JPH09507829A - 増殖分化因子−８ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 増殖分化因子−８（ＧＤＦ−８）がそのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列と共に開示される。ＧＤＦ−８ポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を用いる診断及び治療方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 増殖分化因子−８ 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、広くは増殖因子に関し、特定的にはトランスフォーミング増殖因子 β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの増殖分化因子−８（ＧＤＦ−８）といわ れる新規なメンバーに関する。 ２．関連技術の説明 トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、胚発 生の間の分化過程の広い範囲に影響を及ぼす構造的に関連する一群のタンパク質 を包含する。このファミリーには、正常な雄性発生に必要なミュラー管阻害物質 （ＭＩＳ）(Behringerら，Nature，345:167，1990)、背腹軸形成及び成虫原基の 形態形成に必要なドロソフィラ・デカペンタプレジック(Drosophila decapentap legic)(ＤＰＰ)遺伝子産物(Padgettら，Nature，325:81-84，1987)、卵の植物極 に局在しているツメガエルＶｇ−１遺伝子産物（Weeksら，Cell，51:861-867，1 987）、ツメガエルの胚の中胚葉及び前部構造の形成を誘発することができる（T homsonら，Cell，63:485，1990）アクチビン(Masonら，Biochem．Biophys．Res ．Commun.，135:957-964，1986)、及びデノボ軟骨及び骨形成を誘発できる骨形 態形成タンパク質（ＢＭＰ，オステオゲニン，ＯＰ−１）（Sampathら，J．Biol ．Chem.，265:13198，1990）が含まれる。ＴＧＦ−β類は、脂質生成、筋発生、 軟骨形成、血液生成、及び上皮細胞分化を含 む種々の分化過程に影響することができる（委細については、Massague，Cell， 49:437，1987を参照のこと）。 ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質は、最初、大きな前駆体タンパク質として 合成され、その後にＣ−末端から約１１０〜１４０アミノ酸の塩基性残基のクラ スターでタンパク質分解性開裂を受ける。これらタンパク質のＣ−末端領域又は 成熟領域は全て構造的に関連しており、個々のファミリーメンバーはそれらの相 同性の程度に基づいて異なるサブグループに分類され得る。特定のサブグループ 内の相同性は７０％から９０％アミノ酸配列同一性の範囲となるが、サブグルー プ間の相同性はかなり低くて一般に僅か２０％から５０％の範囲に過ぎない。そ れぞれの場合において、活性種はＣ−末端断片のジスルフィド連結ダイマーのよ うである。ＴＧＦ−βファミリーのあるメンバーのプロ領域をＴＧＦ−βファミ リーの他のメンバーの成熟領域と同時発現させると、細胞内二量体化及び生物活 性なホモダイマーの分泌が起こることが研究によって示された（Gray，A.とMast on，A.，Science，247:1328，1990）。Hammondsらによる更なる研究（Molec．En docrin．5:149，1991）で、ＢＭＰ−４成熟領域と結合したＢＭＰ−２プロ領域 を用いると、成熟ＢＭＰ−４の発現が劇的に向上したことが示された。研究した 殆どのファミリーメンバーについて、そのホモダイマー種が生物活性であること が分かったが、インヒビン（Lingら，Nature，321:779，1986）及びＴＧＦ−β 類（Cheifetzら，Cell，48:409，1987）のような他のファミリーメンバーについ ては、ヘテロダイマーが検出され、そしてこれらはそれぞれのホモダイマーとは 異なる生物活性を有するようであ る。 発現パターンが組織特異的である新規な因子の同定は、その組織の発生及び機 能の深い理解を提供するであろう。発明の概要 本発明は、細胞増殖及び分化因子、つまりＧＤＦ−８、該因子をコードするポ リヌクレオチド配列、及び該因子と免疫反応性である抗体を提供する。この因子 は、種々の細胞増殖性疾患、特に筋肉、神経、及び脂肪組織に関連する疾患に関 係するようである。 かくして、１つの態様においては、本発明は、ＧＤＦ−８に関係する筋肉、神 経、又は脂肪起源の細胞増殖性疾患を検出する方法を提供する。もう１つの態様 においては、本発明は、ＧＤＦ−８活性を抑制するか又は増進することによって 細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する。図面の簡単な説明 図１は、成体組織内でのＧＤＦ−８ ｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロット である。そのプローブは部分的マウスＧＤＦ−８クローンであった。 図２は、マウスＧＤＦ−８（図２ａ）及びヒトＧＤＦ−８（図２ｂ）のヌクレ オチド配列及び予想アミノ酸配列を示す。該マウス配列中の推定二塩基プロセシ ング部位をボックスで囲んである。 図３は、ＧＤＦ−８とＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーとのＣ− 末端配列のアラインメント（並列化）を示す。保存システイン残基をボックスで 囲んである。短い横線はアラインメントを最大にするために空けた空所を表わす 。 図４は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの異なるメンバー間の アミノ酸相同性を示す。数字は、第１保存システインからＣ−末端まで計算した それぞれの対の間のアミノ酸同一性のパーセントを表わす。ボックスは、特定の サブグループ内で高度に関連するメンバー間の相同性を表わす。 図５はＧＤＦ−８の配列を示す。マウス（図５ａ）及びヒト（図５ｂ）ＧＤＦ −８ ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。数字は、５'末 端からのヌクレオチドの位置を示す。コンセンサスＮ結合グリコシル化シグナル を暗くしてある。推定RXXRタンパク質分解性開裂部位をボックスで囲んである。 図６は、ＧＤＦ−８のハイドロパシシティ（hydropathicity）プロフィールを 示す。マウス（図６ａ）及びヒト（図６ｂ）ＧＤＦ−８についての平均疎水性値 をKyteとDoolittleの方法(J．Mol．Biol.，157:105-132，1982)を用いて計算し た。正の数値は疎水性の増加を示す。 図７は、マウスＧＤＦ−８アミノ酸配列とヒトＧＤＦ−８アミノ酸配列の比較 を示す。予想マウス配列を上側の列に示し予想ヒト配列を下側の列に示す。数字 は、Ｎ−末端からのアミノ酸の位置を示す。これら２つの配列間の同一性を垂直 線により表してある。 図８は、細菌内でのＧＤＦ−８の発現を示す。ｐＲＳＥＴ／ＧＤＦ−８発現プ ラスミドを保有するＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）細胞をイソプロピルチオ −β−ガラクトシドで誘発し、そしてＧＤＦ−８融合タンパク質を金属キレート クロマトグラフィーにより精製した。レーン：全体＝全細胞溶解産物；可溶物＝ 可 溶性タンパク質画分；不溶物＝カラムに充填した不溶性タンパク質画分（１０ｍ ＭトリスｐＨ８.０、５０ｍＭリン酸ナトリウム、８Ｍ尿素、及び１０ｍＭβ− メルカプトエタノール〔緩衝液Ｂ〕中に再懸濁させた）；ペレット＝カラムに充 填する前に廃棄した不溶性タンパク質画分；流出物＝カラムに結合しなかったタ ンパク質；洗浄液＝示したｐＨで緩衝液Ｂで行った洗浄の洗浄液。分子量スタン ダードの位置を右側に示している。矢印はＧＤＦ−８融合タンパク質の位置を示 す。 図９は、哺乳動物細胞内でのＧＤＦ−８の発現を示す。チャイニーズハムスタ ー卵巣細胞をｐＭＳＸＮＤ／ＧＤＦ−８発現プラスミドで形質転換してＧ４１８ 中で選択した。Ｇ４１８耐性細胞からの馴化培地（ＧＤＦ−８をアンチセンス又 はセンス方向のいずれかでクローン化した構築体でトランスフェクトした細胞か ら調製した）を濃縮し、還元条件下で電気泳動し、ブロットし、そして抗ＧＤＦ −８抗体及び〔¹²⁵I〕ヨードプロテインＡで釣り上げた。矢印はプロセシングさ れたＧＤＦ−８タンパク質の位置を示す。 図１０は、ＧＤＦ−８ ｍＲＮＡの発現を示す。成体組織（図１０ａ）又は示 した妊娠日数における胎盤及び胚（図１０ｂ）から調製したポリＡ選択ＲＮＡ（ 各５μｇ）をホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、ブロットし、そして完全長 マウスＧＤＦ−８で釣り上げた。 図１１は、ヒトＧＤＦ−８の染色体マッピングを示す。ヒト／げっ歯類体細胞 ハイブリッド系から調製したＤＮＡサンプルをＰＣＲに付し、アガロースゲル上 で電気泳動し、ブロットし、そし て釣り上げた。それぞれのハイブリッド細胞系内に含有されるヒト染色体が始め の２４レーン（１〜２２、Ｘ及びＹ）のそれぞれの最上部において確認される。 Ｍ、ＣＨＯ及びＨと名付けたレーンでは、出発ＤＮＡ鋳型は、それぞれマウス、 ハムスター、及びヒト由来の全ゲノミックＤＮＡであった。Ｂ１の記号を付けた レーンでは、鋳型ＤＮＡは用いなかった。左側の数字は、ＤＮＡスタンダードの 移動度を示す。発明の詳細な説明 本発明は、増殖及び分化因子ＧＤＦ−８及びＧＤＦ−８をコードするポリヌク レオチド配列を提供する。ＧＤＦ−８は筋肉中で最高レベルで発現され、脂肪組 織中ではより低いレベルで発現される。１つの態様においては、本発明は、ＧＤ Ｆ−８発現に関係する筋肉、神経、又は脂肪起源の細胞増殖性疾患を検出する方 法を提供する。他の態様においては、本発明は、ＧＤＦ−８活性を抑制するか又 は増進する物質を用いることによって細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する 。 ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、多くの細胞型内で増殖、分化、及び他の機 能を制御する多機能性ポリペプチドからなる。これら多くのペプチドは、他のペ プチド増殖因子の正と負の両方の調節作用を有する。本発明のＧＤＦ−８タンパ ク質とＴＧＦ−βファミリーのメンバーの間の構造的相同性は、ＧＤＦ−８が増 殖及び分化因子のファミリーの新規なメンバーであることを示している。多くの 他のメンバーの既知の活性に基づき、ＧＤＦ−８もそれを診断及び治療剤として 有用なものにする生物活性を有するであろうと期待される。 特に、このスーパーファミリーのある種のメンバーは、神経系の機能に関係す る発現パターンを有するか又は活性を保持する。例えば、インヒビン及びアクチ ビンは脳内で発現されることが示され(Meunierら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，85:247，1988；Sawchenkoら，Nature，334:615，1988)、そしてアクチビンが 神経細胞生存分子として機能できることが示された(Schubertら，Nature，344:8 68，1990)。もう一つのファミリーメンバー、即ち、ＧＤＦ−１は、その発現パ ターンが神経系特異的であり（Lee，S.J.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:42 50，1991）、そしてＶｇｒ−１（Lyonsら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:45 54，1989；Jonesら，Development，111:531，1991）、ＯＰ−１（Ozkaynakら，J ．Biol．Chem.，267:25220，1992）及びＢＭＰ−４（Jonesら，Development，11 1:531，1991）の如き一部の他のファミリーメンバーも、神経系で発現されるこ とが知られている。骨格筋は運動ニューロンの生存を促進する１又は複数の因子 を産生することが知られている（Brown，Trends Neurosci.，7:10，1984）ので 、筋肉内でのＧＤＦ−８の発現は、ＧＤＦ−８の１つの活性がニューロンのため の栄養因子としてのものであることを示唆している。この点で、ＧＤＦ−８は、 筋萎縮性側索硬化症の如き神経変性疾患の治療に、又は培養下の細胞若しくは組 織を移植前に維持することに有用であるかも知れない。 ＧＤＦ−８は、筋変性疾患の如き筋肉に関連する疾患過程の治療又は外傷に起 因する組織修復にも有用であるかも知れない。これに関して、ＴＧＦ−βファミ リーの他の多くのメンバーも組織 修復の重要な媒介物質である。ＴＧＦ−βはコラーゲンの生成に顕著な作用を有 すること及び新生子マウス内でめざましい血管形成反応を起こすことが示されて いる(Robertsら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83:4167，1986)。ＴＧＦ−βが 培養下の筋芽細胞の分化を阻害することも示されている(Massagueら，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA，83:8206，1986)。更には、筋芽細胞は遺伝子治療のために 筋肉へ遺伝子を送達する運搬体として用いることができるので、ＧＤＦ−８の特 性は、移植前に細胞を維持するのに又は融合過程の効率を高めるのに利用できる かも知れない。 脂肪組織内でのＧＤＦ−８の発現も、肥満症又は脂肪細胞の異常増殖に関連す る疾患の治療におけるＧＤＦ−８の用途の可能性を思い起こさせる。これに関し て、ＴＧＦ−βがin vitroで脂肪細胞増殖の強力な阻害物質であることが示され ている(IgnotzとMassague，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82:8530，1985)。 ここで用いられる“実質的に純粋”という用語は、他のタンパク質、脂質、炭 水化物又はそれが天然に随伴している他の物質を実質的に含まないＧＤＦ−８の ことをいう。当業者は、タンパク質精製の標準的技術を用いてＧＤＦ−８を精製 することができる。この実質的に純粋なポリペプチドは、非還元的ポリアクリル アミドゲル上で単一の主バンドを示すであろう。ＧＤＦ−８ポリペプチドの純度 は、アミノ末端のアミノ酸配列分析によっても測定することができる。ＧＤＦ− ８ポリペプチドには、ＧＤＦ−８の活性が残っている限り、このポリペプチドの 機能性断片が含まれる。ＧＤＦ−８の生物活性を含有するより小さなペプチドが 本発明に 包含される。 本発明は、ＧＤＦ−８タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。 これらポリヌクレオチドには、ＧＤＦ−８をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲ ＮＡ配列が含まれる。ＧＤＦ−８の全部又は部分をコードする全てのポリヌクレ オチドも、それらがＧＤＦ−８活性を有するポリペプチドをコードする限りここ に含まれることが了解される。かかるポリヌクレオチドには、天然に存在する、 合成の、及び故意に操作したポリヌクレオチドが含まれる。例えば、ＧＤＦ−８ ポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発に付してもよい。ＧＤＦ−８のため のポリヌクレオチド配列にはアンチセンス配列も含まれる。本発明のポリヌクレ オチドには、遺伝暗号の結果として縮重している配列が含まれる。２０の天然ア ミノ酸があり、その殆どが１を越えるコドンにより規定される。従って、そのヌ クレオチド配列によりコードされるＧＤＦ−８ポリペプチドのアミノ酸配列が機 能的に不変である限り、全ての縮重ヌクレオチド配列が本発明に包含される。 ＧＤＦ−８遺伝子の部分を含有するゲノミックＤＮＡ配列が、ここに具体的に 開示されている。この配列は、ＧＤＦ−８前駆体タンパク質の予想Ｃ−末端領域 に対応するオープンリーディングフレームを含有する。コードされるポリペプチ ドは、２つの潜在的タンパク質分解性プロセシング部位（KR及びRR）を含有する と予想される。この前駆体の下流部位での開裂は、約１２，４００の予想分子量 を有する１０９アミノ酸の生物活性成熟Ｃ−末端断片を生じるであろう。また、 完全長マウス及びヒトＧＤＦ−８ ｃＤＮＡ配列も開示されている。このマウス プレプロＧＤＦ −８タンパク質は長さが３７６アミノ酸であって、２６７６塩基対ヌクレオチド 配列によりコードされ、それはヌクレオチド１０４から開始しヌクレオチド１２ ３２のTGA停止コドンまで及ぶ。ヒトＧＤＦ−８タンパク質は３７５アミノ酸で あり、ヌクレオチド５９から開始しヌクレオチド１１８４まで及ぶオープンリー ディングフレームを有する２７４３塩基対配列によりコードされる。 推定タンパク質分解性プロセシング部位の後ろのＧＤＦ−８のＣ−末端領域は 、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの既知メンバーと有意な相同性を示す。このＧ ＤＦ−８配列は、他のファミリーメンバー内に高度に保存されている殆どの残基 を含有する（図３を参照のこと）。ＴＧＦ−β類とインヒビンβ類のように、Ｇ ＤＦ−８は、殆ど全ての他のファミリーメンバーに見られる７つのシステインの ほかに追加の対のシステイン残基を含有する。既知のファミリーメンバーの中で 、ＧＤＦ−８はＶｇｒ−１に最も相同性である（４５％配列同一性）（図４を参 照のこと）。 組換えＧＤＦ−８の一次アミノ酸配列を僅かに修飾すると、ここに記載したＧ ＤＦ−８ポリペプチドに比較して実質的に等しい活性を有するタンパク質が生じ 得る。かかる修飾は、部位特異的突然変異誘発のように故意であっても自然に生 じたものであっってもよい。ＧＤＦ−８の生物活性が依然として存在する限り、 これら修飾によりもたらされる全てのポリペプチドがここに含まれる。更に、１ 又は２以上のアミノ酸を欠失させても、その生物活性を有意に変化させることな く、その結果生じる分子の構造の修飾がもたらされる。これは、より広い有用性 をもつと思われるより小さな活性分子の開発へと導くことができる。例えば、Ｇ ＤＦ −８生物活性に不要なアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸を除去すること ができる。 本発明のＧＤＦ−８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列には、開示し た配列及びその保存的変異体が含まれる。ここで用いる“保存的変異体”という 用語は、他の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を表わす。保存的 変異体の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの如き１つの 疎水基の別の疎水基との置換；又はアルギニンのリシンとの置換、グルタミン酸 のアスパラギン酸との置換、又はグルタミンのアスパラギンとの置換等の如き１ つの極性基の別の極性基との置換が含まれる。“保存的変異体”という用語には 、未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を用いることも含まれる。但し、そ の置換ポリペプチドに対して生じる抗体はその未置換ポリペプチドとも免疫反応 することができることを条件とする。 本発明のＤＮＡ配列は、幾つかの方法により得ることができる。例えば、この ＤＮＡは、当該技術分野で周知のハイブリダイゼーション技術を用いて単離する ことができる。これらには、1）相同性ヌクレオチド配列を検出するためのゲノ ミック又はｃＤＮＡライブラリーとプローブとのハイブリダイゼーション、2） 興味の対象であるＤＮＡ配列にアニーリングできるプライマーを用いるゲノミッ クＤＮＡ又はｃＤＮＡ上でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び3）共有さ れる構造的特徴を有するクローン化ＤＮＡ断片を検出するための発現ライブラリ ーの抗体スクリーニング、が含まれるがこれらに限定されない。 好ましくは、本発明のＧＤＦ−８ポリヌクレオチドは、哺乳動 物、最も好ましくは、マウス、ラット、又はヒトから誘導される。適切なプロー ブが入手可能であれば、核酸ハイブリダイゼーションに依拠するスクリーニング 操作であらゆる生物から任意の遺伝子配列を単離するのが可能である。問題のタ ンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、化 学的に合成することができる。これには、短いオリゴペプチドのアミノ酸配列が 既知でなければなない。このタンパク質をコードするＤＮＡ配列は遺伝暗号から 推定することができるが、遺伝暗号の縮重を考慮に入れなければならない。その 配列が縮重したものである場合には混合付加反応（mixed addition reaction） を行うことが可能である。これは、変性二本鎖ＤＮＡの不均一混合液を含む。か かるスクリーニングのために、ハイブリダイゼーションを好ましくは一本鎖ＤＮ Ａ又は変性二本鎖ＤＮＡのいずれかで行う。興味の対象であるポリペプチドに関 連するｍＲＮＡ配列が極端に少ない量しか存在しない供給源から誘導されるｃＤ ＮＡクローンの検出には、ハイブリダイゼーションが特に有用である。換言する と、非特異的結合の回避に向けたストリンジェントなハイブリダイゼーション条 件を用いることにより、例えば、特異的ｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフ ィーでの可視化を、その標的ＤＮＡとその完全な相補体である単一プローブとの 混合液中でのハイブリダイゼーションにより可能とすることができる(Wallaceら ，Nucleic Acids Res.，9:879，1981)。 ＧＤＦ−８をコードする特定のＤＮＡ配列の開発は、1）ゲノミックＤＮＡか らの二本鎖ＤＮＡ配列の単離；2）興味の対象であるポリペプチドの必要なコド ンを得るためのＤＮＡ配列の化学 的製造；及び3）真核ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写による二本鎖Ｄ ＮＡ配列のin vitro合成、によっても得ることができる。後者の場合には、一般 にｃＤＮＡといわれるｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補体が最終的に生成する。 組換え操作に用いる特定ＤＮＡ配列を開発するための上記の３種の方法のうち 、ゲノミックＤＮＡ単離物の単離が最も普通ではない。これは、特に、イントロ ンの存在のために哺乳動物ポリペプチドを微生物で発現させることが望ましい場 合に当てはまる。 ＤＮＡ配列の合成は、所期のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が既知 であるときは、しばしば最適の方法となる。所期のポリペプチドのアミノ酸残基 の全配列が未知であるときには、ＤＮＡ配列の直接合成は可能ではないので、最 上の方法はｃＤＮＡ配列の合成となる。興味の対象であるｃＤＮＡ配列を単離す る標準的操作の中で抜きん出ているのは、高レベルの遺伝子発現を有するドナー 細胞内に豊富なｍＲＮＡの逆転写から誘導されるプラスミド又はファージ保有ｃ ＤＮＡライブラリーの形成である。ポリメラーゼ連鎖反応法と組み合わせて用い ると、希薄な発現産物であっもクローン化できる。ポリペプチドのアミノ酸配列 のかなりの部分が分かっている場合には、標的ｃＤＮＡ中に存在すると推定され る配列を複写する標識した一本又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡプローブ配列を作 って、一本鎖型に変性されたｃＤＮＡのクローン化コピー上で行われるＤＮＡ／ ＤＮＡハイブリダイゼーション操作に用いることができる（Jayら，Nucl．Acid Res.，11:2325，1983）。 λｇｔ１１の如きｃＤＮＡ発現ライブラリーは、ＧＤＦ−８に 特異的な抗体を用いて、少なくとも１つのエピトープを有するＧＤＦ−８ペプチ ドについて間接的にスクリーニングすることができる。かかる抗体はポリクロー ナル的に誘導されてもモノクローナル的に誘導されてもよく、ＧＤＦ−８ ｃＤ ＮＡの存在を示す発現産物を検出するのに用いることができる。 ＧＤＦ−８をコードするＤＮＡ配列は、適する宿主細胞内へのＤＮＡ移入によ り in vitroで発現させることができる。“宿主細胞”は、ベクターがその中で 増殖できてそのＤＮＡを発現しうる細胞である。この用語は、宿主細胞の如何な る子孫も包含する。複製の間に突然変異が起こることがあるので、全ての子孫が 親細胞と同一という訳ではないことが了解される。しかしながら“宿主細胞”と いう用語を用いるときは、かかる子孫が含まれる。安定な移入は、外来ＤＮＡを 宿主内に継続的に維持することを意味するのであるが、その方法は当該技術分野 で既知である。 本発明では、ＧＤＦ−８ポリヌクレオチド配列を組換え発現ベクター内に挿入 してもよい。“組換え発現ベクター”という用語は、ＧＤＦ−８遺伝子配列の挿 入又は組み込みにより操作されたプラスミド、ウィルス又は当該技術分野で既知 のその他の運搬体のことをいう。かかる発現ベクターは、宿主の挿入遺伝子配列 の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する。この発現ベクターは、 典型的には、複製起点、プロモーター、並びにその形質転換細胞の表現型選択を 可能にする特定遺伝子を含有する。本発明に用いるのに適するベクターには、細 菌内での発現のためのＴ７に基づく発現ベクター（Rosenbergら，Gene，56:125 ，1987）、哺乳動物細胞内での発現のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベク ター（LeeとNathans，J．Biol．Chem.，263:3521，1988）及び昆虫細胞内での発 現のためのバキュロウィルス誘導ベクターが含まれるが、これらに限定されない 。ＤＮＡセグメントは、調節要素、例えば、プロモーター（例えば、Ｔ７、メタ ロチオネインＩ、又はポリヘドリンプロモーター）に機能しうる状態で連結され たベクター内に存在することができる。 ＧＤＦ−８をコードするポリヌクレオチド配列は、原核生物内でも真核生物内 でも発現させることができる。宿主には、微生物、酵母、昆虫及び哺乳動物が含 まれ得る。原核生物内で真核性又はウィルス性配列を有するＤＮＡ配列を発現さ せる方法は、当該技術分野で周知である。宿主内で発現及び複製できる生物学的 に機能性のウィルス及びプラスミドＤＮＡベクターは、当該技術分野で周知であ る。かかるベクターが、本発明のＤＮＡ配列を組み込むのに用いられる。好まし くは、ＧＤＦ−８の成熟Ｃ−末端領域は、ＧＤＦ−８の全コーディング配列を含 有するｃＤＮＡクローンから発現される。また、ＧＤＦ−８のＣ−末端部分を、 ＴＧＦ−βファミリーの別のメンバーのプロ領域との融合タンパク質として発現 させても、別のプロ領域と同時発現させてもよい（例えば、Hammondsら，Molec ．Endocrin．5:149，1991；Gray，A.とMason，A.，Science，247:1328，1990を 参照のこと）。 組換えＤＮＡでの宿主細胞の形質転換は、当業者にとって周知である慣用的技 術により行うことができる。宿主が大腸菌の如き原核生物である場合、ＤＮＡ取 込み能を有するコンピテント細胞は、対数増殖期後に採取してからＣａＣｌ₂法 により処理した細胞から当該技術分野で周知の操作を用いて調製することができ る。 また、ＭｇＣｌ₂又はＲｂＣｌを用いることができる。形質転換は、必要なら宿 主細胞のプロトプラストを形成した後に行うこともできる。 宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈；マイクロインジェクショ ン、エレクトロポレーション、リポソーム内に保持させたプラスミドの挿入の如 き慣用的な機械的操作；又はウィルスベクター；の如きＤＮＡのトランスフェク ションを用いることができる。真核細胞は、本発明のＧＤＦ−８をコードするＤ ＮＡ配列、及び単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子の如き選択可能な表現型を コードする第二外来ＤＮＡ分子で同時形質転換することもできる。他の方法は、 シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）又はウシパピローマウィルスの如き真核性ウ ィルスベクターを用いて、真核細胞を一時的に感染又は形質転換して本タンパク 質を発現させることである（例えば、Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman編，1982を参照のこと）。 本発明により提供される微生物発現ポリペプチド又はその断片の単離及び精製 は、分取クロマトグラフィー及びモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を 関与させる免疫学的分離法を含む慣用的手段により行うことができる。 本発明は、ＧＤＦ−８ポリペプチド又はその機能性断片と免疫反応性の抗体を 包含する。異なるエピトープ特異性を有するプールしたモノクローナル抗体から 本質的になる抗体、並びに明確に異なるモノクローナル抗体調製物が提供される 。モノクローナル抗体は、当業者にとって周知の方法により本タンパク質の断片 を 含有する抗原から作られる(Kohlerら，Nature，256:495，1975)。本発明で用い る抗体という用語は、ＧＤＦ−８上のエピトープ決定基に結合できる無傷の抗体 分子並びにＦａｂ及びＦ(ａｂ’)₂の如きその断片を包含するものである。 “細胞増殖性疾患”という用語は、形態学的にも遺伝子型的にもしばしば周辺 組織と相違して見える悪性並びに非悪性の細胞集団を表わす。悪性細胞（即ち、 癌）は、多段階経過の結果発生する。アンチセンス分子であるＧＤＦ−８ポリヌ クレオチドは、種々の器官系、特に、例えば、筋肉内の細胞又は脂肪組織の悪性 腫瘍を治療のに有用である。本質的に、ＧＤＦ−８の変化した発現に病因学的に 関連するあらゆる疾患は、ＧＤＦ−８抑制剤での治療に感受性であると考えられ る。かかる疾患の１つは、例えば、悪性細胞増殖性疾患である。 本発明は、抗ＧＤＦ−８抗体をＧＤＦ−８関連疾患を有する疑いがある細胞に 接触させ、そして該抗体への結合を検出することを含む、筋肉又は脂肪組織の細 胞増殖性疾患を検出する方法を提供する。ＧＤＦ−８と反応性の抗体は、ＧＤＦ −８への結合の検出を可能にする化合物で標識される。本発明の目的のためには 、ＧＤＦ−８ポリペプチドに特異的な抗体を用いて、生物学的液体及び組織中の ＧＤＦ−８のレベルを検出する。検出できる量の抗原を含有するあらゆる検体を 用いることができる。本発明の好ましいサンプルは筋肉組織である。疑いのある 細胞内のＧＤＦ−８のレベルを正常細胞内のレベルと比較して、その被験体がＧ ＤＦ−８関連細胞増殖性疾患を有するかどうか確認することができる。好ましく は、被験体はヒトである。 本発明の抗体は、in vitro又はin vivoの免疫診断又は免疫治療を施すのが望 ましいあらゆる被験体に用いることができる。本発明の抗体は、例えば、それら を液相で用いるか又は固相担体に結合させるイムノアッセイに用いるのに適して いる。加えて、これらイムノアッセイにおける抗体は、種々の方法で検出できる ように標識することができる。本発明の抗体を用いることができるイムノアッセ イのタイプの例は、直接又は間接のいずれかの形式の競合及び非競合イムノアッ セイである。かかるイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及 びサンドイッチ（イムノ）アッセイである。本発明の抗体を用いる抗原の検出は 、フォワード、リバース、又は同時モードのいずれかで行われる、生理学的サン プルに対する免疫組織化学的アッセイを含むイムノアッセイを用いて行うことが できる。当業者は、過度に実験を重ねることなく他のイムノアッセイ形式を知っ ているか又は容易に識別できるであろう。 本発明の抗体は、多くの異なる担体に結合させて、本発明のポリペプチドを含 む抗原の存在を検出するのに用いることができる。周知の担体の例には、ガラス 、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、ア ミラーゼ、天然又は変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄 鉱が含まれる。担体の性質は、本発明の目的のためには可溶性であっても不溶性 であってもよい。当業者は、結合抗体のための他の適する担体を知っているか、 又は定型的な実験を用いてそうしたものを探知できるであろう。 当業者にとって既知の多くの異なる標識及び標識方法がある。 本発明に用いることができる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位元素、蛍 光化合物、コロイド状金属、化学発光化合物、リン光化合物、及び生物発光化合 物が含まれる。当業者は、抗体への結合のための他の適する標識を知っているか 、又は定型的な実験を用いてそうしたものを探知できるであろう。 より大きな感度をもたらすことができる他の技術は、低分子量ハプテンへの抗 体のカップリングからなるものである。次いで、これらハプテンを第二反応によ り特異的に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、又は 特異的抗ハプテン抗体と反応できるジニトロフェノール、ピリドキサール、及び フルオレセインの如きハプテンを用いるのが普通である。 抗原のin vivo検出のために本発明のモノクローナル抗体を用いるには、検出 できるように標識された抗体を診断に有効な量で与える。“診断に有効な”とい う用語は、検出できるように標識されたモノクローナル抗体の量が、そのモノク ローナル抗体が特異的である本発明のポリペプチドを含む抗原を有する部位の検 出を可能にするのに十分な量で投与されることを意味する。 投与される標識モノクローナル抗体の濃度は、ポリペプチドを有する細胞への 結合がバックグランドに比較して検出可能となるのに十分であるべきである。更 に、検出できるように標識されたモノクローナル抗体は、最良の標的対バックグ ランドのシグナル比が得られるように、循環系から速やかに浄化されるのが望ま しい。 一般に、in vivo診断のための標識モノクローナル抗体の投与量は、その個体 の年齢、性別、及び疾患の程度の如き要因に依存 して変動するであろう。かかる投与量は、例えば、多数回注射するかどうか、抗 原負担、及び当業者にとって既知の他の要因に依存して変動してもよい。 in vivo診断的画像化（diagnostic imaging）については、利用できる検出装 置の型が所与の放射性同位元素を選択するに際しての主要な要因となる。選ばれ る放射性同位元素は、所与の型の装置にとって検出可能なタイプの崩壊を持たな ければならない。in vivo診断のための放射性同位元素を選択するに際してのい ま一つ重要な要因は、宿主に対して有害な放射線を最小限とすることである。理 想的には、in vivo画像化に用いる放射性同位元素は粒子の放出を欠いているが 、慣用的なガンマカメラで容易に検出できる１４０〜２５０ｋｅＶ幅の多数の光 子を生じるであろう。 in vivo診断のため、放射性同位元素は直接にでも中間官能基を用いて間接に でもイムノグロブリンに結合させることができる。金属イオンとして存在する放 射性同位元素をイムノグロブリンに結合させるのにしばしば用いられる中間官能 基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及びエチレンジアミン四酢酸（ ＥＤＴＡ）及び類似の分子の如き二官能性キレート剤である。本発明のモノクロ ーナル抗体に結合できる金属イオンの典型例は、¹¹¹Ｉｎ、⁹⁷Ｒｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸ Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒ、及び²⁰¹Ｔｌである。 本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）又は電子スピン共 鳴（ＥＳＲ）におけるように、in vivo診断の目的で常磁性同位元素で標識する こともできる。一般に、診断画像を可視化するあらゆる慣用的方法を用いること ができる。通常、ガンマ及び陽電子放出放射性同位元素がカメラ画像化に用いら れ、ＭＲＩには常磁性同位元素が用いられる。かかる技術に特に有用な元素には 、¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｃｒ、及び⁵⁶Ｆｅが含まれる。 本発明のモノクローナル抗体をin vitro及びin vivoで用いて被験体における ＧＤＦ−８関連疾患の改善の経過を追跡することができる。かくして、例えば、 本発明のポリペプチドを含む抗原を発現する細胞の数の増加若しくは減少又は種 々の体液中に存在するかかる抗原の濃度の変化を測定することによって、ＧＤＦ −８関連疾患を改善することを狙った特定の治療法が有効であるかどうかを確認 することが可能となろう。“改善”という用語は、治療を受けている被験体のＧ ＤＦ−８関連疾患の好ましくな い作用が少なくなることを表わす。 本発明は、正常細胞内での発現に比較して変わったやり方で発現され得るヌク レオチド配列を同定するものであり、従ってこの配列に向けた適切な治療又は診 断技術をデザインすることが可能となる。かくして、細胞増殖性疾患がＧＤＦ− ８の発現と関係している場合には、翻訳レベルでＧＤＦ−８発現を妨害する核酸 配列を用いることができる。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸及び リボザイムを用いて特定のＧＤＦ−８ ｍＲＮＡの翻訳を遮断するものであって 、それはそのｍＲＮＡをアンチセンス核酸でマスクするか又はそれをリボザイム で開裂させるかのいずれかによりなされる。かかる疾患には、例えば、神経変性 疾患が含まれる。 アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に相補的なＤＮ Ａ又はＲＮＡ分子である（Weintraub，Scientific American，262:40，1990）。 細胞内でこのアンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡとハイブリダイズして二本鎖 分子を形成する。細胞は二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないだろうから、このア ンチセンス核酸はこのｍＲＮＡの翻訳を妨害することになる。約１５ヌクレオチ ドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。というのは、それらは容易に合成され かつ標的ＧＤＦ−８産生細胞内に導入した際により大きな分子よりもあまり問題 を起こしそうにないからである。遺伝子のin vitro翻訳を阻害するためにアンチ センス法を用いることは、当該技術分野で周知である(Marcus-Sakura，Anal．Bi ochem.，172:289，1988)。 リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似のやり方 で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に開裂する能力を有すＲＮＡ分子である。これらＲ ＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾を通して、あるＲＮＡ分子内の特定の ヌクレオチド配列を認識してそれを開裂する分子を工学的に作ることが可能であ る(Cech，J．Amer．Med．Assn.，260:3030，1988)。このアプローチの主要な利 点は、それらが配列特異的なので、特定の配列を有するｍＲＮＡだけを不活性化 する点である。 ２つの基本的な型のリボザイム、即ち、テトラヒメナ型(Hasselhoff，Nature ，334:585，1988)及び“ハンマーヘッド”型がある。テトラヒメナ型リボザイム は長さが４塩基の配列を認識し、“ハンマーヘッド”型リボザイムは長さが１１ 〜１８塩基の塩基配列を認識する。認識配列が長ければ長いほど、その配列が標 的ｍＲＮＡ種内に独占的に存在する可能性が大きくなる。従って、特定のｍＲＮ Ａ種を不活性化するには、ハンマーヘッド型リボザイムがテトラヒメナ型リボザ イムよりも好ましく、しかも１８塩基認識配列がより短い認識配列よりも好まし い。 本発明は、ＧＤＦ−８タンパク質により媒介される細胞増殖性疾患又は免疫疾 患を治療するための遺伝子治療も提供する。かかる治療は、ＧＤＦ−８アンチセ ンスポリヌクレオチドを増殖性疾患を有する細胞内に導入することによりその治 療効果をもたらすことになる。アンチセンスＧＤＦ−８ポリヌクレオチドの送達 は、キメラウィルスの如き組換え発現ベクター又はコロイド分散系を用いて行う ことができる。アンチセンス配列の治療的送達に特に好ましいのは、ターゲット （標的設定）されたリポソームを用いることである。 ここに教示した遺伝子治療に用いることができる種々のウィルスベクターには 、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス又は、好ましくは、 レトロウィルスの如きＲＮＡウィルスが含まれる。好ましくは、レトロウィルス ベクターは、マウス又は鳥類レトロウィルスの誘導体である。単一の外来遺伝子 を挿入することができるレトロウィルスの例には、モロニーマウス白血病ウィル ス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイ（Harvey）マウス肉腫ウィルス（ＨａＭｕＳＶ） 、マウス乳癌ウィルス（ＭｕＭＴＶ）、及びラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）が含 まれるが、これらに限定されない。多くの更なるレトロウィルスベクターが多様 な遺伝子を取り込むことができる。導入細胞が同定されて世代形成できるように 、これら全てのベクターは、選択マーカー用の遺伝子を移入するか又は組み込む ことができる。興味の対象であるＧＤＦ−８配列を、例えば、特定の標的細胞上 のレセプターのためのリガンドをコードする別の遺伝子と一緒にウィルスベクタ ーの中に挿入することにより、そのベクターはその時点で標的特異性となる。例 えば、糖、糖脂質又はタンパク質を付けることにより、レトロウィルスベクター を標的特異性にすることができる。好ましいターゲッティングは、そのレトロウ ィルスベクターをターゲットとするための抗体を用いることにより行われる。当 業者は、過度な実験を重ねることなく、ＧＤＦ−８アンチセンスポリヌクレオチ ドを含有するレトロウィルスベクターの標的特異的送達を可能にするためにレト ロウィルスゲノム内に挿入できるか又はウィルスエンベロープに付けることがで きる特定のポリヌクレオチド配列を知っているか、又は容易に探知できるであろ う。 組換えレトロウィルスは欠損ウィルスであるので、それらは感染性ベクター粒 子を生成させるために助けを必要とする。この助けは、例えば、レトロウィルス の全ての構造遺伝子をそのＬＴＲ内の調節配列の制御下でコードするプラスミド を含有するヘルパー細胞系を用いることにより提供することができる。これらプ ラスミドは、そのパッケージングメカニズムがキャプシド化のためのＲＮＡ転写 産物を認識するのを可能にするヌクレオチド配列を欠いている。このパッケージ ングシグナルの欠失を有するヘルパー細胞系には、例えば、Ψ２、ＰＡ３１７及 びＰＡ１２が含まれるが、これらに限定されない。これら細胞系は、ゲノムがパ ッケージされていないので、空のウィルス粒子を産生する。レトロウィルスベク ターを、パッケージングシグナルは完全であるが構造遺伝子が興味の対象の他の 遺伝子により置換されている細胞内に導入すると、そのベクターはパッケージさ れてベクターウィルス粒子を産生することができる。 また、ＮＩＨ３Ｔ３又は他の組織培養細胞は、レトロウィルス構造遺伝子ｇａ ｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖをコードするプラスミドで慣用的なリン酸カルシウムトラ ンスフェクションにより直接トランスフェクトすることができる。次いで、これ ら細胞を興味の対象の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクト する。得られる細胞は、培地中にそのレトロウィルスベクターを放出する。 ＧＤＦ−８アンチセンスポリヌクレオチドのもう１つのターゲットされた送達 系は、コロイド分散系である。コロイド分散系には、巨大分子複合体；ナノカプ セル；マイクロスフェア；ビー ズ；及び水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質を ベースとした系；が含まれる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである 。リポソームは、in vitro及びin vivoでの送達ベヒクルとして有用である人工 膜小胞である。サイズが０.２〜４.０μｍの大型の単ラメラ小胞（largeunilame llar vesicle，ＬＵＶ）は巨大分子を含有する水性緩衝液を相当なパーセンテー ジで保持できることが示された。ＲＮＡ、ＤＮＡ及び無傷ウィルス粒子をその水 性内部に保持させて、生物活性な形で細胞に送達することができる（Fraleyら， Trends Biochem．Sci.，6:77，1981）。哺乳動物細胞に加えて、リポソームは、 植物、酵母、及び細菌細胞におけるポリヌクレオチドの送達に用いられてきた。 リポソームが有効な遺伝子移入ベヒクルであるためには、次の特徴が存在すべき である：(1)興味の対象である遺伝子を高い効率で保持するがそれらの生物活性 を弱めないこと；(2)非標的細胞に比較して標的細胞に優先的かつ強固に結合す ること；(3)標的細胞の細胞質にその小胞の水性内容物を高い効率で送達するこ と；及び(4)遺伝子情報を正確かつ効率的に発現すること（Manninoら，Biotechn iques，6:682，1988）。 リポソームの組成は、通常、リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質の組み 合わせで、通常は、ステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。他 のリン脂質又は他の脂質を用いることもできる。リポソームの物理的特性は、ｐ Ｈ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。 リポソーム形成に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセ ロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノ ールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド及びガングリオシドの如きホスファ チジル化合物が含まれる。特に有用なのは、脂質部分が１４〜１８炭素原子、特 に１６〜１８炭素原子を含有しそして飽和であるジアシルホスファチジルグリセ ロールである。代表的なリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイ ルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。 リポソームのターゲッティングは、解剖学的及び機械学的要因に基づいて分類 される。解剖学的分類は、選択性のレベル、例えば、器官特異性、細胞特異性及 びオルガネラ特異性のレベルに基づく。機械学的ターゲッティングは、それが受 動的であるか能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的ターゲッ ティングは、洞様毛細血管を含む器官内の細網内皮系（reticulo-endothelial s ystem，ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの自然的傾向を用いる。一方、能 動的ターゲッティングは、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質又はタ ンパク質の如き特異的リガンドにカップリングさせることにより又はリポソーム の組成若しくはサイズを変えることによりリポソームを変更して、天然に存在す る局在化部位以外の器官及び細胞型に標的を定めることを包含する。 ターゲットされた送達系の表面をいろいろな方法で修飾することができる。タ ーゲットされたリポソーム送達系の場合には、脂質基をリポソームの脂質二重層 内に組み込んで、標的指向性リガンドをそのリポソーム二重層との安定な結合状 態で維持するよう にできる。脂質鎖を標的指向性リガンドに結合するために種々の連結基を用いる ことができる。 筋肉及び脂肪組織内でのＧＤＦ−８の発現のために、本発明のポリペプチド、 ポリヌクレオチド及び抗体を用いるこれら組織に関連する種々の用途がある。か かる用途には、神経組織の如きこれら及び他の組織に関係する細胞増殖性疾患の 治療が含まれる。加えて、ＧＤＦ−８は、種々の遺伝子治療法に有用であり得る 。 実施例６のデータは、ヒトＧＤＦ−８遺伝子が染色体２にあることを示してい る。ＧＤＦ−８の染色体位置を種々のヒトの疾患のマップ位置と比較することに より、ＧＤＦ−８遺伝子内の突然変異がヒトの疾患の病因に関連しているかどう かを確認することが可能な筈である。例えば、若年筋萎縮性側索硬化症の常染色 体性劣性型は、染色体２にあることが示された（Hentatiら，Neurology，42［Su ppl.3］:201，1992）。ＧＤＦ−８のより正確なマッピング及びこれら患者から のＤＮＡの分析で、ＧＤＦ−８が実際にこの疾患において害された遺伝子である ことを示すことができる。さらに、ＧＤＦ−８は染色体２を他の染色体から区別 するのに有用である。 以下の実施例は、本発明を説明するものであって限定を意図するものではない 。それらは用いることができるものの代表であるが、当業者にとって既知の他の 方法を代わりに用いてもよい。 実施例１ 新規なＴＧＦ−βファミリーメンバーの同定及び単離 ＴＧＦ−βスーパーファミリーの新規なメンバーを同定するために、既知のフ ァミリーメンバー間の２つ保存領域に対応する縮重オリゴヌクレオチドを設計し た。一方の領域はＭＩＳを除く全てのファミリーメンバーで保存されている２つ のトリプトファン残基に及び、他方の領域はＣ−末端の近くの非変異システイン 残基に及ぶ領域であった。これらプライマーをマウスゲノミックＤＮＡ上でポリ メラーゼ連鎖反応に用いた後、それらプライマーの５'末端に位置する制限部位 を用いてＰＣＲ産物をサブクローン化し、これらサブクローン化挿入体を保有す る個々の大腸菌コロニーを拾い上げ、そしてランダム配列決定及びハイブリダイ ゼーション分析の組み合わせを用いてこのスーパーファミリーの既知メンバーを 除いた。 下記プライマーで得られたＰＣＲ産物の混合物からＧＤＦ−８を同定した。 SJL141:5'-CCGGAATTCGGITGG(G/C/A)A(G/A/T/C)(A/G)A(T/C) TGG(A/G)TI(A/G)TI(T/G)CICC-3'（配列番号：１） SJL147:5'-CCGGAATTC(G/A)CAI(G/C)C(G/A)CA(G/A)CT(G/A/T/C) TCIACI(G/A)(T/C)CAT-3'（配列番号：２） これらプライマーを用いるＰＣＲは２μｇのマウスゲノミックＤＮＡを用いて ９４℃で１分間、５０℃で２分間、そして７２℃で２分間の４０サイクルを行っ た。 約２８０ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製し、ＥｃｏＲＩで消化し、再度ゲル精製 し、そしてBluescriptベクター（Stratagene， San Diego，CA）内にサブクローン化した。個々のサブクローンを保有する細菌 コロニーを９６ウェルマイクロタイタープレート内に拾い取り、そしてそれら細 胞をニトロセルロース上にプレートすることにより多数のレプリカを調製した。 これらレプリカフィルターをこのファミリーの既知メンバーに相当するプローブ にハイブリダイズさせ、そして配列分析用に非ハイブリダイズコロニーからＤＮ Ａを調製した。 アミノ酸配列GW(H/Q/N/K/D/E)(D/N)W(V/I/M)(V/I/M)(A/S)P（配列番号：９） 及びM(V/I/M/T/A)V(D/E)SC(G/A)C（配列番号：１０）をそれぞれコードするＳＪ Ｌ１４１及びＳＪＬ１４７のプライマーの組み合わせを用いたところ、分析した １１０のサブクローンの中から以前に同定された４種の配列（ＢＭＰ−４、イン ヒビンβＢ、ＧＤＦ−３及びＧＤＦ−５）と１種の新規な配列が得られ、これを ＧＤＦ−８と名付けた。 下記のプライマーを用いてヒトＧＤＦ−８を単離した。 ACM13:5'-CGCGGATCCAGAAGTCAAGGTGACAGACACAC-3' （配列番号：３）； 及び ACM14:5'-CGCGGATCCTCCTCATGAGCACCCACAGCGGTC-3'（配列番号：４） これらプライマーを用いるＰＣＲは１μｇのヒトゲノミックＤＮＡを用いて９ ４℃で１分間、５８℃で２分間、そして７２℃で２分間の３０サイクルを行った 。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、そしてBluescriptベクタ ー（Stratagene，San Francisco，CA）内にサブクローン化した。 実施例２ ＧＤＦ−８の発現パターン及び配列 ＧＤＦ−８の発現パターンを調べるために、種々の成体組織から調製したＲＮ Ａサンプルをノーザン分析によりスクリーニングした。ＲＮＡ単離及びノーザン 分析は、ハイブリダイゼーションを５×ＳＳＰＥ、１０％硫酸デキストラン、５ ０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌサケＤＮＡ、及び各０.１％ のウシ血清アルブミン、フィコール、及びポリビニルピロリドン中で行ったこと を除いて、以前に記載された通りに行った（Lee，S.J.，Mol．Endocrinol．4:10 34，1990）。各組織から調製した５μｇの２度ポリＡ選択ＲＮＡ（筋肉について は２μｇのＲＮＡしか用いなかった）をホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、 ブロットし、そしてＧＤＦ−８で釣り上げた。図１に示すように、このＧＤＦ− ８プローブを用いて、筋肉中で最高レベルで発現されそして脂肪組織中ではかな り低いレベルでしか発現されない単一のｍＲＮＡ種を検出した。 ＧＤＦ−８遺伝子のより大きなセグメントを得るために、マウスゲノミックラ イブラリーをＧＤＦ−８ＰＣＲ産物から誘導したプローブでスクリーニングした 。ＧＤＦ−８ゲノミッククローンの部分配列を図２ａに示す。この配列は、ＧＤ Ｆ−８前駆体タンパク質の推定Ｃ−末端領域に対応するオープンリーディングフ レームを含有する。この推定ＧＤＦ−８配列は、ボックスで囲んだ２つの潜在的 タンパク質分解性プロセシング部位を含有する。これら部位の２番目でのこの前 駆体の開裂により、１２，４００の予想分子量を有する長さが１０９アミノ酸の 成熟Ｃ−末端断片が生ずるであろう。ヒトＧＤＦ−８の部分配列を図２ｂに示す 。このヒトクローンの単離中にＰＣＲで引き起こされる誤りがなかっ たと仮定すると、この領域におけるヒト及びマウスのアミノ酸配列は１００％同 一である。 推定タンパク質分解性プロセシング部位のあとに続くＧＤＦ−８のＣ−末端領 域は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの既知メンバーに対して有意な相同性を示 す（図３）。図３は、ＧＤＦ−８のＣ−末端配列と、ヒトＧＤＦ−１(Lee，S.J. ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:4250-4254，1991)、ヒトＢＭＰ−２及び４( Wozneyら，Science，242:1528-1534，1988)、ヒトＶｇｒ−１(Celesteら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，87:9843-9847，1990)、ヒトＯＰ−１（Ozkaynakら，E MBO J.，9:2085-2093，1990）、ヒトＢＭＰ−５（Celesteら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，87:9843-9847，1990）、ヒトＢＭＰ−３（Wozneyら，Science，242 :1528-1534，1988）、ヒトＭＩＳ（Cateら，Cell，45:685-698，1986）、ヒトイ ンヒビンα、βＡ、及びβＢ(Masonら，Biochem．Biophys．Res．Commun.，135: 957-964，1986)、ヒトＴＧＦ−β１(Derynctら，Nature，316:701-705，1985)、 ヒトＴＧＦ−β２（deMartinら，EMBO J.，6:3673-3677，1987）、及びヒトＴＧ Ｆ−β３（ten Dijkeら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:4715-4719，1988） の対応する領域とのアラインメントを示す。保存システイン残基をボックスで囲 んである。短い横線はアラインメントを最大にするために空けた空所を表わす。 ＧＤＦ−８は、他のファミリーメンバーに高度に保存された殆どの残基を含有 し、それらには７つのシステイン残基がそれらの特徴的な間隔と共に含まれる。 ＴＧＦ−β類とインヒビンβ類の ように、ＧＤＦ−８は、２つの追加のシステイン残基も含有する。ＴＧＦ−β２ の場合には、これら２つの追加のシステイン残基が分子内ジスルフィド結合を形 成することが知られている(Daopin)ら，Science，257:369，1992；Schlunegger とGrutter，Nature，358:430，1992)。 図４は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの異なるメンバー間のアミノ酸相同性 を示す。数字は、第１保存システインからＣ−末端まで計算したそれぞれの対の 間のアミノ酸同一性のパーセントを表わす。ボックスは、特定のサブグループ内 で高度に関連するメンバー間の相同性を表わす。この領域では、ＧＤＦ−８がＶ ｇｒ−１に最も相同性である（４５％配列同一性）。 実施例３ マウス及びヒトＧＤＦ−８をコードするｃＤＮＡクローンの単離 マウス及びヒトＧＤＦ−８をコードする完全長ｃＤＮＡクローンを単離するた めに、ｃＤＮＡライブラリーをλＺＡＰIIベクター（Stratagene）中に骨格筋か ら調製したＲＮＡを用いて調製した。マウス及びヒト筋肉から調製した５μｇの ２度ポリＡ選択ＲＮＡから、それぞれ４.４×１０⁶及び１.９×１０⁶の組換えフ ァージからなるｃＤＮＡライブラリーをStratageneにより提供された使用説明書 に従って構築した。これらライブラリーを増幅しないでスクリーニングした。ｃ ＤＮＡ挿入体のライブラリースクリーニング及び特性決定は以前に記載された通 りに行った(Lee，S.J.，Mol．Endocrinol．4:1034-1040)。 マウス筋肉ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングした２.４×１０⁶組換え ファージから、２８０より多くの陽性ファージ を実施例１に記載したゲノミッククローンから誘導したマウスＧＤＦ−８プロー ブを用いて同定した。最長ｃＤＮＡ挿入体の分析した全ヌクレオチド配列を図５ ａ及び配列番号：１１に示す。この２６７６塩基対配列は、ヌクレオチド１０４ のメチオニンコドンから開始してヌクレオチド１２３２のTGA停止コドンまで及 ぶ１本の長いオープンリーディングフレームを含有する。この推定開始メチオニ ンコドンの上流には、ヌクレオチド２３の同一フレーム内（in-frame）停止コド ンがある。この予想プレプロＧＤＦ−８タンパク質は長さが３７６アミノ酸であ る。この配列は、Ｎ−末端において分泌のためのシグナルペプチドを示唆する疎 水性アミノ酸のコア（図６ａ）を、アスパラギン７２に１つの潜在的Ｎ−グリコ シル化部位を、アミノ酸２６４〜２６７に推定RXXRタンパク質分解性開裂部位を 、そしてＴＧＦ−βスーパーファミリーの既知メンバーに対して有意な相同性を 示すＣ−末端領域を含有する。推定RXXR部位における前駆体タンパク質の開裂は 、約１２，４００の予想分子量を有する１０９アミノ酸の長さの成熟Ｃ−末端Ｇ ＤＦ−８断片を生じるであろう。 ヒト筋肉ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングした１.９×１０⁶組換えフ ァージから、４個の陽性ファージをヒトゲノミックＤＮＡでのポリメラーゼ連鎖 反応により誘導したヒトＧＤＦ−８プローブを用いて同定した。最長ｃＤＮＡ挿 入体の全ヌクレオチド配列を図５ｂ及び配列番号：１３に示す。この２７４３塩 基対配列は、ヌクレオチド５９のメチオニンコドンから開始してヌクレオチド１ １８４のTGA停止コドンまで及ぶ１本の長いオープンリーディングフレームを含 有する。この予想プレプロＧＤ Ｆ−８タンパク質は長さが３７５アミノ酸である。この配列は、Ｎ−末端に分泌 のためのシグナルペプチドを示唆する疎水性アミノ酸のコア（図６ａ）を、アス パラギン７１に１つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位を、そしてアミノ酸２６３〜 ２６６に推定RXXRタンパク質分解性開裂部位を含有する。図７は、予想マウス（ 上方）及びヒト（下方）ＧＤＦ−８アミノ酸配列の比較を示す。数字は、Ｎ−末 端からのアミノ酸の位置を示す。これら２つの配列間の同一性を垂直線により表 わす。マウス及びヒトのＧＤＦ−８は、予想プロ領域内で約９４％同一性であり 、予想RXXR開裂部位の後ろで１００％同一性である。 実施例４ ＧＤＦ−８に対する抗体の調製及び 哺乳動物細胞内でのＧＤＦ−８の発現 ＧＤＦ−８に対する抗体を調製するために、ＧＤＦ−８抗原を細菌内で融合タ ンパク質として発現させた。アミノ酸２６８から３７６に及ぶマウスＧＤＦ−８ ｃＤＮＡの部分（成熟領域）をｐＲＳＥＴベクター（Invitrogen）内に、ＧＤ Ｆ−８コーディング配列がこのベクター内に存在する開始メチオニンコドンと同 じフレーム内に配置されるように挿入した。得られた構築体には、約１６，６０ ０の分子量を有する融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム ができた。この融合構築体をＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）細胞内に形質転 換し、この融合タンパク質の発現を記載された通りにイソプロピルチオ−β−ガ ラクトシドにより誘発した（Rosenbergら，Gene，56:125-135）。次いで、この 融合タンパク質をInvitrogenにより提供された使用 説明書に従って金属キレートクロマトグラフィーにより精製した。未精製及び精 製融合タンパク質のクマシーブルー染色ゲルを図８に示す。 この精製融合タンパク質を用いてウサギ及びニワトリの両方を免疫感作した。 ウサギの免疫感作はSpring Valley Labs(Sykesville，MD)により実施され、ニワ トリの免疫感作はHRP，Inc．(Denver，PA)により実施された。免疫感作したウサ ギ及び免疫感作したニワトリの両方からの血清のウェスタン分析により、この融 合タンパク質に対する抗体の存在が証明された。 哺乳動物細胞内でＧＤＦ−８を発現させるために、ヌクレオチド４８〜１３０ ３からのマウスＧＤＦ−８ ｃＤＮＡ配列をｐＭＳＸＮＤ発現ベクター内のメタ ロチオネインＩプロモーターの下流に両方向でクローン化した。このベクターは 、ＳＶ４０から誘導したプロセシングシグナル、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝 子、及び抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する遺伝子を含有する。(LeeとNa thans，J．Biol．Chem.，263:3521-3527)得られた構築体をチャイニーズハムス ター卵巣細胞内に形質転換し、そして安定な形質転換体をＧ４１８の存在下で選 択した。Ｇ４１８耐性細胞から調製した２ｍｌの馴化培地を透析し、凍結乾燥し 、変性還元条件下で電気泳動し、ニトロセルロースに移行させ、そして抗ＧＤＦ −８抗体（上記のもの）及び〔¹²⁵I〕ヨードプロテインＡと共にインキュベート した。 図９に示すように、ウサギＧＤＦ−８抗体（１：５００希釈）は、ＧＤＦ−８ の成熟Ｃ−末端断片のおよその予想分子量をもつタンパク質を、ＧＤＦ−８がメ タロチオネインプロモーターに関 して正しい（センス）方向にクローン化された構築体により形質転換された細胞 の馴化培地中に検出した（レーン２）。このバンドは、対照のアンチセンス構築 体で形質転換された細胞から調製した類似のサンプル中では検出されなかった（ レーン１）。ニワトリより調製した抗体を用いて同様な結果が得られた。それゆ え、ＧＤＦ−８は分泌され、これらトランスフェクト哺乳動物細胞による加水分 解プロセシングを受ける。 実施例５ ＧＤＦ−８の発現パターン ＧＤＦ−８の発現パターンを調べるために、種々のマウス組織源から調製した ５μｇの２度ポリＡ選択ＲＮＡをノーザン分析に付した。図１０ａに示すように （そして実施例２に示したように）、ＧＤＦ−８プローブは、検分した多くの成 体組織間で殆ど骨格筋にだけ存在する単一のｍＲＮＡ種を検出した。同ブロット をもっと長く露出すると、かなり低いが検出可能なレベルのＧＤＦ−８ ｍＲＮ Ａが、脂肪、脳、胸腺、心臓、及び肺に見られた。このことから、これら結果は 、骨格筋中でのＧＤＦ−８発現の高度な特異性を確認するものである。ＧＤＦ− ８ ｍＲＮＡは、マウス胚内においても検査した両妊娠期間（交尾後１２.５日及 び１８.５日）で検出されたが、胎盤では種々の発生段階において検出されなか った（図１０ｂ）。 実施例６ ＧＤＦ−８の染色体での位置確認 ＧＤＦ−８の染色体位置をマッピングするために、ヒト／げっ歯類体細胞ハイ ブリッド（Drwingaら，Genomics，16:311-413， 1993；DuboisとNaylor，Genomics，16:315-319，1993）からのサンプルをポリメ ラーゼ連鎖反応とこれに続くサザーンブロッティングにより分析した。ポリメラ ーゼ連鎖反応は、プライマー＃８３，5'-CGCGGATCCGTGGATCTAAATGAGAACAGTGAGC- 3'（配列番号：１５）及びプライマー＃８４：5'-CGCGAATTCTCAGGTAATGATTGTTTC CGTTGTAGCG-3'（配列番号：１６）を用いて、９４℃で２分間、６０℃で１分間 、そして７２℃で２分間の４０サイクルを行った。これらプライマーは、それぞ れヒトＧＤＦ−８ ｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド１１９から１４３まで（Ｂａ ｍＨＩ認識配列が隣にある）、及びヌクレオチド３９４から４１８まで（Ｅｃｏ ＲＩ認識配列が隣にある）に相当する。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動 し、ブロットし、そしてプライマー＃８３及び＃８４によってはさまれた領域の 内部の配列に相当するオリゴヌクレオチド＃１００，5'-ACACTAAATCTTCAAGAATA- 3'（配列番号：１７）で釣り上げた。フィルターを６×ＳＳＣ、１×Denhardt溶 液、１００μｇ／ｍｌ酵母トランスファーＲＮＡ、及び０.０５％ピロリン酸ナ トリウム中で５０℃でハイブリダイズさせた。 図１１に示すように、ヒト特異的プローブにより、陽性対照サンプル（全ヒト ゲノミックＤＮＡ）中で及びヒト／げっ歯類ハイブリッドパネルからの１つのＤ ＮＡサンプル中で予想サイズ（約３２０塩基対）のバンドが検出された。この陽 性シグナルは、ヒト染色体２に相当する。それぞれのハイブリッド細胞系内に含 有されるヒト染色体は、始めの２４レーン（１〜２２、Ｘ及びＹ）のそれぞれの 最上部において確認される。Ｍ、ＣＨＯ及びＨと名付けたレーンでは、出発ＤＮ Ａ鋳型は、それぞれマウス、ハムス ター、及びヒト起源の全ゲノミックＤＮＡであった。Ｂ１の記号を付けたレーン では、鋳型ＤＮＡは用いなかった。左側の数字は、ＤＮＡスタンダードの移動度 を示す。これらデータは、ヒトＧＤＦ−８遺伝子が染色体２に位置することを示 している。 現時点で好ましい態様に関して本発明を説明してきたが、本発明の精神から逸 脱することなく種々の変更を行うことができることが理解されるべきである。従 って、本発明は、次の請求の範囲によってのみ限定される。 配列の概要 配列番号：１は、クローンＳＪＬ１４１の核酸配列である。 配列番号：２は、クローンＳＪＬ１４７の核酸配列である。 配列番号：３は、クローンＡＣＭ１３の核酸配列である。 配列番号：４は、クローンＡＣＭ１４の核酸配列である。 配列番号：５は、マウスＧＤＦ−８の部分ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸 配列である。 配列番号：６は、マウスＧＤＦ−８の推定部分アミノ酸配列である。 配列番号：７は、ヒトＧＤＦ−８の部分ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配 列である。 配列番号：８は、ヒトＧＤＦ−８の推定部分アミノ酸配列である。 配列番号：９は、プライマーＳＪＬ１４１のアミノ酸配列である。 配列番号：１０は、プライマーＳＪＬ１４７のアミノ酸配列である。 配列番号：１１は、マウスＧＤＦ−８のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配 列である。 配列番号：１２は、マウスＧＤＦ−８の推定アミノ酸配列である。 配列番号：１３は、ヒトＧＤＦ−８のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列 である。 配列番号：１４は、ヒトＧＤＦ−８の推定アミノ酸配列である。 配列番号：１５及び１６は、それぞれプライマー＃８３及び＃８４のヌクレオ チド配列であり、ヒト／げっ歯類体細胞ハイブリッド内でのヒトＧＤＦ−８のマ ッピングに用いたものである。 配列番号：１７は、プライマー＃８３及び＃８４によってはさまれた領域の内 部の配列に相当するオリゴヌクレオチド＃１００のヌクレオチド配列である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ１２Ｑ 1/68 9282−4Ｂ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に純粋な増殖分化因子−８（ＧＤＦ−８）及びその機能性断片。 ２．請求項１のＧＤＦ−８ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチ ド配列。 ３．ＧＤＦ−８ポリヌクレオチド配列が下記の核酸配列からなる群から選ばれる 、請求項２のポリヌクレオチド。 ａ．ＴがＵであってもよい図５ａ； ｂ．ＴがＵであってもよい図５ｂ； ｃ．図５ａに相補的な核酸配列； ｄ．図５ｂに相補的な核酸配列； ｅ．長さが少なくとも１５塩基であり、図５ａのＧＤＦ−８タンパク質をコー ドするゲノミックＤＮＡに選択的にハイブリダイズするａまたはｃの断片；及び ｆ．長さが少なくとも１５塩基であり、図５ｂのＧＤＦ−８タンパク質をコー ドするゲノミックＤＮＡに選択的にハイブリダイズするｂ又はｄの断片。 ４．ポリヌクレオチドが哺乳動物細胞から単離される、請求項２のポリヌクレオ チド配列。 ５．哺乳動物細胞がマウス、ラット、及びヒトの細胞からなる群から選ばれる、 請求項４のポリヌクレオチド。 ６．請求項２のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 ７．プラスミドである、請求項６のベクター。 ８．ウィルスである、請求項６のベクター。 ９．請求項６のベクターで安定に形質転換された宿主細胞。 10．細胞が原核細胞である、請求項９の宿主細胞。 11．細胞が真核細胞である、請求項９の宿主細胞。 12．請求項１のポリペプチド又はその断片と反応性の抗体。 13．ポリクローナルである、請求項12の抗体。 14．モノクローナルである、請求項12の抗体。 15．細胞増殖性疾患を検出する方法であって、請求項12の抗体をＧＤＦ−８関連 疾患を有する疑いがある被験体の検体と接触させ、そして該抗体の結合を検出す ることを含む方法。 16．細胞が筋細胞である、請求項15の方法。 17．検出がin vivoである、請求項15の方法。 18．抗体が検出できるように標識されている、請求項17の方法。 19．検出できる標識が、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、及び化 学発光化合物からなる群から選ばれる、請求項18の方法。 20．検出がin vitroである、請求項15の方法。 21．抗体が検出できるように標識されている、請求項20の方法。 22．標識が、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、 及び酵素からなる群から選ばれる、請求項21の方法。 23．ＧＤＦ−８の発現と関連する細胞増殖性疾患を治療する方法であって、該細 胞をＧＤＦ−８活性を抑制する薬剤と接触させることを含む方法。 24．薬剤が抗ＧＤＦ−８抗体である、請求項23の方法。 25．薬剤がＧＤＦ−８アンチセンス配列である、請求項23の方法。 26．細胞が筋細胞である、請求項23の方法。 27．ＧＤＦ−８活性を抑制する薬剤がベクターを用いて細胞に導入される、請求 項23の方法。 28．ベクターがコロイド状分散系である、請求項27の方法。 29．コロイド状分散系がリポソームである、請求項28の方法。 30．リポソームが本質的に標的特異性である、請求項29の方法。 31．リポソームが解剖学的にターゲッティングされている、請求項30の方法。 32．リポソームが機械学的にターゲッティングされている、請求項31の方法。 33．機械学的ターゲッティングが受動的なものである、請求項32の方法。 34．機械学的ターゲッティングが能動的なものである、請求項32の方法。 35．リポソームが、糖、糖脂質、及びタンパク質からなる群から選ばれる成分と カップリングすることにより能動的にターゲッティングされている、請求項34の 方法。 36．タンパク質成分が抗体である、請求項35の方法。 37．ベクターがウィルスである、請求項36の方法。 38．ウィルスがＲＮＡウィルスである、請求項37の方法。 39．ＲＮＡウィルスがレトロウィルスである、請求項38の方法。 40．レトロウィルスが本質的に標的特異性である、請求項39の方法。 41．標的特異性の成分がレトロウィルスゲノムの中に挿入されたポリヌクレオチ ドによりコードされる、請求項40の方法。 42．標的特異性の成分が、糖、糖脂質、及びタンパク質からなる群から選ばれる 、請求項40の方法。 43．タンパク質が抗体である、請求項42の方法。