KR20160030581A - 항-액티빈 a 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 액티빈 A에 결합하는 항체 및 그 이용 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 항체는 고친화도로 액티빈 A에 결합하는 완전 인간 항체이다. 본 발명의 항체는 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 및 장애, 예컨대 사르코페니아, 악액질, 근육 부상, 근육 소모/위축, 암, 섬유증, 및 체중 감소의 치료에 유용하다. 본 발명의 항체는 또한 GDF8 결합 단백질과 조합되어 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 및 장애의 치료에 유용하다. 본 발명의 항체는 또한 액티빈 A에 의해 유도되고, 촉진되고, 악화되고, 및/또는 심해지는 장애 및 질환, 예컨대 신장 섬유증의 예방, 치료, 또는 완화에 유용하다.

Description

항-액티빈 A 항체 및 그의 용도{ANTI-ACTIVIN A ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 액티빈 A에 대해 특이적인 항체, 및 그의 항원-결합 단편, 그리고 미오스타틴 억제제와 함께 액티빈 A에 대해 특이적인 항체를 이용하는 방법을 포함하는 그의 이용 방법에 관한 것이다.
액티빈은 전환 성장 인자-베타(TGF-β) 수퍼패밀리에 속하며, 세포 증식, 분화, 및 아폽토시스에 광범위한 생물학적 효과를 발휘한다. 액티빈은 인히빈βA, 인히빈βB, 인히빈βC 및 인히빈βE의 동종- 또는 이종-이량체이며, 그 상이한 조합이 액티빈 단백질 군의 다양한 멤버를 생성한다. 예를 들어, 액티빈 A는 인히빈βA의 동종이량체이며 액티빈 B는 인히빈βB의 동종이량체인 반면, 액티빈 AB는 인히빈βA 및 인히빈βB의 이종이량체이고 액티빈 AC는 인히빈βA 및 인히빈βC의 이종이량체이다(Tsuchida, K. et al., Cell Commun Signal 7:15(2009)).
액티빈 A는 액티빈 II형 수용체(각각 ActRIIA 및 ActRIIB로도 공지된 IIA형 및 IIB형)로 공지된 세포 표면 상의 수용체 복합체에 결합하여 이를 활성화한다. 이들 수용체의 활성화는 액티빈 I형 수용체(예로, Alk4 또는 7)의 인산화로 이어지며, 이는 다시 SMAD 2 및 3 단백질의 인산화, SMAD 복합체의 형성(SMAD4와), 및 SMAD 복합체의 세포 핵으로의 전위로 이어지고, 여기서 SMAD2 및 SMAD3은 다양한 유전자의 전사를 조절하는 기능을 한다(Sozzani, S. and Musso, T., Blood 117(19):5013-5015(2011)).
GDF8(미오스타틴), 액티빈 B, 액티빈 AB, 인히빈 A, 인히빈 B, GDF3, GDF11, Nodal, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, 및 BMP10을 포함하는 수많은 다른 리간드가 ActRIIB에 결합하고 이를 활성화한다. ActRIIB와 그 리간드의 상호작용 차단은 유익한 생리적 효과로 이어질 수 있다. 예를 들어, GDF8은 골격 근육의 발달 및 유지에 중추적 역할을 담당하며, 근육 질량의 음성적 조절자로 작용한다(McPherron AC et al.(1997). Nature 387(6628):83-90). ActRIIB-Fc(즉, IgG Fc 도메인의 융합에 의해 안정화된, IIB형 수용체, ActRIIB의 세포외 부분)의 투여는 골격 근육 질량의 유의미한 증가로 이어지고 마우스에서 근육 중량 및 근육 강도 측정치를 개선한다(Lee SJ, et al.(2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102(50):18117-18122). ActRIIB-Fc의 유효성은 Mstn(미오스타틴) 부재(null) 마우스에서 약화되지만 제거되지 않아서, 미오스타틴에 부가하여 다른 ActRIIB 리간드(들)가 근육 성장의 음성적 조절자로 작용할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 임상적 유익을 제공할 수 있는 ActRIIB 신호전달의 추가 억제제에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 인히빈 βA 및 인히빈 βA를 함유하는 이량체, 예로 액티빈 A, 액티빈 AB 등에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 특히, 액티빈 A-매개성 신호전달을 억제하고, 액티빈 A-매개성 신호전달의 억제를 통해 유익한 임상 결과를 생성하기 위해, 예로 액티빈 A 활성 및/또는 신호전달에 의해 유도되거나 이와 관련된 질환 및 장애의 치료를 위해 유용하다. 본 발명의 항체는 또한 ActRIIA 및 ActRIIB 수용체의 다른 리간드의 억제제, 예컨대 GDF8 억제제와 함께 사용하기 위한 유용성을 갖는다.
본 발명의 항체는 전장일 수도 있고(예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체) 또는 항원-결합부(예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편)만을 포함할 수도 있으며, 기능성에 영향을 미치기 위해, 예로 잔여 효과기 기능을 제거하기 위해 개질될 수 있다(Reddy et al., J Immunol 164:1925-1933(2000)).
본 발명은 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정되는 약 500 nM 미만의 결합 회합 평형 상수(binding association equilibrium constant)(Ka) 및 약 5 pM 미만의 해리 평형 상수(dissociation equilibrium constant)(KD)로 액티빈 A에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 단리된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정되는 약 4 pM 미만의 KD로 액티빈 A에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 단리된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 약 500 nM 미만의 결합 회합 평형 상수(Ka)로 액티빈 A에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 액티빈 A에 특이적으로 결합하고 액티빈 A에 대한 적어도 하나의 액티빈 A 수용체의 결합을 차단하는 단리된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 단리된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 25℃에서 생체내 수용체/리간드 결합 바이오에세이(bioassay)에서 측정되는 약 80 pM 미만의 IC50 값으로 액티빈 A 수용체에 대한 액티빈 A 결합을 차단한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 단리된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 25℃에서 생체내 수용체/리간드 결합 바이오에세이에서 측정되는 약 60 pM 미만의 IC50 값으로 액티빈 A 수용체에 대한 액티빈 A 결합을 차단한다. 본 발명은 또한 액티빈 A에 특이적으로 결합하고 액티빈 A에 의한 적어도 하나의 액티빈 A 수용체의 활성화를 차단하는 단리된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 단리된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 액티빈 II형 수용체에 대한 액티빈 A의 결합을 유의미하게 차단하지 않는다. 본 발명의 일부 구현예에서, 단리된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 액티빈 IIA형 수용체(ActRIIA), 액티빈 IIB형 수용체(ActRIIB), 및 액티빈 I형 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 액티빈 A 수용체에 대한 액티빈 A의 결합을 억제한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 단리된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 SMAD 복합체 신호전달의 액티빈 A-매개성 활성화를 억제한다.
본 발명은 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 106, 114, 122, 130, 138, 154, 162, 170, 178, 186, 194, 및 202로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 146, 및 210으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/90, 106/90, 114/90, 122/90, 130/90, 138/146, 154/146, 162/146, 170/146, 178/146, 186/146, 194/146, 및 202/210으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR(HCVR/LCVR) 서열 쌍(pair)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 및 208로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR3(HCDR3) 도메인; 및 서열번호 16, 32, 48, 64, 80, 96, 152, 및 216으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR3(LCDR3) 도메인을 포함하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항체의 항원-결합부는 서열번호 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/96, 112/96, 120/96, 128/96, 136/96, 144/152, 160/152, 168/152, 176/152, 184/152, 192/152, 200/152, 및 208/216으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 또한 서열번호 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 108, 116, 124, 132, 140, 156, 164, 172, 180, 188, 196, 및 204로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR1(HCDR1) 도메인; 서열번호 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 158, 166, 174, 182, 190, 198, 및 206으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR2(HCDR2) 도메인; 서열번호 12, 28, 44, 60, 76, 92, 148, 및 212로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR1(LCDR1) 도메인; 및 서열번호 14, 30, 46, 62, 78, 94, 150, 및 214로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR2(LCDR2) 도메인을 추가로 포함하는 항체 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명의 특정한 비제한적이고 예시적인 항체 및 항원-결합 단편은 각각 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 포함한다: 서열번호 4-6-8-12-14-16(예로 H4H10423P); 20-22-24-28-30-32(예로 H4H10424P); 36-38-40-44-46-48(예로 H4H10426P); 52-54-56-60-62-64(예로 H4H10429P); 68-70-72-76-78-80(예로 H4H10430P); 84-86-88-92-94-96(예로 H4H10432P2; 100-102-104-92-94-96(예로 H4H10433P2); 108-110-112-92-94-96(예로 H4H10436P2); 116-118-120-92-94-96(예로 H4H10437P2); 124-126-128-92-94-96(예로 H4H10438P2); 132-134-136-92-94-96(예로 H4H10440P2); 140-142-144-148-150-152(예로 H4H10442P2); 156-158-160-148-150-152(H4H10445P2); 164-166-168-148-150-152(H4H10446P2); 172-174-176-148-150-152(H4H10447P2); 180-182-184-148-150-152(H4H10448P2); 188-190-192-148-150-152(H4H10452P2); 196-198-200-148-150-152(H4H10468P2); 및 204-206-208-212-214-216(H2aM10965N).
관련 구현예에서, 본 발명에는 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 포함되며, 여기서 항체 또는 단편은 하기 서열번호로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역(HCVR/LCVR) 서열 내에 함유된 중쇄 및 경쇄 CDR 도메인을 포함한다: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/90, 106/90, 114/90, 122/90, 130/90, 138/146, 154/146, 162/146, 170/146, 178/146, 186/146, 194/146, 및 202/210. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내에서 CDR을 확인하기 위한 방법 및 기법은 본 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 개시된 명시된 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내에서 CDR을 확인하기 위해 이용될 수 있다. CDR의 경계를 확인하기 위해 이용될 수 있는 예시적인 관례에는, 예로 Kabat 정의, Chothia 정의, 및 AbM 정의가 포함된다. 일반적인 용어에서, Kabat 정의는 서열 가변성에 기반하며, Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치에 기반하고, AbM 정의는 Kabat 및 Chothia 접근법 간의 절충이다. 예로, [Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991); Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-948(1997); 및 Martin et al., PNAS(USA) 86:9268-9272(1989)]를 참고하라. 공개 데이터베이스도 항체 내에서 CDR 서열을 확인하기 위해 이용 가능하다.
본 발명은 또한 항-액티빈 A 항체 또는 그의 일부를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 표 1에 기재된 임의의 HCVR 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 기재된 임의의 HCVR 핵산 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 여기에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 기재된 임의의 LCVR 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 기재된 임의의 LCVR 핵산 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 여기에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 기재된 임의의 HCDR1 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 기재된 임의의 HCDR1 핵산 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 여기에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 기재된 임의의 HCDR2 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 기재된 임의의 HCDR2 핵산 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 여기에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 기재된 임의의 HCDR3 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 기재된 임의의 HCDR3 핵산 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 여기에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 기재된 임의의 LCDR1 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 기재된 임의의 LCDR1 핵산 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 여기에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 기재된 임의의 LCDR1 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 기재된 임의의 LCDR2 핵산 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 여기에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 기재된 임의의 LCDR3 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 기재된 임의의 LCDR3 핵산 서열로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 여기에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 HCVR을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 HCVR은 3 개 CDR의 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3)을 포함하고, HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 기재된 임의의 예시적인 항-액티빈 A 항체에 의해 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 LCVR을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 LCVR은 3 개 CDR의 세트(즉, LCDR1-LCDR2-LCDR3)을 포함하고, LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 기재된 임의의 예시적인 항-액티빈 A 항체에 의해 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 HCVR 및 LCVR을 둘 다 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 HCVR은 표 1에 기재된 임의의 HCVR 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 표 1에 기재된 임의의 LCVR 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 기재된 임의의 HCVR 핵산 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 여기에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열, 및 표 2에 기재된 임의의 LCVR 핵산 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 여기에 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 본 발명의 상기 측면에 따른 특정 구현예에서, 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 인코딩하며, 여기서 HCVR 및 LCVR은 둘 다 표 1에 기재된 동일한 항-액티빈 A 항체로부터 유도된다.
본 발명은 또한 항-액티빈 A 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 본 발명에는 상기 언급된 임의의 핵산 분자, 즉 표 1에 나타낸 임의의 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 포함된다. 또한 본 발명의 범위 내에는 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포뿐만 아니라 항체 또는 항체 단편의 생산을 허용하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하고 이렇게 생산된 항체 및 항체 단편을 회수함으로써 항체 또는 그의 일부를 생산하는 방법이 포함된다.
본 발명에는 개질된 탄수화물 함량을 갖는 항-액티빈 A 항체가 포함된다. 일부 적용에서, 바람직하지 못한 글리코실화 부위를 제거하기 위한 개질이 유용할 수 있다. 일부 적용에서, 글리코실화 패턴을 변경하는 개질, 예로 올리고당 사슬 상에 존재하는 푸코스 모이어티가 없도록 항체를 개질하여, 예를 들어 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC) 기능을 증가시키는 것이 유용할 수 있다(Shield et al. J Biol Chem 277:26733(2002) 참고). 다른 적용에서, 보체 의존적 세포독성(CDC)을 개질하기 위해 갈락토실화의 개질이 수행될 수 있다. 일부 적용에서, 항체는 효과기 기능을 최소화하기 위해 개질된 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 예를 들어, 항체는 추가로 글리코실화되거나 시알릴화된 항체를 수득하기 위해 개질될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 액티빈 A 및 약학적으로 허용가능한 담체에 특이적으로 결합하는 재조합 인간 항체 또는 그의 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 항-액티빈 A 항체 및 제2 치료제의 조합인 조성물을 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 제2 치료제는 항-액티빈 A 항체와 유리하게 조합되는 임의의 제제이다. 항-액티빈 A 항체와 유리하게 조합될 수 있는 예시적 제제에는 비제한적으로 액티빈 A 활성을 억제하는 다른 제제(다른 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 펩타이드 억제제, 소분자 길항제 등을 포함) 및/또는 액티빈 A에 직접 결합하지는 않지만, 그럼에도 불구하고 액티빈 A-매개성 신호전달을 방해하거나, 차단하거나, 약화시키는 제제가 포함된다. 하나의 구현예에서, 2차 치료제는 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체의 또 다른 리간드(예로, GDF8, 액티빈 B, 액티빈 AB, 인히빈 A, 인히빈 B, GDF3, GDF11, Nodal, BMP2, BMP4, 및/또는 BMP7)의 활성을 억제하고, 방해하고, 차단하고, 및/또는 약화시킨다. 하나의 구현예에서, 2차 치료제는 항-GDF8 길항제(예로, 인간 항-GDF8 항체 또는 그의 항원-결합 단편)이다. 본 발명의 항-액티빈 A 항체와 함께 사용하기 위한 예시적인 항-GDF8 제제에는 인간 항-GDF8 항체(예로, US 2011-0293630 A1에 나타낸 임의의 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열을 포함하는 항-GDF8 항체(예로, 서열번호 217을 포함하는 HVCR의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)(예로, 서열번호 218, 219, 및 220에 각각 나타낸 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열) 및 서열번호 221을 포함하는 LVCR의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)(예로, 서열번호 222, 223, 및 224에 나타낸 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열)을 갖는 항-GDF8 항체인 H4H1657N2)가 포함된다. 본 발명의 항-액티빈 A 항체가 관여되는 추가적인 조합 치료법 및 공동-제형은 본원에서 다른 곳에 개시된다.
본 발명의 추가 측면에서, 액티빈 A-특이적 결합 도메인 및 GDF8-특이적 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자가 제공된다. 본 발명의 상기 측면의 하나의 구현예에서, 항원-결합 분자는 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 GDF8에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항-액티빈 A 항체 또는 본 발명의 항체의 항원-결합부를 이용하여 액티빈 A 활성을 억제하기 위한 치료 방법을 제공하며, 여기서 치료 방법은 항체 또는 본 발명의 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 치료 유효량의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 치료받는 장애는 액티빈 A 활성 또는 신호전달의 제거, 억제 또는 감소에 의해 개선되거나, 완화되거나, 억제되거나, 예방되는 임의의 질환 또는 상태이다. 본 발명의 항-액티빈 A 항체 또는 항체 단편은 액티빈 A 및 액티빈 II형 수용체(예로, 액티빈 IIA형 수용체 및/또는 액티빈 IIB형 수용체) 간; 액티빈 A 및 액티빈 I형 수용체 간; 액티빈 A 및 II형 및 I형 수용체 모두 간 상호작용을 차단하거나; 또는 다르게는 액티빈 A의 신호전달 활성을 억제하는 기능을 할 수 있다.
본 발명에는 또한 환자에서 액티빈 A 활성에 관련되거나 이에 의해 유도되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서 항-액티빈 A 항체 또는 본 발명의 항체의 항원 결합부의 용도가 포함된다. 본 발명은 또한 대상체에 액티빈 A 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하여 대상체에서 근육 질량 또는 강도를 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 대상체에 액티빈 A-특이적 결합 단백질 및 GDF8-특이적 결합 단백질을 투여하여, 또는 대상체에 액티빈 A-특이적 결합 도메인 및 GDF8-특이적 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자의 투여에 의해 대상체에서 근육 질량 또는 강도를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에는 또한 이를 필요로 하는 대상체에 액티빈 A-특이적 결합 단백질(예로, 항-액티빈 A 항체)의 투여에 의한, 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 완화 방법이 포함된다. 관련 측면에서, 본 발명의 방법에는 이를 필요로 하는 대상체에 액티빈 A-특이적 결합 단백질 및 GDF8-특이적 결합 단백질(예로, 항-액티빈 A 항체 및 항 GDF8 항체)을 투여하여 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 완화하는 것이 포함된다. 본 발명의 방법에는 또한 이를 필요로 하는 대상체에 액티빈 A-특이적 결합 도메인 및 GDF8-특이적 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 투여하여 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 완화하는 것이 포함된다. 본 발명의 방법을 이용해서 치료, 예방 및/또는 완화될 수 있는 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 또는 장애에는 사르코페니아, 악액질(예로, 특발성 악액질 또는 또 다른 상태(예로, 암, 만성 신부전, 또는 만성 폐색성 폐 질환)에 이차적인 악액질), 근육 부상, 근육 소모 및/또는 위축(예로, 오용, 부동화, 침상 안정, 부상, 의학적 치료, 수술적 개입(예로, 엉덩이 골절, 엉덩이 대체술 및 무릎 대체술) 및 기계적 환기의 필요성에 의해 유도되거나 이와 연관됨), 암, 비만, 당뇨병, 관절염, 다발성 경화증, 근디스트로피, 근위축 측삭 경화증, 파킨슨 질환, 골다공증, 골관절염, 골감소증, 및 대사 증후군(예로, 하나 이상의 당뇨병, 비만, 영양 장애, 기관 위축, 만성 폐색성 폐 질환, 및 식욕부진)이 포함된다.
본 발명에는 또한 이를 필요로 하는 대상체에 액티빈 A에 특이적인 결합 단백질(즉, 인히빈 βA 이량체), 예로 항-액티빈 A 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여에 의한 인히빈 βA를 함유하는 분자(예로, 인히빈 βA를 함유하는 이량체, 예로, 액티빈 A, 액티빈 AB 등)의 활성에 의해 유도되거나, 촉진되거나, 악화되거나, 심해지는 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 완화 방법이 포함된다. 본 발명의 하나의 측면에서, 본 발명의 방법에는 이를 필요로 하는 대상체에 항-액티빈 A 항체의 투여에 의한 신장 섬유증의 치료, 예방 및/또는 완화 방법이 포함된다. 본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 방법에는 이를 필요로 하는 대상체에 항-액티빈 A 항체의 투여에 의한, 만성 신장 질환(예로, 고혈압, 당뇨병, 사구체신염, 유전 질환(예컨대 다낭성 신장 질환), 신장 기형, 자가면역 질환(예로, 루푸스) 또는 폐색(예로, 신장 결석, 종양, 비대 전립선) 또는 반복된 요로 감염 결과)에 의해 유도되는 신장 섬유증의 치료, 예방, 및/또는 완화 방법이 포함된다. 본 발명의 추가적인 측면에는 이를 필요로 하는 대상체에 항-액티빈 A 항체의 투여에 의한 패혈증, 만성 심질환, 만성 폐색성 폐 질환, 양성 또는 악성 크롬친화세포종, 자궁 섬유양/다중 평활근종, 자간전증, 켈로이드, 비대 흉터, 또는 폐동맥 고혈압의 치료, 예방, 및/또는 완화 방법이 포함된다. 본 발명의 추가 측면에는 이를 필요로 하는 대상체에 항-액티빈 A 항체의 투여에 의한 액티빈 A 활성에 의해 유도되거나, 촉진되거나, 악화되거나, 심해지는 악액질의 치료, 예방, 및/또는 완화 방법이 포함된다. 본 발명의 추가 측면에는 이를 필요로 하는 대상체에 항-액티빈 A 항체의 투여에 의한 액티빈 A 활성에 의해 유도되거나, 촉진되거나, 악화되거나, 심해지는 체중 감소의 치료, 예방, 및/또는 완화 방법이 포함된다.
다른 구현예는 이어지는 상세한 설명의 검토로부터 자명해질 것이다.
도 1은 제1 항-액티빈 A 항체("항체 샘플")를 항-인간 FC-코팅 센서 칩에 적용한 뒤 액티빈 A에 사전 결합된 제2 항-액티빈 A 항체(1 μM) 용액 중에 침지시키는 항체 교차-경쟁 분석 결과를 나타내는 매트릭스이다. 시험된 각각의 항체 조합에 대한 결합 반응(수치 값 0.22 내지 1.84)이 도시된다. 검은색 유형으로 흰색 상자에 나타낸 결합 반응은 액티빈 A의 결합에 대한 경쟁을 나타내지 않아, 구별되는 결합 영역을 제시한다.
도 2: 패널 A는 이소형 대조군 항체 대비 평균 피크 강직력에 대한 21 일 항-GDF8 항체 처리(H4H1657N2, 10 mg/kg 또는 30 mg/kg) 효과를 나타낸다. 데이터는 원-웨이 변동량 분석(ANOVA)에 이어 Tukey 테스트를 이용해서 분석하였다. *이소형 대조군 대비 p < 0.05 유의성(n = 6, 페어링되지 않은 Student t 테스트); n.s. = 이소형 30 mg/kg 대비 통계적으로 유의미하지 않음. 패널 B는 일정 범위의 주파수(40 내지 100 Hz)에 걸쳐 전기 전류로 자극된 경우, 3 주 동안 H4H1657N2-처리 마우스(10 mg/kg) 대 이소형 대조군 항체로 처리된 마우스에서의 앞 정강근(TA) 근육 피크 강직력의 증가를 나타낸다. 데이터는 평균 피크력 ± SEM으로 표시된다.
도 3: 패널 A는 뒷다리 현수-유도된 근육 위축으로부터의 회복기 동안 H4H1657N2의 효과를 평가하기 위한 실험 설계를 나타낸다. 패널 B는 뒷다리 현수 후 7 일의 회복-후(HLS + 7Rec) H4H1657N2-처리 및 이소형 대조군 항체-처리 마우스 대 뒷다리 현수 후 7 일 회복기가 없는 마우스(HLS) 및 대조군 마우스(비-HLS 대조군)에 대한 TA 및 장딴지근(GA) 근육 중량의 변화 백분율을 나타낸다. 값은 대조군 비-HLS 값 대비 평균 변화 백분율 ± SEM으로 표시된다. 데이터는 원-웨이 변동량 분석(ANOVA)에 이어 Tukey 테스트를 이용해서 분석하였다. * = 비-HLS 군 대비 p < 0.05 유의성. # = HLS 군 대비 p < 0.05 유의성.
도 4: 패널 A는 액티빈 A를 과발현하는 마우스 체중에 대한 항-액티빈 A 항체 H4H10446P2(대 이소형 대조군)의 투여 효과를 나타낸다. 데이터는 투-웨이 변동량 분석(반복 측정 ANOVA + Boneferroni 다중 비교 테스트)에 이어 Tukey 테스트를 이용해서 분석하였다. * = 이소형 대조군 대비 p < 0.05. # = 액티빈 A + 이소형 대조군 대비 p < 0.05. 패널 B는 액티빈 A를 과발현하는 마우스에서 앞 정강근(TA) 및 장딴지근(GA) 근육 중량에 대한 항-액티빈 A 항체 H4H10446P2(대 이소형 대조군)의 효과를 나타낸다. 데이터는 원-웨이 변동량 분석(ANOVA)에 이어 Tukey 테스트를 이용해서 분석하였다. * = 벡터 + 이소형 대조군 대비 p < 0.05. # = 액티빈 A + 이소형 대조군 대비 p < 0.05.
본 발명을 기재하기 전에, 기재된 특정 방법 및 실험 조건은 변할 수 있으므로, 본 발명이 이러한 방법 및 조건으로 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로 본원에서 이용된 용어가 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이지 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은 특정한 언급된 수치 값에 대해 사용되는 경우, 그 값이 언급된 값으로부터 1% 이하로 변할 수 있음을 의미한다. 예를 들어 본원에서 사용되는 표현 "약 100"에는 99 및 101과 그 사이의 모든 값(예로, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)이 포함된다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있지만, 이제 바람직한 방법 및 물질을 기재한다.
항원-특이적 결합 단백질
본 발명은 항원-특이적 결합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 액티빈 A-특이적 결합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에서 사용되는 표현 "항원-특이적 결합 단백질"은 특정 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 도메인을 포함하는 단백질을 의미한다. 항원-특이적 결합 단백질의 예시적인 범주에는 항체, 항체의 항원-결합부, 특정 항원과 특이적으로 상호작용하는 펩타이드(예로, 펩티바디), 특정 항원과 특이적으로 상호작용하는 수용체 분자, 및 특정 항원에 특이적으로 결합하는 수용체의 리간드-결합부를 포함하는 단백질이 포함된다.
본 발명에는 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 결합 단백질, 즉 "액티빈 A-특이적 결합 단백질"이 포함된다. 액티빈은 베타 서브유닛을 포함하는 동종- 및 이종-이량체성 분자, 즉 인히빈 βA, 인히빈 βB, 인히빈 βC, 및/또는 인히빈 βE이다. βA 서브유닛은 서열번호 226의 아미노산 서열을 가지며, βB 서브유닛은 서열번호 228의 아미노산 서열을 갖는다. 액티빈 A는 2 개의 βA 서브유닛의 동종이량체이고; 액티빈 B는 2 개의 βB 서브유닛의 동종이량체이고; 액티빈 AB는 하나의 βA 서브유닛 및 하나의 βB 서브유닛의 이종이량체이고; 액티빈 AC는 하나의 βA 서브유닛 및 하나의 βC 서브유닛의 이종이량체이다. 액티빈 A-특이적 결합 단백질은 βA 서브유닛에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 결합 단백질일 수 있다. βA 서브유닛이 액티빈 A, 액티빈 AB, 및 액티빈 AC 분자에서 발견되므로, "액티빈 A-특이적 결합 단백질"은 액티빈 A 뿐만 아니라 액티빈 AB 및 액티빈 AC에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 결합 단백질일 수 있다(βA 서브유닛과의 그 상호작용으로 인해). 따라서 본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 액티빈 A-특이적 결합 단백질은 액티빈 A; 또는 액티빈 A 및 액티빈 AB; 또는 액티빈 A 및 액티빈 AC; 또는 액티빈 A, 액티빈 AB 및 액티빈 AC에 특이적으로 결합하지만, 다른 ActRIIB 리간드, 예컨대 액티빈 B, GDF3, GDF8, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, BMP10, GDF11, Nodal 등에는 결합하지 않는다. 따라서 본 발명의 하나의 구현예에서, 액티빈 A-특이적 결합 단백질은 액티빈 A에 특이적으로 결합하지만 액티빈 B 또는 액티빈 C에 유의미하게 결합하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 액티빈 A-특이적 결합 단백질은 또한 액티빈 B에 결합할 수 있다(βB 서브유닛, 즉 인히빈βB와의 교차-반응으로 인해). 또 다른 구현예에서, 액티빈 A-특이적 결합 단백질은 액티빈 A에 특이적으로 결합하지만 ActRIIB의 임의의 다른 리간드에는 결합하지 않는 결합 단백질이다. 또 다른 구현예에서, 액티빈 A-특이적 결합 단백질은 결합 단백질이고 액티빈 A에 특이적으로 결합하며, 임의의 뼈 형태형성 단백질(BMP)(예로, BMP2, BMP4, BMP6, BMP9, BMP10)에는 결합하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 액티빈 A-특이적 결합 단백질은 액티빈 A에 특이적으로 결합하지만 전환 성장 인자 베타(TGFβ) 수퍼패밀리의 임의의 다른 멤버에 결합하지 않는 결합 단백질이다.
본 발명에는 또한 GDF8에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 결합 단백질, 즉 "GDF8-특이적 결합 단백질"이 포함된다. 용어 "GDF8"("성장 및 분화 인자-8" 및 "미오스타틴"으로도 불림)은 서열번호 225의 아미노산 서열을 갖는 단백질(성숙 단백질)을 의미한다. 본 발명에 따르면, GDF8-특이적 결합 단백질은 GDF8에 특이적으로 결합하지만 다른 ActRIIB 리간드, 예컨대 GDF3, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, BMP10, GDF11, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, Nodal 등에는 결합하지 않는다.
본 발명의 맥락에서, 분자, 예컨대 ActRIIB 수용체의 리간드-결합부를 포함하는 ActRIIB-Fc(예로, "ACE-031")는 이러한 분자가 GDF8, 액티빈 A 및 액티빈 AB에 더하여 여러 리간드에 결합하므로, "액티빈 A-특이적 결합 단백질" 또는 "GDF8-특이적 결합 단백질"로 간주되지 않는다.
본원에서 단백질, 폴리펩타이드 및 단백질 단편에 대한 모든 참조는 명시적으로 비-인간 종으로부터인 것으로 명시되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩타이드 또는 단백질 단편의 인간 버전을 나타내려는 것이다.
2 개의 상이한 항원-특이적 결합 도메인을 갖는 항원-결합 분자
본 발명에는 또한 2 개의 상이한 항원-특이적 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자가 포함된다. 특히, 본 발명에는 액티빈 A-특이적 결합 도메인 및 GDF8-특이적 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "항원-특이적 결합 도메인"에는 하기를 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드가 포함된다: (i) 항체 분자의 항원-결합 단편, (ii) 특정 항원과 특이적으로 상호작용하는 펩타이드(예로, 펩티바디), 및/또는 (iii) 특정 항원에 특이적으로 결합하는 수용체의 리간드-결합부. 예를 들어, 본 발명에는 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 제1 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역(HCVR/LCVR) 쌍을 포함하는 하나의 팔 및 GDF8에 특이적으로 결합하는 제2 HCVR/LCVR 쌍을 포함하는 또 다른 팔을 갖는 이중특이적 항체가 포함된다.
특이적 결합
본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는" 등은 항원-특이적 결합 단백질, 또는 항원-특이적 결합 도메인이 일반 시험 조건 하에서 500 pM 이하의 해리 상수(KD)를 특징으로 하는 특정 항원과의 복합체를 형성하며, 다른 관련되지 않은 항원에 결합하지 않음을 의미한다. "관련되지 않은 항원"은 서로 95% 미만의 아미노산 동일성을 갖는 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 두 분자가 서로 특이적으로 결합하는지 여부의 결정 방법은 본 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라즈몬 공명 등이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 사용되는 항원-특이적 결합 단백질 또는 항원-특이적 결합 도메인에는 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정되는 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 200 pM 미만, 약 100 pM 미만, 약 90 pM 미만, 약 80 pM 미만, 약 70 pM 미만, 약 60 pM 미만, 약 50 pM 미만, 약 40 pM 미만, 약 30 pM 미만, 약 20 pM 미만, 약 10 pM 미만, 약 5 pM 미만, 약 4 pM 미만, 약 2 pM 미만, 약 1 pM 미만, 약 0.5 pM 미만, 약 0.2 pM 미만, 약 0.1 pM 미만, 또는 약 0.05 pM 미만의 KD로 특정 항원(예로, 액티빈 A 및/또는 AB, 또는 GDF8) 또는 그의 일부에 결합하는 분자가 포함된다.
본원에서 사용되는 항원-특이적 결합 단백질 또는 항원-특이적 결합 도메인은 단백질 또는 결합 도메인이 표면 플라즈몬 공명 분석에서 25℃에서 분자에 대한 결합에 대해 시험되는 경우, 50.0 nM 초과의 KD를 나타내거나 이러한 분석 또는 그의 동등물에서 임의의 결합을 나타내지 못하는 경우, 명시된 분자에 대해 "결합하지 않는다"(예로, "GDF11에 결합하지 않는다", "BMP9에 결합하지 않는다", "BMP10에 결합하지 않는다" 등).
본원에서 사용되는 용어 "표면 플라즈몬 공명"은 바이오센서 매트릭스 내에서, 예를 들어 BIAcore™ 시스템(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 이용하여 단백질 농도 변화의 검출에 의해 실시간 상호작용 분석을 허용하는 광학 현상을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "KD"는 특정 단백질-단백질 상호작용(예로, 항체-항원 상호작용)의 평형 해리 상수를 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 개시된 KD 값은 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 결정된 KD 값을 나타낸다.
항체 및 항체의 항원-결합 단편
상기 나타낸 바와 같이, 항원-특이적 결합 단백질은 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 또한, 2 개의 상이한 항원-특이적 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자의 경우, 항원-특이적 결합 도메인 중 하나 또는 둘 다는 항체의 항원-결합 단편을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본원에서 사용되는, "액티빈에 결합하는 항체" 또는 "항-액티빈 A 항체"에는 액티빈 A 단백질의 가용성 단편에 결합하고 액티빈 βA 서브유닛-함유 액티빈 이종이량체에도 결합할 수 있는 항체, 및 그의 항원-결합 단편이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 특정 항원(예로, 액티빈 A)에 특이적으로 결합하거나 이와 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"에는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 2 개의 중쇄(H) 및 2 개의 경쇄(L)의 4 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 면역글로불린 분자뿐만 아니라 그의 다량체(예로, IgM)가 포함된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 명명된, 보다 보존되는 영역이 분산된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된 고가변성 영역으로 추가 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 이루어지며, 아미노-말단부터 카복시-말단까지 하기 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 상이한 구현예에서, 항-액티빈 A 항체(또는 그의 항원-결합부)의 FR은 인간 생식계열 서열과 동일할 수도 있고, 또는 자연적으로 또는 인공적으로 개질될 수도 있다. 아미노산 공통 서열은 2 개 이상의 CDR의 차례 차례의 분석에 기반하여 정의될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"에는 또한 전체 항체 분자의 항원-결합 단편이 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 항체의 "항원-결합부", 항체의 "항원-결합 단편" 등에는 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 천연 생성, 효소적으로 수득 가능한, 합성, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질이 포함된다. 항체의 항원-결합 단편은, 예로 항체 가변 도메인 및 선택적으로 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현이 관여되는 임의의 적합한 표준 기법, 예컨대 단백분해 소화 또는 재조합 유전 조작 기법을 이용하여 전체 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예로 상업적 공급원, DNA 라이브러리(예로, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 쉽게 이용 가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는, 예를 들어 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 배치로 배열하기 위해, 또는 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산을 개질하거나, 부가하거나, 결실시키는 등을 위해, 화학적으로 또는 분자 생물학 기법을 이용하여 서열분석되고 조작될 수 있다.
항원-결합 단편의 비제한적 예에는 하기가 포함된다: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일쇄 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 고가변 영역(예로, 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 예컨대 CDR3 펩타이드), 또는 구속된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 모사하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위. 다른 조작된 분자, 예컨대 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라성 항체, CDR-그래프팅된 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예로, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 소형 모듈형 면역약제(SMIPs), 및 상어 가변 IgNAR 도메인도 본원에서 사용되는 표현 "항원-결합 단편" 내에 포괄된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성일 수 있으며, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 틀 내인 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 연관된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 서로에 대해 임의의 적합한 배열로 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체성일 수 있고 VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체성 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
특정 구현예에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 확인될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인 예시적인 배치에는 하기가 포함된다: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL. 임의의 상술된 예시적인 배치를 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 배치에서, 가변 및 불변 도메인은 서로에 대해 직접 연결될 수도 있고, 또는 전체 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수도 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 간 가요성 또는 반-가요성 연결을 생성하는 적어도 2 개(예로, 5, 10, 15, 20, 40, 60 개 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 서로 및/또는 하나 이상의 단량체성 VH 또는 VL 도메인과 비공유 회합하는(예로, 디설파이드 결합(들)에 의해) 상술된 임의의 가변 및 불변 도메인 배치의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다.
전장 항체 분자에서와 같이, 항원-결합 단편은 단일특이적 또는 다중특이적(예로, 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 2 개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 각각의 가변 도메인은 별도 항원 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 예시적인 이중특이적 항체 포맷을 포함하는 임의의 다중특이적 항체 포맷은 본 기술분야에서 이용 가능한 일상적 기법을 이용해서 본 발명의 항체의 항원-결합 단편의 맥락에서 사용하기 위해 채택될 수 있다.
본 발명의 항체는 보체-의존적 세포독성(CDC) 또는 항체-의존적 세포-매개성 세포독성(ADCC)을 통해 기능할 수 있다. "보체-의존적 세포독성"(CDC)은 보체의 존재 하에 본 발명의 항체에 의한 항원-발현 세포의 용해를 나타낸다. "항체-의존적 세포-매개성 세포독성"(ADCC)은 Fc 수용체(FcRs)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예로, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식구)가 표적 세포 상에서 결합된 항체를 인식하고, 이에 따라 표적 항체의 용해로 이어지는 세포-매개성 반응을 나타낸다. CDC 및 ADCC는 본 기술분야에 잘 알려져 있고 이용 가능한 분석을 이용해서 측정될 수 있다(예로, U.S. 특허 번호 5,500,362 및 5,821,337, 및 Clynes et al., PNAS USA 95:652-656(1998) 참고). 항체의 불변 영역은 항체가 보체를 고정하고 세포-의존적 세포독성을 매개하는 능력에 있어서 중요하다. 따라서, 항체의 이소형은 항체가 세포독성을 매개하는 것이 바람직한지 여부에 기반하여 선택될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 항-액티빈 A 항체는 인간 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에서 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하려는 것이다. 본 발명의 인간 항체에는, 예를 들어 CDR, 특히 CDR3에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열(예로, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이화에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 그러나 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식계열에서 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그래프팅된 항체를 포함하려는 것이 아니다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 재조합 인간 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리되는 모든 인간 항체, 예컨대 숙주 세포 내에 전달감염된 재조합적 발현 벡터를 이용해서 발현된 항체(아래에 추가로 기재됨), 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체(아래에 추가로 기재됨), 인간 면역글로불린에 대해 트랜스제닉인 동물(예로, 마우스)로부터 단리된 항체(예로, Taylor et al., Nucl Acids Res 20:6287-6295(1992) 참고) 또는 다른 DNA 서열에 대한 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱이 관여되는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 항체를 포함하려는 것이다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에서 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 특정 구현예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이화(또는 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 이용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이화)를 거치며, 이에 따른 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 이에 관련되지만, 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 천연 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
인간 항체는 힌지 이종성과 연관되는 두 형태로 존재할 수 있다. 하나의 형태에서, 면역글로불린 분자는 이량체가 사슬 간 중쇄 디설파이드 결합에 의해 함께 유지되는 대략 150-160 kDa의 안정한 4 개 사슬 구축물을 포함한다. 제2 형태에서, 이량체는 사슬 간 디설파이드 결합을 통해 연결되지 않으며, 약 75-80 kDa의 분자가 공유 결합된 경쇄 및 중쇄(절반-항체)로 이루어져 형성된다. 이들 형태는 친화도 정제 후에도, 매우 분리하기 어려웠다.
다양한 온전한 IgG 이소형인 제2 형태의 출현 빈도는 비제한적으로 항체의 힌지 영역 이소형과 연관된 구조적 차이에 기인하지만, 이에 제한되지 않는다. 인간 IgG4 힌지의 힌지 영역에서의 단일 아미노산 치환은 제2 형태의 출현을 인간 IgG1 힌지를 이용해서 전형적으로 관찰되는 수준으로 상당히 감소시킬 수 있다(Angal et al. Molecular Immunology 30:105 1993)). 본 발명은, 예를 들어 생산에서 원하는 항체 형태의 수율을 개선하기 위해 바람직할 수 있는 힌지, CH2 또는 CH3 영역 내 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 포괄한다.
본 발명의 항체는 단리된 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 "단리된 항체"는 그 천연 환경의 적어도 하나의 성분으로부터 확인되고 분리되고/되거나 회수된 항체를 의미한다. 예를 들어, 항체가 천연 존재하거나 천연 생산되는 유기체로부터, 또는 조직 또는 세포로부터 적어도 하나의 성분에서 분리되거나 제거된 항체가 본 발명의 목적을 위한 "단리된 항체"이다. 단리된 항체에는 또한 재조합 세포 내에서의 원 위치 항체가 포함된다. 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 항체이다. 특정 구현예에 따르면, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 발명에는 항-액티빈 A 항체의 중화 및/또는 차단이 포함된다. 본원에서 사용되는 "중화" 또는 "차단" 항체는 액티빈 A에 대한 그 결합이 하기와 같은 항체를 나타내려는 것이다: (i) 액티빈 A 및 액티빈 A 수용체(예로, 액티빈 IIA형 수용체, 액티빈 IIB형 수용체, 액티빈 I형 수용체 등) 간 상호작용을 방해함; (ii) 액티빈-액티빈 수용체 복합체의 형성을 방해함; 및/또는 (iii) 액티빈 A의 적어도 하나의 생물학적 기능의 억제를 야기함. 액티빈 A 중화 또는 차단 항체에 의해 유도된 억제는 이것이 적절한 분석을 이용해서 검출 가능한 한 완전할 필요는 없다. 액티빈 A 억제의 검출을 위한 예시적인 분석은 본원에서 작용 실시예에 기재되어 있다.
본원에 개시된 항-액티빈 A 항체는 항체가 유도된 대응하는 생식계열 서열에 비해 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는, 예를 들어 본원에 개시된 아미노산 서열을 공개 항체 서열 데이터베이스로부터 이용 가능한 생식계열 서열과 비교하여 쉽게 확인될 수 있다. 본 발명에는 본원에 개시된 임의의 아미노산 서열로부터 유도되는 항체, 및 그의 항원-결합 단편이 포함되며, 여기서 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유도된 생식계열 서열의 대응하는 잔기(들)로 또는 또 다른 인간 생식계열 서열의 대응하는 잔기(들)로, 또는 대응하는 생식계열 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이된다(이러한 서열 변화는 본원에서 "생식계열 돌연변이"로 총칭됨). 본 기술분야의 기술자는 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 시작하여 하나 이상의 개별 생식계열 돌연변이 또는 그의 조합을 포함하는 여러 항체 및 항원-결합 단편을 쉽게 생산할 수 있다. 특정 구현예에서, VH 및/또는 VL 도메인 내의 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기는 항체가 유도된 원래 생식계열 서열에서 확인된 잔기로 역 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 특정 잔기만, 예로 FR1의 최초 8 개 아미노산 내에서 또는 FR4의 최종 8 개 아미노산 내에서 확인된 돌연변이된 잔기만, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 확인된 돌연변이된 잔기만 원래 생식계열 서열로 역 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들)는 상이한 생식계열 서열의 대응하는 잔기(들)(즉, 항체가 원래 유도된 생식계열 서열과 상이한 생식계열 서열)로 돌연변이된다. 또한, 본 발명의 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에 2 개 이상의 생식계열 돌연변이의 임의 조합을 함유할 수 있다, 예로 특정한 개별 잔기가 특정 생식계열 서열의 대응하는 잔기로 돌연변이되는 반면 원래 생식계열 서열과 상이한 특정한 다른 잔기는 유지되거나 상이한 생식계열 서열의 대응하는 잔기로 돌연변이된다. 일단 수득되면, 하나 이상의 생식계열 돌연변이를 함유하는 항체 및 항원-결합 단편은 하나 이상의 바람직한 특성, 예컨대 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선되거나 향상된 길항성 또는 작동성 생물학적 특성(가능한 경우), 감소된 면역원성 등에 대해 쉽게 시험될 수 있다. 상기 일반적 방식으로 수득된 항체 및 항원-결합 단편이 본 발명에 포괄된다.
본 발명에는 또한 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 항-액티빈 A 항체가 포함된다. 예를 들어, 본 발명에는, 예로 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 대비 10 개 이하, 8 개 이하, 6 개 이하, 4 개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-액티빈 A 항체가 포함된다.
용어 "에피토프"는 파라토프로 공지된 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 나타낸다. 단일 항원이 하나를 초과하는 에피토프를 가질 수 있다. 따라서 상이한 항체가 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 입체형태 또는 선형일 수 있다. 입체형태 에피토프는 선형 폴리펩타이드 사슬의 상이한 절편으로부터의 공간적으로 나란히 놓인 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성된 것이다. 어떤 경우, 에피토프에는 항원 상의 당 모이어티, 포스포릴 기 또는 설포닐 기가 포함될 수 있다.
용어 "실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은 핵산 또는 그의 단편을 나타내는 경우, 또 다른 핵산(또는 그 상보쇄)과 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실을 포함하여 최적으로 정렬되었을 때, 아래에서 논의되는 임의의 널리 공지된 서열 동일성 알고리즘, 예컨대 FASTA, BLAST 또는 Gap에 의해 측정되는 뉴클레오타이드 염기의 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%에 뉴클레오타이드 서열 동일성이 존재함을 시사한다. 참조 핵산 분자에 대해 실질적 동일성을 갖는 핵산 분자는, 어떤 경우 참조 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩한다.
폴리펩타이드에 적용되는 용어 "실질적 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은, 예컨대 기본 갭 가중치를 이용해서 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬된 경우, 두 펩타이드 서열이 적어도 95% 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예로, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2 개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 서열 동일성 백분율 또는 유사성 정도는 치환의 보존적 성질에 대해 보정하기 위해 상향 조절될 수 있다. 이러한 조정 수단은 본 기술분야 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 예로, [Pearson, W.R., Methods Mol Biol 24: 307-331(1994)]를 참고하라. 유사한 화학적 특성의 측쇄를 갖는 아미노산 기의 예에는 하기가 포함된다: (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드 함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황 함유 측쇄 시스테인 및 메티오닌. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 하기이다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민. 대안적으로, 보존적 대체는 [Gonnet et al., Science 256: 1443-1445(1992)]에 개시된 PAM250 로그-개연성 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "온전하게 보존적"인 대체는 PAM250-개연성 매트릭스에서 음성이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
서열 동일성으로도 불리는 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 이용해서 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 다양한 치환, 결실 및 다른 개질에 배정된 유사성 척도를 이용해서 유사한 서열을 매칭한다. 예를 들면, GCG 소프트웨어는 가깝게 관련된 폴리펩타이드, 예컨대 상이한 종의 유기체로부터의 상동성 폴리펩타이드 간 또는 야생형 단백질 및 그의 뮤테인 간 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위한 기본 파라미터와 함께 이용될 수 있는 프로그램, 예컨대 Gap 및 Bestfit을 함유한다. 예로, GCG Version 6.1을 참고하라. 폴리펩타이드 서열은 또한 GCG Version 6.1 내 프로그램인 기본 또는 권장 파라미터를 이용하는 FASTA를 이용해서 비교될 수 있다. FASTA(예로, FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 서열 및 검색 서열 간 최적 오버랩 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다(예로, Pearson, W.R., Methods Mol Biol 132: 185-219(2000) 참고). 본 발명의 서열을 상이한 유기체로부터의 다수 서열을 함유하는 데이터베이스와 비교하는 경우 또 다른 바람직한 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 기본 파라미터를 이용하는 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예로, [Altschul et al., J Mol Biol 215:403-410(1990) 및 Altschul et al., Nucleic Acids Res 25:3389-402(1997)]을 참고하라.
항체의 생물학적 특징
본 발명에는 고친화도로 액티빈 A에 결합하는 항-액티빈 A 항체 및 그의 항원-결합 단편이 포함된다. 예를 들어, 본 발명에는 표면 플라즈몬 공명에 의해, 예로 본원에서 실시예 3에 정의된 분석 포맷을 이용해서 측정되는 약 30 nM 미만의 KD로 액티빈 A에 결합하는(예로, 25℃ 또는 37℃에서) 항체 및 항체의 항원-결합 단편이 포함된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 표면 플라즈몬 공명에 의해, 예로 본원에서 실시예 3에 정의된 분석 포맷 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용해서 측정되는 약 25 nM 미만, 약 20 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 2 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 500 pM 미만, 약 250 pM 미만, 약 240 pM 미만, 약 230 pM 미만, 약 220 pM 미만, 약 210 pM 미만, 약 200 pM 미만, 약 190 pM 미만, 약 180 pM 미만, 약 170 pM 미만, 약 160 pM 미만, 약 150 pM 미만, 약 140 pM 미만, 약 130 pM 미만, 약 120 pM 미만, 약 110 pM 미만, 약 100 pM 미만, 약 95 pM 미만, 약 90 pM 미만, 약 85 pM 미만, 약 80 pM 미만, 약 75 pM 미만, 약 70 pM 미만, 약 65 pM 미만, 약 60 pM 미만, 약 55 pM 미만, 약 50 pM 미만, 약 45 pM 미만, 약 40 pM 미만, 약 35 pM 미만, 약 30 pM 미만, 약 25 pM 미만, 약 20 pM 미만, 약 15 pM 미만, 약 10 pM 미만, 약 9 pM 미만, 약 8 pM 미만, 약 7 pM 미만, 약 6 pM 미만, 약 5 pM 미만, 약 4 pM 미만, 또는 약 3 pM 미만의 KD로 액티빈 A에 결합한다.
본 발명에는 또한 액티빈 A-매개성 세포성 신호전달을 억제하는 항-액티빈 A 항체 및 그의 항원-결합 단편이 포함된다. 예를 들어, 본 발명에는 세포-기반 차단 바이오에세이에서, 예로 본원에서 실시예 5에 정의된 분석 포맷, 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용해서 측정되는, 약 4 nM 미만의 IC50 값으로 액티빈 A의 액티빈 I형 또는 II 수용체에 대한 결합을 통한 SMAD 복합체 신호 전달 경로의 활성화를 억제하는 항-액티빈 A 항체가 포함된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 세포-기반 차단 바이오에세이에서, 예로 본원에서 실시예 5에 정의된 분석 포맷, 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용해서 측정되는, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 500 pM 미만, 약 250 pM 미만, 약 240 pM 미만, 약 230 pM 미만, 약 220 pM 미만, 약 210 pM 미만, 약 200 pM 미만, 약 190 pM 미만, 약 180 pM 미만, 약 170 pM 미만, 약 160 pM 미만, 약 150 pM 미만, 약 140 pM 미만, 약 130 pM 미만, 약 120 pM 미만, 약 110 pM 미만, 약 100 pM 미만, 약 95 pM 미만, 약 90 pM 미만, 약 85 pM 미만, 약 80 pM 미만, 약 75 pM 미만, 약 70 pM 미만, 약 65 pM 미만, 약 60 pM 미만, 약 55 pM 미만, 약 50 pM 미만, 약 49 pM 미만, 약 48 pM 미만, 약 47 pM 미만, 약 46 pM 미만, 약 45 pM 미만, 약 44 pM 미만, 약 43 pM 미만, 약 42 pM 미만, 약 41 pM 미만, 약 40 pM 미만, 또는 약 39 pM 미만의 IC50 값으로 액티빈 A의 액티빈 I형 또는 II 수용체에 대한 결합을 통한 SMAD 복합체 신호 전달 경로의 활성화를 억제한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 세포-기반 차단 바이오에세이에서, 예로 본원에서 실시예 5에 정의된 분석 포맷, 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용해서 측정되는, 약 50 nM 미만, 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 IC50 값으로 액티빈 B의 액티빈 I형 또는 II 수용체에 대한 결합을 방해하여 액티빈 B의 신호전달 활성화를 억제한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 세포-기반 차단 바이오에세이에서, 예로 본원에서 실시예 5에 정의된 분석 포맷, 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용해서 측정되는, 약 500 pM 미만, 약 450 pM 미만, 약 440 pM 미만, 약 430 pM 미만, 약 420 pM 미만, 약 410 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 390 pM 미만, 약 380 pM 미만, 약 370 pM 미만, 약 360 pM 미만, 약 350 pM 미만, 약 340 pM 미만, 약 320 pM 미만, 약 310 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 290 pM 미만, 약 280 pM 미만, 약 270 pM 미만, 약 260 pM 미만, 약 250 pM 미만, 약 240 pM 미만, 약 230 pM 미만, 약 220 pM 미만, 약 210 pM 미만, 약 200 pM 미만, 약 190 pM 미만, 약 180 pM 미만, 약 170 pM 미만, 약 160 pM 미만, 약 150 pM 미만, 또는 약 140 pM 미만의 IC50 값으로 액티빈 AB의 액티빈 I형 또는 II 수용체에 대한 결합을 통한 SMAD 복합체 신호 전달의 활성화를 억제한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 세포-기반 차단 바이오에세이에서, 예로 본원에서 실시예 5에 정의된 분석 포맷, 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용해서 측정되는, 약 1 nM 미만, 약 900 pM 미만, 약 800 pM 미만, 약 750 pM 미만, 약 700 pM 미만, 약 650 pM 미만, 약 600 pM 미만, 또는 약 580 pM 미만의 IC50 값으로 액티빈 AC의 액티빈 I형 또는 II 수용체에 대한 결합을 통한 SMAD 복합체 신호 전달의 활성화를 억제한다.
본 발명의 항체는 하나 이상의 상기 언급된 생물학적 특징, 또는 그의 임의 조합을 보유할 수 있다. 본 발명의 항체의 다른 생물학적 특징은 본원에서 작용 실시예를 포함하는 본 개시의 검토로부터 본 기술분야의 기술자에게 자명할 것이다.
Fc 변이체를 포함하는 항- 액티빈 A 항체
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 예로 중성 pH에 비해 산성 pH에서 FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 향상시키거나 소멸시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-액티빈 A 항체가 제공된다. 예를 들어, 본 발명에는 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에 돌연변이를 포함하는 항-액티빈 A 항체가 포함되며, 여기서 돌연변이(들)는 산성 환경에서(예로, pH가 약 5.5 내지 약 6.0 범위인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는 동물에게 투여되는 경우, 항체의 혈청 반감기 증가를 일으킬 수 있다. 이러한 Fc 개질의 비제한적 예에는, 예로 위치 250(예로, E 또는 Q); 250 및 428(예로, L 또는 F); 252(예로, L/Y/F/W 또는 T), 254(예로, S 또는 T), 및 256(예로, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 개질; 또는 위치 428 및/또는 433(예로, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예로, A, W, H, F 또는 Y[N434A, N434W, N434H, N434F 또는 N434Y])에서의 개질; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 개질; 또는 위치 307 또는 308(예로, 308F, V308F), 및 434에서의 개질이 포함된다. 하나의 구현예에서, 개질은 428L(예로, M428L) 및 434S(예로, N434S) 개질; 428L, 259I(예로, V259I), 및 308F(예로, V308F) 개질; 433K(예로, H433K) 및 434(예로, 434Y) 개질; 252, 254, 및 256(예로, 252Y, 254T, 및 256E) 개질; 250Q 및 428L 개질(예로, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 개질(예로, 308F 또는 308P)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 개질은 265A(예로, D265A) 및/또는 297A(예로, N297A) 개질을 포함한다.
예를 들어, 본 발명에는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이 쌍 또는 군을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-액티빈 A 항체가 포함된다: 250Q 및 248L(예로, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E(예로, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예로, M428L 및 N434S); 257I 및 311I(예로, P257I 및 Q311I); 257I 및 434H(예로, P257I 및 N434H); 376V 및 434H(예로, D376V 및 N434H); 307A, 380A 및 434A(예로, T307A, E380A 및 N434A); 및 433K 및 434F(예로, H433K 및 N434F). 본원에 개시된 항체 가변 도메인 내의 상기 Fc 도메인 돌연변이, 및 다른 돌연변이의 모든 가능한 조합이 본 발명의 범위 내에 고려된다.
본 발명에는 또한 키메라성 중쇄 불변(CH) 영역을 포함하는 항-액티빈 A 항체가 포함되며, 여기서 키메라성 CH 영역은 하나를 초과하는 면역글로불린 이소형의 CH 영역에서 유도된 절편을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자에서 유도된 CH3 도메인의 일부 또는 전부와 조합된 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자에서 유도된 CH2 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 키메라성 CH 영역을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 키메라성 힌지 영역을 갖는 키메라성 CH 영역을 포함한다. 예를 들면, 키메라성 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역에서 유도된 "하부 힌지" 서열(EU 넘버링에 따른 위치 228 내지 236의 아미노산 잔기)과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역에서 유도된 "상부 힌지" 아미노산 서열(EU 넘버링에 따른 위치 216 내지 227의 아미노산 잔기)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 키메라성 힌지 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 상부 힌지에서 유도된 아미노산 잔기 및 인간 IgG2 하부 힌지에서 유도된 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 키메라성 CH 영역을 포함하는 항체는 항체의 치료적 또는 약동학적 특성에 불리하기 영향을 미치지 않고 개질된 Fc 효과기 기능을 나타낸다(예로, U.S. 가출원 번호 61/759,578, 2013. 2. 1. 출원 참고).
에피토프 맵핑 및 관련 기술
본 발명에는 액티빈 A 내에서(예로, 액티빈 II형 수용체 결합 부위 내에서) 확인되는 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 항-액티빈 A 항체가 포함된다. 항체가 결합하는 에피토프는 액티빈 βA 서브유닛 내에 위치하는 3 개 이상(예로, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 이상) 아미노산의 단일 인접 서열로 구성될 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 액티빈 A 이량체 내에 위치하는 복수의 비-인접 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 구성될 수 있다.
항체가 폴리펩타이드 또는 단백질 내에서 "하나 이상의 아미노산과 상호작용하는지" 여부를 결정하기 위해 본 기술분야의 기술자에게 공지된 다양한 기법이 이용될 수 있다. 예시적인 기법에는, 예로 일상적인 교차-차단 분석, 예컨대 [Antibodies, Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)]에 기재된 분석, 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석(Reineke, Methods Mol Biol 248:443-463(2004)), 및 펩타이드 절단 분석이 포함된다. 또한, 예컨대 항원의 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 화학적 개질 방법이 채용될 수 있다(Tomer, Protein Science 9:487-496(2000)). 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내의 아미노산을 확인하기 위해 이용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분광측정에 의해 검출된 수소/중수소 교환이다. 일반적인 용어에서, 수소/중수소 교환 방법에는 관심 단백질의 중수소-표지화에 이어 중수소-표지된 단백질에 대한 항체의 결합이 관여된다. 다음으로, 단백질/항체 복합체가 물로 전달되어 항체에 의해 보호된 잔기(중수소-표지된 채 유지됨)를 제외한 모든 잔기에서 수소-중수소 교환이 일어날 수 있도록 한다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테아제 절단 및 질량 분광측정 분석을 거쳐서 항체가 상호작용하는 특정 아미노산에 대응하는 중수소-표지된 잔기가 드러난다. 예로 [Ehring, Analytical Biochemistry 267(2):252-259(1999); Engen and Smith, Anal. Chem. 73:256A-265A(2001)]을 참고하라.
본 발명에는 본원에서 기재된 임의의 특이적인 예시적인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-액티빈 A 항체가 추가로 포함된다(예로, H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P2, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2, H2aM10965N 등). 마찬가지로, 본 발명에는 또한 본원에서 기재된 임의의 특이적인 예시적인 항체와 액티빈 A에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항-액티빈 A 항체가 포함된다(예로, H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P2, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2, H2aM10965N 등). 예를 들어, 본 발명에는 본원에서 실시예 4에 정의된 "Bin 1"의 하나 이상의 항체와 액티빈 A에 대한 결합에 대해 교차-경쟁하는 항-액티빈 A 항체가 포함된다(예로, H4H10423P, H4H10446P2, H4H10468P2 및 H4H10442P2). 본 발명에는 또한 본원에서 실시예 4에 정의된 "Bin 2"의 하나 이상의 항체와 액티빈 A에 대한 결합에 대해 교차-경쟁하는 항-액티빈 A 항체가 포함된다(예로, H4H10429, H4H1430P, H4H10432P2, H4H10436P2, 및 H4H10440P2).
본 기술분야에 공지되고 본원에서 예시된 일상적 방법을 이용해서 항체가 참조 항-액티빈 A 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 이것과 결합에 대해 경쟁하는지를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 발명의 참조 항-액티빈 A 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 참조 항체가 액티빈 A(또는 βA 서브유닛-함유 이종이량체)과 결합하도록 둘 수 있다. 다음으로, 시험 항체가 액티빈 A에 결합하는 능력이 평가된다. 시험 항체가 참조 항-액티빈 A 항체와의 포화 결합 후 액티빈 A에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체는 참조 항-액티빈 A 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 결론지을 수 있다. 반면, 시험 항체가 참조 항-액티빈 A 항체와의 포화 결합 후 액티빈 A에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 본 발명의 참조 항-액티빈 A 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 이어서 관찰된 시험 항체의 결합 부재가 실제로 참조 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합에 기인하는지 또는 입체 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합 부재에 관여되는지를 확인하기 위해 추가적인 일상적 실험(예로, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)이 수행될 수 있다. 상기 종류의 실험은 본 기술분야에서 이용 가능한 ELISA, RIA, Biacore, 유세포 측정 또는 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 분석을 이용해서 수행될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 예로 하나의 항체의 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100-배 과량이 경쟁적 결합 분석에서 측정되는 다른 항체의 결합을 적어도 50% 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99% 억제하는 경우, 두 항체는 동일한(또는 중복되는) 에피토프에 결합한다(예로, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495-1502(1990) 참고). 대안적으로, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 두 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 하위세트만 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 두 항체는 "중복되는 에피토프"를 갖는 것으로 간주된다.
항체가 참조 항-액티빈 A 항체와 결합에 대해 경쟁하는지(또는 결합에 대해 교차-경쟁하는지)를 결정하기 위해, 상술된 결합 방법론이 2 방향으로 수행된다: 제1 방향에서는 참조 항체가 포화 조건 하에 액티빈 A 단백질(또는 βA 서브유닛-함유 이종이량체)에 결합하도록 둔 뒤 시험 항체의 액티빈 A 분자에 대한 결합을 평가한다. 제2 방향에서는 시험 항체가 포화 조건 하에 액티빈 A에 결합하도록 둔 뒤 참조 항체의 액티빈 A에 대한 결합을 평가한다. 두 방향 모두에서, 제1(포화) 항체만 액티빈 A에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체 및 참조 항체는 액티빈 A에 대한 결합에 대해 경쟁하는 것으로 결론짓는다(예로, 시험 액티빈 A 항체가 센서 팁 상에서 포획된 후 액티빈 A와 사전 결합된 참조 액티빈 A 항체를 함유하는 용액 중에 침지되는 본원에서 실시예 4에 기재된 분석 포맷 참고). 본 기술분야의 기술자에 의해 이해될 바와 같이, 참조 항체와의 결합에 대해 경쟁하는 항체는 반드시 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않을 수는 있지만, 중복되거나 인접하는 에피토프의 결합에 의해 참조 항체의 결합을 구조적으로 차단할 수 있다.
본 발명의 항-액티빈 A 항체는 액티빈 II형 수용체에 대한 결합 부위 내에 또는 근처에 있는 액티빈 A 상 에피토프에 결합하고, 액티빈 A 및 액티빈 II형 수용체 간 상호작용을 직접적으로 차단하고, 액티빈 A 및 액티빈 I형 수용체 간 상호작용을 간접적으로 차단할 수 있다. 본 발명의 항-액티빈 A 항체는 액티빈 I형 수용체에 대한 결합 부위 내에 또는 근처에 있는 액티빈 A 상의 에피토프에 결합하고, 액티빈 A 및 액티빈 I형 수용체 간 상호작용을 직접적으로 차단할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 액티빈 I형 수용체 결합 부위에서 또는 그 근처에서 액티빈 A에 결합하는 본 발명의 항-액티빈 A 항체는 액티빈 A 및 액티빈 A II형 수용체 간 상호작용을 차단하지 않는다.
인간 항체의 제조
완전 인간 모노클로날 항체를 포함하는 모노클로날 항체의 생성 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 이러한 공지된 방법이 인간 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 제조하기 위해 본 발명의 맥락에서 이용될 수 있다.
예를 들어, VELOCIMMUNE™ 기술 또는 완전 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 임의의 다른 공지된 방법을 이용해서, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 인간 액티빈 A에 대한 고친화도 키메라성 항체가 처음에 단리된다. 아래 실험 섹션에서와 같이, 항체는 친화도, 선택성, 에피토프 등을 포함하는 바람직한 특징에 대해 특징분석되고 선택된다. 필요한 경우, 마우스 불변 영역이 원하는 인간 불변 영역, 예를 들어 야생형 또는 개질된 IgG1 또는 IgG4로 대체되어 완전 인간 항-액티빈 A 항체를 생성한다. 선택된 불변 영역은 특정 용도에 따라 변할 수 있지만, 고친화도 항원-결합 및 표적 특이성 특징이 가변 영역에 존재한다. 어떤 경우, 완전 인간 항-액티빈 A 항체는 항원-양성 B 세포로부터 직접 단리된다.
생물학적 동등물
본 발명의 항-액티빈 A 항체 및 항체 단편은 기재된 항체로부터 변하지만 인간 액티빈 A에 대한 결합력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포괄한다. 이러한 변이체 항체 및 항체 단편은 모계 서열과 비교된 경우, 하나 이상의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 기재된 항체와 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 본 발명의 항-액티빈 A 항체-인코딩 DNA 서열은 개시된 서열과 비교된 경우, 하나 이상의 뉴클레오타이드 부가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 본 발명의 항-액티빈 A 항체 또는 항체 단편에 대해 본질적으로 생물학적 동등물인 항-액티빈 A 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 서열을 포괄한다. 이러한 변이체 아미노산 및 DNA 서열의 예는 상기에서 논의된다.
예를 들어 단일 용량이건 다중 용량이건 유사한 실험 조건 하에 동일한 몰 용량으로 투여되는 경우, 두 항원-결합 단백질, 또는 항체의 흡수 속도 및 범위가 유의차를 나타내지 않는 약학적 동등물이거나 약학적 대체물인 경우, 이들은 생물학적 동등물로 간주된다. 일부 항체는 이들이 이들의 흡수 속도에서가 아니라 흡수 범위에서 동등한 경우, 그러나 이러한 흡수 속도에서의 차이가 의도적이고 표지에 반영되고, 예로 만성 사용에 대한 유효 신체 약물 농도의 획득에 필수적이 아니며, 연구된 특정 완제 의약품에 대해 의학적으로 유의미하지 않은 것으로 간주되므로 생물학적 동등물로 간주될 수 있는 경우, 동등물 또는 약학적 대체물로 간주될 것이다.
하나의 구현예에서, 2 개의 항원-결합 단백질의 안전성, 순도 및 역가에서 임상적으로 의미있는 차이가 없는 경우, 이들은 생물학적 동등물이다.
하나의 구현예에서, 스위칭이 없는 연속 치료법에 비해 면역원성에서의 임상적으로 유의미한 변화 또는 소멸된 유효성을 포함하는 유해 효과의 위험의 증가가 예상되지 않고 환자가 참조 제품 및 생물학적 제품 간에 1 회 이상 스위칭될 수 있는 경우, 2 개의 항원-결합 단백질은 생물학적 동등물이다.
하나의 구현예에서, 2 개의 항원-결합 단백질이 기전이 알려져 있는 범위까지, 사용 조건 또는 조건들에 대한 일반 작용 기전 또는 기전들에 의해 모두 작용하는 경우, 이들은 생물학적 동등물이다.
생물학적 동등성은 생체내 및 시험관내 방법에 의해 나타날 수 있다. 생물학적 동등성 척도에는, 예로 하기가 포함된다: (a) 항체 또는 그 대사물질의 농도가 시간의 함수로 혈액, 혈장, 혈청 또는 다른 생물학적 유체 중에서 측정되는 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체내 시험; (b) 인간 생체내 생체이용률 데이터와 연관되었고 이를 합리적으로 예측하는 시험관내 시험; (c) 항체(또는 그 표적)의 적절한 급성 약리 효과가 시간의 함수로 측정되는 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체내 시험; 및 (d) 항체의 안전성, 유효성 또는 생체이용률 또는 생물학적 동등성을 구축하는 잘 대조된 임상 시험에서.
본 발명의 항-액티빈 A 항체의 생물학적 동등물의 변이체는, 예를 들어 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 제조하거나 또는 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시켜 구축될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 필수적이 아닌 시스테인 잔기는 복원 시 불필요하거나 부정확한 분자내 디설피드 가교의 형성을 방지하기 위해, 결실되거나 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적으로 동등한 항체에는 항체의 글리코실화 특징을 개질하는 아미노산 변화, 예로 글리코실화를 제거하거나 삭제하는 돌연변이를 포함하는 항-액티빈 A 항체 변이체가 포함될 수 있다.
종 선택성 및 종 교차-반응성
특정 구현예에 따르면, 본 발명은 인간 액티빈 A에 결합하지만 다른 종으로부터의 액티빈 A에는 결합하지 않는 항-액티빈 A 항체를 제공한다. 본 발명에는 또한 인간 액티빈 A 및 하나 이상의 비-인간 종으로부터의 액티빈 A에 결합하는 항-액티빈 A 항체가 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 항-액티빈 A 항체는 인간 액티빈 A에 결합할 수 있고, 가능한 바와 같이, 하나 이상의 마우스, 래트, 기니아픽, 햄스터, 저빌, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 시아노몰구스, 마모셋, 붉은털원숭이 또는 침팬지 액티빈 A에 결합할 수도 결합하지 않을 수도 있다. 본 발명의 특정한 예시적인 구현예에 따르면, 인간 액티빈 A(예로, 액티빈 A 또는 βA 서브유닛-함유 이종이량체) 및 사이노몰구스 원숭이(예로, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 항-액티빈 A 항체가 제공된다.
면역접합체
본 발명은 치료 모이어티("면역접합체"), 예컨대 세포독소, 화학치료 약물, 면역억제제 또는 방사선동위원소에 접합된 항-액티빈 A 모노클로날 항체를 포괄한다. 세포독성제에는 세포에 해로운 임의의 제제가 포함된다. 면역접합체를 형성하기 적합한 세포독성제 및 화학치료제의 예는 본 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, WO 05/103081 참고).
다중특이적 항체
본 발명의 항체는 단일특이적, 이중특이적, 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프에 특이적일 수도 있고, 또는 하나를 초과하는 표적 폴리펩타이드에 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수도 있다. 예로, [Tutt et al., J Immunol 147:60-69(1991); Kufer et al., Trends Biotechnol 22:238-244(2004)]를 참고하라. 본 발명의 항-액티빈 A 항체는 또 다른 기능적 분자, 예로, 또 다른 펩타이드 또는 단백질에 연결되거나 공동 발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 다른 분자 물체, 예컨대 또 다른 항체 또는 항체 단편에 기능적으로 연결되어(예로, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합에 의해 또는 다르게) 제2의 결합 특이성을 갖는 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에는 면역글로불린의 하나의 팔이 인간 액티빈 A 또는 그의 단편에 특이적이고, 면역글로불린의 다른 팔이 제2 치료 표적에 특이적이거나 치료 모이어티에 접합되는 이중특이적 항체가 포함된다. 본 발명의 하나의 구현예에는 면역글로불린의 하나의 팔이 인간 액티빈 A 또는 그의 단편에 특이적이고, 면역글로불린의 다른 팔이 GDF8에 특이적인 이중특이적 항체가 포함된다.
본 발명의 맥락에서 이용될 수 있는 예시적인 이중특이적 항체 포맷에는 제1 면역글로불린(Ig) CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인의 사용이 관여되며, 여기서 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 적어도 하나의 아미노산이 서로 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 없는 이중특이적 항체에 비해 단백질 A에 대한 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다(예로, US 특허 번호 8,586,713 참고). 하나의 구현예에서, 제1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하며, 제2 Ig CH3 도메인은 단백질 A 결합을 감소시키거나 폐지하는 돌연변이, 예컨대 H95R 개질(IMGT 엑손 넘버링에 의해; EU 넘버링에 의해서는 H435R)을 함유한다. 제2 CH3은 Y96F 개질(IMGT에 의해; EU에 의해서는 Y436F)을 추가로 포함할 수 있다. 제2 CH3에서 확인될 수 있는 추가 개질에는 하기가 포함된다: IgG1 항체의 경우 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I(IMGT에 의해; EU에 의해서는 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I); IgG2 항체의 경우 N44S, K52N, 및 V82I(IMGT; EU에 의해서는 N384S, K392N, 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, V82I, 및 L105P(IMGT에 의해; EU에 의해서는 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, V422I, 및 L445P). 상술된 이중특이적 항체 포맷 상의 변이가 본 발명의 범위 내에 고려된다.
본 발명의 맥락에서 이용될 수 있는 다른 예시적인 이중특이적 포맷에는, 비제한적으로 예로, scFv-기반 또는 디아바디 이중특이적 포맷, IgG-scFv 융합, 이중 가변 도메인(DVD)-Ig, Quadroma, 구멍-내-손잡이(knobs-into-holes), 일반 경쇄(예로, 구멍-내-손잡이를 갖는 일반 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)바디, 류신 지퍼, Duobody, IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab(DAF)-IgG, 및 Mab2 이중특이적 포맷이 포함된다(예로, [Klein et al., mAbs 4:6, 1-11(2012)] 및 여기서 언급된 참고문헌을 상기 포맷의 검토를 위해 참고하라). 이중특이적 항체는 또한, 예로 펩타이드/핵산 접합을 이용해서 구축될 수 있고, 여기서 오르소 화학 반응성을 갖는 비천연 아미노산이 사용되어 부위-특이적 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 생성한 뒤 정의된 조성, 결합가 및 기하구조를 갖는 다량체성 복합체로 자가조립된다(예로, [Kazane et al., J Am Chem Soc. 135(1):340-346(2013)]을 참고하라).
치료 제형 및 투여
본 발명은 본 발명의 항-액티빈 A 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 개선된 이동, 전달, 관용성 등을 제공하는 적합한 담체, 부형제, 및 다른 제제와 제형화된다. 여러 적절한 제형이 모든 약학 화학자에게 공지된 제형분야에서 확인될 수 있다: [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]. 이들 제형에는, 예를 들어 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 소포(예컨대 LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA)를 함유하는 지질(양이온성 또는 음이온성), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀션, 에멀션 카르보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔 및 카르보왁스를 함유하는 반고체 혼합물이 포함된다. 또한 [Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA, J Pharm Sci Technol 52:238-311(1998)]을 참고하라.
환자에게 투여될 항체 용량은 환자의 연령 및 체격, 표적 질환, 상태, 투여 경로 등에 따라 변할 수 있다. 바람직한 용량은 전형적으로 체중 또는 체표면적에 따라 계산된다. 본 발명의 항체가 성인 환자에서 액티빈 A 활성과 연관된 상태 또는 질환을 치료하기 위해 사용되는 경우, 보통 약 0.01 내지 약 20 mg/kg 체중, 보다 바람직하게는 약 0.02 내지 약 7, 약 0.03 내지 약 5, 또는 약 0.05 내지 약 3 mg/kg 체중의 단일 용량으로 본 발명의 항체를 정맥내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 상태의 중증도에 따라, 치료 빈도 및 기간이 조정될 수 있다. 항-액티빈 A 항체를 투여하기 위한 유효 투여량 및 일정은 실험적으로 결정될 수 있다; 예를 들어, 환자 진행이 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있고, 용량이 이에 따라 조정된다. 또한, 종 간 투여량 스케일링은 본 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용해서 수행될 수 있다(예로, Mordenti et al., Pharmaceut Res 8:1351(1991)).
다양한 전달 시스템, 예로 리포좀내 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 본 발명의 항체 또는 다른 치료 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개성 내세포이입이 공지되어 있고, 본 발명의 약학적 조성물을 투여하기 위해 이용될 수 있다(예로, Wu et al., J Biol Chem 262:4429-4432(1987) 참고). 본 발명의 항체 및 다른 치료 활성 성분은 또한 유전자 치료법 기법에 의해 전달될 수 있다. 도입 방법에는 비제한적으로 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 경구 경로가 포함된다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부(예로 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)를 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성 제제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 이용해서 피하 또는 정맥내 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달에 관해, 펜 전달 장치는 용이하게 본 발명의 약학적 조성물의 전달에서의 용도를 갖는다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용 가능하거나 일회용일 수 있다. 재사용 가능한 펜 전달 장치는 일반적으로 약학적 조성물을 함유하는 대체 가능한 카트리지를 이용한다. 카트리지 내의 모든 약학적 조성물이 투여되었고 카트리지가 비면, 빈 카트리지는 쉽게 폐기되고 약학적 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 대체될 수 있다. 이어서 펜 전달 장치가 재사용될 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 대체 가능한 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치에는 장치 내의 저장소에 보유된 약학적 조성물이 사전 충전된다. 저장소에서 약학적 조성물이 비면, 전체 장치가 폐기된다.
여러 재사용 가능한 펜 및 자동주입장치 전달 장치가 본 발명의 약학적 조성물의 피하 전달에서의 적용을 갖는다. 예에는 비제한적으로 소수만 언급하면, AUTOPEN™(Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ 펜(Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜(Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II 및 III(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ 펜(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, 및 OPTICLIK™(sanofi-aventis, Frankfurt, Germany)이 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물의 피하 전달에서의 적용을 갖는 일회용 펜 전달 장치의 예에는 비제한적으로 소수만 언급하면, SOLOSTAR™ 펜(sanofi-aventis), FLEXPEN™(Novo Nordisk), 및 KWIKPEN™(Eli Lilly), SURECLICK™ 자동주입장치(Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™(Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN(Dey, L.P.), 및 HUMIRA™ 펜(Abbott Labs, Abbott Park IL)이 포함된다.
어떤 상황에서는, 약학적 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 하나의 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다([Langer, 상기와 동일; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987)을 참고하라). 또 다른 구현예에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있다; [Medical Applications of Controlled Release, Langer And Wise(eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida]를 참고하라. 또 다른 구현예에서, 제어 방출 시스템이 조성물의 표적 인근에 배치되어 전신 용량의 일부만 필요로 할 수 있다(예로, [Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, 상기와 동일, vol. 2, pp. 115-138] 참고). 다른 제어 방출 시스템은 [Langer, Science 249:1527-1533(1990)]에 의한 검토에서 논의된다.
주사형 제조물에는 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 드립 주입 등을 위한 투여 형태가 포함될 수 있다. 이들 주사형 제조물은 공개적으로 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사형 제조물은, 예로 상술된 항체 또는 그 염을 통상적으로 주사를 위해 사용되는 멸균 수성 매체 또는 유성 매체 중에 용해시키거나, 현탁하거나, 유화하여 제조될 수 있다. 주사를 위한 수성 매체로서, 예를 들어 적절한 가용화제, 예컨대 알코올(예로, 에탄올), 폴리올(예로, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제[예로, 폴리소르베이트 80, HCO-50 수소화 피마자유의 폴리옥시에틸렌(50 몰) 부가물)] 등과의 조합으로 사용될 수 있는 생리 식염수, 글루코스 및 다른 보조 제제 등을 함유하는 등장성 용액이 있다. 유성 매체로서, 예로 가용화제, 예컨대 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 조합 사용될 수 있는 참기름, 대두유 등이 채용된다. 이렇게 제조된 주사는 바람직하게는 적절한 앰플에 충전된다.
유리하게, 상술된 경구 또는 비경구 용도를 위한 약학적 조성물은 활성 성분의 용량에 맞춰 적합화된 단위 용량의 투여 형태로 제조된다. 이러한 단위 용량의 투여 형태에는, 예를 들어 정제, 알약, 캡슐, 주사(앰플), 좌약 등이 포함된다. 함유된 상기 항체의 양은 일반적으로 단위 용량의 투여 형태 별로 약 5 내지 약 500 mg; 특히 주사 형태로, 상기 항체가 약 5 내지 약 100 mg, 다른 투여 형태에 대해 약 10 내지 약 250 mg 함유되는 것이 바람직하다.
항체의 치료적 용도
본 발명의 항체는 특히 액티빈 A 발현, 신호전달, 또는 활성에 연관되거나 이에 의해 매개된, 또는 액티빈 A 및 액티빈 A 수용체(예로, ActRIIA, ActRIIB, 액티빈 I형 수용체 등) 간 상호작용의 차단에 의해 치료 가능한, 또는 액티빈 A 활성 및/또는 신호전달을 다르게 억제하는 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 완화에 유용하다. 예를 들어, 본 발명은 개인에서 근육 강도/힘 및/또는 근육 질량 및/또는 근육 기능의 증가에 의해, 또는 액티빈 A에 특이적으로 결합하지만 다른 ActRIIB 리간드에는 결합하지 않음으로써 또는 액티빈 A 및 GDF8에 특이적으로 결합하지만 다른 ActRIIB 리간드에는 결합하지 않음으로써 대사(탄수화물, 지질 및 단백질 가공)를 유리하게 변경하여 치유되거나, 경감되거나, 개선될 수 있는 상태 또는 질병의 치료 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명에는 대상체에 액티빈 A-특이적 결합 단백질을 투여함으로써, 대상체에서 근육 강도/힘 및/또는 근육 질량 및/또는 근육 기능을 증가시키거나 대상체에서 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법이 포함된다. 본 발명에는 또한 대상체에 액티빈 A-특이적 결합 단백질 및 GDF8-특이적 결합 단백질을 투여함으로써, 대상체에서 근육 강도/힘 및/또는 근육 질량 및/또는 근육 기능을 증가시키거나 대상체에서 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법이 포함된다. 본원에서 개시되거나 언급된 임의의 액티빈 A-특이적 결합 단백질 및/또는 GDF8-특이적 결합 단백질이 본 발명의 이들 측면의 맥락에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료 방법에는 대상체에 항-액티빈 A 항체 및/또는 항-GDF8 항체를 투여하는 단계가 포함된다.
따라서, 본원에 기재된 치료 방법의 맥락에서, 항-액티빈 A 항체는 단일치료법으로(즉, 유일한 치료제로) 또는 그 추가 예가 본원에서 다른 곳에 기재되어 있는 하나 이상의 추가 치료제(예로, 항-GDF8 항체)와의 조합으로 투여될 수 있다.
액티빈 A-특이적 결합 단백질 및 GDF8-특이적 결합 단백질을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법에서, 액티빈 A-특이적 결합 단백질 및 GDF8-특이적 결합 단백질은 대상체에 동일하거나 실질적으로 동일한 시간에, 예로 단일 치료 투여량으로, 또는 서로 동시에 또는 약 5 분 이내에 투여되는 2 개의 별도 투여량으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 액티빈 A-특이적 결합 단백질 및 GDF8-특이적 결합 단백질은 대상체에 순차적으로, 예로 서로 약 5 분 초과의 시간이 분리된 별도의 치료 투여량으로 투여될 수 있다.
본 발명에는 또한 대상체 액티빈 A-특이적 결합 도메인 및 GDF8-특이적 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 투여함으로써, 대상체에서 근육 강도/힘 및/또는 근육 질량 및/또는 근육 기능을 증가시키거나 대상체에서 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법이 포함된다. 본원에 개시되거나 언급된 임의의 항원-결합 분자가 본 발명의 상기 측면의 맥락에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료 방법에는 대상체에 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 HCVR/LCVR 쌍을 포함하는 제1 가변 도메인 및 CDF8에 특이적으로 결합하는 HCVR/LCVR 쌍을 포함하는 제2 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체의 투여 단계가 포함된다.
본 발명의 조성물은 대상체에, 예로 성장 인자 억제제, 면역억제제, 소염제, 대사 억제제, 효소 억제제 및 세포독성제/세포증식억제제를 포함하는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 투여될 수 있다. 추가 치료제(들)는 본 발명의 액티빈 A- 및 GDF8-특이적 결합 단백질의 투여 전, 동시 또는 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 예시적인 질환, 장애 및 상태에는 비제한적으로 사르코페니아, 악액질(예로, 특발성 악액질 또는 또 다른 상태, 예로, 암, 만성 신부전, 또는 만성 폐색성 폐 질환에 이차적인 악액질), 근육 부상, 근육 외상, 근육 소모 및 근육 위축, 예로 오용, 예로 근육, 부동화, 침상 안정, 부상, 의학적 치료 또는 수술적 개입(예로, 엉덩이 골절, 엉덩이 대체술, 무릎 대체술 및 다른 관절, 힘줄 또는 인대 부상, 예컨대 앞십자인대(ACL) 및/또는 안쪽곁인대(MCL) 등의 열상), 근디스트로피(예로, 근긴장성, 뒤시엔느, 베커, 팔다리-이음, 얼굴어깨위팔(FSHD, 란두우지-뒤시엔느 질환으로도 알려짐), 선천성, 눈인두, 원위, 에머리-드레이푸스 등), 글루코코르티코이드-유도된 근육병증, 뇌졸중 재활(예로, 뇌졸중 반신불완전마비에 대한 재활) 또는 기계적 환기의 필요성에 의해 유도되거나 이와 연관된 근육 위축 또는 소모가 포함된다. 본 발명의 조성물은 또한 질환, 예컨대 암, 비만, 당뇨병, 관절염, 다발성 경화증, 근디스트로피, 근위축 측삭 경화증, 파킨슨 질환, 골다공증, 골관절염, 골감소증, 및 대사 증후군(비제한적으로 당뇨병, 비만, 영양 장애, 기관 위축, 만성 폐색성 폐 질환, 및 식욕부진 포함)을 치료하거나, 예방하거나, 완화시키기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 사용해서 예방되고, 치료되고, 및/또는 완화될 수 있는 추가적인 질환, 장애, 및 상태에는 패혈증, 만성 심부전, 양성 및 악성 크롬친화세포종, 자궁 섬유양/다중 평활근종, 자간전증, 켈로이드 및 비대 흉터, 및 폐동맥 고혈압이 포함된다.
결합 및 활성의 개선된 특이성
본 발명에는 다중(예로, 3 개 이상의) ActRIIB 리간드에 결합하는 분자의 투여와 연관되는 유해 효과를 유도하지 않고, 대상체에서 근육 강도/힘 및/또는 근육 질량 및/또는 근육 기능을 증가시키거나, 대상체에서 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하거나, 액티빈 A 활성에 의해 유도되거나, 촉진되거나, 심해지는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법이 포함된다. 다르게 말하면, 항-액티빈 A 항체 또는 그의 항원 결합 단백질(예로, 항-액티빈 A 항체는 액티빈 A에만 유의미하게 결합함)을 사용하는 방법은 다중 ActRIIB 리간드에 결합하는 분자를 이용해서 나타난 원치 않거나 유해한 효과를 유도하지 않고 질환 또는 장애를 치료할 수 있다. 예를 들어, ACE-031(Acceleron Pharma, Inc., Cambridge, MA)로 불리는 임상 분자는 IgG Fc 도메인에 융합된 ActRIIB의 세포외 부분으로 구성된 다량체(상기 분자는 본원에서 "ActRIIB-Fc"로도 불림)이다. ActRIIB-Fc는 액티빈 A뿐만 아니라 다른 ActRIIB 리간드, 예컨대 액티빈 B, GDF8, GDF11, BMP9, BMP10, 및 TGFβ에 결합하며, 인간 환자에게 투여된 경우 다양한 유해 효과를 유도하는 것으로 알려져 있다. 중요하게는, 본 발명자들은 놀랍게도 다른 ActRIIB 리간드, 예컨대 액티빈 B, GDF11, BMP9, BMP10, 및 TGFβ를 억제하지 않으면서 액티빈 A 및 GDF8을 특이적으로 억제하는 것이(예로, 항-액티빈 A 항체 및 항-GDF8 항체를 투여함으로써) 결합제, 예컨대 ActRIIB-Fc와 연관된 유해 효과를 유도하지 않고 ActRIIB-Fc의 투여에 의해 관찰된 것과 적어도 동등한 근육 질량의 증가를 일으킴을 발견하였다.
조합 치료법 및 제형
본 발명에는 하나 이상의 추가적인 치료 활성 성분과 조합된 본원에서 기재된 임의의 항-액티빈 A 항체를 포함하는 조성물 및 치료 제형, 그리고 이러한 조합을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 포함된다. 본 발명에는 또한 하나 이상의 추가적인 치료 활성 성분과 조합된 본원에서 기재된 임의의 항-액티빈 A 항체를 포함하는 조성물 및 치료 제형, 그리고 이러한 조합을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 항-액티빈 A 항체는 또한 항바이러스제, 항생제, 진통제, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 산소, 항산화제, 금속 킬레이터, IFN-감마 및/또는 NSAID와 조합되어 투여되고/되거나 공동-제형화될 수 있다. 본 발명의 항-액티빈 A 항체는 또한 방사선 치료 및/또는 통상적 화학치료법을 또한 포함하는 치료 방식의 일환으로 투여될 수 있다(예로, 암 치료 또는 종양 성장 억제 방법의 맥락에서). 임의의 상기 언급된 추가적인 치료 활성 성분은, 예로 사르코페니아, 악액질, 근육 부상, 근육 소모 및 근육 위축을 포함하는, 항-액티빈 A 항체의 투여가 유익한 임의의 질환 또는 장애의 치료를 위해 임의의 본 발명의 항-액티빈 A 항체와 조합되어 투여될 수 있다. 임의의 상기 언급된 추가적인 치료 활성 성분은 또한 GDF8 억제제(예로, 항-GDF8 항체)와 함께 임의의 본 발명의 항-액티빈 A 항체와 조합되어 투여될 수 있다.
추가적인 치료 활성 성분(들)은 대상체에 본 발명의 항-액티빈 A 항체의 투여 전에 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 제2 성분의 투여 1 주 전, 72 시간 전, 60 시간 전, 48 시간 전, 36 시간 전, 24 시간 전, 12 시간 전, 6 시간 전, 5 시간 전, 4 시간 전, 3 시간 전, 2 시간 전, 1 시간 전, 30 분 전, 15 분 전, 10 분 전, 5 분 전, 또는 1 분 미만 전에 투여되는 경우, 제1 성분은 제2 성분 "전에" 투여되는 것으로 간주될 수 있다. 다른 구현예에서, 추가적인 치료 활성 성분(들)은 대상체에 본 발명의 항-액티빈 A 항체의 투여 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 제2 성분의 투여 1 분 후, 5 분 후, 10 분 후, 15 분 후, 30 분 후, 1 시간 후, 2 시간 후, 3 시간 후, 4 시간 후, 5 시간 후, 6 시간 후, 12 시간 후, 24 시간 후, 36 시간 후, 48 시간 후, 60 시간 후, 72 시간 후 투여되는 경우, 제1 성분은 제2 성분 "후에" 투여되는 것으로 간주될 수 있다. 다른 구현예에서, 추가적인 치료 활성 성분(들)은 대상체에 본 발명의 항-액티빈 A 항체의 투여와 동시에 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위한 "동시" 투여에는, 예로 서로 약 30 분 이하 내에 대상체에 투여된 단일 투여 형태로 또는 별도 투여 형태로 대상체에 대한 항-액티빈 A 항체 및 추가적인 치료 활성 성분의 투여가 포함된다. 별도 투여 형태로 투여되는 경우, 각각의 투여 형태는 동일한 경로를 통해 투여될 수 있다(예로, 항-액티빈 A 항체 및 추가적인 치료 활성 성분이 둘 다 정맥내, 피하, 유리체내 등으로 투여될 수 있음); 대안적으로, 각각의 투여 형태는 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다(예로, 항-액티빈 A 항체는 국소(예로, 유리체내) 투여될 수 있고, 추가적인 치료 활성 성분은 전신으로 투여될 수 있음). 어느 경우에도, 단일 투여 형태, 동일한 경로에 의한 별도 투여 형태, 또는 상이한 경로에 의한 별도 투여 형태의 성분 투여는 모두 본 개시의 목적을 위한 "동시 투여"로 간주된다. 본 개시의 목적을 위해, 추가적인 치료 활성 성분의 투여 "전", "동시" 또는 "후"(이들 용어는 상기 본원에서 정의된 바와 같음) 항-액티빈 A 항체의 투여는 추가적인 치료 활성 성분과 "조합된" 항-액티빈 A 항체의 투여로 간주된다).
본 발명에는 본 발명의 항-액티빈 A 항체가 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료 활성 성분(들)과 공동-제형화되는 약학적 조성물이 포함된다.
투여량
대상체에 투여될 수 있는 활성 성분(예로, 항-액티빈 A 항체, 항-액티빈 A 항체와의 조합으로 주어진 항-GDF8 항체, 또는 액티빈 A 및 GDF8에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체)의 양이 일반적으로 치료 유효량이다. 본원에서 사용되는 어구 "치료 유효량"은 하나 이상의 하기 파라미터에서 검출 가능한 증가를 일으키는 항원-특이적 결합 단백질 및/또는 항원-결합 분자의 용량을 의미한다: 체중, 근육 질량(예로, 앞 정강근[TA] 근육 질량, 장딴지근[GA] 근육 질량, 사두[Quad] 근육 질량 등), 근육 강도/힘, 및/또는 근육 기능. 예를 들어, 액티빈 A-특이적 결합 단백질 및/또는 GDF8-특이적 결합 단백질의 "치료 유효량"에는, 예로 본원에서 실시예 7에 예시된 바와 같이, 시험 대상체에 투여된 경우 대조군 처리 대상체에 비해 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60% 이상의 TA 또는 GA 근육 질량 증가를 유도하는 액티빈 A-특이적 결합 단백질 및/또는 GDF8-특이적 결합 단백질의 양이 포함된다.
본 발명의 항체(예로, 항-액티빈 A 항체, 항-액티빈 A 항체와의 조합으로 주어진 항-GDF8 항체, 또는 액티빈 A 및 GDF8에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체)의 경우, 치료 유효량은 각각의 항체의 약 0.05 mg 내지 약 600 mg; 예로, 약 0.05 mg, 약 0.1 mg, 약 1.0 mg, 약 1.5 mg, 약 2.0 mg, 약 10 mg, 약 20 mg, 약 30 mg, 약 40 mg, 약 50 mg, 약 60 mg, 약 70 mg, 약 80 mg, 약 90 mg, 약 100 mg, 약 110 mg, 약 120 mg, 약 130 mg, 약 140 mg, 약 150 mg, 약 160 mg, 약 170 mg, 약 180 mg, 약 190 mg, 약 200 mg, 약 210 mg, 약 220 mg, 약 230 mg, 약 240 mg, 약 250 mg, 약 260 mg, 약 270 mg, 약 280 mg, 약 290 mg, 약 300 mg, 약 310 mg, 약 320 mg, 약 330 mg, 약 340 mg, 약 350 mg, 약 360 mg, 약 370 mg, 약 380 mg, 약 390 mg, 약 400 mg, 약 410 mg, 약 420 mg, 약 430 mg, 약 440 mg, 약 450 mg, 약 460 mg, 약 470 mg, 약 480 mg, 약 490 mg, 약 500 mg, 약 510 mg, 약 520 mg, 약 530 mg, 약 540 mg, 약 550 mg, 약 560 mg, 약 570 mg, 약 580 mg, 약 590 mg, 약 600 mg, 약 610 mg, 약 620 mg, 약 630 mg, 약 640 mg, 약 650 mg, 약 660 mg, 약 670 mg, 약 680 mg, 약 690 mg, 약 700 mg, 약 710 mg, 약 720 mg, 약 730 mg, 약 740 mg, 약 750 mg, 약 760 mg, 약 770 mg, 약 780 mg, 약 790 mg, 약 800 mg, 약 810 mg, 약 820 mg, 약 830 mg, 약 840 mg, 약 850 mg, 약 860 mg, 약 870 mg, 약 880 mg, 약 890 mg, 약 900 mg, 약 910 mg, 약 920 mg, 약 930 mg, 약 940 mg, 약 950 mg, 약 960 mg, 약 970 mg, 약 980 mg, 약 990 mg, 또는 약 1000 mg일 수 있다.
개별 용량 내에 함유된 본 발명의 항체(예로, 항-액티빈 A 항체, 항-액티빈 A 항체와의 조합으로 주어진 항-GDF8 항체, 또는 액티빈 A 및 GDF8에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체)의 양은 환자 체중 당 항체 밀리그램(즉, mg/kg)의 측면에서 표시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-액티빈 A, 항-GDF8 및/또는 항-액티빈 A/항-GDF8 이중특이적 항체는 약 0.0001 내지 약 50 mg/kg의 환자 체중 당 용량으로 환자에게 투여될 수 있다(예로 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4.0 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6.0 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9.0 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10.0 mg/kg, 10.5 mg/kg, 11.0 mg/kg, 11.5 mg/kg, 12.0 mg/kg, 12.5 mg/kg, 13.0 mg/kg, 13.5 mg/kg, 14.0 mg/kg, 14.5 mg/kg, 15.0 mg/kg, 15.5 mg/kg, 16.0 mg/kg, 16.5 mg/kg, 17.0 mg/kg, 17.5 mg/kg, 18.0 mg/kg, 18.5 mg/kg, 19.0 mg/kg, 19.5 mg/kg, 20.0 mg/kg 등).
본 발명의 조성물은 동일한 양의 액티빈 A-특이적 결합 단백질 및 GDF8-특이적 결합 단백질을 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물 중 액티빈 A-특이적 결합 단백질의 양은 GDF8-특이적 결합 단백질의 양보다 많거나 적을 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 일상적 실험을 이용해서 원하는 치료 효과를 생성하기 위해 필요한 본 발명의 조성물 내 개별 성분의 적절한 양을 결정할 수 있을 것이다.
투여 방식
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 다중 용량의 활성 성분(예로, 항-액티빈 A 항체, 항-액티빈 A 항체와 조합되어 투여되는 항-GDF8 항체, 항-액티빈 A 항체 및 예로, 항-GDF8 항체, 또는 액티빈 A 및 GDF8에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 포함하는, 본원에서 언급된 임의의 추가적인 치료 활성 제제의 조합을 포함하는 약학적 조성물)은 정해진 시기에 걸쳐 대상체에 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 측면에 따른 방법은 대상체에 다중 용량의 본 발명의 활성 성분을 순차적으로 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 "순차적으로 투여하는"이란 활성 성분의 각각의 용량이 대상체에 상이한 시점에, 예로 소정 간격(예로, 수 시간, 수 일, 수 주 또는 수 개월)으로 구분된 상이한 날에 투여됨을 의미한다. 본 발명에는 환자에 단일 초기 용량의 활성 성분, 이어서 하나 이상의 2차 용량의 활성 성분, 및 선택적으로 이어서 하나 이상의 3차 용량의 활성 성분을 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 포함된다.
용어 "초기 용량", "2차 용량" 및 "3차 용량"은 활성 성분, 예로, 본 발명의 항-액티빈 A 항체 또는 본 발명의 조합 치료법, 예로 항-액티빈 A 항체 및 항-GDF8 항체 투여의 시간적 순서를 나타낸다. 따라서, "초기 용량"은 치료 방식의 시작 시 투여되는 용량("기준선 용량"으로도 불림)이며; "2차 용량"은 초기 용량 후 투여되는 용량이고; "3차 용량"은 2차 용량 후 투여되는 용량이다. 초기, 2차, 및 3차 용량은 모두 동일한 양의 활성 성분, 예로 항-액티빈 A 항체를 함유할 수 있지만, 일반적으로 투여 빈도 면에서 서로 상이할 수 있다. 그러나 특정 구현예에서, 초기, 2차 및/또는 3차 용량에 함유된 활성 성분, 예로 항-액티빈 A 항체의 양은 치료 기간 동안 서로 다르다(예로, 적절한 바에 따라 상향 또는 하향 조정됨). 특정 구현예에서, 2 개 이상(예로, 2, 3, 4, 또는 5 개) 용량이 치료 방식 시작 시 "로딩 용량"으로, 이어서 덜 빈번한 기준으로 투여되는 후속 용량(예로, "유지 용량")이 투여된다.
본 발명의 특정한 예시적인 구현예에서, 각각의 2차 및/또는 3차 용량은 직전 용량 후 1 내지 26(예로, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5 이상) 주에 투여된다. 본원에서 사용되는 어구 "직전 용량"은 다중 투여 순서에서, 개재 용량이 없이, 순서에서 바로 다음 용량의 투여 전에 환자에게 투여되는 활성 성분, 예로 항-액티빈 A 항체의 용량을 의미한다.
본 발명의 상기 측면에 따른 방법은 환자에게 본 발명의 활성 성분, 예로 항-액티빈 A 항체의 임의 수의 2차 및/또는 3차 용량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어 특정 구현예에서, 하나의 2차 용량만 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 2 개 이상(예로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 개 이상의) 2차 용량이 환자에게 투여된다. 마찬가지로 특정 구현예에서, 하나의 3차 용량만 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 2 개 이상(예로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 개 이상)의 3차 용량이 환자에게 투여된다.
다중 2차 용량이 관여되는 구현예에서, 각각의 2차 용량은 다른 2차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각의 2차 용량은 환자에게 직전 용량 후 1 내지 2 주 또는 1 내지 2 개월에 투여될 수 있다. 유사하게, 다중 3차 용량이 관여되는 구현예에서, 각각의 3차 용량은 다른 3차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각의 3차 용량은 환자에게 직전 용량 후 2 내지 12 주에 투여될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 2차 및/또는 3차 용량이 환자에게 투여되는 빈도는 치료 방식 과정에 걸쳐 변할 수 있다. 투여 빈도는 또한 임상 검사 후 개별 환자의 필요성에 따라 의사에 의한 치료 과정 동안 조정될 수 있다.
본 발명에는 2 내지 6 개의 로딩 용량이 환자에게 제1 빈도(예로, 주 1 회, 2 주 1회, 3 주 1회, 월 1 회, 2 개월 1 회 등)로 투여되고, 이어서 덜 빈번한 기준으로 환자에게 2 개 이상의 유지 용량이 투여되는 투여 방식이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 상기 측면에 따르면, 로딩 용량이 월 1 회의 빈도로 투여되는 경우, 유지 용량은 환자에게 6 주 1 회, 2 개월 1 회, 3 개월 1 회 등으로 투여될 수 있다).
항체의 진단 용도
본 발명의 항-액티빈 A 항체는 또한, 예로 진단 목적을 위해, 샘플에서 액티빈 A, 또는 액티빈 A-발현 세포를 검출하고/하거나 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-액티빈 A 항체, 또는 그의 단편은 액티빈 A의 이상 발현(예로, 과발현, 저발현, 발현 부재 등)을 특징으로 하는 상태 또는 질환을 진단하기 위해 사용될 수 있다. 액티빈 A에 대한 예시적인 진단 분석은, 예로 환자로부터 수득된 샘플을 본 발명의 항-액티빈 A 항체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 항-액티빈 A 항체는 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다. 대안적으로, 표지되지 않은 항-액티빈 A 항체는 자체가 검출 가능하게 표지되는 2차 항체와 조합되어 진단 적용에서 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자는 방사선동위원소, 예컨대 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I; 형광 또는 화학발광 모이어티, 예컨대 플루오레신 이소티오시아네이트, 또는 로다민; 또는 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 홀스래디쉬 페록시다제, 또는 루시퍼라제일 수 있다. 샘플에서 액티빈 A를 검출하거나 측정하기 위해 사용될 수 있는 구체적인 예시적 분석에는 효소-연관 면역흡착 분석(ELISA), 방사선면역분석(RIA), 및 형광-활성화 세포 정렬(FACS)이 포함된다.
본 발명에 따른 액티빈 A 진단 분석에서 사용될 수 있는 샘플에는 정상적 또는 병리적 상태 하에서 검출 가능한 양의 액티빈 A 단백질, 또는 그의 단편을 함유하는 환자로부터 수득 가능한 임의의 조직 또는 유체 샘플이 포함된다. 일반적으로, 건강한 환자(예로 비정상적인 액티빈 A 수준 또는 활성과 연관된 질환 또는 상태를 겪지 않는 환자)로부터 수득된 특정 샘플 내 액티빈 A의 수준이 처음에 액티빈 A의 기준선, 또는 표준, 수준을 구축하기 위해 측정될 것이다. 이후, 액티빈 A의 상기 기준선 수준이 액티빈 A-관련 질환 또는 상태를 가질 것으로 추정된 개인으로부터 수득된 샘플에서 측정된 액티빈 A의 수준에 대해 비교될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 기술분야의 기술자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 어떻게 제조하고 이용하는지의 전체 개시 및 설명을 제공하기 위해 주어지며, 발명자가 자신의 발명에 관해 간주하는 범위를 제한하려는 것이다. 이용된 수치(예로, 양, 온도 등)에 관해 정확성을 보장하기 위한 노력이 수행되었으나, 일부 실험 오차 및 일탈이 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이며, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압 또는 그 근처이다.
실시예 1. 액티빈 A에 대한 인간 항체의 생성
액티빈 A 단백질(인히빈-βA 이량체)을 포함하는 면역원을 면역 반응을 자극하기 위한 보강제와 함께, 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스에 직접 투여하였다. 항체 면역 반응을 액티빈 A-특이적 면역분석에 의해 모니터링하였다. 원하는 면역 반응이 달성되었을 때, 비장세포를 수확하고 마우스 골수종 세포와 융합시켜 이들의 생활성을 보존하고 하이브리도마 세포주를 형성하였다. 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선택하여, 액티빈 A-특이적 항체를 생산하는 세포주를 확인하였다. 상기 기법을 이용해서, 몇몇 항-액티빈 A 키메라성 항체(즉, 인간 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 보유하는 항체)를 수득하였다. 상기 방식으로 수득한 예시적인 항체는 H2aM10965N이다. 이후, 키메라성 항체로부터의 인간 가변 도메인을 인간 불변 도메인 상에 클로닝하여 본원에서 기재된 바와 같은 완전 인간 항-액티빈 A 항체를 제조하였다.
항-액티빈 A 항체를 또한, US 2007/0280945A1에 기재된 바와 같이, 골수종 세포에 융합하지 않고 항원-양성 B 세포로부터 직접 단리하였다. 상기 방법을 이용하여, 몇몇 완전 인간 항-액티빈 A 항체(즉, 인간 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 보유하는 항체)를 수득하였다; 상기 방식으로 생성한 예시적인 항체를 하기와 같이 명명하였다: H4H10423P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10436P2, 및 H4H10446P2.
본 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항-액티빈 A 항체의 특정한 생물학적 특성은 아래에 나타낸 실시예에서 상세히 기재된다.
실시예 2. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
표 1은 선택된 항-액티빈 A 항체 및 그의 대응하는 항체 식별자의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 쌍을 나타낸다. 대응하는 핵산 서열 식별자를 표 2에 나타낸다.
아미노산 서열 식별자
서열번호:
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
H4H10423P 2 4 6 8 10 12 14 16
H4H10424P 18 20 22 24 26 28 30 32
H4H10426P 34 36 38 40 42 44 46 48
H4H10429P 50 52 54 56 58 60 62 64
H4H10430P 66 68 70 72 74 76 78 80
H4H10432P2 82 84 86 88 90 92 94 96
H4H10433P2 98 100 102 104 90 92 94 96
H4H10436P2 106 108 110 112 90 92 94 96
H4H10437P2 114 116 118 120 90 92 94 96
H4H10438P2 122 124 126 128 90 92 94 96
H4H10440P2 130 132 134 136 90 92 94 96
H4H10442P2 138 140 142 144 146 148 150 152
H4H10445P2 154 156 158 160 146 148 150 152
H4H10446P2 162 164 166 168 146 148 150 152
H4H10447P2 170 172 174 176 146 148 150 152
H4H10448P2 178 180 182 184 146 148 150 152
H4H10452P2 186 188 190 192 146 148 150 152
H4H10468P2 194 196 198 200 146 148 150 152
H2aM10965N 202 204 206 208 210 212 214 216
핵산 서열 식별자
서열번호:
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
H4H10423P 1 3 5 7 9 11 13 15
H4H10424P 17 19 21 23 25 27 29 31
H4H10426P 33 35 37 39 41 43 45 47
H4H10429P 49 51 53 55 57 59 61 63
H4H10430P 65 67 69 71 73 75 77 79
H4H10432P2 81 83 85 87 89 91 93 95
H4H10433P2 97 99 101 103 89 91 93 95
H4H10436P2 105 107 109 111 89 91 93 95
H4H10437P2 113 115 117 119 89 91 93 95
H4H10438P2 121 123 125 127 89 91 93 95
H4H10440P2 129 131 133 135 89 91 93 95
H4H10442P2 137 139 141 143 145 147 149 151
H4H10445P2 153 155 157 159 145 147 149 151
H4H10446P2 161 163 165 167 145 147 149 151
H4H10447P2 169 171 173 175 145 147 149 151
H4H10448P2 177 179 181 183 145 147 149 151
H4H10452P2 185 187 189 191 145 147 149 151
H4H10468P2 193 195 197 199 145 147 149 151
H2aM10965N 201 203 205 207 209 211 213 215
항체는 전형적으로 본원에서 하기 명명법에 따라 불린다: Fc 접두사(예로 "H1M," "H2aM," "H4H")에 이어, 숫자 식별자(예로, 표 1 및 2에 나타낸 "10423", "10424" 또는 "10426"), 뒤이어 "P," "P2" 또는 "N" 접미사. 따라서 상기 명명법에 따르면, 항체는 본원에서, 예로 "H4H10423P", " H4H10432P2", "H2aM10965N" 등으로 불릴 수 있다. 본원에서 사용되는 항체 명칭 상의 H1M, H2M 및 H4H 접두사는 항체의 특정 Fc 영역 이소형을 시사한다. 예를 들어, "H2aM" 항체는 마우스 IgG2a Fc를 갖는 반면, "H4H" 항체는 인간 IgG4 Fc를 갖는다. 본 기술분야의 기술자에 의해 이해될 바와 같이, 특정 Fc 이소형을 갖는 항체는 상이한 Fc 이소형을 갖는 항체로 전환될 수 있지만(예로, 마우스 IgG2a Fc를 갖는 항체가 인간 IgG4를 갖는 항체 등으로 전환될 수 있음), 어느 경우에든 가변 도메인(CDR 포함) - 표 1에 나타낸 숫자 식별자에 의해 나타냄 - 은 동일하게 유지될 것이며, 결합 특성은 Fc 도메인의 성질과 무관하게 동일하거나 실질적으로 유사할 것으로 예상된다.
하기 실시예에서 사용된 대조군 구축물
항-액티빈 A 대조군 분자가 비교 목적을 위해 하기 실시예에 포함되었다. 본원에서 대조군 1로 명명된 대조군 항체는 US 8,309,082에 나타낸 "A1"의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 인간 항-액티빈 A 항체이다. 대조군 2는 U.S. 특허 출원 번호 2012/0237521 A1에서 MOR8159로 개시된 항-인간 액티빈 수용체 IIB형 항체(항-ActR2B mAb)이다. 대조군 3은 R&D Systems, Minneapolis, MN(카탈로그 번호 MAB3381)의 쥐과 항-액티빈 A 모노클로날 항체이다. 대조군 4는 액티빈 IIB형 수용체-Fc 융합 분자(C-말단 인간 IgG1 Fc 융합 단백질과 함께 생성된 가용성 액티빈 RIIB 수용체 세포외 도메인(NP_001097의 E23-P133에 이어 Gly-Ser 링커, 뒤이어 C-말단 인간 IgG1 Fc 융합)이며, 그 서열이 서열번호 227로 제공된다.
실시예 3. 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 인간 액티빈 A에 대한 항체 결합
선택된 정제 항-인간 액티빈 A 모노클로날 항체로의 항원 결합에 대한 결합 친화도 및 반응속도 상수를 25℃ 및 37℃에서 실시간 표면 플라즈몬 공명 바이오센서(Biacore T200 또는 Biacore 4000, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) 분석을 이용해서 결정하였다. 마우스 Fc(접두사 H2aM) 또는 인간 Fc(접두사 H4H)로 발현된 항체를 이들 각각의 항-Fc 센서 표면(mAb 포획 포맷) 상에서 포획하였다. 항-액티빈 A 항체를 Biacore CM5 센서 칩에 대한 직접적 아민 커플링을 통해 생성된 염소 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체(GE Healthcare, #BR-1008-38) 또는 마우스 항-인간 IgG 모노클로날 항체(GE Healthcare, #BR-1008-39) 표면 상에서 포획하였다. 반응속도 실험을 수행 완충액 및 샘플 완충액 둘 다로서 HBS-EP(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4) 또는 PBS-P(10 mM 나트륨 포스페이트, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 0.02% NaN3, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4)를 이용하여 수행하였다. 항원-항체 회합 속도는 다양한 농도(50 내지 0.2 nM 범위의 4-배 희석)의 액티빈 A(R&D Systems, # 338-AC-050/CF), 액티빈 B(R&D Systems, # 659-AB-025/CF), 액티빈 AB(R&D Systems, # 1006-AB-005), 액티빈 AC(R&D Systems, # 4879-AC/CF), 또는 인히빈 E(Novus Biologicals, #H00083729-P01)를 포획된 항체 표면에 걸쳐 주사하여 측정하였다. 항체-항원 회합은 240 초 동안 모니터링한 반면, 완충액 중 해리는 600 초 동안 모니터링하였다. 반응속도 회합 및 해리 속도 상수는 Scrubber 소프트웨어 버전 2.0c를 이용하여 데이터를 처리하고 피팅시켜 결정하였다. 이어서 결합 평형 해리 상수(K D) 및 해리 반감기(t1/2)를 다음과 같이 반응속도 속도 상수로부터 계산하였다: K D(M) = k d / k a 및 t1/2(min) = [ln2/(60*k d)]. 상이한 항-액티빈 A 모노클로날 항체에 대한 반응속도 결합 파라미터를 표 3 내지 10에 나타낸다(NB = 이용된 조건 하에서 결합이 관찰되지 않음; NT = 시험되지 않음).
25℃에서 항- 액티빈 A 항체의 액티빈 A에 대한 결합 특징
항체 포획된 mAb의 양(RU ± SE) 액티빈 A-20 nM(RU) k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K D (Molar) t 1/2 (min)
H4H10423P 86.2 ± 0.7 19.4 3.33E + 06 1.09E-04 3.26E-11 106.4
H4H10424P 337 82 3.14E + 06 7.19E-04 2.29E-10 16
H4H10426P 81 23 1.18E + 07 7.00E-04 5.95E-11 16
H4H10429P 115.2 ± 1 24.9 7.82E + 06 6.39E-05 8.17E-12 180.8
H4H10430P 90.3 ± 4.2 19.4 4.75E + 07 1.67E-04 3.52E-12 69
H4H10432P2 109.6 ± 1.2 20.7 1.57E + 07 5.00E -05 ≤ 3.18E-12 ≥ 231
H4H10433P2 102 16 1.42E + 07 5.77E-04 4.06E-11 20
H4H10436P2 113.6 ± 0.6 23.2 8.85E + 06 1.68E-04 1.90E-11 68.7
H4H10437P2 167 30 1.58E + 07 2.13E-03 1.34E-10 5
H4H10438P2 124 25 1.20E + 07 5.88E-04 4.92E-11 20
H4H10440P2 79.2 ± 0.7 12.9 3.76E + 06 9.28E-05 2.47E-11 124.5
H4H10442P2 139.3 ± 1 31.3 1.10E + 07 5.00E -05 ≤ 4.55E-12 ≥ 231
H4H10445P2 149 43 2.40E + 06 5.00E -05 ≤ 2.08E-11 ≥ 231
H4H10446P2 104.6 ± 0.7 24.1 1.29E + 07 5.00E -05 ≤ 3.88E-12 ≥ 231
H4H10447P2 164 43 2.36E + 06 5.00E -05 ≤ 2.12E-11 ≥ 231
H4H10448P2 244 64 4.76E + 06 5.00E -05 ≤ 1.05E-11 ≥ 231
H4H10452P2 191 55 4.69E + 06 5.00E -05 ≤ 1.07E-11 ≥ 231
H4H10468P2 93 ± 0.1 21.7 7.86E + 06 5.00E -05 ≤ 6.36E-12 ≥ 231
H2aM10965N 393 76 1.48E + 06 1.10E-03 7.45E-10 10
대조군 1 84.7 ± 0.3 15.9 7.26E + 06 9.92E-05 1.37E-11 116.4
이탤릭체인 k d 값에 있어서는 이들 실험 조건 하에서 분석물질의 해리가 관찰되지 않았으며, 이에 따라 k d 값을 5.0E-05 s-1에서 고정하였다.
37℃에서 항- 액티빈 A 항체의 액티빈 A에 대한 결합 특징
항체 포획된 mAb의 양(RU ± SE) 액티빈 A-20nM(RU) k a (M -1 s -1 ) k d(s -1 ) K D (Molar) t 1/2 (min)
H4H10423P 101 ± 1.4 25.2 3.95E + 06 5.00E -05 ≤ 1.26E-11 ≥ 231
H4H10424P 231 58 4.59E + 06 3.64E-03 7.94E-10 3
H4H10426P 71 21 1.61E + 07 1.98E-03 1.23E-10 6
H4H10429P 150.8 ± 5.3 31.4 1.33E + 07 5.00E -05 ≤ 3.75E-12 ≥ 231
H4H10430P 109.3 ± 1.3 25.0 3.80E + 07 1.51E-04 3.97E-12 76.5
H4H10432P2 141.8 ± 1.6 25.1 2.30E + 07 5.00E -05 ≤ 2.18E-12 ≥ 231
H4H10433P2 85 12 2.00E + 07 1.07E-03 5.37E-11 11
H4H10436P2 139.8 ± 1.4 29.4 1.49E + 07 5.00E -05 ≤ 3.35E-12 ≥ 231
H4H10437P2 115 20 2.04E + 07 4.68E-03 2.29E-10 2
H4H10438P2 99 18 1.87E + 07 2.38E-03 1.27E-10 5
H4H10440P2 98.6 ± 1.1 15.3 6.37E + 06 3.28E-04 5.15E-11 35.2
H4H10442P2 181 ± 2.5 40.5 1.44E + 07 5.00E -05 ≤ 3.48E-12 ≥ 231
H4H10445P2 120 36 4.33E + 06 5.00E -05 ≤ 1.15E-11 ≥ 231
H4H10446P2 137.2 ± 1.7 31.5 1.54E + 07 5.00E -05 ≤ 3.25E-12 ≥ 231
H4H10447P2 126 36 4.69E + 06 5.00E -05 ≤ 1.07E-11 ≥ 231
H4H10448P2 175 49 7.86E + 06 5.00E -05 ≤ 6.36E-12 ≥ 231
H4H10452P2 146 43 7.94E + 06 5.00E -05 ≤ 6.30E-12 ≥ 231
H4H10468P2 98.7 ± 0.7 24.5 1.22E + 07 5.00E -05 ≤ 4.10E-12 ≥ 231
H2aM10965N 435 80 2.35E + 06 4.15E-03 1.77E-09 3
대조군 1 93.9 ± 0.7 18.0 8.99E + 06 5.00E -05 ≤ 5.56E-12 ≥ 231
이탤릭체의 k d 값에 있어서는 이들 실험 조건 하에서 분석물질의 해리가 관찰되지 않았으며, 이에 따라 k d 값은 5.0E-05 s-1에서 고정되었다.
25℃에서 항- 액티빈 A 항체의 액티빈 B에 대한 결합 특징
항체 포획된 mAb의 양(RU ± SE) 결합된 50 nM Ag ( RU ) k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K D (Molar) t 1/2 (min)
H4H10423P 83.1 ± 0.6 4.7 4.89E + 05 3.02E-02 6.18E-08 0.4
H4H10429P 112.3 ± 0.7 26.4 3.49E + 06 1.31E-02 3.75E-09 0.9
H4H10432P2 104.4 ± 1.8 5.1 NB NB NB NB
H4H10436P2 110.8 ± 3.9 32.8 9.52E + 06 5.28E-04 5.54E-11 21.9
H4H10440P2 75.7 ± 0.8 18.8 1.06E + 06 1.16E-03 1.09E-09 10.0
H4H10442P2 136 ± 0.7 3.4 NB NB NB NB
H4H10430P 88 ± 0.5 3.9 NB NB NB NB
H4H10446P2 101.5 ± 0.4 3.6 NB NB NB NB
H4H10468P2 92.5 ± 0.2 6.2 NB NB NB NB
대조군 1 84.1 ± 0.3 6.4 NB NB NB NB
37℃에서 항- 액티빈 A 항체의 액티빈 B에 대한 결합 특징
항체 포획된 mAb의 양(RU ± SE) 결합된 50 nM Ag(RU) k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K D (Molar) t 1/2 (min)
H4H10423P 96 ± 1.2 4.4 NB NB NB NB
H4H10429P 142.8 ± 1.3 25.3 3.43E + 06 3.43E-02 9.98E-09 0.3
H4H10432P2 134.1 ± 1.7 5.1 NB NB NB NB
H4H10436P2 132 ± 1.4 38.1 9.78E + 06 1.36E-03 1.39E-10 8.5
H4H10440P2 94 ± 4.5 20.9 1.28E + 06 4.19E-03 3.29E-09 2.8
H4H10442P2 173.1 ± 1.4 4.4 NB NB NB NB
H4H10430P 105.8 ± 1.3 3.6 NB NB NB NB
H4H10446P2 131.4 ± 1.2 3.8 NB NB NB NB
H4H10468P2 95.5 ± 1 3.4 NB NB NB NB
대조군 1 90.2 ± 0.9 2.7 NB NB NB NB
25℃에서 항- 액티빈 A 항체의 액티빈 AB에 대한 결합 특징
항체 포획된 mAb의 양(RU ± SE) 결합된 50 nM Ag(RU) k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K D (Molar) t 1/2 (min)
H4H10423P 81.3 ± 0.5 14.7 6.13E + 05 2.03E-02 3.31E-08 0.6
H4H10429P 110.7 ± 0.5 40.0 4.53E + 06 1.03E-04 2.28E-11 111.7
H4H10432P2 101.2 ± 1.6 38.3 4.00E + 06 2.27E-03 5.68E-10 5.1
H4H10436P2 107.5 ± 0.3 28.2 7.66E + 06 2.61E-04 3.41E-11 44.2
H4H10440P2 73.7 ± 0.4 15.5 2.97E + 06 5.26E-04 1.77E-10 22.0
H4H10442P2 133.3 ± 0.6 34.6 5.53E + 06 1.77E-03 3.20E-10 6.5
H4H10430P 86.9 ± 0.5 33.0 1.17E + 07 2.17E-04 1.85E-11 53.3
H4H10446P2 99.8 ± 0.4 31.9 4.99E + 06 4.06E-03 8.15E-10 2.8
H4H10468P2 92.1 ± 0.2 34.7 3.76E + 06 2.09E-03 5.56E-10 5.5
대조군 1 83.5 ± 0.6 31.1 3.44E + 06 2.83E-04 8.22E-11 40.9
37℃에서 항- 액티빈 A 항체의 액티빈 AB에 대한 결합 특징
항체 포획된 mAb의 양(RU ± SE) 결합된 50 nM Ag(RU) k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K D (Molar) t 1/2 (min)
H4H10423P 90.8 ± 1.2 21.7 8.80E + 05 2.13E-02 2.42E-08 0.5
H4H10429P 137.7 ± 1.2 50.0 6.47E + 06 4.88E-04 7.55E-11 23.6
H4H10432P2 127.7 ± 1.3 44.4 5.40E + 06 5.92E-03 1.10E-09 2.0
H4H10436P2 126.8 ± 0.8 33.9 1.03E + 07 4.58E-04 4.43E-11 25.2
H4H10440P2 88.9 ± 1.7 17.7 5.20E + 06 1.63E-03 3.14E-10 7.1
H4H10442P2 166.5 ± 1.7 45.9 9.17E + 06 4.25E-03 4.64E-10 2.7
H4H10430P 101.6 ± 1.2 41.0 1.01E + 07 5.41E-04 5.35E-11 21.3
H4H10446P2 126.6 ± 1.2 41.5 6.08E + 06 8.17E-03 1.34E-09 1.4
H4H10468P2 92.2 ± 0.8 34.5 5.03E + 06 4.43E-03 8.80E-10 2.6
대조군 1 86.4 ± 0.6 29.3 3.77E + 06 7.38E-04 1.96E-10 15.7
25℃에서 항- 액티빈 A 항체의 액티빈 AC에 대한 결합 특징
항체 포획된 mAb의 양(RU ± SE) 결합된 50 nM Ag(RU) k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K D (Molar) t 1/2 (min)
H4H10423P 79.9 ± 0.4 -0.8 NB NB NB NB
H4H10429P 108.9 ± 0.5 28.0 9.13E + 05 9.10E-05 9.97E-11 126.9
H4H10432P2 101.6 ± 0.7 34.9 6.29E + 05 1.87E-03 2.98E-09 6.2
H4H10436P2 106.7 ± 0.4 30.1 6.98E + 05 1.56E-03 2.24E-09 7.4
H4H10440P2 73.5 ± 0.4 11.8 5.13E + 05 2.27E-04 4.42E-10 50.8
H4H10442P2 132.5 ± 3.1 18.6 1.31E + 06 2.05E-03 1.57E-09 5.6
H4H10430P 85.1 ± 0.3 23.6 1.23E + 06 1.09E-02 8.86E-09 1.1
H4H10446P2 96.9 ± 0.5 12.6 1.04E + 06 1.22E-02 1.18E-08 0.9
H4H10468P2 91.4 ± 0.3 17.2 7.98E + 05 5.92E-03 7.41E-09 2.0
대조군 1 82.5 ± 0.3 22.3 5.58E + 05 2.25E-03 4.03E-09 5.1
37℃에서 항- 액티빈 A 항체의 액티빈 AC에 대한 결합 특징
항체 포획된 mAb의 양(RU ± SE) 결합된 50 nM Ag(RU) k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K D (Molar) t 1/2 (min)
H4H10423P 85.9 ± 1.1 0.0 NB NB NB NB
H4H10429P 132.6 ± 1.2 35.7 1.34E + 06 6.20E-04 4.62E-10 18.6
H4H10432P2 123.8 ± 1.4 34.6 7.22E + 05 9.02E-03 1.25E-08 1.3
H4H10436P2 122.9 ± 1.3 32.6 8.81E + 05 3.31E-03 3.75E-09 3.5
H4H10440P2 86.6 ± 2.7 13.3 7.18E + 05 7.55E-04 1.05E-09 15.3
H4H10442P2 160.1 ± 1.5 21.4 1.46E + 06 5.99E-03 4.10E-09 1.9
H4H10430P 96.8 ± 1 25.3 1.20E + 06 2.00E-02 1.67E-08 0.6
H4H10446P2 120.3 ± 1 14.4 9.59E + 05 2.16E-02 2.25E-08 0.5
H4H10468P2 88.4 ± 0.8 10.7 7.19E + 05 1.24E-02 1.73E-08 0.9
대조군 1 83.2 ± 0.9 15.6 6.51E + 05 6.52E-03 1.00E-08 1.8
표 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항-액티빈 A 항체는 25℃에서 3.18 pM 미만(즉, ≤ 3.18E-12) 내지 745 pM(즉, 7.45E-10) 범위의 K D 값 및 37℃에서 2.18 pM 미만(즉, ≤ 2.18E-12) 내지 1.77 nM(1.77E-09) 범위의 K D 값으로 액티빈 A에 결합하였다. 표 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 몇몇 항-액티빈 A 항체(즉, H4H10432P2, H4H10442P2, H4H10430P2, H4H10446P2, 및 H4H10468P2)는 25℃ 또는 37℃에서 액티빈 B에 대해 측정 가능한 결합을 나타내지 않았다. 일부 항체는 25℃에서 대략 18.5 pM(즉, 1.85E-11) 내지 33.1 nM(즉, 3.31E-08)(표 7) 및 37℃에서 대략 44.3 pM(즉, 4.43E-11) 내지 24.2 nM(즉, 2.42E-08)(표 8) 범위의 K D 값으로 액티빈 AB에 측정 가능한 결합을 나타내었다. 일부 항체는 25℃에서 대략 99.7 pM(즉, 9.97E-11) 내지 11.8 nM(즉, 1.18E-08)(표 9) 및 37℃에서 대략 462 pM(즉, 4.62E-10) 내지 22.5 nM(즉, 2.25E-08)(표 10) 범위의 K D 값으로 액티빈 AC에 측정 가능한 결합을 나타내었다. 또한, 시험된 본 발명의 항-액티빈 A 항체는 어느 것도 인히빈 E에 대해 측정 가능한 결합을 나타내지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 4. 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 TGF -베타 패밀리 멤버에 대한 항체 결합
액티빈 A mAb를 TGF-베타 패밀리 멤버의 패널에 대한 결합 교차-반응성에 대해 시험하였다. 결합 실험을 위해, Biacore 4000 기기를 이용하였다. 항체 H4H10429P, H4H10430P, H4H10436P2, H4H10442P2, H4H10446P2; 대조군 4(C-말단 인간 IgG1 Fc 태그를 포함하여 생산된 ActR2B 가용성 외(ecto) 도메인 단백질(ActR2B-hFc; 서열번호 227)); 및 이소형 대조군 항체를 먼저 모노클로날 마우스 항-인간 Fc 항체(GE, 카탈로그# BR-1008-39)를 이용한 아민 커플링에 의해 유도체화된 Biacore CM4 바이오센서 칩 상에서 포획하였다. 모든 Biacore 결합 연구를 HBS-T 수행 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.5 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.5 mg/ml 소 혈청 알부민, 0.05% v/v 계면활성제 P20) 중에 수행하였다. 인간 TGF-베타 패밀리 멤버 리간드는 R&D systems(액티빈 A, #338-AC; 액티빈 B, #659-AB; 액티빈 AB, #1066-AB; 액티빈 AC, #4879-AC; BPM2, #355-BM; hBMP4, #314-BP; hBMP6, #507-BP; hBMP7, #354-BP; hBMP9, #3209-BP; hBMP10, #2926-BP; hGDF8, #788-G8; hGDF11, #1958-GD)에서 구입하였다. 모든 결합 측정은 37℃에서 수행하였다. 60 - 200 공명 단위(RU) 범위의 포획 수준을 각각의 항체 또는 가용성 수용체에 대해 수득하였다. 포획된 항체 표면에 걸친 3.1 nM 내지 200 nM 범위의 농도에 걸쳐 TGF-베타 패밀리 리간드를 주사하였다. 200 nM 분석물질 주사에 대한 결합 값을 표 11에 나타낸다.
37℃에서 인간 TGF -β 패밀리 리간드에 대한 항- 액티빈 A 모노클로날 항체의 결합
포획된 항체 센서 표면에 걸쳐 주사된 200 nM TGF -베타 패밀리 리간드에 대한 결합 반응(공명 단위)
시험된 TGF-베타 패밀리 리간드 H4H10429P H4H10430P H4H10436P2 H4H10442P2 H4H10446P2 H4H8925C 대조군 4(ActR2B-hFc)
(양성 대조군) 		이소형 대조군 mAb
액티빈 A 56.8 69.1 56.5 63.9 53.2 67.6 70.9 -0.1
액티빈 B 51.5 0.4 60.1 -1.8 2.6 0.3 68.0 1.9
액티빈 AB 76.5 95.0 54.3 65.2 66.7 102.0 59.5 -0.1
액티빈 AC 43.1 34.8 55.6 14.2 15.2 32.5 59.4 -0.1
hBMP2 3.6 -1.7 14.9 -2.3 3.3 -4.0 36.9 -1.0
hBMP4 1.1 -0.6 19.3 -0.7 0.8 -0.5 26.4 0.4
hBMP6 4.6 5.7 4.0 1.1 5.3 4.8 86.3 5.1
hBMP7 9.2 6.4 13.6 1.5 5.7 4.5 64.2 4.3
hBMP9 33.4 -0.6 11.7 0.0 -0.3 -0.1 32.3 -1.0
hBMP10 32.4 0.3 22.5 -0.7 0.5 0.0 34.2 0.3
GDF8 -0.4 -0.1 -0.5 0.5 0.7 -0.1 25.8 0.5
GDF11 1.6 3.0 0.0 1.0 1.8 3.3 24.2 3.0
200 nM에서 주사된 TGF-베타 패밀리 리간드에 대한 포획된 액티빈 A 항체의 관찰된 결합 반응이 배경 수준 비특이적 결합 척도를 제공하는 음성 대조군 항체(이소형 대조군 mAb)의 결합 반응, 및 시험된 TGF-베타 패밀리 멤버의 전체 패널에 대해 결합하는 것으로 관찰되었고 이에 따라 양성 대조군 리간드-결합 단백질로 작용하는 ActR2B-hFc의 결합 반응과 비교할 수 있었다(표 11). 상기 비교로부터, 몇몇 항체(예로, H4H10430, H4H10442, H4H20446)가 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 AC에 결합하지만 액티빈 B 또는 BMP 또는 GDF 리간드에는 인식 가능하게 결합하지 않음을 확인하였다. 또한 일부 항체가 추가적인 TGF-베타 패밀리 리간드에 대해 더 넓은 교차-반응성으로 결합함을 확인하였다. 예를 들어, H4H10429P는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 또한 BMP9 및 BMP10에 인식 가능하게 결합하였다. H4H10436P2는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 AC, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, 및 BMP10에 인식 가능한 결합을 나타내었다. 이들 데이터로부터, 액티빈 A 리간드로 마우스를 면역화한 후 TGF-베타 패밀리 리간드에 대해 상이한 결합 특이성을 갖는 항체를 수득할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 5. 항- 액티빈 A 항체의 교차-경쟁 분석
9 개 항체 패널(H4H10446P2, H4H10468P2, H4H10442P2, H4H10423P, H4H10430P, H4H10429P, H4H10432P2, H4H10436P2 및 H4H10440P2)의 인간 액티빈 A에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하는 능력을 평가하기 위해 교차-경쟁 분석을 수행하였다. 2 개의 이소형 대조군 항체 및 2 개의 대조군 액티빈 A 항체, 대조군 1(US 8,309,082에 나타낸 "A1"의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 인간 항-액티빈 A 항체) 및 대조군 3(MAB3381, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN에서 입수 가능)을 또한 분석에 포함시켰다. 모든 분석을 제조사(ForteBio Corp., Menlo Park, CA)의 지침에 따라 Octet HBST 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20, 0.1 mg/mL BSA) 중 1000 rpm의 마이크로타이터 플레이트 진탕 속도로 25℃에서 수행하였다. 간략하게, 각각의 항-액티빈 A 항체의 10 ㎍/mL 용액 중에 5 분 동안 팁을 침지시켜 대략 1.8 nm의 결합 반응을 제공하는 양의 항-액티빈 A 항체를 항-인간 Fc 항체 코팅된 Octet 센서 팁(Fortebio, # 18-0015) 상에 포획하였다. 5 분 동안 비관련 항체의 50 ㎍/mL 용액 중에 팁을 인큐베이션하여 팁 상의 임의의 잔여 항-hFc 결합 부위를 차단하였다. 이어서 센서 팁을 1 μM의 제2 항-액티빈 A 항체가 사전 결합된 50 nM 액티빈 A(R&D Systems, # 338-AC/CF) 용액을 함유하는 웰 내로 침지하였다. 액티빈 A 항체 코팅된 센서 팁에 대한 제2 액티빈 A 항체 / 액티빈 A 용액의 결합을 5 분 동안 1000 rpm에서 모니터링하였다. 액티빈 A 항체 코팅된 센서 팁에 대한 mAb/액티빈 A 복합체의 결합 반응을 비교하고, 상이한 항-액티빈 A 모노클로날 항체의 경쟁적/비경쟁적 거동을 결정하였다. 결과를 도 1에 예시한다.
도 1에서, 경쟁적 결합 반응을 검은색 또는 담회색 색조로 나타내며, 대응하는 항체 쌍이 액티빈 A로의 결합에 대해 서로 경쟁함을 시사한다. 검은색 폰트의 담회색 박스는 동일한 항체 간 자가-경쟁에 대한 결합 반응을 나타낸다. 흰색 폰트의 검은색 박스는 결합 순서에 무관하게, 두 방향 모두에서 액티빈 A 결합에 대해 경쟁하는 항체를 나타낸다. 검은색 폰트의 진회색 박스는 이소형 대조군(즉, 비-결합) 항체에 대한 판독을 나타내며, 항-액티빈 A 항체-액티빈 A 복합체에 대한 이소형 대조군 항체의 결합 부재(이소형 대조군 항체가 Octet 센서 팁에 결합한 경우) 또는 액티빈 A에 대한 이소형 대조군 항체의 결합 부재(이소형 대조군 항체를 액티빈 A를 포함하는 웰에서 제2 항체로 이용한 경우)를 시사한다. 검은색 폰트의 흰색 박스는 항체 간 경쟁이 없음을 나타내어, 항체가 액티빈 A 상에서 구별되는 결합 에피토프를 가짐을 제시한다.
4 개 항체, H4H10446P2, H4H10468P2, H4H10442P2, 및 H4H10423P는 액티빈 A로의 결합에 대해 서로 양방향으로 경쟁한다. 추가로, 이들 4 개 항체는 결합에 대해 대조군 1 또는 대조군 3과 경쟁하지 않는다. 이들 4 개의 액티빈 A 항체 중 3 개, H4H10446P2, H4H10468P2, 및 H4H10442P2는 임의의 다른 액티빈 A 항체와 교차 경쟁하지 않는다. 4 개의 항체 중 하나(H4H10423P)도 액티빈 A로의 결합에 대해 H4H10430P에 대해 양방향으로 경쟁한다. 5 개의 항체, H4H10430P, H4H10429, H4H10432P2, H4H10436P2, 및 H4H10440P2는 액티빈 A로의 결합에 대해 뿐만 아니라 대조군 1 및 대조군 3과 서로 양방향으로 경쟁한다. 이들 5 개의 항체 중 4 개(즉, H4H10429, H4H10432P2, H4H10436P2, 및 H4H10440P2)는 임의의 다른 액티빈 A 항체와 교차 경쟁하지 않는 반면, H4H10423P는 상기 주지된 바와 같이 H4H10430P와 교차 경쟁한다.
본 실시예의 결과는 본 발명의 항-액티빈 A 항체가 에피토프 결합 특징에 기반하여 2 개의 구별되는 "bin"으로 그룹화될 수 있음을 시사한다: Bin 1에는 H4H10423P, H4H10446P2, H4H10468P2 및 H4H10442P2가 포함된다. Bin 2에는 H4H10429, H4H1430P, H4H10432P2, H4H10436P2, 및 H4H10440P2가 포함된다. 또한, 각각의 bin으로부터의 하나의 항체, 즉 H4H10423P 및 H4H1430P는 서로 교차-경쟁한다. 본 실시예의 결과는 Bin 1의 항체가 Bin 2의 항체와 액티빈 A 상에서 구별되는 영역에 결합함을 제시한다.
실시예 6. 항- 액티빈 A 항체를 이용한 액티빈 A- 매개성 수용체 활성화 및 SMAD 복합체 신호전달의 억제
본 발명의 항-액티빈 A 항체를 추가 분석하기 위해, 액티빈 IIA형 및 IIB 수용체(각각 ActRIIA 및 ActRIIB)의 활성화 및 액티빈 I형 수용체의 후속 인산화 및 활성화를 검출하기 위한 바이오에세이를 개발하였다. ActRIIA 및 ActRIIB 그리고 액티빈 간 상호작용은 성장 조절, 암 세포의 전이 및 배아 줄기 세포의 분화를 포함하는 다양한 세포 공정의 유도로 이어진다(Tsuchida, K. et al., Cell Commun Signal 7:15(2009)). I형 수용체의 인산화 및 활성화는 SMAD 2 및 3 단백질의 인산화를 야기하여 활성화된 SMAD 복합체를 형성해서 유전자의 전사 조절로 이어진다.
액티빈 II형 수용체에 대한 액티빈 결합을 통해 SMAD 복합체 신호 전달 경로의 활성화를 검출하기 위해, 인간 A204 횡문근육종 세포주(ATCC, # HTB-82)를 Smad 2/3-루시퍼라제 리포터 플라스미드(CAGAx12-Luc; Dennler, 1998)로 전달감염하여 A204/CAGAx12-Luc 세포주를 생성하였다. A204/CAGAx12-Luc 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS), 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 및 250 ㎍/mL의 G418로 보강된 McCoy's 5A(Irvine Scientific, # 9090) 중에 유지하였다. 바이오에세이를 위해, A204/CAGAx12-Luc 세포를 저혈청 배지, 0.5% FBS 및 OPTIMEM(Invitrogen, #31985-070) 중 10,000 세포/웰로 96-웰 분석 플레이트 상에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 리간드 용량 반응을 결정하기 위해, 액티빈 A(R&D Systems, #338-AC), 액티빈 B(R&D Systems, #659-AB), 액티빈 AB(R&D Systems, #1066-AB) 및 액티빈 AC(R&D Systems, #4879-AC/CF)를 100부터 0.002 nM까지 1:3으로 연속 희석하고 액티빈을 함유하지 않는 대조군과 함께 시작하여 세포에 첨가하였다. 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 및 액티빈 AC가 A204/CAGAx12-Luc 세포주를 각각 EC50 값 99 pM, 47 pM, 19 pM, 및 4.4 nM로 활성화함을 관찰하였다. 억제를 측정하기 위해, 적절한 이소형 대조군 항체를 함유하거나 항체를 함유하지 않는 대조군 샘플을 포함하여 100부터 0.002 nM까지, 1000부터 0.02 nM까지, 또는 300부터 0.005 nM까지 항체를 1:3으로 연속 희석하고, 일정한 농도의 100 pM 액티빈 A, 50 pM 액티빈 B, 30 pM 액티빈 AB 또는 4 nM 액티빈 AC와 함께 세포에 첨가하였다. 또한 상기 분석에서 양성 차단 대조군으로 대조군 4를 이용하였다(ActRIIB-hFc; 서열번호 227). 37℃ 및 5% CO2에서 5.5 시간 인큐베이션 후, OneGlo 기질(Promega, # E6051)을 첨가한 뒤 루시퍼라제 활성을 Victor X(Perkin Elmer) 기기를 이용해서 검출하였다. 결과를 Prism 5 소프트웨어(GraphPad)로 비선형 회귀(4-파라미터 로지스틱)를 이용해서 분석하였다.
표 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항-액티빈 A 항체는 100 pM의 액티빈 A를 39 pM 내지 3.5 nM 범위의 IC50 값으로 차단한 반면, 대조군 1는 83 pM의 IC50 값으로 차단하였다. 본 발명의 항-액티빈 A 항체의 하위세트를 액티빈 B, AB, 및 AC의 차단에 대해 시험하였다. 시험된 9 개의 항체 중 4 개가 50 pM의 액티빈 B를 130 pM 내지 100 nM 범위의 IC50 값으로 차단하였다. 액티빈 B 차단에 대해 시험된 본 발명의 5 개 항체는 높은 항체 농도에서만 차단한 반면, 대조군 1은 임의의 측정 가능한 액티빈 B 차단을 나타내지 않았다. 시험한 본 발명의 8 개의 항체는 30 pM의 액티빈 AB를 100 pM 내지 8.2 nM 범위의 IC50 값으로 차단한 반면, 대조군 4는 540 pM의 IC50 값으로 차단하였다. 하나의 항체, H4H10423P는 액티빈 AB의 약한 차단만을 나타내었다. 시험된 8 개의 항체 중 7 개는 4 nM의 액티빈 AC를 580 pM 내지 6.5 nM 범위의 IC50 값으로 차단한 반면, 대조군 4는 1.1 nM의 IC50 값으로 차단하였다. 하나의 항체, H4H10423P는 액티빈 AC의 임의의 차단을 나타내지 않았다. 마우스 IgG(mIgG 이소형 대조군) 및 인간 IgG(hIgG 이소형 대조군) 음성 대조군은 둘 다 수용체의 리간드 활성화를 차단하지 않았다.
항- 액티빈 A 항체에 의한 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 및 액티빈 AC의 억제(IC 50 [M])
Constant: 액티빈 A 액티빈 B 액티빈 AB 액티빈 AC
항체
H4H10423P 2.0E-10 약한 차단제 비-차단제
H4H10424P 7.6E-10
H4H10426P 2.3E-10
H4H10429P 1.6E-10 7.9E-08 2.9E-10 5.8E-10
H4H10430P 6.1E-11 고농도에서 차단 1.0E-10 9.3E-10
H4H10432P2 1.1E-10 고농도에서 차단 8.0E-10 2.8E-09
H4H10433P2 1.5E-10 1.0E-07
H4H10436P2 2.0E-10 1.3E-10 1.4E-10 1.3E-09
H4H10437P2 2.9E-10 고농도에서 차단
H4H10438P2 2.6E-10
H4H10440P2 2.8E-10 5.2E-09 4.3E-10 7.5E-10
H4H10442P2 5.6E-11 2.2E-09 6.5E-09
H4H10445P2 5.3E-11
H4H10446P2 4.7E-11 고농도에서 차단 8.2E-09 5.6E-09
H4H10447P2 7.8E-11
H4H10448P2 4.6E-11
H4H10452P2 5.8E-11
H4H10468P2 3.9E-11 고농도에서 차단 2.3E-09 3.4E-09
H2aM10965N 3.5E-09
mIgG 이소형 대조군 비-차단제
hIgG 이소형 대조군 비-차단제 비-차단제 비-차단제 비-차단제
대조군 1 8.3E-11 비-차단제 5.4E-10 1.1E-09
A204/CAGAx12-Luc 세포를 이용한 바이오에세이를 또한 GDF8(R&D Systems, Cat # 788-G8/CF) 및 GDF11(R&D Systems, Cat # 1958-GD-010/CF)에 의해 자극할 수 있었다. 액티빈 A 항체를 이용한 이들 리간드의 기능적 억제를 시험하기 위해, 상술된 조건 하에 그러나 리간드 활성화에 대해 GDF8 또는 GDF11을 치환하여 분석을 수행하고, 각각 188 pM 및 84 pM의 EC50 값을 생성하였다. 상기 분석에서, 일정한 농도의 0.50 nM GDF8 또는 0.40 nM GDF11에 의한 활성화는 각각 298 pM 및 214 pM의 IC50 값으로 대조군 4에 의해 완전 차단되었다. 이러한 동일한 일정 농도의 리간드를 이용해서, 최대 100 nM의 항체를 시험했을 때, 액티빈 A 항체, H4H10446P2 및 H4H10430P에 의해 GDF8 또는 GDF11의 억제는 관찰되지 않았다. 다른 날, 액티빈 A 항체 H4H10429P 및 H4H10436P2를 일정한 농도의 250 pM GDF8 또는 250 pM GDF11의 존재 하에 상기 분석에서 억제에 대해 시험하였고, 최대 150 nM의 시험된 액티빈 A 항체와 세포의 인큐베이션 후 억제는 관찰되지 않았다; 상기 분석에서 GDF8 및 GDF11 단독은 각각 124 pM 및 166 pM의 EC50 값을 나타내었다. 이들 데이터는 액티빈 A 항체 H4H10446P2, H4H10430P, H4H10429P 및 H4H10436P2가 GDF8 또는 GDF11을 기능적으로 억제하지 않음을 나타낸다.
실시예 7. 액티빈 A 항체를 이용한 골격 근육 비대의 자극
미오스타틴-특이적 길항제, 항-GDF8 항체 H4H1657N2(US 2011-0293630 A1 참고), 또는 H4H1657N2 및 상이한 항-액티빈 A 항체 조합의 투여에 의해 유도된 골격 근육 비대를 CB17 SCID 마우스에서 평가하였다. 이소형-매칭된 대조군 항체를 이용한 치료 대비 비대 정도를 측정하였다. 또한 C-말단 인간 IgG1 Fc 도메인(대조군 4, 서열번호 227)을 포함하여 생성된 인간 ActRIIB의 세포외 도메인을 이용한 치료가 본 연구에 포함되었다. 대조군 4는 이전에 생체내 근육 비대를 유도하고, 또한 다중 TGF-베타 패밀리 멤버 리간드에 결합하고 그 활성을 차단하는 것으로 나타났다(Souza, TA et al. Mol Endocrinol 22:2689-702(2008); Lee, SJ et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 102(50):18117-22(2005)).
총 8 개의 본 발명의 항-액티빈 A 항체 및 대조군 1을 이소형 대조군, 대조군 4, H4H1657N2 단독, 또는 대조군 2(US 2010/0272734 A1에 기재된 항체 MOR08159의 VH/VL을 갖는 항-액티빈 RIIB 항체) 처리군과 대비하여, 8 개 연구에서 H4H1657N2와의 조합으로 또는 단독으로 시험하였다. 연구를 위해, 대략 10 주령의 웅성 CB17 SCID 마우스(Taconic, #CB17SC-M)를 5 마리 마우스씩의 6 개 군으로 체중에 따라 균일하게 구분하였다. 마우스 군을 각 연구에서 표 13에 기재된 바와 같이 처리하였다.
생체내 근육 비대 연구에서 시험된 항체 및 대조군
연구 # 시험된 샘플 투여량 1 투여량 1의 투여 간격 투여량 2 투여량 2의 투여 간격
1 이소형 대조군 10 mg/kg 0, 3, 및 7 일 8 mg/kg 14 일
H4H1657N2 10 mg/kg 0, 3, 및 7 일 8 mg/kg 14 일
대조군 4 10 mg/kg 0, 3, 및 7 일 8 mg/kg 14 일
H4H10423P + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 및 7 일 8 mg/kg + 8 mg/kg 14 일
H4H10432P2 + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 및 7 일 8 mg/kg + 8 mg/kg 14 일
H4H10442P2 + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 및 7 일 8 mg/kg + 8 mg/kg 14 일
2 이소형 대조군 10 mg/kg 0, 3, 및 7 일 8 mg/kg 14 일
H4H1657N2 10 mg/kg 0, 3, 및 7 일 8 mg/kg 14 일
대조군 4 10 mg/kg 0, 3, 및 7 일 8 mg/kg 14 일
H4H10429P + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 및 7 일 8 mg/kg + 8 mg/kg 14 일
H4H10436P2 + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 및 7 일 8 mg/kg + 8 mg/kg 14 일
H4H10440P2 + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 및 7 일 8 mg/kg + 8 mg/kg 14 일
3 이소형 대조군 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일 N/A
H4H1657N2 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
대조군 4 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10446P2 + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10430P + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
4 이소형 대조군 25 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일 N/A
H4H1657N2 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10430P 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10430P + H4H1657N2 2 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10430P + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10430P + H4H1657N2 25 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
5 이소형 대조군 25 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일 N/A
H4H1657N2 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10446P2 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10446P2 + H4H1657N2 2 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10446P2 + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10446P2 + H4H1657N2 25 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
6 이소형 대조군 10 mg/kg 0, 3, 7, 14, 및 21 일 N/A
H4H1657N2 10 mg/kg 0, 3, 7, 14, 및 21 일
대조군 4 10 mg/kg 0, 3, 7, 14, 및 21 일
대조군 1 10 mg/kg 0, 3, 7, 14, 및 21 일
대조군 1 + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 14, 및 21 일
7 이소형 대조군 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일 N/A
대조군 4 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
대조군 2 25 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10430P + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10446P2 + H4H1657N2 10 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
8 이소형 대조군 25 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일 N/A
H4H1657N2 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
대조군 4 25 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
대조군 2 25 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10423P + H4H1657N2 25 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
H4H10430P + H4H1657N2 25 mg/kg + 10 mg/kg 0, 3, 7, 및 14 일
연구 1-5, 7, 및 8에 있어서, 항체 및 대조군 4를 실험 첫 주 동안(0 및 3 일) 10 mg/kg 용량의 각 단백질을 2 회 그리고 두 번째 주 동안(7 일) 10 mg/kg 용량의 각 단백질을 1 회 피하 투여하였다. 세 번째 주 동안(14 일) 최종 용량의 항체 또는 대조군 4를 연구 #1 및 #2에 대해 8 mg/kg으로 그리고 연구 #3 - #8에 대해 10 mg/kg으로 피하 투여하였다(표 13). 21 일에, 마우스를 안락사시키고, 각 마우스에 대한 총 체중을 측정하였다. 연구 6을 위해, 항체를 이전 연구 1-5에 대해 투여하였지만, 치료를 21 일에 추가 주사를 포함하여 28 일로 연장하였다. 각 마우스로부터 앞 정강근(TA) 및 장딴지근(GA) 근육을 박리하고 칭량하였다. 조직 중량을 시작 체중으로 정규화하고, 이소형 대조군 항체 처리군의 평균 체중에 비해 체중의 평균 변화 백분율을 계산하였다. 표 14-21에 요약된 결과를 이소형 대조군 대비 평균 증가 백분율 ± 평균의 표준 오차로 표시한다.
이소형 대조군 처리 대비 체중 및 근육 중량의 변화 백분율, 연구 1
이소형 대조군 H4H1657N2 대조군 4 H4H10423P + H4H1657N2 H4H10432P2 +
H4H1657N2		 H4H10442P2 +
H4H1657N2
용량 10 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg + 10 mg/kg 10 mg/kg +
10 mg/kg		 10 mg/kg +
10 mg/kg
체중 0.00 ± 0.91 10.99 ± 0.48 18.45 ± 0.89 13.36 ± 1.10 12.84 ± 0.98 12.09 ± 0.78
TA 근육 0.00 ± 1.15 19.54 ± 2.67 45.80 ± 1.47 32.03 ± 2.12 24.83 ± 2.95 40.76 ± 2.59
GA 근육 0.00 ± 0.89 26.46 ± 3.63 31.91 ± 1.40 27.58 ± 1.61 26.39 ± 1.87 30.62 ± 2.32
표 14에 나타낸 바와 같이, 제1 연구에서, 대조군 4는 검사된 모든 근육에서 유의미한 비대를 유도하였고, 이소형 대조군 처리 마우스 대비 TA에서 45.80 ± 1.47%, 및 GA 중량에서 31.91 ± 1.4% 증가를 가졌다. H4H1657N2만을 이용한 처리도 TA(19.54 ± 2.67% 증가) 및 GA(26.46 ± 3.63% 증가) 근육 중량에서 비대를 유도하였지만, 대조군 4 보다 덜 유효하였다. H4H1657N2 + H4H10442P2의 조합은 대조군 4로 처리한 마우스에 비해 평균 TA(40.76 ± 2.59%) 및 GA(30.62 ± 2.32%) 근육 중량에서 유사한 증가를 유도하였다. 조합 처리 H4H1657N2/H4H10423P 및 H4H1657N2/H4H10432P2는 H4H16757N2/H4H10442P 또는 대조군 4 처리에 의해 유도된 것만큼 큰 평균 TA 중량 증가를 유도하지 않았다.
이소형 대조군 처리 대비 체중 및 근육 중량의 변화 백분율, 연구 2
이소형 대조군 H4H1657N2 대조군 4 H4H10429P + H4H1657N2 H4H10436P2 +
H4H1657N2		 H4H10440P2 +
H4H1657N2
용량 10 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg + 10 mg/kg 10 mg/kg +
10 mg/kg		 10 mg/kg +
10 mg/kg
체중 0.00 ± 2.53 4.12 ± 2.19 11.22 ± 1.71 7.17 ± 1.57 7.89 ± 0.37 1.89 ± 1.39
TA 근육 0.00 ± 3.59 16.70 ± 2.73 43.47 ± 2.37 34.14 ± 2.55 29.31 ± 1.59 14.55 ± 2.22
GA 근육 0.00 ± 3.54 18.54 ± 3.48 29.24 ± 2.22 26.24 ± 3.11 26.55 ± 2.41 15.65 ± 2.66
표 15에 나타낸 바와 같이, 제2 연구에서, 대조군 4는 검사된 모든 근육에서 비대를 유도하였고, 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 평균 TA 중량의 43.47 ± 2.37% 및 GA 평균 근육 중량의 29.24 ± 2.22% 증가를 가졌다. 상기 연구에서, H4H1657N2만을 이용한 처리도 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 TA 및 GA 평균 근육 중량 증가(각각 16.7 ± 2.73% 및 18.54 ± 3.48%)를 유도하였지만, 이들 평균 증가는 대조군 4 처리군에 대해 관찰된 것보다 작았다. 조합 처리 H4H1657N2/H4H10429P 및 H4H1657N2/H4H10436P2는 평균 TA(각각 34.14 ± 2.55% 및 29.31 ± 1.59%) 및 평균 GA(각각 26.24 ± 3.11% 및 26.55 ± 2.41%) 증가를 유도하였고, 그 증가는 H4H1657N2 또는 대조군 4만으로 관찰된 증가 사이에 있었다. 조합 H4H1657N2/H4H10440P2는 상기 연구에서 다른 두 조합에 의해 또는 대조군 4 처리에 의해 유도된 것만큼 높은 TA 또는 GA 평균 중량의 증가를 유도하지 않았다.
이소형 대조군 처리 대비 체중 및 근육 중량의 변화 백분율, 연구 3
이소형 대조군 H4H1657N2 대조군 4 H4H10446P2 +
H4H1657N2		 H4H10430P + H4H1657N2
용량 10 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg + 10 mg/kg 10 mg/kg + 10 mg/kg
체중 0.00 ± 2.00 1.43 ± 1.14 18.92 ± 3.53 10.90 ± 2.51 8.88 ± 1.58
TA 근육 0.00 ± 2.13 14.19 ± 3.19 39.90 ± 3.58 40.01 ± 3.67 28.30 ± 3.27
GA 근육 0.00 ± 1.62 15.73 ± 0.58 34.01 ± 2.87 31.29 ± 2.60 21.55 ± 2.30
표 16에 나타낸 바와 같이, 제3 연구에서, 대조군 4는 검사된 모든 근육에서 비대를 유도하였고, 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 평균 TA 근육 중량의 39.90 ± 3.58% 및 평균 GA 근육 중량의 34.01 ± 2.87% 증가를 가졌다. H4H1657N2만을 이용한 처리도 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 TA(14.19 ± 3.19%) 및 GA 평균 근육 중량(15.73 ± 0.58%) 증가를 유도하였지만, 이러한 평균 증가는 대조군 4 처리군에 대해 관찰된 것보다 작았다. 조합 처리 H4H1657N2/H4H10446P2는 대조군 4로 처리된 마우스에 대해서와 같이 TA(40.01 ± 3.67%) 및 GA(31.29 ± 2.60%) 평균 근육 중량에서 유사한 증가를 유도하였다. H4H1657N2/H4H10430P를 이용한 조합 처리는 TA(28.30 ± 3.27%) 및 GA(21.55 ± 2.30%) 평균 근육 중량의 증가를 유도하였고, 이는 H4H1657N2 단독 또는 H4H1657N2/H4H10446P2 조합 처리로 관찰된 증가 사이에 있었다.
이소형 대조군 처리 대비 체중 및 근육 중량의 변화 백분율, 연구 4
이소형 대조군 H4H1657N2 H4H10430P H4H10430P + H4H1657N2 H4H10430P + H4H1657N2 H4H10430P + H4H1657N2
용량 25 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg 2 mg/kg + 10 mg/kg 10 mg/kg + 10 mg/kg 25 mg/kg + 10 mg/kg
체중 0.00 ± 0.57 9.89 ± 0.98 4.20 ± 1.00 14.53 ± 0.80 12.61 ± 1.81 13.78 ± 1.58
TA 근육 0.00 ± 3.04 21.05 ± 2.64 7.83 ± 2.74 39.02 ± 3.55 40.20 ± 2.48 44.92 ± 5.70
GA 근육 0.00 ± 2.71 22.85 ± 2.28 8.86 ± 1.24 27.57 ± 1.26 22.46 ± 5.03 30.22 ± 2.97
표 17에 나타낸 것과 같이, 제4 연구에서, H4H1657N2는 검사된 근육에서 비대를 유도하였고, 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 평균 TA 근육 중량의 21.05 ± 2.64% 및 평균 GA 근육 중량의 22.85 ± 2.28% 증가를 가졌다. 상기 연구에서, H4H10430P만을 이용한 처리도 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 근육 중량이 약간 증가하였지만, 값은 통계적으로 유의미하지 않았다. 각각 10 mg/kg 및 2 mg/kg의 H4H1657N2 및 H4H10430P의 조합 처리는 H4H1657N2 또는 H4H10430P만으로 관찰된 것보다 TA 근육에서 더 큰 TA(39.02 ± 3.55%) 및 GA(27.57 ± 1.26%) 평균 근육 중량 증가를 유도하였다. 각각 10 mg/kg 및 10 mg/kg의 H4H1657N2 및 H4H10430P의 조합 처리는 H4H1657N2 및 H4H10430P만으로 관찰된 것보다 TA 근육에서 더 큰 TA(40.20 ± 2.48%) 및 GA(22.46 ± 5.03%) 평균 근육 중량 증가를 유도하였다. 각각 10 mg/kg 및 25 mg/kg의 H4H1657N2 및 H4H10430P의 조합 처리는 H4H1657N2 및 H4H10430P만으로 관찰된 것보다 TA 근육에서 더 큰 TA(44.92 ± 5.70%) 및 GA(30.22 ± 2.97%) 평균 근육 중량 증가를 유도하였다.
이소형 대조군 처리 대비 체중 및 근육 중량의 변화 백분율, 연구 5
이소형 대조군 H4H1657N2 H4H10446P2 H4H10446P2 + H4H1657N2 H4H10446P2 + H4H1657N2 H4H10446P2 + H4H1657N2
용량 25 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg 2 mg/kg + 10 mg/kg 10 mg/kg + 10 mg/kg 25 mg/kg + 10 mg/kg
체중 0.00 ± 1.23 10.94 ± 1.03 0.29 ± 1.33 14.26 ± 1.45 12.61 ± 1.26 16.31 ± 2.04
TA 근육 0.00 ± 2.20 25.40 ± 1.35 3.70 ± 1.67 51.29 ± 4.20 49.64 ± 4.08 49.79 ± 5.46
GA 근육 0.00 ± 2.92 22.82 ± 1.97 2.70 ± 1.06 39.24 ± 3.08 35.56 ± 3.39 35.14 ± 3.49
표 18에 나타낸 바와 같이, 제5 연구에서, H4H1657N2는 검사된 근육에서 비대를 유도하였고, 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 평균 TA 근육 중량의 25.4 ± 1.35% 및 평균 GA 근육 중량의 22.82 ± 1.97% 증가를 가졌다. 상기 연구에서, H4H10446P2만을 이용한 처리는 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 평균 TA 근육 중량의 3.70 ± 1.67% 및 평균 GA 근육 중량의 2.70 ± 1.06% 증가를 가지며 저수준의 근육 비대를 유도하였다. 각각 10 mg/kg 및 2 mg/kg의 H4H1657N2 및 H4H10446P2의 조합 처리는 H4H1657N2 또는 H4H10446P2만으로 관찰된 것보다 큰 TA(51.29 ± 4.20%) 및 GA(39.24 ± 3.08%) 평균 근육 중량 증가를 유도하였다. 각각 10 mg/kg 용량의 H4H1657N2 및 H4H10446P2의 조합 처리는 H4H1657N2 또는 H4H10446P2만으로 관찰된 것보다 큰 TA(49.64 ± 4.08%) 및 GA(35.56 ± 3.39%) 평균 근육 중량 증가를 유도하였다. 각각 10 mg/kg 및 25 mg/kg의 H4H1657N2 및 H4H10446P2의 조합 처리는 H4H1657N2 또는 H4H10446P2만으로 관찰된 것보다 큰 TA(49.79 ± 5.46%) 및 GA(35.14 ± 3.49%) 평균 근육 중량 증가를 유도하였다.
이소형 대조군 처리 대비 체중 및 근육 중량의 변화 백분율, 연구 6
이소형 대조군 대조군 4 H4H1657N2 대조군 1 대조군 1 1 + H4H1657N2
용량 10 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg 10 mg/kg + 10 mg/kg
체중 0.00 ± 0.51 17.04 ± 2.90 8.92 ± 1.26 3.52 ± 0.86 15.84 ± 0.75
TA 근육 0.00 ± 2.15 47.34 ± 2.63 17.21 ± 2.97 4.54 ± 2.25 30.06 ± 5.51
GA 근육 0.00 ± 1.71 32.17 ± 3.81 21.57 ± 1.90 2.72 ± 1.30 30.72 ± 3.64
표 19에서 나타낸 바와 같이, 제6 연구에서, 대조군 4는 검사된 모든 근육에서 비대를 유도하였고, 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 평균 TA 근육 중량의 47.34 ± 2.63% 및 GA 평균 근육 중량의 32.17 ± 3.81% 증가를 가졌다. 상기 연구에서, H4H1657N2만을 이용한 처리도 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 각각 TA 및 GA 평균 근육 중량 17.21 ± 2.97% 및 21.57 ± 1.90% 증가를 유도하였지만, 이들 평균 증가는 대조군 4 처리군에 대해 관찰된 것보다 작았다. 상기 연구에서, 대조군 1만을 이용한 처리는 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 평균 TA 근육 중량의 4.54 ± 2.25% 및 평균 GA 근육 중량의 2.72 + 1.30% 증가를 갖는 저수준의 근육 비대를 유도하였다. 각각 10 mg/kg 및 10 mg/kg H4H1657N2 및 대조군 1의 조합 처리는 H4H1657N2 또는 대조군 1만으로 관찰된 것보다 큰 TA(30.06 ± 5.51%) 및 GA(30.72 ± 3.64%) 평균 근육 중량 증가를 유도하였다.
이소형 대조군 처리 대비 체중 및 근육 중량의 변화 백분율, 연구 7
이소형 대조군 대조군 4 대조군 2 H4H10430P + H4H1657N2 H4H10446P2 + H4H1657N2
용량 10 mg/kg 10 mg/kg 25 mg/kg 10 mg/kg + 10 mg/kg 10 mg/kg + 10 mg/kg
체중 0.00 ± 0.90 8.17 ± 3.30 19.18 ± 1.75 10.55 ± 1.48 11.67 ± 0.98
TA 근육 0.00 ± 2.30 34.43 ± 5.92 36.75 ± 3.88 33.13 ± 2.02 41.28 ± 2.76
GA 근육 0.00 ± 2.01 14.86 ± 3.65 26.41 ± 3.16 22.82 ± 1.34 29.21 ± 2.62
표 20에서 나타낸 바와 같이, 제7 연구에서, 대조군 4는 검사된 모든 근육에서 비대를 유도하였고, 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 평균 TA 중량의 34.43 ± 5.92% 및 GA 평균 근육 중량의 14.86 ± 3.65% 증가를 가졌다. 상기 연구에서, 대조군 2만을 이용한 치료는 검사된 근육에서 비대를 유도하였고, 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 평균 TA 중량의 36.75 ± 3.88% 및 GA 평균 근육 중량의 26.41 ± 3.16% 증가를 가졌다. 각각 10 mg/kg 및 10 mg/kg의 H4H1657N2 및 H4H10430P 조합 처리는 TA(33.13 ± 2.02%) 및 GA(22.82 ± 1.34%) 평균 근육 중량 증가를 유도하였고, 이는 ActRIIB-Fc 단독 및 대조군 2 단독에 대해 관찰된 증가 사이에 있었다. 각각 10 mg/kg 및 10 mg/kg의 H4H1657N2 및 H4H10446P2의 조합 처리는 TA(41.28 ± 2.76%) 및 GA(29.21 ± 2.62%) 평균 근육 중량 증가를 유도하였다.
이소형 대조군 처리 대비 체중 및 근육 중량의 변화 백분율, 연구 8
이소형 대조군 대조군 4 H4H1657N2 대조군 2 H4H10423P + H4H1657N2 H4H10430P + H4H1657N2
용량 25 mg/kg 25 mg/kg 10 mg/kg 25 mg/kg 25 mg/kg + 10 mg/kg 25 mg/kg + 10 mg/kg
체중 0.00 ± 0.64 19.81 ± 0.90 8.64 ± 1.30 21.56 ± 1.29 10.45 ± 1.40 15.45 ± 1.18
TA 근육 0.00 ± 2.72 53.74 ± 5.31 18.44 ± 2.30 39.90 ± 1.69 36.33 ± 3.67 43.83 ± 1.56
GA 근육 0.00 ± 0.76 39.39 ± 4.56 21.17 ± 1.72 25.87 ± 2.72 28.18 ± 3.11 31.24 ± 1.90
표 21에서 나타낸 바와 같이, 제8 연구에서, 대조군 4는 검사된 모든 근육에서 비대를 유도하였고, 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 평균 TA 중량의 53.74 ± 5.31% 및 GA 평균 근육 중량의 39.39 ± 4.56% 증가를 가졌다. 상기 연구에서, H4H1657N2만을 이용한 처리는 또한 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 각각 18.44 ± 2.30% 및 21.17 ± 1.72%의 TA 및 GA 평균 근육 중량 증가를 유도하였지만, 이들 평균 증가는 대조군 4 처리군에 대해 관찰된 것보다 작았다. 상기 연구에서, 대조군 2만을 이용한 처리는 검사된 근육에서 비대를 유도하였고, 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 평균 TA 중량의 39.90 ± 1.69% 및 GA 평균 근육 중량의 25.87 ± 2.72% 증가를 가졌다. 각각 10 mg/kg 및 25 mg/kg의 조합 처리 H4H1657N2 및 H4H10423P는 이소형 대조군 처리 마우스에 비해 TA(36.33 ± 3.67%) 및 GA(28.18 ± 3.11%) 평균 근육 중량 증가를 유도하였다. 각각 10 mg/kg 및 25 mg/kg의 조합 처리 H4H1657N2 및 H4H10430P는 TA(43.83 ± 1.56%) 및 GA(31.24 ± 1.90%) 평균 근육 중량 증가를 유도하였고, 이는 대조군 4 단독 및 대조군 2 단독에 대해 관찰된 증가 사이에 있었다.
이들 연구는 미오스타틴 억제제와 항-액티빈 A 항체의 투여가 시험된 용량 및 주사 빈도에서 미오스타틴 억제제만을 이용한 처리보다 유의미하게 더 큰 정도로 골격 근육 비대를 추가로 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 8. 액티빈 A 항체를 이용한 액티빈 A 결합의 차단
액티빈 A와 그 수용체, ActRIIB 및 ActRIIA뿐만 아니라 그 내인성 길항제, 폴리스타틴의 상호작용을 차단하는 선택된 항-액티빈 A 항체의 능력을 Biacore 3000 기기를 이용해서 결정하였다. 상기 실험을 위해, 대조군 4(C-말단 인간 Fc 태그와 함께 발현된 인간 ActRIIB(서열 목록: 227)), C-말단 인간 Fc 태그와 함께 발현된 인간 ActRIIA(hActRIIA-Fc; R&D Systems, # 340-R2-100), 또는 폴리스타틴-288(R&D Systems, #5836-FS-025)을 Biacore CM5 센서 표면으로 아민-커플링하였다. 단독으로 또는 최종 농도 60 nM(액티빈 A 대비 12-배 몰 농도 과량)의 액티빈 A 항체, hActRIIA-Fc, hActRIIB-Fc, 또는 이소형 대조군 항체와 혼합된 최종 농도 5 nM의 액티빈 A(R&D Systems, #338-AC)를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 항체-액티빈 A 혼합물을 20 uL/분의 유속에서 아민 커플링된 대조군 4, hActRIIA-Fc, 또는 폴리스타틴-288 표면에 걸쳐 주사하였다. 결합 신호(RU)를 주사 개시 후 150 초에 측정하였고, 상기 신호에서 음성 대조군 참조 표준에 대해 측정된 RU 값을 빼서 특이적 결합 신호를 결정하였다. 각각의 항-액티빈 A 항체의 존재 하에 수용체 또는 길항제 표면에 걸친 자유 액티빈 A 결합 백분율을 관찰된 특이적 결합 신호를 항체의 부재 하에 5 nM 액티빈 A로부터의 특이적 결합 신호로 나눈 비로 계산하였다.
항- 액티빈 A 항체에 의한 폴리스타틴으로의 액티빈 A 결합의 차단
폴리스타틴-288 표면(3000RU 포획됨)-액티빈 A(억제제 없이 결합된 RU%)에 대해 정규화됨
mAb/단백질 농도(nM) H4H10442P2 H4H10446P2 H4H10430P H4H10440P2 H4H10429P H4H10436P2 H4H10423P 대조군 1 대조군 3 hActRIIA-hFc 대조군 4(hActRIIB-hFc) 이소형(-) 대조군
0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
0.94 73 77 79 76 97 78 120 83 172 156 169 100
1.88 46 54 59 57 80 61 122 68 170 148 163 102
3.75 6 7 15 17 20 16 103 27 145 138 151 97
7.5 3 3 1 4 1 1 97 0 33 116 120 102
15 3 3 1 2 1 1 96 1 5 60 43 102
30 3 3 1 1 2 2 94 1 7 11 1 104
60 3 3 1 0 3 2 93 2 9 13 1 103
표 22에 나타낸 바와 같이, 시험된 7개의 본 발명의 항-액티빈 A 항체 중 6 개 및 대조군 1 및 대조군 3 둘 다 폴리스타틴-288에 대한 액틴 A의 결합을 차단하였다. 본 발명의 하나의 항체, H4H10423P는, 폴리스타틴-288에 대한 액틴 A의 결합을 방지하지 않았다. 대조군 4 및 hActRIIA-Fc는 더 높은 농도에서 폴리스타틴-288에 대한 액틴 A의 결합을 차단하였다.
항- 액티빈 A 항체에 의한 hActRIIA - Fc로의 액티빈 A 결합의 차단
g hActRIIA-hFc 표면(8000RU 포획됨)-액티빈 A(억제제 없이 결합된 RU%)에 대해 정규화됨
mAb/단백질 농도(nM) H4H10442P2 H4H10446P2 H4H10430P H4H10440P2 H4H10429P H4H10436P2 H4H10423P 대조군 1 대조군 3 hActRIIA-hFc 대조군 4(hActRIIB-hFc) 이소형(-) 대조군
0.00 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
0.94 114 111 81 75 87 75 112 82 207 236 276 109
1.88 114 115 62 52 66 55 114 66 190 222 266 112
3.75 95 85 19 17 19 16 111 28 139 188 231 110
7.50 105 94 3 6 1 2 110 1 32 128 160 115
15 113 108 2 4 1 2 112 1 1 50 51 116
30 117 98 2 3 1 2 114 1 1 5 2 118
60 118 118 2 3 1 2 116 2 0 3 1 119
표 23에 나타낸 바와 같이, 시험된 7개의 본 발명의 항-액티빈 A 항체 중 4 개 및 대조군 1 및 대조군 3 둘 다 액티빈 A에 대한 hActRIIA-Fc의 결합을 차단하였다. 본 발명의 3 개의 항체, H4H10442P2, H4H10446P2, 및 H4H10423P는, 액티빈 A의 hActRIIA-Fc에 대한 결합을 방지하지 않았다. 대조군 4 및 hActRIIA-Fc는 hActRIIA-Fc에 대한 액티빈 A의 결합을 차단하였다.
항- 액티빈 A 항체에 의한 hActRIIB - Fc로의 액티빈 A 결합의 차단
hActRIIB-hFc(대조군 4) 표면(4000RU 포획됨)-액티빈 A(억제제 없이 결합된 RU%)에 대해 정규화됨
mAb/단백질 농도(nM) H4H10442P2 H4H10446P2 H4H10430P H4H10440P2 H4H10429P H4H10436P2 H4H10423P 대조군 1 대조군 3 hActRIIA-hFc 대조군 4(hActRIIB-hFc) 이소형(-) 대조군
0.00 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
0.94 110 107 80 79 87 80 93 85 135 131 149 105
1.88 106 105 62 58 67 60 78 69 133 129 148 105
3.75 88 76 20 19 19 19 47 31 120 127 144 104
7.50 103 95 4 7 2 3 42 2 33 113 130 107
15 115 115 3 4 2 2 42 2 2 56 51 110
30 122 89 3 4 2 3 41 2 1 5 3 111
60 124 129 3 4 3 4 41 3 2 5 2 115
표 24에 나타낸 바와 같이, 시험된 7개의 본 발명의 항-액티빈 A 항체 중 4 개 및 대조군 1 및 대조군 3 둘 다 hActRIIB-Fc에 대한 액티빈 A의 결합을 차단하였다. 본 발명의 2 개의 항체, H4H10442P2 및 H4H10446P2는, hActRIIB-Fc에 대한 액티빈 A의 결합을 방지하지 않았다. 본 발명의 하나의 항체, H4H10423P는, 시험한 더 높은 농도의 항체에서 hActRIIB-Fc에 대한 액티빈 A의 결합을 부분 차단하는 능력을 나타내었다. hActRIIB-Fc 및 hActRIIA-Fc는 둘 다 hActRIIB-Fc에 대한 액티빈 A의 결합을 차단하였다.
실시예 9. 근육 질량 및 운동 수행에 대한 H4H1657N2의 효과
근육 질량 및 운동 수행에 대한 항-GDF8 항체 H4H1657N2의 효과를 노령 웅성 C57BL/6 마우스(19 개월령)에서 평가하였다.
마우스를 21 일 동안 주 2 회(6 회 주사) 피하 용량의 H4H1657N2 또는 이소형 대조군 항체(10 mg/kg)를 수여받는 좌위군 또는 운동군의 4 개 군(n=6-8/군)으로 무작위화하였다. 운동군의 마우스를 10 m/분으로 5°경사를 갖는 Exer 6M 트레드밀(Columbus Instruments, Columbus, OH) 상에서 20 분으로 구성된 하루 1 회의 훈련 세션이 관여되는 운동 방식에, 3 주 연속해서 주 5 일 배치하였다. 3 주 처리 말기에, 트레드밀 탈진 시험을 이용하여 모든 4 개 군에서 지구력을 측정하였다. 데이터는 2-웨이 ANOVA에 이어 Tukey HSD 테스트로 분석하였다. 근육 중량은 정규화된 중량으로 보고하였다(즉, 근육 중량을 실험 시작 시 측정된 체중에 대해 정규화하였음). 사두 근육에 대한 결과를 이소형 대조군 항체군 대비 각 군에 대한 평균 변화%(± 평균의 표준 오차)로 표 25에 제공한다.
사두 근육 중량 변화
이소형 대조군
( 좌위 ) 		H4H1657N2
( 좌위 ) 		이소형 대조군 + 운동 H4H1657N2 + 운동
사두근 중량 0.00 ± 2.72 15.77 ± 2.73 9.85 ± 3.57 17.66 ± 3.24
이소형 대조군으로부터의 변화%. 평균 ± SEM을 나타냄.
표 25에 나타낸 바와 같이, H4H1657N2 처리는 사두 근육 질량에서 유의미한 증가를 가져왔다(두 H4H1657N2 군 모두에 대해 이소형 대조군 대비 p < 0.01 유의성). 뒷다리 근육 군 중량(TA, GA) 증가가 이소형 대조군 항체에 비해 운동(각각 17.4%, 12.5%) 및 좌위(각각 14.1%, 11.6%) 노령 마우스에서 나타났다. 근육 중량의 약간의 증가가 이소형 대조군 항체를 수여받은 운동 및 좌위 노령 마우스에서 관찰되었으나, 이는 통계적으로 유의미하지 않았다(표 25).
운동 지구력에 대한 H4H1657N2 처리 효과를 또한 19 월령 웅성 C57BL/6 마우스에서 검사하였다(표 26).
지구력 시험
이소형 대조군
( 좌위 ) 		H4H1657N2
( 좌위 ) 		이소형 대조군 + 운동 H4H1657N2 + 운동
탈진 시까지 달린 시간(min) 27.94 ± 4.12 28.54 ± 6.10 50.26 ± 8.56 73.23 ± 4.68
탈진 시까지 달린 거리(m) 428.42 ± 71.91 535.99 ± 155.61 930.06 ± 179.78 1366.65 ± 95.91
운동 노령 마우스에서, H4H1657N2도 이소형 대조군에 비해 트레드밀에서 달린 시간(73.2 min 대 50.2 min) 및 거리(1.33 km 대 0.93 km)로 측정되는 지구력의 유의미한 증가를 유도하였다(표 26). 그러나 좌위 마우스에서, H4H1657N2는 이소형 대조군에 비해 지구력을 유의미하게 증가시키지 않았다.
근육 중량 연구에서와 같이, H4H1657N2는 좌위 마우스에서가 아니라 운동 마우스에서만 트레드밀에서 달린 시간 및 거리로 측정되는 지구력의 유의미한 증가를 유도하였다. 이들 결과는 H4H1657N2가 운동 훈련과 조합된 경우, 신체 수행 결과를 증가시킴을 나타낸다.
실시예 10. 마우스에서 골격 근육 질량 및 등척력 상의 H4H1657N2의 효과
H4H1657N2가 골격 근육 비대를 유도하는 능력을 생체내 9 주령 마우스 C57BL/6 마우스에서 평가하였다.
10 또는 30 mg/kg의 반복 피하 용량의 H4H1657N2 또는 이소형 대조군 항체를 3 주 동안 주 2 회 투여하였다(n=6). 21 일 동안의 H4H1657N2 처리는 동일 용량으로 투여된 이소형 대조군을 수여받는 마우스에 비해 각각 4.7 ± 2.3%(n.s.) 및 7.1 ± 1.5%(n.s.)의 체중 증가를 일으켰다. 개별 근육 중량은 이소형 대조군(10 mg/kg & 30 mg/kg)에 비해 하기와 같이 증가하였다: 앞 정강근(19.4 ± 4.9%** & 20.6 ± 1.5%**), 장딴지근: (14.9 ± 2.9%** & 25.3 ± 1.9%***), 및 사두근(17.7 ± 3.6%* & 26.2 ± 3.8%**). (모든 통계는 원 웨이 ANOVA와 Tukey의 포스트 혹 테스트에 의함[* p < .05; ** p < .01; *** p < .001; n.s. = 통계적으로 상이하지 않음]).
앞 정강근(TA) 근육 질량의 증가에는 생체외 등척력 증가가 동반되어, 근육 기능 및 질량을 모두 유지하는 능력을 시사하였다. TA 근육을 절제하여 25℃에서 일정하게 유지된 산소화 락테이트화 링거조에 배치하는 동안 반복 피하 용량의 H4H1657N2 또는 이소형 대조군 항체(3 주 동안 2 주 1 회 10 mg/kg 투여됨, n = 6/군)로 미리 처리된 마우스를 개별 마취하고 이소플루란 기체 하에 유지하였다. 원위 힘줄을 305C 레버 팔(Cambridge Systems)에 묶어둔 동안 TA의 위쪽 말단을 조에 놓인 침지 기둥에 단단히 묶었다. TA를 약간 연신한 뒤 최소 전압에서 1Hz 자극에 의해 생성된 힘을 시험하여 최적 길이를 결정하였다. 힘이 감소되어 이전 위치로 이완될 때까지 TA 근육을 반복해서 연신하고 자극하였다. 이어서 전압을 일련의 1Hz 자극으로 증분씩 증가시켜 최대 힘 출력을 달성하였다. 최적 길이 및 전압이 결정되면, TA 근육을 증가 주파수(40-100Hz)에서 400 밀리초 동안 자극하여 최대 강직력을 결정하였다. TA 근육에 각각의 강직 자극 사이 2 분 휴식기를 주었다.
21 동안 10 mg/kg 및 30 mg/kg 용량으로 이소형 대조군 항체로 처리한 마우스로부터의 TA 근육은 각각 892.6 ± 37 및 906.1 ± 37.8의 평균 피크 강직력을 생성하였다. H4H1657N2로 처리한 마우스로부터의 TA 근육은 각각 1041.3 ± 31.7 및 1003.3 ± 35.7 mN의 평균 피크 강직력을 생성하였다. 이들 힘 값은 이소형 대조군 대비 평균 피크 강직력의 16.7%*(10 mg/kg) 및 10.7% n.s(30 mg/kg) 증가를 나타낸다(도 2a). 피크 강직력에 대한 H4H1657N2 처리의 전반적 약물 효과는 10 mg/kg 및 30 mg/kg 용량(도 2b에 나타낸 10 mg/kg 용량) 둘 다에서 이소형 대조군과 통계적으로 상이하였다. (도 2a: 원 웨이 ANOVA와 Tukey의 포스트 혹 테스트에 의한 통계 분석[* p < .05; n.s. = 통계적으로 상이하지 않음]. 도 2b: 투 웨이 ANOVA 및 Sidaks 포스트 혹 테스트에 의한 통계 분석[p > 0.0001]).
실시예 11. H4H1657N2는 뒷다리 현수 ( HLS )-유도된 위축으로부터의 회복을 개선함
뒷다리 현수(HLS) 유도된 위축 7 일로부터의 회복기 동안 골격 근육 질량 상의 H4H1657N2의 효과를 1 년령 C57BL/6 웅성 마우스에서 평가하였다.
0 일에, 18 마리의 마우스를 꼬리로 매달아 두 뒷다리가 7 일 기간 동안 땅에 닿을 수 없게 하였다. 마우스를 음식 및 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 특수 우리에 수용하였다. 동시에, 6 마리 마우스의 하나의 추가 군을 일반 우리에 놔두고 이것이 대조군(비-HLS 대조군)으로 작용하였다. 7 일에, 현수 마우스를 내리고 HLS 동안 손실 체중의 백분율로 3 개 군(각각 n = 6)으로 무작위화하였다. 7일에, 비-HLS 대조군 및 하나의 HLS 군(HLS 군)으로부터의 근육 중량을 취해서 HLS에 대해 반응하는 위축 백분율을 평가하였다. 나머지 2 개의 HLS 군(각각 n = 6)은 일반 우리에서 8 일(즉, 실험 7 일부터 15 일) 동안 회복하도록 두고, 7 일 및 10 일(즉, 회복 0 일 및 3 일 후)에 10 mg/kg 용량의 H4H1657N2 또는 이소형 대조군으로 피하 처리하였다(각각 HLS + 7Rec + H4H1657N2 및 HLS + 7rec + 이소형 대조군). 15 일(즉, 8 일 회복 후)에, 근육 중량을 취해서 HLS-유도된 위축 후 회복 백분율을 평가하였다.
도 3b에서 알 수 있듯이, 7 일의 HLS는 비-HLS 대조군(각각 -13.7%* 및 -14.8%*)에 비해 앞 정강근(TA) 및 장딴지근(GA)(HLS 군) 모두에서 유의미한 질량 손실을 가져왔다. 8 일 회복 후, HLS + 7rec + 이소형 대조군은 비-HLS 대조군에 비해 TA 및 GA 근육 질량 손실을 유지한 반면(-6.3% 및 -7.5%), HLS + 7Rec + H4H1657N2 군은 비-HLS 대조군에 비해 질량 획득을 나타내었다(4.7% 및 5%).
2 개의 회복군(즉, HLS + 7Rec + H4H1657N2 대 HLS + 7rec + 이소형 대조군)을 비교하면, TA 및 GA 질량에 대한 H4H1657N2의 효과는 이소형 대조군 항체로 나타난 효과와 통계적으로 상이하지 않았다. 그러나 HLS + 7rec + 이소형 대조군의 근육 질량은 HLS 군 또는 비-HLS 대조군과 통계적으로 상이하지 않았으나, HLS + 7Rec + H4H1657N2 군은 HLS 군과 비교될 때 통계적으로 더 큰 TA 및 GA 질량을 가졌다(모든 통계는 원 웨이 ANOVA와 Tukey의 포스트 혹 테스트에 의함[* 비 HLS 대비 p < 0.05; ## HLS 대비 p < 0.01).
실시예 12. 항- 액티빈 A 항체 및 ActRIIB - Fc에 의한 BMP 수용체 I형 및 II 활성화의 억제
뼈 형태형성 단백질(BMPs)은 TGF-β 수퍼패밀리에 속하며, BMP 수용체 I형 및 II형으로 이루어진 세포 표면 상의 수용체 복합체의 활성화에 의한 여러 생리적 공정의 조절에 관여한다. 수용체의 활성화는 SMAD 단백질의 인산화 및 리간드-반응성 유전자의 전사 활성화로 이어진다.
이전에 BMP2에 반응성인 것으로 나타난 마우스 골수 간질 세포주인 W-20-17 세포에서 BMP 신호전달의 조절을 검출하기 위해 바이오에세이를 개발하였다. 세포를 루시퍼라제 리포터를 안정적으로 발현하도록 조작하고(즉, BMP-반응성 요소(BRE(2X)-루시퍼라제-IRES-GFP)), GFP의 고발현에 대해 정렬하였다. 생성된 안정한 세포주를 W-20-17/BRE-luc으로 부르고, 10% FBS, DMEM, Pen/Strep, 및 200 ㎍/ml G418 중에 유지하였다. 이들 세포를 이용해서 BMP 활성화 및 항-액티빈 A 항체 및 ActRIIB-hFc(대조군 4, 서열번호 227)에 의한 상기 활성화의 억제를 측정하였다.
4 개의 항-액티빈 A 항체 및 ActRIIB-hFc가 BMP 신호전달을 억제하는 능력을 W-20-17/BRE-luc 세포주를 이용해서 평가하였다. 바이오에세이를 위해, W-20-17/BRE-luc 세포를 10,000 세포/웰로 96-웰 분석 플레이트 상에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음 날, BMP2, BMP4, BMP6, BMP9 또는 BMP10을 1:3으로 연속 희석하고, 100 nM부터 0.002 nM까지 세포에 첨가하였다(용량 반응을 위한 BMP 비함유 대조군 포함). 항-액티빈 A 항체 또는 ActRIIB-hFc에 의한 BMP의 억제를 위해, 항체 또는 ActRIIB-hFc를 1000 nM부터 0.02 nM까지 1:3으로 연속 희석하고(항체 비함유, 대조군 항체, 또는 ActRIIB-hFc에 대한 음성 대조군(즉, hFc로 태그화된 비관련 단백질 "대조군 단백질" 포함)) 나타낸 바와 같이, 세포에 100 pM BMP2, 100 pM BMP4, 10 nM BMP6, 800 pM BMP9 또는 4 nM BMP10과 함께 첨가하였다. 루시퍼라제 활성을 37℃ 및 5% CO2 중 5.5 시간 인큐베이션 후 Victor X(Perkin Elmer)로 검출하고, 결과를 Prism 5 소프트웨어(GraphPad)로 비선형 회귀(4-파라미터 로지스틱)를 이용해서 분석하였다.
아래 표 27에 나타낸 바와 같이, H4H10446P2 및 H4H10430P는 시험된 임의의 BMP도 억제하지 않은 반면, 시험된 다른 액티빈 A 항체(H4H10429 및 H4H10436P2) 및 ActRIIB-hFc는 모두 일부 BMP의 일부 억제를 나타내었다. H4H10429P는 각각 8.1 nM 및 3.5 nM의 IC50 값으로 BMP9 및 BMP10의 억제를 나타내었으나, BMP2, BMP4 및 BMP6은 억제하지 않았다. H4H10436P2는 항체의 최고 농도에서 BMP2 및 BMP4의 약한 억제 및 > 100 nM의 IC50 값으로 BMP10의 억제를 나타내었으나, BMP6 및 BMP9의 임의 억제를 나타내지 않았다. ActRIIB-hFc는 2 nM 및 1 nM의 IC50 값으로 BMP9 및 BMP10의 억제를 나타내었지만, BMP2, BMP4, 및 BMP6은 억제하지 않았다. 대조군 분자(즉, 이소형 대조군 항체(대조군 mAb) 및 hFc로 태그화된 비관련 단백질(대조군 단백질)) 어느 것도 임의의 BMP를 억제하는 것으로 나타나지 않은 반면, BMP2, BMP4, BMP6, BMP9, 또는 BMP10 단독(즉, 항체 또는 hFc-태그화된 단백질이 없음)은 각각 34 pM, 63 pM, 4.5 nM, 260 pM, 및 2.5 nM의 EC50 값으로 W-20-17/BRE-luc 세포를 활성화하였다.
W-20-17/ BRE -luc 세포에서 BMP의 항- 액티빈 A 항체 및 ActRIIb -hFc에 의한 억제
리간드 BMP2 BMP4 BMP6 BMP9 BMP10
EC50 [M] 3.4E-11 6.3E-11 4.5E-09 2.6E-10 2.5E-09
일정 BMP 100pM 100pM 10nM 800pM 4nM
항체 IC50 [M] IC50 [M] IC50 [M] IC50 [M] IC50 [M]
H4H10446P2 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음
H4H10430P 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음
H4H10429P 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음 8.1E-09 3.5E-09
H4H10436P2 약함(1uM에서 31% 억제) 약함(1uM에서 51% 억제) 억제하지 않음 억제하지 않음 > 1.0E-07
ActRIIB -hFc 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음 2.0E-09 1.0E-09
대조군 mAb 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음
대조군 단백질 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음 억제하지 않음
실시예 13. 항- 액티빈 A 항체 H4H10446P2를 이용한 처리는 생체내 신장 섬유증을 감소시킴
신장 섬유증에 대한 본 발명의 특정한 항-액티빈 A 항체, H4H10446P2의 효과를 신장 섬유증의 단측 수뇨관 폐색(UUO) 마우스 모델에서 결정하였다. 우측 신장 기능은 온전하게 유지하면서 좌측 수뇨관의 완전 결찰에 의해 UUO 모델을 개발하였다. 간략하고, UUO를 케타민/실라잔 마취 하에 마우스에서 수행하고, 옆구리 절개를 통해 좌측 수뇨관에 접근하여 5-0 실크 실을 이용해서 수뇨관의 근위 1/3 상에 2 개의 결찰을 5 mm 간격으로 배치하였다. 수뇨관에 임의 결찰을 배치하지 않고 유사한 방식으로 모의 수술을 수행하였다. 상기 모델에서, UUO 후 14 일 내에 신장에 중증 섬유증이 발생하며, 이를 하이드록시프롤린 방법으로 불리는, 샘플 중 하이드록시프롤린의 양을 직접 측정하여 신장 콜라겐을 측정함으로써 평가하였다. 하이드록시프롤린은 특정한 콜라겐 성분으로, 대부분의 포유동물 조직 내 콜라겐 아미노산 조성의 대략 14.4%를 차지한다(Cochrane et al., J Am Soc Nephrol 16:3623-30 (2005)). 하이드록시프롤린 방법을 통해 콜라겐 함량을 측정하기 위해, 먼저 냉동 신장 샘플을 진공 챔버를 이용해서 하룻밤 동안 건조하였다. 이어서 건조된 신장 조직 샘플을 빙냉 NaCl/NaHCO3 용액 중에 균질화하고, 6 M HCl을 이용해서 가수분해하였다. 이후 샘플을 진공 원심분리기를 이용해서 건조한 뒤 0.1 M HCl을 이용해서 재수화하였다. 재수화된 샘플 중의 하이드록시프롤린을 300 mM 클로라민 T(Sigma, # 857319)로 산화한 뒤, 에를리히 시약[60% 과염소산(Sigma, # 311413) 중 3.5M p-디메틸아미노벤즈알데히드(FW: 149.19, Sigma, # 39070)]을 첨가하여 발색시켰다. 마지막으로 분광측정기를 이용해서 샘플의 흡광도를 558 nm에서 측정하고, 이를 공지된 농도의 하이드록시프롤린 표준(Sigma, # H5534)과 비교해서 신장 하이드록시프롤린 함량을 결정하였다. 그 뒤, 측정된 하이드록시프롤린 값에 인수 6.94로 곱해서 콜라겐 값을 결정하였다. UUO 14 일 후, 실질 손상 결과 건조 신장 중량이 감소한다. 모의(n = 10) 또는 UUO(n = 20) 수술을 16 주령 웅성 C57BL/6 마우스(Taconic farms, Inc.)에서 수행하였다. 이후, UUO 수술을 거친 마우스를 2 개 군으로 구분하였다. 각각의 UUO 군에 수술 전날에 시작해서 수술 후 1, 3, 6, 8, 10 및 13 일에 H4H10446P2(40 mg/kg, n = 10) 또는 임의의 공지된 마우스 단백질에 결합하지 않는 이소형 대조군 항체(40 mg/kg, n = 10)의 피하 주사를 수여하였다. 모의 수술을 거친 마우스에는 상기 시기 동안 UUO 군과 동일한 일정을 이용해서 비히클(멸균 PBS)을 수여하였다. 모든 마우스를 수술 후 14 일에 희생시켰다. 신장 중량을 측정하고, 신장을 액체 질소를 이용해서 급속 냉동하고, 콜라겐 함량을 측정할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 하이드록시프롤린 방법을 이용해서 신장 콜라겐 함량을 측정한 뒤 총 신장 콜라겐(㎍) 또는 신장 중량에 대해 정규화된 신장 콜라겐(㎍/건조 중량mg)으로 표시하였다. 통계 분석은 원 웨이 ANOVA와 Turkey 다중 비교 테스트를 이용해서 수행하였다. 각 처리군에 대한 총 신장 콜라겐, 정규화된 신장 콜라겐 및 건조 신장 중량의 요약을 포함하는 결과를 아래 표 28에서 평균 ± SEM으로 표시하였다.
각 군에서의 총 신장 콜라겐, 정규화된 신장 콜라겐, 및 건조 신장 중량(평균 ± SEM)
처리군 총 신장 콜라겐(㎍) 정규화된 신장 콜라겐
(㎍/조직 건조 중량mg)		 건조 신장 중량(g)
모의 + 비히클 429.6 ± 25.93 8.16 ± 0.29 0.0524 ± 0.002
UUO + 이소형 대조군 980.7 ± 50.48 25.07 ± 0.86 0.0396 ± 0.0027
UUO + H4H10446P2 730.7 ± 48.02 17.48 ± 0.79 0.0422 ± 0.0029
표 28에 나타낸 바와 같이, 총 신장 콜라겐 및 신장 중량에 대해 정규화된 신장 콜라겐은 모두 모의 수술 마우스에 비해 UUO 마우스에서 유의미하게 증가하였다. H4H10446P2로 처리한 UUO 마우스는 이소형 대조군 항체 처리된 UUO 마우스에 비해 총 신장 콜라겐 및 신장 중량에 대해 정규화된 신장 콜라겐 모두에서 유의미한 감소를 나타내어(섬유성 콜라겐의 대략 45% 감소) 항-액티빈 A 항체가 신장에서 감소된 섬유증으로 이어짐을 시사하였다. H4H10446P2로 처리된 UUO 마우스는 이소형 대조군 항체 처리된 UUO 마우스에 비해 건조 신장 중량 증가를 나타내어, 항-액티빈 A 항체 처리 마우스에서 실질의 보존을 시사하였다.
실시예 14. 액티빈 A를 과발현하는 마우스에서 체중 및 근육 질량에 대한 H4H10446P2의 효과
마우스에서 액티빈 A의 증가된 수준 중화에서의 H4H10446P2의 유효성을 평가하기 위해, 전장 액티빈 A를 인코딩하는 DNA 구축물의 수력학적 전달(HDD)에 의해 액티빈 A를 C57BL/6 마우스(10 주령)에서 과발현시켰다. 마우스를 3 개 군으로 무작위화하였다(n = 5-6/군); 하나에는 이소형 대조군 항체의 존재 하에 식염수/2.5 ㎍의 DNA 구축물 대조군의 혼합물을 주사하였고, 2 개 군에는 이소형 대조군 항체 또는 H4H10446P2의 존재 하에 식염수/2.5 ㎍의 DNA 구축물의 혼합물을 주사하였다. DNA 구축물은 0 일에 주사하고, 항체는 7 일 동안 0 일 및 4 일에 2.5 mg/kg(2 회 주사) 투여하였다. 근육 중량은 정규화된 중량으로 보고하였다(즉, 근육 중량을 실험 시작 시 측정된 체중에 대해 정규화함). 체중에 대한 결과를 시작 체중으로부터의 평균 변화로 나타낸다. 앞 정강근(TA) 및 장딴지근(GA) 근육에 대한 결과를 구축물 대조군 + 이소형 대조군 항체 군의 HDD 전달 대비 각 군에 대한 평균 변화 백분율(± 평균의 표준 오차)로 도 4에 나타낸다. 데이터를 원- 또는 투-웨이 ANOVA에 이어 Tukey HSD 시험으로 분석하였다.
도 4에서 알 수 있듯이, HDD 7 일 후, 이소형 대조군 항체로 처리한 마우스에서 액티빈 A의 전달은 체중(-10.81 ± 2.46%) 및 앞 정강근과 장딴지근 근육 질량(각각 -13.96 ± 1.85% 및 -10.34 ± 1.51%)에서 유의미한 감소를 일으켰다(이소형 대조군 대비 p < 0.01 유의성). H4H10446P2로 처리한 마우스에서 액티빈 A의 전달은 7 일의 처리 말기에 체중(-1.49 ± 1.98%) 및 앞 정강근 및 장딴지근 근육 질량(각각 -2.57 ± 1.26% 및 -1.77 ± 2.42%)의 유의미한 약화를 일으켰다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 구현예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기재된 것들에 부가하여 본 발명의 다양한 개질은 상기 기재 및 첨부 도면으로부터 본 기술분야 숙련가에게 자명해질 것이다. 이러한 개질은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하려는 것이다.
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> ANTI-ACTIVIN A ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 2016-FPA-7403 <150> 61/859,926 <151> 2013-07-30 <150> 61/864,036 <151> 2013-08-09 <150> 61/911,834 <151> 2013-12-04 <150> 61/913,855 <151> 2013-12-09 <160> 228 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctgctgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggag ttggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat attacagggc caactggttt 180 aatgattatg cactttctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagtcac atccacgaac 240 cacttctccc tgcagctgca ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agagaagggg ctctgggata ctactttgac tcctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser 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Val Pro Gly Ser 100 105 110 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 187 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 187 ggtggctcct tcagcagtca cttc 24 <210> 188 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 188 Gly Gly Ser Phe Ser Ser His Phe 1 5 <210> 189 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 189 atctattaca gtgggggcac c 21 <210> 190 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 190 Ile Tyr Tyr Ser Gly Gly Thr 1 5 <210> 191 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 191 gcgagagcta gatcggggat aacgtttggg ggagttctcg tccctggttc ttttgatatt 60 60 <210> 192 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 192 Ala Arg Ala Arg Ser Gly Ile Thr Phe Gly Gly Val Leu Val Pro Gly 1 5 10 15 Ser Phe Asp Ile 20 <210> 193 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 193 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccttcagt agtcacttct ggagctggat ccggcagccc 120 ccaggaaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggggcac ccactacaac 180 ccctccctcg agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aaactgaact ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtttatt actgtgcgag agctagatcg 300 gggattactt ttgggggact tatcgtccct ggttcttttg atatctgggg ccaagggaca 360 atggtcaccg tctcttca 378 <210> 194 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 194 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Ser His 20 25 30 Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Gly Thr His Tyr Asn Pro Ser Leu Glu 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Arg Ser Gly Ile Thr Phe Gly Gly Leu Ile Val Pro Gly Ser 100 105 110 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 195 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 195 ggtggctcct tcagtagtca cttc 24 <210> 196 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 196 Gly Gly Ser Phe Ser Ser His Phe 1 5 <210> 197 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 197 atctattaca gtgggggcac c 21 <210> 198 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 198 Ile Tyr Tyr Ser Gly Gly Thr 1 5 <210> 199 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 199 gcgagagcta gatcggggat tacttttggg ggacttatcg tccctggttc ttttgatatc 60 60 <210> 200 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 200 Ala Arg Ala Arg Ser Gly Ile Thr Phe Gly Gly Leu Ile Val Pro Gly 1 5 10 15 Ser Phe Asp Ile 20 <210> 201 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 201 cgggtgcaac tggtgcagtc tgggtctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaggg cttctggata catcttcacc agttatgata tcaattgggt gcgacaggcc 120 actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta ataatggtaa cacagcctat 180 acacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaaaggga 300 ttactatggt tcgggaagtt attagggtac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 202 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 202 Arg Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Asn Gly Asn Thr Ala Tyr Thr Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Leu Leu Trp Phe Gly Lys Leu Leu Gly Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 203 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 203 ggatacatct tcaccagtta tgat 24 <210> 204 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 204 Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Asp 1 5 <210> 205 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 205 atgaacccta ataatggtaa caca 24 <210> 206 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 206 Met Asn Pro Asn Asn Gly Asn Thr 1 5 <210> 207 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 207 gcgagaaagg gattactatg gttcgggaag ttattagggt acggtatgga cgtc 54 <210> 208 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 208 Ala Arg Lys Gly Leu Leu Trp Phe Gly Lys Leu Leu Gly Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 209 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 209 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaa 324 <210> 210 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 210 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 211 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Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Ala Trp Lys Met Ser Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser 115 120 <210> 218 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 218 Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr Ala 1 5 <210> 219 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 219 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ala 1 5 <210> 220 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 220 Ala Lys Asp Gly Ala Trp Lys Met Ser Gly Leu Asp Val 1 5 10 <210> 221 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 221 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ile Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 222 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 222 Gln Asp Ile Ser Asp Tyr 1 5 <210> 223 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 223 Thr Thr Ser 1 <210> 224 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 224 Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Leu Thr 1 5 <210> 225 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 225 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 226 <211> 426 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 226 Met Pro Leu Leu Trp Leu Arg Gly Phe Leu Leu Ala Ser Cys Trp Ile 1 5 10 15 Ile Val Arg Ser Ser Pro Thr Pro Gly Ser Glu Gly His Ser Ala Ala 20 25 30 Pro Asp Cys Pro Ser Cys Ala Leu Ala Ala Leu Pro Lys Asp Val Pro 35 40 45 Asn Ser Gln Pro Glu Met Val Glu Ala Val Lys Lys His Ile Leu Asn 50 55 60 Met Leu His Leu Lys Lys Arg Pro Asp Val Thr Gln Pro Val Pro Lys 65 70 75 80 Ala Ala Leu Leu Asn Ala Ile Arg Lys Leu His Val Gly Lys Val Gly 85 90 95 Glu Asn Gly Tyr Val Glu Ile Glu Asp Asp Ile Gly Arg Arg Ala Glu 100 105 110 Met Asn Glu Leu Met Glu Gln Thr Ser Glu Ile Ile Thr Phe Ala Glu 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Arg Lys Thr Leu His Phe Glu Ile Ser Lys Glu Gly 130 135 140 Ser Asp Leu Ser Val Val Glu Arg Ala Glu Val Trp Leu Phe Leu Lys 145 150 155 160 Val Pro Lys Ala Asn Arg Thr Arg Thr Lys Val Thr Ile Arg Leu Phe 165 170 175 Gln Gln Gln Lys His Pro Gln Gly Ser Leu Asp Thr Gly Glu Glu Ala 180 185 190 Glu Glu Val Gly Leu Lys Gly Glu Arg Ser Glu Leu Leu Leu Ser Glu 195 200 205 Lys Val Val Asp Ala Arg Lys Ser Thr Trp His Val Phe Pro Val Ser 210 215 220 Ser Ser Ile Gln Arg Leu Leu Asp Gln Gly Lys Ser Ser Leu Asp Val 225 230 235 240 Arg Ile Ala Cys Glu Gln Cys Gln Glu Ser Gly Ala Ser Leu Val Leu 245 250 255 Leu Gly Lys Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Lys Lys 260 265 270 Gly Gly Gly Glu Gly Gly Ala Gly Ala Asp Glu Glu Lys Glu Gln Ser 275 280 285 His Arg Pro Phe Leu Met Leu Gln Ala Arg Gln Ser Glu Asp His Pro 290 295 300 His Arg Arg Arg Arg Arg Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile 305 310 315 320 Cys Cys Lys Lys Gln Phe Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn 325 330 335 Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly 340 345 350 Glu Cys Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe 355 360 365 His Ser Thr Val Ile Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe 370 375 380 Ala Asn Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser 385 390 395 400 Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln 405 410 415 Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 420 425 <210> 227 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 227 Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu 1 5 10 15 Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp 20 25 30 Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser Ser Gly Thr Ile 35 40 45 Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp 50 55 60 Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys 65 70 75 80 Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu 85 90 95 Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Ser 100 105 110 Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 115 120 125 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 130 135 140 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 145 150 155 160 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 165 170 175 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 180 185 190 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 195 200 205 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 210 215 220 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 225 230 235 240 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 245 250 255 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 260 265 270 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 275 280 285 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 290 295 300 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 305 310 315 320 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 325 330 335 Ser Pro Gly Lys 340 <210> 228 <211> 407 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 228 Met Asp Gly Leu Pro Gly Arg Ala Leu Gly Ala Ala Cys Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Gly Trp Leu Gly Pro Glu Ala Trp Gly Ser Pro Thr Pro 20 25 30 Pro Pro Thr Pro Ala Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Ser Pro 35 40 45 Gly Gly Ser Gln Asp Thr Cys Thr Ser Cys Gly Gly Phe Arg Arg Pro 50 55 60 Glu Glu Leu Gly Arg Val Asp Gly Asp Phe Leu Glu Ala Val Lys Arg 65 70 75 80 His Ile Leu Ser Arg Leu Gln Met Arg Gly Arg Pro Asn Ile Thr His 85 90 95 Ala Val Pro Lys Ala Ala Met Val Thr Ala Leu Arg Lys Leu His Ala 100 105 110 Gly Lys Val Arg Glu Asp Gly Arg Val Glu Ile Pro His Leu Asp Gly 115 120 125 His Ala Ser Pro Gly Ala Asp Gly Gln Glu Arg Val Ser Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Phe Ala Glu Thr Asp Gly Leu Ala Ser Ser Arg Val Arg Leu Tyr 145 150 155 160 Phe Phe Ile Ser Asn Glu Gly Asn Gln Asn Leu Phe Val Val Gln Ala 165 170 175 Ser Leu Trp Leu Tyr Leu Lys Leu Leu Pro Tyr Val Leu Glu Lys Gly 180 185 190 Ser Arg Arg Lys Val Arg Val Lys Val Tyr Phe Gln Glu Gln Gly His 195 200 205 Gly Asp Arg Trp Asn Met Val Glu Lys Arg Val Asp Leu Lys Arg Ser 210 215 220 Gly Trp His Thr Phe Pro Leu Thr Glu Ala Ile Gln Ala Leu Phe Glu 225 230 235 240 Arg Gly Glu Arg Arg Leu Asn Leu Asp Val Gln Cys Asp Ser Cys Gln 245 250 255 Glu Leu Ala Val Val Pro Val Phe Val Asp Pro Gly Glu Glu Ser His 260 265 270 Arg Pro Phe Val Val Val Gln Ala Arg Leu Gly Asp Ser Arg His Arg 275 280 285 Ile Arg Lys Arg Gly Leu Glu Cys Asp Gly Arg Thr Asn Leu Cys Cys 290 295 300 Arg Gln Gln Phe Phe Ile Asp Phe Arg Leu Ile Gly Trp Asn Asp Trp 305 310 315 320 Ile Ile Ala Pro Thr Ser Tyr Tyr Gly Asn Tyr Cys Glu Gly Ser Cys 325 330 335 Pro Ala Tyr Leu Ala Gly Val Pro Gly Ser Ala Ser Ser Phe His Thr 340 345 350 Ala Val Val Asn Gln Tyr Arg Met Arg Gly Leu Asn Pro Gly Thr Val 355 360 365 Asn Ser Cys Cys Ile Pro Thr Lys Leu Ser Thr Met Ser Met Leu Tyr 370 375 380 Phe Asp Asp Glu Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp Val Pro Asn Met Ile 385 390 395 400 Val Glu Glu Cys Gly Cys Ala 405

Claims (44)

  1. 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정되는 약 5 pM 미만의 결합 해리 평형 상수(KD)로 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정되는 약 4 pM 미만의 KD로 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 약 500 nM 미만의 결합 회합 평형 상수(Ka)로 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 액티빈 A에 대한 적어도 하나의 액티빈 A 수용체의 결합을 차단하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 액티빈 A에 의한 적어도 하나의 액티빈 A 수용체의 활성화를 차단하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 액티빈 II형 수용체에 대한 액티빈 A의 결합을 유의미하게 차단하지 않는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 청구항 4에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 25℃에서 생체내 수용체/리간드 결합 바이오에세이에서 측정되는 약 80 pM 미만의 IC50 값으로 액티빈 A 수용체에 대한 액티빈 A 결합을 차단하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 25℃에서 생체내 수용체/리간드 결합 바이오에세이에서 측정되는 약 60 pM 미만의 IC50 값으로 액티빈 A 수용체에 대한 액티빈 A 결합을 차단하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 액티빈 IIA형 수용체(ActRIIA), 액티빈 IIB형 수용체(ActRIIB) 및 액티빈 I형 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 액티빈 A 수용체에 대한 액티빈 A의 결합을 억제하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 SMAD 복합체 신호전달의 액티빈 A-매개성 활성화를 억제하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/90, 106/90, 114/90, 122/90, 130/90, 138/146, 154/146, 162/146, 170/146, 178/146, 186/146, 194/146 및 202/210으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(HCVR)/경쇄 가변 영역(LCVR) 서열 쌍을 포함하는 참조 항체와 액티빈 A에 대한 결합에 대해 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/90, 106/90, 114/90, 122/90, 130/90, 138/146, 154/146, 162/146, 170/146, 178/146, 186/146, 194/146 및 202/210으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍을 포함하는 참조 항체와 액티빈 A 상의 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, (a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 106, 114, 122, 130, 138, 154, 162, 170, 178, 186, 194 및 202로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCVR의 상보성 결정 영역(CDR); 및 (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 146 및 210으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCVR의 CDR을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편이 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/90, 106/90, 114/90, 122/90, 130/90, 138/146, 154/146, 162/146, 170/146, 178/146, 186/146, 194/146 및 202/210으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍의 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 각각 서열번호 4-6-8-12-14-16; 20-22-24-28-30-32; 36-38-40-44-46-48; 52-54-56-60-62-64; 68-70-72-76-78-80; 84-86-88-92-94-96; 100-102-104-92-94-96; 108-110-112-92-94-96; 116-118-120-92-94-96; 124-126-128-92-94-96; 132-134-136-92-94-96; 140-142-144-148-150-152; 156-158-160-148-150-152; 164-166-168-148-150-152; 172-174-176-148-150-152; 180-182-184-148-150-152; 188-190-192-148-150-152; 196-198-200-148-150-152; 및 204-206-208-212-214-216으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 액티빈 A에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 (a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 106, 114, 122, 130, 138, 154, 162, 170, 178, 186, 194 및 202로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCVR; 및 (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 146 및 210으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 항체 또는 항원-결합 단편이 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/90, 106/90, 114/90, 122/90, 130/90, 138/146, 154/146, 162/146, 170/146, 178/146, 186/146, 194/146 및 202/210으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  18. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  19. 대상체에서 근육 질량 또는 강도를 증가시키는 방법으로서, 청구항 18의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편, GDF8 길항제 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서,
    GDF8 길항제가 GDF8-억제 융합 단백질, 항-GDF8 항체 및 항-GDF8 항체의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  22. 청구항 19에 있어서,
    GDF8 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 GDF8 길항제는 항-GDF8 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 방법.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 GDF8 길항제가 서열번호 217을 포함하는 HCVR의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 및 서열번호 221을 포함하는 LCVR의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함하는 항-GDF8 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 방법.
  24. 청구항 22에 있어서,
    상기 GDF8 길항제가 하기를 포함하는 항-GDF8 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 방법:
    a) 서열번호 218, 서열번호 219 및 서열번호 220을 포함하는 3 개의 HCDR, 및
    b) 서열번호 222, 서열번호 223 및 서열번호 224를 포함하는 3 개의 LCDR.
  25. 대상체에서 근육 질량 또는 강도를 증가시키는 방법으로서, 청구항 20의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 대상체에서 근육 질량 또는 강도를 증가시키는 방법에 있어서, 액티빈 A-특이적 결합 도메인 및 GDF8-특이적 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 청구항 26에 있어서,
    상기 액티빈 A-특이적 결합 도메인이 HCVR 및 LCVR을 포함하는 방법.
  28. 청구항 26에 있어서,
    상기 GDF8-특이적 결합 도메인이 HCVR 및 LCVR을 포함하는 방법.
  29. 청구항 27에 있어서,
    상기 HCVR이 하기를 포함하는 방법:
    (a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 106, 114, 122, 130, 138, 154, 162, 170, 178, 186, 194 및 202로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCVR의 CDR; 및
    (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 146 및 210으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCVR의 CDR.
  30. 청구항 28에 있어서,
    상기 HCVR이 서열번호 218, 서열번호 219 및 서열번호 220을 포함하는 3 개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함하고, 상기 LCVR이 서열번호 222, 서열번호 223 및 서열번호 224를 포함하는 3 개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함하는 방법.
  31. 청구항 26에 있어서,
    상기 액티빈 A-특이적 결합 도메인이 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 상기 GDF8-특이적 결합 도메인이 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 방법.
  32. 청구항 26에 있어서,
    상기 항원-결합 분자가 이중특이적 항체인 방법.
  33. 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 완화 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 액티빈 A-특이적 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 완화 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 액티빈 A-특이적 결합 단백질 및 GDF8-특이적 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 청구항 34에 있어서,
    상기 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 또는 장애가 사르코페니아, 악액질, 근육 부상, 근육 소모/위축, 암, 비만, 당뇨병, 관절염, 다발성 경화증, 근디스트로피, 근위축 측삭 경화증, 파킨슨 질환, 골다공증, 골관절염, 골감소증 및 대사 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 악액질이 특발성이거나, 다른 상태에 이차적인 악액질인 방법.
  37. 청구항 36에 있어서,
    상기 상태가 암, 만성 신부전, 또는 만성 폐색성 폐 질환인 방법.
  38. 청구항 35에 있어서,
    상기 근육 소모/위축이 오용, 부동화, 침상 안정, 부상, 의학적 치료, 수술적 개입 및 기계적 환기의 필요성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상태에 의해 유도되거나 이와 연관되는 방법.
  39. 청구항 38에 있어서,
    상기 수술적 개입이 엉덩이 골절, 엉덩이 대체술 및 무릎 대체술로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  40. 청구항 35에 있어서,
    상기 대사 증후군이 당뇨병, 비만, 영양 장애, 기관 위축, 만성 폐색성 폐 질환, 및 식욕부진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 포함하는 방법.
  41. 감소된 근육 질량 또는 강도를 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 완화 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 액티빈 A-특이적 결합 도메인 및 GDF8-특이적 결합 도메인을 포함하는 항원-결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  42. 액티빈 A 활성에 의해 유도되거나, 촉진되거나, 악화되거나, 심해지는 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 완화 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 액티빈 A 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  43. 청구항 42에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 신장 섬유증인 방법.
  44. 청구항 42에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 악액질인 방법.
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