PL191248B1 - Izolowane kwasy nukleinowe, wektor, komórka gospodarza, (54) sposób wytwarzania polipeptydu, polipeptyd, izolowane przeciwciało monoklonalne, kompozycja, białko fuzyjne - Google Patents

Abstract

1. lzolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację domeny kinazy tyrozynowej białka receptorowego Ret. 2. Izolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację domeny kinazy tyrozynowej białka receptorowego Ret. 11. Wektor obejmujący wstawkę zawierającą kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z: a) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80%, korzystnie z co najmniej 90% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, najkorzystniej kodującego polipeptyd z SEK NR ID: 17, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jego domeny kinazy tyrozynowej; b) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jego domeny kinazy tyrozynowej, a jego sekwencja aminokwasowa zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdy jest dopasowana do SEK NR ID: 17; c) izolowanego kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję nukleotydową z SEK NR ID: 16. 23. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera a) izolowane przeciwciało wiążące się z polipeptydem wybranym z grupy składającej się z SEK NR ID: 15, SEK NR ID: 17 i SEK NR ID: 19, korzystnie z polipeptydem o SEK NR ID: 19, związane z (b) toksyną, związkiem umożliwiającym obrazowanie lub radionuklidem. 27. Białko fuzyjne, znamienne tym, że obejmuje polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z: a) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80%, korzystnie z co najmniej 90% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, najkorzystniej kodującego polipeptyd z SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jego domeny kinazy tyrozynowej; b) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jego domeny kinazy tyrozynowej, a jego sekwencja aminokwasowa zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdy jest dopasowana do SEK NR ID: 21; c) izolowanego kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję nukleotydową z SEK NR ID: 20; połączony z immunoglobuliną, toksyną, związkiem umożliwiającym obrazowanie lub radionuklidem.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszegowynalazku są izolowane kwasy nukleinowe, wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu, polipeptyd, izolowane przeciwciało monoklonalne, kompozycja, białko fuzyjne. Wynalazek oparty jest na ujawnieniu sekwencji nukleotydowych, które kodują ligand Ret (RetL) i znajduje zastosowanie w sposobach stymulowania wzrostu tkanki nerwowej i nerkowej przez poddanie komórek i pacjentów będących ssakami działaniu DNA albo białka RetL.

DZIEDZINA WYNALAZKU

Jednym z celów prowadzonych obecnie badań nad przekazywaniem sygnałów w komórce i aktywacją receptorów jest umożliwienie modulowania terapeutycznego procesów zaangażowanych we wzrost i przeżycie komórek. Procesy takie determinują przebieg różnych schorzeń medycznych, w tym niewydolności narządowej, rozwoju płodowego oraz wzrostu nowotworów, między innymi. Każdy z tych stanów ma kliniczne znaczenie w skali światowej i ograniczone skuteczne opcje lecznicze. Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie rozwiązań promujących regenerację albo przeżycie uszkodzonej tkanki, jak również umożliwiających leczenie chorób, obejmujących nienormalny wzrost i rozwój tkanek.

Utrata tkanki albo schyłkowa niewydolność narządu dotyka milionów ludzi na całym świecie każdego roku i przyczynia się znacznie do kosztów opieki medycznej. Utrata organu albo tkanki zwykle leczona jest przez przeszczepienie tkanki od dawców, przez rekonstrukcję chirurgiczną albo przy pomocy urządzeń mechanicznych. Każde z tych rozwiązań ma swoje wady. Transplantacja jest ograniczona przez brak dawców, rekonstrukcja chirurgiczna może stwarzać inne długoterminowe problemy, a urządzenia mechaniczne nie mogą pełnić wszystkich funkcji pojedynczego organu i dlatego nie mogą zapobiec postępującemu pogarszaniu się stanu. A zatem, istnieje rzeczywista medyczna potrzeba nowych rozwiązań tych problemów.

Czynniki białkowe, które wpływają na wzrost, różnicowanie i/lub przeżycie komórek mogą być użyteczne w leczeniu schorzeń organów, które zawierają odpowiadające komórki. Czynniki albo ligandy, które reagują z receptorami rodziny receptorowych białkowych kinaz tyrozynowych (RPTK, ang. receptor protein tyrosine kinase) są szczególnie interesujące w tym względzie. Receptory te zaangażowane są w wiele programów komórkowych, w tym we wzrost i różnicowanie komórek oraz powstawanie licznych nowotworów. A zatem te czynniki albo ligandy, które reagują z tymi receptorami mogą okazać się użyteczne w leczeniu chorób pewnych narządów, w których dochodzi do zniszczenia tkanki. Alternatywnie, może być użyteczne zablokowanie interakcji tych czynników z ich receptorami w celu zablokowania wzrostu nowotworu złośliwego.

Protoonkogen Ret koduje receptorową kinazę tyrozynową, która ulega ekspresji w czasie rozwoju różnych tkanek, w tym obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego oraz nerki. Wady obecne u myszy pozbawionych genu ret sugerują, iż białko Ret jest istotne dla migracji i unerwienia neuronów jelitowych w jelicie tylnym oraz dla proliferacji i rozgałęziania się nabłonka zawiązka moczowodu w czasie rozwoju nerki (Nature 367, 380-383, 1994). Poszukiwanie kluczowego składnika drogi przekazywania sygnałów za pośrednictwem Ret, ligandu Ret, było obszarem intensywnych badań.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z SEK NRID: 17 i SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację domeny kinazy tyrozynowej białka receptorowego Ret. Korzystnie, sekwencja aminokwasowa kodowanego polipeptydu zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdy jest dopasowana do SEK NR ID: 21. Również korzystnie, kodowany polipeptyd wykazuje 90% homologię sekwencji względem sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z SEK NR ID: 17 i SEKNR ID: 21. Korzystniej kwas nukleinowy według wynalazku koduje polipeptyd o SEK NR ID: 17 lub SEKNR ID: 21.

Przedmiotem wynalazku jest również izolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z SEKNR ID: 16 i SEKNR ID: 20.

Najkorzystniej izolowany kwas nukleinowy według wynalazku przeznaczony jest do zastosowania do leczenia lub diagnozowania.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor obejmujący wstawkę zawierającą kwas nukleinowy według wynalazku. Korzystnie wektor według wynalazku przeznaczony jest do zastosowania do leczenia lub diagnozowania.

PL 191 248 B1

Ponadto przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza, która zawiera wektor obejmujący wstawkę zawierającą kwas nukleinowy według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania polipeptydu, obejmujący etapy: hodowania komórki gospodarza, która obejmuje wektor obejmujący wstawkę zawierającą kwas nukleinowy według wynalazku; oraz odzyskiwania polipeptydu wyrażanego z wstawki w komórce gospodarza.

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy według wynalazku. Korzystnie polipeptyd według wynalazku przeznaczony jest do zastosowania do leczenia lub diagnozowania.

Przedmiotem wynalazku jest izolowane przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z polipeptydem wybranym z grupy składającej się z SEKNR ID: 15, SEKNR ID: 17, SEKNR ID: 19 i SEKNR ID: 21. Korzystnie przeciwciało według wynalazku wiąże się z polipeptydem o SEKNR ID: 19 lub SEKNR ID: 21, a korzystniej jest wytwarzane przez hybrydoma AA.FF9 lub hybrydoma AA.GE7.3. Najkorzystniej izolowane przeciwciało według wynalazku przeznaczone jest do zastosowania do leczenia lub diagnozowania.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca a) przeciwciało według wynalazku związane z (b) toksyną, związkiem umożliwiającym obrazowanie lub radionuklidem. Korzystnie kompozycja według wynalazku przeznaczona jest do zastosowania do leczenia lub diagnozowania.

Przedmiotem wynalazku jest również białko fuzyjne, obejmujące polipeptyd według wynalazku połączony z immunoglobuliną, toksyną, związkiem umożliwiającym obrazowanie lub radionuklidem. Korzystnie polipeptyd według wynalazku przeznaczony jest do zastosowania do leczenia lub diagnozowania.

Niniejszym zostały opisane oczyszczone i wyizolowane cząsteczki DNA kodujące RetL, o sekwencji nukleotydowej dowolnego RetL, ale w szczególności obejmujące: szczurzy cDNA retL1 (SEK NR ID: 1), częściowy ludzki cDNA retL1 (SEK NR ID: 8), ludzki cDNA retL1 pełnej długości (SEK NR ID: 10), ludzki cDNA retL2 (SEK NR ID: 12), mysi cDNA retL3 (SEK NR ID: 16), częściowy ludzki cDNA retL3 (SEK NR ID: 18) lub ludzki cDNA retL3 (SEK NR ID: 20). Ponadto zostały opisane białka RetL o sekwencji aminokwasowej obejmującej sekwencje: szczurzego RetL1 (SEK NR ID: 2), częściowego ludzkiego RetL1 (SEK NR ID: 9), ludzkiego RetL1 pełnej długości (SEK NR ID: 11), ludzkiego RetL2 (SEK NR ID: 13), mysiego RetL3 (SEK NR ID: 17), częściowego ludzkiego RetL3 (SEK NR ID: 19) lub ludzkiego RetL3 (SEK NR ID: 21).

Ujawniona sekwencja DNA może obejmować sekwencję (częściowego ludzkiego cDNA retL1 (SEK NR ID: 8)) wstawki DNA klonu HRL20, który ma numer ATCC 97604 lub sekwencję wstawki DNA klonu #230-5A-86-17 (szczurzego cDNA retL1 (SEK NR ID: 1), który ma numer ATCC 98047.

Oczyszczona i wyizolowana cząsteczka DNA jest przeznaczona do zapewnienia ekspresji z wytworzeniem produktu polipeptydowego w prokariotycznej lub eukariotycznej komórce gospodarza, który ma co najmniej w części pierwszorzędową konformację strukturalną i aktywność biologiczną RetL, przy czym DNA może być a) cząsteczką DNA, która obejmuje szczurzy cDNA retL1, częściowy ludzki cDNA retL1, ludzki cDNA retL1 pełnej długości, ludzki cDNA retL2, mysi cDNA retL3 lub ludzki cDNA retL3 albo nić komplementarną do szczurzego cDNA retL1, częściowego ludzkiego cDNA retL1, ludzkiego cDNA retL1 pełnej długości, ludzkiego cDNA retL2, mysiego cDNA retL3, ludzkiego cDNA retL3; b) cząsteczkami DNA, które hybrydyzują w ostrych warunkach z cząsteczkami DNA zdefiniowanymi w a) lub ich fragmentami albo c) cząsteczkami DNA, które, gdyby nie degeneracja kodu genetycznego, hybrydyzowałyby z cząsteczkami DNA zdefiniowanymi w a) i b). Ujawniona została również oczyszczona i wyizolowana cząsteczka DNA, kodująca fragment polipeptydowy lub wariant ludzkiej RetL, mające aktywność biologiczną RetL.

Opisane tu zrekombinowane cząsteczki DNA mogą być połączone w sposób funkcjonalny z sekwencją kontrolującą ekspresję.

Ujawniono również wektory i systemy dostarczania, które obejmują cząsteczki DNA i/lub konstrukty zdefiniowane w innym miejscu tego opisu. Wektor może zawierać cząsteczkę DNA kodującą RetL lub wariant RetL.

Ponadto opisano prokariotyczne lub eukariotyczne komórki gospodarza stabilnie stransformowane lub transfekowane wektorem zawierającym cząsteczkę DNA kodującą natywny wariant RetL.

Ujawniony niniejszym oczyszczony i wyizolowany ludzki RetL jest zasadniczo wolny od innych ludzkich białek. Ponadto opisany został sposób wytwarzania produktu polipeptydowego mającego w części lub w całości pierwszorzędową konformację strukturalną i aktywność biologiczną RetlL. Taki sposób może obejmować etap hodowania w odpowiednich warunkach prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarza transformowanych lub transfekowanych dowolnym opisanym tu DNA, w sposób umożliwiający ekspresję takiego produktu polipeptydowego i otrzymanie RetL. W obecnym

PL 191 248 B1 opisie ujawniono również polipeptydowy produkt ekspresji DNA w prokariotycznych lub eukariotycznych komórkach gospodarza.

Opisane zostały również białka oraz fragmenty, warianty i pochodne białka, zarówno rozpuszczalne, jak i związane z błoną. W wybranych wykonaniach, białko takie ma sekwencję aminokwasową, która obejmuje: szczurzy RetL1, częściowy ludzki RetL1, ludzki RetL1 pełnej długości, ludzki RetL2, mysi RetL3 lub ludzki RetL3 albo wariant jednej z tych sekwencji. Ponadto białko może być białkiem fuzyjnym zawierającym Ret lub RetL, połączone z inną cząsteczką lub fragmentem cząsteczki, takimi jak immunoglobulina, toksyna, związek umożliwiający uwidocznienie lub radionuklid. Ujawniono niniejszym również cząsteczki hybrydowe RetL.

W obecnym opisie zostały opisane również specyficzne monoklonalne przeciwciała wobec RetL. Takie przeciwciała mogą być połączone z toksyną, związkiem umożliwiającym uwidocznienie lub radionuklidem. Ujawnione zostały również linie komórkowe hybrydoma, które wytwarzają przeciwciała wobec ReltL, w tym AA.FF9, AA.HE3, AF.E9, BA.B1, BB.B6, AA.GE7, CD.F11, AH.E3, CD.G4, AG.E7, BD.G6 i BH.G8, jak również subklony tych hybrydoma.

Ujawniono ponadto sposób promowania wzrostu nowej tkanki lub promowania przeżycia uszkodzonej tkanki pacjenta, przez podawanie pacjentowi leczniczo skutecznej ilości związku, który oddziałuje z komórkowym Ret i w ten sposób indukuje autofosforylację Ret. Związkiem tym może być RetL1, RetL2 lub RetL3 albo fragment RetL pełnej długości albo przeciwciało, które wiąże się z Ret. Związek może być podawany jednocześnie z leczniczo skuteczną ilością drugiego związku, takiego jak GDNF, neurturyna lub cząsteczka spokrewniona z GDNF. Podczas gdy tkanki będące przedmiotem zainteresowania mogą obejmować dowolną tkankę, korzystne tkanki obejmują tkankę nerki, tkankę nerwową, serce, żołądek, jelito cienkie, rdzeń kręgowy lub płuca. Sposoby takie mogą być stosowane wobec człowieka, a stosowany w nich RetL może być rozpuszczalnym RetL.

Przekazywanie sygnału przez RetL pomiędzy pierwszą komórką wyrażającą RetL, a drugą komórką może być hamowane przez doprowadzenie do kontaktu pierwszej komórki z rozpuszczalnym białkiem Ret lub przeciwciałem przeciw RetL. Białko rozpuszczalne może być białkiem fuzyjnym.

Opisano niniejszym również sposób kierowania toksyny, związku umożliwiającego uwidocznienie lub radionuklidu do komórki wyrażającej Ret, obejmujący doprowadzenie do kontaktu komórki z białkiem fuzyjnym zawierającym RetL albo przeciwciałem anty-Ret skoniugowanymi z toksyną, związkiem umożliwiającym uwidocznienie lub radionuklidem. RetL może być RetL1, RetL2 lub RetL3. W innej metodzie, hamowany jest wzrost komórki nowotworowej, która wyraża Ret, przy czym jednym z etapów metody jest doprowadzenie do kontaktu komórki z białkiem fuzyjnym RetL i toksyny lub radionuklidu, albo z przeciwciałem anty RetL skoniugowanym z toksyną lub radionuklidem. Komórka może być w organizmie pacjenta, a białko lub skoniugowane przeciwciało podaje się pacjentowi.

Ponadto ujawniony został również sposób kierowania toksyny, związku umożliwiającego uwidocznienie lub radionuklidu do komórki wyrażającej RetL, obejmujący doprowadzenie do kontaktu komórki z białkiem fuzyjnym zawierającym Ret i toksynę, związek umożliwiający uwidocznienie lub radionuklid, albo z przeciwciałem anty-RetL skoniugowanym z toksyną, związkiem umożliwiającym uwidocznienie lub radionuklidem. Inne wykonanie obejmuje sposób hamowania wzrostu komórki nowotworowej, która wyraża RetL, obejmujący doprowadzenie do kontaktu komórki z białkiem fuzyjnym Ret i toksyny lub radionuklidu, albo z przeciwciałem anty RetL skoniugowanym z toksyną lub radionuklidem; komórka może być w organizmie pacjenta, a białko może być podawane pacjentowi.

RetL w dowolnym z wyżej opisanych sposobów może być RetL1, RetL2 lub RetL3, albo wariantem lub fragmentem RetL1, RetL2 lub RetL3.

Opisane zostały także sposoby terapii genowej. Przykładowy sposób leczenia pacjenta z nieprawidłowościami w metabolizmie Ret, obejmuje podawanie pacjentowi wektora zawierającego cząsteczkę DNA kodującą RetL. Możliwe jest również promowanie wzrostu nowej tkanki u pacjenta, przez podawanie pacjentowi takiego wektora. W obecnym opisie ujawniono również sposób promowania przeżywalności uszkodzonej tkanki, przy czym jednym z etapów jest podawanie pacjentowi leczniczo skutecznych ilości wektora kodującego RetL.

Krótki opis rysunków

Figura 1 jest sekwencją cDNA (SEK NR ID: 1) i wydedukowaną sekwencją aminokwasową (SEK NR ID: 2) retL1 szczura. Sekwencja rozciąga się od nukleotydu 201 do 1700 w SEKNR ID: 1 i zawiera całą otwartą ramkę odczytu.

PL 191 248 B1

Figura 2A jest częściową sekwencją cDNA (SEK NR ID: 8)i wydedukowaną sekwencją aminokwasową (SEK NR ID: 9) ludzkiego retL1. Sekwencja ta jest sekwencją wstawki klonu HRL20, zdeponowanego jako ATCC Nr 97604.

Figura 2B przedstawia skład sekwencji DNA pełnej długości (SEK NR ID: 10) i wydedukowaną sekwencję aminokwasową (SEK NR ID: 11) ludzkiego RetL1.

Figura 3A jest porównaniem sekwencji nukleotydowej ludzkiego RetL1 (górny wiersz w sekwencji) z sekwencją RetL1 szczura (dolny wiersz w sekwencji). Pionowe linie pomiędzy nukleotydami pokazują pozycje identyczności, a kropki przedstawiają przerwę w danej pozycji.

Figura 3B jest porównaniem sekwencji aminokwasowej ludzkiego RetL1 (górny wiersz w sekwencji) z sekwencją RetL1 szczura (dolny wiersz w sekwencji). Pionowe linie pomiędzy nukleotydami pokazują pozycje występowania identycznych reszt, a kropki przedstawiają konserwatywne podstawienia w tej pozycji aminokwasowej.

Figura 4A jest schematycznym diagramem możliwej roli Ret i RetL w oddziaływaniu pomiędzy komórką mezenchymy nerki ostatecznej i komórką zawiązka moczowodu.

Figura 4B jest schematycznym diagramem metody przeszukiwania transfektantów biblioteki cDNA pod kątem klonów, które wyrażają RetL. Obecność wyrażanego RetL na transfektantach jest wykrywana przez uzyskanie wiązania się tych transfektantów z białkiem fuzyjnym Ret/IgG, bądź z białkiem fuzyjnym Ret/alkaliczna fosfataza.

Figura 5 jest schematycznym diagramem pokazującym konstrukcję plazmidów stosowanych do wyrażania białka fuzyjnego: szczurzy Ret/IgG.

Figura 6 jest schematycznym diagramem pokazującym konstrukcję plazmidów stosowanych do wyrażania białka fuzyjnego: ludzki Ret/IgG.

Figura 7 jest sekwencją cDNA (SEK NR ID: 12) i wydedukowana sekwencją aminokwasową (SEK NR ID: 13) ludzkiego retL2, znalezionego w klonie DSW240. Otwarta ramka odczytu białka znajduje się w obrębie nukleotydów 25 do 1416.

Figura 8 jest porównaniem sekwencji nukleotydowej ludzkiego RetL2 (górny wiersz w sekwencji) z sekwencją ludzkiego RetL1 (dolny wiersz w sekwencji). Pionowe linie pomiędzy nukleotydami pokazują pozycje identyczności, a kropki przedstawiają przerwę w danej pozycji.

Figura 9 jest sekwencją cDNA (SEK NR ID: 16) i wydedukowaną sekwencją aminokwasową (SEK NR ID: 17) mysiego RetL3.

Figura 10 jest sekwencją cDNA (SEK NR ID: 20) i wydedukowaną sekwencją aminokwasową (SEK NR ID: 21) ludzkiego RetL3.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Numery identyfikacyjne sekwencji

Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe, do których odnosi się opis, otrzymały następujące numery identyfikacyjne sekwencji:

SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID SEK NR ID

- szczurzy cDNA retL1

- szczurzy RetL1 aa (aminokwasy)

- oligomer kid-13

- oligomer kid-14

- oligomer kid-15

- cDNA dla zewnątrzkomórkowego szczurzego ret

- zewnątrzkomórkowy szczurzy Ret aa

- częściowy ludzki cDNA retL1

- częściowy ludzki RetL1 aa 10 - ludzki cDNA retL1 11 - ludzki RetL1 aa

- ludzki cDNA retL2

- ludzki RetL2 aa

- częściowy mysi cDNA retL3 (EST AA50083)

- częściowy mysi RetL3 aa

- mysi cDNA RetL3

- mysi RetL3 aa

- częściowy ludzki cDNA RetL3

- częściowy ludzki RetL3 aa

- ludzki cDNA retL3

PL 191 248 B1

SEK NR ID: 21 - ludzki RetL3 aa

Definicje

Stosowany tu termin „RetL” oznacza dowolne białko, które specyficznie oddziałuje z białkiem receptorowym Ret i które, wówczas kiedy oddziałuje z Ret, daje sygnał do dimeryzacji i/lub autofosforylacji domeny kinazy tyrozynowej Ret. Sekwencje DNA, które kodują RetL i Ret są nazywane, odpowiednio, „retL” i „ret”. Ligand może być rozpuszczalny albo obecny jako związany z błoną na tej samej lub innej komórce, co cząsteczka Ret, dla której następuje włączenie autofosforylacji. Ligandy obejmują koreceptory lub dodatkowe kofaktory ligandów. Ligandy obejmują ponadto monoklonalne przeciwciała anty-Ret, które działają jak antagoniści Ret, stanowiąc sygnał dimeryzacji i autofosforylacji Ret. Ligand może być również zmodyfikowany w różny sposób, na przykład przez połączenie z innym białkiem lub radionuklidem, tworząc białko fuzyjne.

„Dopasowanie sekwencji” oznacza ułożenie jednej sekwencji, bądź nukleotydowej, bądź aminokwasowej, względem innej sekwencji w celu umożliwienia wzajemnego porównania odpowiednich części sekwencji. Przykład metody dla tej procedury dostarczył Needleman i wsp. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970). Metoda może być dogodnie zastosowana za pośrednictwem programu komputerowego, takiego jak program Align (DNAstar, Inc). Jak będzie zrozumiałe przez biegłych w tej dziedzinie, sekwencje homologiczne lub funkcjonalnie równoważne obejmują funkcjonalnie równoważne ułożenie reszt cysteinowych w obrębie konserwowanego szkieletu cysteinowego, włączając w to wstawienia lub delecje aminokwasowe, które zmieniają liniowe ułożenie tych cystein, ale nie wpływają istotnie na ich wzajemne relacje w sfałdowanej strukturze białka. A zatem, wewnętrzne przerwy i wstawienia aminokwasowe w sekwencji będącej kandydatem są ignorowane dla celów obliczania poziomu homologii aminokwasowej i identyczności pomiędzy kandydatem i cząsteczkami stanowiącymi odniesienie. Jedną z często stosowanych właściwości przy ustalaniu homologii białek jest podobieństwo w liczbie i pozycji reszt cysteinowych pomiędzy dwoma białkami.

„Klonowanie” oznacza zastosowanie technik rekombinowania in vitro w celu wstawienia konkretnego genu lub innej sekwencji DNA do cząsteczki wektora. Wcelu pomyślnego klonowania pożądanego genu, konieczne jest zastosowanie sposobów: wytworzenia fragmentów DNA, połączenia fragmentów DNA z cząsteczkami wektora, wprowadzenia złożonej cząsteczki DNA do komórki gospodarza, w której może się ona replikować i wyselekcjonowania klonu mającego docelowy gen spośród komórek gospodarza stanowiących biorcę.

„cDNA” oznacza DNA komplementarny lub będący kopią wytworzony z matrycy RNA przez działanie polimerazy DNA zależnej od RNA (odwrotnej transkryptazy). A zatem „klon cDNA” oznacza dupleks sekwencji DNA komplementarnej do cząsteczki RNA będącej przedmiotem zainteresowania, przenoszonej przez wektor do klonowania.

„Biblioteka cDNA” oznacza kolekcję zrekombinowanych cząsteczek DNA zawierających wstawki cDNA, które razem stanowią reprezentację cząsteczek RNA obecnych w całym organizmie lub tkance, w zależności od źródła matryc RNA. Taką bibliotekę cDNA można przygotować metodami znanymi biegłym w tej dziedzinie, jak opisał na przykład w Maniatis i wsp. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, jak wyżej. Generalnie, RNA izoluje się najpierw z komórek lub organizmu, z genomu którego pożądane jest sklonowanie konkretnego genu. Korzystnymi dla celów niniejszego wynalazku są linie komórkowe ssacze, a w szczególności ludzkie. Alternatywnie, RNA można wyizolować z komórek nowotworowych, pochodzących z nowotworu zwierzęcego, a korzystnie nowotworu ludzkiego. A zatem bibliotekę można otrzymać, przykładowo, z ludzkiego nowotworu nadnerczy, ale można zastosować dowolny nowotwór.

Stosowany tu termin „polimorfizm DNA” oznacza przypadki, kiedy istnieją dwie lub więcej różnych sekwencji nukleotydowych dla określonego miejsca w DNA.

„Wektor ekspresyjny” obejmuje wektory, które mają zdolność wyrażania zawartych w nich sekwencji DNA, tj. kodowane sekwencje są połączone w sposób funkcjonalny z innymi sekwencjami zdolnymi do przeprowadzania ich ekspresji. Zakłada się, chociaż nie zawsze wyraźnie o tym mówi, że wektory ekspresyjne muszą replikować się w organizmach gospodarza bądź jako episomy, bądź jako integralna część chromosomalnego DNA. Użytecznym, jakkolwiek nie koniecznym, elementem skutecznego wektora ekspresyjnego jest sekwencja kodująca marker, która jest sekwencją kodującą białko, którego rezultatem są właściwości fenotypowe (np. oporność na tetracyklinę) komórek zawierających to białko, co umożliwia łatwą identyfikację tych komórek. Podsumowując, „wektor ekspresyjny” został zdefiniowany funkcjonalnie i dowolna sekwencja DNA, która ma zdolność do zapewnienia ekspresji konkretnej zawartej w nim kodującej cząsteczki DNA jest objęta tym terminem, jeżeli jest zastosowana wobec

PL 191 248 B1 tej konkretnej sekwencji. Takie wektory mają często postać plazmidów, a zatem „plazmid” i „wektor ekspresyjny” są często stosowane zamiennie. Jednakże, możliwe jest uwzględnienie innych postaci wektorów ekspresyjnych, włączając w to faga, który spełnia równoważne funkcje i który może z czasem stać się znany w tej dziedzinie.

Podobnie, „funkcjonalna pochodna” genu dla dowolnego z białek ma obejmować „fragmenty”, „warianty” lub „analogi” genu, który może być „zasadniczo podobny” w sekwencji nukleotydowej i który koduje cząsteczkę posiadającą podobną aktywność.

„Cząsteczka spokrewniona z GDNF” oznacza dowolną cząsteczkę, która jest w co najmniej 40% homologiczna bądź z GDNF, bądź z neurturyną i ma również zdolność specyficznego wiązania się z RetL.

Termin „gen” oznacza sekwencję polinukleotydową kodującą peptyd.

„Homogeny” oznacza, w odniesieniu do peptydu lub sekwencji DNA, że pierwszorzędowa struktura cząsteczki (tj. sekwencja aminokwasów lub nukleotydów) zasadniczo wszystkich cząsteczek obecnych w branym pod uwagę związku jest identyczna.

Stosowany tu termin „oligonukleotyd” w odniesieniu do sond, fragmentów oligonukleotydowych, które mają być wykrywane, kontroli oligonukleotydowych, niewyznakowanych blokujących nukleotydów i starterów do powielania sekwencji, jest zdefiniowany jako cząsteczka zawierająca więcej niż trzy deoksyrybonukleotydy lub rybonukleotydy. Jej dokładna wielkość zależy od wielu czynników, które z kolei zależą od konkretnej funkcji lub zastosowania oligonukleotydu.

Termin „sonda” oznacza ligand o znanej jakości, zdolny do selektywnego wiązania się z docelowym antyligandem. Przy stosowaniu wobec kwasów nukleinowych, termin „sonda” oznacza nić kwasu nukleinowego, o sekwencji zasad komplementarnej do nici docelowej.

„Zrekombinowane komórki gospodarza” oznaczają komórki, które zostały stransformowane wektorami skonstruowanymi przy zastosowaniu technik rekombinowania DNA. Zdefiniowany tu termin przeciwciało lub jego modyfikacja wytworzone przez zrekombinowaną komórkę gospodarza oznacza, że powstaje ono w wyniku takiej transformacji, a nie wytworzenia w mniejszych ilościach, albo, na ogół, w mniej niż wykrywalnych ilościach, w przypadku gospodarza niestransformowanego.

Stosowany tu termin „endonukleazy restrykcyjne” lub „enzymy restrykcyjne” odnosi się do enzymów bakteryjnych, z których każdy przecina dwuniciową cząsteczkę DNA w obrębie albo w pobliżu specyficznej sekwencji nukleotydowej.

Stosowany tu termin „polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych” („RFLP”) oznacza różnice w długości konkretnego fragmentu restrykcyjnego pomiędzy poszczególnymi osobnikami. Mówi się, że cząsteczka jest „zasadniczo podobna do innej cząsteczki, jeżeli sekwencja aminokwasowa obydwu cząsteczek jest zasadniczo taka sama i jeżeli obydwie cząsteczki mają podobną aktywność biologiczną. A zatem, zakładając, że dwie cząsteczki posiadają podobną aktywność, uważa się je za warianty w znaczeniu stosowanego tu terminu, nawet jeżeli jedna cząsteczka zawiera dodatkowe reszty aminokwasowe, nie znajdywane w innej, lub jeżeli sekwencja reszt aminokwasowych nie jest taka sama. Termin „pochodna chemiczna” innej cząsteczki stosuje się tu wobec cząsteczki, która zawiera dodatkowe ugrupowanie chemiczne, nie będące normalnie częścią cząsteczki. Takie ugrupowania mogą zwiększać rozpuszczalność, absorpcję, biologiczny półokres trwania cząsteczki itd. Ugrupowania mogą alternatywnie zmniejszać toksyczność cząsteczki, eliminować lub zmniejszać dowolny niepożądany efekt uboczny cząsteczki, itd. Ugrupowania zdolne do pośredniczenia w takich efektach są ujawnione, przykładowo, w Remington's Pharmaceutical Sciences wyd. 16, Mack Publishing Co., Easton, Penn (1980).

„Wektor” oznacza cząsteczkę DNA, pochodzącą od plazmidu lub bakteriofaga, do którego można wstawić albo wklonować fragmenty DNA. Wektor będzie zawierał jedno lub więcej pojedynczych miejsc restrykcyjnych i może być zdolny do autonomicznej replikacji w określonym organizmie gospodarza albo przenośnika, tak, że klonowana sekwencja namnaża się.

„Zasadniczo czyste” oznacza dowolne białko lub dowolny gen kodujący takie białko, które są zasadniczo wolne, odpowiednio, od innych białek lub genów albo innych zanieczyszczeń, które mogą być normalnie znajdywane w naturze, i jako takie występują w postaci nie znajdywanej w naturze.

Związki

Rozwiązania według wynalazku dotyczą cDNA kodującego RetL, takiego jak sekwencja nukleotydowa szczurzego cDNA RetL1, częściowego ludzkiego cDNA RetL1, ludzkiego cDNA RetL1 pełnej długości, ludzkiego cDNA RetL2, mysiego cDNA RetL3 lub ludzkiego cDNA RetL3. Ponadto związki które mogą znaleźć zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku obejmują sekwencje, które zawierają powyższe sekwencje lub są pochodnymi jednej z takich sekwencji. Ponadto opisane zostały

PL 191 248 B1 również wektory, liposomy i inne cząsteczki przenośnikowe, które zawierają jedną z tych sekwencji lub pochodną jednej z tych sekwencji, oraz białka powstające w wyniku transkrypcji i translacji szczurzego cDNA RetL1, częściowego ludzkiego cDNA RetL1, ludzkiego cDNA RetL1 pełnej długości, ludzkiego cDNA RetL2, mysiego cDNA RetL3 lub ludzkiego cDNA RetL3, włączając w to między innymi szczurzy RetL1, częściowy ludzki RetL1, ludzki RetL1 pełnej długości, ludzki RetL2, mysi RetL3, ludzki RetL3 oraz ich pochodne i warianty.

Rozwiązania według wynalazku wykorzystają również rozpuszczalne warianty RetL. W niektórych wariantach brak jest co najmniej części odcinka wewnątrzbłonowego natywnego RetL. Warianty rozpuszczalne obejmują białka fuzyjne, które zawierają pochodne RetL z brakującym motywem fosfatydyloinozytolowym.

Warianty mogą różnić się od naturalnie występującego RetL sekwencją aminokwasową albo w inny sposób, który nie obejmuje sekwencji, albo jednym i drugim. Wytwarzane są warianty sekwencji aminokwasowej, w których jeden albo więcej aminokwasów naturalnie występujących w RetL jest podstawionych przez różne aminokwasy lub pochodne aminokwasów albo aminokwasy nie występujące natywnie. Szczególnie korzystne warianty obejmują naturalnie występujący RetL lub biologicznie aktywne fragmenty naturalnie występującego RetL, których sekwencje różnią się od typu dzikiego jednym lub więcej konserwatywnym podstawieniem aminokwasowym, które zazwyczaj mają minimalny wpływ na strukturę drugorzędową i naturę hydrofobową białka lub peptydu. Warianty mogą również mieć sekwencję, która różni się jednym lub więcej niekonserwatywnym podstawieniem aminokwasowym, delecjami i wstawieniami, które nie zaburzają aktywności biologicznej RetL. Konserwatywne podstawienia zwykle obejmują podstawienia aminokwasu o innych, ale podobnych właściwościach, takie jak podstawienie w obrębie następujących grup: walina, glicyna; glicyna, alanina; walina, izoleucyna; kwas asparaginowy, kwas glutaminowy; asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina; oraz fenyloalanina, tyrozyna. Niepolarne (hydrofobowe) aminokwasy obejmują alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Polarne obojętne aminokwasy obejmują glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę i glutaminę. Dodatnio naładowane (zasadowe) aminokwasy obejmują argininę, lizynę i histydynę. Ujemnie naładowane (kwaśne) aminokwasy obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy.

Inne konserwatywne podstawienia można znaleźć w poniższej tabeli, a jeszcze inne opisał Dayhoff w Atlas of Protein Sequences and Structure (1988).

Tabel a 1

Zastępowanie konserwatywnymi aminokwasami

Dla aminokwasu	Kod	Zastąpienie dowolnym spośród
1	2	3
Alanina	A	D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginina	R	D-Arg, Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Asparagina	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Kwas asparaginowy	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Cysteina	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamina	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Kwas glutaminowy	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
Glicyna	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Beta-Ala, Acp
Izoleucyna	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucyna	L	D-Leu, Val, D-Val, Met, D-Met
Lizyna	K	D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Metionina	M	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val, Norleu

PL 191 248 B1 ciąg dalszy tabeli 1

1	2	3
Fenyloalanina	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans 3, 4 lub 5-fenyloprolina, cis 3, 4 lub 5-fenyloprolina
Prolina	P	D-Pro, kwas L-I-tiazolidyno-4-karboksylowy, kwas D- lub L-l-oksazolidyno-4-karboksylowy
Seryna	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Treonina	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Tyrozyna	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Walina	V	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

Inne warianty w obrębie wynalazku są takimi, których modyfikacje będą zwiększać stabilność peptydu. Takie warianty mogą zawierać, przykładowo, jedno lub więcej wiązań niepeptydowych (które zastępują wiązania peptydowe) w sekwencji peptydu. Włączone są tu również: warianty, które zawierają reszty inne niż aminokwasy występujące naturalnie, takie jak D-aminokwasy lub aminokwasy nie występujące naturalnie albo syntetyczne, takie jak aminokwasy beta gamma i odmiany cykliczne. Włączenie aminokwasów D zamiast L do peptydu może zwiększać jego oporność na proteazy. Patrz np., Patent USA 5219990.

Peptydy można również modyfikować poprzez rozmaite zmiany, takie jak wstawienia, delecje i podstawienia, bądź konserwatywne, bądź niekonserwatywne, przy czym takie zmiany mogą dawać pewne korzyści przy ich zastosowaniu. Korzystne są również warianty składania.

Poza zasadniczo pełnymi polipeptydami, niniejszym dostarczono biologicznie aktywnych fragmentów polipeptydów. Polipeptyd RetL lub fragment jest biologicznie aktywny jeżeli wykazuje aktywność biologiczną naturalnie występującego RetL. Taka aktywność biologiczna obejmuje zdolność do specyficznego wiązania zewnątrzkomórkowej części Ret, z powinowactwem wynoszącym co najmniej 50%, a korzystniej, co najmniej równej powinowactwu naturalnie występującego RetL.

Warianty z podstawieniami aminokwasowymi, które są mniej konserwatywne mogą również dawać w rezultacie pożądane pochodne, np. przez powodowanie zmian w ładunku, konformacji i innych właściwościach biologicznych. Takie podstawienia będą obejmowały, przykładowo, podstawienie reszty hydrofilowej resztą hydrofobową, podstawienie cysteniny lub proliny inną resztą, podstawienie reszty mającej mały łańcuch boczny resztą mającą duży łańcuch boczny lub podstawienie reszty mającej ładunek dodatni resztą mającą ładunek ujemny. Kiedy wyniku danego podstawienia nie można przewidzieć z całą pewnością, pochodne można łatwo testować zgodnie z ujawnionymi tutaj sposobami w celu określenia obecności lub braku pożądanych właściwości.

Generalnie, podstawienia, dla których można się spodziewać, że będą indukowały zmiany we właściwościach funkcjonalnych polipeptydów RetL, są takimi, w których: (I) reszta hydrofilowa, np. seryna lub treonina jest podstawiona resztą hydrofobową, np. leucyną, izoleucyną, fenyloalaniną lub alaniną; (ii) reszta cysteinowa jest zastąpiona przez dowolną inną resztę; (iii) reszta mająca dodatnio naładowany łańcuch boczny, np. lizyna, arginina lub histydyna jest wymieniona na resztę mającą ładunek elektryczny ujemny, np. kwas glutaminowy lub kwas asparaginowy, lub (iv) reszta mająca duży łańcuch boczny, np. fenyloalanina jest zamieniona na aminokwas nie mający takiego łańcucha bocznego, np. glicyną.

Warianty mogą obejmować białka i peptydy o sekwencjach aminokwasowych mających co najmniej sześćdziesiąt procent homologii ze szczurzym RetL1 (SEK NR ID: 2), częściowym ludzkim RetL1 (SEK NR ID: 9), ludzkim RetL1 pełnej długości (SEK NR ID: 11), ludzkim RetL2 (SEK NR ID: 13), mysim RetL2 (SEK NR ID: 17), częściowym ludzkim RetL3 (SEK NR ID: 19) lub ludzkim RetL3 (SEK NR ID: 21). Bardziej korzystne jest, jeżeli homologia wynosi co najmniej osiemdziesiąt, co najmniej dziewięćdziesiąt lub co najmniej dziewięćdziesiąt pięć procent. Dla celów określenia homologii, długość porównywanych sekwencji będzie wynosiła co najmniej 8 reszt aminokwasowych, zwykle co najmniej 20 reszt aminokwasowych. Warianty związków obejmują również dowolne białko, które 1) ma sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej czterdziestu procentach homologiczna do białka RetL, a także, która 2) po optymalnym dopasowaniu do sekwencji RetL (jak przedstawiono dla RetL1 i RetL2 na fig. 8), ma co najmniej 80% reszt cysteinowych odpowiadających cysteinom białka RetL.

PL 191 248 B1

Tak, jak jest możliwe zastąpienie części składowych rusztowania, możliwe jest również podstawienie grup funkcyjnych, które są dołączone do rusztowania grupami o podobnych właściwościach. Takie modyfikacje nie zmieniają sekwencji pierwszorzędowej. Wyjściowo mogą być one konserwatywne, tj. podstawienie grupą, która ma w przybliżeniu taki sam rozmiar, hydrofobowość i ładunek, jak grupa wyjściowa. Modyfikacje nie dotyczące sekwencji obejmują, przykładowo, tworzenie in vivo i in vitro pochodnych chemicznych części naturalnie występującego RetL, jak również zmiany w acetylacji, metylacji, fosforylacji, karboksylacji lub glikozylacji.

Opisane zostały również czynniki, które specyficznie wiążą się z białkiem lub fragmentem białka. Czynniki te obejmują białka fuzyjne Ig i przeciwciała (włączając w to pojedyncze łańcuchy, podwójne łańcuchy, fragmenty Fab i inne, zarówno natywne, jak i humanizowane, prymatyzowane lub hybrydowe). Dodatkowe opisy tych kategorii czynników znajdują się w zgłoszeniu PCT 95/16709, opis który jest tu włączony jako odniesienie.

PROCEDURY DOŚWIADCZALNE

Zarys ogólny strategii

Ogólna strategia zastosowana do klonowania RetL jest pokazana na fig. 4A i 4B. Nasza strategia opiera się na założeniu, że co najmniej RetL jest wyrażany w mezenchymie nerki ostatecznej rozwijającej się nerki jako białko błonowe (jakkolwiek możliwe jest, że ligand jest również wyrażany w postaci rozpuszczalnej, fig. 4A). RetL oddziałuje z receptorem Ret w komórkach zawiązka moczowodu, aktywując jego domenę cytoplazmatyczną kinazy tyrozynowej i przesyła sygnał do jądra, który z kolei aktywuje geny zaangażowane we wzrost i rozgałęzianie się zawiązka moczowodu. A zatem, białka zawierające zewnątrzkomórkową domenę Ret, połączone bądź z częścią Fc ludzkiej immunoglobuliny G1 (IgG1), bądź alkaliczną fosfatazą, mogą być zastosowane jako część strategii klonowania RetL, jak pokazano na fig. 4B. Białka fuzyjne, biblioteki ekspresyjne i inne związki zastosowane do klonowania RetL1 są opisane poniżej.

Najpierw wyizolowaliśmy cDNA dla szczurzego RetL1, a następnie użyliśmy go jako sondę do wyizolowania cDNA dla ludzkiego RetL1. Kolejno izolowane były cDNA dla RetL2 i RetL3.

Wytworzenie odczynników wymaganych do klonowania ligandów Ret poprzez bezpośrednią ekspresję

1. Izolacja cDNA kodującego domenę zewnątrzkomórkową szczurzego Ret.

W celu zidentyfikowania RetL1, wytworzono białko fuzyjne zawierające zewnątrzkomórkowe domeny Ret, szczurzego bądź ludzkiego, połączone z białkiem, w jednym z przykładów, częścią Fc ludzkiej IgG1, a w innym przykładzie z alkaliczną fosfatazą. Obecność obydwu partnerów fuzji można łatwo testować w celu wykrycia komórek, które wyrażają ligand, jak przedstawiono na fig. 4B.

Ponieważ cDNA kodujący szczurzy Ret nigdy nie był ujawniony, wyizolowaliśmy cDNA kodujący zewnątrzkomórkową domenę receptora Ret, stosując metodę reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą, metoda RT-PCR (ang. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Porównaliśmy dwie sekwencje nukleotydowe ludzkiego (Numer dostępu w Genebanku M57464 i X15262) i mysiego (Numer dostępu w Genebanku X67812) ret i zaprojektowaliśmy startery oligonukleotydowe dla regionów o wysokiej identyczności pomiędzy tymi dwiema sekwencjami. Oligomer sensowny, nazwany kid-013 (SEK NR ID: 3; zawiera nukleotydy 150-169 z sekwencji Genebank

Χ15262) wybrano z końca 5' sekwencji ludzkiego cDNA ret, obejmującej kodon inicjacyjny ATG. Na końcu 5' zawiera on nukleotydy, kodujące miejsce restrykcyjne Notl dla celów klonowania. Dwa oligomery antysensowne, nazwane kid-014 (SEK NR ID: 4; zawierają sekwencję komplementarną wobec nukleotydów 1819-1839 z sekwencji Genebank M57464) i kid-015 (SEK NR ID: 5; zawierają sekwencję komplementarną wobec nukleotydów 1894-1914 z sekwencji Genebank X67812) wybrano, odpowiednio, z sekwencji cDNA ludzkiej i mysiej, bezpośrednio 5' w stosunku do sekwencji, które kodują domeny transbłonowe. Oligomery kid-014 i kid-015 zawierają dodatkowe nukleotydy na swoich końcach 5', które kodują miejsce restrykcyjne SalIdla celów klonowania.

Całkowity RNA izolowano z 14-dniowej embrionalnej szczurzej nerki i oczyszczano mRNA przy zastosowaniu chromatografii na oligo-dT. mRNA przekształcano w cDNA przy zastosowaniu odwrotnej transkryptazy AMV, a cDNA przekształcano w dwuniciowy cDNA i powielano przy zastosowaniu polimerazy Taq w standardowej reakcji łańcuchowej polimerazy z oligomerami kid-013 i kid-015. Syntezę fragmentu PGR o wielkości 1942 bp potwierdzano poprzez puszczenie próbki reakcji PCR na 1% żel agarozowy. Resztę fragmentu PCR trawiono Notl i Ncol i klonowano w pSAB132, strawionym uprzednio Notl i SalI. Otrzymany w rezultacie plazmid nazwano pJC011. Całą wstawkę w plazmidzie pJC011, zawartą pomiędzy miejscami Notl i SalI zsekwencjonowano i wykazano, że jest to cDNA dla

PL 191 248 B1 zewnątrzkomórkowego ret szczura, SEK NR ID: 6. Translacja tej sekwencji dała sekwencję peptydową (SEK NR ID: 7) zewnątrzkomórkowego Ret szczura. Ponieważ oligomery do PCR wybrano z ludzkiej i mysiej sekwencji ret, możliwe jest, że sekwencja oligonukleotydowa i sekwencja peptydowa pokazana jako sekwencja dla zewnątrzkomórkowego Ret szczura, mogą różnić się od naturalnie występującej sekwencji nukleotydowej ret i peptydowej Ret w regionach sekwencji kid-013 i kid-015. Następnie wyizolowano klony szczurzego cDNA z biblioteki cDNA z 18-dniowej embrionalnej szczurzej nerki i zaobserwowano kilka zmian nukleotydowych w regionach starterów, prowadzących w rezultacie do dwóch zmian aminokwasowych. Jedna zmiana jest w sekwencji sygnałowej (argininy w pozycji 6 na treoninę) i jedna zmiana znajduje się blisko końca domeny zewnątrzkomórkowej (kwasu glutaminowego w pozycji 633 na alaninę). Obydwie zmiany nie powinny wpływać na wiązanie ligandu.

2. Białka fuzyjne Ret/IgG

Wytworzono białka fuzyjne składające się z zewnątrzkomórkowych domen receptorów Ret, szczurzego (reszty aminokwasowe #1-637) i ludzkiego (reszty aminokwasowe #1-636) połączonych z częścią Fc ludzkiej IgG1.

Konstrukcja plazmidów zastosowanych do ekspresji białka fuzyjnego Ret/IgG jest pokazana schematycznie na fig. 5. W celu skonstruowania genu kodującego białko fuzyjne Ret/IgG, pJC011 (opisany powyżej), zawierający zewnątrzkomórkową domenę Ret trawimy SalI i poddajemy ligacji z fragmentem SalI o długości 700 bp z plazmidu 2-4, w celu wytworzenia plazmidu pJC012. Ten fragment SalI zawiera część Fc ludzkiej IgG1, pochodzący wyjściowo z plazmidu pSAB144. Plazmid 2-4 został uprzednio wytworzony przez potrójną ligację: fragmentu Notl - SalI, wytworzonego przez PCR, zawierającego zewnątrzkomorkową domenę króliczego receptora TGF typu II; fragmentu SalI - Notl o wielkości 693 bp z pSAB132 zawierającego część Fc ludzkiej IgG1; oraz pSAB132 strawionego Notl. Jak pokazano na fig. 5, fragment zawierający domenę Fc można uwolnić z plazmidu 2-4 jako fragment SalI o długości 700 bp. PJC012 transfekuje się do komórek COS i białko fuzyjne szczurzy Ret/IgG oczyszcza się z pożywki 48 godz. później, stosując chromatografię na złożu Sepharose Protein-A. W celu uzyskania stabilnej linii komórkowej wytwarzającej białko szczurzy Ret/IgG, fragment Notl pJV012 o wielkości 2612 bp, zawierający całe białko fuzyjne szczurzy Ret/IgG izoluje się i klonuje w miejscu Notl wektora ekspresyjnego pMDR901. Otrzymany w rezultacie plazmid nazwano pJC022. Plazmid pJC022 transfekuje się do komórek COS w celu wytworzenia stabilnych linii komórkowych. Linie komórkowe o największej wydajności adaptuje się do hodowli zawiesinowej. Typowa wydajność dla szczurzej linii CHO Ret/IgG wynosi 75 mg/l.

Konstrukcja plazmidów stosowanych do ekspresji białka fuzyjnego ludzki Ret/IgG jest pokazana schematycznie na fig. 6. W celu wytworzenia genu kodującego białko fuzyjne ludzki Ret/IgG, otrzymaliśmy plazmid zawierający cDNA kodujący ludzki receptor Ret od Dr M. Takahashi (Department of Patology, Nagoya University, School of Medicine, Nagoja, Japonia). Fragment PCR jest wytworzony z tego plazmidu przy użyciu oligomerów kid-013 i kid-014. Fragment PCR traktuje się fragmentem Klenowa, a następnie trawi Notl w celu otrzymania fragmentu PCR z lepkim końcem Notl i jednym tępym końcem. Fragment ten jest wklonowany do wektora pGEM11zf(+) poprzednio strawionego EcoRI, traktowanego fragmentem Klenowa i strawionego Notl w celu wytworzenia lepkiego końca Notl i jednego tępego końca. Otrzymany w rezultacie plazmid nazwano pJC013. Fragment Notl - SalI z pJC013, o wielkości 1916 bp, izoluje się po całkowitym strawieniu Notl i częściowym trawieniu SalI i poddaje się ligacji z fragmentem SalI - Notl z pSAB144, o wielkości 693 bp, zawierającym część domeny Fc z ludzkiej IgG1 oraz wektorem ekspresyjnym pSAB132, strawionym Notl. Otrzymany w rezultacie plazmid nazwano pJC015. Wstawkę w plazmidzie pJC013 sekwencjonowano i stwierdzono, że zawiera pojedynczą różnicę nukleotydową, która zmienia jeden aminokwas w zewnątrzkomórkowej domenie ludzkiego Ret (sekwencja Genbank M57464 ma C w pozycji 812, podczas gdy pJC013 ma w odpowiadającej pozycji T; prowadzi to w rezultacie do zmiany aminokwasu alaniny na walinę w pozycji 294 sekwencji ludzkiego białka Ret). Ten nukleotyd podlega korekcie do zasady C określonej w sekwencji M57464 w Genebanku, przez mutagenezę miejscowo specyficzną plazmidu pJC013, z wytworzeniem plazmidu pJC023. Fragment BstE2 z pJC023, o wielkości 585 bp, zawierający naprawioną sekwencję nukleotydową izoluje się i klonuje do plazmidu pJC015, z którego został usunięty fragment BstE2 o wielkości 585 bp, zawierający wariant nukleotydowy. Nowy plazmid nazwano pJC024. Fragment Notl o wielkości 2609 bp z pJC024, zawierający całe białko fuzyjne ludzkie Ret/IgG izolowano i klonowano w miejscu Notl wektora ekspresyjnego pMDR901. Otrzymany w rezultacie plazmid nazwano pJC025. Plazmid pJC025 transfekuje się do komórek COS w celu wytworzenia stabilnych

PL 191 248 B1 linii komórkowych. Linie komórkowe o największej wydajności adaptuje się do hodowli zawiesinowej. Typowa wydajność dla ludzkiej linii CHO Ret/IgG wynosi 6 mg/l.

Dalsze szczegóły wytwarzania wektorów zastosowanych w sposobach tu opisanych są przedstawione w zgłoszeniach PCT 94/01456 i 92/02050, których opisy są tutaj jest włączone jako odniesienie.

3. Aktywność biologiczna białek fuzyjnych Ret/IgG.

W celu określenia, czy białka fuzyjne Ret/IgG, które wytworzyliśmy, wykazują aktywność biologiczną i zatem byłyby dobrymi środkami do badań przesiewowych w celu sklonowania RetL, przeprowadzamy kilka testów hodowli narządowych dla określenia aktywności biologicznej. Test hodowli narządowej polega na hodowaniu nerek pochodzących od 13-14-dniowego płodu szczura w hodowli narządowej przez 3-5 dni w obecności białka fuzyjnego Ret/IgG w stężeniu 50 μg/ml. Nerki hoduje się również w obecności LFA-3TIP/IgG albo buforu nośnikowego. Po okresie hodowli, niektóre z nerek barwi się fluoroscencyjną lektyną Dolichos Biflorus Aglutinin (lektyną DB), która wybarwia tkanki kanalików zbiorczych, które są komórkami nabłonkowymi pochodzącymi z zawiązka moczowodu. Te „DBdodatnie” komórki wyznaczają komórki Ret-dodatnie, ponieważ Ret ulega ekspresji w zawiązku moczowodu i jego pochodnych nabłonkowych. Zapewnia to zgrubne oszacowanie wpływu białka fuzyjnego Ret/IgG na wzrost i rozwój nerki płodowej. Istnieje wyraźna różnica w morfologii i wzroście kanalika zbiorczego pomiędzy nerkami, które hodowano z LFA-3TIP a hodowanymi ze szczurzym białkiem fuzyjnym Ret/IgG. Nerki poddane działaniu Ret/IgG mają kanaliki zbiorcze, które wykazują znacznie mniej rozgałęzień i są typowo ogólnie mniejsze.

Skrawki parafinowe przygotowuje się z innych nerek do badania histologicznego. Nerki płodowe poddaje się obróbce buforem kontrolnym albo Ret/IgG, a następnie barwi hematoksyliną i eozyną. Nerki płodowe poddane działaniu Ret/IgG wykazują mniejsze rozgałęzianie się kanalików zbiorczych niż nerki płodowe poddane działaniu buforu kontrolnego. Dodatkowo, nerki poddane działaniu Ret/IgG mają mniej kanalików. Zaobserwowaliśmy również ten efekt dla ludzkiego białka fuzyjnego Ret/IgG. Te obserwacje zgodne są z blokowaniem przez białka fuzyjne sygnału indukcyjnego pomiędzy mezenchymą a zawiązkiem moczowodu. Dlatego też wyciągamy wniosek, iż białko fuzyjne jest dobrym odczynnikiem do klonowania RetL.

4. Białko fuzyjne Ret/fosfataza zasadowa

Białka fuzyjne receptor/fosfataza zasadowa (AP) wykorzystywano z sukcesem do identyfikacji i klonowania ligandu dla c-kit (Cell63:185, 1990), ligandów dla członków rodziny eph receptorów sierocych (Cell79:157, 1994) a ostatnio do klonowania receptora dla leptyny, produktu genu ob (Cell83:1263, 1995). Konstruuje się plazmidy kodujące białko fuzyjne Ret/AP, a białko szczurze Ret/AP wytwarza się w komórkach COS7 w fabrykach komórkowych. Następnie, wytwarza się stabilną linię komórkową NIH3T3, wykazującą ekspresję średnio 10 mg/l białka fuzyjnego. Analiza SDS-PAGE białka szczurzego Ret/AP wskazuje, iż jego rozmiar zgodny jest z przewidywaną masą cząsteczkową, a analiza filtracyjna żelu wskazuje iż jest ono wytwarzane jako dimer. Częściowe oczyszczenie uzyskuje się metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie anty-AP.

5. Przeciwciała anty-Ret

Wytwarza się królicze przeciwciało poliklonalne przeciw białku fuzyjnemu Ret/IgG. Przeciwciało to działa na filtrach Western, w analizie FACS linii komórkowych Ret-dodatnich oraz w immunohistochemii skrawków nerki płodowej.

Wytworzono zestaw monoklonalnych chomiczych przeciwciał anty-szczurze Ret. Szczurze białko fuzyjne Ret/IgG, sprzężone ze złożem Protein A Sepharose, stosuje się do immunizacji chomików armeńskich. Uzyskano 316 klonów po fuzji i przeszukano je pod kątem ich zdolności do wiązania szczurzych białek fuzyjnych Ret/IgG i/lub ludzkiej IgG w teście ELISA. 11 klonów wytwarza przeciwciała, które wiążą się wyłącznie ze szczurzym Ret/IgG (i szczurzym Ret/AP), ale nie z ludzką IgG. Krzyżowa reaktywność ludzkiego Ret oceniana jest metodą FACS; cztery klony wytwarzają przeciwciała, które mogą wiązać się z Ret-dodatnią ludzką linią komórkową THP-1. Poniższa tabela podsumowuje własności wiązania Ret dwunastu przeciwciał monoklonalnych.

PL 191 248 B1

Klon	ELISA szczur Ret/Ig	FACS człowiek THP-1
AA.FF9.5	+	-
AA.HE3.7	+	+
AF.E9.5	+	-
BA.B1.16	+	-
BB.B6	+	-
AA.GE7.3	+	-
CD.F11.2	+	-
AH.E3.11	+	+
CD.G4.2	+	+
AG.E7.9	+	-
BD.G6	+	+
BH.G8	-	-

6. BibliotekaekspresyjnacDNA

Sporządziliśmy biblioteki cDNA ze szczurzej embrionalnej nerki, jedną na wektorze CDN8, który wykorzystuje do amplifikacji miejsce replikcji SV40 i jedną na zmodyfikowanym wektorze InVitrogenu, pCEP4, który wykorzystuje dla amplifikacji miejsce replikacji EBV. Ten zmodyfikowany wektor, CH269, ma usuniętą sekwencję genu EBNA-1. Białko EBNA-1 oddziałuje z miejscem replikacji EBV, ale gen nie jest potrzebny na wektorze, kiedy stosuje się komórki, które stabilnie wytwarzają białko EBNA. Biblioteka w wektorze CDM8 zawiera 1,5x 10⁶ klonów,z przeciętną wielkością wstawki 1,18 kb, podczas gdy biblioteka na wektorze CH269 zawiera w przybliżeniu 1 x10⁶ klonów, zprzeciętnąwielkością wstawki 1,5kb.

KlonowanieliganduRet,RetL1,przezekspresję

A. Klonowanie szczurzego ligandu Ret, RetL1

1. PoczątkowepróbyklonowanialiganduRet,RetL1, przez ekspresję

Aby sklonowac RetL1, wypróbowano kilka metod opartych na bezpośredniej ekspresji. Koncepcję wszystkich tych metod przedstawia fig. 4B. cDNA z biblioteki cDNA wprowadzano do komórek ssaków; komórki, które otrzymały RetL1można zidentyfikować przy użyciu białek fuzyjnych Ret. Chociaż trzy opisane poniżej podejścia nie zakończyły się sukcesem, zdobyto istotną wiedzę i doświadczenie, które zostało wykorzystane w następnym podejściu, które zaowocowało sukcesem.

a. Metoda wyłapywania na płytkach przy pomocy Ret/IgG - W próbie izolacji RetL1 przez klonowanie oparte na bezpośredniej ekspresji metodą wyłapywania na płytkach (Aruffo i Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8753-8757 (1987)) użyto białko fuzyjne Ret/IgG. Do wyłapywania na płytkach wykorzystano bibliotekę cDNA z nerki 18-dniowego embrionu szczurzego w CDM8. Pule cDNA z tej biblioteki (5000-10000 cDNA na pulę) wprowadzono do komórek COS używając metody DEAEdekstran. Po 48 godzinach komórki usunięto z szalek za pomocą EDTA, inkubowano z białkiem fuzyjnym, a następnie wyłapywano na płytkach pokrytych przeciwciałem przeciw ludzkiej IgG1. DNA odzyskanym ze związanych komórek, ponownie transformowano E. coli i izolowano do następnej rundy wyłapywania. Nie udało się zaobserwować żadnej związanej komórki po trzeciej rundzie wyłapywania, a po ponownej transformacji niewiele klonów uzyskano E. coli DNA Hirt. cDNA VCAM użyte w połączeniu z przeciwciałem monoklonalnym przeciw VCAM jako kontrolą pozytywną można rozcieńczyć do stosunku 1:100 i nadal pozostanie wykrywalnym, co wskazuje, że wielkości zastosowanych pul są prawdopodobnie zbyt duże. Analiza niektórych klonów uzyskanych po drugiej rundzie wyłapywania wskazuje, że klony ulegają rearanżacji i delecji.

b. Metoda preparatywna FACS z Ret/IgG - 80000 klonów cDNA z biblioteki z nerki 18-dniowych embrionów szczurzych (wektor CDM8) wprowadzono do komórek COS7 i poddano preparatywnej metodzie FACS, używając szczurzego białka Ret/IgG, a następnie wyznakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych. Zebrano 0,5% i 0,9% komórek o najsilniejszej fluorescencji i odzyskano DNA plazmidowy przez lizę Hirt. Tym DNA transformowano E. coli poprzez elektroporację: otrzymano

PL 191 248 B1

228 klonów dla puli 0,5% i 752 klony dla puli 0,9%. Odzyskano DNA z klonów bakteryjnych i przeprowadzono drugą rundę preparatywnego FACS. Analizowano plazmidy odzyskane klonów bakteryjnych na końcu drugiej rundy i zauważono, że zawierają obszerne delecje i rearanżacje.

c. Metoda detekcji kolorymetrycznej z Ret/IgG - Komórki COS transfekowano 400 pulami klonów cDNA (1000 klonów na pulę) z biblioteki cDNA z nerki 18-dniowego embrionu szczurzego (wektor CDM8) i barwiono białkiem Ret/AP i substratem kolorymetrycznym dla alkalicznej fosfatazy (AP). Transfekowane komórki przeglądano pod mikroskopem pod kątem pozytywnych sygnałów. W jednym eksperymencie ponownie analizowano pięć potencjalnych sygnałów pozytywnych, lecz wszystkie były negatywne.

Jako kontrolę dla białka Ret/AP wytworzono białko VCAM/AP przez fuzję ludzkiego VCAM z N-końcem łożyskowej AP. (VCAM wiąże się z integryną VLA4, która składa się z dwóch łańcuchów, alfa-4 i beta-1). Szybkie transfekcje komórek COS dostarczały wystarczających ilości białka VCAM/AP do eksperymentów kontrolnych. Białko VCAM/AP porównywano z VCAM/IgG bezpośrednio związanym z AP i do VCAM/IgG z drugorzędowym przeciwciałem z przyłączonym AP, aby oszacować zdolność wykrywania VLA4 na komórkach COS transfekowanych cDNA łańcucha alfa-4 (komórki COS wyrażają już łańcuch beta-1). Wyniki pokazują, że o ile białko VCAM/AP mogło wykryć VLA4 na transfekowanych komórkach, to na najlepszą detekcję pozwalało białko VCAM/IgG w kombinacji z AP przyłączonym do drugorzędowego przeciwciała.

d. Wnioski metodologiczne

Trzy najważniejsze wnioski nasunęły się po tych wstępnych próbach klonowania:

1. Metody wymagające odzyskiwania DNA plazmidowego w kilku rundach (np. wyłapywanie na płytkach i preparatywny FACS) nie są odpowiednie, gdy ilość docelowego cDNA jest niska, ponieważ w czasie kolejnych rund wykrywane są rearanżacje i delecje. Niska ekspresja Ret jest dobrym powodem by podejrzewać, że ekspresja RetL1 jest także niska. Korzystnym podejściem jest transfekcja w pulach i użycie metody pozwalającej na zidentyfikowanie pozytywnej puli. Wyjściowa pula może być następnie dzielona bez konieczności odzyskiwania DNA podlegającego ekspresji ze stransfekowanych komórek.

2. Białko Ret/IgG związane z drugorzędowym odczynnikiem pozwala na lepszą detekcję niż białko Ret/AP

3. Eksperymenty kontrolne z kontrolnym białkiem VCAM/IgG (i AP przyłączonym do drugorzędowego przeciwciała) i cDNA integryny alfa-4 (rozcieńczonym w wektorze CDM8 i w transfekowanym do komórek COS) wskazują, że nasza zdolność detekcji jest rzędu jeden na tysiąc (wielkość puli nie może przekroczyć 1000 klonów). By osiągnąć wyższy poziom czułości, zmieniliśmy wektor z pochodzącego od SV40 (wyrażany w komórkach COS) na pochodzący od EBV (wyrażany w liniach komórkowych EBNA-pozytywnych). Wektory oparte na EBV są osiągalne jako episomy i nie są toksyczne dla komórek jak wektory pochodzące od SV40 po amplifikacji. Istnieją istotne dowody na to, że geny mogą ulegać ekspresji przy wysokim poziomie tych wektorów i, że cDNA może być rozcieńczane znacznie bardziej (1 do 80000) i nadal być wykrywanym.

2. Przeszukiwanie pul z biblioteki cDNA opartej na wektorze pochodzącym z EBV

Przeszukiwano pule klonów z biblioteki cDNA z nerki 18-dniowego embrionu szczurzego (wektor CH269 z miejscem startu replikacji z EBV) przy użyciu białka fuzyjnego szczurzy Ret/IgG. W jednym eksperymencie stworzono 256 pul, z których każda zawierała 5000 klonów z tej biblioteki. Pokrótce, biblioteki cDNA mianowano, wysiewano 5000 komórek (256 razy) i pozwalano rosnąć przez noc. Kolonie zdrapywano do pożywki: część hodowli użyto do zabankowania puli w glicerolu (przechowywano w -70), a część użyto do wytworzenia plazmidu. DNA z 256 pul indywidualnie transfekowano komórki 293/EBNA (8 x 10⁵ na płytkę 60mm) używając metody lipofekcji. Po 48 godzinach komórki płukano dwa razy buforem HBHA (0,5 mg/ml BSA; 0,1% NaN3; 20 mM HEPES (pH 7,0) i inkubowano z 20 μg/ml szczurzego Ret/IgG w soli fizjologicznej buforowanej Tris z 1 mM MgCl₂ i CaCl₂ przez 60-90 min. w temperaturze pokojowej. Po tej inkubacji, komórki płukano cztery razy buforem HBHA i utrwalano roztworem 60% acetonu/3% formaldehydu/20 mM HEPES (pH 7,0) przez 30 sekund. Po dwukrotnym płukaniu buforem HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7,0)), komórki inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem związanym z AP (kozie przeciwciało przeciw ludzkiej IgG specyficzne dla

Fc- gamma F(ab')₂ (Jackson Immuno Research Laboratories; numer katalogowy #109-056-098; rozcieńczone1:5000 wsolifizjologicznej buforowanej Trisz 1mMMgCl2 i CaCl2) przez60min. wtemperaturze pokojowej. Następnie komórki płukano dwukrotnie w buforze HBSidwukrotniewbuforzedlasubstratu dla AP (100 mM Tris-HCl (pH 9,5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) zawierającym 2XPierce Immuno Pure^R

PL 191 248 B1

Phosphatase Supresor (numer katalogowy #35002). Ostatnie płukanie pozostawiono na 15 min. Następniedodawano substraty dla AP:NBT (0,33 mg/ml) i BCIP (0,17 mg/ml) w buforze dla substratu dla AP zawierającym inhibitor Pierce dla AP iinkubowanoz komórkami przez 5-20min. Płytki dwukrotnie płukano wodą. Następnie płytki przeglądano pod mikroskopem z mikromanipulatorem pod kątem obecności komórek zabarwionych na purpurowo.

Po analizie 256 pul, w pierwszym przeszukiwaniu zidentyfikowano 17 pul pozytywnych. DNA z każdej pozytywnej puli retransfekowano do komórek 293/EBNA i powtarzano powyższą procedurę z kilkoma dodatkowymi eksperymentami kontrolnymi, aby potwierdzić, że obserwowane zabarwienie jest specyficzne dla Ret/IgG. 10 z 17 pul wykazuje zabarwienie tylko z białkiem fuzyjnym Ret/IgG, anie z innymi białkami fuzyjnymi IgG.

3. Dzieleniepuli#230

Jako przykład, jedna z wyżej opisanych pozytywnych pul, oznaczona #230, została podzielona na mniejsze podpule, aby zidentyfikować cDNA znajdujący się w puli nadający zdolność wiązania białka fuzyjnego Ret/IgG. 600 komórek z banku glicerolowego dla puli #230 wysiewano (10 razy) i hodowano przez noc. Kolonie na tych płytkach zdrapywano do pożywki: jedną dziesiątą hodowli użyto do stworzenia banku w glicerolu, a pozostałą porcję użyto do izolacji DNA. Dziesięć podpul 600 klonów oznaczono 230-1A do 230-5A i 230-1B do230-5B. DNA z tych podpul transfekowano do komórek 293/EBNA i powtarzano opisaną wyżej procedurę barwienia białkiem fuzyjnym Ret/IgG. Jedna podpula #230-A5 była pozytywna na barwienie białkiem Ret/IgG.

Pula #230-A5 została dalej podzielona, aby zidentyfikować cDNA znajdujący się w puli nadający zdolność wiązania białka fuzyjnego Ret/IgG. Komórki z banku glicerolowego puli 230-5A wysiewano i hodowano przez noc. Kolonie przenoszono do studzienek siedmiu 96-studzienkowych płytek Biblocks® i hodowano przez noc. Z każdej z 96-studzienkowych płytek Biblock stworzono 4 pule po20 klonów i 1pulę o 16 klonach. Tak więc utworzono 35 pul z 7 płytek Biblocks® oznaczonych 230-5A-71 do 230-5A-105. DNA izolowano z każdej z tych pul i transfekowano do komórek 293/EBNA i ponownie oznaczano białkiem fuzyjnym Ret/IgG jak opisano wyżej. Pozytywna była pula 230-5A-86.

Pulę #230-A5-86 podzielono przez powrót do płytki Biblock i identyfikację 20 klonów, które zmieszano by utworzyć pulę. Ze wszystkich 20 klonów wyizolowano DNA i transfekowano pojedynczo komórki 293/EBNA i ponownie oznaczano białkiem fuzyjnym Ret/IgG jak opisano wyżej. Stwierdzono, że pula #230-5A-86-17 była pozytywna.

4. Charakterystyka klonu #230-5A-86-17

Klon #230-5A-86-17 (nazywany retL-17 lub klon 17 i zdeponowany jako ATCC 98047) został następnie zanalizowany poprzez sekwencjonowanie DNA. Pełna sekwencja nukleotydowa wstawki tego klonu to SEKNR ID: 1(cDNA szczurzego retL1), a część sekwencji nukleotydowej pokazuje fig.1. W tej sekwencji odnaleziono otwartą ramkę odczytu kodującą białko o długości 468 aminokwasów (szczurze RetL1). Przewidywane białko ma sekwencję sygnałową z potencjalnym miejscem cięcia za aminokwasem 24 (Von Heijne i wsp., Nucl. Acid Res. 14:14683 (1986)). Hydrofobowy N-koniec wskazuje, że to białko może łączyć się z komórką przez glikan fosfatydyloinozytolu. Są trzy przypuszczalne miejsca glikozylacji. Właściwości te są zgodne z oczekiwanymi dla ligandu Ret.

Można wyrażać rozpuszczalne formy szczurzego białka RetL1 przez skrócenie genu przedhydrofobowym C-końcem. Na przykład, można to zrobić przez skrócenie po lizynie 435 (szczurze RetL1). Skrócenie przed tym aminokwasem powinno także powodować ekspresję rozpuszczalnej formy szczurzego białka RetL1. Rozpuszczalne szczurze białko RetL1 może ulegać ekspresji samo lub jako część fuzji z ludzką immunoglobuliną, znacznikiem histydynowym lub niewielkim epitopem, który jest rozpoznawany przez przeciwciało.

B. Klonowanie ludzkiego RetL1-ligandu dla Ret

Ludzką embrionalną bibliotekę cDNA z nerki na wektorze lambda gt10 zakupiono w firmie Clontech (numer katalogowy #HL5004A). Milion jednostek tworzących łysinki z banku faga wysiewano na 10 płytekNunc™.Wykonanoodwzorowaniałysinek nafiltrachSchleicherandSchuellOpitran™.

Sondę otrzymano przez trawienie plazmidu ze szczurzym RetL1enzymem restrykcyjnym PvuII i izolację z żelu agarozowego fragmentu o wielkości 1,34 kb, co odpowiada nukleotydom 242-1582 sekwencji nukleotydowej szczurzego białka RetL1 (szczurze cDNA RetL1). Sonda dla regionu kodującego była znakowana P³² metodą losowych starterów (Feinberg and Vogelstein, Anal. Biochem. 137: 266-267, 1984). Filtry hybrydyzowano przez noc w 300 ml buforu PBS do przeszukiwania łysinek (50mM Tris pH 7,5; 1M NaCl; 0,1% pirofosforan sodu; 0,2% PVP i 0,2%Ficoll) zawierającym 10% siarczan dekstranu, 100 μg/ml tRNA i 6,7 x 10⁷ CPM szczurzej sondy w 55°C. Dwukrotnie płukano w buforze

PL 191 248 B1 do przeszukiwania łysinek i dwukrotnie 2 x SSC/1% SDS w 55°C i eksponowano na kliszy w -70°C z ekranem wzmacniającym.

Pozytywne kopie były usuwane z oryginalnych płytek do SM (100 mM NaCl, 10 mM SO4, 50 mM Tris pH 7,5) z żelatyną. Oczyszczono 24 pozytywne łysinki. Mikrolizaty DNA lambda z oczyszczonych łysinek kandydatów trawiono Notl i poddawano elektroforezie w 1% żelu agarozowym oraz hybrydyzacji typu Southern. Filtr hybrydyzowano z sondą dla regionu kodującego szczurzy RetL1. Najdłuższą wstawkę (4,4 kb) zawierał klon HRL20, który silnie hybrydyzował ze szczurzą sondą. Z tego klonu uzyskano sekwencję DNA (częściowy ludzki cDNA retL1; SEK NR ID: 8; fig. 2A) i wywnioskowaną z niej sekwencję peptydu (częściowe ludzkie RetL1 SEK NR ID: 9; fig. 2A), potwierdzając, że jest to ludzki homolog. Ten klon koduje większość regionu kodującego, zawierając 3' koniec regionu kodującego.

Aby otrzymać koniec 5' ludzkiego cDNA, w firmie Clontech zakupiono ludzki zarodkowy zestaw cDNA Marathon-Ready™ (numer katalogowy #7423-1). Zsyntetyzowano antysensowne oligonukleotydy Kid-155, odpowiadające nukleotydom komplementarnym do nukleotydów 62-81 SEK NR ID: 8 (częściowy ludzki cDNA retL1) i Kid-154, odpowiadające nukleotydom komplementarnym do nukleotydów 17-43 SEK NR ID: 8 (częściowy ludzki cDNA retL1). Przeprowadzono reakcję PCR używając zestawu Advantage™ cDNA PCR (Clontech numer katalogowy #8417-1) w połączeniu z odczynnikami Marathon™ cDNA i oligonukleotydami Kid-155 i Kid-154. Pierwszą reakcję PCR przeprowadzono w następujący sposób: 35,5 μl H₂O; 5,0 μl 10 bufor dla KlenTaq; 1,0 μl 10 mM mieszaniny dNTP; 1,0 μl 50 x mieszaninypolimerazyAdvantage^TM KlenTaq. Wymienione składniki zostałypołączonei zmieszane. Następnie dodano 5,0 μl cDNA nerki zarodkowej Marathon-Ready™; 1,0 pi 10 μΜ startera AP1 i 1,5 μl 6,4 μΜ Kid-155 (objętość końcowa=50 μ^. PCR przeprowadzono w Perkin-Elmer Cetus DNA Termal Cycler 480 przy następujących warunkach cykli: 1 cykl 94°C przez 1 min; 30 cykli 94°C przez 30 sek, 55°C przez 30 sek, 68°C przez 4 min. Następną serię PCR przeprowadzano używając produktu pierwszej reakcji PCR. Najpierw 5 μl produktu PCR #1 rozcieńczano 50-krotnie TE (końcowa objętość 250 μ^. Kolejna seria reakcji PCR zawiera: 35,5 μl H₂O; 5,0 μl 10 bufor dla KlenTaq; 1,0 μl 10 mM mieszaniny dNTP; 1,0 μl 50 x mieszaniny polimerazy Advantage^TM KlenTaq. Te składniki zostały zmieszane jak wyżej. Następnie dodano 5,0 μl rozcieńczonego produktu PCR #1; 1,0 μl 10 μΜ startera AP2 i 1,5 μl 6,4 μΜ Kid-154. Warunki cykli byłytakiejak powyżej. Otrzymany produkt o wielkości w przybliżeniu700 bp był oczyszczany na 1% agarozie o niskiej krzepliwości i ekstrahowany fenolem. Oczyszczony DNA wklonowano w miejsce EcoRV wektora pZErO™ (Invitrogen numer katalogowy #K2510-01). Uzyskano informację o sekwencji z licznych izolacji zawierających klony nazwane HRL7G6 i HRL7G8.

Stwierdzono, że sekwencja uzyskana z klonu HRL7G8 zachodzi na sekwencję klonu HRL20 (częściowy ludzki cDNA retL1) i wykorzystano jej do stworzenia sekwencji ludzkiego RetL1 pełnej długości (ludzkie cDNA retL1 pełnej długości), także pokazanej na rysunku 2B. Sekwencja nukleotydowa uzyskana z klonu HRL7G8 odpowiada nukleotydom 1 do 502 cDNA ludzkiego RetL1 pełnej długości; sekwencja HRL20 odpowiada nukleotydom 460-1682 ludzkiego cDNA retL1 pełnej długości. Sekwencję klonu HRL7G8 potwierdzono przez sekwencjonowanie innego klonu (GJ102) wyizolowanego z biblioteki cDNA ludzkiej nerki embrionalnej lambda gt10 opisanej powyżej, używając sondy pochodzącej z klonu HRL7G6. Nukleotydy 118 do 1497 obejmują ramkę odczytu białka pełnej długości ludzkiego cDNA retL1.

Kompletna sekwencja aminokwasowa ludzkiego RetL1 jest także przedstawiona na rysunku 2B. Jak to pokazuje analiza BESTFIT zaprezentowana na fig. 3A, ludzki cDNA retL1 jest w 88,2% identyczny ze szczurzym cDNA retL1. Porównanie peptydów (fig. 3B) pokazuje, że domniemana sekwencjaludzkiego peptydu jest w 93,3% identyczna, a w 97,2% podobna do szczurzej.

Klonowanie RetL2 - ligandu dlaRet

A. Klonowanie ludzkiego RetL2

Sekwencję peptydu RetL1 (szczurzy RetL1) użyto do przeszukania bazy danych GenBank programem BLAST w celu identyfikacji podobnych białek (tj. izologów). BLAST czyli Basic Local Alignment Search Tool wykorzystuje metodę Altschul i wsp. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990) do poszukiwania podobieństw między zadaną sekwencją, a wszystkimi sekwencjami w bazie danych sekwencji. Zadaną sekwencją i przeszukiwaną bazą danych może być zarówno peptyd, jak i nukleotyd w każdej kombinacji. Kiedy zadawano sekwencję peptydu szczurzego RetL1 bazie nukleotydowej Podlegające Ekspresji Etykietki (ang. Expressed Sequence Tag, EST), uzyskano dwa znacząco pasujące obiekty. Jeden to GenBank Accession # R02249 - EST o długości 229 bp z ludzkiej zarodkowej biblioteki zawierającej połączone cDNA z wątroby i śledziony, drugi to GenBank Accession # H12981 - EST o długości 521 bp z biblioteki z dziecięcego mózgu. Te dwa EST są w 99% identyczne w regionie

PL 191 248 B1 w którym na siebie zachodzą co wskazuje, że pochodzą z tego samego cDNA. Stworzono oligonukleotydy na podstawie EST H12981: KID-228 (GAA TGA CAA CTG CAA GAA GCT GCG CTC CTC; odpowiadający nukleotydom 38-67, a także nukleotydom 534-563 SEK NR ID: 12) i nukleotyd antysensowny KID-229 (GTG TAC TCG CTG GGC ACC CG; odpowiadający sekwencji komplementarnej do nukleotydów 156-175, a także komplementarnej do nukleotydów 652-671 SEK NR ID: 12).

x 10⁶ jednostek tworzących łysinki z biblioteki cDNA Clontech Human Fetal Liver 5'-Stretch

Plus lambda GT10 (numer katalogowy HL5003a) przeszukiwano na kopiach wykonanych na filtrach

OPTITRAN™. Filtry hybrydyzowano z oligonukleotydami KID-228 i KID-229 znakowanymi P³² w 400 ml buforu do przeszukiwania łysinek (50 mM Tris pH 7,5; 1M NaCl; 0,1% pirofosforan sodu; 0,2% PVP i 0,2% Ficoll) zawierających 10% siarczan dekstranu, 100 μg/ml tRNA i 80 pmoli każdego wyznakowanego P³² oligonukleotydu w 65°C przez noc. Dwukrotnie płukano je 2xSSC/1%SDS i dwukrotnie w 1xSSC/1% SDS i eksponowano na kliszy. Oczyszczono 11 pozytywnych kopii. DNA z każdego z tych klonów analizowano przez trawienie enzymami restrykcyjnymi i elektroforezę w żelu agarozowym oraz hybrydyzację typu Southern. Filtry hybrydyzowano z KID-228 i KID-229 by potwierdzić, że wstawki hybrydyzują z sondą. Wstawka klonu DSW240 została całkowicie zsekwencjonowana (ludzkie cDNA retL2, SEK NR ID: 12) i jest przedstawiona na fig. 7.

Nukleotydy 25-1416 odpowiadają otwartej ramce odczytu białka ludzkiego cDNA retL2, które koduje białko o wielkości 464 aminokwasów (ludzkie RetL2, SEK NR ID:13) i jest przedstawiona na fig. 7. Jak pokazuje analiza BESTFIT zaprezentowana na fig. 8, ludzkie białko RetL2 jest w 49,1% identyczne i w 63,7% podobne do ludzkiego białka RetL1. Ma ono wspólny z RetL1 hydrofobowy koniec N, wskazujący na sekwencję sygnałową i hydrofobowy koniec C, wskazujący na motyw przyłączania glikanu fosfatydyloinozytolu. Oprócz tego 30 cystein z 31 obecnych w każdym białku jest konserwowanych.

B. Wykazanie, że RetL2 jest ligandem dla Ret

Wykazano, że RetL2 jest ligandem dla Ret przez transfekcję komórek 293/EBNA plazmidem ekspresyjnym zawierającym wstawkę klonu DSW240 i pokazanie, że komórki mogą wiązać rozpuszczalne białko fuzyjne Ret/IgG.

Wstawkę z DSW240 usunięto używając Notl i wklonowano do wektora ekspresyjnego CH269, który zawiera miejsce startu replikacji EBV i pozwala na wysoką ekspresję w liniach komórkowych pozytywnych względem EBNA. Przeprowadzono trawienia restrykcyjne by zidentyfikować klony, które mają prawidłową orientację.

Plazmidowe DNA (plazmid ekspresyjny retL2, plazmid ekspresyjny retL1 jako kontrolę pozytywną i plazmid ekspresyjny zawierający niezwiązane białko jako kontrolę negatywną) transfekowano do komórek 293/EBNA (8 x 10⁵ na płytce 60 mm) używając metody lipofekcji. Po 48 godzinach komórki płukano dwa razy buforem HBHA (0,5 mg/ml BSA; 0,1% NaN3; 20 mMHEPES (pH 7,0) i inkubowano z 20 μg/ml szczurzego Ret/IgG w soli fizjologicznej buforowanej Tris z 1 mM MgCl₂ i CaCl₂ przez 60-90 min w temperaturze pokojowej. Po tej inkubacji, komórki płukano cztery razy buforem HBHA i utrwalano roztworem 60% acetonu/3% formaldehydu/20 mMHEPES (pH 7,0) przez 30 sekund. Po dwukrotnym płukaniu buforem HBS (150mMNaCl, 20mMHEPES (pH 7,0)), komórki inkubowano drugorzędowym przeciwciałem związanym z AP (kozie przeciwciała przeciw ludzkiej IgG specyficzne dla Fc-gamma F(ab')₂ (Jackson Immuno Research Laboratories; numer katalogowy #109-056-098; rozcieńczone 1:5000 w soli fizjologicznej buforowanej Tris z 1 mMMgCl2 i CaCl2) przez 60 min w temperaturze pokojowej. Następnie komórki płukano dwukrotnie w buforze HBS i dwukrotnie w buforze dla substratu dla AP (100 mM Tris-HCl (pH 9,5), 100 mMNaCl, 5 mM MgCl2) zawierającym 2x Pierce Immuno Pure^R Phosphatase Supresor (numer katalogowy #35002). Ostatnie płukanie pozostawiono na 15 min. Następnie dodawano substraty dla AP: NBT (0,33mg/ml) i BCIP (0,17 mg/ml) w buforze dla substratu dla AP zawierającym inhibitor Pierce dla AP i inkubowano z komórkami przez 5-20 min. Płytki dwukrotnie płukano wodą. Następnie płytki przeglądano pod mikroskopem z mikromanipulatorem pod kątem obecności komórek zabarwionych na purpurowo. Obecność zabarwionych na purpurowo komórek wskazuje, że białko fuzyjne z Ret związało się do komórek i, że białko RetL2 jest ligandem dla Ret. Zabarwione na purpurowo komórki były także obserwowane po transfekcji wektorem ekspresyjnym retL1, ale nie przy wektorze będącym kontrolą negatywną.

Klonowanie RetL3 -ligandu dlaRet

A. Mysi RetL3

Przeszukanie bazy danych EST sekwencją RetL1 ujawniło dwie mysie EST z homologią do ligandów dla Ret. Te EST to AA049894 i AA050083 (które jest częściowym mysim cDNA retL3, SEK

PL 191 248 B1

NR ID:14) plazmidy kodujące teEST otrzymano z Genom SystemsInc. (numer katalogowy #475791 i #475497) jako skosy bakteryjne. DNA plazmidowe izolowano z pojedynczych kolonii uzyskanych przez zdrapywanie skosów na płytki LB z ampicyliną. Wstawki z plazmidów sekwencjonowano w całości. Porównanie dwóch sekwencji pokazuje, że AA049894, która ma wstawkę 1,4 kb zawiera się w AA050083, która ma wstawkę 1,9 kb. Translacja sekwencji DNA z AA050083 wskazuje, że jest nieprzerwana otwarta ramka odczytu od NT205 do NT1242 (częściowy mysi cDNA retL3,SEKNRID:15). TaORFma37,5%identycznoścido szczurzej retL1 i 40,2% identyczności do szczurzej retL2. Jednak, otwarta ramka odczytu nie koduje Met lub sekwencji sygnałowej na końcu 5'. Przebadano obszar ORF przed tym regionem i znaleziono Met w kontekście sekwencji najwyższej zgodności Kozak dla inicjacji translacji i potencjalną sekwencję sygnałową dla powierzchniowej ekspresji/wydzielania. Ta ORF jest nie w ramce odczytu ze znajdującą się dalej ORF wskazując, że EST AA050083 zawiera potencjalną mutację taką jakinsercja,delecja,intronlubartefaktklonowanianaswoimkońcu5'.

Aby otrzymać prawidłowy koniec 5', wykorzystano Marathon RACE. Wfirmie Clontech zakupiono cDNA 11-dniowych embrionów mysich Marathon-Ready™ (numer katalogowy #7458-1) i Advantage™ Kit (numer katalogowy #8417-1). Zsyntetyzowano oligonukleotydy antysensowne, Kid-366, odpowiadający nukleotydom komplementarnym do nukleotydów 847-866 SEK NR ID: 14 i Kid-365, odpowiadający nukleotydom komplementarnym do nukleotydów 589-615 SEK NR ID: 14. Przeprowadzono reakcję PCR używając zestawu Advantage™ cDNA PCR (Clontech numer katalogowy #8417-1) zmieszanego z odczynnikami Marathon™ cDNA i oligonukleotydem Kid-366. Pierwszą reakcję PCR przeprowadzono w następujący sposób: 35,3 μl H₂O; 5,0 μl 10 bufor dla KlenTaq; 1,0 μl 10 μΜ mieszaniny dNTP; 1,0 μl 50 x mieszaniny polimerazy Advantage™ KlenTaq. Te składniki zostały połączone i zmieszane. Następnie dodano 5,0 μl cDNA 11-dniowych embrionów mysich Marathon-Ready™; 1,0 μl 10 μΜ, startera AP1 i 1,7 μl 5,88 μΜ. Kid-366 (objętość końcowa=50 μ^. PCR przeprowadzono w PerkinElmer Cetus DNA Termal Cycler 480 przy następujących warunkach cykli: 1 cykl 94°C przez 1 min; 5 cykli 94°C przez 30 sek., 72°C przez 4 min; 5 cykli 94°C przez 30 sek., 70°C przez 4 min; 25 cykli 94°C przez 30 sek., 68°C przez 4 min. Następną serię PCR przeprowadzano używając produktu pierwszej reakcji PCR. Wpierw 5 μl produktu PCR #1 rozcieńczano 50-krotnie TE (końcowa objętość 250 μ^. Kolejna seria reakcji PCR zawiera: 35,5 μl H₂O; 5,0 μl 10 bufor dla KlenTaq; 1,0 μl 10 mM mieszaniny dNTP; 1,0 μl 50 x mieszaniny polimerazy Advantage™ KlenTaq. Te składniki zostały zmieszane jak wyżej. Następnie dodano 5,0 μl rozcieńczonego produktu PCR #1; 1,0 μl 10 μΜ startera AP2 i 3,6 μl 2,8 μΜ Kid-365. Warunki cykli były takie jak powyżej. Otrzymany produkt o wielkości w przybliżeniu 665 bp był oczyszczany na 1% agarozie o niskiej krzepliwości i ekstarahowano Qiaex II (Qiagen numer katalogowy #20021). Oczyszczony DNA klonowano na pNoTA/T7™ używając systemu klonowania PRME PCR CLONER™ (5 Prime->3 Prime numer katalogowy #1-725029). Informacje o sekwencji uzyskano z wielokrotnych izolacji, które zawierały klony nazwane DSW252 i DSW253.

Stwierdzono, że sekwencja DSW252 zachodzi na SEKNR ID: 14 za wyjątkiem dodatkowego T obecnego między NT252, a NT 253 w SEK NR ID: 14. To T jest także obecne w innych izolatach DSW251 i DSW253. Wstawienie tej dodatkowej zasady naprawia ORF tak, że otrzymuje się pojedynczą ORF o długości 1191 bp (licząc od pierwszej Met) kodujący 397 aminokwasów. Ta ORF koduje Met w kontekście właściwej inicjującej sekwencji najwyższej zgodności (Kozak) i zawiera sekwencję sygnałową dla powierzchniowej ekspresji/wydzielania.

Aby otrzymać mysi klon pełnej długości, którego ekspresja byłaby możliwa, oczyszczono fragment DSW252 Notl-BamHI o długości 630 bp i fragment AA050083 BamHI-Notl o długości 1308 bp i ligowano z wektorem ekspresyjnym CH269 trawionym Notl. Mieszaniną ligacyjną transformowano E. coli XL1-Blue (Stratagene Numer katalogowy #200236). Z uzyskanych transformantów wykonano mikrolizaty Qiawell Ultra. Analizowano je przez trawienie enzymami restrykcyjnymi i elektroforezę w celu sprawdzenia wielkości i orientacji. Konstrukt nazwano DSW254. Sekwencjonowano całą wstawkę DSW254 (mysie retL3; SEKNR ID:16) i potwierdzono ORF jako kodującą białko o 397 aminokwasach (mysie RetL3; SEK NR ID:17). Sekwencje te są także pokazane na fig. 9. C-koniec RetL3 jest hydrofobowy wskazuje na motyw przyłączania glikanu fosfatydyloinozytolu.

B. Ludzki RetL3

Aby znaleźć tkankę będącą kandydatem na źródło do klonowania ludzkiego RetL3, użyto hybrydyzacji typu Northern tkanek mysich by ustalić wzór ekspresji dla mysiego RetL3. Z przebadanych tkanek, najwyższą ekspresję wykazywała tkanka serca. Zakupiono w firmie Clontech cDNA z ludzkiego serca osoby dorosłej na wektorze lambda gt10 (numer katalogowy #HL3026a). Μί^τι jednostek

PL 191 248 B1 tworzących łysinki z banku faga wysiano na płytki Nunc. Wykonano odwzorowania łysinek na filtrach Schleicher and Schuell Opitran™.

Sondę uzyskano przez reakcję PCR ze starterami Kid-366 i Kid-367, odpowiadającymi nukleotydom 397-420 sekwencji AA050083. Reakcję PCR przeprowadzono w następujący sposób: zmieszano 10 μ! 10 x PFU Buffer; 2,0 μ! 10 mM mieszaniny dNTP; 72,1 μ! H₂O; 3,1 μ! 13,2 pM. Kid-367; 6,8 μ! 5,88 pM. Kid-366; 5,0 μ! 0,1 pg/μ! DNA AA050083 i 2,0 μ! 2,5 jednostek/μ! PFU (Stratagene numer katalogowy #600154). PCR przeprowadzono w Perkin-Elmer Cetus DNA Termal Cycler 480 przy następujących warunkach cykli: 25 cykli 94°C przez 1 min, 55°C przez 1 min, 72°C przez 4 min. Produkt czyszczono przez ekstrakcję mieszaniną fenol, chloroform, alkohol izoamylowy w stosunku 50:49:1, a następnie przez elektroforezę w żelu agarozowym o niskiej krzepliwości i oczyszczanie wyciętego fragmentu Qiaexll. Sonda dla regionu kodującego była znakowana P³² metodą losowych starterów (Feinberg and Vogelstein). Filtry hybrydyzowano przez noc w 200ml buforu do przeszukiwania łysinek (50 mM Tris pH 7,5; 1M NaCl; 0,1% pirofosforan sodu; 0,2% PVP i 0,2% Ficoll) zawierającego 10% siarczan dekstranu, 100 pg/m! tRNA i 1,8 x 10⁸ CPM mysiej sondy w 65°C. Dwukrotnie płukano w buforze do przeszukiwania łysinek, dwukrotnie 2xSSC/1% SDS, dwukrotnie 1xSSC/1% SDS w 65°C i eksponowano na kliszy w -70°C z ekranem wzmacniającym. Pozytywne łysinki były czyszczone. Mikrolizaty DNA lambda z oczyszczonych łysinek-kandydatów trawiono EcoRI, poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym i hybrydyzacji typu Southern z mysią sondą. KlonGJ128, posiadający wstawkę 1,3kb silnie hybrydyzował z sondą dla mysiego obszaru kodującego. Z tego klonu uzyskano sekwencję DNA (częściowy cDNA ludzkiego retL3; SEK NR ID: 18) i wywnioskowaną z niej sekwencję peptydu (częściowe ludzkie RetL3 SEK NR ID: 19) potwierdzając, że jest to ludzki homolog. Ten klon koduje większość regionu kodującego, zawierając 3' koniec regionu kodującego.

Oczyszczono wstawkę 1,3 kb z GJ128, wyznakowano P³² i użyto do przeszukania ludzkiej biblioteki z serca dorosłego (Clontech) w celu odnalezienia klonu z końcem 5'. Po przeszukaniu 2x 10⁶ łysinek z tej biblioteki nie odnaleziono klonu zawierającego koniec 5'. Analiza Northern mRNA ludzkich tkanek dorosłych (Clontech numer katalogowy #7760-1, 7759-1 i 7767-1) hybrydyzowanych z tą samą sondą, używając protokołu dostarczonego przez producenta, wskazuje, że ludzkie RetL3 ulega ekspresji u dorosłych w rdzeniu kręgowym, żołądku, sercu, trzustce, jelicie cienkim, okrężnicy, prostacie i jądrach. Ludzką bibliotekę cDNA z rdzenia kręgowego dorosłego (Clontech, numer katalogowy #5001a) przeszukano wstawką GJ128. Oczyszczono 3 niezależne klony, a najdłuższy GJ135 zsekwencjonowano. Sekwencja wstawki GJ135 zachodzi na wstawkę GJ128 pozwalając na stworzenie sekwencji pełnej długości ludzkiego cDNA retL3 (SEK NR ID: 20) i ustalenie ludzkiego RetLS pełnej długości (SEKNR ID: 21). Te sekwencje są także pokazane na fig. 10. Ludzki RetL3 jest w 34,3% i 34,9% identyczny z odpowiednio ludzkim RetL1i ludzkim RetL2. Posiada 76,8% identyczności z mysim RetL3.

TERAPEUTYCZNE ZASTOSOWANIA ZWIĄZKÓW

Natywne i wariantowe białka z rodziny RetL, przeciwciała anty-RetL, przeciwciała anty-Ret oraz białka fuzyjne Ret i RetL mogą być użyteczne klinicznie w sytuacjach, w których pożądane jest zablokowanie albo zaktywowanie drogi przekazywania sygnału za pośrednictwem Ret, w celu stymulacji nerkowego i/lub neuronalnego wzrostu bądź przeżywalności w stanach chorobowych, w których te komórki ulegają utracie albo uszkodzeniu, albo w celu zahamowania wzrostu, albo też zabicia niepożądanych komórek, takich jak komórki nowotworów złośliwych, które wykazują ekspresję Ret albo RetL.

Ogólnie, związki, które wiążą się z Ret, wywołując dimeryzację i/lub autofosforylację Ret, użyteczne są do stymulowania wzrostu albo ograniczania uszkodzenia w tkankach wykazujących ekspresję Ret. Związki takie użyteczne są w stymulowaniu wzrostu i/lub przeżycia tkanki nerkowej, wspieraniu funkcji nerek oraz w minimalizowaniu uszkodzenia tkanki nerkowej po różnych urazach. Szczególne stany chorobowe, które można z korzyścią leczyć takimi związkami obejmują ostrą niewydolność nerek, ostre zapalenie nerek, przewlekłą niewydolność nerek, zespół nerczycowy, defekty kanalików nerkowych, przeszczepy nerek, uszkodzenia toksyczne, uszkodzenia z niedotlenienia oraz urazy. Do defektów kanalików nerkowych należą te o naturze wrodzonej bądź nabytej, takie jak wielotorbielowate zwyrodnienie nerek, torbielowatość rdzenia nerek albo nerka o rdzeniu gąbczastym. Lista ta nie jest ograniczona i może obejmować wiele innych chorób nerek (patrz np. Harrison's Principles of Internal Medicine, wyd. 13, 1994, które jest w niniejszym włączone przez odniesienie).

W innych zastosowaniach, geny i białka można stosować do leczenia chorób, w których pożądany jest wzrost i przeżycie nerwów. Należą do nich wszelkie choroby obejmujące choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera, Parkinsona, Huntingtona, Tourette'a, stwardnienie zanikowe boczne, jak również choroba neuronu ruchowego, choroby demielinizacyjne, takie jak stwardnienie

PL 191 248 B1 rozsiane, choroby bakteryjne, takie jak zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, ropień albo ropniak, choroby wirusowe, takie jak mielopatia związana z HIV, choroby prionowe, w tym choroba Creutzfeldta-Jacoba. Należą tu również choroby z uszkodzeniem tkanki nerwowej, czy to spowodowanym naciekiem nowotworowym, urazem, czy też epizodami naczyniowo-mózgowymi, takimi jak krwotok albo zatory. Choroby nerwów czaszkowych i rdzenia kręgowego, w tym choroby o etiologii urazowej, zapalnej, wrodzonej albo naczyniowej, należą tu szczególnie, podobnie jak choroby dotyczące autonomicznego układu nerwowego. Należą tu również rozwojowe choroby nerwowe, takie jak opóźnienie umysłowe, autyzm, płodowy zespół alkoholowy, zespół Downa oraz porażenie mózgowe. Związki tu opisane można również stosować do leczenia zespołów dotyczących obwodowego układu nerwowego. Do chorób tychnależą te spowodowane dowolnym z uprzednio wymienionych czynników, a w szczególności należą do nich borelioza z Lyme, neuropatie związane z HIV, zapalenie wielomięśniowe, dystrofia mięśniowai miastenia.

Przeciwciała anty-RetL i białka fuzyjne Ret, które swoiście wiążą się z białkiem szczurzym RetL, częściowym ludzkim RetL1, ludzkim RetL1 o pełnej długości, ludzkim RetL2, mysim RetL3 albo ludzkim RetL3, albo fragmentami tych białek, są użyteczne w kilku metodach. Związki te mogą być stosowane terapeutycznie w celu hamowania albo blokowania sygnału receptora Ret, takiego jak blokowanie wzrostu nowotworów złośliwych, które zależne są od aktywacji sygnału Ret dla swego wzrostu. Środki te mogą również podlegać fuzji z wykrywalnymi znacznikami, takimi jak fluoroskopowo albo radiograficznie wykrywalne substancje, i mogą być podawane pacjentowi w celu umożliwienia obrazowania tkanek, które wykazują ekspresję RetL. Środki te mogą się również wiązać z substancjami, takimi jak peroksydaza chrzanowa, które można stosować jako barwniki immunohistochemiczne w celu umożliwienia wizualizacji obszarów komórek RetL-dodatnich na skrawkach histologicznych. Swoiste przeciwciało można stosować w ten sposób pojedynczo a miejsca, gdzie zostanie związane można uwidocznić w teście kanapkowym przy zastosowaniu przeciwciała antyimmunoglobulinowego, które samo związane jest z wykrywalnym znacznikiem. Swoiste przeciwciała na dowolne z białek RetL są również użyteczne w testach immunologicznych w celu ilościowej oceny substancji, względem której swoiste jest dane przeciwciało. Swoiste przeciwciała na RetL można również związać ze stałym podłożem, takim jak kuleczki albo płytki i stosować do usuwania ligandu z roztworu, czy to dla zastosowania w oczyszczaniu białek czy też do oczyszczania zeń roztworu. Każda z tych technik stosowana jest rutynowo przez osoby biegłe w dziedzinie immunologii.

Do innych sposobów należą modulowanie przekazywania sygnału Ret-RetL przez kontaktowanie Ret z przeciwciałem monoklonalnym anty-Ret. Efektem takiego kontaktu mAb-Ret może być albo zablokowanie albo stymulacja aktywacji drogi przekazywania sygnału Ret, zależnie od charakterystyki interakcji każdego szczególnego mAb z Ret. Pewne przeciwciała monoklonalne reagują z Ret jako agoniści, przy czym związanie agonisty mAb-Ret wyzwala dimeryzację i autofosforylację Ret. Inne przeciwciała monoklonalne działają jako antagoniści Ret. Interakcja Ret z antagonistycznym mAb zapobiega aktywacji sygnału Ret przez inne RetL-e albo przez kompleksy zawierające RetL-e, co inaczej spowodowałoby aktywację drogi przekazywania sygnału Ret.

RetL i/lub przeciwciała wobec Ret albo wobec białka fuzyjnego Ret można zastosować do umożliwienia obrazowania tkanek, które wykazują ekspresję Ret albo w metodach immunohistologicznych albo preparacyjnych opisanych powyżej dla przeciwciałwobec RetL.

Białka fuzyjne zawierające RetL i/lub przeciwciała anty-Ret można stosować do swoistego nacelowania terapii medycznych na raki i nowotwory złośliwe, które wykazują ekspresję Ret. Takie nowotwory złośliwe mogą obejmować kilka różnych fenotypów nowotworowych, które wiążą się z mutacjami w białku Ret (N. Engl. J. Med. 335:943-951, 1996; Nature 367:319-3220, 1996; Trends Gen.12:138-144, 1996). Interwencje terapeutyczne przeciwko nowotworom, które wykazują ekspresję RetL wykorzystują białka fuzyjne, które zawierają Ret i/lub przeciwciało anty-Ret. Przeciwciało anty-Ret albo anty-RetL może być skuteczne samo w sobie przez zależną od przeciwciał i zależną od dopełniacza cytolizę, zachodzącą za pośrednictwem domeny Fc. Takie ligandy hybrydowe i przeciwciała można uczynić bardziej skutecznymi jako środki przeciwnowotworowe poprzez zastosowanie ich jako nośników dostarczających dla leków przeciwnowotworowych, toksyn i komórkobójczych radioizotopów, takich jak itr 90. Cytotoksyczne komórki efektorowe można nacelować na komórki nowotworowe przy zastosowaniu heterokoniugowanych przeciwciał, w których przeciwciało swoiste względem albo Ret, albo RetL, które ulegają ekspresji w nowotworze złośliwym, jest kowalencyjnie sprzężone z przeciwciałem skierowanym przeciwko białku powierzchniowemu na cytotoksycznych komórkach efektorowych, takich jak komórki NK alboCTL.

PL 191 248 B1

Jednym z przykładów terapii przy użyciu przeciwciała anty-Ret albo RetL jest skoniugowanie toksycznego łańcucha A rycyny albo zmodyfikowanej pełnołańcuchowej formy rycyny (która nie może już wiązać się z komórkami) z RetL albo z przeciwciałem skierowanym przeciwko polipeptydowi Ret, który ulega ekspresji na powierzchni zezłośliwionych komórek. W innym przykładowym wykonaniu, toksyna ulega koniugacji z Ret albo z przeciwciałem anty-RetL w celu wybiórczego nacelowania i zabicia komórek Ret-dodatnich, takich jak nowotwór złośliwy wykazujący ekspresję RetL. Takie podejście okazało się udane w przypadku zablokowanej rycyny skoniugowanej z monoklonalnym przeciwciałem przeciwko antygenowi CD19, który ulega ekspresji na większości komórek nowotworów złośliwych (Grossbard i wsp., Blood 79:576, 1992). Inne toksyny są równie użyteczne, jak wiadomo specjalistom w tej dziedzinie techniki. Do takich toksyn należą, ale nie wyłącznie, egzotoksyny pseudomonas, toksyny krztuśca i saporyny. Podejście to powinno okazać się jeszcze bardziej udane przy zastosowaniu RetL albo przeciwciała anty-Ret, w przeciwieństwie do znanego podejścia z antygenem anty-CD19, ponieważ Ret ulega ekspresji w bardzo ograniczonej liczbie tkanek.

Powyższe podejścia, przy zastosowaniu fuzji rycyny lub innych toksyn, nadają się również do zastosowania do toksycznych koniugatów RetL albo przeciwciała anty-Ret; są one użyteczne dla wybiórczego nacelowania i zabicia komórek Ret-dodatnich, takich jak komórki nowotworu złośliwego wykazującego ekspresję Ret.

Innym podejściem do takich terapii medycznych jest zastosowanie przeciwciał RetL albo antyRet wyznakowanych radioizotopem. Takie związki wyznakowane radioizotopem będą wybiórczo kierowały radioaktywność na miejsca nowotworowe w komórkach wykazujących ekspresję Ret, oszczędzając normalne tkanki. Zależnie od zastosowanego radioizotopu, promieniowanie emitowane z wyznakowanego radioizotopem przeciwciała związanego z komórką nowotworu złośliwego może również zabić sąsiednie złośliwe komórki nowotworowe, które nie wykazują ekspresji Ret. Zastosować

131 można wiele radioizotopów. Z powodzeniem stosowano izotopy, które emitują cząstki β (na przykład I), gdy zastosowano je z monoklonalnymi przeciwciałami przeciwko CD20 obecnemu na chłoniakach z limfocytów B (Kaminski i wsp., N. Engl. J. Med. 329: 459 (1993); Press i wsp., N. Engl. J. Med. 329: 1219 (1993). Radionuklidy emitujące cząstki β wytwarzają radioaktywne promieniowanie, które ma właściwości zabójcze dla nowotworów złośliwych w odległości pokrywającej kilka średnic komórek, pozwalając na usunięcie negatywnych antygenowo komórek i zmniejszenie konsekwencji niejednorodnego odkładania się przeciwciała albo ligandu w nowotworach.

Można również zastosować radionuklidy emitujące cząstki α. Napromieniowanie o niskiej dawce wytwarzane przez RetL albo przeciwciała anty-Ret wyznakowane radionuklidem może być bardziej skuteczne terapeutycznie niż chwilowe napromieniowanie, dostarczane z zewnątrz w konwencjonalnej terapii radiacyjnej. Napromieniowanie o niskiej dawce może wywołać apoptozę (zaprogramowaną śmierć komórkową) w pewnych liniach komórkowych (Macklis i wsp., Radiat. Rs. 130:220 (1992); Maklis iwsp., Radiopharm. 5:339 (1992).

Związki tu ujawnione podaje się w terapeutycznie skutecznych ilościach, co oznacza ilośćzwiązku, która wytwarza medycznie pożądany rezultat albo wywiera wpływ na daną leczoną chorobę.

Termin „pacjent”stosowany tutaj oznacza tutaj dowolnego ssaka, któremu można podać ligand Ret albo gen. Do pacjentów, którzy szczególnie nadają się do leczenia opisanym tu sposobem należą ludzie, jak również naczelne inne niż ludzie, owce, konie, bydło, kozy, świnie, psy, koty, króliki, świnki morskie, chomiki, gerbile, szczury i myszy, jak również narządy, nowotwory złośliwe i komórki pochodzące albo pobrane od tych gospodarzy.

Zastosowanie związków w terapii genowej

Geny RetL wprowadza się do uszkodzonej tkanki w celu stymulacji wytwarzania RetL przezkomórki transfekowane w celu promowania wzrostu i/lub przeżycia komórek, które wykazują ekspresję Ret.

W konkretnym przykładzie wykonania terapii genowej, gen RetL można wprowadzić do nerkowej albo nerwowej tkanki docelowej według wyboru. RetL ulegałby wówczas stabilnej ekspresji i stymulowałby Ret-receptorowo-dodatnie komórki do wzrostu, podziału, różnicowania i/lub wzmagałby przeżycie komórek. Ponadto, geny RetL można wprowadzić do komórek docelowych przy zastosowaniu wielu dobrze znanych sposobów, które wykorzystują strategie z wykorzystaniem wirusa albo bezwirusowe.

Bezwirusowe metody obejmują elektroporację, fuzję błonową z liposomami, bombardowanie o wysokiej prędkości mikropociskami pokrytymi DNA, inkubację z precypitatem fosforan wapnia-DNA, transfekcję za pośrednictwem DEAE-dekstranu orazbezpośrednią mikroiniekcję do pojedynczych komórek. Na przykład, gen RetL można wprowadzić do komórki przez koprecypitację z fosforanem wapnia (Pillicer i wsp., Science, 209:1414-1422 (1980); mechaniczną mikroiniekcję i/lub przyspieszenie cząstek (Anderson

PL 191 248 B1 i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5399-5403 (1980); transfer DNA w oparciu o liposomy (np. transfekcja za pośrednictwem LIPOFECTIN - Fefgner i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:471-477, 1987; Gao i Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179:280-285, 1991; transfekcję za pośrednictwem DEAE-dekstranu; elektroporację (amerykański opis patentowy 4,956,288); albo metody oparte na polilizynie, w których DNA ulega koniugacji w celu dostarczenia DNA preferencyjnie do hepatocytów wątroby (Wolff i wsp., Science, 247:465-468, 1990; Curiel i wsp., Human Gene Therapy 3: 147-154,1992).

Komórki docelowe mogą być transfekowane genami przez bezpośredni transfer genu. Patrz np., Wolff i wsp., „Direct Gene Transfer Into Mouse Muscle In Vivo”, Science 247:1465-68, 1990. W wielu przypadkach, pożądana będzie transfekcja za pośrednictwem wektora. Można stosować dowolne ze znanych sposobów wprowadzania sekwencji polinukleotydowych do wektora. Patrz na przykład Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) oraz Ausbel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY (1992), które to obie publikacje są włączone w niniejszym przez odniesienie. Aktywacja promotora może być tkankowo swoista albo indukowana przez produkt metaboliczny, albo podawaną substancję. Do takich promotorów/enhancerów należą, ale nie wyłącznie, natywny promotor RetL, cytomegalowirusowy natychmiastowy-wczesny promotor/enhancer(Karasuyama i wsp., J. Exp. Med., 169:13 (1989)); ludzki promotorbeta-aktyny (Gunning i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831 (1987); indukowalny glukokortykoidami promotor obecny w długiej powtarzalnej sekwencji terminalnej wirusa mysiego raka sutka (MMTV LTR) (Klessig i wsp., Mol. Cell. Biol., 4: 1354 (1984)); długie powtarzalne sekwencje terminalne wirusa mysiej białaczki Moloneya (MuLV LTR) (Weiss i wsp., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1985)); promotor wczesnego regionu SV40 (Bernoist i Chambon, Nature, 290:304(1981)); promotorwirusa mięsaka Rousa (RSV) (Yamamoto i wsp., Cell, 22:787(1980)),promotorkinazytymidynowej ludzkiego wirusa opryszczki (HSV) (Wagneri wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1441 (1981)); promotor adenowirusowy (Yamada i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3567 (1985)).

Geny RetL można również wprowadzić przy pomocy swoistych wektorów wirusowych do zastosowania w układach transferu genu, które są obecnie dobrze opracowane. Patrz na przykład: Madza i wsp., J. Gen. Virol., 73:1533-36, 1992 (papovavirus SV40); Berkner i wsp., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-61, 1992 (adenowirus); Hoffman i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:10099-10103, 1995 (bakulowirus), Moss i wsp., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:25-38, 1992 (wirus krowianki); Muzyczka., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:97-123, 1992 (wirus związany z adenowirusem), Margulskee., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-93, 1992 (wirus opryszczki (HSV) oraz wirus Epsteina-Barr (EBV)); Miller., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24, 1992 (retrowirus) ; Brandyopadhyay i wsp., Mol. Cell. Biol., 4:749-754, 1984 (retrowirus), Miller i wsp., Nature, 357:455-450, 1992 (retrowirus); Anderson, Science, 256:808-813, 1992 (retrowirus), Current Protocols in Molecular Biology: Rozdziały 9.10-9.14 (Ausubel i wsp., red.), Greene Publishing Associates, 1989, z których wszystkie są niniejszym włączone tu przez odniesienie.

Korzystnymi wektorami są wirusy DNA, do których należą adenowirusy (korzystnie wektory oparte na Ad-2 albo Ad-5), bakulowirus, wirus herpes (korzystnie wektory oparte na wirusie opryszczki) oraz parwowirus (korzystnie wektory oparte na „defektywnych” albo nieautonomicznych parwowirusach, bardziej korzystnie wektory oparte na wirusach związanych z adenowirusami, najkorzystniej wektory oparte na AAV-2). Patrz np. Ali i wsp., Gene Therapy 1:367-384, 1994; amerykański opis patentowy 4,797,368 oraz 5,399,346 i dyskusja poniżej.

Wybór szczególnego układu wektorowego do transferu, na przykład sekwencji RetL będzie zależeć od wielu czynników. Jednym z ważnych czynników jest natura docelowej populacji komórek. Choć wektory retrowirusowe badano intensywnie i stosowano w wielu zastosowaniach terapii genowej, nie nadają się one ogólnie do zakażania komórek, które się nie dzielą, ale mogą być użyteczne w terapii raka, ponieważ tylko one integrują się i dokonują ekspresji swych genów w komórkach replikujących. Są one również użyteczne w podejściach ex vivo i są atrakcyjne w tym względzie z uwagi na ich stabilną integrację z genomem komórki docelowej.

Adenowirusy są wirusami DNA, które można modyfikować w celu wydajnego dostarczania terapeutycznego albo reporterowego transgenu do różnych typów komórek. Ogólne typy adenowirusów 2 i 5 (odpowiednio, Ad2 i Ad5), które powodują choroby układu oddechowego u ludzi, podlegają obecnie opracowaniu dla celów terapii genowej Dystrofii Mięśniowej Duchenne'a (DMD) oraz Mukowiscydozy (CF). Zarówno Ad2 jak i Ad5 należą do podklasy adenowirusów, które nie są związane z nowotworami złośliwymi u ludzi. Wektory adenowirusowe zdolne są do zapewnienia niezwykle wysokich poziomów

PL 191 248 B1 dostarczania transgenu do zasadniczo wszystkich typów komórek, niezależnie od ich stanu mitotycznego. Wysokie miana (10¹³ jednostek tworzenia łysinek/ml) rekombinowanego wirusa można łatwo wytworzyć w komórkach 293 (transformowana adenowirusem, komplementacyjna linia komórkowa nerki płodu ludzkiego: ATCC CRL1573) i przechowywana w zamrożeniu kriogenicznym przez długie okresy bez znaczących strat. Wydajność tego układu w dostarczaniu terapeutycznego transgenu in vivo, która równoważy nierównowagę genetyczną została wykazana w zwierzęcych modelach różnych chorób. Patrz Y. Watanabe, Atherosclerosis, 36:261-268 (1986); K. Tanzawa i wsp., FEBS Letters, 118(1): 81-84 (1980); J.L. Golasten i wsp., New Engl. J. Med., 309(11983):288-296 (1983); S. Ishibashi i wsp., J. Glin. Invest. 92:883-893 (1993); oraz S. Ishibashi i wsp., J. Glin. Invest. 93:1889-1893 (1994), z których wszystkie są tu włączone przez odniesienie. Faktycznie, rekombinowane, defektywne replikacyjnie adenowirusy kodujące cDNA dla przezbłonowego regulatora mukowiscydozy (CFTR) dopuszczono do stosowania w przynajmniej dwóch klinicznych badaniach CF u ludzi. Patrz np., J. Wilson, Nature, 365: 691-692 (21 października 1993). Dalszym wsparciem dla bezpieczeństwa rekombinowanych adenowirusów w terapii genowej jest szerokie doświadczenie z żywymi szczepionkami adenowirusowymi w populacjach ludzkich.

Ludzkie adenowirusy składają się z genomu liniowego, w przybliżeniu 36 kb dwuniciowego DNA, który podzielony jest na 100 jednostek mapowych (m.u.), z których każda ma długość 360 bp. DNA zawiera krótkie odwrócone powtórzenia terminalne (ITR) przy każdym końcu genomu, które są wymagane dla replikacji wirusowego DNA. Produkty genów dzielą się na wczesne (E1 do E4) i późne (L1 do L5) regiony, w zależności od tego, czy ekspresja nastąpiła przed czy po inicjacji syntezy wirusowegoDNA. Patrz np., Horowitz, Virology, wyd. 2, wyd. B.N.Fields, RavenPressLtd.,NowyJork(1990).

Rekombinanty pierwszej generacji, defektywne replikacyjnie adenowirusy, które opracowano dla terapii genowej DMD i innych chorób dziedzicznych zawierają delecje w całym regionie E1a i części E1b. Ten replikacyjnie defektywny wirus hodowany jest w komórkach 293, zawierających funkcjonalny gen adenowirusowy E1a, który zapewnia transaktywne białko E1a. Wirusy z delecją E1a zdolne są do replikacji i wytwarzania zakaźnych wirusów w komórkach 293, które zapewniają produkty genów regionu E1a i E1b w trans. Otrzymany wirus zdolny jest do zakażania wielu typów komórek i ekspresji wprowadzonego genu (zakładając, iż ma on swój własny promotor), ale nie mogą replikować w komórce, która nie przenosi DNA regionu E1, chyba, że komórka zostanie zakażona z wysoką wielokrotnością zakażenia. Adenowirusy mają tę zaletę, iż mają szeroki zakres gospodarzy, mogą zakażać spoczynkowe albo terminalnie zróżnicowane komórki, takie jak neurony i wydają się zasadniczo nieonkogenne. Adenowirusy nie wydają się ulegać integracji z genomem gospodarza. Ponieważ istnieją pozachromosomalnie, ryzyko mutagenezy przez insercję jest znacznie zmniejszone. Ali i wsp., patrz wyżej, w 373. Rekombinowane adenowirusy (rAdV) wytwarzają bardzo wysokie miana, cząsteczki wirusa są dosyć stabilne, poziomy ekspresji wysokie a wirusy zakazić mogą szeroki zakres komórek. Ich naturalnymi komórkami gospodarza jest nabłonek dróg oddechowych, tak że są użyteczne w terapii raków płuc.

Transfer za pośrednictwem bakulowirusa ma kilka zalet. Bakulowirusowy transfer genów może zachodzić w replikujących i nie replikujących komórkach i może zachodzić w komórkach nerki, jak również w hepatocytach, komórkach nerwowych, śledzionie, skórze i mięśniu. Bakulowirus jest niereplikującym i niepatogennym wirusem w komórkach ssaczych. Ludzie nie posiadają wcześniej istniejących przeciwciał przeciwko rekombinowanemu bakulowirusowi, które mogłyby zablokować infekcję. Dodatkowo, bakulowirus zdolny jest do włączenia doń i przeniesienia bardzo dużych insertów DNA.

Wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV) również stosowano jako wektory do somatycznej terapii genowej. AAV jest małym, jednoniciowym (ss) wirusem DNA o prostej organizacji genomu (4.7 kb), co czyni go idealnym substratem dla inżynierii genetycznej. Dwie otwarte ramki odczytu kodują serię polipeptydów rep i cap. Polipeptydy rep (rep78, rep68, rep62 i rep40) zaangażowane są w replikację, uwolnienie i integrację genomu AAV. Białka osłonki (VP1, VP2 i VP3) tworzą kapsyd wirionu. Flankujące otwarte ramki odczytu rep i cap na końcach 5' i 3' są odwróconymi powtórzeniami terminalnymi (ITR) o długości 145 bp, z których pierwsze 125 bp jest zdolnych do tworzenia struktur dupleksowych o kształcie liter Y lub T. Dla opracowywania wektorów AAV ważna jest możliwość wycięcia całych domen rep i cap i zastąpienia transgenem terapeutycznym albo reporterowym. Patrz B.J. Carter, w Handbook of Parvoviruses, red., P. Tijsser, CRC Press, str. 155-168 (1990). Wykazano, iż ITR stanowią minimalną sekwencję wymaganą dla replikacji, uwolnienia, pakowania i integracji genomu AAV.

Cykl życiowy AAV jest dwufazowy, złożony zarówno z epizodów latentnych jak i litycznych. W czasie infekcji latentnej, wiiriony AAV wchodzą do komórki jako zamknięte w kapsule ssDNA i wkrótce

PL 191 248 B1 potem dostarczane są do jądra, gdzie DNA AAV stabilnie ulega integracji z chromosomem gospodarza bez wyraźnej potrzeby podziału komórki gospodarza. Przy braku wirusa pomocniczego, zintegrowany genom AAV pozostaje latentny ale zdolny do reaktywacji i uwolnienia. Faza lityczna cyklu życiowego zaczyna się, gdy komórka zawierająca prowirusa AAV ulegniezakażeniuwtórnemu wirusem herpes albo adenowirusem, który koduje funkcje pomocnicze, które wymagane są przez AAV dla pomocy w wycięciu z chromatyny gospodarza (B.J. Carter, j.w.). Zakażające rodzicielskie ssDNA ulega rozszerzeniu do podwójnej postaci replikującej (RF) DNA w sposób zależny od rep. Uwolnione genomy AAV zostają upakowane we wstępnie uformowanych kapsydach białkowych (o symetrii ikozaedralnej i w przybliżeniu 20 nm średnicy)i uwolnione jako zakaźne wiriony,które mają upakowane genomyz albo + albo - ssDNA, po lizie komórki.

Wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV) mają znaczny potencjał w terapii genowej. Cząstki wirusowe są bardzo stabilne a rekombinowane AAV (rAAV) mają lekopodobną charakterystykę polegającą na tym, że rAAV można oczyścić przez peletowanie albo przez wirowanie w gradiencie CsCl. Są one stabilne cieplnie i mogą być liofilizowane na proszek i ponownie uwadniane do pełnej aktywności. Ich DNA stabilnie integruje się z chromosomami gospodarza tak, że ekspresja jest długoterminowa. Zakres gospodarzy dla AAV jest szeroki i AAV nie wywołuje żadnej znanej choroby tak, że wektoryrekombinowaneniesą toksyczne.

Po wprowadzeniu do komórki docelowej, interesujące sekwencje można zidentyfikować konwencjonalnymi metodami, takimi jak hybrydyzacja kwasów nukleinowych przy zastosowaniu sond, zawierających sekwencje, które są homologiczne/komplementarne do wstawionych sekwencji genów w wektorze. W innym podejściu, sekwencję (sekwencje) można zidentyfikować przez obecność albo nieobecność funkcji genów „znacznikowych” (np. aktywności kinazy tymidynowej, oporności na antybiotyki, itp.) spowodowanej przez wprowadzenie wektora ekspresyjnego do komórki docelowej.

Preparaty i podawanie

Związki tu opisane można podawać w dowolny sposób, który jest dopuszczalny medycznie. Może to obejmować wstrzyknięcia, drogi parenteralne, takie jak dożylna, donaczyniowa, dotętnicza, podskórna, domięśniowa, do wnętrza guza, dootrzewnowa, dokomorowa, do przestrzeni nadtwardówkowej, albo inne, jak również sposoby doustne, donosowe, dooczne, doodbytnicze albo nanoszenie miejscowe. Podawanie z podtrzymywanym uwalnianiem jest również włączone w zakres wynalazku, i obejmuje takie metody jak wstrzyknięcia depot albo rozpuszczalne implanty. W szczególności rozważa się dostarczenie zlokalizowane, przy pomocy takich metod jak dostarczanie przez cewnik do jednej bądź wielu tętnic, takich jak tętnica nerkowa albo naczynie zaopatrujące zlokalizowany nowotwór.

Termin „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” oznacza jeden bądź więcej organicznych, bądź nieorganicznych składników, naturalnych albo syntetycznych, z którym zmutowany protoonkogen albo zmutowana onkoproteina są połączone wcelu ułatwienia ich podania. Do dogodnych nośników należy jałowa sól fizjologiczna, choć znane są inne wodne i niewodne izotoniczne jałowe roztwory i jałowe zawiesiny farmaceutycznie dopuszczalne. W tym względzie, termin „nośnik” obejmuje liposomy i białko HIV-1tat (patrz Chen i wsp., Anal. Biochem. 227:168-175, 1995), jak również wszelkie plazmidowe i wirusowe wektory ekspresyjne. „Ilość skuteczna” odnosi się do tej ilości, która zdolna jest do polepszenia albo opóźnienia postępu choroby, degeneracji albo uszkodzenia. Ilość skuteczną określa się dla danego przypadku, biorąc pod uwagę, między innymi, leczone objawy i pożądane rezultaty. Przeciętny fachowiec może określić skuteczną ilość, uwzględniając powyższe czynniki, bez wykraczania poza rutynowe doświadczenie.

Układ liposomalny może być dowolną odmianą jednowarstwowych pęcherzyków, wielowarstwowych pęcherzyków albo stabilnych wielowarstwowych pęcherzyków i może być przygotowany i podany według sposobów dobrze znanych specjalistom, na przykład ujawnionych w opisach patentowych USA nr 5,169,637, 4,762,915, 5,000,958 albo 5,185,154. Ponadto, pożądana może być ekspresja nowych polipeptydów jak również innych wybranych peptydów, takich jak lipoproteiny, w celu wzmocnienia ich wiązania z liposomami. Jako przykład, leczenie u ludzi ostrej niewydolności nerek zamkniętym w liposomie RetL można przeprowadzić in vivo przez wprowadzenie RetL do komórek potrzebujących takiego leczenia przy zastosowaniu liposomów. Liposomy można dostarczyć poprzez cewnik do tętnicy nerkowej. Rekombinowane białko RetL oczyszcza się, na przykład z komórek CHO przez chromatografię immunopowinowactwa albo inną dogodną metodą, następnie miesza z liposomami i włącza do nich z wysoką wydajnością. Białko zamknięte w liposomie można testować in vitro nawpływna stymulacjęwzrostu komórek.

PL 191 248 B1

Rozważane jest również podawanie zwierzęciu nowych polipeptydów przez układ dostarczania liposomalnego w celu wzmocnienia ich stabilności i/lub immunogenności. Dostarczenie nowych polipeptydów przez liposomy może być szczególnie korzystne, ponieważ liposom może ulegać internalizacji przez komórki fagocytarne u leczonego zwierzęcia. Takie komórki, po strawieniu błony liposomalnej następnie prezentują polipeptydy układowi odpornościowemu w połączeniu z innymi cząsteczkami wymaganymi dla wywołania silnej odpowiedzi immunologicznej.

Każdy z nowych polipeptydów RetL może być zastosowany w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli. Dogodne kwasy i zasady, które zdolne są do tworzenia soli z polipeptydami są dobrze znane osobom biegłym w stanie techniki i obejmują nieorganiczne i organiczne kwasy i zasady.

Choć powyższy wynalazek opisano dosyć szczegółowo w charakterze objaśnienia i przykładu dla celów jasności zrozumienia, dla osoby biegłej w stanie techniki będzie oczywiste, iż pewne zmiany i modyfikacje można przeprowadzić w zakresie wynalazku, ograniczonym jedynie przez zakres załączonych zastrzeżeń.

Lista sekwencji (1) Informacje ogólne:

(i) Zgłaszający: BIOGEN IDEC MA INC.

(ii) Tytuł wynalazku: Ligand Ret (RetL) do stymulacji wzrostu tkanki nerwowej i nerkowej (iii) Liczba sekwencji: 21 (iv) Adres do korespondencji:

(A) Adres: BIOGEN IDEC MA INC.

(B) Ulica: 14 Cambridge Center (C) Miasto: Cambridge (D) Stan: MA (E) Państwo: USA (F) Kod pocztowy: 02142 (v) Sposób odczytu kompterowego:

(A) Typ nośnika: Dyskietka (B) Komputer: zgodny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (vi) Dane obecnego zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia:

(B) Data złożenia: 7 maja 1997 (C) Klasyfikacja:

(vi) Dane poprzedniego zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: US 08/999999 (B) Data złożenia: 1 stycznia 1996 (viii) Informacje o rzeczniku/pełnomocniku (A) Nazwisko: Levine Leslie M.

(B) Numer rejestracyjny: 35,245 (C) Numer sprawy: A008 PCT CIP (ix) Informacje telekomunikacyjne:

(A) telefon: 6176792400 (B) fax: 6176792838 (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 3616 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: Nie

PL 191 248 B1 (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CHARAKTERYSTYKA (A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Położenie: 257..1660 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 1

GCGGCCGCAG GTTGGGTCGG AACTGAACCC CTGAAAGCGG	GTCCGCCTCC	CGCCCTCGCG	60
CCCGCCCGGA TCTGAGTCGC TGGCGGCGGT GGGCGGCAGA	GCGACGGGGA	GTCTGCTCTC	120
ACCCTGGATG GAGCTGAACT TTGAGTGGCC AGAGGAGCGC	AGTCGCCCGG	GGATCGCTGC	180
ACGCTGAGCT CTCTCCCCGA GACCGGGCGG CGGCTTTGGA	TTTTGGGGGG	GCGGGGACCA	240
GCTGCGCGGC GGCACC ATG TTC CTA GCC ACT CTG TAC TTC GCG CTG CCA Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro	289

1

5

10

CTC

CTG

GAT

TTG

CTG

ATG

TCC

GCC

GAG

GTG

AGT

GGT

GGA

GAC

CGT

CTG

337

Leu

Leu

Asp

Leu 15

Leu

Met

Ser

Ala

Glu 20

val

Ser

Gly

Gly

Asp 25

Arg

Leu

GAC

TGT

GTG

AAA

GCC

AGC

GAT

CAG

TGC

CTG

AAG

GAA

CAG

AGC

TGC

AGC

385

Asp

Cys

Val 30

Lys

Ala

Ser

Asp

Gin 35

Cys

Leu

Lys

Glu

Gin 40

Ser

Cys

Ser

ACC

AAG

TAC

CGC

ACA

CTA

AGG

CAG

TGC

GTG

GCG

GGC

AAG

GAA

ACC

AAC

433

Thr

Lys 45

Tyr

Arg

Thr

Leu

Arg 50

Gin

Cys

Val

Ala

Gly 55

Lys

Glu

Thr

Asn

TTC

AGC

CTG

ACA

TCC

GGC

CTT

GAG

GCC

AAG

GAT

GAG

TGC

CGT

AGC

GCC

481

Phe 60

Ser

Leu

Thr

Ser

Gly 65

Leu

Glu

Ala

Lys

Asp 70

Glu

Cys

Arg

Ser

Ala 75

ATG

GAG

GCC

TTG

AAG

CAG

AAG

TCT

CTG

TAC

AAC

TGC

CGC

TGC

AAG

CGG

529

Met

Glu

Ala

Leu

Lys 80

Gin

Lys

Ser

Leu

Tyr 85

Asn

Cys

Arg

Cys

Lys 90

Arg

GGC

ATG

AAG

AAA

GAG

AAG

AAT

TGT

CTG

CGT

ATC

TAC

TGG

AGC

ATG

TAC

577

Gly

Met

Lys

Lys 95

Glu

Lys

Asn

Cys

Leu 100

Arg

Ile

Tyr

Trp

Ser 105

Met

Tyr

CAG

AGC

CTG

CAG

GGA

AAT

GAC

CTC

CTG

GAA

GAT

TCC

CCG

TAT

GAG

CCG

625

Gin

Ser

Leu 110

Gin

Gly

Asn

Asp

Leu 115

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro 120

Tyr

Glu

Pro

GTT

AAC

AGC

AGG

TTG

TCA

GAT

ATA

TTC

CGG

GCA

GTC

CCG

TTC

ATA

TCA

673

Val

Asn 125

Ser

Arg

Leu

Ser

Asp 130

Ile

Phe

Arg

Ala

Val 13 5

Pro

Phe

Ile

Ser

PL 191 248 B1

GAT GTT TTC

CAG Gin

CAA Gin

GTG Val 145

GAA CAC ATT TCC AAA GGG AAC AAC TGC

CTG Leu 155

721

Asp Val 140

Phe

Glu

His

He

Ser

Lys 150

Gly

Asn

Asn

Cys

GAC

GCA

GCC

AAG

GCC

TGC

AAC

CTG

GAC

GAC

ACC

TGT

AAG

AAG

TAC

AGG

769

Asp

Ala

Ala

Lys

Ala

Cys

Asn

Leu

Asp

Asp

Thr

Cys

Lys

Lys

Tyr

Arg

160

165

170

TCG

GCC

TAC

ATC

ACC

CCC

TGC

ACC

ACC

AGC

ATG

TCC

AAC

GAG

GTC

TGC

817

Ser

Ala

Tyr

Ile

Thr

Pro

Cys

Thr

Thr

Ser

Met

Ser

Asn

Glu

Val

Cys

175

180

185

AAC

CGC

CGT

AAG

TGC

CAC

AAG

GCC

CTC

AGG

CAG

TTC

TTC

GAC

AAG

GTT

865

Asn

Arg

Arg

Lys

Cys

His

Lys

Ala

Leu

Arg

Gin

Phe

Phe

Asp

Lys

Val

190

195

200

CCG

GCC

AAG

CAC

AGC

TAC

GGG

ATG

CTC

TTC

TGC

TCC

TGC

CGG

GAC

ATC

913

Pro

Ala

Lys

His

Ser

Tyr

Gly

Met

Leu

Phe

Cys

Ser

Cys

Arg

Asp

Ile

205

210

215

GCC

TGC

ACC

GAG

CGG

CGG

CGA

CAG

ACT

ATC

GTC

CCC

GTG

TGC

TCC

TAT

961

Ala

Cys

Thr

Glu

Arg

Arg

Arg

Gin

Thr

Ile

Val

Pro

Val

Cys

Ser

Tyr

220

225

230

235

GAA

GAA

CGA

GAG

AGG

CCC

AAC

TGC

CTG

AGT

CTG

CAA

GAC

TCC

TGC

AAG

1009

Glu

Glu

Arg

Glu

Arg

Pro

Asn

Cys

Leu

Ser

Leu

Gin

Asp

Ser

Cys

Lys

240

245

250

ACC

AAT

TAC

ATC

TGC

AGA

TCT

CGC

CTT

GCA

GAT

TTT

TTT

ACC

AAC

TGC

1057

Thr

Asn

Tyr

Ile

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp

Phe

Phe

Thr

Asn

Cys

255

260

265

CAG

CCA

GAG

TCA

AGG

TCT

GTC

AGC

AAC

TGT

CTT

AAG

GAG

AAC

TAC

GCA

1105

Gin

Pro

Glu

Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Asn

Cys

Leu

Lys

Glu

Asn

Tyr

Ala

270

275

2Θ0

GAC

TGC

CTC

CTG

GCC

TAC

TCG

GGA

CTG

ATT

GGC

ACA

GTC

ATG

ACT

CCC

1153

Asp

Cys

Leu

Leu

Ala

Tyr

Ser

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr

Val

Met

Thr

Pro

285

290

295

AAC

TAC

GTA

GAC

TCC

AGC

AGC

CTC

AGC

GTG

GCA

CCA

TGG

TGT

GAC

TGC

1201

Asn

Tyr

Val

Asp

Ser

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

Ala

Pro

Trp

Cys

Asp

Cys

300

305

310

315

AGC

AAC

AGC

GGC

AAT

GAC

CTG

GAA

GAC

TGC

TTG

AAA

TTT

CTG

AAT

TTT

1249

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

Asp

Leu

Glu

Asp

Cys

Leu

Lys

Phe

Leu

Asn

Phe

320

325

330

TTT

AAG

GAC

AAT

ACT

TGT

CTC

AAA

AAT

GCA

ATT

CAA

GCC

TTT

GGC

AAT

1297

Phe

Lys

Asp

Asn

Thr

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

Ile

Gin

Ala

Phe

Gly

Asn

335

340

345

GGC

TCA

GAT

GTG

ACC

ATG

TGG

CAG

CCA

GCC

CCT

CCA

GTC

CAG

ACC

ACC

1345

Gly

Ser

Asp

Val

Thr

Met

Trp

Gin

Pro

Ala

Pro

Pro

Val

Gin

Thr

Thr

350 3S5 360

PL 191 248 B1

ACT GCC Thr Ala	ACC ACT ACC ACT GCC TTC CGG GTC AAG AAC AAG	CCT CTG GGG	1393
Thr	Thr Thr Thr Ala Phe 370	Arg	Val	Lys	Asn 375	Lys	Pro Leu	Gly
	365
CCA	GCA	GGG	TCT GAG AAT GAG ATC	CCC	ACA	CAC	GTT	TTA	CCA CCC	TGT	1441
Pro	Ala	Gly	Ser Glu Asn Glu Ile	Pro	Thr	His	Val	Leu	Pro Pro	Cys
380			385			390				395
GCG	AAT	TTG	CAG GCT CAG AAG CTG	AAA	TCC	AAT	GTG	TCG	GGT AGC	ACA	1489
Ala	Asn	Leu	Gin Ala Gin Lys Leu	Lys	Ser	Asn	Val	Ser	Gly Ser	Thr
			400		405				410
CAC	CTC	TGT	CTT TCT GAT AGT GAT	TTC	GGA	AAG	GAT	GGT	CTC GCT	GGT	1537
His	Leu	Cys	Leu Ser Asp Ser Asp	Phe	Gly	Lys	Asp	Gly	Leu Ala	Gly
			415	420					425
GCC	TCC	AGC	CAC ATA ACC ACA AAA	TCA	ATG	GCT	GCT	CCT	CCC AGC	TGC	1585
Ala	Ser	Ser	His Ile Thr Thr Lys	Ser	Met	Ala	Ala	Pro	Pro Ser	Cys
		430	435					440
AGT	CTG	AGC	TCA CTG CCG GTG CTG	ATG	CTC	ACC	GCC	CTT	GCT GCC	CTG	1633
Ser	Leu	Ser	Ser Leu Pro Val Leu	Met	Leu	Thr	Ala	Leu	Ala Ala	Leu
	445		450				455
TTA	TCT	GTA	TCG TTG GCA GAA ACG	TCG	TAGCTGCATC CGGGAAAACA		1680
Leu	Ser	Val	Ser Leu Ala Glu Thr	Ser
460			465

GTATGAAAAG	ACAAAAGAGA	ACCAAGTATT	CTGTCCCTGT	CCTCTTGTAT	ATCTGAAAAT	1740
CCAGTTTTAA	AAGCTCCGTT	GAGAAGCAGT	TTCACCCAAC	TGGAACTCTT	TCCTTGTTTT	1800
TAAGAAAGCT	TGTGGCCCTC	AGGGGCTTCT	GTTGAAGAAC	TGCTACAGGG	CTAATTCCAA	1860
ACCCATAAGG	CTCTGGGGCG	TGGTGCGGCT	TAAGGGGACC	ATTTGCACCA	TGTAAAGCAA	1920
GCTGGGCTTA	TCATGTGTTT	GATGGTGAGG	ATGGTAGTGG	TGATGATGAT	GGTAATTTTA	1980
ACAGCTTGAA	CCCTGTTCTC	TCTACTGGTT	AGGAACAGGA	GATACTATTG	ATAAAGATTC	2040
TTCCATGTCT	TACTCAGCAG	CATTGCCTTC	TGAAGACAGG	CCCGCAGCCT	AGTGTGAATG	2100
ACAAGTGGAG	GTTGGCCTCA	AGAGTGGACT	TGGCAGACTC	TACCTTGTAG	TAATGTTCAC	2160
CTTTCCGTGT	ATGGTCTCCA	CAGAGTGTTT	ATGTATTTAC	AGACTGTTCT	GTGATCCCCC	2220
AACAACAACA	ACCACAAATT	CCTTGGTCAC	CTCCAAATGT	AACCGGTCCT	TTAGCCCAGT	2280
AGAGGAGGGT	GGGTGTGGCC	CTGGCACAGC	TCCCGGATTG	TTGATGGGCA	CTCTCCTGAG	2340
CTTTGCTTGA	GTGAGAAGCT	GAATGTAGCT	GAAAATCAAC	TCTTCTTACA	CTTCTTACTG	2400
CTTCGTTCAC	TTACGAGGTC	ACATATAGAA	CAAACATCAC	CAACTATTAG	CTTACCGTTA	2460

PL 191 248 B1

GCTTCCCAAC	TATTAGCTTT	CTATGTTTTG	AAAGCAGTGT	TGCTGACCCC	ATGTTTTAAT	2520
GATGGTTTAA	TACATGCAGC	CCTTTCCTCT	CATCGGTAAC	ACTAGCTCCA	ACATCAACTT	2580
CATGCATGTG	GCTCTCAAAA	GCAGGCCCCA	AGAAGCCCAG	TTCTTTAGGA	GAAAGCTGCG	2640
TCCTGTTTCT	GTGGACAGGC	AGGAGGAAAC	AGAGCAGCCT	GCCCGTGGTG	TCTTTATCTG	2700
TTTTGAAATC	AAGGCTGCCT	GTGTGTAAGG	AATGGTTCAA	TTCTTATAAA	GGGTGCCACT	2760
GTTGATGCCA	CAACTGGCAG	TTGGTCTAGC	TCCAGGACAC	CGGTTTCCAT	GTTGCCTGGC	2820
AGAGACAGCT	TTGATTGGGA	CTGGCTGGCC	ACAAGGGATG	GGATGAAGAT	GTGCTGCCCT	2880
CTCTTTCAAA	GTTGAGCCCT	GCCAGGGCAC	ATAGAAGCAT	CTTTGCTCCT	GACCACAACG	2940
TAGAACAGCT	TGGATTCAAG	GTCATCAAGC	GTCTCCTGTA	CATTGCTCTG	TGACCTTCAT	3000
AACAGACTGT	CCCGCACAAA	AGGAACGGCA	GTTTATGGAT	CTAGAGTGGG	AGCACAGGGT	3060
CTGGAAAGGT	GAACCGATTG	GCAAAATACA	CAGAACAGGA	GGGAGAGTCT	CAAGCCGAGA	3120
CATCTTGCTT	ACTAGCCACA	CACCATCTCC	TGGAGCCCTC	CTCCTGACCT	GGGCAGACCC	3180
TTAGGTGTAT	ATCTAAAGAC	CTCTTCAATG	TTCAGGTTCA	GAATCTGTAA	ATGGTTGCGT	3240
CCTGGCACCC	ATTCCTGAAA	ACTGAACAAA	GGAGAGGATA	TCTTTCCTCC	ATTGAGCCCT	3300
GAAAGTATGA	CTGGCTTCTC	ACCCTCCCAC	AGAGCAGGGA	GCCCTGGTGC	ACACAGTCTC	3360
CTGATATCCT	CCCTGCTCTT	TGAGGTTTGC	CTTGGGAGAA	AATGATTCAC	CTCGGGAGGG	3420
GACGCTTTGG	TGTCTGAAGT	ACGTTTATAT	CGAAATGTTA	ATGAATACCC	ATGTAAAATA	3480
CTCAATAGCC	ACCTTTCTTC	CCTTCACAAT	GTTTTCGAGG	GGAATGCATC	CAACATCCAA	3540
GTGTACCTGG	TCAGTGGGAA	GTTCCATGAA	GACTCATACA	TTGAATAAAC	ATATTCGATG	3600
TGCCGAAAGC	GGCCGC					3616

(2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 468 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 2

Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu ¹ 5 10 15

PL 191 248 B1

Met Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly 20

Ser Asp Gin Cys Leu Lys Glu Gin 35 40

Leu Arg Gin Cys Val Ala Gly Lys 50 55

Gly Leu Glu Ala Lys Asp Glu Cys 65 70

Gin Lys Ser Leu Tyr Asn Cys Arg 85

Lys Asn Cys Leu Arg Ile Tyr Trp 100

Asn Asp Leu Leu Glu Asp Ser Pro 115 120

Ser Asp Ile Phe Arg Ala Val Pro 130 135

Val Glu His Ile Ser Lys Gly Asn 145 150

Cys Asn Leu Asp Asp Thr Cys Lys 165

Pro Cys Thr Thr Ser Met Ser Asn 180

His Lys Ala Leu Arg Gin Phe Phe 195 200

Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys 210 215

Arg Arg Gin Thr Ile Val Pro Val 225 230

Pro Asn Cys Leu Ser Leu Gin Asp 245

Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe 260

Ser Val Ser Asn Cys Leu Lys Glu 275 280

Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val 290 295

Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala 25 30

Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr 45

Glu Thr Asn Phe Ser Leu Thr Ser 60

Arg Ser Ala Met Glu Ala Leu Lys 75 80

Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu 90 95

Ser Met Tyr Gin Ser Leu Gin Gly 105 110

Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu 125

Phe Ile Ser Asp Val Phe Gin Gin 140

Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala 155 160

Lye Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile Thr 170 175

Glu Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys 185 190

Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser 205

Arg Asp Ile Ala Cys Thr Glu Arg 220

Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Arg 235 240

Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys 250 255

Thr Asn Cys Gin Pro Glu Ser Arg 265 270

Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala 285

Met Thr Pro Asn Tyr Val Asp Ser 300

PL 191 248 B1

Ser 305

Ser

Leu

Ser

Val

Ala 310

Pro

Trp

Cys

Asp

Cys 315

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn 320

Asp

Leu

Glu

Asp

Cys 325

Leu

Lys

Phe

Leu

Asn 330

Phe

Phe

Lys

Asp

Asn 335

Thr

Cys

Leu

Lys

Asn 340

Ala

Ile

Gln

Ala

Phe 345

Gly

Asn

Gly

Ser

Asp 350

Val

Thr

Met

Trp

Gln 355

Pro

Ala

Pro

Pro

Val 360

Gln

Thr

Thr

Thr

Ala 365

Thr

Thr

Thr

Thr

Ala 370

Phe

Ars

Val

Lys

Asn 375

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro 380

Ala

Gly

Ser

Glu

Asn 385

Olu

Ile

Pro

Thr

Bis 390

Val

Leu

Pro

Pro

Cys 395

Ala

Asn

Leu

Gln

Ala 400

Gln

Lys

Leu

Lys

Ser 405

Asn

Val

Ser

Gly

Ser 410

Thr

His

Leu

Cye

Leu 415

Ser

Asp

Ser

Asp

Phe 420

Gly

Lys

Asp

Gly

Leu 425

Ala

Gly

Ala

Ser

Ser 430

His

Ile

Thr

Thr

Lys 435

Ser

Met

Ala

Ala

Pro 440

Pro

Ser

Cys

Ser

Leu 445

Ser

Ser

Leu

Pro

Val 450

Leu

Met

Leu

Thr

Ala 455

Leu

Ala

Ala

Leu

Leu 460

ser

Val

Ser

Leu

Ala 465

Olu

Thr

Ser

(2) INFORMACJE DLA

SEK

NR

ID:

3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 3: AAGGAAAAAA GCGGCCGCCA TGGCGAAGGC GACGTCCGG (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 4: ³⁹ (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

PL 191 248 B1 (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 4 AGTTTTGTCG ACGGTGCGGC ACAGCTCGTC GCA (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 5: AGTTTTGTCG ACCGTGCGGC ACAGCGCATC ACA (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1926 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Położenie: 10..1920 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 6

GCGGCCGCC ATG GCG AAG GCG ACG TCC GGC GCC GCA GGG CTG GGG CTG 48

Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Gly Leu

470 475 480

AAG CTG TTT TTG CTG CTG CCG CTA CTG GGA GAA GCC COG CTG GGT CTC 96

Lys Leu Phe Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Glu Ala Pro Leu Gly Leu

485 490 495

PL 191 248 B1

TAC TTC TCA	AGG GAT GCT Arg Asp Ala	TAC TGG Tyr Trp 505	GAG Glu
Tyr	Phe	Ser 500
GCT	GGC	ACA	CCT CTG CTC	TAT GTC	CAT
Ala	Gly 515	Thr	Pro Leu Leu	Tyr Val 520	His
GAA	GTG	CCC	AGC TTC CGC	CTG GGC	CAG
Glu 530	Val	Pro	Ser Phe Arg 535	Leu Gly	Gin
ACG	CGT	CTG	CAT GAG AAT	GAC TGG	ATC
Thr	Arg	Leu	His Glu Asn 550	Asp Trp	Ile
CTC	CTC	TAC	CTC AAT CAG	AGC CTG	GAC
Leu	Leu	Tyr	Leu Asn Gin 565	Ser Leu	Asp 570
AGC	ATC	CGA	AAT GGC GGC	TTC CCC	TTG
Ser	Ile	Arg 580	Asn Gly Gly	Phe Pro 585	Leu
TTC	CTG	GGG	TCC ACA GCC	CAG AGA	GAG
Phe	Leu S95	Gly	Ser Thr Ala	Gin Arg 600	Glu
TGT	GCC	CGT	GTG TAC TTC	TCC TTC	ATC
Cys 610	Ala	Arg	Val Tyr Phe 615	Ser Phe	Ile
AGC	TCC	TTC	AAA GCC CGG	GAT CTC	TGC
Ser	Ser	Phe	Lys Ala Arg 630	Asp Leu	Cys
TTC	CGC	ATC	AGG GAG AAC	AGG CCC	CCT
Phe	Arg	Ile	Arg Glu Asn 64 5	Arg Pro	Pro 650
ATG	CTA	CCT	GTG CAG TTC	CTT TGT	CCT
Met	Leu	Pro 660	Val Gin Phe	Leu Cys 665	Pro
CTC	TTA	GAA	GGG GAC GGT	CTG CCC	TTC
Leu	Leu 675	Glu	Gly Asp Gly	Leu Pro 680	Phe
GAG	GTG	AGC	ACG CGG TGG	GCA CTG	GAT
Glu 690	Val	Ser	Thr Arg Trp 695	Ala Leu	Asp
GTG	CTG	GAG	GCT GAG TGC	GCA GTG	GCA
Val	Leu	Glu	Ala Glu Cys	Ala Val	Ala

710

AGG	CTG	TAT	GTG	GAC	CAG	CCA	144
Arg	Leu	Tyr	Val 510	Asp	Gin	Pro
GCC	CTA	CGG	GAT	GCC	CCT	GGA	192
Ala	Leu	Arg 525	Asp	Ala	Pro	Gly
TAT	CTC	TAT	GGC	GTC	TAC	CGC	240
Tyr	Leu 540	Tyr	Gly	val	Tyr	Arg 545
CAC	ATC	GAT	GCG	GGC	ACT	GGC	288
His 555	Ile	Asp	Ala	Gly	Thr 560	Gly
CAT	AGT	TCC	TGG	GAG	CAG	CTC	336
His	Ser	Ser	Trp	Glu 575	Gin	Leu
CTC	ACC	GTC	TTC	CTC	CAG	GTC	364
Leu	Thr	Val	Phe 590	Leu	Gin	Val
GGA	GAG	TGT	CAT	TGG	CCA	GGC	432
Gly	Glu	Cys 605	His	Trp	Pro	Gly
AAC	GAC	ACC	TTC	CCA	AAT	TGT	480
Asn	Asp 620	Thr	Phe	Pro	Asn	Cys 62S
ACC	CCA	GAG	ACG	GGT	GTG	TCC	528
Thr 635	Pro	Glu	Thr	Gly	Val 640	Ser
GGC	ACC	TTC	TAC	CAG	TTC	CGC	576
Gly	Thr	Phe	Tyr	Gin 655	Phe	Arg
AAC	ATC	AGT	GTG	AAG	TAC	AAA	624
Asn	Ile	Ser	Val 670	Lys	Tyr	Lys
CGT	TGT	GAC	CCC	GAC	TGT	CTG	672
Arg	Cys	Asp 685	Pro	Asp	Cys	Leu
CGG	GAG	CTT	CAG	GAG	AAG	TAT	720
Arg	Glu 700	Leu	Gin	Glu	Lys	Tyr 705
GGC	CCT	GGA	GCC	AAC	AAG	GAG	768
Gly 715	Pro	Gly	Ala	Asn	Lys 720	Glu

PL 191 248 B1

AAG

GTG

GCC

GTG

TCC

TTC

CCG

GTG

ACG

GTG

TAT

GAT

GAA

GAC.

GAC

TCC

816

Lys

Val

Ala

Val 725

Ser

Phe

Pro

Val

Thr 730

Val

Tyr

Asp

Glu

Asp 735

Asp

Ser

CCG

CCC

ACC

TTC

TCC

GGA

GGT

GTG

GGC

ACC

GCC

AGT

GCT

GTG

GTG

GAG

864

Pro

Pro

Thr 740

Phe

Ser

Gly

Gly

Val 745

Gly

Thr

Ala

Ser

Ala 750

Val

Val

Glu

TTT

AAG

CGG

AAG

GAG

GGC

ACT

GTG

GTA

GCC

ACT

CTG

CAG

GTG

TTT

GAT

912

Phe

Lys 755

Arg

Lys

Glu

Gly

Thr 760

Val

Val

Ala

Thr

Leu 765

Gin

Val

Phe

Asp

GCA

GAT

GTG

GTG

CCA

GCA

TCT

GGG

GAG

CTG

GTG

AGG

CGG

TAC

ACA

AGC

960

Ala 770

Asp

Val

Val

Pro

Ala 775

Ser

Gly

Glu

Leu

Val 780

Arg

Arg

Tyr

Thr

Ser 785

ACA

CTA

CTC

TCA

GGG

GAT

TCC

TGG

GCC

CAG

CAG

ACC

TTC

CGG

GTG

GAG

1008

Thr

Leu

Leu

Ser

Gly 790

Asp

Ser

Trp

Ala

Gin 795

Gin

Thr

Phe

Arg

Val 800

Glu

CAC

ACA

CCC

AAC

GAG

ACC

TTG

GTC

CAG

TCC

AAC

AAC

AAC

TCC

GTG

CGG

1056

His

Thr

Pro

Asn Θ05

Glu

Thr

Leu

Val

Gin 810

Ser

Asn

Asn

Asn

Ser 815

Val

Arg

GCA

ACC

ATG

CAC

AAT

TAC

AAG

CTG

GTT

CTC

AAC

AGG

AGC

CTG

TCC

ATC

1104

Ala

Thr

Met 820

His

Asn

Tyr

Lys

Leu 825

Val

Leu

Asn

Arg

Ser 830

Leu

Ser

Ile

TCA

GAG

AGC

CGA

GTC

CTG

CAG

CTA

GTA

GTC

CTG

GTC

AAT

GAC

TCA

GAC

1152

Ser

Glu 835

Ser

Arg

Val

Leu

Gin 840

Leu

Val

Val

Leu

Val 845

Asn

Asp

Ser

Asp

TTC

CAG

GGG

CCT

GGG

TCA

GGT

GTT

CTC

TTC

CTC

CAT

TTC

AAC

GTG

TCT

1200

Phe 850

Gin

Gly

Pro

Gly

Ser 855

Gly

Val

Leu

Phe

Leu 860

His

Phe

Asn

Val

Ser 865

GTG

CTG

CCT

GTC

ACC

CTG

AAC

CTA

CCC

ATG

GCC

TAC

TCC

TTC

CCA

GTG

1248

Val

Leu

Pro

Val

Thr 870

Leu

Asn

Leu

Pro

Met 875

Ala

Tyr

Ser

Phe

Pro 880

Val

AAT

AGG

AGA

GCC

CGC

CGT

TAT

GCC

CAG

ATT

GGG

AAA

GTT

TGC

GTG

GAG

1296

Asn

Arg

Arg

Ala 885

Arg

Arg

Tyr

Ala

Gin 890

Ile

Gly

Lys

Val

Cys 895

Val

Glu

AAC

TGC

CAG

GAG

TTC

AGC

GGT

GTC

TCC

ATC

CAG

TAC

AAG

CTG

CAG

CCC

1344

Asn

Cys

Gin 900

Glu

Phe

Ser

Gly

Val 905

Ser

Ile

Gin

Tyr

Lys 910

Leu

Gin

Pro

TCC

AGC

ACC

AAC

TGC

AGT

GCC

CTA

GGT

GTG

GTC

ACC

TCA

ACA

GAA

GAC

1392

Ser

Ser

Thr

Asn

Cys

Ser

Ala

Leu

Gly

Val

Val

Thr

Ser

Thr

Glu

Asp

915 920 925

PL 191 248 B1

ACC TCA GGG ACC CTA TAT GTA AAT GAC ACG GAG GCC CTG Thr Ser Gly Thr Leu Tyr Val Asn Asp Thr Glu Ala Leu 930 935 940

GAG TGT ACC GAG CTT CAG TAC ACA GTG GTA GCC ACT GAC

Glu Cys Thr Glu Leu Gin Tyr Thr Val Val Ala Thr Asp

950 955

CGC AGG CAG ACC CAA GCT TCG TTA GTC GTC ACA GTG GAG

Arg Arg Gin Thr Gin Ala Ser Leu Val Val Thr Val Glu

965 970

ATT GCA GAA GAA GTG GGC TGC CCC AAG TCC TGT GCA GTA

Ile Ala Glu Glu Val Gly Cys Pro Lys Ser Cys Ala Val

960 98S 990

CGA CCT GAG TGT GAG GAG TGT GGT GGC CTG GGT TCT CCA

Arg Pro Glu Cys Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro

995 1000 1005

TGT GAG TGG CGT CAG GGA GAT GGT AAA GGG ATC ACC AGG

Cys Glu Trp Arg Gin Gly Asp Gly Lys Gly Ile Thr Arg

1010 1015 1020

ACC TGT TCT CCT AGC ACC AGG ACC TGT CCT GAT GGC CAC

Thr Cys Ser Pro Ser Thr Arg Thr Cys Pro Asp Gly His

1030 1035

CTG GAG AGC CGG GAT ATC AAC ATT TGC CCC CAG GAC TGT

Leu Glu Ser Arg Asp Ile Asn Ile Cys Pro Gin Asp Cys

1045 1050

CCC ATT GTT GGC GGG CAT GAG CGA GGG GAG CGC CAG GGG

Pro Ile Val Gly Gly His Glu Arg Gly Glu Arg Gin Gly

1060 1065 1070

GGC TAT GGC ATC TGC AAC TGT TTC CCT GAT GAG AAG AAG

Gly Tyr Gly Ile Cys Asn Cys Phe Pro Asp Glu Lys Lys

1075 1080 1085

GAG CCA GAG GAC AGC CAG GGC CCA TTG TGT GAT GCG CTG

Glu Pro Glu Asp Ser Gin Gly Pro Leu Cys Asp Ala Leu

1090 1095 1100

GTCGAC

CGG CGA CCT Arg Arg Pro 945

CGG CAG ACC Arg Gin Thr 960

GGG ACA TAC Gly Thr Tyr 975

AAC AAG AGG Asn Lys Arg

ACT GGC AGA Thr Gly Arg

AAC TTC TCC Asn Phe Ser 1025

TGT GAT GCT Cys Asp Ala 1040

CTC CGT GGC Leu Arg Gly 1055

ATT AAA GCC Ile Lys Ala

TGC TTC TGC Cys Phe Cys

TGC CGC ACG Cys Arg Thr 1105

1440

1486

1536

1564

1632

1680

1728

1776

1824

1672

1920

1926 (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 637 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

PL 191 248 B1

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 7:

Met 1

Ala

Lys

Ala

Thr 5

Ser

Gly

Ala

Ala

Gly 10

Leu

Gly

Leu

Lys

Leu 15

Phe

Leu

Leu

Leu

Pro 20

Leu

Leu

Gly

Glu

Ala 25

Pro

Leu

Gly

Leu

Tyr 30

Phe

Ser

Arg

Asp

Ala 35

Tyr

Trp

Glu

Arg

Leu 40

Tyr

Val

Asp

Gin

Pro 45

Ala

Gly

Thr

Pro

Leu 50

Leu

Tyr

Val

His

Ala 55

Leu

Arg

Asp

Ala

Pro 60

Gly

Glu

Val

Pro

Ser 65

Phe

Arg

Leu

Gly

Gin 70

Tyr

Leu

Tyr

Gly

Val 75

Tyr

Arg

Thr

Arg

Leu 80

His

Glu

Asn

Asp

Trp 65

Ile

His

Ile

Asp

Ala 90

Gly

Thr

Gly

Leu

Leu 95

Tyr

Leu

Asn

Gin

Ser 100

Leu

Asp

His

Ser

Ser 105

Trp

Glu

Gin

Leu

Ser 110

Ile

Arg

Asn

Gly Gly 115

Phe

Pro

Leu

Leu

Thr 120

Val

Phe

Leu

Gin

Val 125

Phe

Leu

Gly

Ser

Thr 130

Ala

Gin

Arg

Glu

Gly 135

Glu

Cys

His

Trp

Pro 140

Gly

Cys

Ala

Arg

Val 145

Tyr

Phe

Ser

Phe

Ile 150

Asn

Asp

Thr

Phe

Pro 155

Asn

Cys

Ser

Ser

Phe 160

Lys

Ala

Arg

Asp

Leu 165

Cys

Thr

Pro

Glu

Thr 170

Gly

Val

Ser

Phe

Arg 175

Ile

Arg

Glu

Asn

Arg 180

Pro

Pro

Gly

Thr

Phe 185

Tyr

Gin

Phe

Arg

Met 190

Leu

Pro

Val

Gin

Phe 195

Leu

Cys

Pro

Asn

Ile 200

Ser

Val

Lys

Tyr

Lys 205

Leu

Leu

Glu

Gly

Asp 210

Gly

Leu

Pro

Phe

Arg 215

Cys

Asp

Pro

Asp

Cys 220

Leu

Glu

Val

Ser

Thr 225

Arg

Trp

Ala

Leu

Asp 230

Arg

Glu

Leu

Gin

Glu 235

Lys

Tyr

Val

Leu

Glu 240

Ala

Glu

Cys

Ala

Val 245

Ala

Gly

Pro

Gly

Ala 250

Asn

Lys

Glu

Lys

Val 255

Ala

Val

Ser

Phe

Pro 260

Val

Thr

Val

Tyr

Asp 265

Glu

Asp

Asp

Ser

Pro 270

Pro

Thr

PL 191 248 B1

Phe

Ser

Gly 275

Gly

Val

Gly

Thr

Ala 280

Ser

Ala

val

Val

Glu 285

Phe

Lys

Arg

Lys

Glu 290

Gly

Thr

Val

Val

Ala 295

Thr

Leu

Gln

Val

Phe 300

Asp

Ala

Asp

Val

Val 305

Pro

Ala

Ser

Gly

Glu 310

Leu

Val

Arg

Arg

Tyr 315

Thr

Ser

Thr

Leu

Leu 320

Ser

Gly

Asp

Ser

Trp 325

Ala

Gln

Gln

Thr

Phe 330

Arg

Val

Glu

His

Thr 335

Pro

Asn

Glu

Thr

Leu 340

Val

Gln

Ser

Asn

Asn 345

Asn

Ser

Val

Arg

Ala 350

Thr

Met

His

Asn

Tyr 355

Lys

Leu

Val

Leu

Asn 360

Arg

Ser

Leu

Ser

Ile 365

Ser

Glu

Ser

Arg

Val 370

Leu

Gln

Leu

Val

Val 375

Leu

Val

Asn

Asp

Ser 380

Asp

Phe

Gln

Gly

Pro 385

Gly

Ser

Gly

Val

Leu 390

Phe

Leu

His

Phe

Asn 395

Val

Ser

Val

Leu

Pro 400

Val

Thr

Leu

Asn

Leu 405

Pro

Met

Ala

Tyr

Ser 410

Phe

Pro

Val

Asn

Arg 415

Arg

Ala

Arg

Arg

Tyr 420

Ala

Gln

Ile

Gly

Lys 425

Val

Cys

Val

Glu

Asn 430

Cys

Gln

Glu

Phe

Ser 435

Gly

Val

Ser

Ile

Gln 440

Tyr

Lys

Leu

Gln

Pro 445

Ser

Ser

Thr

Asn

Cys 450

Ser

Ala

Leu

Gly

Val 455

Val

Thr

Ser

Thr

Glu 460

Asp

Thr

Ser

Gly

Thr 465

Leu

Tyr

Val

Asn

Asp 470

Thr

Glu

Ala

Leu

Arg 475

Arg

Pro

Glu

Cys

Thr 480

Glu

Leu

Gln

Tyr

Thr 485

Val

Val

Ala

Thr

Asp 490

Arg

Gln

Thr

Arg

Arg 495

Gln

Thr

Gln

Ala

Ser 500

Leu

Val

Val

Thr

Val 505

Glu

Gly

Thr

Tyr

Ile 510

Ala

Glu

Glu

Val

Gly 515

Cys

Pro

Lys

Ser

Cys 520

Ala

Val

Asn

Lys

Arg 525

Arg

Pro

Glu

Cys

Glu 530

Glu

Cys

Gly

Gly

Leu 535

Gly

Ser

Pro

Thr

Gly 540

Arg

Cys

Glu

Trp

Arg

Gln

Gly

Asp

Gly

Lys

Gly

Ile

Thr

Arg

Asn

Phe

Ser

Thr

Cys

Ser

545 550 S55 560

PL 191 248 B1

Pro Ser Thr Arg Thr Cys Pro Asp Gly His	Cys Asp Ala Leu Glu 575	Ser
	S65	570
Arg	Asp Ile Asn Ile	Cys Pro Gin Asp Cys	Leu Arg Gly Pro Ile	Val
	560	585	590
Gly	Gly His Glu Arg	Gly Glu Arg Gin Gly	Ile Lys Ala Gly Tyr	Gly
	595	600	605
Ile	Cys Asn Cys Phe	Pro Asp Glu Lys Lys	Cys Phe Cys Glu Pro	Glu
	610	615	620
Asp	Ser Gin Gly Pro	Leu Cys Asp Ala Leu	Cys Arg Thr
625		630	635
(2)	INFORMACJE DLA SEK NR ID: 8:
	(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
	(A) DŁUGOŚĆ: 1223 pary zasad
	(B) TYP:	kwas nukleinowy
	(C) RODZAJ NICI: pojedyncza
	(D) TOPOLOGIA: liniowa
	(ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

(ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) :

Nazwa/Klucz

: CDS

(B)

Położenie:

1..1038

(xi) OPIS

SEKWENCJI:

SEK NR

ID:

8:

CTG

CTG

GAG

GAT

TCC

CCA

TAT

GAA

CCA

GTT

AAC

AGC

AGA

TTG

TCA

GAT

48

Leu

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro

Val

Asn

Ser

Arg

Leu

Ser

Asp

640

645

650

ATA

TTC

CGG

GTG

GTC

CCA

TTC

ATA

TCA

GTG

GAG

CAC

ATT

CCC

AAA

GGG

96

Ile

Phe

Arg

Val

Val

Pro

Phe

Ile

Ser

Val

Glu

His

Ile

Pro

Lys

Gly

655

660

665

AAC

AAC

TGC

CTG

GAT

GCA

GCG

AAG

GCC

TGC

AAC

CTC

GAC

GAC

ATT

TGC

144

Asn

Asn

Cys

Leu

Asp

Ala

Ala

Lys

Ala

Cys

Asn

Leu

Asp

Asp

Ile

Cys

670

675

680

685

AAG

AAG

TAC

AGG

TCG

GCG

TAC

ATC

ACC

CCG

TGC

ACC

ACC

AGC

GTG

TCC

192

Lys

Lys

Tyr

Arg

Ser

Ala

Tyr

Ile

Thr

Pro

Cys

Thr

Thr

Ser

Val

Ser

690

695

700

AAC

GAT

GTC

TGC

AAC

CGC

CGC

AAG

TGC

CAC

AAG

GCC

CTC

CGG

CAG

TTC

240

Asn

Asp

Val

Cys

Asn

Arg

Arg

Lys

Cys

His

Lys

Ala

Leu

Arg

Gin

Phe

705

710

715

PL 191 248 B1

TTT

GAC

AAG

GTC

CCG

GCC

AAG

CAC

AGC

TAC

GGA

ATG

CTC

TTC

TGC

TCC

286

Phe

Asp

Lys 720

Val

Pro

Ala

Lys

His 725

Ser

Tyr

Gly

Met

Leu 730

Phe

Cys

Ser

TGC

CGG

GAC

ATC

GCC

TGC

ACA

GAG

CGG

AGG

CGA

CAG

ACC

ATC

GTG

CCT

336

Cys

Arg 735

Asp

Ile

Ala

Cys

Thr 740

Glu

Arg

Arg

Arg

Gin 745

Thr

Ile

Val

Pro

GTG

TGC

TCC

TAT

GAA

GAG

AGG

GAG

AAG

CCC

AAC

TGT

TTG

AAT

TTG

CAG

384

Val 750

Cys

Ser

Tyr

Glu

Glu 755

Arg

Glu

Lys

Pro

Asn 760

Cys

Leu

Asn

Leu

Gin 765

GAC

TCC

TGC

AAG

ACG

AAT

TAC

ATC

TGC

AGA

TCT

CGC

CTT

GCG

GAT

TTT

432

Asp

Ser

Cys

Lys

Thr 770

Asn

Tyr

Ile

Cys

Arg 775

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp 780

Phe

TTT

ACC

AAC

TGC

CAG

CCA

GAG

TCA

AGG

TCT

GTC

AGC

AGC

TGT

CTA

AAG

480

Phe

Thr

Asn

Cys 785

Gin

Pro

Glu

Ser

Arg 790

Ser

Val

Ser

Ser

Cys 795

Leu

Lys

GAA

AAC

TAC

GCT

GAC

TGC

CTC

CTC

GCC

TAC

TCG

GGG

CTT

ATT

GGC

ACA

528

Glu

Asn

Tyr 800

Ala

Asp

Cys

Leu

Leu 805

Ala

Tyr

Ser

Gly

Leu 810

Ile

Gly

Thr

GTC

ATG

ACC

CCC

AAC

TAC

ATA

GAC

TCC

AGT

AGC

CTC

AGT

GTG

GCC

CCA

576

Val

Met 815

Thr

Pro

Asn

Tyr

Ile 820

Asp

Ser

Ser

Ser

Leu 825

Ser

Val

Ala

Pro

TGG

TGT

GAC

TGC

AGC

AAC

AGT

GGG

AAC

GAC

CTA

GAA

GAG

TGC

TTG

AAA

624

Trp 830

Cys

Asp

Cys

Ser

Asn 835

Ser

Gly

Asn

Asp

Leu 840

Glu

Glu

Cys

Leu

Lys 845

TTT

TTG

AAT

TTC

TTC

AAG

GAC

AAT

ACA

TGT

CTT

AAA

AAT

GCA

ATT

CAA

672

Phe

Leu

Asn

Phe

Phe 850

Lys

Asp

Asn

Thr

Cys 855

Leu

Lys

Asn

Ala

Ile 860

Gin

GCC

TTT

GGC

AAT

GGC

TCC

GAT

GTG

ACC

GTG

TGG

CAG

CCA

GCC

TTC

CCA

720

Ala

Phe

Gly

Asn 865

Gly

Ser

Asp

Val

Thr 870

Val

Trp

Gin

ΡΓΟ

Ala 875

Phe

Pro

GTA

CAG

ACC

ACC

ACT

GCC

ACT

ACC

ACC

ACT

GCC

CTC

CGG

GTT

AAG

AAC

768

Val

Gin

Thr 860

Thr

Thr

Ala

Thr

Thr 885

Thr

Thr

Ala

Leu

Arg 890

Val

Lys

Asn

AAG

CCC

CTG

GGG

CCA

GCA

GGG

TCT

GAG

AAT

GAA

ATT

CCC

ACT

CAT

GTT

816

Lys

Pro 895

Leu

Gly

Pro

Ala

Gly 900

Ser

Glu

Asn

Glu

Ile 905

Pro

Thr

His

Val

TTG

CCA

CCG

TGT

GCA

AAT

TTA

CAG

GCA

CAG

AAG

CTG

AAA

TCC

AAT

GTG

864

Leu 910

Pro

Pro

Cys

Ala

Asn 915

Leu

Gin

Ala

Gin

Lys 920

Leu

Lys

Ser

Asn

Val 925

TCG

GGC

AAT

ACA

CAC

CTC

TGT

ATT

TCC

AAT

GGT

AAT

TAT

GAA

AAA

GAA

912

Ser

Gly

Asn

Thr

His

Leu

Cys

Ile

Ser

Asn

Gly

Asn

Tyr

Glu

Lys

Glu

93° 935 940

PL 191 248 B1

GGT

CTC

GGT

GCT

TCC

AGC

CAC

ATA

ACC

ACA

AAA

TCA

ATG

GCT

GCT

CCT

960

Gly

Leu

Gly

Ala 945

Ser

Ser

His

Ile

Thr 9S0

Thr

Lys

Ser

Met

Ala 955

Ala

Pro

CCA

AGC

TGT

GGT

CTG

AGC

CCA

CTG

CTG

GTC

CTG

GTG

GTA

ACC

GCT

CTG

1006

Pro

Ser

Cys 960

Gly

Leu

Ser

Pro

Leu 965

Leu

Val

Leu

Val

Val 970

Thr

Ala

Leu

TCC Ser

ACC Thr 975

CTA Leu

TTA Leu

TCT Ser

TTA Leu

ACA Thr 980

GAA Glu

ACA Thr

TCA Ser

TAGCTGCATT AAAAAAATAC

1058

AATATGGACA TGTAAAAAGA CAAAAACCAA GTTATCTGTT TCCTGTTCTC TTGTATAGCT

GAAATTCCAG TTTAGGAGCT CAGTTGAGAA ACAGTTCCAT TCAACTGGAA CATTTTTTTT

TTTTCCTTTT AAGAAAGCTT CTTGTGATCC TTCGGGGCTT CTGTG (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 346 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 9

Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val Asn Ser Arg Leu Ser Asp 15 10 15

Ile Phe Arg Val Val Pro Phe Ile Ser Val Glu His Ile Pro Lys Gly 20 25 30

Asn Asn Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala Cys Asn Leu Asp Asp Ile Cys 35 40 45

Lys Lys Tyr Arg Ser Ala Tyr Ile Thr Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser 50 55 60

1118

1178

1223

Asn Asp Val Cys Asn Arg Arg Lys Cys His Lys Ala Leu Arg Gin Phe fiS 70 75 80

Phe Asp Lys Val Pro Ala Lys His Ser Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser

90 9S

Cys Arg Asp Ile Ala Cys Thr Glu Arg Arg Arg Gin Thr Ile Val Pro 100 105 110

Val Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Lys Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gin lis 120 125

PL 191 248 B1

Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp ¹³⁰ 135 140

Phe Thr Asn Cys Gin Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser Cys Leu 145 150 155

Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly 165 170 175

Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala 180 185 190

Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu 195 200 205

Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile 210 215 220

Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gin Pro Ala Phe 225 230 235

Val Gin Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys 245 250 255

Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His 260 265 270

Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gin Ala Gin Lys Leu Lys Ser Asn 275 280 285

Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys 290 295 300

Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala 305 310 315

Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala 325 330 335

Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr Ser 340 345 (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1682 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) Nazwa/Klucz: CDS

Phe

Lys

160

Thr

Pro

Lys

Gin

Pro

240

Asn

Val

Val

Glu

Pro

320

Leu

PL 191 248 B1 (B) Położenie: 118..1497 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 10:

GGGCGGCCAG AGCAGCACAG CTGTCCGGGG ATCGCTGCAT GCTGAGCTCC CTCGGCAAGA 60

CCCAGCGGCG GCTCGGGATT TTTTTGGGGG GGCGGGGACC AGCCCCGCGC CGGCACC 117

ATG TTC CTG GCG ACC CTG

TAC TTC GCG Tyr Phe Ala 355

CTG Leu

CCG CTC TTG GAC TTG

CTC Leu

165

Met

Phe

Leu

Ala Thr Leu 350

Pro Leu Leu

Asp Leu 360

CTG

TCG

GCC

GAA

GTG

AGC

GGC

GGA

GAC

CGC

CTG

GAT

TGC

GTG

AAA

GCC

213

Leu

Ser

Ala

Glu

Val

Ser

Gly Gly

Asp

Arg

Leu

Asp

Cys

Val

Lys

Ala

365

370

375

AGT

GAT

CAG

TGC

CTG

AAG

GAG

CAG

AGC

TGC

AGC

ACC

AAG

TAC

CGC

ACG

261

Ser

Asp

Gin

Cys

Leu

Lys

Glu

Gin

Ser

Cys

Ser

Thr

Lys

Tyr

Arg

Thr

380

385

390

CTA

AGG

CAG

TGC

GTG

GCG

GGC

AAG

GAG

ACC

AAC

TTC

AGC

CTG

GCA

TCC

309

Leu

Arg

Gin

Cys

Val

Ala

Gly

Lys

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Leu

Ala

Ser

395

400

405

410

GGC

CTG

GAG

GCC

AAG

GAT

GAG

TGC

CGC

AGC

GCC

ATG

GAG

GCC

CTG

AAG

357

Gly

Leu

Glu

Ala

Lys

Asp

Glu

Cys

Arg

Ser

Ala

Met

Glu

Ala

Leu

Lys

415

420

425

CAG

AAG

TCG

CTC

TAC

AAC

TGC

CGC

TGC

AAG

CGG

GGT

ATG

AAG

AAG

GAG

405

Gin

Lys

Ser

Leu

Tyr

Asn

Cys

Arg

Cys

Lys

Arg

Gly

Met

Lys

Lys

Glu

430

435

440

AAG

AAC

TGC

CTG

CGC

ATT

TAC

TGG

AGC

ATG

TAC

CAG

AGC

CTG

CAG

GGA

453

Lys

Asn

Cys

Leu

Arg

Ile

Tyr

Trp

Ser

Met

Tyr

Gin

Ser

Leu

Gin

Gly

445

450

455

AAT

GAT

CTG

CTG

GAG

GAT

TCC

CCA

TAT

GAA

CCA

GTT

AAC

AGC

AGA

TTG

501

Asn

Asp

Leu

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro

Tyr

Glu

Pro

Val

Asn

Ser

Arg

Leu

460

465

470

TCA

GAT

ATA

TTC

CGG

GTG

GTC

CCA

TTC

ATA

TCA

GTG

GAG

CAC

ATT

CCC

549

Ser

ASp

Ile

Phe

Arg

Val

Val

Pro

Phe

Ile

Ser

Val

Glu

His

Ile

Pro

475

480

485

490

AAA

GGG

AAC

AAC

TGC

CTG

GAT

GCA

GCG

AAG

GCC

TGC

AAC

CTC

GAC

GAC

597

Lys

Gly

Asn

Asn

Cys

Leu

Asp

Ala

Ala

Lys

Ala

Cys

Asn

Leu

Asp

Asp

495

500

505

ATT

TGC

AAG

AAG

TAC

AGG

TCG

GCG

TAC

ATC

ACC

CCG

TGC

ACC

ACC

AGC

645

Ile

Cys

Lys

Lys

Tyr

Arg

Ser

Ala

Tyr

Ile

Thr

Pro

Cys

Thr

Thr

Ser

510

51 5

570

PL 191 248 B1

GTG TCC AAC GAT GTC TGC Vał Ser Asn Asp Val Cys 525

CAG TTC TTT GAC AAG GTC Gin Phe Phe Asp Lys Val 540

TGC TCC TGC CGG GAC ATC Cys Ser Cys Arg Asp Ile 555 560

GTG CCT GTG TGC TCC TAT Val Pro Val Cys Ser Tyr 575

TTG CAG GAC TCC TGC AAG Leu Gin Asp Ser Cys Lys 590

GAT TTT TTT ACC AAC TGC Asp Phe Phe Thr Asn Cys 605

CTA AAG GAA AAC TAC GCT Leu Lys Glu Asn Tyr Ala 620

GGC ACA GTC ATG ACC CCC Gly Thr Val Met Thr Pro
635	640
GCC	CCA	TGG	TGT	GAC	TGC
Ala	Pro	Trp	Cys	Asp	Cys

655

TTG AAA TTT TTG AAT TTC Leu Lys Phe Leu Asn Phe

670

ATT CAA GCC TTT GGC AAT Ile Gin Ala Phe Gly Asn

685

TTC CCA GTA CAG ACC ACC Phe Pro Val Gin Thr Thr

700

AAC CGC CGC AAG TGC CAC AAG Asn Arg Arg Lys Cys His Lys 530 535

CCG GCC AAG CAC AGC TAC GGA Pro Ala Lys His Ser Tyr Gly ⁵⁴5 550

GCC TGC ACA GAG CGG AGG CGA Ala Cys Thr Glu Arg Arg Arg 565

GAA GAG AGG GAG AAG CCC AAC Glu Glu Arg Glu Lys Pro Asn 580

ACG AAT TAC ATC TGC AGA TCT Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser 595

CAG CCA GAG TCA AGG TCT GTC Gin Pro Glu Ser Arg Ser Val 610 6i5

GAC TGC CTC CTC GCC TAC TCG Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser 625 630

AAC TAC ATA GAC TCC AGT AGC Asn Tyr Ile Asp Ser Ser Ser 645

AGC AAC AGT GGG AAC GAC CTA Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu 660

TTC AAG GAC AAT ACA TGT CTT Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu 675

GGC TCC GAT GTG ACC GTG TGG Gly Ser Asp Val Thr Val Trp 690 695

ACT GCC ACT ACC ACC ACT GCC Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala 705 710

CCA GCA GGG TCT GAG AAT GAA Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu 725

GCA AAT TTA CAG GCA CAG AAG Ala Asn Leu Gin Ala Gin Lys 740

AAG	AAC	AAG	CCC	CTG	GGG
Lys 715	Asn	Lys	Pro	Leu	Gly 72 0
CAT	GTT	TTG	CCA	CCG	TGT
His	Val	Leu	Pro	Pro 735	Cys

GCC CTC CGG Ala Leu Arg

ATG CTC TTC Met Leu Phe

CAG ACC ATC 789

Gin Thr Ile

570

TGT TTG AAT 837

Cys Leu Asn

S8S

CGC CTT GCG 885

Arg Leu Ala 600

AGC AGC TGT 933

Ser Ser Cys

GGG CTT ATT 981

Gly Leu Ile

CTC AGT GTG 1029

Leu Ser Val 650

GAA GAG TGC 1077

Glu Glu Cys 665

AAA AAT GCA 1125

Lys Asn Ala 680

CAG CCA GCC 1173

Gin Pro Ala

CTC CGG GTT 1221

Leu Arg Val

ATT CCC ACT 1269

Ile Pro Thr 730

CTG AAA TCC 1317

Leu Lys Ser 745

PL 191 248 B1

AAT Asn	GTG TCG GGC	AAT Asn	ACA CAC Thr His	CTC TGT ATT TCC AAT GGT AAT TAT GAA	1365
Val	Ser Gly 750	Leu	Cys 755	Ile	Ser Asn Gly Asn 760	Tyr	Glu
AAA	GAA	GGT CTC	GGT	GCT TCC	AGC	CAC	ATA	ACC ACA AAA TCA	ATG	GCT	1413
Lys	Glu	Gly Leu	Gly	Ala Ser	Ser	His	Ile	Thr Thr Lys Ser	Met	Ala
		765			770			775
GCT	CCT	CCA AGC	TGT	GGT CTG	AGC	CCA	CTG	CTG GTC CTG GTG	GTA	ACC	1461
Ala	Pro	Pro Ser	Cys	Gly Leu	Ser	Pro	Leu	Leu Val Leu Val	Val	Thr
	780			785				790
GCT	CTG	TCC ACC	CTA	TTA TCT	TTA	ACA	GAA	ACA TCA TAGCTGCATT		1507
Ala	Leu	Ser Thr	Leu	Leu Ser	Leu	Thr	Glu	Thr Ser
795				800				805
AAAAAAATAC AATATGGACA TGTAAAAAGA CAAAAACCAA GTTATCTGTT	TCCTGTTCTC	1567
TTGTATAGCT GAAATTCCAG TTTAGGAGCT CAGTTGAGAA ACAGTTCCAT	TCAACTGGAA	1627
CATTTTTTTT TTTTCCTTTT aagaaagctt cttgtgatcc ttcggggctt	CTGTG	16B2
(2)	INFORMACJE DLA SEK NR ID: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 460 aminokwasów

	(B) TYP: aminokwasowa (Ć, RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) TYP CZĄSTECZKI:	białko	11
(xi) OPIS	SEKWENCJI:	SEK NR	ID:
Met 1	Phe Leu Ala	Thr Leu Tyr 5	Phe Ala	Leu 10	Pro Leu Leu Asp Leu Leu 15
Leu	Ser Ala Glu 20	Val Ser Gly Gly Asp 25	Arg	Leu Asp Cys Val Lye Ala 30
Ser	Asp Gin Cys 35	Leu Lys Glu	Gin Ser 40	Cys	Ser Thr Lys Tyr Arg Thr 45
Leu	Arg Gin Cys 50	Val Ala Gly 55	Lys Glu	Thr	Asn Phe Ser Leu Ala Ser 60
Gly 65	Leu Glu Ala	Lys Asp Glu 70	Cye Arg	Ser	Ala Met Glu Ala Leu Lys 75 80
Gin	Lys Ser Leu	Tyr Asn Cys 85	Arg Cys	Lys 90	Arg Gly Met Lys Lys Glu 95
Lys	Asn Cys Leu	Arg Ile Tyr	Trp Ser	Met	Tyr Gin Ser Leu Gin Gly

100 105 110

PL 191 248 B1

Asn

Asp

Leu 115

Leu

Glu

Asp

Ser

Pro 120

Tyr

Glu

Pro

Val

Asn 125

Ser

Arg

Leu

Ser

Asp 130

Ile

Phe

Arg

Val

Val 135

Pro

Phe

Ile

Ser

Val 140

Glu

His

Ile

Pro

Lys 145

Gly

Asn

Asn

Cys

Leu 150

Asp

Ala

Ala

Lys

Ala 155

Cys

Asn

Leu

Asp

Asp 160

Ile

Cys

Lys

Lys

Tyr 165

Arg

Ser

Ala

Tyr

Ile 170

Thr

Pro

Cys

Thr

Thr 175

Ser

Val

Ser

Asn

Asp 180

Val

Cys

Asn

Arg

Arg 185

Lys

Cys

His

Lys

Ala 190

Leu

Arg

Gin

Phe

Phe 195

Asp

Lys

Val

Pro

Ala 200

Lys

His

Ser

Tyr

Gly 205

Met

Leu

Phe

Cys

Ser 210

Cys

Arg

Asp

Ile

Ala 215

Cys

Thr

Glu

Arg

Arg 220

Arg

Gin

Thr

Ile

Val 225

Pro

Val

Cys

Ser

Tyr 230

Glu

Glu

Arg

Glu

Lys 235

Pro

Asn

Cys

Leu

Asn 240

Leu

Gin

Asp

Ser

Cys 245

Lys

Thr

Asn

Tyr

Ile 250

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu 255

Ala

Asp

Phe

Phe

Thr 260

Asn

Cys

Gin

Pro

Glu 265

Ser

Arg

Ser

Val

Ser 270

Ser

Cys

Leu

Lys

Glu 275

Asn

Tyr

Ala

Asp

Cys 280

Leu

Leu

Ala

Tyr

Ser 285

Gly

Leu

Ile

Gly

Thr 290

Val

Met

Thr

Pro

Asn 295

Tyr

Ile

Asp

Ser

Ser 300

Ser

Leu

Ser

Val

Ala 305

Pro

Trp

Cys

Asp

Cys 310

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn 315

Asp

Leu

Glu

Glu

Cys 320

Leu

Lys

Phe

Leu

Asn 325

Phe

Phe

Lys

Asp

Asn 330

Thr

Cys

Leu

Lys

Asn 335

Ala

Ile

Gin

Ala

Phe 340

Gly

Asn

Gly

Ser

Asp 345

Val

Thr

Val

Trp

Gin 350

Pro

Ala

Phe

Pro

Val 355

Gin

Thr

Thr

Thr

Ala 360

Thr

Thr

Thr

Thr

Ala 365

Leu

Arg

Val

Lys

Asn 370

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro 375

Ala

Gly

Ser

Glu

Asn 380

Glu

Ile

Pro

Thr

His 385

Val

Leu

Pro

Pro

Cys 390

Ala

Asn

Leu

Gin

Ala 395

Gin

Lys

Leu

Lys

Ser 400

PL 191 248 B1

Asn

Val

Ser

Gly

Asn 405

Thr Ί

His

Leu

Cys

Ile 410

Ser

Asn

Gly

Asn

Tyr 415

Glu

Lys

Glu

Gly

Leu 420

Gly

Ala

Ser

Ser

His 425

Ile

Thr

Thr

Lys

Ser 430

Met

Ala

Ala

Pro

Pro 435

Ser

Cys

Gly

Leu

Ser 440

Pro

Leu

Leu

val

Leu 445

Val

Val

Thr

Ala

Leu 450

Ser

Thr

Leu

Leu

Ser 455

Leu

Thr

Glu

Thr

Ser 460

(2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1888 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Położenie: 25..1416 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 12:

AAAAAACGGT GGGATTTATT TAAC ATG ATC TTG GCA AAC GTC TTC TGC CTC Met Ile Leu Ala Asn Val Phe Cys Leu

465

TTC	TTC	TTT	CTA	GAC	GAG	ACC	CTC	CGC
Phe 470	Phe	Phe	Leu	Asp	Glu 475	Thr	Leu	Arg
CTG	CAG	GGC	CCC	GAG	CTC	CAC	GGC	TGG
Leu	Gin	Gly	Pro	Glu 490	Leu	His	Gly	Trp
CGG	GCC	AAT	GAG	CTG	TGT	GCC	GCC	GAA
Arg	Ala	Asn	Glu 505	Leu	Cys	Ala	Ala	Glu 510
CGC	ACT	CTG	CGG	CAG	TGC	CTG	GCA	GGC
Arg	Thr	Leu 520	Arg	Gin	Cys	Leu	Ala 525	Gly
GCC	AAC	AAG	GAG	TGC	CAG	GCG	GCC	TTG
Ala	Asn 535	Lys	Glu	Cys	Gin	Ala 540	Ala	Leu

TCT	TTG	GCC	AGC	CCT	TCC	TCC	99
Ser	Leu 460	Ala	Ser	Pro	Ser	Ser 465
CGC	CCC	CCA	GTG	GAC	TGT	GTC	147
Arg 495	Pro	Pro	Val	Asp	Cys 500	Val
TCC	AAC	TGC	AGC	TCT	CGC	TAC	195
Ser	Asn	Cys	Ser	Ser SIS	Arg	Tyr
CGC	GAC	CGC	AAC	ACC	ATG	CTG	243
Arg	Asp	Arg	Asn 530	Thr	Met	Leu
GAG	GTC	TTG	CAG	GAG	AGC	CCG	291
Glu	Val	Leu 545	Gin	Glu	Ser	Pro

PL 191 248 B1

CTG TAC GAC TGC CGC TGC AAG CGG GGC Leu Tyr Asp Cys Arg Cys Lys Arg Gly 550 555

CTG CAG ATC TAC TGG AGC ATC CAC CTG Leu Gin Ile Tyr Trp Ser Ile His Leu 570

TTC TAC GAA GCC TCC CCC TAT GAG CCG Phe Tyr Glu Ala Ser Pro Tyr Glu Pro 565 590

ATC TTC AGG CTT GCT TCA ATC TTC TCA Ile Phe Arg Leu Ala Ser Ile Phe Ser 600 £05

GTC AGC GCC AAG AGC AAC CAT TGC CTG Val Ser Ala Lys Ser Asn His Cys Leu 615 620

CTG AAT GAC AAC TGC AAG AAG CTG CGC Leu Asn Asp Asn Cys Lys Lys Leu Arg 630 635

AAC CGC GAG ATC TCG CCC ACC GAG CGC Asn Arg Glu Ile Ser Pro Thr Glu Arg 650

AAG	GCC	CTG	CGC	CAG	TTC	TTC	GAC	CGG
Lys	Ala	Leu	Arg 665	Gin	Phe	Phe	Asp	Arg 670
CGC	ATG	CTC	TTC	TGC	TCC	TGC	CAA	GAC
Arg	Met	Leu 680	Phe	Cys	Ser	Cys	Gin 685	Asp
CGG	CAA	ACC	ATC	CTG	ccc	AGC	TGC	TCC
Arg	Gin 695	Thr	Ile	Leu	Pro	Ser 700	Cys	Ser
AAC	TGC	CTG	GAC	CTG	CGT	GGC	GTG	TGC
Asn 710	Cys	Leu	Asp	Leu	Arg 715	Gly	Val	Cys
TCC	CGG	CTG	GCC	GAC	TTC	CAT	GCC	AAT
Ser	Arg	Leu	Ala	Asp 730	Phe	His	Ala	Asn
GTC	ACC	AGC	TGC	CCT	GCG	GAC	AAT	TAC
Val	Thr	Ser	Cys 745	Pro	Ala	Asp	Asn	Tyr 750
GCT	GGC	ATG	ATT	GGG	TTT	GAC	ATG	ACA
Ala	Gly	Met 760	Ile	Gly	Phe	Asp	Met 765	Thr

ATG	AAG	AAG	GAG	CTG	CAG	TGT
Met	Lys 560	Lys	Glu	Leu	Gin	Cys 565
GGG	CTG	ACC	GAG	GGT	GAG	GAG
Gly 575	Leu	Thr	Glu	Gly	Glu 580	Glu
GTG	ACC	TCC	CGC	CTC	TCG	GAC
Val	Thr	Ser	Arg	Leu 595	Ser	Asp
GGG	ACA	GGG	GCA	GAC	CCG	GTG
Gly	Thr	Gly	Ala 610	Asp	Pro	Val
GAT	GCT	GCC	AAG	GCC	TGC	AAC
Asp	Ala	Ala 625	Lys	Ala	Cys	Asn
TCC	TCC	TAC	ATC	TCC	ATC	TGC
Ser	Ser 640	Tyr	Ile	Ser	Ile	Cys 645
TGC	AAC	CGC	CGC	AAG	TGC	CAC
Cys 655	Asn	Arg	Arg	Lys	Cys 660	His
GTG	CCC	AGC	GAG	TAC	ACC	TAC
Val	Pro	Ser	Glu	Tyr 675	Thr	Tyr
CAG	GCG	TGC	GCT	GAG	CGC	CGC
Gin	Ala	Cys	Ala 690	Glu	Arg	Arg
TAT	GAG	GAC	AAG	GAG	AAG	CCC
Tyr	Glu	Asp 705	Lys	Glu	Lys	Pro
CGG	ACT	GAC	CAC	CTG	TGT	CGG
Arg	Thr 720	Asp	His	Leu	Cys	Arg 725
TGT	CGA	GCC	TCC	TAC	CAG	ACG
Cys 735	Arg	Ala	Ser	Tyr	Gin 740	Thr
CAG	GCG	TGT	CTG	GGC	TCT	TAT
Gin	Ala	Cys	Leu	Gly 755	Ser	Tyr
CCT	AAC	TAT	GTG	GAC	TCC	AGC
Pro	Asn	Tyr	Val	Asp	Ser	Ser

770

PL 191 248 B1

CCC ACT GGC ATC GTG GTG TCC CCC TGG TGC AGC TGT CGT GGC AGC GGG Pro Thr Gly Ile Val Val Ser Pro Trp Cye Ser Cye Arg Gly Ser Gly

775

780

785

AAC ATG GAG GAG GAG TGT GAG AAG TTC CTC AGG GAC TTC ACC GAG AAC Asn Met Glu Glu Glu Cys Glu Lys Phe Leu Arg Asp Phe Thr Glu Asn

790

795

800

605

CCA TGC CTC CGG AAC GCC ATC CAG GCC TTT GGC AAC GGC ACG GAC GTG Pro Cys Leu Arg Asn Ala Ile Gin Ala Phe Gly Asn Gly Thr Asp Val

810

815

820

AAC GTG TCC CCA AAA GGC CCC TCG TTC CAG GCC ACC CAG GCC CCT CGG Asn Val Ser Pro Lys Gly Pro Ser Phe Gin Ala Thr Gin Ala Pro Arg

825

830

835

GTG GAG AAG ACG CCT TCT TTG CCA GAT GAC CTC AGT GAC AGT ACC AGC Val Glu Lys Thr Pro Ser Leu Pro Asp Asp Leu Ser Asp Ser Thr Ser

840

845

850

TTG GGG ACC AGT GTC ATC ACC ACC TGC ACG TCT GTC CAG GAG CAG GGG Leu Gly Thr Ser Val Ile Thr Thr Cys Thr Ser Val Gin Glu Gin Gly

855

860

865

CTG AAG GCC AAC AAC TCC AAA GAG TTA AGC ATG TGC TTC ACA GAG CTC Leu Lys Ala Asn Asn Ser Lys Glu Leu Ser Met Cys Phe Thr Glu Leu

870

875

880

885

ACG ACA AAT ATC ATC CCA GGG AGT AAC AAG GTG ATC AAA CCT AAC TCA Thr Thr Asn Ile Ile Pro Gly Ser Asn Lys Val Ile Lys Pro Asn Ser

890

895

900

GGC CCC AGC AGA GCC AGA CCG TCG GCT GCC TTG ACC GTG CTG TCT GTC Gly Pro Ser Arg Ala Arg Pro Ser Ala Ala Leu Thr Val Leu Ser Val

905

910

915

CTG ATG CTG AAA CTG GCC TTG TAGGCTGTGG GAACCGAGTC AGAAGATTTT Leu Met Leu Lys Leu Ala Leu

920

TGAAAGCTAC

ACACCTTGCA

TTTCTTCTCT

TGGCCCAGGG

AATGCCCTTC

CAAGAGCCTG

CACAGCTOCT

GCAGACAAGA

AAAAAAAAAT

GGAGAAGTTT

GTCCCCTGGC

ACTTTCTCCT

CAGCGGAAGG

TCCCCAGGCT

ACAGCCGCCT

TGTTTTTCCC

TTGTAAACCA

AGGGGAAACT

GGTGTTTTTC

GACTCTGGGC

GCCCACTCTG

GACGAAATGG

ACCTTGTCGC

AACAGACAAG

CTGGTGCCGG

TCTCTGGACC

TGTGCCTGAG

GGGACCCGCT

AAACACACAC

TGAACCTGTC

CAGGCAGGCA

GGAGGGCACG

CTTCTGAAGC

GCTGGCTGGG

GGGGGCTGGC

AGACACACAC

TCCTCCCAGG

GCCTGAGAGC

AGGCTCTAGA

AGAGACCGGA

GGCAGGACAA

AGAGGGCATC

1011

1059

1107

1155

1203

1251

1299

1347

1395

1446

1506

1566

1626

1686

1746

1806

1866

PL 191 248 B1

GGTCAGCGGG GCAGCGGGGC TG (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 464 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 13

Met Ile Leu Ala Asn Val Phe Cys Leu Phe Phe Phe Leu Asp Glu Thr

1.5 io is

Leu Arg Ser Leu Ala Ser Pro Ser Ser Leu Gin Gly Pro Glu Leu His 20 25 30

Gly Trp Arg Pro Pro Val Asp Cys Val Arg Ala Asn Glu Leu Cys Ala 35 40 45

Ala Glu Ser Asn Cys Ser Ser Arg Tyr Arg Thr Leu Arg Gin Cys Leu 50 55 60

Ala Gly Arg Asp Arg Asn Thr Met Leu Ala Asn Lys Glu Cys Gin Ala ⁶⁵ 70 75 80

Ala Leu Glu Val Leu Gin Glu Ser Pro Leu Tyr Asp Cys Arg Cys Lys BS 90 95

Arg Gly Met Lys Lys Glu Leu Gin Cys Leu Gin Ile Tyr Trp Ser Ile 100 105 no

His Leu Gly Leu Thr Glu Gly Glu Glu Phe Tyr Glu Ala Ser Pro Tyr 115 120 125

Glu Pro Val Thr Ser Arg Leu Ser Asp Ile Phe Arg Leu Ala Ser Ile 130 135 ₁₄₀

Phe Ser Gly Thr Gly Ala Asp Pro Val Val Ser Ala Lys Ser Asn His ¹⁴⁵ 150 155 i6o

Cys Leu Asp Ala Ala Lys Ala Cys Asn Leu Asn Asp Asn Cys Lys Lys

165 170 175

Leu Arg Ser Ser Tyr Ile Ser Ile Cys Asn Arg Glu Ile Ser Pro Thr 180 185 190

Glu Arg Cys Asn Arg Arg Lys Cys His Lys Ala Leu Arg Gin Phe Phe 195 200 205

Asp Arg Val Pro Ser Glu Tyr Thr Tyr Arg Met Leu Phe Cys Ser Cys 210 215 220

1060

PL 191 248 B1

Gin 225

Asp

Gin

Ala

Cys

Ala 230

Glu

Arg

Arg

Arg

Gin 235

Thr

Ile

Leu

Pro

Ser 240

Cys

Ser

Tyr

Glu

Asp 245

Lys

Glu

Lys

Pro

Asn 2S0

Cys

Leu

Asp

Leu

Arg 255

Gly

Val

Cys

Arg

Thr 260

Asp

His

Leu

Cys

Arg 265

Ser

Arg

Leu

Ala

Asp 270

Phe

His

Ala

Asn

Cys 275

Arg

Ala

Ser

Tyr

Gin 260

Thr

Val

Thr

Ser

Cys 285

Pro

Ala

Asp

Asn

Tyr 290

Gin

Ala

Cys

Leu

Gly 295

Ser

Tyr

Ala

Gly

Met 300

Ile

Gly

Phe

Asp

Met 305

Thr

Pro

Asn

Tyr

Val 310

Asp

Ser

Ser

Pro

Thr 315

Gly

Ile

Val

Val

Ser 320

Pro

Trp.

Cys

Ser

Cys 325

Arg

Gly

Ser

Gly

Asn 330

Met

Glu

Glu

Glu

Cys 335

Glu

Lys

Phe

Leu

Arg 340

Asp

Phe

Thr

Glu

Asn 345

Pro

Cys

Leu

Arg

Asn 350

Ala

Ile

Gin

Ala

Phe 355

Gly

Asn

Gly

Thr

Asp 360

Val

Asn

Val

Ser

Pro 365

Lys

Gly

Pro

Ser

Phe 370

Gin

Ala

Thr

Gin

Ala 375

Pro

Arg

Val

Glu

Lys 380

Thr

Pro

Ser

Leu

Pro 365

Asp

Asp

Leu

Ser

Asp 390

Ser

Thr

Ser

Leu

Gly 395

Thr

Ser

Val

Ile

Thr 400

Thr

Cys

Thr

Ser

Val 405

Gin

Glu

Gin

Gly

Leu 410

Lys

Ala

Asn

Asn

Ser 415

Lys

Glu

Leu

Ser

Met 420

Cys

Phe

Thr

Glu

Leu 425

Thr

Thr

Asn

Ile

Ile 430

Pro

Gly

Ser

Asn

Lys 435

val

Ile

Lys

Pro

Asn 440

Ser

Gly

Pro

Ser

Arg 445

Ala

Arg

Pro

Ser

Ala

Ala

Leu

Thr

Val

Leu

Ser

Val

Leu

Met

Leu

Lys

Leu

Ala

Leu

*50 455 460 (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1878 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 191 248 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Położenie: 205..1242 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 14

CGCGGCGCCC AGCGCAGGCA GAGCGCTGTC	GCATCCCGGG CGTCCACCCG CCATGGGGCT	60
CTCCTGGAGC CCGCGACCTC CACTGCTGAT	GATCCTGCTA CTGGTGCTGT CGTTGTGGCT	120
GCCACTTGGA GCAGGAAACT CCCTTGCCAC	AGAGAACAGG TTTGTGAACA GCTGTACCCA	180
GGCCAGAAAG AAATGCGAGG CTAA TCC CGC TTG CAA GGC TGC CTA CCA GCA Ser Arg Leu Gln Gly Cys Leu Pro Ala	231

465 470

CCT GGG CTC CTG CAC

CTC CAG TTA AGC AGG CCG CTG CCC TTA GAG GAG

279

Pro Gly

Leu

Leu His

Leu Gln 480

Leu

Ser

Arg

Pro

Leu 485

Pro

Leu

Glu

Glu

475

TCT

GCC

ATG

TCT

GCA

GAC

TGC

CTA

GAG

GCA

GCA

GAA

CAA

CTC

AGG

AAC

327

Ser

Ala

Met

Ser

Ala

Asp

Cys

Leu

Glu

Ala

Ala

Glu

Gln

Leu

Arg

Asn

490

495

500

505

AGC

TCT

CTG

ATA

GAC

TGC

AGG

TGC

CAT

CGG

CGC

ATG

AAG

CAC

CAA

GCT

375

Ser

Ser

Leu

Ile

Asp

Cys

Arg

Cys

His

Arg

Arg

Met

Lys

His

Gln

Ala

510

515

520

ACC

TGT

CTG

GAC

ATT

TAT

TGG

ACC

GTT

CAC

CCT

GCC

CGA

AGC

CTT

GGT

423

Thr

Cys

Leu

Asp

Ile

Tyr

Trp

Thr

Val

His

Pro

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

525

530

S35

GAC

TAC

GAG

TTG

GAT

GTC

TCA

CCC

TAT

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC

AGC

AAA

471

Asp

Tyr

Glu

Leu

Asp

Val

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

540

545

550

CCC

TGG

AAA

ATG

AAT

CTT

AGC

AAG

TTG

AAC

ATG

CTC

AAA

CCA

GAC

TCG

519

Pro

Trp

Lys

Met

Asn

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn

Met

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

555

560

565

GAC

CTC

TGC

CTC

AAA

TTT

GCT

ATG

CTG

TGT

ACT

CTT

CAC

GAC

AAG

TGT

567

Asp

Leu

Cys

Leu

Lys

Phe

Ala

Met

Leu

Cys

Thr

Leu

His

Asp

Lys

Cys

570

575

580

585

GAC

CGC

CTG

CGC

AAG

GCC

TAC

GGG

GAG

GCA

TGC

TCA

GGG

ATC

CGC

TGC

615

Asp

Arg

Leu

Arg

Lys

Ala

Tyr

Gly

Glu

Ala

Cys

Ser

Gly

Ile

Arg

Cys

590

595

600

CAG

CGC

CAC

CTC

TGC

CTA

GCC

CAG

CTG

CGC

TCC

TTC

TTT

GAG

AAG

GCA

663

Gln

Arg

His

Leu

Cys

Leu

Ala

Gln

Leu

Arg

Ser

Phe

Phe

Olu

Lys

Ala

£05

610

615

PL 191 248 B1

GCA

GAG

TCC

CAC

GCT

CAG

GGT

CTG

CTG

CTG

TGT

ccc

TGT

GCA

CCA

GAA

711

Ala

Glu

Ser 620

His

Ala

Gin

Gly

Leu 625

Leu

Leu

Cys

Pro

Cys 630

Ala

Pro

Glu

GAT

GCG

GGC

TGT

GGG

GAG

CGG

CGG

CGT

AAC

ACC

ATC

GCC

CCC

AGT

TGC

759

Asp

Ala 635

Gly

Cys

Gly

Glu

Arg 640

Arg

Arg

Asn

Thr

Ile 645

Ala

Pro

Ser

Cys

GCC

CTG

CCT

TCT

GTA

ACC

CCC

AAT

TGC

CTG

GAT

CTG

CGG

AGC

TTC

TGC

807

Ala 650

Leu

Pro

Ser

Val

Thr 655

Pro

Asn

Cys

Leu

Asp 660

Leu

Arg

Ser

Phe

Cys 665

CGT

GCG

GAC

CCT

TTG

TGC

AGA

TCA

CGC

CTG

ATG

GAC

TTC

CAG

ACC

CAC

855

Arg

Ala

Asp

Pro

Leu 670

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu 675

Met

Asp

Phe

Gin

Thr 680

His

TGT

CAT

CCT

ATG

GAC

ATC

CTT

GGG

ACT

TGT

GCA

ACT

GAG

CAG

TCC

AGA

903

Cys

His

Pro

Met 685

Asp

Ile

Leu

Gly

Thr 690

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin 695

Ser

Arg

TGT

CTG

CGG

GCA

TAC

CTG

GGG

CTG

ATT

GGG

ACT

GCC

ATG

ACC

CCA

AAC

951

Cys

Leu

Arg 700

Ala

Tyr

Leu

Gly

Leu 705

Ile

Gly

Thr

Ala

Met 710

Thr

Pro

Asn

TTC

ATC

AGC

AAG

GTC

AAC

ACT

ACT

GTT

GCC

TTA

AGC

TGC

ACC

TGC

CGA

999

Phe

Ile 715

Ser

Lys

Val

Asn

Thr 720

Thr

Val

Ala

Leu

Ser 725

Cys

Thr

Cys

Arg

GGC

AGC

GGC

AAC

CTA

CAG

GAC

GAG

TGT

GAA

CAG

CTG

GAA

AGG

TCC

TTC

1047

Gly 730

Ser

Gly

Asn

Leu

Gin 735

Asp

Glu

Cys

Glu

Gin 740

Leu

Glu

Arg

Ser

Phe 745

TCC

CAG

AAC

CCC

TGC

CTC

GTG

GAG

GCC

ATT

GCA

GCT

AAG

ATG

CGT

TTC

1095

Ser

Gin

Asn

Pro

Cys 750

Leu

Val

Glu

Ala

Ile 755

Ala

Ala

Lys

Met

Arg 760

Phe

CAC

AGA

CAG

CTC

TTC

TCC

CAG

GAC

TGG

GCA

GAC

TCT

ACT

TTT

TCA

GTG

1143

His

Arg

Gin

Leu 765

Phe

Ser

Gin

Asp

Trp 770

Ala

Asp

Ser

Thr

Phe 775

Ser

Val

GTG

CAG

CAG

CAG

AAC

AGC

AAC

CCT

GCT

CTG

AGA

CTG

CAG

CCC

AGG

CTA

1191

Val

Gin

Gin 780

Gin

Asn

Ser

Asn

Pro 785

Ala

Leu

Arg

Leu

Gin 790

Pro

Arg

Leu

CCC

ATT

CTT

TCT

TTC

TCC

ATC

CTT

CCC

TTG

ATT

CTG

CTG

CAG

ACC

CTC

1239

Pro

Ile 795

Leu

Ser

Phe

Ser

Ile 800

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu 805

Leu

Gin

Thr

Leu

TGG TAGCTGGGCT TCCTCAGGGT CCTTTGTCCT CTCCACCACA CCCAGACTGA 1292

Trp 810

TTTGCAGCCT GTGGTGGGAG AGAACTCGCC AGCCTGTGGA AGAAGACGCA GCGTGCTACA 1352

PL 191 248 B1

CAGCAACCCG	GAACCAACCA	ggcattccgc	AGCACATCCC	GTCTGCTCCA	GAAGAGGTCT	1412
TAGAAGTGAG	GGCTGTGACC	CTTCCGATCC	TGAGCGGCTA	GTTTTCAAkc	CTCCCTTGCC	1472
CCTGCTTCCT	TCTGGCTCAG	GCTGCTCCTC	CTTAGGACTT	TGTGGGTCCA	GTTTTGCCTT	1532
CTGTTCTGAT	GGTGATTAGC	GGCTCACCTC	CAGCGCTTCT	TCCTGTTTCC	CAGGACCACC	1592
CAGAGGCTAA	GGAATCAGTC	ATTCCCTGTT	GCCTTCTCCA	GGAAGGCAGG	CTAAGGGTTC	1652
TGAGGTGACT	GAGAAAAATG	TTTCCTTTGT	GTGGAAGGCT	GGTGCTCCAG	CCTCCACGTC	1712
CCTCTGAATG	GAAGATAAAA	ACCTGCTGGT	GTCTTGACTG	CTCTGCCAGG	CAATCCTGAA	1772
CATTTGGGCA	TGAAGAGCTA	AAGTCTTTGG	GTCTTGTTTA	ACTCCTATTA	CTGTCCCCAA	1032
ATTCCCCTAG	TCCCTTGGGT	CATGATTAAA	CATTTTGACT	TAAAAA		1878

(2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 346 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

	(xi) OPIS SEKWENCJI:	SEK NR ID:	15
Ser 1	Arg Leu Gin Gly Cys Leu 5	Pro Ala Pro 10	Gly Leu Leu His Leu Gin 15
Leu	Ser Arg Pro Leu Pro Leu 20	Glu Glu Ser 25	Ala Met Ser Ala Asp Cys 30
Leu	Glu Ala Ala Glu Gin Leu 35	Arg Asn Ser 40	Ser Leu Ile Asp Cys Arg 45
Cye	His Arg Arg Met Lys His 50 55	Gin Ala Thr	Cys Leu Asp Ile Tyr Trp 60
Thr 65	Val His Pro Ala Arg Ser 70	Leu Gly Asp	Tyr Glu Leu Asp Val Ser 75 80
Pro	Tyr Glu Asp Thr Val Thr 85	Ser Lys Pro 90	Trp Lys Met Asn Leu Ser 95
Lys	Leu Asn Met Leu Lys Pro 100	Asp Ser Asp 105	Leu Cys Leu Lys Phe Ala 110
Met	Leu Cys Thr Leu His Asp 115	Lys Cys Asp 120	Arg Leu Arg Lys Ala Tyr 125

PL 191 248 B1

Gly Glu Ala 130

Cys

Ser

Gly Ile Arg Cys Gin Arg His Leu

Cys

Leu Ala

13S

140

Gin

Leu

Arg

Ser

Phe

Phe

Glu

Lys

Ala

Ala

Glu

Ser

His

Ala

Gin

Gly

145

150

155

160

Leu

Leu

Leu

Cys

Pro

Cys

Ala

Pro

Glu

Asp

Ala

Gly

Cys

Gly

Glu

Arg

165

170

175

Arg

Arg

Asn

Thr

Ile

Ala

Pro

Ser

Cys

Ala

Leu

Pro

Ser

Val

Thr

Pro

180

185

190

Asn

Cys

Leu

Asp

Leu

Arg

Ser

Phe

Cys

Arg

Ala

Asp

Pro

Leu

Cys

Arg

195

200

205

Ser

Arg

Leu

Met

Asp

Phe

Gin

Thr

His

Cys

His

Pro

Met

Asp

Ile

Leu

210

215

220

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin

Ser

Arg

Cys

Leu

Arg

Ala

Tyr

Leu

Gly

225

230

235

240

Leu

Ile

Gly

Thr

Ala

Met

Thr

Pro

Asn

Phe

Ile

Ser

Lys

Val

Asn

Thr

245

250

255

Thr

Val

Ala

Leu

Ser

Cys

Thr

Cys

Arg

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Gin

Asp

260

265

270

Glu

Cys

Glu

Gin

Leu

Glu

Arg

Ser

Phe

Ser

Gin

Asn

Pro

Cys

Leu

Val

275

260

285

Glu

Ala

Ile

Ala

Ala

Lys

Met

Arg

Phe

His

Arg

Gin

Leu

Phe

Ser

Gin

290

295

300

Asp

Trp

Ala

Asp

Ser

Thr

Phe

Ser

Val

Val

Gin

Gin

Gin

Asn

Ser

Asn

305

310

315

320

Pro

Ala

Leu

Arg

Leu

Gin

Pro

Arg

Leu

Pro

Ile

Leu

Ser

Phe

Ser

Ile

325

330

335

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu

Leu

Gin

Thr

Leu

Trp

340

345

(2)

INFORMACJE

DLA

SEK NR

ID:

16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1889 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy <C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) Nazwa/Klucz: CDS

PL 191 248 B1 (B) Położenie: 41..1231 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 16:

CGCAGGCAGA GCGCTGTCGC ATCCCGGGCG TCCACCCGCC ATG GGG CTC TCC TGG Met Gly Leu Ser Trp

350

AGC CCG CGA CCT CCA CTG CTG ATG ATC CTG CTA CTG GTG CTG TCG TTG

Ser Pro Arg Pro Pro Leu Leu Met Ile Leu Leu Leu Val Leu Ser Leu

355 360 365

TGG CTG CCA CTT GGA GCA GGA AAC TCC CTT GCC ACA GAG AAC AGG TTT

Trp Leu Pro Leu Gly Ala Gly Asn Ser Leu Ala Thr Glu Asn Arg Phe

370 375 _3B0

GTG AAC AGC TGT ACC CAG GCC AGA AAG AAA TGC GAG GCT AAT CCC GCT

Val Asn Ser Cys Thr Gin Ala Arg Lys Lys Cys Glu Ala Asn Pro Ala

385 390 395

TGC AAG GCT GCC TAC CAG CAC CTG GGC TCC TGC ACC TCC AGT TTA AGC

Cys Lys Ala Ala Tyr Gin His Leu Gly Ser Cys Thr Ser Ser Leu Ser ⁴⁰⁰ 405 4io 4i5

AGG CCG CTG CCC TTA GAG GAG TCT GCC ATG TCT GCA GAC TGC CTA GAG

Arg Pro Leu Pro Leu Glu Glu Ser Ala Met Ser Ala Asp Cys Leu Glu

420 425 430

GCA GCA GAA CAA CTC AGG AAC AGC TCT CTG ATA GAC TGC AGG TGC CAT

Ala Ala Glu Gin Leu Arg Asn Ser Ser Leu Ile Asp Cys Arg Cys His

435 440 445

CGG CGC ATG AAG CAC CAA GCT ACC TGT CTG GAC ATT TAT TGG ACC GTT

Arg Arg Met Lys His Gin Ala Thr Cys Leu Asp Ile Tyr Trp Thr Val

450 455 ₄₆₀

CAC CCT GCC CGA AGC CTT GGT GAC TAC GAG TTG GAT GTC TCA CCC TAT

His Pro Ala Arg Ser Leu Gly Asp Tyr Glu Leu Asp Val Ser Pro Tyr

465 470 475

GAA GAC ACA GTG ACC AGC AAA CCC TGG AAA ATG AAT CTT AGC AAG TTG

Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp Lys Met Asn Leu Ser Lys Leu ⁴⁸⁰ 485 490 495

103

151

199

247

295

343

391

439

487

AAA	CCA	GAC	TCG	GAC	CTC	TGC	CTC	AAA	TTT	GCT	ATG
Lys	Pro 500	Asp	Ser	Asp	Leu	Cys 505	Leu	Lys	Phe	Ala	Met SIO
CAC	GAC	AAG	TGT	GAC	CGC	CTG	CGC	AAG	GCC	TAC	GGG
His 515	Asp	Lys	Cys	Asp	Arg 520	Leu	Arg	Lys	Ala	Tyr 525	Gly

535

583

PL 191 248 B1

GCA TGC TCA GGG ATC CGC TGC CAG CGC CAC CTC TGC CTA GCC CAG CTG

Ala Cys Ser Gly Ile Arg Cys Gin Arg His Leu Cys Leu Ala Gin Leu ⁵³⁰ 535 540

CGC TCC TTC TTT GAG AAG GCA GCA GAG TCC CAC GCT CAG GGT CTG CTG

Arg Ser Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu Ser His Ala Gin Gly Leu Leu ⁵⁴5 550 5₅₅

CTG TGT CCC TGT GCA CCA GAA GAT GCG GGC TGT GGG GAG CGG CGG CGT

Leu Cys Pro Cys Ala Pro Glu Asp Ala Gly Cys Gly Glu Arg Arg Arg ⁵⁶⁰ 565 ₅₇₀ * * ₅₇*

AAC ACC ATC GCC CCC AGT TGC GCC CTG CCT TCT GTA ACC CCC AAT TGC

Asn Thr Ile Ala Pro Ser Cys Ala Leu Pro Ser Val Thr Pro Asn Cys ⁵⁸⁰ 585 590

CTG GAT CTG CGG AGC TTC TGC CGT GCG GAC CCT TTG TGC AGA TCA CGC

Leu Asp Leu Arg Ser Phe Cys Arg Ala Asp Pro Leu Cys Arg ser Arg

595 600 605

CTG ATG GAC TTC CAG ACC CAC TGT CAT CCT ATG GAC ATC CTT GGG ACT

Leu Met Asp Phe Gin Thr His Cys His Pro Met Asp Ile Leu Gly Thr ⁶¹⁰ 615 620

TGT GCA ACT GAG CAG TCC AGA TGT CTG CGG GCA TAC CTG GGG CTG ATT

Cys Ala Thr Glu Gin Ser Arg Cys Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Leu Ile

525 630 635

GGG ACT GCC ATG ACC CCA AAC TTC ATC AGC AAG GTC AAC ACT ACT GTT

Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Ile Ser Lys Val Asn Thr Thr Val ⁶⁴⁰ 645 650 655

GCC TTA AGC TGC ACC TGC CGA GGC AGC GGC AAC CTA CAG GAC GAG TGT

Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn Leu Gin Asp Glu Cys

660 665 670

GAA CAG CTG GAA AGG TCC TTC TCC CAG AAC CCC TGC CTC GTG GAG GCC

Glu Gin Leu Olu Arg Ser Phe Ser Gin Asn Pro Cys Leu Val Glu Ala

675 680 685

ATT GCA GCT AAG ATG CGT TTC CAC AGA CAG CTC TTC TCC CAG GAC TGG

Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His Arg Gin Leu Phe Ser Gin Asp Tro ⁶⁹⁸ 695 700

GCA GAC TCT ACT TTT TCA GTG GTG CAG CAG CAG AAC AGC AAC CCT GCT

Ala Asp Ser Thr Phe Ser Val Val Gin Gin Gin Asn Ser Asn Pro Ala

705 7io 7i5

CTG AGA CTG CAG CCC AGG CTA CCC ATT CTT TCT TTC TCC ATC CTT CCC

Leu Arg Leu Gin Pro Arg Leu Pro Ile Leu Ser Phe Ser Ile Leu Pro ⁷²⁰ 725 730 735

TTG ATT CTG CTG CAG ACC CTC TGG TAGCTGGGCT TCCTCAGGGT CCTTTGTCCT Leu Ile Leu Leu Gin Thr Leu Trp

740

631

679

727

775

823

871

919

967

1015

1063

1111

1159

1207

1261

PL 191 248 B1

CTCCACCACA	CCCAGACTGA	TTTGCAGCCT	GTGGTGGGAG	AGAACTCGCC	AGCCTGTGGA	1321
AGAAGACGCA	GCGTGCTACA	CAGCAACCCG	GAACCAACCA	GGCATTCCGC	AGCACATCCC	1381
GTCTGCTCCA	GAAGAGGTCT	TAGAAGTGAG	GGCTGTGACC	CTTCCGATCC	TGAGCGGCTA	1441
GTTTTCAAAC	CTCCCTTGCC	CCTGCTTCCT	TCTGGCTCAG	GCTGCTCCTC	CTTAGGACTT	1501
TGTGGGTCCA	GTTTTGCCTT	CTGTTCTGAT	GGTGATTAGC	GGCTCACCTC	CAGCGCTTCT	1561
TCCTGTTTCC	CAGGACCACC	CAGAGGCTAA	GGAATCAGTC	ATTCCCTGTT	GCCTTCTCCA	1621
GGAAGGCAGG	CTAAGGGTTC	TGAGGTGACT	GAGAAAAATG	TTTCCTTTGT	GTGGAAGGCT	1661
GGTGCTCCAG	CCTCCACGTC	CCTCTGAATG	GAAGATAAAA	ACCTGCTGGT	GTCTTGACTG	1741
CTCTGCCAGG	CAATCCTGAA	CATTTGGGCA	TGAAGAGCTA	AAGTCTTTGG	GTCTTGTTTA	1801
ACTCCTATTA	CTGTCCCCAA	ATTCCCCTAG	TCCCTTGGGT	CATGATTAAA	CATTTTGACT	1861

1889 (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 397 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 17

Met Gly Leu Ser Trp Ser Pro Arg Pro Pro Leu Leu Met Ile Leu Leu 15 10 15

Leu Val Leu Ser Leu Trp Leu Pro Leu Gly Ala Gly Asn Ser Leu Ala 20 25 30

Thr Glu Asn Arg Phe Val Asn Ser Cys Thr Gin Ala Arg Lys Lys Cys 35 40 45

Glu Ala Asn Pro Ala Cys Lys Ala Ala Tyr Gin His Leu Gly Ser Cys 50 55 60

Thr Ser Ser Leu Ser Arg Pro Leu Pro Leu Glu Glu Ser Ala Met Ser 65 70 75 80

Ala Asp Cys Leu Glu Ala Ala Glu Gin Leu Arg Asn Ser Ser Leu Ile 85 90 95

Asp Cys Arg Cys His Arg Arg Met Lys His Gin Ala Thr Cys Leu Asp 100 105 110

PL 191 248 B1

Ile Tyr Trp Thr Val His Pro Ala Arg Ser Leu Gly Asp Tyr Glu Leu 115 120 125

Asp Val Ser Pro Tyr Glu Asp Thr Val Thr Ser Lys Pro Trp Lys Met 130 135 140

Asn Leu Ser Lys Leu Asn Met Leu Lye Pro Asp Ser Asp Leu Cye Leu

1*5 150 155 ifio

Lys Phe Ala Met Leu Cys Thr Leu His Asp Lys Cys Asp Arg Leu Arg

165 170 175

Lys Ala Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Ile Arg Cye Gin Arg Hie Leu 100 185 190

Cys Leu Ala Gin Leu Arg Ser Phe Phe Glu Lys Ala Ala Glu Ser His 195 200 205

Ala Gin Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Glu Asp Ala Gly Cys 210 215 220

Gly Glu Arg Arg Arg Asn Thr Ile Ala Pro Ser Cye Ala Leu Pro Ser

225 230 235 240

Val Thr Pro Asn Cys Leu Asp Leu Arg Ser Phe Cys Arg Ala Asp Pro

245 250 255

Leu Cys Arg Ser Arg Leu Met Asp Phe Gin Thr His Cys His Pro Met 260 265 270

Asp Ile Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gin Ser Arg Cys Leu Arg Ala 275 280 285

Tyr Leu Gly Leu Ile Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Ile Ser Lys 290 295 300

Val Asn Thr Thr Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn

305 310 315 320

Leu Gin Asp Glu Cys Glu Gin Leu Glu Arg Ser Phe Ser Gin Asn Pro

325 330 335

Cys Leu Val Glu Ala Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His Arg Gin Leu 340 345 350

Phe Ser Gin Asp Trp Ala Asp Ser Thr Phe Ser Val Val Gin Gin Gin 355 360 365

Asn Ser Asn Pro Ala Leu Arg Leu Gin Pro Arg Leu Pro Ile Leu Ser 370 375 380

Phe Ser Ile Leu Pro Leu Ile Leu Leu Gin Thr Leu Trp

385 390 395

PL 191 248 B1

2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1271 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) Nazwa/Klucz; CDS (B) Położenie: 2..946 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 18 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:

C GGC TAC TGT GAA ACA CCT CAA CTC AGG AAC AGC TCT CTG ATA GGC Gly Tyr Cys Glu Thr Pro Gin Leu Arg Asn Ser Ser Leu Ile Gly

400 405 410

TGC Cys

ATG TGC CAC CGG

CGC ATG Arg Met

AAG AAC CAG GTT GCC TGC TTG GAC ATC

94

Met

Cys His 415

Arg

Lys 420

Asn

Gin

Val

Ala

Cys Leu 425

Asp

Ile

TAT

TGG

ACC

GTT

CAC

CGT

GCC

CGC

AGC

CTT

GGT

AAC

TAT

GAG

CTG

GAT

142

Tyr

Trp

Thr

Val

His

Arg

Ala

Arg

Ser

Leu

Gly

Asn

Tyr

Glu

Leu

Asp

430

435

440

GTC

TCC

CCC

TAT

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC

AGC

AAA

CCC

TGG

AAA

ATG

AAT

190

Val

Ser

Pro

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp

Lys

Met

Asn

445

450

455

460

CTC

AGC

AAA

CTG

AAC

ATG

CTC

AAA

CCA

GAC

TCA

GAC

CTC

TGC

CTC

AAG

238

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn

Met

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

Cys

Leu

Lys

465

470

475

TTT

GCC

ATG

CTG

TGT

ACT

CTC

AAT

GAC

AAG

TGT

OAC

CGG

CTG

CGC

AAG

286

Phe

Ala

Met

Leu

Cys

Thr

Leu

Asn

Asp

Lys

Cys

Asp

Arg

Leu

Arg

Lys

480

485

490

GCC

TAC

GGG

GAG

GCG

TGC

TCC

GGG

CCC

CAC

TGC

CAG

CGC

CAC

GTC

TGC

334

Ala

Tyr

Gly

Glu

Ala

Cys

Ser

Gly

Pro

His

Cys

Gin

Arg

His

Val

Cys

495

500

SOS

CTC

AGG

CAG

CTG

CTC

ACT

TTC

TTC

GAG

AAG

GCC

GCC

GAG

CCC

CAC

GCG

382

Leu

Arg

Gin

Leu

Leu

Thr

Phe

Phe

Glu

Lys

Ala

Ala

Glu

Pro

His

Ala

510

515

520

CAG

GGC

CTG

CTA

CTG

TGC

CCA

TGT

GCC

CCC

AAC

GAC

CGG

GGC

TGC

GGG

430

Gin

Gly

Leu

Leu

Leu

Cys

Pro

Cys

Ala

Pro

Asn

Asp

Arg

Gly

Cys

Gly

525

530

S35

540

PL 191 248 B1

GAG Glu	CGC Arg	CGG CGC AAC ACC ATC GCC	CCC AAC TGC GCG CTG CCG CCT GTG Pro Asn Cys Ala Leu Pro Pro Val	478
Arg	Arg Asn Thr 545	Ile	Ala
550	555
GCC	CCC	AAC	TGC CTG GAG	CTG	CGG	CGC CTC	TGC TTC TCC GAC CCG CTT	526
Ala	Pro	Asn	Cys Leu Glu	Leu	Arg	Arg Leu	Cys Phe Ser Asp Pro Leu
			560			565	570
TGC	AGA	TCA	CGC CTG GTG	GAT	TTC	CAG ACC	CAC TGC CAT CCC ATG GAC	574
Cys	Arg	Ser	Arg Leu Val	Asp	Phe	Gin Thr	His Cys His Pro Met Asp
		575			580		585
ATC	CTA	GGA	ACT TGT GCA	ACA	GAG	CAG TCC	AGA TGT CTA CGA GCA TAC	622
Ile	Leu	Gly	Thr Cys Ala	Thr	Glu	Gin Ser	Arg Cys Leu Arg Ala Tyr
	590			595			600
CTG	GGG	CTG	ATT GGG ACT	GCC	ATG	ACC CCC	AAC TTT GTC AGC AAT GTC	670
Leu	Gly	Leu	Ile Gly Thr	Ala	Met	Thr Pro	Asn Phe Val Ser Asn Val
605			610				615 620
AAC	ACC	AGT	GTT GCC TTA	AGC	TGC	ACC TGC	CGA GGC AGT GGC AAC CTG	718
Asn	Thr	Ser	Val Ala Leu	Ser	Cys	Thr Cys	Arg Gly Ser Gly Asn Leu
			625			630	635
CAG	GAG	GAG	TGT GAA ATG	CTG	GAA	GGG TTC	TTC TCC CAC AAC CCC TGC	766
Gin	Glu	Glu	Cys Glu Met	Leu	Glu	Gly Phe	Phe Ser His Asn Pro Cys
			640			645	650
CTC	ACG	GAG	GCC ATT GCA	GCT	AAG	ATG CGT	TTT CAC AGC CAA CTC TTC	814
Leu	Thr	Glu	Ala Ile Ala	Ala	Lys	Met Arg	Phe His Ser Gin Leu Phe
		655			660		665
TCC	CAG	GAC	TGG CCA CAC	CCT	ACC	TTT GCT	GTG ATG GCA CAC CAG AAT	862
Ser	Gin	Asp	Trp Pro His	Pro	Thr	Phe Ala	Val Met Ala His Gin Asn
	670			675			680
GAA	AAC	CCT	GCT GTG AGG	CCA	CAG	CCC TGG	GTG CCC TCT CTT TTC TCC	910
Glu	Asn	Pro	Ala Val Arg	Pro	Gin	Pro Trp	Val Pro Ser Leu Phe Ser
6B5			690				695 700
TGC	ACG	CTT	CCC TTG ATT	CTG	CTC	CTG AGC	CTA TGG TAGCTGGACT	956
Cys	Thr	Leu	Pro Leu Ile	Leu	Leu	Leu Ser	Leu Trp

705 710

TCCCCAGGGC	CCTCTTCCCC	TCCACCACAC	CCAGGTGGAC	TTGCAGCCCA	CAAGGGGTGA	1016
GGAAAGGACA	GCAGCAGGAA	GGAGGTGCAG	TGCGCAGATG	AGGGCACAGG	AGAAGCTAAG	1076
GGTTATGACC	TCCAGATCCT	TACTGGTCCA	GTCCTCATTC	CCTCCACCCC	ATCTCCACTT	1136
CTGATTCATG	CTGCCCCTCC	TTGGTGGCCA	CAATTTAGCC	ATGTCATCTG	GTGCCTGTGG	1196
GCCTTGCTTT	ATTCCTATTA	TTGTCCTAAA	GTCTCTCTGG	GCTCTTGGAT	CATGATTAAA	1256
CCTTTGACTT	AAAAA					1271

PL 191 248 B1 (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 315 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 19

Gly 1

Tyr

Cys

Glu

Thr 5

Pro

Gin

Leu

Arg

Asn 10

Ser

Ser

Leu

Ile

Gly 15

Cys

Met

Cys

His

Arg 20

Arg

Met

Lys

Asn

Gin 25

Val

Ala

Cys

Leu

Asp 30

Ile

Tyr

Trp

Thr

Val 35

His

Arg

Ala

Arg

Ser 40

Leu

Gly

Asn

Tyr

Glu 45

Leu

Asp

Val

Ser

Pro 50

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val 55

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp 60

Lys

Met

Asn

Leu

Ser

Lys

Leu

Asn

Met

Leu

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

Cys

Leu

Lys

Phe

75

Ala Met Leu Cys Thr Leu Asn Asp Lys Cys Asp Arg Leu Arg Lys Ala 85 go 95

Tyr Gly Glu Ala Cys Ser Gly Pro His Cys Gin Arg His Val Cys Leu ¹⁰⁰ 105 no

Arg Gin Leu Leu Thr Phe Phe Glu Lye Ala Ala Glu Pro His Ala Gin 115 120 125

Gly Leu Leu Leu Cys Pro Cys Ala Pro Asn Asp Arg Gly Cys Gly Glu 130 135 140

Arg Arg Arg Asn Thr Ile Ala Pro Asn Cys Ala Leu Pro Pro val Ala ¹⁴⁵ I⁵⁰ 155 Igo

Pro Asn Cys Leu Glu Leu Arg Arg Leu Cys Phe Ser Asp Pro Leu Cys

165 170 175

Arg Ser Arg Leu Val Asp Phe Gin Thr His Cys His Pro Met Asp Ile 160 185 190

Leu Gly Thr Cys Ala Thr Glu Gin Ser Arg Cys Leu Arg Ala Tyr Leu ¹⁹⁵ 200 205 ®ly Łeu He Gly Thr Ala Met Thr Pro Asn Phe Val Ser Asn Val Asn 210 215 220

PL 191 248 B1

Thr Ser Val Ala Leu Ser Cys Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn Leu Gin

225 230 235 240

Glu Glu Cys Glu Met Leu Glu Gly phe Phe Ser His Asn Pro Cys Leu

245 250 255

Thr Glu Ala Ile Ala Ala Lys Met Arg Phe His Ser Gin Leu Phe Ser 260 265 270

Gin Asp Trp Pro His Pro Thr Phe Ala Val Met Ala His Gin Asn Glu 275 280 285

Asn Pro Ala Val Arg Pro Gin Pro Trp Val Pro Ser Leu Phe Ser Cys 290 295 300

Thr Leu Pro Leu Ile Leu Leu Leu Ser Leu Trp

305 310 315 (2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1699 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Położenie: 175..1374 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID: 20:

TGTGGACGCG CGCTTCGGAG TTGGAGGGCG GCGCCCAGGA CCCTGGTGGG AGAGTGTGTG 60

CGTCGCGCTG GAGGGCGGGA GGCGGGGGCG GGAGGTGCCG GTCGAGGGAG CCCCGCTCTC 120

AGAGCTCCAG GGGAGGAGCG AGGGGAGCGC GGAGCCCGGC GCCTACAGCT CGCC ATG 177

Met

GTG CGC CCC CTG AAC CCG CGA CCG CTG CCG CCC GTA GTC CTG ATG TTG 225

Val Arg Pro Leu Asn Pro Arg Pro Leu Pro Pro Val Val Leu Met Leu

320 32S 330

CTG CTG CTG CTG CCG CCG TCG CCG CTG CCT CTC GCA GCC GGA GAC CCC 273

Leu Leu Leu Leu Pro Pro Ser Pro Leu Pro Leu Ala Ala Gly Asp Pro

335 340 34S

CTT CCC ACA GAA AGC CGA CTC ATG AAC AGC TGT CTC CAG GCC AGG AGG 321

Leu Pro Thr Glu Ser Arg Leu Met Asn Ser Cys Leu Gin Ala Arg Arg

350 355 360

PL 191 248 B1

AAG

TGC

CAG

GCT

GAT

CCC

ACC

TGC

AGT

GCT

GCC

TAC

CAC

CAC

CTG

GAT

369

Lys 365

Cys

Gin

Ala

Asp

Pro 370

Thr

Cys

Ser

Ala

Ala 375

Tyr

His

His

Leu

Asp 380

TCC

TGC

ACC

TCT

AGC

ATA

AGC

ACC

CCA

CTG

CCC

TCA

GAG

GAG

CCT

TCG

417

Ser

Cys

Thr

Ser

Ser 385

Ile

Ser

Thr

Pro

Leu 390

Pro

Ser

Glu

Glu

Pro 395

Ser

GTC

CCT

GCT

GAC

TGC

CTG

GAG

GCA

GCA

CAG

CAA

CTC

AGG

AAC

AGC

TCT

465

Val

Pro

Ala

Asp 400

Cys

Leu

Glu

Ala

Ala 405

Gin

Gin

Leu

Arg

Asn 410

Ser

Ser

CTG

ATA

GGC

TGC

ATG

TGC

CAC

CGG

CGC

ATG

AAG

AAC

CAG

GTT

GCC

TGC

513

Leu

Ile

Gly 415

Cys

Met

Cys

His

Arg 420

Arg

Met

Lys

Asn

Gin 425

Val

Ala

Cys

TTG

GAC

ATC

TAT

TGG

ACC

GTT

CAC

CGT

GCC

CGC

AGC

CTT

GGT

AAC

TAT

561

Leu

Asp 430

Ile

Tyr

Trp

Thr

Val 435

His

Arg

Ala

Arg

Ser 440

Leu

Gly

Asn

Tyr

GAG

CTG

GAT

GTC

TCC

CCC

TAT

GAA

GAC

ACA

GTG

ACC

AGC

AAA

CCC

TGG

609

Glu 445

Leu

Asp

Val

Ser

Pro 450

Tyr

Glu

Asp

Thr

Val 455

Thr

Ser

Lys

Pro

Trp 460

AAA

ATG

AAT

CTC

AGC

AAA

CTG

AAC

ATG

CTC

AAA

CCA

GAC

TCA

GAC

CTC

657

Lys

Met

Asn

Leu

Ser 465

Lys

Leu

Asn

Met

Leu 470

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp 475

Leu

TGC

CTC

AAG

TTT

GCC

ATG

CTG

TGT

ACT

CTC

AAT

GAC

AAG

TGT

GAC

CGG

705

Cys

Leu

Lys

Phe 480

Ala

Met

Leu

Cys

Thr 485

Leu

Asn

Asp

Lys

Cys 490

Asp

Arg

CTG

CGC

AAG

GCC

TAC

GGG

GAG

GCG

TGC

TCC

GGG

CCC

CAC

TGC

CAG

CGC

753

Leu

Arg

Lys 495

Ala

Tyr

Gly

Glu

Ala SCO

Cys

Ser

Gly

Pro

His 505

Cys

Gin

Arg

CAC

GTC

TGC

CTC

AGG

CAG

CTG

CTC

ACT

TTC

TTC

GAG

AAG

GCC

GCC

GAG

801

His

Val 510

Cys

Leu

Arg

Gin

Leu 515

Leu

Thr

Phe

Phe

Glu 520

Lys

Ala

Ala

Glu

CCC

CAC

GCG

CAG

GGC

CTG

CTA

CTG

TGC

CCA

TGT

GCC

CCC

AAC

GAC

CGG

849

Pro 525

His

Ala

Gin

Gly

Leu 530

Leu

Leu

Cys

Pro

Cys 535

Ala

Pro

Asn

Asp

Arg 540

GGC

TGC

GGG

GAG

CGC

CGG

CGC

AAC

ACC

ATC

GCC

CCC

AAC

TGC

GCG

CTG

897

Gly

Cys

Gly

Glu

Arg 545

Arg

Arg

Asn

Thr

Ile 550

Ala

Pro

Asn

Cys

Ala 555

Leu

CCG

CCT

GTG

GCC

CCC

AAC

TGC

CTG

GAG

CTG

CGG

CGC

CTC

TGC

TTC

TCC

945

Pro

Pro

Val

Ala 560

Pro

Asn

Cys

Leu

Glu 565

Leu

Arg

Arg

Leu

Cys 570

Phe

Ser

PL 191 248 B1

993

GAC

CCG

CTT

TGC

AGA

TCA

CGC

CTG

GTG

GAT

TTC

CAG

ACC

CAC

TGC

CAT

Asp

Pro

Leu 575

Cys

Arg

Ser

Arg

Leu 580

Val

Asp

Phe

Gln

Thr 585

His

Cys

His

CCC

ATG

GAC

ATC

CTA

GGA

ACT

TGT

GCA

ACA

GAG

CAG

TCC

AGA

TGT

CTA

Pro

Met 590

Asp

Ile

Leu

Gly

Thr 595

Cys

Ala

Thr

Glu

Gln 600

Ser

Arg

Cys

Leu

CGA

GCA

TAC

CTG

GGG

CTG

ATT

GGG

ACT

GCC

ATG

ACC

CCC

AAC

TTT

GTC

Arg 605

Ala

Tyr

Leu

Gly

Leu 610

Ile

Gly

Thr

Ala

Met 615

Thr

Pro

Asn

Phe

Val 620

AGC

AAT

GTC

AAC

ACC

AGT

GTT

GCC

TTA

AGC

TGC

ACC

TGC

CGA

GGC

AGT

Ser

Asn

Val

Asn

Thr 625

Ser

Val

Ala

Leu

Ser 630

Cys

Thr

Cys

Arg

Gly 635

Ser

GGC

AAC

CTG

CAG

GAG

GAG

TGT

GAA

ATG

CTG

GAA

GGG

TTC

TTC

TCC

CAC

Gly

Asn

Leu

Gln 640

Glu

Glu

Cys

Glu

Met 645

Leu

Glu

Gly

Phe

Phe 650

Ser

His

AAC

CCC

TGC

CTC

ACG

GAG

GCC

ATT

GCA

GCT

AAG

ATG

CGT

TTT

CAC

AGC

Asn

Pro

Cys 655

Leu

Thr

Glu

Ala

Ile 660

Ala

Ala

Lys

Met

Arg 665

Phe

His

Ser

CAA

CTC

TTC

TCC

CAG

GAC

TGG

CCA

CAC

CCT

ACC

TTT

GCT

GTG

ATG

GCA

Gln

Leu 670

Phe

Ser

Gln

Asp

Trp 675

Pro

His

Pro

Thr

Phe 680

Ala

Val

Met

Ala

CAC

CAG

AAT

GAA

AAC

CCT

GCT

GTG

AGG

CCA

CAG

CCC

TGG

GTG

CCC

TCT

His 685

Gln

Asn

Glu

Asn

Pro 690

Ala

Val

Arg

Pro

Gln 695

Pro

Trp

Val

Pro

Ser 700

CTT

TTC

TCC

TGC

ACG

CTT

CCC

TTG

ATT

CTG

CTC

CTG

AGC

CTA

TGG

Leu

Phe

Ser

Cys

Thr 705

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu 710

Leu

Leu

Ser

Leu

Trp 715

1041

1089

1137

1185

1233

1281

1329

1374

TAGCTGGACT	TCCCCAGGGC	CCTCTTCCCC	TCCACCACAC	CCAGGTGGAC	TTGCAGCCCA	1434
CAAGGGGTGA	GGAAAGGACA	GCAGCAGGAA	GGAGGTGCAG	TGCGCAGATG	AGGGCACAGG	1494
AGAAGCTAAG	GGTTATGACC	TCCAGATCCT	TACTGGTCCA	GTCCTCATTC	CCTCCACCCC	1554
ATCTCCACTT	CTGATTCATG	CTGCCCCTCC	TTGGTGGCCA	CAATTTAGCC	ATGTCATCTG	1614
GTGCCTGTGG	GCCTTGCTTT	ATTCCTATTA	TTGTCCTAAA	GTCTCTCTGG	GCTCTTGGAT	1674
CATGATTAAA	CCTTTGACTT	AAAAA				1699

(2) INFORMACJE DLA SEK NR ID: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 400 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 191 248 B1

	(ii) TYP CZĄSTECZKI: białko	21
(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEK NR ID:
Met Val 1	Arg	Pro Leu Asn Pro Arg 5	Pro Leu Pro 10	Pro Val Val Leu Met 15
Leu Leu	Leu	Leu Leu Pro Pro Ser 20	Pro Leu Pro 25	Leu Ala Ala Gly Asp 30
Pro Leu	Pro 35	Thr Glu Ser Arg Leu 40	Met Asn Ser	Cys Leu Gin Ala Arg 45
Arg Lys 50	Cys	Gin Ala Asp Pro Thr 55	Cys Ser Ala	Ala Tyr His His Leu 60
Asp Ser 65	Cys	Thr Ser Ser Ile Ser 70	Thr Pro Leu 75	Pro Ser Glu Glu Pro SO
Ser Val	Pro	Ala Asp Cys Leu Glu 85	Ala Ala Gin 90	Gin Leu Arg Asn Ser 95
Ser Leu	Ile	Gly Cys Met Cys His 100	Arg Arg Met 105	Lys Asn Gin Val Ala 110
Cys Leu	Asp 115	Ile Tyr Trp Thr Val 120	His Arg Ala	Arg Ser Leu Gly Asn 125
Tyr Glu 130	Leu	Asp Val Ser Pro Tyr 135	Glu Asp Thr	Val Thr Ser Lys Pro 140
Trp Lys 145	Met	Asn Leu Ser Lys Leu 150	Asn Met Leu 155	Lys Pro Asp Ser Asp 160
Leu Cys	Leu	Lys Phe Ala Met Leu 165	Cys Thr Leu 170	Asn Asp Lys Cys Asp 175
Arg Leu	Arg	Lys Ala Tyr Gly Glu 180	Ala Cys Ser 185	Gly Pro His Cys Gin 190
Arg His	Val 195	Cys Leu Arg Gin Leu 200	Leu Thr Phe	Phe Glu Lys Ala Ala 205
Glu Pro 210	His	Ala Gin Gly Leu Leu 215	Leu Cys Pro	Cys Ala Pro Asn Asp 220
Arg Gly 225	Cys	Gly Glu Arg Arg Arg 230	Asn Thr Ile 235	Ala Pro Asn Cys Ala 240
leu Pro	Pro	Val Ala Pro Asn Cys 24 5	Leu Glu Leu 250	Arg Arg Leu Cys Phe 255
Ser Asp	Pro	Leu Cys Arg Ser Arg 260	Leu Val Asp 265	Phe Gin Thr His Cys 270

PL 191 248 B1

His

Pro

Met 275

Asp

Ile

Leu

Gly

Thr 280

Cys

Ala

Thr

Glu

Gin 285

Ser

Arg

Cys

Leu

Arg 290

Ala

Tyr

Leu

Gly

Leu 295

Ile

Gly

Thr

Ala

Met 300

Thr

Pro

Asn

Phe

Val 305

Ser

Asn

Val

Asn

Thr 310

Ser

Val

Ala

Leu

Ser 315

Cys

Thr

Cys

Arg

Gly 320

Ser

Gly

Asn

Leu

Gin 325

Glu

Glu

Cys

Glu

Met 330

Leu

Glu

Gly

Phe

Phe 335

Ser

His

Asn

Pro

Cys 340

Leu

Thr

Glu

Ala

Ile 345

Ala

Ala

Lys

Met

Arg 350

Phe

His

Ser

Gin

Leu 355

Phe

Ser

Gin

Asp

Trp 360

Pro

His

Pro

Thr

Phe 365

Ala

Val

Met

Ala

His 370

Gin

Asn

Glu

Asn

Pro 375

Ala

Val

Arg

Pro

Gin 380

Pro

Trp

Val

Pro

Ser 385

Leu

Phe

Ser

Cys

Thr 390

Leu

Pro

Leu

Ile

Leu 395

Leu

Leu

Ser

Leu

Trp 400

Zastrzeżenia patentowe

Claims (43)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. lzolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEKNR ID: 17, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację domeny kinazy tyrozynowej białka receptorowego Ret.
2. 2. Izolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację domeny kinazy tyrozynowej białka receptorowego Ret.
3. 3. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa kodowanego polipeptydu zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdy jest dopasowana do SEK NR ID: 17.
4. 4. Kwas nukleinowy według zastrz. 2, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa kodowanego polipeptydu zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdy jest dopasowana do SEK NR ID: 21.
5. 5. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że kodowany polipeptyd wykazuje co najmniej 90% homologię sekwencji względem SEK NRID: 17.
6. 6. Kwas nukleinowy według zastrz. 2, znamienny tym, że kodowany polipeptyd wykazuje co najmniej 90% homologię sekwencji względem SEK NRID: 21.
7. 7. Kwas nukleinowy według zastrz. 5, znamienny tym, że kodowanym polipeptydem jest SEK NRID: 17.
8. 8. Kwas nukleinowy według zastrz. 6, znamienny tym, że kodowanym polipeptydem jest SEK NRID: 21.
9. 9. Izolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową o SEK NR ID: 16.
10. 10. Izolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję nukleotydową o SEK NR ID: 20.
11. 11. Wektor obejmujący wstawkę zawierającą kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:

    a) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80%, korzystnie z co najmniej 90% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, najkorzystniej kodującego polipeptyd

    PL 191 248 B1 z SEK NR ID: 17, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylacjęjego domeny kinazy tyrozynowej;

    b) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, przyczym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jegodomeny kinazy tyrozynowej, a jego sekwencja aminokwasowa zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdy jest dopasowana do SEK NR ID: 17;

    c) izolowanego kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję nukleotydową z SEK NR ID: 16.
12. 12. Wektor obejmujący wstawkę zawierającą kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:

    a) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80%, korzystnie z co najmniej 90% homologią sekwencji względem SEKNR ID: 21, najkorzystniej kodującego polipeptyd z SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jego domeny kinazy tyrozynowej;

    b) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, przyczym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jegodomeny kinazy tyrozynowej, a jego sekwencja aminokwasowa zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdy jest dopasowana do SEK NR ID: 21;

    c) izolowanego kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję nukleotydową z SEK NR ID: 20.
13. 13. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje wektor obejmujący wstawkę zawierającą kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:

    a) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80%, korzystnie z co najmniej 90% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, najkorzystniej kodującego polipeptyd z SEK NR ID: 17, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzacjęlubautofosforylacjęjegodomenykinazytyrozynowej;

    b) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, przyczym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jegodomeny kinazy tyrozynowej, a jego sekwencja aminokwasowa zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdy jest dopasowana do SEK NR ID: 17;

    c) izolowanego kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję nukleotydową z SEK NR ID: 16.
14. 14. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje wektor obejmujący wstawkę zawierającą kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:

    a) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80%, korzystnie z co najmniej 90% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, najkorzystniej kodującego polipeptyd z SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzacjęlubautofosforylacjęjegodomenykinazytyrozynowej;

    b) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, przyczym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jegodomeny kinazy tyrozynowej, a jego sekwencja aminokwasowa zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdy jest dopasowana do SEK NR ID: 21;

    c) izolowanego kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję nukleotydową z SEK NR ID: 20.
15. 15. Sposób wytwarzania polipeptydu, znamienny tym, że obejmuje etapy: hodowania komórki gospodarza, która obejmujewektor obejmujący wstawkę zawierającą kwasnukleinowy wybrany z grupy składającej się z:

    a) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80%, korzystnie z co najmniej 90% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, najkorzystniej kodującego polipeptyd z SEK NR ID: 17, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzacjęlubautofosforylacjęjegodomenykinazytyrozynowej;

    b) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, przyczym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jegodomeny kinazy tyrozynowej, a jego sekwencja aminokwasowa zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdy jest dopasowana do SEK NR ID: 17;

    c) izolowanego kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję nukleotydową z SEK NR ID: 16; oraz odzyskiwania polipeptydu wyrażanego z wstawki w komórce gospodarza.
16. 16. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje wektor obejmujący wstawkę zawierającą kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:

    a) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80%, korzystnie z co najmniej 90% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, najkorzystniej kodującego polipeptyd

    PL 191 248 B1 z SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzacjęlubautofosforylacjęjegodomenykinazytyrozynowej;

    b) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jego domeny kinazy tyrozynowej, a jego sekwencja aminokwasowa zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdyjest dopasowana do SEK NR ID: 21 ;

    c) izolowanego kwasu nukleinowegoobejmującegosekwencjęnukleotydowąz SEKNR ID: 20; oraz odzyskiwania polipeptydu wyrażanego z wstawki w komórce gospodarza.
17. 17. Izolowany polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:

    a) izolowanego kwasu nukleinowego kodującegopolipeptydz co najmniej 80%, korzystniez co najmniej 90% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, najkorzystniej kodującego polipeptyd z SEK NR ID: 17, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jego domeny kinazy tyrozynowej;

    b) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołującjegodimeryzacjęlubautofosforylacjęjegodomenykinazytyrozynowej, a jegosekwencjaaminokwasowa zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdyjest dopasowana do SEK NR ID: 17;

    c) izolowanegokwasunukleinowegoobejmującegosekwencjęnukleotydowązSEKNRID:16.
18. 18. Izolowany polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:

    a) izolowanego kwasu nukleinowego kodującegopolipeptydz co najmniej 80%, korzystniez co najmniej 90% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, najkorzystniej kodującego polipeptyd z SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzacjęlubautofosforylacjęjegodomenykinazytyrozynowej;

    b) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jego domeny kinazy tyrozynowej, a jego sekwencja aminokwasowa zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdyjest dopasowana do SEK NR ID: 21 ;

    c) izolowanegokwasunukleinowegoobejmującegosekwencję nukleotydowązSEKNRID:20.
19. 19. Izolowane przeciwciało, znamienne tym, że wiąże się z polipeptydem wybranym z grupy składającejsięzSEKNRID:15,SEKNRID:17iSEKNRID: 19.
20. 20. Izolowane przeciwciało według zaostrz. 19, znamienne tym, że wiąże się z polipeptydem zSEKNRID:19.
21. 21. Izolowane przeciwciało, znamiennetym, że wiąże się z polipeptydem o SEK NR ID: 21 .
22. 22. Izolowane przeciwciało, znamienne tym, że jest wytwarzane przez hybrydoma wybraną zgrupyskładającejsięzAA.FF9lubAA.GE7.3.
23. 23. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera a)izolowane przeciwciało wiążące się z polipeptydemwybranymzgrupyskładającejsięzSEKNRID:15,SEKNRID:17i SEKNRID:19,korzystnie zpolipeptydemoSEKNRID:19,związanez(b)toksyną,związkiem umożliwiającymobrazowanielub radionuklidem.
24. 24. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera a) izolowane przeciwciało wiążące się z polipeptydem oSEKNRID:21,związanez(b)toksyną,związkiem umożliwiającymobrazowanielubradionuklidem.
25. 25. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera a) izolowane przeciwciało wytwarzane przez hybrydomaAA.FF9lubhybrydomaAA.GE7.3, związanez (b) toksyną, związkiem umożliwiającym obrazowanielubradionuklidem.
26. 26. Białko fuzyjne, znamienne tym, że obejmuje polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy wybranyzgrupyskładającejsięz:

    a) izolowanego kwasu nukleinowego kodującegopolipeptydz co najmniej 80%, korzystniez co najmniej 90% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, najkorzystniej kodującego polipeptyd z SEK NR ID: 17, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jego domeny kinazy tyrozynowej;

    b) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 17, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jego domeny kinazy tyrozynowej, a jego sekwencja aminokwasowa zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdyjest dopasowana do SEK NR ID: 1 7;

    c) izolowanego kwasu nukleinowegoobejmującegosekwencjęnukleotydowąz SEKNR ID: 16; połączonyzimmunoglobuliną,toksyną,związkiemumożliwiającym obrazowanielubradionuklidem.

    PL 191 248 B1
27. 27. Białko fuzyjne, znamienne tym, że obejmuje polipeptyd kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:

    a) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80%, korzystnie z co najmniej 90% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, najkorzystniej kodującego polipeptyd z SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jego domeny kinazy tyrozynowej;

    b) izolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd z co najmniej 80% homologią sekwencji względem SEK NR ID: 21, przy czym polipeptyd oddziaływuje z białkiem receptorowym Ret wywołując jego dimeryzację lub autofosforylację jego domeny kinazy tyrozynowej, a jego sekwencja aminokwasowa zachowuje co najmniej 80% reszt cysteinowych gdy jest dopasowana do SEK NR ID: 21;

    c) izolowanego kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję nukleotydową z SEK NR ID: 20; połączony z immunoglobuliną, toksyną, związkiem umożliwiającym obrazowanie lub radionuklidem.
28. 28. Kwas nukleinowy według zastrz. 1 albo 3, albo 5, albo7 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
29. 29. Kwas nukleinowy według zastrz. 9 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
30. 30. Kwas nukleinowy według zastrz. 2 albo 4, albo 6, albo8 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
31. 31. Kwas nukleinowy według zastrz. 10 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
32. 32. Polipeptyd według zastrz. 17 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
33. 33. Polipeptyd według zastrz. 18 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
34. 34. Wektor według zastrz. 11 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
35. 35. Wektor według zastrz. 12 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
36. 36. Przeciwciało według zastrz. 19 albo 20 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
37. 37. Przeciwciało według zastrz. 21 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
38. 38. Przeciwciało według zastrz. 22 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
39. 39. Kompozycja według zastrz. 23 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
40. 40. Kompozycja według zastrz. 24 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
41. 41. Kompozycja według zastrz. 25 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
42. 42. Białko fuzyjne według zastrz. 26 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.
43. 43. Białko fuzyjne według zastrz. 27 do zastosowania do leczenia lub diagnozowania schorzeń narządów i stymulowania wzrostu komórek tkanek, w szczególności nerwowej i nerkowej.