KR20010012826A - 신경교 세포주-유래 향신경성 인자 수용체 - Google Patents

Abstract

신경교 세포주 유래 향신경성 인자(GDNF)의 수용체들, 이들의 세포내 발현, 단리, 생화학적 특성화 및 서열이 개시된다. c-RET는 GDNF의 수용체의 하나로 밝혀졌고, 또다른 신규의 수용체들도 또한 밝힌다. GDNF에 대한 모노클로날 항체의 제조가 또한 공개된다.

Description

신경교 세포주-유래 향신경성 인자 수용체{Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor Receptors}

본 발명은 가출원 일련 번호 제60/006,619호(1995년, 11월 13일 출원), 제60/015,767호(1996년, 4월 16일 출원), 제60/021,965호(1996년, 6월 27일 출원), 제60/020,638호(1996년, 6월 27일 출원), 제20/020,639호(1996년, 6월 27일 출원)의 우선권의 이익을 주장하는 출원중인 출원 일련 번호 08/747,842호의 부분 계속 출원이다(모든 출원은 그 전문을 참고로서 본원에 포함한다).

신경교 세포주-유래 향신경성 인자(GDNF)는 영양 폴리펩티드이다. 이는 각 단량체의 분자량이 약 25-30 kD인 134개의 아미노산의 당폴리펩티드 두 개가 디설파이드 가교로 연결된 동종 이량체이다. 1993년 GDNF의 분자적 클로닝 이전에, 파킨슨병과 연관된 뉴론 손실, 특히 복측 중뇌의 도파민 작용성 뉴론의 손실을 경감시킬 영양 폴리펩티드를 찾았다. 한때 이 뉴론의 생존은 신경교 세포주의 조건화된 배지에 존재하는 수용성 인자에 의해 촉진되는 것으로 알려져 왔다. 배아의 복측 중뇌 뉴론으로부터 준비한 1차 배양에서 도파민의 흡수를 촉진하는 능력에 기초하여, GDNF 단백질이 처음으로 단리된 세포주가 이들 세포주들 중의 하나였다[Lin et al., 260 Science 1120,1993]. 곧, GDNF가 약학적 치료 및 파킨슨 유사 증후군을 닮은 병변 후 생체 내에서 성숙 흑질 뉴론의 생존을 촉진하는 것으로 밝혀졌다[Beck et al., 377 Nature 339, 1995; Tomac et al., 373 Nature 335, 1995]. 비록 GDNF가 원래 도파민 작용성 뉴론에 매우 특이적이라고 보고되었으나, 이후 이 분자의 유력한 활성이 몇가지 밝혀졌는데, 이로는 안면 및 척수 운동 뉴론[Henderson et al., 266 Science 30 1062, 1994; Oppenheim et al., 373 Nature 344, 1995; Yan et al., 373 Nature 341, 1995], 청반의 노르아드레날린 작동성 뉴론[Arenas et al., Neuron, 발간중, 1995], 소뇌의 푸르키니에 세포[Mount et al., 92 PNAS 9092, 1995], 말초 신경절에서의 교감 뉴론 및 감각 뉴론[Trupp et al., 130 J. Cell Biol. 137, 1995], 및 표적-유래 활성 및 파라크린(paracrine) 모드의 활성을 갖는 말초 뉴론군[Trapp, M. et al., J. Cell Biol., 130, 137-148(1995); Pitchel, J., Sariola, H., Hoffer, B ＆ Westphal, H.(미공개된 관찰); Buj-Bello, A., Buchman, V.L., Horton, A., Rosenthal, A.＆ Davies, A. M. Neuron, 15, 821-828(1995)]에서의 생존 및 표현형적 응답 등이 있다. 이들 뉴론의 많은 것들이 신경변성적 질병에서 영향을 받는 것이기 때문에, GDNF는 강력한 치료적 응용성을 가질 수 있다. 특히, 외부적으로 투여되는 GDNF는 설취류에서의 실험실적으로 유도된 파킨슨병에서 흑질의 도파민 작용성 뉴론을 지탱(maintain)시키고[Beck et al. (1995) Nature, 373, 339-341; Tomac et al. (1995) Nature, 373, 335-339], 파킨슨 증후군의 붉은털 원숭이에서 기능 회복을 가져온다[Gash et al.(1996) Nature, 380, 252-255]. GDNF처리는 실험실적으로 악조토마이즈시킨(axotomized) 쥐과의 운동 뉴론의 약 절반을 또한 구제하는데[Oppenheim et al. (1995) Nature, 373, 344-346; Li et al. (1995) Proc. Natl. Acad, Sci. USA., 92, 9771-9775] 이는 GDNF가 운동 뉴론성 질병의 치료에 사용될 수 있음을 암시한다. 그러나, 정상 및 질병 상태에서의 GDNF 활성 기작에 대한 연구는 기본적으로 그 수용체가 알려지지 않아서 방해되어 왔다.

구조적 유사성(주로 7개의 보존된 시스테인 아미노산 잔기들)에 기초하여 보면, GDNF는 TGF-β들, 악티빈(activins), 뼈형태형성 단백질(BMPs), 및 성장 및 분화 인자들(GDFs)을 포함하는 다기능성 사이토카인(cytokine)의 형질전환 성장 인자-베타(TGF-13) 초군(superfamily)의 먼 종족의 하나에 속하는 것으로 보인다(Roberts et al., 327 Philos. Trans. R. Soc. Land. 145, 1990). TGF-β 및 관련된 리간드들은 상피세포 및 면역세포의 증식을 억제하고, 초기 발생에서 형태원(morphogen)으로서 기능하고, 골격 조직의 전위적 발현을 유도하고, 뉴론의 생존 및 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. TGF-β 초군 단백질들은 응답 세포 표면상의 수많은 수용체 서브유닛과 상호작용한다[Attisano et al., 1222 Mol. Cell Res. 71, 1994; Derynck, 19 Trends Biochem. Sci. 548, 1994]. 친화성 표지된 복합체의 분자량에 기초하여 수용체의 상이한 유형들이 기술되었다. 이들 중에는, 각각 55 kD, 70 kD, 300 kD의 결합단백질을 나타내는 유형I, 유형II 및 유형III가 있다. 유형 III 수용체는 풍부하게 발현되며, 세포질쪽 꼬리가 짧은 약 300 kD의 막투과성 프로테오글리칸(proteoglycan)으로 리간드를 올리고머성 수용체 복합체로 소집하는 기능을 하는 것으로 생각된다(Lopez-Casillas et al., 67 Cell 785, 1991). 실제, 일부 세포주에서는 유형 III 수용체가 TGF-β2가 신호전달 수용체에 결합하는데 필요하다. 유형 I 및 유형 II 수용체는 세포내 세린-트레오닌 키나제 부위를 갖는 막투과성 단백질이고, 따라서 리간드 결합시 신호를 하류로 전달할 수 있다[Attisano et al., 75 Cell 671, 1993; Derynck, 1994 상기참조. 유형 II 수용체는 조직적으로 활성화되는 키나제로, 리간드 결합시 유형 I 수용체를 신호전달 복합체로 소집시킨다. 이 복합체에서, 유형 I 수용체는 세린 잔기가 풍부한 막접합 부위에서 유형 II 수용체에 의해 인산화되고, 이 인산화는 유형 I 수용체의 세린-트레오닌 키나제 활성의 활성화를 가져와 하류로의 신호전달을 야기하는 것으로 생각된다(Wrana et al., 370 Nature 341, 1994). 이 모델에 따르면, 비록 일부의 경우 유형 II 수용체에의 효과적인 결합을 위하여 유형 I 수용체가 필요하기도 하지만, TGF-β 초군의 단백질들은 유형 II 수용체 없이는 유형 I 수용체에 결합할 수 없다(Letsou et al., 80 Cell 899, 1995). 발현 클로닝이나 유사성 클로닝에 의해 TGF-β, 악티빈 및 BMP들에 대한 유형 I, II, III 수용체의 cDNA 클론들이 여러 개 단리되었다(포유류 유형 I 수용체 7개, 유형 II 수용체 4 개 및 하나의 유형 III 베타글리칸 수용체 포함). 이 군의 다른 멤버와 결합하는 부가적인 막 단백질로는 구조와 기능이 알려지지 않은 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPS)-연결된 150 kD 및 180 kD의 단백질(Mackay and Danielpour, 226 J. Bio. Chem. 9907. 1991) 및 TGF-β1에는 결합하나 TGF-β2에는 결합하지 않는 180 kD의 디설파이드 연결된 이중합체인 엔도글린(endoglin)이 있다.

GDNF 수용체의 단리 및 특성화가 GDNF의 생물학적 활성의 완전한 이해 및 GDNF가 응답 세포에 결합시 발생하는 신호전달 과정의 이해에 선결조건이다. 지금까지 이 분야의 진보가 GDNF에 응답하는 세포주의 결여, 즉 GDNF 수용체를 함유하는 세포주의 결여로 방해받아 왔다.

발명의 요약

GDNF의 수용체를 발현하는 세포주와 GDNF의 수용체가 본문에 개시되어 있다. 이들 수용체를 동정 및 단리하는 방법이 또한 개시되었다.

일 양상에서, 본원 발명은 GDNF에 결합하는 단리된 수용체에 관계된다.

또다른 양상에서, 본원 발명은 GDNF 수용체에 결합하는 화합물 또는 조성물을 결정하는 방법에 관계된다.

또다른 양상에서, 본원 발명은 티로신 인산화, c-fos mRNA의 증가 및 세포 생존의 증가와 같은 유사한 생물학적 효과를 갖는 화합물 또는 조성물을 스크리닝하여 GDNF의 동종체를 동정하는 방법에 관계된다.

또다른 양상에서, 본원 발명은 상기 열거한 바와 같은 GDNF의 생물학적 효과에 대하여 길항적인 화합물 또는 조성물을 스크리닝함으로써 GDNF의 유사체를 동정하는 방법에 관한 것이다.

추가적인 양상에서, 본원 발명은 서열 목록 SEQ ID NOS 2 및 9에 개시된 서열을 갖는 화합물에 관계된다.

또다른 추가적인 양상에서, 본원 발명은 서열 목록 SEQ ID NOS 5 및 10에 개시된 서열을 갖는 핵산에 관계된다.

본 발명은 GDNF 수용체의 동정 및 GDNF의 기능, 및 그 수용체를 발현하는 세포주에 관한 것이다.

도1. 병아리 교감 뉴론상 수용체에의¹²⁵I-GDNF의 결합. (a) E10 배아 병아리 교감 뉴론에 대한¹²⁵I-GDNF의 포화 정지 상태 결합. 데이터는 세 번의 측정의 평균±표준편차로서 나타내었다. (b) (a)에서 작성된 데이터의 스캐챠드(Scatchard) 변환이다. (c) (a)에서 작성된 데이터의 힐(Hill) 변환이다. nH: 힐 계수.

도2. 병아리 교감 뉴론상에의 GDNF 수용체의 친화성 표지(affinity labeling).¹²⁵I-GDNF를 E10 배아 병아리 교감 뉴론에 교차 연결시키고, 수용체 복합체를 SDS/PAGE로 분리하여 젤 방사선 사진술로 가시화하였다(가운데 레인). 100 kD 및 300 kD 복합체에서의 이중선을 화살표시하였다. 과량의 cold(비표지) GDNF는¹²⁵I-GDNF의 교차 연결을 방해한다(오른쪽 레인). 비교를 위하여,¹²⁵I-TGF-β의 밍크 폐 상피세포 MvILu에의 교차연결을 또한 도시하였다(왼쪽 레인). 분자량 마커는 kD으로 나타내었다.

도3. 세포주상의 GDNF 수용체의 친화성 표지.¹²⁵I-GDNF를 교차 연결제로는 DSS 또는 EDAC 중 하나를 가지고, C6 신경교종, RN33B 봉합핵, L6 근모세포 및 MN-1 운동 뉴론 세포주에 교차 연결 시켰다. 수용체 복합체를 SDS/PAGE로 분리하여 젤 방사선 사진술로 가시화하였다. 과량의 cold(비표지) GDNF는¹²⁵I-GDNF의 교차 연결을 방해한다. 분자량 마커는 kD으로 나타내었다.

도4. RN33B 및 MN-1 세포에서 GDNF 수용체 서브유닛들의 각 구성체 친화도. (a) EDAC 또는 DSS를 가지고 교차 연결한 후, RN33B 및 MN-1 세포상의 상이한 GDNF 수용체 복합체의 크기. (b) 및 (c) 비표지 GDNF의 농도를 증가시키면서¹²⁵I-GDNF를 RN33B(b) 또는 MN-1(c) 세포에 교차 연결시켰다. 지적된 수용체 서브유닛에 결합하는¹²⁵I-GDNF의 백분율을 결합중 사용된 비표지 GDNF의 농도에 대한 함수로서 도시하였다.

도5. GDNF 수용체를 발현하는 세포주에서 GDNF mRNA의 발현. (a) 지적된 세포주로부터 전체 RNA 동량을 이용한 RNAse 보호 실험의 방사선 사진(autoradiogram). 생후 1일된 신장 tRNA 및 효모 tRNA를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 사용하였다. (b) PI 신장에서의 mRNA 양에 상대적인 상이한 세포주에서의 GDNF mRNA 양의 정량화. 미분화 RN33B는 미분화된 RN33B 세포; 분화 RN33B는 분화된 RN33B세포; 분화 RN33B+GDNF는 GDNF의 존재에서 분화된 RN33B 세포를 나타냄.

도6. 상이한 세포주에서 c-ret mRNA의 발현.

도7. RN33B 및 MN-1 세포에서의 GDNF에 의한 ERK의 티로신 인산화의 자극. RN33B(a) 또는 MN-1(b) 세포의 단일층을 지시된 시간(분) 동안 50 ng/ml GDNF에 노출시키고, 세포 용혈물을 SDS/PAGE로 분리하여, 항 인산화티로신 항체(aP-Tyr)을 프로브로하여 웨스턴 블롯하였다. 이 블롯을 떼어내어 p42^erk12 및 p44^erk1(오른쪽 화살표)를 모두 인식하는 항 ERK2항체(a-ERK2)를 프로브로 사용하여 재탐색하였다. 분자량 마커는 kD로 표시된다.

도8. RN33B 및 MN-1세포에서 GDNF에 의한 c-fos mRNA 발현의 자극. RN33B(a) 또는 MN-1(b) 세포의 단일층을 지시된 시간(분) 동안 50 ng/ml GDNF에 노출시키고, 전체 RNA를 추출하여 아가로스 젤에서 분리하고, 노던 블롯에서는³²P-표지된 랫(rat) c-fos 프로브를 사용하였다. 높은 세척력(high stringency)로 세척한 필터의 x-선 방사선 사진을 도시하였다.

도9. GDNF는 RN46A 세포의 생존을 증가시켰다. RN46A 세포는 배지±0-50ng/ml GDNF 중에서 8일 동안 분화시켰다. 본 데이터는 3번의 독립적인 실험(조건당 1,500-3,000 개의 세포가 계수되었다)의 평균±SEM을 나타낸다. ANOVA는 배지만에 비해서 GDNF는 모든 농도에서 생존에 상당한 영향을 줌을 나타내었다(전체 ANOVA: df=6,203; F=11.39, p, 0.001; unequal N LSD post hoc test, p. 0.001).

도10a-c. GDNF에 대한 MN-1의 생물학적 및 생화학적 응답. (a) GDNF는 혈청이 고갈된 MN-1 세포의 생존을 촉진한다. (b) GDNF는 MN-1 세포에서 여러 단백질들(별표)의 급속하고 일시적인 티로신 인산화를 촉진한다. GDNF 처리 시간(분) 및 분자량 마커가 표시되어 있다. (c) GDNF가 MN-1 세포에서 급속하고 지속적인 ERK1 및 ERK2 티로신 인산화를 촉진하였다.

도11 a-b. c-RET는 신호전달 GDNF 수용체이다. (a) MN-1 세포에서 GDNF-수용체 복합체의 면역침전 분석. GDNF-표지된 결합 단백질은 렉틴 세파로스 비드, 또는 항 GDNF 항체, 항 인산화 티로신(P-Tyr) 항체 및 항 c-RET 항체로 침전될 수 있다. 대조군 예비 면역된 항체는 GDNF 수용체 복합체를 면역침전시키지 않았다. (b) GDNF는 MN-1 세포에서 c-RET의 티로신 인산화를 유도한다. c-RET 티로신 인산화가 GDNF 첨가 후 5분에서 이미 관찰되었다(상부 패널). 30ng/ml의 GDNF에서 포화가 관찰되었다(하부 패널).

도12 a-b. c-ret 발현은 섬유아세포에서 GDNF에 대한 생물학적 응답 및 결합을 매개하는데에 충분하다. (a) 요오드화 GDNF는 MEN2a-ret로 또는 야생의 c-ret 발현 플라스미드로 안정적으로 형질감염된 3T3 세포에 교차 연결할 수 있다. 형질감염되지 않은 3T3세포(3T3)는 GDNF와 결합하지 않았다. 결합의 특이성은 50X의 과량의 cold GDNF로 표지를 변경하여 증명하였다. (b) GDNF는 c-ret 발현 플라스미드로 안정하게 형질 감염된 3T3 섬유아세포에서 생존 및 성장 응답을 촉진한다. 비형질전환된 세포는 GDNF에 반응하지 않았다.

도13 a-c. 성숙 뇌 및 발생중인 흑점에서의 c-ret mRNA이 발현. (a) 성숙한 랫(rat) 뇌의 상이한 부분에서의 c-ret mRNA의 리보누클리아제 보호분석(ribonuclease protection analysis)(RPA). (b) 랫 복측 중뇌(흑점)의 발생 과정에서 c-ret mRNA의 발현의 RPA 및 발생중인 선조체(striatum)에서 GDNF mRNA 발현의 RPA. (c) 임의 단위(여기서 100은 신생 동물의 각 부위에서의 발현량에 해당한다)로서 mRNA 발현을 나타내었다.

도14 a-h. c-RET가 GDNF 응답성 흑점 도파민 작동성 뉴론에서 발현된다. (a) 성숙 흑점에서의 in situ 혼성화(hybridization)로 분석한 c-ret mRNA 발현의 암실 방사선 사진. 축척 막대: 40μm. (b) c-ret mRNA를 포함하는 흑점 뉴론을 보여주는 명실(bright-field) 방사선 사진. 축척 막대: 7.5μm. (c) 성숙 흑점에서의 c-RET 단백질 발현의 면역조직화학적 분석. 축척 막대: 27μm. (d) 6-OHDA로 일측성 병변을 가져온 후 성숙 랫 뇌에서의 c-ret mRNA에 대한 in situ 혼성화를 보여주는 방사선 사진. 이 유독한 도파민 유사체의 전뇌 중앙 번들(medial forebrain bundle)로의 주입은 도파민을 활발하게 섭취하고 후방으로 이송시키는 세포만이 확실히 손상을 입을 것이다. 병변 1일 및 5일 된 병변된 흑점(화살표 머리)에서 c-ret mRNA에 대한 표지의 사라짐에 주목하라. (e) 6-OHDA로 병변 후 및 가상(가상) 형질감염된 섬유아세포의 이식(대조군 이식) 후 성숙 흑점에서의 c-RET 단백질 발현의 면역조직화학적 분석. 병변에 의해 야기되는 c-RET-L1의 거의 완전한 부존재에 주목하라. 축척 막대: 20μm. (f) GDNF를 발현하는 섬유아세포의 이식은 c-RET-L1을 구제한다. c-RET 양성 섬유가 GDNF를 생성하는 이식을 둘러싸고 침입하고 있다(화살표). (e)에서와 같은 축척. (g) 6-OHDA로 병변 후 및 가상 형질감염된 섬유아세포의 이식(대조군 이식) 후 성숙 청반에서의 c-RET 단백질 발현의 면역조직화학적 분석. 축척 막대: 23μm. (h) 6-OHDA 병변된 청반에서 GDNF에 의한 c-RET-L1을 발현시키는 세포체의 구제. (g)와 같은 축척. 이식은 (e) 및 (f)에서는 오른쪽에 있고, (g) 및 (h)에서는 상부에 있다.

도15 a-c. PC12 및 NB2/a 세포는 GDNF에 응답하고 GDNF에 결합한다. (a) GDNF는 혈청이 제거된 PC12 세포의 생존을 촉진한다. (b) GDNF는 NB2/a 세포의 수를 증가시킨다. (c)¹²⁵I-GDNF는 50배의 비표지 GDNF의 부존재(빈 칼럼) 또는 존재 (채워진 칼럼)에서 PC12 및 NB2/a에 결합한다.

도16.¹²⁵I-GDNF의 세포주에의 친화성 교차연결.¹²⁵I-GDNF는 PC12세포(lane 1), SY5Y 세포(lane 2), E20 랫 신장 세포(lane 3) 및 NB2/a(lane 4)에 가교연결되고, 생성된 복합체는 세제 용혈물로부터 항 GDNF 항체(Santa Cruz)에 의해 침전된다.

도17 a-b. GDNF는 c-RET에 특이적으로 결합한다. (a)¹²⁵I-GDNF는 1000배 과량의 비표지 GDNF(PreproTech EC Ltd.)의 존재(+) 또는 부존재(-)에서 NB2/a세포에 교차연결되고, 생성된 복합체는 세제 용혈물로부터 각각 cRET의 세포밖 및 세포내 영역을 인식하는 모노클로날 및 폴리클로날(Santa Cruz) 항 c-RET 항체의 혼성물에 의해 침전된다. 용혈물은 또한 모노클로날 항-뉴로필라멘트 항체 13AA8(lane3)에 의해, 단백질 A-세파로스(lane4) 및 WGA-아가로스(lane5)에 의해 침전된다. (b)¹²⁵I-GDNF는 c-RET를 일시적으로 발현하는 COS 세포에는 결합하나, 가상 형질감염된(pBK-CNV 플라스미드) COS 세포에는 결합하지 않는다. 빈칼럼은 50배 과량의 비표지 GDNF의 존재에서의 결합을 나타내고, 채워진 칼럼은 부존재에서의 결합을 나타낸다.

도18. GDNF는 형질감염된 COS세포에서 c-RET의 티로신 인산화를 증가시킨다. c-RET는 GDNF-처리한(+)(lane 1) 또는 처리하지 않은(-)(lane2) c-ret cDNA 또는 PBK-CMV 플라스미드로 가상-형질감염된 COS 세포의 세제 용혈물로부터 (lane3) 면역침전되었다. (a) 항-c-RET 항체(Santa Cruz)로 프로브시킨 면역블롯 (b) 항-인산화티로신 항체로 재프로브시킨 동일한 필터.

도19a-h. GDNF는 c-ret 양성인 발생중인 장 뉴론에 in situ 결합한다. (a,b) E15 랫 창자의 파라핀 섹션에 대한 GDNF 안티센스 cRNA 혼성화의 암실(a) 및 상응하는 명실(b) 현미경사진. (c,d) E15 랫 창자 외식체에¹²⁵I-GDNF의 in situ 결합의 암실(a) 및 상응하는 명실(b) 현미경사진. (e) E15 랫 창자의 크리오섹션(cryosection)에의 c-ret 안티센스 cRNA 혼성화. (f) E15 랫 창자 크리오섹션의 항-페리퍼린(peripherin) 항체로의 면역염색. (g) E15 랫 창자 섹션에의 GDNF 센스 cRNA 혼성화. (h) 250배 과량의 비표지 GDNF의 존재에서 E15 랫 창자 외식체에의¹²⁵I-GDNF의 in situ 결합. --, 근육층; n, 장 신경 프렉서스(plexus). 축척 막대, 100 μm.

도20a-b. GDNF-응답 세포주 및 c-ret 형질감염된 세포로부터 교차 연결된 GDNF-c-RET 복합체를 얻었다. (a)¹²⁵I-GDNF는 EDAC로 PC12세포, NB2/a 세포, 해체된 E20 랫 신장 세포 및 COS 세포에 교차연결되고, 생성된 복합체를 항-GDNF 항체로 침전시켰다. (b) EDAC-교차 연결된¹²⁵I-GDNF-c-RET 복합체는 PC12세포, 안정하게 c-ret 형질감염된 세포(Ret.-3T3) 또는 가상-형질감염된(가상-3T3) 세포의 추출물로부터 뿐만 아니라, 해체된 E15신장 세포로부터 500배 과량의 비표지 GDNF 또는 TGF-β1의 존재(+) 또는 부존재(-)에서 항-c-RET 항체로 면역침전시켰다. 모든 젤에서 약 50K 밴드가 GDNF의 이중합체와 교차연결되었다.

도21a-b. GDNF는 안정적으로 형질감염된 3T3 세포주에서 c-RET 자가인산화를 증가시킨다. (a) GDNF는 c-ret 형질감염된 세포(ret-3T3)에서 c-RET의 160kD 이소형태(isoform)의 티로신 인산화를 GDNF 양-의존적으로 증가시키나, 가상-형질감염된 세포에서는 그렇지 않다. (b) GDNF는 c-ret 형질감염된 3T3 세포에서 c-RET의 160kD 이소형태의 티로신 인산화를 GDNF 시간-의존적으로 증가시킨다. 상부패널(Ret.-PTyr)은 항-인산티로신 항체로 염색된 면역블롯이고, 하부 패널(Ret.)은 같은 필터를 항-c-RET 항체로 재프로브시킨 것을 나타낸다.

도22. GDNF는 c-RET를 일시적으로 발현시키는 trkC-3T3 섬유아세포의 수를 증가시키나(빈상자) 가상 형질감염된 세포(채워진 상자) 수는 증가시키지 못한다. 다섯개의 평행적인 c-ret 및 가상-형질감염된 세포를 지시된 농도에서 랫 GDNF 또는 NT-3로 5일 동안 처리하였다. Abacus^TM세포 증식 키트(Clontech)로 정량한 세포수를 성장인자 없는 대조군 세포의 백분율로 표현하였다. *, p＜0.001 가상 형질감염된 세포와 비교시.

도23 a-b. L6 골수모세포로부터 수용체의 정제. (a) L6 세포 용혈물의 음이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 분획의 플라스몬 공명(Plasmon resonance) 분석. 분획들의 총 단백질을 또한 묘사하였다. (b) (a)로부터 얻은 1M 분획을 소수성 상호작용 크로마토그래피로 더욱 정제하였다.

도24. 성숙 랫 뇌(lane 2) 및 간(lane 3)으로부터의 단백질에 대한¹²⁵I-GDNF 리간드 블롯의 방사선 사진 필름. 50배 과량의 비표지 GDNF(lane 1)는 결합을 상당히 감소시켰다.

도25. GDNFR-β의 아미노산 서열.

도26a-b. 랫 GDNFR-α 및 GDNFR-β(a), 및 랫 및 인간 GDNFR-α 및 GDNFR-β(b)의 아니노산 서열 비교.

도27. RNAse 보호 실험을 이용한 GDNFR-α mRNA의 발현.

도28. RNAse 보호 실험을 이용한 GDNFR-β mRNA의 발현.

도29. 형질감염된 COS 세포에서 GDNFR-α 및 GDNFR-β에 대한¹²⁵I-GDNF의 화학적 교차 연결.

도30. 형질감염된 COS 세포에서 GDNFR-α 및 GDNFR-β에 대한¹²⁵I-GDNF의 교차 연결에서 얻은 복합체와 RN33B 세포상의 수용체에 대한¹²⁵I-GDNF 교차 연결에서 얻은 복합체와의 비교.

도31. COS 세포에서 c-Ret와 함께 GDNFR-α 및 GDNFR-β의 동시-형질감염의 c-RET의 인산화에 대한 효과(a) 및 뉴로-2A 세포에서 GDNFR-α 및 GDNFR-β의 형질감염의 c-RET의 인산화에 대한 효과.

도32. 랫 GDNFR-β에 대한 cDNA 서열.

도33. (a) 인간 GDNFR-β의 cDNA 서열. 번역 종결 위치 및 유전자의 5' 말단을 증폭시키기 위해 사용된 프라이머의 서열은 굵은체로 표시하였다. I.M.A.G.E.EST 클론으로부터 유도된 서열의 처음 및 마지막 6 뉴클레오티드(뉴클레오티드 469-1490)에 밑줄그었다. (b) 예상되는 인간 및 랫 GDNFR-α 및 GDNFR-β 단백질의 배열. N-글리코실화 자리에 밑줄을 그었고, 서열 4개 중 적어도 3개가 일치하는 아미노산 자리를 굵은체로 표시하였다.

도34. 여러 인간 조직에서 GDNFR-β mRNA의 발현을 나타내는 노던 블롯. 분자량 마커 크기는 모든 필터에서 같다. 하부 패널은 인간 β-액틴 프로브로 재혼성화시킨 동일한 필터를 나타낸다.

도35. 중기 염색체상의 인간(a) 및 생쥐(b) GDNFR-β 유전자의 형광성 in situ 혼성화의 그레이스케일(Grayscale) 화상.

도36. GDNFR-β는 일시적으로 형질감염된 COS-7 세포에서 GDNF가 유도하는 c-Ret 자가인산화를 매개한다.

도37. 랫 GDNFR-β(B,E,H,K,N) 또는 GDNFR-α(C,F,I,L,O)에 대한 프로브로 혼성화시킨 E17 랫의 부신(A,B,C), 신장(D,E,F), 소장(G,H,I), 척수(J,K,L) 및 삼차신경 신경절(M,N,O)의 연속섹션의 명실 및 암실 화상. 화살표는 신장(E)의 미분화된 간엽조직 및 창자(H)의 장 뉴론에서 GDNFR-β mRNA의 낮은 발현을 나타낸다. 약어, ac=부신 피질, am=부신 수질, drg=배측 뿌리 신경절, en=장 신경층, mn=복측 운동뉴론 칼럼, nt=삼차신경 분비 세관의 신경줄기, tg=삼차신경 신경절, u=요관아 말단, vr=척수의 복측 뿌리. 축척막대=200μm.

GDNF의 작용 기작 및 전반적인 이해의 선결요건은 GDNF 수용체 및 그들의 신호전달 기작을 밝히는 것이다. TGF-β 초군에 속하는 다른 멤버들의 수용체는 잘 특성분석되어 있으나, GDNF 수용체는 본 발명의 개시 이전까지는 정해지지 않았다. 본원에서는 GDNF 수용체의 생화학적 특성을 개시하고 교감 뉴론 및 응답하는 세포주에서의 이들의 하류로의 응답을 개시한다. 친화성 표지를 이용하여, 배아(embryonic) 교감 뉴론에 GDNF가 협동적으로 결합하는 것을 매개하는 다수의 GDNF 결합 서브유닛들을 동정하였다. 30개 이상의 세포주를 스크리닝하면 처음에는 봉합핵으로부터의 조건적으로 불사화된(immortalized) 뉴론의 전구체에서 55kD, 70kD, 135kD 및 300kD의 GDNF 결합 단백질의 높은 발현이 보였다. 데이터가 증명하는 바와 같이, GDNF 수용체는 이들 세포의 뉴론 분화 후 높게 유도되어, 그 후 GDNF의 생존 촉진 효과에 민감하게 된다. 신경교종, 근모세포, 세르톨리(Sertoli) 세포에서는 이들 서브유닛의 상이한 조합이 관찰되었다. 운동 뉴론 하이브리드 세포주에서는 상이한 수용체 패턴이 관찰되었는데, 여기서 우세한 성분은 CPI-고정된 155kD의 단백질이다.

다른 TGF-β 초군에 속하는 인자들의 수용체 패턴과의 놀라운 유사성에도 불구하고, 면역침전 실험으로부터 GDNF 수용체의 55kD, 70kD, 135kD 및 300kD 서브유닛은 신규의 단백질인 것으로 나타났다. 55kD 결합 단백질은 흑점(Treanor et al. Nature, 382:80-83, 1995) 및 망막(Jing et al. Cell, 85:1113-1124, 1996)으로부터 클로닝된 것으로 기술되어 있는 GDNFR-α인 것으로 확인되었다. GDNFR-α는 글리코실포스파티딜 이노시톨 연결(GPI)에 의해 세포막에 부착되어 있고, 따라서 그 자신만으로는 세포내 신호를 전달할 수 없다. 70kD 결합 단백질은 본원에서 랫 및 인간으로부터 클로닝되었고, 서열이 밝혀져 "GDNFR-β"로 명명되었다.

본 발명자들은 GDNFR-β의 좌위가 인간 염색체 8p21-22 및 생쥐 염색체 14D3-E1임을 찾았다. 이어서 155kD 서브유닛은 배설계 및 신경계 일부의 발생에 중요한 수용체 티로신 키나제이고, c-ret 원종양유전자(proto-oncogene)의 산물인, c-RET인 것으로 밝혀졌다. 봉합핵 및 운동 뉴론 세포주에서 상이한 타임 코스도중에 GDNF가 ERK 티로신 인산화 및 c-fos mRNA 발현을 자극하는데, 이는 GDNF 수용체 서브유닛의 상이한 보체들이 독특한 신호전달 복합체를 형성할 수 있음을 암시한다.

동시에, c-RET는 부가적인 세포주상에서 GDNF의 수용체로 밝혀졌다. GDNF는 파킨슨병의 병변 모델에서 c-RET 양성의 도파민 작동성 및 노르아드레날린 작동성 뉴론을 구제하는데, 이는 c-RET가 성숙 뇌에서 GDNF의 항-파킨슨성 효과를 매개할 수도 있다는 것을 암시한다.

c-ret 원종양유전자(Takahashi et al.(1985) Cell, 42, 581-588)는 구조적으로 수용체 티로신 키나제와 연관이 있는 단백질을 부호화한다(Takahashi et al.(1988) Oncogene, 3, 571-578). 이의 세포밖 부분은 통상적이지 않은 카드헤린 유사(cadherin-like) 영역 및 또한 시스테인이 풍부한 영역을 함유하고, 이들의 생물학적 역활은 밝혀지지 않았다. 교대적 스플라이싱(alternative splicing)에 의한 c-ret mRNA의 몇몇 이소형태(isoform)들이 기술되었으나[Tahira et al.(1990) Oncogene, 5, 97-102; Myers et al., (1995) Oncogene, 11, 2039-2045; Lorenzo et al.(1995) Oncogene, 10, 1377-1383], 현재 그들의 생물학적 의미는 이해되지 않고 있다. 몇몇 세포주에서, 160kD 및 140kD의 분자량을 갖는 c-ret가 엔코딩하는 단백질이 기술되었는데, 이들은 각각 120 kD의 핵심 단백질의 전체 및 부분적으로 글리코실화된 이소형태를 나타내었다(Takahashi et al., 1988). 다른 수용체 티로신 키나제에서와 같이, c-RET도 그 티로신 잔기의 인산화에 따른 동형 이분자화에 의해 활성화된다.

배설계에서, c-ret는 신장 도관, 요관아(ureteric bud) 및 수집관의 성장 말단에서 발현된다(Pachnis et al.,(1993), 상기 참조). c-ret 유전자의 무효(null) 돌연변이에 대한 동형접합체는 신장이 없거나 초보적이고, 내부적 신경계가 심한 손상을 보여서 생후 즉시 사망한다(Schuchardt et al., Nature 367, 380-3)(1994)). 이러한 증거에 근거하여, 동종의 c-ret 리간드가 형태발생 및 뉴론발생에 중요한 성장인자일 것으로 제안되어 왔다.

쥐과의 배발생 도중, c-ret mRNA는 주로 신경계 및 배설계에서 발현된다. c-ret mRNA는 배측 뿌리(dorsal root), 교감신경절, 장내신경절, 두부신경절(Pachnis et al., Development 119, 1005-17(1993))에서, 및 후방 유주성의 신경능 세포에서 및 신경능 기원의 다양한 종양(갈색세포종, 티로이드 수질 종양 및 신경아세포종[Ikeda, I., et al. Oncogene 5, 1291-6(1990); Santoro, M., et al, Oncogene 5, 1595-1598)(1990)] 등 포함)에서 발견된다. 발생중인 중추 신경계에서, c-ret발현 부위로는 신경관의 복측 부분, 망막, 및 척수 및 후뇌의 운동 뉴론[Pachnis et al., (1993), 상기참조] 등이 있다. 그러나, 성숙 신경계에서의 c-ret의 발현 패턴은 이전에 보고되지 않았었다.

c-RET에 대한 리간드가 알려진 것이 없어서, c-RET가 매개하는 세포내 경로에 대한 연구가 기본적으로 지장이 있었다. 섬유아세포 또는 조혈세포에서 발현되는 표피 성장인자 수용체/c-RET 키메라의 성장 촉진 활성의 비교 분석시, 생물학적 표현형이 표피 성장인자 수용체의 것과는 확연히 구별되는 것이었다[Santoro et al.(1994) Mol. Cell. Biol. 14, 663-675]. 본 발명자들은 NGF와 GDNF가 모두 PC12세포의 생존을 촉진하는 반면, NGF 만이 이들의 분화를 유도하는 것을 밝혔고, 이는 NGF의 수용체인 c-RET와 trkA의 신호전달 경로는 그 일부분만이 중복된다는 것을 암시한다. 연결 단백질(adaptor protein)인 Grb2가 c-RET의 종양유전자형에 결합하는 것이 증명되었다[Borrello et al.(1994) Oncogene, 9, 1661-1668]. 그러나 상세한 경로는 완전히 알려지지 않았다. 본원에서는 GDNF를 리간드로하여, GDNF결합시 c-RET의 세포내 신호전달을 밝힐수 있었다.

c-RET와 유사하게, GNDF도 위장관의 근육층 및 신장의 응축 간엽조직에서 풍부하게 발현된다[Suvanto et al.(1996) Eur. J. Neurosci., 8, 816-822]. 나아가, 본문에서 기술하는 바와 같이, GDNF는 발생중인 장에서 c-RET 양성 세포에만 특이적으로 결합하고, GDNF는 여러 세포주 및 발생중인 신장에서 c-RET에 교차 연결될 수 있으며, GDNF는 특이적으로 c-RET의 티로신 인산화를 유도하고, 3T3세포에서 c-RET의 전위적 발현은 이들 세포의 GDNF에 대한 생물학적 응답을 부여한다. 따라서, c-RET는 GDNF에 의해 활성화되고 그 기능을 매개한다.

본문에서 추가로 개시하는 바와 같이, GDNFR-α 및 GDNFR-β는 형질감염된 세포에서 GDNF가 유도하는 c-RET 자가인산화를 매개한다. 유사하게 작용하는 GDNF 제시 단백질의 존재는 c-RET를 활성화하는데 필요한 GDNF의 양을 줄일 수 있다. 노던 혼성화(Northern hybridization)에 의해, 본 발명자들은 인간 GDNFR-β mRNA의 전사체 양이 성인 뇌, 장 및 태반과, 태아 뇌, 폐 및 신장에서 많다는 것을 밝혔다. in situ 혼성화(hybridization) 연구에 의해, GDNFR-β mRNA는 E17 랫의 배에서, 특히 부신, 신장 및 장에서 GDNFR-α mRNA의 것과 다른 분포를 보였다. 발생중인 신경계에서, GDNFR-β mRNA 발현은 특정의 뉴론 군에 제한적인 반면, GDNFR-α mRNA는 비 뉴론 세포에서도 광범위하게 발현된다. GDNFR-β mRNA의 특징적인 조직 분포 및 형질감염된 세포에서의 GDNF신호 매개 능력은 생체내에서 GDNF 및 관련된 향신경성 인자들의 신호전달에서의 역할을 암시한다. GDNF가 이용가능하지 않은 일부 기관(부신 피질 등)에 GDNFR-β mRNA가 존재한다는 사실은 어떤 다른 리간드(뉴투린(neuturin) 및 퍼세핀(persefin)과 같은 GDNF 동종체 등; 각각 Kotzbauer et al., Nature, 384:467-470, 1996 및 Kotzbauer et al., Differentiation and Degeneration, Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology, Taos, NM, March 27-April 2, 1996, p. 136)가 GDNFR-β를 그들의 신호전달에 사용할 수도 있다는 가능성을 지적하고 있다. 마찬가지로 GDNFR-β는 또한 Ret 이외의 다른 신호전달 수용체의 활성화에도 사용될 수도 있다.

GDNF 및 이의 신호 전달에 관여하는 유전자들은 임상적으로 중요한데, 이는 운동뉴론 및 파킨슨병의 치료에의 강력한 용도를 갖기 때문이다. 또한, 이들 유전자들은 흑점 및 위장관에서 뉴론의 생존에 영향을 주는 선천적 또는 유전적 질환의 가능한 후보 질병 유전자로서 강도높게 연구되고 있다.

c-ret 원종양유전자의 산물은 인간 질병에 중요한 역할을 한다. c-ret 유전자의 재배열 및 돌연변이는 몇몇 종양(예를 들어, 가족성 갑상성 수질 종양(familial medullary thyroid carcinoma), 복합 내분비선 종양 유형2(multiple endocrine neoplasia type 2 등) 및 허쉬스프렁병(Hirschsprung disease) (후장내 장내 뉴론의 부재가 특징인 질환으로 유아 및 성인들에게 변비와 거대결장증을 가져오는 질환) [Mak, Y.F. 및 Ponder, B.A.J.(1996) Curr. Op. Genet. Dev., 6, 82-86]과 관련이 있다. c-RET에 대한 리간드로서 GDNF의 동정은 이들 질병의 분자적 원인을 분석하는 것을 추가로 가능하게 한다. 특히, GDNF 유전자의 돌연변이는 c-ret 좌위가 돌연변이되지 않은 경우에도 허쉬스프렁병을 야기할 수 있는 것으로 연구되었다.

현재, GDNFR-β 유전자, 즉 8p21-22의 인체 좌위에 할당된 후보 질환은 없으나, 이것이 뉴론에서 GDNF의 신호전달에 참여할 것이기 때문에, 신규의 수용체 GDNFR-β가 신경변성질환에 관한 연구에 지대한 영향을 미칠 것이다. 또한, GDNFR-β에 대한 유전자는 GDNF 또는 RET의 녹아웃(knock-out) 생쥐(예를 들어, 허쉬스프렁병, 신장 발육부전증 및 형성장애증)의 표현형을 닮은 선천적 질병에 대한 강력한 후보 질환 유전자이고, 본 발명자들은 이들 발생적 순서에서의 돌연변이를 스크리닝하고 있다.

본문에 사용된 "GDNF 수용체"는 GDNF와 결합하는 수용체 서브유닛들의 조합 뿐만 아니라 GDNF에 결합하는 하나의 서브유닛을 지칭한다.

본문에 사용된 용어 "효과"란 변화나 변경을 의미한다. 효과는 일부 물질의 증가를 야기하는 것과 같은 양성 효과 또는 길항적이고 억제적인 음성효과일 수 있다.

본문에 사용된 용어 "동종체"란 본문에 개시되는 바와 같은 GDNF와 유사한 생물학적 효과를 갖는 화합물 또는 조성물을 지칭한다.

본문에 사용된 "유사체"란 GDNF의 생물학적 효과와 길항적인 효과를 갖는 화합물 또는 조성물을 지칭한다.

본문에서 GDNF 수용체와 관련하여 사용된 용어 "단리된"이란 그의 천연적 환경으로부터 분리된 화합물 또는 재조합적으로 발현되었다면, 그의 발현 환경으로부터 분리된 화합물을 의미한다.

본문에서 화합물과 관련하여 사용된 어구 "실질적으로 순수한"이란 자연적으로 화합물과 동반되는 기타 성분들로 부터 분리된 단리된 화합물을 의미한다. 전형적으로, 화합물이 측정된 총 물질의 75% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상(예를 들어, 부피비, 건조 또는 습윤 중량, 또는 몰백분율이나 몰분획)일 때 실질적으로 순수하다고 한다.

본문에서 사용된 어구 "비허용적 배양 조건"이란 온도, 배지 성분 등이 통상적으로 실험실에서 배양된 세포의 생존을 지지하지 못하는 조건을 지칭한다.

본문에서 경쟁적 실험에서 표지된 GDNF의 첨가와 관련하여 사용된 어구 "과량"이란, 경쟁 화합물의 검출을 용이하게 하기에 충분한 표지된 GDNF의 양-예를 들어, 표지된 GDNF의 양이 시험 화합물의 양의 두 배인 양과 같은 것이다.

본문에서 사용된 용어, "결합"이란, GDNF 리간드와 그 수용체 사이의 상호작용을 지칭하고, 이 결합은 본문에 개시된 검정 조건하에서 상기 결합이 검출될 수 있기에 충분하게 강하고 충분한 시간 동안 결합이 이루어진다.

본문에서 수치값과 관련하여 사용된 용어 "약"은 수치값±10%, 더욱 바람직하게는 ±5%, 가장 바람직하게는 ±2%를 의미한다.

본원에서 서열에 대한 모든 청구항은 기능에 영향을 주지않고 서열상에 가해질 수 있는 비실질적 변형 즉, 실질적으로 같은 서열도 포함한다. 예를 들어, 원래의 코돈에 의해 지정되는 아미노산과 같은 아미노산을 가져오는 코돈내의 핵산의 변화는 "실질적으로 같은 서열"이다. 또한, 기능에 영향을 주지 않는 서열내 보존적 아미노산 치환도 또한 "실질적으로 같은 서열"이다.

하기 제시하는 특정 실시예는

1) GDNF 수용체가 다수의 뉴론 및 비뉴론 세포 유형에 존재한다는 것과,

2) GDNF 수용체는 협동적으로 작용하여 강한 인력의 결합을 달성하는 다수의 서브유닛으로 구성된다는 것과,

3) ERK/MAP 키나제군의 구성원은 GDNF 신호전달 기작의 성분들이라는 것 및

4) c-RET는 GDNF의 기능성 수용체임을 증명하고 있다.

1. 다수의 뉴론 및 비뉴론성 세포 유형에서의 신규 GDNF 수용체의 발현.

지금까지 밝혀지지 않았던 GDNF수용체들이 본원에서 동정되었다. 이들 신규 GDNF수용체들은 비록 뉴론성 세포에서 가장 풍부하게 나타나지만, 여러 상이한 기원의 세포주에서 발견되었다. 바람직하게는, 이 세포주는 RN33B, RN46A 및 C6로 이루어진 군(표1 참조)에서, 가장 바람직하게는 RN33B에서 선택되었다. 이들 세포유형에서의 GDNF 수용체의 동정은 생체내에서 GDNF에 반응하는 신규의 세포군을 제시하고 있다. GDNF는 뉴론의 특정 아종, 특히 척수 및 안면 운동 뉴론 뿐만 아니라 도파민 작동성 및 노르아드레날린 작동성 중앙 뉴론의 생존 및 표현형을 촉진하는 것으로 나타났다. 여러 단아민자극성 뉴론에서의 GDNF의 활성에서 볼 때, 수질 봉합(medullary raphe)에서 유래된 세포주에서의 GDNF수용체의 발견은 세로토닌 작동성 뉴론도 또한 생체내에서 GDNF에 반응할 수 있음을 나타낸다. 이들 세포에 의한 GDNF의 내생적 발현은 GDNF가 봉합핵 내에서 파라크린/오토크린 (paracrine/autocrine) 양상으로 작용할 수 있음을 암시한다. 세르톨리 TM4 세포에서 GDNF 수용체의 발현은 발생중인 정소에서의 GDNF의 비뉴론적 역할을 암시한다. 생체내에서, 정소에서의 GDNF mRNA의 일시적 발현은 세르톨리 세포군의 증폭과 관련이 있고(Trupp et al., 상기 참조), 이는 TM4 세포주에서의 GDNF 수용체의 발견과 함께 세르톨리 세포 성숙 도중 GDNF의 오토크린 작용을 암시한다. 마찬가지로, 랫 근모세포 L6 세포에서 GDNF 수용체의 존재는, 생체내에서 발생중인 근육에서의 발현(Henderson et al., 상기 참조; Trupp et al., 상기 참조)과 함께, 근육 생성 도중에 GDNF의 잠재적인 파라크린 역할을 나타낸다. 배 교감 뉴론에서 GDNF 수용체의 존재 및 생물학적 활성에도 불구하고, NGF로 유사 교감 뉴론으로 분화된 PC12 세포에서는 초기의 실험 조건하에서 GDNF 수용체를 발현시키지 않았다. 그러나, 하기 논의하는 바와 같이, GDNF 수용체가 최종적으로는 PC12 세포상에서 동정되었다.

뇌교 노르아드레날린 작동성 세포주 CATH.a 에는 GDNF 수용체가 존재하지 않는다. 청반으로부터의 성숙 중앙 노르아드레날린 작동성 뉴론상에 미치는 GDNF의 강력한 효과에서 볼 때, CATH.a에서 GDNF 수용체의 부존재는 흥미로운 것이다. 그러나, 최근 공(Gong) 등은 6-OH 도파민의 처리에 의해 유도되는 CATH.a 세포의 변성을 GDNF가 방지할 수 있다고 보고하고 있는데[Gong et al., 21 Abs. Soc. Neurosci., 1789, 1995], 이는 6-OH-도파민 병변 후 이들 세포에서 GDNF수용체가 유도될 수 있음을 암시한다. 실로, 생체내 연구는 GDNF가 비병변 청반에서 보다 6-OH-도파민 주입 후 노르아드레날린 작동성 뉴론의 표현형에 더욱 확실한 유도를 자극하는 것으로 나타났다. 나아가, 트리노(Treanor) 등은 최근 전뇌 번들(forebrain bundle)의 의학적 처치 후 흑점의 섹션들에서의 GDNF 결합의 증가적 조절을 보고하였는데(Treanor et al., 21 Abs. Soc. Neurosci. 1301, 1995), 이는 수용체의 증가적 조절이 중추신경계에서의 GDNF 응답성을 조절하는 일반적 기작일 수 있음을 제시한다.

GDNF 수용체의 상승적 조절은 또한 실험실에서의 봉합핵 세포의 분화도중에서도 관찰된다. 최근 이들 세포주들은 성숙 뇌로 이식한 후 국부적 미세 환경적 신호에 응답할 수 있는 능력을 보유하는 것으로 알려졌고, 이에 의해 이들은 이식 부위에서의 내생적 뉴론의 분화 방향과 일치하는 방향으로 분화하였다(Shihabuddin et al., 15 J. Neurosci. 6666, 1995). 그러나, 실험실에서 비허용적 온도로의 이동은 이들이 각각 글루타메이트 작동성(RN33B) 또는 세로토닌 작동성(RN46A) 표현형을 갖는 디폴트(default) 경로로 분화하도록 한다. 배양내 분화는 또한 이들 세포에서 뉴로트로핀 수용체 p75^LNGFR및 trkB을 포함하는, 다른 영양 인자들에 대한 수용체의 발현을 증가적으로 조절하는 것으로 밝혀졌다[Whittemore and White, 615 British Res. 27, 1993]. 비록 이들이 이식 위치에 따라서 상이한 뉴론성 유형을 발생시킬 수 있지만, RN33B 세포는 글리아 엘리먼트를 발생시킬 수 없는데, 이는 이들 세포가 뉴론적으로 제한된 다잠재력의 전구체를 나타냄을 암시한다(Shihabuddin et al., 상기 참조). 이러한 관점에서, 이 둘 다잠재력 뉴론성 간세포의 유형에 GDNF 수용체가 부존재(Renfranz et al., 66 Cell 713, 1991; Synder et al., 30 68 Cell 33, 1992)하는 것에 주목하는 것은 흥미로운 것이고, 이는 이들 세포가 봉합핵 세포주보다 덜 제한적이라는 것을 암시한다. 이를 종합하면, 이러한 관찰들은 GDNF 수용체의 발현은 새로이 분화된 체세포 분열 후의 뉴론에서 처음 나타나고, 뉴론의 성숙 도중에 진보적으로 증가할 수 있음을 제안한다.

2. 다수의 GDNF 수용체 서브유닛

본 데이터는 신규 GDNF 수용체가 협동하여 강한 친화도를 갖는 결합을 이루는 다수의 서브유닛으로 구성됨을 증명한다. GDNF의 배 교감 뉴론에의 협동적 결합은 따라서 수용체 조합의 다단계적 기작을 암시하는 것일 수 있다. 결합 측정이 4℃에서 수행되었기 때문에, 협동적 결합이 막투과성 수용체 단백질의 실질적인 측방향 이동에 기인하는 것 같지는 않고, 이는 GDNF 결합이 막상에서 부분적으로 수행된 수용체 복합체에 형태적 변성을 유도하는 것을 제시한다. 교차 연결에 의할 때, 상이한 GDNF 수용체 서브유닛이 거의 동일한 친화도를 갖는데 이 또한 부분적으로 예비 조합된 수용체 복합체에의 GDNF의 협동적 결합을 지지한다.

GDNF와 TGF-β 초군의 멤버들 사이의 구조적 유사성은 GDNF 수용체도 TGF-β군의 수용체에 대하여 기술된 일반적 유형을 따를 것임을 암시한다. 실제로, 본원에 기술된 GDNF 결합 단백질의 패턴은 유형I, 유형II 및 유형III의 TGF-β수용체를 강력하게 반영하고 있다.

GDNF와 TGF-β 초군 수용체 사이의 전체적인 유사성에도 불구하고, 밍크 폐 상피세포주 MvILu를 포함하는, 다양한 TGF-β 및 악티빈 수용체 서브유닛을 발현하는 것으로 알려진 세포주들에서 GDNF 수용체는 발견되지 않았다. 이 관찰과 일치하게, 최근에 단리된 BMP에 대한 유형 II 수용체(Rosenzweig et al., 92 PNAS USA 7632, 1995) 및 신규의 뇌-특이적 유형I 수용체(Ryden et al., 21 Abs. Soc. Neurosci 1754, 1995)를 포함하는 공지의 유형I 및 유형II TGF-β 초군 수용체(Ibanez, C., 미발행; P. ten Dijke, 개인적 교류)의 상이한 조합으로 형질감염된 COS 세포에서는 GDNF의 결합이 검출되지 않았다. 더우기, 임의의 클로닝된 TGF-β 초군 수용체에 대한 항펩티드 항혈청으로 면역침전시킨 후 GDNF 수용체 복합체가 회수되지 않았는데, 이는 GDNF 수용체 성분들이 신규의 단백질임을 나타낸다.

3. c-RET는 GDNF의 수용체이다.

GDNF 수용체는 운동 뉴론-신경아세포종 히브리드 세포주에서는 발견되지만, 동일한 신경아세포종과의 히브리드인 기저 전뇌 세포에서는 발견되지 않았는데, 이는 MN-1세포에서 검출된 수용체가 생리학적으로 관련된 운동 뉴론 GDNF 수용체를 나타냄을 암시한다. 봉합핵 세포와는 대조적으로, 생체내에서 근육 유래 GDNF는 표적-유래 형태의 활성을 보이는데 이와 일치하게 운동 뉴론 세포주에서 GDNF 발현이 검출될 수 없었다(Henderson et al., 266 Science 1062, 1994; Trupp et al., 상기 참조). GDNF는 결합하여 c-ret의 산물로 동정된 이들 수용체의 티로신 인산화를 유도한다. c-ret는 또한 GDNF의 결합을 매개하고, 순수한 섬유아세포로의 형질감염시 GDNF에 응답하는 생존/성장을 매개할 수 있다. 더우기, 성숙 흑질의 도파민 작동성 뉴론은 c-ret mRNA를 다량 발현시키고, CNS에서 c-RET를 발현하는 도파민 작동성 및 노르아드레날린 작동성 뉴론은 생체내에서 외생적 GDNF의 보호적 효과에 응답한다. 이들 데이터는 함께 c-ret 원종양유전자의 산물은 GDNF의 기능적 수용체를 엔코딩하고, 이 수용체는 이 인자의 도파민 작동성 뉴론, 노르아드레날린 작동성 뉴론 및 운동 뉴론에 향신경성 효과를 매개할 수 있음을 나타낸다.

본원에 개시된 결과는 c-RET 수용체 티로신 키나제가 GDNF의 신호전달 수용체임을 나타낸다. 지금까지 밝혀진 모든 TGF-β 초군의 멤버들에 대한 수용체가 수용체 세린-트레오닌 키나제(Derynck, R. Trends Biochem Sci 19, 548-553 (1994); Attisano et al., J. Bba-Mol Cell Res, 222, 71-80(1994))라는 것을 고려할 때, 이러한 발견은 놀라운 것이다. GDNF는 TGF-β 초군과 아미노산 서열에서 보존적인 시스테인 잔기 사이의 간격을 주로 공유하는 사실상 TGF-β 초군 중에서 매우 이종적인 멤버이다. GDNF가 수용체 티로신 키나제와 작용할 수 있는 능력은 TGF-β 초군의 다른 구성원들과의 기능적 이종성을 더욱 나타낸다. 역으로, 이러한 발견은 TGF-β 초군의 다른 멤버들도 수용체 티로신 키나제를 이용할 수 있음을 암시할 수 있다.

본원에 개시된 하기의 결과는 또한 c-ret 원종양유전자 산물이 GDNF의 기능적 수용체라는 것을 함축적으로 나타낸다;

i) GDNF는 c-ret 원종양유전자를 전위적으로 발현하는 COS 세포에 결합한다.

ii) GDNF는 COS 세포에서 전위적으로 발현되는 c-ret 원종양유전자의 산물 또는 NB2/a 및 PC12 세포로부터의 산물에 화학적으로 교차 연결할 수 있다.

iii) COS 세포 및 NB2/a 세포에서 또한 전위적으로 발현되는 c-ret 원종양유전자 산물은 GDNF 결합시 티로신 잔기가 급속하게 인산화된다.

iv) GDNF는 c-ret 원 종양유전자 산물을 발현하는 세포에서 생물학적 영향(유발적 또는 영양적 영향 등)을 촉진한다.

GDNF는 RET를 발현하는(도19 c,d,h) 장 뉴론 및 발생중인 신장에서 요관아 말단에 특이적으로 결합한다. c-ret 결손 생쥐에서는 이들 조직이 부존재하거나 심하게 감소되어 있다(Schuchardt et al. (1994) Nature, 367, 380-383; Durbec et al.(1996) Development, 122, 349-358). 본원에 공개된 데이터는 GDNF 응답성 세포 및 c-ret 형질감염된 세포로부터 그리고 배의 신장 세포로부터의 GDNF-c-RET 복합체를 더욱 증명하고 있다. 결국, GDNF는 시간 및 용량 의존적으로 c-RET를 활성화하고, c-ret를 GDNF 비응답성 세포로 도입하면 GDNF 응답성의 결과가 발생한다.

4. GDNF 수용체에 의해 활성화되는 하류로의 신호전달 경로

봉합핵 및 운동 뉴론 세포주에서 GDNF 신호 전달 기작에 대한 연구가 수행되었다. 이들 세포에서 GDNF에 의해 밝혀진 하류로의 응답은 본원에서 동정된 GDNF 결합 단백질이 기능적인 GDNF 수용체임을 입증한다. 초기의 GDNF 신호전달 경로의 생화학적 특성 분석은 GDNF신호전달 기작의 성분으로서 ERK/MAP 키나제 군의 성분이 동정되었다. 인산화에 의한 ERK/MAP 키나제의 활성화는, TGF-β(Yan et al., 269 J. Biol. Chem. 13231, 1994; Hartsough 및 Mulder, 270 J. Biol. Chem. 7117, 1995) 및 신경성장인자(Thomas et al., 68 Cell 1031, 1992; Wood et al., 68 Cell 10 II, 1992)를 포함하는 다양한 성장 인자에 의한 Ras경로의 활성화 후 작동하는 키나제의 케스케이드(cascade)에서 마지막 단계이다. 더욱 최근에는, ERK2가 또한 Ras를 활성화시키는 것으로 알려져 있지 않은 인터페론 및 인터루킨과 같은 여러 사이토카인에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 일부를 형성하는 것으로 알려졌다(David et al., 269 Science 1721, 1995). Ras의 활성화가 GDNF의 신호전달 기작 단계 중의 하나인지는 더욱 관심을 가져야할 분야이다.

봉합핵 RN33B 세포와 운동 뉴론 MN-1 세포에서 GDNF에 의해 유도되는 ERK 인산화 패턴 사이에 흥미로운 차이가 발견되었다. RN33B 세포에서는 GDNF 처리가 매우 빠르고(최대 5분) 일시적인(60분 후에는 검출불가) ERK1 및 ERK2의 티로신 인산화를 자극하나, MN-1 세포에서는 비교적 느리고(최대 15분) 더욱 지속적인(120분 후에도 검출가능) ERK2의 인산화(ERK1은 아님)를 자극한다. 이러한 차이가 기능적으로 중요성을 가질 것이라는 것은 상이한 성장 인자로 처리한 PC12 세포에서 얻어진 최근의 관찰로부터 제안되었다. PC12 세포를 NGF 및 섬유아세포 성장인자(FGF)에 노출시키면, 뉴론 분화와, Ras활성 및 ERK 티로신 인산화의 지속적인 증가를 가져온다(Qiu and Green, 7 Neuron 977, 1991). 대조적으로, DNA 합성 및 PC12 세포의 증식을 촉진하는 표피 성장 인자(EGF)를 처리하면, 단지 일시적인(1시간 미만) Ras 및 ERK의 활성화를 가져온다(Qiu and Green, 1991). 따라서, ERK활성의 상이한 시간 경과는 PC12세포에서 상이한 생물학적 응답을 가져온다. 함께 고려하면, RN33B 및 MN-1 세포에서 GDNF 수용체의 상이한 패턴 및 GDNF가 유도하는 ERK 인산화의 상이한 패턴들은 상이한 세포 유형에서는 상이한 GDNF 수용체 서브유닛들이 협동하여 독특한 신호전달 복합체를 형성할 수 있다는 것을 제안하고 있다. 상이한 GDNF 신호전달 경로가 GDNF의 상이한 생물학적 효과의 근거가 되는지는 더욱 연구되어야 할 분야이다.

활성화되면, ERK는 핵으로 이동하고 거기서 전사인자를 인산화하고 이에 의해 전사인자의 활성을 조절하여, 유전자 발현을 조절한다. p67^SRF및 p62^TCF전사인자의 인산화는 이들을 c-fos 유전자 프로모터상의 혈청 반응성 엘리먼트(Serum responsive element(SRE))로 소집하여 c-fos 유전자의 전사를 촉진한다(Gille et al., 358 Nature 414, 1992). c-fos의 전사는 PC12 세포의 NGF에의 노출(Millbrandt, 83 PNAS USA 4789, 1986) 및 골아세포의 TGF-β에의 노출(Machwate et al., 9 Mol. Endocrin. 187, 1995)을 포함하는 다양한 자극 후 빠르고 일시적으로 유도된다.

c-fos는 성장인자, 뉴로펩티드 및 신경전달물질 합성 효소 유전자를 포함하는 다수 유전자의 조절에 관여하는 것으로 생각되는 AP-1 전사 인자 복합체의 일부를 형성한다(Gizang-Ginsberg and Ziff, 4 Genes Dev. 477, 1990; Hengerer etal., 87 PNAS USA 3899, 1990; Jalava and Mai, 9 Oncogene 2369, 1994). GDNF에 의한 c-fos 전사의 촉진은 GDNF가 유도하는 유전자 발현에서 AP-1 복합체의 관여를 암시한다. 따라서, c-fos는 중앙 노르아드레날린 작동성 뉴론의 GDNF 처리시 관찰되는 티로신 히드록실라제(TH) 발현의 증가, 또는 상부 경부 신경절(superior cervical ganglion)로부터의 배양된 교감 뉴론에서 GDNF에 의해 유발되는 혈관작용성 장 펩티드(vasoactive intestinal peptide;VIP) 및 프리프로타키키닌-A(PPTA) mRNA의 증가적 조절을 매개할 수 있었다(Trupp et al., 130 J.Cell Biol. 137, 1995).

GDNF의 세로토닌 작동성 분화된 봉합핵 세포의 생존에의 효과는 이들 세포에서 동정된 GDNF 수용체가 관련된 생물학적 응답을 유발할 수 있음을 나타낸다. 이들 세포에서 GDNF 수용체 발현의 증가에 동반하여 증식, 분화 및 GDNF 응답성이 중단된다는 사실은 GDNF가 생체내에서 발생중 세로토닌 작동성 봉합 뉴론에 대한 생존 인자일 수 있음을 암시한다. 본원에서 공개하는 데이터는 GDNF 매개의 뉴론 생존에서 ERK들 및 c-fos의 역할을 제안한다. 이것은 우성 음성(dominant negative) 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 직접적으로 밝힐 수 있다.

본원에서 공개된 GDNF 수용체 서브유닛 및 복합체는 넓은 범위의 응용성을 가진다. GDNF 수용체의 동정 및 단리는 예를 들어 뉴론성 질환, 특히 뉴론 세포 사망과 관련된 질병들을 치료하는데 유용한 의약을 위한 합리적인 의약 설계를 용이하게 한다. 이전에 논의한 바와 같이, GDNF는 생체내에서 제약학적 처리 및 파킨슨적 증후군 유사의 병변 후 성숙 흑질 뉴론의 생존을 촉진할 뿐만 아니라, 기타 뉴론성 세포주에서 생존 응답성을 보였다. 의약은 GDNF 수용체에 대한 결합 친화도 및 하기의 ERK2 및 ERK1의 인산화와 같은 GDNF의 하류에의 효과에 대한 이들의 영향을 시험할 수 있다. GDNF 수용체는 악성 종양 세포주에서도 동정되었으므로, 암치료 용도로의 의약 설계도 또한 명백하다. 나아가, BMP와의 구조적 유사성을 고려하면, 뼈 관련 질환, 즉 골다공증의 치료에 사용될 의약 및 골절의 치유를 촉진하는 의약의 개발도 또한 예상된다.

따라서, 본원에 따르면 단리된 수용체는 GDNF의 동종체 및 유사체인 화합물 또는 조성물을 스크리닝하기 위하여 사용될 수 있다. 잠재적인 동종체 및 유사체는 우선 수용체를 발현하는 세포주(즉, NB2/a 세포) 또는 단리된 수용체 및¹²⁵I로 표지된 GDNF를 이용한 경쟁적 결합 실험으로 스크리닝될 수 있다. 실시예 13에 개시된 것과 같은 방법들이 사용될 수 있다. 이어서 유사체 또는 동종체 활성은 이들 화합물 또는 조성물이 예를 들어 RET 원종양유전자의 티로신 인산화의 각각 감소 또는 증가에 미치는 효과를 동정하여 더욱 확실히 할 수 있다. 실시예 17에서 개시한 것과 같은 방법들이 사용될 수 있다. 또는 GDNF는 상기한 절차 또는 이들의 변형을 이용하여 다른 수용체들을 스크리닝하고 동정하는데 사용될 수 있다.

GDNF 수용체의 단리는 또한 수용체에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 개발을 용이하게 한다. 이들 항체는 수용체 자체를 정제하는데, GDNF 수용체를 발현하는 다른 세포들을 동정하는데(이에 의해 다른 치료적 응용을 촉진할 수 있음), 유형 I과 반응하는 다른 수용체를 동정하는데 사용될 뿐만 아니라, 그자체로서 의약으로 사용될 수도 있다. 항체는 주로 면역원(immunogen)으로서 본원에 개시된 리간드/수용체 복합체를 사용하여 생산될 수 있다. 리간드에 특이적인 항체는 폴리클로날 혈청에서 리간와의 흡착으로 제거할 수 있다. 모노클로날 생성을 위한 하이브리도마는 리간드에의 결합에 기초하여 선택될 수 있고, 수용체와 복합체를 이루지 않는 리간드와는 결합하지 않는 클론들을 증폭시켰다. 항체는 당업계에서 공지된 방법으로 제조될 수 있다.

또는, GDNF 수용체 및 GDNF 단백질에 대한 모노클로날 및 폴리클로날 항체는 GDNF 수용체 분자 클론의 특성화 및/또는 단리에 사용될 수 있다. 나아가, 항 GDNF 항체는 잠재적으로 GDNF를 닮은 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체의 생성 또는 동종체의 스크리닝에 사용될 수 있다.

GDNF 수용체의 단리는 또한 진단 및 치료적 응용을 위한 실험실적 및 생체내에서의 재조합 GDNF 수용체의 발현을 위한 핵산의 단리 및(또는) 생산을 용이하게 한다. 여기서 사용된 "핵산"이란 용어는 예를 들어 게놈 DNA, mRNA, cDNA를 포함한다. GDNF 수용체의 적어도 일부분을 서열분석할 때, GDNF 수용체에 대한 게놈 DNA 및 수용체 mRNA를 단리하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머(primer)를 개발할 수 있다.

cDNA는 단리된 mRNA로부터 제조할 수 있다. 핵산의 단리 및 생산은 마니아티스 등[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982](참고문헌으로 본문에 삽입한다)에서 개시된 것과 같은 표준적인 분자 생물학적 기술을 이용하여 이 기술분야의 숙련자들에게는 잘 알려진 방법들을 이용하여 성사될 수 있다. 재조합적으로 생성된 수용체는 합리적인 의약 설계를 위한 결정화(crystallography) 연구에 사용될 수 있다. 재조합된 세포밖 영역은 생성되어서 길항적 성질을 갖는 리간드를 위한 리간드 침전에 응용되는 의약으로서 사용될 수 있다.

상기 개시한 핵산들은 생체내 및 생체외 기술 모두를 이용하여 유전자 치료용으로 이용될 수 있다. 핵산들은 또한 예를 들어, 낮은 강도의 스크리닝(low stringency screen) 및 역전사효소 PCR을 이용하여 관련된 다른 수용체를 클로닝하는데 사용될 수 있고, 또한 예를 들어 팬닝(panning)에 의하여 다른 리간드, 및 수용체 작동물질, 길항물질 또는 부분 작동물질 및 부분 길항물질로서 작용하는 다른 물질을 스크리닝하기 위해, 수용체를 과발현시키는 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 또는 재조합적으로 생산된 수용체 자체가 스크리닝 실험에 사용될 수 있다. 부가적으로, 신호전달 경로를 밝히기 위하여 TGF-β 수용체군의 다른 구성원을 이용하여 키메라 수용체를 발현하는 세포를 생산할 수도 있다. GDNF수용체의 세포내 표적은 예를 들어, 효모 2-하이브리드 시스템을 이용하여 동정될 수 있다(Chen, et al., 377 Nature 548, 1995, 참고문헌으로 본문에 삽입한다).

상기 개시한 핵산은 또한 유전자변이(transgenic) 및(또는) 유전자 표적된(gene targeted) 동물을 개발하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자변이 동물은 GDNF 수용체의 과발현의 효과를 시험하기 위하여 개발될 수 있다. 호간(Hogan) 등의 서적[Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986] 및 논문[Capecchi, M.R., Trends Genet, 5: 70-76, 1989](이 모두를 참고문헌으로 본문에 삽입한다)에 기술되어 있는 것과 같은 방법이 이용될 수 있다.

또는, GDNF에 의한 신호전달을 차단한 효과를 확인하기 위하여, GDNF 수용체를 발현할 수 없는 세포주 및 유전자변이 동물을 제조할 수 있다. 문헌[Wurst et al., Gene Targeting Vol. 126, A.L.Joyner편집, IRL 출판사, 옥스포드 대학 출판부, 옥스포드 영국, pp.33-61, 1993](참고문헌으로 본문에 삽입함)에 개시된 바와 같은 절차를 이용할 수 있다.

본문에 개시된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범위내에서 다른 응용 및 개변이 가능하고, 이는 이 기술분야의 당업자에게 즉시 명백할 것이다.

하기의 실시예들은 상세한 설명 및 청구범위를 제한하려는 목적이 아니라 이를 설명하려는 목적으로 제공된다.

달리 표시되지 않는 한, 결합연구 및 생화학적 연구는 바쿨로비루스(baculo virus) 발현계를 이용하여 Sf21 곤충 세포에서 생성된 재조합 랫 GDNF를 가지고 수행되었다. 단백질은 이전에 기술한 바와 같이 생산 및 정제되었다(Trupp et al., 상기 참조, 참고문헌으로서 본문에 삽입). GDNF 단백질은 SDS/PAGE의 은염색(silver staining) 후 GDNF와 유사한 분자량의 시판되는 시료 단백질로 얻어진 표준 곡선을 이용하여 정량화하였다. 정제된 인간 TGF-β1은 준-이키 쿠메가와(Jun-ichi Koumegawa, Kirin Brewery, Tokyo, Japan)로부터 친절하게 제공받았다. 단백질들은 클로라민-T 방법(chloramine T method)에 의해 Na-¹²⁵I로 비활성이 약 1 ×10⁸cpm/μg되도록 표지하였다.

달리 표시되지 않는 한, 결합실험은 하기와 같이 수행되었다. 세포를 둘베코의 인산염 완충수 염수 및 2mg/ml 소 혈청 알부민(BSA) 중의 요오드화 GDNF와 함께 밀리포어 친수성 두라포어 96웰 여과 플레이트(Millipore Hydrophilic Durapore 96-well filtration plate)상에서 키웠다. 4℃에서 2시간 동안 격하게 교반시킨 후, 세포를 진공하에서 냉각 결합 완충수로 두 번 세척하였다. 건조시킨 필터를 띠어내고, 결합된¹²⁵I-GDNF를 감마 계수기로 정량화하였다. 500배 과량의 비표지 리간드를 결합 혼합물에 첨가하여 비특이 결합을 측정하였다.

친화성 표지를 위하여, 1차 뉴론 또는 세포주의 단층 배양액에 요오드화 단백질을 결합시켰다. 결합전에 해체된 병아리 교감 뉴론을 폴리오르니틴/라미닌 피복된 접시상에서 NGF의 존재에서 48시간 동안 배양하였다. 플레이트시킨 세포를 상기한 바와 같이, 결합 완충액중에서 4℃에서 10ng/ml의¹²⁵I-GDNF와 인큐베이트하였다. 디숙시니미딜 수버레이트(disuccinimidyl suberate; DSS) 또는 1-에틸-3(-3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 히드로클로리드(EDAC)(Pierce Chemical, Rockland, IL)를 이용하여 실온에서 30분 동안 리간드/수용체 복합체를 교차 연결시켰다. 교차연결 반응의 종료 후, 세포를 10mM Tris/HCl 완충시킨 염수, 2mM EDTA, 10% 글리세롤, 1% NP-40, 1% Triton X-100, 10μg/ml leupeptin, 10μg/ml antipain, 50μg/ml aprotinin, 100μg/ml 벤자미딘 히드로클로리드, 10μg/ml 펩스타틴 및 1mM PMSF(프로테인나제 억제제, 시그마사)로 두 번 세척하였다. 맑아진 용혈물을 SDS/β-머캅토에탄올 완충액에서 5분 동안 가열하고, 4-20% 구배의 전기영동 젤상에서 SDS/PAGE 하여 분리하여 방사선 사진술로 가시화하였다. 나타낸 분자량은 SDS-PAGE에 의해 가시화되는 교차 연결된 복합체의 추정 분자량에서 GDNF 리간드 단량체의 중량(예를 들면, 25-30 kD, 더욱 바람직하게는 23 kD)을 빼서 얻어졌다. 교차 연결된 복합체의 친화도 측정을 위하여, 비표지 GDNF의 양을 증가시키면서 상기한 바와 같이 플레이트 상에서 세포를 배양하였다. 이들 시료를 구배적 SDS/PAGE로 분리하고, 젤을 말린 후, 방사선 사진에서 측정한 분자량에 따라 특정 밴드를 잘라내어 감마 계수기에서 계수하였다. 요오드화 리간드와 결합 및 교차 연결시킨 후 친화성 표지된 수용체 복합체의 면역침전을 위하여, 세포 용혈물을 투명하게 하여, 상이한 유형 I,II 및 III TGFβ 초군 수용체에 대한 항펩티드 토끼 항혈청(ten Dijke et al., 264 Science 101, 1994)(Peter ten Dijke로 부터 제공받음, Ludwig Institute for Cancer Research, Uppsala, Sweden) 5-10μl와 함께 배양시켰다. 면역복합체를 단백질 A-세파로스(파마시아, 스웨덴)로 수거하고, 용혈 완충액(lysis buffer)으로 세척하고, 상기한 바와 같이 SDS/PAGE 및 방사선 사진하기 전에 5분 동안 끓였다.

＜실시예1＞

배(embryonic) 교감 뉴론상의 GDNF 수용체들

GDNF는 신경성장인자(NGF)와 유사한 효율 및 사용량 응답곡선으로 배양된 병아리 배 교감 뉴론의 생존을 촉진한다(Trupp et al., 상기 참조). 병아리 교감 뉴론은 전술한 바와 같이 단리 및 제조되었다(Trupp et al., 상기 참조). 트립신의 존재에서 기계적으로 해체된 배발생 10일 된 (E10) 병아리 척추주위 교감 신경절로부터 단리된 뉴론에 대하여 요오드화 GDNF와의 포화 결합을 수행하였다. 이 제조물은 처리되지 않은 조직 배양 플라스틱상에서 2시간 동안 예비 플레이트하여 뉴론을 증식시키고 수용체의 재발현을 도모하였다. 포화 결합 데이터의 그래프는 S자형 곡선을 만들었고, 이로부터 400 pM의 Kd를 어름잡을 수 있었다(도1a). 이 곡선의 S자형 행적과 일치하게, 데이터의 스케챠드 변환은 역 U자형 곡선을 생성하였고, 이는 협동적 결합을 나타낸다(도1b). 협동적 결합의 측정은 힐 변환이 리간드 또는 수용체 서브유닛의 올리고머화를 암시하는 양의 기울기(1.63)(도1c)를 생성하는 것으로부터 확인할 수 있다.

교감 뉴론의 막에 GDNF 결합 성분을 동정하기 위하여,¹²⁵I-GDNF를 이들 세포에 화학적으로 교차 연결시키고 생성된 복합체를 SDS-PAGE에 의해 가시화하였다. 구배적 젤 전기영동은 70 및 300 kD(여기 보고된 GDNF 수용체 서브유닛들의 분자량은 SDS-PAGE로 가시화된 교차 연결된 복합체의 추정 분자량으로부터 GDNF 리간드 단량체의 분자양(예를 들어 23kD)을 빼서 구하였다)의 결합 단백질을 분리시켰고, 밴드의 패턴은 MvILu 밍크 폐 표피 세포에 TGF-β1을 교차 연결시킨 후 얻어지는 패턴과 유사한 패턴을 가져온다(도 2). 이 결과는 TGF-β 수용체와 같이, GDNF 결합 단백질들도 올리고머적인 수용체 시스템을 형성할 수도 있음을 제안한다. 과량의 cold(비표지) 리간드는 수용체 복합체로부터 요오드화 GDNF를 치환시키는데, 이는 표지의 특이성을 나타낸다.

＜실시예2＞

세포주상의 GDNF 수용체들

30개 이상의 세포주에 대하여 요오드화 GDNF와의 친화성 표지화를 이용하여 GDNF 수용체의 발현을 스크리닝하였다(표 1, 하기 참조).

다른 언급이 없는 한, 본 연구에서 사용된 모든 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD)로부터 입수가능하고 ATCC에 의해 기술되어 있다. A875 인간 신경아세포종(neuroblastoma)은 마트 사르마(Mart Saarma, University of Helsinki, Finland)로부터 제공받았다. 티로신 히드록시라제 프로모터의 전사 조절하에 SV40 T 항체를 발현시키는 유전자변이 생쥐의 뇌교에서의 종양으로부터 단리된 노르아드레날린 작동성 세포주인 CATH.A (Suri et al., 1993)은 도나 키카라이시(Dona Chikaraishi, Tufts University School of Medicine, Boston, MA)에 의해 제조 및 공급되었다. 랫 신경간 세포주 C17-2(Snyder et al., 68 Cell 33, 1992)는 에반 스니더(Evan Snyder, Harvard medical School, Boston, MA)에 의해 제조 및 공급되었다. LAN5 인간 신경아세포종은 스벤 파흘만(Sven Pahlman, Uppsala University, Sweden)에 의해 공급되었다. 데이비드 하몬드(David Hammond, University of Chicago)가 생쥐 기저 전뇌 콜린성 뉴론 및 생쥐 신경아세포종 N18TG2(Hammond et al., 1986)의 하이브리드인 SN6 세포를 생산 및 제공하였다. 인간 신경아세포종 SY5Y는 데이비드 카프란(David Kaplan, ABL-Basic Research Program, NCI-Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, MD)에 의해 제공되었다. 랫 신경간 세포주 ST15A는 론 맥케이(Ron McKay, National Instituted of Health, MD)로부터 친절하게 제공되었다. 봉합핵 세포주 RN33B 및 RN46A의 생성 및 특성화는 다른 문헌(Whittemore and White, 1993)에 개시되어 있다. RN33B 및 RN46A 세포는 마이아미 대학의 스콧 휫트모어(Scott Whittemore) 박사로부터 얻었다. 운동 뉴론 하이브리드 세포주 2FI.10.14(본문에서는 MN-1으로 언급)는 이미 기술되었다(Salazar-Grueso et al., 2 Neuroreport 505, 1991).

다수의 GDNF 수용체 서브유닛들이 다양한 신경교세포, 뉴론 및 비뉴론성 세포에서 검출되었다(표 I). 디숙시미딜 수버레이트(DSS)와의 교차 연결 후 몇 세포주에서 300kD의 큰 분자량 밴드가 가장 흔한 종인 것으로 나타났고, 이것이 다른 수용체들(표 I)이 모두 없는 경우에는 리간드와 결합하는 것으로 보이는 유일한 수용체였다. 유사한 패턴이 랫 C6 신경교종, 생쥐 세르톨리 TM4 세포 및 랫 봉합핵의 배 뉴론성 전구체로부터 유래되는 두 세포주에서 발견되었는데, 이들은 이전에 글루타메이트 합성 효소(RN33B) 및 세로토닌 합성 효소(RN46A)를 포함하는 다수의 뉴론성 마커를 발현하는 것으로 알려져 왔다(Whittemore and White, 615 Brain Res. 27, 1993; White et al., 14 J. Neuro., 1994; Eaton et al., 170 Dev. Biol. 169, 1995). DSS와의 교차 연결 후 이들 세포에서의 공통적인 패턴은 300 kD의 고분자량 밴드 및 각각 50-55 kD 및 65-70 kD의 분자량을 갖는 두 개의 다른 수용체 서브유닛으로 구성된다(도3 및 표I). 50-55 kD 성분은 종종 이중 또는 삼중 밴드로 달린다. 고분자량 성분에 의해 나타나는 끌리는 모양 및 이형적 범위의 크기는 번역후의 개질(주로 글리코실화)을 암시하고, 이전에 유형 III 베타글리칸 TGF-β 수용체에 대하여 기술한 것과 유사한 것으로 보인다. 이 종은 봉합핵에서 유래된 세포에서는 크기가 다소 작은데, 이는 구별되는 핵심 단백질이거나 또는 글리코실화 정도가 다른 것을 나타낼 수 있다.

현재의 4℃의 실험 조건에서는, NGF 유도에 의한 교감성 뉴론 유사의 표현형으로의 분화 후에도 갈색세포종 PC12 세포에서는 GDNF 수용체가 검출될 수 없다(표1, 데이타 도시 안함). 다양한 신경아세포종 및 두 다잠재성(pluripotent) 신경간세포에서는 GDNF 수용체가 발현되지 않거나 아주 낮은 정도로 발현되었다(표I).

세포주	설명	55kD	70kD	135kD	155kD	300kD
A875	인간 흑색종	-	-	-	-	+
Balb.SFME	생쥐 배 세포	-	-	-	-	-
CATH.a	랫 뇌교 노르아드레날린성	-	-	-	-	-
Mv1Lu	밍크 폐 표피 세포	-	-	-	-	-
COS-7	원숭이 신장 섬유아세포	-	-	-	-	-
C2-C12	생쥐 근모세포	-	-	-	-	-
C6	랫 신경교종	+	+	+	-	+
C17-2	랫 CNS 간세포	-	-	-	-	-
FR-3T3	랫 섬유아세포	-	-	-	-	-
HELA	인간 자궁 종양	-	-	-	-	-
LAN5	인간 신경아세포종	-	-	-	-	+
L6	랫 근모세포	-	-	+	-	+
MN-1	생쥐 운동 뉴론	-	+	-	+	+
NB41A3	TH+ 생쥐 신경아세포종	-	-	-	-	-
NRK-49F	랫 신장 섬유아세포	-	-	-	-	-
PC12	랫 갈색세포종	-	-	-	-	-
P19	생쥐 배 종양	-	-	-	-	-
RN33B	랫 봉합핵(글루타맷트)	+	+	+	-	+
RN46A	랫 봉합핵(세로톤)	+	+	+	-	+
SK-N-MC	인간 신경표피종	-	-	-	-	-
SK-N-SH	DRH+ 생쥐 신경아세포종	-	+	-	-	+
SN6	생쥐 기저 전뇌(콜린)	-	-	-	-	-
ST15A	랫 CNS 간세포	-	-	-	-	+
SW153	인간 연골육종	-	-	-	-	-
SY5Y	인간 신경아세포종	-	-	-	-	-
TM3	생쥐 레이딕 세포	-	-	-	-	-
TM4	생쥐 세르톨리 세포	+	+	+	-	+
U138MG	인간 신경교아세포종	-	-	-	-	-

지적하는 세포주에서 특정 GDNF 수용체 복합체의 존재(+) 또는 부존재(-).

교차연결제로 에틸-디메틸-아미노프로필 카보디이미드(EDAC)를 이용한 친화성 표지화로, DSS 교차연결된 복합체에 겔을 매우 장기간 노출시킨 후에야 발견할 수 있는 120-135kD(도3)의 추가적인 GDNF 수용체 성분의 존재가 밝혀졌다. DSS와 마찬가지로, EDAC도 또한, GDNF를 50-55kD 및 65-70kD의 수용체에 가교 연결시키나, 고분자량 서브유닛인 300kD은 EDAC에 의해 효율적으로 가교 연결되지 않았다(도3).

봉합핵 세포주는 단지 조건적으로 불사화 되고 형질전환의 징후는 보이지 않는다. 비허용적 온도 및 정의된 배지에서, 이들은 증식을 멈추고, 유사핵분열후 뉴론으로 분화한다(Whittemore and White, 1993). 분화후의 RN33B 및 RN46A 세포에서 GDNF 결합이 크게 증가하였다(도시 안함). 전체적인 패턴 및 GDNF 수용체 성분들의 상대적인 양은 분화 후 변화가 없었다.

랫 근모세포주 L6상의 GDNF결합 단백질의 분석은 50-55kD 및 65-70kD 수용체가 명백하게 부존재하는 것이 특징인 상이한 수용체 서브유닛의 패턴을 보였다. DSS와의 가교 연결 후 단지 200-400kD의 고분자량 성분만이 발견될 수 있었다(도3). 그러나 EDAC로의 가교 연결은 이전에 C6, TM4 및 봉합핵 세포주에서 보여진 120-135kD 서브유닛을 즉시 표지화한다(도3). 이들 다른 세포주에서와 같이, 이 성분은 또한 L6 근모세포에서 이중선으로서 달린다.

배의 생쥐 척수 운동 뉴론 하이브리드 세포에서 별개의 수용체 복합체가 발견되었다(도3). 이 세포주는 E14 생쥐 척수 운동 뉴론과 N18TG2 생쥐 신경아세포종의 융합 후, 높은 콜린 아세틸트랜스퍼라제 활성을 나타내는 클론을 선택하여 얻어졌다(Salazar-Grueso et al., 2 Neuroreport 505, 1991). 의미있게도, SN6(배의 생쥐 기저 전뇌 콜린 작동성 뉴론 및 같은 N18TG2 신경아세포종과의 하이브리드 세포주)(Hammond et al., 234 Science 1237, 1986)은 GDNF 수용체를 하나도 보이지 않았는데(표1), 이는 운동 뉴론 세포(본문에서는 MN-1이라 언급함)상에 보여지는 GDNF 결합 단백질은 척수 운동 뉴론에 존재하는 GDNF 수용체 성분을 나타내는 것을 암시한다. L6 근모세포에서와 같이, MN-1 세포에서 우세한 수용체는 비록 이들 세포에서 이 수용체는 155 kD의 큰 단백질이지만(도3) 바람직하게 EDAC와 가교 연결된다. 이것은 곧 c-RET 수용체인것으로 동정되었다(하기 실시예 9 참조). MN-1세포는 또한 65-70kD의 결합 단백질 및 소량의 300kD 수용체를 발현시켰다(도3 및 표1).

GDNF 수용체 서브유닛의 각 성분의 친화도를 구분하기 위하여, 치환 결합 측정을 수행하고, 이어서 가교 연결 및 SDS-PAGE를 수행하였다. 수용체-리간드 복합체는 방사선 사진술로 가시화시키고, 젤로부터 도려내서 감마 계수기로 계수하였다. 결과적인 치환 곡선은 RN33B 및 MN-1 세포상의 모든 성분에 대하여 약 0.2 nM의 Kd를 나타내었다(도4 a-c). 현재 이들 데이터로는 모든 GDNF 수용체 서브유닛이 유사한 결합 친화도를 나타내는지 또는 높은 친화력을 갖는 수용체 복합체를 형성하는데 이들이 모두 필요한지를 명확히 밝히지는 못한다.

＜실시예 3＞

GDNF 수용체의 생화학적 특성화

GDNF와 TGF-β 사이의 수용체 패턴의 전체적인 유사성으로, TGF-β 초군의 구성원에 대하여 이전에 동정된 임의의 수용체가 GDNF 수용체 복합체의 일부인지에 대한 시험이 촉진되었다. 분화된 RN33B 세포로부터의 가교 연결된¹²⁵I-GDNF-수용체 복합체를, 유형I 수용체들(ALK-1 내지 ALK-6), 유형II 수용체들(TBRII, ActRII 및 BMPRII), 유형III 수용체들(베타글리칸) 및 엔도글린 등을 포함하는 클로닝된 모든 TGF-β 초군 수용체에 특이적인 상이한 항 펩티드 항혈청으로 면역침전시켰다. 병행하는 대조실험에서,¹²⁵I-TGF-β1을 밍크 폐 상피 세포주 MvILu상의 유형I, 유형II 및 유형III 수용체에 가교연결시키고, 각각 항 TBRI(ALK-5), TBRII 및 베타글리칸에 대한 항혈청으로 면역침전시켰다. 비록 유형I, 유형II 및 유형III TGF-β가 대조 실험에서는 회수되었지만, 분화된 RN33B 세포에서 GDNF 수용체 성분의 어느것도 시험된 항혈청에 의해 면역침전되지 않았다(도시 안함). 이들 데이터는 이들 세포에서 발현되는 GDNF 수용체 서브유닛들이 신규의 단백질임을 확인한다.

＜실시예 4＞

GDNF 수용체를 발현시키는 세포주에서 내생적 GDNF 발현

향신경성 인자들의 작용에 대한 전통적인 모델은 이들이 표적-유래의(target-derived) 폴리펩티드로서 특정 뉴론성 서브파퓰레이션(subpopulation)의 생존 및 분화를 촉진하는 것으로 기술되어 왔다. 더욱 최근에는, 향신경성 인자들이 파라크린(paracrine) 및 오토크린(autocrine) 형태의 작용모드를 가질 수도 있다는 것이 명백해지고 있다(Ernfors and Persson, 3 Eur. J. Neurosci. 953, 1991; Acheson et al., 374 Nature 450, 1995). GDNF 수용체를 발현하는 세포주에서 GDNF mRNA의 발현을 시험하였다. 세포를 구아니딘 이소티오시아네이트(GITC) 및 β-머르캅토에탄올에서 균질화시켰다. RNA 추출 및 GDNF RNAse 보호 실험은 이전에 기술한 방법과 같다(Trupp et al., 상기 참조).

기대치않게, 운동 뉴론 세포주 MN-1 이외에는 모든 세포주가 RNA 분해효소에 대한 보호실험에서 GDNF mRNA를 상당량 발현시켰다(도5). 가장 많은 양의 GDNF mRNA의 발현은 봉합핵으로부터의 세포에서 발견되었고, 이는 발생중인 랫에서 가장 풍부한 GDNF mRNA 원천중 하나인 생후 1일(P1) 신장에서 보다 5배나 높은 발현을 보이는 것으로 관찰되었다(Trupp et al., 상기 참조). 흥미롭게도, RN33B 세포의 분화시에는 미분화된 세포에서 보다 약 30% GDNF mRNA의 발현양 감소를 보였다(도5). 분화된 RN33B 세포에의 GDNF 처리는 GDNF mRNA(도5) 또는 GDNF 수용체(도시 안함)의 발현을 변화시키지 않았다.

RN33B, L6 및 MN-1 세포에서의 c-ret mRNA의 발현을 RNAse 보호 실험을 이용하여 연구하였다. 나타낸 세포주들로부터 10 마이크로그램의 총 RNA를 생쥐 c-ret mRNA의 키나제 부위로부터의 코딩 서열 400 뉴클레오티드에 상보적인 리보프로브(riboprobe)를 이용하여 분석하였다. 비록 MN-1 세포에서는 높은 발현이 관찰되었으나, RN33B 및 L6 세포에서는 c-ret mRNA가 검출되지 않았다(도6). 이들 결과는 c-RET 이외의 GDNF에 대한 신호전달 수용체가 존재해야 함을 나타낸다.

＜실시예 5＞

GDNF 응답성 세포주에서 ERK 신호전달 경로의 활성화

세포주에서 밝혀진 GDNF 결합 단백질들이 리간드 의존적인 신호전달 복합체를 형성할 수 있는지를 연구하였다. 10 cm 플레이트내의 세포 단층(monolayer)을 50 ng/ml의 GDNF의 존재하 37℃에서 지시된 시간 동안 배양하고, 곧 1mM 소듐 오토바나데이트가 첨가된 냉각된 용혈 완충액(상기와 같음) 1ml로 용혈시켰다. 전체 세포 용혈물을 SDS-PAGE (10% 폴리아크릴아미드)로 분리하고 니트로셀룰로스 필터에 블롯팅하였다. 항-인산화티로신 항혈청(UBI, Lake Placed, NY)을 프로브로 하여 웨스턴 블롯을 수행하고, 양고추냉이 퍼옥시다제가 축합된 염소 항-생쥐 IgG를 부착시키고, ECL 웨스턴 검출 시스템(아머샴, 영국)으로 현상하였다. 재프로빙을 위하여, 62.5 mM Tris-HCl(pH6.7), 100mM β-머르캅토에탄올, 2% 소듐 도데실 설페이트 중에서 50℃에서 30분간 배양하여 블롯을 먼저 띠어내었다. 항체를 제거한 후, 블롯을 ERK1 및 ERK2 모두를 인식하는 재조합 랫 ERK2에 대하여 생성된 토끼 폴리클로날 항혈청(Teri Boulton의 선물, Regeneron Pharmaceuticals Inc., Tarrytown, NY)을 프로브로 부착시키고, 상기한 바와 같이 양고추냉이 퍼옥시다제가 축합된 염소 항-토끼 2차 항체를 이용하여 현상하였다.

GDNF 수용체 서브유닛들의 상이한 패턴 때문에, 세포내 신호 응답은 봉합핵 세포주 RN33B및 운동 뉴론 세포주 MN-1에서 처음 밝혀졌다. RN33B 또는 MN-1 세포에서 GDNF 처리에 의해 유발되는 티로신-인산화 단백질들의 패턴 변화를 연구하였다. 티로신 인산화는 수많은 사이토카인(cytokine) 및 성장 인자들에 의해 자극되는 세포내 신호전달 단백질들의 보편적인 조절 기작이다. RN33B 또는 MN-1 단층을 다른 시간 동안 GDNF의 포화 농도(5ng/ml)에 노출시키고, 총 세포 용혈물을 SDS/PAGE 및 항-인산화 티로신 모노클로날 항체와의 웨스턴 블롯팅에 의해 티로신 인산화에 대하여 분석하였다. RN33B 세포를 GDNF로 처리한 5분 후 각각 42kD 및 44kD에 해당하는 이동성을 갖는 두개의 단백질이 티로신에서 인산화되었다(도7A). 유사한 결과가 GDNF 처리한 분화된 RN33B 세포에서 얻어졌다.

타문헌(Qiu and Green, 9 Neuron 705, 1992)에서의 성장 인자가 유도하는 단백질 티로신 인산화에 대한 기재에서와 그 크기를 비교하면, 42kD 및 44kD 종은 세포밖 신호에 의해 조절되는 키나제(ERK, 미세소관에 부착된 단백질 키나제라고도 칭함)군의 두 단백질 세린-트레오닌 키나제군인 각각 p42,k2 및 p44, kI일 것으로 보인다(Boulton et al., 65 Cell 663, 1991). 이들 단백질이 각각 ERK2 및 ERK1임을 확인하기 위하여, 항-인산화티로신 항체로 반응시킨 단백질 블롯을 띠어내고, 이를 단백질 블롯에서 ERK1 및 ERK2 모두를 인식하는 재조합 ERK2에 대하여 생성된 토끼 폴리클로날 항체를 프로브로 재부착시켰다. 항-인산화티로신 항체를 프로브로 부착시킨 블롯의 방사선 사진과 항-ERK2 항체를 프로브로 부착시킨 블롯의 방사선 사진 비교로 p42 및 p44 단백질이 각각 ERK2 및 ERK1인 것으로 밝혀졌다(도7a). MN-1 세포의 GDNF처리는 단지 ERK2의 인산화만을 자극하는 것처럼 보이지만, MN-1 세포 용혈물에는 ERK1 및 ERK2가 모두 존재하였다(도7b). 따라서, GDNF처리는 RN33B 세포에서는 ERK1 및 ERK2의 빠르고 일시적인 티로신 인산화를 자극하고, MN-1 세포에서는 ERK2의 느리고, 더욱 지속적인 인산화를 자극하였다.

ERK 경로의 활성화는 c-fos 원종양유전자를 포함하는 즉발적 초기 유전자(immediate early gene)의 빠르고 일시적인 전사 증가를 유도하는 것으로 이전에 알려졌다(Gille et al., 358 Nature 414, 1992). 따라서, GDNF가 분화된 봉합핵 RN33B 및 운동 뉴론 MN-1 세포에서 c-fos mRNA를 유도하는 능력을 연구하였다. 세포주들에서 c-fos mRNA 발현의 분석을 위하여, 세포 단층에 100ng/ml의 GDNF를 첨가하기 90분 전에 배양 배지를 교체하였다. 지시된 시간 간격에서, 배지를 제거하고, 구아니딘 이소티오시아네이트 및 β-머캅토에탄올로 세포를 용해시키고, RNA를 이전에 기술한 바와 같이 추출하였다(Trupp et al., 상기 참조). 전체 RNA의 20 마이크로그램을 0.7% 포름알데히드를 함유하는 1% 아가로즈 젤에서 분리하여 하이본드-C 멤브레인(Hybond-C)(아머샴, 영국)으로 옮겼다. 노던 블롯을³²P-dCTP 표지된 랫 c-fos 유전자 단편(Curran et al., 2 Oncogene 79, 1987)으로 혼성화시키고, 강한 세척력으로 세척하고 x-선 필름에서 방사선 사진술로 가시화하였다.

세포 단층을 차등적인 시간동안 포화 농도의 GDNF에 노출시키고, 곧 전체 RNA에 대한 노던 블롯으로 c-fos mRNA의 양을 분석하였다(도 8). 이 분석 결과는 RN33B 세포가 GDNF에 노출된 15분 후 일시적인 c-fos mRNA 양의 증가를 가져오고 처리 45후에는 기준양으로 되돌아갔다(도8a). MN-1 세포에서도 c-fos mRNA의양이 증가하였으나 GDNF 처리후 30분이 지나서 증가하였다(도8b). c-fos mRNA의 양 증가는 약 한 시간 동안 지속되고 처리 개시 후 120분이 지나자 기준양으로 되돌아갔다(도8b). 따라서, ERKS의 티로신 인산화와 같이, GDNF 처리에 의해 유도되는 c-fos mRNA의 양 증가도 RN33B 세포에서는 매우 빠르고 일시적이었지만, MN-1 세포에서는 다소 느렸다.

＜실시예 6＞

분화된 봉합핵 세포에서 GDNF에 의한 생존 응답의 촉진

봉합핵 세로토닌 응답성 세포주 RN46A의 불사멸화의 조건적 특성의 잇점을 이용하여 GDNF가 분화된 봉합핵 뉴론의 생존 인자인지를 시험하였다. 생존 측정은 기존에 기술한 바와 같이 수행하였다(Eaton et al., 1995, 상기 참조). 요약하면, 10⁵RN 세포들을 콜라겐/피브로넥틴에 피복된 8-웰 유리 슬라이드에 심고, 33℃(성장 허용 온도)에서 75-90% 밀도로 자랄때까지 배양하였다. 이어서 슬라이드를 39℃(성장 불허용 온도)로 옮기고, 혈청 함유 배지를 1% BSA, 1 μg/ml 트랜스페린, 5μg/ml 인슐린, 100 mM 푸트레신(putrescine) 및 nM 프로게스테론을 함유하고 0-50 ng/ml rhGDNF(프로메가, Madison WI)가 첨가되거나 되지 않은 정의된 B16 배지(Brewer and Cotman, 494, Brain Res. 65, 1989)로 교체하였다. 배지와 GDNF는 8일 동안 매 이틀 마다 교체하였고, 이후 세포를 4% 파라포름알데히드/2% 글루타르알데히드에 고정시키고, 헹구고, 1mM 비스벤자미드(Hoechst dye 33342)를 함유하는 글리세롤 탑제 배지로 코팅하여 생존하는 핵을 염색하였다. 세포 무리들을 Zeiss Axiophot 현미경에서 40배로 확대하여 형광을 발하는 핵(355 nM 여기, 465 nM 방출에서)을 검사하여, 이미지 화상을 포착하여 Imade I^TM소프트웨어로 세포를 계수하였다. 각 조건에 대하여, 10개의 세포 무리를 각 3번씩의 독립된 실험으로 계수하였다.

RN46A 세포는 GDNF 농도를 증가시키면서 정의된 배지에서 비허용적 온도에서 배양시켰다. 플레이팅 9일 후, 생존 세포를 계수하고 GDNF 부존재에서 형성된 배양물과 비교하였다. 생존 세포의 수의 3-배의 증가가 GDNF의 존재에서 자란 배양물에서 관찰되었다(도9). 분화된 RN46A의 생존에 미치는 GDNF의 효과는 양에 의존적이다(5ng/ml에서 EC50).

＜실시예 7＞

항-GDNF 모노클로날 항체의 생성 클로닝 및 특성화

면역화

5마리의 어린 암컷 생쥐를 완전 프루드 첨가제(Freund's adjuvant:FA)로 연화시킨 곤충 세포에서 유래된 재조합 GDNF 35μg으로 면역화시켰다. 2차 및 3차 면역화는 첫번째 면역화 후 2 주 및 4주에 불완전 FA에서 수행하였다. 모든 주사는 복강내적(i.p.)으로 하였다. 마지막 면역화 2주 후 혈청내 항체 역가를 ELISA 및 표준적인 방법을 이용한 웨스턴 블롯 분석으로 조사하였다. 가장 높은 역가를 갖는(1:2000 이상) 생쥐를 세포융합 3일 전에 불완전 FA에서의 3 μg의 GDNF로 복강내적으로 양양시켰다.

세포융합

세포융합은 코흘러 및 밀스테인(Kohler and Milstein, 1975, 참고문헌으로 본문에 포함함)의 방법을 약간 개조하여 이루어졌다.

a) 융합 전날:

Sp2/0 쥐과 세포주로부터의 생존 세포를 완전 DMEM(10% 태생 송아지 혈청, 1% L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100ug/스트렙토마이신 설페이트)로 ml당 2×10⁵세포수로 조정하였다.

비면역된 생쥐로부터의 세포는 0.34 M 수크로스 용액의 주사에 의하여 복강으로부터 주사하여 얻었다. 이 세포를 하이포잔틴(hypoxantine) 100μM; 아미노프테린 0.4 M; 및 티미딘 16μM(HAT 배지)를 포함하는 완전 DMEM에서 현탁하여 ml당 1×10⁵세포수로 조정하였다. 세포 현탁액 100 μL를 96웰 플레이트의 60 내부 웰에 첨가하고, 대기중 5% CO₂분위기에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 이들 세포가 성장인자의 원천이었다.

b) 융합

가장 높은 역가(상기 참조)를 보이는 생쥐로부터의 비장 세포를 10ml DMEM에서 표피 지방 및 다른 접착성 조직을 멸균 후드에서 제거하면서 균질화시켰다.

용융 PEG(3000-3700, Hybri-Max, Sigma) 용액 중에서 4.2×10⁷Sp2/0세포를 8.4×10⁷비장세포와 융합시켰다. 그다음 이 세포를 HAT 배지에서 대기중 5% CO₂분위기에서 37℃에서 길렀다. 배양 일주일 후, 웰을 검사하였다. 하이브리드 세포가 웰 표면의 10 내지 50%를 덮었을때 배양 상청액을 ELISA로 항체 측정을 하였다.

ELISA를 위하여, 마이크로플레이트(Costar, EIA/RIA plate high binding)의 웰을 탄산염/중탄산염 완충액(pH 9.6)으로 희석시킨 2ug/ml의 GDNF 100ul로 코팅하였다. 4℃에서 밤새 배양한 후, 웰을 0.05% 트윈을 함유하는 0.05M 인산염 완충된 염수(pH 7.2)(PBS-T)로 세척하였다. 3% 비지방성 우유 및 1% 염소 노말 혈청을 함유하는 PBS-T로 비특이적 결합을 차단하였다. 상청 시료는 실온에서 4시간 동안 배양하였다. 퍼옥시다제 염소 항-생쥐 항체를 사용하였고 기질은 o-페닐렌디아민 디히드로클로리드(OPD)이다. ELISA 독출기로 492 nm에서 플레이트를 읽었다. 음성 대조군으로는 완전 배지 및 표준 생쥐 혈청을 포함하였다.

이 하이브리드를 융합 후 2주 까지 HAT 배지에서 키웠다. 이어서 제한적 희석 방법을 이용하여 2번의 클로닝 방법의 완성시까지 HT 배지에서 세포를 길렀다. 각 단계 후(세포가 10 내지 50%를 차지하도록 자랐을 때), ELISA에 의해 상청액에서 특정 항체에 대한 검정을 하였다. 재클로닝시, 5개의 양성 하이브리도마 클론을 선택하고 이 세포들을 완전 DMEM에서 30일 동안 유지시켰다.

모노클로날 항체의 이소타입 결정

모노클로날 항체의 종(class) 및 아종(subclass)은 생쥐 모노클로날 항체의 이소타입 분석을 위한 DAKO 판넬을 이용하여 ELISA에 의해 결정되었다. 5개의 모노클로날 항체 모두 IgG₁으로 밝혀졌다.

모노클로날 항체의 정제

배양 상청액으로부터의 모노클로날 항체는 제조자의 지시에 따라 단백질 G 세파로스 고속 흐름(Pharmacia, Biotech)으로 정제하였다. 배양 상청액을 농축시키고 0.45μm의 멤브레인(Schleicheer and Schull, Germany)을 통하여 여과시킨 후, 20mM 인산 나트륨(pH 7.0)으로 미리 평형화시킨 칼럼을 통하여 밤새 펌프하였다. 0.05M글리신 완충액으로 Ig를 용리시켰다.

＜실시예 8＞

GDNF에 대하여 생물학적 및 생화학적 응답을 보이는 운동 뉴론 세포주

MN-1 세포 단층을 혈청이 결여된 배지에서 농도를 증가시켜 가면서 GDNF에 노출시키고, 3일 후 에시드 포스퍼타제(acid phosphatase) 활성의 측정(Clontech)으로 세포의 생존 및 성장을 측정하였다. GDNF는 이전에 기술한 바와 같이 바쿨로비루스에 감염된 곤충 세포로부터 생산 및 정제되었다(Trupp et al., 상기 참조). 혈청이 제거된 MN-1 단층에의 GDNF 처리는 처리량에 의존적으로 세포수를 증가시켰다(도10a). MN-1 세포의 생물학적 반응은 GDNF 처리에 대한 생화학적 및 전사적(transcriptional) 응답과 관련이 있다. MN-1 세포 단층을 50ng/ml의 GDNF에 노출 시간을 증가시키면서 노출시키고, 세포 용혈물을 SDS/PAGE로 분리하고 항-인산화티로신 항체(UBI)를 프로브로하여 웨스턴 블롯시켰다.

MN-1 세포의 GDNF 처리 후, 전기영동상의 이동거리가 42K인 단백질을 포함하는 몇개의 단백질의 티로신 인산화의 증가가 관찰되었다(도10b). 다른 문헌[Boulton, T.G., et al. Cell 65, 663-75(1991)]에서 기술된 것과 크기 비교시, 42K 종이 세포밖 신호에 조절되는 키나제(ERK)군의 세린-트레오닌 키나제 일종인 p42^erk2인 것으로 보인다. 단백질이 ERK2인 것은 항ERK2 폴리클로날 항혈청으로의 면역 침전 후 티로신 인산화 분석에 의해 확인되었다(도10c). GDNF-자극된 MN-1 세포의 용혈물을 ERK1도 또한 인식하는 항-ERK2 항혈청(Santa Cruz)으로 면역침전시키고 항-인산화티로신으로 웨스턴 블롯팅시켰다. 이 분석으로 ERK군의 또다른 구성원인 p44erk1이 또한 MN-1 세포의 GDNF처리후 티로신이 인산화됨을 추가로 밝혔다(도10c). ERK 경로의 활성화는 이전에 c-fos 원종양유전자(Gille et al., Nature 358, 414-7(1992))를 포함하는 즉발적 초기 유전자의 빠르고 일시적인 전사 증가를 유도하는 것으로 알려져 왔다.

＜실시예 9＞

GDNF에 대한 신호전달 수용체의 c-ret 원종양유전자 산물.

MN-1 세포로부터의 GDNF 수용체 복합체는 항-GDNF 항체와의 면역침전 또는 렉틴-세파로스 비드와의 결합에 의해 회수될 수 있다(도 11a). 기대치않게, 180kD수용체 복합체(즉, c-RET; 180kD-23kD=157kD, 이것은 c-RET로 동정된 155kD 수용체와 거의 동등하다-실시예 2 참조, 하기참조)가 또한 항-인산화티로신 항체로의 면역침전에 의해 회수될 수 있는데, 이는 이 복합체내 GDNF결합 단백질이 수용체 티로신 키나제일 수 있음을 암시한다.

c-ret 원종양유전자의 산물은 1차적 운동 뉴론에서 높게 발현되고(Pachnis et al., 상기 참조 및 Tsuzuki, T., et al. Oncogene 10, 191-8(1995)), MN-1 세포에서 검출된 주된 GDNF 수용체 성분과 유사한 분자량을 갖는다(Takahashi, M., et al. Oncogene 3, 571-578(1988). 본 발명자들은 이 종이 C-RET-GDNF 교차 연결된 복합체를 나타내는지를 항-c-RET 항체로의 면역침전으로 실험하였다.

EDAC를 이용하여¹²⁵I-GDNF를 MN-1세포에 교차 연결시키고, 수용체 복합체를 GDNF에 대한 항체(Trupp et al., 상기 참조), 렉틴 세파로스비드(Formica), 항-인산화티로신 항체(UBI), 항-c-RET 항체(Santa Cruz) 및 면역화되지 않은 토끼로부터의 대조군 항체로 침전시켰다. 항펩티드 c-RET 토끼 항혈청은 MN-1 세포에서 180kD의 주된 리간드-수용체 복합체를 즉시 침전시켰으나(도11a), 대조군으로 사용된 관련되지 않은 많은 모노클로날 및 폴리클로날 항체들은 이 복합체를 침전시키지 못하였다(도11a 및 데이터 도시 안함).

c-ret 유전자 산물이 수용체 티로신 키나제이기 때문에, 본 발명자들은 GDNF가 MN-1 세포에서 c-RET 단백질의 티로신 인산화를 자극할 수 있는지를 연구하였다. MN-1 세포 단층을 다른 농도의 GDNF 또는 다른 시간 동안 GDNF에 노출시키고, 세포 용혈물을 항-c-RET 항체로 면역침전시키고, 상기 개시한 바와 같이 SDS/PAGE 및 항-인산화티로신 항체로 웨스턴 블롯팅하여 분석하였다. GDNF 처리는 MN-1 세포에서 빠른 c-RET 티로신 인산화를 자극하였다(도11b). 최대의 인산화는 GDNF 처리 5분 후에 도달하였고, 최소한 60분은 지속되었다. MN-1 세포에서 GDNF가 유도하는 c-RET 인산화의 사용량에 따른 응답 분석에서는 30ng/ml의 GDNF에서 최대의 인산화를 보였는데(도11b), 이는 혈청이 제거된 MN-1 세포(도10a) 및 배 교감 뉴론(Trupp et al., 상기 참조)의 GDNF에 대한 응답과 유사하다. 이를 종합하면, 이들 데이터는 c-RET 수용체가 GDNF의 신호전달 기작에서 중요한 성분일 수 있다는 것을 나타낸다.

＜실시예 10＞

c-ret 형질감염은 GDNF결합 및 GDNF에 대한 생물학적 활성을 재현시킨다.

c-ret 유전자 산물의 발현이 GDNF 수용체가 없는 세포들이 GDNF와 결합할 수 있게 하는데 충분할 수 있는지를 판단하는 실험이 수행되었다. 이 목적을 위하여, 형질감염 안된 3T3 섬유아세포, 및 야생형 c-ret 또는 MEN2a 환자에서 발견되는 c-ret의 종양성 변형(Mulligan et al., Nature, 363: 458-460, 1993) 중의 하나로 안정적으로 형질감염된 3T3 세포에 대하여 GDNF 결합 및 교차 연결 실험이 수행되었다. 형질감염된 세포에서 c-ret의 발현을 위하여, 인간의 야생형 c-ret 및 MEN2a-ret cDNA를 pcDNA3(Invitrogen)에 서브클로닝하였다. Cold(비표지) GDNF는 50배의 몰 과량으로 사용되었다. 생존/성장 실험을 위하여, 세포를 주어진 농도의 GDNF가 보충된 혈청이 제거된 배지에서 6일 동안 배양하였다(배지와 GDNF는 매 2일 마다 교체하였다). 세포수는 에시드 포스퍼타제 활성(Clontech)의 측정으로 정량화하였다.

c-RET 항체로의 면역침전 후, GDNF 표지된 약 180K의 수용체 복합체가 MEN2a-ret 및 c-ret 형질감염된 3T3 섬유아세포에서는 검출되었으나 형질감염되지 않은 세포에서는 검출되지 않았다(도12a). 이 표지는 과량의 cold(비표지) GDNF로 치환될 수 있는데, 이는 이것이 특이적 GDNF 결합을 함을 나타낸다(도12a).

c-ret가 비응답성 세포에 형질감염시 GDNF에 대하여 생물학적 반응을 매개할 수 있는지를 판단하는 실험이 또한 수행되었다. 혈청이 제거된 배지에서 배양시킨 형질감염되지 않은 섬유아세포 및 c-ret 형질감염된 3T3 섬유아세포에서 GDNF에 대한 생존 및 성장 반응을 연구하였다. GDNF는 c-ret 형질감염된 세포에서는 사용량에 의존적인 세포수의 증가를 유발하였으나, 형질감염되지 않은 3T3 세포에서는 그렇지 않았다(도12b). 이는 혈청이 제거된 MN-1 세포에서의 이전 관찰과 비교할만하다. 순수한 3T3 세포는 형질감염 전에는 감지할만한 양의 GDNF 수용체를 발현시키지 않기 때문에(도 12a 참조), c-ret 발현이 이들 세포에서 GDNF에 대한 생물학적 반응을 매개하는데 충분하다고 결론이 났다.

＜실시예 11＞

흑질의 adult(성숙) 뇌 및 도파민 작동성 뉴론에서의 c-ret 발현

랫 중추신경계의 다른 영역들에서의 c-ret 발현을 검사함으로써 c-ret 산물이 뇌에서 GDNF의 향신경적 영향을 매개할 수 있는지를 판단하는 실험을 수행하였다. 랫 c-ret 리보프로브(riboprobe)는 서열 U22513 및 U22514(Genbank accession numbers)의 서열에 의거한 프라이머로 PCR하여 얻은 cDNA 단편을 주형으로 사용하여 생성하였다. 많은 양의 c-ret mRNA가 MN-1 세포 및 랫 척수에서 발견되었다(데이터 도시 안함). 높은 c-ret mRNA의 발현이 시상 및 소뇌(데이터 도시 안함)에서 뿐만 아니라, adult 뇌교, 수질, 청반 및 시상하부(도13a)에서 발견되었다. 선조체, 해마, 소뇌 피질(도13a)에서는 c-ret mRNA가 겨우 검출될 만큼의 양으로 발현되었다. GDNF 응답성 도파민 작동성 뉴런의 세포체(cell body)를 함유하는 복측 중뇌에서는, c-ret mRNA 양이 생후 발생과정 도중에 점차적으로 증가한다. 발현의 최고점은 생후 6일(P6)과 8일(P8) 사이에서 관찰되었고, 이 때에 흑질의 도파민 작동성 뉴론의 액손이 선조체를 침입하기 시작하고, 이는 이 표적 영역에서의 GDNF mRNA의 발현의 증가와도 일치한다(도13b). mRNA의 정량화를 위하여, 글리세르알데히드-3-P-디히드로게나제(GAPDH) 리보프로브를 RPA에 포함시키고, 젤 방사선 사진을 농도측정기로 스캐닝하여 얻은 상대적인 mRNA 발현의 값을 각 RNA시료의 GAPDH 신호를 이용하여 표준화하였다. GDNF mRNA를 위한 RPA는 이전에 기술되었었다(Trupp et al., 상기 참조).

in situ 혼성화 및 면역조직화학적 분석은 이전에 기술한 바와 같이 수행되었다(Arenas, E. ＆ Persson, H. Nature 367, 368-371)(1994); Neveu, I ＆ Arenas, E. J.Cell Biol.발간중(1996)). c-RET 단백질은 랫 c-RET(Lo, 상기 참조)도 또한 인식하는 햄스터 모노클로날 항-생쥐 c-RET 항체 및 이어서 플루오레세인이 축합된 토끼 항-햄스터 2차 항체(Southern Biotechnologies)를 이용하여 검출하였다. 성숙 흑질의 섹션상에 행한 in situ 혼성화는 이 구조의 전반적 뉴론에서 강한 표지를 나타내었다(도14a-b). 또한, c-RET 유사 면역반응성에 대하여 양성인 세포(c-RET-L1)가 세포체에서 강한 표지를 가지고, 성숙 흑질 전체에서 발견되었다(도14c).

성숙 흑질에서의 c-ret 발현이 도파민 작동성 뉴론에 국한된 것이라는 것을 확인하기 위하여, 6-히드록시도파민(6-OHDA)을 일측면에 주사하여 이들 세포들을 선택적으로 병변시키고, in situ 혼성화로 이들 세포의 c-ret mRNA의 발현을 분석하였다. 흑질의 도파민 작동성 뉴론의 병변은 중간 전뇌 번들에 하기의 좌표로 8 pig 6-OHDA의 입체공간적 주사로 수행하였다(1.6 mm의 꼬리점에서 정수리점, 1.3 mm의 측방에서 중앙선 및 청각간 라인(interaural line)을 넘어 인사이서 바(incisor bar) 5 mm의 경막표면하 8.4 mm). 6-OHDA 주사 30분 전에, 동물에게 25 mg/kg 데시프라민(decipramine)을 복강적으로 예비처리하였다. 3μl의 배지중의 0.75×10⁶의 GDNF 발현 섬유아세포를 하기의 좌표로 수프라니그럴하게(supranigrally)주사하였다(청각간 라인으로부터 3.1mm, 측방에서 중앙선까지 2 mm 및 -3.3 mm에서의 인사이서 바(incisor bar)를 갖는 경막표면하 7 mm). 청반에서의 병변 및 이식은 이전에 기술되었었다(Arenas et al., Neuron 15, 1465-1473(1995)). GDNF 발현 섬유아세포의 생성 및 특성화는 이전에 기술되었었다(Arenas et al., 상기 참조).

병변 5시간 후, 동일 및 반대측면 사이에서 c-ret mRNA 발현의 차이를 발견할 수 없었다(도14d). 그러나, 6-OHDA 처리후 이미 하루만에 병변된 흑질에서 c-ret mRNA 발현의 현저한 감소가 관찰되었고, 병변 후 5일째는 거의 사라졌다(도14d). 그러나 병변의 반대측면에서의 c-ret mRNA 발현은 영향이 없었다(도 14d). 이 결과는 성숙 흑질에서 c-ret mRNA의 발현은 도파민 작동성 뉴런에 국한된 것임을 나타낸다.

＜실시예 12＞

GDNF는 c-RET 양성인 도파민 작동성 및 노르아드레날린 작동성 뉴론을 구제한다.

c-RET를 발현하는 성숙 흑질 및 청반의 뉴론들이 GDNF에 응답하는지를 판단하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해, 흑질의 도파민 작동성 뉴론을 6-OHDA로 병변시키고, 이어서 GDNF를 발현하는 섬유아세포의 이식이 c-RET 면역반응성 뉴론상에 응답을 유발하는지를 판단하는 시험을 하였다. 대조군 섬유아세포의 이식을 받은 병변된 동물에서는 c-RET-L1을 검출할 수 없었는데, 이는 성숙 흑질에서 도파민 작동성 뉴론의 선택적인 병변에 의해 c-ret 발현 세포가 고갈되었음을 나타낸다(도14e). 그러나, c-RET-L1은 GDNF를 발현하는 이식에 의해 구제될 수 있고, 여기서 c-RET 면역 양성 섬유가 이식체를 둘러싸고 투과하는 것을 볼 수 있다(도14f). 청반에서도 유사한 결과가 얻어졌는데, 6-OHDA로 병변시키면 c-RET 면역반응성 세포체가 고갈되는데(도14g) 이는 GDNF의 외부적 투여에 의하여 구제될 수 있었다(도14h). 양쪽의 뇌 영역에서, c-RET-L1 양성 세포의 구제 및 GDNF를 발현하는 섬유아세포로 이식된 동물에서의 급속 성장은 티로신 히드록실라제 면역반응성의 것과 일치하였는데(데이터 도시 안함), 이는 c-RET를 발현하는 성숙 도파민 작동성 뉴론 및 노르아드레날린 작동성 뉴론들이 GDNF에 응답하는 것을 증명한다.

＜실시예 13＞

GDNF c-RET 수용체들의 동정

PC12 세포 및 NB2/a 세포들을 각각 혈청이 없는 RPMI-1640 또는 DMEM으로 세번씩 세척하고, 50ng/ml의 GDNF(Peprotech EC Ltd.)의 존재 및 부존재에서 코팅되지 않은 접시(NB2/a 세포) 또는 콜라겐으로 코팅된 접시(PC12 세포)에 접시당 5000 내지 6000개의 세포농도로 플레이팅하고, 48시간 후 세포의 수를 현미경적으로 계수하였다. PC12 및 NB2/a 세포를 수거하여(100,000 세포들, 5개 유사물들), 얼음에서 120-150분 동안 50배의 비표지 GDNF의 존재 또는 부존재에서, 10ng/ml의 인간¹²⁵I-GDNF(Chloramine T 방법으로 요오드화시킴, 100μCi/μg)으로 배양하고, 비결합 인자들은 30% 수크로스 쿠션(cushion)을 통하여 원심분리하여 제거하고, 세포와 결합한 방사능은 1271 RIAGAMMA 계수기(LKB Wallac)로 계수하였다.

재조합 인간 GDNF는 50ng/ml의 농도에서 혈청이 제거된 랫 갈색세포종 PC12세포의 약 20%의 생존을 촉진하였다(도15a). 혈청이 제거된 PC 12세포는 또한 신경성장인자(NGF)에 의해서도 유지되었다. NGF로의 처리시, PC12세포는 또한 분열을 멈추고, 교감성 뉴론 유사의 긴 뉴라이트(neurite)를 가지는 세포로 분화하였다. 따라서 GDNF는 NGF보다는 덜 강력하지만, PC12세포의 생존 촉진 인자이고, 연구된 농도에서는 PC12세포의 분화를 유도하지는 않았는데, 이는 주로 NGF 활성 trkA 수용체와 GDNF 수용체의 신호전달의 차이 때문인 것같다.

인간 신경아세포종 NB2/a 세포를 혈청이 제거된 배지에 50 ng/ml의 GDNF의 존재 및 부존재에서 플레이팅하고, 배양 48시간 후 세포수를 계수하였다. GDNF는 NB2/a 세포수를 현저히 증가시켰다(도15b). 원숭이 COS 세포, 인간 SY5Y 세포 및 생쥐 NIH 3T3 세포는 GDNF에 대하여 유사분열 촉진성 응답 또는 생존 응답을 보이지 않았다(데이터 도시 안함). 따라서, GDNF는 랫 PC12 세포 및 인간 NB2/a 세포에 생물학적 효과를 발휘하고, 이는 이들 세포주가 모두 기능성 GDNF 수용체를 발현한다는 것을 나타낸다.

GDNF가 응답성 세포에 결합하는지를 판단하기 위하여, 도15의 설명에서 나타낸 바와같이 PC12 세포 및 NB2/a 세포를 40℃에서¹²⁵I-표지된 인간 GDNF로 배양하였다. 도15c에 도시된 바와 같이, PC12 및 NB2/a 세포주 모두 효과적으로 GDNF 30에 결합한다. 더욱 중요하게는,¹²⁵I-표지된 GDNF의 결합은 50배 과량의 비표지 GDNF와 경쟁할 수 있다(도15b). 따라서, PC12 및 NB2/a 세포상의 수용체에 대한 GDNF의 결합은 특이적인 것으로 보인다.

＜실시예 14＞

GDNF-c-RET 결합 성분들의 동정

PC12세포, SY5Y 신경아세포종 세포 및 NB2/a 세포를 EDC로¹²⁵I-GDNF에 화학적으로 교차 연결시켰다. 3-5×10⁶세포 또는 2E20 랫 신장으로부터의 기계적으로 해체된 세포들을 얼음에서 1시간 동안 10ng/ml의¹²⁵I-GDNF와 함께 배양하고, 얼음상에서 30분 동안 30mM EDAC(Pierce)로 교차 연결시켰다. 세제 용혈물을 면역침전시키고, 침전물을 단백질 A-세파로스로 수거하고, 7% SDS-PAGE상에서 분리하여 Phosphorimager SI(Molecular Dynamics)로 가시화하였다.

생성된 복합체를 GDNF에 대한 토끼 항체로 면역침전시키고, SDS-PAGE로 분석하여 방사선 사진으로 가시화하였다. GDNF 수용체원으로 추정되는 배 신장 세포를 연구하였다(Suvanto, P. et al., Eur. J. Neurosci., 8, 101-107(1996); Sainio, K. et al., Nature, (1996) 제출됨). PC12세포, SY5Y 세포 및 NB2/a 세포 추출물로부터 170 및 190 kD의 교차 연결된 복합체를 얻었고, 배 신장 추출물로부터 190kD의 복합체를 얻었다(도16).

교차 연결된 단백질에서 약 25-30kD의 GDNF를 뺀 분자량은, 정확하지는 않으나, 실질적으로 c-RET 원종양유전자, 올판(orphan) 수용체 티로신 키나제의 분자량에 해당한다(Takahashi, M., Ritz, J. ＆ Cooper G. M. Cell, 42, 581-588, 1985; Takahashi, M. et al., Oncogene, 3, 571-578, 1988)(c-RET의 상이하게 글리코실화된 형을 나타내는 140 kD 및 160 kD; Tsuzuki, T., Takahashi, M., Asai, N., lwashita, T., Matsuyama, M. ＆ Asai, J. Oncogene, 10, 191-198, 1995).

＜실시예 15＞

GDNF의 c-RET에의 친화성 교차 연결

교차 연결된 복합체를 c-RET 수용체의 세포밖부분 및 세포내 부분을 인식하는 항체들의 혼성물을 가지고 NB2/a 세포로부터 면역침전시켰다. 도17a(lane 1)에 도시된 바와 같이, 170kD 및 190kD의 복합체는 c-RET 항체에 의해 침전되고, 따라서 교차 연결된 GDNF-c-RET 복합체에 해당한다.¹²⁵I-GDNF의 c-RET 단백질에의 결합은 비표지된 GDNF를 500배 과량 사용시 완전히 파괴된다(lane 2). 모노클로날 항-뉴로필라멘트 항체(lane 3) 또는 단백질 A-세파로스(lane 4)만에 대하여는 어떤 단백질도 침전하지 않았다. COS 세포로부터는 교차 연결된 복합체를 얻을 수 없었다(도시 안함). c-ret 원종양유전자는 당단백질이기 때문에,¹²⁵I-표지된 NB2/a 세포 추출물은 또한 맥아 응집소로 면역침전되었다. 또한, 170 및 190 kD의 단백질이 얻어졌다(Lane 5).

GDNF가 c-RET에 특이적으로 결합하는 것을 더욱 확실히 하기 위하여, 생쥐 c-ret cDNA를 포유류 발현 벡터 PBK-CMV에 클로닝하고 원숭이 COS 세포에서 일시적으로 발현시켰다. pbluescript SK'(Stratagene)내의 생쥐 c-ret cDNA(Pachnis, V., Mankoo, B, ＆ Costantini, F. Development, 119, 1005-1017, 1993)를 SacII 및 EcoRV로 잘라서 pBK-CNV 벡터(Stratagene)의 SacII 및 SmaI 자리에 클로닝하였다. 공동 형질감염된 PEF-BOS 벡터내 레드 시프트 그린 플루오레슨트 단백질(Red Shift Green Fluorescent Protein)의 형광에 의한 -30% 효율성을 갖는 전기적투과(electroporation; Bio Rad)를 이용하여 COS 세포를 c-ret cDNA 또는 빈 플라즈미드로 순간적으로 형질감염시켰다. 48시간 후, 10×10⁶형질전환된 COS 세포 또는 3-5×10⁶선친 COS 세포 또는 NB2/a 세포에¹²⁵I-GDNF를 처리하고, 교차 연결시킨 후, 도15 및 도16의 설명에서 특정한 바와 같이 분석하였다.

우선, c-RET 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 검사하였다. c-ret 형질감염된 COS 세포(도18a) 및 NB2/a 세포(도시 안함)는 측정가능한 양의 c-RET 단백질을 발현시켰지만, 가상 형질감염된(PBK-CMV 플라즈미드로) COS 세포(도18a)에서는 c-RET 단백질이 검출되지 않았다. PC12 세포는 또한 NB2/a 세포 또는 c-ret 형질감염된 COS세포(도시 안함) 보다는 상당히 낮은 양이지만 c-RET 단백질을 발현시킨다. 생쥐 c-ret 원종양유전자를 일시적으로 발현시키는 COS 세포를¹²⁵I-GDNF와 인큐베이션시켰다. 도17b에 도시된 바와 같이, 이들 세포들은 GDNF에 결합하고,¹²⁵I-GDNF의 결합은 과량의 비표지 GDNF와 경쟁할 수 있다. 대조적으로, 가상-형질감염된 COS 세포에서는 상당한 GDNF의 결합이 관찰되지 않았다.

＜실시예 16＞

티로신 잔기의 인산화

10 x 10⁶의 형질 감염된 COS 세포(감염후 48 시간 후)를 혈청이 없는 DMEM 내에서 5 분간 50 ng/ml의 GDNF(Preprotech EC Ldt.)으로 처리하거나, 또는 처리하지 않고 이어서 동일한 배지로 신속하게 세척하였다. NB2/a 세포를 유사하게 처리하였다(결과는 표시하지 않음). c-RET 단백질을 단일클론 항-c-ret 항체(Lo, L. ＆ Anderson, D. J. Neuron, 15, 527-539 (1995)) 및 폴리클론(Santa Cruz) 항-c-ret 항체의 혼합물에 의하여 세제 추출로부터 면역침전시키고, 7% SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로오스에 옮기고, 항-c-ret 항체(Santa Cruz)로 프로브하고, 떼어낸 후 항-인산화티로신 항체(Sigma)로 재프로브하였다.

이러한 처리는 170 kD 형은 현저하지 않게 인산화시키면서, 190 kD의 cRET 원 종양유전자의 티로신 인산화는 현저한 증가를 초래하였다(도 18b). 두 세포주 모두에서, 높은 c-RET 인산화가 대개의 경우 이러한 세포가 분비하는 내생적 GDNF 및/또는 리간드-비의존적인 수용체 이량체화를 통하여, GDNF 부재의 경우에도 관측될 수 있었다(도 18).

＜실시예 17＞

¹²⁵1-GDNF가 c-ret-양성 장 뉴론에 결합한다

¹²⁵1-GDNF는 in situ 발생 도중의 랫 쥐 조직 이식체에 결합하였다. 클로르아민 티 방법(Chloramine T Method)에 의하여 요오드화되는 인간¹²⁵1-GDNF(PreproTech. EC Ltd.)의 in situ 결합은 본질적으로 (Partanen 및 Thesleff, 1987)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 요약하면, E15 랫 창자의 이식체를 상온에서 90 분간 뉴클레오포어 필터(Costar) 상에서 이글의 최소 필수 배지 내의¹²⁵1-GDNF 10 ng/ml와 함께 성장시켰다. 250-배 과량의 비표지 GDNF를 이식체를 제어하기 위한 경쟁물질로서 첨가하였다. 주의하여 세척한 후에, 상기 이식체를 PBS 중 3.5% 파라포름알데히드 3.5%로 고정시키고, 섹션하여 NTB-2 에멀젼(Kodak)에 노출시켰다.

GDNF mRNA를 강하게 발현시키고(Suvanto et al., 1996; 도 19 a 및 b), c-RET-양성 뉴론이 c-ret-결핍 생쥐의 위장관에는 존재하지 않기 때문에(Schuchart et al., 1994: Durbec et al., 1996) 위장관을 선택하였다.¹²⁵1-GDNF는 발생 후(E) 15일된 랫 창자의 근육층 내의 세포군에 결합한다(도 19 c 및 d). 이러한 결합은 총 150-배 과량의 비표지 GDNF과 경쟁하므로 특이적이다(도 19h). GDNF와 결합하는 세포는 페리퍼린 면역반응성에 의하여 밝혀진바와 같이, 장근 플렉서스의 장 뉴론이었다(도 19f). 나아가, 이러한 뉴론은 in situ 혼성화에 의하여 증명되는 바와 같이 c-ret mRNA도 발현시켰다(도 19e). GDNF cDNA의 클로닝 및 GDNF 프로브와의 in situ 혼성화는 (Suvanto et al., 1996)에 기재된 바와 꼭 같이 수행하였다. c-ret의 짧은 형태(Takahashi et al., 1988)의 3'-영역을 포함하는 생쥐 c-ret cDNA의 646 bp 길이의 조각(Pachnis et al., 1993)을 pBSK + 벡터(Stratagene)의 Notl-Xhol 부위 내로 클로닝시켰다. 안티센스 및 센스 방향의 cRNA를 디그옥시제닌-UTP(Boehringer-Mannheim)으로 표지하고, E15 랫 창자의 크리오섹션에 혼성화하혀 제조자 지침에 따른 염기성 인산가수분해효소-콘쥬게이티드 항-디그옥시제닌 항체로 가시화하였다. 두 사례 모두에서, 센스 방향의 상응하는 프로브로의 혼성화로는 단지 배경 표지만이 얻어졌다(도 19g). 폴리클론 항-페리퍼린 항체(Bio-Rad)를 1:100 희석시킨 E15 랫 창자의 크리오섹션에 1 시간 동안 적용하고 FITC-컨쥬게이티드 2차 항체(Jackson)로 가시화하였다. 따라서, GDNF는 성장하는 랫의 c-RET-발현 장 뉴론에 특이적으로 결합한다.

＜실시예 18＞

c-RET에 대한 GDNF의 친화성-교차 연결

PC12 세포 및 NB2/a 세포를 혈청이 없는 RPMI-1640 또는 DMEM으로 세번 세척하고 50ng/ml의 GDNF(PreproTech EC Ltd.)의 존재 또는 부재하에서 각각 코팅되지 않은 접시(NB2a/세포) 또는 콜라겐-코팅 접시(PC12 세포)에 플레이팅시키고(접시당 5000 내지 6000개의 세포를 세개씩), 48 시간 후에 현미경으로 세포의 수를 측정하였다.

형질 감염된 세포내의 c-RET 발현을 위하여, 인간의 야생형 c-ret cDNA의 짧은 형태(Takahashi et al., 1988)을 pcDNA3(Invitrogen)내에 서브클로닝하였다. 3T3 섬유 아세포를 c-ret 발현 플라스미드 또는 빈 벡터(가상-형질 감염 세포)로 안정적으로 형질 감염시키고 양성 세포주를 G418로 선택하였다.

pcDNA3 벡터내에 인간 c-ret cDNA를 갖거나 또는 빈 벡터를 갖는 trkC 3T3 섬유 아세포(Ip et al. (1993) Neuron, 10, 137-149)의 일시적인 형질 감염은 리포펙틴 방법(lipofectin method; Gibco-BRI)으로 수행하였다. 다섯 번의 동일한 실험에서 c-ret 및 가상-형질 감염 세포(웰 당 10.000-15.000 세포)를 5일 동안 지시된 농도의 랫 GDNF(Trupp et al. (1995) J. Cell. Biol. 130, 137-148)로 처리하였다. NT-3 30 ng/ml을 양성 대조군으로서 사용하였다. 세포 수는 Abacus^TM세포 증식 키트(Clontech)를 사용하는 애시드 포스퍼타제 활성을 측정하여 정량화하였다.

3-5 x 10⁶PC12 세포, NB2/a 세포, COS 세포 또는 c-ret-3T3 및 가상-3T3 세포 또는 둘의 F20 또는 17E15 랫 신장으로부터 기계적으로 해체된 세포를 클로르아민 티 방법으로 요오드화시킨¹²⁵I-GDNF(PeproTech EC Ltd.의 인간 GDNF 또는 C. F. Ibanez로부터의 랫 GDNF)(Trupp et al., 1995) 10 ng/ml와 함께 얼음 상에서 1시간 동안 성장시켰다. 비표지 GDNF(peproTech EC) 또는 TGF-β1(M. Laiho박사가 제공) 250-배의 과량을 대조 표본에 첨가하였다.¹²⁵I-GDNF를 이어서 얼음상에서 30 분간 30 mM의 에틸-디메틸아미노프로필 카르보디이미드(EDAC)(Pierce)로 세포에 교차 연결시켰다. 세포의 세제 용혈물을 폴리클론 항-GDNF 항체(Santa Cruz) 또는 대조 항체로서 사용되는 뉴로필라멘트 단백질(I. Virtanen 박사가 제공)에 대한 단일클론 항-c-RET 항체(Lo and Anderson의 D. Anderson 박사가 1995년 제공) 및 폴리클론 항-c-RET 항체(Santa Cruz)의 혼합물로 면역 침전시켰다. 침전물을 단백질 A-세파로스(Pharmacia) 또는 WGA-아가로스(O. Renkonen박사가 제공)으로 수집하고 7% SDS-PAGE 상에서 분리하고 Phosphorimager SI(Molecular DynanLics)로 가시화하였다.

우선,¹²⁵1-GDNF를 PC12 세포, NB2/a 세포 및 COS 세포에 에틸-디메틸아미노프로필 카르보디이미드(EDAC)로 교차 연결시키고, 복합체를 항-GDNF 항체로 침전시켰다. 도 20a에 나타난 바와 같이, 분자량 190 및 170 kD를 가지는 복합체를 PC12 및 NB2/A 세포로부터 얻었으나 COS 세포로부터는 얻지 못했다. 교차 연결된 단백질의 분자량(마이너스 ~25K의 GDNF 단량체)는 c-RET의 분자량(각각 부분적으로 및 완전히 글리코실화된 c-RET의 이소 형태를 나타내는 140 및 160 kD)에 상응한다(Takahashi et al., 1988).

다음으로,¹²⁵1-GDNF를 EDAC로 PC12 및 NB2/a 세포에 교차 연결시키고 항-c-RET 항체로 형성된 복합체를 면역침전시켰다. 190 kD 분자량의 밴드가 두 세포주으로부터 모두 얻어졌다(도 20a 및 b). 복합체의 형성은 비표지 GDNF의 500-배 과량에 의해서 해체되었다. c-RET의 완전히 및 부분적으로 글리코실화된 형태 모두가 항-GDNF 항체에 의하여 침전되지만 항-c-RET 항체에 의한 것은 단지 더 큰 이소 형태만 침전되는 이유는 불확실하다. 훨씬 약하지만 동일한 복합체가 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)를 교차 연결제로서 사용할 경우에 또한 얻어졌다(데이터는 나타나 있지 않음).

EDAC-교차 연결 접근법은 c-ret mRNA가 성장하는 요관 가지의 말단에서 강하게 발현되는 E15 배아 신장 세포로부터 GDNF-c-RET 복합체를 밝혀내는데 사용될 수도 있다. 항-GDNF 및 항-c-RET 항체 양자를 사용하여 과량의 비표지 GDNF와 경쟁하는 190 kD의 밴드를 얻었다(도 20 a 및 b). 따라서 단지 c-RET의 완전히 글리코실화된 형태만이 배아 신장 세포내에서 발현된다.

c-ret를 전위적으로 발현하는 세포로부터 교차 연결된¹²⁵1-GDNF-c-RET 복합체가 또한 증명되었다. 3T3 세포를 c-ret cDNA 또는 빈 플라스미드로 형질 감염시키고 안정한 감염 세포주(c-ret 3T3 세포 또는 가상-3T3 세포)를 만들었다. 이러한 세포에¹²⁵1-GDNF를 교차 연결시키고 이어서 항-RET-침전시키는 것에 의하여, 비표지 GDNF의 250-배 과량에 의하여 해체되는 190 kD 밴드를 밝혀내었다(도 20b). GDNF가 TGF-β 족의 먼 친척의 일원이므로, 본 출원인은 또한 TGF-β1의 250-배 과량을 경쟁체로서 사용하였다. TGF-β1과의 경쟁은 관측되지 않았다(도 20b)는 사실을 함께 고려하면, 이들 데이터는 GDNF가 c-RET에 직접적이고 특이적으로 결합한다는 사실을 나타낸다.

＜실시예 19＞

GDNF는 c-RET의 티로신 인산화를 특이적으로 증가시킨다.

c-ret-3T3 세포 및 가상-3T3 세포를 GDNF로 처리하고 이들 세포로부터의 단백질을 항-c-RET 항체로 면역 침전시켰다. 침전된 단백질을 이어서 항-인산화티로신 항체로 웨스턴 블로팅하여 분석하였다.

10 x 10⁶c-ret-3T3 세포를 1 mM의 Na₃VO₄를 함유하는 혈청이 없는 둘베코(Dulbecco)의 개질된 이글스 배지 내에서 5분 동안 상이한 분량의 GDNF(PeproTech LC Ltd. 또는 C. F. Ibanez)(Trupp et al., 1995) 또는 표시된 시간동안 50 ng/ml의 GDNF로 처리하고 이어서 신속하게 동일한 배지로 세척하였다. c-RET 단백질을 1mM Na₃VO₄를 함유하는 세제 추출물로부터 단일클론 항-c-RET 항체(Lo, L 및 Anderson, D. J. (1995) Neuron, 15 527-539) 및 폴리클론 항-c-RET 항체(Santa Cruz)의 혼합물을 사용하여 면역침전시키고, 7% SDS-PAGE로 분리시키고, 니트로셀룰로오스에 옮기고 이것을 항-인산화티로신 항체 PY20(Transduction Laboratories)로 프로브시킨 후, 떼어내고, 항-c-RET 항체(Santa Cruz)로 재프로브하였다.

도 21a에 나타난 바와 같이, c-ret-3T3 세포에 GDNF를 양-의존적(25 ng/ml에서 시작)으로 짧게 처리하는 것은 160 kD c-RET 이소 형태의 티로신 인산화를 증가시키는 반면에 140 kD 이소 형태의 인산화는 변화가 없었다. c-RET 인산화의 증가는 25ng/ml 및 그 이상의 GDNF에서 명백하였다. 가상-3T3 세포에서는 c-RET 단백질이 감지되지 않았다. c-ret-3T3 세포에 또한 상이한 시간 동안 GDNF(50 ng/ml)을 처리하였다. 처리 5 분후 c-RET 티로신 인산화가 명백하였고 적어도 1 시간 이상 지속되었다(도 21 b). 연장된 노출에 의하여, 낮은 c-RET 이소 형태의 인산화의 증가도 명백해졌다. 상기 수용체의 리간드-비의존적인 이량체화에 의하여 발생할 것같은 기준 수준의 c-RET 인산화가 GDNF의 부재하에서 관측되었다. 이들 실험에서 c-RET 단백질의 양을 밝히기 위하여, 필터에서 항체를 떼어내고 항-c-RET 항체로 재프로브하였다. c-ret-3T3 세포 내에서 c-RET 단백질의 양은 GDNF 처리에 의하여 변하지 않았다(도 21 a 및 b, 하부 패널). GDNF가 특이적으로 c-RET를 활성화한다는 사실의 발견은 c-RET가 GDNF에 대한 신호 전달 수용체라는 사실을 나타낸다.

＜실시예 2＞

c-RET 발현은 3T3 세포에 대한 GDNF-응답성을 부여한다.

trkC(trkC-3T3)(Ip et al, 1993)을 발현하는 생쥐 3T3 섬유 아세포 세포주를 일시적으로 c-ret 발현 플라스미드로 형질전환시켰다. trkC-3T3 세포는 trkC 리간드 뉴로트로핀-3(NT-3)(Ip et al., 1993)의 부재하에는 혈청이 없는 배지에서 2-3일내에 사멸하고 감지가능한 양의 c-ret를 발현하지 않는다. GDNF는 c-ret-형질감염된 trkC-3T3 세포의 수를 양-의존적으로 증가시키지만 가상-형질 감염 trkC-3T3 세포의 수를 증가시키지는 않는데(도 22), 이는 NT-3에 의하여 초래된 반응에 필적하였다. 이것이 증식적 응답인지 생존-촉진 응답인지의 여부는 데이터 상으로는 구분 할 수 없었다. 따라서, GDNF-비응답성 세포에 c-RET를 도입하는 것은 GDNF에 대한 생물학적 응답을 초래하기에 충분하다.

＜실시예 21＞

GDNF 수용체의 단리

L6 근모세포를 1% NP40으로 용혈시키고 세포 용혈물을 Q-세파로스 컬럼상에서 음이온 교환에 의하여 분획하였다. 상이한 이온력에서 용출된 분획을 투석하고 Biacore device(Pharmacia)내의 칩상에 고착된 GDNF에 대한 결합도를 측정하였다. 상이한 결합 성분이 L6 세포 용혈물의 분획에서 감지되었다(도 23a). 도면에서, 굵은 막대는 총 단백질(280 nm에서의 흡수도), 빗금 막대는 GDNF 검출(레조넌스 단위(in resonance units))을 나타낸다. 이러한 분획은 특히 단백질이 풍부하지는 않고, 이는 전체 단백질 혼합물에 대한 실질적인 정제를 의미한다. COS 세포 용혈물의 동일한 분획은 동일한 조건하에서 결합을 보이지 않는다(데이터는 나타내지 않았음).

첫번째 1 M 염 분획내의 GDNF 결합 활성의 추가적인 정제는 소수성 상호작용 크로마토그래피 후에 얻었다(도 23b). 데이터는 GDNF 결합(레조넌스 단위) 및 단백질 농도(280 nm에서의 OD) 사이의 비를 나타낸다. 분획은 황산암모늄의 단계적인 구배용액으로 용출하였다.

대안적으로, 정제는 방사성 표지 리간드의 흔적량의 존재하에서 세포에 GDNF를 교차 연결시켜서 촉진될 수 있고, 리간드/수용체 복합체는 이온 교환 크로마토그래피에 이은 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 SDS/PAGE에 의하여 분획될 수 있다. GDNF-수용체 복합체의 분자량에 상응하는 밴드는 도려내고, 분해시키고 이어서 회수율에 따라서 질량분석기 또는 에드만 분해에 의하여 서열이 결정될 수 있다.

＜실시예 22＞

뇌의 신규한 GDNF-결합 단백질

리간드-블롯팅에 의하여, 본 출원인은 전체 뇌 추출물로부터 또다른 GDNF-결합 단백질을 식별해내었다. 본 출원인은 뇌 및 간의 전체 추출물로부터의 단백질을 함유하는 필터에¹²⁵I-GDNF를 결합시켰다(리간드 블롯 실험). 약 50 kD의 분자량을 가지는 주 밴드가 뇌 추출물로부터 얻어졌지만 간으로부터는 얻어지지 않았다(도 24). 이러한 결합은¹²⁵I-GDNF가 전체 용혈물로부터의 다른 단백질에는 결합하지 않으므로 특이적이고, 간 용혈물에서는 발견되지 않으며(기타 일부 세포조직에서도 발견되지 않음), 과량의 비표지 GDNF와 경쟁할 수 있다.

¹²⁵I-GDNF가 c-RET에 결합하는 것은 리간드 블롯에서는 밝혀지지 않았다. 그 이유는 전체 뇌 추출물내의 매우 낮은 c-RET 비율 때문일 수 있다. 대안적으로, GDNF에 대한 다른 수용체와 유사하게 GDNF가 c-RET에 직접 결합하지는 않고, 먼저 또다른 비신호 전달 수용체에 결합하고 이어서 신호 전달 수용체인 c-RET에 대한 리간드를 제시할 수도 있다. 50 kD GDNF-결합 단백질은 추정되는 제시 수용체에 대한 양호한 후보이다.

＜실시예 23＞

GDNF에 대한 신규한 신호 전달 수용체의 분리를 위한 프로토콜

혈청의 부재하에서, 3T3 섬유 아세포는 적절한 수용체가 세포 표면에 발현되는 경우, 주어진 외래의 성장 인자에 의존적이 되도록 제조될 수 있다. 발현 라이브러리가 RN33B cDNA를 사용하여 제조될 수 있고, 이것은 이어서 본 기술분야에 공지된 공정에 의하여 3T3 섬유 아세포 내로 형질감염될 수 있다(Maniatis et al., 상기 참조). 적절한 감염체는 GDNF가 보충된 혈청이 없는 배지내에서 선별될 수 있다. 신호 전달 GDNF 수용체를 발현하는 섬유 아세포 클론은 혈청이 없는 배지내에서 GDNF의 존재하에서 선별적으로 성장할 것이다. 선별 단계는 그들의 차동적인 성장 잇점때문에 매우 희귀한 클론조차도 감지할 수 있게 한다. 회수된 클론을 GDNF가 있거나 없는 배지에서 부수적으로 분석하여 GDNF-비의존적 생존 클론으로부터 GDNF-의존적 생존할 수 있다.

＜실시예 24＞

GDNF-β의 클로닝 및 서열화

랫(Rat):

NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 공개적으로 이용가능한 게놈 데이타베이스의 BLAST 서치를 Jing et al.(1996) Cell 85: 1113-1124(본원에 참고문헌으로 포함됨)에 보고된 바와 같은 GDNFR-α에 대한 아미노산 서열을 사용하여 수행하였다. 서치는 GDNFR-α에 대한 동족성을 가지는 몇몇의 인간 ESTs를 밝혀내었다. 이러한 서열로부터 프라이머를 디자인하였고 부분적인 cDNA 클론을 인간의 태아 뇌 RNA로부터 증폭시켰다. 상류 PCR 프라이머는 5'ATGGATCCGCAACCTGAATGACAACTGC3'[SEQ ID NO: 3] 이다. 하류 PCR 프라이머는 5'CCGAATTCAGTTGGGCTTCTCCTTGTC3'[SEQ ID NO:4] 이다. 이 cDNA 클론은 랫 뇌 cDNA 라이브러리를 스크린하기 위하여 사용되었고 이로부터 거의 완전한 cDNA가 단리되었다. 추가적인 PCRs가 이 cDNA의 가장 5'쪽을 클로닝하기 위하여 사용되었다. 완전한 cDNA 서열이 도 32에 나타나 있다(SEQ ID NO: 5). 완전한 cDNA 클론의 아미노산 서열이 도 25에 결정되어 나타나 있다. 그것은 464 개의 아미노산 길이를 가진다. 추정적인 신호 펩티드 및 GPI 부착 모티프가 각각 N-말단 15 및 C-말단 17 아미노산 잔기내에서 식별되었다.

인간:

랫 GDNERR-α 서열(6 GenBank^TMaccession number U59486)을 인간의 EST 데이터베이스를 스크린하기 위하여 사용하였고 밀접한 유사성(200 bp에 걸쳐서 동일성이 70%를 초과)을 가진 6의 상이한 클론으로부터의 8의 인간 서열을 식별하였다(GenBank^TMaccession numbers H12981, H05619, R02135, RO2249, T03342, W73681, W73633 및 Z43761). 세개의 EST 클론의 완전한 서열 분석은 본발명자가 인간 EST GDNFR-β cDNA라고 지적하는(도 33에서 뉴클레오티드 469-1490) 3'-말단 공통 서열을 밝혀내었다.

완전한 cDNA를 얻기 위하여, 인간 EST GDNFR-β cDNA를 성숙한 랫 뇌의 해마 cDNA 라이브러리(λZap, Stratagene)을 스크린하기 위하여 사용하였다. 백만 개 중에 두개의 동일한 클론이 프로브에 대하여 91%의 동일성을 가진 2002 염기쌍 길이를 함유하였다. 랫 GDNFR-β 서열로부터 디자인된 전방향(forward) 프라이머를 이용하여, 인간의 GDNFR-β 서열의 5'-말단을 인간의 전체 뇌 cDNA로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 인간의 전체 RNA는 표준적인 방법에 의하여 추출되어 슈퍼스크립트(superscript) II(Life Technologies) 프로토콜에 기재되어 있는 바와 같은 임의적-프라이머 반응(random-primed reaction) 역전사하였다. 인간의 GDNFR-β 유전자를 하기의 PCR 조건하에서 cDNA로부터 증폭하였다: 200 μM 농도의 dNTP 및 1 μM 농도의 프라이머(전방향) 5'-ATGATCTTGGCAAACGCCTTCTG-3[SEQ ID NO:6] 및 (역방향) 5'-TTGCAGTTGTCATTCAGGTTGC-3'[SEQ ID NO:7], 대략 5 ng의 인간 뇌 cDNA, 1 u의 Dynazyme(Finnzymes) Taq 중합효소를 합하여 50 μl. 초기의 94℃에서의 5분 후에, 94℃에서 30 초, 57℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 이루어진 30 사이클이 72℃에서 최종적으로 5분간 연장되었다. PCR 조각들을 pGEM-T 벡터(Promega)내로 클로닝하고 네개의 상이한 클론을 서열화하였다. 몇몇의 프라이머 쌍을 가지고 완전한 GDNFR-β cDNA 서열을 동일한 인간 뇌 cDNA로부터의 PCR에 의하여 증폭하였다. 이 서열은 EST-유래된 서열과 동일하였다. EST 및 PCR 조각의 중첩 삽입이 조합 및 클론되어 완전한-길이의 인간 cDNA의 콘티그(contig)를 얻었다. 인간의 GDNFR-β cDNA 서열(GenBank^TMaccession number U93703)은 139 염기 쌍 길이의 개방된 읽기 프레임을 함유한다(도 33).

아미노산 수준에서, 인간 및 랫 GDNFR-β 오르토로그(orthologue)는 96% 일치하였다. 예측되는 47 kD(비클리코실화) 성숙 단백질은 발표된 인간 및 랫 GDNFR-α 단백질(Jing et al., 상기 참조) 서열과 48% 일치하고 63%까지 유사한 464 아미노산으로 구성된다(도 26). MAP(multiple alignment program)을 사용하여 어라인먼트를 수행하였다(Huang, X, Comp. Appl. BioSci., 10: 227-235, 1994). 추정적인 신호 서열은 von Heijne(Nucl. Acids. Res 14:4683-4699, 1986)에 따라서 예측되었다. GDNFR-β의 아미노산 서열은 추정적인 신호 서열, 세개의 N-글리코실화 부위 및 GDNFR-α에 유사한 추정적인 GPI-부착 부위를 가진다. 완전히 보전된 시스테인 잔기 및 GDNFR-α에 대한 전체적으로 밀접한 유사성은 GDNFR-수용체 α 및 β의 공간적인 구조의 매우 높은 유사성을 예측하게 한다(도 26).

본원에서 사용된 아미노산 일치도는 동일한 아미노산 잔기를 의미한다. 본원에서 사용된 아미노산 유사성은 동일하거나 화학적으로 유사한 아미노산 잔기를 의미한다(예를 들면, Lys는 Lys와는 동일하지만 Arg와는 유사하다).

＜실시예 25＞

GDNFR-α 및 GDNFR-β의 발현

화학적 교차 연결 연구로부터 측정된 바와 같은 GDNF 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포내에서 GDNFR-α 및 GDNFR-β에 대한 mRNA의 발현은 상기 실시예 4에 기술된 바와 같은 RNAse 보호 분석에 의하여 조사되었다. GDNFR-α mRNA는 RN33B 및 MN1 세포내에서 발견되었다(도 27). 다량의 GDNFR-β mRNA이 RN33B 세포내에서 감지되었다. 출생-후(P1)의 신장 및 MN1 세포내에서 소량 발견되었다(도 28 참조). L6 세포 내에서는 GDNFR-α 또는 GDNFR-β mRNA를 감지할 수 없었다(도 27 및 28).

GDNFR-α 및 GDNFR-β mRNA의 mRNA 발현 형태를 또한 측정하고 E17 랫 배아 내에서 in situ 혼성화에 의하여 비교하였다. E17 랫 섹션 상의 in situ 혼성화는 앞서 기재한 바와 똑같이 수행하였다(Suranto et al. Eur. J. Neurosc., 8:816-822, 1996; Wilkinson et al. in Post Implantation Mammalian Embryos a Practical Approach, IRL Press, Oxford, Copp., A. J. and Cockroft, D. L., eds. pp. 151-171, 1990, 양자 모두 본원에 참고문헌으로 포함되어 있음). 랫 GDNFR-α 및 랫 GDNFR-β에 대한 안티센스 cRNA 프로브는 GenBank^TM서열 U59486의 뉴클레오티드 294-1039 및 랫 GDNFR-β 서열의 뉴클레오티드 1231-1394를 각각 포함한다. 몇몇의 생물에서, GDNFR-α 및 GDNFR-β mRNA는 상이한, 비-중첩적인 분포를 보인다. 강한 GDNFR-β mRNA 발현은 부신 분비선의 캡슐 및 피질내에서 발견되는 반면에(도 37B), GDNFR-α mRNA는 부신 수질(도 37 C)에서 발견된다. 신장에서, GDNFR-α 전사물은 요관아의 말단, 응축된 간엽조직 및 초기 표피 세관에서 발견되는 반면에(도 37 F), GDNFR-β mRNA는 비분화된 신장형성 간엽조직 및 신우 펠비스(renal pelvis)의 근육 벽내에 존재한다(도 37 E). GDNFR-α mRNA의 강한 발현이 위장관을 따라 근육 및 신경층 내에 존재하였다(도 37 I). 소장의 장 플렉서스 내에서는 낮은 정도의 전사만이 감지되는 반면에(도 37 H), 위 내에서는 GDNFR-β mRNA가 신경층 내에 적당하게 발현되었다(나타나 있지 않음). 배아 (E)17 랫 신경계에서, GDNFR-α mRNA는 척수에서 풍부하게 발현되었고, 특히 복측 운동뉴론에서 풍부하게 발현되었다(도 37J). 또한 발형양은 중간정도였지만, GDNFR-β mRNA가 복측 운동뉴론을 포함하는 척수의 많은 부위 내에 존재하였다(도 5J,K). 배측 뿌리 및 삼차신경의 신경절에서, GDNFR-β mRNA 발현은 뉴론성 세포의 서브파퓰레이션으로 제한되었고(도 37 K, M, N), 이는 Ret mRNA 분포(Pachnis et al., Development, 119:1005-1017, 1993)와 유사하였다. 반면에, GDNFR-α 전사물의 변화하는 양이 신경절의 전체를 통하여 발견되었고(도 37 J, L, M, O) 또한 트리제미날 신경 및 척수신경을 포함하는 세포내에서 발견되었는데(도 37M, O), 이는 뉴론 세포 및 신경교 세포 모두에서의 발현을 암시한다.

＜실시예 26＞

GDNFR-α 및 GDNFR-β에 대한 GDNF의 친화 교차 연결

COS 세포를 GDNFR-α, GDNFR-β, c-RET 및 대조 플라스미드로 형질감염시키고, 친화성 교차 연결 연구를 상기 실시예 15에서와 같이 수행하였다. 결과가 도 29에 도시되어 있다. 대조 플라스미드로 형질감염된 COS 세포는 GDNF에 결합하지 않았다(레인 1 및 2). GDNFR-α cDNA로 형질감염시키고 이어서¹²⁵I-GDNF와 함께 인큐베이션시키면 대략 70 kD의 분자량을 가지는 GDNF 결합 복합체를 발생시켰다(레인 3). 이러한 복합체의 형성은 cold(비표지) GDNF와의 인큐베이션으로 억제될 수 있다(레인 4).

GDNFR-β cDNA로 형질감염시키는 것은 대략 100kD의 분자량을 가지는 GDNF 결합 복합체를 발생시켰다(레인 5). 이러한 복합체의 형성은 또한 cold(비표지) GDNF와의 인큐베이션으로 억제할 수 있다(레인 6). GDNFR-α 및 GDNFR-β 모두 c-RET에 대한¹²⁵I-GDNF의 특이적 교차 연결을 촉진하였다(레인 7 내지 10). c-Ret cDNA 단독으로 형질 감염된 COS 세포는 GDNF에 결합하지 않았다(레인 11 및 12). 분자량 마커 및 상이한 GDNF 수용체 복합체의 위치가 표시되어 있다.

＜실시예 27＞

RN33B 세포와의 교차 연결 연구에서의 복합체와 비교

차례 차례 비교할 경우, 형질감염된 COS 세포내에서 형성된 GDNF-α 및 GDNF의 복합체는 실시예 2에서 기술한 바와 같이 수행된 EDAC로의 GDNF 교차 연결 이후에 RN33B 세포 내에서 관측된 70 kD 복합체와 동일한 분자량을 가졌다(도 30의 레인 1 및 2를 비교). 감염된 COS 세포 내에서 형성된 GDNF-β 및 GDNF의 복합체는 RN33B 세포 내에서 관측된 100 kD 복합체와 동일한 분자량을 가졌다(레인 1 및 3을 비교). 155 kD 결합 복합체 내의 수용체 성분의 동일성은 알 수 없지만 이것은 식별된 135k GDNF-결합 단백질에 결합되어서 형성된다.

＜실시예 28＞

cRET의 인산화

COS 세포내로 형질감염되자마자, cRET는 GDNF의 존재여부에 관계없이 티로신 잔기가 높은 정도로 인산화된다(도 31, 상부 패널). COS 세포를 4μg의 c-Ret 플라스미드 및 16 μg의 대조 플라스미드로 형질 감염시켰다. 감염된 COS 세포를 실시예 16에 기재된 공정을 사용하여 상이한 농도의 GDNF에 노출시키고, 세포질 세포 용혈물을 항-c-RET 항체로 면역침전 시켰다. 침전된 c-RET 수용체의 티로신 인산화를 항-P-티로신 단일클론 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅에 의하여 분석하였다.

GDNFR-α 또는 GDNFR-β를 암호화하는 플라스미드와 공동 형질감염시키는 것은(대조 플라스미드를 대체하여), 양-의존적인 방식으로 수용체 티로신 인산화의 리간드 자극을 가능하게 하지만, GDNF의 부재하에서, c-RET의 티로신 인산화의 지속-상태 수준의 현저한 감쇄를 초래하였다(도 31. 상부 패널). 항-c-RET로 동일한 블롯을 다시 프로브하여서 모든 레인이 동일한 양의 c-RET를 함유하는 사실을 밝혀내었다(데이터는 나타내지 않았음).

COS-7 세포를 상이한 조합으로 GDNF 수용체를 암호화하는 cDNA로 일시적으로 형질 감염시키고 GDNF(100 ng/ml)로 처리할 경우, GDNFR-α 또는 GDNFR-β의 존재하에서만 Ret의 170 kD 형태의 인산화를 유도고(도 36, 레인 1 내지 4), 이들 수용체가 없을 경우에는 유도하지 않았다(도 36. 레인 5 내지 6). Ret의 170 kD 형태는 플라스마 막 상에서 완전히 글리코실화된 성숙한 수용체를 나타낸다(Takahashi et al. Oncogene, 3:571-578, 1988). Ret 없이 GDNFR-α 및 GDNFR-β로 공동 형질감염된 대조 세포에서는, 항-Ret 항체에 의하여 침전되는 티로신 인산화된 단백질이 없었다(도 36, 레인 7 내지 8). 동일한 결과가 GPI-부착이 결핍된 GDNFR-β 구조체를 사용할 경우 얻어졌다(데이터는 나타나 있지 않음). 미성숙한 부분적으로 글리코실화된 Ret의 150 kD 형태의 티로신 인산화는 GDNF 처리에 의하여 증가하지 않았다. GDNFR-α 형질감염된 세포에서 85 kD 밴드의 성질은 알려지지 않았다. 모든 레인에서 주 50 kD 밴드는 IgG의 무거운 사슬이다.

인간의 전체-길이 GDNFR-β cDNA를 pCDNA3(Invitrogen) 및 pBk-CMV(Stratagene) 포유류 발현 벡터내로 클로닝시켰다. 랫 GDNF-β cDNA를 동일한 발현 벡터내에 클로닝시켰다. 하나의 랫 구조물에서, 인간의 GDNFR-β cDNA의 3'-말단을 유일한 Bc1I 제한 부위를 사용하여 첨가하고, 또 다른 구조물에는 인공적인 정지 코돈을 GPI-꼬리 대신에 삽입하여 랫 GDNFR-β의 명백히 용해가능한 형태를 제조하였다.

COS-7 세포(실험 점 당 5 x 10⁶세포)을 Ret 및 GDNFR-α, Ret 및 GDNFR-β , GDNFR-α 및 GDNFR-β, 또는 Ret 단독의 cDNA(각각 5μg)로 전기투과(electroporation)(Bio-Rad)에 의해 공동 형질감염시키고 48시간 동안 배양하였다. 세포의 인산분해 효소를 1시간 동안의 1 mM의 Na₃VO₄로 억제시키고, 세포를 30분 동안 100 ng/ml의 GDNF(Promega 또는 PeproTech Ltd)로 처리하고 2 mM의 EDTA, 10%의 글리세롤, 1%의 Nonidet P-40, 1%의 트리톤 x-100 및 프로테아제 억제제를 함유하는 pH 7.5의 트리스-발란스된 염수내에서 용혈시켰다. 항-RET 항체(Snata Cruz)에 의하여 면역침전된 단백질을 항-인산화티로신 항체 PY20(Transduction Laboratories)로 웨스턴 블로팅하여 분석하였다. GPI 부착이 결핍된 GDNFR-β의 분비 형태를 가지고 행한 실험에서, 세포를 GDNF 처리 전에 세척하지 않았다.

뉴로-2A 세포는 c-RET을 내생적으로 발현하지만, 낮은 수준의 구성 수용체 티로신 인산화를 나타낸다(도 31, 하부 패널). 그러나, 상기에 기재된 공정을 사용하는 뉴로-2A 세포의 형질감염은 GDNF의 존재하에서 분량 의존적인 방식으로 c-RET 수용체의 티로신 인산화 촉진을 초래한다(도 31, 하부 패널).

＜실시예 29＞

GDNFR-β의 조직 분포

인간 GDNFR-β의 조직 분포는 상이한 성인 및 태아 조직으로 부터 추출된 mRNA의 노던 혼성화에 의하여 연구되었다. GDNFR-β mRNA의 발현은 성인의 뇌, 장 및 태반 및 태아의 뇌, 폐 및 신장에서 풍부하였다. 2.9 및 3.5 kb의 두 개의 주된 전사물은 모든 조직에서 관측되었고 부가적인 7.5 kb 전사물은 태반에서 1.4 kb는 정소에서 발견되었다(도 34).

노던 혼성화를 위하여, 100 ng의 인간 EST GDNFR-β 삽입체(insert)를 Prime-a-Gene-키트(Promega)에 의하여³²P-dCTP(Amersham)으로 표지하였다. 최종적인 프로브의 특이적 활성은 2 x 10⁷cmp/μg 이었고 인간 및 인간 태아의 여러 조직 노던 블롯 필터(Clontech)의 혼성화가 65℃에서 2 시간 동안 ExpressHyb 용액내에서 수행되었다. 필터는 50℃에서 30분간 2 x 염수 구연산나트륨(SSC) + 0.1% SDS 및 0.1 % SSC + 0.1% SDS내에서 두번 세척하였고 이어서 포스포이미저(Fuji BAS 1500)으로 분석하였다. 대조 시험으로서, 동일한 필터를 인간 β-액틴 프로브(Clontech)로 혼성화하였다.

＜실시예30＞

GDNFR-β 좌위

GDNFR-β의 염색체상의 위치가 1.49 kb 인간 GDNFR-β cDNA 프로브로 형광성 in situ 혼성화(FISH)에 의하여 인간 염색체 8p21-22에 할당되었다. 또한, 생쥐 GDNFR-β 유전자에 대한 위치가 인간 위치 8p21-22에 상응하는 생쥐 염색체 14D3-E1에 할당되었다(도 35).

인간 말초 혈액 림프세포를 배양하고 생쥐 태아 조직으로부터의 세포 배양물을 표준적인 프로토콜에 따라서 제조하고(Fresny, I. R., Culture of Animal Cells, Manual of Basic Technique, Allan R. Lisa, Inc. New York, 1983) 중기 염색체 원으로 사용하였다. 인간 림프세포 및 생쥐 단일층 세포 모두를 복제 초기상에서 5-브로모옥시유리딘으로 처리하여 밴딩 형태를 유도하였다(Takahashi, et al. Hum. Gene, 86:14-16, 1990; Lemieux et al., Cell Gene, 59:311-312, 1992). 슬라이드를 훼치스트(Hoechst) 33258(1μg/ml)로 염색하고 자외선(302 nm)에 30 분간 노출시켰다. 프로브를 biotin-11-dUTP(Sigma)을 사용하여 닉 번역 키트(BRL)에 의하여 표지하고, 앞서 기재한 바와 같이 50% 포름아미드, 2x SSC 내의 10% 덱스트란 설페이트에서 FISH 공정을 수행하였다(Lichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:9664-9665, 1988; Pinkel et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:2934-2938, 1986. 양자 모두 본원에 참고문헌으로 포함). 반복 서열은 Cot-1-DNA(BRL)의 10-배 과량으로 억제하고, 밤새도록 인큐베이션시킨 후에 슬라이드를 45 ℃에서 50% 포름아미드/2x SSC, 2x SSC 및 0.5x SSC로 세척하는 것에 의하여 비특이적 혼성화 신호를 제거하였다. 특이적인 혼성화 신호는 FITC-콘쥬게이티드 아비딘(Vecotr Laboratories)를 사용하여 가시화하고 슬라이드는 4'-6'-디아미노-2-페닐인돌(25 ng/ml)로 역염색하였다. 혼성화 신호의 인식, 표시 및 정량화에 대한 이미지 분석을 PowerMac 7100/AV 워크스테이션에 부착된 PXL 카메라(Photometrics)로 수행하였다. IPLab 소프트웨어가 카메라 작동, 이미지 인식 및 Ludl wheel을 제어하였다(Heiskanen, et al. Genet. Anal. Biol. Eng., 12:179-184, 1996). 인간 GDNFR-β 유전자에 대한 프로브는 1490 bp 길이의 cDNA이었고, 혼성화는 G-밴딩 형태를 기초로하여 식별한 중기 염색체 100 개중의 30 개내에서 특이적인 이중 점 신호를 나타내었다. 10 kb 게놈 생쥐 프로브의 혼성화 신호는 생쥐 중기 염색체 30개 중 27개에서 특이적인 위치를 나타내었다(Cowell, et al., Chromosome, 89:294-320, 1984).

본원에서 언급된 모든 참고문헌은 그 전체가 참고문헌으로 본원에 포함되어 있다.

Claims (6)

1. 아미노산 서열 SEQ ID NO:2를 포함하는 단리된 GDNFR-β.
2. 아미노산 서열 SEQ ID NO:9를 포함하는 단리된 GDNFR-β.
3. 아미노산 서열 SEQ ID NO:2를 포함하는 화합물.
4. 아미노산 서열 SEQ ID NO:9를 포함하는 화합물.
5. 서열 SEQ ID NO:5를 가지는 단리된 핵산.
6. 서열 SEQ ID NO:10을 가지는 단리된 핵산.