NO323612B1

NO323612B1 - Ret-ligandb3 (RetL3) for stimulering av neural og renal vekst, nukleinsyrer som koder for polypeptidet, fusjonsprotein samt antistoff som spesifikt binder polypeptidet.

Info

Publication number: NO323612B1
Application number: NO19985231A
Authority: NO
Inventors: Richard L Cate; Michele Sanicola-Nadel; Catherine Hession
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1996-05-08
Filing date: 1998-11-09
Publication date: 2007-06-18
Also published as: KR20060024843A; NO985231L; CN1232469A; DE69736428T2; CA2253871C; EP1757617A1; JP2002515743A; CA2253871A1; ES2270465T3; NO324957B1; ATE335003T1; PT914339E; EP0914339B1; WO1997044356A2; BG109433A; BR9710665A; BG102973A; NZ332706A; IL126918A0; AU732392B2

Abstract

Nukleotidsekvenser som koder for en Ret-ligand (RetL), samt fremgangsmåter ved stimulering av neural og renal vekst ved å behandle celler og pattedyrpasienter med RetL-DNA eller RetL-protein. Det frembringes et renset og isolert DNA-molekyl som koder for en RetL og som har nukleotidsekvensen av hvilken som helst RetL, men spesielt omfattende rotte-retLl-cDNA (SEKV. ID NR. 1), partsiell human retLl-cDNA (SEKV. ID NR. 8), hellengdes human retLl-cDNA (SEKV. ID NR. 10), human retl,2-cDNA (SEKV. ID NR. 12), murin retL3-cDNA (SEKV. ID NR. 12) eller human retL3-cDNA (SEKV. ID NR. 16), partsiell human retL3-cDNA (SEKV. ID NR. 18) eller human retL3-cDNA (SEKV. ID NR. 20). Det frembringes ytterligere et RetL-protein med en aminosyresekvens som omfatter sekvensen av rotte-RetLl (SEKV. ID NR. 2), partsiell human RetLl (SEKV. ID NR. 9), hellengdes human RetLl (SEKV. ID NR. 11), human RetL2 (SEKV. ID NR. 13), murin RetL3 (SEKV. ID NR. 17), partsiell human RetL3 (SEKV.ID NR. 19) eller human RetL3 (SEKV. ID NR. 21).

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert nukleinsyre som angitt i krav 1 og som koder for en Ret-ligand (RetL), samt fremgangsmåte ved fremstilling av slikt polypeptid som angitt i krav 8, polypeptid som kodes av denne nukleinsyren som angitt i krav 9 og antistoffer som binder til disse som angitt i krav 10. Oppfinnelsen angår også sammensetning, fusjonsprotein og nukleinsyre som angitt henholdsvis i kravene 12, 13 og 14.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Et mål for dagens forskning i området cellesignalering og reseptoraktivering, er å muliggjøre en terapeutisk modula-sjon av prosesser forbundet med cellevekst og celleover-levelse. Slike prosesser bestemmer utgangen av forskjellige medisinske tilstander, bl.a. organsvikt, føtal utvikling og svulstvekst. Hver av disse tilstander er av klinisk betyd-ning verden rundt, og har begrenset virksomme behandlings-muligheter. Det er et formål med foreliggende oppfinnelse å frembringe sammensetninger for å fremme regenerasjonen eller overlevelsen av skadet vev, samt- for å behandle lidelser som omfatter en avvikende vekst og utvikling av vev.

Tap av vev eller sene stadier av organsvikt rammer millio-ner av mennesker verden rundt hvert år, og fører til betydelig hevede helsekostnader. Organ- eller vevstap behandles vanligvis ved transplantasjon av organer fra donorer, ved kirurgisk rekonstruksjon eller med mekaniske anordninger. Hver av disse behandlinger har ulemper. Transplantasjon begrenses av mangelen på donorer, kirurgisk rekonstruksjon kan føre til andre problemer over tid, og mekaniske anordninger kan ikke utføre alle funksjonene av et enkelt organ og kan derfor ikke forebygge en progressiv forverring av tilstanden. Dermed foreligger det et reelt medisinsk behov for nye løsninger på disse problemer.

Proteinfaktorer som påvirker veksten, differensieringen og/eller overlevelsen av celler kan være nyttige ved behandling av lidelser i organer som inneholder mottakelige celler. Faktorer eller ligander som vekselvirker med reseptorer av reseptorproteinfamilien tyrosinkinase (RPTK), er spesielt interessante i denne sammenheng. Disse reseptorer er innblandet i mange cellulære programmer, bl.a. cellevekst og differensiering, og genesen av flere neoplasier. Dermed kan faktorene eller ligandene som vekselvirker med disse reseptorer, vise seg å være nyttige ved behandling av forstyrrelser i bestemte organer hvor vevet er blitt skadet. Alternativt kan det være nyttig å blokkere vekselvirkningen av disse faktorer med sine reseptorer, for å blokkere svulstvekst.

Ret-proto-onkogenet koder for en reseptortyrosinkinase som uttrykkes under utvikling av forskjellige vev, bl.a. det perifere og det sentrale nervesystem samt nyren. Abnormali-tetene som foreligger i ret-null-mus, tyder på at Ret er vesentlig for migrasjonen og innervasjonen av enteriske neuroner til bakstrengen, og for proliferasjonen og forgreningen av ureterspireepitelet under utviklingen av nyren (Nature 367, 380-383, 1994). Søket etter en nøkkelkomponent av Ret-signaleringsbanen, dvs. Ret-liganden, har vært et område hvor det drives intens forskning.

SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen frembringer et renset og isolert DNA-molekyl som koder for en RetL, med nukleotidsekvensen murin RetL3 (SEKV. ID NR. 17} eller human retL3-cDNA (SEKV. ID NR. 20). Et RetL-protein kan ha en aminosyresekvens omfattende sekvensen av murin RetL3 (SEKV. ID NR. 17) eller human RetL3 (SEKV. ID NR. 21).

Slike rensete og isolerte DNA-molekyler kan anvendes ved sikring av ekspresjon i en prokaryotisk eller eukaryotisk vertscelle av et polypeptidprodukt, minst en del av den primære strukturelle konformasjon og den biologiske aktivitet av RetL, og DNA<*>et kan være a) et DNA-molekyl som omfatter murin retL3-cDNA eller human retL3-cDNA, eller den komplementære kjede av murin retL3-cDNA eller human retL3-cDNA; b) DNA-molekyler som under stringente betingelser hybridiserer til DNA-molekylene som ble nevnt i punkt a) eller fragmenter derav; eller c) DNA-molekyler som, hvis det ikke var for degeneransen av den genetiske kode, ville ha minst 80% sekvensidentitet med DNA-molekylene nevnt under punktene a) og b). Et renset og isolert DNA-molekyl som koder for et polypeptidfragment eller en variant av en human RetL som angitt i krav 1 og som har den biologiske aktivitet av RetL, ligger også innen rammen for oppfinnelsen.

Alle de rekombinante DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen kan kobles operabelt til en ekspresjonsregulerende sekvens.

Også omfattet av oppfinnelsen er vektorer og leverings-systemer som omfatter DNA-molekylene eller konstruksjonene som angitt i krav 6. Vektoren kan omfatte et DNA-molekyl som koder for en RetL eller en variant av en RetL.

Oppfinnelsen omfatter prokaryote eller eukaryote vertsceller som angitt i krav 7, og som er stabilt transformert eller transfisert med en vektor omfattende et DNA-molekyl som koder for en nativ RetL eller en RetL-variant.

En renset og isolert human RetL som er tilnærmet fri for andre humane proteiner, omfattes spesielt av oppfinnelsen, liksom også en fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptidprodukt som har en delvis eller fullstendig primær strukturell konformasjon med, og den biologiske aktivitet av, en RetL. En slik fremgangsmåte kan omfatte trinnene å under egnede kultiveringsbetingelser, dyrke prokaryote eller eukaryote vertsceller som er blitt transformert eller transfisert med et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen, på en slik måte at en ekspresjon av et slikt polypeptidprodukt muliggjøres, og å isolere en RetL. Polypeptidproduktet av ekspresjonen i en prokaryote eller eukaryote vertscelle av et DNA, omfattes også av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen vedrører også proteiner og proteinfragmenter, varianter og avledede produkter, være seg de er oppløselige eller membranbundet. I utvalgte utførelser har proteinet en aminosyresekvens som omfatter murin retL3 eller human retL3, eller en variant av en av disse sekvenser. I andre utførelser er proteinet et fusjonsprotein omfattende Ret eller en RetL, kombinert med et annet molekyl eller molekylfragment, så som et immunoglobulin, toksin, en avbildbar forbindelse eller et radionuklid. Også omfattet er kimære molekyler av RetL.

Andre utførelser av oppfinnelsen omfatter bestemte monoklonale antistoffer mot en RetL ifølge oppfinnelsen. Et slikt antistoff kan være forbundet med et toksin, en avbildbar forbindelse eller et radionuklid. Oppfinnelsen omfatter også hybridomaceller som danner bestemte antistoffer mot Ret, bl.a. AA.FF9, AA.HE3, AF.E9, BA.Bl, BB.B6, AA.GE7, CD.Fil, AH.E3, CD.G4, AG.E7, BD.G6 og BH.G8, samt subkloner av disse hybridomaer, og antistoffene som dannes av disse hybridomaer eller subkloner av disse hybridomaer.

Materialene ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved fremming av vekst av nytt vev, eller fremming av overlevelsen av skadet vev i en pasient, hvor disse materialer vekselvirker med cellulær Ret og dermed induserer autofosforylasjon av Ret. Forbindelsen kan være RetL3, et fragment av en hellengdes RetL eller et antistoff som bindes til Ret. Forbindelsen kan administreres sammen med en terapeutisk virksom mengde av en annen forbindelse, så som GDNF, neurturin eller et GDNF-beslektet molekyl. Mens vev av interesse kan omfatte hvilke som helst vev, omfatter foretrukne vev renalt vev, neuralt vev, hjerte, mage, tynntarm, ryggmarg og lunge. I én utførelse er den aktuelle RetL en oppløselig RetL.

I en mulig fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen hemmes Ret-signaltransduksjonen mellom en første celle, som uttrykker en RetL, og en annen celle, ved å bringe den første celle i berøring med et oppløselig Ret-protein eller med et antistoff mot denne RetL. Det oppløselige Ret-protein kan være et fusjonsprotein.

Materialene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes ved målretting av et toksin, en avbildbar forbindelse eller et radionuklid til en celle som uttrykker Ret, hvor cellen bringes i berøring med et RetL-fusjonsprotein eller et anti-Ret-antistoff som er konjugert med et toksin, en avbildbar forbindelse eller et radionuklid. RetL'en kan være RetL3. Alternativt hemmes veksten av en svulstcelle som uttrykker Ret, hvor ett trinn er å bringe cellen i berøring med et fusjonsprotein av en RetL og et toksin eller radionuklid, eller et anti-Ret-antistoff som er konjugert med et toksin eller radionuklid.

Materialene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes ved målretting av et toksin, en avbildbar forbindelse eller et radionuklid mot en celle som uttrykker en RetL, hvor cellen bringes i berøring med et fusjonsprotein omfattende Ret og et toksin, en avbildbar forbindelse eller et radionuklid, eller et anti-RetL-antistoff som er konjugert med et toksin, en avbildbar forbindelse eller et radionuklid. En annen mulighet omfatter hemming av veksten av en svulstcelle som uttrykker en RetL, omfattende å bringe cellen i berøring med et fusjonsprotein av Ret og et toksin eller radionuklid, eller med et anti-RetL-antistoff som er konjugert med et toksin eller radionuklid.

RetL'en for hvilken som helst av de mulige anvendelsene kan være RetL3, eller en variant eller et fragment av RetL3.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 viser en cDNA-sekvens (SEKV. ID NR. 1) og den avledede aminosyresekvens (SEKV. ID NR. 2) av rotte-RetLl. Nukleotidsekvensen strekker seg fra basepar 201 til basepar 1700 av SEKV. ID NR. 1, og inneholder hele den åpne leseramme. Figur 2A viser en partiell cDNA-sekvens (SEKV. ID NR. 8) og den avledede aminosyresekvens (SEKV. ID NR. 9) av human RetLl. Denne sekvens utgjør innføyelsen av klon HRL20, som ble deponert med betegnelsen ATCC-nr. 97604. Figur 2B viser en sammensatt hellengdes DNA-sekvens (SEKV. ID NR. 10) og den avledede aminosyresekvens (SEKV. ID NR.

11) av human RetLl.

Figur 3A viser en sammenligning av nukleotidsekvensen av human RetLl (øvre linje av sekvensen) og rotte-RetLl-sekvensen (nedre linje av sekvensen). Vertikale linjer mellom nukleotidene angir identitet ved en bestemt posisjon, mens et punktum viser til et mellomrom ved den aktuelle posisjon. Figur 3B viser en sammenligning mellom aminosyresekvensen av human RetLl (øvre linje av sekvensen) og rotte-RetLl-sekvensen (nedre linje av sekvensen). Vertikale linjer mellom tilsvarende aminosyrer angir en identitet ved et bestemt residuum, mens et punktum viser til en konservativ substitusjon ved det aktuelle residuum. Figur 4A er et skjematisk diagram av en mulig rolle for Ret og RetL i vekselvirkningen mellom en metanefrisk mesenkym-celle og en ureterspirecelle. Figur 4B er et skjematisk diagram av en fremgangsmåte ved testing av transfektanter av en cDNA-semling for å finne klonene som uttrykker en RetL. Nærværet av uttrykt RetL på transfektanter påvises ved å bedømme disse transfektanters binding av enten et Ret/IgG-fusjonsprotein eller et Ret/alkalifosfatase-fusjonsprotein. Figur 5 er et skjematisk diagram som viser konstruksjonen av plasmidene som brukes for å uttrykke rotte-Ret/IgG-fusjonsproteinet. Figur 6 er et skjematisk diagram som viser konstruksjonen av plasmidene som brukes for å uttrykke humant Ret/IgG-fusjonsprotein. Figur 7 viser en cDNA-sekvens (SEKV. ID NR. 12} og den avledede aminosyresekvens (SEKV. ID NR. 13) av human RetL2, som forefinnes i klon DSW240. Proteinleserammen foreligger i nukleotidene 25 til 1416. Figur 8 viser en sammenligning mellom aminosyresekvensen av human RetL2 (øvre linje av sekvensen) og human RetLl-sekvensen (nedre linje av sekvensen). Vertikale linjer mellom aminosyrer angir identitet ved en bestemt posisjon, mens et punktum viser til et mellomrom ved den aktuelle posisjon. Figur 9 viser en cDNA-sekvens (SEKV. ID NR. 16) og den avledede aminosyresekvens (SEKV. ID NR. 17) av murin RetL3. Figur 10 viser en cDNA-sekvens (SEKV. ID NR. 20) og den avledede aminosyresekvens (SEKV. ID NR. 21) av human RetL3.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Sekvensidentifikasjonstall

Nukleotid- og aminosyresekvensene som det henvises til i beskrivelsen, har fått tildelt de følgende sekvensidentifikasjonstall:

SEKV. ID NR. 1: rotte-retLl-cDNA

SEKV. ID NR. 2: rotte-RetLl-aminosyre

SEKV. ID NR. 3: oligomer kid-13

SEKV. ID NR. 4: oligomer kid-14

SEKV. ID NR. 5: oligomer kid-15

SEKV. ID NR. 6: ekstracellulær rotte-ret-cDNA

SEKV. ID NR. 7: ekstracellulær rotte-Ret-aminosyre

SEKV. ID NR. 8: partiell human retLl-cDNA

SEKV. ID NR. 9: partiell human RetLl-aminosyre

SEKV. ID NR. 10: human retLl-cDNA

SEKV. ID NR. 11: human RetLl-aminosyre

SEKV. ID NR. 12: human retL2-cDNA

SEKV. ID NR. 13: human RetL2-aminosyre

SEKV. ID NR. 14: partiell murin retL3-cDNA (EST AA50083) SEKV. ID NR. 15: partiell murin RetL3-aminosyre

SEKV. ID NR. 16: murin retL3-cDNA

SEKV. ID NR. 17: murin RetL3-aminosyre

SEKV. ID NR. 18: partiell human retL3-cDNA

SEKV. ID NR. 19: partiell human RetL3-aminosyre

SEKV. ID NR. 20: human retL3-cDNA

SEKV. ID NR. 21: human retL3-aminosyre

Definisjoner

Anvendt heri betyr begrepet "RetL" hvilket som helst protein som vekselvirker spesifikt med reseptorproteinet Ret,

og som når det vekselvirker med Ret, utløser en Ret-dimeri-sasjon og/eller autofosforylasjon av tyrosinkinasedomene av Ret. DNA-sekvensene som koder for RetL og for Ret, benevnes henholdsvis "retL" og "ret". En ligand kan være oppløselig eller foreligge i form av et membranbundet molekyl på samme celle som eller på en annen celle enn Ret-molekylet for hvilket det utløser autofosforylering. I visse anvendelser eller vekselvirkninger med Ret, kan liganden kreve ytterligere molekyler for å utløse autofosforylering. Ligander ifølge oppfinnelsen omfatter koreseptorer eller tilleggs-ligand-kofaktorer. Ligander ifølge oppfinnelsen omfatter ytterligere anti-Ret-mAb'er som virker som Ret-antagoniser idet de utløser Ret-dimerisering og autofosforylering. Liganden kan også være modifisert på forskjellige måter, så som å være innlemmet som en del av et fusjonsprotein, så som med et toksin eller radionuklid.

Med "samstilling av sekvenser" menes plassering av en sekvens, enten en nukleotid- eller aminosyresekvens, med en annen sekvens, for å muliggjøre en sammenligning av sekvensen av relevante partier av én sekvens med den andre. Et eksempel på en fremgangsmåte ved denne prosess beskrives av Needleman et al. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970). Fremgangsmåten kan med fordel implementeres ved hjelp av data-maskinprogrammer, så som "Align"-programmet (DNAstar, Inc.). En fagman vil forstå at homologe eller funksjonelt likeverdige sekvenser omfatter funksjonelt likeverdige anordninger av cysteinresiduene innen det konserverte cysteinskjelett, omfattende aminosyreinnføyelser eller delesjoner som endrer den lineære innretning av disse cysteiner, men som ikke vesentlig endrer deres forhold i den foldede struktur av proteinet. Derfor overses indre mellomrom og aminosyreinnføyelser i kandidatsekvensen med det formål å beregne aminosyresekvenshomogien eller identiteten mellom kandidaten og referansesekvenser. Et kjennetegn som ofte brukes ved bestemmelse av homologien av proteiner, er likheten av antallet og plasseringen av cysteinresiduene mellom det ene protein og det andre.

Med "kloning" menes bruken av in vitro-rekombinasjons-teknikker for å innføye et bestemt gen eller en annen DNA-sekvens i et vektormolekyl. For å lykkes med å klone et ønsket gen, er det nødvendig å bruke fremgangsmåter for generering av DNA-fragmenter, for sammenføyning av fragmen-tene til vektormolekyler, for innføring av det sammensatte DNA-molekyl i en vertscelle hvor det kan repliseres, og for å velge det klon som har målgenet, blant mottakerverts-cellene.

Med "cDNA" menes komplementært eller kopi-DNA som fremstilles ut fra en RNA-sjablong ved innvirkning av RNA-avhengig DNA-polymerase {revers transkriptase). Dermed betyr et "cDNA-klon" en duplisert DNA-sekvens som er komplementær med et aktuelt RNA-molekyl og som bæres i en kloningsvek-tor.

Med "cDNA-samling" menes en samling av rekombinante DNA-molekyler som inneholder cDNA-innføyelser som sammen omfatter en representasjon av mRNA-molekylene som foreligger i en hel organisme eller et vev, avhengig av kilden for RNA-sjablonene. En slik cDNA-samling kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjent for fagmannen og som beskrives i f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, se ovenfor. Generelt isoleres først RNA fra cellene av en organisme av hvis genom det er ønskelig å klone et bestemt gen. Foretrukket for formålene med foreliggende oppfinnelse er cellelinjer fra pattedyr, og spesielt fra mennesker. Alternativt kan RNA isoleres fra en svulstcelle, erholdt fra en dyresvulst, og fortrinnsvis fra en human svulst. Dermed kan en samling fremstilles fra f.eks. en human adrenalsvulst, men hvilken som helst svulst kan brukes.

Brukt heri henviser begrepet "DNA-polymorfisme" til tilstanden hvor to eller flere forskjellige nukleotidsekvenser kan foreligge i en bestemt stilling av DNA.

"Ekspresjonsvektor" omfatter vektorer som har evnen til å uttrykke DNA-sekvenser som foreligger deri, dvs. kode-sekvensene er operabelt bundet til andre sekvenser som har evnen til å bevirke en ekspresjon derav. Det er underfor-stått, selv om det ikke alltid nevnes uttrykkelig, at disse ekspresjonsvektorer må være repliserbare i vertorganismene, enten i form av episomer eller som en iboende del av kromosomalt DNA. Et nyttig, men ikke nødvendig, element av en virksom ekspresjonsvektor er en markørkodende sekvens, hvilket er en sekvens som koder for et protein som fører til en fenotypisk egenskap (f.eks. tetracyklinresistens) av cellene som inneholder proteinet, hvilket gjør det lett å identifisere disse celler. Sammenfattet har "ekspresjonsvektor" en funksjonell definisjon, og hvilken som helst DNA-sekvens som har evnen til å bevirke en ekspresjon av en bestemt innesluttet DNA-kode, omfattes av dette begrep som det anvendes på den angitte sekvens. Slike vektorer foreligger ofte i form av plasmider, og derfor anvendes begrepene "plasmid" og "ekspresjonsvektor" ofte synonymt. Imid-lertid skal oppfinnelsen omfatte slike andre former for ekspresjonsvektorer, bl.a. fager, som ivaretar likeverdige funksjoner og som fra tid til annen kan bli kjent innen faget.

På lignende måte skal begrepet "funksjonelt derivat" av et gen av hvilke som helst proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte "fragmenter", "varianter" og "analoger" av genet, som kan ha en "tilnærmet lignende" nukleotidsekvens, og som koder for et molekyl som har lignende aktivitet.

"GDNF-beslektet molekyl" betyr hvilket som helst molekyl som er minst 40% homologt med enten GDNF eller neurturin og som også har evnen til å spesifikt binde en RetL.

Begrepet "gen" betyr en polynukleotidsekvens som koder for et peptid.

Med "homogen" menes når det henvises til et peptid eller en DNA-sekvens, at den primære molekylære struktur (dvs. sekvensen av aminosyrer eller nukleotider) av tilnærmet alle molekyler som foreligger i den aktuelle sammensetning, er identiske.

Begrepet "oligonukleotid" som anvendt her under henvisning til prober, oligomerfragmenter som skal påvises, kontroll-oligomerer, umerkede blokkerende oligomerer og primere for amplifikasjon av sekvenser, defineres som et molekyl som er satt sammen av flere enn tre deoksyribonukleotider eller ribonukleotider. Dets nøyaktige størrelse vil avhenge av flere faktorer, som i sin tur er avhengige av den endelige funksjon eller bruk av oligonukleotidet.

Begrepet "probe" henviser til en ligand som har kjente egenskaper og som har evnen til å selektivt bindes til en tilsiktet antiligand. Anvendt i sammenheng med nuklein-syrer, henviser begrepet "probe" til en kjede av nukleinsyre hvis basesekvens er komplementær med en tilsiktet kj ede.

"Rekombinante vertsceller" henviser til celler som er blitt transformert med vektorer som er blitt konstruert ved bruk av rekombinante DNA-teknikker. Ifølge definisjonen heri grunner seg antistoffet eller modifikasjonen derav som pro-

duseres av en rekombinant vertscelle, i denne transforma-sjon, heller enn i mindre mengder, eller vanligere, slike ikke påvisbare mengder, som ville produseres av en utrans-formert vert.

Anvendt heri henviser begrepene "restriksjonsendonuklease" og "restriksjonsenzymer" til bakterielle enzymer som hver kutter dobbeltkjedet DNA ved eller nær en bestemt nukleotidsekvens.

Anvendt heri henviser begrepet "restrisjonsenzym-fragment-lengde-polymorfisme" ("RFLP") til forskjellene blant indi-vider i lengden av et bestemt restriksjonsfragment.

Et molekyl sies å være "tilnærmet lignende" et annet molekyl hvis sekvensen av aminosyrene i molekylene er tilnærmet like, og hvis begge molekyler har en lignende biologisk aktivitet. Forutsatt at to molekyler har en lignende aktivitet, anses de dermed være varianter slik dette begrep brukes heri, selv om ett av molekylene inneholder tilleggs-aminosyreresiduer som ikke forefinnes i det andre molekyl, eller hvis sekvensen av aminosyreresiduene ikke er identisk. Anvendt heri sies et molekyl å være et "kjemisk derivat" av et annet molekyl når det inneholder ytterligere kjemiske grupper som normalt ikke er en del av molekylet. Slike grupper kan forbedre molekylets oppløselighet, absorpsjon, biologiske halveringstid osv. Gruppene kan alternativt nedsette molekylets toksisitet, fjerne eller dempe eventuelle uønskede bivirkninger av molekylet osv. Grupper som har evnen til å mediere slike virkninger, beskrives f.eks. i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utg., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

Med "vektor" menes et DNA-molekyl avledet fra et plasmid eller en bakteriofag og som fragmenter av DNA kan innføyes eller klones inn i. En vektor vil inneholde én eller flere ensartede restriksjonsstillinger, og kan ha evnen til en autonom replikasjon i en angitt vert eller vehikkelorga-nisme, slik at den klonede sekvens er reproduserbar.

Med "tilnærmet ren" menes hvilket som helst protein ifølge oppfinnelsen eller hvilket som helst gen som koder for et slikt protein, som er tilnærmet fritt for andre proteiner eller gener, eller for andre forurensninger som eventuelt kan foreligge deri i naturen, og som sådant foreligger i en form som ikke forefinnes i naturen.

Forbindelser ifølge oppfinnelsen

Oppfinnelsen omfatter cDNA som koder for en RetL, så som nukleotidsekvensen av murin retL3-cDNA eller human retL3-cDNA. I tillegg omfatter forbindelsene ifølge oppfinnelsen sekvenser som omfatter de ovennevnte sekvenser, eller som er derivater av en av disse sekvenser med minst 80% sekvensidentitet. Oppfinnelsen omfatter også vektorer, liposomer og andre bærervehikler som omfatter en av disse sekvenser eller et derivat av en av disse sekvenser. Oppfinnelsen omfatter også proteiner som er avskrevet og translatert fra murin retL3-cDNA eller human retL3-cDNA.

Én utførelse av oppfinnelsen omfatter oppløselige varianter av en RetL. Oppløselige varianter mangler minst en del av intramembranpartiet av nativ RetL. I noen eksempler mangler den oppløselige variant fosfatidylinositolglykanbindingen av nativ RetL. Oppløselige varianter omfatter fusjonsproteiner som omfatter derivater av RetL som mangler fosfatidyl-inositol-motivet.

Varianter kan skille seg fra naturlig forekommende RetL med hensyn til aminosyresekvensen eller på måter som ikke omfatter sekvensen, eller på begge måter. Varianter med hensyn til aminosyresekvensen dannes når én eller flere aminosyrer som foreligger i naturlig forekommende RetL, erstattes med en annen naturlig aminosyre, et aminosyre-derivat eller en ikke-nativ aminosyre. Spesielt foretrukne varianter omfatter naturlig forekommende RetL eller biologisk aktive fragmenter av naturlig forekommende RetL, hvis sekvenser skiller seg fra villtypesekvensen ved én eller flere konservative aminosyresubstitusjoner, som vanligvis vil ha en minimal innvirkning på den sekundære struktur og hydrofobe natur av proteinet eller peptidet. Varianter kan også ha sekvenser som skiller seg ved én eller flere ikke-konservative aminosyresubstitusjoner, delesjoner eller inn-føyelser som ikke fjerner den biologiske aktivitet av RetL. Konservative substitusjoner omfatter vanligvis en erstatning av én aminosyre med en annen aminosyre som har lignende egenskaper, så som substitusjoner innen de følgende grupper: valin, glycin; glycin, alanin; valin, isoleucin; asparaginsyre, glutamsyre; asparagin, glutamin; serin, treonin; lysin, arginin; og fenylalanin, tyrosin. De ikke-polare {hydrofobe) aminosyrer omfatter alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin. De polare nøytrale aminosyrer omfatter glycin, serin, treonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer omfatter arginin, lysin og histidin. De negativt ladede (sure) aminosyrer omfatter asparaginsyre og glutamsyre.

Andre konservative substitusjoner fremgår av den følgende tabell, og enda andre beskrives av Dayhoff i Atlas of Protein Sequence and Structure (1988).

Andre varianter ifølge oppfinnelsen er slike med modifikasjoner som øker peptidstabiliteten. Slike varianter kan f.eks. inneholde én eller flere ikke-peptidbindinger (som erstatter peptidbindingene) i peptidsekvensen. Også omfattet er: varianter som omfatter andre residuer enn naturlig forekommende L-aminosyrer, så som D-aminosyrer eller ikke-naturlig forekommende eller syntetiske aminosyrer, så som beta- eller gammaaminosyrer, og cykliske varianter. Inn-lemmelsen av D-aminosyrer istedenfor L-aminosyrer i polypeptidet kan øke dets resistens mot proteaser. Jfr. f.eks. US-patent 5.219.990.

Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også modifiseres ved forskjellige endringer så som innføyelser, delesjoner og substitusjoner, enten konservative eller ikke-konservative, hvor slike endringer kan tilveiebringe bestemte fordeler ved bruk. Spleisevarianter spesielt omfattes av foreliggende oppfinnelse.

I tillegg til tilnærmet hellengdes polypeptider, frembringer foreliggende oppfinnelse biologisk aktive fragmenter av polypeptidene. Et RetL-polypeptid eller fragment er biologisk aktivt hvis det oppviser en biologisk aktivitet av naturlig forekommende RetL. Slike biologiske aktiviteter omfatter evnen til å spesifikt binde det ekstracellulære parti av Ret, med en affinitet som er minst 50% av, og fortrinnsvis er minst lik, affiniteten av naturlig forekommende RetL for det ekstracellulære parti av Ret. En annen biologisk aktivitet er evnen til å bindes til et antistoff som er rettet mot en epitop som foreligger på naturlig forekommende RetL.

I andre utførelser kan varianter med aminosyresubstitusjoner som er mindre konservative, også føre til ønskede derivater, f.eks. ved å forårsake endringer av ladningen, kon-formasjonen og andre biologiske egenskaper. Slike substitusjoner ville f.eks. omfatte erstatning av et hydrofilt residuum med et hydrofobt residuum, erstatning av et cystein eller prolin med et annet residuum, erstatning av et residuum som har en liten sidekjede, med et residuum som har en omfangsrik sidekjede, eller erstatning av et residuum som har en positiv nettoladning, med et residuum som har en negativ nettoladning. Når resultatet av en gitt substitusjon ikke kan forutsies med visshet, kan derivatene lett testes ifølge fremgangsmåtene som beskrives heri, for å bestemme om de ønskede kjennetegn foreligger eller ikke.

Generelt er substitusjoner som kan forventes å indusere endringer av de funksjonelle egenskaper av Ret-polypeptider, slike hvor: (I) et hydrofilt residuum, f.eks. serin eller treonin, erstatter (eller erstattes med) et hydrofobt residuum, f.eks. leucin, isoleucin, fenylalanin eller alanin; (II) et cysteinresiduum erstatter (eller erstattes med) hvilket som helst annet residuum; (III) et residuum som har en elektropositiv sidekjede, f.eks. lysin, arginin eller histidin, erstatter (eller erstattes med) et residuum som har en elektronegativ ladning, f.eks. glutamsyre eller asparaginsyre; eller (IV) et residuum som har en omfangsrik sidekjede, f.eks. fenylalanin, erstatter (eller erstattes med) et residuum som ikke har en slik sidekjede, f.eks. glycin.

Varianter som ligger innen rammen for oppfinnelsen, omfatter proteiner og peptider med aminosyresekvenser som har minst 80% sekvensidentitet med murin RetL3 (SEKV. ID NR.

17) eller human RetL3 (SEKV. ID NR. 21). Mer foretrukket er sekvensidentiteten minst 90 eller minst 95%. For å bestemme identiteten vil lengden av sammenligningssekvensen generelt være minst 8 aminosyreresiduer, vanligvis minst 20

aminosyreresiduer.

På samme måte som det er mulig å erstatte substituenter av skjelettet, er det også mulig å erstatte funksjonelle grupper som er bundet til skjelettet, med grupper som kjenne-tegnes ved lignende egenskaper. Slike modifikasjoner endrer ikke primærsekvensen. Disse substitusjoner vil i utgangs-punktet være konservative, dvs. den erstattende gruppe vil ha tilnærmet lik størrelse, form, hydrofobisitet og ladning som den opprinnelige gruppe. Modifikasjoner utenom sekvensen kan f.eks. omfatte en kjemisk in vivo- eller in vitro-derivatisering av partier av naturlig forekommende RetL, samt endringer av acetylasjonen, metylasjonen, fosforyla-sjonen, karboksylasjonen eller glykosylasjonen.

Også omfattet innen oppfinnelsen er midler som spesifikt bindes til et protein ifølge oppfinnelsen eller et fragment av et slikt protein. Disse midler omfatter Ig-fusjonsproteiner og antistoffer (omfattende enkelt kjede, dobbelt kjede, Fab-fragmenter og andre, være seg de er native, humaniserte, primatiserte eller kimære). Nærmere beskrivel-ser av disse kategorier av midler forefinnes i PCT-søknaden 95/16709.

EKSPERIMENTELLE PROSEDYRER

Oversikt over strategien

Den generelle strategi som brukes for å klone RetLl, vises på figurene 4A og 4B. Vår strategi baserte seg på premissen at i det minste en RetL uttrykkes på den metanefriske mesenkyn av en nyre under utvikling, i form av et membran-protein (selv om det også er mulig at liganden uttrykkes i en oppløselig form, figur 4A). RetL<*>en vekselvirker med Ret-reseptor på ureterspirecellen og aktiverer dens tyro-sinkinasecytoplasmatiske domene og sender et signal til kjernen, som i sin tur aktiverer gener forbundet med veksten og forgreningen av ureterspiren. Derfor kan proteiner som inneholder den ekstracellulære domene av Ret smeltet sammen med enten Fc-partiet av humant immunoglobulin Gl (IgGl) eller alkalifosfatase (AP), anvendes som del av en strategi for å klone RetL som vist på figur 4B. Fusjonsproteinene, ekspresjonssamlingene og andre reagenser som brukes ved kloning av RetLl, skal beskrives i det følgende.

Vi isolerer først cDNA for rotte-RetLl, og bruker dette som en probe for å isolere cDNA for human RetLl. cDNA<*>er isoleres deretter for RetL2 og RetL3.

Generering av reagenser som er nødvendige for en direkte ekspresjonskloning av Ret- ligander 1. Isolasjon av cDNA som koder for ekstracellulær domene av rotte-Ret

For å identifisere RetLl genereres fusjonsproteiner som består av de ekstracellulære domener av Ret fra enten rotte eller menneske, smeltet sammen med et protein, som i ett eksempel er det humane Fc-parti av IgGl og i et annet eksempel er alkalifosfatase. Begge fusjonspartnere kan lett fremvises for å påvise celler som uttrykker liganden som vist på figur 4B.

Fordi cDNA som koder for rotte-Ret aldri er blitt beskrevet, isolerer vi et cDNA som koder for den ekstracellulære domene av rotte-Ret-reseptor ved bruk av metoden med revers transkriptase/polymerasekjedereaksjon (RT-PCR). Vi sammen-ligner de to nukleotidsekvenser for humant (Genbank-til-gangsnumre M57464 og X15262) og murint (Genbank-tilgangs-nummer X67812) ret, og konstruerer oligonukleotidprimere ut fra partier som har en høy identitetsgrad mellom de to sekvenser. En senseoligomer som benevnes kid-013 (SEKV. ID NR. 3, inneholder nukleotidene 150-169 av Genbank-sekvensen X15262), velges fra 5"-ende av human ret-cDNA-sekvensen som overlapper ATG-initieringskodonet. Den omfatter nukleotider i sin 5<*->ende som koder for en Notl-restriksjonsstilling, med kloningshensikt. To antisenseoligomerer som benevnes kid-014 (SEKV. ID NR. 4; inneholder komplementet av nukleotidene 1819-1839 av Genbanksekvensen M57464) og kid-015 (SEKV. ID NR. 5; inneholder komplementet av nukleotidene 1894-1914 av Genbanksekvensen X67812), velges fra henholdsvis den humane og murine cDNA-sekvensen umiddelbart i retning av 5' fra sekvensene som koder for den transmem-brane domene. Oligomerene kid-014 og kid-015 inneholder ytterligere nukleotider i sine 5'-ender, som koder for en Sall-restriksjonsstilling med kloningshensikt.

Det samlede RNA isoleres fra nyren av en 14 dagers rotteembryo, og mRNA renses ved bruk av oligo-dT-kromatografi. mRNA omdannes til cDNA ved bruk av AMV-revers transkriptase, og cDNA omdannes til dobbeltkjedet cDNA og amplifise-res ved bruk av Taq-polymerase i en standard polymerase-kjedereaksjon med oligomerene kid-013 og kid-015. Syntesen av et 1942 bp langt PCR-fragment bekreftes ved å føre en alikvot av PCR-reaksjonen på en 1% agarosegel. Resten av PCR-fragmentet spaltes med Noti og Sali og klones inn i pSAB132 som på forhånd er blitt spaltet med Noti og Sali. Det dannede plasmid benevnes pJCOll. Hele innføyelsen i plasmidet pJCOll som foreligger mellom Noti- og Sall-stil-lingene, sekvenseres, og vises i form av ekstracellulært rotte-ret-cDNA, dvs. SEKV. ID NR. 6. En translasjon av denne sekvens viser peptidsekvensen (SEKV. ID NR. 7) for ekstracellulært rotte-Ret. Fordi oligomerene for PCR ble valgt fra humane og musesekvenser av ret, er det mulig at nukleotidsekvensen som vises å være ekstracellulært rotte-ret-cDNA, og peptidsekvensen som vises å være ekstracellulært rotte-Ret, kan skille seg fra de naturlige rotte-ret-nukleotid- og Ret-peptidsekvenser i områdene av kid-013- og kid-015-sekvensene. Deretter isoleres ret-cDNA-kloner fra en cDNA-samling av rotteembryonyrer fra dag 18, og noen få nukleotidendringer observeres i primerområdene, hvilket fører til to aminosyreendringer. Én endring er i signal-sekvensen (arginin i stilling 5 erstattet med treonin), og én endring er nær enden av den ekstracellulære domene (glutamsyre i stilling 633 erstattet med alanin). Ingen av disse endringer skulle påvirke ligandbindingen.

2. Ret/IgG-fusjonsproteiner

Fusjonsproteiner genereres bestående av de ekstracellulære domener av rottens (aminosyreresiduer nr. 1-637) og human (aminosyreresiduer nr. 1-636) Ret-reseptorer smeltet sammen med Fc-partiet av humant IgGl.

Konstruksjonen av plasmidene som brukes for å uttrykke rotte-Ret/IgG-fusjonsproteinet, vises skjematisk på figur 5. For å konstruere et gen som koder for rotte-Ret/IgG-fusjonsproteinet, spalter vi pJCOll (beskrevet ovenfor) som inneholder den ekstracellulære domene av rotte-Ret, med Sali, og ligerer dette med et 700 bp langt Sall-fragment fra plasmid 2-4, for å danne plasmidet pJC012. Dette Sall-fragment inneholder en del av Fc-domene av humant IgGl som opprinnelig ble avledet fra plasmidet pSAB144. Plasmidet 2-4 ble dannet på forhånd ved en treveis ligering: et Notl-Sall-fragraent som ble generert ved PCR og inneholder den ekstracellulære domene av kanin-TGF-beta type II-reseptor, et 693 bp langt Sall-Notl-fragment fra pSAB144 som inneholder en del av Fc-domene av humant IgGl, og Notl-spaltet pSAB132. Som vist på figur 5, kan et fragment som inneholder Fc-domene, frigjøres fra plasmidet 2-4 i form av et 700 bp langt Sall-fragment. pJC012 transfiseres inn i COS-celler, og rotte-Ret/IgG-fusjonsproteinet isoleres fra mediet 48 timer senere ved bruk av kromatografi med Protein A-Sepharose. For å danne en stabil cellelinje som produserer rotte-Ret/IgG-proteinet, isoleres det 2612 bp lange Notl-fragment fra pJC012 som inneholder det fullstendige rotte-Ret/IgG-fusjonsprotein, og klones inn i Notl-stillin-gen av ekspresjonsvektoren pMDR901. Det dannede plasmid benevnes pJC022. Plasmidet pJC022 transfiseres inn i CHO-celler for å generere stabile cellelinjer. Cellelinjen som har den høyeste produksjon, suspensjonstilpasses. Vanlige utbytter for CHO-linjen som produserer rotte-Ret/IgG, er 75 mg/l.

Konstruksjonen av plasmider som brukes for å uttrykke human Ret/IgG-fusjonsprotein, vises skjematisk på figur 6. For å konstruere et gen som koder for human Ret/IgG-fusjonsprotein, erverver vi et plasmid som inneholder cDNA som koder for human Ret-reseptor, fra Dr. M Takahashi {Department of Pathology, Nagoya University, School of Medicine, Nagoya, Japan). Et PCR-fragment genereres fra dette plasmid ved bruk av oligomerene kid-013 og kid-014. PCR-fragmentet behandles med Klenows fragment, etterfulgt av spaltning med Noti for å danne et PCR-fragment med en klebrig Notl-ende og en butt ende. Dette fragment klones inn i vektoren pGEMllzf(+) som på forhånd er blitt spaltet med EcoRl, behandlet med Klenows fragment og spaltet med Noti, for å generere en klebrig Notl-ende og en butt ende. Det dannede plasmid benevnes pJC013. Det 1916 bp lange Notl-Sall-fragment fra pJC013 isoleres etter en fullstendig spaltning med Noti og en delvis spaltning med Sali, og ligeres til det 693 bp lange Sall-Notl-fragment fra pSAB144 som inneholder en del av Fc-domene av humant IgGl, og pSAB132-ekspresjonsvektoren som er spaltet med Noti. Det dannede plasmid benevnes pJC015. Innføyelsen i plasmidet pJC013 sekvenseres, og viser seg å omfatte én enkelt nukleotidforskjell, som endrer én aminosyre i det ekstracellulære domene av human Ret (Genbank-sekvens M57464 har et C i posisjon 812, mens pJC013 har et T i den tilsvarende posisjon, og dette fører til en endring av aminosyren fra alanin til valin i posisjon 294 av human Ret-proteinsekvensen). Dette nukleotid korrigeres tilbake til C-residuet som angis av Genbank-sekvensen M57464, ved stillingsspesifikk mutagenese av plasmidet pJC013, hvorved man danner plasmid pJC023. Et 585 bp langt BstE2-fragment fra pJC023, som inneholder den reparerte nukleotidsekvens, isoleres og klones inn i plasmidet pJC015, fra hvilket man har fjernet det 585 bp lange BstE2-fragment som inneholder det endrede nukleotid. Det nye plasmid benevnes pJC024. Det 2609 bp lange Notl-fragment fra pJC024, som inneholder det fullstendige humane Ret/IgG-fusjonsprotein, isoleres og klones inn i Notl-stil-lingen av ekspresjonsvektoren pMDR901. Det dannede plasmid benevnes pJC025. Plasmidet pJC025 transfiseres inn i CHO-celler for å generere stabile cellelinjer. Cellelinjen med den høyeste produksjon suspensjonstilpasses. Vanlige utbytter for CHO-linjen som produserer human Ret/IgG, er 6 mg/l.

Ytterligere detaljer om produksjonen av vektorene som brukes i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, angis i PCT-søk-nadene 94/01456 og 92/02050.

3. Bioaktivitet av Ret/IgG-fusjonsproteinene

For å bestemme om Ret/IgG-fusjonsproteinene som vi produserer, er bioaktive og dermed ville være gode testmidler for kloning av en RetL, utfører vi flere organkulturtester for å bestemme bioaktiviteten. Organkulturtesten omfatter å dyrke nyre fra rotteembryo fra dag 13-14 i organkultur i 3-5 dager i nærvær av Ret/Ig-fusjonsproteinet i konsentrasjo-nen 50 ug/ml. Nyrene dyrkes også i nærvær av LFA-3TIP/IgG eller vehikkelbuffer. Etter dyrkingsperioden farges enkelte av nyrene med det fluorescerende lektin "Dolichos Biflorus Agglutinin" (DB-lektin), som farger samletraktvevene, som er eptitelceller avledet fra ureterspiren. Disse "DB"-positive celler merker de Ret-positive celler, fordi Ret uttrykkes i ureterspiren og dennes epitele derivater. Dette gir en grov vurdering av Ret/IgG-fusjonsproteinet på veksten og utviklingen av embryonyren. Det foreligger en klar forskjell i samletraktmorfologien og veksten mellom nyrer som ble dyrket med LFA-3TIP og slike som ble dyrket med rotte-Ret/IgG-fusjonsprotein. De Ret/IgG-behandlede nyrer har samletrakter som viser vesentlig mindre forgrening, og har vanligvis en mindre samlet størrelse.

Parafinsnitt prepareres fra andre nyrer for en histologisk undersøkelse. Embryonyrer behandles med kontrollbuffer eller med Ret/IgG og farges deretter med hematoksylin og eosin. Den Ret/Ig-behandlede embryonyre oppviser mindre forgrening av samletraktene enn kontrollbufferbehandlede embryonyrer. I tillegg har Ret/IgG-behandlede nyrer færre tubuli. Vi har også observert denne virkning med humant Ret/IgG-fusjonsprotein. Disse observasjoner er forenelige med at fusjonsproteinene blokkerer det induktive signal mellom mesenkym og ureterspiren. Derfor trekker vi den kon-klusjon at fusjonsproteinet er et godt reagensmiddel for kloning av en RetL.

4. Ret/alkalifosfatase-fusjonsprotein

Reseptor/alkalifosfatase- (AP)-fusjonsproteiner er blitt brukt med fremgang for å identifisere og klone ligander for c-kit (Cell 63: 185, 1990), ligander for medlemmer av eph-familien av orphan-reseptorer (Cell 79: 157, 1994) og nylig for å klone en reseptor for leptin, som er produktet av ob-genet (Cell 83: 1263, 1995). Plasmider som koder for rotte-Ret /AP- f us jonsproteinet, konstrueres, og rotte-Ret/AP-proteinet produseres i COS7-celler i cellefabrikker. Deretter genereres en stabil NIH3T3-cellelinje som uttrykker gjen-nomsnittlig 10 mg/l fusjonsprotein. SDS-PAGE-analyse av rotte-Ret/AP-proteinet antyder at dets størrelse stemmer overens med den forutsagte molekylvekt, og gelfiltrasjons-analyse tyder på at det dannes i form av en dimer. En delvis rensing oppnås ved affinitetskromatografi på en anti-AP-kolonne.

5. Anti-Ret-antistoffer

Et polyklonalt kaninantistoff genereres mot rotte-Ret/IgG-fusjonsproteinet. Antistoffet virker på "western blots", FACS-analyse av Ret-positive cellelinjer og immunohisto-kjemi av embryonyresnitt.

Et panel av hamster-anti-rotte-Ret-monoklonale antistoffer genereres. Rotte-Ret/IgG-fusjonsprotein som er koblet sammen med Protein A-Sepharose, brukes for å immunisere armen-ske hamstere. 316 kloner erholdes etter fusjonen, og testes for sin evne til å binde rotte-Ret-fusjonsproteiner og/eller humant IgG i et ELISA-assay. 11 kloner produserer antistoffer som kun bindes til rotte-Ret/IgG (og rotte-Ret /AP) , men ikke til humant IgG. Kryssreaktiviteten med humant Ret testes ved FACS, og fire kloner produserer antistoffer som kan bindes til den Ret-positive humane cellelinje THP-1. I den følgende tabell sammenfattes Ret-bin-dingsegenskapene av tolv monoklonale antistoffer.

6. cDNA-Ekspresjonssamlinger

Vi fremstiller cDNA-samlinger fra rotteembryonyre, én i CDM8-vektor som benytter seg av SV40-opphavet for amplifikasjonen, og én i en modifisert InVitrogen-vektor, nemlig pCEP4, som benytter seg av EBV-opphavet for amplifikasjonen. Fra denne modifiserte vektor, nemlig CH269, har man fjernet EBNA-l-gensekvensen. EBNA-l-proteinet vekselvirker med EBV-opphavet, men genet er ikke nødvendig i vektoren når cellene brukes for å stabilt uttrykke EBNA-proteinet. Samlingen i CDM8-vektor inneholder 1,5 x IO<6> kloner med en midlere innføyelsesstørrelse på 1,18 kb, mens samlingen i CH269-vektor inneholder ca. lx IO<6> kloner med en midlere innføyelsesstørrelse på 1,5 kb.

Ekspresjonskloning av Ret- liqanden RetLl

A. Kloning av rotte-Ret-liganden RetLl

1. Første forsøk pa ekspresjonskloning av Ret- liganden RetLl

Et antall direkte ekspresjonsmetoder er blitt prøvd for å klone RetLl. Alle disse metoder baserer seg på konseptet som illustreres på figur 4B. cDNA fra en cDNA-samling inn-føres i pattedyrceller, og cellene som mottar RetLl, kan identifiseres ved bruk av Ret-fusjonsproteinene. Selv om de tre fremgangsmåter som skal beskrives i det følgende, ikke var fremgangsrike, vant man viktige innsikter og eksper-tise, som ble brukt i en senere fremgangsmåte som møtte fremgang.

a. Vaskemetode med Ret/ IgG: Rotte-Ret/IgG-fusjonsproteinet brukes i et forsøk på å isolere RetLl ved direkte ekspresjonskloning ved bruk av en vaskemetode {Aruffo og Seed, Proe. Nati. Acad. Sei. 84: 8753-8757 (1987)). En cDNA-samling fra rotteembryonyre fra dag 18 i CDM8 brukes for vas-keforsøket. Puljer av cDNA fra denne samling (5.000-10.000 cDNA'er pr. pulje) innføres i COS-celler ved bruk av DEAE-

dekstranaretoden. Etter 48 timer fjernes cellene fra platene med EDTA, inkuberes med fusjonsproteinet og vaskes deretter på plater som er bestrøket med anti-humant IgG-antistoff. DNA isoleres fra celler som kleber fast, transformeres tilbake til E. coli og isoleres deretter for en andre vaskerunde. Vi kan etter den tredje vaskerunde ikke se noen celler som bindes, og det erholdes meget få kloner etter transformasjonen av Hirt-DNA'et tilbake til E. coli. Et VCAM-cDNA som brukes sammen med et anti-VCAM-monoklonalt antistoff som en positivkontroll, kunne bare fortynnes til forholdet 1:100 og fortsatt påvises, hvilket tydet på at våre puljestørrelser sannsynligvis var for store. En analyse av enkelte av klonene som ble erholdt etter den andre vaskerunde, tyder på at klonene gjennomgår en omstilling og delesjon.

b. Preparativ FACS- metode med Ret/ IgG: 80.000 cDNA-kloner fra samlingen fra rotteembryonyre fra dag 18 {CDM8-vektor) innføres i COS7-celler og underkastes preparativ FACS ved bruk av rotte-Ret/IgG-proteinet etterfulgt av et fluor-merket sekundært antistoff. De øvre 0,5% og 0,9% fluorescerende celler puljes samlet, og plasmid-DNA<*>et isoleres ved Hirt-lysis. DNA<1>et elektroporeres tilbake til E. coli: det erholdes 228 kloner for 0,5%-puljen og 752 kloner for 0,9%-puljen. DNA isoleres fra de bakterielle kloner, og en andre runde med preparativ FACS utføres. Plasmider isolert fra bakterielle kloner etter den andre runde, analyseres, og viser seg å inneholde store delesjoner og omplasseringer. c. Kolorimetrisk påvisninqsmetode med Ret/ AP: COS-celler transfiseres med 400 puljer av cDNA-klonene {1.000 kloner pr. pulje) fra cDNA-samlingen (CDM8-vektor) fra rotteembryonyre fra dag 18, og farges med Ret/AP-protein og et kolorimetrisk substrat for alkalifosfatase. De transfiserte celler undersøkes under et mikroskop for å påvise positive signaler. I ett eksperiment ble fem potensielle positive kloner gjenanalysert, men de testet alle negative.

Som en kontroll for Ret/AP-proteinet produseres et VCAM/AP-protein ved a smelte sammen de første to domener av humant VCAM med N-terminus av placenta-AP. (VCAM bindes til inte-grinet VLA4, som består av to kjeder, nemlig alfa-4 og beta-1.) Forbigående transfeksjoner av COS-celler gir til-strekkelig VCAM/AP-protein for å utføre kontrolleksperimen-ter. VCAM/AP-proteinet sammenlignes med VCAM/IgG som er direkte koblet til AP, og med VCAM/IgG plus et AP-koblet sekundært antistoff, for å bedømme deres evne til å påvise VLA4 på COS-celler som er blitt transfisert med alfa-4-kjede-cDNA (COS-celler uttrykker allerede beta-l-kjeden). Resultatene viser at mens VCAM/AP-proteinet kunne påvise VLA4 på transfiserte celler, oppnås den beste påvisning med VCAM/IgG-proteinet i kombinasjon med et AP-koblet sekundært antistoff.

d. Metodologiske konklusjoner:

Tre hovedkonklusjoner ble trukket etter disse første klo-ningsforsøk: 1) Metoder som gjør det nødvendig å isolere plasmid-DNA for senere runder (dvs. vasking og preparativ FACS), er ikke egnet når rikdommen av mål-cDNA er lav, grunnet omplasseringer og delesjoner som finner sted under disse følgende runder. På grunnlag av den lave ekspresjon av Ret, er det god grunn til å tro at ekspresjonen av RetLl også vil være lav. Den foretrukne fremgangsmåte er å transfisere i puljer og å bruke en påvisningsmetode som tillater iden-tifikasjonen av en positiv pulje. Den opprinnelige pulje kan deretter deles opp uten noe behov for å isolere det forbigående uttrykte DNA fra transfiserte celler. 2) Ret/Ig-proteinet gir når det er koblet til et sekundært reagensmiddel, en bedre påvisningsevne enn Ret/AP-proteinet. 3) Kontroileksperimenter med et VCAM/IgG-kontrollprotein (og et AP-koblet sekundært antistoff) og alfa-4-integrin-cDNA (fortynnet inn i CDM8-vektor og transfisert inn i COS-celler) viser at vår påvisningsevne er kun ca. 1 pr. tusen (dvs. puljestørrelsen får ikke overskri 1.000 kloner). For å oppnå et forbedret nivå for følsomheten, skiftet vi fra en SV40-opphavs-basert vektor (uttrykt i COS-celler) til en EBV-opphavsbasert vektor (uttrykt i EBNA-positive cellelinjer) . EBV-opphavsbaserte vektorer opprettholdes som episomer, og er ikke like toksiske for cellen som de SV40-opphavs-baserte vektorer etter amplifikasjonen. Det foreligger betydelige tegn på at gener kan uttrykkes i høyere nivåer i disse vektorer, og at cDNA'er kan fortynnes enda mer (dvs. opptil 1 til 80.000) og fortsatt påvises.

2. Testing av puljer fra den EBV- opphavsbaserte cDNA- samling

Vi tester puljer av kloner fra cDNA-samlingen av rotteembryonyre fra dag 18 (CH269-vektor med EBV-opphav) med rotte-Ret/IgG-fusjonsproteinet. I ett eksperiment genereres 256 puljer som hver inneholder 5.000 kloner fra samlingen. Kort sagt titreres en alikvot av cDNA-samlingen, 5.000 celler spres på plater (256 ganger) og får vokse over natten. Koloniene skrapes inn i medium, og en del av kulturen brukes for å generere en glycerolstam for puljen (lagres ved

-70°C), og en del brukes for en plasmidpreparering. DNA fra de 256 puljer transfiseres individuelt inn i 293/EBNA-celler (8 x IO<5> på en 60 mm plate) ved bruk av lipofeksjonsmetoden. Etter 48 timer vaskes cellene to ganger med HBHA-buffer (0,5 mg/ml BSA, 0,1% NaN3, 20 mM HEPES (pH 7,0)) og inkuberes med 20 ug/ml rotte-Ret/IgG i Tris-bufret saltvann plus 1 mM MgCl2 og CaCl2 i 60-90 minutter ved romtemperatur. Etter denne inkubasjon vaskes cellene fire ganger med HBHA-buffer og fikseres deretter med 60% aceton/3% formaldehyd/20 mM HEPES (pH 7,0) i 30 sekunder. Etter to vaskinger med HBS-buffer (150 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7,0)), inkuberes cellene med et AP-koblet sekundært antistoff (geite-anti-humant IgG Fc-gamma-spesifikt F(ab')2 (Jackson Immuno Research Laboratories, katalog-nr. 109-056-098, 1:5000-fortynning i Tris-bufret saltvann plus 1 mM MgCl2 og

CaCl2) i 60 minutter ved romtemperatur. Cellene vaskes deretter to ganger med HBS-buffer og to ganger med AP-substratbuffer (100 mM Tris-HCl (pH 9,5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCIa) som inneholder 2X "Immuno Pure" fosfatasehemmer fra Pierce (katalog-nr. 35002). Den siste vaskingen får stå i 15 minutter. AP-substratene NBT (0,33 mg/ml) og BCIP (0,17 mg/ml) tilføres deretter i AP-substratbuffer som inneholder AP-hemmeren fra Pierce, og inkuberes med cellene i 5-20 minutter. Platene vaskes deretter to ganger med vann. Platene inspiseres deretter under et dissekeringsmikroskop for å bestemme om det foreligger lillafargede celler.

I en analyse av de 256 puljer identifiseres 17 positive puljer i den primære testing. DNA fra hver positive pulje gjentransfiseres inn i 293/EBNA-celler, og fremgangsmåten ovenfor gjentas sammen med noen ytterligere kontroileksperimenter for å bekrefte at den observerte farging er Ret/IgG-spesifikk. 10 av de 17 positive puljer oppviser farging kun med Ret/IgG-fusjonsprotein, og ikke med et annet IgG-fusjonsprotein.

3. Oppdeling av pulje nr. 230

Som et eksempel deles en av de ovenfor beskrevne puljer som testet positive, benevnt nr. 230, opp i mindre delpuljer for å identifisere cDNA'et innen puljen som formidler en binding til Ret/IgG-fusjonsproteinet. 600 celler fra glyceroistammen for pulje nr. 230 spres på plater (10 ganger) og dyrkes over natten. Kolonier på disse plater skrapes inn i medium: 1/10 av kulturen brukes for å generere en glycerolstam, og resten brukes for en DNA-preparering. De ti delpuljer med 600 kloner hver benevnes 210-1A til 230-5A og 230-1B til 230-5B. DNA fra disse delpuljer transfiseres inn i 293/EBNA-celler, og fremgangsmåten som ble beskrevet ovenfor for farging med Ret/IgG-fusjonsproteinet gjentas. Én delpulje, nemlig nr. 230-5A, tester positiv for farging med Ret/IgG-proteinet.

Pulje nr. 230-5A deles ytterligere opp for å identifisere cDNA'et i denne delpulje som formidler en binding til Ret/IgG-fusjonsproteinet. Celler fra glycerolstammen av samlingen 230-5A spres på plater og dyrkes over natten. Kolonier plukkes inn i brønner av syv 96-brønners "Bioblocks" og dyrkes over natten. Fra hver 96-brønners "Bioblock" lages 4 puljer med 20 kloner og 1 pulje med 16 kloner. Dermed genereres 35 puljer fra de syv "Bioblocks" som benevnes 230-5A-71 til 230-5A-105. DNA prepareres fra hver av disse puljer og transfiseres inn i 293/EBNA-celler og testes igjen med Ret/IgG-fusjonsproteinet som beskrevet ovenfor. Pulje nr. 230-5A-86 tester positiv.

Pulje nr. 230-5A-86 deles opp ved å gå tilbake til Bioblok-ken og å identifisere de 20 kloner som ble blandet sammen for å danne denne pulje. DNA lages fra alle disse 20 kloner og transfiseres enkeltvis inn i 293/EBNA-celler og testes igjen for Ret/IgG som beskrevet tidligere. Pulje nr. 230-5A-86-17 viser seg å teste positiv.

4. Karakterisering av klon nr. 230- 5A- 86- 17

Klon nr. 230-5A-86-17 (benevnt retL-17 eller klon 17, og deponert med betegnelsen ATCC 98047) analyseres ytterligere ved DNA-sekvensering. Den fullstendige nukleotidsekvens av innføyelsen i denne klon er SEKV. ID NR. 1 (rotte-retLl-cDNA), og en del av nukleotidsekvensen vises på figur 1. Innen denne nukleotidsekvensen finner vi en leseramme som koder for et protein på 468 aminosyrer (rotte-RetLl). Det forutsagte protein har en signalsekvens med en forutsagt spaltning etter aminosyre 24 (Von Heijne et al., Nucl. Acid Res. 14: 14683 (1986)). Den hydrofobe C-terminus tyder på at proteinet kan være bundet til cellen via en fosfatidyl-inositolglykanbinding. Det finnes tre forutsagte N-bundne glykosylasjonsstillinger. Disse egenskaper er i overens-stemmelse med hva som forventes for en ligand for Ret.

Vi kan uttrykke oppløselige former av rotte-RetLl-proteinet ved å avkorte genet foran den hydrofobe C-terminus. Dette kan f.eks. utføres ved avkorting etter Lysin 435 (rotte-RetLl). En avkorting oppstrøms for denne aminosyre bør også føre til en oppløselig form av rotte-RetLl-proteinet. Det oppløselige rotte-RetLl-protein kan uttrykkes for seg selv eller i form av en fusjon med et humant immunoglobulin, en histidinmarkør eller en liten epitop som gjenkjennes av et antistoff.

B. Kloning av human Ret-ligand RetLl

En cDNA-samling av human embryonyre i vektoren lambda gt10 erverves fra Clontech (katalog-nr. HL5004A). Én million plakkdannende enheter fra fagstammen spres på 10 "Nunc"-plater. To plakkløft utføres på Schleicher- og "Schuell Optitran"-filtere.

En probe genereres ved å spalte plasmid-rotte-RetLl med restriksjonsenzymet PvuII, etterfulgt av en isolasjon på agarosegel av et 1,34 kb langt fragment som tilsvarer nt 242-1582 av rotte-RetL-nukleotidsekvensen (rotte-retLl-cDNA). Denne kodeområdeproben merkes med P<32> ved tilfeldig priming (Feinberg og Vogelstein, Anal. Biochem. 137: 266-267, 1984). Filtrene hybridiseres over natten i 300 ml plakktest-PSB-buffer (50 mM Tris pH 7,5, IM NaCl, 0,1% natriumpyrofosfat, 0,2% PVP og 0,2% Ficoll) som inneholder 10% dekstransulfat, 100 ug/ml tRNA og 6,7 x 10<7> CPM av rotteproben, ved 55°C. De vaskes to ganger med plakktestbuffer og to ganger med 2XSSC/1% SDS ved 55°C, og eksponeres på film ved -70°C med en intensiveringsduk.

Duplikater av positive kandidater overføres fra hovedplatene til SM (100 mM NaCl, 10 mM S04, 50 mM Tris pH 7,5) plus gelatin. 24 av disse positive kandidater plakkrenses. Lambda-miniprep-DNA fra de rensede kandidatplakker spaltes med Noti, elektroforeseres på 1% agarosegel og underkastes "southern blot". "Southern blod-produktet hybridiseres med rotte-rotte-RetLl-kodende regionproben. Klonen HRL20 har den lengste innføyelse (4,4 kb), som hybridiserer intenst med rotteproben. DNA-sekvensen (partiell human retLl-cDNA, SEKV. ID NR. 8, figur 2A) og den avledede peptidsekvens (partiell human RetLl, SEKV. ID NR. 9, figur 2A) er blitt erholdt for denne klon, og bekreftet at den er den humane homolog. Denne klon koder for hovedparten av det kodende parti, omfattende 3'-ende av det kodende parti.

For å erholde 5'-ende av humant cDNA, erverves et cDNA-sett for human føtal nyre, "Marathon-Ready" fra Clontech (katalog-nr. 7423-1). Antisenseoligonukleotidene Kid-155, som tilsvarer komplementet av nukleotidene 62-81 av SEKV. ID NR. 8 (partiell human retLl-cDNA) og Kid-154, som tilsvarer komplementet av nukleotidene 17-43 av SEKV. ID NR. 8 (partiell human retLl-cDNA) syntetiseres. PCR utføres ved bruk av cDNA-PCR-settet "Advantage" (Clontech, katalog-nr. 8417-1) i kombinasjon med cDNA-reagensmidlene "Marathon" og oligonukleotiden Kid-155 eller Kid-154. Den første PCR-reaksjon stilles opp som følger: 35,5 ul H20, 5,0 um 10X KlenTaq-buffer, 1,0 ul 10 mM dNTP-blanding, 1,0 ul 50X "Advantage" KlenTaq-polymeraseblanding. Disse reagensmidler slås sammen og blandes. Deretter tilføres 5,0 ul "Marathon-Ready" føtalt nyre-cDNA, 1,0 ul 10 uM APl-primer og 1,5 ul 6,4 uM Kid-155 (endelig volum = 50 ul). PCR utføres i en "Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480" med de følgende syklusbetingelser: 1 syklus med 94°C i 1 min., 30 sykluser med 94°C i 30 sek. og 55°C i 30 sek., 68°C i 4 min. En nestet PCR utføres ved bruk av produktet av den første PCR-reaksjon. Først fortynnes 5 ul av PCR-produkt nr. 1 50 ganger med TE (endelig volum 250 ul). Den nestede PCR-reaksjon inneholder 35,5 ul H20, 5,0 ul 10X KlenTaq-buffer, 1,0 ul 10 mM dNTP-blanding, 1,0 ul 50X "Advantage" KlenTaq-polymeraseblanding. Disse reagenser blandes som beskrevet ovenfor. 5,0 ul fortynnet PCR-produkt nr. 1, 1,0 ul 10 uM AP2-primer og 1,5 ul 6,9 uM Kid-154 tilsettes deretter. Syklusbetingelsene er de samme som ovenfor. Det dannede produkt med ca. 700 bp lengde isoleres på en 1% lavsmeltende agarosegel og ekstraheres med fenol. Det isolerte DNA klones inn i EcoR5-stillingen av "pZErO" (Invitrogen, katalognr. K2510-01). Sekvensinformasjon erholdes fra flere isolater, bl.a. klonene som benevnes HRL7G6 og HRL7G8.

Sekvensene som erholdes fra klon HRL7G8, viser seg å overlappe med sekvensen av klon HRL20 (partiell human retLl-cDNA), og brukes for å generere en hellengdes sekvens av human RetLl (hellengdes human retLl-cDNA), også vist på figur 2B. Nukleotidsekvensen som erholdes fra klon HRL7G8, representerer nukleotidene 1-502 av hellengdes human retLl-cDNA, og nukleotidsekvensen fra klon HRL20 representerer nukleotidene 460-1682 av hellengdes human retLl-cDNA. Sekvensen fra klon HRL7G8 bekreftes ved sekvensering av en annen cDNA-klon (GJ102) som ble isolert fra human embryonyre-lambda gtlO-cDNA-samlingen som ble beskrevet ovenfor, ved bruk av en probe avledet fra klonen HRL7G6. Nukleotidene 118-1497 omfatter proteinleserammen av hellengdes human retLI-cDNA.

Den fullstendige aminosyresekvens av human RetLl vises også på figur 2B. Som vist med BESTFIT-analysen som er avbildet på figur 3A, er human retLl-cDNA 88,2% identisk med rotte-retLl-cDNA. Peptidsammenligningen (figur 3B) viser at den tenkte humane peptidsekvens er 93,3% identisk med, og 97,2% lignende som sekvensen fra rotte.

Kloning av Ret- ligand RetL2

A. Kloning av human RetL2

Peptidsekvensen av rotte-RetLl (rotte-RetLl) brukes for å gjennomsøke GenBank-databasen med programmet "BLAST" for å identifisere beslektede proteiner (dvs. isologer). "BLAST", dvs. "Basic Local Alignment Search Tool", benytter seg av metoden til Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990) for å søke etter likheter mellom en søksekvens og alle sekvensene som foreligger i sekvensdatabasen. Søk-sekvensen og databasen som skal gjennomsøkes, kan være enten peptid eller nukleotid, i hvilken som helst kombinasjon. Når rotte-RetLl-peptidsekvensen forespørres om i nuk-leotiddatabasen "Expressed Sequence Tag" (EST), erholdes to signifikante motstykker. Det ene har GenBank-tilgangsnumme-ret R02249 og er et 229 bp langt EST fra en kombinert human føtal lever- og milt-cDNA-samling, og det andre har Genbank-tilgangsnummeret H12981 og er et 521 bp langt EST fra human barnehjerne-cDNA-samling. De to EST<*>er har 99% identitet i et overlappingsområde, hvilket tyder på at de stammer fra samme cDNA. Oligonukleotider genereres fra H12981-EST: KID-228 (GAA TGA CAA CTG CAA GAA GCT GCG CTC CTC, som tilsvarer nukleotidene 38-67 og også nukleotidene 534-563 av SEKV. ID NR. 12), og antisense-oligonukleotid KID-229 (GTG TAC TCG CTG GGC ACC CG, som tilsvarer komplementet av nukleotidene 156-175 og også komplementet av nukleotidene 652-671 av SEKV. ID NR. 12).

I x IO<6> plakkdannende enheter fra en Clontech human føtal lever 5'-strekning plus lambda GTlO-cDNA-samling (katalog nr. HL5003a) testes i to eksemplarer på "OPTITRAN"-filtre. Filtrene hybridiseres med <32>P-merkede oligonukleotider KID-228 og KID-229 i 400 ml plakktestbuffer (50 mM Tris pH 7,5, IM NaCl, 0,1% natriumpyrofosfat, 0,2% polyvinylpyrro-lidin og 0,2% Ficoll) som inneholder 10% dekstransulfat og 100 jig/ml tRNA og 80 pmol av hvert <32>P-merkede oligonukleotid ved 65°C over natten. De vaskes to ganger med 2X SSC/1% SDS og to ganger med IX SSC/1% SDS og eksponeres på film. II duplikat-positivkandidater isoleres. DNA fra hver av disse kloner analyseres ved restriksjonsenzymspaltning, etterfulgt av agarosegelelektroforese og "southern blot-ting". Filtrene hybridiseres til KID-228 og KID-229 for å bekrefte at innføyelsene hybridiserer til proben. Innføyel-sen av DSW240 sekvenseres fullstendig (human retL2-cDNA, SEKV. ID NR. 12), og vises på figur 7.

Nukleotidene 25-1416 omfatter proteinleserammen av human retL2-cDNA, som koder for et protein bestående av 4 64 aminosyrer (human RetL2, SEKV. ID NR. 13), og vises på figur 7. Som vist med "BESTFIT"-analysen som er avbildet på figur 8, er humant RetL2-protein 49,1% identisk med, og 63,7% lignende som, humant RetLl-protein. Det har til felles med human RetLl en hydrofob N-terminus som indikerer en signalsekvens, og en hydrofob C-terminus som indikerer et fosfat-idylinositolglykanbindingsmotiv. I tillegg er 30 cysteiner av de 31 som foreligger i hvert protein, konservert.

B. Demonstrasjon at RetL2 er en ligand for Ret

Vi demonstrerer at RetL2 er en ligand for Ret ved å transfisere 293/EBNA-celler med et ekspresjonsplasmid som inneholder innføyelsen av klon DSW240, og ved å vise at cellene kan binde et oppløselig Ret/IgG-fusjonsprotein.

Innføyelsen av DSW240 fjernes ved bruk av Noti, og klones inn i ekspresjonsvektoren CH269, som inneholder et EBV-opphav og tillater en høy ekspresjon i EBNA-positive cellelinjer. Restriksjonsspaltninger utføres for å identifisere kloner som har riktig orientering. Plasmid-DNA fremstilles fra en klon som har riktig orientering.

Plasmid-DNA'er {retL2-ekspresjonsplasmidet, et retLl-ekspresjonsplasmid som positivkontroll og et ekspresjonsplasmid som inneholder et ubeslektet protein, som negativ-kontroll) transfiseres inn i 293/EBNA-celler (8 x IO<5> på en 60 mm plate) ved bruk av lipofeksjonsmetoden. Etter 48 timer vaskes cellene to ganger med HBHA-buffer (0,5 mg/ml BSA, 0,1% NaN3, 20 mM HEPES (pH 7,0)) og inkuberes med 20 ug/ml rotte-Ret/IgG i Tris-bufret saltvann plus 1 mM MgCl2 og CaCl2 i 60-90 minutter ved romtemperatur. Etter denne inkubasjon vaskes cellene fire ganger med HBHA-buffer og fikseres deretter med 60% aceton/3% formaldehyd/20 mM HEPES (pH 7,0) i 30 sekunder. Etter to vaskinger med HBS-buffer (150 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7,0)), inkuberes cellene med et AP-koblet sekundært antistoff (geite-anti-humant IgG-Fc-gamma-spesifikt F(Ab')2 (Jackson Immuno Research Laboratories, katalognr. 109-056-098, 1:5000-fortynning i Tris-bufret saltvann plus 1 mM MgCl2 og CaCl2) i 60 minutter ved romtemperatur. Cellene vaskes deretter to ganger med HBS-buffer og to ganger med AP-substratbuffer (100 mM Tris-HCl (pH 9,5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) som inneholder 2X Pierce "Immuno Pure"-fosfatasesuppressor (katalog-nr. 35002). Den siste vasking får stå i 15 minutter. AP-substratene NBT (0,33 mg/ml) og BCIP (0,17 mg/ml) tilføres deretter i AP-substratbuffer som inneholder Pierce AP-hemmeren, og inkuberes med cellene i 5-20 minutter. Platene vaskes deretter to ganger med vann. Platene inspiseres deretter under et dissekeringsmikroskop for å bestemme om det foreligger lillafargede celler. Nærværet av lillafargede celler tyder på at Ret-fusjonsproteinet har bundet seg til cellene, og at RetL2-proteinet er en ligand for Ret. Lillafargede celler observeres også etter transfeksjon med retLl-ekspresjonsvektoren, men ikke med negativkontrollvektoren.

Kloning av Ret- ligand RetL3

A. Murin RetL3

En gjennomsøking av EST-databasen med rotte-RetLl-aminosyresekvensen bringer for dagen to murine EST'er med homo-logi med Ret-ligandene. Disse EST<*>er er AA04 9894 og AA050083 (som er partiell murin retL3-cDNA, SEKV. ID NR.

14). Plasmider som koder for disse EST<*>er, erverves fra Genome Systems Inc. (katalognr. 475791 og 475497) i form av bakterielle stikk. Plasmid-DNA prepareres fra enkelte kolonier som ble dannet ved å stryke stikkene på LB Amp-plater. Innføyelsene i disse plasmider sekvenseres i sin helhet. En sammenligning av de to sekvenser viser at AA04 9894, som har en 1,4 kb innføyelse, foreligger innen AA050083, som har en 1,9 kb innføyelse. Translasjon av DNA-sekvensen fra AA050083 viser at det foreligger en kontinu-erlig åpen leseramme fra NT205 til NT1242 (partiell murin RetL3; SEKV. ID NR. 15). Denne ORF hadde 37,5% identitet med rotte-retLl og 40,2% identitet med rotte-retL2. Imid-lertid koder den åpne leseramme ikke for noe Met eller signalsekvens i 5<*->ende. Vi undersøker 5'-0RFene oppstrøms for dette område, og finner en Met i sammenheng med en Kozak-konsenssekvens for translasjonsinitiering, og en potensiell signalsekvens for overflateekspresjon/utsondring. Denne ORF er ut av leseramme med den nedstrøms ORF, hvilket tyder på at EST AA050083 inneholder en potensiell mutasjon, så som en innføyelse, delesjon, et intron eller en kloningsarti-fakt, i sin 5'-ende.

For å erholde den riktige 5'-ende, bruker vi "Marathon RACE". Museembryo-"Marathon-Ready"-cDNA fra museembryo fra dag 11 (katalognr. 7458-1) og et "Advantage"-sett {katalog-nr. 8417-1) erverves fra Clontech. Antisense-oligonukleo-tidene Kid-366, som tilsvarer komplementet av nukleotidene 847-866 av SEKV. ID NR. 14), og Kid-365, som tilsvarer komplementet av nukleotidene 589-615 av SEKV. ID NR. 14, syntetiseres. PCR utføres ved bruk av et "Advantage" cDNA-PCR-sett {Clontech, katalog-nr. 8417-1) i kombinasjon med "Marathon" cDNA-reagenser og oligonukleotidet Kid-366. Den første PCR-reaksjon settes opp som følger: 35,3 ul H20, 5,0 ul 10X KlenTaq-buffer, 1,0 ul 10 mM dNTP-blanding, 1,0 ul 50X "Advantage" KlenTaq-polymeraseblanding. Disse reagensmidler slås sammen og blandes. Deretter tilføres 5,0 ul "Marathon-Ready"-cDNA fra museembryo fra dag 11, 1,0 ul 10 uM APl-primer og 1,7 ul 5,88 uM Kid-366 (endelig volum = 50 ul). PCR utføres i en "Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480" under de følgende syklusbetingelser: 1 syklus med 84°C i 1 min., 5 sykluser med 94°C i 30 sek. og 72°C i 4 min., 5 sykluser med 94°C i 30 sek. og 70°C i 4 min., 25 sykluser med 94°C i 30 sek. og 68°C i 4 min. Nestet PCR utføres ved bruk av produktet fra den første PCR-reaksjon. Først fortynnes 5 ul PCR-produkt nr. 1 50 ganger med TE (endelig volum 250 ul). Den nestede PCR-reaksjon inneholder 35,5 ul H20, 5,0 ul 10X KlenTaq-buffer, 1,0 ul 10 mM dNTP-blanding, 1,0 fil 50X "Advantage" KlenTaq-polymeraseblanding. Disse reagenser blandes som beskrevet ovenfor. 5,0 ul fortynnet PCR-produkt nr. 1, 1,0 ul 10 uM AP2-primer og 3,6 ul 2,8 uM Kid-365 tilsettes deretter. Syklusbetingelsene er de samme som nevnt ovenfor. Det dannede produkt med omtrent 665 bp lengde renses på en 1% lavsmeltende agarosegel og ekstraheres med Qiaex II (Qiagen, katalog-nr. 20021). Det rensede DNA klones inn i "pNoTA/T7" ved bruk av klonings-systemet "PRIME PCR CLONER" (5 prime —► 3 prime, katalog-nr. 1-725029). Sekvensinformasjon erholdes fra flere isolater, bl.a. kloner som benevnes DSW252 og DSW253.

Sekvensen av DSW252 viser seg å overlappe med SEKV. ID NR. 14, unntatt at det foreligger et ytterligere T mellom NT252 og NT253 av sekvensen SEKV. ID NR. 14. Dette T foreligger også i de andre isolater, DSW251 og DSW253. Innføyelse av denne ytterligere base korrigerer ORF slik at det erholdes en enkelt, 1191 bp lang ORF (talt fra det første Met), som koder for 397 aminosyrer. Denne ORF koder for en Met i sammenheng med en kanonisk translasjonsinitieringskonsens-sekvens (Kozak), og omfatter en signalsekvens for over-flateekspresjon/utsondring.

For å erholde en hellengdes murin klon som har evnen til å kunne uttrykkes, renses et 630 bp langt Not1-BamHl-fragment av DSW252 og et 1308 bp langt BamHl-Notl-fragment av AA050083 og ligeres til Notl-spaltet ekspresjonsvektor CH269. Ligasjonen transformeres inn i E. coli XLl-Blue (stratagene, katalog-nr. 200236). "Qiawell Ultra"-miniprep'er utføres på de dannede transformanter. Disse analyseres ved restriksjonsspaltning og gelelektroforese for å bedømme riktigheten av størrelsen og orienteringen. Denne konstruksjon benevnes DSW254. Innføyelsen av DSW254 sekvenseres i sin helhet (murin retL3, SEKV. ID NR. 16), og det bekreftes at ORF'en koder for et protein bestående av 397 aminosyrer (murin RetL3, SEKV. ID NR. 17). Disse sekvenser vises også på figur 9. C-terminus av RetL3 er hydrofob, og tyder på et fosfatidylinositolglykanbindings-motiv.

B. Human RetL3

For å finne en første vevkildekandidat for å klone human RetL3, benytter vi oss av "northern blot"-undersøkelser av musevev for å bestemme ekspresjonsmønstret av murin RetL3. Av de undersøkte vev, er ekspresjonen av RetL3 høyest i hjertevevet. En cDNA-samling fra hjerte fra voksent menneske i vektoren lambda gt10 erverves fra Clontech (katalog-nr. HL3026a). Én million plakkdannende enheter fra fagstammen strykes på 10 Nunc-plater. To plakkløft utføres på "Schleicher- og Schuell Optitran"-filtere.

En probe genereres ved PCR med primerne Kid-366 og Kid-367, tilsvarende nukleotidene 397-420 av AA050083-sekvensen. PCR-reaksjonen stilles opp som følger: 10 ul 10X PFU-buffer, 2,0 ul 10 mM dNTP-blanding, 72,1 fil H20, 3,1 ul 13,2 uM Kid-367, 6,8 ul 5,88 uM Kid-366, 5,0 ul 0,1 ug/ul AA050083-DNA og 2,0 ul 2,5 Enheter/ul PFU (Stratagene, katalog-nr. 600154) blandes sammen. PCR utføres i en "Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480" med de følgende betingelser: 25 sykluser med 94°C i 1 min. og 53°C i 1 min., 72°C i 4 min. Produktet renses ved ekstrahering med fenol, kloroform og isoamylalkohol 50:49:1, etterfulgt av lavsmetende agarosegel-elektroforese og QiaexII-rensing av det utskårne fragment. Denne probe for det kodende område merkes med P<32> ved tilfeldig priming {Feinberg og Vogelstein). Filtrene hybridiseres over natten i 200 ml plakktestbuffer som inneholder 10% dekstransulfat, 100 ug/ml tRNA og 1,8 x IO<8> CPM av museproben ved 65^. De vaskes to ganger med plakktestbuffer, to ganger med 2XSSC/1% SDS og to ganger med 1XSSC/1% SDS ved 65°C, og eksponeres på film ved -70°C med en intensiveringsduk. To eksemplarer hver av kandidater som tester positive, plakkrenses. Lambda miniprep-DNA fra de rensede plakk-kandidater spaltes med EcoRl, elektroforesebehandles på 1% agarosegel og underkastes "southern blot". "Southern blot"-produktet hybridiseres med museproben. Klon GJ128, som har en 1,3 kb lang innføyelse, hybridiseres intenst til proben for musekodepartiet. DNA-sekvensen (partiell human retL3-cDNA, SEKV. ID NR. 18) og den avledede peptidsekvens (partiell human RetL3, SEKV. ID NR. 19) erholdes for denne klon, og bekrefter at det dreier seg om den humane homolog. Denne klon koder for størstepar-ten av det kodende parti, omfattende 3'-ende av det kodende parti.

Den 1,3 kb lange innføyelse fra GJ128 renses, merkes med P<32> og brukes for å gjennomsøke samlingen fra humant voksent hjerte for å erholde en klon omfattende 5'-ende. Det erholdes ingen kloner som inneholder 5'-ende, ved testing av 2 x IO<6> plakker fra denne samling. En <M>northern"-analyse av mRNA-blotter fra humant voksent vev (Clontech-katalog nr. 7760-1, 7759-1 og 7767-1) hybridisert med samme probe, ved bruk av protokollene som leveres av produsenten, tyder på at human RetL3 uttrykkes i human voksen ryggmarg, mage, hjerte, bukspyttkjertel, tynntarm, kolon, prostata og testikkel. En cDNA-samling fra Clontech fra human voksen ryggmarg (katalog-nr. 5001a) gjennomsøkes med GJ128-innføy-elsen. 3 uavhengige kloner isoleres, og den lengste, GJ135, sekvenseres. Sekvensen av innføyelsen i GJ135 overlapper med innføyelsen i GJ128 og tillater dermed genereringen av en sammensatt sekvens av hellengdes human retL3-cDNA (SEKV. ID NR. 20) og bestemmelse av hellengdes human RetL3 (SEKV. ID NR. 21). Disse sekvenser vises også på figur 10. Human RetL3 er 34,3% og 34,9% identisk med henholdsvis human RetLl og human RetL2. Den har 76,8% identitet med murin RetL3.

TERAPEUTISK ANVENDELSE AV FORBINDELSENE IFØLGE OPPFINNELSEN

Native og variant-RetL'er, anti-RetL-antistoffer, anti-Ret-antistof f er og fusjonsproteiner av Ret og RetL'er kan finne terapeutisk anvendelse i situasjoner hvor det er ønskelig å blokkere eller aktivere Ret-signaleringsbanen for å stimulere renal og/eller neuronal cellevekst eller celleoverle-velse i sykdomstilstander hvor disse celler går tapt eller skades, eller for å hemme veksten av eller drepe uønskede celler, så som svulstceller, som uttrykker Ret eller en RetL.

Generelt er forbindelsene ifølge oppfinnelsen som bindes til Ret og dermed induserer dimerisering og/eller autofosforylering av Ret, nyttige for stimulering av vekst eller for å begrense skaden på Ret-uttrykkende vev. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er nyttige for å stimulere en renal vevsvekst og/eller overlevelse, støtte nyrefunksjonen og minimere skaden på nyrevev etter forskjellige skader. Bestemte tilstander som det kan være gunstig å behandle med forbindelsene ifølge oppfinnelsen, omfatter akutt nyresvikt, akutt nefritt, kronisk nyresvikt, nefrotisk syndrom, nyretubulusdefekter, nyretransplantasjoner, toksisk skade, hypoksisk skade og trauma. Nyretubulusdefekter omfatter slike som er av enten arvelig eller pådratt natur, så som polycystisk renal sykdom, medullær cystisk sykdom og medullær svampnyre. Denne liste er ikke begrensende, og kan omfatte mange andre nyreforstyrrelser (jfr. f.eks. Harri-son^ Principles of Internal Medicine, 13. utg., 1994.

I andre anvendelser kan genene og proteinene ifølge oppfinnelsen brukes for å behandle tilstander hvor det er ønskelig med en neural vekst og regenerasjon. Dette kan omfatte hvilke som helst tilstander omfattende forstyrrelser med neural degenerasjon, så som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom, Tourettes sykdom, amyotrofisk lateral sklerose samt motoneuronsykdom, demyeliniserende sykdommer så som multippel sklerose, bakterielle sykdommer så som meningitt, absesser eller empyem, virale sykdommer så som HIV-forbundet myelopati, prionsykdommer omfattende Creutzfeldt-Jakobs sykdom. Også omfattet er forstyrrelser fra skade på neuralvevet, være seg dette er forårsaket av neoplastisk påtrenging, trauma, cerebrovaskulære hendelser så som hemorragi eller emboli. Sykdommer i kranialnervene og ryggmargen, omfattende forstyrrelser med tranumatiske, inflammatoriske, kongenitale eller vaskulære etiologier, er spesielt omfattet, liksom også forstyrrelser som rammer det autonome nervesystem. Også omfattet er neurale utviklings-forstyrrelser, så som mental retardasjon, autisme, føtalt alkoholsyndrom, Downs syndrom og cerebral lammelse. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også brukes for å behandle syndromer omfattende det perifere nervesystem. Disse forstyrrelser omfatter slike som forårsakes av hvilke som helst av de ovennevnte faktorer, og omfatter spesielt Lymes sykdom, HIV-forbundne neuropatier, polymyositt, muskulær dystrofi og myasthenia gravis.

Anti-RetL-antistoffer og Ret-fusjonsproteiner ifølge oppfinnelsen, som bindes spesifikt til proteinet av murin RetL3 eller human RetL3 eller fragmenter av disse proteiner, er nyttige i flere metoder. Forbindelsene kan brukes terapeutisk for å hemme eller blokkere Ret-reseptorsignaleringen, så som for å blokkere veksten av svulster som er avhengig av en aktivering av Ret-signale-ringen for vekst. Disse midler kan også kombineres med påvisbare markører, så som fluoroskopisk eller radiografisk synlige substanser, og administreres til en pasient for å muliggjøre en avbildning av vev som uttrykker en RetL. Mid-lene kan også bindes til substanser så som pepperrotperok-sidase, som kan brukes som immunocytokjemiske farger for å muliggjøre en visualisering av områder med RetL-positive celler på histologiske snitt. Et bestemt antistoff kunne brukes for seg,<4>selv på denne måte, og steder hvor det bindes kan visualiseres i et sjiktvis assay ved bruk av et anti-immunoglobulin-antistoff som er bundet til en påvisbar markør. Bestemte antistoffer mot hvilken som helst RetL er også nyttige i immunoassayer for å bestemme substansen som et gitt antistoff er spesifikt for. Spesifikke antistoffer mot en RetL kan også bindes på faste bærere, så som kuler eller skåler, og brukes for å fjerne liganden fra en opp-løsning, enten for bruk ved rensing av proteinet eller fjerning derav fra oppløsningen. Hver av disse teknikker er rutine for fagmannen innen immunologi.

Andre fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen omfatter å modu-lere en Ret-RetL-signalering ved å bringe Ret i berøring med et monoklonalt anti-Ret-antistoff. Virkningen av en slik mAb-Ret-berøring kan være å enten blokkere eller stimulere aktivering av Ret-signaleringsbanen, avhengig av egenskapene av vekselvirkningen mellom det bestemte monoklonale antistoff med Ret. Visse mAb'er vekselvirker med Ret som agonister, hvor agonist-mAb/Ret-bindingen utløser dimerisering og autofosforylasjon av Ret. Andre mAb'er virker som Ret-antagonister. Vekselvirkningen mellom Ret med et antagonist-mAb forebygger en Ret-signaleringsaktivering av andre RetL<*>er eller av komplekser omfattende RetL<1>er, som ellers hadde aktivert Ret-signaleringsbanen.

En RetL og/eller antistoffer mot Ret eller mot et Ret-fusjonsprotein kan brukes for å muliggjøre avbildning av vev som uttrykker Ret, eller i de immunohistologiske eller preparative metoder som ble beskrevet ovenfor for antistoffer mot en RetL.

Fusjonsproteiner omfattende en RetL og/eller anti-Ret-antistoffer kan brukes for å spesifikt målrette medisinske terapier mot kreft og svulster som uttrykker Ret. Slike svulster kan omfatte de flere forskjellige svulstfenotyper som man forbinder med mutasjoner av Ret (N. Eng. J. Med. 335:943-951, 1996; Nature 367: 219-320, 1996; Trends Gen. 12: 138-144, 1996). Terapeutiske inngrep mot neoplasier som uttrykker en RetL, benytter seg av fusjonsproteiner omfattende Ret og/eller et anti-RetL-antistoff. Anti-Ret-antistoffet eller anti-RetL-antistoffet kan i og for seg være virksomt ved en antistoff-avhengig og komplement-avhengig cytolyse som medieres av Fc-domene. Slike hybridligander og antistoffer kan gjøres mer virksomme som kreftterapeutika ved å bruke dem som leveringsvehikler for antineoplastiske legemidler, toksiner og cytocidale radionuklider, så som yttrium 90. cytotoksiske effektorceller kan målrettes mot svulstceller ved bruk av heterokonjugerte antistoffer, hvor et antistoff som er spesifikt for enten Ret eller for en RetL som uttrykkes av en svulst, er kovalent koblet til et antistoff rettet mot et overflateprotein på cytotoksiske effektorceller, så som NK-celler eller CTL'er.

Ett eksempel på en anti-Ret-antistoff- eller RetL-terapi er å konjugere den toksiske A-kjede av ricin eller en modifisert hellengdes form for ricin {som ikke lenger kan binde celler) til en RetL eller til et antistoff rettet mot Ret-polypepetidet som uttrykkes på overflaten av ondartede celler. I en annen utførelse konjugeres et toksin med Ret eller med et anti-RetL-antistoff for å selektivt sikte inn og drepe RetL-positive celler, så som en svulst som uttrykker en RetL. En slik fremgangsmåte har vist seg å være frem-gangsrik med blokkert ricin konjugert mot et monoklonalt antistoff mot CD19-antigenet som uttrykkes på de fleste neoplastiske celler (Grossbard et al., Blood 79: 576, 1992). Andre toksiner er like nyttige, hvilket er kjent for fagmannen. Slike toksiner omfatter, men er ikke begrenset til, pseudomonas-eksotoksin, difteritoksin og saporin. Denne fremgangsmåte kan vise seg å være enda mer fremgangs-rik ved bruk av en RetL eller et anti-Ret-antistoff: disse er nyttige for å selektivt sikte inn og drepe Ret-positive celler, så som svulstceller som uttrykker Ret.

En annen fremgangsmåte ved slike medisinske terapier er å bruke radioisotopmerkede RetL<*>er eller anti-Ret-antistoffer. Slike radiomerkede forbindelser vil fortrinnsvis målrette radioaktivitet mot svulststeder i celler som uttrykker Ret, og skåne normalt vev. Avhengig av den brukte radioisotop, kan strålingen som emitteres fra et radiomer-ket antistoff som er bundet til en svulstcelle, også drepe hosliggende ondartede svulstceller som ikke uttrykker Ret. Forskjellige radionuklider kan brukes. Isotoper som emitterer p-partikler (f.eks. 13<1>I) har vært fremgangsrike når de ble brukt med monoklonale antistoffer mot CD20 som foreligger på B-cellelymfomaer {Kaminski et al., N. Engl. J. Med. 329: 459 (1993); Press et al., N. Engl. J. Med. 329: 1219

(1993)). Radionuklider som emitterer p-partikler, genererer radioaktive emisjoner som er svulstdrepende over områder som strekker seg over flere cellediametere, hvilket tillater utslettingen av antigen-negative celler og minsker kon-sekvensene av en ikke-homogen avsetting av antistoff eller ligand i svulstene.

Radionuklider som emitterer a-partikler, kan også brukes. Den lave doseratebestrålning som benereres av radionuklid-merkede RetL'er eller anti-Ret-antistoffer, kan være mer terapeutisk virksom enn den umiddelbare bestrålning som leveres eksternt i konvensjonell bestrålningsterapi. En lav doseratebestrålning kan indusere apoptose (programmert cel-ledød) i visse cellelinjer (Macklis et al., Radiat. Res. 130: 220 (1992); Maklis et al., Radiopharm. 5: 339 (1992)).

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen administreres i terapeutisk virksomme mengder, hvilket betyr en mengde av en forbindelse som fører til et medisinsk ønskelig resultat eller utøver en virkning på den bestemte tilstand som skal behandles.

Begrepet "pasient" som brukes heri, skal bety hvilket som helst pattedyr som en Ret-ligand eller et Ret-gen kan administreres til. Pasienter som spesielt er ment å skulle behandles omfatter mennesker og ikke-menneskelige primater, sau, hester, storfe, geiter, griser, hunder, katter, kaniner, marsvin, hamstere, ørkenrotter, rotter og mus, samt organene, svulstene og cellene som er avledet fra eller stammer fra disse verter.

Bruk av forbindelsene ifølge oppfinnelsen innen genterapien

RetL-genene ifølge oppfinnelsen føres til skadet vev for å stimulere en produksjon av en RetL av de transfiserte celler, for å fremme cellevekst og/eller overlevelse av celler som uttrykker Ret.

I en spesiell utførelse av en genterapimetode, kan et RetL-gen tilføres et utvalgt renalt eller neuralt målvev. En RetL vil da uttrykkes stabilt og stimulere Ret-reseptor-positive celler til å vokse, dele seg, differensiere og/eller potensiere celleoverlevelsen. I tillegg kan RetL-gener tilføres til en målcelle ved bruk av forskjellige velkjente metoder som benytter seg av viralt eller ikke-viralt baserte strategier.

Ikke-virale metoder omfatter elektroporering, membranfusjon med liposomer, høyhastighets bombardering med DNa-bestrøkne mikroprojektiler, inkubasjon med kalsiumfosfat-DNA-presipi-tat, DEAE-dekstran-mediert transfeksjon og direkte mikro-injeksjon i enkelte celler. F.eks. kan et RetL-gen innføres i en celle ved kalsiumfosfat-kopresipitasjon (Pillicer et al., Science, 209: 1414-1422 (1980)), mekanisk mikroinjek-sjon og/eller partikkelaksellerasjon (Anderson et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77: 5399-5403 (1980)), liposom-basert DNA-overføring (f.eks. LIPOFECTIN-mediert transfeksjon: Fefgner et al., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, 84: 471-477, 1987; Gao og Huang, Biochim. Biophys. Res. Comm., 179: 280-285, 1991), DEAE-dekstran-mediert transfeksjon, elek-troporasjon (US-patent 4.956.288) eller polylysinbaserte metoder hvor DNA konjugeres for å levere DNA fortrinnsvis til leverhepatocytter (Wolff et al., Science, 247: 465-468, 1990; curiel et al., Human Gene Therapy 3: 147-154, 1992).

Målceller kan transfiseres med genene ifølge oppfinnelsen ved en direkte genoverføring. Jfr. f.eks. Wolff et al., "Direct Gene Transfer Into Moose Muscle In Vivo", Science 247: 1465-1468, 1990. I mange tilfeller vil det være ønskelig med en vektormediert transfeksjon. Hvilken som helst metode som er kjent innen faget for innføyelse av poly-nukleotidsekvenser i en vektor, kan brukes. Jfr. f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY

(1989) og Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY (1992), som begge innlemmes heri som referanse. En promoteraktivering kan være vev-spesifikk eller induserbar med et metabolsk produkt eller en administrert substans. Slike promotere/forsterkere omfatter, men er ikke begrenset til, den native RetL-promoter, cytomegalovirus<*> umiddelbare tidlige promoter/forster-ker (Karasuyama et al., J. Exp. Med., 169: 13 (1989)), human beta-aktin-promoter (Gunning et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 84: 4831 (1987), glukokortikoid-induserbar promoter som foreligger i murin brystsvulstvirus-lang terminal gjentakelse (MMTV LTR) (Klessig et al., Mol. Cell. Biol., 4: 1354 (1984)), de lange terminale gjentakelsessekvenser av Moloneys murine leukemivirus (MuLV LTR) (Weiss et al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1985)), SV40-tidlig parti-promoter (Bernoist og Chambon, Nature, 290: 304 (1981)), promoteren

av Rous' sarkomavirus (RSV) {Yaraamoto et al., Cell, 22: 787

(1980) ), herpes simpleks-virus<*> (HSV) tymidinkinasepromoter (Wagner et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 78: 1441

(1981) ), adenoviruspromoter (Yamada et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 82: 3567 (1985)).

RetL-genene kan også innføres ved hjelp av spesifikke virale vektorer for bruk i genoverføringssystemer som idag er velkjent. Jfr. f.eks. Madzak et al., J. Gen. Virol., 73: 1533-1536, 1992 (papovavirus SV40); Berkner et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 39-61, 1992 (adenovirus); Hofmann et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 92: 10099-10103, 1995 (baculovirus); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38, 1992 (vacciniavirus), Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123, 1992 (adenoassosiert virus); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158: 67-93, 1992 (herpes simpleks-virus (HSV) og Epstein-Barr-virus (HBV)); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 1-24,

1992 (retrovirus); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol., 4: 749-754, 1984 (retrovirus); Miller et al., Nature, 357: 455-450, 1992 (retrovirus); Anderson, Science, 256: 808-813 (retrovirus); Current Protocols in Molecular Biology: avsnitt 9.10-9.14 (Ausubel et al., utg.), Greene Publishing Associates, 1989.

Foretrukne vektorer er DNA-viruser som omfatter adenoviruser (fortrinnsvis Ad-2 eller Ad-5-baserte vektorer), baculovirus, herpesviruser (fortrinnsvis herpes simpleks-virusbaserte vektorer) og parvoviruser (fortrinnsvis "defekte" eller ikka-autonome parvovirusbaserte vektorer, mer foretrukket adenoassosiert virusbaserte vektorer, mest foretrukket AAV-2-baserte vektorer). Jfr. f.eks. Ali et al., Gene Therapy 1: 367-384, 1994; US-patent 4.797.368 og 5.399.346 og beskrivelsen i det følgende.

Valget av et bestemt vektorsystem for å overføre f.eks. en RetL-sekvens, vil avhenge av diverse faktorer. En viktig faktor er naturen av målcellepopulasjonen. Selv om retro-virale vektorer er blitt omfattende undersøkt og brukt i et antall genterapiapplikasjoner, er de generelt uegnet for å infisere celler som ikke deles, men kan være nyttige i kreftterapien fordi de kun integrerer og uttrykker sine gener i replikerende celler. De er nyttige for ex vivo-fremgangsmåter, og er attraktive i denne hensyn grunnet sin stabile integrasjon i målcellegenomet.

Adenovirus er eukaryote DNA-virus som kan modifiseres for å virksomt levere et terapeutisk middel eller en reportertransgen til forskjellige celletyper. De generelle adenovirus av type 2 og 5 (Ad2 hhv. Ad5), som forårsaker respiratorisk sykdom i mennesker, befinner seg for tiden under utvikling for en bruk innen genterapien av Duchennes muskeldystrofi (DMD) og cystisk fibrose (CF). både Ad2 og Ad5 tilhører en undergruppe av adenovirus som ikke forbin-des med humane sykdommer. Adenovirusvektorer har evnen til å tilveiebringe ekstremt høye nivåer av transgenlevering til nærmest alle celletyper, uansett deres mitotiske tilstand. Høye titere (IO<13> plakkdannende enheter/ml) av rekombinant virus kan lett genereres i 293-celler (en adenovirus-transformert, komplementasjonshuman embryonisk nyrecellelinje: ATCC CRL1573) og kryolagres over lengre tidsrom uten noe vesentlig tap. Effekten av dette system ved levering av et terapeutisk transgen in vivo som komple-menterer en genetisk ubalanse, er blitt demonstrert i dyre-modeller av forskjellige forstyrrelser. Jfr. Y. Watanabe, Atherosclerosis, 36: 261-268 (1986); K. Tanzawa et al., FEBS Letters, 118 (1): 81-84 (1980); J.L. Golasten et al., New Engl. J. Med., 309 (11983): 288-296 (1983); S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest., 92: 883-893 (1993); og S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest., 93: 1889-1893 (1994). Faktisk har rekombinant replikasjonsdefekt adenovirus som koder for et cDNA for cystisk fibrose-transmembranregulater (CFTR), blitt tillatt for bruk i minst to humane kliniske forsøk med CF. Jfr. f.eks. J. Wilson, Nature, 365: 691-692 (21. oktober 1993). Ytterligere støtte for sikkerheten av rekombinante adenoviruser for genterapi er den omfattende erfaring man har med vaksiner av levende adenovirus i humane populasjoner.

Humane adenovirus omfatter et lineært, ca. 36 kb langt dobbeltkjedet DNA-genom, som er delt opp i 100 kartenheter ("map unit", m.u.) med en lengde på 360 bp hver. DNA'et inneholder korte inverterte terminale gjentakelser (ITR) i hver ende av genomet, som er nødvendige for en viral DNA-replikasjon. Genproduktene er organisert i tidlige (El til E4) og sene (LI til L5) partier, basert på ekspresjonen før eller etter initiering av en viral DNA-syntese. Jfr. f.eks. Horwitz, Virology, 2. utg., utg. B.N. Fields, Raven Press Ltd., New York (1990).

Den første generasjon av rekombinante, replikasjonsdefekte adenovirus som er blitt utviklet for genterapi av DMD og andre arvelige forstyrrelser, omfatter en delesjon hav hele Ela-partiet og en del av Elb-partiet. Dette replikasjons-def ekte virus dyrkes i 293-celler som inneholder et funksjonelt adenovirus-Ela-gen som gir et vekselvirkende Ela-protein. El-deleterte virus har evnen til å replikeres og danne smittsomt virus i 293-cellene, som gir Ela- og Elb-parti-genprodukter in trans. Det dannede virus har evnen til å smitte mange celletyper, og kan uttrykke det innførte gen (forutsatt at dette bærer sin egen promoter), men kan ikke replikeres i en celle som ikke bærer El-parti-DNA'et, hvis ikke cellen infiseres med en meget høy multiplisitet av infeksjon. Adenovirus har den fordel at de har et bredt område av verter, kan infisere hvilende eller endelig differensierte celler så som neuroner, og virker å være hovedsaklig ikke-onkogene. Adenovirus virker ikke å integreres i vertens genom. Fordi de foreligger ekstrakromaso-malt, er faren for innføyelsesmutagenese meget lav. Ali et al., jfr. ovenfor, s. 373. Rekombinante adenovirus (rAdV) produserer meget høye tigere, de virale partikler er mode-rat stabile, ekspresjonsnivået er høyt, og et bredt område av celler kan infiseres. Deres naturlige vertsceller er luftveisepitel, og de er dermed nyttige ved terapi av lungekreft.

Baculovirusmediert overføring har flere fordeler. En bacu-loviral genoverføring kan finne sted i replikerende og ikke-replikerende celler, og kan finne sted i renale celler samt i hepatocytter, neurale celler, milt, hud og muskel. Baculovirus er ikke-replikerende og ikke-patogent i pattedyrceller. Mennesker mangler pre-eksistente antistoffer mot rekombinant baculovirus som kunne blokkere en infeksjon. I tillegg har baculovirus evnen til å innlemme og transdusere meget store DNA-innføyelser.

Adenoassosierte virus (AAV) er også blitt brukt som vektorer for somatisk genterapi. AAV er et lite, enkeltkjedet (ss) DNA-virus med en enkel genomisk organisasjon (4,7 kb) som gør det til et ideelt substrat for en genetisk konstruksjon. To åpne leserammer koder for en rekke rep- og cap-polypeptider. J?ep-polypeptider (rep78, rep68, rep62 og rep40) er innblandet i replikasjonen, befrielse og integrasjon av AAV-genomet. Cap-proteinene (VP1, VP2 og VP3) utgjør virionkapsiden. På flankene av de åpne rep- og cap-leserammer i 5'- og 3'-ende befinner det seg 145 bp lange inverterte terminale gjentakelser (ITR'er), hvis 125 første bp har evnen til å danne Y- eller T-formede dupleksstruktu-rer. For utviklingen av AAV-vektorer er det viktig at hele rep- og cap-domenene kan skjæres ut og erstattes med et terapeutisk middel eller et reportertransgen. Jfr. B.J. Carter, i Handbook of Parvoviruses, utg. P. Tijsser, CRC Press, s. 155-168 (1990). Det har vist seg at ITR'ene representerer den minste sekvens som er nødvendig for replikasjon, befrielse, forpakning og integrasjon av AAV-genomet .

AAV-levesyklusen er tofaset og setter seg sammen av både latente og lytiske episoder. Under en latent infeksjon trenger AAV-virioner inn i en celle i form av et innkapslet ssDNA, og leveres kort tid deretter til kjernen, hvor AAV-DNA stabilt integreres med et vertskromosom uten noe åpen-bart behov for en deling av vertscellen. I fravær av et hjelpevirus, forblir AAV-genomet latent men i stand til å aktiveres og befris. Den lytiske fase av levesyklusen star-ter når en celle som huser et AAV-provirus, utsettes for en sekundær infeksjon med et herpesvirus eller adenovirus som koder for hjelperfunksjoner som brukes av AAV for å fremme dets utskjæring fra vertens kromatin (B.J. Carter, se ovenfor) . Det infiserende parentale ssDNA ekspanderes til dob-belte replikasjonsform- (RF) DNA<*>er på rep-avhengig måte. De befridde AAV-genomer forpakkes i på forhånd dannede proteinkapsider (ikosahedral symmetri ca. 20 nm diameter) og frigis i form av smittsomme virioner som har forpakket enten +- eller -ssDNA-genomer etter cellelysis.

Adenoassosierte virus (AAV) har et betydelig potensial innen genterapien. De virale partikler er meget stabile, og rekombinante AAVer (rAAV<*>er) har "droge-lignende" egenskaper i at rAAV kan renses ved pelletering eller ved CsCl-gradientbånding. De er varmestabile og kan lyofiliseres til et pulver og rehydreres til fullstendig aktivitet. Deres DNA integreres stabilt i vertens kromosomer, slik at ekspresjonen er langvarig. Deres vertsområde er bredt, og AAV forårsaker ingen kjente sykdommer, slik at de rekombinante vektorer er ikke-toksiske.

Når de er blitt innført i en vertscelle, kan aktuelle sekvenser identifiseres ved konvensjonelle metoder, så som nukleinsyrehybridisering ved bruk av prober omfattende sekvenser som er homologe/komplementære med de innføyde gensekvenser av vektoren. I en annen fremgangsmåte kan sekvensen(e) identifiseres ifølge nærværet eller fraværet av en "markør"-genfunksjon (f.eks. tymidinkinaseaktivitet, antibiotisk resistens og lignende) som forårsakes av innfø-ringen av ekspresjonsvektoren i målcellen.

Formuleringer og administrasjon

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres på hvilken som helst måte som er medisinsk akseptabel. Dette kan omfatte injeksjoner, via parenterale ruter så som intravenøs, intravaskulær, intraarteriell, subkutan, intramuskulær, intrasvulst, intraperitoneal, intraventrikulær, intraepidural eller andre, samt oralt, nasalt, oftalmisk, rektalt eller topisk. En administrasjon med forlenget frigivning kan også benyttes, så som ved depotinjeksjoner eller eroderbare implantater. En lokali-sert levering overveies spesielt, så som ved levering via en kateter til én eller flere arterier, så som den renale arterie, eller et kar som forsyner en lokal svulst.

Begrepet "farmasøytisk akseptabel bærer" betyr én eller flere organiske eller uorganiske ingredienser, være seg naturlige eller syntetiske, som det muterte protoonkogen eller det muterte onkoprotein kombineres med for å forenkle dets bruk. En egnet bærer omfatter sterilt saltvann, selv om også andre vandige eller ikke-vandige isotoniske sterile oppløsninger og sterile suspensjoner som er kjent for å være farmasøytisk akseptable er kjent for fagmannen. I denne sammenheng omfatter begrepet "bærer" liposomer og HIV-l-tat-proteinet (jfr, Chen et al., Anal. Biochem. 227: 168-175, 1995), samt hvilke som helst plasmider og virale ekspresjonsvektorer. En "virksom mengde" vedrører den mengde som har evnen til å bedre eller sinke progresjonen av den syke, degenerative eller skadede tilstand. En virksom mengde kan bestemmes på individuelt grunnlag, og vil til dels basere seg på betraktninger vedrørende symptomene som skal behandles, og resultatene som ønskes. En virksom mengde kan bestemmes av en person med vanlige kunnskaper innen faget, ved betraktning av slike faktorer og ved bruk av kun rutinemessig eksperimentering.

Liposomsysternet kan være hvilken som helst type unilamel-lære vesikler, multilamellære vesikler eller stabile pluri-lamellære vesikler, og kan fremstilles og administreres ifølge fremgangsmåter som er velkjent for fagmannen, f.eks. ifølge hva som beskrives i US-patentene 5.169.637, 4.762.915, 5.000.958 eller 5.185.154. I tillegg kan det være ønskelig å uttrykke de nye polypeptider ifølge oppfinnelsen, samt andre utvalgte polypeptider, i form av lipo-proteiner for å forsterke deres binding til liposomer. Som et eksempel, kan behandling av human akutt nyresvikt med liposominnkapslet RetL utføres in vivo ved å innføre et RetL i celler som er i behov for en slik behandling, ved bruk av liposomer. Liposomene kan leveres via kateter til den renale arterie. Det rekombinante RetL-protein renses f.eks. fra CHO-celler ved immunoaffinitetskromatografi eller hvilken som helst annen beleilig metode, blandes deretter med liposomer og innlemmes i dem med høy effekt. Det innkapslede protein kan testes in vitro for å bestemme dets virkning med å stimulere celleveksten.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse har også som mulighet å administrere, til et dyr via et

liposomleveringssystem for å forbedre deres stabilitet og/eller immunogenisitet. Levering av de nye polypeptider via liposomer kan være spesielt fordelaktig fordi liposomet kan internaliseres av fagocyttceller i det behandlede dyr. Slike celler vil etter inntak av liposomalmembranen, deretter presentere polypeptidene for immunsystemet sammen med andre molekyler som er nødvendige for å utløse en sterk immunrespons.

Hvilket som helst av de nye RetL-polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes i form av et farmasøytisk akseptabelt salt. Egnede syrer og baser som har evnen til å danne salter med polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, er velkjent for fagmannen, og omfatter uorganiske og organiske syrer og baser.

Claims

1. Isolert nukleinsyre som koder for et polypeptid med minst 80% sekvensidentitet med en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEK ID NR: 17 og SEK ID NR: 21, hvor nevnte polypeptid samvirker med et reseptorprotein Ret for å aktivere dimerisering av reseptorproteinet Ret eller autofosforylering av et tyrosinkinasedomene av reseptorproteinet Ret.

2. Nukleinsyre ifølge krav 1, hvor aminosyresekvensen av det kodede protein innehar minst 80% av cysteinene når samstilt med SEK ID NR: 17 eller SEK ID NR: 21.

3. Nukleinsyre ifølge krav 1, hvor det kodede polypeptid har minst 90% sekvensidentitet med en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEK ID NR: 17 og SEK ID NR: 21.

4. Nukleinsyre ifølge krav 3, hvor det kodede polypeptid er SEK ID NR: 17 eller SEK ID NR: 21.

5. Isolert nukleinsyre omfattende en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av SEK ID NR: 16 og -SEK ID NR: 20.

6. Vektor omfattende et innskudd omfattende nukleinsyren ifølge ethvert av kravene 1-5.

7. Vertscelle omfattende vektoren ifølge krav 6.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid omfattende trinnene å: dyrke vertscellen ifølge krav 7 og gjen-vinne polypeptidet uttrykt fra innskuddet i nevnte vertscelle.

9. Polypeptid kodet av nukleinsyren ifølge ethvert av kravene 1-5.

10. Isolert monoklonalt antistoff som binder til et polypeptid valgt fira gruppen bestående av SEK ID NR: 15, SEK ID NR: 17, SEK ID NR: 19 og SEK ID NR: 21.

11. Antistoff ifølge krav 10, hvor antistoffet binder til polypeptidet av SEK ID NR: 19 eller SEK ID NR: 21.

12. Sammensetning omfattende: (a) et antistoff ifølge krav 10 eller 11 assosiert til (b) et toksin, en avbildbar forbindelse eller et radionuklid.

13. Fusjonsprotein omfattende et polypeptid ifølge krav 9 kondensert til et immunoglobulin, et toksin, en avbildbar forbindelse eller et radionuklid.

14. Nukleinsyre ifølge ethvert av kravene 1-5, polypeptidet ifølge krav 9, vektoren ifølge krav 6 eller fusjonsproteinet ifølge krav 13 for anvendelse ved terapi eller diagnose.