | Gin | Lys | Ser | Leu | Tyr | Asn | Cys | Aurg | cys | Lys | Arg |
80 | 85 | 90 | |||||||||||||
GGC | ATG | AAG | AAA | GAG | AAG | AAT | TGT | CTG | CGT | ATC | TAC | TGG | AGC | ATG | TAC |
Gly | Met | Lys | Lys | Glu | Lys | Asn | cys | Leu | Arg | Ile | Tyr | Trp | Ser | Met | Tyr |
95 | 100 | 105 | |||||||||||||
CAG | AGC | CTG | CAG | GGA | AAT | GAC | CTC | CTG | GAA | GAT | TCC | CCG | TAT | GAG | CCG |
Gin | Ser | Leu | Gin | Gly | Asn | Asp | Leu | Leu | Glu | Asp | Ser | Pro | Tyr | Glu | Pro |
110 | 115 | 120 | |||||||||||||
GTT | AAC | AGC | AGG | TTG | TCA | GAT | ATA | TTC | CGG | GCA | GTC | CCG | TTC | ATA | TCA |
Val | Asn | Ser | Arg | Leu | Ser | Asp | Ile | Phe | Arg | Ala | Val | Pro | Phe | Ile | Ser |
125 | 130 | 135 | |||||||||||||
GAT | GTT | TTC | CAG | CAA | GTG | GAA | CAC | ATT | TCC | AAA | GGG | AAC | AAC | TGC | CTG |
Asp | Val | Phe | Gin | Gin | Val | Glu | His | Ile | Ser | Lys | Gly | Asn | Asn | Cys | Leu |
140 | 145 | 150 | 155 |
-28CZ 296516 B6
GAC | GCA | GCC | AAG | GCC | TGC | AAC | CTG | GAC | GAC | ACC | TGT | AAG | AAG | TAC | AGG |
Asp | Ala | Ala | Lys | A1 fi | cys | Asn | Leu | ASp | Asp | Thr | Cys | Lys | Lys | Tyr | Arg |
160 | 165 | 170 |
TCG C-CC TAC ATC ACC CCC TC-C ACC ACC AGC ATG TCC AAC GAG GTC TGC
Ser Ala Tyr Ile Thr Pro Cys Thr Thr Ser Hec Ser Asn Glu Val Cys 1'5 180 165
AAC | CGC | CGT | AAG | TGC | CAC | AAG | GCC | CTC | AGG | CAG | TTC | TTC | GAC | AAG | GTT |
Asn | Arg | Arg | Lys | cys | His | Lys | Ala | Leu | Arg | Gin | Phe | Phe | Asp | Lys | Val |
190 | 195 | 200 | |||||||||||||
CCG | GCC | AAG | CAC | AGC | TAC | GC-G | ATG | CTC | TTC | TGC | TCC | TGC | CGG | GAC | ATC |
Pro | Ala | Lys | His | ser | Tyr | Gly | Met | Leu | Phe | Cys | Ser | Cys | Arg | Asp | Ile |
205 210 215
GCC TGC ACC GAG 961 | CGG CGG CGA CAG ACT ATC GTC | CCC GTG | TGC TCC | TAT Tyr 235 | |||||||||||
Ala Cys 220 | Thr | Glu | Arg | Arg 225 | Arg | Gin | Thr | Ile | Val 230 | Pro | Val | Cys | Ser | ||
GAA | GAA | CGA | GAG | AGG | CCC | AAC | TGC | CTG | AGT | CTG | CAA | GAC | TCC | TGC | AAG |
1009 | |||||||||||||||
Glu | Glu | Arg | Glu | Arg | Pro | Asn | Cys | Leu | Ser | Leu | Gin | Asp | Ser | Cys | Lys |
240 245 250
ACC AAT TAC ATC TC-C AGA TCT CGC CTT GCA GAT TTT TTT ACC AAC TGC 1057
Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys
255 | 260 | 265 | |||||||||||||
CAG | CCA | GAG | TCA | AGG | TCT | GTC | AGC | AAC | TGT | CTT | AAG | GAG | AAC | TAC | GCA |
1105 | |||||||||||||||
Gin | Pro | Glu | Ser | Arg | Ser | Val | Ser | Asn | cys | Leu | Lys | Glu | Asn | Tyr | Ala |
270 | 275 | 280 | |||||||||||||
GAC | TGC | CTC | CTG | GCC | F— * • Λ — | TCG | GGA | CTG | ATT | GGC | ACA | GTC | ATG | rX 1 | CCC |
1153 | |||||||||||||||
Asp | Cys | Leu | Leu | Ala | Tyr | Ser | Gly | Leu | Ile | Gly | Thr | Val | Met | Thr | Pro |
265 | 290 | 295 | |||||||||||||
AAC | TAC | C-TA | GAC | TCC | AGC | AGC | CTC | AGC | GTG | GCA | CCA | TGG | TGT | GAC | |
1201 | |||||||||||||||
Asn | Tyr | Val | Asp | Ser | Ser | Ser | Leu | Ser | Val | Ala | Pro | Trp | cys | Asp | Cys |
300 | 305 | 310 | 315 | ||||||||||||
AGC | AAC | AGC | GGC | AAT | GAC | CTG | GAA | GAC | TGC | TTG | AAA | TTT | CTG | AAT | TTT |
1249 | |||||||||||||||
Ser | Asn | Ser | Gly | Asn | Asp | Leu | Glu | Asp | Cys | Leu | Lys | Phe | Leu | Asn | Phe |
320 | 325 | 330 | |||||||||||||
TTT | AAG | GAC | AAT | ACT | TGT | CTC | AAA | AAT | GCA | ATT | CAA | GCC | TTT | GGC | AAT |
1297 | |||||||||||||||
Phe | Lys | Asp | Asn | Thr | Cys | Leu | Lys | Asn | Ala | Ile | Gin | Ala | Phe | Gly | Asn |
335 | 340 | 345 | |||||||||||||
GGC | TCA | GAT | GTG | ACC | ATG | TGG | CAG | CCA | GCC | CCT | CCA | GTC | CAG | ACC | ACC |
1345 | |||||||||||||||
Gly | Ser | Asp | Val | Thr | Met | Trp | Gin | Pro | Ala | Pro | Pro | val | Gin | Thr | Thr |
350 | 355 | 360 |
-29CZ 296516 B6
ACT 1393 Thr | GCC ACC | ACT Thr | ACC Thr | ACT Thr | GCC TTC CGG | GTC AAG AAC | AAG CCT CTG | GGG Gly | |||||||
Lys | Pro | Leu | |||||||||||||
Ala 365 | Thr | Ala 370 | Phe | Arg | Val | Lys | Asn 375 | ||||||||
CCA | GCA | GGG | TCT | GAG | AAT | GAG | ATC | CCC | ACA | CAC | GTT | TTA | CCA | CCC | TGT |
1441 | |||||||||||||||
Pro | Ala | Gly | Ser | Glu | Asn | Glu | I le | Pro | Thr | His | Val | Leu | Pro | Pro | Cys |
380 | 385 | 390 | 395 | ||||||||||||
GCG | AAT | TTG | CAG | GCT | CAG | AAG | CTG | AAA | TCC | AAT | GTG | TCG | GGT | AGC | ACA |
1469 | |||||||||||||||
Ala | Asn | Leu | Gin | Ala | Gin | Lys | Leu | Lys | Ser | Asn | Val | Ser | Gly | Ser | Thr |
400 | 405 | 410 | |||||||||||||
CAC | CTC | TGT | CTT | TCT | GAT | AGT | GAT | TTC | GGA | AAG | GAT | GGT | CTC | GCT | GGT |
1537 | |||||||||||||||
His | Leu | cys | Leu | Ser | Asp | Ser | Asp | Phe | Gly | Lys | Asp | Gly | Leu | Ala | Gly |
415 | 420 | 425 | |||||||||||||
GCC | TCC | AGC | CAC | ATA | ACC | ACA | AAA | TCA | ATG | GCT | GCT | CCT | CCC | AGC | TGC |
1585 | |||||||||||||||
Ala | Ser | Ser | His | Xle | Thr | Thr | Lys | Ser | Met | Ala | Ala | Pro | Pro | Ser | cys |
430 | 435 | 440 | |||||||||||||
AGT | CTG | AGC | TCA | CTG | CCG | GTG | CTG | ATG | CTC | ACC | GCC | CTT | C-CT | GCC | CTG |
1633 | |||||||||||||||
Ser | Leu | Ser | Ser | Leu | Pro | Val | Leu | Met | Leu | Thr | Ala | Leu | Ala | Ala | Leu |
445 | 450 | 455 | |||||||||||||
TTA | TCT | G7A | TCG | TTG | GCA | GAA | ACG | TCG | TAGCTGCATC CGGGAAAACA | ||||||
1680 | |||||||||||||||
Leu | Ser | Val | Ser | Leu | Ala | Glu | Thr | Ser | |||||||
460 | 465 |
GTATGAAAAG 1740 | ACAAAAGAGA | ACCAAGTATT | C7GTCCCTGT | CC7C77C7AT | ATCTGAAAA7 |
CCAGTTTTAA 1800 | AAGCTCCGT? | GAGAAGCAGT | TTCACCCAAC | TC-GAACTCTT | TCCTTG7T7T |
TAA.GAAAGCT 1860 | TGTGGCCC7C | AGGC-C-CTTCT | GTTGAAGAAC | TGC7ACAC-GG | CTAATTCCAA |
ACCCATAAC-G 1920 | CTC7GGC-C-CG | TGGTGCGGCT | TAAGGGGACC | ATTTGCACCA | TGTAAAGCAA |
GCTGGGCTTA 1980 | TCATG7G77T | GATGG7GAGG | ATGGTAGTG-G | TGÁTGATGAT | ggtaatttta |
ACAGCTTGAA 2040 | CCCTGTTCTC | TCTACTGGTT | AGGAACAGGA | GATACTATTG | ATAAAGATTC |
TTCCATGTCT 2100 | TACTCAGCAG | CA7TGCCTTC | TGAAGACAGG | CCCGCAGCCT | AGTGTGAATG |
ACAAGTGGAG 2160 | GTTGGCCTCA | AGAGTGGACT | TGGCAGACTC | TACCTTGTAG | TAATG77CAC |
CTTTCCGTGT 2220 | ATGGTCTCCA | CAGAGTGTTT | ATGTATTTAC | AGAC7GTTCT | GTGATCCCCC |
AACAACAACA | ACCACAAATT | CCTTGG7CAC | CTCCAAATGT | AACCGGTCCT | TTAGCCCAGT |
2280
-30CL 296516 B6
AGAGGAGGGT 2340 | GGGTGTGGCC | CTGGCACAGC | TCCCGGATTG | T7GATGGGCA | CTCTCCTGAG |
CTTTGCTTGA 2400 | GTGAGAAGCT | GAA7GTAGCT | GA-AAATCAAC | TCT7C77ACA | CTTCTTACTG |
CTTCGTTCAC 2460 | TTACGAGGTC | ACATATAGAA | CAAACATCAC | CAACTATTAG | CTTACCGTTA |
GCTTCCCAAC 2520 | TATTAGC7T7 | CTATGTTT7G | AAAGCAGTGT | TGCTGACCCC | ATGTTTTAAT |
GATGGTTTAA 2580 | TACATGCAGC | CCTTTCCTCT | CATCGGTAAC | ACTAGCTCCA | ACATCAACTT |
CATGCATGTG 2640 | GCTCTCAAAA | GCAGGCCCCA | AGAAGCCCAG | TTCTTTAGGA | GAAAGCTGCG |
TCCTGTTTCT 2700 | G7GGACAGGC | AGGAGGAAAC | AGAGCAGCCT | GCCCGTGGTG | TCTTTA7CTG |
T7TTGAAA7C 2760 | AAGGC7GCCT | G7G7GTAAGG | AATGGT7CAA | TTCTTATAAA | GGGTGCCACT |
GTTGATGCCA 2820 | CAACTGGCAG | T7GGTCTAGC | TCCAGGACAC | CGGTTTCCAT | GTTGCC7GGC |
AGAGACAGCT 2880 | T7GATTGGGA | CTGGCTGGCC | ACAAGGGATG | GGATGAAGAT | GTGCTGCCCT |
CTCTTTCA.AA 2940 | GTTGAGCCC7 | GCCAGGGCAC | ATAGAAGCAT | CTTTGC7CCT | GACCA.CAACG |
TAGAACAGCT 3000 | TGGATTCAAG | G7GATC.AAGC | G7CTCCTG7A | CATTGCTCTG | TGACCTTCAT |
AACAGACTGT 3060 | CCCGCACAAA | AGGAACGGCA | G77TATGGAT | CTAGAGTGGG | AGCACAGGG7 |
Z“*Z·“*/-»** V. · * 3120 | GAACCC-A7TG | GCAAAATACA | CAGAACAGGA | GGGAGAG7CT | CAAGCCGAGA |
CATCTTGCTT 3180 | ACTAGCCACA | CACCATCTCC | TGGAGCCCTG | CTCCTGACCT | GGGCAGACCC |
TTAGGTGTAT 3240 | A7CTA.AAGAC | CTCT7CAA.7G | T7CAGG77CA | GAATCTGTAA | A7GGT7GCGT |
CCTGGCACCC 3300 | ATTCCTG.AAA | AC7GAACAAA | GGAGAGGATA | TCTTTCCTCC | ATTGAGCCCT |
GAAAGTATGA 3360 | CTGGCTTCTC | ACCCTCCCAC | AGAGCAGGGA | GCCCTGGTGC | ACACAG7CTC |
CTGATATCCT 3420 | CCCTGCTCTT | TGAGG7TTGC | CTTGGGAGAA | AATGATTCAC | CTCGGGAGGG |
GACGCTTTGG 3480 | TGTCTGAAGT | ACGTTTATAT | CGAAA7GTTA | ATGAATACCC | ATG7AAAATA |
CTCAATAGCC 3540 | ACCT77C77C | CCTTCACAAT | GTTTTCGAGG | GGAATGCATC | CAACATCCAA |
G7GTACCTGG | TCAGTGGGAA | GTTCCATGAA | GACTCATACA | TTGAATAAAC | ATATTCGATG |
3600
TGCCGAAAGC GGCCGC 3616
-31 CZ 296516 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 468 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
Met 1 | Phe | Leu Ala | Thr 5 | Leu | Tyr | Phe Ala | Leu 10 | Pro | Leu | Leu Asp | Leu 15 | Leu | |||
Met | Ser | Ala | Glu | Val | Ser | Gly | Gly | Asp | Arg | Leu | Asp | Cys | Val | Lys | Ala |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Ser | Asp | Gin | cys | Leu | Lys | Glu | Gin | Ser | Cys | Ser | Thr | Lys | Tyr | Arg | Thr |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Leu | Arg | Gin | Cys | Val | Ala | Gly | Lys | Glu | Thr | Asn | Phe | Ser | Leu | Thr | Ser |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gly | Leu | Glu | Ala | Lys | Asp | Glu | cys | Arg | Ser | Ala | Met | Glu | Ala | Leu | Lys |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Gin | Lys | Ser | Leu | Tyr | Asn | Cys | Arg | Cys | Lvs | Arg | Gly | Met | Lys | Lys | Glu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Lys | Asn | Cys | Leu | kra | Ile | Tyr | Trp | Ser | Met | Tyr | Gin | Ser | Leu | Gin | C-ly |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Asn | Asp | Leu | Leu | Glu | Asp | Ser | Pro | Tyr | Glu | Pro | Val | Asn | Ser | Arg | Leu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ser | Asp | Ile | Phe | Are | Ala | Val | Pro | Phe | Ile | Ser | As o | Val | Phe | Gin | Gin |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Val | Glu | His | Ile | Ser | Lys | Gly | Asn | Asn | Cys | Leu | Asp | Ala | Ala | Lys | Ala |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Cys | Asn | Leu | Asp | Asp | Thr | Cys | Lys | Lys | Tyr | Arg | Ser | Ala | Tyr | Ile | Thr |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Pro | Cys | Thr | Thr | Ser | Met | Ser | Asn | Glu | Val | Cys | Asn | Arg | Arg | Lys | Cys |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
His | Lys | Ala | Leu | Arg | Gin | Phe | Phe | Asp | Lys | Val | Pro | Ala | Lys | His | Ser |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Tyr | Gly | Met | Leu | Phe | Cys | Ser | cys | Arg | Asp | Ile | Ala | Cys | Thr | Glu | Arg |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Arg | Arg | Gin | Thr | Ile | Val | Pro | val | Cys | Ser | Tyr | Glu | Glu | Arg | Glu | Ara |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Pro | Asn | cys | Leu | Ser | Leu | Gin | Asp | Ser | Cys | Lys | Thr | Asn | Tyr | Ile | Cys |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Arg | Ser | Arg | Leu | Ala | Asp | Phe | Phe | Thr | Asn | Cys | Gin | Pro | Glu | Ser | Arg |
-32CZ zy&516 B6
260 26S 270
Ser | Val | Ser Asn 275 | C/S | Leu | Lys Glu Asn 280 | Tyr | Ala | Asp | Cys 285 | Leu | Leu | Ala | |||
Tyr | Ser | Gly | Leu | Ile | Gly | Thr | Val | Ket | Thr | Pro | Asn | Tyr | Val | Asp | Ser |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ser | Ser | Leu | Ser | Val | Ala | Pro | Trp | Cys | Asp | Cys | Ser | Asn | Ser | Gly | Asn |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
ASp | Leu | Glu | Asp | Cys | Leu | Lys | Phe | Leu | Asn | Phe | Phe | Lys | Asp | Asn | Thr |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Cys | Leu | Lys | Asn | Ala | Ile | Gin | Ala | Phe | Gly | Asn | Gly | Ser | Asp | Val | Thr |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Mec | Trp | Gin | Pro | Ala | Pro | Pro | Val | Gin | Thr | Thr | Thr | Ala | Thr | Thr | Thr |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Thr | Ala | Phe | Arg | Val | Lys | Asn | Lys | Pro | Leu | Gly | Pro | Ala | Gly | Ser | Glu |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Asn | Glu | Tle | Pro | His | Val | Leu | Pro | Pro | Cys | Ala | Asn | Leu | Gin | Ala | |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Gin | Lys | Leu | Lys | Ser | Asn | Val | Ser | Gly | Ser | Thr | His | Leu | Cys | Leu | Ser |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Asp | Ser | Asp | Phe | Gly | Lys | Asp | Gly | Leu | Ala | Gly | Ala | Ser | Ser | His | Ile |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Thr | Thr | Lys | Ser | Meu | Ala | Ala | Pro | Pro | Ser | Cys | Ser | Leu | Ser | Ser | Leu |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Pro | Val | Leu | Leu | Thr | A- ci | Leu | Ala | Ala | Leu | Leu | Ser | Val | Ser | LřS — | |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Ala | Glu | Thr | Ser | ||||||||||||
465 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
.. AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGCGAAGGC GACGTCCGG
-33CZ 296516 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 33 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCTCGTC GCA 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 33 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCGCATC ACA 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1926 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 10...1920
-34CZ ZVOSIO B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
GCGGCCGCC ATG GCG AAG GCG ACG TCC GGC GCC GCA GGG CTG GGG CTG
Hec Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Gly Leu 470
475
480
336
432
624
144
192
240
288
384
480
528
576
672
720
768
AAG | CTG | TTT | TTG | CTG | CTG | CCG | CTA | CTG | GGA | GAA | GCC | CCG | CTG | GGT | CTC |
Lys | Leu | Phe | Leu 485 | Leu | Leu | Pro | Leu | Leu 490 | Gly | Glu | Ala | Pro | Leu 495 | Gly | Leu |
TAC | TTC | TCA | AGG | GAT | GCT | TAC | TGG | GAG | AGG | CTG | TAT | GTG | GAC | CAG | CCA |
Tyr | Phe | Ser 500 | Arg | Asp | Ala | Tyr | Trp 505 | Glu | Arg | Leu | Tyr | Val 510 | Asp | Gin | Pro |
GCT | GGC | ACA | CCT | CTG | CTC | TAT | GTC | CAT | GCC | CTA | CGG | GAT | GCC | CCT | GGA |
Ala | Gly 515 | Thr | Pro | Leu | Leu | Tyr 520 | Val | His | Ala | Leu | Arg 525 | Asp | Ala | Pro | Gly |
GAA | GTG | CCC | AGC | TTC | CGC | CTG | GGC | CAG | TAT | CTC | TAT | GGC | GTC | TAC | CGC |
Glu 530 | Val | Pro | Ser | Phe | Arg 535 | Leu | Gly | Gin | Tyr | Leu 540 | Tyr | Gly | Val | Tyr | Arg 545 |
ACG | CGT | CTG | CAT | GAG | AAT | GAC | TGG | ATC | CAC | ATC | GAT | GCG | GGC | ACT | GGC |
Thr | Arg | Leu | His | Glu 550 | Asn | Asp | Trp | Ile | His 555 | Ile | Asp | Al a | Gly | Thr 560 | Gly |
CTC | CTC | TAC | CTC | AAT | CAG | AGC | CTG | GAC | CAT | AGT | TCC | TGG | GAG | CAG | CTC |
Leu | Leu | Tyr | Leu 565 | Asn | Gin | Ser | Leu | Asp 570 | His | Ser | Ser | Trp | Glu 575 | Gin | Leu |
AGC | ATC | CGA | AAT | GGC | GGC | TTC | CCC | TTG | CTC | ACC | GTC | TTC | CTC | CAG | GTC |
Ser | Ile | Arg 580 | Asn | Gly | Gly | Phe | Pro 585 | Leu | Leu | Thr | Val | Phe 590 | Leu | Gin | Val |
TTC | CTG | GGG | TCC | ACA | GCC | CAG | AGA | GAG | GGA | GAG | TGT | CAT | TGG | CCA | GGC |
Phe | Leu 595 | Gly | Ser | Thr | Ala | Gin 600 | Arg | Glu | Gly | Glu | Cys 605 | His | Trp | Pro | Gly |
TGT | GCC | CGT | GTG | TAC | TT^ | TCC | TTC | ATC | AAC | GAC | ACC | TTC | CCA | AAT | TGT |
Cys 610 | Ala | Arg | Val | Tyr | Phe 615 | Ser | Phe | Ile | Asn | Asp 620 | Thr | Phe | Pro | Asn | Cvs 625 |
AGC | TCC | TTC | AAA | GCC | CGG | GAT | CTC | TGC | ACC | CCA | GAG | ACG | C-GT | GTG | TCC |
Ser | Ser | Phe | Lys | Ala 630 | Arg | Asp | Leu | cys | 635 | Pro | Glu | Thr | Gly | Val 640 | Ser |
TTC | CGC | ATC | AGsj | GAG | AAC | AGG | CCC | CCT | GGC | ACC | TTC | TAC | CAG | T*7V· | CGC |
Phe | Arg | Ile | Arg 645 | Glu | Asn | A-rg | Pro | Pro 650 | Gly | Thr | Phe | Tyr | Gin 655 | Phe | Arg |
ATG | CTA | CCT | GTG | CAG | TTC | CTT | TGT | CCT | AAC | ATC | AGT | GTG | AAG | TAC | |
EeC | Leu | Pro 660 | Val | Glr. | Phe | Leu | Cys 6 65 | Pro | Asn | Ile | Ser | Val 670 | Lys | Tyr | Lys |
CTC | TTA | GAA | GGG | GAC | C-GT | CTG | CCC | TTC | CGT | TGT | GAC | CCC | GAC | TGT | CTG |
Leu | Leu 675 | Glu | Gly | Asp | Gly | Leu 680 | Pro | Phe | Arg | Cys | Asp 685 | Pro | Asp | cys | Leu |
GAG | GTG | AGC | ACG | CGG | TGG | GCA | CTG | GAT | CGG | GAG | CTT | CAG | GAG | AAG | TAT |
Glu 690 | Val | Ser | Thr | Arg | Trp 695 | Ala | Leu | Asp | Arg | Glu 700 | Leu | Gin | Glu | Lys | Tyr 705 |
GTG | CTG | GAG | GCT | GAG | TGC | GCA | GTG | GCA | GGC | CCT | GGA | GCC | AAC | AAG | GAG |
Val | Leu | Glu | Ala | Glu 710 | Cys | Ala | Val | Ala | Gly 715 | Pro | Gly | Ala | Asn | Lys 720 | Glu |
AAG | GTG | GCC | GTG | TCC | TTC | CCG | GTG | ACG | GTG | TAT | GAT | GAA | GAC | GAC | TCC |
816
-35CZ 296516 B6
Lys | Val | Ala | Val 725 | Ser | Phe | Pro | V a 1 | 730 | Val | Tyr Asp | Glu | Asp 735 | Asp | Ser | |
CCG | CCC | ACC | TTC | TCC | GGA | GGT | GTG | GGC | ACC | GCC | AGT | GCT | GTG | GTG | GAG |
E 64 | |||||||||||||||
Pra | ?ro | Thr | Phe | Ser | Gly | Gly | Val | Gly | Thr | Ala | Ser | Ala | Val | Val | Glu |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
TTT | AAG | CGG | AAG | GAG | C-GC | ACT | GTG | GTA | GCC | ACT | CTG | CAG | GTG | TTT | GAT |
912 | |||||||||||||||
Pr.e | Lys | Arg | Lys | Glu | Gly | Tr.r | Val | Val | Ala | Thr | Leu | Gin | Val | Phe | Asp |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
GCA | GAT | GTG | GTG | CCA | GCA | TCT | GGG | GAG | CTG | GTG | AGG | CGG | TAC | ACA | AGC |
960 | |||||||||||||||
Ala | Asp | Val | Val | Pro | Ala | Ser | Gly | Glu | Leu | Val | Arg | Arg | Tyr | Thr | Ser |
770 | 775 | 780 | 7S5 | ||||||||||||
ACA | CTA | CTC | TCA | GGG | GAT | TCC | TGG | GCC | CAG | CAG | ACC | TTC | CGG | GTG | GAG |
10C8 | |||||||||||||||
Thr | Leu | Leu | Ser | Gly | Asp | Ser | Trp | Ala | Gin | Gin | Thr | Phe | Arg | Val | Glu |
790 | 795 | 800 | |||||||||||||
CAC | ACA | CCC | AAC | GAG | ACC | TTG | GTC | CAG | TCC | AAC | AAC | AAC | TCC | GTG | CGG |
1056 | |||||||||||||||
His | Thr | Pro | Asn | Glu | Thr | Leu | Val | Gin | Ser | Asn | Asn | Asn | Ser | Val | Arg |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
GCA | ACC | ATG | CAC | AAT | TAC | AAG | CTG | GTT | CTC | AAC | AGG | AGC | CTG | TCC | ATC |
1104 | |||||||||||||||
Ala | Thr | Met | His | Asn | Tyr | Lys | Leu | Vel | Leu | Asn | Arg | Ser | Leu | Ser | Ile |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
TCA | GAG | AGC | CGA | GTC | CTG | CAG | CTA. | GTA. | GTC | CTG | GTC | AAT | GAC | TCA | GAC |
1152 | |||||||||||||||
Ser | Glu | Ser | Arg | Val | Leu | Gin | Leu | Val | Val | Leu | Val | Asn | A.sp | Ser | Asp |
83 5 | 840 | 845 | |||||||||||||
TTC | CAG | C-GG | CCT | GGG | TCA | C-GT | GTT | CTC | TTC | CTC | CAT | TTC | AAC | GTG | TCT |
12C0 | |||||||||||||||
Gin | Gly | Pro | Gly | Ser | Gly | Val | Leu | Phe | Leu | His | Phe | Asn | Vel | Ser | |
E53 | 655 | 860 | 865 | ||||||||||||
GTG | CTG | CCT | GTC | ACC | CTG | AAC | CTA | CCC | ATG | GCC | TCC | TTC | CCA | GTG | |
1248 | |||||||||||||||
Val | Leu | Pro | Val | Thr | Leu | Asn | Leu | Pro | Met | Ala | Tyr | Ser | Phe | Pro | Val |
870 | 875 | 880 | |||||||||||||
AAT | AGG | AGA | GCC | CGC | CGT | GCC | CAG | ATT | GGG | AAA | GTT | TGC | GTG | GAG | |
1296 | |||||||||||||||
Asn | Arg | Arg | Ala | Arg | Arg | Tyr | Ala | Glr. | Ile | Gly | Lys | Val | Cys | Val | Glu |
£85 | 890 | 895 | |||||||||||||
AAC | TGC | CAG | GAG | TTC | AGC | GGT | GTC | TCC | ATC | CAG | TAC | AAG | CTG | CAG | CCC |
1344 | |||||||||||||||
Asn | Cys | Gin | Glu | Phe | Ser | Gly | Val | Ser | Ile | Gin | Tyr | Lys | Leu | Gin | Pro |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
7CC | AC-C | ACC | AAC | TGC | AGT | GCC | CTA | GGT | GTG | GTC | ACC | TCA | ACA | GAA | GAC |
1392 | |||||||||||||||
Ser | Ser | Thr | Asn | Cys | Ser | Ala | Leu | Gly | Val | Val | Thr | Ser | Thr | Glu | Asp |
$15 | 920 | 925 | |||||||||||||
ACC | TCA | GGG | ACC | CTA | TAT | GTA | AAT | GAC | ACG | GAG | GCC | CTG | CGG | CGA | CCT |
1440
-36CZ 290010 136
1488
1536
1584
1632
16S0
1728
1776
1824
1872
1920
Thr 930 | Ser | Gly | Tr - | Leu | Tyr 935 | Val | Asn | Asp | Thr | Glu 940 | Ala | Leu | Arg | Arg | Pro 945 |
GAG | TGT | ACC | GAG | CTT | CAG | TAC | ACA | GTG | GTA | GCC | ACT | GAC | CGG | CAG | ACC |
Glu | Cys | Thr | Glu | Leu 950 | Gin | Thr | Val | Val 955 | Ala | Thr | Asp | Arg | Gin 960 | Thr | |
CGC | AGG | CAG | ACC | CAA | GCT | TCG | TTA | GTC | GTC | ACA | GTG | GAG | GGG | ACA | TAC |
> Arg | Arg | Gin | Thr 965 | Gin | Ala | Ser | Leu | Val 970 | Val | Thr | Val | Glu | Gly 975 | Thr | Tyr |
ATT | GCA | GAA | GAA | GTG | GGC | TGC | CCC | AAG | TCC | TGT | GCA | GTA | AAC | AAG | AGG |
1 Ile | Ala | Glu 980 | Glu | Val | Gly | Cys | Pro 985 | Lys | Ser | Cys | Ala | Val 990 | Asn | Lys | Arg |
CGA | CCT | GAG | TGT | GAG | GAG | TGT | C-GT | GGC | CTG | GGT | TCT | CCA | ACT | GGC | AGA |
Arg | Pro 995 | Glu | Cys | Glu | Glu | Cys Gly 10C0 | Gly | Leu | Gly | Ser Pro 1005 | Thr | Gly | Arg | ||
TGT i | GAG | TGG | CGT | CAG | GGA | C-AT | GGT | ΑΛΑ | GGG | ATC | ACC | AGG | AAC | TTC | TCC |
Cys Glu 1010 | Trp | Arg | Gin | Gly Asp 1015 | Gly | Lys | Gly | Ile Thr 1020 | Arg | Asn | Phe | Ser 102 | |||
ACC • | TGT | TCT | CCT | AGC | ACC | AGG | ACC | TGT | CCT | GAT | GGC | CAC | TGT | GAT | GCT |
i Thr | Cys | Ser | Pro | Ser 103: | Thr | Arg | Thr | Cys | Pro Asp 1035 | Gly | His | Cys | Asp Ala 1040 | ||
CTG | GAG | AGC | CGG | GAT | ATC | AAC | ATT | TGC | CCC | CAG | GAC | TGT | CTC | CC-T | C-GC |
Leu | Glu | Ser | Arg 104: | A.sp | Ile | Asn | Ile | Cys Pro 1050 | Gin | A.sp | cys | Leu Arg 1055 | Gly | ||
ccc | ATT | GTT | GGC | C-GG | CAT | C-.AG | CC-A | C-GG | GAG | CC-C | CAG | C-GG | ATT | AAA | GCC |
í Pro | Ile | Val Glv 1060 | Gly | His | Glu | Arg Gly 1065 | Glu | Arg | Gin | Gly Ile 1070 | Lys | Ala | |||
GGC > | TAT | C-GC | ATC | TGT | TTC | CCT | GAT | GAG | AAG | AA.G | TGC | TTC | T-GC | ||
Gly | Tyr 107! | _Gly | Ile | Cys | Asn | Cys Phe 1080 | Pro | Asp | Glu | Lys 10SÍ | Lys | Cys | Phe | Cys | |
GAG i | CCA | GAG | GAC | A>i w | CAG | GGC | CCA | T7G | TGT | GAT | GCG | CTG | TGC | CGC | ACG |
i Glu | Pro | Glu | Asp | Ser | Gin | Gly | Pro | Leu | Cys | Asp | Ala | Leu | Cys | Arg | Thr |
1090
1100
1095
11C5
GTCGAC
1926 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 637 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
-37CZ 296516 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
Met Ala 1 | Lys | Ala | Thr 5 | Ser | Gly Ala | Ala | Gly 10 | Leu Gly | Leu | Lys | Leu 15 | Phe | |||
Leu | Leu | Leu | Pro | Leu | Leu | Gly | Glu | Ala | Pro | Leu | Gly | Leu | Tyr | Phe | Ser |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Arg | Asp | Ala | Tyr | Trp | Glu | Arg | Leu | Tyr | Val | Asp | Gin | Pro | Ala | Gly | Thr |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Pro | Leu | Leu | Tyr | Val | His | Ala | Leu | Arg | Asp | Ala | Pro | Gly | Glu | Val | Pro |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ser | Phe | Arg | Leu | Gly | Gin | Tyr | Leu | Tyr | Gly | Val | Tyr | Arg | Thr | Arg | Leu |
65 | 70 | 75 | 50 | ||||||||||||
His | Glu | Asn | Asp | Trp | Ile | Kis | Ile | Asp | Ala | Gly | Thr | Gly | Leu | Leu | Tyr |
55 | 90 | 95 | |||||||||||||
Leu | Asn | Gin | Ser | Leu | Asp | His | Ser | Ser | Trp | Glu | Gin | Leu | Ser | Ile | Arg |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Asn | Gly | Gly | Phe | Pro | Leu | Leu | Tr.r | Val | Phe | Leu | Gin | Val | Phe | Leu | Gly |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ser | Thr | Ala | Gin | Arg | Glu | Gly | Glu | cys | His | Trp | Pro | Gly | Cys | Ala | Arg |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Val | Tyr | Phe | Ser | Phe | Ile | Asn | Asp | Thr | Phe | Pro | Asn | Cys | Ser | Ser | Phe |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Lys | Ala | Arg | A.sp | Leu | Cys | Thr | Pro | Glu | Thr | Gly | Val | Ser | Phe | Ar o | Ile |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Arg | Glu | Asn | Arg | Pro | Pro | Gly | Thr | Phe | Tyr | Gin | Phe | Are | Met | Leu | Pro |
150 | 155 | 190 | |||||||||||||
Val | Gin | Phe | Leu | cys | Pro | Asn | Ile | Ser | Val | Lys | Tyr | Lys | Leu | Leu | Glu |
155 | 200 | 205 | |||||||||||||
Gly | Asp | Gly | Leu | Pro | Phe | Arg | Cys | Asp | Pro | Asp | cys | Leu | Glu | Val | Ser |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Thr | Arg | Trp | Ala | Leu | Asp | Arg | Glu | Leu | Gin | Glu | Lys | Tyr | Val | Leu | Glu |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Ala | Glu | Cys | AI a | Val | Ala | Gly | Pro | Gly | Ala | Asn | Lvs | Glu | Lys | Val | Ala |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Val | Ser | Phe | Pro | Val | Thr | Val | Tyr | Asp | Glu | Asp | Asp | Ser | Pro | Pro | |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Phe | Ser | Gly | Gly | Val | Gly | Thr | Ala | Ser | Ala | Val | Val | Glu | Phe | Lys | Arg |
275 | 250 | 285 | |||||||||||||
Lys | Glu | Gly | Thr | val | Val | Ala | Thr | Leu | Gin | Val | Phe | Asp | Ala | Asp | Val |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Val | Pro | Ala | Ser | Gly | Glu | Leu | Val | Arg | Arg | Tyr | Thr | Ser | Thr | Leu | Leu |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Ser | Gly | Asp | Ser | Trp | Ala | Gin | Gin | Thr | Phe | Arg | Val | Glu | His | Thr | Pro |
325 | 330 | 335 |
-38CZ 296516 B6
Asn | Glu | Thr | Leu 34 0 | Val | Gin | Ser | Asn | Asn 345 | Asn | Ser | Val | Arg | Ala 350 | Thr | Met |
His | Asn | Tyr | Lys | Leu | Val | Leu | Asn | Arg | Ser | Leu | Ser | Ile | Ser | Glu | Ser |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Arg | Val | Leu | Gin | Leu | Val | Val | Leu | Val | Asn | Asp | Ser | Asp | Phe | Gin | Gly |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Pro | Gly | Ser | Gly | Val | Leu | Phe | Leu | His | Phe | Asn | Val | Ser | Val | Leu | Pro |
335 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Val | Thr | Leu | Asn | Leu | Pro | Xet | Ala | Tyr | Ser | Phe | Pro | Val | Asn | Arg | Arg |
4C5 | 410 | 415 | |||||||||||||
Ala | Arg | Arg | Tyr | Ala | Gin | Ile | Gly | Lys | Val | Cys | Val | Glu | Asn | Cys | Gin |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Glu | Phe | Ser | Gly | Val | Ser | Ile | Gin | Tyr | Lys | Leu | Gin | Pro | Ser | Ser | Thr |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Asn | Cys | Ser | Ala | Leu | Gly | Val | Val | Thr | Ser | Thr | Glu | Asp | Thr | Ser | Gly |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Thr | Leu | Tyr | Val | Asn | Asp | Thr | Glu | Ala | Leu | Arg | Arg | Pro | Glu | cys | Thr |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Glu | Leu | Gin | Tyr | Thr | Val | Val | Ala | Thr | Asp | Arg | Gin | Thr | Arg | Arg | Gin |
4 8 5 | 490 | 495 | |||||||||||||
Thr | Gin | Ala | Ser | Leu | Val | Val | -v | Val | Glu | Gly | Thr | Tyr | Ile | Ala | Glu |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Glu | Val | Glv | Cys | Pro | Lys | Ser | Cys | Ala | Val | Asn | Lys | Arg | Arg | Pro | Glu |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Cys | Glu | Glu | Cys | Gly | Gly | Leu | Gly | Ser | Pro | Thr | Gly | Arg | Cys | Glu | Trp |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Arg | Gin | Gly | Asp | Gly | Lys | Gly | Ile | Thr | Arg | Asn | Phe | Ser | Thr | Cys | Ser |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Pxo | Ser | Thr | Arg | Thr | Cys | Pro | Asp | Gly | His | Cys | Asp | Ala | Leu | Glu | Ser |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Ajrg | Asp | Ile | Asn | Ile | Cys | Pro | Gin | Asp | Cys | Leu | Arg | Gly | Pro | Ile | Val |
530 | 555 | 590 | |||||||||||||
Gly | Gly | His | C-lu | Arg | Gly | Glu | Arg | Gin | Gly | Ile | Lys | Ala | Gly | Tyr | Gly |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Ile | Cys | Asn | Cys | Phe | Pro | As? | Glu | Lys | Lys | Cys | Phe | Cys | Glu | Pro | Glu |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Asp | Ser | Gin | Gly | Pro | Leu | cys | Asp | Ala | Leu | Cys | Arg | Thr | |||
625 | 630 | 635 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1223 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché ío (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA
-39CZ 296516 B6 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 10...1038 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
48 | CTG Leu | CTG GAG | GAT Asp | TCC Ser | CCA Pro | TAT Tyr | GAA Glu 645 | |
Leu | Glu 640 | |||||||
ATA | TTC | CGG | GTG | GTC | CCA | TTC | ATA | |
96 | ||||||||
Ile | Phe 655 | Arg | Val | Val | Pro | Phe 660 | Ile | |
AAC | AAC | TGC | CTG | GAT | GCA | C-CG | AAG | |
144 | ||||||||
Asn 670 | Asn | Cvs | Leu | Asp | Ala 675 | Ala | Lys | |
AAG | »♦ a* | TAC | AGG | TCG | GCG | TAC | ATC | |
192 | ||||||||
Lys | Lys | Tyr | Ser 69C | Ala | Tyr | Ile | ||
AAC | GAT | GTC | TC-C | AAC | CGC | CGC | » * rj-.vj | |
240 | ||||||||
Asn | Asp | Val | Cys 705 | Asn | Arg | rUC | Lys | |
GAC | AAG | GTC | CCG | GCC | AAG | CAC | ||
288 | ||||||||
Phe | Asp | Lys 720 | Val | Pro | Ala | Lys | His 725 | |
TGC | CC-G | GAC | ATC | GCC | CGC | ACA | GA.G | |
336 | ||||||||
Cys | Arg 735 | Asp | Ile | Ala | Cys | 740 | Glu | |
GTG | TGC | TCC | TAT | GAA | GAL· | AGG | GAG | |
384 | ||||||||
val 750 | Cys | Ser | Tyr | Glu | Glu 755 | Arg | Glu | |
GAC | TCC | TGC | AAG | ACG | AAT | TAC | ATC | |
432 | ||||||||
Asp | Sejf | Cys | Lys | Thr 770 | Asn | Tyr | Ile | |
TTT | ACC | AAC | TGC | CAG | CCA | GAG | TCA | |
480 | ||||||||
Phe | Thr | Asn | Cys 85 | Gin | Pro | Glu | Ser | |
GAA | AAC | TAC | GCT | GAC | TGC | CTC | CTC | |
528 | ||||||||
Glu | Asn | Tyr 800 | Ala | Asp | Cys | Leu | Leu 805 |
CCA GTT AAC AGC AGA TTG TCA GAT
Pro Val Asn Ser Arg Leu Ser Asp
650
TCA GTG GAG CAC ATT CCC AAA GGG
Ser Val Glu His Ile Pro Lys Gly
665
GCC TGC AAC CTC GAC GAC ATT TGC
Ala Cys Asn Leu Asp Asp Ile Cys
680685
ACC CCG TGC ACC ACC AGC GTG TCC
Thr Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser
655700
TGC CAC AAG GCC CTC CGG CAGTTC
Cys His Lys Ala Leu Arg GinPhe
710715
AGC TAC GGA ATG CTC TTC TGCTCC
Ser Tvr Gly Hec Leu Phe CvsSer
730
CGG AGG CGA CAG ACC ATC GTGCCT
Arg Arg Arg Gin Thr Ile Val Pro
745
AAG CCC AAC TGT TTG AAT TTG CAG
Lvs Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gin
760765
TGC AGA TCT CGC CTT GCG GATTTT
Cys Arg Ser Arg Leu Ala AspPhe
775780
AGG TCT GTC AGC AGC TGT C7AAAG
Arg Ser Val Ser Ser Cys LeuLys
790795
GCC TAC TCG GGG CTT ATT GGC ACA
Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr
810
-40CZ 296516 B6
576 | GTC ATG | ACC CCC AAC | TAC ΑΤΑ | GAC Asp | ||||
Thr | Pro Asn | Tyr | Ile 820 | |||||
Val | Met 815 | |||||||
TGG | TGT | GAC | TGC | AGC | AAC | AGT | GGG | |
624 | ||||||||
Trp 820 | Cys | Asp | Cys | Ser | Asn 835 | Ser | Gly | |
TTT | TTG | AAT | TTC | TTC | AAG | GAC | AAT | |
672 | ||||||||
Phe | Leu | Asn | Phe | Phe 850 | Lys | Asp | Asn | |
GCC | TTT | GGC | AAT | GGC | TCC | GAT | GTG | |
720 | ||||||||
Ala | Phe | Gly | Asn 865 | Gly | Ser | Asp | Val | |
GTA | CAG | ACC | ACC | ACT | GCC | ACT | ACC | |
768 | ||||||||
Val | Gin | Thr 880 | Thr | Thr | Ala | Thr | Thr 885 | |
AAG | CCC | CTG | GGG | CCA | GCA | GGG | TCT | |
816 | ||||||||
Lys | Pro 895 | Leu | Gly | Pro | Ala | Gly 900 | Ser | |
TTG | CCA | CCG | TGT | GCA | AAT | TTA | CAG | |
864 | ||||||||
Leu 910 | Pro | Pro | Cys | Ala | Asn 915 | Leu | Gin | |
TCG | C-GC | A-AT | ACA | CAC | CTC | TG? | * í“ 4 - | |
912 | ||||||||
Ser | Gly | Asn | Thr | His 930 | Leu | Cys | Ile | |
C-GT | CTC | GGT | GCT | TCC | AGC | CAC | ATA | |
960 | ||||||||
Gly | Leu | Gly | Ala 945 | Ser | Ser | His | Ile | |
CCA 1008 | AGC | TGT | C-GT | CTG | AC-C | CCA | CTG | |
Pro | Ser | Cys 960 | Gly | Leu | Ser | Pro | Leu 965 | |
TCC 1058 | ACC | CTA | iVV * á m | 7CT | TTA | ACA | GAA | |
Ser | Thr 975 | Leu | Leu | Sex | Leu | Thr 980 | Glu |
AATATGGACA TGTAAAAAGA CAAAAACCAA 1118
GAAATTCCAG TTTAGGAGCT CAGTTGAGAA 1178
TTTTCCTTTT AAGAAAGCTT CTTGTGATCC 1223
TCC AGT AGC CTC AGT GTG GCCCCA
Ser Ser Ser Leu Ser Val AlaPro
825
AAC GAC CTA GAA GAG TGC TTGAAA
Asn Asp Leu Glu Glu Cys LeuLys
840845
ACA TGT CTT AAA AAT GCA ATTCAA
Thr Cys Leu Lys Asn Ala IleGin
855860
ACC GTG TGG CAG CCA GCC TTCCCA
Thr Val Trp Gin Pra Ala PhePro
870875
ACC ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC
Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn
890
GAG AAT GAA ATT CCC ACT CA? GTT
Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val
905
GCA CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG
Ala Gin Lys Leu Lys Ser Asn Val
920925
TCC AAT GGT A\T TAT GAA AAA GAA
Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu
935940
ACC ACA AAA CCA ATG GCT C-CTCCT
Thr Thr Lys Ser Hec Ala AlaPro
950955
CTG GTG CTG GTG GTA ACC GCT CTG
Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu
970
ACA TCA TAGCTGCATT AAAAAAATAC
Thr Ser
GTTATCTGTT
ACAGTTCCAT
TTCGGGGCTT
TCCTGTTCTC TTGTATAGCT
TCAACTGGAA CATTTTTTTT
CTG TG
-41 CZ 296516 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 346 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein o
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
Leu 1 | Leu | Glu | Asp | Ser Pro 5 | Tyr | Glu Pro | Val 10 | Asn | Ser | Arg | Leu Ser 15 | Asp |
Ile | Phe | Arg | Val 20 | Val Pro | Phe | Ile Ser 25 | Val | Glu | His | Ile | Pro Lys 30 | Gly |
Asn | Asn | Cys 35 | Leu | Asp Ala | Ala | Lys Ala 40 | Cys | Asn | Leu | Asp 45 | Asp Ile | Cys |
Lys | Lys 50 | Tyr | Arg | Ser Ala | Tyr 55 | Ile Thr | Pro | Cys | Thr 60 | Thr | Ser val | Ser |
Asn 65 | Asp | Val | Cys | Asn Arg 70 | Arg | Lys Cys | His | Lys 75 | Ala | Leu | Arg Gin | Phe 80 |
Phe | Asp | Lys | Val | Pro Ala 65 | Lys | His Ser | Tyr 90 | Gly | Met | Leu | Phe Cys 95 | Ser |
cys | Arg | Asp | Xle 100 | Ala Cys | Thr | Glu Arg 105 | Arg | Arg | Gin | Thr | Ile Val 110 | Pro |
Val | cys | Ser 115 | Tyr | Glu Glu | Arg | Glu Lvs 120 | Pro | Asn | cys | Leu 125 | Asn Leu | Gin |
Asp | Ser 130 | Cys | I.ys | Tyr 135 | Ile Cys | Arg | Ser | Arg 140 | Leu | Ala Asp | Phe | |
Phe 145 | Thr | Asn | Cys | Gin Pro 150 | Glu | Ser Arg | Ser | Val 155 | Ser | Ser | Cys Leu | Lys 160 |
Glu | Asn | Tyr | Ala | Asp Cys 16 5 | Leu | Leu Ala | Tyr 170 | Ser | Gly | Leu | Ile Gly 175 | Thr |
Val | Met | Thr | Pro 1B0 | Asn Tyr | Ile | Aso Ser 165 | Ser | Ser | Leu | Ser | Val Ala 190 | Pro |
Trp | Cys | Asp 195 | Cys | Ser Asn | Ser | Gly Asn 2C0 | Asp | Leu | Glu | Glu 205 | Cys Leu | Lys |
Phe | Leu 210 | Asn | Phe | Phe Lys | Asp 215 | Asn Thr | Cys | Leu | Lys 220 | Asn | Ala Ile | Gin |
Ala 225 | Phe | Gly | Asn | Gly Ser 230 | Asp | Val Thr | Val | Trp 235 | Gin | Pro | Ala Phe | Pro 240 |
Val | Gin | Thr | Thr | Thr Ala 245 | Thr | Thr Thr | Thr 250 | Ala | Leu | Arg | Val Lys 255 | Asn |
Lys | Pro | Leu | Gly 260 | Pro Ala | Gly | Ser Glu 265 | Asn | Glu | Ile | Pro | Thr His 270 | Val |
Leu | Pro | Pro 275 | Cys | Ala Asn | Leu | Gin Ala 280 | Gin | Lys | Leu | Lys 285 | Ser Asn | Val |
-42CZ 296516 B6
Ser | Gly Asn 290 | 1 ..i | His | Leu | Cys 295 | Ile | Ser | Asn Gly Asn 300 | Tyr Glu | Lys | Glu | ||||
Gly | Leu | Gly | Ala | Ser | Ser | His | Ile | Thr | Thr | Lys | Ser | Met | Ala | Ala | Pro |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Pro | Ser | Cys | Gly | Leu | Ser | Pro | Leu | Leu | Val | Leu | Val | Val | Thr | Ala | Leu |
32S | 330 | 335 |
Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu
340
Thr Ser
345 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1682 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 118...1497 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
GGGCC-GCCAG AGCAGCACAG CTGTCCGGC-G ATCGCTGCAT GCTGAGCTCC CTCGGCAAGA 60
CCCAGCGGCG GCTCGGG.-.TT TTTTTGGGGG GC-CGGC-GACC AGCCCCGCGC CGGCACC
165 | ATG TTC | CTG Leu | C-CG A1& 350 | ACC CTG | TAC TTC GCG CTG | CCG CTC TTG | GAC A.sp 360 | TTG Leu | CTC Leu | |||||||
Ke z | Phe | Thr | Leu | Tyr | Phe | Ala 355 | Leu | |||||||||
Pro | Leu Leu | |||||||||||||||
CTG | TCG | GCC | GAA | GTG | AGC | C-GC | GGA | GAC | CGC | CTG | GAT | TGC | GTG | AAA | GCC | |
213 | ||||||||||||||||
Leu | Ser | Ala | Glu | Val | Ser | Gly | Gly | Asp | Arg | Leu | Asp | Cys | Val | Lys | Ala | |
365 | 370 | 375 | ||||||||||||||
AGT | GAT | CAG | TGC | CTG | A—AG | GAG | CAG | AGC | TGC | AGC | ACC | AAG | TAC | CGC | ACG | |
261 | ||||||||||||||||
Ser | Asp | Gin | Cys | Leu | Lys | Glu | Gin | Ser | Cys | Ser | Thr | Lys | Tyr | Arg | Thr | |
300 | 3S5 | 390 | ||||||||||||||
CTA | AGG | CAG | TGC | GTG | GCG | GGC | AAG | GAG | ACC | AAC | TTC | AGC | CTG | GCA | TCC | |
309 | ||||||||||||||||
Leu | Arg | Gin | Cys | Val | Ala | Gly | Lys | Glu | Thr | Asn | Phe | Ser | Leu | Ala | Ser | |
395 | 400 | 405 | 410 | |||||||||||||
GGC | CTG | GAG | GCC | AAG | GAT | GAG | TGC | CGC | AGC | GCC | ATG | GAG | GCC | CTG | AAG | |
357 | ||||||||||||||||
Gly | Leu | Glu | Ala | Lys | Asp | Glu | cys | Arg | Ser | Ala | Met | Glu | Ala | Leu | Lys | |
415 | 420 | 425 | ||||||||||||||
CAG | AAG | TCG | CTC | TAC | AAC | TGC | CGC | TGC | AAG | CGG | GGT | ATG | AAG | AAG | GAG | |
405 | ||||||||||||||||
Gin | Lys | Ser | Leu | Tyr | Asn | Cys | Arg | Cys | Lys | Arg | Gly | Met | Lys | Lys | Glu |
-43 CZ 296516 B6
420 | 435 | 440 | ||||||||||||
AAG | AAC | 4 | CTG | CGC | ATT | TAC | í -r j | AGC | ATG | TAC | CAG | AGC | CTG | CAG |
Lys | Asn | cys | Leu | Arg | Ile | ‘ JT - | Trp | Ser | Met | Tyr | Gin | Ser | Leu | Gin |
445 | 450 | 455 | ||||||||||||
AAT | GAT | CTG | CTG | GAG | GAT | TCC | CCA | TAT | GAA | CCA | GTT | AAC | AGC | AGA |
Asn | Asp | Leu | Leu | Glu | Asp | Ser | Pro | Tyr | Glu | Pro | Val | Asn | Ser | Arg |
450 | 4 6 5 | 470 | ||||||||||||
TCA | GAT | AT A | TTC | CGG | GTG | GTC | CCA | TTC | ATA | TCA | GTG | GAG | CAC | ATT |
Ser | Asp | Ile | Phe | Arg | Val | Val | Pro | Phe | Ile | Ser | Val | Glu | His | Ile |
475 | 430 | 485 | ||||||||||||
ΑΛΑ | GGG | AAC | AAC | TGC | CTG | GAT | GCA | GCG | AAG | GCC | TGC | AAC | CTC | GAC |
Lys | Gly | Asn | Asn | Cys | Leu | Asp | Ala | Ala | Lys | Ala | Cys | Asn | Leu | Asp |
4S5 | 500 | 505 | ||||||||||||
ATT | TGC | AAG | AAG | TAC | AGG | TCG | GCG | TAC | ATC | ACC | CCG | TGC | ACC | ACC |
Ile | Cys | Lys | Lys | Tyr | Arg | Ser | Ala | Tyr | Ile | Thr | Pro | Cys | Thr | Thr |
510 | 515 | 520 | ||||||||||||
GTG | TCC | A_-C | GAT | GTC | TGC | AAC | CGC | CGC | AAG | TGC | CAC | AAG | GCC | CTC |
Val | Ser | Asn | Asp | Val | Cys | Asn | Ar a | Arg | Lys | cys | His | Lvs | Ala | Leu |
525 | 53 Ó | 535 | ||||||||||||
CAG | TTC | 1 4 — | GAC | * * r* .J | GTC | CCG | GCC | AAG | CAC | AGC | TAC | GGA | ATG | CTC |
C-ln | Fhe | Phe | Asp | Lys | Val | Pro | Ala | Lys | His | Ser | Tyr | Gly | Met | Leu |
540 | 54 5 | 550 | ||||||||||||
TGC | TCC | TGC | CC-G | GAC | ATC | GCC | TGC | ACA | GAG | CC-G | AGG | CGA | CAG | ACC |
Cys | Ser | cys | Arg | Asp | Ile | Ala | cys | Thr | Glu | Arg | Arg | Arg | Gin | Thr |
555 | 560 | 565 | ||||||||||||
GTG | CCT | C-TG | TC-C | TCC | TAT | GAA | GAG | AGG | GAG | AAG | CCC | AAC | TGT | TTG |
Val | Pro | Val | Cys | Ser | Tyr | Glu | Glu | Arg | Glu | Lys | Pro | Asn | Cys | Leu |
575 | 530 | 565 | ||||||||||||
TTG | CAG | GAC | TCC | ACG | A.-.T | TAC | ATC | TGC | AGA | TCT | CGC | CTT | ||
Leu | Gin | Asp | Ser | Cys | Lys | Thr | Asn | Tyr | Ile | Cys | Arg | Ser | Arg | Leu |
550 | 595 | 600 | ||||||||||||
GAT | TTT | TTT | ACC | AAC | TC-C | CAG | CCA | GAG | TCA | AGG | TCT | GTC | AGC | AGC |
Asp | Phe | Phe | Thr | Asn | Cys | Gin | Pro | Glu | Ser | Arg | Ser | Val | Ser | Ser |
605 | 610 | 615 | ||||||||||||
CTA | GA-A | AAC | TAC | GCT | GAC | TGC | CTC | CTC | GCC | TAC | TCG | GGG | CTT | |
Leu | Lys | Glu | Asn | Τ'/r | Ala | Asp | Cys | Leu | Leu | Ala | Tyr | Ser | Gly | Leu |
62 0 | 625 | 630 | ||||||||||||
GGC | ACA | GTC | A7G | ACC | CCC | AAC | TAC | ATA | GAC | TCC | AGT | AGC | CTC | AGT |
Gly | Thr | Val | Met | Thr | Pro | Asn | Ile | Asp | Ser | Ser | Ser | Leu | Ser |
-44CZ 296516 B6
635 | 640 | 645 | 650 | ||||||||||||
GCC | CCA | TGG | TGT | GAC | TGC | AGC | AAC | AGT | GGG | AAC | GAC | CTA | GAA | GAG | TGC |
1077 | |||||||||||||||
Al & | Pro | Trp | Cys | Asp | Cys | Ser | Asn | Ser | Gly | Asn | Asp | Leu | Glu | Glu | Cys |
655 | 660 | 665 | |||||||||||||
TTG | AAA | TTT | TTG | AAT | TTC | TTC | AAG | GAC | AAT | ACA | TGT | CTT | AAA | AAT | GCA |
1125 | |||||||||||||||
Leu | Lys | Phe | Leu | Asn | Phe | ?he | Lys | Asp | Asn | Thr | Cys | Leu | Lys | Asn | Ala |
670 | 675 | 680 | |||||||||||||
ATT | CAA | GCC | TTT | GGC | AAT | GGC | TCC | GAT | GTG | ACC | GTG | TGG | CAG | CCA | GCC |
1173 | |||||||||||||||
Ile | Gin | Ala | Phe | Gly | Asn | Gly | Ser | Asp | Val | Thr | Val | Trp | Gin | Pro | Ala |
685 | 690 | 695 | |||||||||||||
TTG | CCA | GTA | CAG | ACC | ACC | ACT | GCC | ACT | ACC | ACC | ACT | GCC | CTC | CGG | GTT |
1221 | |||||||||||||||
Phe | Pro | Val | Gin | Thr | Thr | Thr | Ala | Thr | Thr | Thr | Thr | Ala | Leu | Arg | Val |
700 | 705 | 710 | |||||||||||||
AAG | AAC | AAG | CCC | CTG | GGG | CCA | GCA | GGG | TCT | GAG | AAT | GAA | ATT | CCC | ACT |
1269 | |||||||||||||||
Lys | Asn | Lys | Pro | Leu | Gly | Pro | Ala | Gly | Ser | Glu | Asn | Glu | Ile | Pro | Thr |
715 | 720 | 725 | 730 | ||||||||||||
CAT | GTT | TTG | CCA | CCG | TGT | GCA | AAT | TTA | CAG | GCA | CAG | AAG | CTG | AAA | TCC |
1317 | |||||||||||||||
His | Val | Leu | Pro | Pra | Cys | Ala | Asn | Leu | Gin | Ala | Gin | Lys | Leu | Lys | Ser |
735 | 740 | 745 | |||||||||||||
AAT | GTG | TCG | GGC | AAT | ACA | CAC | CTC | TGT | ATT | TCC | AAT | GGT | AAT | TAT | GAA |
1365 | |||||||||||||||
Asn | Val | Ser | Gly | Asn | Thr | His | Leu | Cvs | Ile | Ser | Asn | Gly | A.sr. | Tyr | Glu |
750 | 755 | 760 | |||||||||||||
AAA | GAA | GGT | CTC | GGT | C-CT | TCC | AGC | CAC | ATA | ACC | ACA | AAA | TCA | ATG | GCT |
1413 | |||||||||||||||
Lys | Glu | Gly | Leu | Gly | Ala | Ser | Ser | His | Ile | i Γ*Χ | Thr | Lys | Ser | Met | Ala |
765 | 770 | 775 | |||||||||||||
GCT | CCT | CCA | AGC | TGT | GGT | CTG | AGC | CCA | CTG | CTG | GTC | CTG | GTG | C-TA | ACC |
1461 | |||||||||||||||
Ala | Pro | Pro | Ser | cys | Gly | Leu | Ser | Pro | Leu | Leu | Val | Leu | Val | Val | Thr |
760 | 785 | 790 | |||||||||||||
GCT | CTG | TCC | ACC | ČTA | TTA | TCT | TTA | ACA | GAA | ACA | TCA | TAGCTGCATT | |||
1507 | |||||||||||||||
Ala | Leu | Ser | Thr | Leu | Leu | Ser | Leu | Thr | Glu | Thr | Ser | ||||
795 | 600 | 805 |
AAAAAAATAC 1567 | AA7ATGGACA | TGTAAAAAGA | CAAAAACCAA | GTTATCTGTT | TCCTGT7CTC |
TTGTATAGCT 1627 | GAAATTCCAG | TTTAGGAGCT | CAGTTGAGAA | ACAGTTCCAT | TCAACTGGAA |
CATTTTTTTT | TTTTCCTTTT | AAGAAAGCTT | CTTGTGATCC | TTCGGGGCTT | CTG TG |
1652 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 460 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineami
-45CZ 296516 B6 (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
Met 1 | Phe | Leu | Ala | Thr 5 | Leu | Tyr | Phe | Ala | Leu 10 | Pro | Leu | Leu | Asp | Leu 15 | Leu |
Leu | Ser | Ala | Glu | Val | Ser | Gly | Gly | Asp | Arg | Leu | Asp | Cys | Val | Lys | Ala |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Ser | Asp | Gin | Cys | Leu | Lys | Glu | Gin | Ser | cys | Ser | 1 ΠΤ | Lys | Tyr | Arg | Thr |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Leu | Arg | Gin | Cys | Val | Ala | Gly | Lys | Glu | Thr | Asn | Phe | Ser | Leu | Ala | Ser |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gly | Leu | Glu | Ala | Lys | Asp | Glu | Cys | Arg | Ser | Ala | Met | Glu | Ala | Leu | Lys |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Gin | Lys | Ser | Leu | Tyr | Asn | Cys | Arg | Cys | Lys | Arg | Gly | Met | Lys | Lys | Glu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Lys | Asn | Cys | Leu | Arg | Ile | Tyr | Trp | Ser | Met | Tyr | Gin | Ser | Leu | Gin | Gly |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Asn | Asp | Leu | Leu | Glu | Asp | Ser | Pro | Tyr | Glu | Pro | Val | Asn | Ser | Arg | Leu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ser | Asp | Ile | Phe | Are | Val | Val | Pro | Phe | Ile | Ser | Val | Glu | His | Ile | Fro |
13 0 | 135 | 140 | |||||||||||||
Lys | Gly | Asn | Asn | Cys | Leu | Asp | Ala | Ala | Lys | Al d | Cys | Asn | Leu | Asp | Asp |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ile | Cys | Lys | Lys | Tyr | Arg | Ser | Tyr | Ile | Thr | Pro | Cys | Thr | Thr | Ser | |
165 | 170 | 17 5 | |||||||||||||
Val | Ser | Asn | Aso | Val | Cys | Asn | Arg | Arg | Lys | Cys | Eis | Lys | Ala | Leu | Arg |
1 = 3 | 185 | 190 | |||||||||||||
Gin | Phe | Phe | Asp | Lys | Val | Pro | Ala | Lys | His | Ser | Tyr | Gly | Met | Leu | Phe |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Cys | Ser | Cys | Arg | As? | Ile | Ala | Cys | Thr | Glu | Arg | Arg | Arg | Gin | Thr | Ile |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Val | Pro | Val | Cys | Ser | Tyr | Glu | Glu | Arg | Glu | Lys | Pro | Asn | Cys | Leu | Asn |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Leu | Gin | Asp | Ser | Cys | Lys | Thr | Asn | Tyr | Ile | Cys | Arg | Ser | Arg | Leu | Ala |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Asp | Phe | Phe | Thr | Asn | Cys | Gin | Pro | Glu | Ser | Arg | Ser | Val | Ser | Ser | Cys |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Leu | Lys | Glu | Asn | Tyr | Ala | Asp | Cys | Leu | Leu | Ala | Tyr | Ser | Gly | Leu | ile |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Gly | Thr | Val | Met | Thr | Pro | Asn | Tyr | Ile | Asp | Ser | Ser | Ser | Leu | Ser | Val |
290 | 29S | 300 |
-46CZ 296516 B6
Ala 3C5 | Pro | Trp | Cys | Asp | Cys 310 | Ser | Asn | Ser | Gly | Asn 315 | Asp | Leu | Glu | Glu | Cys 320 |
Leu | Lys | Phe | Leu | Asn | Phe | Phe | Lys | Asp | Asn | Thr | Cys | Leu | Lys | Asn | Ala |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ile | Gin | Ala | Phe | Gly | Asn | Gly | Ser | Asp | Val | Thr | Val | Trp | Gin | Pro | Ala |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Phe | Pro | Val | Gin | Thr | Thr | Thr | Ala | Thr | Thr | Thr | Thr | Ala | Leu | Arg | Val |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Lys | Asn | Lys | Pro | Leu | Gly | Pro | Ala | Gly | Ser | Glu | Asn | Glu | Ile | Pro | Thr |
3 70 | 375 | 380 | |||||||||||||
His | Val | Leu | Pro | Pro | cys | Ala | Asn | Leu | Gin | Ala | Gin | Lys | Leu | Lys | Ser |
365 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Asn | Val | Ser | Gly | Asn | Thr | Hí s | Leu | Cys | Ile | Ser | Asn | Gly | Asn | Tyr | Glu |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Lys | Glu | Gly | Leu | Gly | Ala | Ser | Ser | His | Ile | Thr | Thr | Lys | Ser | Met | Ala |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Ala | Pro | Pro | Ser | Cys | Gly | Leu | Ser | Pro | Leu | Leu | Val | Leu | Val | Val | Thr |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Ala | Leu | Ser | Thr | Leu | Leu | Ser | Leu | Thr | Glu | Thr | Ser |
450 455 460 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1888 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 25...1416 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
AAAAAACGGT GGGA7TTATT TAAC A TG ATC TTG GGA AAC GTC TTC TGC CTC
Met Ile Leu Ala Asn Val Phe Cys Leu
465
TTC | TTT | CTA | GAC | GAG | ACC | CTC | CGC | TCT | TTG | GCC | AGC | CCT | TCC | TCC | |
Phe 470 | Phe | Phe | Leu | Asp | Glu 475 | Thr | Leu | Arg | Ser | Leu 480 | Ala | Ser | Pro | Ser | Ser 485 |
CTG | CAG | GGC | CCC | GAG | CTC | CAC | GGC | TGG | CGC | CCC | CCA | GTG | GAC | TGT | GTC |
Leu | Gin | Gly | Pro | Glu 490 | Leu | His | Gly | Trp | Arg 495 | Pro | Pro | Val | Asp | cys 500 | Val |
CGG | GCC | AAT | GAG | CTG | TGT | C-CC | GCC | GAA | TCC | AAC | TGC | AGC | TCT | CGC | TAC |
195
-47CZ 296516 Β6
Arg | Ala | Asn Glu 505 | Leu | cys | Ala | Ala | Glu S10 | Ser | Asn Cys | Ser | Ser 515 | Arg | Tyr | ||
CGC | ACT | CTG | CGG | CAG | TGC | CTG | GCA | GGC | CGC | GAC | CGC | AAC | ACC | ATG | CTG |
Arg | Thr | Leu 520 | Arg | Gin | cys | Leu | Ala 525 | Gly | kzg | Asp | Arg | Asn 530 | Thr | Met | Leu |
GCC | AAC | AAG | GAG | TGC | CAG | GCG | GCC | TTG | GAG | GTC | TTG | CAG | GAG | AGC | CCG |
Ala | Asn 535 | Lys | Glu | cys | Gin | Ala 540 | Ale | Leu | Glu | Val | Leu 545 | Gin | Glu | Ser | Pro |
CTG | TAC | GAC | TGC | CGC | TGC | AAG | CC-G | GGC | ATG | AAG | AAG | GAG | CTG | CAG | TGT |
Leu 550 | Tyr | Asp | Cys | Arg | cys 555 | Lys | Arg | Gly | Met | Lys S60 | Lys | Glu | Leu | Gin | Cys 565 |
CTG | CAG | ATC | TAC | TC-G | AGC | ATC | CAC | CTG | GGG | CTG | ACC | GAG | C-GT | GAG | GAG |
Leu | Gin | Ile | Tyr | Trp 570 | Ser | Ile | His | Leu | Gly 575 | Leu | Thr | Glu | Gly | Glu 580 | Glu |
TTC | TAC | GAA | GCC | TCC | CCC | TAT | GAG | CCG | GTG | ACC | TCC | CGC | CTC | TCG | GAC |
Phe | Tyr | Glu | Ala 5E5 | Ser | Pro | Tyr | Glu | Pro 550 | Val | Thr | Ser | Arg | Leu 595 | Ser | Asp |
ATC | TTC | AGG | CTT | GCT | TCA | ATC | TTC | TCA | GGG | ACA | GGG | GCA | GAC | CCG | GTG |
Ile | Phe | Arg 600 | Leu | Ala | Ser | Ile | Phe 605 | Ser | Gly | Thr | Gly | Ala 610 | Asp | Pro | Val |
GTC | AGC | GCC | AAG | AGC | AAC | CAT | TGC | CTG | GAT | GCT | GCC | AAG | GCC | TGC | AAC |
Val | Ser 615 | Ala | Lys | Ser | Asn | His 620 | Cys | Leu | ASp | Ala | Ala 625 | Lys | Ala | cys | Asn |
CTG | AAT | GAC | AAC | TGC | AAG | AAG | CTG | CGC | TCC | TCC | TAC | ATG | TCC | ATC | TGC |
Leu 63 0 | Asn | Asp | Asn | Cys | Lvs 635 | Lys | Leu | Arg | Ser | Ser 640 | Tyr | Ile | Ser | Ile | Cvs 645 |
AAC | CGC | GAG | ATC | TCG | CCC | ACC | GAG | CGC | TGC | AAC | CGC | CGC | AAG | TGC | CAC |
Asn | Arg | Glu | Ile | Ser 6 = 0 | Pro | Thr | Glu | Arg | Cys 655 | Asn | Arg | Arg | Lys | Cys 660 | His |
AAG | GCC | CTG | CGC | CAG | TTC | TTC | GAC | CGG | GTG | CCC | AGC | GAG | TAC | ACC | TAC |
Lys | Ala | Leu | Arg 665 | Gin | Phe | Phe | Asp | Arg 670 | Val | Pro | Ser | Glu | Tyr 675 | Thr | Tyr |
CGC | ATG | CTC | TTC | TGC | TCC | TGC | CAA | GAC | CAG | GCG | TGC | GCT | GAG | CGC | CGC |
Arg | Met | Leu 6S0 | Phe | Cys | Ser | Cys | Gin 6S5 | Asp | Gin | Ala | Cys | Ala 690 | Glu | Arg | Arg |
CGG | CAA | ACC | ATC | CTG | CCC | AGC | TGC | TCC | TAT | GAG | GAC | AAG | GAG | AAG | CCC |
Arg | Gin 695 | Thr | Ile | Leu | Pro | Ser 700 | Cys | Ser | Tyr | Glu | Asp 705 | Lys | Glu | Lys | Pro |
AAC | TGC | CTG | GAC | CTG | CGT | GGC | GTG | TGC | CGG | ACT | GAC | CAC | CTG | TGT | CGG |
-48CZ 296516 B6
Asn | Cys | Leu | Asp | Leu | Arg Gly Val 715 | Cys | Arg | Thr 720 | Asp | His | Leu | Cys | Arg 725 | ||
710 | |||||||||||||||
TCC | CGG | CTG | GCC | GAC | TTC | CA | GCC | AAT | TGT | CGA | GCC | TCC | TAC | CAG | ACG |
867 | |||||||||||||||
Ser | Arg | Leu | Ala | Asp 730 | Phe | His | Ala | Asn | Cys 735 | Arg | Ala | Ser | Tyr | Gin 740 | Thr |
GTC | ACC | AGC | TGC | CCT | GCG | GAC | AAT | TAC | CAG | GCG | TGT | CTG | GGC | TCT | TAT |
915 | |||||||||||||||
Val | Thr | Ser | cys 745 | Pro | Ala | Asp | Asn | Tyr 750 | Gin | Ala | Cys | Leu | Gly 755 | Ser | Tyr |
GCT | GGC | ATG | AT? | GGG | TTT | GAC | ATG | ACA | CCT | AAC | TAT | GTG | GAC | TCC | AGC |
963 | |||||||||||||||
Ala | Gly | Met 760 | Ile | Gly | Phe | Asp | Met 765 | Thr | Pro | Asn | Tyr | Val 770 | Asp | Ser | Ser |
CCC | ACT | GGC | ATC | GTG | GTG | TCC | CCC | TGG | TGC | AGC | TGT | CGT | GGC | AGC | GGG |
1011 | |||||||||||||||
Pro | Thr 775 | Gly | Ile | Val | val | Ser 780 | Pro | Trp | Cys | Ser | Cys 785 | Arg | Gly | Ser | Gly |
AAC | ATG | GAG | GAG | GAG | TGT | GAG | AAG | TTC | CTC | AGG | GAC | TTC | ACC | GAG | AAC |
1059 | |||||||||||||||
Asn 790 | Met | Glu | Glu | Glu | cys 795 | Glu | Lys | Phe | Leu | Arg 800 | Asp | Phe | Thr | Glu | Asn 805 |
CCA | TGC | CTC | CGG | AAC | GCC | ATC | CAG | GCC | TTT | GGC | AAC | GGC | ACG | GAC | GTG |
1107 | |||||||||||||||
Pro | cys | Leu | Asn 810 | Ala | Ile | Gin | Ala | Pne 815 | Gly | Asn | Gly | Thr | Asp 820 | Val | |
AAC | GTG | TCC | CCA | AAA | C-GC | CCC | TCG | TTC | CAG | GCC | ACC | CAG | GCC | CCT | CGG |
1155 | |||||||||||||||
Asn | Val | Ser | Pro 825 | Lys | C-ly | Pro | Ser | Phe 830 | Gin | Ala | Thr | Gin | Ala 835 | Pro | Arg |
GTG | GAG | AAG | ACG | CCT | TCT | TTG | CCA | GAT | GAC | CTC | AGT | GAC | AGT | ACC | AGC |
1203 | |||||||||||||||
Val | Glu | Lys 840 | i r.r | Pro | Ser | Leu | Pro 845 | Asp | Asp | Leu | Ser | Asp 850 | Ser | inr | Ser |
TTG | GC-G | ACC | AGT | GTC | ATC | ACC | ACC | TGC | ACG | TCT | GTC | CAG | GAG | CAG | GGG |
1251 | |||||||||||||||
Leu | Glv 855 | Thr | Ser | Val | Ile | Thr 860 | Thr | Cys | Thr | Ser | Val 865 | Gin | Glu | Gin | Gly |
CTG | AAG | GCC | AAC | AAC | TCC | AAA | GAG | orr * 1 1 Λ | AGC | ATG | TGC | TTC | ACA | GAG | CTC |
1299 | |||||||||||||||
Leu 870 | Lys | Ala | Asn | Asn | Ser 875 | Lys | Glu | Leu | Ser | Met 880 | Cys | Phe | Thr | Glu | Leu 885 |
ACG | ACA | AAT | ATC | ATC | CCA | GC-G | AGT | AAC | AAG | GTG | ATC | AAA | CCT | AAC | TCA |
1347 | |||||||||||||||
Thr | Thr | Asn | Ile | Ile 890 | Pro | Gly | Ser | Asn | Lys 895 | Val | Ile | Lys | Pro | Asn 900 | Ser |
GGC | CCC | AGC | AGA | GCC | AGA | CCG | TCG | GCT | GCC | TTG | ACC | GTG | CTG | TCT | GTC |
1395 | |||||||||||||||
Gly | Pro | Ser | Arg 905 | Ala | Arg | Pro | Ser | Ala 910 | Ala | Leu | Thr | Val | Leu 915 | Ser | Val |
TTG TAGGCTGTGG GAACCGAGTC AGAAGATTTT
CTG ATG CTG AAA CTG GCC 1446
Leu Met Leu Lys Leu Ala Leu
920
-49CZ 296516 B6
AAA G CT AC 15C6 | GCAGACAAGA | ACAGCCGCCT | GACGA-AATGG | AAACACACAC | AGACACACAC |
ACACCTTGCA 1565 | TGTTTTTCCC | ACCTTGTCGC | TGAACC7GTC | TCCTCCCAGG | |
TTTCTTCTCT 1626 | GGAGAAC-TTT | TTGTAAACCA | AACAGACAAG | CAGGCAGC-CA | GCCTGAGAGC |
GCrG C C C A CGGG 16 86 | GTCCCCTGGC | AGGGG AAAC T | CTGGTGCCGG | GGAC-GGCACG | AGGCTCTAGA |
AA7C-CCCTTC 174 6 | ACTTTCTCCT | GGTGTTTTTC | TCTCTGGACC | CTTCTGAJ-GC | AGAGACCGGA |
CAAGAGCCTG 1806 | CAGCGGAAC-G | GACTCTGGGC | TGTC-CCTGAG | GCTC-GCTGGG | GGCAGGACAA |
CACAGCTC-CT 1566 GGTCAGCGGG 1556 | TCCCCAGGC7 G CA GC G-GGAj C | GCCCACTCTG TG | GGGACCCGCT | GGC-GGCTGGC | AGAGC-GCATC |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 464 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární o
(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
Met 1 | Ile Leu | Ala | Asn c | Val | Phe | cys | Leu | Phe 10 | Phe | Phe | Leu | Asp | Glu 15 | Thr | |
Leu | Arg | Ser | Leu | Ala | Ser | Pro | Ser | Ser | Leu | Gin | Gly | Pro | Glu | Leu | Eis |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | Trp | Arg | Pro | Pro | Val | Asp | Cys | Val | Arg | Ala | Asn | Glu | Leu | cys | Ala |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Ala | Glu | Ser | Asn | cys | Ser | Ser | Arg | Tyr | Arg | Thr | Leu | Arg | Gin | Cys | Leu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ala | Gly | Arg | Asp | Arg | Asn | Thr | Met | Leu | Ala | Asn | Lys | Glu | Cys | Gin | Ala |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ala | Leu | Glu | Val | Leu | Gin | Glu | Ser | Pro | Leu | Tyr | Asp | cys | Arg | Cys | Lys |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Arg | Gly | Met | Lys | Lys | Glu | Leu | Gin | Cys | Leu | Gin | Ile | Tyr | Trp | Ser | Ile |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
His | Leu | Gly | Leu | Thr | Glu | Gly | Glu | Glu | Phe | Tyr | Glu | Ala | Ser | Pro | Tyr |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Glu | Pro | Val | Thr | Ser | Arg | Leu | Ser | Asp | Ile | Phe | Arg | Leu | Ala | Ser | Ile |
130 | 135 | 140 |
-50CZ 296516 B6
Phe 145 | Ser | Gly | - | Gly | Ala 150 | Asp | Pro | Val | Va 1 | Ser 155 | Ala | Lys | Ser | Asn | His 160 |
cys | Leu | Asp | Ala | Ala | Lys | Ala | Cys | Asn | Leu | Asn | Asp | Asn | Cys | Lys | Lys |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Leu | Arg | Ser | Ser | Tyr | Ile | Ser | Ile | Cys | Asn | Arg | Glu | Ile | Ser | Pro | Thr |
160 | 185 | 190 | |||||||||||||
Glu | Arg | Cys | Asn | Arg | Arg | Lys | Cys | His | Lys | Ala | Leu | Arg | Gin | Phe | Phe |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Asp | Arg | Val | Pro | Ser | Glu | Tyr | Thr | Tyr | Arg | Met | Leu | Phe | Cys | Ser | Cys |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Gin | Asp | Gin | Ala | Cys | Ala | Glu | Arg | Arg | Arg | Gin | Thr | Ile | Leu | Pro | Ser |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Cys | Ser | Tyr | Glu | Asp | Lys | Glu | Lys | Pro | Asn | Cys | Leu | Asp | Leu | Arg | Gly |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Val | Cys | Arg | Thr | Asp | His | Leu | cys | Arg | Ser | Arg | Leu | Ala | Asp | Phe | His |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Ala | Asn | Cys | Arg | Ala | Ser | Tyr | Gin | Thr | Val | Thr | Ser | cys | Pro | Ala | Asp |
275 | 260 | 285 | |||||||||||||
Asn | Tyr | Gin | Ala | Cys | Leu | Gly | Ser | Tyr | Ala | Gly | Met | Ile | Gly | Phe | Asp |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Met | Thr | Pro | Asn | Tyr | Val | Asp | Ser | Ser | Pro | Thr | Gly | Ile | Val | Val | Ser |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Pro | Trp | Cys | Ser | Cys | A-g | Gly | Ser | Gly | Asn | Met | Glu | Glu | Glu | Cys | Glu |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Lys | Phe | Leu | Arg | Asp | Phe | Thr | Glu | Asn | Pro | Cys | Leu | Arg | Asn | Ala | Ile |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Gin | Ala | Phe | c-iy | Asn | Gly | T Γ; T | Asp | Val | Asn | Val | Ser | Pro | Lys | Gly | Pro |
355 | 3 60 | 365 | |||||||||||||
Ser | Phe | Gin | Ala | Thr | Gin | Ala | Pro | Arg | Val | Glu | Lys | «V- <_» 4 Ui | Pro | Ser | Leu |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Pro | Asp | Asp | Leu | Ser | Asp | Ser | Thr | Ser | Leu | Gly | Thr | Ser | Val | Ile | Thr |
365 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Thr | Cys | Thr | Ser | Val | Gin | Glu | Gin | Gly | Leu | Lys | Ala | Asn | Asn | Ser | Lys |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Glu | Leu | Ser | Met | cys | Phe | Thr | Glu | Leu | Thr | Thr | Asn | Ile | Ile | Pro | Gly |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Ser | Asn | Lys | Val | Ile | Lys | Fro | Asn | Ser | Gly | Pro | Ser | Arg | Ala | Arg | Pro |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Ser | Ala | Ala | Leu | Thr | Val | Leu | Ser | Val | Leu | Met | Leu | Lys | Leu | Ala | Leu |
450 | 455 | 460 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1878 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché ío (D) TOPOLOGIE: lineární
-51 CZ 296516 B6 (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 205...1242 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
CGCGGCGCCC AGCGCAGGCA GAGCGCTGTC GCATCCCGGG CGTCCACCCG CCATGGGGCT
CTCCTGGAGC CCGCGACCTC CACTGCTGAT GATCCTGCTA CTGGTGCTGT CGTTGTGGCT 120
GCCACTTGGA GCAGGAAACT CCCTTGCCAC AGAGAACAGG TTTGTGAACA GCTGTACCCA 180
GGCCAGAAAG AAATGCGAGG CTAA TCC CGC TTG CAA GGC TGC CTA CCA GCA 231
Ser Arg Leu Gin Gly Cys Leu Pro Ala
465 470
279 | CCT Pro | GGG CTC | CTG CAC CTC CAG TTA | AGC AGG CCG CTG CCC TTA C-AG | GAG Glu | ||||||||||||
Leu His | Leu Gin Leu 4S0 | Ser | Arg | Pro | Leu 485 | Pro | Leu | Glu | |||||||||
Gly 475 | Leu | ||||||||||||||||
TCT | GCC | ATG | TCT | GCA | GAC | TC-C | CTA | GAG | GCA | GCA | GAA | CAA | CTC | AGG | AAC | ||
327 | |||||||||||||||||
Ser | Ala | Met | Ser | Ala | A.sn | Cys | Leu | Glu | Ala | Ala | Glu | Gin | Leu | Arg | Asn | ||
490 | 495 | 500 | 505 | ||||||||||||||
AGC | TCT | CTG | ATA | GAC | TGC | AGG | TGC | CAT | CGG | CGC | ATG | AAG | CAC | CAA | GCT | ||
375 | |||||||||||||||||
Ser | Ser | Leu | Ile | Asp | Cys | Arg | Cys | His | Arg | Arg | Met | Lys | His | Gin | Ala | ||
510 | 515 | 520 | |||||||||||||||
ACC | TGT | CTG | GAC | ATT | TAT | TGG | ACC | GTT | CAC | CCT | GCC | CGA | AGC | CTT | GGT | ||
423 | |||||||||||||||||
Thr | Cys | Leu | Asp | Xle | Tyr | Trp | Thr | Val | His | Pro | Ala | Arg | Ser | Leu | Gly | ||
525 | 530 | 535 | |||||||||||||||
GAC | TAC | GAG | TTG | GAT | GTC | TCA | CCC | TAT | GAA | GAC | ACA | GTG | ACC | AGC | AAA | ||
471 | |||||||||||||||||
Asp | Tyr | Glu | Leu | Asp | Val | Ser | Pro | Tyr | Glu | Asp | Thr | Val | Thr | Ser | Lys | ||
540 | 545 | 550 | |||||||||||||||
CCC | TGG | AAA | ATG | AAT | CTT | AGC | AAG | TTG | AAC | ATG | CTC | AAA | CCA | GAC | TCG | ||
519 | |||||||||||||||||
Pro | Trp | Lys | Met | Asn | Leu | Ser | Lys | Leu | Asn | Met | Leu | Lys | Pro | Asp | Ser | ||
555 | 560 | 565 | |||||||||||||||
GAC | CTC | TGC | CTC | AAA | TTT | C-CT | ATG | CTG | TGT | ACT | CTT | CAC | GAC | AAG | TGT | ||
567 | |||||||||||||||||
Asp | Leu | Cys | Leu | Lys | Phe | Ala | Met | Leu | Cys | Thr | Leu | His | Asp | Lys | Cys | ||
10 | 570 | 575 | 580 | 585 |
-52CZ 296516 B6
615 | GAC CGC CTG | CGC Arg | AAG GCC | TAC GGG GAG GCA | TGC Cys | TCA GGG ATC CGC | TGC cys | |||||||||
Tyr | Gly | Glu | Ala 595 | Ser | Gly Ile | Arg 600 | ||||||||||
Asp | Arg Leu | Lys 590 | Ala | |||||||||||||
CAG | CGC | CAC | CTC | TGC | CTA | GCC | CAG | CTG | CGC | TCC | TTC | TTT | GAG | AAG | GCA | |
663 | ||||||||||||||||
Gin | Arg | His | Leu | Cys | Leu | Ala | Gin | Leu | Arg | Ser | Phe | Phe | Glu | Lys | Ala | |
605 | 610 | 615 | ||||||||||||||
GCA | GAG | TCC | CAC | GCT | CAG | GGT | CTG | CTG | CTG | TGT | CCC | TGT | GCA | CCA | GAA | |
711 | ||||||||||||||||
Ala | Glu | Ser | His | Ala | Gin | Gly | Leu | Leu | Leu | cys | Pro | cys | Ala | Pro | Glu | |
620 | 625 | 630 | ||||||||||||||
GAT | GCG | GGC | TGT | C-GG | GAG | CGG | CGG | CGT | AAC | ACC | ATC | GCC | CCC | AGT | TC-C | |
759 | ||||||||||||||||
Asp | Ala | Gly | cys | Gly | Glu | Arg | Arg | Arg | Asn | Thr | Ile | Ala | Pro | Ser | cys |
635 640 645
GCC CTG CCT TCT GTA ACC CCC AAT TGC CTG GAT CTG CGG AGC TTC TGC 807
Ala Leu 650 | Pro | Ser Val | Thr 655 | Pro | Asn | cys | Leu Asp Leu Arg 660 | Ser | Phe | Cys 665 | ||||||
CGT | GCG | GAC | CCT | TTG | TGC | AGA | TCA | CGC | CTG | ATG | GAC | TTC | CAG | ACC | CAC | |
855 | ||||||||||||||||
Arg | Ala | Asp | Pro | Leu | Cys | Arg | Ser | Arg | Leu | Met | Asp | Phe | Gin | Thr | His | |
670 | 675 | 680 | ||||||||||||||
TGT | CAT | CCT | ATG | GAC | ATC | CTT | GGG | ACT | TGT | GCA | ACT | GAG | CAG | TCC | AGA | |
903 | ||||||||||||||||
Cys | His | Pro | Met | Asp | Ile | Leu | Gly | -r“ • 4 4 a> | Cys | Ala | Thr | C-lu | Gin | Ser | Arg | |
685 | 690 | 695 | ||||||||||||||
TGT | CTG | CGG | GCA | TAC | CTG | GGG | CTG | ATT | GGG | ACT | GCC | AT>j | ACC | CCA | AAC | |
951 | ||||||||||||||||
cys | Leu | Arg | Ala | Tyr | Leu | Gly | Leu | Ile | Gly | Thr | Ala | Met | Thr | ?ro | Asn | |
700 | 705 | 710 | ||||||||||||||
TTC | ATC | AGC | Λ.-.G | GTC | AAC | ACT | nL a | GTT | GCC | TTA | AC-C | TGC | ACC | TGC | CGA | |
999 | ||||||||||||||||
Phe | Ile | Ser | Lys | Val | Asn | Thr | Thr | Val | Ala | Leu | Ser | Cys | Thr | Cys | Arg | |
715 | 720 | 725 | ||||||||||||||
GGC | AGC | GGC | AAC | CTA | CAG | GAC | GAG | TGT | GAA | CAG | CTG | GAA | AGG | TCC | TTC |
1047
Gly Ser Gly Asn 730 | Leu Gin Asp 735 | Glu | Cys | Glu | C-ln 740 | Leu | Glu | Arg | Ser | Phe 745 | |||||
TCC | CAG | AAC | CCC | TGC | CTC | GTG | GAG | GCC | ATT | GCT | AAG | ATG | CGT | TTC | |
1095 | |||||||||||||||
Ser | Gin | Asn | Pro | Cys | Leu | Val | Glu | Ala | Ile | Ala | Ala | Lys | Met | Arg | Phe |
750 | 755 | 760 | |||||||||||||
CAC | AGA | CAG | CTC | TTC | TCC | CAG | GAC | TGG | GCA | GAC | TCT | ACT | TTT | TCA | GTG |
1143 | |||||||||||||||
His | Arg | Gin | Leu | Phe | Ser | Gin | Asp | Trp | Ala | Asp | Ser | Thr | Phe | Ser | Val |
765 | 770 | 775 | |||||||||||||
GTG | CAG | CAG | CAG | fkC | AGC | AAC | CCT | GCT | CTG | AGA | CTG | CAG | CCC | AGG | CTA |
1191 | |||||||||||||||
Val | Gin | Gin | Gin | Asn | Ser | Asn | Pro | Ala | Leu | Arg | Leu | Gin | Pro | Arg | Leu |
780 | 785 | 790 |
-53 CZ 296516 B6
CCC | ATT | ΛΡ-ντ» Cl* | TCT | TTC | TCC | ATC | CTT | CCC | TTG | ATT | CTG | CTG | CAG ACC | CTC |
Pro | Ile | Leu | Ser | Phe | ser | Ile | Leu | Pro | Leu | Ile | Leu | Leu | Gin Thr | Leu |
795 | 8C0 | Θ05 | ||||||||||||
TGG 1 | TAGCTGGGCT | TCCTCAGGGT CCTTTGTCC' | 7 CTCCACCACA | CCCAGACTGA | ||||||||||
Trp | ||||||||||||||
810 |
TTTGCAGCCT 1352 | GTGGTGGGAG | AGAAC7CGCC | AGCCTGTGGA | AGAAGACGCA | GCGTGCTACA |
CAGCAACCCG 1412 | GAACCAACCA | GGCATTCCGC | AGCACATCCC | GTCTGCTCCA | GAAGAGGTCT |
TAGAAGTGAG 1472 | GGCTGTGACC | CTTCCGATCC | TGAGCGGCTA | GTTTTCAAAC | CTCCCTTGCC |
CCTGCTTCCT 1532 | TCTGGCTCAG | GCTGCTCCTC | CTTAGGACTT | TGTGGGTCCA | GTTTTGCCTT |
CTGTTCTGAT 1592 | GGTGATTAC-C | GGCTCACCTC | CAGCGCTTCT | TCCTGTTTCC | CAGGACCACC |
CAGAGGCTAA 1652 | GGAATCAG7C | ATTCCCTGTT | GCCTTCTCCA | GGAAGGCAGG | CTAAGGGTTC |
TGAGGTGACT 1712 | .V | TTTCCTTTGT | GTGGAAGGCT | GGTGCTCCAG | CCTCCACGTC |
CCTCTGAATG 1772 | G ΑΛ GA T AAAA | ACCTGCTGGT | GTCTTGACTG | CTCTGCCAGG | CAATCCTGAA |
1832 | TGAAGAGCTA | AAGTCITTGG | GTCTTC-TTTA | ACTCCTATTA | C7GTCCCCAA |
AT7CCCCTAG 1878 | TCCCTTGC- | CATGATTAAA | CATTTTC-ACT | TAAAAA |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 346 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
Ser 1 | Arg | Leu | Gin | Gly 5 | Cys | Leu | Pro | Ala | Pro 10 | Gly | Leu | Leu | His | Leu 15 | Gin |
Leu | Ser | Arg | Pro 20 | Leu | Pro | Leu | Glu | Glu 25 | Ser | Ala | Mec | Ser | Ala 30 | Asp | Cys |
Leu | Glu | Aid 35 | Ala | Glu | Gin | Leu | Arg 40 | Asn | Ser | Ser | Leu | Ile 45 | Asp | cys | Arg |
Cys | His 50 | Arg | Arg | Met | Lys | His 55 | Gin | Ala | Thr | Cys | Leu 60 | Asp | Ile | Tyr | *rp |
Thr | Val | His | Pro | Ala | Arg | Ser | Leu | Gly | Asp | Tyr | Glu | Leu | Asp | Val | Ser |
-54CZ 296516 B6
65 | 70 | ||||||
Pro | Tyr | Glu | Asp | Tr.r £5 | Val | Thr | Ser |
Lys | Leu | Asn | Met 100 | Leu | Lys | Pro | Asp |
Met | Leu | Cys 115 | Thr | Leu | His | Asp | Lys 120 |
Gly | Glu 130 | Ala | Cys | Ser | Gly | Ile 135 | Arg |
Gin. 145 | Leu | Arg | Ser | Phe | Phe 150 | Glu | Lys |
Leu | Leu | Leu | Cys | Pro 165 | Cys | Ala | Pro |
Arg | Arg | Asn | Thr ieo | Ile | Ala | Pro | Ser |
Asn | Cys | Leu 155 | Asp | Leu | Arg | Ser | Phe 200 |
Ser | Arg 210 | Leu | Met | Asp | Phe | Gin 215 | Thr |
Gly 225 | *· | Cys | Ala | Thr | C-lu 230 | Gin | Ser |
Leu | Ile | Gly | 1Γ.· | Ala 245 | Met | Thr | Pro |
Thr | Val | Ala | Leu 260 | Ser | Cys | Thr | Cys |
Glu | Cys | Glu 275 | Gin | Leu | Glu | Arg | Ser 280 |
Glu | Ala 290 | Ile | Ala | Ala | Lys | Met 295 | A.rg |
Asp 3C5 | Trp | Aid | Asp | Ser | 310 | Phe | Ser |
Pro | Ala | Leu | Arg | Leu 3 2 5 | Gin | Pro | Arg |
Leu | Pro | Leu | Ile 340 | Leu | Leu | Gin | Tr.r |
Leu Trp
345
75 | 60 | ||||||
Lys | Pro 90 | Trp | Lys | Met | Asn | Leu 95 | Ser |
Ser 105 | Asp | Leu | Cys | Leu | Lys 110 | Phe | Ala |
Cys | Asp | Arg | Leu | Arg 125 | Lys | Ala | Tyr |
Cys | Gin | Arg | His 140 | Leu | Cys | Leu | Ala |
Ala | Ala | Glu 155 | Ser | His | Ala | Gin | Gly 160 |
Glu | Asp 170 | Ala | Gly | Cys | Gly | Glu 175 | Arg |
Cys 165 | Ala | Leu | Pro | Ser | Val 190 | Thr | Pro |
cys | Arg | Ala | Asp | Pro 205 | Leu | cys | Arg |
His | Cys | His | Pro 220 | Met | Asp | Ile | Leu |
Arg | Cys | Leu 235 | Arg | Ala | Tyr | Leu | G-y 240 |
Asn | Phe 250 | Ile | Ser | Lys | Val | Asn 255 | Thr |
Arg 265 | Gly | Ser | cly | Asn | Leu 270 | Gin | Asp |
Phe | Ser | Gin | Asn | Pro 265 | Cys | Leu | Val |
Phe | His | Arg | Gin 300 | Leu | Phe | Ser | Gin |
Val | Val | C-ln 315 | Gin | Gin | Asn | Ser | r·- sn 320 |
Leu | Pro 330 | Ile | Leu | Ser | Phe | Ser 335 | Ile |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1889 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA
-55CZ 296516 B6 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 41...1231 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
CGCAGGCAGA GCGCTGTCGC ATCCCGGC-CG TCCACCCGCC ATG GGG CTC TCC TGG 55
Met Gly Leu Ser Trp
350
103 | AGC CCG CGA CCT | CCA CTG | CTG ATG ATC | CTG CTA | CTG GTG CTG | TCG Ser | TTG Leu | |||||||||
Leu | Val | Leu 365 | ||||||||||||||
Ser | Pro | Arg | Pro 355 | Pro | Leu | Leu | Met | Ile 360 | Leu | Leu | ||||||
TGG | CTG | CCA | CTT | GGA | C-CA | GGA | AAC | TCC | CTT | GCC | ACA | GAG | AAC | AGG | TTT | |
151 | ||||||||||||||||
Trp | Leu | Pro | Leu | Gly | Ala | Gly | Asn | Ser | Leu | Ala | Thr | Glu | Asn | Arg | Phe | |
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
GTG | AAC | AGC | TGT | ACC | CAG | GCC | AGA | AAG | AAA | TGC | GAG | GCT | AAT | CCC | GCT | |
199 | ||||||||||||||||
Val | Asn | Ser | Cys | Thr | C-ln | Ala | Arg | Lys | Lys | Cys | Glu | Ala | Asn | Pro | Ala | |
385 | 390 | 395 | ||||||||||||||
TGC | AAG | GCT | GCC | TAC | CAG | CAC | CTG | GGC | TCC | TGC | ACC | TCC | AGT | TTA | AGC | |
247 | ||||||||||||||||
cys | Lys | Ala | Ala | Tyr | Gin | His | Leu | Gly | Ser | cys | Thr | Ser | Ser | Leu | Ser | |
400 | 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
AGG | CCG | CTG | CCC | TTA | GAG | GAG | TCT | GCC | ATG | TCT | GCA | GAC | TGC | CTA | GAG | |
295 | ||||||||||||||||
Arg | Pro | Leu | Pro | Leu | Glu | C-lu | Ser | Ala | Met | Ser | Ala | Asp | cys | Leu | Glu | |
420 | 42S | 430 | ||||||||||||||
GC?x | GCA | GAA | CAA | CTC | .-.G-G | AAC | AGC | TCT | CTG | ATA | GAC | TGC | AGG | TGC | CAT | |
343 | ||||||||||||||||
Ala | Ala | Glu | Gin | Leu | Arg | Asn | Ser | Ser | Leu | Ile | Asp | Cys | Arg | Cys | His | |
435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
CGG | CGC | ATG | AAG | CAC | CAA | GCT | ACC | TGT | CTG | GAC | ATT | TAT | TGG | ACC | GTT | |
391 | ||||||||||||||||
Arg | Arg | Met | Lys | His | Gin | Ala | ** | Cys | Leu | Asp | Ile | Τ'γχ | Trp | Thr | Val | |
450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
CAC | CCT | GCC | CGA | AGC | CTT | C-GT | GAC | TAC | GAG | TTG | GAT | GTC | TCA | CCC | TAT | |
439 | ||||||||||||||||
His | Pro | Ala | Arg | Ser | Leu | Gly | Asp | Tyr | Glu | Leu | Asp | Val | Ser | Pro | Tyr | |
465 | 470 | 475 | ||||||||||||||
GAA | GAC | ACA | GTG | ACC | AGC | AAA | CCC | TGG | AAA | ATG | AAT | CTT | AGC | AAG | TTG | |
487 | ||||||||||||||||
Glu | Asp | Thr | Val | Thr | Ser | Lys | Pro | Trp | Lys | Met | Asn | Leu | Ser | Lys | Leu | |
480 | 4S5 | 490 | 495 | |||||||||||||
AAC | ATG | CTC | AAA | CCA | GAC | TCG | GAC | CTC | TGC | CTC | AAA | TTT | GCT | ATG | CTG | |
535 | ||||||||||||||||
Asn | Met | Leu | Lys | Pro | Asp | Ser | Asp | Leu | cys | Leu | Lys | Phe | Ala | Met | Leu | |
500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
TGT | ACT | CTT | CAC | GAC | AAG | TGT | GAC | CGC | CTG | CGC | AAG | GCC | TAC | GGG | GAG | |
583 | ||||||||||||||||
Cys | Thr | Leu | His | Asp | Lys | Cys | Asp | Arg | Leu | Arg | Lys | Ala | Tyr | Gly | Glu | |
515 | 520 | 525 |
-56CZ 296516 B6
631
679
727
775
823
871
919
967
1015
1063
1111
1159
1207
GCA | TGC | TCA | GGG | ATC | CGC | TGC | CAG | CGC | CAC | CTC | TGC | CTA | GCC | CAG | CTG |
Ala | cys | Ser | Gly | Ile | Arg | Cys | Gin | Arg | His | Leu | Cys | Leu | Ala | Gin | Leu |
530 | S35 | 540 | |||||||||||||
CGC | TCC | TTC | TTT | GAG | AAG | GCA | GCA | GAG | TCC | CAC | GCT | CAG | GGT | CTG | CTG |
Arg | Ser | Phe | Phe | Glu | Lys | Ala | Ala | Glu | Ser | His | Ala | Gin | Gly | Leu | Leu |
545 | 550 | 555 | |||||||||||||
CTG | TGT | CCC | TGT | C-CA | CCA | GAA | GAT | GCG | GGC | TGT | GGG | GAG | CGG | CGG | CGT |
Leu | Cys | Fro | Cys | Ala | Pro | Glu | Asp | Ala | Gly | Cvs | Gly | Glu | Arg | A.rg | Arg |
560 | 565 | 570 | 575 | ||||||||||||
AAC | ACC | ATC | GCC | CCC | AGT | TGC | GCC | CTG | CCT | TCT | GTA | ACC | CCC | AAT | TGC |
Asn | Thr | Ile | Ala | Pro | Ser | Cys | Ala | Leu | Pro | Ser | Val | Thr | Pro | Asn | Cys |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
CTG | GAT | CTG | CC-G | AGC | TGC | TGC | CGT | GCG | GAC | CCT | TTG | TGC | AGA | TCA | CGC |
Leu | Asp | Leu | Arg | Ser | Phe | Cys | Arg | Ala | Asp | Pro | Leu | Cys | Arg | Ser | Arg |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
CTG | ATG | GAC | TTC | CAG | ACC | CAC | TGT | CAT | CCT | ATG | GAC | ATC | CTT | GGG | ACT |
Leu | Met | Asp | Phe | Gin | Thr | His | Cys | His | Pro | Met | Asp | Ile | Leu | Gly | Thr |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
TGT | GCA | ACT | GAG | CAG | TCC | AGA | TGT | CTG | CGG | GCA | TAC | CTG | GGG | CTG | ATT |
Cys | A1 3. | Thr | Glu | Gin | Ser | Arg | Cys | Leu | Arg | Ala | Tyr | Leu | Gly | Leu | Ile |
62 5 | 630 | 63 5 | |||||||||||||
GGG | ACT | GCC | Λ1 -•J | ACC | CCA | AAC | rrvr.f'·* A * | ATC | AGC | AA.G | GTC | AAC | ACT | ACT | GTT |
Gly | Thr | Ala | Met | Thr | Pro | Asn | Phe | Ile | Ser | Lys | Val | Asn | Thr | Γ'ν v | Val |
640 | 645 | 650 | 655 | ||||||||||||
GCC | TTA | AGC | TGC | ACC | GGC | CGA | C-GC | AGC | GGC | AAC | CTA | CAG | GA.C | GAG | TGT |
Ala | Leu | Ser | Cys | Thr | Cys | Arg | Gly | Ser | Gly | Asn | Leu | Gin | Asp | C-lu | Cys |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
GAA | CAG | CTG | GAA | AC-G | TCC | <-ι£Γ· | CAG | AAC | CCC | TGC | CTC | GTG | GAG | GCC | |
Glu | Gin | Leu | Glu | Arg | Ser | Phe | Ser | Gin | Asn | Pro | cys | Leu | Val | Glu | Ala |
67 5 | 680 | 685 | |||||||||||||
ATT | GCA | C-CT | AAG | ATG | CGT | TTC | CAC | AGA | CAG | CTC | TTC | TCC | CAG | GAC | TGG |
Ile | Ala | Ala | Lys | Met | Arg | Phe | His | Arg | Gin | Leu | Phe | Ser | Gin | Asp | Trp |
690 | 695 | 7Q0 | |||||||||||||
GCA | GAC | TCT | ACT | TTT | TCA | GTG | GTG | CAG | CAG | CAG | AAC | AGC | AAC | CCT | GCT |
Ala | ASO | Ser | Thr | Phe | Ser | Val | Val | Gin | Gin | Gin | Asn | Ser | Asn | Pro | Ala |
705 | 710 | 715 | |||||||||||||
CTG | AGA | CTG | CAG | CCC | AGG | CTA | CCC | ATT | CTT | TCT | TTC | TCC | ATC | CTT | CCC |
Leu | Arg | Leu | Gin | Pro | Arg | Leu | Pro | Ile | Leu | Ser | Phe | Ser | Ile | Leu | Pro |
720 | 725 | 730 | 735 |
-57CZ 296516 B6
TTG | ΑΓΤ | CTG | CTG | CAG | ACC | CTC | TGG TAGCTGGGCT TCCTCAGGGT CCTTTGTCC7 |
1261 | |||||||
Leu | Ile | Leu | Leu | Gin 740 | Thr | Leu | Trp |
CTCCACCACA 1321 | CCCAGACTGA | TTTGCAGCCT | GTGG7GGC-AG | AGAACTCGCC | AGCCTG7GGA |
AGAAGACGCA 1381 | GCG7C-C7ACA | CAGCAACCCG | GAACCAACCA | GGCATTCCGC | AC-CACATCCC |
GTCTGCTCCA 1441 | GAAGAGGTCT | m » * » <· rv ♦ Λ* X aa(j a | GGCTGTGACC | CTTCCGATCC | TGAC-CGGCTA |
GTTTTCAAAC 1501 | CTCCCTTGCC | CCTGCTTCCT | TCTGGCTCAG | GCTGCTCCTC | CTTAGGACTT |
TGTGGGTCCA 1561 | G7TTTC-CCTT | CTGTTCTGAT | GGTC-ATTAGC | GGCTCACCTC | CAGCGCTTCT |
TCCTGTTTCC 1621 | CAGGACCACC | CAGAGGCTAA | GGAATCAGTC | ATTCCCTGTT | GCCTTC7CCA |
GGAAGGCAGG 1681 | CTAAGGG7TC | TGAGGTGACT | GAGAAAAATG | TTTCCTTTGT | GTGGAAGGCT |
GGTGCTCCAG 1741 | CCTCCACGTC | CCTCTGAATG | GAAGATAAAA | ACCTGCTGGT | GTCTTGACTG |
CTCTGCCAC-G 1801 | CAATCC7GAA | CATTTC-GC-CA | TGAAGAGCTA | AAGTCTTTGG | GTCTTGTTTA |
ACTCCTATTA 1861 | CTGTCCCC.-.A | ATTCCCCTAG | TCCCTTGGGT | CATC-ATTAAA | CATTTTGACT |
X ΛΑΛΪ^ΛΛΛΛΛ 1689 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 397 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární o
(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
Met 1 | Gly | Leu Ser | Trp 5 | Ser | Pro | Arg | Pro | Pro 10 | Leu | Leu | Met | Ile | Leu 15 | Leu | |
Leu | Val | Leu | Ser | Leu | Trp | Leu | Pro | Leu | Gly | Ala | Gly | Asn | Ser | Leu | Ala |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Thr | Glu | Asn | Arg | Phe | Val | Asn | Ser | Cys | Thr | Gin | Ala | Arg | Lys | Lys | Cys |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Glu | Ala | Asn | Pro | Ala | Cys | Lys | Ala | Ala | Tyr | Gin | His | Leu | Gly | Ser | Cys |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Thr | Ser | Ser | Leu | Ser | Arg | Pro | Leu | Pro | Leu | Glu | Glu | Ser | Ala | Met | Ser |
65 | 70 | 75 | 80 |
-58CL 296516 B6
Ala Asp | Cys | Leu | Glu 85 | Ala Ala Glu | Gin | Leu 90 | Arg | Asn | Ser | Ser | Leu 95 | Ile | |||
Asp | Cys | Arg | Cys | His | Arg | Arg | Met | Lys | His | Gin | Ala | Thr | cys | Leu | Asp |
1C0 | 105 | 110 | |||||||||||||
Ile | Tyr | Trp | Thr | Val | His | Pro | Ala | Arg | Ser | Leu | Gly | Asp | Tyr | Glu | Leu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Asp | Val | Ser | Pro | Tyr | Glu | Asp | Thr | Val | Thr | Ser | Lys | Pro | Trp | Lys | Met |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Asn | Leu | Ser | Lys | Leu | Asn | Met | Leu | Lys | Pro | Asp | Ser | Asp | Leu | cys | Leu |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Lys | Pne | Ala | Met | Leu | cys | Thr | Leu | His | Asp | Lys | Cys | Asp | Arg | Leu | Arg |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Lys | Ala | Tyr | Gly | Glu | Ala | Cys | Ser | Gly | Ile | Arg | Cys | Gin | Arg | His | Leu |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Cys | Leu | Ala | Gin | Leu | Arg | Ser | Phe | Phe | Glu | Lys | Ala | Ala | Glu | Ser | His |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Ala | Gin | Gly | Leu | Leu | Leu | Cys | Pro | Cys | Ala | Pro | Glu | Asp | Ala | Gly | Cys |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Gly | Glu | Arg | Arg | Arg | Asn | Thr | Ile | Ala | Pro | Ser | Cys | Ala | Leu | Pro | Ser |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Val | Thr | Pro | Asn | Cys | Leu | Asp | Leu | Arg | Ser | Phe | Cys | Arg | Ala | Asp | Pro |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Leu | Cys | Arg | Ser | Arg | Leu | Met | Asp | Phe | Gin | Thr | His | Cys | His | Pro | Met |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Asp | Ile | Lsu | Gly | Cys | Ala | Thr | Glu | Gin | Ser | Arg | Cys | Leu | Arg | Ala | |
275 | 2S0 | 285 | |||||||||||||
Tyr | Leu | Gly | Leu | Ile | Gly | Thr | Ala | Met | Thr | Pro | Asn | Phe | Ile | Ser | Lys |
250 | 295 | 300 | |||||||||||||
Val | Asn | Thr | Thr | Vel | Ala | Leu | Ser | Cys | Thr | Cys | Arg | Gly | Ser | Gly | Asn |
3 05 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Leu | Gin | Asp | C-lu | Cys | Glu | Gin | Leu | Glu | Arg | Ser | Phe | Ser | Gin | Asn | Pro |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Cys | Leu | Val | Glu | Ala | Ile | Ala | Ala | Lys | Met | Arg | Phe | His | Arg | Gin | Leu |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Phe | Ser | Gin | Asp | Trp | Ala | Asp | Ser | Thr | Phe | Ser | Val | Val | Gin | Gin | Gin |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Asn | Ser | Asn | Pro | Ala | Leu | Arg | Leu | Gin | Pro | Arg | Leu | Pro | Ile | Leu | Ser |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Phe | Ser | Ile | Leu | Pro | Leu | Ile | Leu | Leu | Gin | Thr | Leu | Trp |
385 390 395 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1271 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
-59CZ 296516 B6 (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 2...946 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:
C GGC TAC TGT GAA ACA CCT C.-A CTC AGG AAC AGC TCT CTG ATA GGC
Gly Tyr Cys Glu Thr Pro Gin Leu Arg Asn Ser Se 405
Leu Ile Gly
410
190
400
142
238
286
334
382
430
473
TGC | ATG | TGC | CAC | CGG | CGC | ATG | AAG | AAC | CAG | GTT | GCC | TGC | TTG | GAC | ATC |
cys | Met | Cys | His | Arg | Arg | Met | Lys | Asn | Gin | Val | Ala | Cys | Leu | Asp | Ile |
415 | 420 | 425 | |||||||||||||
TAT | TGG | ACC | GTT | CAC | CGT | GCC | CGC | AC-C | CTT | GGT | AAC | TAT | GAG | CTG | GAT |
Tyr | Trp | Thr | Val | His | Arg | Ala | Arg | Ser | Leu | Gly | Asn | Tyr | Glu | Leu | Asp |
430 | 4 3 5 | 440 | |||||||||||||
GTC | TCC | CCC | TAT | GAA | GAC | ACA | GTG | ACC | AGC | AAA | CCC | TGG | AAA | ATG | AAT |
Val | Ser | Pro | Tyr | Glu | Asp | Thr | Val | Thr | Ser | Lys | Pro | Trp | Lys | Met | Asn |
445 | 450 | 455 | 460 | ||||||||||||
CTC | AC-C | AAA | CTG | AAC | ATG | CTC | Λ---Α | C<_A | GAC | TCA | GAC | CTC | TGC | CTC | AAG |
Leu | Ser | Lys | Leu | Asn | Me t | Leu | Lys | Pro | Asp | Ser | Asp | Leu | Cys | Leu | Lys |
465 | 470 | 475 | |||||||||||||
TTT | GCC | ATG | CTG | TG? | 2-_^T | CTC | AAT | GAC | AAG | TGT | GAC | CGG | CTG | CGC | AAG |
Phe | Ala | Met | Leu | Cys | Thr | Leu | Asn | Asp | Lys | cys | Asp | Arg | Leu | Arg | Lys |
4 S 0 | 485 | 490 | |||||||||||||
GCC | TAC | GGG | GAG | GCG | GGG | CCC | CAC | TGC | CAG | CC-C | CAC | GTC | TGC | ||
Ala | Tyr | Gly | Glu | Ala | Cys | Ser | Glv | Pro | His | Cys | Gin | Arg | His | Val | Cys |
495 | 500 | 505 | |||||||||||||
CTC | AGG | CAG | CTG | CTC | ACT | TTC | TTC | GAG | AAG | GCC | GCC | GAG | CCC | CAC | GCG |
Leu | Arg | Gin | Leu | Leu | Thr | Fhe | Phe | Glu | Lys | Ala | Ala | Glu | Pro | His | Ala |
510 | 515 | 520 | |||||||||||||
CAG | GGC | CTG | CTA | CTG | TGC | CCA | TGT | GCC | CCC | AAC | GAC | CGG | GGC | TGC | GGG |
Gin | Gly | Leu | Leu | Leu | Cys | Pro | Cys | Ala | Pro | Asn | Asp | Arg | Gly | Cys | Gly |
525 | 530 | 535 | 540 | ||||||||||||
GAG | CGC | CGG | CGC | AAC | ACC | ATC | GCC | CCC | AAC | TGC | GCG | CTG | CCG | CCT | GTG |
Glu | Arg | Arg | Arg | Asn | ir.r | Ile | Ala | Pro | Asn | Cys | Ala | Leu | Pro | Pro | Val |
555
S45
S50
-60CL 296516 B6
526
574
622
670
718
766
814
862
910
956
GCC | CCC | AAC | TGC | CTG | GAG | CTG | CGG | CGC | CTC | TGC | TTC | TCC | GAC | CCG | |
Ala | Pro | Asn | Cys | Leu | Glu | Leu | Arg | Arg | Leu | Cys | Phe | Ser | Asp | Pro | Leu |
560 | 565 | 570 | |||||||||||||
TGC | AGA | TCA | CC-C | CTG | GTG | GAT | CAG | ACC | CAC | TGC | CAT | CCC | ATG | GAC | |
cys | Arg | Ser | Arg | Leu | Val | Asp | Phe | Gin | Thr | Eis | Cys | His | Pro | Met | Asp |
575 | 580 | 585 | |||||||||||||
ATC | CTA | GGA | ACT | TGT | GCA | ACA | GAG | CAG | TCC | AGA | TGT | CTA | CGA | GCA | |
Ile | Leu | Gly | Thr | Cys | Ala | Thr | Glu | Gin | Ser | Arg | Cys | Leu | Arg | Ala | Tyr |
590 | 595 | 600 | |||||||||||||
CTG | GGG | CTG | ATT | GGG | ACT | GCC | ATG | ACC | CCC | AAC | TTT | GTC | AGC | AAT | GTC |
Leu | Gly | Leu | Ile | Gly | Thr | Ala | Met | Thr | Pro | Asn | Phe | Val | Ser | Asn | Val |
605 | 610 | 615 | 620 | ||||||||||||
AAC | ACC | AGT | GTT | GCC | TTA | AGC | TGC | ACC | TGC | CGA | GGC | AGT | GGC | AAC | CTG |
Asn | Thr | Ser | Val | Ala | Leu | Ser | Cys | Thr | Cys | Arg | Gly | Ser | Gly | Asn | Leu |
625 | 630 | 63 5 | |||||||||||||
CAG | GAG | GAG | TGT | GAA | ATG | CTG | GAA | GGG | TTC | TTC | TCC | CAC | AAC | CCC | TGC |
Gin | Glu | Glu | Cys | Glu | Met | Leu | Glu | Gly | Phe | Phe | Ser | His | Asn | Pro | Cys |
640 | 645 | 650 | |||||||||||||
CTC | ACG | GAG | GCC | ATT | GCA | GCT | AAG | ATG | CGT | TTT | CAC | AGC | CAA | CTC | TTC |
Leu | Thr | Glu | Ala | Ile | Ala | Ala | Lvs | Me t | Arg | Phe | His | Ser | Glr. | Leu | Phe |
655 | 660 | 665 | |||||||||||||
TCC | CAG | GAC | TC-G | CCA | CAC | CCT | ACC | TTT | GCT | GTG | ATG | GCA | CAC | CAG | AAT |
Ser | Gin | Asp | Trp | Pro | His | Pro | Thr | Phe | Ala | Val | Met | Ala | His | Gin | Asn |
670 | 675 | 680 | |||||||||||||
GAA | AAC | CCT | GCT | GTG | AGG | CCA | CAG | CCC | TGG | GTG | CCC | TCT | CTT | TTC | TCC |
Glu | Asn | Pro | Ala | Val | Arg | Pro | Gin | Pro | Trp | Val | Pro | Ser | Leu | Phe | Ser |
68 5 | 690 | 695 | 7 CO | ||||||||||||
TGC | ACG | CTT | CCC | TTG | ATT | CTG | CTC | CTG | AGC | CTA | TGG | TAGCTGGACT | |||
Cys | Thr | Leu | Pro | Leu | Ile | Leu | Leu | Leu | Ser | Leu | Trp |
705
710
TCCCCAGGGC
1016
CCTCTTCCCC
TCCACCACAC
CCAGGTGGAC
T7GCAGCCCA
CAAC-GGGTGA
GCAGCAGGA_A
GGAGG7GCAG
TGCGCAGATG
AGGGCACAGG
AG AAGCT AAG
GGTTATGACC
1136
TCCAGATCCT
TACTGGTCCA
G7CCTCATTC
CCTCCACCCC
ATCTCCACTT
CTGATTCA7G
1196
CTGCCCCTCC
TTGGTGGCCA
CAATTTAGCC
ATGTCATCTG
GTGCCTGTGG
ATTCCTAT7A
TTGTCCTAAA
GTCTCTCTGG
CCTTTGACTT ΑΛΑΑΑ 1271
-61 CZ 296516 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 315 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein o
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:
Gly 1 | Tyr | Cys | Glu | Thr 5 | Pro | Gin | Leu |
Met | Cys | His | Arg 20 | Arg | Met | Lys | Asn |
Trp | Thr | Val 35 | His | Arg | Ala | Arg | Ser 40 |
Ser | Pro 50 | Tyr | Glu | Asp | Thr | Val 55 | Thr |
Ser 65 | Lys | Leu | Asn | Met | Leu 70 | Lys | Pro |
Ala | Met | Leu | Cys | Thr 65 | Leu | Asn | Asp |
Arg | Asn 10 | Ser | Ser | Leu | Ile | Gly 15 | Cys |
Gin 25 | Val | Ala | Cys | Leu | Asp 30 | Ile | Tyr |
Leu | Gly | Asn | Tyr | Glu 45 | Leu | Asp | Val |
Ser | Lys | Pro | Trp 60 | Lys | Met | Asn | Leu |
Asp | Ser | Asp 75 | Leu | Cys | Leu | Lys | Phe 60 |
Lys | Cys 90 | Asp | Aurg | Leu | Arg | Lys 95 | Ala |
Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro
100 | |||||||
Arg | Gin | Leu 115 | Leu | Thr | Phe | Phe | Glu 120 |
Gly | Leu 130 | Leu | Leu | Cys | Pro | Cys 135 | Ala |
Arg 145 | Arg | Arg | Asn | Thr | Ile 150 | Ala | Pro |
Pro | Asn | Cys | Leu | Glu 165 | Leu | Arg | Arg |
Arg | Ser | Arg | Leu 160 | Val | Asp | Phe | Gin |
Leu | Gly | Thr 195 | Cys | Ala | Thr | Glu | Gin 200 |
Gly | Leu 210 | Ile | Gly | Thr | Ala | Met 215 | Thr |
Thr 225 | Ser | Val | Ala | Leu | Ser 230 | Cys | Thr |
Glu | Glu | Cys | Glu | Met 245 | Leu | Glu | Gly |
Thr | Glu | Ala | Ile 260 | Ala | Ala | Lys | Met |
His 105 | cys | C-ln | Arg | His | Val 110 | Cys | Leu |
Lys | Ala | Ala | Glu | Pro 125 | His | Ala | Gin |
Pro | Asn | Asp | Arg 140 | Gly | Cys | Gly | Glu |
Asn | Cys | Ala 155 | Leu | Pro | Pro | Val | Ala 160 |
Leu | Cys 170 | Phe | Ser | Asp | Pro | Leu 175 | Cys |
Thr 165 | His | Cys | His | Pro | Met 190 | Asp | Ile |
Ser | Arg | Cys | Leu | Arg 205 | Ala | Tyr | Leu |
Pro | Asn | Phe | Val 220 | Ser | Asn | Val | Asn |
Cys | Arg | Gly 235 | Ser | Gly | Asn | Leu | Gin 240 |
Phe | Phe 250 | Ser | His | Asn | Pro | Cys 255 | Leu |
Arg 265 | Phe | His | Ser | Gin | Leu 270 | Phe | Ser |
-62CZ 296516 B6
Gin | Asp | Trp 275 | Pro | His | Pro | Thr | Phe 280 | Ala | Val | Met | Ala | His 285 | Gin | Asn | Glu |
Asn | Pro | Ala | val | Arg | Pro | Gin | Pro | Trp | Val | Pro | Ser | Leu | Phe | Ser | Cys |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Thr | Leu | Pro | Leu | Ile | Leu | Leu | Leu | Ser | Leu | Trp | |||||
305 | 310 | 315 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1699 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 175...1374 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:
TGTGGACC-CG CGCTTCGGAG TTGGAGGGCG GCGCCCAGGA CCCTC-GTGGG AGAGTGTGTG 60
CGTCGCGCTG GAGGGCGGC-A GGCC-GGC-GCG GGAC-GTGCCG GTCG.-.GGGAG CCCCGCTCTC 120
AGAGCTCCAG GGGAC-GAGCG AGGC-GAC-CGC GGAGCCCGGC GCCTACAGCT CGCC ATG
177
Met
225 | GTG CGC | CCC Pro | CTG Leu 320 | AAC Asn | CCG CGA | CCG Pro | CTG Leu 325 | CCG Pro | CCC Pro | GTA Val | GTC Val | CTG Leu 330 | ATG Met | TTG Leu | ||
Pro | Arg | |||||||||||||||
Val | Arg | |||||||||||||||
CTG | CTG | CTG | CTG | CCG | CCG | TCG | CCG | CTG | CCT | CTC | GGA | C-CC | GGA | GAC | CCC | |
273 | ||||||||||||||||
Leu | Leu | Leu | Leu | Pro | Pro | Ser | Pro | Leu | Pro | Leu | Ala | Ala | Gly | Asp | Pro | |
335 | 340 | 345 | ||||||||||||||
CTT | CCC | ACA | GAA | AGC | CGA | CTC | ATG | AAC | AGC | TGT | CTC | CAG | GCC | AGG | AGG | |
321 | ||||||||||||||||
Leu | Pro | Thr | Glu | Ser | Arg | Leu | Met | Asn | Ser | Cys | Leu | Gin | Ala | Arg | Arg | |
350 | 355 | 360 | ||||||||||||||
AAG | TGC | CAG | GCT | GAT | CCC | ACC | TGC | AGT | GCT | GCC | TAC | CAC | CAC | CTG | GAT | |
369 | ||||||||||||||||
Lys | Cys | Gin | Ala | Asp | Pro | Thr | Cys | Ser | Ala | Ala | Tyr | His | His | Leu | Asp | |
365 | 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
TCC | TGC | ACC | TCT | AGC | ATA | AGC | ACC | CCA | CTG | CCC | TCA | GAG | GAG | CCT | TCG | |
417 | ||||||||||||||||
Ser | Cys | Thr | Ser | Ser | Ile | Ser | Thr | Pro | Leu | Pro | Ser | Glu | Glu | Pro | Ser |
385 390 395
-63CZ 296516 B6
GTC | CCT | GCT | GAC | TGC | CTG | GAG | GCA | GCA | CAG | CAA | CTC | AGG | AAC | AGC | TCT |
Val | Pro | Ala | Asp | Cys | Leu | Glu | Ala | Ala | Gin | Gin | Leu | Arg | Asn | Ser | Ser |
400 | 405 | 410 | |||||||||||||
CTG | ATA | GGC | TGC | ATG | TGC | CAC | CGG | CGC | ATG | AAG | AAC | CAG | GTT | GCC | TGC |
Leu | Ile | Gly | Cys | Met | cys | His | Arg | Arg | Met | Lys | Asn | Gl.n | Val | Ala | cys |
415 | 420 | 425 | |||||||||||||
TTG | GAC | ATC | TAT | TGG | ACC | GTT | CAC | CGT | GCC | CGC | AGC | CTT | GGT | AAC | TAT |
Leu | Asp | Ile | Tyr | Trp | Thr | Val | His | Arg | Ala | Arg | Ser | Leu | Gly | Asn | Tyr |
430 435 440
GAG | CTG | GAT | GTC | TCC | CCC | TAT | GAA | GAC | ACA | GTG | ACC | AGC | AAA | CCC | TGG |
Glu | Leu | Asp | Val | Ser | Pro | Tyr | Glu | Asp | Thr | Val | Thr | Ser | Lys | Pro | Trp |
445 | 450 | 455 | 460 | ||||||||||||
AAA | ATG | AAT | CTC | AGC | AAA | CTG | AAC | ATG | CTC | AAA | CCA | GAC | TCA | GAC | CTC |
Lys | Met | Asn | Leu | Ser | Lys | Leu | Asn | Met | Leu | Lys | Pro | Asp | Ser | Asp | Leu |
4£5 470 475
TGC CTC AAG TTT GCC ATG CTG TGT ACT CTC AAT GAC AAG TGT GAC CGG 705
Cys | Leu Lys | Phe 480 | Ala | Met | Leu | Cys | Thr 485 | Leu | Asn Asp Lys Cys 490 | Asp | Arg | |||||
CTG | CGC | AAG | GCC | TAC | GGG | GAG | GCG | TC-C | TCC | GGG | CCC | CAC | TGC | CAG | CGC | |
753 | ||||||||||||||||
Leu | Arg | Lys | Ala | Tyr | cly | Glu | Ala | cys | Ser | Gly | Pro | His | Cys | Gin | Arg | |
495 | 500 | 505 | ||||||||||||||
CAC | GTC | TGC | CTC | AC-G | CAG | CTG | CTC | ACT | TTC | TTC | GAG | AAG | GCC | GCC | GAG | |
601 | ||||||||||||||||
His | Val | cys | Leu | Arg | Gin | Leu | Leu | Thr | Phe | Phe | Glu | Lys | Ala | Ala | Glu | |
S10 | 515 | 520 | ||||||||||||||
CCC | CAC | GCG | CAG | GC-C | CTG | CTA | CTG | TGC | CCA | TGT | GCC | CCC | AAC | GAC | CC-G | |
649 | ||||||||||||||||
Pro | His | Ala | Gin | Gly | Leu | Leu | Leu | Cys | Pro | Cys | Ala | Pro | Asn | Asp | z-.rg | |
525 | 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
GGC | TGC | G-GG | GAG | CGC | CGG | CGC | AAC | ACC | ATC | GCC | CCC | AAC | TGC | GCG | CTG | |
897 | ||||||||||||||||
Gly | cys | Gly | G1U | Arg | Arg | Arg | Asn | Thr | Ile | Ala | Pro | Asn | Cys | Ala | Leu |
545 550 555
CCG CCT GTG GCC CCC AAC TGC CTG GAG CTG CGG CGC CTC TGC TTC TCC
Pro | Pro Val | Ala 560 | Pro Asn Cys | Leu | Glu 565 | Leu | Arg Arg | Leu | Cys 570 | Phe | Ser | ||||
GAC | CCG | CTT | TGC | AGA | TCA | CGC | CTG | GTG | GAT | TTC | CAG | ACC | CAC | TGC | CAT |
Asp | Pro | Leu | Cys | Are | Ser | Arg | Leu | Val | Asp | Phe | Gin | Thr | His | Cys | His |
575 | 580 | 585 | |||||||||||||
CCC | ATG | GAC | ATC | CTA | GGA | ACT | TGT | GCA | ACA | GAG | CAG | TCC | AGA | TG | CTA |
Pro | Met | Asp | Ile | Le-J | Gly | Thr | Cys | Ala | Thr | Glu | Gin | Ser | Arg | Cys | Leu |
590 | 595 | 6C0 |
-64CZ 296516 B6
CGA GCA TAC CTG GGG CTG ATT 1039
Arg Ala Tyr Leu Gly Leu Ile 605 610
AGC AAT GTC AAC ACC AGT GTT 1137
Ser Asn Val Asn Thr Ser Val
625
GGC AAC CTG CAG GAG GAG TGT 1185
Gly Asn Leu Gin Glu Glu Cys 640
AAC CCC TGC CTC ACG GAG GCC 1233
Asn Pro Cys Leu Thr Glu Ala 655
CAA CTC TTC TCC CAG GAC TGG 1281
Gin Leu Phe Ser Gin Asp Trp 670 675
CAC CAG AAT GAA AAC CCT GCT 1329
His Gin Asn Glu Asn Pro Ala
685 690
CTT TTC TCC TGC ACG CTT CCC 1374
Leu Phe Ser Cys Thr Leu Pro
705
GGG ACT GCC ATG ACC CCC AAC TTT GTC
Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Val
615620
GCC TTA AGC TGC ACC TGC CGA GGCAGT
Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg GlySer
630635
GAA ATG CTG GAA GGG TTC TTC TCCCAC
Glu Met Leu Glu Gly Phe Phe SerHis
645650
ATT GCA GCT AAG ATG CGT TTT CACAGC
Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe HisSer
660665
CCA CAC CCT ACC TTT GCT GTG ATG GCA
Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met Ala
680
GTG AGG CCA CAG CCC TGG GTG CCC TCT
Val Arg Pro Gin Pro Trp Val Pro Ser
695 700
TTG ATT CTG CTC CTG AGC CTA TGG
Leu Ile Leu Leu Leu Ser Leu Trp
710 715
TAGCTGGACT 1434 | TCCCCAGGGC | CCTCTTCCCC | TCCACCACAC | CCAGGTC-GAC | T7GCAGCCCA |
CAA.GGGGTGA 1494 | GGAAAGGACA | GCAGCAGG.AA | GGAGGTGCAG | TGCGCAGATG | AC-GGCACAGG |
AGAAGCTAAG 1554 | GGTTATGACC | TCCAGATCCT | TACTGGTCCA | GTCCTCATTC | CCTCCACCCC |
ATCTCCACTT 1614 | C7GAT7CATG | CTGCCCCTCC | TTGGTGGCCA | CAATTTAGCC | ATGTCATCTG |
GTGCCTGTGG | GCCT7GCTTT | ATTCCTATTA | TTGTCCTAAA | GTCTCTCTGG | GCTCTTC-GAT |
1674
CATGATTAAA CCTTTC-ACTT AAAAA
1699 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 400 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineami (ii) TYP MOLEKULY: protein
-65CZ 296516 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:
Met 1 | Val | Arg | Pro | Leu 5 | Asn | Pro | Arg | Pro | Leu 10 | Pro | Pro | Val | Val | Leu 15 | Met |
Leu | Leu | Leu | Leu | Leu | Pro | Pro | Ser | Pro | Leu | Pro | Leu | Ala | Ala | Gly | Asp |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Pro | Leu | Pro | Thr | Glu | Ser | Arg | Leu | Met | Asn | Ser | Cys | Leu | Gin | Ala | Arg |
3 5 | 40 | 45 | |||||||||||||
Arg | Lys | cys | Gin | Ala | Asp | Pro | Thr | Cys | Ser | Ala | Ala | Tyr | His | His | Leu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Asp | Ser | Cys | Thr | Ser | Ser | Ile | Ser | Thr | Pro | Leu | Pro | Ser | Glu | Glu | Pro |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ser | Val | Pro | Ala | Asp | Cys | Leu | Glu | Ala | Ala | Gin | Gin | Leu | Arg | Asn | Ser |
65 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Leu | Ile | Glv | Cys | Her | Cys | His | Arg | Arg | Met | Lys | Asn | Gin | Val | Ala |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Cys | Leu | Asp | Ile | Tyr | Trp | Thr | Val | His | Arg | Ala | Arg | Ser | Leu | Gly | Asn |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Tyr | Glu | Leu | Asp | Val | Ser | Pro | Tyr | Glu | Asp | Thr | Val | Thr | Ser | Lys | Pro |
13 0 | 135 | 140 | |||||||||||||
Trp | Lys | Met | Asn | Ser | Lys | Leu | Asn | Met | Leu | Lys | Pro | Asp | Ser | Asp | |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Leu | Cys | Leu | Lys | rhe | Ai a | Met | Leu | Cys | Thr | Leu | Asn | Asp | Lys | Cys | Asp |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
λΣ Z | Arg | Lys | A i a | . ·*· | C-ly | Glu | Ala | Cys | Ser | Cly | Pro | His | Cys | Gin | |
160 | 165 | 190 | |||||||||||||
.-.Z g | His | Val | Cys | Le - | •-.rg | Gin | Leu | Leu | Thr | Phe | Phe | Glu | Lys | Ala | Ala |
155 | 200 | 205 | |||||||||||||
Glu | Pro | His | Ala | Gin | C-iy | Leu | Leu | Leu | Cys | Pro | Cys | Ala | Pro | Asn | Asp |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Arg | C-lv | Cys | Cly | Glu | Are | Arg | Arg | Asn | Thr | Ile | Ala | Pro | Asn | Cys | Ala |
225 | 233 | 235 | 240 | ||||||||||||
Leu | Pro | Pro | Val | Ala | ?ro | Asn | Cys | Leu | Glu | Leu | Arg | Arg | Leu | Cys | Phe |
Ξ 4 5 | 250 | 255 | |||||||||||||
Ser | Asp | Pro | Leu | Cys | Arg | Ser | Arg | Leu | Val | Asp | Phe | Gin | Thr | His | Cys |
250 | 265 | 270 | |||||||||||||
His | Pro | Met | A.sp | Ile | Leu | Gly | Thr | Cys | Ala | Thr | Giu | Gin | Ser | Arg | Cys |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Leu | Arg | Ala | Tyr | Leu | Gly | Leu | Ile | Gly | Thr | Ala | Met | Thr | Pro | Asn | Phe |
250 | 255 | 300 | |||||||||||||
Val | Ser | Asn | Val | Asn | Thr | Ser | Val | Ala | Leu | Ser | Cys | Thr | Cys | Arg | Gly |
3C5 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Ser | Gly | Asn | Leu | Gin | Glu | Glu | Cys | Glu | Met | Leu | Glu | Gly | Phe | Phe | Ser |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
His | Asn | Pro | Cys | Leu | Thr | Glu | Ala | Ile | Ala | Ala | Lys | Met | Arg | Phe | His |
340 | 345 | 350 |
Claims (19)
1. Izolovaná nukleová kyselina, která kóduje polypeptid mající alespoň 80% sekvenční identitu se sekvencí aminokyselin vybranou ze skupiny sestávající ze sekvencí uvedených v popisu jako sekvence id. č. 17 a sekvence id. č. 21, přičemž polypeptid vytváří interakci s receptorovým proteinem Ret, která spouští dimerizaci receptorového proteinu Ret nebo autofosfoiylaci tyrosinkinázové domény receptorového proteinu Ret.
2. Nukleová kyselina podle nároku 1, kde aminokyselinová sekvence kódovaného peptidu zachovává alespoň 80 % cysteinových zbytků při srovnání se sekvencí id. č. 17 nebo sekvencí id. č.21.
3. Nukleová kyselina podle nároku 1, kde kódovaný polypeptid má alespoň 90% sekvenční identitu se sekvencí aminokyselin vybranou ze skupiny sestávající ze sekvence id. č. 17a sekvence id. č. 21.
4. Nukleová kyselina podle nároku 3, kde kódovaný polypeptid je polypeptid se sekvencí id. č. 17 nebo sekvencí id. č. 21.
5. Izolavaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze sekvence id. č. 16 a sekvence id. č. 20.
6. Vektor obsahující inzert obsahující nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
7. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 6.
8. Způsob přípravy polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se: kultivují buňky podle nároku 7 a izoluje se polypeptid exprimovaný z inzertu v hostitelských buňkách.
9. Polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
10. Izolovaná monoklonální protilátka, která se může na polypeptid vybraný ze skupiny sestávající z polypeptidů sekvence id. č. 15, sekvence id. č. 17, sekvence id. č. 19 sekvence id.č. 21.
11. Protilátka podle nároku 10, která se váže na polypeptid sekvence id. č. 19 nebo sekvence id. č. 21.
12. Kompozice, vy z n a č uj í c í se t í m , že obsahuje (a) protilátku podle nároku 10 nebo 11, která je asociována s (b) toxinem, zobrazitelnou sloučeninou nebo radionuklidem.
-67CZ 296516 B6
13. Fúzní protein obsahující polypeptid podle nároku 9, který je fúzován s imunoglobulinem, toxinem, zobrazitelnou sloučeninou nebo radionuklidem.
14. Nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 pro použití při léčení nebo diagnostice.
15. Vektor podle nároku 6 pro použití při léčení nebo diagnostice.
16. Polypeptid podle nároku 9 pro použití při léčení nebo diagnostice.
17. Protilátka podle nároku 10 nebo 11 pro použití při léčení nebo diagnostice.
18. Kompozice podle nároku 12 pro použití při léčení nebo diagnostice.
19. Fúzní protein podle nároku 13 pro použití při léčení nebo diagnostice.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US1742796P | 1996-05-08 | 1996-05-08 | |
US1930096P | 1996-06-07 | 1996-06-07 | |
US2185996P | 1996-07-16 | 1996-07-16 | |
US4353397P | 1997-04-11 | 1997-04-11 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ361598A3 CZ361598A3 (cs) | 1999-03-17 |
CZ296516B6 true CZ296516B6 (cs) | 2006-04-12 |
Family
ID=27360789
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ0361598A CZ296516B6 (cs) | 1996-05-08 | 1997-05-07 | Nukleová kyselina kódující ligand c-Ret, polypeptid kódovaný touto nukleovou kyselinou a zpusob jeho prípravy |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0914339B1 (cs) |
JP (1) | JP2002515743A (cs) |
KR (2) | KR20060024843A (cs) |
CN (2) | CN1163509C (cs) |
AT (1) | ATE335003T1 (cs) |
AU (1) | AU732392B2 (cs) |
BG (2) | BG109433A (cs) |
BR (1) | BR9710665A (cs) |
CA (1) | CA2253871C (cs) |
CZ (1) | CZ296516B6 (cs) |
DE (1) | DE69736428T2 (cs) |
DK (1) | DK0914339T3 (cs) |
EA (1) | EA002544B1 (cs) |
EE (1) | EE9800377A (cs) |
ES (1) | ES2270465T3 (cs) |
IL (1) | IL126918A (cs) |
IS (1) | IS2361B (cs) |
NO (2) | NO323612B1 (cs) |
NZ (1) | NZ332706A (cs) |
PT (1) | PT914339E (cs) |
RO (1) | RO120343B1 (cs) |
SK (1) | SK286115B6 (cs) |
TR (2) | TR200103297T2 (cs) |
WO (1) | WO1997044356A2 (cs) |
Families Citing this family (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6696259B1 (en) | 1995-11-13 | 2004-02-24 | Licentia Ltd. | Assays using glial cell line-derived neurotrophic factor receptors |
EP0846764A3 (en) * | 1996-11-27 | 1998-09-30 | Smithkline Beecham Plc | Glial cell line-derived neurotrophic factor alpha receptor family |
EP0948620A2 (en) * | 1996-12-06 | 1999-10-13 | Genetics Institute, Inc. | Secreted proteins and polynucleotides encoding them |
US6025157A (en) * | 1997-02-18 | 2000-02-15 | Genentech, Inc. | Neurturin receptor |
US6372453B1 (en) | 1997-02-18 | 2002-04-16 | Genetech, Inc. | Neurturin receptor |
US6777196B2 (en) | 1997-02-18 | 2004-08-17 | Genentech, Inc. | Neurturin receptor |
ATE312915T1 (de) * | 1997-02-18 | 2005-12-15 | Genentech Inc | Neurturin-rezeptor |
CA2291705A1 (en) * | 1997-04-17 | 1998-10-22 | Washington University | Receptors for tgf-.beta.-related neurotrophic factors |
AU7583898A (en) * | 1997-05-20 | 1998-12-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Gdnf receptors |
JP2001527418A (ja) * | 1997-05-22 | 2001-12-25 | セフアロン・インコーポレーテツド | グリア細胞系由来の神経栄養因子レセプター |
CA2291608C (en) * | 1997-05-30 | 2004-04-13 | Amgen Inc. | Neurotrophic factor receptors |
US7026138B1 (en) | 1998-03-23 | 2006-04-11 | Genentech, Inc. | Polynucleotides encoding GFRα3 |
AU765070B2 (en) * | 1998-03-23 | 2003-09-11 | Genentech Inc. | GFRalpha3 and its uses |
US6593133B1 (en) | 1998-07-06 | 2003-07-15 | Nsgene A/S | Neurotrophic factors |
US20020055467A1 (en) | 1998-07-06 | 2002-05-09 | Johansen Teit E. | Novel neurotrophic factors |
WO2001016169A2 (en) * | 1999-09-01 | 2001-03-08 | Biogen, Inc. | RET LIGAND 5 (Retl5) FROM HUMAN AND MOUSE |
CN102367277B (zh) | 2003-01-31 | 2014-04-09 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 突变神经胚素的聚合物偶联物 |
DK2918588T3 (en) | 2010-05-20 | 2017-08-28 | Array Biopharma Inc | Macrocyclic compounds as TRK kinase inhibitors |
US10023855B2 (en) | 2011-10-31 | 2018-07-17 | Macrogen, Inc. | Fusion protein comprising C-terminal domain of RET protein and use thereof as a diagnosing marker |
JPWO2014017491A1 (ja) * | 2012-07-26 | 2016-07-11 | 国立研究開発法人国立がん研究センター | Cep55遺伝子とret遺伝子との融合遺伝子 |
WO2014176696A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Université de Montréal | Novel biomarkers for acute myeloid leukemia |
JP6816100B2 (ja) | 2015-07-16 | 2021-01-20 | アレイ バイオファーマ、インコーポレイテッド | RETキナーゼ阻害物質としての置換ピラゾロ[1,5−a]ピリジン化合物 |
TWI704148B (zh) | 2016-10-10 | 2020-09-11 | 美商亞雷生物製藥股份有限公司 | 作為ret激酶抑制劑之經取代吡唑并[1,5-a]吡啶化合物 |
JOP20190077A1 (ar) | 2016-10-10 | 2019-04-09 | Array Biopharma Inc | مركبات بيرازولو [1، 5-a]بيريدين بها استبدال كمثبطات كيناز ret |
CN110267960B (zh) | 2017-01-18 | 2022-04-26 | 阿雷生物药品公司 | 作为RET激酶抑制剂的取代的吡唑并[1,5-a]吡嗪化合物 |
WO2018136663A1 (en) | 2017-01-18 | 2018-07-26 | Array Biopharma, Inc. | Ret inhibitors |
JOP20190213A1 (ar) | 2017-03-16 | 2019-09-16 | Array Biopharma Inc | مركبات حلقية ضخمة كمثبطات لكيناز ros1 |
TWI791053B (zh) | 2017-10-10 | 2023-02-01 | 美商亞雷生物製藥股份有限公司 | 6-(2-羥基-2-甲基丙氧基)-4-(6-(6-((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-3,6-二氮雜雙環[3.1.1]庚-3-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲腈之結晶形式及其醫藥組合物 |
TW202410896A (zh) | 2017-10-10 | 2024-03-16 | 美商絡速藥業公司 | 6-(2-羥基-2-甲基丙氧基)-4-(6-(6-((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-3,6-二氮雜雙環[3.1.1]庚-3-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲腈之調配物 |
US11603374B2 (en) | 2018-01-18 | 2023-03-14 | Array Biopharma Inc. | Substituted pyrrolo[2,3-d]pyrimidines compounds as ret kinase inhibitors |
EP3740490A1 (en) | 2018-01-18 | 2020-11-25 | Array Biopharma, Inc. | Substituted pyrazolo[3,4-d]pyrimidine compounds as ret kinase inhibitors |
EP3740486A1 (en) | 2018-01-18 | 2020-11-25 | Array Biopharma, Inc. | Substituted pyrazolyl[4,3-c]pyridinecompounds as ret kinase inhibitors |
CN112996794A (zh) | 2018-09-10 | 2021-06-18 | 阿雷生物药品公司 | 作为ret激酶抑制剂的稠合杂环化合物 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5169637A (en) | 1983-03-24 | 1992-12-08 | The Liposome Company, Inc. | Stable plurilamellar vesicles |
CA1237671A (en) | 1983-08-01 | 1988-06-07 | Michael W. Fountain | Enhancement of pharmaceutical activity |
US4762915A (en) | 1985-01-18 | 1988-08-09 | Liposome Technology, Inc. | Protein-liposome conjugates |
US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
US4956288A (en) | 1988-04-22 | 1990-09-11 | Biogen, Inc. | Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA |
US5185154A (en) | 1989-02-02 | 1993-02-09 | Liposome Technology, Inc. | Method for instant preparation of a drug containing large unilamellar vesicles |
US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
JP3021800B2 (ja) | 1990-07-24 | 2000-03-15 | セイコーエプソン株式会社 | 半導体装置及びその製造方法 |
US5219990A (en) | 1991-01-28 | 1993-06-15 | Biogen, Inc. | Papillomavirus e2 trans-activation repressors |
FR2693107B1 (fr) | 1992-07-01 | 1994-09-23 | Chauvin Laboratoire | Moyens pour la prévention de la cataracte secondaire. |
WO1995016709A2 (en) | 1993-12-13 | 1995-06-22 | Biogen, Inc. | Anti-mullerian hormone receptor polypeptides and antibodies thereto |
CA2237641A1 (en) * | 1995-11-13 | 1997-05-22 | Urmas Arumae | Glial cell line-derived neurotrophic factor receptors |
CA2246768C (en) * | 1996-03-14 | 2013-12-31 | Genentech, Inc. | Uses of gdnf and gdnf receptor |
US6455277B1 (en) * | 1996-04-22 | 2002-09-24 | Amgen Inc. | Polynucleotides encoding human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor polypeptides |
-
1997
- 1997-05-07 SK SK1524-98A patent/SK286115B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-05-07 TR TR2001/03297T patent/TR200103297T2/xx unknown
- 1997-05-07 CZ CZ0361598A patent/CZ296516B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-05-07 WO PCT/US1997/007726 patent/WO1997044356A2/en active Application Filing
- 1997-05-07 DK DK97930981T patent/DK0914339T3/da active
- 1997-05-07 CN CNB971954666A patent/CN1163509C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-07 EE EE9800377A patent/EE9800377A/xx unknown
- 1997-05-07 KR KR1020067002921A patent/KR20060024843A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-05-07 AT AT97930981T patent/ATE335003T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-05-07 JP JP54243197A patent/JP2002515743A/ja active Pending
- 1997-05-07 EP EP97930981A patent/EP0914339B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-07 CA CA002253871A patent/CA2253871C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-07 ES ES97930981T patent/ES2270465T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-07 EP EP06013826A patent/EP1757617A1/en not_active Withdrawn
- 1997-05-07 DE DE69736428T patent/DE69736428T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-07 KR KR1020057007519A patent/KR100587556B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-05-07 RO RO98-01550A patent/RO120343B1/ro unknown
- 1997-05-07 AU AU34729/97A patent/AU732392B2/en not_active Ceased
- 1997-05-07 NZ NZ332706A patent/NZ332706A/en unknown
- 1997-05-07 EA EA199800990A patent/EA002544B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-05-07 TR TR1998/02252T patent/TR199802252T2/xx unknown
- 1997-05-07 PT PT97930981T patent/PT914339E/pt unknown
- 1997-05-07 IL IL126918A patent/IL126918A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-05-07 BR BR9710665A patent/BR9710665A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-05-07 CN CNA2004100629039A patent/CN1624126A/zh active Pending
-
1998
- 1998-11-06 IS IS4884A patent/IS2361B/is unknown
- 1998-11-09 NO NO19985231A patent/NO323612B1/no unknown
- 1998-12-01 BG BG109433A patent/BG109433A/en unknown
- 1998-12-01 BG BG102973A patent/BG64907B1/bg unknown
-
2006
- 2006-11-30 NO NO20065528A patent/NO324957B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ296516B6 (cs) | Nukleová kyselina kódující ligand c-Ret, polypeptid kódovaný touto nukleovou kyselinou a zpusob jeho prípravy | |
US6677135B1 (en) | Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth | |
EP0907735B1 (en) | Modulators of tissue regeneration | |
JP2975679B2 (ja) | ヒト神経膠腫のegf受容体遺伝子の構造変化 | |
WO2001016169A2 (en) | RET LIGAND 5 (Retl5) FROM HUMAN AND MOUSE | |
WO1995016709A2 (en) | Anti-mullerian hormone receptor polypeptides and antibodies thereto | |
US20040110218A1 (en) | BMOG, a novel protein member of the myelin-oligodendrocyte glycoprotein family and its use for immunomodulatory purposes | |
PL191248B1 (pl) | Izolowane kwasy nukleinowe, wektor, komórka gospodarza, (54) sposób wytwarzania polipeptydu, polipeptyd, izolowane przeciwciało monoklonalne, kompozycja, białko fuzyjne | |
KR100554901B1 (ko) | 신경및신장증식을자극하기위한RET리간드(RetL) | |
MXPA98009309A (en) | Compounds that promote tej growth | |
CA2496906A1 (en) | Ret ligand (retl) for stimulating neural and renal growth | |
JP2003038174A (ja) | ヒトアミン受容体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090507 |