TWI655207B - 抗活化素ａ之抗體及其用途 - Google Patents

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TWI655207B TW103125622A TW103125622A TWI655207B TW I655207 B TWI655207 B TW I655207B TW 103125622 A TW103125622 A TW 103125622A TW 103125622 A TW103125622 A TW 103125622A TW I655207 B TWI655207 B TW I655207B
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Abstract

本發明係提供與活化素A結合之抗體及其使用方法。根據本發明特定的實施例，此等抗體為以高親和力與活化素A結合之全人類抗體。本發明之抗體可用於治療特徵為肌肉量或強度減低之疾病和病症，例如肌少症、惡質病、肌肉損傷、肌肉消瘦/萎縮和癌症。本發明之抗體亦可用於與GDF8結合蛋白組合供治療特徵為肌肉量或強度減低之疾病和病症。

Description

抗活化素A之抗體及其用途
本發明係關於對活化素A專一之抗體和其抗原結合片段，以及其使用方法，包括使用對活化素A專一之抗體與肌肉生長抑制素(myostatin)抑制劑聯用之方法。
活化素係屬於轉化生長因子-β(TGF-β)超家族且對細胞增生、分化和凋亡有廣大範圍的生物效應。活化素為抑制素βA、抑制素βB、抑制素βC和抑制素βE之同型或異型二聚體，其不同的組合係創造出活化素蛋白群族之各種成員。例如，活化素A為抑制素為抑制素βA之同型二聚體及抑制素B為抑制素βB之同型二聚體，而活化素AB為抑制素βA和抑制素βB之異型二聚體，及活化素AC為抑制素βA和抑制素βC之異型二聚體(Tsuchida,K.等人，Cell Commun Signal 7：15(2009))。
活化素A係結合並活化稱為第II型活化素受體(分別為IIA型和IIB型，亦稱為ActRIIA和ActRIIB)之細胞表面上的受體複合物。這些受體的活化導致第I型活化素受體(Alk2、4或7)之磷酸化，其轉而導致SMAD 2和3蛋白之磷酸化、SMAD複合物形成(與SMAD4)及SMAD複合物易位至細胞核，在該處SMAD2和SMAD3進行上調各種基因之轉錄作用(Sozzani,S.和Musso,T.,Blood 117(19)：5013-5015(2011))。
許多其他配體係結合並活化ActRIIB，包括GDF8、活化素B、活化素AB、抑制素A、抑制素B、GDF3、GDF11、Nodal、BMP2、BMP4、BMP7、BMP9、BMP10和TGFβ。阻斷ActRIIB與其配體之相互作用可導致有利的生理效應；例如投予ActRIIB-Fc(亦即IIB型受體之胞外部份， ActRIIB，其藉由與IgG Fc區融合安定化)導致骨骼肌量顯著增加。然而，在人類的臨床試驗中，稱為ACE-031之ActRIIB-Fc分子顯示造成各種有害的副作用。例如，將ACE-031投予停經後之婦女，在Ib期遞增劑量研究中顯示造成不欲的血紅素增加及FSH量降低。此外，患有肌肉失養症之兒科病患的ACE-031第II期研究由於有害的副作用(包括鼻和牙齦出血)而中斷。亦在以ActRIIB-Fc治療的病患中觀察到血管擴張。因此，在本項技術中對於可提供臨床利益而無ActRIIb-Fc臨床研究所觀察到的有害副作用之新穎的ActRIIB抑制劑存有需求。
本發明係提供結合抑制素βA同型二聚體，亦即活化素A之抗體。本發明之抗體可用於，其中包括，抑制活化素A-媒介的訊號傳遞，經由抑制活化素A-媒介的訊號傳遞產生有利的臨床結果，例如用於治療由活化素A活性及/或訊號傳遞所造成或與其相關的疾病和病症。本發明之抗體亦具有與其他的ActRIIA和ActRIIB受體之配體，例如GDF8抑制劑聯用之實用性。
本發明之抗體可為全長(例如，IgG1或IgG4抗體)或可僅包括一抗原結合蛋白(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，及可經修飾以影響功能性，例如消除殘基效應子功能(Reddy等人，J Immunol 164：1925-1933(2000))。
本發明係提供如表面電漿共振分析於25℃所測量，以低於約500nM之結合平衡常數(Ka)及低於約5pM之解離平衡常數(KD)專一結合活化素A之單離的抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，此單離的抗體或其抗原結合片段，如以表面電漿共振分析於25℃所測量，係以低於約4pM之KD專一與活化素A結合。在某些實施例中，此單離的抗體或其抗原結合片段係以低於約500nM之結合平衡常數(Ka)專一與活化素A結合。
本發明係提供專一結合活化素A及阻斷至少一種活化素受體與活化素A結合之單離的抗體或其抗原結合片段。在本發明某些實施例中，此單離的抗體或其抗原結合片段，如活體內受體/配體結合分析於25℃ 所測量，係以低於約80pM之IC50值阻斷活化素A與活化素A受體結合。在本發明某些實施例中，此單離的抗體或其抗原結合片段，如活體內受體/配體生物結合分析於25℃所測量，係以低於約60pM之IC50值阻斷活化素A與活化素A受體結合。本發明亦提供專一結合活化素A及阻斷至少一種活化素受體被活化素A活化之單離的抗體或其抗原結合片段。在本發明某些實施例中，此單離的抗體或其抗原結合片段不會顯著地阻斷活化素A與第II型活化素受體之結合。在本發明某些實施例中，此單離的抗體或其抗原結合片段係抑制活化素A與由下列組成之群中選出的活化素A受體之結合：IIA型活化素受體(ActRIIA)、IIB型活化素受體(ActRIIB)、第I型活化素受體。在本發明某些實施例中，此單離的抗體或其抗原結合片段係抑制活化素A-媒介的SMAD複合物訊號傳遞之活化。
本發明係提供包括一重鏈可變區(HCVR)之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區係具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、106、114、122、130、138、154、162、170、178、186、194和202，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供包括一輕鏈可變區(LCVR)之抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區係具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、146和210，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列。
本發明亦提供一包括由下列組成之群中選出之HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列對的抗體或其抗原結合片段：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/90、106/90、114/90、122/90、130/90、138/146、154/146、162/146、170/146、178/146、186/146、194/146和202/210。
本發明亦提供一抗體或其抗原結合片段，其係包括一具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)區：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、112、120、128、136、144、160、168、176、184、192、200和208，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列；及一具有由下列組成之群中選出之胺基 酸序列的輕鏈LDR3(LCDR3)區：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、152和216，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列。
在特定的實施例中，此抗體或抗體之抗原結合部分係包括由下列組成之群中選出之HCDR3/LCDR3胺基酸序列對：SEQ ID NO：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/96、112/96、120/96、128/96、136/96、144/152、160/152、168/152、176/152、184/152、192/152、200/152和208/216。
本發明亦提供一抗體或其抗原結合片段，其進一步係包括一具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)區：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、108、116、124、132、140、156、164、172、180、188、196和204，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列；及一具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)區：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、110、118、126、134、142、158、166、174、182、190、198和206，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列；一具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的輕鏈CDR1(LCDR1)區：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、148和212，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列；及一具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列的輕鏈CDR2(LCDR2)區：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、150和214，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之其實質上類似序列。
本發明之特定的非限定示例性抗體及其抗原結合片段係包括HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3區，其分別具有由下列組成之群中選出之胺基酸序列：SEQ ID NO：4-6-8-12-14-16(例如H4H10423P)；20-22-24-28-30-32(例如H4H10424P)；36-38-40-44-46-48(例如H4H10426P)；52-54-56-60-62-64(例如H4H10429P)；68-70-72-76-78-80(例如H4H10430P)；84-86-88-92-94-96(例如H4H10432P2；100-102-104-92-94-96(例如H4H10433P2)；108-110-112-92-94-96(例如 H4H10436P2)；116-118-120-92-94-96(例如H4H10437P2)；124-126-128-92-94-96(例如H4H10438P2)；132-134-136-92-94-96例如H4H10440P2)；140-142-144-148-150-152(例如H4H10442P2)；156-158-160-148-150-152(H4H10445P2)；164-166-168-148-150-152(H4H10446P2)；172-174-176-148-150-152(H4H10447P2)；180-182-184-148-150-152(H4H10448P2)；188-190-192-148-150-152(H4H10452P2)；196-198-200-148-150-152(H4H10468P2)；和204-206-208-212-214-216(H2aM10965N)。
在一相關的實施例中，本發明係包括專一與活化素A結合之抗體或抗體之抗原結合片段，其中該抗體或片段係包括重鏈和輕鏈CDR區，其係包含在由下列組成之群中選出的重鏈和輕鏈可變區(HCVR/LCVR)序列內：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/90、106/90、114/90、122/90、130/90、138/146、154/146、162/146,170/146、178/146、186/146,194/146和202/210。用於鑑別HCVR和LCVR胺基酸序列內的CDR之方法和技術已為本項技術所熟知並可用於鑑別文中所揭示之特定HCVR及/或LCVR胺基酸序列內的CDR。可用於鑑別CDR範圍之示例性慣用法包括，例如Kabat定義、Chothia定義及AbM定義。一般而言，Kabat定義係以序列的變異性為基礎，Chothia定義係以結構環區域之位置為基礎，而AbM定義為介於Kabat和Chothia方法間之折衷。參見，例如Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人.,J Mol Biol 273：927-948(1997)；及Martin等人，PNAS(USA)86：9268-9272(1989)。亦可取得公開的資料庫供辨識抗體內的CDR序列。
本發明亦提供編碼抗-活化素A抗體或其部分之核酸分子。例如，本發明係提供編碼任何表1所列的HCVR胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括任何由表2所列的HCVR核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之實質上類似序列。
本發明亦提供編碼任何表1所列的LCVR胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括任何由表2所列的LCVR核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之實質上類似序列。
本發明亦提供編碼任何表1所列的HCDR1胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括任何由表2所列的HCDR1核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之實質上類似序列。
本發明亦提供編碼任何表1所列的HCDR2胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括任何由表2所列的HCDR2核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之實質上類似序列。
本發明亦提供編碼任何表1所列的HCDR3胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括任何由表2所列的HCDR3核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之實質上類似序列。
本發明亦提供編碼任何表1所列的LCDR1胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括任何由表2所列的LCDR1核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之實質上類似序列。
本發明亦提供編碼任何表1所列的LCDR2胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括任何由表2所列的LCDR2核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之實質上類似序列。
本發明亦提供編碼任何表1所列的LCDR3胺基酸序列之核酸分子；在特定的實施例中此核酸分子係包括任何由表2所列的LCDR3核酸序列中選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之實質上類似序列。
本發明亦提供編碼HCVR之核酸分子，其中該HCVR係包括一組三個CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中該HCDR1-HCDR2-HCDR3胺基酸序列組係如任何表1所列的示例抗-活化素A抗體所定義。
本發明亦提供編碼LCVR之核酸分子，其中該LCVR係包括一組三個CDR(亦即LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中該LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組係如任何表1所列的示例抗-活化素A抗體所定義。
本發明亦提供編碼HCVR和LCVR二者之核酸分子，其中該HCVR係包括任何表1所列的HCVR胺基酸序列之胺基酸序列，及其中該LCVR係包括任何表1所列的LCVR胺基酸序列之胺基酸序列。在特定的實施例中，核酸分子係包括由任何表2所列的HCVR核酸序列選出的多核苷酸序列，或具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%其序列一致性之實質上類似序列，及由任何表2所列的LCVR核酸序列選出的多核苷酸序列，或其具有至少90%，至少95%，至少98%或至少99%序列一致性之實質上類似序列。在特定的實施例中根據本發明此方面，此核酸分子係編碼HCVR和LCVR，其中該HCVR和LCVR二者係衍生自表1所列的相同抗-活化素A抗體。
本發明亦提供一重組的表現載體，其能表現一包括抗-活化素抗體之重鏈或輕鏈可變區的多肽。例如，本發明係包括重組的表現載體，其包含任何上述之核酸分子，亦即編碼任何如表1中所示的HCVR、LCVR及/或CDR序列之核酸分子。本發明之範圍亦包括其中已導入此等載體之宿主細胞，以及藉由在得以產生抗體或抗體片段之條件下培養宿主細胞，並回收所產生的抗體或抗體片段來製造抗體或其部份之方法。
本發明包括具有修飾碳水化合物含量之抗-活化素A抗體。在某些應用中，移除不欲的糖基化位置之修飾作用可能為有用的。在某些應用中，改變糖基化模式之修飾作用可能為有用的，例如修飾抗體使寡糖鏈上缺乏岩藻糖基團存在，例如，用以增加抗體依賴的細胞毒殺(ADCC)功能(參見Shield等人(2002)JBC 277：26733(2002))。在其他的應用上，可進 行半乳糖基化之修飾作用以修改補體依賴的細胞毒殺作用(CDC)。在某些應用中，抗體可具有修飾的糖基化模式以便於將效應子功能減至最小。例如，抗體可經修飾以得到額外糖基化或唾酸化抗體。
在另外方面，本發明係提供包括專一與活化素A結合之重組的人類抗體或其片段以及醫藥上可接受載劑的醫藥組成物。在一相關的方面，本發明之特徵為組合抗-活化素A抗體和第二治療劑之組成物。在一實施例中，此第二治療劑為任何有利地與抗-活化素A抗體組合之試劑。可有利地與抗-活化素A抗體組合之示例性試劑係包括(不限於)抑制活化素A活性之其他試劑(包括其他抗體或其抗原結合片段、胜肽抑制劑、小分子拮抗劑等)及/或不會直接與活化素A結合但會干擾、阻斷或減弱活化素A媒介的訊號傳遞之試劑。在一實施例中，此第二治療劑係抑制、干擾、阻斷及/或減弱另外的ActRIIA及/或ActRIIB受體之配體活性(例如，GDF8、活化素B、活化素AB、抑制素A、抑制素B、GDF3、GDF11、Nodal、BMP2、BMP4及/或BMP7)。在一實施例中，此第二治療劑為一抗-GDF8拮抗劑(例如，人類抗-GDF8抗體或其抗原結合片段)。可與本發明之抗-活化素A抗體一起使用之示例性抗-GDF8試劑包括人類抗-GDF8抗體(例如，包括如US 2011-0293630 A1中述之任何HCVR/LCVR或CDR胺基酸序列的抗-GDF8抗體(例如H4H1657N2，其為帶有包括SEQ ID NO：217之HCVR的重鏈互補決定區(HCDR)(例如，分別在SEQ ID NO：218、219和220中所述之CDR1、CDR2和CDR3序列)，及包括SEQ ID NO：221之LCVR的輕鏈互補決定區(LCDR)(例如，分別在SEQ ID NO：22、223和224中所述之CDR1、CDR2和CDR3序列)。包括本發明抗-活化素A抗體之另外的組合治療和共調配物係揭示於文中的他處。
在本發明另外的方面，係提供包括活化素A-專一結合區和GDF8-專一結合區之抗原結合分子。在本發明此方面之一實施例中，此抗原結合分子為雙專一性抗體，其包括專一與活化素A結合之第一可變區和專一與GDF8結合之第二可變區。
又在另外的方面，本發明係提供使用本發明之抗-活化素A抗體或抗體之抗原結合部分來抑制活化素A活性之治療方法，其中該治療 方法係包括投予一治療上有效量之包括本發明抗體或抗體之抗原結合片段的醫藥組成物。所治療的病症為任何藉由移除、抑制或降低活化素A活性或訊號傳遞加以改善、減輕、抑制或預防之疾病或症狀。本發明之抗-活化素A抗體或抗體片段可進行阻斷活化素A和第II型活化素A受體(例如IIA型活化素受體及/或IIB型活化素受體)之間；活化素A和第I型活化素A受體之間；活化素A和第I型及第II型活化素A受體二者之間的相互作用；或另外抑制活化素A的訊號傳遞活性。
本發明亦包括本發明之抗-活化素A抗體或抗體之抗原結合部分於製造醫藥品供治療病患中與活化素A活性有關或由其所造成的疾病或病症之用途。本發明亦提供藉由於患者中投予活化素A抗體或其抗原結合片段來增加患者肌肉量或強度之方法。本發明亦提供藉由於患者中投予活化素A-專一結合蛋白和GDF8-專一結合蛋白，或藉由於患者中投予包括活化素A-專一結合區和GDF8-專一結合區之抗原結合分子來增加患者肌肉量或強度之方法。
本發明亦包括藉由於有此需要之患者中投予活化素A-專一結合蛋白(例如抗-活化素A抗體)，供治療、預防及/或改善特徵為肌肉量或強度減低之疾病或病症的方法。在一相關的方面，本發明之方法包括藉由於有此需要之患者中投予活化素A-專一結合蛋白和GDF8-專一結合蛋白(例如抗-活化素A抗體和抗GDF8抗體)，治療、預防及/或改善特徵為肌肉量或強度減低之疾病或病症。本發明之方法亦包括藉由於有此需要之患者中投予包括活化素A-專一結合區和GDF8-專一結合區之抗原結合分子，治療、預防及/或改善特徵為肌肉量或強度減低之疾病或病症。可使用本發明明方法加以治療、預防及/或改善之特徵為肌肉量或強度減低的疾病或病症包括肌少症、惡質病(例如特發性惡質病或續發於另外症狀之惡質病(例如癌症、慢性腎衰竭或慢性阻塞性肺疾病))、肌肉損傷、肌肉消瘦及/或萎縮(例如由廢用、固定不動、臥床休養、受傷、醫療、手術介入(例如髖部骨折、髖關節置換和膝關節置換)及必要的呼吸器輔助所造成或與其有關)、癌症、肥胖症、糖尿病、關節炎、多發性硬化症、肌肉失養症、肌萎縮側索硬化症、帕金森氏症、骨質疏鬆症、骨關節炎、骨質缺乏症和代謝症候群(例如， 一或多項糖尿病、肥胖症、營養失調、器官萎縮、慢性阻塞性肺疾病和惡質病)。
從確認詳細說明之論述中其他的實施例將變得顯而易見。
圖1為一顯示抗體交叉競爭分析結果之矩陣，其中係將第一抗-活化素A抗體(「抗體樣本」)施用於塗覆抗人類-FC感應器尖端，接著浸入與活化素A抗體預結合之第二抗-活化素A抗體溶液(1μM)。描述試驗的各抗體組合之結合反應(數值0.22至1.84)。以帶有黑色字體之白色盒形表示的結合反應係代表對活化素A之結合無競爭，其表示明顯的結合區。
圖2係顯示當以一頻率範圍(40至100Hz)之電流刺激時，經H4H1657N2-治療的小鼠對同型對照抗體治療的小鼠，脛骨前(TA)肌力增加。
圖3：A圖係顯示用以評估H4H1657N2對後肢懸吊引發的肌肉萎縮之效用的實驗設計。B圖係顯示肢懸吊(HLS)7天後與後肢懸吊(HLS)7天後無恢復期和對照小鼠(非-HLS對照組)對於經H4H1657N2-治療和同型對照抗體-治療小鼠後恢復期之TA和腓腸(GA)肌肉重量的%變化。
在描述本發明之前，應了解，本發明不限於所述的特定方法和實驗條件，因為此等方法和條件可改變。亦應了解，文中所用的術語僅作為描述特定實施例之目的，且不希望受限，因為本發明之範圍將僅受限於所附的申請專利範圍。
除非另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解之相同意義。如文中所用，術語「大約」當用於有關特定引述的數值時，係指該值可從該引述值做不大於1%的變化。例如，如文中所用，「約100」一詞係包括99和101及所有介於之間的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
雖然在施行或試驗本發明時可使用任何該等與文中所述的方法和物質類似或相當者，但較佳的方法和物質為目前所述。本說明書中所提及的所有專利、申請案和非專利刊物係以全文引用的方式併入本文中。
抗原-專一結合蛋白
本發明係關於包括抗原-專一結合蛋白之組成物。更特言之，本發明係提供包括活化素A-專一結合蛋白之組成物。
如文中所用，「抗原-專一結合蛋白」一詞係指包括至少一專一結合特定抗原之區域的蛋白。示例性抗原-專一結合蛋白之類別包括抗體、抗體之抗原-結合部份、專一與特定抗原相互作用之胜肽(例如肽體)、專一與特定抗原相互作用之受體分子及包括專一與特定抗原相互作用之受體的配體-結合部份之蛋白。
本發明包括專一結合活化素A之抗原-專一結合蛋白，亦即「活化素A-專一結合蛋白」。活化素為包括β亞單元之同型和異型-二聚體，亦即抑制素βA、抑制素βB、抑制素βC及/或抑制素βE。βA亞單元具有SEQ ID NO：226之胺基酸序列而βB亞單元具有SEQ ID NO：228之胺基酸序列。活化素A為二個βA亞單元之同型二聚體；活化素B二個βB亞單元之同型二聚體；活化素AB為一βA亞單元和一βB亞單元之異型二聚體；而活化素AC為一βA亞單元和一βC亞單元之異型二聚體。活化素A-專一結合蛋白可為專一結合βA亞單元之抗原-專一結合蛋白。因為βA亞單元係在活化素A、活化素AB和活化素AC分子中發現，因此「活化素A-專一結合蛋白」可為專一結合活化素A以及活化素AB和活化素AC之抗原-專一結合蛋白(藉由其與βA亞單元之相互作用)。因此，根據本發明之一實施例，活化素A-專一結合蛋白係專一與活化素A；或活化素A和活化素AB；或活化素A和活化素AC；或活化素A、活化素AB和活化素AC結合，但不會與其他ActRIIB配體例如活化素B、GDF3、GDF8、BMP2、BMP4、BMP7、BMP9、BMP10、GDF11、Nodal等結合。在其他的實施例中，活化素A-專一結合蛋白亦可與活化素B結合(藉由與βB亞單元，亦即抑制素βB交叉反應)。在另外的實施例中，活化素A-專一結合蛋白為專一與活化素A結合但不會與任何其他ActRIIB之配體結合的結合蛋白。在另外的實施例中， 活化素A-專一結合蛋白為專一與活化素A結合但不會與任何骨形態發生蛋白(BMP)(例如，BMP2、BMP4、BMP6、BMP9、BMP10)結合的結合蛋白。在另外的實施例中，活化素A-專一結合蛋白為專一與活化素A結合但不會與任何其他轉化生長因子β(TGFβ)超家族的成員結合之結合蛋白。
本發明亦包括專一與GDF8結合之抗原-專一結合蛋白，亦即「GDF8-專一結合蛋白」。術語「GDF8」(亦稱為「生長和分化因子-8」及「肌肉生長抑制素」)係指具有SEQ ID NO：225之胺基酸序列之蛋白(成熟蛋白)。根據本發明，GDF8-專一結合蛋白係專一與GDF8結合，但不會與其他ActRIIB配體，例如GDF3、BMP2、BMP4、BMP7、BMP9、BMP10、GDF11、活化素A、活化素B、活化素AB、Nodal等結合。
在本發明的內文中，分子例如ActRIIB-Fc(例如"ACE-031")，其包括ActRIIB受體之配體結合部份，並不視為「活化素A-專一結合蛋白」或「GDF8-專一結合蛋白」，因為此等分子除了GDF8、活化素A和活化素AB外係與多種配體結合。
除非明確指出來自非人類物種，否則文中所有提及的蛋白、多肽和蛋白片段希望係指人類之各別的蛋白、多肽和蛋白片段。
帶有二個不同抗原-專一結合區之抗原-結合分子
本發明亦包括，包含二個不同抗原-專一結合區之抗原-結合分子。特言之，本發明係包括，包含一活化素A-專一結合區和一GDF8-專一結合區之抗原-結合分子。術語「抗原-專一結合區」如文中所用，係包括或由下列組成之多肽：(i)抗體分子之抗原結合片段，(ii)專一與特定抗原相互作用之胜肽(例如肽體)，及/或(iii)專一與特定抗原結合之受體的配體結合部份。例如，本發明係包括雙專一性抗體，其中一臂係包含專一與活化素A結合之第一重鏈可變區/輕鏈可變區對(HCVR/LCVR)，及另一臂係包括專一與GDF8結合之第二HCVR/LCVR對。
專一結合
術語「專一結合」或類似術語，如文中所用，係指抗原-專一結合蛋白或抗原-專一結合區，與特定抗原形成一複合物，其特徵為500pM或更低之解離常數，且在正常的試驗條件下不會與其他不相關的抗原結 合。「不相關抗原」為彼此具有低於95%胺基酸相同性之蛋白、胜肽或多肽。測定二個分子是否彼此專一結合之方法已為本項技術所熟知並包括，例如平衡透析、表面電漿共振及其類似方法。例如，抗原專一結合蛋白或抗原-專一結合區，如本發明內文中所用，係包括如表面電漿共振分析所測，以低於約500pM，低於約400pM，低於約300pM，低於約200pM，低於約100pM，低於約90pM，低於約80pM，低於約70pM，低於約60pM，低於約50pM，低於約40pM，低於約30pM，低於約20pM，低於約10pM，低於約5pM，低於約4pM，低於約2pM，低於約1pM，低於約0.5pM，低於約0.2pM，低於約0.1pM或低於約0.05pM之KD與特定抗原(例如活化素A及/或AB，或GDF8)或其部份結合之分子。
如文中所用，若蛋白或結合區，當於25℃以表面電漿共振分析就此分子之結合作試驗，具有大於50.0nM之KD，或在此一分析或其同等分析中無法顯現任何結合時，抗原專一結合蛋白或抗原-專一結合區「不會」與特定分子結合(例如「不會與GDF11結合」、「不會與BMP9結合」，「不會與BMP10結合」等)。
術語「表面電漿子共振」，如文中所用，係指得以藉由偵測生物感測器基質內蛋白濃度改變，進行即時生物分子交互作用分析之光學現象，例如使用BIAcoreTM系統(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare,Piscataway,NJ)。
術語「KD」，如文中所用，係指特定的蛋白-蛋白相互作用(例如抗體-抗原相互作用)之平衡解離常數。除非另有指出，否則文中所揭示的KD值係指以表面電漿共振分析於25℃所測定之KD值。
抗體和抗體之抗原-結合片段
如上所示，抗原-專一結合蛋白可包括或由抗體或抗體之抗原結合片段所組成。再者，在包括二個不同抗原-專一結合區之抗原-結合分子的情況下，一或二個抗原-專一結合區可包括或由抗體之抗原結合片段所組成。
如文中所用，「結合活化素之抗體」或「抗-活化素A抗體」包括結合活化素A蛋白之可溶性片段及亦可與含活化素βA亞單元之活化 素異型二聚體結合的抗體和其抗原結合片段。
術語「抗體」，如文中所用，係指包括至少一個與特定抗原(例如活化素A)專一結合或相互作用之互補決定區(CDR)的任何抗原結合分子或分子複合物。術語「抗體」係包括：包含藉由雙硫鍵相連接的四條多肽鏈(二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈)之免疫球蛋白分子以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈係包括一重鏈可變區(文中縮寫為HCVR或VH)及一重鏈恆定區。重鏈恆定區係包括三個區，CH1、CH2和CH3。各輕鏈係包括一輕鏈可變區(文中縮寫為LCVR或VL)及一輕鏈恆定區。輕鏈恆定區係包括一個區(CL1)。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為框架區(FR)。各VH和VL係由三個CDR和四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明不同的實施例中，抗-活化素A抗體(或其抗原結合部分)之FR可與人類生殖系序列相同，或可為天然的或經人工修飾。胺基酸共有序列可以二或多個CDR之並排(side-by-side)分析為基準來定義。
術語「抗體」，如文中所用，亦包括全抗體分子之抗原結合片段。術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」等等，如文中所用，包括任何與抗原專一結合形成複合物之天然生成、酵素製得、合成或基因工程化的多肽或糖蛋白。抗體之抗原結合片段可使用任何適合的標準技術，例如蛋白質水解消化作用或涉及編碼抗體可變區和(視需要)恆定區之DNA操作和表現的重組基因工程技術，衍生自例如全抗體分子。此DNA為已知的及/或可容易地從例如市面來源、DNA資料庫(包括，例如噬菌體-抗體資料庫)取得或可經合成。此DNA可用化學或藉由使用分子生物技術來定序和操作，例如將一或多個可變及/或恆定區排列成適合的組態，或導入密碼子，產生半胱胺酸殘基，修飾、增添或刪除胺基酸等。
抗原結合片段之非限定實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模擬抗體高變區之胺基酸殘基所組成的最小識別單位(例如分離的互補決定區(CDR)，例如CDR3胜肽)或限制性FR3-CDR3-FR4胜肽。其他工程化分子，例如區域專一性抗體、單區抗體、區域刪除抗體、嵌合抗體、 CDR-嫁接抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小模組免疫醫藥(SMIP)及鯊可變IgNAR區，亦涵蓋在文中所用的「抗原結合片段」之詞語內。
抗體之抗原結合片段典型地將包括至少一可變區。可變區可為任何大小或胺基酸組成之區域且一般應包括與一或多個框架序列相鄰或在其框架內之CDR。在具有VL區與VH區結合之抗原結合片段中，VH和VL區可以任何適合的排列位於彼此相對處。例如可變區可為二聚化並含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。另外，抗體之抗原結合片段可含有單一VH或VL區。
在特定的實施例中，抗體之抗原結合片段可含有至少一個可變區與至少一個恆定區共價連接。可在本發明之抗體的抗原結合片段內發現的可變區和恆定區之非限定、示例性組態包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在任何可變區和恆定區之組態中，包括上列任何的示例性組態，可變區和恆定區可直接彼此相連接或可藉由完整或部分的絞鏈區或連接子區相連接。絞鏈區可由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所組成，使其在單一多肽分子中相鄰的可變及/或恆定區間產生柔性和半柔性連結。再者，在本發明之抗體的抗原結合片段可包括以非共價彼此相互連結及/或與一或多個單一VH或VL區相連結(例如以雙硫鍵)之任何上列的可變和恆定區組態之同型二聚體或異型二聚體(或其他多聚體)。
如同全抗體分子，抗原結合片段可為單專一性或多專一性(例如雙專一性)。抗體之多專一性抗原結合片段典型地應包括至少二個不同的可變區，其中各可變區能專一與個別的抗原結合或與相同抗原上不同的表位結合。任何多專一性抗體型式，包括文中所揭示的示例性雙專一性抗體型式，可使用本項技術中可取得的習用技術來改造，使其適用於本發明抗體之抗原結合片段狀況。
本發明之抗體可經由補體-依賴的細胞毒殺作用(CDC)或抗體-依賴的細胞媒介之細胞毒殺作用(ADCC)來作用。「補體-依賴的細胞毒殺作用(CDC)」係指在補體的存在下藉由本發明之抗體解離抗原-表現細胞。「抗體-依賴的細胞媒介之細胞毒殺作用(ADCC)」係指細胞媒介的反應，其中表現Fc受體(FcR)之非專一性細胞毒性細胞(例如天然的殺手(NK)細胞、嗜中性細胞和巨噬細胞)辨識出目標細胞上的結合抗體並據此導致目標細胞的解離。CDC和ADCC可使用本項技術所熟知和可取得的分析來測量。(參見，例如美國專利第5,500,362號和第5,821,337號，及Clynes等人，PNAS USA 95：652-656(1998))。抗體的恆定區對於抗體固定補體和媒介細胞-依賴的細胞毒殺作用之能力很重要。因此，同型之抗體可依其是否為抗體所欲的媒介細胞毒殺作用為基準來選擇。
在本發明特定的實施例中，本發明之抗-活化素A抗體為人類抗體。術語「人類抗體」，如文中所用，希望係包括具有衍生自人類生殖系列免疫球蛋白序列之可變區和恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例如藉由隨機或活體外位置專一性誘變所導入之突變或活體內體細胞突變)，例如在CDR中及特別是CDR3。然而，術語「人類抗體」，如文中所用，不希望包括其中衍生自另外哺乳動物物種(例如小鼠)之生殖系的CDR序列已稼接在人類框架序列上之抗體。
本發明之抗體，在某些實施例中可為重組的人類抗體。術語「重組的人類抗體」，如文中所用，希望包括藉由重組方法，例如使用重組的表現載體轉染至宿主細胞(進一步詳述於下)所製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，由重組的組合人類抗體庫(進一步詳述於下)單離出之抗體，由經轉殖人類免疫球蛋白基因之動物(例如小鼠)單離出的抗體(參見，例如Taylor等人，Nucl.Acids Res.20：6287-6295(1992))，或由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列與DNA序列拼接之方法所製備、表現、產生或單離之抗體。此等重組的人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區和恆定區。然而，在特定的實施例中，此等重組的人類抗體係在活體外經誘發突變(或當使用以人類Ig序列基因轉殖之動物時，為活體內體細胞 誘發突變)，且因此重組抗體之VH和VL區的胺基酸序列(當衍生自人類生殖系VH和VL序列或與其有關時)其可能並非天然存在於活體內人類抗體生殖系庫中之序列。
人類抗體可以二種與絞鏈異質性有關之形式存在。第一種形式，包括約150-160kDa之安定四鏈結構的免疫球蛋白分子，其中此二聚體係藉由鏈間重鏈雙硫鍵聚集一起。第二種形式，二聚體並非經由雙硫鍵相連接且約75-80kDa之分子係由共價偶合的輕鏈和重鏈(半抗體)所組成。這些形式極難分離，即使在親和純化後。
在各種完整的IgG同型中，第二種形式出現的頻率係由於(但不限於)與抗體之絞鏈區同型有關之結構差異所致。在人類IgG4絞鏈之絞鏈區中單一胺基酸取代可顯著地降低第二種形式出現(Angal等人Molecular Immunology 30：1051993)至典型地使用人類IgG1絞鏈所觀察到的程度。本發明係涵蓋絞鏈、CH2或CH3區中具有一或多個突變之抗體，該突變例如在製造上可能為所希望的，用以改善所欲的抗體形式之產率。
本發明之抗體可為單離的抗體。「單離的抗體」，如文中所用，係指經鑑定及從至少一種其天然環境之組成份分離及/或回收之抗體。例如，從至少一種生物體，或從組織或細胞之組成份分離或移出之抗體，其中就本發明之目的，該存在自然界或為自然產生的抗體為一「單離的抗體」。單離的抗體亦包括重組細胞內原位抗體。單離的抗體為歷經至少一純化或分離步驟之抗體。根據特定的實施例，單離的抗體可能實質上無其他細胞物質及/或化學物。
本發明係包括中和及/或阻斷抗-活化素A抗體。「中和」或「阻斷」抗體，如文中所用係指與活化素A結合之抗體，其：(i)干擾活化素A與活化素A受體(例如IIA型活化素受體、IIB型活化素受體、第I型活化素受體等)之間的相互作用；(ii)干擾活化素-活化素受體複合物形成；及/或(iii)產生抑制至少一種活化素A的生物功能。由活化素A之中和或阻斷抗體所造成的抑制作用不需完全，只要可使用適當的分析偵測即可。用於偵測抑制作用之示例性分析係描述於文中之操作實例中。
相較於可從其衍生抗體之對應的生殖系序列，文中所揭示的抗-活化素A抗體可在重鏈和輕鏈可變區之框架及/或CDR區中包括一或多個胺基酸取代、插入及/或刪除。此等突變可藉由將文中所揭示之胺基酸序列與得自，例如公開的抗體序列資料庫之生殖系序列相比較，容易地確定。本發明包括由任何文中所揭示的胺基酸序列所衍生之抗體及其抗原結合片段，其中在一或多個框架及/或CDR區中的一或多個胺基酸係突變成從其衍生抗體之生殖系序列的對應殘基，或另一種人類生殖系序列之對應殘基，或對應生殖系殘基之保守胺基酸取代(此等序列之改變在文中統稱為「生殖系突變」)。本項技術之一般技術者，由文中所揭示之重鏈和輕鏈可變區序列開始，可容易地製造許多包括一或多個個別的生殖系突變或其組合之抗體和抗原結合片段。在特定的實施例中，VH及/或VL區內的所有框架及/或CDR殘基係突變回到衍生此抗體之原始生殖系序列中所發現的殘基。在其他實施例中，僅特定的殘基突變回到原始的生殖系序列，例如僅在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中發現突變的殘基，或僅在CDR1、CDR2或CDR3內發現突變的殘基。在其他的實施例中，一或多個框架及/或CDR殘基係突變成不同生殖系序列之對應殘基(亦即與最初從其衍生抗體之生殖系序列不同的生殖系序列)。再者，本發明之抗體在框架及/或CDR區內可含有任何二或多個生殖系突變之組合，例如，其中特定的個別殘基係突變成特定生殖系序列之對應殘基，而與原始生殖系序列不同的其他殘基係維持原樣或突變成不同生殖系序列之對應殘基。一旦得到後，含有一或多個生殖系突變之抗體和抗原結合片段可容易地測試其一或多種所欲的性質，例如結合專一性改善、結合親和力增加、拮抗或促效性生物性質改善或增進(視情況而定)、致免疫力降低等。以此通用方法所得的抗體和抗原結合片段係涵蓋在本發明中。
本發明亦包括抗-活化素A抗體，其係包含任何具有一或多個保守取代之文中所揭示的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的變體。例如，本發明包括抗-活化素A抗體，其相對於文中所揭示之任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列，係具有含例如10個或更少、8個或更少、6 個或更少、4個或更少之保守性胺基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列。
術語「表位」係指與抗體分子可變區中稱為補位(paratope)的特定抗原結合位置相互作用之抗原決定位。單一抗原可具有一個以上的表位。因此，不同的抗體可與抗原上不同的區域結合並可具有不同的生物效應。表位可為構型或線性。構型表位係由直鏈多肽鏈不同線段之空間上並列的胺基酸所產生。線性表位係由多肽鏈相鄰的胺基酸殘基所產生。在特定的情況下，表位可包括抗原上的醣類基團、磷醯基或磺醯基。
術語「實質上一致」或「實質上相同」當指核酸或其片段時，係表示當以適當的核苷酸插入或刪除與另一核酸(或其互補股)最佳化對齊時，以任何熟知的序列一致性演算法，例如下文所論述的FASTA、BLAST或Gap來測量，有至少約95%，及更佳地至少約96%、97%、98%或99%之核苷酸鹼基具核苷酸序列一致性。與參照核酸分子具有實質上一致性的核酸分子，在特定情況下，可編碼與參照核酸分子所編碼的多肽具有相同或實質上類似胺基酸序列之多肽。
當用於多肽時，術語「實質類似」或「實質上類似」係指二個胜肽序列，當以GAP或BESTFIT程式使用內建缺位權重最佳化對齊時，享有至少95%序列一致性，甚佳地至少98%或99%序列一致性。較佳地，不同的殘基位置係相差在保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為其中一胺基酸殘基係經另一帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)側鏈(R基)之胺基酸殘基所取代。一般而言，保守性胺基酸取代實質上不會改變蛋白的功能特性。在其中彼此有二或多個保守性取代之不同胺基酸序列的案例中，可上調序列一致性之百分比或類似程度以修正此取代作用之保守性質。調整之方法已為熟習本項技術者所熟知。參見，例如Pearson W.R.,Methods Mol.Biol.24：307-331(1994)，其係以引用的方式併入本文中。具有類似化學性質之側鏈的胺基酸基團實例包括(1)脂系側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂系-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含醯胺側鏈：天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；(4)芳香側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天門冬 胺酸和麩胺酸，及(7)含硫側鏈有半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代基群有：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。另外，保守性置換為在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445(1992)(其係以引用的方式併入本文中)所揭示的PAM250對數似然矩陣中具有正值之任何變化。「中度保守性」置換為在PAM250對數似然矩陣中具有非負值之任何變化。
多肽之序列類似性，其亦指序列一致性，典型地係使用序列分析軟體來測量。蛋白分析軟體使用分配至各種取代、刪除和其他修飾作用(包括保守性胺基酸取代)之類似度量值配出類似的序列。例如，GCG軟體含有例如Gap和Bestfit程式，其可使用內定參數，測定密切相關的多肽間，例如來自不同生物物種之同源多肽，或野生型和其突變蛋白間之序列同源性或序列一致性。參見，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA，利用內定或建議參數，一種GCG Version 6.1內的程式，作比較。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢序列和搜尋序列間最佳重疊區之比對和序列一致性百分比(參見，例如Pearson,W.R.,Methods Mol Biol 132：185-219(2000)，其係以引用的方式併入本文中)。當本發明序列與含有較大量來自不同生物體的序列資料庫作比較時，另一較佳的演算法為使用內定參數之電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN。參見，例如Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)及Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)，其各自係以引用的方式併入本文中。
抗體之生物特性
本發明係包括以高親和力與活化素A結合之抗-活化素A抗體及其抗原結合片段。例如，本發明係包括抗體及其抗原結合片段，其如以表面電漿共振，例如使用如文中實例3所定義的分析形式所測量，係以低於約30nM之KD與活化素A結合。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如以表面電漿共振，例如使用如文中實例3所定義的分析形式或實質上類似的分析所測量，係以低於約25nM，低於約20nM，低於約15nM，低於約10nM，低於約5nM，低於約2nM，低於約1nM， 低於約500pM，低於約250pM，低於約240pM，低於約230pM，低於約220pM，低於約210pM，低於約200pM，低於約190pM，低於約180pM，低於約170pM，低於約160pM，低於約150pM，低於約140pM，低於約130pM，低於約120pM，低於約110pM，低於約100pM，低於約95pM，低於約90pM，低於約85pM，低於約80pM，低於約75pM，低於約70pM，低於約65pM，低於約60pM，低於約55pM，低於約50pM，低於約45pM，低於約40pM，低於約35pM，低於約30pM，低於約25pM，低於約20pM，低於約15pM，低於約10pM，低於約9pM，低於約8pM，低於約7pM，低於約6pM，低於約5pM，低於約4pM或低於約3pM之KD與活化素A結合。
本發明亦包括抑制活化素A-媒介的細胞訊號傳遞之抗-活化素A抗體及其抗原結合片段。例如，本發明包括，如以細胞為基礎的阻斷分析，例如使用如文中實例6所定義的分析形式或實質上類似的分析所測量，係以低於約4nM之IC50值抑制SMAD複合物訊號轉導路經由活化素A與第I或第II型活化素受體結合而活化之抗-活化素A抗體。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如以細胞為基礎的阻斷分析，例如使用如文中實例6所定義的分析形式或實質上類似的分析所測量，係以低於約3nM，低於約2nM，低於約1nm，低於約500pM，低於約250pM，低於約240pM，低於約230pM，低於約220pM，低於約210pM，低於約200pM，低於約190pM，低於約180pM，低於約170pM，低於約160pM，低於約150pM，低於約140pM，低於約130pM，低於約120pM，低於約110pM，低於約100pM，低於約95pM，低於約90pM，低於約85pM，低於約80pM，低於約75pM,less than 70pM，低於約65pM，低於約60pM，低於約55pM，低於約50pM，低於約49pM，低於約48pM，低於約47pM，低於約46pM，低於約45pM，低於約44pM，低於約43pM，低於約42pM，低於約41pM，低於約40pM或低於約39pM之IC50值抑制SMAD複合物訊號轉導路經由活化素A與第I或第II型活化素受體結合之活化。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如以細胞為基礎的阻斷分析，例如使用如文中實例6所定義的分析形式或實質上類似 的分析所測量，係以低於約50nM，低於約20nM，低於約10nm，低於約5nM或低於約1nM之IC50值，藉由干擾活化素B與第I或第II型活化素受體結合抑制活化素B訊號轉遞活化。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如以細胞為基礎的阻斷分析，例如使用如文中實例6所定義的分析形式或實質上類似的分析所測量，係以低於約500pM，低於約450pM，低於約440pM，低於約430pM，低於約420pM，低於約410pM，低於約400pM，低於約390pM，低於約380pM，低於約370pM，低於約360pM，低於約350pM，低於約340pM，低於約320pM，低於約310pM，低於約300pM，低於約290pM，低於約280pM，低於約270pM，低於約260pM，低於約250pM，低於約240pM，低於約230pM，低於約220pM，低於約210pM，低於約200pM，低於約190pM，低於約180pM，低於約170pM，低於約160pM，低於約150pM或低於約140pM之IC50值抑制SMAD複合物訊號轉導路經由活化素AB與第I或第II型活化素受體結合而活化。在特定的實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段，如以細胞為基礎的阻斷分析，例如使用如文中實例6所定義的分析形式或實質上類似的分析所測量，係以低於約1nM，低於約900pM，低於約800pM，低於約750pM，低於約700pM，低於約650pM，低於約600pM或低於約580pM之IC50值抑制SMAD複合物訊號轉導路經由活化素AC與第I或第II型活化素受體結合而活化。
本發明之抗體可具有一或多種前述生物特性或其任何組合。本發明抗體之其他的生物特性，熟習技術之一般技術者由包括文中操作實例之本揭示文的論述中，應顯而易見。
包括Fc變體之抗-活化素A抗體
根據本發明特定的實施例，係提供包括一Fc區之抗-活化素A抗體，而該Fc區係包括一或多個，例如相較於中性pH，在酸性pH時增進或減低抗體與FcRn受體結合之突變。例如，本發明係包括於Fc區域之CH2或CH3區包括一突變的抗-活化素A抗體，其中該突變係增加Fc區於酸性環境中對FcRn之親和力(例如於其中pH範圍約5.5至約6.0之核內體中)。此等突變可在投予動物時使抗體之血清半衰期增加。此等Fc修飾之非 限定實例包括，例如於位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)；或或位置428及/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如A,W,H,F或Y[N434A,N434W,N434H,N434F或N434Y])之修飾；或位置250及/或428之修飾；或位置307或308(例如308F,V308F)和434之修飾。在一實施例中，此修飾係包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾(例如T250Q和M428L)；和307及/或308修飾(例如308F或308P)。又在另外的實施例中，此修飾係包括265A(例如D265A)及/或297A(例如N297A)修飾。
例如，本發明係包括包含一Fc區之抗-活化素A抗體，而該Fc區係包括一或多對(或組)由下列組成之群中選出的突變：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y,254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；257I和311I(例如P257I和Q311I)；257I和434H(例如P257I和N434H)；376V和434H(例如D376V和N434H)；307A、380A和434A(例如T307A,E380A和N434A)；以及433K和434F(例如H433K和N434F)。所有可能的前述Fc區突變之組合，及其他揭示於文中之抗體可變區內的突變係涵蓋在本發明之範圍內。
本發明亦包括包含嵌合重鏈恆定(CH)區之抗-活化素A抗體，其中該嵌合CH區係包括衍生自一個以上的免疫球蛋白同型之CH區的片段。例如，本發明之抗體可包括一嵌合的CH區，其係包括部份或全部衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之CH2區，與部份或全部衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之CH3區組合。根據特定的實施例，本發明之抗體係包括一具有嵌合絞鏈區之嵌合CH區。例如，嵌合絞鏈可包括一衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4絞鏈區之「上絞鏈」序列(根據EU編號，從位置216至227之胺基酸殘基)，與衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4絞鏈區之「下絞鏈」序列(根據EU編號，從位置228至236之胺基酸殘基)組合。根據特定的實施例，此嵌合絞鏈係包括衍生自 人類IgG1或人類IgG4上絞鏈之胺基酸殘基以及衍生自人類IgG2下絞鏈之胺基酸殘基。包括如文中所述之嵌合CH區的抗體，在特定的實施例中，在對抗體之治療或藥物動力學性質無不利的影響下，可具有修飾的Fc效應子功能。(參見，例如2013年2月1日申請的美國臨時申請案第61/759,578號，其揭示文係以全文引用的方式併入本文中)。
表位定位及相關技術
本發明係包括與一或多個活化素A所發現的胺基酸相互作用之抗-活化素A抗體(例如在第II型活化素受體結合位置內)。與抗體結合之表位可由3或更多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個)位於活化素βA亞單元內的單一連續序列所組成。另外，表位可由多數個位於活化素A二聚體內的非連續胺基酸(或胺基酸序列)所組成。
各種本項技術之一般技術者已知的技術皆可用於測定抗體是否與多肽或蛋白內的「一或多個胺基酸相互作用」。示例的技術包括，例如，如描述於Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中之習用交叉阻斷分析，丙胺酸掃描突變分析、胜肽墨點分析(Reineke,Methods Mol Biol 248：443-463(2004))及胜肽裂解分析。此外，可使用例如表位切除、表位萃取及抗原之化學修飾等方法(Tomer,Protein Science 9：487-496(2000))。可用於辨識多肽內與抗體相互作用之胺基酸的另外方法係以質譜偵測氫/氘交換。一般而言，氫/氘交換方法係包括以氘標定有關的蛋白，接著讓抗體與氘-標定的蛋白結合。接著，將蛋白/抗體複合物轉置於水中，讓除了受抗體保護的殘基(其仍為氘標定)以外的所有殘基發生氫-氘交換。解離抗體後，將目標蛋白以蛋白酶裂解並以質譜分析，藉此找出氘標定殘基，其係相當於與抗體相互作用之專一性胺基酸。參見，例如Ehring,Analytical Biochemistry 267(2)：252-259(1999)；Engen和Smith,Anal.Chem.73：256A-265A(2001)。
本發明進一步係包括與任何文中所述之特定示例性抗體相同之表位結合的抗-活化素A抗體(例如H4H10423P、H4H10424P、H4H10426P、H4H10429P、H4H10430P、H4H10432P2、H4H10433P2、 H4H10436P2、H4H10437P2、H4H10438P2、H4H10440P2、H4H10442P2、H4H10445P2、H4H10446P2、H4H10447P2、H4H10448P2、H4H10452P2、H4H10468P2、H2aM10965N等)。同樣地，本發明亦包括與任何文中所述之特定示例性抗體(例如H4H10423P、H4H10424P、H4H10426P、H4H10429P、H4H10430P、H4H10432P2、H4H10433P2、H4H10436P2、H4H10437P2、H4H10438P2、H4H10440P2、H4H10442P2、H4H10445P2、H4H10446P2、H4H10447P2、H4H10448P2、H4H10452P2、H4H10468P2、H2aM10965N等)競爭與活化素A相結合之抗-活化素A抗體。例如，本發明包括與一或多種如文中實例4所定義之「Bin 1」抗體交叉競爭和活化素A結合之抗-活化素A抗體(例如H4H10423P、H4H10446P2、H4H10468P2和H4H10442P2)。本發明亦包括與一或多種如文中實例4所定義之「Bin 2」抗體交叉競爭和活化素A結合之抗-活化素A抗體(例如H4H10429、H4H1430P、H4H10432P2、H4H10436P2和H4H10440P2)。
藉由使用本項技術中已知及文中作為示例的習用方法，可容易地測定一抗體是否與參照的抗-活化素A抗體相同之表位結合或是與其競爭結合。例如，測定試驗抗體是否與本發明之參照抗-活化素A抗體上相同的表位結合，係讓參照抗體與活化素A(或含βA-亞單元之異型二聚物)結合。接著，評估試驗抗體與活化素A結合之能力。若試驗抗體在與參照的抗-活化素A抗體飽和結合後，能與活化素A結合，則其可結論出，該試驗抗體係與參照的抗-活化素A抗體不同的表位結合。另一方面，若試驗抗體在與參照的抗-活化素A抗體飽和結合後，不能與活化素A分子結合，則試驗抗體可能與和本發明之參照的抗-活化素A抗體結合的表位相同之表位結合。然後可進行另外例行的實驗(例如胜肽突變和結合分析)，以確定所觀察到無試驗抗體結合是否事實上係由於與和參照抗體相同的表位結合所致，或是否係因立體阻斷(或另外的現象)造成無觀察到結合。此類實驗可使用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞儀或本項技術中可取得的另外其他量性或質性抗體-結合分析來進行。依照本發明特定的實施例，如於競爭性結合分析中所測，若例如一1-、5-、10-、20-或100-倍過量的抗體抑制另一抗體之結合至少50%，但較佳地75%、90%或甚至99%，則二種抗體係與相同(或 重疊)的表位結合(參見，例如Junghans等人，Cancer Res.50：1495-1502(1990))。另外，若基本上降低或消除一抗體之結合的抗原中所有的胺基酸突變，係降低或消除另一種抗體之結合，則二種抗體被認為係與相同的表位結合。若僅一亞群降低或消除一抗體結合之胺基酸突變降低或消除另一種抗體之結合，則二種抗原結合蛋白被認為具有「重疊的表位」。
為了測定一抗體是否與參照的抗-活化素A抗體競爭結合(或交叉競爭結合)，係以二個方向進行上述結合方法：第一個方向：讓參照的抗體在飽和的條件下與活化素A蛋白(或含βA亞單元之異型二聚體)結合，接著評估試驗抗體與活化素A分子之結合。第二個方向：讓試驗抗體在飽和的條件下與活化素A分子結合，接著評估參照的抗體與活化素A分子之結合。若在二個方向中，僅有第一(飽和)抗體能與活化素A結合，則結論出試驗抗體係和參照的抗體競爭與活化素A結合(參見，例如文中實例4中所述的分析模式，其中係將試驗的活化素A抗體捕捉至感應器尖端，及然後將其浸入含有與活化素A預結合之參照活化素A抗體的溶液中)。本項技術之一般技術者應了解，與參照的抗體競爭結合之抗體可能不一定係與參照抗體相同之表位結合，但可能係藉由與重疊或相鄰的表位結合，在立體上阻斷參照抗體之結合。
對於第II型活化素受體，本發明之抗-活化素A抗體可與在結合位置內或靠近結合位置之活化素A上的表位結合，直接阻斷活化素A和第II型活化素受體間的相互作用，及間接阻斷活化素A和第I型活化素受體間的相互作用。對於第I型活化素受體，本發明之抗-活化素A抗體可與在結合位置內或靠近結合位置之活化素A上的表位結合並直接阻斷活化素A和第I型活化素受體間的相互作用。在本發明一實施例中，在第I型活化素受體結合位置或靠近其位置與活化素A結合的本發明之抗-活化素A抗體不會阻斷活化素A和第II型活化素受體間的相互作用。
製備人類抗體
用於製造單株抗體，包括全人類單株抗體之方法已為本項技術所知。任何此等已知的方法可用於本發明內文中來製造專一與人類活化素A結合之人類抗體。
例如，使用VELOCIMMUNETM技術，或用於產生全人類單株抗體之任何其他已知方法，最初係先分離具有人類可變區和小鼠恆定區的之人類活化素A的高親和力嵌合抗體。如下文實驗部分，將抗體定性並就所欲的特性作選擇，包括親和力、選擇性、表位等。若需要，以所欲的人類恆定區置換小鼠恆定區，例如野生型或經修飾的IgG1或IgG4，產生全人類抗-活化素A抗體。當所選的恆定區可根據特定的用途改變時，高親和力抗原-結合和目標特異性特性係留在可變區中。在特定情況下，全人類抗-活化素A抗體係直接由抗原-陽性的B細胞分離出。
生物等效性
本發明之抗-活化素A抗體及抗體片段係涵蓋具有與所述的抗體不同但保留與人類活化素A結合能力之胺基酸序列的蛋白。此等變異抗體及抗體片段，當與親代序列相比較時，係包括一或多個胺基酸之添加、刪除或取代，但具有與所述的抗體基本上相當之生物活性。同樣地，本發明之編碼抗-活化素A抗體的DNA序列，當與所揭示的序列相比較時，係涵蓋包括一或多個核苷酸之添加、刪除或取代之序列，但編碼抗-活化素A抗體或抗體片段者其基本上與本發明之抗-活化素A抗體或抗體片段為生物等效的。此等變異的胺基酸和DNA序列之實例係如上所論述。
二種抗原結合蛋白或抗體，若例如其為醫藥同等物或醫藥替代品，當於類似的實驗條件下以單一劑量或多劑量之相同的莫耳劑量投予時，其吸收速率和程度並無顯示顯著的差異，則係視為生物等效的。某些抗體若其吸收程度相當但是吸收速率不同應可視為等效物或醫藥替代品，且仍可視為生物等效，因為此等吸收速率上的差異為故意的並反映在標示上，對於達到例如長期使用之有效體藥濃度並非必要的，且就特定藥物產品的研究上被視為無醫療上的顯著性。
在一實施例中，二種抗原結合蛋白若在其安全性、純度及效力上不具有臨床上有意義的差異，則為生物等效的。
在一實施例中，二種抗原結合蛋白，若相較於無此變更之持續治療，病患可在參照產品和生物產品間作一或多次變更而無增加預期的 有害效應之風險(包括臨床上致免疫性之明顯改變或效用減低)，則為生物等效的。
在一實施例中，若二種抗原結合蛋白係藉由共同的機制或作用機制作用於症狀或所用症狀，而達到此等機制已知的程度，則二者係為生物等效的。
生物等效性可藉由活體內和活體外方法來驗證。生物等效性測量包括，例如(a)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中係測量血液、血漿、血清或其他生物體液中隨著時間變化之抗體或其代謝物濃度；(b)與人類活體內生物可利用性數據有相互關係及可合理預測此數據之活體外試驗；(c)人類或其他哺乳動物之活體內試驗，其中係測量隨時間變化之抗體(或其目標)的適當急性藥理效用；及(d)以建立抗原結合蛋白之安全性、效力或生物可利用性或生物等效性之良好對照的臨床試驗。
本發明之抗-活化素A抗體的生物等效變體可藉由，例如製造各種殘基或序列之取代，或刪除生物活性不需要的末端或內部殘基或序列來建構。例如，生物活性不需要的半胱胺酸殘基可刪除或以其他的胺基酸置換，以防止因變性而形成不必要或不正確的分子內雙硫橋。在其他內容中，生物等效的抗體可包括抗-活化素A抗體變體，其係包含修飾抗體之糖基化特性的胺基酸改變，例如消除或移除糖基化之突變。
物種選擇性和物種交叉反應
根據特定的實施例，本發明係提供與人類活化素A結合但不與來自其他物種活化素A結合之抗-活化素A抗體。本發明亦包括與人類活化素A及來自一或多種非人類物種之活化素A結合的抗-活化素A抗體。例如，本發明之抗-活化素A抗體可與人類活化素A結合，以及可或不可(視情況而定)與一或多種小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、獼猴、絨猴、恆河猴或黑猩猩活化素A結合。根據本發明特定的示例性實施例，係提供專一與人類活化素A(例如活化素A或含βA亞單元之異型二聚體)和食蟹獼猴(例如Macaca fascicularis)活化素A結合之抗-活化素A抗體。
免疫接合物
本發明係涵蓋與療效成份，例如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素接合之抗-活化素A單株抗體(免疫接合物)。細胞毒性劑包括任何對細胞有害之試劑。用於形成免疫接合物之適合的細胞毒性劑及化療劑實例已為本項技術所知(參見，例如WO 05/103081)。
多專一性抗體
本發明之抗體可為單專一性、雙專一性或多專一性。多專一性抗體可對一目標多肽之不同的表位具專一性或可含有對一個以上的目標多肽具專一性之抗原結合區。參見，例如Tutt等人，J.Immunol.147：60-69(1991)；Kufer等人，Trends Biotechnol.22：238-244(2004)。本發明之抗-活化素A抗體可與另外的功能分子，例如另外的胜肽或蛋白相連結或共表現。例如，抗體或其片段可與一或多個其他的分子實體，例如另外的抗體或抗體片段功能性連接(例如以化學偶合、基因融合、非共價連結或其他)，產生帶有第二結合專一性之雙專一性或多專一性抗體。例如，本發明係包括雙專一性抗體，其中免疫球蛋白之一臂係對人類活化素A具專一性，而免疫球蛋白之另一臂係對第二治療目標具專一性，或與第二療效成份接合。本發明之一實施例中係包括雙專一性抗體，其中免疫球蛋白之一臂係對人類活化素A或其片段具專一性，而免疫球蛋白之另一臂係對GDF8具專一性。
可用於本發明內容中之示例性雙專一抗體形式係包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3區和第二Ig CH3區，其中該第一和第二Ig CH3區彼此至少有一個胺基酸不同，且相較於缺乏此胺基酸差異之雙專一性抗體，其中至少一個胺基酸的差異降低了此雙專一性抗體與蛋白A之結合(參見，例如美國專利第8,586,713號，其全文係以引用的方式併入本文中)。在一實施例中，第一Ig CH3區與蛋白A結合而第二Ig CH3區含有降低或消除蛋白A結合之突變，例如H95R修飾(IMGT之外顯子編號；EU編號為H435R)。第二CH3可進一步包括Y96F修飾(IMGT；EU為Y436F)。在第二CH3中可發現的另外修飾作用，就IgG1抗體之情況而言係包括：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；EU為D356E、L358M、N384S、 K392N、V397M和V422I)；就IgG2抗體之情況為N44S、K52N和V82I(IMGT；EU為N384S、K392N和V422I)；及就IgG4抗體之情況為Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、V82I和L105P(IMGT；EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、V422I和L445P)。上述之雙專一性抗體形式之變異係涵蓋在本發明的範圍內。
可用於本發明內容中之其他示例性雙專一抗體形式係包括(不限於)，例如scFv-為基礎或雙抗體雙專一性形式、IgG-scFv融合物、雙可變區(DVD)-Ig、細胞雜交瘤(Quadroma)、knobs-into-holes、共同輕鏈(例如帶有knobs-into-holes之共同輕鏈等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、白胺酸拉鏈(leucine zipper)、Duobody、IgG1/IgG2、雙作用Fab(DAF)-IgG和Mab2雙專一形式(參見，例如Klein等人，mAbs 4：6,1-11(2012)及文中所引述的參考文獻，供審閱前述形式)。雙專一性抗體亦可使用胜肽/核酸接合來建構，例如其中係使用具有垂直化學反應性之非天然胺基酸來產生位點-專一性之抗體-寡核苷接合物，然後其可自我組合成帶有定義組成、價數和幾何形狀之多聚合複合物(參見，例如Kazane等人，J.Am.Chem.Soc.135(1)：340-346(2013))。
治療調配物及給藥
本發明係提供包括本發明之抗-活化素A抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物。本發明之醫藥組成物係以適合的載劑、賦形劑和其他提供改善轉移、運送、耐受性及類似性質之試劑所調配。許多適合的調配物可參見所有醫藥化學家已知的處方集：賓州伊斯頓馬克出版公司之Remington's Pharmaceutical Sciences。這些調配物包括，例如散劑、糊膏、軟膏、軟凍、蠟、油、脂質、含脂質(陽離子或陰離子)之囊泡(例如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA接合物、無水吸收糊膏、水包油和油包水乳劑、乳劑碳蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠及含碳蠟(carbowax)之半固體混合物。亦參見Powell等人"Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA,J Pharm Sci Technol 52：238-311(1998)。
投予病患之抗體劑量可依照病患的年齡和體型大小、目標疾病、症狀、給藥路徑及其類似因素而不同。較佳的劑量典型地係根據體重或體表面積來計算。當本發明之抗體係用於成人病患供治療與活化素A活性有關的症狀或疾病時，有利的一般可以單一劑量由靜脈投予約0.01至約20毫克/公斤體重，更佳地約0.02至約7，約0.03至約5，或約0.05至約3毫克/公斤體重之本發明抗體。依照症狀之嚴重度，治療之頻率和作用期可調整。給予抗-活化素A抗體之有效劑量和時程可依經驗來決定；例如可藉由定期評估來監看病患進步，並據此調整劑量。再者，物種間劑量之衡量可使用本項技術中熟知的方法來進行(例如Mordenti等人，Pharmaceut.Res.8：1351(1991))。
各種的遞送系統已為所知並可用於投予本發明之醫藥組成物，例如包膠之微脂體、微粒、微膠囊、能表現本發明抗體或其他治療蛋白之重組細胞、受體媒介的內吞作用(參見，例如Wu等人，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))。本發明之抗體和其他治療活性組份亦可藉由基因治療技術來遞送。導入方法包括(但不限於)皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服路徑。組成物可以任何方便的路徑，例如以輸注或團注、以經由上皮或黏膜層(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收來給藥，並可與其他生物活性劑共同給藥。給藥可為全身性或局部的。
本發明之醫藥組成物可以標準針和注射器由皮下或靜脈內來遞送。此外，就皮下遞送而言，筆型遞送裝置可容易地用於遞送本發明之醫藥組成物。此筆型遞送裝置可為重複使用型或拋棄型。可重複使用的筆型遞送裝置一般係利用含有醫藥組成物之可更換補充匣。一旦匣內的所有醫藥組成物投予後而補充匣變空，則此空匣可容易丟棄並更換新的含醫藥組成物之補充匣。然後此筆型遞送裝置便可再使用。在拋棄型筆型遞送裝置中無可置換的補充匣。取而代之的，拋棄型筆型遞送裝置係預先填充醫藥組成物收藏在裝置內的儲槽中。一旦醫藥組成物的儲槽變空，整個裝置便可丟棄。
許多可重複使用的筆型和自動注射器遞送裝置已應用於皮下遞送本發明之醫藥組成物。實例包括(但不限於)AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN 70/30TM筆(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I,II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，僅提出一些。用於皮下遞送本發明醫藥組成物之拋棄型筆型遞送裝置包括(但不限於)SOLOSTARTM筆(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自動注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM筆(Abbott Labs,Abbott Park IL)，僅提出一些。
在特定的情況下，醫藥組成物可以控制釋放系統來遞送。在一實施例中，可使用幫浦(參見Langer,上文；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987))。在另外的實施例中，可使用聚合物質；參見Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。又在另外的實施例中，控制釋放系統可放置在靠近組成物的目標處，因此僅需要全身劑量之一部分(參見，例如Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138)。其他的控制釋放系統係論述於Langer,Science 249：1527-1533(1990)之評論中。
可注射的製備物可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等之劑型。這些可注射製備物可以公開已知的方法來製備。例如，可注射製備物可，例如藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於注射上習用的無菌水性媒劑或油性媒劑中來製備。注射用之水性媒劑有，例如生理食鹽水、含葡萄糖和其他佐劑之等張溶液等，其可與適合的增溶劑例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚環氧乙烷(50莫耳)加合物)]等組合使用。油性媒劑，可使用的有芝麻油、大豆油等，其可與增溶劑例如苯 甲酸苯甲基酯、苯甲醇等組合使用。由此所製備的注射液較佳地係填充於適當的安瓶中。
有利地，上述之口服或非經腸用途之醫藥組成物係製備成適合活性成份劑量之單位劑型。此等單位劑量之劑型包括，例如錠劑、片劑、膠囊、注射劑(安瓶)、栓劑等。所含的前述抗體之量一般每單位劑量之劑型為約5至約500毫克；特別是注射形式，較佳的前述抗體係含有約5至約100毫克而其他劑型為約10至約250毫克。
抗體之治療用途
本發明之抗體可用於，其中包括，治療、預防及/或改善任何與活化素A表現、訊號傳遞或活性有關或媒介，或藉由阻斷活化素A和活化素A受體(例如ActRIIA、ActRIIB、第I型活化素受體等)之間的相互作用，或另外抑制活化素A活性及/或訊號傳遞為可治療的疾病或病症。例如，本發明係提供治療可藉由於一個體中增加肌肉強度/力量及/或肌肉量及/或肌肉功能而治癒、減緩或改善，或藉由專一與活化素A結合，而不會與其他ActRIIB配體結合，或專一與活化素A和GDF8結合而不會與其他ActRIIB配體結合，有利地改變代謝作用(碳水化合物、脂質和蛋白處理)之症狀或痛苦的方法。例如，本發明係包括藉由投予患者一活化素A-專一結合蛋白，於患者中增加肌肉強度/力量及/或肌肉量及/或肌肉功能之方法，或於患者中治療特徵為肌肉量或強度減低之疾病或病症之方法。本發明亦包括藉由投予患者一活化素A-專一結合蛋白和一GDF8-專一結合蛋白，於此患者中增加肌肉強度/力量及/或肌肉量及/或肌肉功能之方法，或於此患者中治療特徵為肌肉量或強度減低之疾病或病症之方法。任何文中所揭示或所指之活化素A-專一結合蛋白及/或GDF8-專一結合蛋白可用於本發明這些方面之內容中。例如，本發明之治療方法包括於一患者中投予抗-活化素抗體及/或抗-GDF8抗體。
因此，在文中所述的治療方法之內容中，抗-活化素A抗體可以單一治療(亦即作為唯一的治療劑)或與一或多種另外的治療劑(例如抗-GDF8抗體)組合給藥，進一步的實例係描述於文中的他處。
在包括投予一患者活化素A-專一結合蛋白和GDF8-專一結合蛋白之方法中，活化素A-專一結合蛋白和GDF8-專一結合蛋白可於相同時間或實質上相同時間投予該患者，例如以單一治療劑量，或以二個分開的劑量同時或相隔約5分鐘以內給藥。另一種選擇，活化素A-專一結合蛋白和GDF8-專一結合蛋白可先後投予該患者，例如以分開的治療劑量以彼此在時間上相隔約5分鐘以上。
本發明亦包括藉由投予患者一包括活化素A-專一結合區和一GDF8-專一結合區之抗原結合分子，於此患者中增加肌肉強度/力量及/或肌肉量及/或肌肉功能之方法，或於此患者中治療特徵為肌肉量或強度減低之疾病或病症之方法。任何文中所揭示或所指之活化素A-專一結合蛋白及/或GDF8-專一結合蛋白可用於本發明這些方面之內容中。例如，本發明之治療方法包括投予患者一雙專一性抗體，其係包括：包含專一與活化素A結合之HCVR/LCVR對的第一可變區，和包含專一與GDF8結合之HCVR/LCVR對的第二可變區。
本發明之組成物可與一或多種另外的治療劑一起投予患者，其包括，例如生長因子抑制劑、免疫抑制劑、抗發炎劑、代謝抑制劑、酵素抑制劑和細胞毒性劑/細胞抑制劑。另外的治療劑可在投予本發明之活化素A-和GDF8-專一結合蛋白之前、同時或之後給藥。
可以本發明組成物治療之示例性疾病、病症和症狀包括(但不限於)肌少症、惡質病(特發性惡質病或其他症狀之次發性，例如癌症、慢性腎衰竭或慢性阻塞性肺疾病)、肌肉損傷、肌肉創傷、肌肉消瘦和肌肉萎縮，例如由廢用所造成或與其有關，例如固定不動、臥床休養、受傷、醫療、手術介入(例如髖部骨折、髖關節置換和膝關節置換和其他關節、肌鍵，或韌帶損傷例如前十字韌帶(ACL)及/或尺內韌帶(MCL)斷裂等)、肌肉失養症(例如強直性、裘馨氏、貝克氏、肢-帶型、顏面肩胛肱骨型(FSHD，亦稱為蘭杜茲氏症)、先天性、眼咽型、末梢性、艾梅氏等)、類固醇引起的肌病變、中風康復(例如由中風輕偏癱康復)及必要的呼吸器輔助。本發明組成亦可用於治療、預防或改善例如癌症、肥胖症、糖尿病、關節炎、多發性硬化症、肌肉失養症、肌萎縮側索硬化症、帕金森氏症、骨質疏鬆症、 骨關節炎、骨質缺乏症和代謝症候群(包括，但不限於糖尿病、肥胖症、營養失調、器官萎縮、慢性阻塞性肺疾病和惡質病)等疾病。
副作用之避免
本發明係包括在無引起與投予結合多個(例如3或多個)ActRIIB配體之分子有關的有害副作用下，於患者中增加肌肉強度/力量及/或肌肉量及/或肌肉功能之方法，或於此患者中治療特徵為肌肉量或強度減低之疾病或病症之方法。例如，稱為ACE-031(Acceleron Pharma,Inc.,Cambridge,MA)之臨床分子為一由融合IgG Fc區之ActRIIB胞外部份所組成的多聚體(此分子在文中亦稱為"ActRIIB-Fc")。ActRIIB-Fc係結合活化素A以及其他ActRIIB配體，例如活化素B、GDF8、GDF11、BMP9、BMP10和TGFβ，且當投予人類患者時已知引起各種有害的副作用。明顯地，本發明者們意外地發現，專一抑制活化素A和GDF8(例如藉由投予抗-活化素A抗體和抗-GDF8抗體)，在不會抑制其他ActRIIB配體，例如活化素B、GDF11、BMP9、BMP10和TGFβ的同時，使得肌肉量增加，此肌肉量增加係在無引起與非專一性活化素結合劑(例如ActRIIB-Fc)有關的有害副作用下，至少與投予ActRIIB-Fc時所觀察到相當。
組合治療及調配物
本發明係包括包含任何文中所述的抗-活化素A抗體之組成物和治療調配物與一或多種另外的治療活性組份組合，以及包括將此組合物投予有此需要的患者之治療方法。本發明亦包括包含任何文中所述的抗-活化素A抗體之組成物和治療調配物與一或多種另外的治療活性組份組合，以及包括將此組合物投予有此需要的患者之治療方法。例如，本發明之抗-活化素A抗體亦可與抗病毒及、抗生素、鎮痛劑、皮質類固醇、類固醇、氧、抗氧化劑、金屬螯合劑、IFN-γ及/或NSAID組合給藥及/或共調配。本發明之抗-活化素A抗體亦可作為同時包括放射線治療及/或傳統化療(例如在治療癌症或抑制腫瘤生長之方法的狀況下)之治療療法的部分來給藥。任何前述的另外治療活性組份皆可與任何本發明之抗-活化素A抗體組合給藥，供治療任何其中投予抗-活化素A抗體為有利的疾病或病症，其包括，例如肌少症、惡質病、肌肉損傷、肌肉消瘦和肌肉萎縮。任何前述的另外 治療活性組份亦可與本任何本發明之抗-活化素A抗體和GDF8抑制劑(例如抗-GDF8抗體)一起組合給藥。
另外的治療活性組份可在投予本發明抗-活化素A抗體之前，投予患者。例如，若第一組份係在投予第二組份1週前，72小時前，60小時前，48小時前，36小時前，24小時前，12小時前，6小時前，5小時前，4小時前，3小時前，2小時前，1小時前，30分鐘前，15分鐘前，10分鐘前，5分鐘前或少於1分鐘前給藥，則第一組份可視係為在第二組「之前」給藥。在其他的實施例中，另外的治療活性組份可在投予本發明抗-活化素A抗體之後，投予患者。例如，若第一組份係在投予第二組份1分鐘後，5分鐘後，10分鐘後，15分鐘後，30分鐘後，1小時後，2小時後，3小時後，4小時後，5小時後，6小時後，12小時後，24小時後，36小時後，48小時後，60小時後，72小時後給藥，則第一組份可視為係在第二組「之後」給藥。又在其他的實施例中，另外的治療活性組份可與本發明抗-活化素A抗體同時投予患者。「同時」投予，就本發明之目的係包括，例如抗-活化素A抗體和另外的治療活性組份係以單一劑型投予患者或以分開的劑型彼此相隔30分鐘之內或更短，投予患者。若以分開的劑型給藥，各劑型可經由相同的路徑給藥(例如抗-活化素A抗體和另外的治療活性組份可以靜脈內、皮下、玻璃體內等給藥)；另一種選擇，各劑型可經由不同的路徑給藥(例如抗-活化素A抗體可以局部給藥(例如玻璃體內)而另外的治療活性組份可以全身性給藥)。就本揭示文之目的，在任何情況下，以單一劑型、以相同路徑之分開的劑型，或以不同路徑之分開的劑型投予組份全部皆視為「同時給藥」。就本揭示文之目的，在投予另外的治療活性組份「之前」、「同時」或「之後」(該等術語係如上文中所定義)投予抗-活化素A抗體係視為抗-活化素A抗體與另外的治療活性組份「組合」給藥。
本發明係包括其中本發明之抗-活化素A抗體係與一或多種如文中他處所述之另外的治療活性組份共調配之醫藥組成物。
劑量
可投予患者之活性成份(例如抗-活化素A抗體、與抗-活化素A抗體組合給予的抗-GDF8抗體，或專一與活化素A和GDF8結合之雙 專一性抗體)之量，一般而言，為治療上有效量。如文中所用，「治療上有效量」一詞係指抗原-專一結合蛋白及/或抗原-結合分子之劑量其造成一或多個下列參數之可偵測性增加：體重、肌肉量(例如脛骨前[TA]肌力量、腓腸[GA]肌肉量、四頭肌[Quad]肌肉量等)、肌肉強度/力量，及/或肌肉功能。例如，活化素A專一結合蛋白及/或GDF8-專一結合蛋白之「治療上有效量」包括，例如活化素A-專一結合蛋白及/或GDF8-專一結合蛋白之量，當其投予受試者時，相較於對照組的受試者，造成至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%或更多的TA或GA肌肉量增加，例如文中實例6中所說明。
在本發明抗體之情況(例如抗-活化素A抗體、與抗-活化素A抗體組合給予的抗-GDF8抗體，或專一與活化素A和GDF8結合之雙專一性抗體)，治療上有效量可從約0.05mg至約600mg；例如約0.05mg，約0.1mg，約1.0mg，約1.5mg，約2.0mg，約10mg，約20mg，約30mg，約40mg，約50mg，約60mg，約70mg，約80mg，約90mg，約100mg，約110mg，約120mg，約130mg，約140mg，約150mg，約160mg，約170mg，約180mg，約190mg，約200mg，約210mg，約220mg，約230mg，約240mg，約250mg，約260mg，約270mg，約280mg，約290mg，約300mg，約310mg，約320mg，約330mg，約340mg，約350mg，約360mg，約370mg，約380mg，約390mg，約400mg，約410mg，約420mg，約430mg，約440mg，約450mg，約460mg，約470mg，約480mg，約490mg，約500mg，約510mg，約520mg，約530mg，約540mg，約550mg，約560mg，約570mg，約580mg，約590mg，約600mg，約610mg，約620mg，約630mg，約640mg，約650mg，約660mg，約670mg，約680mg，約690mg，約700mg，約710mg，約720mg，約730mg，約740mg，約750mg，約760mg，約770mg，約780mg，約790mg，約800mg，約810mg，約820mg，約830mg，約840mg，約850mg，約860mg，約870mg，約880mg，約890mg，約900mg，約910mg，約920mg，約930mg，約940mg，約950mg，約960mg，約970mg，約980mg，約990mg或約1000mg的個別抗體。
包含在個別劑量內之本發明抗體的量(例如抗-活化素A抗體、與抗-活化素A抗體組合給予的抗-GDF8抗體，或專一與活化素A和GDF8結合之雙專一性抗體)可用每公斤病患體重之抗體毫克數來表示(亦即mg/kg)。例如，本發明之抗-活化素A、抗-GDF8及/或抗-活化素A/抗-GDF8雙專一性抗體可以約0.0001至約50mg/kg之病患體重之劑量投予病患(例如，0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、9.5mg/kg、10.0mg/kg、10.5mg/kg、11.0mg/kg、11.5mg/kg、12.0mg/kg、12.5mg/kg、13.0mg/kg、13.5mg/kg、14.0mg/kg、14.5mg/kg、15.0mg/kg、15.5mg/kg、16.0mg/kg、16.5mg/kg、17.0mg/kg、17.5mg/kg、18.0mg/kg、18.5mg/kg、19.0mg/kg、19.5mg/kg、20.0mg/kg等)。
本發明之組成物可包括等量的活化素A-專一結合蛋白和GDF8-專一結合蛋白。另一種選擇，組成物中活化素A-專一結合蛋白之量可低於或大於GDF8-專一結合蛋白之量。本項技術之一般技術者，使用例行的實驗，應能決定產生所欲治療效用需要之本發明組成物中個別組份的適合量。
給藥療法
根據本發明特定的實施例，可於一定義的時程將多劑量的活性成份(例如抗-活化素A抗體、與抗-活化素A抗體組合給藥的抗-GDF8抗體，包括抗-活化素A抗體與任何文中所提及的另外治療活性劑組合物之醫藥組成物，其係包括例如抗-GDF8抗體，或專一與活化素A和GDF8結合之雙專一性抗體)投予一患者。根據本發明此方面之方法係包括先後將多劑量之本發明活性成份投予一患者。如文中所用，「先後給藥」係指各劑量之活性成份係於不同的時間點投予該患者，例如以預定的間隔隔開(例如小時、日、週或月)之不同日。本發明係包括，包含將一單一起始劑量之活性成份先後投予病患，接著一或多個第二劑量之活性成份及視需要接著一或多個第三劑量之活性成份之方法。
術語「起始劑量」、「第二劑量」和「第三劑量」係指投予本發明活性成份之暫時順序，例如本發明或本發明組合治療之抗-活化素A抗體，例如抗-活化素A抗體和抗-GDF8抗體。因此，「起始劑量」為治療療法開始時所投予之劑量(亦稱為「基線」劑量)；「第二劑量」為在起始劑量之後所投予之劑量；而「第三劑量」為在第二劑量之後所投予之劑量。起始、第二和第三劑量皆可含有相同量之活性成份，例如抗-活化素A抗體，但就給藥的頻率而言，一般可彼此不同。然而，在特定的實施例中，包含在起始、第二及/或第三劑量中之活性成份，例如抗-活化素A抗體之量，在治療期間可互不相同(例如，若適當經上調或下調)。在特定的實施例中，係在治療療法開始時投予二或多個(例如2、3、4或5個)劑量為「承載劑量」，接著以較低頻率為基礎，投予後續劑量(例如「維持劑量」)。
在本發明特定的示例性實施例中，各第二及/或第三劑量係緊接前面劑量之後的1至26週(例如1、1½、2、2½、3、3½、4、4½、5、5½、6、6½、7、7½、8、8½、9、9½、10、10½、11、11½、12、12½、13、13½、14、14½、15、15½、16、16½、17、17½、18、18½、19、19½、20、20½、21、21½、22、22½、23、23½、24、24½、25、25½、26、26½或更久)給藥。「緊接前面劑量」一詞，如文中所用，係指在一多重給藥之順序中，活性成份之劑量，例如抗-活化素A抗體，在每個相鄰接的劑量給藥之前係以無插入劑量之順序投予患者。
根據本發明此方面之方法可包括將任何數目之第二及/或第三劑量之本發明活性成份，例如抗-活化素A抗體，投予一病患。例如，在特定的實施例中，僅將一單一第二劑量投予該病患。在其他實施例中，係將二或多個(例如2、3、4、5、6、7、8或更多個)第二劑量投予該病患。同樣地，在特定的實施例中，僅將一單一的第三劑量投予該病患。在其他實施例中，係將二或多個(例如2、3、4、5、6、7、8或更多個)第三劑量投予該病患。
在涉及多重第二劑量之實施例中，各第二劑量可以如同其他第二劑量之相同頻率來給藥。例如，各第二劑量可在緊接前面劑量後1至2週或1至2個月，投予該病患。同樣地，在涉及多重第三劑量之實施例中， 各第三劑量可以如同其他第三劑量之相同頻率來給藥。例如，各第三劑量可在緊接前面劑量後2至12週，投予該病患。在本發明特定的實施例中，投予病患之第二及/或第三劑量的頻率，在治療療法期間可不同。在治療期間，給藥頻率亦可依照個別病患之需求在臨床檢查後由醫師做調整。
本發明係包括其中以第一頻率將2至6個承載劑量投予病患(例如每週一次、每二週一次、每三週一次、每月一次、每二個月一次等)，接著以較低頻率為基礎將二或多個維持劑量投予病患之給藥療法。例如，根據本發明此方面，若承載劑量係以每月一次的頻率給藥，則維持劑量可以每六周一次、每二個月一次、每三個月一次等，投予病患。
抗體之診斷用途
本發明之抗-活化素A抗體亦可用於偵測或測量樣本中之活化素A或活化素A表現細胞，例如供作診斷目的。例如抗-活化素A抗體或其片段可用於診斷特徵為活化素A異常表現(例如過度表現，表現不足，無表現等)之症狀或疾病。活化素A之示例性診斷分析可包括，例如將得自病患的樣本與本發明之抗-活化素A抗體接觸，其中該抗-活化素A抗體係經可偵測的標記或報導分子標定。另一種選擇，未標定的抗-活化素A抗體可與本身經可偵測標記標定之第二抗體組合用於診斷用途。可偵測標記或報導分子可為放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I；螢光或化學螢光基團，例如螢光素異硫氰酸酯或羅丹明(rhodamine)；或酵素例如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶或螢光素酶(luciferase)。可用於樣本中偵測或測量活化素A之特定示例性分析包括酵素連結免疫吸附法(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)及螢光活化細胞分類(FACS)。
根據本發明可用於活化素A診斷分析之樣本包括含有可偵測量之活化素A蛋白或其片段，其係在正常或病理條件下可由病患得來之任何組織或液體樣本。一般而言，係測量得自健康病患(例如未罹患與異常的活化素A量或活性有關的疾病或症狀之病患)之特定樣本中活化素A的量，以先建立一基線或標準的活化素A量。然後可將活化素A之基線量與得自疑似患有活化素A相關疾病或症狀之個體樣本中所測量的活化素A量相比較。
實例
提出下列實例以提供本項技術之一般技術者如何製造及使用本發明方法和組合物之完整揭示和說明，且不希望限制發明者所認為之發明範圍。雖已盡力確保所用的相關數字(例如量、溫度等)之正確性，但仍應考量某些實驗誤差和偏差。除非另有指出，否則份數係為重量份，分子量為平均分子量，溫度係以攝氏度數表示，而壓力係為或接近大氣壓。
實例1.產生人類之活化素A抗體
將一包括人類活化素A(抑制素-βA二聚體)之免疫原直接投予包括編碼人類免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈可變區之DNA的VELOCIMMUNE®小鼠，幫助刺激免疫反應。以活化素A-專一性免疫分析監測抗體免疫反應。當達到所欲的免疫反應時，收取脾臟細胞並與小鼠骨髓瘤細胞融合以保留其生存力及形成雜交瘤細胞株。篩選及選擇雜交瘤細胞株用以鑑別產生活化素A-專一性抗體之細胞株。使用此技術得到數種抗-活化素A嵌合抗體(亦即，具有人類可變區和小鼠恆定區之抗體)。以此方式產生的一示例性抗體為H2aM10965N。隨後將來自嵌合抗體之人類可變區選殖至人類恆定區用以製造如文中所述之全人類抗-活化素A抗體。
如US 2007/0280945A1中所述，直接從沒有與骨髓瘤細胞融合的抗原陽性B細胞分離全人類抗-活化素A抗體。使用此法，得到數種全人類抗-活化素A抗體(亦即具有人類可變區和人類恆定區之抗體)；以此方式產生的示例性抗體係命名如下：H4H10423P、H4H10429P、H4H10430P、H4H10432P2、H4H10440P2、H4H10442P2、H4H10436P2和H4H10446P。
依照此實例之方法所產生的示例性抗-活化素A抗體之特定生物性質係詳述於下文所述的實例中。
實例2.重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列
表1係列出所選的抗-活化素A抗體之重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列對和CDR序列及其對應的抗體識別碼。對應的核酸序列識別碼係列於表2中。
抗體典型地在文中係根據下列命名法來命名：Fc字首(例如「H1M」、「H2aM」、「H4H」)，接著數字識別碼(例如，如表1和2中所示之「10423」、「10424」或「10426」)，接著「P」、「P2」或「N」字尾。因此，根據此命名法，一抗體在文中可稱為，例如「H4H10423P」、「H4H10432P2」、「H2aM10965N」等。在用於文中之抗體命名上H1M、H2M和H4H字首係指抗體特定的Fc區同型。例如，「H2aM」抗體係具有小鼠IgG2a Fc，而「H4H」抗體係具有人類IgG4 Fc。本項技術之一般技術者應了解，具有特定Fc同型之抗體可轉變為具有不同Fc同型之抗體(例如帶有小鼠IgG2a Fc之抗體可轉變為帶有人類IgG4之抗體等)，但在任何情況下，可變區(包括CDR)-其係以如表1所示的數字識別碼表示-則仍不變，且結合性質預期為相同的或實質上類似的，與Fc之性質無關。
用於下列實例之對照組結構
抗-活化素A對照組抗體係包括在下列實例中作為比較目的。此對照抗體在文中係稱為對照組1：帶有US 8,309,082中所述之A1重鏈和輕鏈可變區序列的人類抗-活化素A抗體。
實例3.以表面電漿共振測定抗體與人類活化素A之結合
抗原與選擇的純化抗-人類活化素A單株抗體結合之結合親和力和動力學常數(KD值)係使用即時表面電漿共振生物感測器(Biacore T200或Biacore 4000,GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)分析於25℃和37℃所測定。將表現小鼠Fc(字首H2aM)或人類Fc(字首H4H)之抗體，捕捉至其個別的抗-Fc感測器表面(Mab捕捉模式)。將抗-活化素A抗體捕捉至經由直接的胺與Biacore CM5感測晶片偶合所製造之山羊抗-小鼠IgG多株抗體(GE Healthcare,#BR-1008-38)或小鼠抗-人類IgG單株抗體(GE Healthcare,#BR-1008-39)表面。動力學實驗係使用HBS-EP(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05%界面活性劑P20，於pH 7.4)或PBS-P(10mM磷酸鈉，2.7mM KCl,137mM NaCl,0.02% NaN3,0.05%界面活性劑P20,pH 7.4)作為運行緩衝劑和樣本緩衝劑來進行。抗原-抗體結合速率係藉 由在捕捉抗體的表面注射各種濃度(範圍從50至0.2nM之4-倍稀釋液)的活化素A(R&D Systems,# 338-AC-050/CF)、活化素B(R&D Systems,# 659-AB-025/CF)、活化素AB(R&D Systems,# 1006-AB-005)、活化素AC(R&D Systems,# 4879-AC/CF)或抑制素E(Novus Biologicals,#H00083729-P01)來測量。抗體-抗原結合係監測240秒，而緩衝液中之解離係監測600秒。動力學結合和解離速率常數係使用Scrubber軟體2.0c版藉由處理和擬合數據來測定。然後從動力學速率常數計算結合平衡解離常數(K D)和解離半衰期(t1/2)：K D(M)=k d/k a及t½(min)=[ln2/(60*k d)]。不同抗-活化素A單株抗體之動力結合常數係如表3至10所示(NB=在所用的條件下無觀察到結合；NT=未檢測)。
斜體之k d值係固定為5.00E-05
斜體之k d值係固定為5.00E-05
如表3和4所示，本發明之抗-活化素A抗體在25℃時係以範圍低於3.18pM(亦即3.18E-12)至745pM(亦即7.45E-10)之K D值，及在37℃時係以範圍從低於2.18pM(亦即2.18E-12)至1.77nM(1.77E-09)之K D 值與活化素A結合。如表5和6所示，數種抗-活化素A抗體(亦即H4H10432P2、H4H10442P2、H4H10430P2、H4H10446P2和H4H10468P2)在25℃或37℃時並未顯現可測量的活化素B結合。這些抗體以範圍從約18.5pM(亦即1.85E-11)至1.34nM(亦即1.34E-09)之K D值顯現可測量的活化素AB之結合，以及如7-10表所示，以範圍從約1.57nM(亦即1.57E-09)至22.5nM(亦即2.25E-08)之K D值與活化素AC結合。再者，本發明之試驗的抗-活化素A抗體對抑制素E並未顯現可測量的結合(數據未顯示)。
實例4.抗-活化素A抗體之交叉競爭分析
進行一交叉競爭分析用以評估9種抗體組(H4H10446P2、H4H10468P2、H4H10442P2、H4H10423P、H4H10430P、H4H10429P、H4H10432P2、H4H10436P2和H4H10440P2)彼此競爭與人類活化素A相結合之能力。二種同型對照抗體和二種對照活化素A抗體、比較子1(帶有US 8,309,082中所述之A1重鏈和輕鏈可變區序列的人類抗-活化素A抗體)和比較子3(MAB3381，可得自R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)亦包括在分析中。所有的分析係根據製造商(ForteBio Corp.,Menlo Park,CA)之說明在25℃以1000rpm之流速於Octet HBST緩衝液中(0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05% v/v界面活性劑P20,0.1mg/mL BSA)進行。簡言之，藉由將尖端浸入各抗-活化素A抗體之10μg/Ml溶液中5分鐘，將約1.8nm之各抗-活化素A抗體捕捉至塗覆抗-人類Fc抗體之Octet感測器尖端(Fortebio,# 18-0015)。藉由將尖端置入相關抗體之50ug/mL溶液中5分鐘以1,000RPM培養，阻斷尖端之任何其餘的抗-hFc結合位置。然後將感測器尖端浸入含有與1μM的第二抗-活化素A抗體預結合之50nM活化素A溶液(R&D Systems,# 338-AC/CF)的孔槽中。第二活化素A抗體/活化素A溶液與塗覆活化素A抗體之感測器尖端的結合係於1000rpm監測5分鐘。感測器尖端在實驗的各步驟間係簡單地以Octet HBST緩衝液清洗。在實驗期間監測即時結合反應並測量mAb-1與預複合mAb-2之活化素A的結合反應。比較這些mAb/活化素A複合物與塗覆抗-活化素A之感測器尖端結合的反應並決定不同抗-活化素A單株抗體之競爭/非競爭行為。結果係如圖1所示。
在圖1中，低於1.0Nm之結合反應係以黑色、深灰色或淡灰色陰影表示並係指對應的抗體對彼此競爭與活化素A結合。帶有黑色字子之淡灰色盒形係代表相同抗體間之自我競爭。帶有白色字體之黑色盒形係代表以二個方向競爭與活化素A結合之抗體，與結合順序無關。帶有黑色字體之深灰色盒形代表部分競爭或在同型對照之情況下未與第二抗體結合。帶有黑色字體之白色盒形係代表抗體間無競爭，其顯示抗體在活化素A上具有不同的結合表位。
四種抗體H4H10446P2、H4H10468P2、H4H10442P2和H4H10423P係雙向性彼此競爭與活化素A結合。另外，這四種抗體並不會與比較子1或MAB3381競爭結合。此四種活化素A抗體中的其中三種H4H10446P2、H4H10468P2和H4H10442P2不會與任何其他活化素A抗體交叉競爭。然而四種抗體中的其中一種(H4H10423P)，亦以雙向性與H4H10430P競爭活化素A之結合。五種抗體，H4H10430P、H4H10429、H4H10432P2、H4H10436P2和H4H10440P2係雙向性彼此競爭以及與比較子1和MAB3381競爭活化素A之結合。五種活化素A抗體中的其中四種(亦即H4H10429、H4H10432P2、H4H10436P2和H4H10440P2)不會與任何其他活化素A抗體交叉競爭，而H4H10423P，如上所示，亦會與H4H10430P交叉競爭。
這些實例之結果顯示，本發明之抗-活化素A抗體以表位結合特性為基準可分成二組不同的箱框(bin)：箱框1包括H4H10423P、H4H10446P2、H4H10468P2和H4H10442P2。箱框2包括H4H10429、H4H1430P、H4H10432P2、H4H10436P2和H4H10440P2。另外，一來自各箱框的抗體，亦即H4H10423P和H4H1430P，係彼此交叉競爭。這些實例的結果顯示，箱框1之抗體與箱框2之抗體係於活化素A上不同的區域結合。
實例5.以抗-活化素A抗體抑制化素A-媒介的受體活化和SMAD複合物訊號傳遞
為了進一步定性出本發明抗-活化素A抗體，係開發一生物分析用以偵測IIA型和IIB型活化素受體(分別為ActRIIA和ActRIIB)之活 化及後續第I型活化素受體之磷酸化和活化。ActRIIA和ActRIIB與活化素間的相互作用引發了各種細胞過程，包括生長調節、癌細胞轉移和胚胎幹細胞之分化(Tsuchida,K.等人，Cell Commun Signal 7：15(2009))。第I型受體之磷酸化和活化導致SMAD 2和3蛋白之磷酸化，其形成了活化的SMAD複合物造成基因的轉錄調節。
就偵測經由活化素與或第II型活化素受體結合之SMAD複合物訊號轉導路徑，係將人類橫紋肌肉瘤細胞株(ATCC,# HTB-82)以Smad 2/3-螢光素酶報導質體(CAGAx12-Luc；Dennler,1998)轉染，產生A204/CAGAx12-Luc細胞株。將A204/CAGAx12-Luc細胞維持在添加10%胎牛血清(FBS)、青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸和250μg/mL的G418之McCoy’s 5A(Irvine Scientific,# 9090)中。對於此生物分析，係將A204/CAGAx12-Luc細胞以10,000個細胞/孔，植入96-孔盤之血清培養基、0.5%FBS和OPTIMEM(Invitrogen,#31985-070)中，並於37℃和5% CO2下培養至隔夜。就測定配體劑量反應，係將活化素A(R&D Systems,#338-AC)、活化素B(R&D Systems,#659-AB)、活化素AB(R&D Systems,#1066-AB)和活化素AC(R&D Systems,#4879-AC/CF)以1：3從100連續稀釋至0.002nM並開始連同不含活化素之對照組加到細胞中。在活化素A、活化素B、活化素AB和活化素AC觀察到分別以99pM、47pM、19pM和4.4nM之EC50值活化了A204/CAGAx12-Luc細胞株。基於這些結果，係檢測分別在100pM、50pM、30pM和4nM濃度時，抗-活化素A抗體阻斷活化素A、活化素B、活化素AB和活化素AC之能力。就測量抑制作用，係將抗體以1：3連續稀釋由100開始至0.002nM，1000至0.02nM，或300至0.005nM，包括含適當同型對照抗體或不含抗體之對照樣本，並加到帶有固定濃度之100pM活化素A、50pM活化素B、30pM活化素AB或4nM活化素AC的細胞中。於37℃和5% CO2培養5.5小時後，加入OneGlo基質(Promega,# E6051)及然後使用Victor X(Perkin Elmer)儀器偵測螢光酶活性。使用非線性迴歸(4-參數邏輯法)以Prism 5軟體(GraphPad)分析結果。
如表11所示，本發明之抗-活化素A抗體以範圍從39pM至3.5nM之IC50值阻斷100pM的活化素A，而對照組1係以83pM之IC50 值阻斷100pM的活化素A。以一小組的本發明抗-活化素A抗體針對阻斷活化素B、AB和AC進行試驗。在9種試驗的抗體中有4種以範圍從130pM至100nM之IC50值阻斷50pM的活化素B。針對活化素B阻斷作用進行試驗之5種本發明抗體僅在高抗體濃度時阻斷，而對照組1並未顯現任何可測量的活化素B阻斷作用。7種試驗的本發明抗體以範圍從100pM至8.2nM之IC50值阻斷30pM的活化素AB，而對照組1係以540pM之IC50值阻斷。僅一種抗體H4H10423P顯現微弱的活化素AB之阻斷作用。8種試驗的抗體中有7種以範圍從580pM至6.5nM之IC50值阻斷4nM的活化素AC，而對照組1係以1.1nM之IC50值阻斷。僅一種抗體H4H10423P未顯現任何的活化素AC之阻斷作用。
如表11所示，數種本發明之抗-活化素A抗體有效地以次奈莫耳範圍之IC50值阻斷第II型活化素受體被活化素A、活化素AB和活化素AC所活化，同時並未阻斷被活化素B活化。另外，小鼠IgG(同型1)和人類IgG(同型2)負性對照並未阻斷受體之配體活化。
實例6.使用活化素A抗體刺激骨骼肌肥大
藉由投予肌肉生長抑制素-專一性拮抗劑，抗-GDF8抗體H4H1657N2(參見US 2011-0293630 A1，其係以全文引用的方式併入本文中)，或H4H1657N2和不同抗-活化素A抗體之組合物引發的骨骼肌肥大，係於CB17 SCID小鼠中評估。測量相對於以相配的同型對照抗體治療之肥大程度。這些研究亦包括以C-端人類IgG1 Fc區(hActRIIB-hFc,SEQ ID No：227)所產生的人類ActRIIB之胞外區治療。ActRIIB-hFc先前已顯示在引發活體內骨骼肌肥大及阻斷多個TGF-β家族成員配體之活性(Souza,TA等人.Mol Endocrinol 22：2689-702(2008))。
總計8種本發明之抗-活化素A抗體和比較子1係與H4H1657N2組合或單獨以8個研究進行試驗，與同型對照組、ActRIIB-hFc、H4H1657N2單獨或比較子2(具有US 2010/0272734 A1中所述抗體MOR08159之VH/VL的抗-活化素RIIB抗體)治療組作比較。對於此等研究，係將約10週大之雄性CB17 SCID小鼠(Taconic,#CB17SC-M)根據體重平均分成6組，每組5隻小鼠。如表12所述於各研究中處理各組小鼠。
就1-5、7和8之研究，在實驗的第1週期間抗體和ActRIIB-hFc係以10mg/kg之各蛋白劑量由皮下投予2次(第0和3天)在第二週以10mg/kg的各蛋白劑量投予一次(第7天)。在第三週期間(第14天)，最終劑量之抗體或ActRIIB-hFc，就研究#1和#2係以8mg/kg，或就研究#3-#8係以10mg/kg由皮下投予(表12)。在第21天，將小鼠安樂死並測量各小鼠的總體重。就研究6而言，抗體係如同先前的研究給藥，但治療係以在第21天額外的注射，延伸至第28天。從各小鼠切下脛骨前(TA)和腓腸(GA)肌肉並秤重。將組織體重正常化至開始的體重，計算超過同型對照抗體治療組織平均重量之重量的平均百分比變化。彙整於表13-20中之結果係以對照同型對照組之增加平均百分比±平均值標準差。
如表13所示，在第1個研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，於所有檢測的肌肉中ActRIIB-Fc引發顯著的肥大，其中TA重增加45.80+1.47%，及GA重增加31.91+1.4%。單獨以H4H1657N2治療亦引發TA(增加19.54+2.67%)和GA(增加26.46+3.63%)肌肉重量肥大，但其效用比ActRIIB-Fc低。相較於以ActRIIB-hFc治療的小鼠，H4H1657N2+H4H10442P2之組合引起類似的平均TA(40.76+2.59%)和GA(30.62+2.32%)肌肉重量增加。H4H1657N2/H4H10423P和H4H1657N2/H4H10432P2之組合治療並未引起如同H4H16757N2/H4H10442P或ActRIIB-Fc治療所引起同樣大的平均TA重量增加。
如表14所示，在第2個研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，於所有檢測的肌肉中ActRIIB-Fc引發了肥大，其中平均TA重增加43.47+2.37%，及GA平均肌肉重增加29.24+2.22%。在本研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，單獨以H4H1657N2治療亦引發TA和GA平均肌肉重增加(分別為16.7±2.73%和18.54±3.48%)，但這些平均增加量低於ActRIIB-Fc治療組中所觀察到的。H4H1657N2/H4H10429P和H4H1657N2/H4H10436P2之組合治療引起平均TA(分別為34.14+2.55%和29.31+1.59%)及平均GA(分別為26.24+3.11%和26.55+2.41%)增加，其增加量係介於單獨的H4H1657N2或ActRIIB-hFc中所觀察到的增加量之 間。H4H1657N2/H4H10440P2之組合治療並未引起如同本研究之其他二種組合或ActRIIB-Fc治療所引起一樣大的TA或GA平均重量之增加。
如表15所示，在第3個研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，於所有檢測的肌肉中ActRIIB-Fc引發肥大，其中平均TA肌肉重增加39.90+3.58%，及平均GA肌肉重增加34.01+2.87%。相較於同型對照組治療的小鼠，單獨以H4H1657N2治療亦引發TA(14.19±3.19%)和GA平均肌肉重增加(15.73±0.58%)，但這些平均增加量低於ActRIIB-Fc治療組中所觀察到的。H4H1657N2/H4H10446P2之組合治療引起與ActRIIB-hFc治療小鼠相類似的TA(40.01±3.67%)和GA(31.29±2.60%)平均肌肉量增加。H4H1657N2/H4H10430P之組合治療引起TA(28.30±3.27%)和GA(21.55±2.30%)平均肌肉量增加，其係介於單獨的H4H1657N2或H4H1657N2/H4H10446P2組合治療中所觀察到的增加量之間。
如表16所示，在第4個研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，於所有檢測的肌肉中H4H1657N2引發肥大，其中平均TA肌肉重增加5.65+1.38%，及平均GA肌肉重增加9.95+0.86%。在本研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，單獨以H4H10430P治療並未引發肌肉肥大。分別為10mg/kg和2mg/kg之H4H1657N2及H4H10430P的組合治療引起TA(24.67+1.77%)和GA(18.37+3.25%)平均肌肉重增加，其係大於單獨的H4H1657N2或H4H10430P中所觀察到。分別為10mg/kg和10mg/kg之H4H1657N2及H4H10430P的組合治療引起TA(30.22+1.94%)和GA(19.4+1.96%)平均肌肉重增加，其係大於單獨的H4H1657N2或H4H10430P中所觀察到的。分別為10mg/kg和25mg/kg之H4H1657N2及H4H10430P的組合治療引起TA(30.91+3.03%)和GA(20.60+1.66%)平均肌肉重增加，其係大於單獨的H4H1657N2或H4H10430P中所觀察到的。
如表17所示，在第5個研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，於所有檢測的肌肉中H4H1657N2引發肥大，其中平均TA肌肉重增加25.4+1.35%，及平均GA肌肉重增加22.82+1.97%。在本研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，單獨以H4H10446P2治療亦引發低量的肌肉肥大，其中平均TA肌肉重增加為3.70+1.67%，及平均GA肌肉重增加為2.70+1.06%。分別為10mg/kg和2mg/kg之H4H1657N2和H4H10446P2的 組合治療引起TA(51.29+4.20%)和GA(39.24+3.08%)平均肌肉重增加，其係大於單獨的H4H1657N2或H4H10446P2中所觀察到的。分別為10mg/kg和10mg/kg之H4H1657N2和H4H10446P2的組合治療引起TA(49.64+4.08%)和GA(35.56+3.39%)平均肌肉重增加，其係大於單獨的H4H1657N2或H4H10446P2中所觀察到的。分別為10mg/kg和25mg/kg之H4H1657N2和H4H10446P2的組合治療引起TA(49.79+5.46%)和GA(35.14+3.49%)平均肌肉重增加，其係大於單獨的H4H1657N2或H4H10446P2中所觀察到的。
如表18所示，在第6個研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，於所有檢測的肌肉中ActRIIB-Fc引發肥大，其中平均TA重增加47.34+2.63%，及GA肌肉平均重增加32.17+3.81%。在本研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，單獨以H4H1657N2治療亦引發TA和GA平均肌肉重增加分別為17.21+2.97%和21.57+1.90%，但這些平均增加量係低於ActRIIB-Fc治療組中所觀察到的。在本研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，單獨以比較子1治療引發低量的肌肉肥大，其中平均TA肌肉重增加為4.54+2.25%，及平均GA肌肉重增加為2.72+1.30%。分別為10mg/kg和10mg/kg之H4H1657N2和比較子1的組合治療引起TA(30.06+5.51%)和GA(30.72+3.64%)平均肌肉重增加，其係大於單獨的H4H1657N2或H4H10446P2中所觀察到的。
如表19所示，在第7個研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，ActRIIB-Fc於所有檢測的肌肉中引發肥大，其中平均TA肌肉重增加34.43+5.92%，及平均GA肌肉重增加14.86+3.65%。在本研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，單獨以比較子2治療於所有檢測的肌肉中引發肥大，其中平均TA重量增加36.75+3.88%及GA平均肌肉重增加26.41+3.16%。分別為10mg/kg和10mg/kg之H4H1657N2和H4H10430P的組合治療引起TA(33.13+2.02%)和GA(22.82+1.34%)平均肌肉重增加，其係介於單獨的ActRIIB-Fc和單獨的比較子所觀察到的增加量之間。分別為10mg/kg和10mg/kg之H4H1657N2和H4H10446P2的組合治療引起TA(41.28+2.76%)和GA(29.21+2.62%)平均肌肉重增加，其係大於經單獨的ActRIIB-Fc、單獨的比較子2或H4H1657N2與H4H10430P之組合所治療的小鼠。
如表20所示，在第8個研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，ActRIIB-Fc於所有檢測的肌肉中引發肥大，其中平均TA重增加53.74+5.31%，及GA平均肌肉重增加39.39+4.56%。在本研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，單獨以H4H1657N2治療亦引發TA和GA平均肌肉重增加分別為18.44+2.30%和21.17+1.72%，但這些平均增加量係低於ActRIIB-Fc治療組中所觀察到的。在本研究中，相較於同型對照組治療的小鼠，單獨以表較子2治療亦於檢測的肌肉中引發肥大，其中平均TA重增加39.90+1.69%及GA平均肌肉重增加25.87+2.72%。分別為10mg/kg和25mg/kg之H4H1657N2及H4H10423P的組合治療，相較於同型對照組治療的小鼠，係引發TA(36.33+3.67%)和GA(28.18+3.11%)平均肌肉重增加。分別為10mg/kg和25mg/kg之H4H1657N2和H4H10430P的組合治療引起TA(43.83+1.56%)和GA(31.24+1.90%)平均肌肉重增加，其係介於單獨的ActRIIB-Fc和單獨的比較子2中所觀察到的增加量之間。
這些研究顯示，相較於單獨以骨肌素治療，投予抗-活化素A抗體與骨肌素抑制劑可促進骨骼肌肥大至ActRIIB-Fc治療所觀察到的相同程度。
實例7.使用活化素A抗體阻斷活化素A結合
選擇的抗-活化素A抗體阻斷活化素A與其受體ActRIIB和ActRIIA，以及其內源性拮抗劑卵泡抑素(Follistatin)之相互作用的能力，係使用Biacore 3000儀器來測定。對於此實驗，係將以C-端人類Fc標籤表現的人類ActRIIB(hActRIIB-Fc；SEQ ID：227)、以C-端人類Fc標籤表現的人類ActRIIA(hActRIIA-Fc；R&D Systems,# 340-R2-100)或卵泡抑素-288(R&D Systems,#5836-FS-025)與胺偶合至Biacore CM5感測器表面。將5nM固定濃度之活化素A(R&D Systems,#338-AC)單獨或與最終濃度60nM(對活化素A為12-倍莫耳過量)之活化素A抗體、hActRIIA-hFc、hActRIIB-hFc或同型對照阻抗體混合，於室溫培養1小時。然後將抗體-活化素A混合物以20uL/min流速注射至胺-偶合的hActRIIB-Fc、hActRIIA-Fc或卵泡抑素-288表面。結合訊號(RU)係在注射開始後150秒測量，及將此訊號減去負性對照參考物表面所測量的RU值，用以測定專一結合訊號。在各抗-活化 素A抗體之存在下，受體或拮抗劑表面上游離活化素A結合百分率，係以所觀察到的專一結合訊號除以在抗體存在下來自5nM活化素A之專一結合訊號之比率來計算。
如表21所示，試驗的7種本發明之抗-活化素A抗體中有6種以及比較子1和比較子3阻斷了卵泡抑素-288與活化素A之結合。1種本發明抗體H4H10423P並未防止卵泡抑素-288與活化素A結合。hActRIIB-Fc和hActRIIA-Fc二者在較高的濃度時阻斷了卵泡抑素-288與活化素A結合。
如表22所示，試驗的7種本發明之抗-活化素A抗體中有4種以及比較子1和比較子3阻斷了hActRIIA-Fc與活化素A之結合。3種本發明抗體H4H10442P2、H4H10446P2和H4H10423P，並未防止hActRIIA-Fc與活化素A結合。Both hActRIIB-Fc和hActRIIA-Fc二者係阻斷了hActRIIA-Fc與活化素A結合。
如表23所示，試驗的7種本發明之抗-活化素A抗體中有4種以及比較子1和比較子3阻斷了hActRIIB-Fc與活化素A之結合。2種本發明抗體H4H10442P2和H4H10446P2並未防止hActRIIB-Fc與活化素A結合。1種本發明抗體H4H10423P，在較高的抗體濃度時顯現部份阻斷hActRIIB-Fc與活化素A結合之能力。hActRIIB-Fc和hActRIIA-Fc二者阻斷了hActRIIB-Fc與活化素A結合。
實例8. H4H1657N2對肌肉量和運動表現之效用
抗-GDF8抗體H4H1657N2對於肌肉量和運度表現之效用係以老化的雄性C57BL/6小鼠(19個月大)來評估。
將小鼠隨機分配至一運動訓練組(其包含對跑步機跑步試驗之最佳表現)，及一不活動組。每週二次皮下注射10 mg/kg H4H1657N2之劑量共計21天(6次注射)。以二因子-ANOVA分析數據，接著以Tukey HSD試驗分析數據。肌肉重係使用正常化的四頭肌重來分析(亦即肌肉重係正常化至實驗開始時所測量的體重)。股四頭肌之結果係提供於表24中，為相較於同型對照抗體組之變化%。
相較於同型對照組之變化%。以平均值±SEM表示。
如表24所示，H4H1657N2治療使得股四頭肌之量顯著增加(就二組H4H1657N2，p<0.01顯著性優於同型對照組)。相較於同型對照抗體，可看到後肢肌肉群重量(TA、GA和股四頭肌在運動(分別為17.4%、12.5%、17.6%)和不活動(分別為14.1%、11.6%、15.7%)的老化小鼠中為增加的。在接受同型對照抗體之運動和不活動的老化小鼠中觀察到肌肉重些微增加，但並非統計上顯著的，其表示僅運動不會造成老化小鼠肌肉肥大(表24)。
亦於老化的雄性C57BL/6小鼠中檢測H4H1657N2治療對運動耐力之效用(表25)。
如以跑步機時間(50.2min對73.2min)和距離(0.93km對1.33km)所測量，相較於同型對照組，在運動的老化小鼠中，H4H1657N2 亦引起顯著的耐力增加(表25)。然而，相較於同型對照組，在不活動的小鼠中，H4H1657N2並未顯著地增加耐力。
如在肌肉重研究中，以跑步機跑步時間和距離所測量，僅在運動的小鼠中H4H1657N2引起顯著的耐力增加，而在不活動的小鼠中則無。這些結果顯示，當與運動訓練組合時，H4H1657N2增加身體表現結果。
實例9.在小鼠中H4H1657N2對骨骼肌肉量和等量收縮力之效用
H4H1657N2引發骨骼肌肥大之能力係於活體內以9週大的雄性C57BL/6小鼠進行評估。
H4H1657N2之重複的皮下給劑係以10或30mg/kg每週投予二次共計3週。21天的H4H1657N2治療，相較於接受以同等劑量給藥之同型對照組，分別產生4.7%(n.s.)和7.1%(n.s.)之體重增加。相較於同型對照組(10mg/kg & 30mg/kg)，個別的肌肉重之增加係如下：脛骨前(19.4%** & 20.6%**)，腓腸：(14.9%** & 25.3%***)和股四頭肌(17.7%* & 26.2%**)。(所有的統計係藉由單因子ANOVA以杜凱氏事後比較試驗(Tukey’s post hoc test)[*p<.05；**p<.01；***p<.001；n.s.=無統計上的差異])
脛骨前(TA)肌肉量之增加係伴隨體內等量收縮力之增加，其顯示維持肌肉功能和質量二者之能力。將之前以重複的皮下給劑H4H1657N2或同型對照組抗體(以10mg/kg每週投予二次共計3週，每組n=6)之小鼠麻醉並保持在異氟烷(Isoflurane)氣體下，同時置於恆定維持在25℃之含氧乳酸林格氏浴中，讓TA肌肉運動。將TA前端固定綁在沉入浴液中之支柱上，同時將末端綁在305C槓桿臂上(Cambridge Systems)。藉由輕微地伸展TA測定最佳長度，及然後檢測在最小電壓時由1Hz刺激所產生的力。重覆伸展和刺激TA肌肉，直到力下降及然後鬆弛至先前位置。然後逐漸增加一系列1HZ刺激之電壓，以達到最大的力輸出。一旦已決定最佳長度和電壓，將TA肌肉以漸增的頻率(40-100Hz)刺激400毫秒，用以測定最大強直性張力。在各強直性刺激間，給予TA肌肉2分鐘的休息期。
相較於同型對照組，H4H1657N2治療21天產生16.7%*(10mg/kg)和10.7%n.s(30mg/kg)之平均峰值強直性張力之增加(圖2A)。H4H1657N2治療對峰值強直性張力之整體藥物效用，在10mg/kg和30mg/kg 劑量時，與同型對照組具有統計上的差異性(10mg/kg劑量顯示於圖2B)。(圖2A：藉由單因子ANOVA以杜凱氏事後比較試驗作統計分析[* p<.05；n.s.=無統計上差異]。圖2B：藉由雙因子ANOVA和Sidak事後比較試驗作統計分析[p>0.0001].)
實例10. H4H1657N2改善後肢懸吊(HLS)-引起的萎縮之復原
在後肢懸吊(HLS)引發的萎縮之7天復原期期間，H4H1657N2對骨骼肌肉量之效用係以1歲大的C57BL/6雄性小鼠進行評估。
在第0天，將18隻小鼠以尾部懸吊，使得二隻後肢無法接觸到地面共計7天的期間。將小鼠圈養在特定的籠子中，可自由取得水和食物。同時，將另一組6隻小鼠留在一般的籠中並作為對照組(非-HLS對照組)。在第7天，將懸吊的小鼠取下並以HLS期間體重減輕的百分比隨機分配成3組(各組(n=6)。在第7天將非-HLS對照組和一HLS組(HLS組)安樂死並取肌肉重進行回應HLS之萎縮百分比的評估。讓二組剩餘的HLS組(各組n=6)於一般的籠中復原8天(亦即實驗的第7天至第15天)並於第7和10天以10mg/kg劑量的H4H1657N2或同型對照抗體皮下治療(亦即復原的0天和3天後)(分別為HLS+7Rec+H4H1657N2以及HLS+7rec+同型對照)。於第15天讓小鼠安樂死(亦即復原的8天後)並取肌肉重評估HLS-引發的萎縮後之復原百分比。
如圖3B中所示，相較於非-HLS對照組，7天的HLS造成脛骨前(TA)和腓腸(GA)(HLS組)顯著的質量流失(分別為-13.7%*和-14.8%*)。復原8天後，相較於非-HLS對照組，HLS+7rec+同型對照組保持TA和GA肌肉量流失(-6.3%n.s.和-7.5%n.s.)，而HLS+7Rec+H4H1657N2組，相較於非-HLS對照組，則顯現質量增加(4.7%n.s和5%n.s)。
當與二組復原組(亦即HLS+7Rec+H4H1657N2與HLS+7rec+同型對照)，H4H1657N2對TA和GA質量之效用與同型對照抗體中所看到的效用相比，並無統計上的差異。然而，在HLS+7rec+同型對照組的肌肉量與HLS組或非-HLS對照組相比並無統計上的差異時，相較於HLS組，HLS+7Rec+H4H1657N2組具有統計上較大的TA##和GA##量(所 有的統計係藉由單因子ANOVA以杜凱氏事後表較試驗[* p<0.05 vs.No HLS；## p<0.01 vs.HLS；n.s.=無統計上差異])
實例11.以抗-活化素A抗體和ActRIIB-Fc抑制第I型和第II型BMP受體活化
骨形態發生蛋白(BMP)係屬於TGF-β超家族並經由活化由第I和II型BMP受體所組成的細胞表上之受體複合物，涉及許多的生理過程調節。受體之活化導致SMAD蛋白之磷酸化以及配體-反應性基因之轉錄活化。
開發一生物分析用以偵測W-20-17細胞中(先前已顯示對BMP2具反應性之小鼠骨髓幹細胞株)，BMP訊號傳遞之調節作用。將細胞工程化以穩定地表現螢光素酶受體(亦即BMP-反應元素(BRE(2X)-螢光素酶-IRES-GFP))，並挑選高表現之GFP。所生成的穩定細胞株係稱為W-20-17/BRE-luc並於10% FBS,DMEM,Pen/Strcp和200μg/ml G418中培養。這些細胞係用於測量BMP活化及此活化被抗-活化素A抗體和ActRIIB-hFc(第II型活化素受體之胞外區與人類Fc區融合)所抑制。
四種抗-活化素A抗體和ActRIIB-hFc抑制BMP訊號傳遞之能力係使用W-20-17/BRE-luc細胞株來評估。就此生物分析，係將W-20-17/BRE-luc細胞以10,000個細胞/孔植入96-孔分吸盤中並於37℃和5% CO2下培養至隔夜。隔天，將BMP2、BMP4、BMP6、BMP9或BMP10以1：3連續稀釋並從100nM至0.002nM加到細胞中(包括用於劑量反應之無BMP對照組)。就抗-活化素A抗體或ActRIIB-hFc之BMP抑制作用，係將抗體或ActRIIB-hFc以1：3從1000nM連續稀釋至0.02nM(包括用於ActRIIB-hFc之無抗體、對照抗體或負性對照組(亦即對照蛋白)並如所示，連同100pM BMP2、100pM BMP4、10nM BMP6、800pM BMP9或4nM BMP10加到細胞中。於37℃和5% CO2中以Victor X(Perkin Elmer)培養5.5小時後，偵測螢光素酶活性並使用非線性迴歸(4-參數邏輯法)以Prism 5軟體(GraphPad)分析結果。
如下表26中所示，H4H10446P2和H4H10430P並未抑制任何受試的BMP，而其他受試的活化素A抗體(H4H10429和H4H10436P2) 及ActRIIB-hFc全部皆顯示對某些BMP之某些抑制作用。H4H10429P顯示BMP9和BMP10之抑制作用，其中IC50值分別為8.1nM和3.5nM，但不會抑制BMP2、BMP4和BMP6。H4H10436P2在最高抗體濃度時顯現微弱的BMP2和BMP4之抑制作用並以>100nM之IC50值抑制BMP10，但對BMP6和BMP9並未顯現任何抑制作用。ActRIIB-hFc顯示BMP9和BMP10之抑制作用，其中IC50值分別為2nM和1nM，但不會抑制BMP2、BMP4和BMP6。任何的對照分子(亦即同型對照抗體(對照mAb)和以hFc標定之不相關蛋白(對照蛋白))皆未觀察到抑制任何的BMP，而單獨的BMP2、BMP4、BMP6、BMP9或BMP10(亦即無抗體或hFc-標定蛋白)，分別以34pM、63pM、4.5nM、260pM和2.5nM之EC50值活化了W-20-17/BRE-luc細胞。
本發明不限於文中所述的特定實施例之範圍。實際上，除了該等文中所述之外，由前述說明及伴隨的圖示，本發明之各種修改對於熟習本項技術者將變得顯而易見。此等修改係希望落在所附的申請專利之範圍中。
<110> 美商再生元醫藥公司
<120> 抗活化素A之抗體及其用途
<130> 8525-WO
<140> 待讓渡
<141> 茲於此送交
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<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 228

Claims (36)

  1. 一種單離的抗體或其抗原結合片段，其在25℃表面電漿共振分析測量下，以低於約500nM之結合平衡常數(Ka)及低於約5pM之解離平衡常數(KD)專一與活化素A結合，其中該抗體或抗原結合片段包含：(a)具SEQ ID NO：162胺基酸序列之HCVR的互補決定區(CDRs)；及(b)具SEQ ID NO：146胺基酸序列之LCVR的CDRs。
  2. 如請求項1之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該單離的抗體或其抗原結合片段，在25℃表面電漿共振分析測量下，係以低於約4pM之KD專一與活化素A結合。
  3. 如請求項1之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該單離的抗體或其抗原結合片段，係以低於約500nM之結合平衡常數(Ka)專一與活化素A結合。
  4. 如請求項1之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係阻斷至少一種活化素A受體與活化素A之結合。
  5. 如請求項1之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係阻斷至少一種活化素A受體被活化素A活化，其中該活化素A受體選自由IIA型活化素受體(ActRIIA)、IIB型活化素受體(ActRIIB)及第I型活化素受體組成之群組。
  6. 如請求項5之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不會顯著地阻斷活化素A與第II型活化素受體結合。
  7. 如請求項4之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段，在25℃活體內受體/配體結合生物分析所測量下，係以低於約80pM之IC50值阻斷活化素A與活化素A受體結合。
  8. 如請求項7之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段，在25℃活體內受體/配體結合生物分析所測量下，係以低於約60pM之IC50值阻斷活化素A與活化素A受體結合。
  9. 如請求項1之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係抑制活化素A與選自由下列組成之群中的活化素A受體結合：IIA型活化素受體(ActRIIA)、IIB型活化素受體(ActRIIB)和第I型活化素受體。
  10. 如請求項1之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係抑制活化素A-媒介的SMAD複合物訊號傳遞之活化。
  11. 如請求項1之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係與包括由下列組成之群中選出的重鏈可變區(HCVR)/輕鏈可變區(LCVR)序列對之參考抗體競爭結合活化素A：SEQ ID NO：2/10、138/146及194/146。
  12. 如請求項1之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係如同包括由下列組成之群中選出的HCVR/LCVR序列對之參考抗體，結合至活化素A上的相同表位：SEQ ID NO：2/10、138/146及194/146。
  13. 一種專一結合活化素A之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係包括：(a)具有SEQ ID NO：162胺基酸序列之HCVR的互補決定區(CDR)；以及(b)具有SEQ ID NO：146胺基酸序列之LCVR的CDR。
  14. 如請求項13之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係包括SEQ ID NO：164-166-168-148-150-152的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3區。
  15. 一種專一結合活化素A之單離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係包括：(a)具有SEQ ID NO：162胺基酸序列之HCVR；以及(b)具有SEQ ID NO：146胺基酸序列之LCVR。
  16. 一種醫藥組成物，其係包括如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段，以及醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
  17. 一種如請求項16之醫藥組成物於製造增加患者肌肉量或強度之藥物的用途。
  18. 一種醫藥組成物，其係包括如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段、GDF8拮抗劑以及醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
  19. 如請求項18之醫藥組成物，其中GDF8拮抗劑係由下列組成之群中選出：GDF8-抑制融合蛋白、抗-GDF8抗體及抗-GDF8抗體之抗原結合片段。
  20. 如請求項17之醫藥組成物的用途，其中該組成物進一步包括GDF8拮抗劑，其中該GDF8拮抗劑為抗-GDF8抗體或其抗原結合片段。
  21. 如請求項20之醫藥組成物的用途，其中該GDF8拮抗劑為一抗-GDF8抗體或其抗原結合片段，其係包括包含SEQ ID NO：217之HCVR的重鏈互補決定區(HCDR)，及包含SEQ ID NO：221之LCVR的輕鏈互補決定區(LCDR)。
  22. 如請求項20之醫藥組成物的用途，其中該GDF8拮抗劑為一抗-GDF8抗體或其抗原結合片段，其係包括：a)含SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：220之三個HCDR，以及b)含SEQ ID NO：222、SEQ ID NO：223和SEQ ID NO：224之三個LCDR。
  23. 一種如請求項18之醫藥組成物於製造增加患者肌肉量或強度之藥物的用途。
  24. 一種醫藥組成物於製造增加患者肌肉量或強度之藥物的用途，該醫藥組成物包括含活化素A-專一結合區和GDF8-專一結合區之抗原結合分子，其中該活化素A-專一結合區係包括一HCVR和一LCVR，其中該HCVR包含：(a)具SEQ ID NO：162胺基酸序列之HCVR的CDRs；及該LCVR包含(b)具SEQ ID NO：146胺基酸序列之LCVR的CDRs。
  25. 如請求項24之醫藥組成物的用途，其中該GDF8-專一結合區係包括一HCVR和一LCVR。
  26. 如請求項25之醫藥組成物的用途法，其中該GDF8-專一結合區之HCVR係包括含SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：219和SEQ ID NO：220之三個重鏈互補決定區(HCDR)及其中該GDF8-專一結合區之LCVR係包括含SEQ ID NO：222、SEQ ID NO：223和SEQ ID NO：224之三個輕鏈互補決定區(LCDR)。
  27. 如請求項24之醫藥組成物的用途，其中該抗原結合分子為雙專一性抗體。
  28. 一種醫藥組成物於製造治療、預防及/或改善特徵為肌肉量或強度減低之疾病或病症之藥物的用途，該醫藥組成物包括活化素A-專一結合蛋白，其中該活化素A-專一結合蛋白係專一性結合活化素A之分離抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含：(a)具SEQ ID NO：162胺基酸序列之HCVR的互補決定區(CDRs)；及(b)具SEQ ID NO：146胺基酸序列之LCVR的CDRs。
  29. 一種醫藥組成物於製造治療、預防或改善特徵為肌肉量或強度減低之疾病或病症之藥物的用途，該醫藥組成物包括活化素A-專一結合蛋白和一GDF8-專一結合蛋白，其中該活化素A-專一結合蛋白係專一性結合活化素A之分離抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含：(a)具SEQ ID NO：162胺基酸序列之HCVR的互補決定區(CDRs)；及(b)具SEQ ID NO：146胺基酸序列之LCVR的CDRs。
  30. 如請求項29之醫藥組成物的用途，其中該特徵為肌肉量或強度減低之疾病或病症係由下列組成之群中選出：肌少症、惡質病、肌肉損傷、肌肉消瘦/萎縮、癌症、肥胖症、糖尿病、關節炎、多發性硬化症、肌肉失養症、肌萎縮側索硬化症、帕金森氏症、骨質疏鬆症、骨關節炎、骨質缺乏症和代謝症候群。
  31. 如請求項30之醫藥組成物的用途，其中該惡質病為特發性惡質病或為續發於另外症狀之惡質病。
  32. 如請求項31之醫藥組成物的用途，其中該症狀為癌症、慢性腎衰竭或慢性阻塞性肺疾病。
  33. 如請求項30之醫藥組成物的用途，其中肌肉消瘦/萎縮係由下列組成之群中選出之症狀所造成或與其相關：廢用、固定不動、臥床休養、受傷、醫療、手術介入及必要的呼吸器輔助。
  34. 如請求項33之醫藥組成物的用途，其中手術介入係由下列組成之群中選出：髖部骨折、髖關節置換和膝關節置換。
  35. 如請求項30之醫藥組成物的用途，其中該代謝症候群係包括由下列組成之群中選出的疾病或病症：糖尿病、肥胖症、營養失調、器官萎縮、慢性阻塞性肺疾病和惡質病。
  36. 一種醫藥組成物於製造治療、預防或改善特徵為肌肉量或強度減低之疾病或病症之藥物的用途，該醫藥組成物包括含活化素A-專一結合區和GDF8-專一結合區之抗原結合分子，其中該活化素A專一結合區包含HCVR及LCVR，其中HCVR包含：(a)具SEQ ID NO：162胺基酸序列之HCVR的互補決定區(CDRs)；及LCVR包含：(b)具SEQ ID NO：146胺基酸序列之LCVR的CDRs。
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