KR100409099B1 - 신경 손상 치료 기구 - Google Patents

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KR100409099B1
KR100409099B1 KR10-2001-7003850A KR20017003850A KR100409099B1 KR 100409099 B1 KR100409099 B1 KR 100409099B1 KR 20017003850 A KR20017003850 A KR 20017003850A KR 100409099 B1 KR100409099 B1 KR 100409099B1
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웬두안치
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암젠 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)에 관한 것으로, 이 GDNF 는 중추신경계와 말초신경계의 다양한 세포 형태에 대하여 광범위한 스펙트럼의 생물학적 활성을 보이는 강력한 뉴로트로핀이다. 또한 본 발명은 GDNF 에 대해 높은 친화성을 갖는 수용체의 클로닝과 그것의 특징 및 이를 이용한 신경 손상 치료 기구에 관한 것이다. 이 분자가 수용체계에서 맨 처음으로 공지된 성분이기 때문에 GDNF 수용체(GDNFR)라 명명되었다. 본원에는 GDNFR 단백질 산물의 핵산 서열과 아미노산 서열이 기술되어 있다. 시그널 펩티드 기능을 하는 소수성 도메인이 아미노 말단에서 발견되는 한편, 카르복시 말단의 제 2 소수성 도메인은 세포 막에 대한 수용체 결합에 관계한다. 막투과 도메인과 세포질 부위의 결핍은, GDNFR 이 막투과 시그널을 매개하기 위해 하나 또는 그 이상의 보조 분자를 필요로 함을 나타내는 것이다. GDNFR mRNA 는 신경계와 비 - 신경 조직에 광범위하게 분포하며, GDNF 분포와 유사하다.

Description

신경 손상 치료 기구{DEVICE FOR TREATING NERVE DAMAGE}
본 발명은 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF) 수용체에 관한 것이며, GDNF 수용체(GDNFR)를 코드하는 핵산과 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 GDNF 에 대해 높은 친화성을 갖는 수용체의 클로닝과 그것의 특징 및 이를 이용한 신경 손상 치료 기구에 관한 것이다.
신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자
신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)는 원래 중뇌의 도파민작용성 신경원의 생존을 강화시키는 강력한 신경영양성 인자로서 랫 B49 세포로부터 분리하여 클로닝하였다[Lin 등의 Science, 260, 1130 - 1132, 1993 참조]. 최근의 연구에서는 이 분자가, 중추신경계와 말초신경계의 일부 신경원 형태에 대하여 영향을 미치는 등의 다른 다양한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 중추신경계(CNS)에 있어서, GDNF 는 포유동물의 안면과 척수 운동신경원의 축삭절단 - 유도 사멸을 막고[Li 등의 Proceedings Of The National Academy Of Sciences, U.S.A., 92, 9771 - 9775, 1995 ; Oppenheim 등의 Nature, 373, 344 - 346, 1995 ; Yan 등의 Nature, 373, 341 - 344, 1995 ; Henderson 등의 Science, 266, 1062 - 1064, 1994 ; Zurn 등의 Neuroreport, 6, 113 - 118, 1994 참조], 자연적으로 프로그램된 세포 사멸로부터 조류의 운동신경원을 보호하는 것으로 나타났다[Oppenheim 등의 1995 상기문헌 참조]. GDNF 를 국부투여하면 축삭절단 - 유도 변성으로부터 흑질 도파민작용성 신경원을 보호하거나[Kearns 및 Gash, Brain Research, 672, 104 - 111, 1995 ; Beck 등의 Nature, 373, 339 - 341, 1995 참조], 신경독 - 유도 변성으로부터 흑질 도파민작용성 신경원을 보호하는 것으로 나타났다[Sauer 등의 Proceedings Of The National Academy Of Sciences U.S.A., 92, 8935 - 8939, 1995 ; Tomac 등의 Nature, 373, 335 - 339, 1995 참조]. 또한, GDNF 를 국부 투여하면 도파민작용성 신경원이 성장하고 도파민, 노르아드레날린 및 세로토닌 양이 증가하며 운동 동작이 향상되는 것으로 나타났다[Tomac 등의 1995 상기문헌 참조].
보다 최근에는, GDNF 가 뇌의 노르아드레날린성 신경원과 푸르키니에 세포에 대한 잠재적인 영양 인자인 것으로 보고되었다. 외생적으로 가한 GDNF 가 시험관내에서 푸르키니에 세포 배의 형태학적 분화와 생존을 효율적으로 강화시키는 반면에[Mount 등의 Proceedings Of The National Academy Of Sciences U.S.A., 92, 9092 - 9096, 1995 참조], GDNF 를 발현하는 섬유아세포를 전위적으로 이식하면 6 - 히드록시도파민 - 유도 변성을 막고 생체내 성숙한 노르아드레날린성 신경원의 표현형을 발현시켰다[Arenas 등의 Neuron, 15, 1465 - 1473, 1995 참조]. 말초신경계에서, GDNF 는 배근신경절(DRG)과 삼차신경절내 배의 감각신경원 소집단 뿐만 아니라 절상신경절, 모양체신경절 및 교감신경절내 신경원의 생존을 돕는 것으로나타났다[Trupp 등의 Journal Of Cell Biology, 130, 137 - 148, 1995 ; Ebendal 등의 Journal Of Neuroscience Research, 40, 276 - 284, 1995 ; Oppenheim 등의 1995 상기문헌 ; Yan 등의 1995 상기문헌 ; Henderson 등의 1994 상기문헌 참조]. 또한 GDNF 는 배양한 상경신경절(SCG) 신경원에서 혈관작용성 장 펩티드와 프리프로타치키닌 - A(preprotachykinin - A) mRNA 의 발현을 촉진시켜 SCF 신경원의 표현형에 영향을 미치고 속상구조 성장을 유도하는 것으로 보고되었다[Trupp 등의 1995 상기참조].
GDNF 는 신경계의 다수의 상이한 세포 형태와 구조에서 발현되었다. CNS 에서의 GDNF mRNA 발현은 흑질 도파민작용성 신경지배의 주요 표적인, 성장중인 랫과 성숙한 랫의 선조체 및 해마, 피질, 시상, 중격, 소뇌, 척수와 연수를 포함한 광범위한 다른 부위에서 역전사효소 폴리메라제 연쇄 반응법(RT - PCR)에 의해 관찰되었다[Arenas 등의 상기문헌 1995 ; Poulsen 등의 Neuron, 13, 1245 - 1252, 1994 ; Springer 등의 Experimental Neurology, 124, 401 - 412, 1993 ; Schaar 등의 Experimental Neurology, 124, 368 - 371, 1993 참조]. 인체의 경우 GDNF 전사물은 선조체에서도 검출되는데, 유미(caudate)에서 가장 많이 검출되고 피각에서는 보다 적은 양으로 검출되었다. 해마, 피질, 척수에서도 검출가능한 양이 나타났으나, 소뇌에서는 검출되지 않았다[Schaar 등의 Experimental Neurology, 130, 387 - 393, 1994 ; Springer 등의 1994 상기문헌 참조]. 말초에서의 GDNF mRNA 는 생후 1 일된 랫의 DRG 와 SCG, 좌골신경 및 신생 쉬반 세포의 일차 배양액에서 발현되는 것으로 보고되었다[Trupp 등의 1995 상기문헌 ; Hoffer 등의 Neuroscience Letters, 182, 107 - 111, 1994 ; Henderson 등의 1994 상기문헌 ; Springer 등의 1994 상기문헌 참조]. 더욱이 최근의 연구에서, GDNF 전사물은 생후의 고환과 신장, 배의 위스커 패드, 위 및 피부를 포함한 비 - 신경원 조직 주변에서도 광범위하게 발현되는 것으로 나타났다. 배 근육, 부신과 지아 및 생후의 폐, 간과 난소에서도 보다 적은 수준의 발현이 검출되었다. 그러나 GDNF 의 비 - 신경원 발현에 대한 생물학적 중요성은 아직 분명하지 않다.
GDNF 단백질 산물의 제조와 특징에 관한 상세한 설명은 1994년 5월 23일자로 제출된 미국 특허 출원 번호 제 08/182,183 호 및 그것의 모출원(또한 1992년 9월 17일자 출원된 PCT/US92/07888, WO 93/06116 및 공개 번호가 제 EP 610 254 호인 유럽 특허 출원 번호 제 92921022.7 호 참조)에 기술되어 있으며, 이 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용한다. 부가적인 GDNF 단백질 산물은 1995년 9월 28일자 출원된 계류중인 미국 특허 출원 번호 제 08/535,681 호에 기술되어 있으며, 이 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용한다. 본원에 사용한 바와 같이, 용어 'GDNF 단백질 산물' 은 생물학적으로 활성인 합성 또는 재조합 GDNF 단백질과 유사체를 비롯하여 화학적으로 변이시킨 그것의 유도체도 포함한다.GDNF 유사체에는 절두된 GDNF 단백질과 같은 결실 변이체 뿐만 아니라 GDNF 의 삽입 변이체와 치환 변이체가 포함된다. 또한 인체 GDNF 단백질과 실질적으로 상동인 GDNF 단백질도 포함된다.
GDNF 치료
GDNF 치료는 하나 또는 그 이상의 신경 세포 형태의 생존 및/또는 고유 기능을 위태롭게 하는 상태에서 야기되는 신경 손상 치료에 유용하다. 이러한 신경 손상은 매우 다양한 원인에 의해 발생할 수 있다. 신경 손상은 다음과 같은 이유로 인해 하나 또는 그 이상의 형태에서 발생할 것이다 : (1) 손상 부위 근처의 축삭 돌기 및/또는 신경세포체 변성의 원인이 되는 물리적 손상 ; (2) 발작처럼 신경계 일부에 대한 혈류의 일시적이거나 영구적인 중단 ; (3) 암치료를 위한 화학치료제(예를들어, 시스플라티눔) 또는 AIDS 치료를 위한 디데옥시사이티딘(ddc) 같은 신경독에 대한 의도적인 노출이나 우연적 노출 ; (4) 당뇨병이나 신기능부전 같은 만성 대사 질환 ; 또는 (5) 파킨슨병, 알쯔하이머병 및 근위축성측삭경화증(ALS)과 같은 신경변성 질환으로서 이는 특정 신경 집단의 변성에 의해 야기된다.
일부 연구에서는, GDNF 치료가 파킨슨병의 흑질 중 도파민작용성 신경원의 변성과 같은 신경변성 조건을 치료하는 데 특히 유용한 것으로 나타났다. 현재 유일한 파킨슨병 치료는 선조체에서 도파민 수준을 증가시킴으로써 이 질환의 정도를 경감시키는 것이다. GDNF 치료의 기대 효과는 단지 선조체내 도파민작용성 신경 말단에서 도파민작용성 신경전달을 증가시키는 것(증상 완화) 뿐만 아니라 변성 과정이 진행되는 것을 완화시키거나 심지어는 중지시키고 손상된 흑질선조체 경로를 복구하여 그 기능을 회복시키는 것이다. GDNF 는 또한 환자의 도파민작용성 신경 세포의 손상 형태나 부적절한 작용을 치료하는 데 사용할 수 있다. 이러한 손상이나 기능부전은 정신분열증이나 그외의 정신병에서 발생할 수 있다. 이러한 증상에 대한 유일한 치료는 징후에 의한 것이며 도파민 수용체나 도파민 흡수 부위에 작용하는 약물을 필요로 하는데, 이는 수용체 - 생산 신경원 집단을 자극하는 도파민작용성 신경원의 부적절한 작용이 질병 진행에 관계한다는 사실과 양립된다.
수용체
인슐린, 혈소판 유래 성장 인자, 상피 성장 인자와 그것의 상관물, 섬유아세포 성장 인자, 다양한 인터루킨, 조혈 성장 인자 및 모양체 신경영양 인자에 대한 수용체를 포함한 단백질 인자에 반응하고 그것에 대한 결합을 조절하는 다수의 수용체를 특정화하고 분자적으로 클로닝하였다[미국 제 5,426,177 호 참조]. 연구 결과, 일부 수용체가 다수의 (관련) 성장 인자에 결합할 수 있는 한편, 경우에 따라 동일한 인자가 다수의 (관련) 수용체에 결합하여 그것을 활성화시킬 수 있는 것으로 나타났다[예를들어, Lupu 등의 Science, 249 : 1552 - 1555, 1990 ; Dionne 등의 EMBO J., 9 : 2685 - 2692, 1990 ; Miki 등의 Science, 251 : 72 - 75, 1991 참조]. 대부분의 수용체는 단백질 인자를 특이하게 결합시키는 세포외 부분이나 도메인, 세포막을 메우는 막통과 도메인 및 수용체의 세포외 부분에 대한 단백질 인자의 결합으로 시그널 트랜스덕션이 시작되는 것에 관계하는 세포내 도메인을 갖는지에 따라 광범위하게 특정할 수 있다. 다수의 수용체가 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되지만, 다른 수용체는 높은 친화성을 갖는 그들의 단백질 인자와 결합하고 결합후에 기능적으로 반응할 수 있도록 둘 또는 그 이상의 개별적인 아단위를 필요로 한다[예를들어, Hempstead 등의 Science, 243 : 373 - 375, 1989 ; Hibi 등의 Cell, 63 : 1149 - 1157, 1990 참조].
주어진 수용체의 세포외 부분과 세포내 부분은 다른 수용체의 상응 부위와 공통적인 구조적 모티프를 공유하는데, 이것은 상이한 수용체 간의 진화론적·기능상 관계를 나타낸다. 이들은 전혀 상관이 없을 수도 있고 특정한 일반 도메인 구조의 반복적인 이용을 단순히 반영할 수도있다. 예를들어, 서로 관련되지 않은 인자와 결합하는 각각의 상이한 수용체는 그것의 세포외 부분내 '면역글로불린' 도메인을 사용하는 반면, 그외의 수용체는 그것의 인자 - 결합 부위에 '시토킨 수용체' 도메인을 사용한다[예를들어, Akira 등의 The FASEB J., 4 : 2860 - 2867, 1990 참조]. 세포외 결합 도메인이 다른 다수의 수용체(따라서 상이한 인자에 결합됨)는 인자 결합으로 활성화되는 티로신 - 특이 단백질 키나아제를 코드하는 관련 세포질내 도메인을 함유한다[예를들어, Ullrich 및 Schlessinger, Cell, 61 : 203 - 212, 1990 참조]. 시그널 트랜스덕션 과정을 '활성화시키는' 인자 - 결합에 의한 메카니즘은 수용체 티로신 키나아제인 경우 조차도 잘 인지되어 있지 않다. 세포내 도메인이 그 기능이 알려지지 않은 도메인을 코드하거나 결합 성분이 기능을 알 수 없는 제 2 단백질과 관련된 다른 수용체일 경우, 시그널 트랜스덕션의 활성화를 특정하여 기술할 수 없다.
생체내 GDNF 의 작용 방식은 본 분야에서 분명하게 밝혀져 있지 않은데, 그 이유 중 하나는 GDNF 수용체에 대한 정보가 없기 때문이다. 두 연구팀은 각각 흑색질내 도파민작용성 신경원이 선조체 투여 [125I] - 표지 GDNF 를 역수송할 수 있을 것이라고 밝혔다[Tomac 등의 Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America,92, 8274 - 8278, 1995 ; Yan 등의 1995 상기참조]. 척수 운동신경원, DRG 감각신경원 및 망막신경절의 B 층에 존재하는 신경원에 의한 [125I] - GDNF 의 역수송 또한 관찰되었다. 이러한 역수송 현상은 모두 100 - 배 또는 그 이상 농도의 비표지 GDNF 에 의해 특이하게 저해되는데, 이것은 포화시킬 수 있는 수용체 - 매개 수송 과정임을 시사한다. 매우 낮은 농도의 시험관내에서, 재조합 GDNF 는 배양시킨 도파민작용성 신경원의 생존을 강화하고 도파민 흡수를 촉진시키는 것으로 나타났다. 이들 신경원에 대하여 관찰된 GDNF 의 반최대 유효 농도(EC50)는 0.2 내지 1.6 pM 이다[Lin 등의 1993 상기참조]. 또한 GDNF 는 낮은 농도에서 분리되는 운동신경원의 생존을 촉진시키는 것으로 나타났다. 운동신경원에 대하여 보고된 GDNF 의 EC50은 5 ~ 10 fM 으로서, 도파민작용성 신경원에 대한 EC50보다 훨씬 낮다[Henderson 등의 1994 상기참조].
이러한 관찰 결과는 총괄적으로 이들 세포에서 발현되는 GDNF 수용체가 매우 높은 리간드 결합 친화성을 가짐을 나타내는 것이다. TGF - β 군에 속하는 멤버와 유사하게, 상이한 세포 집단에 대하여 GDNF 가 여러 조직에 광범위하게 분포하고 다양한 생물학적 기능을 하는 것은 GDNF 에 대하여 상이한 형태의 수용체 또는 수용체 복합체가 존재함을 시사한다. E10 병아리의 교감신경원에 대한 [125I] - GDNF 의 포화 정상 상태 결합과 경쟁적인 결합은, 이들 신경원이 도파민작용성 신경원과 운동신경원에서 관찰되는 부위와는 다른 GDNF 결합 부위를 가짐을 나타냈다. 이들 결합 부위에 대한 GDNF 의 반최대 포화 농도와 반최대 저해 농도는 1 ~ 5 nM 범위로 존재한다[Trupp 등의 1995 상기참조]. 마찬가지로, P1 랫 SCG 교감신경원의 생존을 돕는 GDNF 의 EC50은 나노몰(nanomolar) 범위인 것으로 보고되었다[Trupp 등의 1995 상기참조].
GDNF 가 그 자신이 세포에 영향을 미칠 수 있도록 시그널 트랜스덕션을 활성화시키는 메카니즘을 보다 잘 이해하기 위하여, 이 단백질 인자에 대한 결합을 중재하고 이 인자에 반응하는 수용체를 확인하는 것이 바람직할 것이다. 또한 GDNF 치료일 경우, GDNF 시그널 트랜스덕션을 돕거나 촉진시키는 보조 분자의 생산을 확인하고 그것이 가능하도록 하는 것이 바람직하다. 더욱이, GDNF 에 대한 단백질 수용체를 확인함으로써 진단 용도로 적용할 수 있게 되는데, 예를들어 그들 각각이 GDNF 단백질 치료에 유용한 지를 결정하는 데 도움이 된다. 또한 GDNF 에 대한 단백질 수용체는, 수용체에 결합하여 원하는 생물학적 활성을 초래하는 부가적인 분자를 확인하는 검정에 있어서 핵심 성분일 수 있다.
본 발명은 도 2 및 4(서열 2 및 4)에 도시한 아미노산 서열을 갖는 신경영양성 인자 수용체 단백질 뿐만 아니라 생물학적으로 동가치인 유사체를 코드하는 핵산 서열을 제공한다. 본 발명의 신경영양성 인자 수용체 단백질과 단백질 산물은 본원에서 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자 수용체(GDNFR) 단백질과 단백질 산물로 규정된다. 신규한 GDNFR 은 특이하고도 높은 친화력으로 GDNF 를 결합시키는 능력과 GDNF 의 시그널 트랜스덕션 효과를 중재하거나 강화시키는 분자 복합체의 일부로서 작용하는 능력에 따라 기능적으로 특정된다. GDNFR 단백질 산물은 일반적으로 가용성 수용체 단백질로서 제공되며 실질적으로 순수한 형태로 존재한다.
한 양상에 있어서, 본 발명은 재조합 유전공학 기술에 의해 GDNFR 단백질 산물을 생산하는 것에 관한 것이다. 선택적인 실시형태에 있어서, GDNFR 단백질은 화학적인 기술에 의해 합성되거나 재조합 기술과 화학적 기술을 연합하여 합성된다.
본 발명의 다른 양상에 있어서, GDNFR 단백질은 글리코실화되거나 글리코실화되지 않은 형태로 제조될 수 있다. GDNFR 단백질 유도체는 일반적으로 GDNFR 단백질에 수용성 중합체를 결합시킴을 포함한다.예를들어, GDNFR 단백질은 수성 환경에서 GDNFR 단백질이 덜 침전되도록 하나 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜과 결합된다.
본 발명의 또다른 양상은 GDNFR 단백질을 코드하는 다양한 폴리누클레오티드를 포함한다. 이 핵산 서열은 진핵 숙주 세포나 원핵 숙주 세포에서 GDNFR 을 발현시키기 위해 사용하는데, 여기에서 발현 산물이나 그것의 유도체는 GDNF 에 결합하는 능력에 의해 특정화되며 도파민작용성 세포에 의한 도파민 흡수를 증가시키는 등의 GDNF 활성을 매개할 수 있는 복합체를 형성한다. 폴리누클레오티드는 또한 세포 치료나 유전자 치료에도 사용할 수 있다. 적합한 핵산 서열은 특히 도면에 나타나 있는 서열 뿐만 아니라 동의 서열, 자연발생적인 대립형질 변이체와 본 발명을 토대로 변이시킨 서열을 포함한다.
전형적인 핵산 서열은 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)와 복합체를 이루어 GDNF 에 대한 세포 반응을 매개하는 능력을 갖는 도 2 및 4(서열 2 및 4)에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는, 신경영양성 인자 수용체 단백질 및 그것의 생물학적으로 동가치인 유사체를 코드하는 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다음을 포함한다 : (a) 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)와 복합체를 이루어 GDNF 에 대한 세포 반응을 매개하는 능력을 갖는 신경영양성 인자 수용체(GDNFR)를코드하는, Met1내지 Ser465를 코드하는 누클레오티드를 포함하는 도 1(서열 1) 또는 Met1내지 Ser468을 코드하는 누클레오티드를 포함하는 도 3(서열 3)에 나타나 있는 서열 ; (b) (a) 의 상보 서열에 혼성되고 GDNFR 활성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열 ; 및 (c) 유전 암호의 동의성이 없다면, (a) 의 상보 서열에 혼성되고 GDNFR 활성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열. 일반적으로 핵산 서열을 증폭시키거나 발현시키는 능력을 갖는 하나 또는 그 이상의 작동 요소와 작동적으로 결합하는 핵산 서열과 같은 벡터가 본원에 기술되어 있다. 이러한 벡터를 함유하는 숙주 세포 또한 본 발명에서 고려할 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 COS - 7 세포와 같은 포유동물 세포와 E. coli 같은 박테리아 세포 중에서 선택한다.
본 발명의 다른 양상은 증폭 조절 서열 및/또는 발현 조절 서열과 작동적으로 결합하는 GDNFR 단백질을 코드하는 폴리누클레오티드 함유 벡터를 포함한다. 원핵 숙주 세포와 진핵 숙주 세포는 모두 GDNFR 단백질로 안정하게 형질전환되거나 형질감염될 수 있다. 또한 본 발명은 GDNFR 단백질의 재조합 생산을 포함하는데, 여기에서 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포는 적당한 영양 배지에서 성장시키며 이 세포에서 발현되는 GDNFR 은 선택적으로 숙주 세포 및/또는 영양 배지에서 분리한다. 본 발명은 유전자 치료나 세포 치료시 GDNFR 을 코드하는 폴리누클레오티드와 이러한 폴리누클레오티드를 내포하는 벡터의 용도를 포함한다.
숙주 세포는 인체 이식에 대한 그것의 적합성에 따라 선택할 수 있는데, 이러한 이식 세포는 본 발명의 신경영양성 인자 수용체를 발현하여 분비한다. 숙주 세포는 인체 이식에 적합한 반투막으로 둘러싸여 있다. 숙주 세포는 생체외에서 형질전환되거나 형질감염될 수 있다. 신경 손상을 치료하는 전형적인 기구는 다음을 포함한다 : (a) 이식에 적합한 반투막 ; 및 (b) 막 내부에서 캡슐로 보호되는, 본원에 기술한 신경영양성 인자 수용체를 발현하여 분비하는 세포. 막은 신경영양성 인자 수용체 단백질에는 투과성이지만 캡슐화된 세포에 해로운 물질에 대해서는 비투과성인 물질 중에서 선택한다.
본 발명의 신경영양성 인자 수용체의 재조합 생산방법 또한 본 발명에 기술되어 있다. 일반적인 방법은 다음을 포함한다 : (a) 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)와 복합체를 이루어 GDNF 에 대한 세포 반응을 매개하는 능력을 갖는 도 2 및 4(서열 2 및 4)에 나타낸 아미노산 서열과 같은 것으로서, 본 발명의 신경영양성 인자 수용체 또는 그것의 생물학적으로 동가치인 유사체를 코드하는 핵산 서열을 함유하는 숙주 세포를 배양하고 ; (b) 상기 신경영양성 인자 수용체가 숙주 세포에 의해 발현되기에 적합한 조건하에서 상기 숙주 세포를 보존하고 ; (c) 선택적으로, 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 상기 신경영양성 인자 수용체를 분리한다. 숙주 세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 박테리아 발현이 포함된다면, 이 방법은 신경영양성 인자 수용체를 되접는 단계가 더 포함된다.
본 발명은 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)와 복합체를 이루어 GDNF 에 대한 세포 반응을 매개하는 능력을 갖는, 도 2 및 4(서열 2 및 4)에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 분리정제된 단백질 및 그것의 생물학적으로 동가치인 유사체를 포함한다. 전형적인 유사체는 도 2(서열 2)에 나타낸 Ser18내지 Pro446, Asp25내지 Leu447및 Cys29내지 Cys442아미노산 서열을 포함하는 단백질 및 도 4(서열 4)에 나타낸 Met17내지 Pro449및 Cys29내지 Cys443아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 본 발명의 단백질은 글리코실화되거나 그렇지 않을 수 있으며, 재조합 기술이나 화학 합성에 의해 생산될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 아미노산 서열을 포함한 수용체 단백질을 코드하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질 수용체와 함께 제약학적으로 용인가능한 담체를 함유하는 제약학적 조성물에 대해서도 기술하고 있다. 그외의 다양한 제제형 물질은 제조, 보관, 취급, 운반이 용이하고 및/또는 효능에 좋도록 하기 위해 사용한다.
본 발명의 다른 양상은 GDNFR 유전자와 단백질의 치료학적 용도를 포함한다. 예를들어, 순환성 또는 가용성 GDNFR 단백질 산물은 GDNF 막투과 시그널 활성을 강화시킴으로써 신경계 질환이나 손상을 치료하기 위해 단독으로 또는 GDNF 와 배합하여 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질과 제약학적 조성물은 도파민작용성 신경 세포의 부적절한 기능, 파킨슨병, 알쯔하이머병 및 근위축성측삭경화증 치료에 사용할 수 있다. 선택적으로, 재조합 GDNFR 유전자는 근위축성측삭경화증을 앓고 있는 환자의 운동신경원 처럼 GDNF 에 대한 감수성을 증가시킴으로써 유익해지는 조직 세포내로 삽입시킬 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, GDNFR 은 GDNF 활성이 해로운 것으로 여겨지는 경우에 GDNF 활성을 차단하기 위해 사용할 수 있다. GDNFR 은 관찰되는 GDNF 효과가 GDNFR 에서 비롯됨을 입증하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 또다른 양상에 있어서, GDNFR 프로브는 정상 상태나 질환 상태에서 GDNF 에 대하여 반응하는 세포와 조직을 확인하는 데 사용한다. 선택적으로, 프로브는 GDNF - 관련 장애를 앓고 있는 환자에게서 비정상적인 GDNFR 발현을 검출하는 데 사용된다.
본 발명의 다른 양상에 있어서, 항체 프로브 뿐만 아니라 핵산을 포함한 GDNFR 프로브는 GDNFR - 관련 분자를 확인하는 데 사용할 수 있다. 예를들어, 본 발명은 GDNFR 과 복합체를 이루어 GDNFR 기능에 관계하는 분자를 제공한다. 다른 예로서, GDNFR 과 동일하지는 않지만 항원적으로 상동이거나 교차반응성인 수용체 분자를 제공한다.
또한 본 발명은 수용체를 토대로 한 GDNF 의 결합 검정 및 기능 검정을 개발하였다. 예를들어 GDNF 활성 검출 검정계는 고수준의 GDNFR 을 발현하여 GDNF 또는 GDNF - 유사 분자의 농도가 매우 낮은 경우 조차도 매우 민감한 세포를 포함한다. 또다른 실시형태에 있어서, 가용성 GDNFR 은 GDNF 나 GDNF - 유사 분자의 존재를 검출하거나 그것에 결합시키는 데 사용한다.
부가적으로 본 발명은 GDNFR 의 생리학적 기능을 연구하기 위한 실험 모델계를 제공한다. 이러한 계는 동물 모델 뿐만 아니라 항 - GDNFR 항체 또는 올리고누클레오티드 프로브와 관련된 검정을 포함하는데, 예를들어 이러한 동물 모델은 고수준의 GDNF 를 발현하여 GDNF 에 대해지나치게 감수성인 형질전환 동물이나 배의 간세포 기술을 이용하여 외생 GDNFR 유전자를 게놈에서 삭제시킨 유도 동물이다. 항 - GDNFR 항체는 신경영양성 인자 수용체 단백질의 펩티드 부분에 결합할 것이다. 항체는 모노클로날 항체와 폴리클로날 항체를 포함한다. 선택적으로, 이미 존재하는 항체에 대한 면역학적 표식은 검출에 도움이 되는 GDNFR 단백질에 결합할 것이다. 이러한 표식은 Flag(IBI/이스트만 코닥)와 myc 서열을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 그외에 폴리히스티딘 같은 표식 서열은 금속 킬레이트 컬럼 상에서 검출 및 정제하는 데에도 사용되었다.
본 발명의 부가적인 양상과 이점은 본 발명을 실시하는 것에 관하여 자세히 기술되어 있는 하기 상세한 설명을 참조하여 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다.
도 1a - 1h 는 인체 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자 수용체(GDNFR)를 코드하는 핵산 서열(서열 1)을 나타낸 것이다. 완전한 길이의 GDNFR 단백질의 아미노산 서열은 핵산 540 내지 1934 에 의해 코드된다.
도 2 는 완전한 길이의 GDNFR 단백질의 아미노산 서열(서열 2)이다.
도 3a - 3g 는 랫의 GDNFR 을 코드하는 핵산 서열(서열 3)이다. 완전한 길이의 GDNFR 단백질 아미노산 서열은 핵산 302 내지 1705 에 의해 코드된다.
도 4 는 완전한 길이의 랫 GDNFR 단백질의 아미노산 서열(서열 4)이다.
도 5a - 5v 는 인체 GDNFR 의 콘센서스 서열 뿐만 아니라 다수의 클론에서 생산된 GDNFR cDNA 서열의 일부를 비교정렬시킨 것이다.
도 6 은 뉴로 - 2A 유래 세포주가 GDNFR 을 발현함을 확인하는 것이다.
도 7a - 7b 는 GDNFR 발현 세포에 대한 [125I]GDNF 의 평형 결합 결과를 나타낸 것이다.
도 8 은 GDNFR 발현 세포에서 발현되는 GDNFR 과 Ret 에 대한 [125I]GDNF 의 화학적 교차 결합 결과를 나타낸 것이다.
도 9a - 9c 는 GDNFR 발현 세포에 의한 c - Ret 자기인산화 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 10a - 10b 는 GDNF 와 가용성 GDNFR 에 의한 c - Ret 자기인산화 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 11 은 Ret - Fc 융합 단백질에 의한 c - Ret 자기인산화 저해 결과를 나타낸 것이다.
도 12 는 운동신경원내 GDNF 에 의한 c - Ret 자기인산화 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 13 은 GDNFR 과 Ret 에 의해 매개되는 GDNF 시그널 모델을 나타낸 것이다.
신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)는 중추신경계와 말초신경계 둘다의 각각의 세포 형태에 대하여 광범위한 생물학적 활성을 보이는 강력한 신경영양성 인자이다. 이 GDNF 는 형질전환 성장 인자 - β(TGF - β) 아군과는 관계가 먼(상동성이 20 % 미만임) 글리코실화되고 디술피드 결합된 이량체이다. 도파민작용성 신경원과 그외의 신경원집단의 생존을 강화시키는 GDNF 의 능력은 파킨슨병 뿐만 아니라 다른 형태의 신경손상이나 기능부전 치료에 대한 그것의 치료학적 잠재력을 나타낸다.
GDNF 의 분포와 생물학적 활성에 대한 폭넓은 연구와는 대조적으로, 세포에 GDNF 가 결합하는 것을 매개하여 세포내 시그널과 세포 반응을 매개하는 수용체(들)을 확인한 보고서는 없었다. 본 발명은 출생후 랫의 망막 세포를 배양하여 그 표면에서 처음으로 높은 친화성을 갖는 수용체가 발견됨을 기초로 한다. 이 수용체는 도파민작용성 신경원 및 운동신경원, 중뇌 도파민작용성 신경원[Lin 등의 1993 상기참조 ; Sauer 등의 1995 상기참조 ; Kearns 및 Grash, 1995 상기참조 ; Beck 등의 1995 상기참조 ; Tomac 등의 1995a 상기참조], 안면 운동신경원과 척수 운동신경원[Li 등의 1995 상기참조 ; Oppenheim 등의 1995 상기참조 ; Yan 등의 1995 상기참조 ; Zurn 등의 1994 상기참조 ; Henderson 등의 1994 상기참조]에서 발견된 수용체의 GDNF 결합 친화성에 필적할 만한 예상 GDNF 결합 친화성을 갖는다. 이 수용체 분자가 GDNF 수용체계에서 제일 먼저 알려진 성분이므로 GDNF 수용체(GDNFR)라 명명하였다. 본 발명은 또한 GDNFR 단백질의 발현 클로닝과 특징에 대해 최초로 기술한 것이다. 재조합 수용체를 발현하도록 변이시킨 세포는 높은 친화력으로 GDNF 에 결합한다.
도파민 섭취 검정과 배양 세포에 대한 [125I] - GDNF 결합을 이용하여 랫의 광수용체 세포 표면에서 GDNF 에 대한 고친화성 수용체를 검출하였다. 실시예에 보다 상세히 기술된 바와 같이, 광수용체 세포 연구로 GDNF 수용체의 발현 클로닝에 의해 cDNA 클론을 분리할 수 있었다. GDNFR 의 핵산 서열은 31 개의 시스테인 잔기와 세 개의 잠재적인 N - 글리코실화 부위를 갖는 468 개 아미노산으로 구성된 단백질을 코드한다. 랫 cDNA 클론의 핵산 서열은 랫 수용체와 아미노산 수준에서 거의 동일한 것으로 밝혀진 그것의 인체 동족체를 분리하는 데 사용되었다. 인체 GDNFR cDNA 서열은 모든 위치에 시스테인 잔기를 가지며 랫 수용체에 비해 보존적인 잠재적 N - 글리코실화 부위를 갖는 465 개 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드한다. 이렇게 1 차 서열이 고도로 보존되는 것은 이 수용체가 GDNF 의 생물학적 기능에 중요한 역할을 함을 시사한다.
상기한 바와 같이, 많은 수용체는 세 개의 주요 도메인을 갖는다 : 단백질 인자에 특이하게 결합하는 세포외 또는 세포 표면 도메인 ; 세포막을 메우는 막투과 도메인 ; 및 일반적으로 단백질 인자가 세포외 도메인에 결합할 때 시그널 트랜스덕션을 개시하는 데 관계하는 세포내 또는 세포질 도메인. 그러나, GDNFR 은 공지된 모든 단백질(예를들어, 수용체 키나아제 또는 시토킨 수용체에서 발견되는 콘센서스 서열)의 서열 특징이나 구조적 특징과 관계가 없으며 세포질 도메인이 결핍되어 있고 막투과 도메인의 C - 말단 변이 잔기 특성이 결핍되어 있으며, 하기에 보다 상세히 기술된 바와 같이 글리코실 - 포스파티딜이노시톨(GPI) 결합에 의해 세포막에 결합되는 것으로 결정되었다. 세포내 촉매 도메인이 없으면 막투과 시그널에서 중요한 기능이 저해되기는 하나, 높은 결합 친화성을 갖는 서열과 진화 서열의 강한 보존성은 이 수용체가 GDNF 기능에 중요한 것임을 시사하였다.
GDNFR 은 세포질 도메인이 결핍되어 있기 때문에, 막투과 시그널에서 어떤 역할을 담당하는 보조 분자 중 하나 또는 그 이상과 함께 작용해야 한다. GDNF 유전자가 결핍된 형질전환 동물은 살아남지 못하였고 신장이 없는 것으로 밝혀졌다. c - ret 프로토 - 종양유전자가 결핍된 형질전환 마우스[Schuchardt 등의 Nature, 367, 380 - 383, 1994 참조]도 유사한 표현형을 갖는 것으로 밝혀졌다. c - ret 프로토 - 종양유전자는 그것의 정상적인 기능이 이제껏 밝혀지지 않았던 수용체 티로신 키나아제(RTK)를 코드한다. 모든 RTK 는 유사한 토폴로지를 갖는다 : 그것은 세포외 리간드 - 결합 도메인, 막투과 도메인 및 촉매 단백질 - 티로신 키나아제 도메인을 함유하는 세포질 단편을 갖는다. 리간드 결합으로 키나아제 도메인이 활성화되고 세포내 시그널을 매개하는세포내 특이 기질이 인산화된다. 본 발명은 가용형의 GDNFR 이 c - ret 프로토 - 종양유전자에 대한 GDNF 결합을 매개하고 그것의 세포 형태 특이성을 변이시킬 뿐 아니라 GDNF 에 대한 세포 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다는 발견에 관계된 것이다.
'수용체 알파' 성분이라 명명된 유사 종은 리간드 결합 특이성은 제공하지만 그 자신의 시그널을 변환시키는 능력은 가지고 있지 않다. 이러한 성분은 모양체의 신경영양성 인자(CNTF) 및 인터루킨 - 6(IL - 6) 수용체 계에서 발견된다. CNTF 수용체는 높은 친화력으로 그것의 리간드에 결합하고 소수성인 C - 말단을 가지며 세포질 도메인이 없고 GPI 결합에 의해 세포막에 결합하는데[Davis 등의 1991 참조], 이것은 GDNFR 과는 유사하고 IL - 6 수용체와는 대조적이다. 시그널 트랜스덕션을 매개하기 위하여, CNTF 는 우선 CNTF 수용체에 결합하여 gp 130 에 결합할 수 있는 복합체를 이룬다. 그런 다음 이 불활성 복합체는 LIF 수용체에 결합하여 활성 시그널 복합체를 이룬다[Davis 등의 Science, 260, 1805 - 1807, 1993 참조]. 본 발명에서와 마찬가지로, CNTF 수용체(리간드 특이 결합 성분)는 막에 결합할 필요는 없지만 발생하는 시그널을 위해 존재해야 한다[Economides 등의 Science, 270, 1351 - 1353, 1995 참조].
하기에 더 자세히 기술하는 바와 같이, GDNFR 단백질은 세포 표면에 결합되거나 가용 형태로 제공될 수 있다. 어떤 경우에, GDNFR 단백질은 GDNF 와 리간드 복합체를 이루고 이 리간드 복합체는 세포 표면 수용체에 결합되어 세포내 시그널이 된다. 이런 식으로, GDNFR 의 가용 형태는 GDNF 작용을 강화하고/하거나 세포 - 유형 특이성을 변이시킨다.
GDNFR 은 모든 공지된 수용체와 관계가 없다. 관련 서열에 대하여 진뱅크 앤 워싱턴 유니버시티 - 머크 데이터베이스(GenBank and Washington University - Merck database) 중에서 외관상 비슷한 것도 없다. 워싱턴 유니버시티 - 머크 EST 데이터베이스에 나타나 있는 발현 서열 표식(EST)은 GDNFR 코딩 부위의 일부분(클론의 5' 말단에서 생성된 521 누클레오티드 서열 중 약 340 누클레오티드)과 75 % 상동이다. 이 클론(진뱅크 취득 번호 #H12981)을 올리고 - dT 프라임 인체 유아 뇌 라이브러리(oligo - dT primed human infant brain library)에서 분리하여 Lafmid BA 벡터(Hillier, L. 등의 아직 발간되지 않은 데이터)내로 직접 클로닝하였다. #H12981 의 3' 말단 서열을 결정하였으나, GDNFR 의 어떤 부분과도 상동성이 없었다. 이 #H12981 클론과 GDNFR 의 상동성은 짧은 부위에서 나타났다 사라졌는데, 이것은 #H12981 클론이 스플라이싱되지 않은 전사물이거나 이것이 원래의 cDNA 전사물이기 보다는 인공적으로 클로닝한 것임을 시사한다.
따라서, 본 발명은 GDNFR 을 발현하는 표적 세포를 선택하는 방법을 제공함으로써 GDNFR 단백질 클로닝을 가능하게 한다. GDNFR 코딩 서열을 많이 제공함으로써, 본 발명에 의해 GDNFR 단백질을 정제할 수 있게 되었고 GDNFR - 코딩 DNA 의 직접적인 클로닝도 가능하게 되었다. GDNFR 핵산 서열과 아미노산 서열에 대한 본 설명으로 다양한 GDNFR 유사체 뿐 아니라 이들의 증식에 필요한 정보가 제공되었다. 이러한 정보로 인해, 본 분야의 숙련자들에게 공지된 방법으로 GDNFR 단백질 산물을 분리하거나 생산할 수 있다. GDNFR 단백질 재조합이나 합성 생산에 대한 다양한 방법도 기술되어 있다.
본원에 기술되어 있는 용어 'GDNFR 단백질 산물' 은 생물학적으로 활성인, 정제된 천연, 합성 또는 재조합 GDNFR, GDNFR 유사체(삽입 변이체, 치환 변이체와 결실 변이체를 포함한 GDNFR 변이체 및 동족체) 및 화학적으로 변이시킨 그것의 유도체가 포함된다. GDNFR 유사체는 도 2 및 4(서열 2 및 4)에 나타낸 GDNFR 아미노산 서열과 실질적으로 상동이다.
본원에 사용된 용어 '생물학적으로 활성' 은 GDNFR 단백질 산물이 높은 친화력으로 GDNF 에 결합하여 GDNF - 유도 시그널 트랜스덕션을 매개하거나 촉진시킴을 의미한다. 본 분야의 숙련자들은 본 명세서에 의해 GDNFR 폴리펩티드 유사체가 도 2 및 4 에 기술된 GDNFR 단백질 산물과 실질적으로 동일한 생물학적 활성도를 갖는지를 결정할 수 있다.
본원에 사용한 용어 '실질적으로 상동' 인 아미노산 서열은 도 2 및 4 에 나타낸 GDNFR 아미노산 서열과 '유사' 하거나 상동인 아미노산 서열을 말하는 것으로 상동 서열은 이 GDNFR 아미노산 서열에 기술된 것과 유사한 생물학적 활성도나 기능을 갖는다. 분자의 3 차원적 입체형태나 활성도에 영향을 끼치지 않으면서, 비교적 다수의 각각의 아미노산 잔기나 군별로 분류된 아미노산 잔기의 위치를 변화시키거나(예를들어, 순서를 바꾸거나 재배열함) 아미노산 서열에서 모두 삭제할 수 있다는 것은 본 분야의 숙련자들이 인식할 수 있을 것이다.
본 분야의 숙련자들은 본 명세서에 의해 이러한 변이를 실시할 수 있을 것이다. 이렇게 변이시킨 서열의 확인 방법과 수득 방법은 하기에 보다 상세히 기술되어 있다. 실질적으로 상동인 단백질(펩티드)의 상동 정도는 같거나 70 % 이상(즉, 70 % 내지 100 % 의 상동성) 이 바람직하다. 따라서, '실질적으로 상동인' GDNFR 아미노산 서열은 서열 2 및 4 에 기술한 아미노산 서열과 같거나 70 % 이상의 상동성을 갖는 것이 바람직하다. 각각의 상동 정도가 같거나 85 % 를 초과하는 것이 더욱 바람직하며, 같거나 90 % 이상의 상동성을 갖는 것이 보다 바람직하고, 가장 바람직한 것은 같거나 95 % 이상인 것이다.
본원에 기술한 상동 백분율은, 어떤 단백질 서열을 다른 단백질 서열과 정렬시켜 그 서열에서 발견되는 같거나 유사한 아미노산 잔기의 백분율로 계산한다. 따라서 GDNFR 상동성의 경우, 서열 2 와 4 에 나타나 있는 GDNFR 폴리펩티드의 참고 아미노산 잔기 또는 도면에 나타나 있는 핵산에 의해 코드되는 아미노산 잔기에 대하여 비교 분자의 아미노산 잔기를 두 서열간의 잔기 상동성이 최대가 되도록 적절하게 정렬시켜 서열의 상동성 정도를 결정할 수 있다. 이러한 정렬이 적당한 보존적 잔기 치환을 포함하며 필요한 만큼의 갭을 도입함으로써 비교 서열의 절두와 내부 결실 또는 삽입은 무시한다는 것을 본 분야의 숙련자들은 인지할 것이다 ; 예를들어 Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5 를 참조하라. 여기에서 정렬을 돕기 위해 100 개의 아미노산에 평균 3 개 또는 4 개의 갭을 도입할 수 있다[p.124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., 1972 ; 이 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용함]. 일단 이렇게 정렬시키고 나서, 비교 폴리펩티드내 정렬 잔기의 수를 비교 폴리펩티드내 총 잔기수로 나누어 백분율을 정한다. 본 발명의 GDNFR 서열은 적어도 부분적으로 GDNFR 활성을 갖는 키메라 단백질이나 융합 단백질의 일부를 형성하는 데 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 이러한 단백질의 정렬과 상동성은 GDNFR 활성도와 관련된 융합 단백질이나 키메라 단백질의 부분을 이용하여 결정될 것이다.
실질적으로 상동인 GDNFR 단백질원은 인체 GDNFR 단백질과 매우 상동일 것으로 기대되는 다른 포유동물의 GDNFR 단백질을 포함한다. 예를들어, 본원에 기술한 랫과 인체 GDNFR 단백질간의 상동성은 약 93 % 이다. 실질적으로 상동인 GDNFR 단백질은 서열 2 와 4 의 GDNFR 아미노산 서열에 대한 항체와의 교차 - 반응성에 의하여 포유동물에서 분리할 수 있다. 선택적으로, 실질적으로 상동인 GDNFR 단백질은 서열 2 와 4 의 GDNFR 을 코드하는 유전자 단편이나 유전자와의 혼성화를 통해 분리하거나 서열 2 와 4 에 나타나 있는 핵산 서열의 상보 서열과 혼성시킨 핵산 서열에 의해 발현될 것이다. 적당한 혼성 조건은 하기에 보다 상세히 기술되어 있다.
불순물은 의도하는 목적에 사용하는 본 폴리펩티드의 이용 가치를 떨어뜨리기 때문에 실질적으로 불순물이 없는 GDNFR 단백질 산물을 얻기 위해 신규한 GDNFR 단백질 산물을 전형적으로 분리정제한다. 예를들어, 바람직한 GDNFR 단백질 산물은 다른 인체 단백질성 물질(예를들어, 비 - GDNFR)이나 병리학적 물질이 실질적으로 존재하지 않을 것이다. 바람직하게, GDNFR 단백질 산물 제조에 사용하는 생산 기술에서 기인하여 존재하는 다른 단백질이 GDNFR 단백질 산물에서 약 80 % 제거된다. 더욱 바람직하게, GDNFR 단백질 산물은 다른 단백질의 약 90 % 가 제거된 것이고 약 95 % 가 제거된 것이 특히 바람직하며, 가장 바람직하게는 약 98 % 이상이 제거된 것이다. 부가적으로, 본 발명은 균질의 GDNFR 단백질 제조를 위해 제공되는 폴리누클레오티드의 독특한 이점을 갖는다.
다양한 GDNFR 변이체는 부가 변이체, 결실 변이체 및 치환 변이체를 포함하여 생각할 수 있다. 예를들어, 일련의 결실 변이체는 GDNFR 단백질의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 아미노산 잔기를 하나 또는 그 이상 제거함으로써 제조할 수 있다. von Heijne 에 의해 기술된 시그널 펩티드 절단 예상 법칙[von Heijne, Nucleic Acids Research, 14, 4683 - 4690, 1986 참조]을 통해 얻은, GDNF 결합에 관련된 GDNFR 단백질의 초기 아미노산 잔기는 도 2(서열 2)의 총 길이의 인체 GDNFR 아미노산 서열에 나타나 있는 바와 같이 Ser18이다. 아미노산 잔기 Met1내지 Ser18은 시그널 펩티드 서열의 일부인 것으로 추정되는 아미노 - 말단 소수성 부위내에 존재하므로, 수용체 단백질의 성숙형에는 포함되지 않는다. 마찬가지로, GDNF 결합에 필요한 것으로 추정되는 GDNFR 단백질의 마지막 아미노산 잔기는 Ser446이다. 아미노산 잔기 Leu447내지 Ser465는 세포 표면에 대한 단백질의 GPI 결합에 관계하는 카르복시 - 말단 소수성 부위에 존재한다. 따라서, Met1내지 Ser18및/또는 Leu447내지 Ser465[도 2(서열 2)를 기준으로] 잔기 중 어떤 것이나 그들 모두는 Ala19내지 Pro446의 '중심' 서열을 제거함으로 인해 GDNFR 단백질에 대한 GDNF 결합에 영향을 미치지 않은 채로 단백질에서 제거될 수 있을 것으로 여겨진다. 또한 공지된 분석 기술을 이용한 N - 말단 절두는 Gly24를 포함하여 Gly24까지 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 제거함을 포함할 것으로 생각된다. 따라서, GDNFR 절두 유사체는 한쪽 말단이나 양 말단에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 결실시킴을 포함하는데, Asp25내지 Pro446또는 Leu447아미노산 서열은 중심 분자의 기초를 이룬다. 부가적인 GDNFR 유사체는 도 4(서열 4)의 GDNFR 아미노산 서열에 나타나 있는 아미노산 잔기 Ser18내지 Pro449를 포함하는, 즉 아미노산 잔기 Met1내지 Ser18및/또는 Pro449내지 Ser468에 나타나 있는 소수성 부위를 포함하는한쪽 말단이나 양 말단에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 결실시킨 것으로 생각된다.
부가적으로, 완전한 길이의 서열에서 맨처음 시스테인과 마지막 시스테인 잔기에 달할 때까지 아미노 말단과 카르복시 말단의 한쪽 또는 양 쪽에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 제거할 수 있을 것으로 생각된다. GDNFR 단백질이 적절하게 분자내 결합할 수 있도록 시스테인 잔기를 보유하는 것이 유리하다. 도 2(서열 2)의 완전한 길이의 인체 GDNFR 아미노산 서열에 나타나 있는 바와 같이, Met1내지 Asp28의 아미노산 잔기 중 일부 또는 전부를, Cys29와 같은 맨처음 시스테인 잔기를 결실시키지 않은 채로 아미노 말단에서 제거할 수 있다. 마찬가지로, Gly443내지 Ser465의 아미노산 잔기 중 일부 또는 전부를, Cys442와 같은 마지막 시스테인 잔기를 결실시키지 않고서 카르복시 말단에서 제거할 수 있다. 도 4(서열 4)의 GDNFR 아미노산 서열에 나타나 있는 바와 같이, 아미노산 잔기 Cys29내지 Cys443을 이용하여 즉, 아미노산 잔기 Met1내지 Asp28및/또는 Ser444내지 Ser468에 나타나 있는 말단 부위의 일부 또는 전부를 결실시킴으로써 다른 GDNFR 유사체를 제조할 수 있다.
같은 이유로, GDNFR 단백질 기능에 영향을 미치지 않으면서 확인된 아미노산 잔기를 결실시키기 보다는 치환할 수 있는 것으로 본 분야의 숙련자들은 인지할 것이다. 선택적으로, 확인된 아미노산 잔기는 GDNFR 단백질 기능에 영향을 미치지 않으면서 잔기내 삽입이나 말단 부가로 변이시킬 수 있다. 또다른 실시형태에 있어서, 결실, 치환이나 부가 중 하나 또는 그 이상을 연합하여 제조할 수 있다.
본 GDNFR 단백질 또는 핵산은 치료용 의약 제조방법이나 치료방법에 사용할 수 있다. 이러한 치료는 GDNFR 단백질 과다 생산을 특징으로 하는 조건을 포함하는데, 여기에서 본 GDNFR, 특히 가용형은 초과분의 GDNF 단백질에 결합하여 그것을 불활성화시킨다. 이러한 치료는, 가용성 수용체를 제조하거나(예를들어, GDNF 결합 도메인의 용도) 이러한 GDNFR 을 함유하는 세포 집단을 제조하여 그것을 필요로 하는 개체에 이 세포를 이식함으로써 실시한다. 또한 본 GDNFR 단백질 산물은 결함이 있는 GDNFR 수용체를 갖는 환자 치료에 이용할 수 있다. 예를들어, 가용성 수용체를 제조 및 수송하거나 이러한 비 - 결함 GDNFR 을 함유하는 세포 집단을 제조하여 이 세포를 개체에 이식함으로써 결함이 있는 GDNFR 을 갖는 개체를 치료할 수 있다. 또는, 각 개체의 GDNF 수용체의 수가 불충분할 수 있으며, 각 개체에 이용할 수 있는GDNF 수용체의 수를 증가시키기 위해 이 수용체를 함유하는 세포를 이식할 수 있다. 이 조성물을 GDNF 수송과 연합하여 사용할 수 있다. c - ret 수용체 티로신 키나아제의 활성에 반응하는 증상 치료에 GDNFR 단백질 산물을 이용할 수 있을 것으로 생각된다.
본 발명의 또다른 양상에 있어서, 신규한 조성물의 다른 이점은 GDNF 단백질 제약학적 조성물을 안정화시키기 위해 GDNFR 을 사용할 수 있는 것이다. 본 발명의 다른 양상에 있어서, GDNFR 은 화합물의 길항물질 활성도를 스크린하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 그외의 양상과 이점은 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다. 예를들어, 부가적인 용도는 신규한 검정계, 형질전환 동물 및 항체 생산을 포함한다.
연구 모델
본 발명은 본 발명의 GDNFR 분자를 발현하는 세포나 세포주에서 유도되는 생리학적 반응을 측정함으로써 펩티드 또는 비 - 펩티드 화합물에 대한 노출에 의한 GDNF 활성과 유사한 GDNF 활성이 검출되는 검정계를 제공한다. 생리학적 반응은 다음을 포함하지만 이것으로 국한되지는않는 GDNF 의 생물학적 활성을 포함할 것이다 : 도파민 흡수, 신경돌기의 확장, 세포 성장이나 생존 강화 뿐 아니라 특정 핵산 서열(예를들어, 프로모터/인핸서 성분 및 구조 유전자)의 전사 활성, GDNF - 관련 프로세싱, 번역 또는 인산화 및 GDNF 에 의해 직·간접적으로 유도되는 과정으로 인한 2 차 과정 유도, 일부를 제외하고 열거함.
예를들어, 모델계는 과도한 GDNF 활성 효과를 연구하기 위해 사용하도록 만든다. 이러한 계에 있어서, GDNF 에 대한 세포 반응은 이렇게 변이되지 않은 세포에 비하여 그 수가 증가한 모델계 세포의 GDNFR 을 조작함으로써 증가시킬 수 있다. 또한 이 계는 정상적으로 GDNFR 을 발현하는 세포에 대하여 증가된 수의 GDNFR 을 선택적으로 제공하도록 개발할 수 있다. GDNFR 이 발현되도록 하기 위해, 적당한 프로모터 서열의 조절하에 GDNFR 유전자를 둔다. 구성 및/또는 조직 특이 프로모터(CNS 신경원 특이 에놀라아제, 신경사상체 및 티로신 수산화효소 프로모터), 유도가능한 프로모터(메탈로티오네인 프로모터와 같은), 인체 면역결핍 바이러스 말단 반복 배열내 UV 활성 프로모터(Valeri 등의 1988, Nature 333 : 78 - 81) 또는 CMV 프로모터(하기 pCMX 에 포함됨)나 발육 조절 프로모터 조절하에 GDNFR 유전자를 두는 것이 바람직하다.
세포내 GDNFR 수를 증가시킴으로써, 내생 GDNF 반응을 증가시킬 수있다. 모델계가 GDNF 를 거의 또는 전혀 함유하지 않는다면, GDNF 를 계에 가할 수도 있다. 또한 초과분의 GDNF 활성 효과를 측정하기 위해 모델계에 부가적인 GDNF 를 가하는 것이 바람직하다. 과다발현된 GDNF(또는 분비된 GDNF)는 GDNF 를 이미 발현한 세포의 상승 수준 효과를 연구하는 한 방법일 수 있다.
GDNFR 치료
다른 양상에 있어서, GDNF 반응성을 증가시킴으로써 특정 조건이 유익해질 수 있다. 따라서, GDNF 치료에 민감한 질환을 앓고 있는 환자에게서 GDNFR 의 수나 결합 친화성을 증가시키는 것이 바람직할 것이다. 이것은 적당한 세포내 재조합 GDNFR 을 선택적으로 발현시키는 유전자 치료를 통해 이루어질 수 있는데, 조직 특이 프로모터나 유도가능한 프로모터에 의해 조절되는 GDNFR 유전자를 사용하거나 재조합 GDNFR 유전자를 운반하는 복제 결함 바이러스로 국부 감염시켜 생산한다.
GDNFR 또는 GDNF/GDNFR 연합 수송으로 완화되는 질환은 근위축성측삭경화증을 포함한 운동신경원 질환, 당뇨병, 파킨슨병, 알쯔하이머병과 관련된 신경학적 질환 및 헌팅톤무도병을 포함하지만 이것으로 국한되지는 않는 것으로 생각된다. GDNFR 또는 GDNF/GDNFR 연합 수송에 이용하기위한 부가적인 적용은 하기하며, 다음의 치료를 더 포함한다 : 망막신경절 세포 변성을 포함한 녹내장이나 그외의 질환 및 증상 ; 감각신경원의 변성이나 손상에 의해 야기되는 감각신경병 ; 광수용체 변성이 일어나고 시각 손실의 원인이 되는 손상 - 관련 망막증, 유전적 망막 변성 및 연령, 질환과 같은 병리학적 증상 ; 및 여러 원인에서 기인하는 청각 손실 예방 및/또는 치료를 위한 모세포와 청각신경원 같은 내이 감각신경원의 손상이나 변성.
형질전환 동물
또다른 양상에 있어서, 재조합 GDNFR 유전자는 내생 유전자를 '넉 아웃(knock out)' 시키거나(예를들어, 상동 재조합에 의해) 불활성화 시키는데 사용하며, 그로 인해 GDNFR 결핍 세포, 조직 또는 동물이 형성된다. 예를들어, 재조합 GDNFR 유전자는 GDNFR 을 불활성화시키는 삽입 돌연변이를 내포하도록 변이시킬 수 있다. 적당한 프로모터의 조절하에, 이러한 구성물은 형질감염, 트랜스덕션, 주입 등을 포함한 통상적인 기술을 이용하여 배의 간세포와 같은 세포내로 도입된다. 그런 다음 구성물을 함유하는 세포는 예를들어 G418 내성으로 선택한다. 원래의 GDNFR 유전자가 결핍된 세포를 확인한다(예를들어, 서던 블롯팅이나 노던 블롯팅 또는 발현 검정에 의해). 원래의 GDNFR 유전자가 결핍된 세포는 초기 배세포에 융합되어 GDNFR 결핍 형질전환 동물을 형성한다. 내생 GDNF 를 발현하지 못하는 동물과 이 동물을 비교하면, 두 표현형 중 하나가 완전히 맞아 떨어지거나 그렇지 않음을 알 수 있는데 이것은 부가적인 GDNF - 유사 인자 또는 수용체가 존재함을 의미한다. 이러한 동물은 특이 신경원 집단 또는 그외의 생체내 돌기, GDNF 에 대한 정상적인 의존성을 확인하는 데 사용한다. 따라서, 이러한 집단이나 돌기는 동물이 GDNFR 을 발현하지 못하여 GDNF 에 반응할 수 없다면 영향을 받지 않을 것으로 기대된다.
진단 적용
본 발명에 따른 GDNFR 프로브는 정상 상태나 질환 상태에서 GDNF 에 민감한 세포와 조직을 확인하는 데 사용한다. 본 발명은 이러한 세포에서 발현되는 GDNFR 을 검출함으로써 GDNF 에 민감한 세포를 확인하는 방법을 제공한다. GDNFR mRNA 전사 또는 GDNFR 단백질 생산으로 GDNFR 발현을 입증한다. GDNFR 발현은 GDNFR 핵산이나 단백질을 확인하는 프로브를 사용하거나 GDNFR 단백질에 인위적으로 부가되는 '표식' 을 검출함으로써 검출할 수 있다.
GDNFR 발현을 검출하는 데 사용하는 프로브 중 하나는 핵산 프로브이며, 이것은 정상소재 혼성화, 노던 블롯 분석 또는 PCR 관련 기술을 포함하지만 이에 국한되지는 않은 본 분야에 공지된 모든 기술에 의해 GDNFR - 코딩 RNA 를 검출하는 데 사용할 수 있다. 본 발명의 핵산 산물은 검출가능한 마커(비오틴처럼 방사성표식 및 비 - 동위원소 표식과 같은)로 표지하여 염색체 지도에서 인체 GDNFR 유전자의 위치 및/또는 모든 관련 유전자군의 위치를 찾아내는 혼성 과정에 사용할 수 있다. 또한 DNA 수준에서 인체 GDNFR 유전자 질환을 확인하는 데에도 사용할 수 있으며 인접 유전자와 그 질환을 확인하는 유전자 마커로도 사용할 수 있다. 본원에서는 이러한 표지 물질을 함유하는 키트도 고려된다.
본 발명의 폴리펩티드 산물은 검출가능한 마커 물질이나 표식(예를들어, 방사능 동위원소, 형광화학 제품 또는 화학발광 제품, 효소 또는 그외에 본 분야의 숙련자들이 입수가능한 표식)과 결합시킴으로써 표지하여 혈액이나 뇨와 같은 액체 시료와 고체 조직에서의 GDNF 검출 및 정량에 유용한 시약을 제공한다. 이러한 산물은 또한 정상 상태나 질병 상태에서 GDNF 에 민감한 세포와 조직을 검출하는 데 사용할 것이다.
실험 시료내 GDNF 의 존재를 검출하거나 GDNF - 유사 분자의 존재를스크린하는 다른 가능한 검정은 고체상에 고정시킨 GDNFR 펩티드와 실험 시료를 접촉시켜 GDNFR 이 결합된 GDNF 를 생산하는 것이다. GDNFR 이 결합된 GDNF 는 GDNF 에 특이하게 표지되는 항체와 같은 검출 시약과 임의적으로 접촉시켜 검출가능한 산물을 생산한다. 이 검정은 실험 시료를 분석하기 위한 검정 기구의 형태에서 발전하였다. 기본형으로서의 이 기구는 GDNFR 을 내포하거나 그것으로 피복된 고체상을 포함한다. GDNF 존재에 대하여 실험 시료를 분석하는 방법은 GDNFR 단백질을 함유하는 검정 시약과 시료를 접촉시킴을 포함하는데, 여기에서 상기 GDNFR 단백질은 실험 시료에 존재하는 GDNF 와 반응하며 GDNF 가 존재함을 나타내는 검출가능한 반응 산물을 생산한다.
본원에서 제공되는 검정 시약도 제조용 키트나 품목의 일부로 포함된다. 패키징 물질 및 현재 제공되는 핵산 서열이나 아미노산 서열 중 하나 또는 그 이상의 제제를 포함하는 제조용 품목도 고려된다. 이러한 패키징 물질은 제제가 생물학적 시료내에서 GDNF, GDNFR 또는 GDNFR 결핍을 검출하는 데 유용함을 나타내는 표식을 포함할 것이다. 이와 같이, 키트는 선택적으로 이러한 실험을 실시하는 물질, 예를들어 혈액, 뇨 또는 조직 시료에 대한 단백질 분석, DNA 나 RNA 혼성화 분석 또는 PCR 분석에 유용한 시약을 포함할 것이다.
항 - GDNFR 항체
본 발명에 따른 GDNFR 단백질 또는 그것의 단편이나 유도체는 항 - GDNFR 항체를 생산하는 면역원으로 사용할 수 있다. 항 - GDNFR 면역 반응을 일으킬 가능성을 더 높이기 위해서, 면역원성 증가와 관련된 분자 부분을 확인하기 위해 GDNFR 의 아미노산 서열을 분석한다. 예를들어, GDNFR 의 친수성, 표면 확률, 굴곡성, 항원 지수, 양친매성 나사선, 양친매성 쉬트와 이차 구조를 컴퓨터 도표로 나타내어 표면 에피토프를 확인할 수 있도록 아미노산 서열을 컴퓨터로 분석하였다. 대안으로서, 상이한 종의 아미노산 서열과 GDNFR 을 비교하여 상대적으로 비 - 상동 부위를 확인할 수 있다 ; 이 비 - 상동 부위는 다양한 종에 대하여 면역원일 것이다.
단지 연속적인 아미노산 서열이나 GDNFR 내부의 2 차 입체형태의 일부로서 복제되는 폴리펩티드 단편도 생각할 수 있는데, 이 단편은 포유동물 GDNFR 의 활성(예를들어, 면역학적 활성)은 가지며 다른 것(예를들어, GDNF 단백질 결합 활성)은 갖지 않는다. 따라서, 항체 생산은 항 - 펩티드 항체 생산을 포함한다. 하기 전형적인 펩티드는 GDNFR 서열을 이용하여 합성하였다.
펩티드 SJP - 6, 7 및 8 은 랫과 인체 GDNFR 에서 확인된다. 펩티드 SJP - 9 와 10 은 랫 서열에서 유도되며 각각은 인체와는 상이한 아미노산이다. 이 펩티드 또는 그외의 GDNFR 부분을 이용하여 본 분야에 공지된 방법으로 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 둘다를 제조할 수 있다.
GDNFR 에 대한 모노클로날 항체는 배양액내 연속 세포주에 의해 항체 분자를 생산하는 모든 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를들어, 하이브리도마 기술은 원래 모노클로날 항체를 생산하기 위해 Kohler 와 Milstein 에 의해 개발되었으며(Nature, 256 : 495 - 497, 1975 참조), 트리오마 기술, 인체 B - 세포 하이브리도마 기술(Kozber 등의 Immunology Today 4 : 72, 1983 참조), EBV - 하이브리도마 기술(Cole 등의 in 'Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 'Alan R. Liss, Inc.pp. 77 - 96, 1985 참조) 등이 사용될 수 있다.
인체 모노클로날 항체나 키메라 인체 - 마우스(또는 그외의 다른 종) 모노클로날 항체를 치료 용도를 위해 제조할 수 있으며, 본 분야에 공지된 다수의 모든 기술로 제조할 수 있다(예를들어, Teng 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 80 : 7308 - 7312, 1983 ; Kozber 등의 Immunology Today, 4 : 72 - 79, 1983 ; Olsson 등의 meth. Enzymol., 92 : 3 - 16, 1982 참조). 키메라 항체 분자는 인체 불변 영역을 갖는 마우스 항원 - 결합 도메인을 함유하도록 제조된다(Morrison 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81 : 6851, 1984 ; Takeda 등의 Nature, 314 : 452, 1985 참조).
본 분야에서 공지된 여러 방법을 폴리클로날 항체 생산에 이용할 수 있다. 항체 생산을 위해, 토끼, 마우스, 랫 등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는 여러 숙주 동물에 GDNFR 단백질이나 그것의 단편이나 유도체를 주사함으로써 그것을 면역화시킬 수 있다. 선택한 숙주 종에 따라, 면역 반응을 증가시키기 위해 여러 보조제를 사용할 수 있다. 유용한 보조제는 다음을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다 : 프로인트 완전 보조제와 불완전 보조제, 수산화 알루미늄 같은 미네랄 겔, 리소레시틴 같은 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모사이아닌, 디니트로페놀 및 BCG(바실레 칼메트 - 구에린)과 코리네박테륨 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 인체 보조제.
GDNFR 에피토프에 대한 항체의 분자 클론은 공지된 기술에 의해 제조할 수 있다. 재조합 DNA 방법학[예를들어, Maniatis 등의 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982 참조]은 모노클로날 항체 분자나 그것의 항원 결합 부위를 코드하는 핵산 서열을 구성하는 데 사용할 수 있다.
항체 분자는 공지 기술, 예를들어 면역흡착 또는 면역친화 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법 또는 그것을 연합하여 정제할 수 있다. 본 발명은 항체 분자 뿐 아니라 그것의 단편을 제공한다. 분자의 유전형을 함유하는 항체 단편은 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 예를들어, 이러한 단편은 다음을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다 : 항체 분자의 펩신 절단에 의해 생산될 수 있는 F(ab') 2 단편 ; F(ab') 2 단편의 이황화물 다리를 환원시킴으로써 생산할 수 있는 Fab' 단편 및 파파인과 환원제로 항체 분자를 처리함으로써 생산할 수 있는 Fab 단편.
이러한 선택적인 결합 분자는 GDNFR 단백질의 대안일 수 있으며, 제약학적 조성물로 제형화할 수 있다.
GDNFR 단백질의 재조합 발현
본 발명은 GDNFR 단백질을 코드하는 다양한 폴리누클레오티드를 제공한다. 발현 산물이나 그 유도체는, 도파민작용성 세포에 의한 도파민 흡수 증가와 같은 GDNF 활성을 제공하거나 강화시킴으로써 시그널 분자와의 상호작용이 일어나도록 높은 친화성으로 특이하게 GDNF 에 결합하는 능력을 갖는 것이 특징이다. 세포 치료나 유전자 치료에도 폴리누클레오티드를 사용할 수 있다.
본 발명에 따라, 신규한 GDNFR 단백질과 이 수용체의 전부 또는 일부를 코드하는 DNA 서열이 제공된다. 본 발명의 신규한 핵산 서열은 1 차 구조 입체형태의 적어도 한 부분과 재조합 인체 GDNFR 의 생물학적 특성 중 하나 또는 그 이상을 갖는 폴리펩티드 산물의 진핵 또는 원핵 숙주 세포 발현을 안정시키는 데 유용한 서열을 포함한다. 원하는 코딩 부분이 본 폴리펩티드 생산에 유용하도록 핵산을 분리정제한다. 선택적으로, 하기에 보다 충분히 기술하는 바와 같이 핵산 서열을 진단 목적에 사용할 수 있다. 본 발명의 전형적인 DNA서열은 도 2 와 4 에 나타나 있고 서열 2 와 4 에 기술되어 있는 GDNFR 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함한다. 부가적으로, 본 발명에 기술된 DNA 서열은 특히 다음을 포함한다 : (a) 도 1 과 3 에 나타나 있는 DNA 서열(및 상보 가닥) ; (b) 아부분(a)의 DNA 서열 또는 그 단편과 혼성되는(하기 cDNA 라이브러리 스크리닝 항목에 기술된 혼성 조건이나 그에 상당하는 조건 또는 보다 엄격한 조건하에서) DNA 서열 ; 및 (c) 유전 암호의 동의성을 제외하고는, 아부분(a)의 DNA 서열에 혼성되는 DNA 서열. (b) 와 (c) 에 특히 포함되는 것은 인체 GDNFR 의 대립형질 변이체를 코드하고/하거나 그외의 포유동물 종의 GDNFR 을 코드하는 게놈 DNA 서열과 GDNFR, GDNFR 단편 및 GDNFR 유사체를 코드하는 제조 DNA 서열이며, 이 DNA 서열에 미생물 숙주내 메신저 RNA 의 전사와 번역을 용이하게 하는 코돈을 결합시킬 수 있다. 이렇게 제조한 서열은 본원에 기술한 기술 뿐 아니라 본 분야에 공지된 방법에 따라 용이하게 파악할 수 있다.
본원에 기술된 방법 또는 그외의 공지된 방법에 따라 실시하는 재조합 발현 기술을, 이 폴리누클레오티드를 생산하고 각각의 GDNFR 단백질을 발현하는 데 사용한다. 예를들어, GDNFR 단백질을 코드하는 핵산 서열을 적절한 벡터로 삽입함으로써 본 분야의 숙련자들은 용이하게 원하는 누클레오티드 서열을 대량 생산할 수 있다. 이 서열은 검출 프로브나 증폭 프라이머를 만드는 데 사용할 수 있다. 선택적으로, GDNFR 단백질을 코드하는 폴리누클레오티드를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 적당한 숙주 내로 발현 벡터를 삽입함으로써 원하는 GDNFR 단백질을 대량으로 생산할 수 있다.
본원에 기술한 바와 같이, 핵산 서열을 증식시키고/시키거나 GDNFR 단백질을 생산하기 위해 사용가능한 숙주/벡터계가 다수 존재한다. 여기에는 플라스미드, 바이러스 벡터, 삽입 벡터, 원핵 숙주와 진핵 숙주가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 본 분야의 숙련자들은 본 발명의 서열을 생산하거나 발현시키기 위해 이형 DNA 를 증식시키거나 발현시킬 수 있는 숙주/벡터계를 사용할 수 있다.
이러한 재조합 기술을 사용하여, 순도 높은 본 발명의 GDNFR 단백질을 상업적인 양으로 용이하게 생산한다. 더욱이, 신규한 핵산 서열은 도면에 특이하게 기술한 GDNFR 단백질을 코드하는 동의성 핵산 서열, GDNFR 단백질 변이체를 코드하는 서열 및 이들 핵산 서열에 상보적으로 혼성되는(바람직하게, 엄격한 혼성 조건하에서) 핵산 서열을 포함하는 것으로 본 분야의 숙련자들은 본 명세서를 참조하여 인지할 것이다 [Maniatis 등의 Molecular Cloning(A Laboratory Manual) ; Cold Spring Harbor Laboratory, Pages 387 - 389, 1982 참조]. 전형적인 엄격한혼성 조건은 62 - 67 ℃ 의 4 × SSC 에서 혼성시킨 다음 62 - 67 ℃ 의 0.1 × SSC 에서 약 1 시간동안 세척하는 것이다. 대안으로서의 전형적인 엄격한 혼성 조건은 40 - 45 ℃ 의 45 - 55 % 포름아미드, 4 × SSC 에서 혼성하는 것이다. 완화된 혼성 조건하에서 GDNFR 단백질의 상보 서열에 혼성되고 본 발명의 GDNFR 단백질을 코드하는 DNA 서열 또한 본원에 기술되어 있다. 완화된 혼성 조건의 예는 45 - 55 ℃ 의 4 × SSC 또는 40 - 45 ℃ 의 30 - 40 % 포름아미드로 혼성하는 것이다.
GDNFR 을 코드하는 폴리누클레오티드 제조
본 발명의 명세서를 토대로, 완전한 길이의 GDNFR 폴리펩티드를 코드하는 핵산 서열 또는 그 단편은 화학 합성, cDNA 또는 게놈 라이브러리 스크리닝, 발현 라이브러리 스크리닝 및/또는 cDNA PCR 증폭을 포함한 다양한 방법으로 용이하게 제조하거나 수득할 수 있으며 이 방법들로 제한되지는 않는다. 핵산 서열을 제조하는 데 유용한 이들 방법과 그외의 방법들은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를들어 Sambrook 등의(Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Ausubel 등의 eds(Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press, 1994) 및 Berger 와 Kimmel 의(Methods in Enzymology : Guide toMolecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987)에 기술되어 있다. GDNFR 을 코드하는 바람직한 핵산 서열은 포유동물 서열이다.
GDNFR 단백질을 코드하는 핵산 서열의 화학 합성은 Engels 등의 (Angew. Chem. Intl. Ed., 28 : 716 - 734, 1989)에 기술된 바와 같이 본 분야에 공지된 방법을 이용하여 이룰 수 있다. 그 중에서도 이러한 방법은 포스포트리에스테르, 포스포르아미디트 및 H - 포스포네이트 핵산 서열 합성 방법을 포함한다. 화학 합성에 바람직한 방법은 표준 포스포르아미디트 화학을 이용한 중합체 - 지지 합성이다. 전형적으로, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 는 그 길이가 수백 염기쌍(bp) 또는 누클레오티드일 것이다. 100 누클레오티드 보다 큰 핵산 서열은 이 방법을 이용하여 수 개의 단편으로 합성할 수 있다. 그런 다음 이 단편들을 서로 결합시켜 완전한 길이의 GDNFR 폴리펩티드를 발현하는 서열 또는 그것의 일부가 되도록 할 수 있다.
선택적으로, 적당한 핵산 서열은 적당한 cDNA 라이브러리(즉, 단백질을 발현하는 것으로 여겨지는 조직원 중 하나 또는 그 이상에서 제조한 라이브러리) 또는 게놈 라이브러리(총 게놈 DNA 에서 제조한 라이브러리)를 스크리닝 함으로써 수득한다. cDNA 라이브러리의 원은 일반적으로적당량의 GDNFR 을 발현하는 것으로 여겨지는 조직이다. 일반적으로, 게놈 라이브러리 원은 GDNFR 을 코드하는 유전자를 내포하는 것으로 여겨지는 포유동물 종의 어떤 조직이다. 라이브러리에 존재하는 GDNFR cDNA 또는 유전자와 선택적으로 혼성되는 하나 또는 그 이상의 핵산 프로브(현재 기술된 서열을 토대로 한 올리고누클레오티드, cDNA 또는 게놈 DNA 단편)를 이용하여 GDNFR cDNA/유전자의 존재에 대하여 라이브러리를 스크린할 수 있다. 이러한 라이브러리 스크리닝에 사용하는 전형적인 프로브는 통상 라이브러리를 제조하는 종과 같거나 유사한 종의 GDNFR 핵산 서열 중 소부위를 코드한다. 선택적으로, 프로브는 본원에 기술한 바와 같이 동의적이다.
라이브러리 스크리닝은 일반적으로 라이브러리내 클론의 올리고누클레오티드 프로브나 cDNA 를 어닐링함으로써 이루어지는데, 이 스크리닝은 프로브나 프라이머와 상당한 정도의 상동성을 갖는 클론의 결합(혼성화)은 허용하지만 비 - 특이 결합은 방해하는 조건에서 이루어진다. 일반적인 혼성 및 세척 조건은 cDNA 나 올리고누클레오티드 프로브의 크기(즉, 누클레오티드의 수)와 프로브의 동의성에 부분적으로 의존한다. 클론의 수득 가능성은 혼성 용액 제조에 있어서도 고려된다(예를들어, cDNA 를 스크린하느냐 게놈 라이브러리를 스크린하느냐의 여부 ; cDNA 라이브러리라면 관심있는 cDNA 가 고수준으로 존재하는 가능성을 고려).
DNA 단편(예를들어 cDNA)을 프로브로 사용하는 경우, 전형적인 혼성 조건은 Ausubel 등의 eds., 상기문헌에 기술된 조건을 포함한다. 혼성시킨 후, 프로브 크기, 클론에 대한 프로브의 예상 상동성, 스크린할 라이브러리 형태, 스크린할 클론의 수 등과 같은 몇몇 인자에 따라 라이브러리를 함유하는 블롯을 적당한 조건에서 세척한다. 엄격한 세척 용액(보통 이온 세기가 낮고 비교적 높은 온도에서 사용)의 예는 다음과 같다. 이러한 엄격한 세척제는 55 - 65 ℃ 의 0.015 M NaCl, 0.005 M 시트르산나트륨 및 0.1 % SDS 이다. 다른 완충액은 약 40 - 50 ℃ 의 1 mM Na2EDTA, 40 mM NaHPO4, pH 7.2 및 1 % SDS 이다. 그외의 엄격한 세척제는 약 50 - 65 ℃ 의 0.2 × SSC 및 0.1 % SDS 이다.
cDNA 나 게놈 라이브러리를 스크린하는 데 올리고누클레오티드 프로브를 사용할 경우에도 엄격한 세척 조건에 관한 전형적인 프로토콜이 존재한다. 예를들어, 첫 번째 프로토콜은 프로브의 길이에 따라 약 35 ~ 62 ℃ 의 온도에서 6 × SSC 와 0.05 % 피로인산나트륨을 사용한다. 예를들어, 14 개의 염기를 갖는 프로브는 35 - 40 ℃ 에서 세척하고, 17 개의 염기를 갖는 프로브는 45 - 50 ℃ 에서, 20 개 염기 프로브는 52 - 57 ℃ 에서, 23 개 염기 프로브는 57 - 63 ℃ 에서 각각 세척한다. 배경 비 - 특이 결합이 높게 나타날 경우 온도는 2 - 3 ℃ 증가시킬 수 있다. 두 번째 프로토콜은 세척액으로 테트라메틸암모늄클로라이드(TMAC)를 사용한다. 엄격한 세척 용액은 5 M TMAC, 50 mM 트리스 - HCl, pH 8.0 및 0.2 % SDS 이다.
GDNFR 단백질을 코드하는 핵산 서열을 수득하는 다른 적당한 방법은 폴리메라제 연쇄 반응법(PCR)이다. 이 방법에 있어서, 폴리(A) + RNA 또는 총 RNA 는 GDNFR 을 발현하는 조직에서 추출한다. 그런다음 효소 역전사효소(즉, RT - PCR)를 이용하여 RNA 로 부터 cDNA 를 제조한다. 일반적으로 GDNFR cDNA(올리고누클레오티드)의 각각의 두 부위에 상보적인 두 프라이머를 Taq 폴리메라제와 같은 폴리메라제와 함께 cDNA 에 가하면, 폴리메라제는 두 프라이머 간의 cDNA 부위를 증폭시킨다.
원하는 GDNFR 단백질을 코드하는 핵산 서열 제조방법에 올리고누클레오티드 프라이머나 프로브를 사용해야 할 경우(예를들어, PCR, cDNA 또는 게놈 라이브러리 스크리닝), 프로브나 프라이머로 선택되는 올리고누클레오티드 서열은 라이브러리 스크리닝이나 PCR 증폭 도중에 발생하는 비 - 특이 결합량을 최소화하기 위해 충분히 길고 분명해야 한다. 프로브나 프라이머의 실제 서열은 보통 본 발명과 관련된 랫의 핵산 서열과 같이 다른 생물체의 같거나 유사한 유전자의 보존된 서열이나 부위 또는 매우 상동인 서열이나 부위를 기초로 한다. 선택적으로, 프로브나 프라이머는 상이한 코돈을 사용하는 것을 제외하고는 완전히 또는 부분적으로 동의적일 수 있다. 즉, 동일한 아미노산 서열을 코드하는 모든 프로브/프라이머 혼합물을 함유한다. 동의성 프로브를 제조하는 대안은 종에 따라 달라지는 일부 또는 모든 코돈 위치에 이노신을 넣는 것이다. 올리고누클레오티드 프로브나 프라이머는 상기한 바와 같이 DNA 화학 합성 방법에 의해 제조할 수 있다.
GDNFR 을 코드하는 이 핵산 서열을 기초로 한 GDNFR 단백질 뿐 아니라 그 서열의 돌연변이체나 변이체도 본 발명의 범주내에 속하는 것으로 생각된다. 돌연변이 서열이나 변이 서열은 야생형 서열에 비하여 하나 또는 그 이상의 누클레오티드가 치환, 결실 및/또는 부가된 서열을 포함하며 이 서열은 야생형 아미노산 서열에 비하여 아미노산 서열 변이체를 발현한다. 몇몇 경우에 있어서, 자연적인 대립형질 변이에서 기인하는 자연발생적인 GDNFR 아미노산 돌연변이체나 변이체가 존재할 수 있다. 이러한 자연발생적인 돌연변이체나 변이체에 기초한 GDNFR 단백질도 본 발명의 범주내에 속한다. 합성 돌연변이 서열 제조방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를들어 Wells 등의(Gene, 34 : 315, 1985) 및 Sambrook 등의 상기문헌에 기술되어 있다.
일부 경우에 있어서, 자연발생적인 GDNFR 의 핵산 및/또는 아미노산변이체를 제조하는 것이 바람직하다. 핵산 변이체(여기에서 하나 또는 그 이상의 누클레오티드는 야생형 GDNFR 이나 자연발생적인 GDNFR 과는 다르도록 만들었다)는 부위 특이 돌연변이유발이나 PCR 증폭을 통해 생산하는데, 이때 프라이머는 원하는 점돌연변이를 갖는다(돌연변이 기술에 관하여는 Sambrook 등의 상기문헌과 Ausubel 등의 상기문헌을 참조하라). Engels 등의 상기문헌에 기술된 방법을 이용한 화학 합성은 이러한 변이체를 제조하는 데 사용할 수 있다. 숙련자들에게 공지된 다른 방법도 사용할 수 있다. 바람직한 핵산 변이체는 GDNFR 재조합 생산에 사용하는 숙주 세포에서의 코돈 선호를 설명하는 누클레오티드 치환을 포함한다. 다른 바람직한 변이체는, 야생형에 비해 보존적인 아미노산 치환체를 코드하는 것(예를들어, 여기에서 자연발생적인 아미노산 사슬의 전하나 극성은 다른 아미노산으로 치환하더라도 실질적으로 변하지 않음) 및/또는 GDNFR 에 새로운 글리코실화 부위 및/또는 인산화 부위 중 하나를 생성시킨 것 또는 GDNFR 에 존재하는 글리코실화 부위 및/또는 인산화 부위를 삭제한 것이다.
벡터
원하는 GDNFR 단백질을 코드하는 cDNA 나 게놈 DNA 를 클로닝(DNA 증폭)하거나 발현시키기 위해 벡터에 삽입한다. 적당한 벡터는 통상적으로 입수가능하며 또는 특별히 구성할 수도 있다. 가능한 벡터는 코스미드, 플라스미드 또는 변이 바이러스를 포함하지만 이에 국한되지는 않으며 벡터계는 선택 숙주 세포와 양립되어야 한다. 이러한 벡터는 람다 유도체와 같은 박테리오파지 또는 pBR322, pUC 이나 Bluescript(등록상표) 플라스미드 유도체(미국 캘리포니아 라 졸라 소재 스트라타진에서 입수)와 같은 플라스미드를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 재조합 분자는 형질전환, 형질감염, 감염, 일렉트로포레이션 또는 그외의 공지 기술에 의해 숙주 세포내로 삽입할 수 있다.
예를들어 GDNFR - 코딩 핵산 서열은, 다수의 핵산 서열 복제가 이루어지도록 적당한 숙주 세포내로 형질전환되거나 형질감염 또는 감염시키는 데 사용하는 클로닝 벡터 내로 삽입된다. 이것은 상보적인 코히시브 말단을 갖는 클로닝 벡터내로 DNA 단편을 결합시킴으로써 이루어질 수 있다. DNA 를 절단하는 데 사용하는 상보적인 제한 부위가 클로닝 벡터내에 존재하지 않는다면, DNA 분자 말단을 효소적으로 변이시킨다. 결과적으로 생성되는 핵산 서열을 벡터내로 용이하게 삽입시키기 위해, 폴리메라제 연쇄 반응법에 사용하는 올리고누클레오티드 프라이머내로 제한 엔도누클레아제 절단 부위를 도입하는 것이 바람직하다. 선택적으로, 원하는 모든 부위는 DNA 말단에 누클레오티드 서열(링커)을 결합시켜 생산할 수 있다 ; 이러한 결합 링커는 제한 엔도누클레아제 인식 서열을코드하는 특정 화학 합성 올리고누클레오티드를 포함할 것이다. 선택적인 방법에 있어서, 절단된 벡터와 GDNFR - 코딩 핵산 서열은 동종중합체 말단끌기(tailing)에 의해 변이시킨다. 특정 실시형태에 있어서, 분리된 GDNFR 유전자, cDNA 또는 합성 DNA 서열을 삽입한 재조합 DNA 분자로 숙주 세포를 형질전환시키면 유전자가 다중 복제된다. 따라서, 형질전환체를 성장시켜 이 형질전환체에서 재조합 DNA 를 분리하고, 필요에 따라 분리된 재조합 DNA 로 부터 삽입 유전자를 회수함으로써 GDNFR - 코딩 핵산 서열을 대량으로 수득할 수 있다.
적당한 벡터의 선택이나 구성은 1) DNA 증폭에 사용하는지 DNA 발현에 사용하는지 여부 2) 벡터내로 삽입되는 DNA 의 크기 및 3) 이 벡터로 형질전환시키는 숙주 세포(예를들어, 포유동물, 곤충, 효모, 진균, 식물 또는 박테리아 세포)에 좌우될 것이다. 각 벡터는 그것의 기능(DNA 증폭 또는 DNA 발현) 및 사용하려는 숙주 세포와의 적합성에 따른 여러 성분을 함유한다. DNA 발현의 경우, 벡터 성분은 다음 중 하나 또는 그 이상을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다 : 시그널 서열, 복제 기원, 하나 또는 그 이상의 선택 유전자 또는 표식 유전자, 인핸서 성분, 프로모터, 전사 종결 서열 등. 이 성분은 천연원이거나 공지된 방법으로 합성하여 수득할 수 있다. 본 발명의 벡터는 선택된 숙주 세포에서 GDNFR - 코딩 핵산 서열의 증폭이나 발현을 관리하거나 조절하고 또는 그 반대의 영향을 미칠 수 있는 조절 성분 또는 유사 작동 성분, 증폭 성분, 발현 조절 성분 중 하나 또는 그 이상과 작동적으로 결합하는, GDNFR 단백질을 코드하는 핵산 서열을 포함한다.
GDNFR 핵산 서열 삽입물을 함유하는 발현 벡터는 일반적으로 세 방법에 의해 확인할 수 있다 : (a) DNA - DNA 혼성화 ; (b) '표식' 유전자 기능의 존재 또는 부재 및 (c) 삽입 서열의 발현. 첫 번째 방법에 있어서, 발현 벡터에 외부 핵산 서열이 삽입되었는 지의 여부는 삽입된 GDNFR - 코딩 핵산 서열과 상동인 서열을 함유하는 프로브를 사용한 DNA - DNA 혼성화로 검출할 수 있다. 두 번째 방법에 있어서, 벡터내로 외부 핵산 서열을 삽입시킴으로써 야기되는 특정 '표식' 유전자 기능(예를들어, 티미딘 키나아제 활성, 항생물질에 대한 내성, 형질전환 표현형, 바쿨로바이러스에서 형성되는 폐쇄체 등)의 존재 또는 부재에 대하여 확인할 수 있다. 예를들어, GDNFR - 코딩 핵산 서열이 벡터의 표식 유전자 서열 내로 삽입된다면, GDNFR 삽입물을 함유하는 재조합체는 표식 유전자 기능의 부재로 확인할 수 있다. 세 번째 방법에 있어서, 재조합 핵산 서열에 의해 발현되는 외부 단백질 산물을 검출함으로써 재조합 발현 벡터를 확인할 수 있다. 이러한 검정은 발현되는 GDNFR 단백질 산물의 물리학적 성질이나 기능상의 특성, 예를들어GDNFR 을 직접 인식하는 GDNF 또는 항체에 대한 GDNFR 단백질의 결합을 토대로 할 수 있다.
시그널 서열
시그널 서열은 벡터 성분이거나 벡터내로 삽입되는 GDNFR DNA 의 일부일 것이다. 천연 GDNFR DNA 는 성숙한 GDNFR 단백질을 생성시키기 위해 번역후 프로세싱 중에 절단되는 단백질 아미노 말단에 존재하는 시그널 서열을 코드한다. 천연 시그널 서열을 수반하는 GDNFR 폴리누클레오티드 뿐 아니라 천연 시그널 서열을 이형 시그널 서열로 치환하거나 삭제한 GDNFR 폴리누클레오티드도 본 발명의 범주에 속한다. 선택된 이형 시그널 서열은 숙주 세포에 의해 인식되어 프로세싱되는, 즉 시그널 펩티드에 의해 절단되는 것이다. 천연 GDNFR 시그널 서열을 인식하지도 프로세싱하지도 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 예를들어 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, 또는 열 - 안정 엔테로톡신 II 리더 중에서 선택한 원핵 시그널 서열로 시그널 서열을 치환한다. 효모 분비의 경우, 효모 인베르타제, 알파 인자 또는 산 포스파타제 리더로 천연 GDNFR 시그널 서열을 치환할 수 있다. 다른 포유동물 시그널 서열이 적당하기는 하나, 포유동물 세포 발현 천연 시그널 서열로 충분하다.
복제 기원
일반적으로 발현 벡터와 클로닝 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택 숙주 세포에서 벡터를 복제할 수 있는 핵산 서열을 함유한다. 클로닝 벡터에 있어서, 이 서열은 숙주 염색체 DNA 와는 별도로 벡터를 복제시키며 복제 기원이나 자체적으로 복제 서열을 포함한다. 이 서열은 각각의 박테리아, 효모 및 바이러스에 대하여 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322 의 복제 기원은 대부분의 그람 - 음성 박테리아에 적당하며, 여러 가지 기원(예를들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포내 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기원 성분은 포유동물 발현 벡터에는 필요없다(예를들어, SV40 기원은 그것이 시발 프로모터를 함유한다는 이유만으로 종종 사용된다).
선택 유전자
발현 벡터와 클로닝 벡터는 선택 유전자를 함유할 것이다. 이 유전자는 형질전환 숙주 세포를 선택 배양 배지에서 성장시킬 때 그것의 생존이나 성장에 필요한 '표식' 단백질을 코드한다. 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 선택 유전자를 함유하지 않을 것이며, 따라서 배양 배지에서 성장하지 못할 것이다. 일반적인 선택 유전자는 (a) 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린과 같은 항생물질이나 그외의 독소에 대한 내성을 부여하고 ; (b) 자가영양 결핍을 보충하거나 ; (c) 배양 배지에서 입수할 수 없는 부족한 영양분을 보충하는 단백질을 코드한다.
그외의 선택 유전자는 발현된 유전자를 증폭시키기 위해 사용한다. 증폭은 성장에 중요한 단백질 생산이 더 많이 요구되는 유전자가 재조합 세포내에서 염색체의 연속 생성을 반복하는 과정이다. 포유동물 세포에 적당한 선택 표식의 예에는 디히드로엽산 환원효소(DHFR)와 티미딘 키나아제가 포함된다. 벡터에 존재하는 표식에 의해 형질전환체만이 생존하도록 변이시키는 선택적 압력하에 포유동물 세포 형질전환체를 둔다. 배지내 선택제의 농도가 연속적으로 변화되는 조건하에서 형질전환 세포를 배양함으로써 선택적 압력을 부가하여, 그로 인해 GDNFR 을 코드하는 DNA 와 선택 유전자 둘다를 증폭시킨다. 결과적으로, 증가량의 GDNFR 은 증폭 DNA 로 부터 합성된다.
예를들어, DHFR 의 경쟁적 길항물질인 메토트렉세이트를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포를 우선 확인한다. 야생형 DHFR 을 사용할 때 적당한숙주 세포는 DHFR 활성이 없는 차이니즈 햄스터 난소 세포주이다[예를들어, Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77(7) : 4216 - 4220, 1980 문헌을 참조하라]. 그런 다음 메토트렉세이트 양을 증가시켜 형질전환 세포를 노출시킨다. 이로써 다중 복제된 DHFR 유전자가 합성되고, 부수적으로 GDNFR 단백질을 코드하는 DNA 처럼 발현 벡터에 존재하는 그외의 다중 복제 DNA 가 합성된다.
프로모터
본 발명의 발현 벡터와 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 GDNFR 단백질을 코드하는 핵산 서열에 결합하는 프로모터를 함유한다. 프로모터는 구조 유전자의 개시 코돈 상류(5')에 위치하는 비번역 서열로서(일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내), 예를들어 GDNFR 을 코드하는 특정 핵산 서열의 전사와 번역을 조절한다. 프로모터는 통상적으로 유도 프로모터와 구성 프로모터의 두 군 중 하나로 구분된다. 유도 프로모터는 영양분의 존재나 부재 또는 온도 변화처럼 배양 조건의 일부 변화에 대한 조절하에서 DNA 전사량을 증가시키기 시작한다. 다양한 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 잘 알려져 있다. 이들 프로모터는, 제한 효소 절단으로 DNA 원에서 프로모터를 제거한 다음 원하는 프로모터 서열을 벡터내로 삽입함으로써 GDNFR 을 코드하는 DNA 에 결합된다. GDNFR DNA 증폭 및/또는 발현을 조절하기 위해서 천연 GDNFR 프로모터 서열을 사용할 수 있다. 그러나 천연 프로모터에 비해 발현 단백질의 순도가 높고 전사량이 더 많으며, 선택한 숙주 세포계와 양립된다면 이형 프로모터가 바람직하다.
원핵 숙주에 사용하기에 적당한 프로모터는 베타 - 락타마제와 락토스 프로모터계 ; 알칼린 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터계 ; 및 tac 프로모터와 같은 혼성 프로모터를 포함한다. 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 그들의 핵산 서열이 공개되어 있으므로, 본 분야의 숙련자들이 필요한 어떤 제한 부위를 제공하기 위해 필요한 만큼의 링커나 어댑터를 이용하여 원하는 DNA 서열에 상기 핵산 서열을 결합시킬 수 있다.
효모에 사용하기에 적당한 프로모터 서열도 본 분야에 널리 알려져 있다. 효모 인핸서는 효모 프로모터와 사용하는 것이 바람직하다. 포유동물 숙주 세포와 사용하기에 적당한 프로모터는 공지되어 있으며, 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 파울폭스 바이러스(fowlpox virus), 아데노바이러스(adenovirus, 예를들어 아데노바이러스 2), 소의 유두종 바이러스(bovine papilloma virus), 닭의 육종 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 레트로바이러스(retrovirus),B 형 간염 바이러스(hepatitis - B virus) 및 가장 바람직하게는 시미안 바이러스 40(Simian Virus 40) 같은 바이러스 게놈에서 수득한 프로모터가 포함된다. 그외에 적당한 포유동물 프로모터는 열 - 안정 프로모터와 액틴 프로모터 같은 이형 포유동물 프로모터를 포함한다. CHO 세포내 GDNFR 단백질 생산에 이용할 수 있는 프로모터는 SRa 이다[Takebe 등의 Mol. Cell. Biol., 8(1) : 466 - 472, 1988 참조]. 적당한 발현 벡터는 pDSRa2 이다. 적당한 GDNFR cDNA 를 함유하는 pDSRa2 플라스미드 구성물은 실질적으로 1990년 3월 29일자 출원된, 공동 소유 및 계류중인 미국 특허 출원 번호 제 501,904 호에 기술된 방법에 의해 제조할 수 있다[1990년 5월 18일자 출원된 유럽 특허 출원 번호 제 90305433 호, 공개 번호 EP 398 753, WO 90/14363 (1990) 도 참조, 이 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용함].
GDNFR 발현 조절에 중요한 부가적인 프로모터는 다음을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다 : SV40 시발 프로모터 영역(Bernoist 및 Chambon, Nature, 290 : 304 - 310, 1981) ; CMV 프로모터 ; 로우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)의 3' 말단 반복 배열에 내포된 프로모터(Yamamoto 등의 Cell, 22 : 787 - 797 ,1980) ; 허피즈 티미딘 키나아제 프로모터(Wagner 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78 : 144 - 1445, 1981) ; 메탈로티오닌 유전자 조절 서열(Brinster 등의 Nature,296 : 39 - 42, 1982) ; 베타 - 락타마제 프로모터와 같은 원핵 발현 벡터(Villa - Kamaroff 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75 : 3727 - 3731, 1978) ; 또는 tac 프로모터(DeBoer 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80 : 21 - 25, 1983). 그외에 중요한 것은 다음의 동물 전사 조절 부위로서 조직 특이성을 보이며 형질전환 동물에 사용되어 왔다 : 췌장의 선포 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 부위(Swift 등의 Cell, 38 : 639 - 646, 1984 ; Ornitz 등의 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 : 399 - 409, 1986 ; MacDonald, Hepatology, 7 : 425 - 515, 1987) ; 췌장의 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 부위(Hanahan, Nature, 315 : 115 - 122, 1985) ; 임파구양 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 부위(Grosschedl 등의 Cell, 38 : 647 - 658, 1984 ; Adames 등의 Nature, 318 : 533 - 538, 1985 ; Alexander 등의 Mol. Cell. Biol., 7 : 1436 - 1444, 1987) ; 고환, 유방, 임파구양 세포 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 부위(Leder 등의 Cell, 45 : 485 - 495, 1986) ; 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 부위(Pinkert 등의 Genes and Devel., 1 : 268 - 276, 1987) ; 간에서 활성인 알파 - 페토프로테인 유전자 조절 부위(Krumlauf 등의 Mol. Cell. Biol., 5 : 1639 - 1648, 1985 ; Hammer 등의 Science, 235 : 53 - 58, 1987) ; 간에서 활성인 알파 - 1 항트립신 유전자 조절 부위(Kelsey 등의 Genes and Devel., 1 : 161 - 171, 1987) ; 골수성 세포에서 활성인 베타- 글로빈 유전자 조절 부위(Mogram 등의 Nature, 315 : 338 - 340, 1985 ; Kollias 등의 Cell, 46 : 89 - 94, 1986) ; 뇌의 희돌기교세포에서 활성인 마이엘린 염기성 단백질 유전자 조절 부위(Readhead 등의 Cell, 48 : 703 - 712, 1987) ; 골격근에서 활성인 미오신 광사슬 - 2 유전자 조절 부위(Sani, Nature, 314 : 283 - 286, 1985) ; 및 시상하부에서 활성인 성선자극호르몬유리호르몬 유전자 조절 부위(Mason 등의 Science, 234 : 1372 - 1378, 1986).
인핸서 성분
인핸서 서열은, 본 발명의 GDNFR 단백질을 코드하는 DNA 서열이 고등 진핵세포에서 전사되는 것을 증가시키기 위해 벡터내로 삽입한다. 인핸서는 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는 DNA 의 시스 - 액팅 성분으로서, 보통 그 길이는 약 10 - 300 bp 이다. 인핸서는 비교적 일정 방향으로 향하며 위치에 대하여 구애받지 않는다. 그것은 전사 단위의 5' 과 3' 에서 발견되었다. 포유동물 유전자에서 입수가능한 몇몇 인핸서 서열이 공지되어 있다(예를들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파 - 페토프로테인 및 인슐린). 그러나 일반적으로는 바이러스의 인핸서를 사용할 것이다. SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 시발 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서는진핵 프로모터를 활성화하는 전형적인 인핸서 성분이다. 인핸서가 GDNFR DNA 의 위치 5' 또는 3' 에서 벡터내로 스플라이싱되기는 하나, 일반적으로는 프로모터의 5' 부위에 위치한다.
전사 종결
진핵 숙주 세포(효모, 진균류, 곤충, 식물, 동물, 인체 또는 그외의 다세포 유기체의 유핵 세포)에 사용하는 발현 벡터는 전사를 종결시키고 mRNA 를 안정시키는 데 필수적인 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 보통 진핵 DNA 나 cDNA 의 5' 및 경우에 따라서는 3' 비번역 부위에서 입수가능하다. 이 부위는 GDNFR 을 코드하는 mRNA 의 비번역 부위에서 폴리아데닐화 단편으로 전사되는 누클레오티드 단편을 포함한다.
원하는 GDNFR - 코딩 서열과 함께 상기 나열한 성분 중 하나 또는 그 이상을 함유하는 적당한 벡터의 구성은 표준 결합 기술에 의해 이루어진다. 분리된 플라스미드나 DNA 단편은, 원하는 플라스미드를 만들기 위해 절단하여 짜 맞추고 재결합시킨다. 서열이 정확히 구성되었는 지를 확인하기 위해, 결합 혼합물로 E. coli 를 형질전환시킨 다음 상기한 암피실린 내성이나 테트라사이클린 내성과 같은 공지 방법으로 제대로 된 형질전환체를 선택한다. 형질전환체로부터 플라스미드를 꺼낸 다음 제한 엔도누클레아제 절단으로 분석하고/하거나 원하는 구성물이 존재하는 지 확인하기 위해 서열을 결정한다.
포유동물 세포내에서 GDNFR 코딩 DNA 를 일시적으로 발현시키는 벡터도 이용할 수 있다. 일반적으로, 일시적인 발현은 숙주 세포에서 효율적으로 복제될 수 있는 발현 벡터의 사용과 관계가 있는데, 숙주 세포는 다수의 발현 벡터 복사물을 축적하면서 교대로 발현 벡터에 의해 코드되는 원하는 단백질을 고수준으로 합성한다. 적당한 발현 벡터와 숙주 세포를 포함한 일시적 발현계로 인해, 클로닝된 DNA 에 의해 코드되는 단백질이 편리하고도 확실하게 확인되며 바람직한 생물학적·생리학적 특성에 대하여 이 단백질을 신속하게 스크리닝할 수 있다. 따라서, 일시적 발현계는 단백질 변이체 확인에 특히 유용하다.
숙주 세포의 선택 및 형질전환
본 발명은 재조합 GDNFR 발현에 사용하는 핵산 서열로 형질전환시킨 숙주 세포(예를들어, 박테리아 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포 또는 식물 세포)를 제공한다. 형질전환 숙주 세포는 핵산 서열을 발현시킬 수 있는 적당한 조건하에서 배양된다. 적당한 숙주 세포의 선택과 형질전환 방법, 배양, 증폭, 스크리닝, 산물 생산, 정제방법은 본 분야에 널리 공지되어 있다. 예를들어, Gething 및 Sambrook, Nature, 293 : 620 - 625(1981) 또는 선택적으로 Kaufman 등의 Mol. Cell. Biol., 5(7) ; 1750 - 1759(1985) 또는 Howley 등의 미국 특허 번호 제 4,419,446 호를 참조하라. 부가적인 물질과 방법의 예를 본원에서 기술한다. 본 분야의 기술자들에게 공지된 적당한 방법에 의해, 형질전환된 숙주 세포를 적당한 배지에서 배양하고, 발현된 GDNFR 단백질을 선택적으로 배양 배지(또는 세포내에서 발현되었다면 세포)에서 회수하여 분리정제한다.
상이한 숙주 세포는 단백질의 번역 프로세싱, 번역후 프로세싱 및 변이(예를들어, 글리코실화, 절단)에 대하여 특징적이고도 특이한 메카니즘을 갖는다. 원하는 변이와 발현 외부 단백질의 프로세싱이 안전하게 이루어지도록 적당한 세포주나 숙주계를 선택한다. 예를들어, 박테리아계에서의 발현은 비글리코실화된 중심 단백질을 생산하는 데 사용할 수 있다. 효모 발현은 글리코실화된 산물 생산에 사용한다. 포유동물 세포 발현은 이형 GDNFR 단백질의 '천연' 글리코실화가 안전하게 이루어지도록 하기 위해 사용할 수 있다. 게다가, 상이한 벡터/숙주 발현계는 단백질 가수분해 절단과 같은 프로세싱 반응에도 상이한 영향을 미친다.
본원에 기술된 클로닝 벡터나 발현 벡터에 적합한 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 세포 또는 고등 진핵 세포이다. 사상 진균류나 효모와 같은 진핵 미생물은 GDNFR 단백질 발현에 적당한 숙주일 수 있다. 하등 진핵 숙주 미생물 중 사카로마이시스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반적인 베이커 효모가 가장 일반적으로 이용되지만 그외에 다수의 속, 종, 균주를 사용할 수 있을 것으로 공지되어 있다.
글리코실화된 GDNFR 단백질 발현에 사용하는 숙주 세포는 다세포 유기체에서도 유래된다. 이러한 숙주 세포는 프로세싱 및 글리코실화 활성 복합체일 수 있다. 원칙적으로, 배양균이 식물 세포와 곤충 세포를 포함한 척추동물 세포나 무척추동물 세포를 포함하든 안하든 간에 모든 고등 진핵 세포 배양균을 사용할 수 있다. 배양균(조직 배양균) 내 척추동물 세포의 증식은 공지된 과정이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 SV40 에 의해 형질전환시킨 원숭이 신장 CV1 주(COS 7), 인체 배 신장주(현탁 배양액 내에서의 성장을 위해 서브클로닝한 293 또는 293 세포), 베이비 햄스터 신장 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 세포가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 그외에 적당한 포유동물 세포주는 HeLa, 마우스 L - 929 세포, 스위스(Swiss)에서 유도한3T3 주, Balb - c 또는 NIH 마우스, BHK 또는 HaK 햄스터 세포주를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
적당한 숙주 세포에서 원핵 세포도 포함된다. 원핵 숙주 세포는 그람 - 음성 유기체나 그람 - 양성 유기체, 예를들어 E.coli, 비. 섭티리스(B. subtilis) 같은 바실리(Bacilli), 녹농균(P. aeruginosa)과 같은 슈도모나스 종, 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescans)와 같은 박테리아 세포를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 예를들어, 여러가지 E. coli 종(예를들어, HB101, DH5a, DH10 및 MC1061)은 생명공학 분야에서 숙주 세포로 잘 알려져 있다. GDNFR 단백질 생산용으로 현재 바람직한 숙주 세포는 박테리아 세포(예를들어, E. coli)와 포유동물 세포(차이니즈 햄스터 난소 세포, COS 세포 등)이다.
상기 발현 벡터나 클로닝 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키고 바람직하게 형질전환시킨 다음 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하고 원하는 서열을 코드하는 유전자를 증폭시키기에 적당하도록 배지를 변화시킬 수 있다. 형질감염이나 형질전환은 본 분야의 숙련자들에게 공지되고 관련 숙주 세포에 적당하도록 선택한 표준 기술을 이용하여 실시한다. 예를들어 세포벽이없는 포유동물 세포의 경우, 인산칼슘 침전법을 사용한다. 일렉트로포레이션, 현미주사 및 그외의 공지 기술도 사용할 수 있다.
숙주 세포 배양
본 발명의 GDNFR 단백질 생산에 사용하는 형질전환 세포는 적당한 배지에서 배양한다. 호르몬 및/또는 그외의 성장 인자(예, 인슐린, 트란스페린 또는 상피 성장 인자), 염(예, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액(예, HEPES), 누클레오시드(예, 아데노신 및 티미딘), 항생물질(예, 젠타마이신), 미량원소(최종 농도가 보통 마이크로몰 범위로 존재하는 무기 화합물로 규정됨) 및 포도당이나 그외의 에너지원으로 필요한 만큼 배지를 보충한다. 그외의 보충물은 본 분야의 숙련자들이 인지하는 바와 같이 적당한 농도로 포함될 수 있다. 선택한 숙주 세포에 사용하기 위한, 온도, pH 등과 같은 적당한 배양 조건은 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.
일단 GDNFR 단백질이 생산되면, 크로마토그래피(예를들어, 이온 교환, 친화 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도를 포함한 표준 방법 또는 그외의 모든 단백질 정제 표준 기술에 의해 분리정제한다. 특히, GDNFR 단백질은 GDNF 또는 고정 지지체에 결합시킨 항- GDNFR 을 함유하는 친화 컬럼에 결합시킴으로써 분리한다.
상동 재조합
GDNFR 단백질은 상동 재조합에 의해 제조하거나 재조합 생산 방법으로 제조하는데, 이 방법은 GDNFR 을 코드하는 DNA 를 이미 함유하는 세포내로 삽입시킨 조절 성분을 이용한다. 예를들어, 상동 재조합 방법은 정상적으로 전사되는 사일런트 GDNFR 유전자 또는 정상이하로 발현되는 유전자를 함유하는 세포를 변이시킴으로써 GDNFR 을 발현하는 세포를 생산하는 데 사용한다. 상동 재조합은 처음에는 전사적으로 활성인 유전자에서 돌연변이를 유발하거나 교정하기 위해 표적 유전자에 대해 개발된 기술이다(Kucherlapati, Prog. in Nacl. Acid Res. and Mol. Biol., 36 : 301, 1989 참조). 기본 기술은 포유동물 게놈의 특정 부위에 특이 돌연변이를 도입하거나(Thomas 등의 Cell, 44 : 419 - 428, 1986 ; Thomas 및 Capecchi, Cell, 51 : 503 - 512, 1987 ; Doetschman 등의 Proc. Natl. Acad. Sci., 85 : 8583 - 8587, 1988 참조) 결함이 있는 유전자내에서 특이 돌연변이를 교정하기 위한(Doetschman 등의 Nature, 330 : 576 - 578, 1987 참조) 방법으로 개발되었다. 전형적인 상동 재조합 기술은 본원에서 참고문헌으로 인용한 U.S. 5,272,071 호(EP 91 90 3051, EP 공개 번호 제 505 500 호 ; PCT/US90/07642, 국제 공개 번호 제 WO91/09955 호)에 기술되어 있다.
상동 재조합을 통해, 게놈 내로 삽입되는 DNA 서열은 표적 DNA 에 부착됨으로써 중요한 유전자의 특이 부위에 의해 조절될 수 있다. 표적 DNA 는 게놈 DNA 부위에 상보적인(상동인) DNA 이다. 게놈의 특이 부위에 상보적인 표적 DNA 소단편은 DNA 복제 과정중에 모가닥과 접촉되도록 한다. 혼성되는 것이 세포내로 삽입되는 DNA 의 일반적인 성질이므로, 공유 상동 부위를 통해 내생 DNA 의 다른 단편과 재조합된다. 이 상보 가닥이 상이한 DNA 서열이나 돌연변이를 함유하는 올리고누클레오티드에 결합한다면, 그것 역시 재조합 결과 새로 합성된 가닥내로 삽입된다. 교정 기능 결과로서, 새로운 DNA 서열이 주형으로 작용할 수 있다. 따라서, 전이 DNA 가 게놈내로 삽입된다.
본원에 나타나 있는 GDNFR 의 핵산 서열, 프리 - 프로 서열 또는 발현 조절 서열과 같은 특정 유전자 서열이 알려져 있다면, 중요 부위에 결합하는 특이 인식 부위에서 천연 DNA 를 적절히 제한함으로써 유전자의 선택 부위에 상보적인 DNA 단편을 합성하거나 수득할 수 있다. 이 단편은 세포내로 삽입될 때 표적 서열로 작용하며 게놈 내부의 상동 부위에 혼성될 것이다. DNA 복제 도중에 이러한 혼성화가 일어난다면, 이 DNA 단편과 거기에 부착되는 부가적인 서열은 오카자키단편(Okazaki fragment)으로 작용할 것이며 새로 합성된 DNA 딸가닥 내로 백스티치될 것이다.
표적 DNA 의 이 단편에 부착되는 것은 GDNFR 단백질 발현에 관련된 DNA 부위이다. 예를들어, 프로모터/인핸서 성분, 억제자 또는 외생 전사 조절 성분이 원하는 GDNFR 단백질을 코드하는 DNA 전사에 영향을 미치기에 충분한 방향과 거리로 숙주 세포 게놈내로 삽입된다. 조절 성분은 GDNFR 을 코드하지는 못하지만, 숙주 세포 게놈에 존재하는 DNA 부분을 조절한다. 따라서, GDNFR 단백질 발현은 GDNFR 유전자 자체를 코드하는 DNA 의 형질감염에 의해서가 아니라, 오히려 내생 유전자 서열에게 GDNFR 단백질의 인식가능한 전사 시그널을 제공하는 DNA 조절 단편과 짝이 되는 표적 DNA(중요한 내생 유전자와 상동인 부위를 함유함)를 사용함으로써 이루어질 수 있다.
A.GDNFR 변이체
상기한 바와 같이, 본원에 사용한 용어 'GDNFR 유사체' 는 도 2 및 4 에 도시한 서열(서열 2 및 4)을 포함하는 자연발생적인 GDNFR 폴리펩티드의 아미노산 서열내의 잔기로 부터 아미노산이 결실된 폴리펩티드('결실 변이체'), 아미노산이 그 잔기내에 삽입된 폴리펩티드('부가 변이체') 또는 아미노산이 그 잔기 대신 치환된 폴리펩티드('치환 변이체')를 포함한다. 그와 같은 변이체는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 내로 적합한 누클레오티드 변화를 도입시킴으로써, 또는 원하는 폴리펩티드를 시험관내 화학합성함으로써 제조한다. 최종 분자가 GDNFR 활성을 지닌다면, 성숙한 인체 GDNFR 과 같은 아미노산 서열에 대한 많은 결실, 삽입 및 치환의 조합이 이루어질 수 있다는 것을 본 분야의 숙련된 기술자들은 이해할 것이다.
GDNFR 아미노산 서열에 관한 본 설명을 기초로 하면, 하나 또는 그 이상의 잔기의 동일성이나 존재위치면에서 도면에 나타낸 입체 형태와 구별되는 일차 입체 형태를 갖는 폴리펩티드의 재조합(예를들어, 미생물) 발현에 사용하기에 적합한 다양한 핵산 서열을 용이하게 고안하고 제조할 수 있다. 도 2 및 4 에 도시한 핵산 서열에 의해 코딩되는 하나 또는 그 이상의 선택 아미노산 잔기를 치환, 삽입 또는 결실시키기 위한 돌연변이유발 기술은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있다(예를들어, 미국 특허 번호 제 4,518,584 호 참조, 이 명세서는 본원에 참고문헌으로 인용됨). 치환 변이체 구성에는 2 가지 주요 변수가 존재한다 : 돌연변이 부위의 존재위치와 돌연변이의 성질. GDNFR 치환 변이체를 고안함에 있어, 돌연변이 부위 및 돌연변이의 성질의 선택은 변형될 GDNFR 특성(들)에 좌우될 것이다. 돌연변이를 위한 부위는, 예를들어 (1) 먼저 보존적 아미노산 변형으로 치환한 다음 획득된 결과에 따라 더 많은 라디칼 선택으로 치환함으로써, (2) 표적 아미노산 잔기를 결실시킴으로써, 또는 (3) 위치가 정해진 부위 부근에 아미노산 잔기를 삽입함으로써 개별적으로나 연속하여 변형시킬 수 있다. 1 내지 30 의 근접 아미노산의 보존적 변화가 바람직하다. N - 말단 및 C - 말단 결실 GDNFR 단백질 변이체는 또한 단백질 분해 효소에 의해 생성될 수 있다.
GDNFR 결실 변이체의 경우, 결실은 일반적으로 약 1 내지 30 근접 잔기, 더 일반적으로는 약 1 내지 10 근접 잔기의 범위이고 전형적으로 약 1 내지 5 근접 잔기이다. N - 말단, C - 말단 및 내부 서열내 결실이 예상된다. GDNFR 의 활성도를 변형시키기 위해 비 - 인체 GDNFR 과 낮은 상동성을 갖는 분자 부위내로 결실을 도입시킬 수 있다. 비 - 인체 GDNFR 서열과 실질적인 상동성을 갖는 부위내 결실이 GDNFR 생물학적 활성도를 더 상당히 변형시킬 것이다. 전형적으로, 영향 받은 도메인, 예를들어 시스테인 교차결합내 GDNFR 단백질 산물의 3 차 구조가 보존되도록 보존적 결실의 수는 선택될 것이다. 결실 변이체의 비제한적 예로는 N - 말단 또는 C - 말단 아미노산 잔기가 결여되어 있는 절단된 GDNFR 단백질 산물을 포함한다. 예를들어, 세포질막에 대한 GDNFR 수용체의 글리코실 - 포스파티딜이노시톨(GPI) 고정과관련된 펩티드 부위를 제거함으로써 가용성 수용체를 제조할 수 있다.
GDNFR 부가 변이체의 경우, 전형적으로 아미노산 서열부가는 N - 및/또는 C - 말단 융합이나, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 내부 또는 중간 부가 뿐만 아니라 하나의 잔기에서 백 또는 그 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이 범위의 말단 부가를 포함한다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 초기 메티오닌 아미노산 잔기(원하는 폴리펩티드의 첫 번째 아미노산 잔기에 대한 위치 -1 에서)를 포함할 수 있다. 내부 부가는 일반적으로 약 1 내지 10 근접 잔기, 보다 전형적으로는 약 1 내지 5 잔기의 범위이고, 보통은 약 1 내지 3 아미노산 잔기의 범위일 것이다. N - 말단 부가 변이체의 예는, 재조합 숙주세포로 부터 성숙한 GDNFR 의 분비를 촉진시켜 수확이나 생체내이용율이 촉진되도록 GDNFR 의 N - 말단에 이종 N - 말단 시그널 서열을 포함시킨 GDNFR 을 포함한다. 그러한 시그널 서열은 일반적으로 의도된 숙주세포종으로 부터 수득될 것이므로 그 종과 동종일 것이다. 또한 부가는 그외의 신경영양성 인자의 서열로 부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를들어, 결합서열과 함께 또는 결합서열 없이 GDNF 와 GDNFR 의 융합단백질을 생산함으로써 단일 분자의 치료학적 실재를 형성하고자 한다.
GDNFR 치환 변이체는 GDNFR 아미노산 서열 중 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그 위치에 다른 잔기(들)가 삽입된 것이다. 그와 같은 치환 변이체는 대립형질 변이체를 포함하는데, 이 대립형질 변이체는 아미노산 변화를 초래할 수 있거나 초래할 수 없는 종 집단에서의 자연발생적인 누클레오티드 서열 변화를 특징으로 한다. 다른 변이체 형태에서와 같이, 치환 변이체는 하나 또는 그 이상의 다른 위치에서 단일 또는 근접 아미노산 잔기의 치환을 포함할 수 있다.
GDNFR 아미노산 서열의 특이 돌연변이는 글리코실화 부위(예를들어, 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴)에 대한 변형을 포함할 수 있다. 임의의 아스파라긴 - 결합 글리코실화 인식 부위에서나 O - 결합 탄수화물 부가에 의해 변형된 분자의 임의의 부위에서 아미노산 치환 또는 결실로 인해 글리코실화의 부재 또는 단지 부분 글리코실화가 초래된다. 아스파라긴 - 결합 글리코실화 인식 부위는 고유의 세포 글리코실화 효소에 의해 특이하게 인식되는 트리펩티드 서열을 포함한다. 이들 트리펩티드 서열은 Asn - Xaa - Thr 이나 아니면 Asn - Xaa - Ser 이되, 여기서 Xaa 는 Pro 이외의 어떠한 아미노산일 수 있다. 글리코실화 인식 부위의 첫 번째 또는 세 번째 아미노산 위치 중 하나 또는 둘 다에서 다양하게 아미노산 치환 또는 결실(및/또는 두 번째 위치에서의 아미노산 결실)됨으로써 변형된 트리펩티드 서열에서 비 - 글리코실화가 초래된다. 따라서, 고유하게 변형된 누클레오티드 서열이 발현하면 그 위치에서 글리코실화되지 않는 변이체가 생산된다. 택일적으로, 글리코실화 부위가 부가되도록 GDNFR 아미노산 서열을 변형시킬 수 있다.
GDNFR 아미노산 잔기나 돌연변이유발을 위한 부위를 확인하는 한 방법은 Cunningham and Wells(Science, 244 : 1081 - 1085, 1989 참조)가 기술한 바와 같이 '알라닌 스캐닝 돌연변이유발' 이라 부른다. 이 방법에 있어, 아미노산 잔기나 표적 잔기의 기를 확인하여(예를들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu 같은 하전 잔기) 세포내 또는 세포 외부의 주변 수성 환경과 아미노산과의 상호작용에 영향을 미치도록 중성 또는 음전화된 아미노산(알라닌 또는 폴리알라닌이 가장 바람직함)으로 대체한다. 그런 다음 치환 부위에 부가 또는 선택 잔기를 도입함으로써 치환에 대한 기능상 감수성을 나타내는 이들 도메인을 정련시킬 수 있다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 표적 부위를 결정하여 상응 표적 코돈이나 그 DNA 서열의 부위에 대해 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 GDNFR 변이체를 원하는 활성 및 활성도의 최적 조합에 대해 선별한다.
치환 돌연변이유발에 가장 흥미있는 부위는, 여러 종의 GDNFR 단백질에서 발견되는 아미노산이 곁사슬 부피, 전하 및/또는 소수성 면에서 실질적으로 다른 부위를 포함한다. 그외의 흥미있는 부위는 여러종으로 부터 수득한, GDNFR - 유사 단백질의 특정 잔기가 동일한 부위이다. 그와 같은 위치는 일반적으로 단백질의 생물학적 활성도에 중요하다. 처음에 이 부위는 비교적 보존적인 방식으로 치환한다. 표 2 의 표제 바람직한 치환 아래에 그와 같은 보존 치환이 나타나 있다. 그와 같은 치환 결과 생물학적 활성도가 변한다면, 더 실질적인 변화(전형적인 치환)를 도입하고/도입하거나 그 외의 부가 또는 결실을 만들어, 결과적으로 생성된 산물을 활성도에 대해 선별한다.
아미노산 서열에 대한 보존적 변형(및 암호화 핵산 서열에 대한 상응 변형)으로 인해 자연발생적인 GDNFR 과 기능적 및 화학적 특성이 유사한 GDNFR 단백질 산물이 생산된다고 예상된다. 대조적으로, GDNFR 단백질 산물의 기능적 및/또는 화학적 특성의 실질적인 변형은 다음을 유지하는 효과 면에서 상당히 다른 치환을 선택함으로써 수행할 수 있다 : (a) 치환 부위의 폴리펩티드 골격 구조, 예를들어, 병풍 또는 나선 입체형태, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 곁사슬 부피. 자연발생적인 잔기는 공동 곁사슬 특성에 기초하여 다음 군으로 나누어질 수 있다 :
1) 소수성 : 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile ;
2) 중성 친수성 : Cys, Ser, Thr ;
3) 산성 : Asp, Glu ;
4) 염기성 : Asn, Gln, His, Lys, Arg ;
5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기 : Gly, Pro ; 및
6) 방향족성 : Trp, Tyr, Phe.
비 - 보존적 치환은 이들 군 중 한 군의 일부를 다른 군의 일부와 교환하는 것을 포함한다. 그와 같은 치환 잔기는 비 - 인체 GDNFR 단백질과 상동인 인체 GDNFR 단백질의 부위내에, 또는 그 분자의 비 - 상동 부위내에 도입시킬 수도 있다.
따라서, GDNFR 단백질, 유사체 또는 그 유도체는 일차 아미노산 서열로서, 도 2 및 4 에 도시한 아미노산 서열(서열 2 및 4)의 전부 또는 일부를 함유하는 생물학적 활성 분자를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 이 단백질은 그 서열내 잔기를 생물학적으로 등가인 아미노산 잔기로 치환하여 그 결과 사일런트 변이를 초래하는 변형된 서열을 포함할 것이다. 예를들어, 서열내 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 사일런트 변이를 초래하는, 기능상 동등하게 작용하는 유사 극성을 갖는 다른 아미노산으로 치환할 수 있다. 서열내 아미노산에 대한 치환체는 아미노산이 속하는 군의 다른 일부 중에서 선택할 수 있다. 예를들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 로이신, 이소로이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루타민산을 포함한다. GDNFR 단백질, 유사체, 또는 그것의 단편이나 유도체는 예를들어, 인산화, 글리코실화, 교차결합, 아실화, 단백질 가수분해, 항체 분자, 막 분자 또는 다른 리간드와의 결합에 의해 번역 중이나 번역후 차별적으로 변형될 수 있다.
B.GDNFR 유도체
GDNFR 또는 GDNFR 유사체를 화학적으로 변형시킨 유도체는 본 상세한 설명을 기초로 하여 본 분야의 숙련된 기술자들이 제조할 수 있다. 유도체에 가장 적합한 화학성분은 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체가 단백질에 부착하면 수성 환경, 이를테면 생리학적 환경에서 침전되지 않기 때문에 이 수용성 중합체가 바람직하다. 바람직하게, 이 중합체는 치료학적 산물 또는 조성물 제조를 위해 제약학적으로 용인가능할 것이다. 본 분야의 숙련된 기술자들은 중합체/단백질 결합체가 치료학적으로 사용될 것인지의 여부, 만일 그렇다면 원하는 투여량, 순환 시간, 단백질 가수분해에 대한 저항과 같은 고려할 사항, 및 그외의 고려할 사항을 기초로 하여 원하는 중합체를 선택할 수 있을 것이다. 유도체화의 유효성은 유도체를 원하는 형태로(예를들어, 삼투펌프에 의해, 더 바람직하게 주사나 주입에 의해, 또는 경구, 폐 또는 그외의 수송 경로용으로 더 제형화시킨 형태로) 투여하여 그것의 유효성을 측정함으로써 확인할 수 있다.
적합한 수용성 중합체로는 다음이 포함되나, 이것으로 국한되지 않는다 : 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리 -1, 3 - 디옥솔란, 폴리 - 1, 3, 6 - 트리옥산, 에틸렌/무수 말레산 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체나 아니면 무작위 공중합체) 및 덱스트란 또는 폴리(n - 비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올류(예를들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그것의 혼합물. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온 알데히드가 물에 안정하므로 제조시 잇점을 가질 수 있다.
중합체는 어떠한 분자량도 가질 수 있으며, 분지되거나 비분지될 수도 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우, 취급하고 제조하기에 용이하도록 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 의 분자량이 바람직하다(용어 '약' 은 폴리에틸렌 글리콜 제조시, 어떤 분자량은 상태 분자량보다 더 많을 것이고, 어떤 분자량은 상태 분자량보다 더 적을 것이라는 것을 의미함). 원하는 치료학적 프로필(예를들어, 원하는 지속적인 유리 기간 ; 가령 존재한다면, 생물학적 활성도에 대한 효과 ; 취급시 용이함 ; 항원성의 정도나 결여 및 치료학적 단백질이나 변이체에 대한 그외 공지된 폴리에틸렌 글리콜의 효과)에 좌우하여 다른 크기를 이용할 수도 있다.
상기와 같이 부착되는 중합체 분자의 수는 다양할 것이며, 본 분야의 숙련된 기술자들은 기능상 효과를 확인할 수 있을 것이다. 모노 - 유도체화 할 수 있거나, 또는 동일하거나 다른 화학성분(예를들어, 중합체, 이를테면 다른 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜)과 함께 디-, 트리-, 테트라 또는 어떤 유도체 조합을 제공할 수 있다. 반응 혼합물에서의 농도가 다양할 것이므로, 단백질(또는 펩티드) 분자에 대한 중합체 분자의 비율은 다양할 것이다. 일반적으로, 최적 비율(비반응된 단백질이나 과량의 중합체가 존재하지 않는다는 반응의 효능 면에서)은 원하는 유도체화의 정도(예를들어, 모노, 디-, 트리- 등), 중합체가 분지된 것이든지 비분지된 것이든지 간에 선택된 중합체의 분자량, 및 반응조건과 같은 인자들에 의해 결정될 것이다.
폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 그외 화학성분)는 단백질의 기능상 효과 또는 항원 도메인을 고려하여 단백질에 부착시켜야 한다. 본 분야의 숙련된 기술자들에게 유용한 많은 부착방법이 있다. 예를들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 제 EP 0 401 384 호(G - CSF 에 대한 PEG 결합) 참조, 또한 Malik 등의 Exp. Hematol., 20 : 1028 - 1035, 1992(트레실 클로라이드를 사용한 GM - CSF 의 폴리에틸렌 글리콜화) 참조. 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜은 반응기, 이를테면 유리 아미노기나 유리 카르복실기에 의해 아미노산 잔기에 공유결합될 수 있다. 반응기란 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합할 수 있는 기이다. 유리 아미노기를 갖는 아미노산 잔기로는 리신 잔기 및 N - 말단 아미노산 잔기가 포함된다. 유리 카르복실기를 갖는 아미노산 잔기로는 아스파르트산 잔기, 글루타민산 잔기 및 C - 말단 아미노산 잔기가 포함된다. 또한 폴리에틸렌 글리콜 분자(들)을 부착시키기 위한 반응기로서 설프히드릴기가 사용될 수 있다. 치료학적 목적을 위해서는 아미노기에서의 부착, 이를테면 N - 말단이나 리신기에서의 부착이 바람직하다. 만일 수용체 결합이 요구된다면, 수용체 결합에 중요한 잔기에서의 부착은 피해야 한다.
N - 말단을 화학적으로 변형시킨 단백질이 특히 바람직하다. 본원 조성물의 실례로서 폴리에틸렌 글리콜을 사용할 때, 당업자들은 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자[분자량, 분지(branching) 등에 의함], 반응 혼합물내 단백질(또는 펩티드) 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율, 수행할 폴리에틸렌 글리콜화 반응의 유형 및 선택된 N - 말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질을 수득하는 방법 중에서 선택할 수 있다. N - 말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 제제를 수득하는 방법(즉, 필요하다면 다른 모노폴리에틸렌 글리콜화된 성분으로 부터 이 성분을 분리)은 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질 분자 집단으로 부터 N - 말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 물질을 정제하는 것이다. 특정 단백질의 유도체화에 유용한 다른 유형의 일차 아미노기(리신 대 N - 말단)의 다른 반응성을 이용하는 환원성 알킬화에 의해 선택적인 N - 말단 화학변형을 수행할 수있다. 적당한 반응조건 하에서, 카르복실기 함유 중합체와 함께 N - 말단에서 단백질의 실질적으로 선택적인 유도체화가 획득된다. 예를들어, 리신 잔기의 e - 아미노기와 단백질의 N - 말단 잔기의 a - 아미노기 간의 pKa 차이의 잇점을 얻을 수 있는 pH 에서 반응을 수행함으로써 단백질을 선택적으로 N - 말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화시킬 수 있다. 그와 같은 선택적 유도체화에 의해, 단백질에 대한 수용성 중합체의 부착은 조절된다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N - 말단에서 우선적으로 일어나되 다른 반응기, 이를테면 리신 곁사슬 아미노의 유의 변형은 발생되지 않는다. 환원성 알킬화를 이용할 때, 수용성 중합체는 상기한 유형일 수 있으며, 단백질에 결합하기 위한 단일 반응성 알데히드를 가져야 한다. 단일 반응성 알데히드를 포함하는, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드를 사용할 수도 있다.
본 발명은 아실 또는 알킬 결합에 의해 하나 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 부착된 GDNFR 또는 그 변이체의 용도 뿐만 아니라 최소한 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 결합된 원핵 - 발현 GDNFR 또는 그 변이체의 용도에 관한 것이다.
폴리에틸렌 글리콜화는 본 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 폴리에틸렌 글리콜화 반응에 의해서도 수행될 수 있다. Focus onGrowth Factors, 3(2) : 4 -10, 1992 ; 명세서를 본원에서 참고로 인용한 제 EP 0 154 316 호 ; 제 EP 0 401 384 호 및 폴리에틸렌 글리콜화와 관련된 그외 공개문헌들 참조. 폴리에틸렌 글리콜화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 상동성인 반응성 수용성 중합체)를 수반한 아실화 반응이나 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다.
일반적으로 아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 GDNFR 단백질이나 변이체를 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 활성 에스테르 유도체와 반응시키는 것을 포함한다. GDNFR 단백질이나 변이체의 폴리에틸렌 글리콜화를 수행하기 위해 어떤 공지된 또는 그 이후에 발견된 반응성 PEG 분자를 사용할 수도 있다. 선호되는 활성화 PEG 에스테르는 N - 히드록시숙시니미드(NHS)에 대해 에스테르화된 PEG 이다. 본원에 사용한 바와 같이, '아실화' 란 치료학적 단백질과 PEG 같은 수용성 중합체 간에 다음과 같은 유형의 결합을 제한없이 포함하는 것이다 : 아미드, 카르밤산염, 우레탄 등. Bioconjugate Chem., 5 : 133 - 140, 1994 참조. 반응조건은 폴리에틸렌 글리콜화 기술 분야에 공지되어 있는 어떠한 조건 또는 그 이후에 발견된 조건들 중에서 선택할 수 있으나, 변형되어질 GDNFR 이나 변이체를 불활성화시키는 온도, 용매 및 pH 와 같은 조건은 피해야 한다.
아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 대개 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNFR 단백질이나 변이체를 생성한다. 바람직하게, 연결 결합은 아미드일 것이다. 또한 바람직하게, 결과적으로 생성된 산물은 실질적으로 오직(예를들어, > 95 %) 모노, 디-, 또는 트리- 폴리에틸렌 글리콜화될 것이다. 그러나, 사용하는 특별한 반응 조건에 좌우되는 양으로, 더 높은 정도의 폴리에틸렌 글리콜화된 어떤 종들이 형성될 수도 있다. 원한다면, 특히 투석, 염석, 한외여과, 이온 - 교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피 및 전기 영동을 포함하는 표준 정제 기술에 의해, 혼합물, 특히 비반응 종으로 부터 더 정제된 폴리에틸렌 글리콜화된 종을 분리할 수 있다.
일반적으로 알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 환원제의 존재하에서 GDNFR 단백질이나 변이체를 PEG 의 말단 알데히드 유도체와 반응시키는 것을 포함한다. 알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화 역시 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNFR 단백질이나 변이체를 생성한다. 또한, GDNFR 단백질이나 변이체(즉, 모노 - 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질)의 N - 말단의 a - 아미노기에서만 실질적으로 폴리에틸렌 글리콜화가 유리하도록 반응조건을 조작할 수 있다. 모노폴리에틸렌 글리콜화나 폴리폴리에틸렌 글리콜화 중 어느 경우에나, -CH2-NH- 기를 통해 PEG 기가 단백질에 부착되는 것이 바람직하다. 특히 -CH2- 기와 관련하여, 이 유형의결합을 본원에서는 '알킬' 결합이라고 언급한다.
모노폴리에틸렌 글리콜화된 산물을 생산하는 환원성 알킬화에 의한 유도체화는 유도체화에 유용한 다른 유형의 일차 아미노기(리신 대 N - 말단)의 차별적인 반응성을 이용한다. 이 반응은 리신 잔기의 e - 아미노기와 단백질의 N - 말단 잔기의 a - 아미노기 간의 pKa 차이의 잇점을 얻을 수 있는 pH 에서 수행한다. 그와 같은 선택적 유도체화에 의해, 단백질에 대한, 알데히드 같은 반응기를 포함하는 수용성 중합체의 부착은 조절된다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N - 말단에서 우선적으로 일어나되, 그외 반응기, 이를테면 리신 곁사슬 아미노기의 유의 변형은 발생되지 않는다. 중요한 한 양상에 있어, 본 발명은 모노중합체/GDNFR 단백질(또는 변이체) 결합체 분자[실질적으로 오직(즉, > 95 %) 단일 위치에서 중합체 분자가 GDNFR 단백질 또는 변이체에 부착되었음을 의미함]의 실질적으로 균질한 제제의 용도를 예상한다. 특히, 폴리에틸렌 글리콜을 사용할 경우, 본 발명은 또한 가능한 항원 결합기가 결여되어 있고, GDNFR 단백질이나 변이체에 직접 결합된 폴리에틸렌 글리콜 분자를 갖는 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNFR 단백질이나 변이체의 용도를 포함한다.
따라서, 본 발명에 따른 GDNFR 단백질 산물은 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNFR 단백질이나 변이체를 포함하는데, 여기서 PEG 기(들)은 아실 또는 알킬기를 통해 부착된다. 상기한 바와 같이, 그와 같은 산물은 모노 - 폴리에틸렌 글리콜화되거나 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화(예를들어, 2 - 6 개, 바람직하게 2 - 5 개의 PEG 기 함유)될 수 있다. PEG 기는 대개 아미노산의 a 또는 e 아미노기에서 단백질에 부착하지만, 또한 PEG 기는 단백질에 부착된 어떠한 아미노기와도 부착할 수 있는데, 이 아미노기는 적합한 반응 조건하에서 PEG 기에 부착될 수 있도록 충분히 반응성이다.
아실화 및 알킬화 접근법 둘 다에 사용되는 중합체 분자는 상기한 바와 같은 수용성 중합체 중에서 선택할 수 있다. 선택한 중합체는 단일 반응기, 이를테면 아실화를 위한 활성 에스테르나 알킬화를 위한 알데히드를 갖도록 변형되어야 하는데, 중합체화 정도는 본 발명에 제공된 바와 같이 조절될 수 있다. 전형적인 반응성 PEG 알데히드는 수용성인 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드 또는 그것의 모노 C1 - C10 알콕시 또는 아릴록시 유도체이다(미국 특허 번호 제 5,252,714 호 참조). 중합체는 분지되거나 비분지될 수 있다. 아실화 반응에 있어, 선택한 중합체(들)은 단을 반응 에스테르기를 가져야 한다. 본 환원성 알킬화에 있어, 선택한 중합체(들)은 단일 반응 알데히드기를 가져야한다. 일반적으로, 수용성 중합체는 자연발생적인 글리코실 잔기 중에서는 선택하지 않을 것인데, 왜냐하면 이 글리코실 잔기는 보통 포유동물 재조합 발현계에 의해 더 편리하도록 제조되기 때문이다. 중합체는 어떠한 분자량일 수 있으며, 분지되거나 비분지될 수 있다.
본원에 사용하기 위한 전형적인 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 본원에 사용한 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 다른 단백질, 이를테면 모노 - (C1 - C10) 알콜시 - 또는 알릴록시 - 폴리에틸렌 글리콜을 유도체화하는데 사용되어진 어떠한 형태의 PEG 도 포함하고자 한다.
일반적으로, 화학 유도체화는 생물학적 활성 물질을 활성 중합체 분자와 반응시키는 데 사용되는 어떤 적합한 조건하에서도 수행될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNFR 단백질 산물을 제조하는 방법은 대개 다음 단계를 포함할 것이다 : (a) 단백질이 하나 또는 그 이상의 PEG 기에 부착되는 조건하에서 GDNFR 단백질 산물과 폴리에틸렌 글리콜(이를테면 반응 에스테르 또는 PEG 의 알데히드 유도체)을 반응시키는 단계, 및 (b) 반응산물(들)을 수득하는 단계. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적 반응 조건은 공지되어 있는 변수 및 원하는 결과를 기초로 하여 사항에 따라 결정될 것이다. 예를들어, PEG : 단백질의 비가 더 클수록 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 산물의 백분율은 더 크다.
모노 - 중합체/GDNFR 단백질 산물의 실질적으로 균질한 집단을 생산하기 위한 환원성 알킬화는 일반적으로 다음 단계를 포함할 것이다 : (a) 상기 GDNFR 단백질이나 변이체의 아미노 말단에서 a - 아미노기의 선택적 변형을 허용하기에 적합한 pH 에서 환원성 알킬화 조건하의 반응성 PEG 분자를 GDNFR 단백질이나 변이체와 반응시키는 단계 ; 및 (b) 반응 산물(들)을 수득하는 단계.
모노 - 중합체/GDNFR 단백질 산물의 실질적으로 균질한 집단에 있어, 환원성 알킬화 반응 조건이란 GDNFR 단백질이나 변이체의 N - 말단에 수용성 중합체 성분을 선택적으로 부착시킬 수 있는 조건을 말한다. 일반적으로 그와 같은 반응 조건은 리신 아미노기와 N - 말단에의 a - 아미노기 간의 pKa 차이를 제공한다(pKa 란 아미노기 중 50 % 는 양자수여되어 있고 50 % 는 그러하지 않은 pH 를 의미함). pH 는 또한 사용할 단백질에 대한 중합체의 비율에 영향을 미친다. 대개, pH 가 낮을 경우, 단백질에 대해 더 많은 과량의 중합체가 요구될 것이다(즉, N - 말단 a - 아미노기가 덜 반응성일 수록, 최적 조건을 획득하기 위해 더 많은 중합체가 필요하다). pH 가 높다면, 중합체 : 단백질 비율은 클 필요가 없다(즉, 더 많은 반응기가 이용될 수 있으므로, 더 적은 중합체 분자가 필요하다). 본 발명을 위한 pH 는 대개 3 - 9, 바람직하게는 3 - 6 범위 이내일 것이다.
다른 중요한 고려할 사항은 중합체의 분자량이다. 일반적으로, 중합체의 분자량이 더 클수록 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자는 더 적다. 유사하게, 이들 변수를 최적화할 때 중합체의 분지도 고려해야 한다. 대개, 분자량이 더 클수록(또는 더 많이 분지된 것일 수록) 중합체 : 단백질 비율은 더 크다. 일반적으로, 본원에서 의도하는 폴리에틸렌 글리콜화 반응에 있어, 바람직한 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 이고, 특히 약 12 kDa 내지 약 25 kDa 이 바람직하다. GDNFR 단백질이나 변이체에 대한 수용성 중합체의 비율은 대개 1 : 1 내지 100 : 1 의 범위일 것이고, 바람직하게는 1 : 1 내지 20 : 1(폴리폴리에틸렌 글리콜화의 경우) 및 1 : 1 내지 5 : 1(모노폴리에틸렌 글리콜화의 경우) 일 것이다.
상기 나타낸 조건을 사용하면, 환원성 알킬화에 의해, 아미노 말단에서 a - 아미노기를 갖는 어떠한 GDNFR 단백질이나 변이체에 대해 중합체의 선택적 부착이 제공될 것이며, 모노중합체/GDNFR 단백질(또는 변이체) 결합체의 실질적으로 균질한 제제가 제공될 것이다. 여기에 사용한 용어 '모노중합체/GDNFR 단백질(또는 변이체) 결합체' 란 GDNFR 단백질이나 GDNFR 변이체 단백질 분자에 단일 중합체 분자가 부착되어 구성되는 조성물을 의미한다. 모노중합체/GDNFR 단백질(또는 변이체) 결합체는 전형적으로 리신 아미노 곁기가 아니라 N - 말단에 위치한 중합체 분자를가질 것이다. 이 제제는 대개 90 % 이상이 모노중합체/GDNFR 단백질(또는 변이체) 결합체일 것이고, 더 보통은 95 % 이상이 모노중합체/GDNFR 단백질(또는 변이체) 결합체일 것이며, 나머지 관찰가능한 분자는 비반응된 것(즉, 중합체 성분이 결여되어 있는 단백질)이다. 또한 GDNFR 단백질 산물이 융합 단백질 또는 결합된 GDNFR 및 GDNF 분자를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜화된 분자 제제와 관련될 수 있다고 생각한다.
본 환원성 알킬화를 위한 환원제는 수성 용액에 안정해야 하며 바람직하게는 환원성 알킬화의 초기 과정에서 형성되는 쉬프염기만을 환원시킬 수 있어야 한다. 적합한 환원제는 소디움 보로하이드라이드, 소디움 시아노보로하이드라이드, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란 및 피리딘 보란 중에서 선택할 수 있다. 특히 적합한 환원제는 소디움 시아노보로하이드라이드이다. 그외 반응변수들, 이를테면 용매, 반응시간, 온도등 및 산물의 정제수단은 수용성 중합체와 단백질의 유도체화와 관련된 공개된 정보를 기초로 하여 사항에 따라 결정할 수 있다(본원에 인용된 공개문헌 참조).
C.GDNFR 단백질 산물 제약학적 조성물
전형적으로 GDNFR 단백질 산물 제약학적 조성물은 투여 방식과의 적합성에 대해 선택한 하나 또는 그 이상의 제약학적으로, 생리적으로 용인가능한 제제형 물질을 치료학적 또는 예방적 유효량의 GDNFR 단백질 산물과 혼합한 것임을 포함한다. 적합한 제제형 물질로는 다음이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다 : 항산화제, 방부제, 착색제, 향료 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전물, 부피 조정제, 완충제, 수송 매개체, 희석제, 부형제 및/또는 제약학적 보조제. 예를들어, 적합한 매개체는 주사용 물, 생리식염수 또는 비경구 투여용 조성물에 보편적인 그외 물질을 보충하는 것이 가능한 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합한 식염수가 더 전형적인 매개체이다. 본원에 사용된 용어 '제약학적으로 용인가능한 담체' 또는 '생리적으로 용인가능한 담체' 란 제약학적 조성물로서 GDNFR 단백질 산물의 수송을 완수하거나 증가시키기에 적합한 제제형 물질(들)을 말한다.
매개체내 일차 용매는 사실상 수성이거나 아니면 비수성일 것이다. 또한, 매개체는 제제형의 pH, 삼투 몰농도, 점성, 정화도, 색체, 무균성, 안정성, 용해율 또는 냄새를 변화시키거나 유지시키기 위한 그외 제제형 물질을 포함할 수 있다. 유사하게, 매개체는 GDNFR 단백질 산물의 방출 속도를 변화시키거나 유지시키기 위한, 또는 혈액 - 뇌 장벽을 가로질러 GDNFR 단백질 산물이 흡수되거나 침투되는 것을 촉진시키기 위한 부가 제제형 물질을 포함할 수 있다.
일단 치료상 제약학적 조성물이 제형화되면, 용액, 현탁액, 겔, 유화액, 고체 또는 탈수시키거나 동결건조시킨 분말로서 무균 용기내에 저장할 수 있다. 그와 같은 제제형은 바로 사용할 수 있는 형태나 아니면 투여전 재구성할 필요가 있는 형태(예를들어, 동결건조된 형태)로 저장될 수 있다.
본 분야의 숙련된 기술자들은 의도하는 투여경로 및 원하는 투여량에 좌우하여 최적의 제약학적 제제형을 결정할 것이다. 예를들어, 본원에서 그 명세서를 참고로 인용한 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) 참조. 그와 같은 조성물은 본 단백질 및 유도체의 물리 상태, 안정성, 생체내 방출율 및 생체내 정화율에 영향을 미칠 수 있다.
효과적인 투여형태, 이를테면 (1) 서방성(slow - release) 제제형, (2) 흡입용 합제 또는 (3) 경구적 활성 제제형도 예상한다. 또한 GDNFR 단백질 산물 제약학적 조성물은 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 상기 비경구적으로 투여되는 치료학적 조성물은 전형적으로, 제약학적으로 용인가능한 매개체내의 GDNFR 단백질 산물을 포함하는 무 -발열물질의, 비경구적으로 용인가능한 수용액 형태이다. 하나의 바람직한 매개체는 생리 식염수이다. 또한 GDNFR 단백질 산물 제약학적 조성물은 폴리락트산, 폴리글리콜산등과 같은 중합체 화합물의 특정 제제, 또는 리포솜 내의 상기 특정 제제를 포함할 수 있다. 하이알루론산 또한 사용될 수 있는데, 이것은 순환시 지속기간을 촉진시키는 효과를 가질 것이다.
비경구 주사용으로 특히 적합한 매개체는 GDNFR 단백질 산물을 무균의 등장액으로서 제형화시켜, 적당히 보존시키는 무균 증류수이다. 다른 제제는, 단백질을 서서히 또는 지속적으로 방출시킨 다음 저장 주사(depot injection)로서 수송할 수 있는, 주사가능한 중심체나 리포솜 같은 인자와 GDNFR 단백질 산물의 제제형을 포함할 수 있다. 그외 적합한 GDNFR 단백질 산물 도입 수단은 GDNFR 단백질 산물을 함유하는 이식가능한 약물 수송 장치를 포함한다.
본 발명의 제제는 본 기술분야에 공지되어 있는 바와 같은 다른 성분, 예를들어, 비경구적으로 용인가능한 방부제, 긴장제(tonicity agent), 혼합용매(cosolvent), 습윤제, 착화제, 완충제, 항균제, 항산화제 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 예를들어, 적합한 긴장 강화제로는 알칼리 금속 할로겐화물(바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨), 만니톨,소르비톨등이 포함된다. 적합한 방부제로는 다음이 포함되나 이것으로 국한되지는 않는다 : 벤잘코니움 클로라이드, 타이메로살, 펜에틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 등. 방부제로서 과산화수소가 사용될 수도 있다. 적합한 혼합용매의 예는 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜이다. 적합한 착화제의 예는 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타 - 사이클로 덱스트린 또는 히드록시프로필 - 베타 - 사이클로덱스트린이다. 적합한 계면활성제 또는 습윤제로는 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 80 같은 폴리소르베이트, 트로메타민, 렉틴, 콜레스테롤, 틸록사팔등이 포함된다. 완충제는 붕산염, 시트르산염, 인산염, 중탄산나트륨 또는 트리스 - HCl 같은 종래의 완충제일 수 있다.
제제형 성분은 투여 부위에 용인가능한 농도로 존재한다. 예를들어, 완충제는 상기 조성물을 생리학적 pH 에서나 약간 낮은 pH 에서, 전형적으로는 약 5 내지 약 8 범위의 pH 내에서 유지시키기 위해 사용한다.
제약학적 조성물은 흡입용으로 제형화될 수도 있다. 예를들어, GDNFR 단백질 산물은 흡입용 건조분말로서 제형화될 수 있다. 또한 GDNFR 단백질 산물 흡입용액은 연무 수송용 액화 추진제로 제형화될수도 있다. 또 다른 제제형에 있어, 용액이 연무될 수도 있다.
또한 GDNFR 단백질 산물을 함유하는 특정 제제형을 경구적으로 투여하고자 한다. 이런식으로 투여되는 GDNFR 단백질 산물은 정제 및 캡슐과 같은 고형의 투여형태를 조합하는 데 통상적으로 사용되는 담체와 함께, 또는 담체없이 제형화할 수 있다. 예를들어, 생체내 이용율은 최대화되고 예비 - 조직 붕괴(pre - systemic degradation)가 최소화될 때 위장관 지점에서 제제형의 활성 부분이 방출되도록 캡슐을 고안할 수 있다. GDNFR 단백질 산물의 흡수를 촉진시키기 위해 부가 제제형 물질을 포함시킬 수도 있다. 희석제, 향료, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕괴제 및 결합제 또한 사용될 수 있다.
다른 제제는 정제 제조에 적합한 비 - 독성 부형제와 혼합한 유효량의 GDNFR 단백질 산물과 관련될 것이다. 멸균수, 또는 다른 적합한 매개체에 정제를 용해함으로써, 용액을 단위 투여형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 다음이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다 : 탄산칼슘, 탄산 또는 중탄산 나트륨, 락토스 또는 인산칼슘과 같은 비활성 희석제 ; 녹말, 젤라틴 또는 아카시아와 같은 결합제 ; 또는 스테아르산 마그네슘, 염스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제.
GDNF 단백질 산물과 결합한 GDNFR 단백질 산물과 관련된 제제형을 포함하는, 부가 GDNFR 단백질 산물 제제형은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 분명할 것이다. 리포솜 담체, 생물 - 부식가능한 미량입자 또는 다공성 비드(bead) 및 저장주사와 같은, 다양한 그외 지속적인- 또는 조절된- 수송 수단을 제형화하는 기술 역시 본 분야의 숙련된 기술자들에게 알려져 있다. 예를들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 Supersaxo 등의 제약학적 조성물 수송을 위한 조절 방출 다공성 중합 미량입자에 관한 명세서 참조(국제 공개 번호 제 WO 93/15722 호 ; 국제 출원 번호 제 PCT/US93/00829 호).
D.GDNFR 단백질 산물 투여
GDNFR 단백질 산물은 피하, 근육내, 정맥내, 경폐적, 경피적, 초내 및 대뇌내 수송을 포함하는 다양한 경로를 통해 비경구적으로 투여할 수 있다. 또한, 혈액 - 뇌 장벽을 쉽게 통과하지 않는 단백질 인자를 직접 대뇌적으로 주입할 수 있거나, 반대로 단백질 인자를 상기 장벽을 가로질러 수송시킬 다른 요소와 공동으로 대뇌내 주입할 수 있다. 예를들어, GDNFR 단백질 산물을 대뇌실내로, 또는 뇌 또는 척수 지주막하강 내로 투여할 수 있다. 또한 GDNFR 단백질 산물을 뇌 실질내로 직접 대뇌내 투여할 수도 있다. GDNFR 단백질 산물을, 그것이혈액 - 뇌 장벽을 통과하도록 화학적으로 변형시키거나 포장한 형태로, 또는 상기 장벽을 가로질러 GDNFR 단백질 산물이 침투되는 것을 촉진시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 인자와 함께 대뇌외 투여할 수도 있다. 예를들어, NGF 와 모노클로날 항트란스페린 수용체 항체와의 결합체가 트란스페린 수용체와 결합함으로써 뇌에 수송된다고 알려져 있다.
원하는 수준의 GDNFR 단백질 산물을 획득하기 위해, 매일 반복 주사하거나 그 보다 덜한 빈도로 주사하여 투여할 수 있거나, 일정 - 또는 프로그램화된 - 흐름 이식 펌프로 부터 연속적으로나 주기적으로 GDNFR 단백질 산물을 주입시킬 수 있다. 생물분해가능한 중합체 기질내에 끼워져 있는 신경영양성 인자를 함유하는 완용형 이식체 역시 GDNFR 단백질 산물을 수송할 수 있다. 투여 빈도는 제형화에 따른 GDNFR 단백질 산물의 약력학 및 투여 경로와 부위에 좌우할 것이다.,
투여 방식에도 불구하고, 체중, 체표면적 또는 기관의 크기에 따라 특이 투여량을 계산할 수 있다. 상기 언급한 각 제제형과 관련되는 치료를 위한 고유 투여량을 결정하는 데 필요한 더 세밀한 계산은 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에 의해 일상적으로 수행되는데, 이것은 그들이 일상적으로 수행하는 과업의 범위내이다. 고유 투여량은 고유 투여량 - 반응 데이터를 사용함으로써 확인할 수 있다.
특이 손상이나 증상을 치료하는 방법과 관련있는 최종 투여량 섭생은 주치의가 결정할 것이다. 일반적으로, 본 GDNFR 폴리펩티드의 유효량은 약의 작용을 변형시키는 여러 인자, 예를들어, 환자의 연령, 건강상태, 체중, 성별 및 규정식, 어떠한 감염의 심각성, 투여시간 및 그외 임상인자를 고려하여 결정될 것이다. 예를들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, pages 697 - 773 참조. GDNF 작용을 증강시키기 위해 GDNFR 을 사용한다면, GDNFR 투여량은 GDNF 요법에 필요한 투여량과 비슷하게 선택하며 ; GDNF 작용을 길항작용화하는 데 GDNFR 을 사용한다면, GDNFR 투여량은 GDNF 투여량의 여러 배일 것이다. 매일 1 회 또는 그 이상으로, 또는 그 보다 덜 빈번하게 투여할 수 있고, 본원에 기술한 바와 같은 다른 조성물과 함께 투여할 수도 있다. 본 발명이 본원에서 제시한 투여량으로 국한되지 않는다는 것을 주목해야 한다.
주어진 치료를 위해 GDNFR 단백질 산물을 연속적으로 투여하거나 지속적으로 수송하는 것이 이로울 것이다. 연속적인 투여는 주입 펌프와 같은 기계적 수단에 의해 수행할 수 있으나, 연속적이거나 거의 연속적인 다른 투여 방식을 실행할 수도 있을 것이다. 예를들어, 화학 유도체화나 피막형성이, 결정된 투여량 섭생에 기초하여, 예측가능한 양으로 혈류에 연속적으로 존재하는 효과를 갖는 단백질의 지속 방출 형태를 초래할 것이다. 따라서, GDNFR 단백질 산물은 그와 같은 연속적인 투여를 달성하도록 유도체화되거나 아니면 제형화된 단백질을 포함하다. GDNFR 단백질 산물의 지속적인 방출 형태는 원하는 유효 투여량이 매일 또는 매주 제공되도록 제형화될 것이다.
또한 GDNFR 단백질 산물은 GDNF 와의 결합 형태로 투여될 수 있다. 택일적으로, GDNFR 과 GDNF 단백질 산물을 개별적으로 투여할 수 있으며, 순서대로나 아니면 동시에 투여할 수도 있다.
신경 질환 치료시 본 발명의 GDNFR 단백질 산물은 단독으로, 또는 그외 다른 인자와 함께 사용될 수도 있다. 또한, 화학 조성물을 포함하는, 그외 인자나 그외 분자를 GDNFR 단백질 산물과 함께 사용할 수 있다. 파킨슨병 치료시, GDNFR 단백질 산물은 단독으로 또는 레보도파 투여와 함께 사용되는데, 여기서 GDNFR 은 내인성 GDNF 의 활성도를 높여 증가된 도파민 농도의 신경원 흡수를 증강시킨다.
상기한 바와 같이, 부가 신경영양성 인자나 부가 신경원 영양 인자 역시 어떤 신경원 집단이나 어떤 유형의 손상 또는 질병 치료에 유용하거나 필수적일 것이다. GDNFR 또는 GDNFR 과 GDNF 와의 결합체와 함께 사용할 수 있는 다른 인자로는 다음이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다 : 인슐린, 인슐린 - 유사 성장인자, 표피 성장인자, 혈관작용 성장인자, 하수체 아데닐산 사이클레이스 활성 폴리펩티드, 인터페론 및 소마토스타틴 같은 마이토젠 ; 신경 성장인자, 뇌 유래의 신경영양성 인자, 뉴로트로핀 - 3, 뉴로트로핀 - 4/5, 뉴로트로핀 - 6 , 인슐린 - 유사 성장인자, 섬모 신경영양성 인자, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자 - 5, 형질전환 성장인자 - β, 코케인 - 암페타민 조절 전사(CART) 같은 신경영양성 인자 ; 및 표피 성장인자, 백혈병 억제인자, 인터루킨, 인터페론 및 군체 자극인자 같은 그외 성장인자 ; 뿐만 아니라 이들 인자와 기능상 동등한 분자 및 물질.
GDNFR 단백질 산물 세포요법 및 유전자요법
GDNFR 단백질 산물 세포요법, 예를들어 GDNFR 단백질 산물을 생산하는 세포의 대뇌내 이식 또한 의도한다. 이 실시형태는 생물학적 활성 형태의 GDNFR 단백질 산물을 합성하고 분비할 수 있는 환자의 세포내로 이식하는 것과 연관되어 있다. 그와 같은 GDNFR 단백질 산물 - 생산 세포는 GDNFR 단백질 산물의 천연 생산자인 세포일 수 있거나 원하는 GDNFR 단백질 산물을 코딩하는 유전자로 형질전환시킴으로써 GDNFR 단백질 산물을 생산하는 능력을 증가시킨 재조합 세포일 수 있다. 그와 같은 변형은 유전자 수송 뿐만 아니라 그것의 발현 및 분비 촉진에 적합한 벡터에 의해 수행될 수 있다. 외래종 GDNFR 단백질 산물을 투여한 환자에게서 잠재적인 면역학적 반응을 최소화하기 위해, GDNFR 단백질 산물을 생산하는 천연세포는 인체 기원이며 인체 GDNFR 단백질 산물을 생산하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, GDNFR 단백질 산물을 생산하는 재조합 세포도 인체 GDNFR 단백질 산물을 코딩하는 유전자를 함유하는 발현벡터로 형질전환시킨 것이 바람직하다.
주변 조직의 침윤을 피하기 위해 이식세포를 피막화시킬 수도 있다. 인체 또는 비 - 인체 동물 세포는, GDNFR 단백질 산물을 방출하지만, 환자의 면역계 또는 주변 조직으로 부터의 그외 유해인자에 의해 세포가 파괴되는 것을 방지하는 생체적합성이고 반투성인 중합성 봉입이나 막을 이루어 환자에게 이식될 수 있다. 택일적으로, 생체외 GDNFR 단백질 산물을 생산하도록 형질전환시킨 환자 자신의 세포를 상기와 같은 피막화없이 환자에게 직접 이식시킬 수 있을 것이다.
생존세포를 피막화시키는 기술은 본 분야에서 통상의 지식을 가진자들에게 잘 알려져 있으며, 피막화된 세포의 제조 및 환자내 이식은 과도한 실험없이 수행할 수 있다. 예를들어, Baetge 등은(본원에서 참고문헌으로 인용한 국제 공개 번호 제 WO 95/05452 호 ; 국제 출원 번호 제 PCT/US94/09299 호) 생물학적 활성분자를 효과적으로 수송하기 위한 유전자 공학에 의해 생산한 세포를 함유하는 생체적합성 캡슐에 관하여 기술하고 있다. 또한, 특별히 본원의 참고문헌으로 인용한 미국 특허 번호 제 4,892,538 호, 제 5,011,472 호 및 제 5,106,627 호 참조. 생존세포를 피막화시키는 시스템에 관하여는 특별히 본원의 참고문헌으로 인용한 Aebischer 등의 PCT 출원 번호 제 WO 91/10425 호에 기술되어 있다. 또한 특별히 본원의 참고문헌으로 인용한 Aebischer 등의 PCT 출원 번호 제 WO 91/10470 호, Winn 등의 Exper. Neurol., 113 : 322 - 329, 1991, Aebischer 등의 Exper. Neurol., 111 : 269 - 275, 1991 ; Tresco 등의 ASAIO, 38 : 17 - 23, 1992 참조.
GDNFR 단백질 산물의 생체내 및 시험관내 유전자요법 수송 역시 예상된다. 시험관내 유전자요법은, 핵산 구성물이나 그외 적합한 수송 벡터를 국소 주사하여 표적세포내로 GDNFR 단백질 산물을 코딩하는 유전자를 도입함으로써 수행할 수 있다(Hefti, J. Neurobiol., 25 : 1418 - 1435, 1994 참조). 예를들어, GDNFR 단백질 산물을 코딩하는 핵산서열을 표적세포내 수송을 위한 아데노 - 관련 바이러스 벡터에 함유시킬 수 있다(예를들어, 본원의 참고문헌으로 인용한 Johnson 의 국제 공개 번호 제 WO 95/34670 호 ; 국제 출원 번호 제 PCT/US95/07178 호 참조). 선택적인 바이러스 벡터로는 다음이 포함되나, 이것으로 국한되는 것은 아니다 : 레트로바이러스, 아데노바이러스, 단순포진 바이러스 및 파필로마바이러스 벡터. 또한 리포좀 - 매개 전이, 직접 주사(누드 DNA), 수용체 - 매개 전이(리간드 - DNA 복합체), 일렉트로포레이션, 인산칼슘 침전 또는 미량입자 충격(유전자 총)에 의해 생체내에서나 아니면 생체외에서 물리적 전이를 수행할 수 있다.
GDNFR 단백질 산물 유전자요법 또는 세포요법은 GDNFR 단백질 산물의 수송을 더 포함할 수 있다. 예를들어, GDNFR 단백질 산물과 GDNF 단백질 산물 둘 다를 발현하여 방출하도록 숙주세포를 변형시킬 수 있다. 택일적으로, GDNFR 및 GDNF 단백질 산물이 개별 세포에서 발현되어 그 세포로 부터 방출될 수도 있다. 그와 같은 세포는 개별적으로 환자내 도입시킬 수 있거나, 상기 캡슐화된 막과 같은 단일 이식장치에 함유시킬 수 있다.
본원에 기술한 GDNFR 단백질 산물 제제형은 인체에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 수의학적으로 사용될 수 있다는 것에 주목해야 하는데, 용어 '환자' 를 제한된 방식으로 파악해서는 안된다. 수의학적으로 적용할 경우, 투여량 범위는 상기한 바와 같이 결정할 수 있다.
실시예 1
고친화성 GDNF 결합 부위를 발현하는 세포의 확인
발현 클로닝은 유의 수준의 표적 전사를 포함할 것 같은 mRNA 원의 선택과 관계있다. 망막 광수용세포가 매우 낮은 농도에서 GDNF 와 반응한다는 것을 확인하였는데, 이것은 기능적인, 고친화성 수용체가 존재한다는 것을 암시한다. 랫의 광수용세포가 GDNF 에 대한 고친화성 수용체를 발현했다는 것을 확인하기 위해, [125I]GDNF 결합 및 사진용유제 분석을 수행하였다.
랫의 망막세포 배양
5 일 된 C57B1/6 마우스 새끼 또는 3 일 된 스프래그 - 돌레인 랫 새끼의 신경망막(미국 메사츄세츠 바 하버에 소재하는 잭슨 라보라토리스에서 구입)을 조심스럽게 제거하고 색소상피없이 절개하여, 1 mm2단편으로 잘라 얼음같이 찬 인산염 - 완충 식염수(PBS) 내에 두었다. 그런 다음 망막을 120 유닛 파파인과 2000 유닛 DNAase 를 함유하는 10 mL 의 Hank's 균형 염용액(HBSS)으로 옮겨 약 200 rpm 의 회전대 진탕기 상에서 37 ℃ 에서 20 분간 항온하였다. 불다듬질된 파스퇴르 피펫으로 상기 세포를 연마하여 분산시키고, 20 μm 니텍스 나일론 메시로 체질한 다음 200 × g 에서 5 분간 원심분리하였다. 결과적으로 생성된 세포펠릿을 1 % 오브알부민과 500 유닛 DNAase 를 함유하는 HBSS 내에 재현탁시키고 4 % 오브알부민 용액(HBSS 내) 상단에 층을 만든 다음 500 × g 에서 10 분간 원심분리하였다. 완전 배지(하기 참조)에 최종 펠릿을 재현탁하고, 약 15,000 세포/mL 로 맞춘 후, 예기한 바와 같이(Louis 등의, Journal Of Pharmacology And Experimental Therapeutics, 262, 1274 - 1283, 1992 참조) 폴리오르니틴과 라미닌으로 피복한 조직배양 평판내에 90 μl 분취량으로 접종하였다.
상기 완전 배지는 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)와 F12 배지의 1 : 1 혼합물로 이루어 진 것으로, 2.5 % 열 - 불활성화된 말 혈청(미국 유타 로간에 소재하는 하이클론에서 구입), B27 배지 보충물[미국 뉴욕 그랜드 아일랜드에 소재하는 집코(GIBCO)에서 구입], D - 글루코스(최종농도 : 5 mg/mL), L - 글루타민(최종농도 : 2 mM), 20 mM HEPES, 소 인슐린 및 사람 트란스페린(최종농도 : 각각 2.5 및 0.1 mg/mL)을 보충하였다.
광수용체의 면역세포화학적 확인
어레스틴, 간상체 - 특이 항원에 면역염색함으로써 광수용체를 확인하였다. 광수용체 배양물을 PBS, pH 7.4 내 4 % 파라포름알데히드와 함께 실온에서 30 분간 고정시킨 다음 PBS 로 3 회 세척하였다.항체 침투를 증가시키기 위해 1 % 노니데트 P - 40 을 함유하는 수퍼블록 차단 완충액(미국 일리노이 록포드에 소재하는 피어스에서 구입)에 상기 고정 배양물을 배양하였다. 항 - 어레스틴 항체(어레스틴의 합성 펩티드 서열 : Val - Phe - Glu - Glu - Phe - Ala - Arg - Gln - Asn - Leu - Lys - Cys 에 대항하는 폴리클로날 토끼 항체)를 동일 완충액으로 1 : 2000 희석하여 가하고, 그 배양물을 회전 진탕기 상에서 37 ℃ 에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양물을 PBS 로 3 회 세척한 후 1 : 500 희석하여 염소 - 항 - 토끼 IgG(미국 캘리포니아 버링게임에 소재하는 벡터 라보라토리스로 부터 구입한 벡타스테인 키트)와 함께 37 ℃ 에서 1 시간 동안 배양하였다. PBS 로 3 회 세척한 후, 2 차 항체를 1 : 500 희석한 아비딘 - 비오틴 - 과산화효소 복합체로 표지하였다(37 ℃ 에서 45 분). PBS 로 3 회 더 세척한 후, 표지된 세포 배양물을, 0.04 % 3', 3' - 디아미노벤지딘 - (HCl)4, 0.06 % NiCl2및 0.02 % 과산화수소를 함유하는 0.1 M 트리스 - HCl, pH 7.4 용액에 5 - 20 분간 반응시켰다. 어레스틴 - 면역반응성을 근거로, 배양물내 약 90 % 의 세포가 간상체 광수용체였다.
200 × 배율에서 밝은 - 빛 광학을 지닌 어레스틴 - 염색 배양물을 조사함으로써 광수용체 생존을 결정하였다. 어레스틴 - 양성 광수용체의 수는 6 mm - 웰의 총 표면적 중 약 20 % 를 나타내는데, 1 직경 1 × 6 mm 스트립으로 계수하였다. 생존가능한 광수용체는 보통 짧은엑손 - 유사 돌기를 갖는 규칙적인 모양의 세포체가 그 특성이다. 불규칙하고, 공포성 핵주위부세포체 또는 단편화된 축삭을 갖는 것과 같은 변성의 신호를 보이는 광수용체는 계산에서 제외시켰다(그러나, 변성 광수용체 중 대부분은 배양 기질로 부터 분리됨). 세포수는 세포/6 - mm 웰로 표시하였다.
광수용체에 대해 강화시킨 배양된 랫의 망막세포(10,000/6 - mm 웰)를 인체 재조합 GDNF(10 ng/mL 내지 1 pg/mL 범위로 10 배 계열희석)로 처리하였다. 6 일 후 배양물을 고정시키고 어레스틴, 간상체 광수용체 - 특이 항원에 대해 면역염색하였다. GDNF 로 처리하지 않은 배양물에서 광수용체의 수는 배양 6 일 후 초기 수의 약 25 % 에 도달하는 동안 꾸준히 감소하였다. 배양물을 GDNF 로 처리한 결과 배양 6 일 후 생존 가능한 어레스틴 - 양성 광수용체의 수가 약 2 배 더 많았다. GDNF 의 효과는 약 200 pg/mL 에서 최대였으며, ED50은 약 30 pg/ml 이다. 광수용체의 생존을 촉진시키는 것 외에도 GDNF 부가는 그것의 축삭 - 유사 돌기가 신장되는 것을 자극함으로써 광수용체의 형태학적 발육에 대한 효과를 증명한다(GDNF 에서 광수용체의 평균 신경 돌기 길이 : 68 μm, 대조 배양물에서 27 ± 18 μm 와 비교).
랫의 망막세포가 고친화성 GDNF 수용체를 발현한다는 것을 확인하기위해, [125I]GDNF 결합 및 사진용유제 분석을 수행하였다. 실험 3 - 4 일 전에 생후 랫 광수용세포를 2800 세포/mm2밀도로 플라스틱 슬라이드 소형 플라스크(넝크)에 접종하였다. 이 세포를 얼음같이 찬 세척 완충액[25 mM N - 2 - 히드록시에틸피페라진 - N' - 2 - 에탄술폰산(HEPES)를 함유하는 둘베코의 변형된 이글배지(DMEM), pH 7.5]으로 1 회 세척하였다. 경쟁 결합을 위해, 500 nM 비표지 GDNF 의 존재 및 부재하 4 ℃ 에서 4 시간 동안 결합 완충액[25 mM HEPES, pH 7.5 를 함유하는 DMEM 및 2 mg/mL 의 소 혈청 알부민(BSA)] 내 다양한 농도의 [125I]GDNF 와 함께 세포를 배양하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 4 회 세척하고, 1 M NaOH 에 용균시켜 세포와 관련된 방사능을 감마 계수기로 측정하였다. 유의량의 [125I]GDNF 는 낮은 리간드 농도(30 pM 만큼)에서도 광수용세포와 결합하였는데, 이 결합은 과량의 비표지 GDNF 의 존재에 의해 경쟁적으로 저해되었다.
사진용유제 검출을 위해, 500 nM 비표지 GDNF 의 존재 또는 부재하 4 ℃ 에서 4 시간 동안 결합 완충액내 50 pM [125I]GDNF 와 함께 세포를 배양하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 6 회 세척하고, 2.5 % 글루타르알데히드로 이어서 50 % 및 70 % 에탄올로 고정시킨 후NTB - 2 사진용유제(미국 뉴욕 로체스터에 소재하는 이스트만 코닥에서 구입)에 잠깐 담그었다. 노출 5 일 후, 슬라이드를 현상하여 조사하였다. 사진용유제 분석은, [125I]GDNF 가 광수용세포 중 일부와 결합한다는 것을 입증하였는데, 이것은 GDNF 에 대한 수용체가 존재한다는 것을 나타낸다. 그러나, 이 결합은 비표지 GDNF 의 부가에 의해 효과적으로 차단되었다.
실시예 2
광수용세포로 부터 GDNFR 의 발현 클로닝
실시예 1 에 기술한 바와 같이, 방사능표지 GDNF 와의 세포 표면 결합 및 매우 낮은 농도의 리간드에 반응하는 능력을 근거로 하여 GDNF 에 대한 고친화성 수용체의 가능한 원으로서 랫 광수용세포를 선택하였다. 수용체를 확인하기 위해, 하기 기술한 방법에 따라 포유동물 발현벡터(pSR 유도체, Takebe 등의 1998 상기문헌 참조) 및 배양된 생후 랫 광수용세포로 부터 분리한 mRNA 를 사용하여 약 50,000 독립 클론의 크기별로 선택한 cDNA 라이브러리를 구성하였다. 이 라이브러리를 약 1,500 내지 2,000 독립 클론의 풀로 나누고 확립된 발현 클로닝 접근법(Gearing 등의EMBO Journal, 8, 3667 - 3676, 1989 참조)을 이용하여 선별하였다. 라이브러리의 각 풀을 대표하는 플라스미드 DNA 를 제조하여 플라스틱 현미경 슬라이드 소형 플라스크(미국 일리노이 네이퍼빌에 소재하는 넝크에서 구입)에서 성장시킨 COS7 세포(입수처 : ATCC 제 CRL 1651 호)내로 형질감염시켰다.
형질감염된 세포를 [125I]GDNF 로 처리하고, 글루타르알데히드로 고정시켜 탈수시킨 후 자가방사기록을 위해 사진용유제에 잠깐 담그었다. 5 일 동안 노출시킨 다음 슬라이드를 현상하고, GDNF 에 대한 수용체의 세포 발현의 결과로서 세포 표면에 대한 [125I]GDNF 의 결합을 나타내는 은가루로 덮힌 세포의 존재에 대해 조사하였다. [125I]EGF 로 처리한 EGF 수용체 형질전환 세포를 양성 대조로서 사용하였다.
이러한 방식으로 선별된 27 풀(F8 - 11) 중 하나가 형질감염에 따른 19 양성 세포를 나타냈다. 따라서, GDNFR 이 발현된 cDNA 클론을 함유하는 단일의 cDNA 라이브러리 풀이 확인되었다. 이 풀을, 상기 동일한 과정에 따라 재선별한 100 클론/풀의 더 작은 60 아풀(subpool)로 나누었다. 이들 풀 중 다섯 개가 양성으로 확인되었으며 이 다섯 풀 중 두 개를 더 세분하여 GDNF 결합 능력을 초래하는 단일 클론을 산출하였다. 단일 클론으로 부터의 플라스미드 DNA 를 COS7 세포내로 형질감염시킨 결과 세포 중 약 15 % 가 [125I]GDNF 와 결합하였다. 이 결합은 과량의 비표지 GDNF 와 함께 경쟁시킴으로써 특이하게 저해되었다.
발현 cDNA 라이브러리의 구성
생후 3 - 7 일 된 랫으로 부터 랫 망막세포를 수확하고 라미닌 및 폴리오르니틴으로 피복된 배양 접시에 약 5700 세포/mm2밀도로 접종하였다. 배양 3 - 4 일 후 약 80 % 의 광수용세포를 함유하는 집단을 어림잡았다. 표준방법에 의해 이 배양물로 부터 총 RNA 를 제조하고, 폴리 A - 트랙트(tract) 키트(미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 프로메가에서 구입)를 사용하여 폴리 A + RNA 를 정제하였다. 집코 수퍼스크립트 초이스 시스템(미국 매릴랜드 게이더스버그에 소재하는 집코/비알엘에서 구입)을 이용하여 랫 광수용체 폴리 A + RNA 로 부터 cDNA 라이브러리를 구성하였다. 2 마이크로그람의 폴리 A + RNA 를 50 ng 의 무작위 6 량체와 혼합하고, 70 ℃ 에서 10 분간 가열한 다음 얼음으로 급히 냉각시켰다. 37 ℃ 에서 1 시간 동안 400 U 수퍼스크립트 Ⅱ RT 로 제 1 가닥 합성을 수행하였다. 동일 시험관에 dNTPs, 10 U 의E.coli DNA 리가제, 40 U 의 E.coli DNA 폴리머라제 I 및 2 U 의 E.coli RNase H 를 부가한 후 제 2 가닥 합성을 수행하였다. 16 ℃ 에서 2 시간 후, cDNA 말단을 16 ℃ 에서 5 분간 더 10 U 의 T4 폴리머라제로 처리하여 블런트화하였다. 이소프로판올 침전을 행한 다음, 10 μg 의 비인산화된 EcoRI 어댑터 올리고누클레오티드와 함께 밤새 결합시킴으로써 cDNA 에 EcoRI 클로닝 부위를 부가하였다.
EcoRI 을 적응시킨 cDNA 를 인산화시킨 다음 세파크릴 S - 500 HR 크기 분별 칼럼에 가하였다. 부하 후, 100 μl 분취량의 TEN 완충액(10 mM 트리스 - HCl pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 25 mM NaCl)으로 칼럼을 세척하고, 30 μl 분획들을 모았다. 약 34 ng 의 고분자량 cDNA 를 함유한 분획 6 내지 8 을 풀로 만들고 침전시켰다. 회수된 EcoRI - 적응 cDNA 를 50 ng 의 EcoRI 절단 벡터 pBJ5(미국 스탠퍼드 유니버시티에서 입수)와 함께 밤새 결합시켰다. 약 15 ng 의 cDNA 를 함유하는 결합 혼합물의 분취량 각각을 일렉트로포레이션에 의해 감응세포(E.coli 균주 DH10B ; 미국 매릴랜드 게이더스버그에 소재하는 집코/비알엘에서 수득) 내로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 역가 측정한 다음 1500 콜로니/평판의 밀도로 27 Amp/LB 평판에 평판화하였다. 각 평판으로 부터 콜로니를 긁어내어 각각 1500 독립 클론으로 된 27 풀을 제조하기 위해 10 mL 의 루리아 육즙(LB)에 모았다. 각 풀로부터의 세포의 일부를 글리세롤을 첨가하여 냉동시키고 그 잔류물은 퀴아겐 팁 - 500 키트(미국 캘리포니아 채츠워스에 소재하는 퀴아겐 인코포레이티드에서 구입)를 사용하여 플라스미드 DNA 를 분리하는 데 사용하였다.
COS 세포 형질감염 및 사진용유제 분석
형질감염 하루 전에 COS7 세포를 프로넥틴(ProNectin)[인산염 완충 식염수(PBS) 내 10 μg/mL]으로 피복된 플라스틱 슬라이드 소형 플라스크(넝크)에 접종하였다(220,000 세포/슬라이드). 형질감염시키기 위해, 2 μg 의 cDNA 를 함유하는 700 μl 의 옵티(Opti) MEMI(미국 매릴랜드 게이더스버그에 소재하는 집코/비알엘에서 구입)를 에펜도르프 시험관에서 35 μl 의 DEAE 덱스트란 용액(10 mg/mL, 미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마에서 구입)과 함께 서서히 혼합하였다. PBS 로 세포를 2 회 세척하고 5 % CO2대기, 37 ℃ 에서 30 분간 형질감염 혼합물과 함께 배양하였다. 배양 후, 10 % 송아지 태아 혈청(FCS)과 80 nM 클로로퀸(미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마에서 구입)을 함유하는 3 mL 의 DMEM 배지를 각 플라스크에 가하였다. 세포를 3.5 시간 동안 더 배양하고, 실온에서 2 분간 DMEM 내 10 % 디메틸술폭시드로 충격을 가한 다음 PBS 로 1 회 세척하고, 10 % FCS 를 함유하는 DMEM 에서 성장시켰다. 48 시간 후, 형질감염된 COS7 세포를 얼음같이 찬 세척 완충액(25 mM HEPES, pH 7.5 를 함유하는 DMEM)으로 1 회 세척하고 50 pM [125I]GDNF 를 보충한 얼음같이 찬 결합 완충액(25 mM HEPES, pH 7.5 및 2 mg/mL BSA 를 함유하는 DMEM)에서 4 ℃ 에서 4 시간 동안 배양하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 6 회 세척하고, 2.5 % 글루타르알데히드로 실온에서 5 분간 고정시키고, 이어서 50 % 및 70 % 에탄올로 탈수시킨 다음 NTB - 2 사진용유제(이스트만 코닥)에 잠깐 담그었다. 4 ℃ 의 어두운 곳에서 4 - 5 일 노출시킨 후 슬라이드를 현상하고 명시야 및 암시야 현미경 검사함으로써 선별하였다.
양성 풀의 세분화
추정상 GDNF 수용체 클론을 함유한 단일 풀을 확인하였다. 이 풀로 부터의 클론을 100 콜로니/평판의 밀도로 60 평판에 평판화하였다. 각 평판으로부터 세포를 긁어내어 LB 에 모으고 37 ℃ 에서 4 - 5 시간 동안 성장시켰다. 상기한 바와 같이 각 풀로 부터 냉동 저장물과 DNA 제제를 만들어 각 100 독립 클론을 함유하는 60 아풀을 생성하였다. 이들 60 아풀 중 두 개가 상기 방법에 의해 양성으로서 확인되었으며, 단일 콜로니를 분리시키기 위해 이들 풀로부터의 클론을 저밀도로 평판화하였다. 두 아풀 각각에서 단일 클로니(384)를 뽑아 내어 96 - 웰평판내의 200 μl LB 에 6 시간 동안 성장시켰다. GDNFR 을 발현하는 단일 클론을 선택하기 위해, 4 개의 96 - 웰 평판을 16 열 및 24 행으로 이루어진 단일의 큰 매트릭스로 정렬시켰다. 각 열과 각 행의 웰로 부터의 세포를 결합시켜 총 40 혼합물을 산출하였다. 이 혼합물을 10 mL LB/Amp(100 μg/mL)에 밤새 성장시키고, 퀴아겐 팁 - 20 키트를 사용하여 DNA 를 제조하였다. 추정상 GDNF 수용체 클론을 분석했을 때, 3 열 혼합물과 3 행 혼합물이 양성 신호를 나타냈는데, 이 신호는 9 개의 잠재적으로 양성인 단일 클론을 암시한다. 잠재적으로 양성인 단일 클론 각각으로 부터 DNA 를 제조하여 EcoRI 과 PstI 으로 절단하였다. 9 개의 단일 클론 중 3 개 클론의 DNA 가 동일한 제한 유형을 나타낸 반면 그외 6 개 클론은 관계가 없었는데, 이것은 상기 3 개 클론이 GDNFR 을 함유하는 확실한 클론이라는 것을 시사하는 것이다.
실시예 3
DNA 서열결정 및 서열 분석
양성의, 단일 클론으로 부터 DNA 를 제조하고 제조자의 지시에 따라 자동 ABI373A DNA 서열결정기(미국 캘리포니아 샌터 클래러에 소재하는 퍼킨/엘머 어플라이드 바이오시스템즈에서 구입)와 디데옥시 - 다이 - 종결기를사용하여 서열결정하였다. 유니버시티 오브 위스콘신 제네틱스 컴퓨터 그룹 패키지(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)에 기술된 바와 같은 FASTA(Pearson and Lipman, Proceedings Of The National Academy Of Science U.S.A., 85, 2444 - 2448, 1988) 프로그램 알고리즘을 이용하여 GDNF 수용체 서열을 모든 유용한 공개 데이터베이스와 비교하였다.
랫 GDNFR 의 서열 특성
상기 실시예 2 에 기술한 클론으로 부터의 플라스미드 DNA 를 제조하여 DNA 서열 분석하였다. 클로닝된 2138 bp 랫 cDNA 의 누클레오티드 서열 분석은 468 아미노산 잔기로 이루어진 번역 단백질을 암호하는 단일의 큰 오픈리딩 프레임을 나타냈다(도 3).
코딩(coding) 서열은, 잠재적인 폴리아데닐화 부위를 함유하고 있지 않는 301 bp 의 5'- 비번역 부위와 430 bp 의 3'- 비번역 부위에 의해 측면에 위치한다. 염기쌍 302 의 첫 번째 ATG 상류의 프레임내 정지코돈의 존재와 그 주변 누클레오티드 환경은 이 메티오닌 코돈이 아마 번역 개시 부위일 것이라는 것을 암시한다(Kozak, Nucleic AcidsResearch. 15, 8125 - 8148, 1987 참조).
랫 cDNA 클론의 3' 비번역 서열의 430 누클레오티드에서 폴리아데닐화 시그널은 발견되지 않았다. 이것은 놀라운 일이 아니다, 왜냐하면 노던 블롯 데이터가 약 3.6 kb 인 가장 짧은 mRNA 전사물을 나타냈기 때문이다.
GDNFR 폴리펩티드 서열은 분비성 시그널 펩티드(von Heijne, Protein Sequences And Data Analysis. 1, 41 - 42, 1987 ; von Heijne, Nucleic Acids Research. 14, 4683 - 4690, 1986 참조)의 특성을 수반하는 약 19 잔기(메티오닌 - 1 내지 알라닌 - 19, 도 3)로 된 N - 말단 소수성 부위를 갖는다. 막통과 도메인으로서 역할을 할 수 있는 내부 소수성 도메인은 발견되지 않았다. 대신, 21 잔기(로이신 - 448 내지 세린 - 468, 도 3)로 된 카르복시 - 말단 소수성 부위가 존재하는 데 이것은 세포질막에 대한 수용체의 글리코실 - 포스파티딜이노시톨(GPI) 고정과 관련될 수 있다. 세 개의 잠재적 N - 결합 글리코실화 부위가 존재하는 것을 제외하고는 보존 서열이나 구조적 모티프는 발견되지 않았다. 이 단백질은 시스테인이 대단히 풍부하지만(468 아미노산 잔기 중 31 아미노산) 그 스페이싱(spacing)은 공지 수용체의 세포외 부분에서 발견되는 시스테인 - 풍부 도메인의 스페이싱과 공유되지 않는다.
FASTA 를 이용하여 GDNFR 서열을 유용한 공개 데이터베이스의 서열과 비교하였다. 이 조사는 다른 공개 서열과 유의 상동성을 나타내지 않았다. 일단 랫 cDNA 클론이 수득되면, 방사능표지하여 하기 실시예 5 에 기술된 바와 같이 인체 뇌 흑질로 부터 제조한 cDNA 를 탐침시키는 데 사용한다.
실시예 4
GDNFR 발현 세포에 대한 GDNF 결합
Jing 등이 이미 기술한 검정 방법(Journal Of Cell Biology, 110, 283 - 294, 1990 참조)에 따라 결합 검정을 수행하였다. 이 검정은, GDNFR 을 발현하도록 형질감염시킨 랫 광수용세포, COS7 세포 또는 293T 세포(입수처 : ATCC 제 CRL - 1573 호)에 [125I]GDNF 를 결합시키는 것과 관련된다. 293T 세포의 표면에 발현되는 재조합 GDNFR 은 GDNF 를 특이하게 결합시킬 수 있으며 랫 망막세포상의 GDNF 결합부위에서 발견된 친화성과 필적할 만한 친화성을 가진다.
상기 실시예 1 에 기술한 바와 같이 랫 광수용세포를 제조하고, 검정 2 - 3 일전, 폴리오르니틴 및 라미닌으로 예비 - 피복된 24 - 웰 코스타 조직 배양 평판에 5.7 × 105세포/cm2의 밀도로 접종하였다. 검정 1 일 전에 COS7 세포를 2.5 × 104세포/cm2의 밀도로 접종하고 DEAE - 덱스트란 - 클로로퀸 방법(Aruffo and Seed, Proceedings Of The National Academy Of Sciences U.S.A., 84, 8573 - 8577, 1987 참조)을 이용하여 10 - 20 μg 의 플라스미드 DNA 로 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후에 각 접시로 부터 세포를 제거하고 24 - 웰 코스타 조직 배양 평판의 30 웰내로 재접종하여, 48 시간 동안 더 성장시켰다. 그런 다음 세포를 5 - 10 분간 얼음위에 둔 다음, 얼음같이 찬 세척 완충액으로 1 회 세척하고 4 ℃ 에서 4 시간 동안 비표지 GDNF 를 수반하거나 수반하지 않는 여러 농도의 [125I]GDNF 를 함유하는 0.2 mL 의 결합 완충액과 함께 배양하였다. 0.5 mL 의 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 4 회 세척하고 0.5 mL 의 1 M NaOH 와 함께 용균시켰다. 용균물을 1470 위저드 오토메틱 감마 카운터로 계수하였다.
어떤 결합 실험을 위해, 일시적으로 형질감염된 293T 세포를 사용하였다(293T 세포 형질감염에 대해서는 하기 참조). 형질감염 2 일후, 2 × 버신(versin)에 의해 접시로 부터 세포를 제거하였다. 세포를 펠릿화하고, 얼음같이 차가운 결합 완충액으로 1 회 세척한 후 3 × 105세포/mL 의 밀도로 얼음같이 찬 결합 완충액에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 1.5 × 105세포/시료를 함유하는 분취량으로 나누었다. 그런다음 세포를 펠릿화하고 500 nM 의 비표지 GDNF 의 존재 또는 부재하의 4 ℃ 에서 4 시간 동안 여러 농도의 [125Ⅰ]GDNF 와 함께 서서히 교반하면서 배양하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 4 회 세척하고 0.5 mL 세척 완충액에 재현탁하였다. 두 개의 0.2 mL 현탁액 분취량을 감마 계수기로 계수하여 세포와 결합한 [125Ⅰ]GDNF 의 양을 측정하였다.
모든 검정에 있어, 중복 시료 - 이 시료 중 하나는 500 nM 의 비표지 GDNF 를 함유함 - 를 사용함으로써 비특이 결합을 측정하였다. 비특이 결합 수준은 비표지 GDNF 의 부재하에서 측정한 특이 결합의 10 % 내지 20 % 까지 다양하였는데, 특이 결합에서 이것을 공제하였다. 이 검정은, 세포를 GDNFR cDNA 클론으로 형질감염시키지 않으면 GDNF 와 결합하지 않는다는 것을 입증했다.
실시예 5
GDNFR mRNA 의 조직 분포
태아 마우스, 성숙한 마우스, 랫 및 인체 조직에서 GDNFR mRNA 의 발현 유형을 노던 블롯 분석으로 조사하였다. 제조자의 방법에 따라 랜덤 프라임드 디엔에이 라벨링 키트(Random Primed DNA Labeling Kit)(미국 인디애나 인디애나폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임에서 구입)를 사용하여 클로닝된 랫 GDNFR cDNA 를 표지하였다. 랫, 마우스 및 인체 조직 RNA 블롯(미국 캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크에서 구입)을 프로브와 혼성화하고 제조자의 지시에 따라 익스프레스하이브 키트(ExpressHyb Kit)(클론테크) 시약을 사용하여 세척하였다.
성숙한 랫, 마우스 및 인체 조직으로 부터 제조한 조직 노던 블롯은 GDNFR mRNA 가 간, 뇌 및 신장에서 가장 높게 발현된다는 것을 나타냈다. 페에서도 높은 mRNA 발현이 검출되었고, 비장, 장, 고환 및 골격근에서는 그 보다 낮게 검출되거나 검출되지 않았다. 마우스 태아에서 분리한 mRNA 로 부터 제조한 블롯에 있어, 발현은 태아 7 일 째에 검출불가능했으나, E11 일 째에는 가시화되었고, E17 일 까지는 매우 높았다. GDNFR mRNA 는 성인 뇌의 몇몇 아부분에서 분리한 조직에서 비교적 동등한 수준으로 발현되었다. 성인 뇌에서의 GDNFR mRNA 발현은 어떤 특정 부위에 대한 특이성을 거의 나타내지 않았다.
대부분 조직에서는 크기가 다른 두 개의 전사물이 존재했다. 마우스 및 인체 조직에서 8.5 및 4.4 kb 의 전사물이 발견된 반면에 랫 조직에서의 전사물은 8.5 및 3.6 kb 이었다. 더 큰 전사물과 더 작은 전사물의 상대량은 조직 유형에 따라 변하는데, 더 작은 전사물은 간 및 신장에서 우세하고 더 큰 전사물은 뇌에서 더 풍부하다. pBKRSV 벡터내 GDNFR cDNA 로 형질감염시킨 293T 세포에 대한 GDNF 의 결합은 스캐차드 분석으로 조사하였다. 두 종류의 결합부위가 검출되었는데, 하나는 낮은 피코몰 범위의 결합 친화성을 갖고 다른 하나는 약 500 pM 의 친화성을 갖는다.
실시예 6
재조합 인체 GDNFR
프로브로서 실시예 1 의 랫 GDNFR cDNA 클론을 사용하여 박테리오파지 gt 10 내에 클로닝된 성인 흑질 cDNA 라이브러리(5' - 신장 + cDNA 라이브러리, 미국 캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크에서 구입)를 선별하였다. 제조자의 지시에 따라 랜덤 프라임드 디엔에이 라벨링 키트(미국 인디애나 인디애나폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임에서 구입)를 사용하여 [32P] - dNTPs 로 상기 프로브를 표지하였다. 인체 흑질 cDNA 라이브러리로 부터 약 1.2 × 106gt 10 파지를 15 cm 아가로스 평판에 평판화시키고 이중 니트로셀룰로스 필터에 복제하였다. 그런 다음 필터를 방사능 표지한 프로브와 혼성화함으로써 선별하였다. 필터를 55 ℃ 에서 3.5 시간 동안 200 mL 의 6 × SSC, 1 × 덴하르츠, 0.5 % SDS, 50 μg/mL 연어 정자 DNA 와 예비 혼성화하였다. 2 × 108cpm 의 방사능표지 프로브를 첨가한 후에 18 시간 동안 계속 혼성화하였다. 0.5 × SSC, 0.1 % SDS 각각으로 55 ℃ 에서 30 분간 필터를 2 회 세척하고 증감 스크린(intensifying screen)과 함께 밤새 X - 선 필름에 노출시켰다.
플라크의 cDNA 삽입물이 인체 GDNFR cDNA 의 일부를 나타낸 다섯 개의 양성 플라크를 분리하였다. 도 3 에 도시한 랫의 핵산 서열과 비교하여(bp 0 내지 2140), 상기 5 개의 인체 GDNFR 클론이 다음의 서열을 함유한다는 것을 발견하였다 :
도 5 에 도시한 바와 같이, 상기 서열을 정렬하고 비교하여 인체 GDNFR 에 대한 칸센서스 서열을 제공하였다. 인체 cDNA 서열에 의해 예상된 번역 산물은 465 아미노산으로 구성되며 랫 GDNFR 과 93 % 동일하다.
전체 길이의 GDNFR 을 코딩하는 인체 cDNA 를 생성시키기 위해, 클론 21B 와 2 의 일부를 내부 BglⅡ 부위에서 서로 결합시켜 포유동물 발현 벡터 pBKRSV(미국 캘리포니아 라 졸라에 소재하는 스트라타진에서 수득) 내에 서브클로닝하였다.
재조합 인체 GDNFR 발현 벡터는 포유동물 세포에서 발현되도록 제조할 수 있다. 상기한 바와 같이, 발현은 비 - 포유동물 세포, 이를테면 박테리아 세포에서도 일어날 수 있다. 본원에 기술한 핵산서열을, 상업적으로 유용한 인체 태아 신장 세포주, '293' 을 포함하는,포유동물 세포내 발현용으로 상업적으로 유용한 포유동물 벡터(예를들어, CEP4, 인비트로겐에서 수득) 내로 위치시킬 수 있다. 박테리아 세포내 발현을 위해서는 리더 서열(예를들어, 도 1 의 핵산 1 - 590)을 코딩하는 부분은 전형적으로 삭제될 것이다. 박테리아 발현을 위해 N - 말단에 부가 메티오닐을 부가시킬 수 있다. 또한, 천연 리더 서열을 다른 리더 서열로, 또는 발현을 용이하게 하기 위한 그외 절단용 서열로 치환할 수 있다.
실시예 7
가용성 GDNFR 구성
가용성 인체 GDNFR 단백질 산물을 제조하였다. 다음의 실례는 단지 카르복시 말단이 상이한 4 개의 다른 형태를 제공하는데, 도 2 에 나타낸 바와같이 번호매긴 잔기로 표시되어 있다. 두 개는, 소수성 꼬리의 바로 상류 및 마지막 시스테인 잔기의 하류로 서로 다른 지점이 절단된 가용성 형태이다. 다른 두 개는 동일한 절단형태지만 'FLAG' 서열, 즉 상업적 항체로 유용한 옥타펩티드(이스트만 코닥)가 부가되어 있다. FLAG 서열은 H2N - DYKDDDDK - COOH 이다.
방법
인체 GDNFR 의 전체 코딩 부위를 거의 함유하는 람다 파지 클론 #21 을 EcoRI 으로 절단하여 cDNA 삽입물을 삭제하였다. 이 단편을 정제하고, 클론 21 - B - 3/pBKRSV 를 생성시키기 위해 EcoRI 절단 pBKRSV 벡터(미국 캘리포니아 라 졸라에 소재하는 스트라타진에서 수득)내에 결합시켰다. 주형으로서 인체 GDNFR 클론 21 - B -3/pBKRSV 와 함께 하기에 나타낸 프라이머 1 및 2 를 PCR 반응에 사용하였다. PCR 조건은 94 ℃, 5 분, 이어서 94 ℃, 1 분으로 25 순환 ; 55 ℃, 1 분 ; 72 ℃, 2 분 및 최종 연장으로 72 ℃ 에서 5 분이었다. 이 PCR 반응으로, 프라이머 2 에 의해 제공되는 종결 코돈과 HindⅢ 제한 부위가 부가된 인체 GDNFR 클론의 누클레오티드 1265 - 1868 로 이루어진 단편이 생성되었다. 이 단편을 제한 효소 HindⅢ(프라이머 2 에 함유)와 BglⅡ(인체 GDNFR 의 위치 1304)로 절단하여, 그 결과 생성된 572 누클레오티드 단편을 겔 전기영동으로써 분리하였다. 이 단편은 이소로이신 - 255 내지 글리신 - 443 이 hGDNFR - 코딩부위를 함유했다. 프라이머 1 및 3 을 가지고 유사한 전략을 행한 결과 이소로이신 - 255 내지 프롤린 - 446 을 코딩하는 BglⅡ 및 HindⅢ 말단을 갖는 단편이 생성되었다. 프라이머 1 및 3 과 동일한 hGDNFR 부위를 코딩하지만, 플래그(Flag) 펩티드 코딩 서열(뉴 해븐에 소재하는 아이비아이/코닥에서 수득)이 부가된 단편이 생성되도록 프라이머 4 및 5 를 고안하였다. 플래그 펩티드 서열은 8 개의 아미노산(H2N - Asp - Tyr - Lys - Asp - Asp - Asp - Asp - Lys - COOH)으로 구성되며 그 항체는 상업적으로 유용하다. 상기한 바와 동일한 주형과 함께 프라이머 1 및 4 또는 1 및 5 를 PCR 반응에 사용하고, 상기한 바와 같이 HindⅢ 및 BalⅡ 로 절단하였다. 이러한 과정에 의해, 이소로이신 - 255 내지 글리신 - 443 및 이소로이신 - 255 내지 프롤린 - 446 을 코딩하지만, 그 카르복시 말단에 플래그 펩티드가 부가된 단편이 생성되었다.
프라이머
상기한 바와 같이 생성된 네 단편 모두를 21B3/pBKRSV(미국 캘리포니아 라 졸라에 소재하는 스트라타진에서 구입)내에 뒤로 옮겼다. 21B3/pBKRSV 클론을 BglⅡ 및 HindⅢ 로 절단하고, 송아지 장 알칼리 포스파타제(CIAP)로 처리하였다. 그 벡터와 BglⅡ 부위까지의 인체 GDNFR 코딩 부위를 함유하는 큰 단편을 겔 정제하고 겔로부터 추출하였다. 상기한 바와 같이 생성된 4 개의 BglⅡ/HindⅢ 단편 각각을 이 벡터에 결합시켜 결과적으로 다음의 pBKRSV 벡터내 구성물을 생성하였다 :
모든 클론의 정확한 구성은 DNA 서열결정함으로써 확인하였다. 하기한 바와 같이 pBKRSV 폴리링커 서열에 존재하는 효소 부위를 사용하여 pBKRSV 클론의 삽입물을 다른 발현벡터로 옮겼다. 또한 가용성 GDNFRs(예를들어, sGDNFR/글리 및 sGDNFR/프로)도 일시적 발현을 위한 벡터 및 안정한 CHO 세포내 발현을 위한 pDSR - 2 내로 옮겼다.
pDSRα2 + PL 클론 :
적당한 pBKRSV 클론을 XbaI 및 SalI 으로 절단한다. 삽입물을 상기와 동일한 효소로 절단한 pDSRα2 + PL 에 결합시키고 CIAP 로 처리한다. 이 구성물은 CHO 세포내에서 GDNFR 을 안정하게 발현시키는 데 사용될 수 있다.
pCEP4 클론 :
적당한 pBKRSV 클론을 SpeI 및 XhoI 으로 절단한다. 이 삽입물을 NheI(SpeI 말단) 및 XhoI 으로 절단한 pCEP4(미국 캘리포니아 샌디에고에 소재하는 인비트로겐에서 수득)와 결합시키고, CIAP 로 처리한다. 이 구성물은 GDNFR 의 일시적 발현을 위해 사용될 수 있다.
본원에서 참고문헌으로 인용한, 1990년 3 월 29 일자 제출한 공동 - 소유, 공동계류중인 미국 특허 출원 번호 제 501,904 호[또한 1990년 5월 18 일자 제출한 유럽 특허 출원 번호 제 90305433 호, 공개 번호 제 EP 398 753 호 및 제 WO 90/14363 호(1990) 참조]에 기술되어 있는 방법에서와 같이 다음의 여섯 개 DNA 단편[(a) - (f)]을 다단계 서브클로닝에 의해 최종적으로 결합시킴으로써 플라스미드 구성물 pDSR - 2 를 실질적으로 제조하되, GDNFR 유사체를 코딩하는 다양한 핵산서열이 사용될 수 있다는 것을 본 분야의 숙련된 기술자들은 이해할 것이다 :
(a) SV40 시발 프로모터/인핸서 및 복제 기원 ; PvuII(SV40 누클레오티드 개열지도 위치 # 272)와HindIII(개열지도 위치 # 5172) 부위 사이의 SV40 서열로 구성됨[DNA Tumor Viruses,J. Tooze, ed., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1981), pp. 801 - 804].
(b) 인체 T - 세포 백혈병 바이러스 제 I 형(HTLV - I)의 긴 말단 반복체(LTR)의 'U5' 서열의 부분 및 'R1' 요소를 함유하는 267 bp 단편. 이 단편은 'R1' 의 정확한 5' 말단(위치 354) 내지 U5 서열내 Sau3A 부위(위치 620)에서 지도화된다[Seiki 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA80, 3618 - 3622(1983)].
(c) SV40 16S, 19S 접합 공여체/수용체 시그널로 구성된 단편(BamHI 링커에 의해 결합된 개열지도 위치 # 502 - 560 및 # 1410 - 1498).
(d) 2.4 kb 의 SalI 내지 BamHI 단편에 존재하는 전사 종결/폴리아데닐레이션 시그널. 이 단편은 소의 하수체 당단백질 호르몬 A - FSH(난포자극호르몬) 소단위체의 31 부분으로 부터 획득하였다. 마지막 엑손의 개시 지점에서의 BstXI 부위를 SalI 부위로 돌연변이시켰다. 이 단편의 3' 말단은 가장 가까운 하류 BamHI 부위로 연장되었다. 이 2.4 kb 단편을 pUC 벡터내로 서브클로닝한 다음 발현 벡터를 더 구성하기 위해 SalI 내지 SmaI 단편으로서 회수하였다.
(e) 내인성 마우스 DHFR 프로모터, cDNA 코딩서열, 및 2.5 kb 의 EcoRI 내지 HindIII 단편으로서 DHFR 전사 종결/폴리아데닐레이션 시그널 모두를 함유하는, 플라스미드 pMg1 로 부터 초기에 회수한 마우스 디하이드로 폴레이트 환원효소(DHFR) 미니유전자. 말단 제한 엔도누클레아제 부위 둘다, 즉 5' EcoRI 과 3' HindIII 는 발현벡터 구성시 파괴되었다. 상기 플라스미드 pMg1 은 Gasser 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA79, 6522 - 6526(1982) 문헌에 기술되어 있는 바와 같이, pDHFR11(1600 - 염기쌍의 마우스 DHFR cDNA 클론)의 190 - 염기쌍 TaqI 및 1.3 kb 의 TaqI - PstI 단편에 pDR34(마우스 DHFR 유전자의 5' 말단에서 수득한 인접 게놈 클론)의 1.0 - kb EcoRI - TaqI 5' 말단을 결합시킴으로써 구성하였다. 이러한 결합산물을 pBR322 의 EcoRI - PstI 긴 단편내로 삽입하고 결과적으로 생성된 테트라사이클린 - 내성 콜로니의 플라스미드 지도화로 TaqI 소단편의 방향을 결정하여, 센스 방향의 단편을 수반하는 클론을 pMg1 이라 명명하였다.
(f)HindII부위(개열지도 위치 # 2448)에서 EcoRI 부위(개열지도 위치 # 4362)까지 연장되며 암피실린 내성 표지유전자 및 E. coli 내 상기 플라스미드의 복제기원을 함유하는 '무독성' pBR322 서열.
다른 구성물은 pDSRα2 로서, 주요한 다음 세가지를 변형시킨 플라스미드 pCD(Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3 : 280 - 289, 1983 참조)의 유도체이다 : (ⅰ) SV40 폴리아데닐화 시그널을 소 난포자극호르몬의 α - 소단위체, α - bFSH(Goodwin 등의 Nucleic Acids Res. 11 : 6873 - 6882, 1983 참조)로 부터의 시그널과 대체하였다 ; (ⅱ) 마우스의 디하이드로 폴레이트 환원효소 미니유전자(Minigene)(Gasser 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. 79 : 6522 - 6526, 1982 참조)를 발현 카세트 하류에 삽입하여 형질전환체가 선택되고 증폭되도록 하였다 ; 및 (ⅲ) 인체 T - 세포 백혈병 바이러스 제 I 형(HTLV - I)의 긴 말단 반복체(LTR)의 'U5' 서열의 부분 및 'R - 요소' 를 함유하는 267 bp 단편을 클로닝하고 SV40 프로모터와 이미 기술되어 있는 바와 같은 접합 시그널(Takebe 등의 Mol. Cell Biol. 8 : 466 - 472, 1988 참조) 사이에 삽입하였다.
상기 플라스미드 pCD 는 Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3 : 280 - 289, 1983 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 다음 세 단편을 T4 DNA 리가제와 함께 결합시킴으로써 제조할 수 있다 : pBR322 ori 및 AmpR을 함유하는, pCDV1(미국 위스콘신 53205 매킨리 애비뉴 1037 에 소재하는 피 - 엘 바이오케미컬스 인코포레이티드에서 수득)으로 부터의 큰 HindII - BamHI 단편, SV40 시발 부위 프로모터 및 후기 부위 인트론을 함유하는, pL1(미국 위스콘신 53205 매킨리 애비뉴 1037 에 소재하는 피 - 엘 바이오케미컬스 인코포레이티드에서 수득)으로 부터의 HindII - PstI 단편, 및 전체 DHFR 단백질 코딩 서열(dhfr cDNA)을 함유하는 PstI - BglII 단편이나 아니면 전체 길이의 α - 글로빈 cDNA 분절을 함유하는 PstI - BamHI 단편.
CHO 세포내 GDNFR 의 발현은 세포 표면에 대한 요오드화 GDNF 의 결합에 따라 변하였다. 상기한 바와 같이, 재조합적으로 발현된 가용성 GDNFR 단백질 산물은 GDNF 의 활성도나 세포 특이성을 강화시키는 데 사용될 수 있다. 또한 검출가능한 표지가 부착된 가용성 GDNFR 도 상기한 바와 같은 진단상 적용에 사용될 수 있다.
실시예 8
GDNF 와 GDNFR 의 화학 교차결합
결합 특성 및 분자 특성을 연구하기 위해, 랫 cDNA 클론을 형질감염시킴으로써 293T 세포 표면에 GDNFR 을 일시적으로 발현시켰다. 293T 세포의 형질감염은 제조자의 지시에 따라 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 시스템(미국 매릴랜드 게이더스버그에 소재하는 집코/비알엘에서 구입)을 사용하여 수행하였다. 감염 2 일 후, 2 × 버신(versine) 처리하여 세포를 제거하고, 세척 완충액으로 1 회 세척한 다음 2 × 106세포/mL 밀도로 세척 완충액에 재현탁하였다. [125I]GDNF 결합전에 0.5 u/mL PI - PLC 와 함께 세포 2 중 세트를 37 ℃ 에서 30 분간 배양하였다. 얼음같이 찬 결합 완충액으로 이들 세포를 3 회 세척한 다음 4 ℃ 에서4 시간 동안 다른 세포와 함께 1 - 3 nM 의 [125I]GDNF 와 배양하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 4 회 세척하고, 1 mM 의 교차결합용 비스 수버레이트(Bis suberate)(BS3, 미국 일리노이 록포드에 소재하는 피어스에서 구입)를 보충한 세척 완충액에 재현탁하고 실온에서 30 분간 배양하였다. TBS 로 3 회 세척한 다음 이중 군 시료를 37 ℃ 에서 30 분간 0.5 u/mL 의 PI - PLC 로 처리하였다. 이들 세포를 펠릿화하고 상청액을 모았다. 그런다음 세척 완충액으로 세포를 세척하고 2 × SDS - PAGE 시료 완충액과 다른 모든 세포와 함께 용균시켰다. 세포 용균물과 수집한 상청액을 7.5 % SDS - PAGE 에서 분해시켰다.
세포 현탁액을 1.5 × 105 세포/시료를 함유하는 분취량으로 나누었다. 그런 다음 세포를 펠릿화하고 500 nM 의 비표지 GDNF 의 존재 또는 부재하 4 ℃ 에서 4 시간 동안 다양한 농도의 [125I]GDNF 와 함께 서서히 교반하면서 배양하였다. 얼음같이 찬 세척완충액으로 세포를 4 회 세척하고 0.5 mL 세척완충액에 재현탁하였다. 현탁액의 0.2 mL 분취량 두 개를 감마 계수기로 계수하여 세포와 결합한 [125I]GDNF 의 양을 측정하였다.
모조물로 형질감염시킨 293T 세포가 어떠한 GDNF 결합 능력도 나타내지 않았으나, GDNFR 로 형질감염시킨 세포는 피코몰 농도에서 조차 [125I]GDNF 와 강하게 결합하였다. 이 결합은 500 nM 의 비표지 GDNF 에 의해 완전히 저해되었는데, 이것은 천연 GDNF 가 발현된 수용체에 대해 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다.
293T 세포에 의해 발현된 GDNFR 을, 포스파티딜이노시톨 - 특이 포스포리파제 C(PI - PLC, 미국 인디애나 인디애나폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임에서 구입)로 처리함으로써 세포로 부터 유리시킬 수 있다. 리간드 결합전 PI - PLC 로 형질감염된 세포를 처리하면 그 세포의 GDNF 결합 능력은 완전히 제거되었다. 부가적으로, 교차결합 후 형질감염 세포를 처리하면 다량의 교차결합 산물이 배지내로 유리되었다. 이 결과는 GDNFR 이 GPI 결합을 통해 세포막에 고정된다는 것을 강하게 암시한다.
교차결합 데이터는 GDNFR 의 분자량이 약 50 - 65 kD 이라는 것을 더 나타내는데, 이것은 저수준의 글리코실화가 존재함을 암시하는 것이다. 대부분의 교차결합종이 수용체의 단량체와 일치하는 분자량을 가질지라도, 대략 이량체에 대한 예상 분자량을 갖는 소수의 종이 발견되었다.
실시예 9
GDNF 시그널링은 GDNFR 과 Ret 수용체 단백질 티로신 키나제의 복합체에 의해 매개됨
서 론
표적화된 GDNF 유전자의 널 돌연변이(null mutation)을 지닌 마우스는 신경릉 세포로 부터 유도된 조직, 자율 신경계 및 삼차신경원과 척수 운동성 신경원에서 다양한 결손을 나타낸다. 신장 부재 및 소화관에서 소장 신경원의 완전한 결핍이 가장 심각한 결손이다. GDNF 녹아웃 마우스의 표현형은 c - ret 녹아웃 동물(Schuchardt 등의 1994)의 표현형과 놀랍도록 유사한데, 이것은 GDNF 의 시그널 트랜스덕션 경로와 c - ret 간의 가능한 결합을 암시하는 것이다.
유전자 전이 실험(Takahashi 등의 Cell. 42, 581 - 588,5 ; Takahashi and Cooper, Mol. Cell. Biol., 7, 1378 - 1385, 1987 참조)에서 분리한 종양유전자로 부터 유도된 프로브를 사용하여 원종양유전자 c - ret을 확인하였다. c - ret cDNA 를 서열분석한 결과 새로운 수용체 단백질 티로신 키나제(PTK)를 코딩하는 큰 오픈 리딩 프레임이 나타났다.수용체 PTKs 군은 세포내 키나제 도메인(van der Geer 등의 1994 참조) 내의 서열 상동성 및 세포외 도메인 구조에 따라 아군들로 분류되어 있다. Ret 의 독특한 세포외 도메인 구조는 어떠한 다른 공지된 수용체 PTK 아군 외부로 그것을 위치시키는 데, 그것은 시그널 펩티드, 캐드헤린 - 유사 모티프 및 시스테인 - 풍부 부위를 포함한다(van heyningen, Nature, 367, 319 - 320, 1994 ; Iwamoto 등의 1993 참조). 정상 소재의 혼성화 및 면역조직화학 분석은, 마우스 태아의 중추 발달 및 말초 신경계 및 배출계에 있어 ret mRNA 와 단백질이 고수준으로 발현한다는 것을 나타냈는데(Pachnis 등의 1993 ; Tsuzuki 등의 Oncogene, 10, 191 - 198, 1995 참조), 이것은 이들 조직의 발달면에서나 아니면 기능면에서 Ret 수용체의 역할을 암시하는 것이다. Ret 수용체의 기능상 리간드가 확인되지 않았으므로, Ret 시그널화의 분자기전을 더 이해하는 것은 제한된다. c - ret 유전자의 돌연변이는 가족성 수질 갑상선암(FMTC)과 다중 내분비성 종양형성 제 2A 형(MEN2A) 및 제 2B 형(MEN2B)의 암에 대한 유전소인과 관계가 있다. 이들 질병은 아마 Ret 키나제를 구조적으로 활성화시키는 돌연변이의 '기능 획득' 에 의해 유발될 것이다(Donis - Keller 등의 Hum. Molec. Genet. 2, 851 - 856, 1993 ; Hofstra 등의 nature. 367, 375 - 376, 1994 ; Mulligan 등의 Nature. 363, 458 - 460, 1993 ; Santoro 등의 Science. 267, 381 - 383, 1995 참조). 그것들은 신경릉에서 유도된 조직의 특이적 악성종양에 대한 소인을 제공하는데, 여기서ret 은 초기 발생시 정상적으로 발현된다. 다른 ret - 관련 유전자 질병인 히르쉬스프룽병(HSCR)은 하부 장관에 부교감 신경성 신경지배가 선천적으로 없다는 것이 그 특징이다(Edery 등의, Nature, 367, 378 - 438, 1994 ; Romeo 등의, 1994 참조). 가장 그럴듯한 HSCR 의 원인은 키나제 도메인이 결여되어 있는 절단된 Ret 단백질 생산을 초래하는 무의미 돌연변이 또는 Ret 키나제를 불활성화시키는 과오돌연변이이다. 상기한 바와 같이 마우스의 c - ret 원종양유전자의 표적 파괴로 인해 신장 무발육이나 심한 발육이상이 초래되며 소화관 전체에 소장 신경원이 결여된다(Schuchardt 등의 1994 참조). 이 표현형은 GDNF 녹아웃 마우스의 표현형과 아주 유사하다. 이와함께, 이들 데이터는 Ret 과 GDNF 둘 다 신장 및 소장 신경계 발생에 결정적인 시그널 트랜스덕션 경로와 관련되어 있음을 암시한다. 그러나 Ret 과 GDNF 가 어떻게 관련되어 있는지 알지 못했다.
상기한 바와 같이, 발현 클로닝에 의한 GDNFR cDNA 의 분리 및 특정화는 형질전환된 인체 태아 신장 세포주 293T 에서 GDNFR 의 발현을 초래한다. 형질전환으로 인해 고(약 2 pM 의 kd) 및 저(약 200 pM 의 kd) 친화성 결합부위가 나타났다. 고친화성 결합부위는 GDNFR 단독의 동종이량체나 동종 - 올리고머, 또는 다른 분자를 수반한 GDNFR 의 이종이량체나 이종 - 올리고머로 구성될 수 있다. 상기한 바와 같이,GDNFR 은 세포질 도메인이 결여되어 있으므로 GDNF 시그널 트랜스덕션에서의 역할을 하기 위해 하나 또는 그 이상의 보조 분자를 통해 기능해야 한다. 이 연구에서, 우리는 GDNFR 의 존재하에서 GDNF 는 Ret 단백질 티로신 키나제 수용체와 결합하고, 신속히 Ret 자가인산화를 유도한다는 것을 확인하였다.
결과
GDNFR 을 발현하는 뉴로 - 2a 세포는 고친화성 GDNF 와 결합함
뉴로 - 2a(Neuro - 2a)는 고수준의 Ret 단백질(Ikeda 등의 Oncogene. 5, 1291 - 1296, 1990 ; Iwamoto 등의 Oncogene. 8, 1087 - 1091, 1993 ; Takahashi and Cooper, 1987 참조)을 내생적으로 발현하지만 노던 블롯에 의해 판단된 바와 같은 GDNFR mRNA 의 검출가능한 수준은 발현하지 않는 마우스 신경아세포종 세포주이다. GDNFR 의 존재하에서 Ret 이 GDNF 와 결합할 수 있는 경우를 결정하기 위해, GDNFR 을 발현하도록 유전자 조작한 뉴로 - 2a 세포에 [125I]GDNF 가 결합하는지를 조사하는 연구를 수행하였다. 랫 GDNFR cDNA 를 함유하는 포유동물 발현벡터(이를테면 상기한 발현 플라스미드)로 뉴로 - 2a 세포를 형질감염시켰다. 이세 클론주, NGR - 16, NGR - 33 및 NGR - 38 을 [125I]GDNF 와 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 배양이 끝나면 비결합 [125I]GDNF 를 제거하고 상기 세포와 관련된 방사능량을 하기 실험 과정에 기술된 바와 같이 측정하였다. 세 클론주 모두 [125I]GDNF 와 특이적으로 결합할 수 있으나 모(parantal)뉴로 - 2a 세포는 [125I]GDNF 결합을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않았다(도 6). 500 nM 의 비표지 GDNF 를 첨가함으로써 결합은 효과적으로 경쟁될 수 있었다. 이 결과는 뉴로 - 2a 세포상에 발현되는 Ret 수용체가 GDNFR 의 부재시 GDNF 와 발현할 수 없다는 것을 입증하는데, 이것은 GDNFR 이 뉴로 - 2a 세포에서 인지가능 한 수준으로 발현되지 않는다는 이전의 관찰과 일치한다.
광범위한 범위의 리간드 농도(500 nM 의 비표지 GDNF 의 존재 또는 부재하에서 0.5 pM 내지 1 nM 의 [125I]GDNF)에서 NGR - 38 세포에 대한 [125I]GDNF 의 평형결합을 조사하였다(도 7A 참조). 배양후 비결합 [125I]GDNF 를 제거하고 실험 과정에 기술된 바와 같이 상기 세포와 관련된 방사능을 측정하였다. 결과는 도 7 에 도시되어 있다 : (A) 비표지 GDNF 의 존재(개방원 및 개방사각형) 또는 부재(채워진 원 및 채워진사각형)시 NGR - 38 세포(원) 및 뉴로 - 2a 세포(사각형)에 대한 [125I]GDNF 의 평형결합 ; (B) NGR - 38 세포에 대한 [125I]GDNF 결합의 스케차드 분석. 뉴로 - 2a 세포는 1 nM [125I]GDNF 의 농도에서 조차 거의 결합을 나타내지 않았는데, 이 결합은 과량의 비표지 GDNF 첨가에 의해 영향받지 않았다. NGR - 38 세포에 대한 결합은 도 7B 에 나타낸 바와 같이 스케차드 플롯으로 분석하였다. 두 종류의 결합부위가 검출되었는데, 하나는 kd= 1.5 ± 0.5 pM 을 갖고 다른 하나는 kd= 332 ± 53 pM 을 갖는다. 이들 해리 상수는 상기한 바와 같이, GDNFR 을 일시적으로 발현하는 293T 세포의 고친화성 및 저친화성 결합부위에 대해 수득한 값과 매우 유사하다.
GDNF 는 GDNFR 을 발현하는 뉴로 - 2a 세포에서 Ret 과 결합함
Ret 수용체 PTK 가 GDNFR 을 발현하는 세포에서 GDNF 와 결합할 수 있는지 결정하기 위해, NGR - 38 및 모뉴로 - 2a 세포를 사용하여 교차결합실험을 행하였다. NGR - 38 세포를 [125I]GDNF 와 배양하고, 교차결합제로 처리한 다음 SDS - PAGE 시료 완충액에 직접 용균시키거나 아니면 트리톤 X - 100 용균 완충액에 용균시켜서 실험 과정에 기술된 바와 같이항 - Ret 항체로 더 면역침전시켰다. 메르캅토에탄올의 부재(NR) 또는 존재(R)하에서 SDS - PAGE 로 면역침전물을 분석하였다. Ret 특이 항체로 용균물을 처리하고, 면역침전한 다음 환원조건하에서 SDS - PAGE 로 분석하였다(도 8 참조, 밴드는 다음과 같이 표시되어 있다 : ~ 75 kD, 채워진 삼각형 ; ~ 150 kD, 개방 삼각형 ; ~ 185 kD, 채워진 화살표 ; ~ 250 kD, 별표 ; ~ 400 kD, 개방 화살표). 가장 눈에 띄는 교차결합종이 ~ 75 kD 및 ~ 185 kD 임에도 불구하고, ~ 150 kD 과 ~ 250 kD 의 밴드는 덜 강하다. 가장 흐린 밴드인 ~ 400 kD 또한 가시화되었다(도 8, 레인 2). 면역침전물을 비환원 SDS - PAGE 로 분석했을 때, ~ 75 kD, ~ 150 및 ~ 185 kD 밴드는 환원 겔에서와 대략 동일한 세기로 존재했지만, ~ 400 kD 밴드의 양은 극적으로 증가했다(도 8, 레인 4). 또한 보다 더 뚜렷해진 것은 ~ 250 kD 밴드였다.
환원조건과 비환원조건 둘 다에서, NGR - 38 대신에 모(parental) 뉴로 - 2a 세포를 사용했을 때 매우 환원된 세기를 갖는 밴드가 아니라 비슷한 분자량을 갖는 밴드가 관찰되었다(도 8, 레인 1 및 3). Ret 을 발현하지 않는 293T 세포에서 교차결합에 의해 동일한 분자량을 갖는 종이 생산되므로, ~ 75 kD 및 ~ 150 kD 종이 GDNF 와 GDNFR 의 교차결합 복합체를 나타낼 것 같다. 게다가, Ret 의 분자량이 170 kD 이므로, Ret 을 포함하는 어떠한 복합체도 최소한 이 크기일 것이다.
이들 복합체가 항 - Ret 항체에 의해 면역침전된다는 사실은 그 복합체가 겔 분석 조건하에서 붕괴된 GDNF/GDNFR 복합체와 Ret 간의 결합산물이라는 것을 나타내는 것이다. 아마 ~ 185 kD 의 폭 넓은 밴드는, 일부 이량체 GDNF 가 포함될 수 있을지라도 단량체 재조합 GDNF 한 분자(15 kD)와 교차결합된 Ret 한 분자(170 kD)로 구성될 것이다. 비표지 GDNF 를 NGR - 38 세포와 교차결합시키고 그 산물을 항 - Ret 항체를 수반하는 웨스턴 블롯으로 조사했을 때 동일한 분자량을 갖는 밴드가 관찰된 개별 실험에 의해 상기 종에 Ret 가 존재한다는 것을 확인하였다(데이터는 나타내지 않았음).
~ 400 kD 밴드는 확실히 확인되지 않았는데, 어느 정도는 그 분자량을 추정하는데 어려움이 있기 때문이다. 그것이 단지 비환원 조건하에서만 두드러진다는 사실은 그것이 환원 조건하에서 관찰된 종 중 하나 또는 그 이상의 이황화물 - 결합 이량체임을 나타내는 것이다. 가장 그럴듯한 설명은, 그것이 두 개의 Ret, 하나 또는 둘의 GDNFR 및 하나 또는 둘의 GDNF 분자로 구성된 고분자량 복합체의 혼합물일 수 있으나, 그것은 185 kD 종의 이량체를 나타낸다는 것이다. ~ 250 kD 밴드의 정확한 동일성은 아직 결정되지 않았다. 한 가능성은 그것이 ~ 75 kD(GDNF + GDNFR)의 교차결합 이종이량체 및 ~ 185 kD(GDNF + Ret) 복합체를 나타낸다는 것이다.
GDNF 는 GDNFR 을 발현하는 뉴로 - 2a 세포에서 Ret 의 자가인산화를 자극한다
GDNFR 의 존재하에서 GDNF 와 결합하는 Ret 단백질 티로신 키나제 수용체의 능력은 Ret 자가인산화에 관한 GDNF 자극 연구를 이끌어 냈다. NGR - 38 세포를 GDNF 로 처리하고 용균한 다음 용균물을 항 - Ret 항체로 면역침전하였다. 실험 과정에 기술된 바와 같이 항 - 포스포티로신 항체를 사용하여 웨스턴 블롯함으로써 면역침전물을 분석하였다. 포유동물(CHO 세포 ; 도 9A, 레인 4)이나 아니면 E. coli 세포(도 9A, 레인 1, 3)에서 생산된 정제한 재조합 GDNF 로 NGR - 38 세포(도 9A, 레인 2 - 4)를 처리했을 때, 170 kD 에서 강한 밴드가 관찰되었는 데, 이것은 성숙한 형태의 Ret 상에서 티로신 잔기가 자가인산화됨을 나타내는 것이다. 훨씬 더 약한 상응 밴드가 GDNF - 처리 뉴로 - 2a 세포에서 관찰되었다(도 9A, 레인 1). 택일적으로 글리코실화된 150 kD 의 Ret 전구체 형태에서는 어떤 인산화도 관찰되지 않았다(도 9A). GDNF 에 의한 Ret 자가인산화 유도는 투여량 의존성이었다. 투여량 반응 및 NGR - 38 세포에서 GDNF 유래의 Ret 티로신 인산화의 동력학은 패널 B 및 C 에 나타나 있다. 모든 패널에 있어, 티로신 인산화된 170 kD Ret 밴드는 채워진 화살표로 표시되어 있다. 항 - Ret 항체(샌터 크루즈, C - 19, 카탈로그 번호 제 SC - 167 호)를 수반한 면역블롯을 재탐침시킴으로써측정된 바와 같은 각 레인에 부하된 Ret 단백질의 양은 패널 A 의 우측에 표시되어 있다. ~ 150 kD 에서의 밴드는 자가인산화하지 않는 택일적으로 글리코실화된 미성숙 형태의 Ret 을 나타낸다. 도 9B 에 나타낸 바와 같이, NGR - 38 세포에서 Ret 자가인산화의 자극은 50 pg/mL 의 GDNF 로 검출될 수 있었고 반응은 20 - 50 ng/mL GDNF 에서 포화되었다. 처리후 0 - 20 분의 시간 동안 NGR - 38 세포의 정제된 재조합 GDNF 에 의한 Ret 자가인산화 자극은 도 9C 에 나타나 있다. Ret 자가인산화의 증가된 수준은 GDNF 처리 1 분 이내에 관찰될 수 있었고 처리후 10 분째에 최대였다(도 9C).
GDNF 및 가용성 GDNFR 은 뉴로 - 2A 세포의 Ret 자가인산화를 유도한다.
상기한 바와 같이, GDNFR 은 GPI 결합을 통해 세포질막에 고정되고 포스파티딜이노시톨 - 특이 포스포리파제 C(PI - PLC)로 처리함으로써 유리될 수 있다. NGR - 38 세포를 PI - PLC 와 함께 배양하면, 이들 세포에서 Ret 의 GDNF - 유래 수용체 자가인산화는 소멸되었다[도 10A ; PI - PLC 로 처리하거나(레인 1) 처리하지 않은(레인 2 및 3) NGR - 38 세포를 GDNF 와 함께(레인 1 및 3) 또는 GDNF 없이(레인 2) 배양하고 실험 과정에 기술된 바와 같이 면역블로팅함으로써 Ret 자가인산화에 대해 분석하였다].
도 10B 는, 실험 과정에 기술된 바와 같이 면역블로팅함으로써 Ret 자가인산화에 대해 분석한 바와 같이, 뉴로 - 2a 또는 NGR - 38 세포로부터 수득한 PI - PLC/CM 의 존재(레인 5 - 8) 또는 부재(레인 1 - 4)시 GDNF 로 처리하거나(레인 2, 4, 6, 8) GDNF 없이 처리한(레인 1, 3, 5, 7) 모뉴로 - 2a 세포를 도시한 것이다. GDNF 로 처리한 NGR - 38 세포는 양성 대조로서 사용하였다. 패널 A 와 B 둘 다에 있어, 자가인산화된 170 kD Ret 밴드는 채워진 화살표로서 표시하였다. NGR - 38 세포를 PI - PLC 처리함으로써 유리된 가용성 GDNFR 을 함유하는 조정배지(PI - PLC/CM)를 GDNF 와 함께 모뉴로 - 2a 세포에 가했을 때, NGR - 38 세포의 GDNF 처리로 수득한 자가인산화에 필적할 만한 Ret 수용체의 자가인산화가 관찰되었다(도 10B, 레인 2 및 8). GDNF 를 가하지 않았을 때나, 뉴로 - 2a 세포의 PI - PLC 처리로 부터 유도된 조정배지를 시험했을 때, 단지 Ret 자가인산화의 배경 수준만이 관찰되었다(도 10B, 레인 3 - 7).
Ret - Fc 융합 단백질은 GDNF 와 가용성 GDNFR 에 의해 유도된 Ret 인산화를 차단한다.
GDNFR 의 존재하에서 GDNF 에 의해 유도되는 Ret 인산화가 수용체자가인산화의 결과라는 것을 확인하기 위해, Ret 세포외 도메인/면역글로불린 Fc(Ret - Fc) 융합 단백질이 Ret 활성화를 차단할 수 있는지를 측정하는 연구를 수행하였다. NGR - 38 세포상에 발현되는 다수의 GDNF 알파 수용체를 차단시키는 기술적 어려움 때문에, 표적세포로서 뉴로 - 2a 와 GDNFR 의 원으로서 PI - PLC 로 처리한 NGR - 38 세포로 부터 제거한 배지를 사용하여 Ret 인산화 검정을 수행하였다. 여러 GDNF(50 ng/mL) 조합물, 가용성 GDNFR 을 함유하는 배지(예를들어, NGR - 38 세포로 부터 유도된 PI- PLC/CM), 및 다른 농도를 갖는 Ret - Fc 융합 단백질 단독이나 아니면 도 11 에 나타낸 바와 같은 여러 조합물을 포함하는 혼합물로 세포를 처리하였다. GDNF, 가용성 GDNFR 을 함유하는 배지, Ret - Fc, 또는 예비 - 배양한 이들 혼합물로 뉴로 - 2a 세포를 처리하였다. 그런다음 세포를 용균시키고, 실험 과정에 기술된 바와 같이 항 - Ret 항체를 사용하여 면역침전시킴으로써 용균물을 c - Ret 자가인산화에 대해 분석하였다. 항 - 포스포티로신 항체를 사용하여 웨스턴 블롯함으로써 면역침전물을 분석하였다.
가용성 GDNFR 을 함유하는 배지와 GDNF 의 예비 - 배양한 혼합물은 GDNF - 처리 NGR - 38 대조세포와 필적할 만한 수준으로 뉴로 - 2a 에서 발현되는 Ret 수용체의 티로신 인산화를 유도했다(도 11, 레인 7 및 2). 자가인산화된 170 kD Ret 밴드의 위치는 채워진 화살표로 표시되어 있다.예비 - 배양한 GDNF/GDNFR 혼합물에 Ret - Fc 융합 단백질을 포함시켰을 때, Ret 인산화는 투여량 의존 방식으로 저해되었다(도 11, 레인 8 - 10). 이것은 Ret 인산화가 GDNFR 에 의해 매개된 GDNF/Ret 상호작용의 결과라는 것을 나타냈다. 비처리 뉴로 - 2a 세포에서, 또는 GDNFR 부재시 어떠한 GDNF 조합물이나 Ret - Fc 융합 단백질로 처리한 세포에서는 단지 배경 수준의 Ret 인산화가 관찰되었다(도 11, 레인 3 - 6).
GDNF 는 태아 운동 신경원에서 발현되는 c - RET 의 자가인산화를 유도한다.
생체내 GDNF 작용의 주요 표적 중의 하나는 척수운동 신경원이다 (Henderson 등의, science. 266, 1062 - 1064, 1994 ; Li 등의, Proceedings Of The National Academy Of Sciences, U.S.A. 92, 9771 - 9775, 1995 ; Oppenheim 등의 Nature. 373, 344 - 346, 1995 ; Yan 등의 Nature. 373, 341 - 344, 1995 ; Zurn 등의 Neuroreport. 6, 113 - 118, 1995 참조). 이들 세포에서 Ret 자가인산화를 유도하는 GDNF 의 능력을 시험하기 위해, 태아 랫 척수 운동 신경원을 20 ng/mL GDNF 로 처리하거나(레인 2 및 4) 20 ng/mL GDNF 없이 처리한 다음(레인 1 및 3)이 세포를 용균시키고, 항 - Ret 항체로 면역침전시킨 다음 실험 과정에 기술된 바와 같이 항 - 포스포티로신 항체로 웨스턴 블로팅함으로써 분석하였다. GDNF 로 처리한 세포 용균물에서, ~ 170 kD 의 분자량을 갖는 티로신으로 인산화된 단백질 밴드가 관찰되었다(도 12, 레인 2). 결합 완충액 단독으로 처리한 세포에서는 그와 같은 시그널이 관찰되지 않았다(도 12, 레인 1). 동일한 웨스턴 블롯 필터를 제거하고 항 - Ret 항체로 재프로빙하면(즉, 항 - Ret 항체로 면역블롯을 재프로빙함으로써 각 레인에 부하된 c - Ret 단백질의 양을 측정하면), 두 시료에서 동일한 분자량과 유사한 세기를 갖는 밴드가 나타났다(도 12, 레인 3 및 4). GDNF - 처리 세포에서의 포스포티로신 밴드는 Ret 단백질 밴드와 함께 공동 - 이동하는데, 이것은 GDNF 가 Ret 의 자가인산화를 자극했다는 것을 암시하는 것이다. 자가인산화된 Ret 밴드(레인 1 및 2)와 상응하는 단백질 밴드(레인 3 및 4)는 채워진 화살표로 표시하였다.
토 론
폴리펩티드 성장 인자는 동계의 세포 표면 수용체와 결합함으로써 생물학적 효과를 이끌어 낸다. 수용체는 그 구조 및 작용기전을 근거로 몇 종류로 분류될 수 있다. 이러한 분류는 단백질 티로신 키나제(PTKs), 세린/트레오닌 키나제 및 사이토킨 수용체를 포함한다. 수용체 PTK 시그널화는 리간드와의 직접 상호작용에 의해 개시되며, 차례로 수용체 자가인산화를 초래하는 수용체 이합체화나 소중합체화를 유도한다. 그런 다음 활성화된 수용체는 세포내 기질을 보충하고 인산화하여 생물학적 반응을 일으키는 케스케이드(cascade) 사건을 개시한다 (Schlessinger 및 Ullrich, Neuron 9, 383 - 391, 1992 참조). 대조적으로, 세린/트레오닌 키나제나 사이토킨 수용체에 의한 시그널 트랜스덕션은 종종 리간드 결합 및 시그널 트랜스덕션 성분이 같지 않은 다성분 수용체 복합체의 형성을 포함한다. 구체적인 예는 TGF - 수용체 복합체, 즉 별개의 결합(제 2 형) 및 시그널(제 1 형) 성분과 CNTF 군으로 구성된 세린/트레오닌 키나제 수용체이다. CNTF, 인터루킨 - 6(IL - 6) 및 백혈구 저해 인자(LIF)는 그 각각의 수용체 복합체에, 공동 시그널화 성분, 즉 gp130 및/또는 ILFR 을 공유한다. 이들 복합체의 리간드 특이성은 각 개별 리간드에 특이하게 결합하는 소단위체에 의해 결정되는 반면, 시그널 트랜스덕션은 초기 리간드 복합체, 및 직접 리간드와 결합할 수 없는 그외 수용체 소단위체와의 리간드 결합 소단위체의 결합을 필요로 한다(Ip 등의 Cell. 69, 1121 - 1132, 1992 참조). CNTF 수용체 복합체에 있어, 리간드 결합 성분은 GDNFR 에 적합한 CNTF 수용체(CNTFR)로서, GPI - 고정 막 단백질이다. 본 발명은 자가인산화가 별개의 리간드 - 특이 결합 성분과의 결합에 달려있는 수용체 PTK 에 관한 첫 번째 실시예의 설명을 포함한다.
본 연구는, GDNFR, GDNF 와 고친화성으로 결합하는 GPI - 결합 막 단백질이 Ret 수용체 PTK 와 GDNF 의 유효 결합을 필요로 한다는 것을 확인한다. GDNFR 의 부재시, GDNF 는 Ret 과 결합할 수 없거나 Ret 수용체 자가인산화를 자극할 수 없다. GDNFR 의 존재시, GDNF 는 Ret 과 결합하고 신속히 투여량 - 의존 방식으로 Ret 자가인산화를 유도한다. 상기한 바와 같이, GDNFR 은 막 결합이나 아니면 가용성 형태에 작용할 수 있다(도 11). 50 pg/mL 의 GDNF 농도(1.7 pM)가 GDNFR 을 발현하는 세포에서 Ret 티로신 키나제를 활성화시킬 수 있다. 이것은 NGR - 38 세포상의 고친화성 GDNF 결합부위에 대해 발견된 해리상수(1.5 pM)와 일치한다. GDNF 에 의한 Ret 인산화의 신속한 유도(처리후 1 분 째에 검출가능) 및 자가인산화를 차단시키는 Ret - Fc 의 능력은, Ret 이 어떤 다른 수용체의 인산화 결과에 따르기 보다는 직접 활성화된다는 것을 암시한다.
교차결합 연구는 GDNF 와 Ret 의 유효결합이 GDNFR 에 달려있다는 가설을 지지한다. 고수준의 GDNFR 을 발현하는 NGR - 38 세포에서 Ret 에 대한 GDNF 의 교차결합은 강하지만, 모뉴로 - 2a 세포 교차결합 산물은 거의 검출불가능하다. 모든 교차결합 복합체를 결정적으로 확인하는 것은 어려우나, 상기 데이터는 GDNF 와 Ret 의 결합이 GDNF 의 존재에 달려있다는 것을 명백히 입증하며, GDNFR 이 교차결합 산물의 일부에서 유도된다는 것을 입증한다. 뉴로 - 2a 세포에 소수의 교차결합종이 존재하는 이유는 명확하지 않다. 뉴로 - 2a 세포에서의 GDNFR mRNA 발현은 노던 블롯에 의해 검출될 수 없었으나, GDNFR 이 이들 세포에서 매우 저수준으로 발현된다는 것은 가능하다.
배양된 랫 태아 척수 운동 신경원에서 Ret 이 GDNF 에 의해 활성화될 수 있다는 사실은 Ret/GDNF 상호작용의 생물학적 관련성을 더 입증해 준다. 이들 세포는 생체내 GDNF 의 일차 표적이며, 저투여량의 생체내 GDNF 와 반응한다고 밝혀졌다(Henderson 등의 1994). 운동성 신경원 세포를 PI - PLC 로 전처리하면 Ret 인산화의 자극이 소멸되었는데(데이터는 나타나 있지 않음), 이것은 GDNF 에 의한 Ret 활성화에 GDNFR 이 필요하다는 것을 시사하는 것이다.
수용체 세포외 도메인에 대한 리간드의 결합이 다른 공지된 수용체 PTKs 활성화에 있어 제 1 단계 일지라도, 이것이 GDNF 와 Ret 에 대한 경우는 아니라는 것을 본 데이터는 나타냈다. 도 13 은 GDNFR 과 Ret 에 대한 GDNF 결합 모델, 및 그 결과로서 일어나는 GDNF 와 반응하는 Ret PTK 의 활성화를 도시한 것이다. 이 과정의 초기 사건은 단량체형태나 아니면 이량체형태로 이황화물 - 결합 이량체 GDNF 가 GDNFR 에 결합하는 것이다. 현재 이량체 GDNFR 존재에 대한 직접적인증거는 없으나, GDNFR cDNA 로 293T 세포를 형질감염시켰을 때 두 종류의 결합 부위가 나타났다. 이 관찰에 대한 가장 간단한 설명은 단량체 및 이량체 GDNFR 이 존재하며, 각각은 그 자체의 리간드 결합 친화성을 갖는다는 것이다. 이것은 GDNF 결합 친화성이 분명히 Ret 존재에 의해 영향 받지 않는다는 발견과 일치한다. 본 실험은 이량체 GDNFR 이 GDNF 의 존재시 그것의 단량체와 평형인지, 이량체화가 GDNF 결합에 의해 유도되는지에 관한 질문을 다루지 않으므로, 이 가능성은 선택경로로서 존재한다. 이량체 GDNFR 과 이량체 GDNF 로 구성된 복합체는 두 개의 Ret 분자와 결합할 수 있는데, 이것은 활성 시그널화 복합체를 형성한다. 그외 PTKs 에 있어서는 두 개의 Ret 분자의 세포내 촉매 도메인 간의 밀접한 접촉으로 수용체 자가인산화가 초래되는 것 같다. 이와 같은 기전에 의한 Ret 기능에 관한 개념은 안정한 상태의 Ret 이량체화를 유발하는 MEN2A 돌연변이로 인해 Ret 키나제의 본질적인 활성화가 일어난다는 사실에 의해 지지된다(Santoro 등의 1995 참조).
운동 신경원은 5fM 만큼이나 낮은 ED50 을 갖는 GDNF 와 반응한다고 보고되어 있다(Henderson 등의 1994 참조). 생물학적 반응을 위한 ED50과 결합 친화성을 비교하기는 어려우나, 이들 세포에 매우 고친화성인 GDNF 결합부위가 존재한다는 것은 가능하다. 그외 세포, 이를테면태아 병아리 교감 신경원은 1 - 5 nM 의 Kd 를 갖는 GDNF 와 반응한다고 보고되어 있다(Trupp 등의 Journal of Cell Biology, 130, 137 - 148, 1995 참조). GDNFR 을 그와 같은 낮은 친화성 부위에 대한 수용체 복합체와 관련되지 않을 것 같지만, GDNF 와 Ret 간에 약한 직접 상호작용이 존재할 수도 있다.
소장 신경계 세포를 포함하여 많은 중추 및 말초 신경계 세포주의 배형성 중에 c - ret 발현이 관찰되었다(Pachnis, 등의 Development, 119, 1005 - 1017, 1993 ; Tsuzuki 등의 1995 참조). 신경계외에, c - ret 발현은 볼프관, 요관아 상피 및 신장의 집합관에서 검출되었다 (Pachnis, 등의 상기문헌 ; Tsuzuki 등의 1995 참조). 신경릉 유래 (Ikeda 등의 1990 참조) 및 외과수술로 절제된 신경아세포종 유래(Nagao 등의 1990 ; Takahashi 및 (Cooper, 1987 참조)의 모든 신경아세포종 세포주에서도 Ret 발현이 검출되었다. CNS 와 PNS 뿐만 아니라 배 발생중의 비 - 신경원 조직에서도 GDNF 발현은 관찰되었다. 많은 비 - 신경원 조직에서 발견된 GDNF 발현 수준은 신경계에서 보다 높았다(Choi - Lundberg 및 Bohn, Brain Res. Dev. Brain Res. 85, 80 - 88, 1995 참조). 비록 GDNFR 의 발현에 관하여 광범위하게 연구되지 않았으나, 성숙한 랫 및 마우스의 간, 뇌 및 신장에서 고수준의 GDNFR mRNA 가 존재한다는 것이 일차 노던 블롯 분석으로 검출되었다.신경계 및 신장 발생시 ret, GDNF 및 GDNFR 발현 유형의 유사성은 발생중의 그들의 조합 작용과 일치한다.
볼프관 미측에서 발생한 분지인 발생 요관(developing ureter)과 후신 사이의 상호작용으로 인하여 포유동물 신장 발생이 일어난다고 가정되어 있다(Saxen, Organogenesis of the Kidney. Development and Cell Biology series, Cambridge University Press, Cambridge, England, 1987 참조). Ret 의 발현은 배 발생시 주변 간엽에서가 아니라 요관아에서 발견된 반면, GDNF 의 발현은 신장의 성숙한 후신모가 아니라 미분화된 후신모에서 검출되었다. 이들 관찰은, GDNF 와 Ret 간의 상호작용으로 인하여 요관 구조의 발생이 개시된다는 것을 암시한다. 이 가설은 GDNF 와 ret 유전자의 표적화된 붕괴에 의해 더 지지되는데, 그 결과 신장에 있어 매우 유사한 표현형 결손이 일어난다(Schuchardt 등의 Nature. 367, 380 - 383, 1994 ; Sanchez 출판사 참조). GDNF (-/-) 와 ret (-/-) 녹아웃 동물에서 관찰된 다른 대부분 표현형 결손은 소화관 전체에 소장 신경원이 완전히 결여된 것이다. 보다 하급 장관(lower intestinal tract)에서 부교감신경지배의 선천성 부재를 특징으로 하는 유전병인 히르쉬스프룽병 역시 Ret 의 '기능 상실(loss - of - function)' 돌연변이와 관련되어 있다(Romeo 등의 Nature. 367, 377 - 378, 1994, Edery 등의 1994 참조). 초기 관찰과는 대조적으로 이후 보고서(Angrist 등의 Hum. Mol. Genet. 4, 821 - 830, 1995 참조)에는 어떤 히르쉬스프룽병 환자는 ret 돌연변이를 지니고 있지 않음을 시사했다. 그와 같은 환자가 GDNF, GDNFR 또는 이 시그널 경로의 어떤 다른 임계 성분에서의 돌연변이를 지니고 있을지도 모른다고 현재 생각된다.
실험 과정
GDNFR 을 발현하는 뉴로 - 2a 세포에 대한 [ 125 I]GDNF 결합
제조자의 지시에 따라 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 시스템(집코/비알엘)을 이용하여 상기한 바와 같이 뉴로 - 2a 세포(입수처 : ATCC 제 CCL 131 호)를 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 400 μg/mL G418 항생제(시그마)에 성장시킴으로써 플라스미드의 발현에 대해 형질감염 세포를 선택하였다. G418 내성 클론을 확장시키고 [125I]GDNF(애머샴, 인코포레이티드에서 구입, 주문 요오드화, 카탈로그 번호 제 IMQ1057 호)와 결합시킴으로써 GDNFR 발현을 검정하였다. 폴리오르니틴으로 예비 - 피복한 24 - 웰 조직배양 평판(벡톤 딕킨슨) 이중 웰에 각 클론으로 부터의 세포를 3 × 104세포/cm2의 밀도로 접종하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액(25 mM HEPES, pH 7.5 를 함유하는 DMEM)으로 세포를 1 회 세척한 다음 500 mM 비표지 GDNF 의 존재 또는 부재하의 4 ℃ 에서 4 시간 동안 50 pM [125I]GDNF 와 함께 결합 완충액(0.2 % BSA 를 더한 세척 완충액)에 배양하였다. 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 4 회 세척하고, 1 M NaOH 로 용균시킨 후 방사성표지가 결합된 세포를 1470 위저드 자동 감마 카운터(월락 인코포레이티드)로 정량하였다. 개별 클론에서 발현된 GDNFR 의 양은 비표지 GDNF 의 존재 및 부재하에서 세포와 결합한 [125I]GDNF 의 비율로써 추정하였다. 결합 실험에 사용하기 위한 높은, 중간 및 낮은 수준의 GDNFR 발현의 대표물로서 세 클론을 선택하였다. 이들 클론에 대한 비표지 GDNF 의 부재 및 존재하에서의 [125I]GDNF 결합비는 다음과 같다 : NGR - 38) 16 : 1, NGR - 16) 12.8 : 1 및 NGR -33) 8 : 1. 표지 GDNF 의 농도 범위가 0.5 pM 내지 1 nM 인 것을 제외하고는 상기한 바와 같이 NGR - 38 세포에 대한 [125I]GDNF 의 평형결합을 수행하였다. 모든 검정에 있어, 500 nM 비표지 GDNF 의 존재하에서 세포와 결합하는 방사성표지의 양으로써 추정한 바와 같은 비특이 결합을 비표지 GDNF 의 부재하에서의 결합에서 공제하였다. 스캐차드 플롯으로써 결합 데이터를 분석하였다.
화학 교차결합
뉴로 - 2a 또는 NGR - 38 세포를 인산염 - 완충 식염수(PBS, pH 7.1)로 1 회 세척한 다음, 500 nM 비표지 GDNF 의 존재나 부재하의 4 ℃ 에서 4 시간 동안 결합 완충액내 1 또는 3 nM [125I]GDNF 로 처리하였다. 결합 후, 얼음같이 찬 세척 완충액으로 세포를 4 회 세척하고 세척 완충액내 1 mM 비스 수버레이트(BS3, 피어스)로 실온에서 45 분간 배양하였다. 트리스 - 완충 식염수(TBS, pH 7.5)로 세포를 3 회 세척함으로써 교차 - 결합 반응을 급랭시켰다. 그런 다음 SDS - PAGE 시료 완충액(80 mM 트리스 HCl [pH 6.8], 10 % 글리세롤, 1 % SDS, 0.025 % 브로모페놀 블루)이나 아니면 트리톤 X - 100 용균 완충액[50 mM Hepes, pH 7.5, 1 % 트리톤 X- 100, 50 mM NaCl, 50 mM NaF, 10 mM 소디움 피로포스페이트, 1 % 아프로티닌(시그마, 카탈로그 번호 제 A - 6279 호), 1 mM PMSF(시그마, 카탈로그 번호 제 P - 7626 호), 0.5 mM Na3VO4(피셔, 카탈로그 번호 제 S454 - 50 호)]에 직접 상기 세포를 용균시켰다. 원심분리하여 용균물을 맑게 해서 5 μg/mL 의 항 - Ret 항체(샌터 크루즈 항체, C - 19, 카탈로그 번호 제 SC - 167 호)와 배양하고, 단백질 A - 세파로스 CL - 4B(파마시아)로 침전시킴으로써 결과적으로 생성된 면역복합체를 수집하였다. 면역침전물을 용균 완충액으로 3 회, 50 mM NaCl 과 20 mM 트리스 - Cl, pH 7.5 를 함유하는 0.5 % NP - 40 으로 1 회 세척한 다음 SDS - PAGE 시료 완충액에 재현탁하였다. 비스 : 아크릴아미드의 비율이 1 : 200 인 7.5 % SDS - PAGE 로 전체 세포 융균물과 면역침전물 둘 다 분획화하였다.
웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 분석에 의해 Ret 수용체의 자가인산화를 조사하였다. 간단히 설명하면, 검정 24 시간 전에 6 - 웰 조직배양 접시에 1.5 × 106세포/웰의 밀도로 세포를 접종하였다. 결합 완충액으로 세포를 1 회 세척하고 여러 시간 동안 여러 농도의 별개 시약(GDNF, PI - PLC, PI - PLC/CM 및 Ret - Fc 융합 단백질 포함) 단독으로나, 아니면 결합 완충액과 공동으로 처리하였다. 처리 세포 및 비처리 대조를 트리톤 X - 100 용균 완충액에 용균시키고 상기한 바와 같이 항 - Ret 항체(샌터 크루즈, C 19, 카탈로그 번호 제 SC - 167 호) 및 단백질 - A 세파로스로 면역침전시켰다. SDS - PAGE 에 의해 면역침전물을 분획화하고 Harlow 및 Lane(Antibodies : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory : Cold Spring Harbor, New York, 1988 참조)이 기술한 바와 같이 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이 막을 5 % BSA(시그마)로 예비 - 차단시키고 실온에서 2 시간 동안 항 - 포스포티로신 모노클로날 항체 4G10(UBI, 카탈로그 번호 제 05 - 321 호)으로 막을 블로팅하여 상기수용체의 티로신 인산화 수준을 결정하였다. 동일한 막을 벗겨내고 항 - Ret 항체로 재탐침시킴으로써 각 레인에 포함된 단백질의 양을 측정하였다. 최종적으로, 제조자의 지시에 따라 막을 화학발광 시약(ECL, 애머샴)으로 처리하여 X - 선 필름(하이퍼필름 - ELC, 애머샴)에 노출시켰다.
PI - PLC 로 세포 처리 및 PI - PLC 처리된 조정배지 생성
세포 표면으로 부터 GPI - 결합 GDNFR 을 유리시키기 위해, 세척 완충액으로 세포를 1 회 세척한 다음 결합 완충액내의 1 U/mL 포스파티딜이노시톨 특이 포스포리파제 C(PI - PLC, 뵈링거 만하임, 카탈로그 번호 제 1143069 호)와 함께 37 ℃ 에서 45 분간 배양하였다. 그런다음 세포를 세척 완충액으로 3 회 세척하고 Ret 자가인산화 검정용이나 교차결합용으로 더 처리하였다. PI - PLC 처리된 조정배지(PI - PLC/CM)를 생성하기 위해, 2 mM 의 EDTA 를 함유하는 PBS 로 세포를 37 ℃ 에서 5 내지 10 분간 처리함으로써 조직배양 접시에서 8 × 106세포를 제거하였다. 세척 완충액으로 세포를 1 회 세척하고, 1 U/mL 의 PI - PLC 를 함유하는 1 mL 의 결합 완충액에 재현탁한 다음 37 ℃ 에서 45 분간 배양하였다. 세포는 펠릿화되었고, PI - PLC/CM 을 수집하였다.
Ret - Fc 융합 단백질 제조
마우스 c - Ret 의 첫 번째 20 아미노산에 상응하는 올리고누클레오티드 프로브를 사용하여 17 일 된 랫 태반 cDNA 라이브러리로 부터 c - Ret 의 전체 코딩 부위를 포함하는 cDNA 를 분리하였다(Iwamoto 등의 1993 ; van Heyningen, 1994 참조). Ret 수용체의 세포외 도메인을 코딩하는 부분(마지막 아미노산에서 종결, R636)을 인체 IgG 의 Fc 부분(IgG1)을 코딩하는 DNA 와 함께 프레임내 융합시키고 이미 기술된 바와 같은(Bartley 등의 Nature. 368, 558 - 560, 1994 참조) 발현 벡터 pDSR2 내에 서브클로닝하였다. 이 ret - Fc/pDSRα2 플라스미드를 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포내로 형질감염시키고 재조합체 Ret - Fc 융합단백질을 Ni++ 칼럼(퀴아겐)을 사용하여 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
태아 랫 척수 운동신경원 배양물 제조
실험 24 시간 전에 E15 스프래그 - 돌레이 랫 태아의 전체 척수로부터 강화된 태아 랫 척수 운동신경원 배양물을 제조하였다. 척수를 절개하고, 수막과 배근신경절(DRGs)을 제거하였다. 척수를 더 작은 단편으로 잘라서 L15 배지내 파파인(파파인 키트, 워싱톤)으로 절단하였다. 해리된 세포 현탁액내에 포함되어 있는 다른 유형의 세포보다 더 큰 운동신경원을 6.8 % 메트리자마이드 기울기(Camu and Henderson, JNeuroscience. 44, 59 - 70, 1992 참조)를 이용하여 강화시켰다. 메트리자마이드 쿠션과 세포 현탁액 사이의 접촉면에 존재하는 강화된 운동신경원을 모아서 세척하고 폴리 - L - 오르니틴 및 라미닌으로 예비 - 피복된 조직배양 접시에 ~9 × 104세포/cm2의 밀도로 접종하여 37 ℃ 에서 배양하였다.
여러 참고문헌들이 본원에 인용되어 있으며, 그 명세서 전체가 참고문헌에 포함되어 있다.
본 발명은 바람직한 실시형태 및 전형적인 핵산과 아미노산 서열로 기술되어 있으나, 본 분야의 숙련된 기술자들에 의해 수정 및 변형될 것임은 물론이다. 따라서, 첨부한 청구의 범위는 본 발명에서 청구하는 바와 같은 범위 내에서의 상기 등가의 모든 변형을 포함하고자 한다.
참고 문헌
서열목록
(1) 서열들에 관한 일반정보 :
(ⅰ) 출원인 : 팍스 게리 엠
징 슈퀴안
웬 두안치
(ⅱ) 발명의 명칭 : 신경 손상 치료 기구
(ⅲ) 서열의 갯수 : 34
(ⅳ) 통신 주소 :
(A) 수신인 : 암젠 인코포레이티드
(B) 스트리트 : 디하빌랜드 드라이브 1840
(C) 시 : 사우전드 오크스
(D) 주 : 캘리포니아
(E) 국명 : 미국
(F) 우편번호 : 91320 - 1789
(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체타입 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 운영체계 : PC - DOS/MS - DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30
(ⅵ) 현출원 데이터 :
(A) 출원번호 :
(B) 출 원 일 : 1997년 4월 14일
(C) 분 류 :
(ⅶ) 선출원 데이터 :
(A) 출원번호 : 제 US 60/017,221 호
(B) 출 원 일 : 1996년 5월 9일
(ⅶ) 선출원 데이터 :
(A) 출원번호 : 제 US 60/015,907 호
(B) 출 원 일 : 1996년 4월 22일
(ⅷ) 대리인/관리인 정보 :
(A) 성명 : 커리 다니엘 알
(B) 등록번호 : 32,727
(C) 참조/문서번호 : A - 401A
(2) 서열 번호 : 1
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 2568 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 540..1934
(xi) 서열 1 :
(2) 서열 번호 : 2
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 465 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 2 :
(2) 서열 번호 : 3
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 2138 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 302..1705
(xi) 서열 3 :
(2) 서열 번호 : 4
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 468 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 4 :
(2) 서열 번호 : 5
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 3209 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : misc _ feature
(B) 존재위치 : 1..539
(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 539 는 도 5 Gdnfr 의 - 237
내지 301 임'
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 540..1937
(xi) 서열 5 :
(2) 서열 번호 : 6
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 466 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 6 :
(2) 서열 번호 : 7
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 508 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : misc _ feature
(B) 존재위치 : 1..508
(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 508 은 도 5 Hsgr - 21af 의
- 237 내지 272 임'
(xi) 서열 7 :
(2) 서열 번호 : 8
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 510 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : misc _ feature
(B) 존재위치 : 1..510
(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 510 은 도 5 Hsgr - 21bf 의
- 237 내지 272 임'
(xi) 서열 8 :
(2) 서열 번호 : 9
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 1927 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 538..1926
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : misc _ feature
(B) 존재위치 : 1..537
(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 537 은 도 5 21acon 의
- 235 내지 301 임'
(xi) 서열 9 :
(2) 서열 번호 : 10
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 463 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 10 :
2) 서열 번호 : 11
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 1929 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 540..1928
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : misc _ feature
(B) 존재위치 : 1..539
(D) 기타 정보 : /주 = '1 내지 539 는 도 5 21bcon 의
- 237 내지 301 임'
(xi) 서열 11 :
(2) 서열 번호 : 12
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 463 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 12 :
(2) 서열 번호 : 13
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 699 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : misc _ feature
(B) 존재위치 : 1..699
(D) 기타 정보 : /주 = '1 내지 699 는 도 5 Hsgr - 29a 의
814 내지 1512 임'
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 2..697
(xi) 서열 13 :
(2) 서열 번호 : 14
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 232 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 14 :
(2) 서열 번호 : 15
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 2157 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 2..886
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : misc _ feature
(B) 존재위치 : 1..2157
(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 2157 은 도 5 29brc 의 814
내지 2971 임'
(xi) 서열 15 :
(2) 서열 번호 : 16
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 295 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 16 :
(2) 서열 번호 : 17
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 659 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 2..658
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : misc _ feature
(B) 존재위치 : 1..659
(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 659 는 도 5 Hsgr - 21ar 의
1033 내지 1691 임'
(xi) 서열 17 :
(2) 서열 번호 : 18
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 219 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 18 :
(2) 서열 번호 : 19
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 630 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 3..629
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : misc _ feature
(B) 존재위치 : 1..630
(D) 기타 정보 : /주 = '1 내지 630 은 도 5 Hsgr - 21br
의 1062 내지 1691 임'
(xi) 서열 19 :
(2) 서열 번호 : 20
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 209 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 20 :
(2) 서열 번호 : 21
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 1075 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 2..445
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : misc _ feature
(B) 존재위치 : 1..1075
(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 1075 는 도 5 Hsgr - 2 의
1255 내지 2330 임'
(xi) 서열 21 :
(2) 서열 번호 : 22
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 148 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 22 :
(2) 서열 번호 : 23
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 1059 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 3..428
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : misc _ feature
(B) 존재위치 : 1..1059
(D) 기타정보 : /주 = '1 내지 1059 는 도 5 Hsgr - 9 의
1272 내지 2330 임'
(xi) 서열 23 :
(2) 서열 번호 : 24
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 142 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 24 :
(2) 서열 번호 : 25
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 10 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 펩티드
(xi) 서열 25 :
(2) 서열 번호 : 26
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 10 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 펩티드
(xi) 서열 26 :
(2) 서열 번호 : 27
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 10 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 펩티드
(xi) 서열 27 :
(2) 서열 번호 : 28
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 10 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 펩티드
(xi) 서열 28 :
(2) 서열 번호 : 29
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 14 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : 펩티드
(xi) 서열 29 :
(2) 서열 번호 : 30
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 21 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(xi) 서열 30 :
(2) 서열 번호 : 31
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 36 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(xi) 서열 31 :
(2) 서열 번호 : 32
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 37 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(xi) 서열 32 :
(2) 서열 번호 : 33
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 60 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(xi) 서열 33 :
(2) 서열 번호 : 34
(ⅰ) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 60 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 분자의 타입 : cDNA
(xi) 서열 34 :

Claims (3)

  1. 다음을 포함하는 신경 손상 치료 기구 :
    (a) 이식에 적합한 반투막 ; 및
    (b) 신경영양성 인자 수용체 단백질은 투과시키지만 세포에 해로운 물질은 투과시키지 않는 막 내부에서 캡슐로 보호되는, 신경교 세포주-유래 신경영양성 인자(GDNF)와 복합체를 이루어 GDNF 에 대한 세포 반응을 매개하는 능력을 가지며 도 2 또는 도 4 (서열 2 또는 4)에 나타나 있는 아미노산 서열을 갖는 신경영양성 인자 수용체 단백질을 분비하는 세포.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 상기 신경영양성 인자 수용체 단백질을 분비하는 자연발생적인 세포임을 특징으로 하는 기구.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가 신경영양성 인자 수용체 단백질을 분비하도록 신경교 세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)와 복합체를 이루어 GDNF 에 대한 세포 반응을 매개하는 능력을 갖는 신경영양성 인자 수용체 단백질(GDNFR)을 코드하는, Met1내지 Ser465를 코드하는 누클레오티드를 포함하는 도 1(서열 1) 또는 Met1내지 Ser468을 코드하는 누클레오티드를 포함하는 도 3(서열 3)에 나타나 있는 핵산 서열로 변이시킴을 특징으로 하는 기구.
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