EA015534B1 - Антитела к миостатину и способы их применения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к антителам, включающим человеческие антитела и их антигенсвязывающие части, которые связываются с миостатином и ингибируют миостатин. Изобретение также описывает человеческие антитела против миостатина и их антигенсвязывающие части. Также данное изобретение относится к антителам, которые являются химерными, биспецифичными, производными, одноцепочечными антителами или частями слитых белков. Изобретение также относится к выделенным тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов, происходящих из человеческих антител против миостатина, и молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим такие иммуноглобулины. Настоящее изобретение также описывает способы получения человеческих антител против миостатина, композиций, содержащих эти антитела, и способы применения этих антител и композиций для диагностики и лечения. Данное изобретение также предлагает способы генной терапии с применением молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих тяжелые и/или легкие иммуноглобулиновые молекулы, которые включают человеческие антитела против миостатина. Также данное изобретение описывает трансгенных животных или трансгенные растения, которые содержат молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.

Description

Изобретение относится к антителам, включающим человеческие антитела и их антигенсвязывающие части, которые связываются с миостатином и ингибируют миостатин. Изобретение также описывает человеческие антитела против миостатина и их антигенсвязывающие части. Также данное изобретение относится к антителам, которые являются химерными, биспецифичными, производными, одноцепочечными антителами или частями слитых белков. Изобретение также относится к выделенным тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов, происходящих из человеческих антител против миостатина, и молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим такие иммуноглобулины. Настоящее изобретение также описывает способы получения человеческих антител против миостатина, композиций, содержащих эти антитела, и способы применения этих антител и композиций для диагностики и лечения. Данное изобретение также предлагает способы генной терапии с применением молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих тяжелые и/или легкие иммуноглобулиновые молекулы, которые включают человеческие антитела против миостатина. Также данное изобретение описывает трансгенных животных или трансгенные растения, которые содержат молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.

Уровень техники изобретения

Растущее количество данных указывает на то, что миостатин (шМп. фактор роста и дифференциации-8 или СЭР-8) подавляет рост скелетной мышцы. Например. у детей нуль-мутация по миостатину была связана с поразительной мышечной гипертрофией. без каких бы то ни было явных отклонений (8сНие1ке е! а1. (2004) МуоДабп ΜιιΙαΙίοη Аззошакй \νί11ι Сгозз Мизс1е Нурейгорйу ίη а СЫ1й. №\у Епд1. 1. Мей. 350:2 682-8). Также была продемонстрирована отрицательная корреляция между уровнями белка мышечного миостатина и массой скелетной мышцы (8с1ш11е. ΤΝ. апй Уагазйезкц К.Е. (2001). ЕПссй οί гезМаисе Ιπιίηίημ оп Не га1е οί тизс1е ргокш зупЛсзО ίη РгаН е1йег1у реор1е. Ιηΐ. 1. 8рог1 ΝιιΙγ. Ехегс. Ме!аЬ. 11 8ирр1:8111-820; ^а1кег К.8. е! а1. (2004) КемДапсе 1га1п1пд аИегз р1азта шуо81а1т би! по! ЮР-1 ίη йеа1Лу тен. Мей 8с1 8ройз Ехегс. 36(5):787-93). Например. с возрастом увеличивается экспрессия уровней мышечного миостатина. и было показано. что повышенная экспрессия миостатина способствует потере мышечной массы у ВИЧ-инфицированных больных (Соихакх-сайаук е! а1. (1998) Ο^дашζаΐ^οη οί Ле Нишаи туоз1а1ш деве апй ехрюзз^ ίη Неа1Лу теη апй ШУлЛескй теη \νίΐ1ι тизс1е νηδίίημ. ΡΝΑ8 95:14938-4321). К тому же повышенные уровни миостатина обнаруживаются у пожилого населения. (УагазкезЛ К.Е. е! а1.. (2002) 8егит туοзίаί^η-^ттиηο^еасί^νе ргокш ίδ шсгеазей ίη 60-92 уеаг о1й \\Όΐικη апй шсп \νί11ι ти8с1е νηδίίημ. ί Νυίτ. Неа1!Н Адшд. 6(5):343-8). Миостатин также влияет на массу кости. так например. у мышей без миостатина возрастает минеральная плотность кости (Натиск е! а1.. (2003) Вопс АгсЫксЛге апй Э1зс ^едеηе^аί^οη ίη Ле ЬитЬаг 8рше οί Мке Ьаскшд СЭР-8 (Муоз1а1ш). 1. Ог11юраеЛс Кез. 21: 1025-1032 (включены здесь в качестве ссылок).

На мышиных моделях сахарного диабета 2 типа было показано. что антитела к циркулирующему миостатину вызывают увеличение мышечной массы и улучшают гомеостаз глюкозы. Ингибирование миостатина посредством внутрибрюшинной инъекции нейтрализующего антитела увеличивает массу скелетной мышцы. уменьшает уровень глюкозы в крови натощак и улучшает восприимчивость глюкозы у страдающих ожирением мышей с диабетом (Ь1 X. е! а1. (2002) 1пЫЬйюп οί туоз1а1ш шсгеазез тизс1е тазз апй тргоуез д1исозе 5спз111у11у ίη оЬезе. ЛаЬекс тке. Роз1ег #224. ίη КсузЮпс 8утроз1а: Э1аЬе1ез Ме11йиз: Мо1еси1аг Мескашзтз. СспсИсз апй №\у Ткегаркз). Кроме того. известно. что у мышей А^у/а развивается устойчивость к инсулину. и они используются в качестве модели для диабета 2 типа. Если мыши А^у/а лишены миостатина посредством делеции локуса миостатина. то они имеют нормальные уровни глюкозы после кормления и инсулина. и чрезвычайно низкие уровни глюкозы после экзогенного введения глюкозы по сравнению с обычными мышами А^у/а (МсРНсггоп е! а1. (2002) 1. С1ш. ЛуезЕ 109:595-601).

Учитывая нежелательные дефекты мышцы. кости и метаболические дефекты. связанные с миостатином. существует крайняя необходимость в антителах в качестве терапевтических средств. которые специфичны к миостатину и которые предотвращают или лечат состояния посредством снижения активности миостатина. а также в антителах в качестве диагностических средств для распознавания индивидуумов. которые нуждаются в лечении для снижения активности миостатина.

Сущность изобретения

Данное изобретение предоставляет антитела против миостатина. кодирующие их нуклеиновые кислоты. векторы и клетки-хозяева для выработки данных антител. композиции и наборы. содержащие антитела и способы производства и применения данных антител. Различные варианты осуществления данного изобретения описаны в нижеследующих пронумерованных пунктах. но не ограничены ими.

1. Химерное. человеческое или гуманизированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть. которые специфически связываются с миостатином. где указанное антитело или часть ингибируют связывание миостатина с рецептором активина типа Ι или типа ΙΙ. и где указанное антитело представляет собой не конкурирующее нейтрализующее антитело. содержащее по крайней мере СЭЮ. СЭК.2 и СЭК3 тяжелой цепи или указанные СЭК. имеющие менее 8 консервативных аминокислотных замен. и СЭК.1. СЭК2 и СЭК3 легкой цепи или указанные СЭК. имеющие менее 3 консервативных аминокислотных замен. из следующих последовательностей:

(a) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 38 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 40 соответственно;

(b) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 42 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 44 соответственно или (c) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 115 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 117 соответственно.

2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1. где указанное антитело выбрано из группы. состоящей из:

(a) антитела. содержащего аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 38 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 40 соответственно;

(b) антитела. содержащего аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 42 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 44 соответственно; и (c) антитела. содержащего аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 115 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 117 соответственно.

3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1. где указанное антитело выбрано из группы. состоящей из:

(а) антитела. содержащего вариабельные домены последовательностей тяжелой и легкой цепей 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 38 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 40 соответственно;

- 1 015534 (b) антитела, содержащего вариабельные домены последовательностей тяжелой и легкой цепей 8ЕО ΙΌ N0: 42 и 8Е0 ГО N0: 44 соответственно; и (c) антитела, содержащего вариабельные домены последовательностей тяжелой и легкой цепей 8Е0 ΙΌ N0: 115 и 8Е0 ΙΌ N0: 117 соответственно.

4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 115 и аминокислотную последовательность легкой цепи 5ЕО ΙΌ N0: 117.

5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащее вариабельные домены в составе последовательностей тяжелой и легкой цепей 8Е0 ΙΌ N0: 115 и 8Е0 ΙΌ N0: 117 соответственно.

6. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело содержит последовательности 0ΌΚ1, СЭК2 и СЭКЗ тяжелой цепи, содержащиеся в 8Е0 ΙΌ N0: 115 и последовательности СЭЮ. СЭК2 и СЭГО легкой цепи, содержащиеся в 8Е0 ΙΌ N0:117.

7. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, которые связываются с пептидом 1 и пептидом 5 миостатина, причем пептид 1 содержит аминокислотную последовательность ГОО ΙΌ N0: 103 и пептид 5 содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 107.

8. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, продуцируемые клеткой, выбранной из группы, включающей АТСС РТА-6574, АТСС РТА-6575 и АТСС РТА-6576.

9. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Способ увеличения мышечной массы, активизации развития скелетной мышцы, лечения заболевания, истощающего мышцу, или усиления роста скелетной мышцы, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8 или фармацевтической композиции по п.9, которые ингибируют активность миостатина.

11. Выделенная клеточная линия, которая продуцирует антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-8 или тяжелую цепь или легкую цепь указанного антитела или указанной антигенсвязывающей части.

12. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, которая кодирует тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть или легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела по любому из пп.1-8.

13. Способ улучшения гомеостаза глюкозы; уменьшения жировой массы; увеличения чувствительности к инсулину; улучшения функции почки; уменьшения накопления жира; лечения, профилактики или подавления заболевания или состояния, характеризующегося разрушением кости, причем указанное заболевание или состояние включает остеопороз, остеопению, остеоартрит и переломы кости; лечения метаболического синдрома или противодействия мышечному истощению от длительного введения глюкокортикоидного или стероидного гормона в то время, когда субъект проходит лечение глюкокортикоидным или стероидным гормоном; включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп. 1-8, которые ингибируют активность миостатина.

14. Способ снижения активности миостатина у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8, которые ингибируют активность миостатина.

15. Способ устранения связанного с возрастом сокращения мышечной массы у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8, которые ингибируют активность миостатина.

16. Линия клеток-хозяев млекопитающих, содержащая полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи человеческого, химерного или гуманизированного моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части, где антитело продуцируется гибридомной клеточной линией, выбранной из группы, включающей АТСС РТА-6574, АТСС РТА-6575 и АТСС РТА-6576.

17. Способ стимуляции роста мышцы или увеличения веса или предотвращения слабости у крупного рогатого скота, свиней, овец, цыплят, индюков, лошадей, рыб, собак и кошек, нуждающихся в этом, включающий введение животному антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8, которые ингибируют активность миостатина.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует результаты исследования миостатинзависимого репортерного гена. Как показано, нейтрализующие антитела против миостатина ингибируют индуцируемую миостатином активность люциферазы в клетках А204. Варианты человеческого антитела 1_116_1Ε-Ο45Ι<; 1_257-1Τ-Τ21Ι; 1_314__1Н-Т92А и 2_112_1Η-Ι12ν, Ь-Р 58Ι, Ι85ν ингибировали активность люциферазы в той же степени, что и антитела дикого типа.

Фиг. 2 демонстрирует результаты исследования бета-лактамазы в Ь6 Аигога. Как показано, нейтрализующие антитела против миостатина ингибируют индуцируемую миостатином активность беталактамазы в миобластах крысы линии Ь6. Варианты человеческого антитела 1_116_1Б-О45К; 1_257-1ЬЬ2Н; 1_314_1Н-Т92А и 2_112_1Η-Ι12ν, Ь-Р58Т, Ι85ν ингибировали активность бета-лактамазы в той же

- 2 015534 степени, что и антитела дикого типа.

Фиг. 3 демонстрирует результаты вестерн-блота. Как показано посредством вестерн-блота, нейтрализующие антитела против миостатина согласно данному изобретению ингибируют индуцируемое миостатином фосфорилирование §таб2 в клетках НерО2.

Фиг. 4 демонстрирует результаты исследований экспрессии мРНК ту£5. (А) Нейтрализующие антитела против миостатина 1_268_1, 2_177_1 и 2_112_1 восстанавливали экспрессию гена ту£5, ингибированную миостатином в миобластах мыши С2С12, тогда как антитело 1_159_1, не являющееся нейтрализующим, не могло восстановить экспрессию. Уровень мРНК ту£5 детектировали посредством ТадМап РСК.. (В) 1_116_1 восстанавливало экспрессию гена ту£5 в зависимости от дозы.

Фиг. 5 демонстрирует результаты исследования дифференциации мышечной клетки С2С12. (А) Нейтрализующие антитела против миостатина 2_43_1, 1_314_1 и 1_257_1 восстанавливали блокированную миостатином дифференциацию мышцы в клетках мышцы мыши С2С12. Уровень белка тяжелой цепи эмбрионального миозина (МНС) использовали в качестве маркера для оценки дифференциации С2С12. (В) Антитела 2_112_1, 1_46_1 и 1_116_1 восстанавливали блокированную миостатином дифференциацию мышцы С2С12.

На фиг. 6 (А) изображены пептиды, полученные из зрелого ΟΌΡ8 (8ЕО ГО N0: 89) для проверки связывания антитела против миостатина. Аминокислоты, указанные строчными буквами, представляют собой аминокислоты, которые отличаются от 0ΌΡ11. (В) Сводные данные о связывании пептида. Как показано на фигуре, некоторые антитела не связываются ни с одним из пептидов. Некоторые антитела связываются с неродственными пептидами. (С) Предсказанная структура 0ΌΡ8 с иллюстрацией пептидного связывания человеческими антителами против миостатина. Структура 0ΌΡ8 была получена при применении 8№188-М0ОЕЬ, полностью автоматизированного сервера по моделированию структурной гомологии белков, который доступен через веб-сервер ЕхРА8у или из программы ОеерУ|е\\' (8\νίδ5 РбЬУ1е^ет). В предсказанной структуре были пропущены первые семь аминокислот. Зрелый 0ΌΡ8 представляет собой гомодимерный белок. Показана только одна субъединица. Описанные здесь антитела связываются с гомодимером 0ΌΡ8. Как показано на фигуре, человеческие моноклональные антитела 2_43_1, 2_112_1 и 2_177_1 связываются с обоими пептидами 1 и 5. Пептиды 1 и 5 пространственно сближены, но не в первичной структуре.

Фиг. 7 демонстрирует аминокислотные последовательности пептидов 1-11 и соответствующие идентификаторы последовательности (8Е0 ГО N0: 103-113).

На фиг. 8 изображено связывание эпитопа. Связывание эпитопа человеческих антител против миостатина согласно данному изобретению картировали посредством экспериментов по конкурентному связыванию, применяя прибор В1АсогеТМ 3000. Антитела изображены как помеченные ячейки. Антитела в одном круге конкурируют с антителами в перекрывающихся кругах. Например, антитело 1_46_1 конкурирует с антителом 1_136_3, но антитело 1_46_1 не конкурирует с антителом 1_268_1. Если два или более антител находятся в одном и том же круге, соответствующее им связывание нельзя различить.

Фиг. 9 демонстрирует результаты исследования иммунопреципитации для оценки способности человеческих антител против миостатина согласно данному изобретению связывать зрелый ΟΌΡ8 и латентный комплекс зрелого ΟΌΡ8 и пропептида. Использовали кондиционированную среду, содержащую клетки 293Т, трансфицированные ΟΌΡ8. Как показано на фигуре, антитела 2_112_1, 2_43_1 и 2_177_1 связывали зрелый ΟΌΡ8, комплекс зрелого ΟΌΡ8 и пропептида и непроцессированный ΟΌΡ8; антитело 1_66_1 связывало зрелый ΟΌΡ8 и комплекс зрелого ΟΌΡ8 и пропептида; ни одно другое антитело не связывало зрелый ΟΌΡ8, пропептид или непроцессированный ΟΌΡ8. Дорожка 4 - это контроль заполнения среды (1/10) и дорожка 7 - это контроль иммунопреципитации, только со средой.

Фиг. 10 демонстрирует результаты исследования иммунопреципитации для оценки способности антител против миостатина согласно данному изобретению связывать зрелый ΟΌΡ8 из мышиной сыворотки. Как показано на фигуре, антитела 2_112_1, 2_43_1 и 2_177_1 связывали зрелый ΟΌΡ8 из мышиной сыворотки, тогда как антитела 1_116__1 и 1_66_1 не могли этого сделать.

Фиг. 11 представляет собой выравнивание последовательности зрелых человеческих ΟΌΡ8 и ΟΌΡ11. Зрелые ΟΌΡ8 (8Е0 ГО N0: 89) и ΟΌΡ11 (8Е0 ГО N0: 90) показали приблизительно 90% идентичность аминокислотных последовательностей. И зрелый ΟΌΡ8, и ΟΌΡ11 образуют гомодимеры. И зрелый ΟΌΡ8, и ΟΌΡ11 имеют девять остатков цистеина, которые образуют четыре внутренние дисульфидные связи и одну межмолекулярную дисульфидную связь. Как видно на фигуре, остатки цистеина, которые образуют друг с другом дисульфидную связь, помечены одинаковыми точками или плюсом. Один цистеин (су§73), который образует межмолекулярную дисульфидную связь, пометили звездочкой. Структура ΟΌΡ8 была предсказана при применении 8№188-М0ОЕЬ (смотрите фиг. 6С).

Фиг. 12 представляет собой таблицу, резюмирующую данные исследования ίη νίίτο.

Фиг. 13 представляет собой таблицу, резюмирующую использование гена, связывание эпитопа и связывание пептида.

Фиг. 14 и 15 демонстрируют влияние лечения ίη νίνο антителами против миостатина на мышечную массу у мышей в сравнении с носителем для мышц да51госпетш5-р1ап1ап5-5о1еи5 (ОР8), НЬНаЛь агИепог (ТА) и диабпсерк (ОпаА).

- 3 015534

Фиг. 16 демонстрирует влияние лечения ίη νΐνο антителом против миостатина на мышечную массу и силу у мышей 8СШ (2_112_К).

Фиг. 17 иллюстрирует влияние лечения ίη νΐνο различными дозами антитела против миостатина на мышечную массу у мышей 8СШ (2_112_К).

Фиг. 18 представляет собой исследование ответа на различные дозы (А) и концентрации (В) антитела против миостатина (2_112_К), и их влияние на мышечную массу.

Фиг. 19 представляет собой выравнивание вариабельных участков тяжелой и легкой цепи антител 2_112_1 (тяжелая цепь: 8Е0 ΙΌ N0: 77; легкая цепь: 8Е0 ΙΌ N0: 79) и 2_112_К (тяжелая цепь: 8Е0 ΙΌ N0: 118; легкая цепь: 8Е0 ΙΌ N0:120).

Фиг. 20 демонстрирует влияние на мышечную массу (А) и жировую массу (В) у мышей лечения ίη νΐνο кортизоном с антителом против миостатина (2_112_К) по сравнению с носителем для мышц дак1госпе1пц1к-р1ап1апк-к1оеик (СР8), ИЬНаНз апЮпог (ТА) и сщабпсерк (Оиабк) (фиг. 20А) и паховой, эпидидимальной и абдоминальной жировой прослойки (фиг. 20В).

Подробное описание изобретения Определения и общие методики

Если здесь не оговорено иначе, научные и технические термины, использованные в связи с настоящим изобретением, должны иметь значения, которые обычно понимаются простыми специалистами в данной области. Кроме того, если по контексту не требуется иначе, термины в единственном числе должны включать формы во множественном числе, и термины во множественном числе должны включать формы единственного числа. Как правило, использованная номенклатура и описанные здесь технические приемы, касающиеся выращивания клеток и ткани, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики и химии и гибридизации белков и нуклеиновых кислот являются общеизвестными и обычно используемыми в данной области.

Способы и технические приемы согласно настоящему изобретению обычно выполняются в соответствии со стандартными способами, общеизвестными в данной области, и как описано в различных общих и более специфических ссылках, которые цитируются и рассматриваются в настоящем описании, если не указано иначе. См., например, 8атЬгоок с! а1. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, 2пб еб., Со1б 8ргшд НагЬог БаЬогаЮгу Ргекк, Со1б 8ргшд НагЬог, КУ. (1989) и АикиЬе1 е! а1., СиггеШ Рго1осо1к 1п Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬБкЫпд Аккоаа1ек (1992), и Наботе апб Ьапе АпбЬоб1ек: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргекк, Со1б 8ргшд НагЬог, КУ. (1990), включенные в настоящее описание в виде ссылок. Ферментативные реакции и очистку проводят согласно инструкциям производителя, как обычно выполняется в данной области или как описано здесь. Использованная номенклатура, лабораторные методики и технические приемы, касающиеся аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанные здесь, являются общеизвестными и обычно используемыми в данной области. Стандартные способы применяются для химического синтеза, химического анализа, фармацевтического приготовления, разработки состава и доставки, и лечения больных.

Следующие термины, если не указано иначе, должны пониматься следующим образом:

Термин полипептид включает природные или искусственные белки, фрагменты белка и полипептидные аналоги белковой последовательности. Полипептид может быть мономерным или полимерным.

Термин выделенный белок, выделенный полипептид или выделенное антитело относится к белку, полипептиду или антителу, которые в силу их происхождения или источника происхождения (1) не связаны с природными компонентами, которые сопутствуют им в их природном состоянии, (2) не содержат других белков того же самого типа, (3) экспрессируются клетками различных видов или (4) не встречаются в природе. Таким образом, полипептид, который синтезируется химически или синтезируется в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он происходит в природе, будет отделен от его связанных с ним в природе компонентов. Белок также может быть получен, по существу, без природно-связанных с ним компонентов посредством выделения, при применении методов очистки белка, общеизвестных в данной области.

В различных вариантах осуществления выделенное антитело против миостатина - это антитело, которое очищено посредством рго!ет А (см., например, пример XVI), антитело, синтезированное гибридомой или иной клеточной линией ш У11го. и/или человеческое антитело против миостатина, полученное от трансгенной мыши.

Белок или полипептид является в значительной степени чистым, в значительной степени гомогенным или в значительной степени очищенным, если по меньшей мере примерно от 60 до 75% образца обнаруживает единственный тип полипептида. Полипептид или белок могут быть мономерными или мультимерными. Полипептид или белок, чистые в значительной степени, обычно будут содержать около 50, 60, 70, 80 или 90% мас./мас. образца белка, чаще приблизительно 95% и предпочтительно будут иметь 99% чистоты. Чистота белка или гомогенность могут быть показаны несколькими способами, хорошо известными в данной области, как, например, электрофорез образца белка в полиакриламидном геле с последующей визуализацией полосы одиночного полипептида посредством окрашивания геля красителем, общеизвестным в данной области. Для некоторых целей более высокое разрешение может

- 4 015534 быть обеспечено посредством применения ВЭЖХ или других способов, хорошо известных в данной области для очистки.

Используемый здесь термин трансгенный организм, не являющийся организмом человека относится к любому отдельному трансгенному живому существу, не являющемуся человеком, включая трансгенное животное, не являющееся человеком, растение, бактерию, простейшее или гриб.

Используемый здесь термин полипептидный фрагмент относится к полипептиду, который имеет делецию на Ν-конце и/или карбоксильном конце, но в котором остальная аминокислотная последовательность идентична соответствующим позициям в природной последовательности. В некоторых вариантах осуществления длина фрагментов составляет по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот. В других вариантах осуществления длина фрагментов составляет по меньшей мере 14, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокислот.

Используемый здесь термин полипептидный аналог относится к полипептиду, содержащему участок, который, существенно идентичен части аминокислотной последовательности и который имеет по меньшей мере одно из следующих свойств: (1) специфическое связывание с миостатином при подходящих для связывания условиях, (2) способность ингибировать или активировать миостатин. Для полипептидных аналогов является типичным то, что они содержат консервативную аминокислотную замену (или инсерцию, или делецию) по отношению к природной последовательности. Для аналогов характерная длина составляет по меньшей мере 20 или 25 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокислот или более, и часто аналоги могут быть такими же длинными, как и полноразмерный полипептид. Некоторые воплощения данного изобретения включают полипептидные фрагменты или полипептидные аналоги антител с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 заменами в исходной аминокислотной последовательности.

В определенных вариантах осуществления аминокислотные замены в антителе против миостатина или его антигенсвязывающей части представляют собой те замены, которые: (1) уменьшают склонность к протеолизу, (2) уменьшают склонность к окислению, (3) изменяют аффинность связывания при формировании белковых комплексов и (4) дают или изменяют другие физико-химические или функциональные свойства подобных аналогов, но все еще сохраняют специфическое связывание с миостатином. Аналоги могут включать различные мутеины последовательности, отличной от обычно встречающейся пептидной последовательности. Например, единичные или множественные аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, могут создаваться в обычной последовательности, предпочтительно в области внешнего домена (доменов) полипептида, образующего межмолекулярные связи. Консервативная аминокислотная замена не должна в значительной степени изменять структурные характеристики родительской последовательности; например, замещение аминокислоты не должно изменять антипараллельный β-слой, который создает встречающийся в родительской последовательности домен, связывающий иммуноглобулин, или не должно разрушать другие типы вторичной структуры, которая характеризует родительскую последовательность. Как правило, глицин и пролин не используются в антипараллельном β-слое. Примеры технологически распознаваемых полипептидных вторичных и третичных структур описаны в Рго1е1И5, 81гис1игев аиб Мо1еси1аг Рппс1р1ев (СгсфЫоп. Еб., ^. Н. Егеешаи аиб Сотрапу, №\ν Уогк (1984)); 1п1гобис1юп !о Рго1еш 81гисШге (С. Вгапбеп аиб 1. Тоохе, ебв., Оаг1апб РиЬВвЬшд, №\ν Уогк, Ν.Υ. (1991)); и Т1югп1оп е! а1., №1Шге 354:105 (1991), включенных в настоящее описание в виде ссылок.

Непептидные аналоги широко используются в фармацевтической промышленности в качестве лекарственных препаратов со свойствами, аналогичными свойствам эталонного пептида. Эти типы непептидного соединения называются пептидные миметики или пептидомиметики. Еаискеге, 1. Абу. Эгид Вее. 15:29 (1986); УеЬег апб Еге1бшдег, ΤΙΝ8 р.392 (1985); и Еуапв е! а1., 1. Меб. Скет. 30:1229 (1987), включенные в настоящее описание в виде ссылок. Такие соединения часто разрабатываются с помощью компьютерного молекулярного моделирования. Пептидные миметики, которые сходны по структуре с применяемыми в терапии пептидами, могут использоваться для получения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. Обычно пептидомиметики имеют структуру, сходную со структурой полипептида-образца (то есть полипептида, который имеет желаемое биохимическое свойство или фармакологическую активность), такого как, человеческое антитело, но имеет одну или несколько пептидных связей, необязательно замещенных связью, выбранной из группы, состоящей из --ΟΗ₂ΝΗ--, --СН₂8--, --СН₂-СН₂--, --СН=СН--(цис- и транс-), --СОСН₂--, --СН(ОН)СН₂-- и --СН₂8О--, посредством общеизвестных в данной области способов. Направленная замена одной или нескольких аминокислот консенсусной последовательности Б-аминокислотой того же типа (например, Близин вместо Ь-лизина) также может применяться для создания более стабильных пептидов. Помимо всего прочего, связанные пептиды, содержащие консенсусную последовательность или, по существу, идентичную разновидность консенсусной последовательности, могут быть получены посредством способов, известных в данной области (В|хо апб 61егавсЬ, Апп. Вет. Вюскет. 61:387 (1992), включенные в настоящее описание в виде ссылки); например, посредством присоединения внутреннего остатка цистеина, способного формировать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые делают пептид цик

- 5 015534 лическим.

В тех случаях, когда идет речь об антителе согласно данному изобретению, обычно подразумевается, что также может применяться его антигенсвязывающая часть. Антигенсвязывающая часть конкурирует с целым антителом за специфическое связывание. См. Рипйатеп!а1 1ттипо1оду. СИ. 7 (Раи1, А., ей., 2пй ей. Кауеп Ргекк, Ν.Υ. (1989)) (полностью включенную в виде ссылки для всех целей) . Антигенсвязывающие части могут создаваться посредством методов с применением рекомбинантной ДНК или посредством ферментативного или химического расщепления целых антител. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие части включают РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, Рй, Ρν, йАЬ и фрагменты участка комплементарности (СЭЯ), одноцепочечные антитела (κοΡν), химерные антитела, димерные антитела и полипептиды, которые содержат по меньшей мере часть антитела, что является достаточным для специфического связывания антигена с полипептидом.

От Ν-конца до С-конца вариабельные домены зрелой легкой и тяжелой цепей содержат, последовательно, участки РЯ1, СЭЯ1, РЯ2, ί.ΌΚ2. РЯ3, СЭЯ3 и РЯ4. Распределение аминокислот в каждом домене находится в соответствии с определениями КаЬа1, 8ециепсек οί Рго!ешк οί 1ттипо1одюа1 1п1егек1 (№!юпа1 (пкИИПек οί НеаИЬ, ВеШекйа, Мй. (1987 апй 1991)), Сйо1Ыа & Ьекк, 1. Мо1. Вю1. 196:901-917 (1987) ог Сйо1Ыа е! а1., №!иге 342:878-883 (1989).

В настоящем описании антитело, на которое ссылаются по номеру, представляет собой то же самое моноклональное антитело, что получено из гибридомы с тем же номером. Например, моноклональное антитело 2_112 является тем же антителом, что и антитело, полученное из гибридомы 2_112 или ее субклона, такого как 2_112_1, 2_112_2 и им подобного. Единственное исключение представляет собой гибридома 1_136_3, которая отличается от субклонов 1_13 6_1 и 1__13 6_2.

В настоящем описании Рй-фрагмент подразумевает фрагмент антитела, который состоит из доменов У_Н и С_Н1; Ρν-фрагмент состоит из доменов У|, и У_Н единственного плеча антитела; и фрагмент йАЬ (Аагй е! а1., №1иге 341:544-546 (1989)) состоит из домена У_Н.

В некоторых вариантах осуществления антитело является одноцепочечным антителом (^Ρν), в котором домены У_ъ и У_Н спарены для образования моновалентных молекул с помощью синтетического линкера, который дает им возможность быть одной белковой цепью. (В1гй е! а1., 8с1епсе 242:423-426 (1988) и Ник!оп е! а1., Ргос. №11. Асай. 8с1. И8А 85:5879-5883 (1988)). В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой димерные антитела, то есть являются бивалентными антителами, в которых домены У_Н и У|, экспрессированы на единственной полипептидной цепи, но используется линкер, который является слишком коротким, чтобы допускать спаривание между двумя данными доменами на одной и той же цепи, таким образом принуждая домены образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антигенсвязывающих сайта. (См., например, НоШдег Р. е! а1., Ргос. №11. Асай. 8ст И8А 90:6444-6448 (1993), и РоЩак Я. 1. е! а1., 81гис1иге 2:1121-1123 (1994)). В некоторых вариантах осуществления один или несколько СЭЯ-участков антитела согласно данному изобретению могут быть объединены в молекулу либо ковалентно, либо нековалентно, чтобы создать иммуноадгезин, который специфически связывается с миостатином. В таких вариантах осуществления СЭЯ может (могут) включаться, как часть, в большую полипептидную цепь, может (могут) ковалентно связываться с другой полипептидной цепью или может (могут) объединяться нековалентно. Более того каркасные участки (РЯ) могут происходить из одного из антител против миостатина, из которого взяты один или несколько СЭЯ, или из одного или нескольких различных антител человека.

В вариантах осуществления, имеющих один или несколько участков связывания, участки связывания могут быть идентичны один другому или могут различаться.

Используемый здесь термин человеческое антитело подразумевает любое антитело, в котором последовательности вариабельного и константного доменов являются последовательностями человека. Термин включает антитела с последовательностями, полученными с генов человека (то есть, с кодирующих генов), но которые были изменены, например, чтобы уменьшить возможную иммуногенность, увеличить аффинность, удалить цистеиновые остатки, которые могут вызывать нежелательный фолдинг и так далее. Термин включает такие антитела, создаваемые рекомбинантно в клетках, не являющихся клетками человека, которые могли бы привнести гликозилирование, не свойственное клеткам человека. Эти антитела могут быть получены различными способами, как описано ниже.

Применяемый здесь термин химерное антитело подразумевает антитело, которое содержит участки двух или более различных антител. В одном варианте осуществления один или несколько СЭЯ химерного антитела происходят из человеческого антитела против миостатина. В другом варианте осуществления все СЭЯ получены из человеческих антител против миостатина. В еще одном воплощении СЭЯ-участки более чем из одного человеческого антитела против миостатина объединены в химерное антитело. Например, химерное антитело может включать СЭЯ1 из легкой цепи первого человеческого антитела против миостатина, СЭЯ2 из легкой цепи второго человеческого антитела против миостатина и СЭЯ3 из легкой цепи третьего человеческого антитела против миостатина, и СЭЯ-участки тяжелой цепи могут происходить из одного или нескольких других антител против миостатина. Более того, каркасные участки могут происходить из одного из антител против миостатина, из которого взяты один или несколько СЭЯ-участков, либо из одного или нескольких различных человеческих антител.

- 6 015534

В некоторых вариантах осуществления химерное антитело согласно данному изобретению является гуманизированным антителом против миостатина. Гуманизированное антитело против миостатина согласно изобретению включает аминокислотную последовательность одного или нескольких каркасных участков и/или аминокислотную последовательность из по меньшей мере части константной области одного или нескольких человеческих антител против миостатина согласно данному изобретению и дополнительно содержит последовательности, например последовательности СЭР, полученные из антитела против миостатина, не являющегося антителом человека.

Фрагменты или аналоги антител или молекул иммуноглобулина могут быть легко получены простым специалистом в данной области после изучения настоящего описания. Предпочтительные Ν-концы и карбоксильные концы фрагментов или аналогов встречаются близ границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут распознаваться посредством сравнения данных о нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности с опубликованными или патентованными базами данных по последовательностям. Предпочтительным является применение компьютерных методов сравнения для распознавания мотивов последовательности или предсказанных конформационных доменов белка, которые встречаются в других белках с известной структурой и/или функцией. Способы распознавания белковых последовательностей, которые сворачиваются в известную трехмерную структуру, известны. См. Во\\'1с е! а1., 8с1еисе 253:164 (1991).

Используемый здесь термин поверхностный плазмонный резонанс относится к оптическому явлению, которое предусматривает исследование биоспецифических взаимодействий в реальном времени посредством выявления изменений концентраций белка на биосенсорной матрице, например, используя систему В1АСОВЕ™ (Рйаттааа Вюкепког АВ, Ирр8а1а, 8\\ебеп апб Р18са1а^ау, Ν.Ι.). Для дальнейших описаний смотрите 1оп8§оп и. е! а1., Апп. Вю1. С1ш. 51:19-26 (1993); 1оп8§оп и. е! а1., Вю1ес11пк.|ие5 11:620-627 (1991); 1оп55оп В. е! а1., 1. Мо1. Весодий. 8:125-131 (1995); и 1оп§8оп В. е! а1., Апа1. Вюсйет. 198:268-277 (1991).

Термин Κι./' подразумевает равновесную константу диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.

Термин скорость диссоциации означает константу скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.

Термин эпитоп включает любой белковый определяющий элемент, способный специфически связываться с иммуноглобулиновым или Т-клеточным рецептором или иначе - взаимодействовать с молекулой. Эпитопные детерминанты, как правило, состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи углевода или сахара и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Эпитоп может быть линейным или конформационным. В линейном эпитопе все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) встречаются линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе все точки взаимодействия встречаются поперек аминокислотных остатков белка, то есть отделены один от другого. Считается, что антитело специфически связывается с антигеном, если константа диссоциации составляет <1 мМ, предпочтительно <100 нМ и наиболее предпочтительно <10 нМ. В определенных вариантах осуществления 1<и составляет от 1 до 500 пМ. В других вариантах осуществления К_с находится между 500 пМ и 1 мкМ. В других вариантах осуществления К_с составляет от 1 мкМ до 100 нМ. В других вариантах осуществления К находится между 100 мМ и 10 нМ. После того как желаемый эпитоп на антигене найден, можно производить антитела к тому эпитопу, например, применяя способы, описанные в настоящем изобретении. Альтернативно, во время обнаружения, получения и определения характеристик антител может появиться информация о желательных эпитопах. Затем, исходя из этой информации, можно сортировать антитела по результатам конкурентного связывания с одним и тем же эпитопом. Подход для достижения этого заключается в проведении исследований конкурентного связывания для обнаружения антител, которые конкурентно связываются друг с другом, например, антитела конкурируют за связывание с антигеном. Технологический процесс с высокой производительностью для связанных антител, основанный на их конкурентном связывании, описан в международной патентной заявке № \¥О 03/48731.

В настоящем изобретении двадцать обычных аминокислот и их аббревиатуры применяются в стандартном обращении. См. 1ттипо1оду - А 8уп!йе5Й (2^пб Ебйюп, Е.8. Со1иЬ апб Ό.Β. Огеп, Еб§., 8шаиег А88ос1а!е8, 8ипбег1апб, Ма§8. (1991)), включенную в настоящее описание в виде ссылки.

Применяемый здесь термин полинуклеотид подразумевает полимерную форму из нуклеотидов длиной по меньшей мере 10 оснований, либо из рибонуклеотидов, либо из дезоксинуклеотидов, либо модифицированную форму из любого типа нуклеотидов. Термин включает одноцепочечные и двухцепочечные формы.

Применяемый здесь термин выделенный полинуклеотид подразумевает полинуклеотид, происходящий из генома, из кДНК или имеющий синтетическое происхождение или какую-либо их комбинацию; в силу своего происхождения выделенный полинуклеотид (1) не связан со всеми полинуклеотидами или с их частью, с которыми выделенный полинуклеотид встречается в природе, (2) функцио

- 7 015534 нально связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе в качестве части большей последовательности.

Используемый здесь термин встречающиеся в природе нуклеотиды включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Используемый здесь термин модифицированные нуклеотиды включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными группами сахаров и тому подобное. Термин олигонуклеотидные связи, на который здесь ссылаются, включает олигонуклеотидные связи, такие как фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, фосфороселеноатные, фосфородиселеноатные, фосфороанилотиоатные, фософораниладатные, фосфороамидатные и им подобные. См., например, ЬаИапсйе е! а1., №с1. Ас1бз Кез. 14:9081 (1986); §!ес е! а1., 1. Ат. СНет. 8ос. 106:6077 (1984); §!еш е! а1., №с1. Ас1бз Кез. 16:3209 (1988); Ζοη е! а1., Апй-Сапсег Игид Иез1дп 6:539 (1991); Ζοη е! а1., О11допис1еоббез апб Апа1одиез: А Ргас!юа1 Арргоасй, рр. 87-108 (Р. Ескз!еш, Еб., ОхГогб Ишуегзйу Ргезз, ОхГогб Епд1апб (1991)); США Ра!еп! №. 5151510; ИШтапп апб Реутап, Сйетюа1 Ке\зе\\'з 90:543 (1990), раскрытие которых включено в настоящее описание в виде ссылок. Если требуется, олигонуклеотид может содержать метку для детекции.

Функционально связанные последовательности включают и регулирующие экспрессию последовательности, которые прилегают к представляющему интерес гену, и регулирующие экспрессию последовательности, которые действуют в транс-положении или регулируют активность интересующего гена на расстоянии. Применяемый здесь термин регулирующая экспрессию последовательность подразумевает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для влияния на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они связаны. Регулирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, последовательности промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые увеличивают эффективность трансляции (то есть консенсусную Козак-последовательность); последовательности, которые увеличивают стабильность белка; и если требуется, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Свойства таких управляющих последовательностей различаются в зависимости от организма-хозяина; у прокариот такие регулирующие последовательности обычно содержат промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции; у эукариот, как правило, такие управляющие последовательности включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Термин регулирующие последовательности предназначен для охвата, как минимум, всех компонентов, присутствие которых является необходимым для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, присутствие которых благоприятно, например, лидерные последовательности и последовательности, участвующие при слиянии.

Используемый здесь термин вектор подразумевает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой плазмиду, то есть кольцевой двухцепочечный участок ДНК, в который могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В одних воплощениях вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в геном вируса. В других вариантах осуществления векторы способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую они вводятся (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы млекопитающих). В прочих вариантах осуществления векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут интегрировать в геном клетки-хозяина через введение в клетку-хозяина, и таким образом реплицироваться вместе с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы обозначены здесь как рекомбинантные экспрессионные векторы (или просто экспрессионные векторы).

Используемый здесь термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) подразумевает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что рекомбинантная клетка-хозяин и клетка-хозяин подразумевают не только отдельную клетку, о которой идет речь, но также потомство такой клетки. Поскольку определенные модификации могут встречаться в последующих поколениях вследствие либо мутации, либо воздействий окружающей среды, такое потомство в действительности может быть не идентичным родительской клетке, но все еще будет охвачено рамками используемого здесь термина клетка-хозяин.

Применяемый здесь термин избирательно гибридизовать подразумевает связываться специфически и с возможностью детектировать. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты в соответствии с данным изобретением избирательно гибридизуются с цепями нуклеиновой кислоты при условиях гибридизации и промывки, которые сводят к минимуму значительные количества детектируемого связывания с неспецифическими нуклеиновыми кислотами. Высокая строгость или очень строгие условия могут применяться для достижения условий избирательной гибридизации, как известно в данной области и обсуждается здесь. Одним примером высокой строгости или очень строгих условий является инкубация полинуклеотида с другим полинуклеотидом, где один полинуклеотид может быть прикреплен к

- 8 015534 твердой поверхности, такой как мембрана, в буфере для гибридизации 6Х 88РЕ или 88С, 50% формамиде, 5Х растворе Денхардта, 0,5% 8Ό8, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при температуре гибридизации 42°С в течение 12-16 ч с последующей двукратной промывкой при 55°С с применением буфера для промывки IX 88С, 0,5% 8Ό8. Смотрите также 8атЬгоок с1 а1. , кирга, стр. 9.50-9.55.

Термин процент идентичности последовательности в контексте последовательностей нуклеиновой кислоты подразумевает остатки в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании на максимальное соответствие. Длина сравниваемого участка последовательности может составлять по меньшей мере около девяти нуклеотидов, обычно - по меньшей мере около 18 нуклеотидов, чаще - по меньшей мере около 24 нуклеотидов, типично - по меньшей мере порядка 28 нуклеотидов, более типично - по меньшей мере примерно 32 нуклеотида и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 36, 48 или более нуклеотидов. Существует несколько различных алгоритмов, известных в данной области, которые могут применяться для измерения идентичности нуклеотидной последовательности. Например, полинуклеотидные последовательности могут сравниваться при помощи ЕЛ8ТЛ, Сар или ΒοχίΓίΙ. являющихся программами в Χνίχοοηχίπ Раскадс Усгкюп 10.0, СспсНех СотрШсг Сгоир (ССС), Майкоп, νίκ^^ω. РЛ8ТЛ, которая включает, например, программы ЕЛ8ТЛ2 и ЕЛ8ТЛ3, обеспечивает выравнивание и процент идентичности последовательности участков наилучшего совпадения между запрашиваемыми последовательностями и перебираемыми последовательностями (Рсагкоп, Мс11ю4х Епхуто1. 183:63-98 (1990); Рсагкоп, Мс11ю4к Мо1. Вю1. 132:185-219 (2000); Рсагкоп, МсЛойк Епхуто1. 266:227258 (1996); Рсагкоп, 1. Мо1. Вю1. 276:71-84 (1998); включенные в настоящее описание в виде ссылок). Если не оговорено иначе, используются параметры по умолчанию для конкретной программы или алгоритма. Например, процент идентичности последовательности нуклеиновых кислот может быть определен при использовании ЕА8ТА с ее параметрами по умолчанию (размер группы символов равен 6, и используется коэффициент ЫОРАМ для матрицы сходства) или при использовании Сар с ее параметрами по умолчанию, как предложено в ССС Усгкюп 6.1, представленными здесь в виде ссылок.

Ссылка на нуклеотидную последовательность включает и комплементарную ей последовательность, если не оговорено иначе. Таким образом, упоминание нуклеиновой кислоты, имеющей конкретную последовательность, подразумевает описание ее комплементарной цепи с ее комплементарной последовательностью.

Используемые здесь термины процент идентичности последовательности и процент гомологии последовательности являются взаимозаменяемыми.

Термин значительное сходство или значительное сходство последовательности, относящийся к нуклеиновой кислоте или ее фрагменту, подразумевает, что при оптимальном выравнивании с подходящими нуклеотидными инсерциями или делециями, идентичность нуклеотидной последовательности другой нуклеиновой кислоте (или ее комплементарной цепи) составляет по меньшей мере около 85%, предпочтительно по меньшей мере около 90% и более предпочтительно по меньшей мере около 95, 96, 97, 98 или 99% нуклеотидных оснований, что определяется посредством любого известного алгоритма для оценки идентичности последовательности, как например, ЕА8ТА, ВЬА8Т или Сар, как описано выше.

При употреблении термина значительное сходство в отношении полипептидов подразумевается, что для двух пептидных последовательностей при оптимальном выравнивании, как например, посредством программ САР или ВЕ8ТЕ1Т при использовании плотностей с интервалом по умолчанию, который поставляется с программами, характерна по меньшей мере 70, 75 или 80% идентичность последовательности, предпочтительно по меньшей мере 90 или 95% идентичность последовательности и более предпочтительно по меньшей мере 97, 98 или 99% идентичность последовательности. В определенных вариантах осуществления остатки, которые не являются идентичными, различаются вследствие консервативных аминокислотных замен. Консервативная аминокислотная замена - это замена, при которой аминокислотный остаток замещен другим аминокислотным остатком, имеющим боковую В-группу со схожими химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). Как правило, консервативная аминокислотная замена не изменяет значительно функциональные свойства белка. В случаях, когда две или более аминокислотных последовательностей отличаются друг от друга консервативными заменами, процент идентичности последовательности может быть увеличен, чтобы скорректировать консервативную природу замены. Способы для осуществления такого регулирования хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Рсагкоп, МсЛойк Мо1. Вю1. 243:307-31 (1994). Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические гидроксильные боковые цепи: серии и треонин; 3) боковые цепи, содержащие амидную группу: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; 6) кислотные боковые цепи: аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и 7) боковые цепи, содержащие серу: цистеин и метионин. Группы консервативных аминокислотных замен это: валинлейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагинглутамин.

Альтернативно, консервативная замена представляет собой любое изменение, имеющее положи

- 9 015534 тельное значение в логарифмической матрице правдоподобия РАМ250, описанной у Сопле! и др., 8с1епсе 256:1443-45 (1992), включенного в настоящее описание в виде ссылки. Умеренно консервативная замена представляет собой любое изменение, не имеющее негативного значения в РАМ250 логарифмической матрице правдоподобия.

Идентичность последовательности для полипептидов обычно оценивается при применении программного обеспечения для анализа последовательностей. Компьютерные программы для анализа белков сравнивают последовательности, используя критерии сходства, приписанные различным заменам, делециям и другим модификациям, включая консервативные аминокислотные замены. Например, ССС включает программы, такие как Сар и Вех1Гц. которые можно использовать с предусмотренными программами параметрами по умолчанию, для определения гомологии последовательности или идентичности последовательности близкородственных полипептидов, таких как гомологичные полипептиды различных видов организмов или белок дикого типа и его мутеин. См., например, ССС Уегхюп 6.1 (ϋηίуегхйу оГ Χνί^οηχίπ, VI). Также полипептидные последовательности можно сравнивать, применяя ЕА8ТА с параметрами по умолчанию или рекомендованными параметрами, смотрите ССС Уегкюп 6.1. ЕА8ТА (например, ЕА8ТА2 и ЕА8ТА3) обеспечивает выравнивание и процент идентичности последовательности участков наилучшего перекрывания между запрашиваемыми и перебираемыми последовательностями (Реагкоп, Ме1йобк Епхуто1. 183:63-98 (1990); Реагкоп, Ме1йобк Μοί. ΒίοΙ. 132:185-219 (2000)). Другой предпочтительный алгоритм при сравнении последовательности согласно данному изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей различных организмов, представляет собой компьютерная программа ВЬА8Т, в особенности Ыак1р или 1Ыак!п, при использовании параметров по умолчанию, которые поставляются с программами. См., например, А11ксйц1 е! а1., I. Мо1. Вю1. 215:403-410 (1990); А11ксйц1 е! а1., Ыискю Аск1к Век. 25:3389-402 (1997).

Длина полипептидных последовательностей, проверяемых на гомологию, как правило, составляет по меньшей мере около 16 аминокислотных остатков, обычно по меньшей мере около 20 остатков, чаще по меньшей мере около 24 остатков, характерно по меньшей мере около 28 остатков и предпочтительно более чем около 35 остатков. При поиске базы данных, содержащей последовательности большого количества различных организмов, предпочтительным является сравнение аминокислотных последовательностей.

Используемые здесь термины метка или меченый говорят о введении еще одной молекулы в антитело. В одном варианте осуществления данная метка представляет собой детектируемый маркер, например, введение аминокислоты с радиоактивной меткой или присоединение к полипептиду биотинилированных частей, которые можно детектировать помеченным авидином (например, стрептавидин, содержащий флуоресцентный маркер, или ферментативную активность, которые можно детектировать оптическими или колориметрическими способами). В другом воплощении метка или маркер могут быть терапевтическим средством, например, лекарственным конъюгатом или токсином. В данной области известны и могут использоваться различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов. Примеры меток для полипептидов включают, но не ограничиваются ими, следующее: радиоизотопы или радионуклиды (например, ³Н, ¹⁴С, ¹⁵Ν, ³⁵δ, ⁹⁰Υ, ⁹⁹Тс, ^ш1п, ¹²⁵1, ¹³¹1), флуоресцентные метки (например, Е1ТС, родамин, лантаноидные люминесцирующие вещества), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфотаза), хемилюминесцентные маркеры, биотинилированные группы, заранее установленные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновая застежка, сайты связывания вторичных антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки), магнитоактивные вещества, такие как хелаты гадолиния, токсины, такие как токсин коклюша, таксол, цитохаластин В, грамицидин Ό, бромистый этидий, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. В некоторых вариантах осуществления метки прикрепляются посредством ножек различной длины для уменьшения потенциальной стерической преграды.

Следует понимать, что во всем данном подробном изложении и в формуле изобретения слово включает или вариации, такие как включают или включающие, подразумевают включение заявленного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.

Человеческие антитела против миостатина и их описание

Изобретение предлагает антитела против миостатина. В одних вариантах осуществления данные антитела являются антителами человека. В других вариантах осуществления антитела представляют собой гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела против миостатина получают посредством иммунизации трансгенного животного, не являющегося человеком, например, грызуна, чей геном содержит гены иммуноглобулина человека, так что у трансгенного животного вырабатываются антитела человека.

Антитело против миостатина согласно данному изобретению может содержать человеческую легкую цепь каппа-типа или лямбда-типа или аминокислотную последовательность, производную от них. В некоторых вариантах осуществления, включающих легкую цепь каппа-типа, вариабельный домен легкой

- 10 015534 цепи (У_ь) кодируется геном человека А30, А3 или Ь2 ν_κ.

В одних вариантах осуществления V антитела против миостатина содержит одну или несколько аминокислотных замен, делеций или инсерций (вставок) относительно исходной аминокислотной последовательности ν_κ. В других вариантах осуществления антитела против миостатина содержит 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен относительно исходной аминокислотной последовательности ν_κ. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько замен исходной последовательности находятся в СЭК-участках легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены в ν_κ относительно исходной последовательности находятся в одной или нескольких тех же самых позициях, что и замены относительно исходной последовательности, обнаруженные в любом одном или более ν антител, предлагаемых здесь. Например, ν антитела против миостатина согласно изобретению может содержать одну или несколько аминокислотных замен относительно исходной последовательности, обнаруженных в У₂ антител 1_257_1. Также может существовать одна или несколько аминокислотных замен относительно исходной последовательности, обнаруженных в ν антитела 1 116 1, которое кодируется тем же самым геном ν_κ, что и антитело 1_257_1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены находятся в одной или более тех же самых положениях, но приводят к разным заменам, по сравнению с упоминаемым антителом. Во всех случаях при упоминании клона антитела с черточками он является равносильным тому же самому клону антитела с точками (например, 1_257_1=1.257.1).

В одних вариантах осуществления аминокислотные замены относительно исходной последовательности встречаются в одной или более тех же самых положениях, что и замены в исходной последовательности в любом из ν антител 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1Ε-Ρ45κ; 1_257_1Ь-Ь2Н; 1_314_1Н-Т92А; 1_46_1Н-Ь81М;

2_112_1Η-Ι12ν; 2_112_1Ь-Р581; 2_112_1Τ-Ι85ν; 2_112_1Н-Ь81М, Ь-Р581; 2_112_1Н-Ь81М, Τ-Ι85ν или 2_112_1Н-Ь81М, Ь-Р581, Ι85ν, но замены могут представлять собой консервативные аминокислотные замены в подобном положении (подобных положениях) относительно аминокислот в упоминаемом антителе. Например, если определенное положение в одном из этих антител меняется относительно исходной последовательности и представляет собой глутамат, он может заместить аспартат в том же положении. Подобным образом, если аминокислотная замена, сравненная с исходной последовательностью в иллюстративном антителе, представляет собой серии, она может консервативно заменить в том положении треонин на серии. Консервативные аминокислотные замены рассматривались кирга в этом заявлении.

В других вариантах осуществления антитело против миостатина содержит аминокислотную последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 30, 40 и 44. В других вариантах осуществления легкая цепь включает аминокислотную последовательность легкой цепи антитела 1_116_1Ε-Ρ45κ; 1_257_1Ε-Ε21Ι; 2_112_1Ε-Ρ58Ι; 2_112_1Ε-Ι85ν или 2_112_1Ε-Ρ58Ι, Ι85ν. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь человеческого антитела против миостатина содержит аминокислотную последовательность ν антитела 1_116_1 (8ЕЦ ΙΌ N0: 4); 1_136_3 (8ЕС) ΙΌ N0: 12); 1_257_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 16); 1_46_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 24); 2_112_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 28); 1_314_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 20); 1_66_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 36); 2_43_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 44); 2_177_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 40); 1_132_1 (8ЕЦ ΙΌ N0: 8) или 1_268_1 (8ЕЦ ΙΌ N0: 32), или указанную аминокислотную последовательность, имеющую до 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных аминокислотных замен и/или в итоге до 3 неконсервативных аминокислотных замен. В других вариантах осуществления легкая цепь человеческого антитела против миостатина содержит аминокислотную последовательность ν антитела 1_116_1Е-О451<; 1_257_1Ь-Ь2П; 2_112_1Ε-Ρ58Ι; 2_112_1Ε-Ι85ν или 2_112_1Ε-Ρ58Ι, 185ν. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь включает аминокислотную последовательность от начала СОКТ до конца СЭК3 любого из вышеприведенных антител.

В других вариантах осуществления легкая цепь может содержать аминокислотные последовательности участков СЭКТ, СЭК2 и СЭК3. независимо выбранных из участков легкой цепи СЭК1. СЭК2 и ί.ΌΚ3. соответственно, двух или более моноклональных антител, выбранных из 1_116_1 (8ЕЦ ΙΌ N0: 4); 1_136_3 (8ЕС) ΙΌ N0: 12); 1_257_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 16); 1_46_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 24); 2_112_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 28); 1_314_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 20); 1_66_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 36); 2_43_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 44); 2_177_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 40); 1_132_1 (8ЕЦ ΙΌ N0: 8) или 1_268_1 (8ЕЦ ΙΌ N0: 32), или указанные СОК-участки, каждый имеющий менее, чем 3 или менее чем 2 консервативные аминокислотные замены и/или всего три или менее неконсервативных аминокислотных замен.

В определенных вариантах осуществления легкая цепь антитела против миостатина содержит аминокислотные последовательности легкой цепи участков СЭКЕ СЭК2 и СЭК3 антитела, выбранного из 1_116_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 4); 1_136_3 (8ЕС) ΙΌ N0: 12); 1_257_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 16); 1_46_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 24); 2_112_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 28); 1_314_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 20); 1_66_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 36); 2_43_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 44); 2_177_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 40); 1_132_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 8) или 1_268_1 (8ЕС) ΙΌ N0: 32), или указанные участкиΤΌΚ, каждый имеющий менее чем 3 или менее чем 2 консервативные аминокислотные замены и/или всего три или менее неконсервативных аминокислотных замен.

В отношении тяжелой цепи в некоторых вариантах осуществления вариабельный домен ^_Н) кодируется человеческим геном ν 1-02, 3-21 или 3-23. В других вариантах осуществления последовательность антитела против миостатина содержит одну или более аминокислотных замен, делеций или

- 11 015534 инсерций (вставок), обобщенно - мутаций, относительно исходной аминокислотной последовательности ν_Η. В одних вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 мутаций по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью ν_Η. В других вариантах осуществления мутация (мутации) являются неконсервативными заменами относительно исходной аминокислотной последовательности. В иных воплощениях мутации находятся в СПК-участках тяжелой цепи.

В одних вариантах осуществления аминокислотные замены находятся в одном или более тех же самых положениях, что и замены в исходной последовательности любого одного или более ν_Η антител 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1Ь-Р45К; 1_257_1Ь-Ь2И; 1_314_1Н-Т92А; 1_46_Ш-Ь81М; 2_112_1Η-Ι12ν; 2_112_1Ε-Ρ58Ι; 2_112_1Ε-Ι85ν; 2_112_Ш-Ь81М, Ε-Ρ58Ι; 2_112_Ш-Ь81М, Ε-Ι85ν или 2_112_Ш-Ь81М, Ε-Ρ58Ι, Ι85ν. В других вариантах осуществления аминокислотные замены находятся в одном или более тех же самых положениях, но включают иные замены, чем в указанном антителе.

В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 и 42. В других вариантах осуществления тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела 1_314_1Н-Т92А, 1_46_1И-Ь81М или 2_112_1Η-Ι12ν. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность ν_Η антитела 1_116_1 (8Е0 ΙΌ N0: 2), 1_136_3 (5ЕО ГО N0: 10), 1_257_1 (5ЕО ГО N0: 14), 1_46_1 (5ЕО ГО N0: 22), 2_112_1 (5ЕО ГО N0: 26), 1_314_1 (5ЕО ГО N0: 18), 1_66_1 (5ЕО ГО N0: 34), 2_43_1 (5ЕО ГО N0: 42), 2_177_1 (5ЕО ГО N0: 38), 1_132_1 (8Е0 ΙΌ N0: 6) и 1_268_1 (8Е0 ΙΌ N0: 30); или указанную аминокислотную последовательность ν_Η, имеющую до 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10 или 11 консервативных аминокислотных замен и/или всего до 3 неконсервативных аминокислотных замен. В других вариантах осуществления тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность ν_Η антитела 1_314_1Н-Т92А, 1_46_1И-Ь81М или 2_112_1Η-Ι12ν. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность от начала СПК1 до конца СПК3 любого из указанных антител.

В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь содержит участки СПК1, СПК2 и СПК3 тяжелой цепи антитела 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1Ь-Р45К; 1_257_1Ь-Ь2И; 1_314_1Н-Т92А; 1_46_Ш-Ь81М; 2_112_1Η-Ι12ν; 2_112_1Ε-Ρ58Ι; 2_112_1Ε-Ι85ν; 2_112_Ш-Ь81М, Ε-Ρ58Ι; 2_112_Ш-Ь81М, Ε-Ι85ν или 2_112_Ш-Ь81М, Ε-Ρ58Ι, Ι85ν или указанные СПК-участки, каждый имеющий менее чем 8, менее чем 6, менее чем 4, или менее чем 3 консервативные аминокислотные замены и/или всего три или менее неконсервативных аминокислотных замен.

В некоторых вариантах осуществления СПК-участки тяжелой цепи независимо выбраны из СПКучастков двух или более антител, выбранных из антител 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1Ь-Р45К; 1_257_1Ь-Е2И; 1_314_1Η-Τ92Α; 1_46_Ш-Ь81М; 2_112_1Η-Ι12ν; 2_112_1Ε-Ρ58Ι; 2_112_1Ε-Ι85ν; 2_112_Ш-Ь81М, Ε-Ρ58Ι; 2_112_1ΗЬ81М, Ε-Ι85ν или 2_112_1И-Е81М, Ε-Ρ58Ι, Ι85ν. В другом варианте осуществления антитело содержит легкую цепь, как описано выше, и тяжелую цепь, как описано выше. В еще одном варианте осуществления СПК-участки легкой цепи и СПК-участки тяжелой цепи взяты из одного и того же антитела.

В различных вариантах осуществления антитела против миостатина имеют полноразмерную аминокислотную последовательность (последовательности) тяжелой цепи и легкой цепи, аминокислотные последовательности ν_Η и У_ь, аминокислотные последовательности СПК1, СПК2 и СПК3 тяжелой цепи и СПК1, СПК2 и СПК3 легкой цепи или аминокислотную последовательность тяжелой цепи от начала СПК1 до конца СПК3 и аминокислотную последовательность легкой цепи от начала СПК1 до конца СПК3 предлагаемого здесь антитела против миостатина.

Один тип аминокислотной замены, который можно произвести, это заменить один или более цистеинов в антителе, которое может быть химически реактивным, на другой остаток, такой как, без ограничений, аланин или серин. В одном воплощении представлена замена неканонического цистеина. Данную замену можно произвести в СОК-участке или каркасном участке вариабельного домена или в константной области антитела. В некоторых вариантах осуществления цистеин является каноническим.

Еще один тип аминокислотной замены, который можно осуществить, это удаление потенциальных протеолитических сайтов в антителе. Такие сайты могут встречаться в СПК-участке или каркасном участке вариабельного домена или в константном домене антитела. Замена цистеиновых остатков и удаление протеолитических сайтов может уменьшить опасность гетерогенности при продукции антител и таким образом увеличить их гомогенность. Другой тип аминокислотной замены представляет собой исключение пар аспарагин-глицин, которые образуют потенциальный сайт дезаминирования, посредством изменения одного или обоих остатков.

В некоторых вариантах осуществления С-терминальный лизин тяжелой цепи антитела против миостатина согласно данному изобретению гидролизован. В различных вариантах осуществления изобретения тяжелая и легкая цепи антител против миостатина могут необязательно включать сигнальную последовательность.

- 12 015534

В одном аспекте данное изобретение предлагает одиннадцать подавляющих человеческих моноклональных антител против миостатина и гибридомные клеточные линии, которые их продуцируют. Табл. 1 отображает идентификаторы последовательности (8ЕО ΙΌ N0) нуклеиновых кислот, кодирующих полноразмерные тяжелые и легкие цепи и вариабельный домен, содержащий части этих цепей, и соответствующие выведенные полноразмерные аминокислотные последовательности.

______________________________Таблица 1______________________________

ИДЕНТИФИКАТОРЫ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (ЗЕО Ю N0)

тАЬ	ПОЛНЫЙ РАЗМЕР	ЧАСТЬ, СОДЕРЖАЩАЯ У-ДОМЕН
ТЯЖЕЛАЯ	ЛЕГКАЯ	ТЯЖЕЛАЯ	ЛЕГКАЯ
ДНК	БЕЛОК	ДНК	БЕЛОК	БЕЛОК	ДНК	БЕЛОК	ДНК
1_116_1	1	2	3	4	45	46	47	48
1_132_1	5	6	7	8	49	50	51	52
1_136_3	9	10	11	12	53	54	55	56
1257_1	13	14	15	16	57	58	59	60
1_314_1	17	18	19	20	65	66	67	68
1_46_1	21	22	23	24	69	70	71	72
2_112_1	25	26	27	28	77	78	79	80
1_268_1	29	30	31	32	61	62	63	64
1_66_1	33	34	35	36	73	74	75	76
2_177_1	37	38	39	40	81	82	83	84
2_4 3_1	41	42	43	44	85	86	87	88

Изобретение также предоставляет варианты тяжелой и/или легкой цепи определенных ранее указанных человеческих антител против миостатина, содержащих одну или более аминокислотных модификаций. Для обозначения вариантов первая буква представляет собой однобуквенное обозначение аминокислоты встречающейся в природе цепи антитела, цифра относится к положению аминокислоты (где позиция один является Ν-терминальной аминокислотой ΡΚΙ), и вторая буква представляет собой однобуквенное обозначение модификации аминокислоты.

Данное изобретение предлагает модификацию легкой цепи моноклонального антитела 1_116_1, названного 1_116_1 Б-О45К. у которого лизин находится в позиции 45 в 8Е0 ΙΌ N0: 4.

Другой модификацией легкой цепи является 1_257_1Ь-Ь211, которая несет остаток изолейцина в положении 21 в 8Е0 ΙΌ N0: 16.

Модификация тяжелой цепи моноклонального антитела 1_314_1, названная 1_314_1Н-Т92А, в которой остаток аланина находится в положении 92 в 8Е0 ΙΌ N0: 18.

Кроме того, изобретение предлагает модификацию тяжелой цепи моноклонального антитела 1_46_1, названного 1_46_1Н-Ь81М, которая несет метионин в положении 81 в 8Е0 ΙΌ N0: 22.

Данное изобретение предоставляет модификацию тяжелой цепи (Ι12ν) и две модификации легкой цепи (Ρ58Ι и Ι85ν) моноклонального антитела 2_112_1. Модификация тяжелой цепи, называемая 2_112_1Η-Ι12ν, несет валин в положении 12 в 8Е0 ΙΌ N0: 26. У одного варианта легкой цепи, 2_112_1Π-Ρ85Ι, изолейцин находится в положении 85 в 8Е0 ΙΌ N0: 28. В другом варианте легкой цепи, обозначаемой 2_112_1Ε-Ι85ν, валин находится в положении 85 в 8Е0 ΙΌ N0: 28. Также изобретение предлагает модификацию легкой цепи, включающую обе мутации, то есть 2_112_1Π-Ρ85Ι, Ι85ν. Также изобретение включает антитела, содержащие модификацию тяжелой цепи либо с одной, либо с обеими мутациями легкой цепи, то есть 2_112_1Η-Ι12ν, Ε-Ρ58Ι; 2_112_1Н-П2^ Ε-Ι85ν и 2_112_1Η-Ι12ν, ЬΡ58Ι, Ι85ν.

В других вариантах осуществления данное изобретение включает антитела, содержащие аминокислотные последовательности вариабельного домена более чем с 80%, более чем с 85%, более чем с 90%, более чем с 95%, более чем с 96%, более чем с 97%, более чем с 98% или более чем с 99% идентичностью аминокислотной последовательности вариабельного домена любого указанного ранее человеческого антитела против миостатина.

Класс и подкласс антител против миостатина

Класс и подкласс антител против миостатина может быть определен посредством любого способа, известного в данной области. Как правило класс и подкласс антитела может быть установлен при применении антител, характерных для определенного класса и подкласса антител. Такие антитела доступны коммерчески. Класс и подкласс можно определить посредством ЕЫ8А или вестерн-блота, также как и другими способами. Альтернативно класс и подкласс можно установить посредством секвенирования целых константных доменов, или части, тяжелой и/или легкой цепей антител, сравнивая их аминокис

- 13 015534 лотные последовательности с известными аминокислотными последовательностями различных классов и подклассов иммуноглобулинов, и определяя класс и подкласс антител.

В некоторых вариантах осуществления антитело против миостатина является моноклональным антителом. Антитело против миостатина может быть молекулой 1дС, 1дМ, 1дЕ, 1дА или Ι§Ό. В предпочтительном варианте осуществления антитело против миостатина является ОС и представляет собой подкласс ОСЕ ^С2, ОСЗ, ОС4. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой подкласс ОС2.

Распознавание эпитопов миостатина, распознаваемых антителами против миостатина

Данное изобретение предоставляет человеческое моноклональное антитело против миостатина, которое связывается с миостатином и конкурирует или конкурентно связывается с и/или связывается с тем же самым эпитопом, что и: (а) антитело, выбранное из 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1Ь-О45К; 1_257_1Ь-Ь2П; 1_314_1Н-Т92А; 1_46_1Н-Ь81М; 2_112_1Н4^; 2_112_1Ε-Ε58Ι; 2_112_1Ε-Ι85ν; 2_112_1Н-Ь81М, Ε-Ε58Ι; 2_112_1НЬ81М, Ε-Ι85ν или 2_112_1Н-Ь81М, Ε-Ε58Ι, Ι85ν; (Ь) антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность домена V любой из 8Е0 ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 или 85, (с) антитело, которое содержит вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность домена V любой из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 или 87, (б) антитело, которое включает и вариабельный домен тяжелой цепи, как оговорено в пункте (Ь), и вариабельный домен легкой цепи, как описано в пункте (с).

Определить, связывается ли антитело с тем же самым эпитопом или конкурирует за связывание с антителом против миостатина можно посредством применения способов, известных в данной области. В одном варианте осуществления специалист связывает антитело против миостатина согласно данному изобретению с миостатином при насыщающих условиях и затем измеряет способность тестируемого антитела связываться с миостатином. Если тестируемое антитело способно связываться с миостатином одновременно с контрольным антителом против миостатина, тогда тестируемое антитело связывается с иным эпитопом, чем контрольное антитело против миостатина. Однако, если тестируемое антитело не может связаться с миостатином в то же самое время, значит, тестируемое антитело связывается с тем же самым эпитопом, перекрывающимся эпитопом, или с эпитопом, который находится в близком соседстве с эпитопом, связываемым антителом против миостатина согласно данному изобретению. Этот эксперимент можно провести посредством ЕЫ8А, К1А, ВIАС0КЕ™ или проточной цитометрии. Для того чтобы тестировать конкурирует ли антитело против миостатина с другим антителом против миостатина, специалист может использовать метод сравнения, описанный ранее в двух руководствах, то есть определяя блокирует ли известное антитело тестируемое антитело и наоборот. В предпочтительном варианте осуществления эксперимент проводится посредством ЕЫ8А.

Подавление активности миостатина антителами против миостатина

Проведя несколько испытаний, специалист может распознать моноклональные антитела против миостатина, которые ингибируют связывание миостатина. Например, нейтрализующие антитела против миостатина можно идентифицировать по их способности блокировать вызываемую миостатином активность люциферазы в А204 клетках, трансфицированных конструкцией 8таб-чувствительные элементы/люцифераза, как описано в примере ΙΙΙ. Предпочтительные антитела против миостатина имеют Κ.'₅₀ не более чем 500, 250, 100, 75, 50, 40, 30, 20, 10, 1, 0,5 или 0,1 нМ.

Специалист также может определить способность антитела против миостатина блокировать индуцируемую миостатином активацию 8таб-белка посредством контакта клеток миобластов крысы линии Ь6, трансфицированных конструкцией 8таб 2/3-связывающий элемент/бета-лактамаза, с антителом против миостатина, как описано в примере Ιν. В различных вариантах осуществления антитело против миостатина имеет ^50 в этом испытании не более чем 500, 250, 100, 75, 50, 40, 30, 20, 10, 1, 0,5 или 0,1 нМ.

Альтернативно, нейтрализующие антитела против миостатина можно распознать по их способности ингибировать фосфорилирование 8таб 2 или 3 в вестерн-блоте, как описано в примере V.

В иных вариантах осуществления антитело против миостатина согласно данному изобретению модулирует экспрессию генов, связанных с пролиферацией и дифференциацией мышечной клетки. Такое модулирование включает, но не ограничивается этим, уменьшение экспрессии белка-ингибитора клеточного цикла Р21 и проапоптического белка-Вах, увеличение фосфорилирования КЬ и увеличение экспрессии Сбк2. В некоторых вариантах осуществления антагонистичные антитела против миостатина согласно изобретению увеличивают экспрессию МуоЭ, миогенина и Му£5. Влияние антитела против миостатина на экспрессию гена можно определить, применяя любой из рутинных способов. (См., например, пример νΙ).

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело против миостатина согласно изобретению усиливает дифференциацию миобластов. Способность антитела увеличивать такую пролиферацию и дифференциацию можно определить посредством исследований с применением, например, клеток С2С12, как описано в примере νΙΙ.

- 14 015534

Конкурирующие человеческие антитела против миостатина в сравнении с неконкурирующими

Человеческие антитела против миостатина согласно данному изобретению можно распределить по категориям, как конкурирующие и неконкурирующие с другими подавляющими, связывающими миостатин белками, применяя эксперименты по иммунопреципитации. Например, пропептид, который образует комплекс со зрелым СЭЕ8 является белком-ингибитором. Кондиционированная среда клеток 293Т, экспрессирующих ΟΌΡ8, содержит зрелый ΟΌΡ8, комплекс зрелого ΟΌΡ8 и пропептида и непроцессированный СЭЕ8. Применяя эту кондиционированную среду, проводили исследования иммунопреципитации для определения связывания человеческих антител против миостатина согласно изобретению с комплексом зрелого ΟΌΡ8 и пропептида. Как описано в примере X, антитела 2_112_1, 2_43_1 и 2_177_1 связывали и иммунопреципитировали зрелый ΟΌΡ8, комплекс зрелого ΟΌΡ8 и пропептида и непроцессированный ΟΌΡ8. Антитело 1_66_1 связывало и иммунопреципитировало зрелый ΟΌΡ8 и комплекс зрелого СЭЕ8 и пропептида. Ни одно из других антител не иммунопреципитировало зрелый ΟΌΡ8, пропептид или непроцессированный СЭЕ8. Таким образом, антитела 2_112_1, 2_43_1 и 2_177_1 являются неконкурирующими антителами, и антитело 1_66_1 также является неконкурирующим антителом, но оно связывается с другим эпитопом миостатина. Неконкурирующее нейтрализующее антитело, то есть антитело, которое связывает миостатин в присутствии других белков-ингибиторов, будет иметь лучшую эффективность ίη νίνο, чем конкурирующее антитело.

В других вариантах осуществления антитело против миостатина согласно изобретению иммунопреципитировало зрелый ΟΌΡ8 из сыворотки мыши. Как описано в примере XI, моноклональные антитела 2_112, 2_43_1 и 2_177 меньше связываются со зрелым ΟΌΡ8, чем 1_116_1 и 1_66_1.

Видоспецифичность и молекулярная селективность

В еще одном аспекте изобретения антитела против миостатина демонстрируют и видоспецифичность, и молекулярную селективность. В некоторых вариантах осуществления антитело против миостатина связывается с миостатином человека, мыши, Кайик погуедюик (норвежской крысы), супото1ди5 тасасще (обезьяны), Масаса Га5сюи1ап5 (макаки-крабоеда), Ме1еадгк даНорасо (индюка), 8и5 ксгоГа (свиньи), Са11и5 да11и5 (цыпленка), СапИ ГатШагк (собаки), Едиик саЬаЙик (лошади), Со!игшх сЫпепкк (перепела), Со!игшх со!игшх (перепела обыкновенного) и Со1итЬа 1ίνίη (домашнего голубя). После обучения по данной спецификации специалист может определить видоспецифичность антитела против миостатина, применяя способы, хорошо известные в данной области. Например, специалист может определить видоспецифичность, применяя вестерн-блот, поверхностный плазмонный резонанс, например, В1Асоге, ЕЫ8А, иммунопреципитацию или К1А.

В других вариантах осуществления антитело против миостатина характеризуется большей селективностью по отношению к миостатину по сравнению с СЭЕ11 по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 100 раз. СОЕ 11 - член близкого миостатину семейства, который проявляет девяностопроцентную идентичность с его зрелым белком. В некоторых вариантах осуществления антитело против миостатина не проявляет какого-либо значительного специфического связывания с любым другим белком отличным от миостатина. После обучения по спецификации специалист может определить селективность антитела против миостатина по отношению к миостатину, применяя способы хорошо известные в данной области. Например, он может определить селективность, применяя вестерн-блот, проточную цитометрию, ЕЫ8А, иммунопреципитацию или К1А.

В других вариантах осуществления согласно данному изобретению антитело против миостатина не имеет этого высокого уровня селективности к СЭЕ8 по сравнению с СЭЕ11.

Способы получения антител и клеточные линии, продуцирующие антитело Иммунизация

В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела продуцируются иммунизированным антигеном миостатина трансгенным животным, не являющимся человеком, содержащим в своем геноме некоторые или все локусы тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина человека. В предпочтительном варианте осуществления животное, не являющееся человеком, - это животное ХЕ/Ы0М0и8Е™ (АЬдешх, 1пс., Ргетоп!, СА).

Мыши ХЕМ0М0И8Е™- это мышиные генно-инженерные линии, которые содержат большие фрагменты локусов тяжелой цепи и легкой цепи человеческого иммуноглобулина и у которых отсутствует продукция мышиного антитела. См., например, Сгееп и др., №11иге Сепейск 7:13-21 (1994) и патенты США 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598, 6130364, 6162963 и 6150584. Смотрите также №0 91/10741, №0 94/02602, №0 96/34096, №0 96/33735, №0 98/16654, №0 98/24893, №0 98/50433, №0 99/45031, №0 99/53049, №0 00/09560 и №0 00/037504.

В еще одном аспекте данное изобретение предлагает способ выработки антител против миостатина у животных, не являющихся человеком или мышью, посредством иммунизации антигеном миостатина трансгенных животных, не являющихся человеком, у которых есть локусы человеческого иммуноглобулина. Специалист может создать таких животных, применяя способы, описанные в документах, приведенных ранее. Способы, раскрытые в этих документах, можно модифицировать, как описано в патенте США 5994619, который включен в настоящее изобретение в виде ссылки. Патент США 5994619 описывает способы продукции новых клеток с культивируемой внутриклеточной массой (С1СМ) и клеточных

- 15 015534 линий, полученных от свиней и коров, и трансгенных клеток С1СМ, в которые внесена гетерологичная ДНК. Трансгенные клетки С1СМ можно использовать для производства клонированных трансгенных эмбрионов, плодов и потомков. Патент '619 также описывает способы получения трансгенных животных, которые способны передавать гетерологичную ДНК своему потомству. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения животные, не являющиеся человеком, - это млекопитающие, в частности крысы, овцы, свиньи, козы, крупные рогатый скот, лошади или цыплята.

Мыши XЕNОМОυ8Е™ продуцируют набор полностью человеческих антител, подобный набору взрослого человека, и вырабатывают антигенспецифические человеческие антитела. В некоторых вариантах осуществления мыши XЕNОМОυ8Е™ несут приблизительно 80% набора У-генов человеческого антитела вследствие введения больших фрагментов исходных локусов человеческой тяжелой цепи и локусов легкой цепи каппа-типа в искусственную хромосому дрожжей (ΥΑ0). В других вариантах осуществления мыши XЕNОМОυ8Е™ сверх того несут практически весь локус человеческой легкой цепи лямбда-типа. См. Мепбех е! а1., №11иге СепеНсв 15:146-156 (1997), Сгееп апб 1акоЬоу11в, I. Ехр. Меб. 188:483-495 (1998) и \УО 98/24893, описание которых включено в настоящее изобретение в виде ссылок.

В некоторых вариантах осуществления не являющиеся человеком животные, несущие гены человеческого иммуноглобулина, представляют собой животных, которые имеют минилокус человеческого иммуноглобулина. При таком подходе экзогенный локус 1д имитируется вследствие включения отдельных генов локуса 1д. Таким образом, один или более генов У_Н, один или более генов Б_Н, один или более генов 1_Н, константная область мю и вторая константная область (предпочтительно - константная область гамма) образуют конструкцию для введения животному. Этот подход описан, ш!ег а11а, в патентах США №№ 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215 и 5643763, включенных в настоящее описание в виде ссылок.

В еще одном аспекте данное изобретение предлагает способ получения гуманизированных антител против миостатина. В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, иммунизированы антигеном миостатина, как описано ниже, при условиях, которые позволяют продуцировать антитело. Из животных выделены клетки, продуцирующие антитело, и нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи представляющего интерес антитела против миостатина, выделены из выделенных продуцирующих антитело клеток или из иммортализованной клеточной линии, полученной из таких клеток. Впоследствии эти нуклеиновые кислоты сконструированы при применении технических приемов, известных специалистам в данной области, и как описано ниже, для уменьшения размера последовательности, не являющейся человеческой, то есть чтобы гуманизировать антитело для уменьшения иммунного ответа у людей.

В одних вариантах осуществления антиген миостатина - это выделенный и/или очищенный миостатин. В других вариантах осуществления антиген миостатина является человеческим миостатином. Несмотря на это, поскольку С-терминальная часть зрелого миостатина одинакова у людей, мышей, крысы, собаки, перепела, цыпленка, индюка, свиньи, лошади и обезьян и не гликозилирована в клетках, миостатин этих видов животных и других видов, имеющих такую же последовательность зрелого белка, также можно использовать в качестве иммуногена. В других вариантах осуществления антиген миостатина представляет собой клетку, которая экспрессирует или сверхэкспрессирует миостатин. В других вариантах осуществления антиген миостатина - это рекомбинантный белок, экспрессированный дрожжами, клетками насекомых, бактериями, такими как Е.Со11, или полученный другими способами посредством технологии рекомбинирования.

Иммунизация животных может осуществляться посредством любого способа, известного в данной области. См., например, Наг1ом апб Ьапе, Ап1|Ьоб1ев: А ЬаЬогаФгу Мапиа1. №\ν Υо^к: Со1б 8ргшд НагЬог Ргевв, 1990. Способы иммунизации животных, не являющихся человеком, таких как мыши, крысы, овцы, козы, свиньи, крупный рогатый скот и лошади, хорошо известны в данной области. См., например, Наг1ом апб Ьапе вирга и патент США 5994619. В предпочтительном варианте осуществления антиген миостатина вводится с адъювантом, чтобы стимулировать иммунный ответ. Иллюстративные адъюванты включают полный или неполный адъювант Фрейнда, ΒΙΒΙ (мурамиловые дипептиды) или 18СОМ (иммуностимулирующие комплексы). Такие адъюванты могут защищать полипептид от быстрого распада посредством связывания его в локальное отложение, или они могут содержать субстанции, которые стимулируют хозяина секретировать факторы, которые являются хемотаксичными для макрофагов и других компонентов иммунной системы. При введении полипептида предпочтительно, чтоб план иммунизации включал два или более введений полипептида, распределенных на несколько недель. Пример Ι иллюстрирует способ продукции моноклональных антител против миостатина в мышах ХЕ^ОМОИ8Е™.

Продукция антител и клеточные линии, продуцирующие антитело

После иммунизации животного антигеном миостатина, у животного могут быть взяты антитела и/или клетки, продуцирующие антитело. В некоторых вариантах осуществления сыворотку, содержащую антитело против миостатина, берут у животного посредством кровопускания или умерщвления животного. Когда сыворотка получена от животного, ее можно использовать, из сыворотки можно получить фракцию иммуноглобулина или из сыворотки можно очистить антитела против миостатина.

- 16 015534

В некоторых вариантах осуществления клеточные линии, продуцирующие антитело, готовят из клеток, выделенных у иммунизованного животного. После иммунизации животное забивают и В-клетки лимфатического узла и/или селезенки иммортализуют посредством любого известного в данной области способа. Способы иммортализации клеток включают, но не ограничиваются этим, трансфицирование их онкогенами, инфицирование их онкогенным вирусом и культивирование их в условиях, которые подобраны для иммортализованных клеток, обработку клеток канцерогенными или вызывающими мутации соединениями, слияние их с иммортализованной клеткой, например, клеткой миеломы, и инактивацию гена опухолевого супрессора. См., например, Наг1оте апб Ьапе, кирга. Если применяется слияние с клетками миеломы, предпочтительно, чтобы клетки миеломы не секретировали полипептиды иммуноглобулина (несекретирующая клеточная линия). Иммортализованные клетки отбирают, применяя миостатин или его часть. В предпочтительном варианте осуществления проводят первоначальное скринирование, применяя ферментативное иммунологическое исследование (ЕЫ8А) или радиологическое иммунологическое исследование. Пример отбора с помощью ЕЬ18А приведен в \УО 00/37504, включенном в настоящее изобретение в виде ссылки.

Клетки, продуцирующие антитело против миостатина, например гибридомы, отбирают, клонируют и затем скринируют на присутствие желаемых характеристик, включая устойчивый рост, высокую продукцию антитела и желаемые характеристики антитела, как описано ниже. Гибридомы можно наращивать ш у|уо в сингенных животных, в животных без иммунной системы, например, в мышах линии пибе, или в клеточной культуре ш νίΙΐΌ. Способы отбора, клонирования и наращивания гибридом хорошо известны простым специалистам в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления иммунизированное животное - это животное, не являющееся человеком, у которого экспрессируются гены человеческого иммуноглобулина, и В-клетки селезенки слиты с миеломной клеточной линией того же вида животных, к которому относится животное, не являющееся человеком. В более предпочтительном варианте осуществления иммунизированное животное - это мышь XЕNОМОυ8Е™, и клеточная линия миеломы - несекретирующая мышиная миелома. В еще более предпочтительном варианте осуществления клеточная линия миеломы - это Р3-Х63Ад8.653 (Атепсап Туре Си1!иге Со11есйоп). См., например, пример I.

Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение предоставляет способы получения клеточной линии, которая продуцирует человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, ориентированные на миостатин, включающие (а) иммунизацию описанного здесь трансгенного животного, не являющегося человеком, миостатином, частью миостатина или клеткой или тканью, экспрессирующей миостатин; (Ь) предоставление возможности трансгенному животному сформировать иммунный ответ на миостатин; (с) выделение у трансгенного животного клеток, продуцирующих антитело; (б) иммортализацию клеток, продуцирующих антитело; (е) создание отдельных моноклональных популяций иммортализованных клеток, продуцирующих антитело; и (ί) скрининг иммортализованных клеток, продуцирующих антитело, для выявления антитела, ориентированного против миостатина.

В еще одном аспекте данное изобретение предлагает клеточную линию, которая продуцирует человеческое антитело против миостатина. В некоторых вариантах осуществления клеточная линия является гибридомной клеточной линией. В некоторых вариантах осуществления гибридомы представляют собой мышиные гибридомы, как описано выше. В других вариантах осуществления гибридомы продуцируются у представителей биологических видов отличных от человека и мыши, таких как крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади. В еще одном варианте осуществления гибридомы являются человеческими гибридомами.

В еще одном варианте осуществления трансгенное животное иммунизируют антигеном миостатина, у иммунизированного трансгенного животного выделяют исходные клетки, например В-клетки селезенки или периферической крови, и распознают отдельные клетки, продуцирующие специфичные к желаемому антигену антитела. Выделяют полиаденилированные мРНК из каждой отдельной клетки и проводят обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) с применением кепкепраймеров, которые отжигаются на последовательностях вариабельного домена, например вырожденные праймеры, которые распознают большинство или все ТВ 1-участки человеческих генов вариабельного домена тяжелой и легкой цепи, и апй-кепке-праймеры, которые отжигаются на последовательностях константной или примыкающей области. Затем кДНК вариабельного домена тяжелой и легкой цепей клонируют и экспрессируют в любой подходящей клетке-хозяине, например, в клетке миеломы, как химерные антитела с соответствующими константными областями иммуноглобулина, такими как тяжелая цепь и константные домены к или λ. См. ВаЬсоок, 1.8. е! а1., Ргос. №ΐί. Асаб. 8ск И8А 93:7843-48, 1996, включенную в настоящее изобретение в виде ссылки. Затем антитела против миостатина могут быть идентифицированы и выделены, как здесь описано.

В еще одном варианте осуществления для формирования библиотек, содержащих набор антител с различной аффинностью к миостатину, может быть применен метод фагового дисплея. Для получения таких наборов не нужно иммортализовывать В-клетки иммунизированного животного. Предпочтительнее, чтобы исходные В-клетки можно было использовать непосредственно в качестве источника мРНК.

- 17 015534

Смесь кДНК, полученную из В-клетки, например, извлеченной из селезенок, используют для приготовления экспрессионной библиотеки, например библиотеки в формате фагового дисплея, трансфицированной в Е.сой. Клетки, получающиеся в результате, тестируют на иммунореактивность к миостатину. Способы выявления высокоаффинных человеческих антител в таких библиотеках описаны СпГГПНк с! а1., ЕМ80 I., 13:3245-3260 (1994); Х188П11 с! а1., 1Ь14, рр. 692-698 и СпГГйПк с! а1., 1ЬИ, 12:725-734, которые включены в настоящее изобретение в виде ссылок. В итоге из библиотеки выявлены клоны, которые дают по отношению к антигену аффинности связывания желаемую величину, и выделены и обработаны для стандартной экспрессии рекомбинантные ДНК, кодирующие продукт, отвечающий за такое связывание. Библиотеки в формате фагового дисплея также могут быть созданы при применении ранее обработанных и скринированных сходным образом нуклеотидных последовательностей. Обычно кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи, независимо поставляются или соединяются для образования Ρνаналогов для создания фаговой библиотеки.

Затем фаговая библиотека скринируется на наличие антител с наибольшей аффинностью к миостатину, и из соответствующего клона выделяется генетический материал. Последующие циклы скринирования могут увеличить аффинность исходного выделенного антитела.

Нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы создания антител, связанные с рекомбинированием

Нуклеиновые кислоты

Настоящее изобретение также включает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против миостатина или его антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления различные молекулы нуклеиновой кислоты кодируют тяжелую цепь и легкую цепь иммуноглобулина против миостатина. В других вариантах осуществления одна и та же молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую цепь и легкую цепь иммуноглобулина против миостатина.

В некоторых вариантах осуществления в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен легкой цепи (У_ъ) , используется ген человеческого А3, А30 или Ь2 У_к, и ген человеческого 1_к1, 1_к3 или 1_к4. В других вариантах осуществления в молекуле нуклеиновой кислоты используется ген человеческого А30, А3 или Ь2 У_к и ген человеческого 1_к4. В некоторых вариантах осуществления в молекуле нуклеиновой кислоты используется ген человеческого А30, А3 или Ь2 и ген человеческого 1_к1. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, кодирует аминокислотную последовательность, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 замен в сравнении с исходной аминокислотной последовательностью (последовательностями). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность У_ъ, содержащую 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных аминокислотных замен и/или 1, 2 или 3 неконсервативных замены в сравнении с исходными последовательностями У_к и 1_к. Замены могут быть в СОВ-участках, каркасных участках или в константном домене.

В одних вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность У_ъ, содержащую одну или более мутаций по сравнению с исходной последовательностью, которые идентичны мутациям в исходной последовательности, обнаруженным в У_ъ любого из антител 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1Ь-Р45к; 1_257_1Ь-Ь211; 1_314_1Н-Т92А; 1_46_1Н-Ь81М; 2_112_1Н-112У; 2_112_1Ь-Р581; 2_112_1Ы85У; 2_112_1Н-Ь81М, Б-Р581; 2_112_1Н-Ь81М, Б-185У или 2_112_1Н-Ь81М, Б-Р581, 185У.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует по меньшей мере три аминокислотные замены по сравнению с исходной последовательностью, обнаруживаемой в У_ъ любого из антител 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1Ь-Р45к; 1_257_1Ь-Ь211; 1_314_1Н-Т92А; 1_46_1Н-Ь81М; 2_112_1Н-112У; 2_112_1ЬΡ58Ι; 2_112_1Ы85У; 2_112_1Н-Ь81М, Б-Р581; 2_112_1Н-Ь81М, Б-185У или 2_112_1Н-Ь81М, Б-Р581, 185У.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность У_ъ моноклонального антитела 1_116_1 (8ЕО ΙΌ N0: 4); 1_136_3 (8ЕО ΙΌ N0: 12); 1_257_1 (8ЕО ΙΌ N0: 16); 1_46_1 (8ЕО ΙΌ N0: 24); 2_112_1 (8ЕО ΙΌ N0: 28); 1_314_1 (8ЕО ΙΌ N0: 20-_); 1_66_1 (8ЕО ΙΌ N0: 36); 2_43_1 (8ЕО ΙΌ N0: 28); 2_177_1 (8ЕО ΙΌ N0: 40); 1_132_1 (8ЕО ΙΌ N0: 8) или 1_268_1 (8ЕО ΙΌ N0: 32) или его модификацию или его часть. В одних вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность, содержащую СОВ-участки легкой цепи одного из перечисленных выше антител. В других вариантах осуществления указанная часть представляет собой непрерывную часть, содержащую СОВ1-СОВ3.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность одного из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 или 87. В одних вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность из 8Е0 ПЭ N0: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 48, 52, 56, 60, 68, 72, 80, 64, 76, 84 или 88 или его часть. В других вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность одного, двух

- 18 015534 или всех трех СЭК-участков легкой цепи указанного антитела. В некоторых вариантах осуществления указанная часть кодирует непрерывный участок СИЯ1-СИЯ3 легкой цепи антитела против миостатина.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность У_ь, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности У|, любого из антител 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1Ь-Р45К; 1_257_1Ь-Ь211; 1_314_1Н-Т92А; 1_46_1Н-Ь81М; 2_112_1Н-112У; 2_112_1Ь-Р581; 2_112_1Ы85У; или 2_112_1Н-Ь81М, Ь-Р581;

2_112_1Н-Ь81М, Ь-185У или 2_112_1Н-Ь81М, Ь-Р581, 185У или аминокислотной последовательности участка У_ъ любой одной из 8ЕС) ГО N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75,

79, 83 или 87. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению включают нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются при чрезвычайно жестких условиях, таких как те, что описаны выше, или которые по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичны нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность У_ъ-участка, из 8ЕО ГО N0: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 или 87 или нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность У_ъ-участка, с 8Е0 ГО N0: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 48, 52, 56, 60, 68, 72,

80, 64, 76, 84 или 88.

В другом предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельный домен тяжелой цепи (У_Н) , которая несет последовательность человеческого гена У_Н 1-02, 321 или 3-23 или происходящую из него последовательность. В различных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты несет человеческий ген У_Н 1-02, ген Ό4-23 и человеческий ген 1_Н6Ь; человеческий ген У_Н3-21, человеческий ген Ό3-16 или Ό5-12 и человеческий ген 1_Н6Ь; человеческий ген У_Н 321, человеческий ген Ό1-26 или Ό5-5 и человеческий ген 1_Н4Ь; человеческий ген У_Н 3-23, человеческий ген Ό1-7 и человеческий ген 1_Н3Ь.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 мутаций в сравнении с исходной аминокислотной последовательностью генов человека У, Ό или 1. В некоторых вариантах осуществления указанные мутации находятся в У_Н-участке. В некоторых вариантах осуществления указанные мутации находятся в СГОК-участках.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательность УН, содержащую одну или несколько аминокислотных мутаций в сравнении с исходной последовательностью УН, которые идентичны аминокислотным мутациям, обнаруженным в УН моноклонального антитела 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1Ь-Р45К; 1_257_1Ь-Ь211 ; 1_314_1Н-Т92А; 1_46_1Н-Ь81М; 2_112_1Н-112У; 2_112_1ЬР581; 2_112_1Ь-185У; 2_112_1Н-Ь81М, Ь-Р581; 2_112_1Н-Ь81М, Ы85У или 2_112_1Н-Ь81М, Ь-Р581, 185У. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере три аминокислотные мутации в сравнении с исходными последовательностями, которые идентичны по меньшей мере трем аминокислотным мутациям, обнаруженным в одном из приведенных выше моноклональных антител.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере часть аминокислотной последовательности У_Н моноклонального антитела, выбранного из 1_116_1 (8Е0 ГО N0: 2); 1_136_3 (8Е0 ГО N0: 10); 1_257_1 (8ЕС) ГО N0: 14); 1_46_1 (8ЕС) ГО N0: 22); 2_112_1 (8ЕС) ГО N0: 26); 1_314_1 (8ЕС) ГО N0: 18); 1_66_1 (8 ЕС) ГО N0: 34); 2_43_1 (8 ЕС) ГО N0: 42); 2_177_1 (8 ЕС) ГО N0: 38); 1_132_1 (8 ЕС) ГО N0: 6) или 1_268_1 (8Е0 ГО N0: 30), ее модификацию, или указанную последовательность, имеющую консервативные аминокислотные мутации и/или всего три или менее неконсервативных аминокислотных замен. В различных вариантах осуществления данная последовательность кодирует один или более СГОКучастков, предпочтительно СГОК3 -участок, все три СГОК-участка, непрерывную часть, включающую СГОК1-СГОК3. или всю область У_Н приведенных выше антител против миостатина.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность одного 8Е0 ГО N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 или 85. В различных предпочтительных вариантах осуществления данная молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности из 8Е0 ГО N0: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82 или 86. В некоторых вариантах осуществления указанная часть кодирует область У_Н, СОКЗ-участок, все три СГОК-участка или непрерывный участок, включающий СГОК1-СГОК3.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность У_Н, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности У_Н в любой из 8Е0 ГО N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 или 85. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению включают нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются при чрезвычайно строгих условиях, как те, что описаны выше, или которые по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичны нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38

- 19 015534 или 42 или их области Ун, или нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность из БЕЦ ΙΌ N0: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37 или 41 или нуклеотидную последовательность, которая кодирует их область У_н.

В еще одном варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует полноразмерную тяжелую цепь антитела, выбранного из 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_Ш-Ц45К; 1_257_1Ь-Ь2П; 1_314_1Н-Т92А; 1_46_1Н-Ь81М;

2_112_1Н-112У; 2_112_1Ь-Р581; 2_112_1Ы85У; 2_112_1Н-Ь81М Ь-Р581; 2_112_1Н-Ь81М ^-I85У или 2_112_1Н-Б81М, Б-Е581. 185У, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность из БЕЦ ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 или 42. Кроме того, нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность БЕЦ ΙΌ N0: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37 или 41.

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую или легкую цепь антитела против миостатина или их части, может быть выделена из любого источника, который продуцирует такое антитело. В различных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты выделены из В-клетки, которая экспрессирует антитело против миостатина, выделенное у животного, иммунизированного миостатином, или из иммортализованной клетки, полученной из такой В-клетки. Способы выделения нуклеиновых кислот, кодирующих антитело, хорошо известны в данной области. См., например, БатЬгоок и др. мРНК может быть выделена и использована для получения кДНК для применения в полимеразной цепной реакции (ПЦР) или для получения кДНК, клонирующей гены антитела. В предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты выделена из гибридомы, которая имеет, в качестве одного из агентов при слиянии, клетку трансгенного животного, не являющегося человеком, указанная клетка продуцирует человеческий иммуноглобулин. В еще более предпочтительном варианте осуществления клетка, продуцирующая человеческий иммуноглобулин выделена из животного ΧΕΝΟΜΟϋ^Ε™. В еще одном варианте осуществления клетка, продуцирующая человеческий иммуноглобулин, выделена из трансгенного животного, не являющегося человеком, не являющегося мышью, как описано ранее. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота выделена из нетрансгенного животного, не являющегося человеком. Молекулы нуклеиновой кислоты, выделенные у не являющегося человеком нетрансгенного животного, можно использовать, например, для гуманизированных антител, которые содержат одну или более аминокислотных последовательностей человеческого антитела против миостатина согласно настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела против миостатина согласно изобретению, может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую домен У_Н согласно изобретению, объединенная в рамке с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен тяжелой цепи из любого источника. Аналогично молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь антитела против миостатина согласно изобретению, может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую домен У|, согласно изобретению, объединенную в рамке с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен легкой цепи из любого источника.

В дополнительном аспекте согласно изобретению молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельный домен тяжелой (У_Н) и/или легкой (У_ъ) цепей, преобразованы в полноразмерные гены антитела. В одном варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие домены У_Н или У_ъ, преобразованы в полноразмерные гены антитела посредством введения в экспрессионный вектор, уже кодирующий константные домены тяжелой цепи (С_Н) или легкой цепи (СЦ , соответственно, так что сегмент У_Н физически связан в данном векторе с сегментом (сегментами) С_Н, и/или сегмент У_ъ физически связан в векторе с сегментом С_й. В другом варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие домены У_Н и/или У_ъ, преобразованы в полноразмерные гены антитела посредством связывания, например, лигирования, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей домены У_Н и/или У|, с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей домен С_Н и/или С_й, при применении стандартных молекулярно-биологических технических приемов. Нуклеотидные последовательности генов константного домена тяжелой и легкой цепи человеческого иммуноглобулина известны в данной области. См., например, КаЬа! е! а1., Бециеисек οί РгсИеиъ οί 1ттипо1ощса1 1п1еге51. 5111 Еб., МН РиЬ1. Νο. 91-3242, 1991. Затем молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полноразмерные тяжелую и/или легкую цепи, могут быть экспрессированы в клетках, в которые они были введены, и может быть выделено антитело против миостатина.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для рекомбинантной экспрессии большого количества антител против миостатина. Молекулы нуклеиновой кислоты также можно использовать для получения химерных антител, биспецифичных антител, одноцепочечных антител, иммуноадгезинов, димерных антител, мутантных антител и производных антитела, как описано далее. Если молекулы нуклеиновой кислоты получены от нетрансгенного животного, не являющегося человеком, молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для гуманизации антител, также как описано ниже.

В еще одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению применяется в качестве зонда или праймера для ПЦР для отдельной последовательности антитела. Например, нуклеиновая кислота может использоваться в качестве зонда в диагностических процедурах или в

- 20 015534 качестве праймера для ПЦР для амплификации участков ДНК, которые могут использоваться, т!ег айа, для выделения дополнительных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих вариабельные домены антител против миостатина. В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты являются олигонуклеотидами. В одних воплощениях олигонуклеотиды из чрезвычайно вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела представляют интерес. В других вариантах осуществления данные олигонуклеотиды кодируют все или часть одного или нескольких СОЯ-участков антител 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1ЬО45К; 1_257_1Ь-Ь211; 1_314_1Н-Т92А; 1_46_1Н-Ь81М; 2_112_1Н-112У; 2_112_1Ь-Р581; 2_112_1Ь-185У; 2_112_1Н-Ь81М, Ь-Р581 или 2_112_1Н-Ь81М, Ы85У, или 2_112_1Н-Ь81М, Ь-Р581, 185У или их модификации, которые здесь описаны.

Векторы

Данное изобретение предоставляет векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют тяжелую цепь антитела против миостатина согласно изобретению или его антигенсвязывающую часть. Изобретение также предлагает векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют легкую цепь таких антител или их антигенсвязывающей части. Кроме того, изобретение предоставляет векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител и их зонды.

В некоторых вариантах осуществления антитела против миостатина согласно изобретению или антигенсвязывающие части экспрессированы посредством введения ДНК, кодирующих неполные или полноразмерные легкую и тяжелую цепи, полученные, как описано ранее, в экспрессионные векторы такие, что гены физически связаны с необходимыми регулирующими экспрессию последовательностями, такими как последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию. Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (ААУ), вирусы растений, такие как мозаичный вирус цветной капусты, мозаичный вирус табака, космиды, ΥАС, эписомы, производные ЕВУ, и им подобные. Ген антитела лигирован в вектор так, что последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, соответствуют их запланированному назначению, т.е. регулируют транскрипцию и трансляцию гена антитела. Экспрессионный вектор и регулирующие экспрессию последовательности выбраны таким образом, чтобы они были совместимы с используемой экспрессионной клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела может быть введен в независимые векторы. В предпочтительном варианте осуществления оба гена введены в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антитела введены в экспрессионный вектор посредством стандартных приемов (например, лигирование комплементарных сайтов рестрикции фрагмента гена антитела и вектора, или лигирование тупых концов, если отсутствуют сайты рестрикции).

Подходящий вектор - это вектор, который кодирует функционально полную последовательность человеческого иммуноглобулина С_Н или Сь, с соответствующими сайтами рестрикции, сконструированными так, что любую последовательность У_Н или У_ъ можно легко ввести и экспрессировать, как описано выше. В таких векторах обычно наблюдается соединение между донорным сайтом сплайсинга во встраиваемом 1-участке и акцепторным сайтом сплайсинга, предшествующим человеческому С-домену, и также в областях сплайсинга, которые встречаются в экзонах человеческого С_Н. Полиаденилирование и терминация транскрипции имеет место в природных сайтах хромосомы ниже кодирующих участков.

Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор такой, что сигнальный пептид встроен в рамку с Ν-концом цепи иммуноглобулина. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (то есть сигнальным пептидом белка, не являющегося иммуноглобулином).

В дополнение к генам цепи антитела рекомбинантные экспрессионные векторы согласно изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антитела в клетке-хозяине. Специалисты в данной области оценят по достоинству тот факт, что конструкция экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка и так далее. Предпочтительная регуляторная последовательность для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающих включает вирусные элементы, которые управляют высокими уровнями экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусных ЬТЯ, цитомегаловируса (СМУ) (как например промотор/энхансер СМУ), полиомавирус (вирус обезъян 40, 8У40) (как например промотор/энхансер 8У40), аденовируса, (например, основной поздний промотор аденовируса (АйМЬР)), полиомы и сильных промоторов млекопитающих, таких как природные промоторы иммуноглобулина и актина. Для дальнейшего описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см. например, патент США №. 5168062, патент США №. 4510245 и патент США №. 4968615. Способы экспрессии антител в растениях, включая описание промоторов и векторов, также как и трансформация растений, известны в данной области. См., например, патент Соединенных Штатов 6517529, включенный в настоящее изобретение в виде ссылки. Способы получения полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, в дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной об

- 21 015534 ласти.

В дополнение к генам цепи антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные экспрессионные векторы согласно данному изобретению могут нести дополнительные последовательности, как например, последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и селективные маркерные гены. Селективный маркерный ген облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см. например, патенты США №. 4399216, 4634665 и 5179017, включенные в настоящее описание в виде ссылок). Например, типичный селективный маркерный ген дает клетке-хозяину, в которую был введен вектор, устойчивость к лекарственным препаратам, таким как С418, гигромицин или метотрексат. Предпочтительные селективные маркерные гены включают ген дигидрофолатредуктазы (БНЕВ) (для применения в бЫг-клетках-хозяевах с селекцией по метотрексату и амплификацией), ген пео (для селекции по С418) и ген глутаматсинтетазы.

Негибридомные клетки-хозяева и способы производства белка, связанные с рекомбинированием

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против миостатина, и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы для трансфекции подходящей клетки-хозяина млекопитающих, растений, бактерий или дрожжей. Трансформация может быть осуществлена посредством любого известного способа для введения полинуклеотидов в хозяйскую клетку. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки животных хорошо известны в данной области и включают опосредованную декстраном трансфекцию, преципитацию с фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядро. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты могут быть введены в клетки млекопитающих посредством вирусных векторов. Способы трансформации клеток хорошо известны в данной области. См., например, патенты США №. 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455, включенные в настоящее изобретение в виде ссылок. Способы трансформации клеток растений хорошо известны в данной области, включая, например, трансформацию, опосредованную АдгоЬас!егшт, биолистическую трансформацию, прямую инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Способы трансформации бактериальных и дрожжевых клеток также хорошо известны в данной области.

Клеточные линии млекопитающих, пригодные в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных клеточных линий, доступных в Атепсап Туре СиНиге Со11ес!юп (АТСС). Они включают, т!ег а11а, клети яичника китайского хомячка (СНО), клетки N80, клетки 8Р2, клетки НЕК-293Т, клетки МН-3Т3, клетки НеЬа, клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки почки африканской зеленой мартышки (С08), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, НерС2), клетки А549 и другие клеточные линии. Особенно предпочтительные клеточные линии выбраны посредством определения, какие клеточные линии имеют наибольшие уровни экспрессии.

Также могут быть использованы клеточные линии, отличные от клеточных линий, происходящих от млекопитающих. Они включают клеточные линии насекомых (такие как клетки 8Г9 или 8Г21), клетки растений (включая клетки Мсойапа, АгаЬ1борк1к, ряски, кукурузы, пшеницы, картофеля и так далее), бактериальные клетки (включая Е.сой и 8!гер!отусек) и дрожжевые клетки (включая 8сЫ/охассйаготусе5 ротЬе, 8ассйаготусек сегеуЫае и РюЫа рахЮпх).

Если рекомбинантные экспрессионные векторы, кодирующие гены антитела, вводятся в клеткихозяева, антитела продуцируются посредством культивирования клеток-хозяев в течение временного периода, достаточного, чтобы дать возможность экспрессировать антитело в клетках-хозяевах или, более предпочтительно, секретировать антитело в культуральную среду, в которой выращиваются клеткихозяева. Антитела могут быть выделены из культуральной среды при применение стандартных способов очистки белка.

Экспрессия антител согласно данному изобретению в продуцирующих клеточных линиях может быть усилена при применении различных известных способов. Например, система экспрессии глутаминсинтетазы (С8-система) представляет собой общий подход для усиления экспрессии при определенных условиях. С8-система описывается целиком или частями в связи с Европейскими патентами №. 0216846, 0256055, 0323997 и 0338841.

Вероятно антитела, экспрессированные в различных клеточных линиях или трансгенных животных, будут иметь различное гликозилирование. Тем не менее, все антитела кодируемые молекулами нуклеиновой кислоты, предлагаемой здесь, или содержащие аминокислотные последовательности, предлагаемые здесь, являются частью настоящего изобретения, несмотря на гликозилирование антител.

Трансгенные животные и растения

Антитела против миостатина согласно изобретению также могут трансгенно продуцироваться через создание млекопитающих или растений, которые являются трансгенными по последовательностям тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, представляющего интерес, и продукцию антитела в восстанавливаемом виде. В связи с трансгенной продукцией у млекопитающих антитела против миостатина могут продуцироваться и выделяться из молока коз, коров или других млекопитающих. См., например, патенты США №. 5827690, 5756687, 5750172 и 5741957, включенные в настоящее изобретение в виде ссылок. В

- 22 015534 некоторых вариантах осуществления трансгенные животные, не являющиеся человеком, содержащие локусы человеческого иммуноглобулина, иммунизированы миостатином или его иммуногенной частью, как описано выше. Способы создания антител в растениях описаны, например, в патентах США 6046037 и 5959177, включенных в настоящее изобретение в виде ссылок.

В некоторых вариантах осуществления не являющиеся человеком трансгенные животные или растения получены посредством введения животному или растению одной или более молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело против миостатина согласно данному изобретению, посредством стандартных трансгенных способов. См. патент Нодап и Соединенных Штатов 6417429, кирга. Трансгенные клетки, использованные для получения трансгенного животного, могут быть эмбриональными стволовыми клетками или соматическими клетками или оплодотворенным яйцом. Трансгенные, не являющиеся человеком организмы могут быть химерными, нехимерными гетерозиготами и нехимерными гомозиготами. Смотрите, например, Нодап е! а1., Мап1ри1а1шд 1йе Мойке ЕшЬгуо: А ЬаЬога1огу Мапиа1 2'¹ еб., Со1б 8рг1пд НагЬог Ргекк (1999); 1аеккоп е! а1., Мойке Сепебск апб Тгапкдешек: А Ргасбса1 Арргоасй, ОхГогб ИшуегкИу Ргекк (2000); и РткеП. Тгапкдешс Ашша1 Тес1шо1оду: А ЬаЬога1огу НапбЬоок, Асабетю Ргекк (1999), все включены в настоящее изобретение в виде ссылок. В некоторых вариантах осуществления трансгенные не являющиеся человеком животные имеют целевое нарушение и замещение ввиду введения целевой конструкции, которая кодирует тяжелую цепь и/или легкую цепь, представляющие интерес. В предпочтительном варианте осуществления трансгенные животные содержат и экспрессируют молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи, которые специфически связываются с миостатином, предпочтительно с человеческим миостатином. В некоторых вариантах осуществления трансгенные животные содержат молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие модифицированное антитело, как, например, одноцепочечное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело. Антитела против миостатина могут быть получены в любом трансгенном животном. В предпочтительном варианте осуществления животные, не являющиеся человеком, - это мыши, крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади. Трансгенные животные, не являющиеся человеком, экспрессируют указанные кодируемые полипептиды в крови, молоке, моче, слюне, слезах, слизи и в других жидкостях тела.

Библиотеки в формате фагового дисплея

Данное изобретение предоставляет способ создания антитела против миостатина или его антигенсвязывающей части, включающий стадии синтеза библиотеки человеческих антител в фаге, скринирование библиотеки с миостатином или его частью, связывающей антитело, выделение фага, который связывает миостатин, и получение антитела из фага. В качестве примера один способ получения библиотеки антител для использования в методах фагового дисплея включает стадии иммунизации животного, не являющегося человеком, содержащего локусы человеческого иммуноглобулина, с миостатином или его антигенной частью для создания иммунного ответа, извлечение продуцирующих антитело клеток из иммунизированного животного; выделение из извлеченных клеток РНК, кодирующей тяжелую и легкую цепи антител согласно изобретению, обратная транскрипция РНК для получения кДНК, амплификация данной кДНК с применением праймеров и встраивание кДНК в вектор фагового дисплея, такой, что антитела экспрессируются фагом. Рекомбинантные антитела против миостатина согласно изобретению могут быть получены этим способом.

Рекомбинантные человеческие антитела против миостатина согласно изобретению могут быть выделены посредством скринирования рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител. Предпочтительно, чтобы такая библиотека была ксЕу-фаговой библиотекой, созданной с применением кДНК человеческих и У_Н, приготовленных с мРНК, выделенной из В-клеток. Способы приготовления и скрининга таких библиотек известны в данной области. Наборы для создания библиотек в формате фагового дисплея доступны коммерчески (например, Рйагташа КесотЬшап! Р1аде АпНЬобу 8ук1ет, са!а1од по. 279400-01; и 81га1адепе ЗигЕАР™ рйаде б1кр1ау кН, са!а1од по. 240612). Также существуют другие способы и реактивы, которые могут применяться при создании и скрининге библиотек антител (см., например, патент США Νθ. 5223409; публикации РСТ Νθ. АО 92/18619, АО 91/17271, АО 92/20791, АО 92/15679, АО 93/01288, АО 92/01047, АО 92/09690; Еисйк е! а1., Вю/Тесйио1оду 9:1370-1372 (1991); Нау е! а1., Нит. АпНЬоб. НуЬпботак 3:81-85 (1992); Нике е! а1., 8с1епсе 24 6:1275-1281 (1989); МсСаГГебу е! а1., №!иге 348:552-554 (1990); СпГГИйк е! а1., ЕМВО 1. 12:725-734 (1993); Намкшк е! а1., 1. Мо1. Вю1. 226:889-896 (1992); С1асккоп е! а1., книге 352:624-628 (1991); Сгат е! а1., Ргос. Асаб. 8сг И8А 89:3576-3580 (1992); Саггаб е! а1., Вю/Тес1ию1оду 9:1373-1377 (1991); НоодепЬоот е! а1., кис. Ас1б Кек. 19:4133-4137 (1991); и ВагЬак е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 88:7978-7982 (1991), все включены в настоящее изобретение в виде ссылок.

В одном варианте осуществления для выделения и производства человеческих антител против миостатина с желаемыми свойствами, человеческое антитело против миостатина, которое описано здесь, сначала используется для отбора человеческих последовательностей тяжелой и легкой цепи, имеющих сходную активность связывания по отношению к миостатину, применяя способы импринтинга эпитопа, описанные в публикации РСТ Νο. АО 93/06213, включенной в настоящее изобретение в виде ссылки. Предпочтительно, чтобы библиотеки антител, используемые в этом способе, были ксЕу-библиотеками,

- 23 015534 приготовленными и скринированными, как описано в публикации РСТ Νο. νθ 92/01047, МсСаГГсПу с! а1., №1Шгс 348:552-554 (1990) и Спйййз с! а1., ЕМВО 1. 12:725-734 (1993), все включены в настоящее изобретение в виде ссылок. Предпочтительно, чтобы зеЕу-библиотеки антител скринировались с применением человеческого миостатина в качестве антигена.

Когда выбраны исходные человеческие домены У|, и У_н, проводятся эксперименты т1х апб та1с11. в которых различные пары изначально отобранных сегментов У|, и У_н скринируются на связывание миостатина, чтобы выбрать предпочтительные комбинации пар Уь/У_н. Дополнительно для дальнейшего улучшения качества антитела, сегменты У_ъ и У_н предпочтительной пары (предпочтительных пар) У_ь/У_н могут быть случайно мутированы, предпочтительно в СОК3-участке У_ъ и/или У_н, посредством процесса, аналогичного процессу соматической мутации ίη νίνο, отвечающему за развитие аффинности антител во время естественного иммунного ответа. Это развитие аффинности ίη νίίτο может быть завершено посредством амплификации доменов У_н и У|, при применении праймеров для ПЦР, комплементарных СЭК.3участку У_н или СЭКЗ-участку У_ъ, соответственно, где праймеры были обработаны случайной смесью четырех нуклеотидных оснований в определенных положениях, так, что итоговые ПЦР-продукты кодируют сегменты У_н и У_ъ, в которые введены случайные мутации в СЭК3 -участки У_ъ и/или У_н. Эти сегменты У_н и У_ъ со случайными мутациями могут заново скринироваться на связывание с миостатином.

После скринирования и выделения антитела против миостатина согласно данному изобретению из библиотеки рекомбинантных иммуноглобулинов, нуклеиновые кислоты, кодирующие выбранное антитело, могут быть выделены из упаковки (например, из фагового генома) и субклонированы в другие экспрессионные векторы посредством стандартных способов обращения с рекомбинантной ДНК. Затем, если нужно, нуклеиновая кислота может быть обработана для создания форм антитела согласно изобретению, как описано ниже. Для экспрессии рекомбинантного человеческого антитела, выделенного посредством скринирования комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонировали в рекомбинантный экспрессионный вектор и вводили в клетки-хозяева млекопитающих, как описано выше.

Переключение классов

Еще один аспект согласно данному изобретению предлагает способ преобразования класса или субкласса антитела против миостатина в другой класс или субкласс. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую Уь или У_н, которые не содержат последовательностей, кодирующих Сь или С_н, выделяют, применяя способы, хорошо известные в данной области. Затем молекула нуклеиновой кислоты физически сшивается с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей Сь или С_н желаемого класса или субкласса иммуноглобулина. Этого можно достигнуть, используя вектор или молекулу нуклеиновой кислоты, которые содержат цепь Сь или С_н, как описано ранее. Например, антитело против миостатина, которое первоначально было 1дМ, может изменить класс на 1дС. Также, переключение класса может использоваться для превращения одного субкласса 1дС в другой, например, 1дС1 в 1дС2. Еще один способ производства антитела согласно изобретению, включающего желаемый изотип, содержит стадии выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела против миостатина, и нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь антитела против миостатина, выделение последовательности, кодирующей область У_н, лигирование последовательности У_н с последовательностью, кодирующей константный домен тяжелой цепи желаемого изотипа, экспрессию гена легкой цепи и конструкции тяжелой цепи в клетке и сбор антитела против миостатина с желаемым изотипом.

Деиммунизированные антитела

В еще одном аспекте согласно изобретению антитело может быть деиммунизировано для уменьшения его иммуногенности при применении способов, описанных, например, в публикациях РСТ Νο. νθ 98/52976 и νθ 00/34317 (включены в настоящее изобретение в виде ссылки).

Мутантные антитела

В еще одном варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, векторы и клетки-хозяева могут использоваться для получения мутантных антител против миостатина. Данные антитела могут быть мутантными в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей, например, для изменения связывающего свойства антитела. Например, мутация может быть получена в одном или более СЭК-участках для увеличения или уменьшения К_с антитела к миостатину, для увеличения или уменьшения к^ или для изменения специфичности связывания с антителом. Способы сайт-направленного мутагенеза хорошо известны в данной области. См., например, 8атЬ^οοк и др. и АизиЬс1 и др., зирга. В другом варианте осуществления созданы одна или более мутаций аминокислотного остатка, о котором известно, что он изменен в сравнении с исходной последовательностью в моноклональном антителе 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1Ь-О45К; 1_257_1Ь-Ь211; 1_314_1н-Т92А; 1_46_Ш-Ь81М; 2_112_1н-112У; 2_112_1Ь-Е581; 2_112_1Ь-185У; 2_112_1н-Ь81М, Ь-Е581; 2_112_1н-Ь81М, Ь-185У или 2_112_1н-Ь81М, Ь-Е581, 185У. Мутации могут быть получены в СЭК-участке или каркасном участке вариабельного домена или в константном домене. В предпочтительном варианте осуществления мутации получены в вариабельном домене. В некоторых вариантах осуществления получены одна или несколько мутаций аминокислотного остатка, о котором известно, что он изменен в сравнении с исходной последовательностью в СЭК-участке или каркасном

- 24 015534 участке вариабельного домена аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕО ΙΌ N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 или 87, или чья последовательность нуклеиновой кислоты присутствует в 8ЕО ΙΌ N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 или 88.

В другом варианте осуществления в каркасный участок введены мутации таким образом, что получающийся в результате каркасный участок (участки) имеет аминокислотную последовательность соответствующего исходного гена. Мутация может быть получена в каркасном участке или константном домене для увеличения времени полувыведения антитела против миостатина. См., например, публикацию РСТ №. \У0 00/09560, включенную в настоящее изобретение в виде ссылки. Также мутация в каркасном участке или константном домене может быть создана для изменения иммуногенности антитела, чтобы предусмотреть сайт для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой, или для изменения таких свойств, как фиксация комплемента, РсК-связывание и антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЛСС). В соответствии с данным изобретением отдельное антитело может иметь мутации в любом одном или нескольких СПК-участках или каркасных участках вариабельного домена или в константном домене.

В некоторых вариантах осуществления существует от 1 до 8 аминокислотных мутаций, включая любое количество между ними, либо в домене ν_Η, либо в домене У_ь мутантного антитела против миостатина в сравнении с антителом против миостатина до мутации. В любом из вышеуказанных вариантов мутации могут встречаться в одном или более СПК-участках. Кроме того, любая из мутаций может быть консервативной аминокислотной заменой. В некоторых вариантах осуществления существует не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотная замена в константных доменах.

Модифицированные антитела

В еще одном варианте осуществления может быть создано слитое антитело или иммуноадгезин, которые содержат целое антитело или часть антитела против миостатина согласно изобретению, связанное с другим полипептидом. В предпочтительном варианте осуществления только вариабельные домены антитела против миостатина связаны с полипептидом. В другом предпочтительном варианте осуществления домен ν_Η антитела против миостатина соединен с первым полипептидом, тогда как домен νι, антитела против миостатина соединен со вторым полипептидом, который связан с первым полипептидом таким образом, что домены ν_Η и νι, могут взаимодействовать друг с другом для образования антигенсвязывающего сайта. В еще одном предпочтительном воплощении домен ν_Η отделен от домена ν,. посредством линкера, такого, что домены ν_Η и νι. могут взаимодействовать друг с другом (смотрите ниже под одноцепочечными антителами). Кроме того, антитело V_Η-линкер-V^ связано с полипептидом, представляющим интерес. Дополнительно могут быть созданы слитые антитела, в которых два (или более) одноцепочечных антитела связаны одно с другим. Это является пригодным, когда специалист хочет создать дивалентное или поливалентное антитело на одной полипептидной цепи, или когда специалист хочет создать биспецифичное антитело.

Для создания одноцепочечного антитела (зсРу) фрагменты ДНК, кодирующие ν_Η и У_ъ, физически связывают с другим фрагментом, кодирующим подвижный линкер, например, с кодирующим аминокислотную последовательность (С1у₄-8ет)₃ (8Е0 ГЛ N0: 122), такую, что ν_Η и νι, последовательности можно экспрессировать как непрерывный одноцепочечный белок, с доменами νι, и ν_Η, объединенными подвижным линкером. См., например, В1гб е! а1., 8аепсе 242:423-426 (1988); Ш^оп е! а1., Ргос. №ΐ1. Асаб. 8сЕ И8А 85:5879-5883 (1988); МсСаГГетТу е! а1., №Шге 348:552-554 (1990). Одноцепочечное антитело может быть моновалентным, если используются только единственные ν_Η и У_ъ, бивалентным, если используются два ν_Η и У_ъ, или поливалентным, если используются более чем два ν_Η и У_ь. Могут быть созданы биспецифичные или поливалентные антитела, которые специфически связываются с миостатином и еще одной молекулой.

В других вариантах осуществления прочие модифицированные антитела могут быть приготовлены при применении антитела против миостатина, кодируемого молекулами нуклеиновой кислоты. Например, могут быть приготовлены Каппа-тела (ΙΙΙ е! а1., Рто!ет Епд. 10: 949-57 (1997)), Минитела (Майш е! а1., ЕМВ0 1. 13: 5303-9 (1994)), Димерные антитела (Лойде!· е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сЕ Л8А 90: 6444-6448 (1993)) или .Тапизтз (Тгаипескег е! а1., ЕМВ0 1. 10:3655-3659 (1991) и Тгаипескег е! а1., Ιπ!. 1. Сапсег (8ирр1.) 7:51-52 (1992)) при применении стандартных молекулярно-биологических технических приемов после обучения по данной спецификации.

Биспецифичные антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены различными способами, включая слияние гибридом или связывание РаЬ'-фрагментов. См., например, 8опдз1У11а1 & Ьасйтапп, С1т. Ехр. Iттиηο1. 79:315-321 (1990), Коз!е1пу е! а1., 1. Iттипο1. 148:1547-1553 (1992). Кроме того, биспецифичные антитела могут быть образованы в виде димерных антител или .Тапизтз. В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело связывается с двумя различными эпитопами миостатина. В других вариантах осуществления биспецифичное антитело имеет первую тяжелую цепь и первую легкую цепь моноклонального антитела 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_4 3_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1Ь-О45К; 1_257_1Ь-Ь2П; 1_314_Ш-Т92А; 1_46_1Η

- 25 015534

Ь81М; 2_112_1Н-112У; 2_112_1Ь-Р581; 2_112_1Ы85У; 2_112_1Н-Ь81М, Ь-Р581; 2_112_1Н-Ь81М, ЬΙ85ν или 2_112_1Н-Ь81М, Ь-Р581, 185V и дополнительную тяжелую цепь, и легкую цепь антитела. В некоторых вариантах осуществления дополнительная легкая цепь и тяжелая цепь также образуют одно из ранее идентифицированных моноклональных антител, но отличаются от первой тяжелой и легкой цепей.

В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитела, описанные ранее, получены при использовании одного или более вариабельных доменов или СЭР-участков человеческого моноклонального антитела против миостатина, предлагаемого здесь.

Преобразованные и меченые антитела

Антитело против миостатина или антигенсвязывающая часть согласно изобретению может быть преобразовано или связано с еще одной молекулой (например, с другим пептидом или белком). Как правило, антитела или их части преобразуются так, что вследствие преобразования или мечения связывание миостатина не затрагивается неблагоприятным образом. Соответственно, подразумевается, что антитела и части антител согласно данному изобретению включают и интактную, и модифицированную формы человеческих антител против миостатина, описанных здесь. Например, антитело или часть антитела согласно изобретению могут быть функционально связаны (посредством химического спаривания, генетического слияния, нековалентного соединения или иначе) с одним или более другими молекулярными объектами, такими как другое антитело (например, биспецифичное антитело или димерное антитело), детектирующее вещество, фармацевтическое вещество и/или белок или пептид, который может опосредовать связь антитела или части антитела с еще одной молекулой (такой как активная часть стрептавидина или полигистидиновая метка).

Один тип преобразованного антитела получается посредством сшивания двух или более антител (того же самого типа или других типов, например, чтобы создать биспецифичные антитела). Подходящие кросс-линкеры включают те, которые являются гетеробифункциональными, имеющими две отдельные реактивные группы, разделенные посредством подходящего спейсера (например, эфир ммалеимидобензоил-№гидроксисукцинимида) или гомобифункциональными (например, дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры доступны в Р1егсе Сйет1са1 Сотрапу, ВоскТогб, II.

Еще один тип преобразованного антитела - это меченое антитело. Пригодные детектирующие вещества, с помощью которых антитело или антигенсвязывающая часть согласно изобретению могут быть преобразованы, включают флуоресцирующие соединения, включая флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталенсульфонилхлорид, фикоэритрин, лантаноидные люминесцирующие вещества и им подобные. Также антитело может быть мечено ферментами, пригодными для детекции, такими как пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза, глюкозоксидаза и им подобными. Когда антитело помечено детектируемым ферментом, оно детектируется посредством добавления дополнительных реактивов, которые фермент использует для образования продукта реакции, который можно различить. Например, если присутствует реактив пероксидаза хрена, добавление перекиси водорода и диаминобензидина приводит к образованию детектируемого окрашенного продукта реакции. Также антитело может быть мечено биотином и детектироваться посредством непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина. Также антитело может быть мечено заранее определенным полипептидным эпитопом, распознаваемым вторичным репортером (например, парными последовательностями лейциновой застежки, сайты связывания вторичных антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки). В некоторых вариантах осуществления метки прикрепляются посредством ножек различной длины, чтобы уменьшить потенциальную стерическую преграду.

Также антитело против миостатина может быть преобразовано химической группой, такой как полиэтиленгликоль (РЕО), метильной или этильной группой или углеводной группой. Эти группы пригодны для улучшения биологических характеристик антитела, например, для увеличения периода полужизни сыворотки.

Фармацевтические композиции и наборы

Данное изобретение также затрагивает композиции, содержащие человеческое антитело против миостатина со свойствами ингибиторов.

Противодействующие антитела против миостатина согласно изобретению применимы для предотвращения или лечения широкого диапазона состояний и заболеваний, при которых желательно увеличить массу скелетной мышцы и/или кость. В некоторых случаях такие состояния и заболевания могут быть связаны с возрастом или с заболеванием. Противодействующее антитело против миостатина согласно данному изобретению может применяться для лечения, предотвращения или сдерживания связанной с возрастом потери мышечной массы и силы, включая мышечную атрофию, которая, например, является результатом постельного режима.

Кроме того, противодействующее антитело против миостатина согласно изобретению пригодно для лечения или предотвращения потери мышечной массы при изнурительных заболеваниях или других заболеваниях или состояниях, связанных с потерей мышечной массы, включая, но не ограничиваясь этим, травму (включая травму мышцы, нерва и кости), ожоги, СПИД, рак, переломы бедра (особенно у пожилых людей), замену сустава, сильные ушибы колена, артрит, хроническую почечную недостаточность

- 26 015534 (СКР). закупорку сердечных сосудов (СНР) . хроническое обструктивное легочное заболевание (ί.ΌΡΟ). рассеянный склероз (М8). болезнь Паркинсона. хроническое критическое заболевание. повреждение центральной нервной системы (СК8). паралич. катехсию. синдром мышечной дистрофии. хирургию и повреждение сустава.

Противодействующие антитела против миостатина согласно изобретению также пригодны для лечения метаболических состояний. Такие состояния включают сахарный диабет типа 2. метаболические синдромы. как например. синдром Х-хромосомы. устойчивость к инсулину. слабая переносимость глюкозы и ожирение.

Кроме того. противодействующее антитело против миостатина согласно изобретению пригодно для лечения или предотвращения заболеваний. связанных с потерей кости. включая. но не ограничиваясь этим. связанные с возрастом или гормонами остеопороз. остеопению. остеоартрит и переломы при остеопорозе.

Лечение может включать введение одного или более подавляющих моноклональных антител против миостатина согласно изобретению или их антигенсвязывающих фрагментов. одних или с фармацевтически приемлемым носителем. Подавляющие антитела против миостатина согласно изобретению и содержащие их композиции могут быть введены в комбинации с одним или более другими терапевтическими. диагностическими или профилактическими агентами. Дополнительные терапевтические агенты включают агенты против дистрофии (включая стероиды. такие как преднизон. дефлазакорт) и анаболические стероиды. альбутерол. пищевые добавки. как например креатин. и антибиотики. такие как гентамицин. Дополнительные терапевтические агенты также включают агенты против диабета. включая. но не ограничиваясь этим. метформин. сульфонилмочевину. инсулин. прамлинтид (8УМЫ№‘). ΤΖΌ. такие как росиглитазон (АудиШа*) и пиоглитазон (АсГоз®). аналоги СЬР-1. такие как эксенитид. и ингибиторы ΌΡΡ-Ιν. такие как ЬАР237. Кроме того. дополнительные терапевтические агенты включают агенты против остеопороза включая. но неограничиваясь этим. бисфосфонаты. как например. алендронат (Розатах®) и ризедронат (АсЮпс1* ). кальцитонин (М1аса1ст®). ралоксифен (Еу1зГа®). гормональные агенты. такие как эстроген и паратиреоидный гормон. Такие дополнительные агенты могут быть включены в одну и ту же композицию или введены раздельно. Используемый здесь термин фармацевтически приемлемый носитель подразумевает любые и все растворители. дисперсионные среды. оболочки. антибактериальные и противогрибковые агенты. изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и им подобные. которые физиологически совместимы. Некоторые примеры фармацевтически приемлемых носителей составляют вода. соляной раствор. забуференный фосфатом соляной раствор. декстроза. глицерин. этанол и им подобные. а также их комбинации. Во многих случаях предпочтительно включить в композицию изотонические агенты. например сахара. полиспирты. такие как маннит. сорбит или хлорид натрия. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых субстанций представляют смачивающие агенты или незначительные количества вспомогательных субстанций. таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты. консерванты или буферы. которые увеличивают срок хранения или эффективность антител.

Композиции этого изобретения могут быть в различных состояниях. например в жидком. полутвердом и твердом в дозированных формах. таких как жидкие растворы (например. впрыскиваемые и вливаемые растворы). дисперсии или суспензии. таблетки. пилюли. порошки. липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от намеченного способа введения и терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции - это композиции в форме впрыскиваемых или вливаемых растворов. такие как композиции. подобные используемым для пассивной иммунизации людей. Предпочтительным способом введения является парентеральный (например. внутривенный. подкожный. внутрибрюшинный. внутримышечный). В предпочтительном варианте осуществления антитело вводится посредством внутривенной инфузии или инъекции. В еще одном предпочтительном воплощении антитело вводится посредством внутримышечной или подкожной инъекции.

Терапевтические композиции должны быть стерильным и стабильными в условиях производства и хранения. Данная композиция может быть разработана как раствор. микроэмульсия. дисперсия. липосома или другая упорядоченная структура. подходящая для высокой концентрации лекарственного препарата. Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены посредством объединения антитела против миостатина в необходимом количестве в соответствующем растворителе с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов. перечисленных выше. с последующей стерилизацией фильтрованием. если требуется. Как правило. дисперсии готовятся посредством введения активного соединения в стерильный растворитель. который включает основную дисперсионную среду и остальные необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае со стерильными порошками для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофильная сушка. которые дают порошкообразный активный ингредиент плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из раствора. стерилизованного ранее фильтрованием. Присущая раствору текучесть может поддерживаться. например. посредством использования оболочки. такой как лецитин. посредством поддержания необходимого размера частицы в случае с дисперсией и при применении по

- 27 015534 верхностно-активных веществ. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть осуществлена посредством включения в композицию агента, который замедляет абсорбцию, например, моностеаратов и желатина.

В одном варианте осуществления антитело вводится в композиции как стерильный водный раствор, имеющий рН, который колеблется в пределах от примерно 5,0 до примерно 6,5, и содержит от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл антитела, от примерно 1 миллимоля до примерно 100 миллимолей гистидинового буфера, от приблизительно 0,01 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл полисорбата 80, от примерно 100 миллимолей до примерно 400 миллимолей трегалозы и от приблизительно 0,01 миллимолей до приблизительно 1,0 миллимолей динатрия ЕЭТА дигидрата.

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть введены посредством различных способов, известных в данной области, хотя для многих случаев терапевтического применения предпочтительным местом/способом введения является подкожный, внутримышечный способ или внутривенная инфузия. Специалисты в данной области оценят по достоинству тот факт, что место и/или способ введения будут изменяться в зависимости от желаемых результатов.

В определенных вариантах осуществления активное соединение композиции антитела может быть получено с носителем, который защитит антитело от быстрого высвобождения, как в композиции с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут применяться биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолиевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких композиций запатентованы или, как правило, известны специалистам в данной области. См., например, 8ик1атеб апб С’оп1го11еб Ке1еаке Эгид ЭеНуегу 8ук1етк (I. К. КоЬшкоп, еб. , Магсе1 Эеккег, Шс., №\ν Уогк, 1978).

В определенных вариантах осуществления антитело против миостатина согласно изобретению может вводиться пероральным путем, например, с инертным разбавляющим веществом или усвояемым съедобным носителем. Состав (и прочие ингредиенты, если требуется) также может быть заключен в твердую или мягкую желатиновую капсулу, спрессован в таблетки или введен непосредственно в рацион субъекта. Для перорального терапевтического введения антитела против миостатина могут быть объединены с инертными наполнителями и использоваться в виде проглатываемых таблеток, рассасываемых таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, пластинок и им подобных. Для введения композиции согласно изобретению способом, отличным от парентерального, может быть необходимо нанести на состав покрытие или ввести состав совместно с веществом для предотвращения его инактивации.

Дополнительные активные соединения также могут быть введены в композиции. В определенных вариантах осуществления подавляющее антитело против миостатина согласно изобретению рецептируется совместно и/или вводится совместно с одним или более дополнительными терапевтическими агентами. Эти агенты включают, без ограничения, антитела, которые связывают другие мишени, антинеопластические агенты, противоопухолевые агенты, химиотерапевтические агенты, аналоги пептидов, которые ингибируют миостатин, или антитела или другие молекулы, которые связываются с мембранными рецепторами типа ΙΙ и предотвращают их связывание или активацию миостатином. Для таких видов комбинированной терапии могут быть необходимы более низкие дозировки подавляющих антител против миостатина, а также совместно вводимых агентов, чтобы таким образом уклониться от возможных токсичностей или сложностей, связанных с различными вариантами монотерапии.

Подавляющие антитела против миостатина согласно данному изобретению и содержащие их композиции также могут быть введены в сочетании с другими терапевтическими режимами, в частности в комбинации с упражнениями и/или добавками к рациону (включая диетологические).

В определенных вариантах осуществления подавляющее антитело против миостатина согласно изобретению рецептируется совместно и/или вводится совместно с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, описанными кирга. Эти агенты включают те, которые подавляют миостатин. Кроме того, такие виды комбинированной терапии также могут применяться для лечения, предотвращения или подавления любого из указанных заболеваний и состояний. Для таких комбинированных видов терапии необходимы более низкие дозировки подавляющих антител против миостатина, а также совместно вводимых агентов, чтобы таким образом уклониться от возможных токсичностей или сложностей, связанных с различными вариантами монотерапии.

Композиции согласно изобретению могут содержать терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество антитела или антигенсвязывающей части согласно изобретению. Терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение времени, необходимого для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или части антитела может изменяться в соответствии с факторами, такими как статус заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, и в соответствии со способностью антитела или части антитела вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество - это количество, в котором терапевтические полезные эффекты превосходят любые токсические или нежелательные эффекты антитела или части антитела. Профилактически эффективное количе

- 28 015534 ство относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение времени, необходимого для достижения желаемого профилактического результата. Характерно, что, поскольку профилактическая доза применяется у людей до заболевания или на ранних стадиях заболевания, профилактически эффективное количество может быть меньше, чем терапевтически эффективное количество.

Режим дозировки может быть скорректирован для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, может быть прописан единственный шарик, в течение времени может быть введено несколько отдельных доз или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, что указывается потребностью терапевтической ситуации. Особенно благоприятно рецептировать парентеральные композиции в дозированных единицах для легкого введения и единообразия дозировки. Дозированная форма, которая используется здесь, относится к физически обособленным единицам, применимым в качестве однократных доз для лечения млекопитающих; каждая единица, содержащая заранее определенное количество активного соединения, рассчитанного для получения желаемого терапевтического эффекта в связи с указанным фармацевтическим носителем. Спецификация для дозированных форм согласно данному изобретению продиктована и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик антитела против миостатина или его части и достигаемого специфического терапевтического или профилактического эффекта, и (Ь) от ограничений, неотъемлемых в области составления рецептуры такого антитела для лечения восприимчивости индивидуумов.

Иллюстративный, не ограничивающий диапазон для терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или части антитела согласно изобретению составляет от 0,025 до 50 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 до 50 мг/кг, более предпочтительно 0,1-25, от 0,1 до 10 или от 0,1 до 3 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 5 мг/мл антитела в буфере: 20 мМ цитрата натрия, рН 5,5, 140 мМ №С1 и 0,2 мг/мл полисорбата 80. Стоит отметить, что значения дозировки могут меняться вместе с типом и серьезностью облегчаемого состояния. Кроме того, следует понимать, что для любого отдельного субъекта специфический режим дозировки должен быть скорректирован со временем в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональной оценкой лица, вводящего или наблюдающего за введением композиции, и что определенный здесь диапазон дозировки является только иллюстративным и не ограничивает область действия или применения заявленной композиции.

Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет наборы, содержащие антитело против миостатина или антигенсвязывающую часть согласно изобретению, или композицию, содержащую такое антитело или его часть. Набор может включать, в дополнение к антителу или композиции, диагностические или терапевтические агенты. Набор также может содержать инструкции по применению в диагностической или терапевтической процедуре. В предпочтительном варианте осуществления данный набор включает антитело или содержащую его композицию и диагностическое вещество, которое может быть использовано в процедуре, описанной ниже. В другом предпочтительном воплощении данный набор включает антитело или содержащую его композицию и один или более терапевтических агентов, которые могут быть использованы в процедуре, описанной ниже.

Эффективные диагностические методы

В еще одном аспекте изобретение предлагает способы диагностики. Антитела против миостатина могут использоваться для обнаружения миостатина в биологическом образце ш М11го или ίπ у1уо.

Антитела против миостатина могут быть использованы в стандартном иммунологическом исследовании, включая, без ограничений, ЕЫ8А, ΒΙΑ, проточную цитометрию, тканевую иммуногистохимию, вестерн-блот или иммунопреципитацию. Антитела против миостатина согласно изобретению могут быть применены, чтобы детектировать миостатин у людей. В еще одном варианте осуществления антитела против миостатина могут использоваться для обнаружения миостатина, например, у мышей, обезьян супотопив, крысы, собаки, перепела, цыпленка, индюка, свиньи и лошади.

Данное изобретение предоставляет способ обнаружения миостатина в биологическом образце, включающий соприкосновение биологического образца с антителом против миостатина согласно изобретению и детекцию связанного антитела. В одном варианте осуществления антитело против миостатина непосредственно помечено детектируемой меткой. В другом варианте осуществления антитело против миостатина (первое антитело) не мечено, и второе антитело или другая молекула, которые могут связывать антитело против миостатина, помечены. Как хорошо известно любому специалисту в данной области, второе антитело выбрано таким образом, что оно способно специфически связываться с конкретными видами и классом первого антитела. Например, если антитело против миостатина представляет собой человеческий 1дС, тогда вторичное антитело могло бы быть антителом против человеческого 1дС. Другие молекулы, которые могут связываться с антителами, включают, без ограничения, Рго!ет А и Рго1еш 6, оба доступные коммерчески, например, в Р1егсе СЬетка1 Со.

Подходящие метки для антитела или вторично антитела описаны ранее вирга и включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцирующие вещества, люминесцирующие вещества и радиоактивные вещества. Примеры пригодных ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры пригодных комплексов простетической группы включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцирующих ве

- 29 015534 ществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлоротриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцирующего вещества включает люминол; и примеры пригодного радиоактивного вещества включают ¹²⁵1, ¹³¹1, ³⁵8 или ³Н.

В других вариантах осуществления миостатин может быть исследован в биологическом образце посредством конкурентного иммунологического исследования при использовании стандартов миостатина, меченных детектируемой субстанцией и немеченого антитела против миостатина. При этом исследовании смешиваются биологический образец, меченые стандарты миостатина и антитело против миостатина, и определяется количество меченого стандарта миостатина, связавшегося с немеченым антителом. Количество миостатина в биологическом образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта миостатина, связавшегося с антителом против миостатина.

Специалист может использовать иммунологические исследования, раскрытые выше для различных целей. Например, антитела против миостатина могут применяться для обнаружения миостатина в культивируемых клетках. В предпочтительном варианте осуществления антитела против миостатина применяются для определения количества миостатина, продуцируемого клетками, которые были обработаны различными составами. Этот способ может применяться для выявления смесей, которые модулируют уровни белка миостатина. В соответствии с этим способом один образец клеток обрабатывается исследуемым составом в течение временного периода, пока другой образец остается необработанным. Если необходимо измерить общий уровень миостатина, клетки лизируются и общий уровень миостатина измеряется при применении одного из иммунологических исследований, описанных выше. Сравнивается общий уровень миостатина в обработанных и необработанных клетках для того, чтобы определить воздействие исследуемого состава.

Предпочтительным иммунологическим исследованием для измерения общих уровней миостатина является проточная цитометрия или иммуногистохимия. Способы, такие как ЕЬ18А, Я1А, проточная цитометрия, вестерн-блот, иммуногистохимия, мечение интегральных мембранных белков на поверхности клетки и иммунопреципитация хорошо известны в данной области. См., например, Наг1оте апй Ьапе, кирга. К тому же иммунологические исследования могут быть расширены для скрининга с высокой пропускной способностью, чтобы тестировать большое количество составов либо для активации, либо для подавления экспрессии миостатина.

Антитела против миостатина согласно изобретению также могут применяться для определения уровней миостатина в ткани или сыворотке. В некоторых вариантах осуществления ткань - это пораженная ткань. В некоторых вариантах осуществления способа ткань или биопсия ткани взяты у пациента. Данный способ включает стадии введения детектируемого меченого антитела против миостатина или содержащей его композиции больному, нуждающемуся в таком диагностическом исследовании, и проведение пациенту визуализирующего исследования для определения локализации тканей, экспрессирующих миостатин. Визуализирующее исследование хорошо известно в медицине и включает, без ограничения, рентгенографическое исследование, магнитно-резонансную томографию (МРТ) или компьютерную томографию (КТ). Антитело может быть мечено любым веществом, подходящим для визуализации ш νίνΌ, например, контрастное вещество, такое как барий, который может применяться для рентгенографического исследования, или магнитное контрастное вещество, такое как хелатный гадолиний, который может применяться для МРТ или КТ. Другие маркирующие вещества включают, без ограничения, радиоизотопы, например ⁹⁹Тс. В другом варианте осуществления антитело против миостатина будет немечено и будет визуализировано посредством введения второго антитела или другой молекулы, которая является детектируемой и которая может связывать антитело против миостатина. В варианте осуществления биопсия взята у больного для определения, экспрессирует ли представляющая интерес ткань миостатин.

Эффективные терапевтические методы

В еще одном варианте осуществления данное изобретение предоставляет способ подавления активности миостатина посредством введения антитела против миостатина больному, нуждающемуся в нем. Любой из типов антител, описанных здесь, может использоваться терапевтически. В различных вариантах осуществления антитело против миостатина является человеческим, химерным или гуманизированным антителом. В предпочтительном варианте осуществления миостатин является человеческим и больной является человеком. Альтернативно, пациент может быть млекопитающим, которое экспрессирует миостатин, так что антитело против миостатина дает с ним перекрестную реакцию. Для ветеринарных целей или в качестве животной модели человеческого заболевания антитело может вводиться млекопитающему, не являющемуся человеком (то есть крысе, мыши или обезьяне супото1дик), экспрессирующему миостатин, с которым антитело дает перекрестную реакцию. Такие животные модели могут быть пригодными для оценки терапевтической эффективности антител согласно этому изобретению.

Эти антитела могут применяться при активизации роста мышцы, увеличения веса и при оказании помощи при предотвращении слабости поголовья скота (у крупного рогатого скота, свиней, овец, лошадей, цыплят, индюков и рыб) и животных-спутников (собак, кошек и лошадей).

В еще одном варианте осуществления данное изобретение предоставляет способ для активизации роста мышцы, увеличения веса и при оказании помощи при предотвращении слабости у крупного рога

- 30 015534 того скота, свиней, овец, цыплят, индюков, лошадей, рыб, собак и кошек, которые в этом нуждаются, включающий стадию введения указанным животным антитела или антигенсвязывающей части, как описано здесь.

Используемый здесь термин состояние, которое можно предотвратить или лечить посредством уменьшения активности миостатина включает заболевания и другие нарушения, при которых было показано, что присутствие высоких уровней миостатина у субъекта, страдающего данным нарушением, отвечает, или предполагается, что отвечает, за патофизиологию нарушения, либо является фактором, который вносит вклад в усиления нарушения. Такие нарушения могут подтверждаться, например, посредством увеличения уровней миостатина в тканях и жидкостях или фосфорилированного 8тай 2 или 3 в мышечной ткани в пораженных клетках или тканях субъекта, страдающего данным нарушением. Увеличение уровней миостатина можно выявлять, например, применяя антитело против миостатина, как описано выше.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления антитело против миостатина может быть введено пациенту, который экспрессирует неподходяще высокие уровни миостатина. В данной области известно, что высокий уровень экспрессии миостатина может приводить к различному ухудшению состояний, разрушению кости и накоплению жировой массы. В одном варианте осуществления указанный способ относится к лечению заболеваний и состояний, при которых желательно уменьшить ослабление или увеличить массу скелетной мышцы, уменьшить разрушение кости или увеличить костную массу и/или уменьшить жировую массу посредством нейтрализации эффектов миостатина. Такие состояния и заболевания указаны кирга.

В другом предпочтительном варианте осуществления антитело против миостатина может вводиться пациенту, который не экспрессирует несоответствующие уровни миостатина (высокий или низкий), но, однако, чье состояние будет успешно пролечено или предотвращено посредством применения лечения, направленного против миостатина. В одном варианте осуществления указанный способ относится к лечению заболеваний и состояний, при которых желательно подавить активность миостатина, чтобы лечить разрушение или увеличить массу скелетной мышцы, чтобы лечить разрушение кости или увеличить костную массу и/или чтобы воздействовать на жировую массу посредством нейтрализации эффектов миостатина. Такие заболевания и состояния известны в данной области и включают заболевания и состояния, которые связаны с различными изматывающими состояниями, которые могут включать разрушение кости и накопление жировой массы, например, дегенеративные заболевания, связанные с возрастом, и недегенеративные, обычные, связанные с возрастом состояния.

Антитело может вводиться однократно, но более предпочтительным является многократное введение. Антитело может вводиться от трех раз каждый день до одного раза каждые шесть месяцев или дольше. Введение может осуществляться по расписанию, как например, три раза каждый день, дважды каждый день, однократно каждый день, однократно каждые два дня, однократно каждые три дня, однократно раз в неделю, однократно каждые две недели, однократно каждый месяц, однократно каждые два месяца, однократно каждые три месяца и однократно каждые шесть месяцев. Антитело также может вводиться непрерывно с помощью мининасоса. Антитело может вводиться пероральным способом, через слизистые оболочки, трансбуккально, интраназально, через ингаляцию, внутривенно, подкожно, внутримышечно или парентерально. Антитело может вводиться однократно, по меньшей мере дважды или по меньшей мере в течение временного периода пока состояние не пролечено, облегчено или излечено. Обычно антитело вводят до тех пор, пока обнаруживается состояние. Как правило, антитело вводят как часть фармацевтической композиции, которая описана кирга. Дозировка антитела обычно находится в диапазоне 0,1-100 мг/кг, более предпочтительно 0,5-50 мг/кг, более предпочтительно 1-20 мг/кг и даже более предпочтительно 1-10 мг/кг. Концентрация антитела в сыворотке может измеряться посредством любого способа, известного в данной области.

Совместное введение антитела с дополнительным терапевтическим агентом (комбинированная терапия) включает введение фармацевтической композиции, содержащей антитело против миостатина и дополнительный терапевтический агент, также как введение двух или более отдельных фармацевтических композиций, одна из которых содержит антитело против миостатина и другая (другие) содержит дополнительный терапевтический агент (агенты). Кроме того, хотя совместное введение или комбинированная терапия обычно подразумевает, что антитело и дополнительные терапевтические агенты вводятся друг с другом в одно и тоже время, также она включает отдельные случаи, когда антитело и дополнительные терапевтические агенты вводятся в разное время. Например, антитело может вводиться однократно каждые три дня, тогда как дополнительный терапевтический агент вводится однократно каждый день. Альтернативно, антитело может вводиться до или после лечения нарушения дополнительным терапевтическим агентом, например, после неудачной терапии дополнительным веществом. Аналогично введение антитела против миостатина может проводиться до или после другой терапии, такой как упражнения и/или диетические (включая пищевые) добавки. Антитело и одно или более дополнительных терапевтических веществ (комбинированная терапия) может вводиться однократно, дважды или по меньшей мере в течение временного периода пока состояние не пролечено, не облегчено или не излечено.

Предпочтительно, чтобы комбинированная терапия проводилась многократно. Комбинированная

- 31 015534 терапия может проводиться от трех раз каждый день до одного раза каждые шесть месяцев. Введение может осуществляться по расписанию, например, три раза каждый день, дважды в день, однократно каждый день, однократно каждые два дня, однократно каждые три дня, однократно каждую неделю, однократно каждые две недели, однократно каждый месяц, однократно каждые два месяца, однократно каждые три месяца и однократно каждые шесть месяцев или может вводиться непрерывно с помощью мининасоса. Комбинированная терапия может проводиться пероральным способом, через слизистые оболочки, трансбуккально, интраназально, через ингаляцию, внутривенно, подкожно, внутримышечно или парентерально.

Генная терапия

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут вводиться пациенту, нуждающемуся в этом, с помощью генной терапии. Данная терапия может проводиться либо ш у1уо, либо ех у1уо. В предпочтительном варианте осуществления пациенту вводятся молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие и тяжелую цепь, и легкую цепь. В более предпочтительном варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты вводятся так, что они стабильно встраиваются в хромосомы В-клеток, поскольку эти клетки специализируются на продукции антител. В предпочтительном варианте осуществления предшественники В-клеток трансфицируют или инфицируют ех у1уо и вновь трансплантируют нуждающемуся в этом больному. В еще одном варианте осуществления предшественники В-клеток или другие клетки инфицируют ш у1уо, используя вирус, о котором известно, что он инфицирует тип клеток, представляющий интерес. Типичные векторы, используемые для генной терапии, включают липосомы, плазмиды и вирусные векторы. Иллюстративные вирусные векторы - это ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы. После инфицирования либо ш у1уо, либо ех у1уо может осуществляться контроль уровней экспрессии антитела посредством взятия образца у пролеченного больного и применения любого иммунологического исследования, известного в данной области или описанного здесь.

В предпочтительном варианте осуществления способ генной терапии включает стадии введения выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или его антигенсвязывающую часть антитела против миостатина, и экспрессирования данной молекулы нуклеиновой кислоты. В еще одном варианте осуществления способ генной терапии включает стадии введения выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь антитела против миостатина или ее антигенсвязывающую часть, и экспрессирования данной молекулы нуклеиновой кислоты. В более предпочтительном способе способ генной терапии включает стадии введения выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, и выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь антитела против миостатина согласно изобретению или ее антигенсвязывающую часть, и экспрессирования данных молекул нуклеиновой кислоты. Способ генной терапии также может содержать стадию введения одного или более дополнительных терапевтических веществ, таких как те, что упоминались кирга.

Для лучшего понимания этого изобретения приведены нижеследующие примеры. Эти примеры приводятся только в качестве иллюстрации и не должны истолковываться как ограничивающие рамки данного изобретения в любом смысле.

Пример I. Создание гибридом, продуцирующих антитело против миостатина.

Антитела согласно изобретению готовили, отбирали и исследовали, как представлено ниже.

От восьми до десяти недель старых мышей ΧΕΝ0Μ0υ8Ε™ иммунизировали внутрибрюшинно или в их задние подушечки лап либо С-терминальной частью зрелого миостатина (10 мкг/доза/мышь) (Κ&Ό 8ук!етк, Са!а1од #788-С8), либо полноразмерным зрелым миостатином супото1дик. Эту дозу повторяли семь раз в течение трех-четырех недель. За четыре дня до слияния мышам делали заключительную инъекцию миостатина в РВ8. Лимфоциты селезенки и лимфатического узла иммунизированных мышей сливали с несекретирующей клеточной линией миеломы Р3-Х63-Ад8.653, и на этих слитых клетках проводили НАТ-селекцию, как описано ранее (Са1Гге апб М11к!еш, МеШобк Епхуто1. 73:3-46, 1981). Выделяли группу гибридом, такую что все они секретируют специфичные к миостатину человеческие антитела 1дС2 или 1дС4.

Протокол исследования ЕЫ8А для СБЕ8 и СОЕ'1'1

Исследование ЕЫ8А применяли для того, чтобы выявить антитело, связывающееся с миостатином или СБГ11. На ночь миостатин или СБГ11 наносили на 96-луночную плашку для микротитрования 1тти1оп (NυNС-Iттиηο™ р1а!е Мах18огр™ кигГасе, №1де №пс 1п!ета!юпа1, Са!. №. 439454) по 4 мкг/мл в 50 мМ натрий-гидрокарбонатном буфере при 4°С. Плашки промывали и затем забивали фосфатносолевым буфером (РВ8), содержащим 0,1% Тетееп-20 и 0,5% бычий сывороточный альбумин. К блокированным чашкам для ЕЫ8А добавляли антитела, инкубировали в течение 1 ч и промывали РВ8 с Тетееп-20. Связывание детектировали посредством конъюгата античеловеческого 1дС и пероксидазы хрена (Р1егсе Са!. №. 31420) с последующим добавлением АВТ8 (Р1егсе Са!. №. 37615). Колориметрическое измерение проводили при 405 нм в считывающем устройстве для микроплашек (использовали 8рес!гаМах Р1ик 384, Мо1еси1аг Беуюек).

Для дальнейшего исследования было выбрано и обозначено одиннадцать гибридом: 1_116_1,

- 32 015534

1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1 и 1_268_1. 10 февраля 2005 года было депонировано одиннадцать гибридом в соответствии с условиями Вибарек! Тгеа1у и Атепсап Туре СиЙиге Собесбоп (АТСС), 10801 ипкегкбу Β1ν6., Мапаккак, УА 20110-2209. Гибридомам присвоены следующие номера для ссылки:

	Идентификационный номер	Номер АТСС
Антитело	гибридомы	для ссылки
	РЕ8-1-116-1 (Ьй 15902)	РТА-5566
1_132_1	РГ8-1-132-1 (Ьй 15903)	РТА-6567
1_1363	РГ8-1-136-3 (Ъй 15904)	РТА-6568
1_257_1	РГ8-1-257-1 (Ьй 15905)	РТА-6569
1_268_1	РГ8-1-268-1 (Ьй 15906)	РТА-6570
1_314_1	РГ8-1-314-1 (Ьй 15907)	РТА-6571
1_46_1	РР8-1-46-1 (ЬН 15908)	РТА-6572
1_66_1	РГ8-1-66-1 (Ьй 15909)	РТА-6573
2_112_1	998-2-112-1 (1Ν 15910)	РТА-6574
2_43_1	РЕ8-2-43-1 (Ьй 15911)	РТА-6575
2_177_1	РГ8-2-177-1 (Ьй 15912)	РТА-6576

Пример II. Последовательности антител против миостатина, подготовленные в соответствии с изобретением.

Чтобы исследовать структуру антител, полученных в соответствии с данным изобретением, клонировали нуклеиновые кислоты, которые кодируют фрагменты тяжелой и легкой цепи в гибридомах, продуцируемых моноклональными антителами против миостатина.

Клонирование и секвенирование вариабельных участков антитела производили, как описано ниже: используя набор ЕаМ-Тгаск (Iηνй^οдеη) выделяли Ро1у(А)⁺ мРНК приблизительно из 2х10⁵ гибридомных клеток, полученных от мышей ХепоМоике™, иммунизированных миостатином. кДНК синтезировали с мРНК посредством применения случайных праймеров. кДНК, полученную со случайными праймерами, амплифицировали, используя праймеры для специфичного вариабельного домена семейства человеческого У_Н или человеческого У_к (Магкк е1 а1., 011допис1еоббе рптегк Гог ро1утегаке скат геасбоп атрШзсабоп оГ китап 1ттипод1оЬибп νа^^аЬ1е депек апб бемдп оГ Гатбу-кресбю обдопис1еоббе ргоЬек. Еиг. I. 1ттипо1. 21:985-991 (1991)) или универсальный праймер для человеческого У_Н [МО-30, 5'СА66Т6СА6СТ66А6СА6ТСЮ0-3'] (8ЕО ГО N0: 91), вместе с праймерами, специфичными к константной области человеческого Су2, МО-40б [5'-6СТ6А666А6ТА6А6ТССТ6А60А-3'] (8ЕО ГО N0: 92) или к константной области С_к [ккР2; как описано ранее у Огееп е1 а1., 1994].

Посредством ПЦР-амплификации ро1у(А⁺)-РНК с применением праймеров, описанных выше, получили молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют транскрипты человеческой тяжелой цепи и легкой каппа-цепи из полученных против миостатина гибридом. ПЦР-продукты клонировали в [рСК11 Добродеи)], применяя набор для клонирования ТА с1ошпд кб (1т^гбгодеп) и секвенировали обе цепи, используя наборы Рпкт буейептпаЮг кесщепОпд кб (Аррбеб ВюкуМетк 1пс) и секвенатор АВ1 377 (Аррбеб ВюкуМетк 1пс). Все последовательности анализировали посредством выравнивания V ВА8Е кесщепсе биесЮгу (Тотбпкоп е1 а1., МКС Сепбе Гог Рго!ет Епдтееппд, СатЬпбде, ИК), применяя компьютерные программы МасУескг® (Ассе1гук, 8ап Шедо, СА) и Оепе^огкк® (Нтбтагкб, 8.А. АиМгаба).

Для получения полноразмерной экспрессируемой нуклеотидной последовательности антител, полученных в соответствии с данным изобретением, клонировали нуклеиновые кислоты, такие, что они кодируют полноразмерные кодирующие участки тяжелой и легкой цепи из гибридом, продуцирующих антитела против миостатина. Клонирование и секвенирование проводили, как описано ниже: выделяли Ро1у(А)⁺ мРНК, применяя К№аку М1ш Кб (О|адеп), и синтезировали кДНК с мРНК с помощью набора Абνаηίаде КТ-Гог-РСК кб (ВЦ Вюкаепсек), применяя праймирование с обдо(бТ). кДНК, полученную с праймерами обдо(бТ), амплифицировали в двух независимых реакциях, применяя вырожденные праймеры, разработанные для гибридизации 5'-нетранслируемого участка (5'ИТК) сегментов гена человеческого У_Н или человеческого У_к (табл. 2А и 2В) вместе с невырожденными праймерами, специфичными к участкам в 3'ИТК в ЮН02 или ЮН04 [О_3ИТК_К, 5'ТАСбТОССААОСАТССТСОС] (8ЕО ГО N0: 93), или ЮК [К_3ИТК_К, 5'А66СТ66ААСТ6А66А6СА66Т0] (8ЕО ГО N0: 94). Амплификация была достигнута при применении набора Ехрапб Н1дк Р1бе1бу РСК кб (Коске) и РТС-200 ЭХА Епдте (М1 Кекеагск) при цикле, описанном ниже: 2 мин при 94°С; 23х (30 с при 94°С, 50 с при 52°С, 2 мин при 72°С); 8 мин при 72°С. Для обеих реакций на тяжелой и легкой цепях ПЦР-продукты из двух независимых ПЦР клонировали в рСК2.1, применяя набор ТОРО-ТА с1ошпд кб (1тбгодеп) и секвенировали обе цепи двух клонов, применяя Оп11к 16'¹' ВЭТу3.1/6СТР скеткбу (Аррбеб ВюкуМетк 1пс) и 3730х1 ЭНА Апа1у/ег (Аррбеб ВюкуМетк 1пс).

- 33 015534

Таблица 2А. 5'-Праймеры для амплификации тяжелой и легкой цепи:

Название праймера	Последовательность праймера	ЗЕб ГО ΝΟ
УН1а_5иТВ_Е	СССТ6А6А6САТСАУМУАКМААСС	95
УНЗа_5иТК_Е	НУТНТССАСТУббТСАТСКбСАСТб	96
УНЗс_5ЦТК_Е	АТТУЙСТбАТСАЙЗАСТбААСАЗАС	97
УК1а_50ТН_Е	63АКТСА6НСУСНУУСА66АСАСА6С	98
νκ2_5υτκ_Γ	САССАеСКСАТТТЗСАТАТТКТССС	99
νκз_5итк_г	АТСААТСССТСКСТСАбАбСУУТС	100

Таблица 2В. 5'-Праймеры, использованные для амплификации тяжелой и легкой цепей антитела против миостатина

Клон	Прямой праймер тяжелой цепи	Прямой праймер леткой цепи
1 116 1	УНЗа 5итв Г	УК1а 5ϋΤΚ Г
—	— —	— —
1_132_1	УН1а_5иТЕ_Г	УК2_5иТК_Е
1_136_3	УНЗа_5иТВ_Г	УК1а_5иТК_Г
1 257 1	УНЗа 5итв г	УК1а 5ϋΤΚ Е
		— —
1 314 1	УНЗа 5НТК Г	УК1а зитк г
	— —,	— —
1_4 6_1	УН1а_50ТК_Г	νΚ2_5υΤΕ_Γ
2 112 1	УНЗс 50ТК г	укз зитк г
— —	— —	— —
1 268 1	УНЗа 50ТК г	УК1а ьитк Е
		—
1 66 1	УНЗа 50ТК Г	УК1а 5ϋΤΚ Г
—	— —	— —
2 177 1	УНЗс 5итк Е	УКЗ 50ТК Е
— —	— —	— —
2 43 1	УНЗс 5НТЕ Г	укз зитк е

Исследование использования генов

По последовательности нуклеиновой кислоты и предсказанной аминокислотной последовательности антител было установлено использование генов для каждой цепи антитела. Табл. 3 отражает использование генов отобранных гибридомных клонов антител в соответствии с данным изобретением.

Таблица 3. Использование сегмента гена тяжелой и легкой цепи

Клон	Использование гена	тяжелой цепи	Использование гена каппа-цепи
ЗЕО ГО ΝΟ:	νΗ	Сн	Дн	Сн	3ΕΏ го N0:	νκ	σκ
1_116_	1	1	УЗ-21	β5-5	ДН4В	62	3	АЗО	σκι
1_132_	1	5	У1-02	ϋ4-23	ДН6В	62	7	АЗ	3Κ4

1136_3	9	УЗ-21	β5-3	ЛН4В	С2	11	АЗО	ДК1
1_257_1	13	УЗ-21	Б5-12	лнбв	С2	15	АЗО	ДКЗ
1_314_1	17	УЗ-21	-	ДН6В	62	19	АЗО	σκι
1_46_1	21	У1-02	04-23	ДН6В	62	23	АЗ	ЛК4
2_112__1	25	УЗ-23	ϋ1-7	днзв	64	27	Ь2	ЗК4
1_268_1	29	УЗ-21	ϋ1-26	ДН4В	62	31	АЗО	ДК4
1_66_1	33	УЗ-21	05-5	ЛН4В	62	35	АЗО	жз
2_177_1	37	УЗ-21	Э1-7	днзв	64	39	Ь2	ДК4
2_43_1	41	УЗ-23	Р1-7	днзв	64	43	1,2	σκ4

Мутации каркасных участков, которые возникают во время созревания антитела, корректировали в исходное состояние относительно исходных последовательностей, как показано на выравнивании последовательности на фиг. 19. В частности остаток 12 в тяжелой цепи моноклонального антитела 2_112_1 (БЕЦ ΙΌ N0: 26 и 77) изменяли с 11е на Уа1. В легкой цепи (БЕЦ ΙΌ N0: 28 и 79) остаток 58 изменяли с РЬе на Не и остаток 85 изменяли с Не на Уа1. Мутагенез специфичных остатков тяжелой и легкой цепей антитела 2_112_1 проводили посредством конструирования праймеров и применяя набор ЦшскСЬаиде Бйе Э|гес1еб Ми!адеие818 Κίΐ от Б!га!адеие, в соответствии с инструкциями производителя. Мутации подтверждали посредством автоматического секвенирования, и мутантные вставки субклонировали в экс

- 34 015534 прессионные векторы. Эти экспрессионные векторы трансфицировали в клетки Ν8Ο (ЕСАСС # 85110503) и НЕК-293Т (Αте^^саη Туре Си1!иге Со11сс!1оп). чтобы экспрессировать рекомбинантные антитела согласно изобретению. Получившееся антитело. имеющее мутировавшие к первоначальному виду каркасные участки. обозначено как антитело 2_112_К.

Пример ΙΙΙ. Ингибирование миостатина человеческими антителами против миостатина (исследование люциферазы. А204).

Чтобы оценить биологическую активность активного миостатина ίη νίΐΐΌ. проводили исследование с миостатин-чувствительным репортерным геном (см.. ТЫез. е! а1.. Сго\\!11 Рас!огз. (2001) 18:251-259). В этом исследовании используется репортерный вектор рСЬ3(САСА)1₅. соединенный с люциферазой. О последовательности САСА-Ьох (АСССАСАСА) (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 101) сообщали. что она является ТСР-βзависимым элементом в промоторном участке гена. индуцирующего ТСР-β. ΡΑI-1. (Ζη\\ό1. е! а1. Мо1. Се11. (1998) 1:611-617).

Этот репортерный вектор получали посредством встраивания 15 копий САСА-Ьох по сайтам 8таI и ХМ вектора рСЬ3-ргото!ег (Гготеда. Са!. №. Е1761). Транзиентно трансфицировали клеточную линию человеческой рабдомиосаркомы А204 (АТСС Се11 №. НТВ-82) с рСЬ3(САСА)15 и СМV β-САЬ. применяя трансфекционный реагент Радене 6 (КосНе ^^адηοз!^сз. Са!. №. 1814443). Тансфицированные клетки культивировали в течение 16 ч в среде МсСоу'з 5А (Iην^!^οдеη. Са!. №. 16600). дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой. 100 Ед/мл стрептомицина и 100 мкг/мл пенициллина. Клетки переносили на минимальную питательную среду (МсСоу'з 5А тейшт со стрептамицином. пенициллином и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) и затем обрабатывали миостатином. СЭР11 или активином в течение 6 ч при 37°С. Активность люциферазы измеряли. используя систему Эна1-1|дН!* 1исйегазе аззау зуз!ет (АррНей В1озуз!етз. Са!. №. Т1004). Миостатин активирует репортер примерно в 10 раз с ЕС50 около 8 нг/мл. СЭР11 активирует репортер с очень близким эффектом. Нейтрализация активности антитела определяли посредством предварительной инкубации антитела с миостатином в течение 30 мин перед добавлением к клеткам А204. Как показано на фиг. 1. человеческие антитела против миостатина согласно изобретению подавляли стимулированную миостатином активность люциферазы в клетках А204. Также был проведен подобный эксперимент с применением СЭР11. для изучения специфичности антител согласно изобретению. Данные резюмированы на фиг. 1. Большая часть антител имеет гораздо большую нейтрализующую активность в отношении СЭР8. чем в отношении СЭР11. Моноклональные антитела 1_46_1 и 1_132_1 нейтрализуют и СЭР8. и СЭР11 с равной силой.

Пример Ιν. Ингибирование миостатина человеческими антителами против миостатина (исследование бета-лактамазы. Ь6).

Проводили исследования ίη νίίΐΌ для измерения связывания миостатина с мембранными рецепторами Типа ΙΙ в присутствии антител против миостатина для определения способности антител против миостатина ингибировать такое связывание и степень ингибирования.

Проводили исследование Ь6 Аигога геройег аззау для оценки биологической активности активного миостатина ίη νίίΐΌ. Ь6 туоз!а!ш БЭ10 - это клеточная линия. стабильно экспрессирующая беталактамазный репортерный ген. Промоторный участок во встроенном репортере состоит из 16 копий 8тай-связывающего элемента (8ВЕ. СТСТАСАС (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 102). Ζη\\ό1 е! а1.. Мо1. Се11 1: 611-17 (1998)). Клетки культивировали в ЭМЕМ Ыдй д1исозе (Iην^!^οдеη. Са!. №. 11995). дополненной 10% инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сывороткой (РВ8). 200-400 мкг/мл Зеоцина. 100 Ед/мл стрептомицина. и 100 мкг/мл пенициллина. Клетки раскапывали в 96-луночную плашку в первый день и переносили на минимальную среду (ЭМЕМ с Зеоцином. стрептомицином. пенициллином и 0.1% РВ8) после полудня во второй день. Утром третьего дня клетки обрабатывали миостатином. СЭР11 или активином в течение 4 ч при 37°С. Набор Аигога ССР2 1оайтд кй использовали для исследования беталактамазной активности. согласно указанию производителя (Iην^!^οдеη. Са!. №. К1032).

Миостатин активизировал опосредованную зтай экспрессию репортера до 2-3 раз с ЕС50 приблизительно 5 нг/мл. СЭР11 и активин активизировали репортер с очень схожим ответом.

Нейтрализацию активности антитела определяли посредством предварительной инкубации антитела с миостатином в течение 30 мин перед добавлением к клеткам Ь6 туоз!а!т БЭ10. Как показано на фиг. 2 и 11. все исследованные человеческие антитела против миостатина ингибировали активацию зтай-белка в диапазоне примерно от 1 до примерно 225 нМ.

Пример ν. Ингибирование фосфорилирования 8тай 2. индуцируемого миостатином (вестерн-блот).

Клетки человеческой гепатоцеллюлярной карциномы НерС2 (АТТС Се11 №. НВ-8065) культивировали в ЭМЕМ 1ид11 д1исозе (М^оде^ Са!. №. 11995). дополненной 10% эбриональной бычьей сывороткой (РВ8) . 100 Ед/мл стрептомицином и 100 мкг/мл пенициллина. 60-70% слившихся клеток переносили на минимальную среду (ЭМЕМ со стрептомицином. пенициллином и 0.5% РВ8) накануне вечером. Клетки обрабатывали миостатином в течение 30 мин. Нейтрализацию активности антитела определяли посредством предварительной инкубации антитела с миостатином в течение 30 мин перед добавлением к клеткам НерС2. Клетки лизировали для вестерн-блота. Фосфорилированный 8тай2 обнаруживали. применяя кроличье антитело против фософрилированного 8тай2 (Се11 8^дηа11^ηд. Са!. №. 3101). которое

- 35 015534 затем детектировали посредством антикроличьих А1ех 680 (Мо1еси1аг РгоЬек, Са!. №. А21076). Количество фосфорилированного 8таб2 подсчитывали, применяя 0буккеу Штагеб Ийаде!· (Ы-Сог). Для стандартизации применяли глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (САРЭН). Как показано на фиг. 3, все из тестированных нейтрализующих человеческих антител против миостатина ингибировали фосфорилирование ктаб 2.

Пример νΙ. Экспрессия туГ5, усиленная посредством человеческих антител против миостатина.

Миобласты С2С12 (АТСС Се11 №. СКБ-1772) культивировали в ЭМЕМ Ыдй д1исоке (Πινί! годен Са!. №. 11995), дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (ЕВ8), 100 Ед/мл стрептомицина и 100 мкг/мл пенициллина. Клетки обрабатывали 300 нг/мл миостатина в течение 2 ч. Нейтрализацию активности антитела определяли посредством предварительной инкубации антитела с миостатином в течение 30 мин перед добавлением к клеткам С2С12. Клетки собирали и очищали РНК, используя набор КЫеаку тйиргер кй (Ц1адеп Са!. №. 74104). Проводилась количественная оценка очищенной РНК с набором К1ЬоСгееп® К®А ЦиапШайоп Кй (Мо1еси1аг РгоЬек, Са!. №. К11490). Одинаковое количество тотальной РНК использовали для ПЦР-анализа в реальном времени, чтобы обнаружить экспрессию РНК туГ5. Группы праймер/зонд для обнаружения мышиной РНК туГ5 были заказаны в Лккаук-0п-Эетапб™ депе ехргеккюп ргобис!к (Аррйеб Вюкук!етк, Са!. №. Нк00271574_т1). Условия, при которых проводилось исследование, находились в согласовании с рекомендациями производителя. Одноэтапный РТ-ПЦР запускали на устройстве для обнаружения последовательности АВI7900 (Аррйеб Вюкук!етк). Как показано на фиг. 4, нейтрализующие человеческие антитела против миостатина согласно изобретению усиливали экспрессию туГ5. Одно человеческое антитело против миостатина, которое не являлось нейтрализующим, 1_159_1, не усиливало экспрессии туГ5.

Пример νΙΙ. Усиление клеточной дифференциации посредством человеческих антител против миостатина.

Способность антител ингибировать опосредованное миостатином подавление дифференциации миобластов оценивали в миобластах С2С12. Клетки С2С12 раскапывали в 96-луночные плашки по 25000 клеток на лунку в 200 мкл ЭМЕМ/20% ЕВ8/Репп-81гер. Двадцать четыре часа спустя среду удаляли, клетки промывали 1 раз в среде ШТ (ЭМЕМ/2% сыворотка лошади/Репп-81гер) и 200 мкл только среды ШТ или среды ШТ с добавлением только 300 нг/мл СОЕ-8 (Κ&Ό 8ук!етк) или с различными концентрациями добавленного антитела. Сорок восемь часов спустя среду удаляли и лизировали клетки в 100 мкл лизирующего буфера (25 мМ Так рН 7,5, 3 мМ БОТА, 1% №-40, 1% Оеохусйо1а!е, 0,1% 8Ό8 и 1 таблетка ингибитора протеаз Косйе Сотр1е!е рго!еаке Iηй^Ьйο^/25 мл лизирующего буфера). Уровни тяжелой цепи эмбрионального миозина (МНС) в лизатах определяли посредством нанесения 5 мкл лизата в отдельные лунки плашек Шдй Вшб МА6000 р1а!ек (М8Э#Р11ХВ-Е Меко 8са1е ^^ксονе^у, М8Э), высушивания в течение 1 ч на воздухе, добавления 100 мкл В1оскег А (М8О#К93ВА-2), инкубации с покачиванием в течение 1 ч при 25°С, промывки 4 раза в РВ8/0,05% Ттеееп-20, добавления 50 мкл эмбрионального антитела МНС (кондиционная среда от гибридомы АТСС #СКБ-2039), инкубации с покачиванием в течение 1,5 ч при 25°С, промывки 4 раза, как и ранее, добавления 50 мкл 8и1Го-ТАС АпБ-Моике ОС (М8Э #К32АС), которое разводили 1:1000 в разбавителе для антитела (М8Э #К50АА-2), инкубации с покачиванием в течение 1,5 ч при 25°С, промывки 4 раза, как и ранее, добавления 150 мкл 1Х буфера Кеаб ВиГГег (М8Э#К92ТС-2) и анализа хемилюминесценции в 8ес1ог Еаадег 6000 (М8Э). Как показано на фиг. 5, в исследовании МНС нейтрализующие человеческие антитела против миостатина прекращали блокирование миостатином мышечной дифференциации.

Пример νΙΙΙ. Пептидное связывание миостатина.

Было получено одиннадцать пептидов от зрелого СЭЕ8 для того, чтобы исследовать и локализовать связывание антитела (см. фиг. 6). Пептидную ЕЫ8А делали на покрытых глутаральдегидом плашках для ЕЫ8А и на необработанных плашках ЕЫ8А (NυNС-Iттиηο™ р1а!е Мах18огр™ кигГасе, Nа1де №пс Ιΐ'ΐ!егпайопа1, Са!. №. 439454). Покрытые глутаральдегидом плашки готовили посредством смешивания 250 мкл глутаральдегида (50% ν/ν) с 50 мл деионизованной воды и добавления 200 мкл раствора в каждую лунку. Чашки инкубировали в течение по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Глутаральдегид вытряхивали из плашки и, перевернув ее вверх дном, постукивали по бумажным полотенцам, чтобы удалить перед использованием всю жидкость.

В плашки для ЕЫ8А наносили пептид при 1,0 мкг/лунка/50 мкл (в натрий-гидрокарбонатном буфере, рН 9,6) в течение по меньшей мере 4 ч, и затем забивали 200 мкл блокирующего агента (1% В8А, 1% этаноламин рН 7,4) в течение минимум 4 ч. Плашки промывали три раза с 200 мкл РВ8Т на лунку. 50 мкл образца антитела (1 мкг/мл в РВ8Т, фосфатно-солевой буфер (РВ8) с 0,05% Ттеееп-20) добавляли в лунки на 1 ч. Затем плашки промывали РВ8Т три раза. 50 мкл коньюгата античеловеческого ОС с пероксидазой хрена (НКР) (Иегсе, Са!# 31420), разведенного в РВ8Т, добавляли на 1 ч. Лунки снова промывали с ТВ8Т три раза, и затем дважды деионизованной водой. 50 мкл АВТ8 (М088) добавляли на 5-20 мин и сигнал детектировали при 405 нм в колориметрическом приборе для считывания чашек. Результаты эксперимента по связыванию показаны на фиг. 6. Одиннадцать пептидов показано на фиг. 7.

Пример ΙΧ. Исследования по картированию эпитопа.

- 36 015534

Эксперименты по конкурентному связыванию проводили, используя прибор В1 АСОКЕ™ 3000 (В1асоге 1п!егпабопа1 АВ, Иррка1а, 8\уебеп апб Рйсакауау, N1) , следуя инструкциям производителя.

Эксперименты проводили на приборе В1АСОКЕ™ 3000 при 25°С в 0,01 М НЕРЕ8 рН 7,4, 0,15 М №С1, 3 мМ ЕОТА, 0,005% Т\уееп-20. Миостатин иммобилизовывали на чипе СМ5 сЫр (В1асоге™), используя стандартные процедуры аминного связывания, дающие приблизительно 1300 ВИ (резонансные единицы). Образцы антитела готовили при 50 нМ и вводили попарно, например, упоминаемое тАЬ вводили в течение 10 мин с немедленным последующим десятиминутным введением исследуемого тАЬ. Поверхность регенерировала, и инъекции повторяли в обратном порядке. Процедуру повторяли для всех возможных пар антител. Применяли перекрестное сравнение общего ответа, полученного для пары антител, с ответами, полученными при параллельных инъекциях каждого отдельного антитела, для обнаружения антител, которые конкурентно связываются друг с другом, например, антител, конкурирующих за связывание с антигеном. Ответ больше того, который наблюдался для каждого из параллельных введений, служил показателем связывания с разными эпитопами, тогда как ответ, промежуточный для ответов, наблюдаемых при параллельных введениях, был показателем связывания с тем же самым или с перекрывающимся, или со смежным эпитопами. Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 8 и резюмированы на фиг. 13.

Пример X. Иммунопреципитация миостатина из клеточной культуральной среды.

Изучение иммунопреципитации проводили для исследования связывания антител против миостатина со зрелым ΟΌΡ8 и комплексом зрелого ΟΌΡ8 и пропептида. Клетки 293Т трансфицировали конструкцией, экспрессирующей 6ΌΡ-8. Культуральную среду отбирали через 7 дней после трансфекции, которая содержала зрелый ΟΌΡ8 и латентный комплекс. 100 мкл культуральной среды инкубировали с 10 мкг антител против миостатина в течение 16 ч при 4°С. Рго!ет А ЭупаЬеабк (Эупак №гуау) добавляли и инкубировали в течение 90 мин при 4°С. Иммунопреципитат собирали, используя магнитный концентратор МРС-Е (Эупак №гуау), и промывали четыре раза с РВ8. Иммунопреципитат ресуспендировали в концентрирующем буфере и наносили на 4-12% гель В1к-Тпк ШРаде де1 (1пуйгодеп). Вестерн-блотинг проводили, используя систему Обуккеу 1пТгагеб Ипадтд кук!ет (Ы-Сог). Зрелый 6ΌΡ8 и непроцессированный 6ΌΡ8 детектировали, применяя козье антитело против миостатина (Β&Ό кук!етк, Са!# АТ788). Поликлональное кроличье антитело против пропептида (собственного производства) использовали для обнаружения и пропептида, и непроцессированного ΟΌΡ8. Как показано на фиг. 9, антитела 2_112_1, 2_43_1 и 2_177_1 иммунопреципитировали зрелый ΟΌΡ8, комплекс зрелого ΟΌΡ8 и пропептида, и непроцессированный ΟΌΡ8; антитело 1_66_1 иммунопреципитировало зрелый ΟΌΡ8 и комплекс зрелого ΟΌΡ8 и пропетида. Ни одно другое антитело не иммунопреципитировало зрелый ΟΌΡ8, пропептид или непроцессированный ΟΌΡ8. Дорожка 4 - это контроль заполнения среды (1/10), и дорожка 7 - это контроль иммунопреципитации только со средой.

Пример XI. Иммунопреципитация миостатина из мышиной сыворотки.

Изучение иммунопреципитации проводили для исследования связывания антител против миостатина со зрелым 6ΌΡ8 из мышиной сыворотки. 200 мкл мышиной сыворотки (Воск1апб, Са! ## Ό208-00) инкубировали с 20 мкг антител против миостатина в течение 16 ч при 4°С. Рго!ет А ЭупаЬеабк (Оупа1, №гуау) добавляли и инкубировали в течение 90 мин при 4°С. Иммунопреципитат собирали, используя магнитный концентратор МРС-Е (Эупак №гуау), и промывали четыре раза с РВ8. Иммунопреципитат ресуспендировали в концентрирующем буфере и наносили на 4-12% гель В1к-Тпк NиРаде де1 Цпуйгодеп). Вестерн-блотинг проводили, используя систему Обуккеу Iηί^а^еб кпади-щ кук!ет (Ы-Сог). Зрелый 6ΌΡ8 детектировали, применяя биотинилированное козье антитело против миостатина (Ρ&Ό кук!етк, Са!# ВАТ788) . Как показано на фиг. 10, антитела 2_112_1, 2_43_1, и 2_177_1 иммунопреципитировали зрелый ΟΌΡ8 из мышиной сыворотки, тогда как 1_116_1 и 1_66_1 не могли этого. Известно, что зрелый ΟΌΡ8 в сыворотке связывается со многими белками-ингибиторами, такими как пропептид, РЬВО и ОА8АР1 (Н111 е! а1. (2002) Тйе туоккабп ргорерббе апб !йе £оШк!а!т-ге1а!еб депе аге 1пй1Ьйогу Ьтбтд рго!етк о£ туок!а!т т погта1 кегит. I. Вю1. Сйет. 277: 40735-40741. Н111 е! а1. (2003) Веди1а!юп о£ туок!а!т 1п у1уо Ьу дгоу!й апб бкйегепйаДоп £ас!ог-аккос1а!еб кегит ргокет-1: а поуе1 рго!ет уйй рго!еаке тЫЬйог апб £оШк!а!т ботатк. Мо1. Епбосгт. 17(6): 1144-1154). Этот эксперимент показывает, что антитела 2_112_1, 2_43_1 и 2_177_1 действительно не конкурирующие нейтрализующие антитела, то есть данные антитела нейтрализуют миостатин, но не блокируют связывание присутствующих в сыворотке связывающих белков-ингибиторов. Такие неконкурирующие нейтрализующие антитела были бы выгодны ш У1уо.

Пример XII. Сравнение антител против миостатина ш у1уо.

Мышам ККА^у/а в возрасте пяти недель (Тйе 1асккоп ЬаЬога!огу (Ваг НагЬог, Маше)) проводили курс с 10 мг/кг моноклональных антител 2_43_1, 2_177_1 и 2_112_К или носителя (РВ8), вводимого подкожно один раз в неделю в течение пяти недель. В конце исследования животных подвергали эвтаназии и препарировали и взвешивали мышечные группы даккгоспетшк-р1ап!апк-ко1еик (ОР8), ДЫаПк ап!епог (ТА) и циабпсерк (фиабк). Курс антитела 2_112_к значительно увеличил (р<0,05) полную мышечную массу ОР8 (+15,5%) и фиабк (+30,6%). Антитело 2_177 значительно увеличило только фиабк (+11,5%). Хотя

- 37 015534 после курса с антителом 2_112_К ТА увеличилась ( + 16,8%), данное увеличение не было статистически значимым (р=0,330). Масса тела увеличилась за 5 недель, но незначительно отличалась между обработанными группами в любой временной точке во время исследования. В тех случаях, когда мышечная масса соответствовала весу тела (индекс мышечной массы), значимые различия наблюдались только при курсе с 2_112_К ( + 11,4% в 6Р8 и +20,6% в фиабв). Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 14 и 15.

Пример XIII. Фармакология и эффективность антитела ш у1уо.

На мышах была оценена фармакология и эффективность антитела 2_112_К ш у1уо. Для предотвращения потенциальной иммуномодуляции вследствие ответа мышиного античеловеческого антитела (МАНА) исследования ш у1уо проводили на бежевых мышах 8еуеге СотЬшеб 1ттипобес1Пеп1 (8СЮ) с иммунной недостаточностью. Подкожное введение этим мышам антитела 2_112_К при 10 мг/кг в неделю в течение 5 недель увеличило массу скелетной мышцы на 19-25% и силу мышцы примерно на 15%. Увеличение продолжительности этого курса до 10 недель привело к дальнейшему увеличению мышечной силы до 21%, но дальнейшего увеличения мышечной массы не было (18-27%). Также доза 50 мг/кг в неделю в течение 10 недель не дала большего увеличения мышечной массы или сил, в сравнении с 10 мг/кг в неделю. Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 16.

Пример XIV. Влияние дозы и концентрации на ответ.

При подкожном введении мышам 8СШ доз, изменяющихся от невлияющей до максимально возможной дозы (0,01, 0,1, 1 и 10 мг/кг в неделю), антитело 2_112_К в зависимости от дозы увеличивало массу скелетной мышцы примерно на 0, 3, 7 и 28%, соответственно, после 5 недель (фиг. 17). Увеличение продолжительности курса до 10 недель не привело к какому-либо дальнейшему увеличению мышечной массы, но способствовало минимальному увеличению мышечной силы ЛЫаНв на дополнительные 5%. Также в зависимости от дозы антитело изменяло формирование жира в теле таких мышей на +10%, + 1%, -10%, -22% в сравнении с РВ8-контрольными мышами 0,01, 0,1, 1,0 и 10 мг/кг в неделю в течение 5 недель.

Полученные данные нелинейного четырехкомпонентного анализа ответа на дозу и концентрацию оценивали по показателям ЕБ50 и ЕС50 при 3,6 мг/кг в неделю и 20,4 мг/мл (~136 нМ), соответственно, считая увеличение мышечной массы, достигнутое при 10 мг/кг в неделю, максимально эффективным. Взаимосвязь между дозой или сывороточной концентрацией антитела 2_112_К в сравнении с изменениями мышечной массы продемонстрированы на фиг. 18.

Пример ХУ. Эффективность антитела в отношении ослабления мышечного истощения.

Мышей КК (1АХ 1аЬога!опев, Ваг НагЬог, Маше) в возрасте десяти недель случайным образом разделяли на три группы: плацебо/носитель, кортизон/носитель и кортизон/антитело 2_112_К. В течение пяти недель мышам вводил подкожно либо носитель (РВ8), либо 10 мг/кг антитела 2_112_К с последующим вживлением шарика плацебо или кортизона. Пять дней спустя мышей подвергали эвтаназии, умерщвляли и оценивали мышечную массу и массу жировой прослойки. Чтобы определить мышечную массу мышечные группы дав1госпет1ив-р1ап1апв-во1еив (6Р8), НЫаЬв агИепог (ТА) и сщабпсерв (фиабв) препарировали и взвешивали. Вживление кортизона приводило к значительному уменьшению (р<0,05) мышечной масс до 85,1±2,2% (6Р8), 85,5±3,9% (ТА) и 84,1±3,7% (фиабв) в группе плацебо/носитель. Курс антитела 2_112_К полностью улучшал вызываемое кортизоном истощение в группе плацепо/носитель в 6Р8 (102,0±2,2%), ТА (99,5±3,6) и фиабв (104,6±2,8%). Значения были сходны при нормировании на грамм веса тела. Чтобы проверить был ли этот эффект специфичен для мышечной массы, была определена жировая масса подушечки лапы. Для определения массы жировой прослойки паховые, эпидидимальные и абдоминальные жировые прослойки препарировали и взвешивали. Курс антитела 2_112-К незначительно (р<0,05) способствовал потере массы жировой прослойки, обусловленной вживленным кортизоном для паховой (кортизон/носитель (75,1±4,7%) и кортизон/2_112_К (82,3±5,3%)), эпидидимальной (кортизон/носитель (79,3±5,0%) и кортизон/2_112_К (87,1±3,9%)) или абдоминальной (кортизон/носитель (79,5±5,5%) и кортизон/2_112_К (82,2±4,2%)) жировой прослойки. Значения выражены относительно жировой прослойки плацебо/носитель. Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 20А и 20В.

Пример XVI. Очистка антитела против миостатина с применением рго!еш А.

1-2 л концентрированной (10-кратной) среды НЕК293 фильтровали (2 мкм) и нагружали на колонку, уравновешенную белком рго!ет А (АтегвЛат Вювшепсев, Р1вса1амау, N1) (53 мл, уравновешенные ΌРВ8, рН 7,0, 5 объемов колонки) по 2 мл/мин. Колонку промывали 5 объемами колонки с ацетатным буфером (20 мМ ацетат натрия, рН 5,5) и белок элюировался 4 объемами колонки рН 3,2-3,5 ацетата натрия (20 мМ). рН элюата доводили до рН 5,5 с помощью гидроксида натрия и при необходимости фильтровали. Наконец материал концентрировали до 10 мг/мл, диализовали в 140 мМ хлориде натрия, 20 мМ ацетате натрия, рН 5,5, фильтровали и хранили при 4°С.

Все публикации и патентные заявки, цитированные в этой спецификации, включены в настоящее изобретение в виде ссылок, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка были специфичны и указывались в отдельности для включения в виде ссылки. Хотя предшествующее изобретение

- 38 015534 описано в некоторых деталях в виде иллюстрации и примера для прояснения понимания, без труда будет видно простым специалистам в данной области в аспекте обучения по данному изобретению, что в нем могут быть осуществлены некоторые изменения и модификации без отклонения от сущности или границ присоединенной формулы изобретения.

Список последовательностей <ιιο> ργιζερ, тс.

ΆΜ6ΕΝ ГР.ЕМОМТ 1ЫС.

<12 0 > АНТИТЕЛА. К МИОСТАТИНУ <130> ΆΒΧ-ΡΕ7 АИ <140>

<141>

<150> 60/674,933 <151>.2005-04-25 <160> 122 <170> Патент в Версии 3.3 <210> 1 <211> 1338 <212> ДНК <213> Ното еарЬепз <400> 1 даддСдсадс СддЬддадРс Лдддддаддс сЬддРсаадс сЬддддддЬс ссРдадасРс60

РссСдРдсад ссВсСддаСС сассРСсадВ адсРаРадса РдааЬЬдддС ссдссаддсЬ120 ссадддаадд ддсрддадрд ддЬсРсаЬсс аЬЬадРадРа дРадЪадРРа саЬаЬасВас180 дсадасРсад Ьдаадддссд аррсассаЬс Ьссададаса асдссаадаа сСсасСдЬаГ240 сЬдсаааЬда асадссЬдад адссдаддас асддсьдрдр аЬЬасЬдЬдс дададаРсдд300 дддСасадсЬ аЬддЬсРСда сЬасЬддддс садддаассс СддРсассдЬ сЬсс+садсс360

Сссассаадд дсссаРсддЬ сррсссссрд дсдсссРдсР ссаддадсас сЬссдададс420 асадсддссс РдддсЪдссВ ддрсааддас РасРСссссд аассддрдас ддЬдЬсдЬдд480 аасбсаддсд сРсЬдассад сддсдВдсас ассЬРсссад сЬдЬссСаса дрссвсадда540 сЬсбасРссс ЪсадсадсдР ддрдассдрд сссрссадса асРЬсддсас ссадассЬас600 ассСдсаасд РадаЬсасаа дсссадсаас ассааддСдд асаадасадЬ Рдадсдсааа660

ЬдРЬдРдРсд адЬдсссасс дрдсссадса ссассСд+дд саддассдВс адРсЬЬссРс720

ЪРссссссаа аасссаадда сасссРсаРд аВсЬсссдда ссссРдаддР сасдЬдсдСд780 дрддрддасд Сдадссасда адассссдад дЬссадЬЬса асЪддРасдЬ ддасддсдрд840 даддЬдсаЬа ардссаадас ааадссасдд даддадсадр Рсаасадсас дЬЬссдЬдРд900 дрсадсд+сс ЬсассдЬЬдЬ дсассаддас ЬддсРдаасд дсааддадЬа саадрдсаад960 дРсЬссааса ааддссЪссс адсссссаЪс дадаааасса ЬсЬссаааас сааадддсад1020 ссссдадаас сасаддЬдЬа сасссЬдссс ссаЬсссддд аддадаЬдас саадаассад1080 дРсадссСда ссЪдссРддЬ саааддсСРс Сассссадсд асаЪсдссдС ддадЬдддад1140 адсаардддс адссддадаа саасГасаад ассасассЬс ссаРдсЬдда сРссдасддс1200

РссЬЬсЬЬсс РсЬасадсаа дсРсассдЬд дасаададса ддРддсадса ддддаасдрс1260

ЬЬсЬсаЬдсЬ ссдрдардса РдаддсРсЬд сасаассасР асасдсадаа дадссЬсЬсс1320 с+д+сРссдд драааЬда133Θ <210> 2 <211> 445 <212> Белок <213> Ното зар±еп5 <400> 2

01 и 1

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1 5

&1и

Зег

С1у

&1у

51у 10

Ъеи

Уа1

Ьуз

Рго

С1у 15

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи 20

Бег

Суз

А1а

А1а

8ег 25

51у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег 30

Зег

Туг

Зег

Мер

Азп 35

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а 40

Р_го

51у

Ьуз

Н1у

Ьеи 45

61 и

Тхр

Уа1

Зег Бег

Не

Зег

Зег

Зег

Зег Зег 55

Туг

11е

Туг

Туг 60

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

Ьуз

61 у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Ахд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

Мер

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азр

Агд

С1у

Туг

Зег

Туг

61у

Ьеи

Азр

Туг

Тгр

61у

С1п

61у

100

105

но

Ткг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Бег

ТЬг

Ьуз

61 у

Рго

Бег

Уа1

РЬе

115

120

125

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

ТЬг

Бег

61и

Бег

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

130

135

140

51 у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

61и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

145

150

155

160

Азп

Зег

51 у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

61 у

Уа1

Н1з

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

165

170

175

61п

Зег

Зег

С1у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Бег

Бег

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Бег

180

185

190

Зег

Азп

РЬе

61у

ТЬг

51п

ТЬг

Туг

ТЬг

Суз

Азп

Уа1

Азр

Н1в

Ьуз

Рго

195

200

205

Зег

Азп

Ткг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

ТЬг

Уа1

61и

Агд

Ьуз

Суз

Суз

Уа1

61 и

210

215

220

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

Рго

Уа1

А1а

61 у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

225

230

235

240

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Меб

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

61 и

245

250

255

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н1з

61 и

Азр

Рго

61 и

Уа1

61 п

260

265

270

РЬе

Азп

Тер

Туг

Уа1

Азр

51 у

Уа1

61и

Уа1

Н±8

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

275

280

285

Рго

Агд

61и

51и

61п

РНе

Азп

Зег

ТЬг

РЬе

Ал-д

Уа1

Уа1

ЗеГ

Уа1

Ьеи

290

295

300

ТЬг

Уа1

Уа1

Н15

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

51у

Ьуз

51и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

305

310

315

320

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

51 у

Теи

Рго

А1а

Рго

Не

61и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

325

330

335

ТЬг

Ьуз

61у

61п

Рго

Агд

61 и

Рго

51п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Бег

340

345

350

Агд

61и

51и

Мер

ТЬг

Ьуз

Азп

61 п

Уа1

Бег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

355

360

365

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

А5р

Не

А1а

Уа1

61 и

Тгр

61и

Зег

Азп

61у

61 п

370

375

380

- 40 015534

Рго 385

51и

Азп

Азп

Туг

Ьуз 390

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

МеЬ 395

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у 400

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг 405

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1 410

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр 415

51п

61п

61у

Азп

Уа1 420

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1 425

МеЬ

ΗΪ8

б1и

А1а

Ьеи 430

Н13

Азп

ΗΪ8

Туг

ТЬг

61п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

Й1у

Ьуз

435 440 445 <210> 3 <211> 645 <212> ДНК <213> Ното нартепз <400> 3 дасабссада аЬсасЬЬдсс дддааадссс адд^Ьсадсд даадаЬЬГ-Ьд дддассаадд ЬсЬдаСдадс сссадададд дададЬдЬса сЪдадсааад сЬдадсЬсдс

РдасссадСс дддсаадСса сЬсадсдссб дсадСддаЪс саасЬЬаЬЬа Ьддааабсаа адЬСдаааСс ссааадЪаса сададсадда садасЬасда ссдЬсасааз

РссаРссС-Сс дддса^Ьада даСсЬаЬдсР Ьдддасадаа срдрс-Ьасад асдаасЬдЬд ЬддаасРдсс дЪддааддЪд садсааддас дааасасааа дадсЬРсаас сЬдЬсЬдсаЬ ааЬдсЬЬЬад дсаЪссадРЪ СЪсасСсЬса саСааЬадЪЬ дс^дсассаЕ ЬсЬд'ЬПдЬдЬ даЬаасдссс адсассСаса дЬсбасдссЬ аддддадад£ сЬдСаддада дсРддРаЬса ЬдсааадЬдд сааЪсадсад асссЬсддас сЬдЬсЬЬсаЬ дссЬдсЬдаа Ъссаа'Ьсддд дссСсадсад дсдаадЬсас дЬЬад сададЬсасс дсадааасса ддСсссаСса ссЬдсадсс1: дЬЬсддссаа сЬЬсссдсса ЬаасЬЬс'Ьаб ЬаасЬсссад сасссЬдасд ссабсадддс

120

180

240

300

360

420

4Θ0

540

600

645 <210> 4 <211> 214 <212> Белок <213> Ното аар1епз <400> 4

Азр 1

Не

61п

МеЬ ТЬг 5

61п

Зег Рго

Зег Зег Ьеи 10

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

61у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

61п

61 у

11е

Агд

Азп

А1а

20

25

30

Ьеи

61 у

Тгр

Туг

61 п

61п

Ьуз

Рго

61 у

Ьуз

А1а

Рго

С1п

Агд

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

А1а

А1а

Зег

Зег

Ьеи

61п

Зег

61у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

61у

50

55

60

Зег

61у

Зег

61 у

ТЬг

С1и

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

61п

Рго

65

70

75

80

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

61 п

Н1е

Азп

Зег

Туг

Рго

Агд

85

90

95

ТЬг

РЬе

61у

С1п

61 у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61 и

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

100

105

но

Рго

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рхс

Рго

Зег

Азр

61 и

61 п

Ьеи

Ьуз

Зег

б!у

115

120

125

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суд

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

С1и

А1а

130

135

140

- 41 015534

Ьуз 145

Уа1

ΟΙ η

Тгр

Ьуз

Уа1 150

Азр

Ав η

А1а

Ьеи

61п 155

Зег

С1у

Азп

Зег

51п 160

С1и

Зег

Уа1

ТЬг

51 и 165

51 η

Азр

Зег

Ьуз

Азр 170

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи 175

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг 180

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр 185

Туг

Б1и

Ьуз

Ηίδ

Ьуз 190

Уа1

Туг

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТЬг

Н13

51 η

51 у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

195 200 205

РЬе Азп Агд О1у 51и Суз

210 <210> 5 <211> 1350 <212> ДНК <213> Ното зар!епз <400> 5 садд+дсадс +сс+дсаадд сс+ддасаад дсасадаад+ а+ддадс+да д+дддаад+д д+с+со+сад асс+ссдада асдд+д+сд+ сад+сс+сад асссадасс+ д++дадсдса +сад+с++сс д+сасд+дсд д+ддасддсд асд++ссд+д +асаад+дса ассааадддс ассаадаасс д+ддад+ддд дас+ссдасд саддддаасд аададсс+с+ +дд+дсад+с с++с+дда+а ддс++дад+д ++садддсад дсаддс+дад дд+ас+ас+а сс+ссассаа дсасадсддс ддаас+садд дас+с+ас+с асасс+дсаа аа+д++д+д+ +с++сссссс +дд+дд+дда +ддадд+дса +дд+садсд+ адд+с+ссаа адссссдада адд+садсс+ ададсаа+дд дс+сс++с++ +с++с+са+д ссс+д+с+сс +ддддс+дад сасс++сасс да+ддда+дд дд+сасса+д а+с+дасдас с+асдд+а+д дддссса+сд сс+дддс+дс сдс+с+дасс сс+садсадс сд+ада+сас сдад+дссса аааасссаад сд+дадссас +аа+дссаад сс+сассд++ саааддсс+с ассасадд+д дасс+дсс+д дсадссддад сс.+с+асадо с+ссд+да+д ддд+ааа+да д+даадаадс ддс+ас+а+а а+саассс+а ассадддаса асддссд+д+ дасд+с+ддд д+с++ссссс с+дд+саадд адсддсд+дс д+дд+дассд аадсссадса ссд+дсссад дасассс+са даадассссд асааадасас д+дсассадд ссадссссса +асассс+дс д+саааддс+ аасаас+аса аадс+сассд са+даддс+с с+ддддса+с ад+даадд+с 60 +дсас+ддд+ дсдасаддсс 120 асаа+дд+дд 0303330+8+ 180 сд+сса+сад сасадсс+ас 240 а+сас+д+дс дадааа+асд 300 дссаадддас сасдд+сасс 360 +ддсдссс+д с+ссаддадс 420 ас+аа++ссс сдаассдд+д 480 асасс++ссс адс+д+со+а 540 +дссс+ссад саас+Ссддс 600 асассаадд+ ддасаадаса 660 сассасс+д+ ддсаддасад 720 +да+с+сссд дасссс+дад 780 адд+ссад++ саас+дд+ас 840 дддаддадса д++саасадс 900 ас+ддс+даа сддсааддад 960 +сдадаааас са+с+ссааа 1020 сссса+сссд ддаддада+д 1080 +с+ассссад сдаса+сдсс 1140 адассасасс +ссса+дс+д 1200 +ддасаадад садд+ддсад 1260 +дсасаасса с+асасдсад 1320 1350 <210> б <211> 449 <212> Белок <213> Ното зар!епз <400> 6

61п 1

Уа1

61 п

Ьеи

Уа1 5

С1п

Зег

С1у А1а

01 и 10

Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

61у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

01 у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

61у

Туг

20

25

30

Туг

Ме+

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

61у

51п

51 у

Ьеи

01 и

Тгр

Ме +

35

40

45

61у

Тгр

Не

Азп

Рго

Азп

Азп

51у

С1у

ТЬг

АзП

Туг

А1а

С1п

Ьуз

РЬе

- 42 015534

55 60

61η 65

61 у

Агд

Уа1

ТЬг

МеЬ ТЬг 70

Агд

Азр

ТЬг

Зег 75

11е

Зег ТЬг

А1а

Туг 80

Мег

С1Ώ

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Нхз

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азп

ТЬг

Уа1

61у

Зег

61у

Туг

Туг

Туг

Туг

61 у

МеЬ

Азр

Уа1

100

105

110

Тгр

61у

61п

61 у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

61 у

115

120

125

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

ТЬг

Зег

61и

Зег

130

135

140

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

61у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

61 и

Рхо

Уа1

145

150

155

160

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

01у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

61 у

Уа1

Н1з

ТЬх

РЬе

165

170

175

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

61п

Зег

Зег

61у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

180

185

190

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

Зег

Азп

₽Ье

61у

ТЬг

61п

ТЬг

Туг

ТЬг

Суз

Азп

Уа1

195

200

205

Азр

Н1з

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

ТЬг

Уа1

61и

Агд

Ьуз

210

215

220

Суз

Суз

Уа1

С1и

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

РГО

Рго

Уа1

А1а

61у

Рго

225

230

235

240

8ег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЬ

Не

Зег

245

250

255

Агд

ТЬг

Рго

61и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зех

Н1з

61и

Азр

260

265

270

Рго

б1и

Уа1

С1п

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

61 у

Уа1

61и

Уа1

Н±з

Азп

275

280

285

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

61и

61и

С1п

РЬе

Азп

Бег

ТЬх

РЬе

Агд

Уа1

290

295

300

ν&ι

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Уа1

Н1з

61 п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

61у

Ьуз

б1и

305

310

315

320

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

61 у

Ьеи

Рго

А1а

Рго

Не

61 и

Ьуз

325

330

335

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

ТЬг

Ьуз

61 у

61п

Рго

Агд

61 и

Рхо

61п

Уа1

Туг

ТЬг

340

345

350

Ьеи.

Рго

Рхо

Зег

Агд

61и

61 и

МеЬ

ТЬг

Ьуз

Азп

61п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

355

360

365

Суз

Ьеи

νβΐ

Ьуз

61 у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

61и

Тхр

61и

37 0

375

380

Зег

Азп.

С1у

61 п

Рго

61 и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рхо

Мер

Ьеи

385

390

395

400

- 43 015534

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег 405

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег 410

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр 415

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

ΘΙη 420

&1п

<31у

Азп

Уа1

РЬе 425

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мер 430

ΗΪ5

51и

А1а

Ьеи

ΗΪ8

Азп

Н1е

Туг

ТЬг

ΘΙη

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

51у

435 440 445

Ьуз <210> 7 <211> 650 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 7 даРаР+дРда Рдас+садРс СссасРс+сс сРдсссдРса сссс+ддада дссддссРсс60 аРсЬссРдса ддРсРад+са дадссРасЬд саРадЬааРд даЬасаасЬа РРРддаРРдд120

РассРдсада адЬсадддса дРсЬссаоад сЬссЬдаРсс аЬЬРдддРРс РааРсдддсс180

РссддддЬсс сРдасаддРР садрддсадр ддаРсаддса садаЬЬРРас асЬдааааРс240 адсададрдд аддсСдадда РдРЬддддРР РаРРасЬдса РдсаадРЬсР асааасРссд300 сРсасРРРсд дсддадддас сааддРддад аРсааасдаа сРдРддсЬдс асса+сРдРс360

РРсаС-сРРсс сдссаРс+да РдадсадРРд аааРсРддаа сРдссРсРдР рдрдрдссрд420 сРдааРаасР РсРаРсссад ададдссааа дРасадРдда аддРддаРаа сдссс+ссаа4 00

РсдддРаасС сссаддадад Рд+сасадад саддасадса аддасадсас сРасадссРс540 адсадсассс РдасдсРдад сааадсадас Расдадааас асааадРсРа сдсс+дсдаа600 д+сассса+с адддссРдад сСсдсссдРс асааададсС Ссаасадддд ададРдРРад660 <210> 8 <211> 219 <212> Белок <213> Ното зардела <400> 8

Азр 1

Не

Уа1

мер

ТЬг 5

ΘΙη

Зег

Рго

Ьеи

Зег 10

Ьеи

Рго

Уа1

ТЬг

Рго 15

б1у

С1и

Рго

А1а

Зег 20

11е

Зег

Суз

Агд

Зег 25

Зег

ΘΙη

Зег

Ьеи

Ьеи 30

Ηίε

Зех

Азп

51у

Туг 35

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр 40

туг

Ьеи

61п

Ьуз

Зег 45

61у

61п

Зег

Рго

ΘΙη 50

Ьеи

Ьеи

11е

Н1з

Ьеи 55

С1у

Зег

Азп

Агд

А1а 60

Зег

51у

Уа1

Рго

Азр 65

Апд

РЬе

Зег

С1у

Зег 70

61у

Зег

С1у

ТЬг

Азр 75

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не 80

Зег

Агд

Уа1

51и

А1а 85

С1и

Азр

Уа1

С1у

Уа1 90

Туг

Туг

Суз

Мер

ΘΙη 95

Уа1

Ьеи

ΘΙη

ТЬг

Рго 100

Ьеи

ТЬг

РЬе

Б1у

еьу 105

е1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

51 и но

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1 115

А1а

А1а

Рго

Зег

Уа1 120

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго 125

Зег

Аэр

51и

ΘΙη

Ьеи

Ьуз

Зег

О1у

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

- 44 015534

130

135

140

Туг

Рго

Агд

61и

А1а

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьей

О1п

145

150

155

160

Зег

С1у

Азп

Зег

О1п

εΐυ

Зег

Уа1

ТЬг

51-ц

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

165

170

175

ТЬг

Туг

Зег

Ьей

Зег

Зег

ТЬг

Ьей.

ТЬг

Ьей

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туп

С1и

180

185

190

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

51а

Уа1

ТЬг

Нхз

01п

С1 у

Ьей

Зег

Зег

195

200

205

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

61у

С1и

Суз

210

215

<210> 9 <211> 1338 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 9 даддрдсадс ЬддРддадРс Рдддддаддс срддрсаадс сРддддддРс ссРдадасРс60 рссрдрдсад сспсРддаРР сассРРсадР адсРаРадса рдаасРдддР ссдссаддсР120 ссадддаадд ддсрддадрд ддРсРсаРсс аРРадРадРа дРадРадРРа саРаРасРас180 дсадасРсад Рдаадддссд аРРсассаРс Рссададаса асдссаадаа сРсасРдЬаР240 сРдсаааРда асадссРдад адссдаддас асддсРдРдР аррасрдрдс дададаРсдР300 ддаРасадсР аРддРаРРда сРасРддддс садддаассс РддРсассдР сРссРсадсс360

Рссассаадд дсссаРсддР сРРсссссРд дсдсссрдср ссаддадсас сРссдададс420 асадсддссс РдддсРдссР ддРсааддас РасРРссссд ааосддрдас ддрдрсдрдд480 аасРсаддсд сРсРдассад сддсдрдсас ассРРсссад сРдРссРаса дРссРсадда540 сРсРасРссс РсадсадсдР ддрдассдрд сссрссадса асРРсддсас ссадассРас600 асаРдсаасд Радарсасаа дсссадсаас ассааддрдд асаадасадР Рдадсдсааа660

РдРРдРдРсд адРдсссасс дРдсссадса ссассРдЕдд саддассдРс адРсЕРссРс720

РРссссссаа аасссаадда сасссРсаРд аРсРссадда ссссРдаддР сасдрдсдрд700 дрддрддасд Рдадссасда адассссдад дРссадрРса асРддРасдР ддасддсдрдΘ40 даддрдсаРа аРдссаадас ааадссасдд даддадсадр Рсаасадсас дррссдРдРд900 дРсадсдРсс РсассдРРдР дсассаддас РддсРдаасд дсааддадра саадрдсаад960 дРсРссааса ааддссрссс адсссссаРс дадаааасса РсРссаааас сааадддсад1020 ссссдадаас сасаддрдра сасссРдссс ссаРсссддд аддадаРдас саадаассад1080 дРсадссРда ссРдссРддР саааддсРРс Рассссадсд асаРсдссдР ддадрдддад1140 адсааРдддс адссддадаа саасРаааад ассасассРс ссаРдсРдда сРссдасддс1200

РссЬРсРРсс РсРасадсаа дсРсассдрд дасаададса ддрддсадса ддддаасдРс1260

РРсРсаРдсР ссдРдаРдса РдаддсРсРд сасаассасР асасдсадаа дадссРсРсс1320 сРдРсРссдд драаарда1338 <210> 10 <211> 445 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 10

61и

Уа1

61 п

Ьей

Уа1

61и

Зег

С1у

51у

01 у

Ней

Уа1

Ьуз

Рго

61 у

61 у

1

5

10

15

Зег

Ьей

Агд

Ьей

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

61 у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

5ег

Туг

20

25

30

Зег

Мер

Азп

Тгр

Уа1

Агд

01 п

А1а

Рго

61 у

Ьуз

61у

Ьей

61 и

Тгр

Уа1

35

40

45

- 45 015534

Зег

Зег 50

Не

Зег

Зег Зег

Зег Зег Туг 11е Туг Туг АЬа Азр Зег УаЬ

55

60

Ьуз

СЬу

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр .

Азп .

АЬа

Ьуз .

Азп

Зег

Ьеи '

Туг

65

70

75

80

Ьеи

СЬп

Мек

Аэп

Зег

Ьеи

Агд

АЬа

С1и

Азр

ТЬг

АЬа '

УаЬ

Туг

Туг

Суз

85

90

95

АЬа

Агд

Азр

Агд

СЬу

Туг

Зег

Туг

СЬу

11е

Азр

Туг

Тгр

СЬу

61п

С1у

100

105

ыо

Ткг

Ьеи

Уа1

ТЬг

УаЬ

Зег

Зег

АЬа

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

УаЬ

РЬе

115

120

125

Рго

Ьеи

АЬа

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

Ткг

Зег

СЬи

Зег

ТЬг

А1а

711а

Ьеи

130

135

140

61у

Суз

Ьеи

УаЬ

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

61 и

Рго

УаЬ

ТЬг

УаЬ

Зег

Тгр

145

150

155

160

Азп

Зег

61 у

АЬа

Ьеи

ТЬг

Зег

СЬу

УаЬ

Н1з

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

УаЬ

Ьеи

165

170

175

СЬп

Зег

Зег

СЬу

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

УаЬ

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

180

185

190

Зег

Азп

РЬе

61 у

ТЬг

61 п

ТЬг

Туг

Ткг

Суз

Азп

Уа1

Азр

НЬз

Ьуз

Рго

195

200

205

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ткг

Уа1

61и

Агд

Ьуз

Суз

Суз

Уа1

СЬи

210

215

220

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

АЬа

Рго

Рго

УаЬ

АЬа

СЬу

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

225

230

235

240

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Мер

1Ье

Зег

Агд

Ткг

Рго

СЬи

245

250

255

Уа1

ТЬг

Суз

УаЬ

Уа1

УаЬ

Азр

Уа1

Зег

ΗΪ3

61и

Азр

Рго

61и

Уа1

СЬп

260

265

270

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

СЯу

Уа1

61 и

УаЬ

НЬз

Азп

АЬа

Ьуз

ТЬг

Ьуз

275

280

285

Рго

Агд

СЬи

СЬи

СЬп

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

РЬе

Агд

УаЬ

УаЬ

Зег

Уа1

Ьеи

290

295

300

ТЬг

УаЬ

Уа1

ΗΪ3

СЬп

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

61у

Ьуз

61и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

305

310

315

320

УаЬ

Зег

Азп

Ьуз

СЬу

Ьеи

Рго

АЬа

Рго

11е

СЬи

Ьуз

Ткг

ТЬе

Зег

Ьуз

325

330

335

ТЬг

Ьуз

СЬу

СЬп

Рго

Агд

61 и

Рго

СЬп

УаЬ

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

340

345

350

Агд

СЬи

СЬи

Ме!

Ткг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

УаЬ

Ьуз

355

360

365

СЬу

Рпе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

АЬа

УаЬ

б1и

Тгр

СЬи

Зег

Азп

СЬу

СЬп

370

375

380

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Ме!

Ьеи

Азр

Бег

Азр

СЬу

- 46 015534

385

390

395

400

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

С1п

405

410

415

С1п

е1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мес

ΗΪ3

С1и

А1а

Ьеи

Είθ

Азп

420

425

430

ΗΪ8

Туг

ТЬг

ΘΙη

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

435 440 445 <210> 11 <211> 645 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 11 дасаЪссада СдасссадЬс ЬссаСссЬсс сЬдЬсЬдсаЬ сЬдЬаддада сададСсасс 60 аЬсасСЬдсс дддсаадСса дддсаЬСада ааСдсСССад дс+ддСаСса дсадааасса 120 дддааадссс сСаадсдссЬ даСсСаЬдсС. дсаСссадСХ СдсааадСдд ддСсссабса 180 аддЪЬсадсд дсадСддаЬс Ьдддасадаа ЬСсасСсЬса саа+садсад ссСдсадссС 240 даадаЬСЬЬд саасСЬаСЬа срдЬсСасад саЬааСадСС асссбсддас дСЬсддссаа 300 дддассаадд ЬддаааЬсаа асдаасЬдЬд дсСдсассаС с-ЬдСсЬСсаС сСЬсссдсса 360 ЬсСдаСдадс адЬСдаааСс ЬддаасСдсс ЬсСдССдрдС дссЬдсСдаа СаасЬЬсСаС 420 сссадададд ссааадЕаса д+ддааддбд даСаасдссс ЬссааЬсддд СаасЬсссад 480 дададЬдЬса сададсадда садсааддас адсассСаса дсс+садсад сасссбдасд 540 сСдадсааад садасбасда дааасасааа д-ЬсСасдсс’Ь дсдаадСсас ссабсадддс 600 оЬдадсЬсдс ссдСсасааа дадсЬСсаас аддддададЬ дЬЬад 645 <210> 12 <211> 214 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 12

Азр 1

Не

ΘΙη

МеС

ТЬг 5

ΘΙη

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг 20

Не

ТЬг

Суз

Агд

А1а 25

Зег

ΘΙη

61у

11е

Агд 30

Азп

А1а

Ьеи

61у

Тгр 35

Туг

ΘΙη

С1п

ьуз

Рго 40

51у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз 45

Агд

Ьеи

11е

Туг.

А1а 50

А1а

Зег

Зег

Ьеи

ΘΙη 55

Зег

&1у

Уа1

Рго

Зег 60

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег 65

61у

Зег

61у

ТЬг

61и 70

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не 75

Зег

Зег

Ьеи

61 п

Рго 80

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг 85

Туг

Туг

Суз

Ьеи

С1п 90

Н15

Азп

Зег

Туг

Рго 95

Агд

ТЬг

РЬе

51 у

61п 100

61 у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и 105

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1 но

А1а

А1а

Рго

Зег

Уа1 115

РЬе

Не

РЬе

Рго

Рго 120

Зег

Азр

С1и

51П

Ьеи 125

Ьуз

Зег

51у

ТЬг

А1а 130

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи 135

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг 140

Рго

Агд

61 и

А1а

- 47 015534

Ьуз 145

Уа1

61п

Тгр

Ьуз

УаЬ 150

Азр

Азп

А1а

Ьеи

61 п 155

Зег

61у

Авп

Зег

51п 160

61 и

Зег

Уа1

ТЬг

б!и 165

61п

Азр

Зел

Ьуз

Азр 170

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи 175

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг 180

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр 185

Туг

51 и

Ьуз

Н1з

Ьуз 190

Уа1

Туг

А1а

Суз

61и

νβΐ

ТЬг

Н1в

61п

61у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

195 200 205

РЬе Ави Агд 61 у 61и Суз

210 <210> 13 <211> 1338 <212> ДНК <213> Ното зар!епз <400> 13 даддбдсадс ЬссЬдСдсад ссадддаадд дсадасСсад сЬдсааабда дда+асЬасЬ Ьссассаадд асадсддссс аасСсаддсд сЬсЬасЬссс ассЬдсаасд ЬдЫдСдЬсд ЬЬссссссаа дЬддЬддасд даддЬдсаЬа дЬсадсдЬсс дЬсЬссааса ссссдадаас дЬсадссЬда адсааЬдддс ЬссЫсЫсс ЬЬс-ЬсаЬдсЬ с'Ьд'ЬсЪссдд

ЬддЬддадЬс ссЬс’СддаЬЬ ддсЬддадЬд Ьдаадддссд асадссЬдад асддЬа+дда дсссаЬсддЬ ЬдддсЬдссЬ сбсЬдассад ЬсадсадсдЬ ЬадаЬсасаа адрдсссасс аасссаадда Ьдадссасда аСдссаадас ЬсассдТРдЬ ааддссЬссс сасаддбд+а ссЬдссЬддЬ адссддадаа ЬсЬасадсаа ссдЬдаЪдса дРаааЬда

Ьдддддаддс сассЬЬсадЬ ддЬсЬсаЬсс аЫсассаСс адссдаддас сдЬсЬддддс сЫсссссйд ддЬсааддас сддсдЬдсас дд+дассдСд дсссадсаас д+дсссадса сасссСсаЪд адассссдад ааадссасдд дсассаддас адсссссабс сасссЬдссс саааддсЬЬс саасЪасаад дсЬсассдЬд ЬдаддсЬсЬд сЬддЬсаадс адсТаЬадса аЬЬадЬадЬа Ьссададаса асддсЬдЬдЬ саадддасса дсдсссЬдсЬ. ЬасЫссссд ассССсссад сссСссадса ассааддЬдд ссассЬдЬдд аЬсЬсссдда дЬссадЫса даддадсадЬ ЬддсЬдаасд дадаааасса ссаЬсссддд Ьассссадсд ассасассЬс дасаададса сасаассасЪ сЬддддддЬс ЬдаасСдддЬ дЬадЬадЫа асдссаадаа аЬЬасЬдЬдс сддЬсассдЬ ссаддадсас аассддЬдас сЬдЬссЬаса асРЬсддсас асаадасадЬ саддассдЬс ссссЬдаддЬ асСддОасдС Ссаасадсас дсааддадЬа ЬсЬсааааас аддадаЬдас аса+сдссдЬ ссаЬдсЬдда дд+ддсадса асасдсадаа ссЬдадасОс 60 ссдссаддсб 120 саЬаЬасЬас 180 сЬсасСдЬаЬ 240 дададаЬадд 300 сЬссЬсадсс 360 сЬссдададс 420 ддЬдЬсдЬдд 480 дЬссбсадда 540 ссадассСас 600 Ьдадсдсааа 660 адСсЫсс+с 720 сасдЬдсдЬд 780 ддасддсдЬд 840 дМссдЪдТд 900 саадрдсаад 960 сааадддсад 1020 саадаассад 1080 ддадЬдддад 1140 сЬссдасддс 1200 ддддаасдЬс 12 60 дадссЪсЪсс 1320 1338 <210> 14 <211> 445 <212> Валок <213> Ното заргепз <400> 14

61и

Уа1

61п

Ьеи

УаЬ

61и

Зег

61 у

51у

61у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

61у

61 у

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

51у

РЬе

ТЫ

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

Зег

МеЬ

Азп

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

51 у

Ьуз

61 у

Ьеи

61и

Тгр

νβΐ

35

40

45

Зег

Зег

Не

Зег

Зег

Зег

Зег

Зег

Туг

Не

Туг

Туг

А1а

Авр

Зег

Ма1

50

55

60

- 48 015534

Ьуз 65

С1у Агд

РЬе

ТЬг

Не 70

Зег Агд Азр Азп

А1а 75

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг 80

Ъеи

С1п

МеЬ

Азп

Зех

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азр

Агд

51 у

Тух

Туг

Туг

51 у

МеЕ

Азр

Уа1

Тгр

51у

51п

51 у

100

105

НО

ТЬх

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зех

А1а

Зех

ТЬг

Ьуз

51у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

115

120

125

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

ТЬг

Зег

51 и

Зег

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

130

135

140

61у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

51и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зех

Тгр

145

150

155

160

Азп

Зег

61у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

Уа1

Н1з

ТЬг

РЬе

Рхо

А1а

Уа1

Ьеи

165

170

175

51 п

Зег

Зег

С1у

Ьеи

Тух

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

190

185

190

Зег

Азп

РЬе

51 у

ТЬг

51п

ТЬг

Тух

ТЬг

Суз

Азп

Уа1

Азр

Нхз

Ьуз

Рго

195

200

205

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

ТЬг

Уа1

61и

Агд

Ьуз

Суз

Суз

Уа1

51и

210

215

220

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

Рхо

Уа1

А1а

51у

Его

Зег

Уа1

РЬе

Ъеи

225

230

235

240

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рхо

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЕ

Не

Зег

Агд

ТЬг

Рго

61и

245

250

255

Уа1

ТЬг

Суз

νβΐ

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Нхз

51 и

Азр

Рго

<31и

Уа1

61п

260

265

270

РЬе

Азп

Тгр

Тух

Уа1

Азр

51 у

Уа1

51и

Уа1

Нхз

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ъуз

275

280

2Θ5

Рго

Ахд

б1и

□1и

Б1п

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

РЬе

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

290

295

300

ТЬх

Уа1

УаЬ

Нхз

61 п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

305

310

315

32 0

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

51 у

Ьеи

Рго

2к1а

Рхо

Не

51и

Ьуз

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

325

330

335

ТЬх

Ьуз

51 у

51п

Рго

Ахд

51 и

Рго

51 п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зех

340

345

350

Агд

51 и

61и

МеЬ

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

355

360

365

01 у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

61и

Зег

Азп

51 у

61 п

370

375

380

Рго

61и

Авп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

МеГ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

51 у

385

390

395

400

- 49 015534

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи Туг 405

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1 410

Аер

Ьуз

Зег

Агд

Тгр 415

61п

611Ί

51у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

Ηίδ

61и

А1а

Ьеи

Ηίε

Азп

420

425

430

ΗΐΒ

Туг

ТЬг

61п

Ьув

Зег

Ьеи

8ег

Ьеи

Зег

Рго

61 у

Ьуз

435 440 445 <210> 15 <211> 645 <212> ДНК <213> Ното вархепв <400> 15 дасаЪссада Ьдасссадкс ЬссаЬссЬсс сЬдксЬдсаЬ сЬдЬаддада сададЬсасс60 сЬсасСПдсс дддсаадЬса дддсаЬПада ааЬдсЬСЬад дсСддЬаПса дсадааасса120 дддааадссс сЬаадсдссЬ даЬсЬаЪддТ: дсаЬссадЬЪ ЪдсааадЬдд ддСсссаГса180 аддСЬсадсд дсадбддаЬс Ьдддасадаа ЬЬсасЬсЬса сааЬсадсад ссбдсадссХ240 даадаЫХСд саасССаСРа сЬдХсЬасад саСааСадЫ; асссаЬЬсас ЪЫсддссЫ300 дддассааад ЬддакаЬсаа асдаасЬдЕд дсЬдсассаР сЕдЕсЬЬсаЬ сЬЬсссдсса360

ЬсЬдаЬдадс адЬЕдаааЬс ЬддаасЬдсс ЬсЬдСЬдЬдЬ дссСдсСдаа гаасЫсЬаЬ420 сссадададд ссааадСаса дЬддааддЬд даПаасдссс ЬссааСсддд ЬаасЬсссад480 дададЕдЬса сададсадда садсааддас адсассЪаса дссЬсадсад сасссЬдасд540 сЬдадсааад садасСасда дааасасааа дЬсЬасдссЬ дсдаадЬсас ссаЬсадддс600 сЬдадсЬсдс ссдЬсасааа дадсЬЬсаас аддддадад! дЬЬад645 <210> 16 <211> 214 <212> Белок <213> Ното зархепв <400> 16

Авр 1

Не

61п МеЬ

ТЬг 5

51п

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

61у

Азр

Агд

Уа1

ТНг

Ьеи

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

61л

51 у

Не

Агд

Азп

А1а

20

25

30

Ьеи

61у

Тгр

Туг

51п

61п

Ьуз

Рго

61у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

61у

А1а

Зег

Зег

Ьеи

61 п

Зег

61у

Уа1

Рго

Зег

Ахд

РЬе

Зех

61у

50

55

60

Зег

61у

Зег

61у

ТЬг

С1и

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

61п

Рго

65

70

75

Θ0

61и

Авр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

61п

31 в

Азп

Зег

Туг

Рго

РЬе

85

90

95

ТЬг

РЬе

61 у

Рго

61у

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

11е

Ьуз

Агд

ТЫ

Уа1

А1а

А1а

100

105

НО

Рго

Зег

Уа!

РЬе

Не

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

б1и

51п

Ьеи

Ьуз

Зег

61 у

115

120

125

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

61и

А1а

130

135

140

Ьуе

Уа1

51п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

С1п

Зег

61 у

Авп

Зег

61п

145

150

155

160

СЬи

Зег

Уа1

ТЬг

СЬи 165

СЬп

Азр

Зег

Ьуз

Азр 170

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи 175

Зег

Зег

ТЬг

Ней

ТЬг 180

Ьеи

Зег

Ьуз

АЬа

Азр 185

Туг

СЬи

Ьуз

НЬз

Ьуз 190

Уа1

Туг

АЬа

Суз

51 и 195

УаЬ

ТЬг

НЬз

61п

61у 200

Ьеи

Зег

Зег

Рго

УаЬ 205

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп 210

Агд

61 у

СЬи

Суз

<210>

<211>

<212>

<213>

1338

ДНК

Ното зарЬепз <400> даддрдсадс РссРдРдсад ссадддаадд дсадасРсад сРдсаааРда ддсРассРс! Рссассаадд асадсддссс аасРсаддсд сРсРасРссс ассРдсаасд РдРРдРдРсд РРссссссаа дрддрддасд даддРдсаРа дРсадсдРсс дРсРссааса ссссдадаас дРсадссРда адсааРдддс РссСРсРРсс РРсРсаРдс! сРдрсРссдд рддрддадрс ссРсРддаРР ддсрддадрд Рдаадддссд асадссРдад асддрардда дсссаРсдд! РдддсРдсс! сРсРдассад РсадсадсдР РадаРсасаа адрдсссасс аасссаадда Рдадссасда аРдосаадас РсассдРРд! ааддссРссс сасаддрдра ссРдссРддР адссддадаа РсРасадсаа ссдрдардса дРаааРда

Ьдддддаддс сассРРсад! ддрсЬсаЪсс аРРсассаРс адссдаддас сдрсрддддс сРСсссссРд ддрсааддас сддсдрдсас ддГдассд^д дсссадсаас д^дсссадса сасссГ.са’Ьд адассссдад ааадссасдд дсассаддас адсссссаРс сасссРдссс саааддсРРс саасРасаад дсРсассдРд ЬдаддсРсРд сЬддддддРс ЬдаасРддд! драдЬадЬРа асдссаадаа аЬЬасРдЬдс сддЬсассд! ссаддадсас срддРсаадс адсРаРадса арРадРадРа Рссададаса асдасрдрд! саадддасса дсдсссрдс!

РасРРссссд аассддрдас ассРРсссад сссРссадса ассааддрдд ссассрдрдд аРсРсссдда дРссадРРса даддадсад!

РддсРдаасд дадаааасса ссаРсссддд Рассссадсд ассасассРс дасаададса сасаассасР сЬдЬссРаса асЬЬсддсас асаадасад! саддассдЬс ссссрдадд! ас'Ьдд'Сасд'Ь Ьсаааадсас дсааддадка ЬсЬссаааас аддадардас асаРсдссд! ссаРдсРдда ддрддсадса асасдсадаа ссРдадасРс ссдссаддс! саРаРасРас сРсасРдРа! дададаРсда сРссРсадсс сРссдададс ддРдРсдРдд дРссРсадда ссадассРас рдадсдсааа адРоРРссРс сасдРдсдРд ддасддсдрд дкрссдкдрд саадрдсаад сааадддсад саадаассад ддадрдддад сРссдасддс ддддаасдРс дадссРсРсо

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1338 <210>

<211>

<212>

<213>

445

Белок

Ното зарЬепз <400>

СЬи 1

Уа1

61п

Ьеи

УаЬ 5

61 и

Зег

61у

61 у

61 у 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

61 у 15

61у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи 20

Зег

Суз

А1а

АЬа

Зег 25

61у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег 30

Зег

Туг

Зег

Ме!

Азп 35

Тгр

УаЬ

Агд

61п

АЬа 40

Рго

СЬу

Ьуз

61у

Ьеи 45

ЙЬи

Тгр

УаЬ

Зег

Зег 50

Не

Зег

Зег

Зег

Зег 55

Зег

Туг

11е

Туг

Туг 60

АЬа

Азр

Зег

УаЬ

Ьуз

61 у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

АЬа

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

- 51 015534

70 75 80

Ьеи

Б1л МеЪ Азп

Зег 85

Ьеи Агд

А1а 51и

Азр 90

ТИг

ТИг Уа1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Агд

Азр

Агд

51 у

Туг

Ьеи

Туг

61 у

МеЬ

Азр

Уа1

Тгр

61 у

С1п

51 у

100

105

но

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

ьуз

51 у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

115

120

125

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

ТИг

Зег

61и

Зег

ТИг

А1а

А1а

Ьеи

130

135

140

61у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

51и

Рго

Уа1

ТИг

Уа1

Зег

Тгр

145

150

155

160

Абп

Зег

51 у

А1а

Ьеи

ТЬг

5ег

61 у

Уа1

Нхз

ТЬх

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

165

170

175

61п

Зег

Зег

51 у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТИг

Уа1

Рго

Зег

180

185

190

Зег

Азп

РЬе

С1у

ТНг

61п

ТЬг

Туг

ТНг

Суз

Азп

Уа1

Азр

Нхз

Ьуз

Рго

195

200

205

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

ТЬг

Уа1

61 и

Агд

Ьуз

Суэ

Суз

Уа1

С1и

210

215

220

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

Рго

Уа1

А1а

61 у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

225

230

235

240

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТИг

Ьеи

Мер

Не

Зег

Агд

ТЬг

Рго

61 и

245

250

255

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н1з

51 и

Азр

Рго

61 и

Уа1

С1п

260

265

270

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

61 у

Уа1

61и

Уа1

Нхз

Азп

А1а

Ьуз

ТИг

Ьуз

275

280

285

Рго

Агд

С1и

С1и

51 п

РНе

АЗП

Зег

ТНг

РЬе

Ахд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

290

295

300

ТНг

Уа1

Уа1

Нхз

51 п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

61у

Ьуз

61и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

305

310

315

320

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

51у

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

51и

Ьуз

ТИг

Не

зег

Ьуз

325

330

335

ТИг

Ьуз

61у

61п

Рго

Агд

61 и

Рго

61п

Уа1

Туг

ТИг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

340

345

350

Агд

51и

61и

МеИ

ТНг

Ьуз

Азп

61п

Уа1

Зег

Ьеи

ТИг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

355

360

365

51 у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

51и

Тгр

51и

Зег

Азп

61у

51п

370

375

380

Рго

61и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТИг

ТЬг

Рго

Рго

Мер

Ьеи

Азр

Зег

Азр

51у

385

390

395

400

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТНг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

51п

405

410

415

- 52 015534

51η СЪу Азп УаЪ РЬе Зег Суз Зег УаЪ Мер ΗΪ3 СЪи АЪа Ьеи НЪз Азп

420 425 430

Н1з Туг ТЬг СЪп Ъуз Зег Ъеи Зег Ъеи Зег Рго СЪу Ъуз

435 440 445 <210> 19 <211> 645 <212> ДНК <213> Ното зарЪепз <400> 19 дасаЬссада ЕдасссадЬс ЬссаЬссЬсс сЬдЕсЕдсаЬ сЬдЬаддада сададЬсасс60 аЪсасЬЬдсс дддсаадЬса ддссаЬЬада ааЬдаЕЬХад дсЬддЬаЬса дсадааасса120 дддааадссс сЪаадсдссЕ даЪсЬаЬдсЬ дсаЬссадЬЬ ЬдсааадЕдд ддЪсссаЪса180 аддЬЪсадсд дсадЬддаЬс Ьдддасадаа РЬсасЕсЬса сааЬсадсад ссЪдсадссЬ240 даадаЪ'ЬЬЪд саасЫаЬЕа сЬдЪсЬасад са'ЬааЬадЕЬ асссЕсддас дЪЬсддссаа300 дддассаадд ЪддаааЪсаа асдаасЬдЬд дсЬдсассаЕ аЬдЬсЬЬсаЪ оЬЪсссдсса360

ЪсЬдаЬдадс адгедаааЬс Оддааспдсс ЪсЪдПС-дЪдГ: дссПдсЪдаа ЬаасЬЬсЬаЬ420 сссадададд ссааадбаса дЪддааддПд даЪаасдссс Ъссаа'Ьсддд ПаасЪсссад4Θ0 дададЬдЬса сададсадда садсааддас адсассЕаоа дссЕсадсад сасссЬдасд540 сЪдадсааад садаскасда дааасасааа дЕсЕасдссЬ дсдаадбсас соаЕсадддс600 сЕдадсЬсдс ссдЬсасааа дадсЬЬсаас аддддададЪ дЪЬад645 <210> 20 <211> 214 <212> Белок <213> Ното зарЪепз <400> 20

Авр 1

1Ъе

СЪп

МеС ТЬг 5

СЪп

Зег

Рго

Зег

Зег ЪО

Ъеи

Зег

АЪа

Бег

УаЪ 15

СЪу

Азр

Агд

УаЪ

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Аид

АЪа

Зег

СЪп

АЪа

Ъ.Ъе

Агд

Азп

Азр

20

25

30

Ьеи

СЪу

Тгр

Туг

СЪп

СЪп

Ъуз

Рго

СЪу

Ъуз

АЪа

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

1Ъе

35

40

45

Туг

АЪа

АЪа

Зег

Зег

Ъеи

СЪп

Зег

СЪу

УаЪ

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

СЪу

50

55

60

Зег

СЪу

Зег

СЪу

ТЬг

СЪи

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

1Ъе

Зег

Зег

Ьеи

СЪп

Рго

65

70

75

80

СЪи

Азр

РЬе

АЪа

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

СЪп

НЪз

Аеп

Зег

Туг

Рго

Ахд

85

90

95

ТЬг

РЬе

СЪу

СЪп

СЪу

ТЬг

Ъуз

УаЪ

СЪи

1Ъе

Ьуз

Агд

ТЬг

УаЪ

АЪа

АЪа

100

105

1Ъ0

Рго

Зег

УаЪ

РЬе

1Ъе

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

СЪи

6Ъп

Ъеи

Ьуз

Зег

СЪу

ЪЪ5

120

125

ТЬг

АЪа

Зег

УаЪ

УаЪ

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

С1и

АЪа

130

135

Ъ40

Ъуз

УаЪ

СЪп

Тгр

Ьуз

УаЪ

Азр

Азп

АЪа

Ьеи

СЪп

Зег

СЪу

Азп

Зег

СЪп

145

Ъ50

155

160

СЪи

Зег

УаЪ

ТЬг

съи

СЪп

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

- 53 015534

165 170 175

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг 180

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр 185

Туг

61и

Ьуз

Е1з

Ьуз 190

Уа1

Туг

А1а

Суз

61и

Уа1

ТЬг

Н1з

61п

61 у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

195

200

205

РЬе Азп Агд 61у 61и Суз

210 <210> 21 <211> 1350 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 21 саддЬдсадс ЬддЬдсадЬс ЬддддсЬдад дЬдаадаадс срддддссГс адЬдааддГс60

ЬссСдсаадд сЬЬсЬддаЬа ЬассЬЬсасс ддсЬасСаЬа ЬдсасЬдддЬ дсдасаддсс120 ссбддасаад ддсррдадЬд дардддаЬдд аЬсаасссЬа асадЬддЬдд сасааас+аЬ100 дсасадаадЬ ЬЬсадддсад ддЬсассаЬд ассадддаса сдЬссаЬсад сасадссЬас240 сЬддадсЬда дсаддсЬдад аЬсСдасдас асддссдЬд'Ь аСЬасЬдЬдс дадаааЬасд300 дЬдддаасбд даГас+асба сЬасддбаГд дасдГсЬддд дссаадддас сасддГсасс360 десессЬсад ссЬссассаа дддсссатсд дбсьессссс гддсдсссЬд стссаддадс420 ассЬссдада дсасадсддс ссЬдддсЬдс сЬддЬсаадд асЬасЬЬссс сдаассддЬд480 асддЬдЬсдЬ ддаасЬсадд сдсЬсЬдасс адсддсдЬдс асассЬЬссс адсЬдЪссЬа540 садГссЬсад дасЬсЬасес ссесадсадс дСддЬдассд ЬдсссСссад саасЬЬсддс600 асссадассЬ асассЬдсаа сдЬадаЬсас аадсссадса асассааддЬ ддасаадаса660 дЬЬдадсдса ааЬдЬЬдЬд1: сдадЬдссса ссдЬдсссад сассассЬдЬ ддсаддассд720

ЬсадЬсЬЬсс ЬсЬЬсссссс аааасссаад дасасссЬса ЬдаЬсЬсссд дассссЬдад780 десасдСдсд иддёдд ί-дда сдЬдадссас даадасссад аддессад'сГ саасСддЬас04 0 дЬддасддсд ЬддаддЬдса ЬааЬдссаад асааадссас дддаддадса дЬЬсаасадс900 асдЬЬссдбд ЬддСсадсдЬ ссЬсассдЫ: дЬдсассадд асЬддсЬдаа сддсааддад960

ЬасаадЬдса аддбсЬссаа саааддссбс ссадссссса есдадаааас саЬсЬссааа1020 ассааадддс адссссдада ассасаддбд ЬасасасЬдс ссссаьсссд ддаддадаЬд1080 ассаадаасс аддЬсадссЬ дасс+дссЬд дбсаааддсЬ ЬсЬассссад сдаса+сдсс1140 дЬддад-Ьддд ададсаабдд дсадссддад аасаасбаса адассасасс ЬсссабдсЬд1200 дасЬссдасд дсбссЕХсеь ссбсЬасадс аадс+сассд Ьддасаадад саддЬддсад1260 саддддаасд ЬаГЬсГсаЬд сЬссдЬдаЬд саЬдаддсЬс Ьдсасаасса сбасасдсад1320 аададссбсЬ сссСд+сЬсс дддЬааа+да1350 <210> 22 <211> 449 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 22

61п 1

Уа1

61п

Ьеи

Уа1 5

61п

Зег

61у

А1а

51и 10

Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

61у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1 20

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег 25

51 у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг 30

61 у

Туг

Туг

МеЬ

Н1з 35

Тгр

Уа1

Агд

<Э1п

А1а 40

Рго

61у

61 п

61 у

Ьеи 45

61и

Тгр

МеЬ

61у

Тгр 50

Не

Азп

Рго

Азп

Зег 55

51 у

51у

ТЬг

Азп

Туг 60

А1а

61п

Ьуз

РЬе

61п

51 у

Агд

Уа1

ТЬг

МеЬ

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Не

Зег

ТЬг

А1а

Туг

70 75 80

- 54 015534

Ьеи

51и

Ьеи

Зег Агд 85

Ьеи

Агд

Зег Азр Азр 90

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Агд

Азп

ТЬг

Уа1

51 у

ТЬг

51у

Туг

Туг

Туг

Туг

51 у

Мер

Азр

Уа1

100

105

но

Тгр

51 у

ΘΙη

е1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

61 у

115

120

125

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

ТЬг

Зег

51и

Зег

130

135

140

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

51у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Тух

РЬе

Рго

51и

Рго

Уа1

145

150

155

160

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Бег

51у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

е1у

Уа1

ΗΪΞ

ТЬг

РЬе

165

170

175

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

61п

Зег

Зег

51у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

180

185

190

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

Зег

Азп

РЬе

51 у

ТЬг

51 п

ТЬг

Туг

ТЬг

Суз

Азп

Уа1

195

200

205

Азр

Н1з

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

ТЬг

Уа1

61и

Агд

Ьуз

210

215

220

Суз

Суз

Уа1

51и

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

Рго

Уа1

А1а

51 у

Рго

225

230

235

240

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Ме+

11е

Зег

245

250

255

Агд

ТЬг

Рго

61 и

Уа1

ТЬг

суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Нхз

51и

Азр

260

265

270

Рго

С1и

Уа1

С1п

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

61у

Уа1

61 и

Уа1

Нхз

Азп

275

280

285

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

51 и

ΘΙη

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

РЬе

Агд

Уа1

290

295

300

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Уа1

Нхз

51 п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

51 у

Ьуз

51и

305

310

315

320

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

С1у

Ьеи

Рго

А1а

Рго

Не

51и

Ьуз

325

330

335

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

ТЬх

Ьуз

51 у

ΘΙη

Рго

Агд

51 и

Рго

51 п

Уа1

Тух

ТЬг

340

345

350

Ьеи.

Рго

Рго

Зег

Агд

61 и

51и

МеЬ

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

355

360

365

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

61и

Тгр

61и

370

375

380

Зег

Азп

51 у

51 п

Рго

61и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

МеЕ

Ьеи

385

390

395

400

Аар

Зег

Азр

51у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

405

410

415

Зег

Агд

Тгр

С1п

51 п

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

суз

Зег

Уа1

Мер

Н1з

61 и

- 55 015534

420

425

430

А1а Ьеи ΗΪ3 Азп ΗΪ3 Туг Ткг 61п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у

435 440 445

Ьуз <210> 23 <211> 660 <212> ДНК <213> Ното зар!епз <400> 23 даЕаЕЕдЕда аЕсЕссЕдса ЕассЕдсада ЕссддддЕсс адсададЕдд сссасЕЕЕсд ЕЕсаЕсЕЕсс сЕдааЕаасЕ ЕсдддЕаасЕ адсадсассс дЕсасссаЕс

ЕдасЕсадЕс ддЕсЕадЕса адссадддса сЕдасаддЕЕ аддсЕдадда дсддадддас сдссаЕсЕда ЕсЕаЕсссад сссаддадад ЕдасдсЕдад адддссЕдад

ЕссасЕсЕсс дадссЕссЕд дксЕссасад садЕддсадЕ ЕдЕЕддддЕЕ сааддЕддад ЕдадсадЕЕд ададдссааа ЕдЕсасадад сааадсадас сЕсдсссдЕс сЕдсссдЕса саЕадЕааЕд дЕссЕдаЕсЕ ддаЕсаддса ЕаЕЕасЕдса аЕсааасдаа аааЕсЕддаа дЕасадЕдда саддасадса Еасдадааас асааададсЕ ссссЕддада даЕасаасЕа аСЕЕддЕЕЕс садаЕЕЕЕас ЕдсаадсЕсЕ сЕдЕддсЕдс сЕдссЕсЕдЕ аддЕддаЕаа аддасадсас асааадЕсЕа Есаасадддд дссддссЕсс ЕЕЕддаЕЕдд ЕааЕсдддсс асЕдааааЕс асааасЕссЕ ассаЕсЕдЕс ЕдЕдЕдссЕд сдсссЕссаа сЕасадссЕс сдссЕдсдаа ададСдЕЕад

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660 <210> 24 <211> 219 <212> Белок <213> Ното зар!епз <400> 24

Азр 1

Не

Уа1

МеЕ Ткг 5

61п Зег

Рго Ьеи

Зег 10

Ьеи

Рго

Уа1

ТЬг

Рго 15

61 у

61и

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

61 п

Зег

Ьеи

Ьеи

Н1з

Зег

20

25

30

Азп

61у

Туг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

Туг

Ьеи

61п

Ьуз

Рго

61 у

61п

Зег

35

40

45

Рго

С1п

Уа1

Ьеи

Не

Туг

Ьеи

Уа1

Бег

Азп

Агд

А1а

Зег

61 у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

Рке

Зег

61 у

Зег

61 у

Зег

61у

Ткг

Азр

Рке

Ткг

Ьеи

Ьуз

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа!

61и

А1а

61и

Азр

Уа1

61у

Уа1

Туг

Туг

Суз

МеЕ

61п

А1а

85

90

95

Ьеи

61 п

Ткг

Рго

Рго

Ткг

Рке

61у

51 у

61у

Ткг

Ьуз

Уа1

61и

11е

Ьуз

100

105

110

Агд

Ткг

Уа1

А1а

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Не

Рке

Рго

Рго

Зег

Азр

61и

115

120

125

61п

Ьеи

Ьуз

Зег

С1у

Ткг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суе

Ъеи

Ьеи

Азп

Азп

Рке

130

135

140

Туг

Рго

Агд

61и

А1а

Ьуз

Уа1

51п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

61п

145

150

155

160

- 56 015534

Зег

61 у

Азп

Зег

61п 165

С1и

Зег

Уа1

ТЬг

01 и 170

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр 175

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Бег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

61 и

180

185

190

Ьуз

Н13

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТЬг

Н1з

61п

61 у

Ьеи

Зег

Зег

195

200

205

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

61 у

С1и

Суз

210

215

<210> 25 <211> 1350 <212> ДНК <213> Нойю зарЬепз <400> 25 даддрдсадс ЬаЪЬддадЬс Ъдддддаддс ЬЪдаЬасадс сЬддддддСс ссЬдадасЬс60

ЬссЬдЬдсад ссЬсСддаСЬ сассЬЫгадс адсЬЬЬдсса ЬдадсЬдддЬ ссдссаддсС120 ссадддаадд ддсЬддааЪд ддЪсЬсаасЬ аЬЬадЬ.ддЬа дЬддЬдд „ΐε. сасаЬЬсЬас180 дсадасЕссд Ъдаадддссд дЬЪсассаЬс Ьссададаса аЬЬссаадаа сасдсЬдЬаЬ240 сбдсааабда асадссЬдад адссдаддас асддссд-Ьаб дааадабдда300 аддЬаЬаасЬ ддаасСасдд ддсЬЬЬЬдаЬ аЬсЬддддсс аадддасааЬ ддЬсассдСс360

ЬсЬЬсадсЬЬ асассааддд сссабссдЬс ЬЬсссссЬдд сдссоЬдсЬс саддадсасс420

Ъссдададса садссдсссЬ дддсЬдссЬд дЬсааддасЬ асЬЬссссда ассддЬдасд480 дЬдЬсдЬдда асгсаддсдс ссЬдассадс ддсдьдсаса ссЬЬссаддс ЬдЬссСасад540

ЬссЬсаддас ЬсЬасЬсссЬ. садсадсдЬд дЪдассдЬдс ссЕссадсад сЕЕдддсасд600 аадассЬаса ссрдсаасдЬ адаЬсасаад сссадсааса ссааддЬдда саадададЬЬ660 дадЬссаааб аЬддЬссссс аЬдсссабса Ьдсссадсас сСдадРЪссС ддддддасса720

ЬаадЬсЬЬсс ЬдЪЬсссссс аааасссаад дасасЬсЕса ЬдаЬсЬсссд дассссЬдад780 дЬсасд-Ьдсд ЬддЪддЬдда сдбдадссад даадассссд аддЬссадЫ; саасЬддЕас84 0 дЬддаЬддсд ЬддаддЬдса ЬааЬдссаад асааадссдс дддаддадса дЬЬсаасадс900 асдЬассдбд ЪддЬсадсд'Ь ссЬсассдЬс сЬдсассадд асЬддскдаа сддсааддад960

ЬасаадЬдса аддбсЬссаа саааддссЬс ссдЬссЬсса Ъсдадаааас саЬсЬссааа1020 дссааадддс адссссдада дссасаддЬд ЬасасссСдс ссасаЬасса ддаддадасд1080 ассаадаасс аддЬсадссЬ дассЬдссЬд дСсаааддсЬ ЬсЕассссад сдасаЬсдсс1140 дЬддадСддд ададсааЬдд дсадссддад аасаасбаса адассасдсс ЬсссдЬдсЬд1200 дасЬссдасд дсЪсскЬсСЬ ссЬсЕасадс аддсЬаассд Сддасаадад саддЬддсад1260 даддддааЬд ЬсЬЬсЬсаЬд сбссдЪдаЬд саЪдаддсЬс Ъдсасаасса сЬасасасад 1320 аададссЬсЁ сссьдьсьсь дддЬааарда1350 <210> 26 <211> 449 <212> Белок <213> Ното зарьепз <400> 26

61 и Уа1 1

С1п

Ьеи

Ьеи 5

61 и

Зег

61у 61у 61у 10

Ьеи

Не

61п

Рго

61 у 15

61у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

61 у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

РЬе

20

25

30

А1а

МеЬ

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

61 у

Ьуз

61 у

Ьеи

61 и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

ТЬг

11е

Зег

61 у

Зег

61у

61у

Туг

ТЬг

РЬе

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

61 у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

- 57 015534

Ьеи

ΘΙη

Μβϋ Азп

Зег 85

Ьеи

Агд

А1а

61и Азр 90

ТЬг А1а

Уа1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Ъуз

Азр

51 у

Агд

Туг

Азп

Тгр

Азп

Туг

61 у

А1а

РЬе

Азр

11е

Тгр

100

105

110

51у

51п

61у

ТЬг

Мее

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

51у

Рго

115

120

125

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

ТЬг

Зег

51и

Зег

ТЬг

130

135

140

А1а

А1а

Ьеи

61у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Его

51и

РГО

Уа1

ТЬг

145

150

155

160

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

61 у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

51 у

Уа1

Нхз

ТЬг

РЬе

Рго

165

170

175

А1а

Уа1

Ьеи

С1п

Зег

Зег

К1у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ν&ι

ТЬг

180

185

190

νθι

Его

Зег

Зег

Зег

Ьеи

Б1у

ТЬг

Ьуз

ТИп

Туг

ТЬг

Суз

Азп

Уа1

Азр

195.

200

205

Нхз

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Агд

Уа1

51и

Зег

Ьуз

Туг

210

215

220

61У

Рго

Рго

Суз

Рго

Зег

Суз

Рго

А1а

Рго

51и

РЬе

Ьеи

51 у

61 у

Рго

225

230

235

240

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЪ

11е

Зег

245

250

255

Агд

ТЬг

Рго

51 и

ν&ι

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

51п

51и

Азр

260

265

270

Рго

С1и

Уа1

51п

РЬе

Азп

тгр

Туе

Уа1

Азр

51 у

V»!

61и

Уа1

Нхз

Азп

275

280

285

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

51 и

51и

61п

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

290

295

300

Уа1

5ег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Нхз

61п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

61 у

Ьуз

61 и

305

310

315

320

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

61у

Ьеи

Его

Зег

Зег

11е

51и

Ьуз

325

330

335

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

А1а

ьуз

С1у

В1П

Рго

Агд

61и

Его

51п

Уа1

Туг

ТЬг

340

345

350

Ней

Рго

Рго

Зег

е1п

Е1и

51и

МеЬ

ТЬг

Ьуз

Азп

51п

Уа1

Зех

Ьеи

ТЬг

355

360

365

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

61у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

51и

Тгр

61 и

370

375

380

Зег

Азп

51 у

61 п

Его

51и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

385

390

395

400

Азр

Зег

Азр

51 у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

405

410

415

- 58 015534

Зег Агд Тгр С1п 31 и 61у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег ’Ы МеЬ Нхз С1и

420 425 430

А1а Ьеи Нхз Азп Нхз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи 61 у

435 440 445

Ьуз <210> 27 <211> 645 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 27 даааЬадЬда сЬсЬссЬдса ддссаддсбс аддЬЬсадЬд даадаЫЫд дддассаадд ЬсЬдаЕдадс сссадададд дададЬдЬса сЬдадсааад срдадсЪсдс

ЬдасдсадЬс дддссадЬса ссаддсЬссЕ дсадЬдддЬс сааьыаыа ЬддадаЬсаа адЬЬдаааЬс ссааадЕаса сададсадда садасЬасда ссдЬеасааа

Ьссадссасс дадЬдЬЬадЬ саЬсЬаЬддЬ Едддасадад сбдрсадсад асдаасЬдЬд ЬддаасЬдсс ^Ъддаадд'Ьд садсааддас дааасасааа дадаЫсаас сЬдЬсЬдЬдЕ адсаасЫад дсаЬссасса ЫсаЫсЬса СаРааРаасЬ. дсЬдсассаЬ ЬсЬдЬЕдЬдр даЬаасдссс адсассЬаса дЕсЬасдссЬ аддддададЬ сЕссадддда ссЬддЬасса дддссасЕдд ссаьсадсад ддссдсРсас сРдЬ-СРЬсаР дссЬдсЬдаа ЕссааЬсддд дссЬсадсад дсдаадЬсас дЕЬад аададссасс 60 дсадааассЬ 120 ЬЫсссадсс 190 ссЬдсадЬсЬ 240 СЬЬсддсддд 300 сЫсссдсса 360 ЬаасЬЬсЬаЬ 420 ЬаасЬсссад 480 сасссЬдасд 540 ссаЬсадддс 600 645 <210> 28 <211> 214 <212> Белок <213> Ното зар1епз <400> 28

61и 1

Не

Уа1 МеЬ

ТЫ 5

61п

Зег

Рго

АЬа ТЬг 10

Ьеи

Зег

Уа1

Зег

Рго 15

61 у

61и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

61п

Зег

Уа1

Зег

Зег

Азп

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

61п

61п

Ьуз

Рго

61у

61 п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

61 у

А1а

Зег

ТЬг

Агд

А1а

ТЬг

61у

РЬе

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

50

55

60

Зег

61 у

Зег

С1у

ТЬг

61 и

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

61п

Зег

65

70

75

80

61и

Азр

РЬе

А1а

11е

Туг

Тух

Суз

61п

61п

Туг

Азп

Азп

Тгр

Рго

Ьеи

85

90

95

ТЬг

РЬе

61у

С1у

61 у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61 и

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Рго

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

61и

61п

Ьеи

Ьуз

Зег

61у

115

120

125

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

61и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

61п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

61п

Зег

61у

Азп

Зел

61п

145

150

155

160

- 59 015534

51и

Зег

Уа1

ТЬг

51и 165

51п Азр

Зег

Ьуз

Азр 170

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи 175

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

51и

Ьуз

Н1е

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

51и

Уа1

ТЬг

Н1з

61п

С1у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

195

200

205

РЬе Азп Агд 61у 61и Суз

210 <210> 29 <211> 1338 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 29 дадд+дсада ЬддЬддад+с Ьдддддаддс сЬддЬсаадс с+дддддд+с сс+дадас+с60

РссСд+дсад ссЬс+дда+С сасс+ЬсадЬ адсЬаЬадса ЬдаасЬдддЬ ссдссаддсЬ120 ссадддаадд ддс+ддад+д дд+с+са+сс а+ЬадЬад+а д+ад+ад+Ьа са+а+ас+ас180 дсадасЬсад Едаадддссд аЬЬсасса+с Ьссададаса асдссаадаа сЬсас+д+аЬ240 с+дсааа+да асадссЬдад адссдаддас асддсЬдЬдЬ аЬ+аеЬдЬдс дададассдЬ300 дддадсЬасЬ ЬссЬс+Ь+да с+ас+ддддс садддаассс Ьдд+сассдЬ с+сс+садсс360

Ьссассаадд дссса+сддЬ с+Ьссссс+д дсдссс+дсь ссаддадсас с+ссдададс420 асадсддссс ЬдддсЬдссЬ дд+сааддас Ьас+Ьссссд аассддЬдас дд+дЕсдЬдд480 аас+саддсд сЬсЬдассад сддсдЬдсас ассЬЬсссад с+д+сс+аса дЬсс+садда540 с+с+ас+ссс ЬсадсадсдС ддЬдассдЬд ссс+ссадса асЬЬсддсас ссадасс+ас600 асс+дсаасд Ьада+сасаа дсссадсаас ассаадд+дд асаадасадС Ьдадсдсааа660

ЬдЬ+д+д+сд ад+дсссасс д+дссаадса ссасс+дСдд саддассдЬс адЬс+Ьсс+с720

Ь+ссссссаа аасссаадда сасссЬсаЬд а+сЬсссдда ссссЬдаддЬ сасд+дсдЬд780 д+дд+ддасд Ьдадссасда адассссдад дЬссад+Ьса ас+дд+асдЬ ддасддсд+д840 дадд+дсаьа а+дссаадас ааадссасдд даддадсадь Ьсаасадсас дб+ссд+д+д900 д+садсд+сс Ьсассд+ЬдЬ дсассаддас Сддс+даасд дсааддадСа саад+дсаад960 дЬсЬссааса ааддсс+ссс адсссссаЬс дадаааасса ЬсЬссаааас сааадддсад1020 ссссдадаае сасаддЬд+а сассс+дссс ссаЬсссддд аддада+дас саадаассад1080 д+садсс+да сс+дссЬддЬ саааддс+Ьс: Ъассссадсд аса+сдссдЬ ддад+дддад1140 адсаа+дддс адссддадаа саас+асаад ассасасс+α сса+дс+дда с+садасддс1200

Ьсс+Ьс+Ьсс ЬсЬасадсаа дсЬсассд+д дасаададса ддЬддсадса ддддаасдЬс1260 ++с+са+дс+ ссд+даЬдса ЬдаддсЬсЬд сасаассасЬ асасдсадаа дадссЬсЬсо1320 с+дЬаЬссдд дЬаааЬда1338 <210> 30 <211> 445 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 30

51и 1

Уа1

С1п

Ьеи

УаЬ 5

СЬи

Зег

С1у

61у

51у 10

Ьеи

УаЬ

Ьуз

Рго

С1у 15

51у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи 20

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег 25

61у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег 30

Зег

Туг

Зег

Меь

Азп 35

Тгр

Уа1

Агд

еьп

А1а 40

Рго

51 у

Ьуа

51 у

Ьеи 45

51и

Тгр

Уа1

Зег

Зег 50

11е

Зег

Зег

Зег

Зег 55

Зег

Туг

Не

Туг

Туг 60

А1а

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

61 у Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

- 60 015534

70 75 80

Ьеи

Б1п

МеЬ Азп

Зег 85

Ьеи

Агд

А1а

51и Азр 90

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Агд

Азр

Агд

51 у

Бег

Туг

РЬе

Ъеи

РЬе

Азр

Туг

Тгр

51у

51п

51 у

100

105

110

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЫ

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

115

120

125

Рю

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

ТЬг

Зег

С1и

Зег

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

130

135

140

61у

Суз

Ьеи

Уа1

ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

51и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

145

150

155

160

Азп

Зег

51 у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

51 у

Уа1

Н±5

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

165

170

175

С1п

Зех

Зег

61у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

180

185

190

Зег

Азп

РЬе

51 у

ТЫ

51п

ТЬг

Туг

ТЬг

Суз

Азп

Уа1

Азр

Нхз

Ъуз

Рго

195

200

205

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

ТЬг

Уа1

51и

Агд

Ьуз

Суз

Суз

Уа1

61и

210

215

220

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

Рго

Уа1

А1а

51 у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

225

230

235

240

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЬ

11е

Зег

Агд

ТЫ

Рго

61 и

245

250

255

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Н13

61и

Азр

Рго

51 и

Уа1

б1п

260

265

270

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

Уа1

51 и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

275

280

285

Рго

Агд

51и

51и

51 п

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

РЬе

Агд

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

290

295

300

ТЬг

Уа1

Уа1

Н1з

61п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

51у

Ъуз

61и

Туг

ьуз

Суз

Ьуз

305

310

315

320

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

51 у

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

51 и

Ьу5

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

325

330

335

ТЬг

Ьуз

С1у

61 п

Рго

Агд

51 и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Зег

340

345

350

Агд

51 и

51и

МеЕ

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

355

360

365

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Аер

Не

А1а

Уа1

61и

Тгр

61и

Зег

Азп

61 у

61 п

370

375

3Θ0

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

МеЬ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

51 у

385

390

395

400

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

61п

405

410

415

- 61 015534

51 η С1у Азп Уа1 420

РЬе

Зег

Суз

Зег Уа1 Мер 425

Н1з

61и А1а

Ьей Нхз Азп 430

Н1з

Туг ТЬг

61п

Ьуз

Зег

Ьей

Зег

Ьей

Зег

Рго

51 у

Ьуз

435

440

445

<210> 31 <211> 645 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 31 дасаРдсада РдасссадРс рссаРссРсс сРдРсРдсаР сРдРаддада сададРсасс60 аРсасРРдсс дддсаадРса дддсаРРада ааРдаРРРад дсРддРаРса дсадааасса120 дддааадссс сРаадсдссР даРсЬаРддР дсаРссадРР РдсааадРдд ддРсссаРса180 аддРРсадсд дсадРддаРс Рдддасадаа РРсасРсРаа аааРсадсад ссРдсадссЕ240 даадаРРоРд саасррарра сРдРсРасад саРааРадРР асссдсРоас РРРсддсдда300 дддассаадд РддадаРсаа асдаасРдРд дсРдсассаР сРдРсРРсаР сРРсссдсса360

РсРдаРдадс адЬРдаааРс рддаасрдсс рсрдррдрдр дссрдсрдаа РаасРРсРаР420 сссадададд ссааадРаса дрддааддрд даРаасдссс РссааРсддд РаасРсссад480 дададРдРса сададсадда садсааддас адсассРаса дссРсадсад сасссРдасд540 сРдадсааад садасРасда дааасасааа дРсРасдссЬ дсдаадРсас ссаРсадддс600 сРдадсЬсдс ссдРсасааа дадсРРсаас аддддададР дРРад645 <210> 32 <211> 214 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 32

Азр Мер 1

С1п

Мер

ТЬг 5

61 п

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьей

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

61 у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Ахд

А1а

Зег

61п

61у

Не

Агд

Азп

Азр

20

25

30

Ьей

61у

Тгр

Туг

61п

61 п

Ьуз

Рго

61у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Ьей

Не

35

40

45

Туг

61у

А1а

Зег

Зег

Ьей

61п

Зег

61у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

61у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

С1и

РЬе

ТЬг

Ьей

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьей

51 п

Рго

65

70

75

80

61и

Азр

Зег

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьей

61 п

Н1з

Азп

Зег

Тух

Рго

Ьей

85

90

95

ТЬг

РЬе

51 у

61 у

51у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61 и

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

100

105

НО

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Не

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

61 и

61п

Ьей

Ьуз

Зег

61у

115

120

125

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьей

Ьей

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

61и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьей

61п

Зег

61 у

Азп

Зег

61п

145

150

155

160

61и

Зег

Уа1

ТЬг

61и

61п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьей

Зег

- 62 015534

Зег

ТЬг

А1а

Суз

Ьеи

С1и

195

165

170

175

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

Ьуз

Н18

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

Уа1

ТЬг

Н1з

С1п

51 у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

200

205

у

С1и

Суз

РЬе

Азп.

210

Агд <210>

<211>

<212>

<213>

1338

ДНК

Ното зарЬепз <4О0>

даддЬдсадс ЬссбдЬдсад ссадддаадд дсадасЬсад сЬдсаааЬда ддаЬасадсЪ Ьссассаадд асадсддссс аасЬсаддсд сЁсЬасЬссс ассбдсаасд ЁдЫдЬдЬсд ЬЬссссссаа дЬддбддасд даддЬдсаба дЬсадсдЬсс дбсЕссааса ссссдадаас дЬсадссЬда адсааЬдддс ЬссЬёсёёсс ЁЕсЁсаЬдсЁ сЕдЬсЬссдд

ЬддЬддадЬс ссЬсЁддаЬЬ ддсЬддадЬд Ьдаадддссд асадссЬдад аЬддЁсЁЁда дсссаЁсддЬ ЬдддсЁдссЬ сЬсЬдассад ЬсадсадсдЬ ЬадаЁсасаа адЬдсссасс аасссаадда Ьдадссасда аЬдссаадас ЁсассдЬЬдЬ ааддссбссс сасаддбдЬа ссЬдссЬддЬ адссддадаа ЬсЬасадсаа ссдЬдабдса дЬаааЬда ьдддддаддс сассЁЁсадЁ ддЬсЬсаЬсс аЬЬсассаЬс адссдаддас сЬасОддддс сЬЬсссссЬд ддЬсааддас сддсдЕдсас ддЬдассдЬд дсссадсаас д+дсссадса сасссЬсаЬд адассссдад ааадссасдд дсассаддас адсссссаЬс сасесЬдссс саааддсЬЕс саасЬасаад дсЬсассдЬд ЬдаддсЬсЬд сЬддЬсаадс адсЬаЁадса а+ЕадЕадЕа Ьссададаса асддсбдЬдЬ садддаассс дсдсссбдсь ЕасЬЕссссд ассЬЁсссад сссЬссадса ассааддЬдд ссассЬдЬдд аЬсбсссдда дРссадРЬса даддадсадЬ ЁддсЬдаасд дадаааасса ссаЬсссддд Ёассссадсд ассасассЬс дасаададса сасаассасЬ сЬддддддЬс ЬдаасСдддЬ дЬадЬадЬЬа асдссаадаа аЕЬасЪдЬдс ЬддЁсассдЁ ссаддадсас аассддЕдас сЬдЬссЕаса асЬЁсддсас асаадасадЬ саддассдЬс ссссЪдаддь асЬддЬасдЕ Ьсаасадсас дсааддадЬа ЁсЬссаааас аддадаЬдас асаЬсдссдб ссаЬдсЬдда ддЬддсадса асасдсадаа ссЬдадасЬс ссдссаддсЬ саЁаЬасЕас сЁсасЬдЁаЬ дададаЬсдЬ сЁссЬсадсс сЁссдададс ддЬдЬсдЬдд дЬссЬсадда ссадассЬас Ьдадсдсааа адбсЬЬссЁс сасдбдсдьд ддасддсд+д дЬЁссдЬдЬд саадЬдсаад сааадддсад саадаассад ддадЬдддад сЁссдасддс ддддаасдЬс дадссЬсбсс

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

940

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1339 <210> 34 <211> 445 <212> Белок <213> Ното зархепэ <400> 34

Б1и Уа1 1

51п

Ьеи Уа1 5

51и

Зег

61у 51у

Б1у 10

Ьеи Уа1

Ьуз

Рго

61У 15

51 у

Зег

Ъеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

51у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

Зег

МеЬ

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

61у

Ьуз

С1у

Ьеи

Б1и

Тгр

ν&1

35

40

45

Зег

Зег

11е

Зег

Зег

Зег

Зег

Зег

туг

11е

Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

- 63 015534

Ъеи

СЪп МеЕ

Азп

Зег 85

Ъеи Агд

АЪа

61и Азр 90

ТЬг

АЪа

УаЪ

Туг

Туг 95

Суз

АЪа

Агд

Азр

Агд

61у

Туг

Бег

Туг

СЪу

Ъеи

Азр

Туг

Тгр

СЪу

СЪп

СЪу

100

105

110

ТЬг

Ъеи

УаЪ

ТЬг

УаЪ

Зег

Зег

АЪа

Зег

ТЬг

Ъуз

СЪу

Рго

Бег

УаЪ

РЬе

115

120

125

Рго

Ъеи

АЪа

Рго

Суз

Бег

Агд

Зег

ТЬг

Зег

СЪи

Зег

ТЬг

АЪа

АЪа

Ъеи

130

135

140

СЪу

Суз

Ъеи

УаЪ

Ъуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

61 и

Рго

УаЪ

ТЬг

УаЪ

Зег

Тгр

145

150

155

160

Азп

Зег

61 у

АЪа

Ьеи

ТЬг

Бег

61 у

УаЪ

НЪз

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

УаЪ

Ъеи

165

170

175

СЪп

Зег

Зег

СЪу

Ъеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

УаЪ

УаЪ

ТЬг

УаЪ

Рго

Зег

180

185

190

Зег

Азп

РЬе

СЪу

ТЬг

СЪп

ТЬг

Туг

ТЬг

Суз

Азп

УаЪ

Азр

НЪз

Ъуз

Рго

195

200

205

Зег

Азп

ТЬг

Ъуз

УаЪ

Азр

Ьуз

ТЬг

УаЪ

С1и

Агд

Ъуз

Суз

Суз

Уа1

61и

210

215

220

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

Рго

УаЪ

АЪа

СЪу

Рго

Зег

УаЪ

РЬе

Ъеи

225

230

235

240

РЬе

Рго

Рго

Ъуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ъеи

МеЕ

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

61и

245

250

255

УаЪ

ТЬг

Суз

УаЪ

УаЪ

УаЪ

Азр

УаЪ

Зег

НЪз

61и

Азр

Рго

61и

УаЪ

61 п

260

265

270

РЬе

Азп

Тгр

Туг

УаЪ

Азр

СЪу

УаЪ

61 и

УаЪ

НЪз

Азп

АЪа

Ъуз

ТЬг

Ъуз

275

280

285

Рго

Агд

61и

61и

СЪп

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

РЬе

Агд

УаЪ

УаЪ

Зег

УаЪ

Ъеи

290

295

300

ТЬг

УаЪ

УаЪ

НЪз

61п

Азр

Тгр

Ъеи

Азп

СЪу

Ъуз

61и

Туг

Ъуз

Суз

Ьуз

305

310

315

320

УаЪ

Зег

Азп

Ъуз

СЪу

Ъеи

Рго

АЪа

Рго

Не

С1и

Ъуз

ТЬг

11е

Зег

Ъуз

325

330

335

ТЬг

Ъуз

СЪу

СЪп

Рго

Агд

СЪи

Рго

СЪп

УаЪ

Туг

ТЬг

Ъеи

Рго

Рго

Зег

340

345

350

Агд

СЪи

С1и

МеЕ

ТЬг

Ъуз

Азп

СЪп

УаЪ

Зег

Ъеи

ТЬг

Суз

Ьеи

УаЪ

Ъуз

355

360

365

СЪу

РЬе

Туг

Рго

Бег

Азр

Не

АЪа

УаЪ

СЪи

Тгр

61 и

Зег

Азп

СЪу

СЪп

370

375

380

Рго

СЪи

Азп

Азп

Туг

Ъуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

МеЕ

Ъеи

Азр

Зег

Азр

61 у

385

390

395

400

Зег

РЬе

РЬе

Ъеи

Туг

Зег

Ъуз

Ьеи

ТЬг

УаЪ

Азр

Ъуз

Зег

Агд

Тгр

61 п

405

410

415

СЪп

61 у

Азп

УаЪ

РЬе

Зег

Суз

Зег

УаЪ

МеЕ

НЪз

61 и

АЪа

Ьеи

НЪз

Азп

- 64 015534

430

425

<210> 35 <211> 645 <212> ДЕК <213> Ното зархепз <400> 35 дасаЬссада аЬсасИЬдсс дддааадссс аддЬЬсадсд даадаЬ'Ь'Ь'Ьд дддассааад ЕсЬдаЬдадс сссадададд дададЬдЬса сЬдадсааад сЬдадсЬсдс

ЬдасссадРо дддсаадИса сЬаадсдссЬ дсадЬддаЬс сдасИ'Ба'Ь'Ьа ЬддаЬаРсаа адИЕдаааИс ссааадИаса сададсадда садасЬасда ссдЬсасааа

ЬссаЬссЬсс дддсаНада даИсИаИдсг Едддасадаа сЬдЕсЬасад асдаасЬдЬд ЕддаасЕдсс дьддааддкд садсааддас дааасасааа дадсЬЕсаас сИдЬсРдсаР ааЬдаЬЬЬад дсаЬссадЬЬ ЬЬсасЬсЬса сЬЬааЬадЬ'Ь дсИдсассаЬ ЬсЬдЬЬдЬдЬ дакаасдссс адсассЬаса дЬсИасдссР аддддададЬ сЬдЬаддада дсЬддЬаЬса ЬдсааадЬдд сааЕсадсад асссаЬЬсас сЬдРсЬЬсаЬ дссЬдсЬдаа ьссааИсддд дссксадсад дсдаздЬсас дИИад сададЬсасс дсадааасса ддЬсссаЬса ссЬдсадссЪ ЬЬЬсддсссЬ сЕРсссдсса ЬаасЬЬсЬаИ ЬаасЕсссад сасссЬдасд ссаЕсадддс

120

180

240

300

360

420

480

540

600

645 <210> 36 <211> 214 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 36

Азр 1

11е

61п

МеЬ

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег Ьеи 10

Зег А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТНг

11е

ТИг

Суз

Агд

А1а

Зег

61п

61у

11е

Агд

Азп

Азр

20

25

30

Ьеи

51 у

Тгр

Туг

61п

61 η

Ьуз

Рго

61 у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

А1а

А1а

Зег

Зег

Ьеи

61п

Зег

31у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

61у

50

55

60

Зег

61у

Зег

С1у

ТИг

С1и

РЬе

ТИг

Ьеи

ТЬг

Т1е

Зег

Зег

Ьеи

61п

Рго

65

70

75

80

61 и

Азр

РИе

А1а

ТИг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

61 п

Ьеи

Азп

Зег

Туг

Рго

РЬе

85

90

95

ТНг

РЬе

61у

Рго

61у

ТИг

Ьуз

Уа1

Азр

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Рго

Зег

Уа1

РИе

Не

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

61и

61 п

Ьеи

Ьуз

Зег

61 у

115

120

125

ТИг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

61и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

61п

Тгр

Ъуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

61п

Зег

61 у

Азп

Зег

61 п

145

150

155

160

С1и

Зег

Уа1

ТИг

С1и

61 η

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

- 65 015534

Зег

ТЬг

Ъец

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

61и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТЬг

Н±з

С1п

61у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

195

200

205

РЬе

Азп

Агд

61у

С1и

Сув

210

<210> 37 <211> 1350 <212> ДНК <213> Ното зар±епз <400> 37 даддЕдсадс ЕссЕдЕдсад ссадддаадд дсадасЕЕсд сЕдсаааЕда аддЕаЕаасЕ ЕсЕЕсадсЕС Ессдададса дЕдЕсдЕдда ЕссЕсаддас аадассЕаса дадЕссаааЕ ЕсадЕсЕЕсс дЕсасдЕдсд дЕддаЕддсд асдЕассдЕд ЕасаадЕдса дссааадддс ассаадаасс дЕддадЕддд дасЕссдасд даддддааЕд аададссЕсЕ

ЕаЕЕддадЕс ссЕсЕддаЕЕ ддсЕддааЕд Едаадддссд асадссЕдад ддаасЕасдд ссассааддд садссдсссЕ асЕсаддсдс ЕсЕасЕсссЕ ссЕдсаасдЕ аЕддЕссссс ЕдЕЕсссасс ЕддСддЕдда ЕддаддЕдса ЕддЕсадсдб аддЕсЕссаа адссссдада аддЕсадссЕ ададсааЕдд дсЕссЕЕсЕЕ ЕсЕЕсЕсаЕд сссЕдЕсЕсЕ

Едддддаддс сассЕЕЕадс ддЕсЕсаасЕ дЕЕсассаЕс адссдаддас ддсЕЕЕЕдаЕ сссаСссдЕс дддсЕдссЕд ссЕдассадс садсадсдЕд адаЕсасаад аЕдсссаЕса аааасссаад сдЕдадссад ЕааЕдссаад ссЕаассдЕс саааддссЕс дссасаддсд дассЕдссЕд дсадссддад ссЕсЕасадс сЕссдЕдаЕд дддЕаааЕда

ЕЕдаЕасадс адсЕСЕдсса аЕЕадЕддЕа Ессададаса асддссдЕаЕ аЕсЕддддсс ЕЕсссссЕдд дЕсааддасЕ ддсдЕдсаса дЕдассдЪдс сссадсааса Едсссадсас дасасЕсЕса даадассссд асааадссдс сЕдсассадд ссдЕссЕсса ЕасасссЕдс дЕсаааддсЕ аасаасЕаса аддсЕаассд саЕдаддсЕс сЕддддддЕс ЕдадсЕдддЕ дЕддЕддЕад аЕЕссаадаа аЕЕасЕдЕдс аадддасаак сдсссЕдсЕс асЕЕссссда ссЕЕсссддс ссЕссадсад ссааддЕдда сЕдадЕЕссЕ ЕдаЕсЕсссд аддЕссадЕЕ дддаддадса асЕддсЕдаа Есдадаааас ссссаЕссса ЕсЕассссад адассасдсс Еддасаадад Едсасаасса ссЕдадасЕс ссдссаддсЕ сасаЕасЕас сасдсЕдЕаЕ дааадаЕдда ддЕсассдЕс саддадсасс ассддЕдасд ЕдЕссЕасад сЕЕдддсасд саадададЕЕ ддддддасса дассссЕдад саасЕддЕас дЕЕсаасадс сддсааддад саЕсЕссааа ддаддадаЕд сдасаЕсдсс ЕсссдЕдсЕд саддЕддсад сЕасасасад

120

130

240

300

360

420

480

540

600

660

720

760

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1350 <210> 38 <211> 449 <212> Белок <213> Ното зарЪепз <400> 38

С1и Уа1 1

С1п

Ъеи

Ъеи 5

61и

Зег

61 у 61 у С1у 10

Ъеи

11е С1п Рго

С1у 15

61 у

Зег

Ъеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

РЬе

20

25

30

А1а

МеЕ

Зег

Тгр

Уа1

Агд

Е1п

А1а

Рго

С1у

Ъуз

61у

Ъеи

51и

Тгр

Уа1

35

40

45

Бег

ТЬг

Не

Зег

С1у

Зег

61 у

61 у

Бег

ТЬг

Туг

Туг

7\1а

Азр

РЬе

Уа1

50

55

60

Ьуз

51у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

МеЕ

Азп

Зег

Ъеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Тух

Туг

Суз

90 95

- 66 015534

А1а

Ьуз Азр

51 у 100

Агд Туг

Азп Тгр

Азп Туг 105

61у А1а

РЬе

Азр но

Не

Тгр

51 у

е1п

61у

ТЬг

МеЬ

Уа1

ТЬг

УаХ

Зег

Зег

АХа

Зег

ТЬх

Ьуз

С1у

Рго

115

120

125

Зег

УаХ

РНе

Рго

Ьеи

АХа

Рго

Суз

Зег

Ахд

Зег

ТЬг

Зех

С1и

Зег

ТЬг

130

135

140

А1а

А1а

Ьеи

СХу

Суз

Ьеи

УаХ

Ьуз

Азр

Тух

РЬе

Рго

61и

Рго

Уа1

ТЬх

145

150

155

160

УаХ

Зег

Тгр

Азп

Зег

51 у

А1а

Ьеи

ТЬх

Зег

СХу

УаХ

ΗΪ3

ТЬг

РЬе

Рго

165

170

175

АХа

Уа1

Ьеи

51 п

Зег

Зег

СХу

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

УаХ

УаХ

ТЬг

1Θ0

185

190

УаХ

Рго

Зег

Зег

Зег

- Ьеи

СХу

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Туг

ТЬг

Суз

Азп

Уа1

Азр

195

200

205

Н1з

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Агд

Уа1

61и

Зех

Ьуз

Тух

210

215

220

СХу

Рго

Рго

Суз

Рго

Зег

Суз

Рго

АХа

Рго

СХи

РЬе

Ьеи

51 у

61 у

Рго

225

230

235

240

Зег

УаХ

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЬ

Не

Зег

245

250

255

Агд

ТЬг

Рго

51 и

Уа1

ТЬг

Суз

УаХ

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

СХп

С1и

Азр

260

265

270

Рго

СХи

Уа1

61п

РЬе

А5П

Тгр

Тух

Уа1

Азр

6Ху

Уа1

61и

УаХ

Н1з

Азп

275

280

285

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

61и

61и

51 п

РЬе

АЗП

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

290

295

300

УаХ

Зег

УаХ

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Ηχε

61п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

61 у

Ьуз

СХи

305

310

315

320

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

51 у

Ьеи

Рго

Зег

Зег

Не

61и

Ьуз

325

330

335

ТНг

Не

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

61 у

СХп

Рго

Агд

51 и

Рго

СХп

Уа1

Тух

ТЬг

340

345

350

Ьеи

Рго

Рго

Зег

С1п

С1и

51и

МеХ

ТЬг

Ьуз

Азп

СХп

УаХ

Зег

Ьеи

ТЬг

355

360

365

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

61 у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

АХа

Уа1

61и

Тгр

61 и

370

375

380

Зег

Азп

61 у

61 п

Рго

51и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

УаХ

Ьеи

385

390

395

400

Азр

Зег

Азр

61 у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Тух

Зех

Агд

Ьеи

ТЬг

УаХ

Азр

Ьуз

405

410

415

Зег

Агд

Тгр

СХп

СХи

51 у

Азп

УаХ

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

НХз

СХи

420

425

430

- 67 015534

А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи С1у

435 440 445

Ьуз <210> 39 <211> 645 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 39 дааа+ад+да сРсРссОдса ддссаддс+с адд+Ьсад+д дайда+Ь+Ьд дддассаадд Ьс+даЬдадс сссадададд дададЬд+са с+дадсааад сЬдадс+сдс

ЬдасдсадРс дддссад+са ссаддсЪссЬ дсад+дддЬс сад+++а++а Ьддада+саа ад+Ьдааа+с ссааад+аса сададсадда садас+асда ссдЪсасааа

Ьссадссасс дадЬд+Хада саЬс+аЪддЬ Ьдддасадад с+дрсадсад асдаас+дС.д Ьддаас+дсс д+ддааддрд садсааддас дааасасааа дадсЬЬсаас сРдЬс+д+дР адсааРЬЬад дсаЬссасаа ЬЬсас+сЬса Ьа+аа+аасР дс+дсассаР ЬсЪд+ЬдЬдЬ даЬаасдссс адсассЬаса д+сЬасдсс+ аддддададЬ сСссадддда ссрддь+сса дддссасЪдд сса+садсад ддссдс+сас с+д+с++са+ дсс+дсЬдаа Ьссаа+сддд дос+оадсад додаадЬсас дЬЬад аададссасс дсадааассь ЬаЬсссадсс сс+дсадРсЬ Н+сддсдда сЪ+сссдсса ЬаасЬЬс'Ьа'Ь Ьаас+сссад сасос+дасд ссаЬсадддс

120

130

240

300

360

420

430

540

600

645 <210> 40 <211> 214 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 40

51и 1

Х1е Уа1

Мер ТЬг 5

61п

Зег

Рго А1а

ТЬг 10

Ьеи

Зех

Уа1

Зег

Рго 15

61у

51 и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Ахд

А1а

Зег

61п

Зег

Уа1

Агд

Зег

Азп

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

РЬе

61п

С1п

Ьуз

Рго

61у

61п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

51 у

А1а

Зег

ТЬг

Агд

А1а

ТЬг

61 у

11е

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зех

61 у

50

55

60

Зег

51 у

Зег

61 у

ТЬг

б1и

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

61п

Зег

65

70

75

80

51и

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

61п

61п

Туг

Азп

Азп.

Тгр

Рго

Ьеи

65

90

95

ТЬг

РЬе

51 у

61у

61 у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61 и

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

100

105

НО

Рго

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

61и

61п

Ьеи

Ьуз

Зег

61у

115

120

125

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп.

РЬе

туг

Рго

Агд

61и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

61п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

61п

Зег

61 у

Азп

Зег

61 п

145

150

155

160

61и

Зег

Уа1

ТЬг

61и

61п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

- 68 015534

Зег ТЬг

Ьеи ТЬг 180

Ьеи

Зег

Ьуз А1а Азр Туг 51и 185

Ьуз

Нхз

Ьуз Уа1 190

Туг

А1а

Суз

51 и

Уа1

ТЬг

Нхз

51п

51 у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

195

200

205

РЬе

Азп

Агд

С1у

61и

Суз

210

<210>

<211>

<212>

<213>

1350 ДНК Ното зархепз <400> даддрдсадс ЕссЬдЕдсад ссадддаадд дсадасЬссд с-ЬдсааЕ-Еда аддЬЬЕааоЬ ЕсЬЬсадсЕЬ Ьссдададса дЕдбсдЕдда СссЬсаддас аадассЬаса дадЬссааай ЬсадЬсЬЕсс дЬсасд^дсд дЬддаЕддсд асдЕассдЬд ЕасаадЕдса дсаааадддс ассаадаасс дЬддадЪддд дасЬссдасд даддддааЬд аададссЕсЬ

Рдддддаддс сассЕЬЕадс ддЬсЬсадсЬ дЬ-ЬсассаСс адссдаддас ддсбЬсбдаб сссаЬссдСс дддсЕдссЬд ссЬдассадс садсадсдкд адаЬсасаад аЕдсссаЬса

ЬдЬЬддадЬс ссЬсЬддаЕЬ ддсЬддадЬд Ьдасдддссд асадсс-Ьдад ддаасЬасдд ссассааддд садссдсссЕ асЬсаддсдс ЬсСасЬсссС ссЬдсаасдЬ абддЕссссс

ЬдСЪсссссс аааасссаад Ьдд1:ддЬдда ЕддаддЬдса ЬддЕсадсдЬ аддЬсЬссаа адссссдада аддЬсадссИ ададсааЬдд 9θϋοοΐ:ϊαΈ·ύ ЕсЬЬсЬсаЕд сссЬдЬсЬсЬ сдЬдадссад ЕааЬдссаад асЬсассдЬс саааддссбс дссасаддЬд дассЕдссЬд дсадссддад ссЬсЬасадс сЬссд¥даЬ.д дддЬаааЬда

ЬЕддЬасадс адсЬаЬдсса аЬЕадЬддЬа Ьссададаса асддссдЬаЬ аЬсЬддддсс РЬсссссРдд дЕсааддасЬ ддсдЬдсаса дбдасадЕдс сссадсааса рдсссадсас дасасЬсбса даадассссд асааадссдс сЕдсассадд ссдЬссЬсса ЬасасссЬдс дЬсаааддсЬ аасаасйаса аддсЬаассд сардаддсЬс сЬддддддЕс ЬдадсЬддд!: дЬддЬддЬад аЬЬссаадаа айсасЬд'Ьда аадддассаЬ сдсссЬдсЬс асЬЬссссда ссЬЕсссддс ссбссадсад ссааддбдда сЬдадЬЬссЬ ЬдаксЕсссд аддЕссадЬЕ дддаддадса асЕддсйдаа Есдадаааас ссссаЬссса ЬсЬассссад адассасдсс Ьддасаадад Ьдсасаасса ссЕдадасЕс ссдссаддсб сасаЬ'ЬсЪас сасдсЬдЕЕЪ дааадаЬдда ддЕсассдЬс саддадсасс асаддЕдасд ЕдЕссЕасад сЬЬдддсасд саадададЕЬ ддддддасса дассссЬдад саасбддЬас дЬЬсаасадс сддсааддад саЪсЬссааа ддаддадард сдасаЬсдсс ЬсссдЬдсЕд саддЬддсад сЪасасасад

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1350 <210>

<211>

<212>

<213>

449

Белок

Нойю зархепз <400>

31 и 1

Уа1

61п

Ьеи

Ьеи 5

С1и

Зех

51у

51у 51у 10

Ьеи

Уа1

51п

Рго

51 у 15

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зех

Сун

А1а

А1а

Зех

51у

РЬе

ТЬх

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

А1а

МеЕ

Зех

Тгр

Уа1

Агд

51 п

А1а

Рхо

С1у

Ьуз

51у

Ьеи

51и

Тхр

Уа1

35

40

45

Зех

А1а

Не

Зех

61у

Зех

51 у

61У

Зег

ТЬх

РЬе

Тух

А1а

Азр

Зех

Уа1

50

55

60

ТЬг

51 у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зех

Ахд

Азр

Азп

Зех

Ьуз

Азп

ТЬх

Ьеи

РЬе

65

70

75

80

Ьеи

б1п

Ьеи

Азп

Зех

Ьеи

Агд

А1а

51и

Азр

ТЬх

А1а

Уа1

Туг

Нхз

Суз

- 69 015534

90 95

А1а

Ьуз Азр

51 у 100

Агд

РЬе Азп. Тгр

Азп 105

Туг 51 у А1а

Зег

Азр 110

Не

Тгр

61у

61 η

51 у

ТЬг

МеЬ

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

51 у

Рго

115

120

125

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

ТЬг

Зег

С1и

Зег

ТЬг

130

135

140

А1а

А1а

Ьеи.

51у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

61и

Рго

Уа1

ТЬг

145

150

155

160

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

51у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

61 у

Уа1

ΗΪ5

ТЬг

РЬе

Рго

165

170

175

А1а

Уа1

Ьеи

51 п

Зег

Зег

51 у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТЬг

180

185

190

Уа1

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

51у

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Туг

ТЬг

Суз

Азп

Уа1

Азр

195

200

205

Ηίε

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Агд

Уа1

61и

Зег

Ьуз

Туг

210

215

220

С1у

Рго

Рго

Суз

Рго

Зег

Суз

Рго

А1а

Рго

61и

РЬе

Ьеи

51у

61 у

Рго

225

230

235

240

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

меь

Не

Зег

245

250

255

Агд

ТЬг

Рго

51 и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

51п

61и

Азр

260

265

270

Рго

51 и

Уа1

51 п

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

61 у

Уа1

61 и

Уа1

Н±з

Азп

275

280

285

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

51и

51 и

51 п

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

290

295

300

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Н±5

51 п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

61 у

Ьуз

51и

305

310

315

320

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

<31у

Ьеи

Рго

Зег

Зег

Не

51и

Ьуз

325

330

335

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

А1а

Ьуз

51У

51п

Рго

Агд

51и

Рго

51п

Уа1

Туг

ТЬг

340

345

350

Ьеи

Рго

Рго

Зег

51п

С1и

51и

МеЬ

ТЬг

Ьуз

Азп

61 п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

355

360

365

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

51 у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

61и

Тгр

61 и

370

375

380

Зег-

Азп

61у

51п

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

385

390

395

400

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

405

410

415

Зег

Агд

Тгр

51П

51 и

61 у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

меЬ

Н±з

61и

420

425

430

- 70 015534

А1а Ьей Нхз Азп Нхз Туг ТЬг 61п Ьуз Зег Ьей. Зег Ьей Зег Ьей 51у 435 440 445

Ьуз <210> 43 <211> 645 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 43 даааРадРда сРсРссРдса ддссаддсРс аддРРсадРд даадаРРРРд дддассаадд РсРдаРдадс сссадададд дададЪдРса сРдадсааад сРдадсРсдс

РдасдсадРс ддассадРса ссаддсЬссР дсадРдддРс садРРРаРРа РддадаРсаа адРРдаааРс ссааадраса сададсадда садасРасда ссдРсасааа

РссадссасЪ дадрдРРадс саРсРаРддР Рдддасадад сРдРсадсад асдаасРдРд РддаасРдсс дрддааддрд садсааддас дааасасааа дадсЫсаас сРдРсРдРдР адсаасРРад дсаРссасса РРсасРсРса РаРааРаасР дсРдсассаР рсрдррдрдр даРаасдссс адсассЬаса дрсрасдсср аддддададр сРссадддда ссРддРасса дддссасРдд ссаРсадсад ддссдсРсас сРдРсРРсаР дссРдсРдаа РссааРсддд дссЪсадсад дсдаадРсас дРРад аададссасс дсадааассР РаРсссадсс ссРдсадРсЬ РРРсддсдда сРРсссдсса РаасРРсРаР РаасРсссад сасссрдасд ссаРсадддс

120

1В0

240

300

360

420

480

540

600

645 <210> 44 <211> 214 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 44

61и 1

Не

Уа1

Мер

ТЬг 5

51 п

Зег

Рго

А1а

ТЬг 10

Ьей

Зег

УаЬ

Зег

Рго 15

51 у

51п

Агд

А1а

ТЬг

Ьей

Зег

Суз

Агд

ТЬг

Зег

51п

Зег

Уа1

Зег

Зег

Азп

20

25

30

Ьей

А1а

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

51у

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьей

Ьей

Не

35

40

45

Туг

51 у

А1а

Зег

ТЬг

Агд

А1а

ТЬг

61 у

Не

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61 у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

51 у

ТЬг

С1и

РЬе

ТЬг

Ьей

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьей

61п

Зег

65

70

75

Θ0

61 и

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

61п

51 п

Туг

Азп

Азп

Тгр

Рго

Ьей

85

90

95

ТЬг

РЬе

51 у

61у

51у

ТЬг

Ьуз

Уа1

51и

Не

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

100

105

но

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Не

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

61и

61п

Ьей

Ьуз

Зег

61у

115

120

125

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьей

Ьей

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

51и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

61п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьей

С1п

Зег

51 у

Азп

Зег

С1п

145

150

155

160

51 и

Зег

Уа1

ТЬг

51 и

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьей

Зег

- 71 015534

165 170 175

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг 180

Ьеи Зег

Ьуз

А1а

Азр 185

Туг

61 и

ьуз

ΗΪ5

Ьуз 190

Уа1

Туг

А1а

Суз

61и

Уа1

ТЬг

Н1з

61п

61 у

Ъеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Бег

195 200 205

РЬе Азп Агд 61у 61и Суз

210 <210> 45 <211> 119 <212> Белок <213> Нотпо зарсепз <400> 45

61и 1

Уа1

61п

Ьеи

Уа1 5

61и

Зег

С1у 61у 61у Ьеи 10

Уа1

Ьуз

Рго

61 у 15

С1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

61 у

РЬе

ТЫ

РЬе

Зег

Бег

Туг

20

25

30

Зег

Мер

Азп

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

61 у

Ьуз

61у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

Зег

11е

Зег

Зег

Зег

Зег

Зег

Туг

11е

Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

61у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ъеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

61 п

Меб

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азр

Агд

61у

Туг

Зег

Туг

61 у

Ьеи

Азр

Туг

Тгр

61у

61п

61 у

100

105

110

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

<210>	46
<211>	358
<212>	ДНК
<213>	Ното	зархепз
<400>	46
даддедсадс	СддСддадСс	Сдддддаддс	сСддСсаадс	оСддддддСа	ссСдадасЕс	60
СссСдСдсад	ссСсСддаСС	сассССсадС	адсСаСадса	СдааССдддС	ссдссаддсС	120
ссадддаадд	ддсСддадСд	ддрсСсаСсс	аССадСадСа	дСадСадССа	саЕаСасСас	180
дсадасСсад	Сдаадддссд	аССсассаСс	Сссададаса	асдссаадаа	сСсасСдСаС	240
сСдсаааСда	асадссСдад	адссдаддас	асддсСдСдС	аССасСдСдс	дададаСсдд	300
дддСасадсС	аСддСсССда	сСасСддддс	садддааосс	СддСсассдС	сСссСсад	358

<210>	47
<211>	107
<212>	Белок
<213>	Ното зарсепз
<400>	47

Азр 11е 51п МеС ТЬг ΘΙη Бег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 61у

- 72 015534

1

5

10

15

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

61п

61у

Не

Агд

Азп

А1а

20

25

30

Ьеи

61у

Тгр

Туг

С1п

61 η

Ьуз

Рго

61у

Ьуз

А1а

Рго

61п

Агд

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

А1а

А1а

Зег

Зег

Ьеи

61 η

Зег

61 у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

61 у

50

55

60

Зег

е1у

Зег

61 у

ТЬг

61 и

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

61и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

О1п

Н1з

Азп

Зег

Туг

Рго

Агд

85

90

95

ТЬг

ЕИе

61у

61а

61 у

ТЬг

Ьуз

уа1

61 и

Не

Ьуз

100

105

<210> 48 <211> 322 <212> ДНК <213> Нолю зарЬепе <400> 48 дасаЬссада ЬдасссадЪс ЬссаЬссЬсс сЬдЬсЬдсаЬ сЬдЬаддада сададЬсасс60 а-ЬсасСЬдсс дддсаадьса дддсаТГада ааьдсгхьад дсЬддЬаЬса дсадааасса120 дддааадссс сЬсадсдасЬ даТсЬаЬдсЪ дсаЬссадЬЬ ЬдсааадЬдд дд+сссаЬса180 адд-ЬЬсадсд дсадЬддаЬс Гдддасадаа ЬГсасЬсГса сааЬсадсад ссЬдсадссЬ240 даадаЬЬЬЬд саасЬЬаЬСа сЬдЬсЬасад саЬааЬадЬЬ асссЬсддас дГГсддссаа300 дддассаадд ЬддаааЬсаа ас322 <210> 49 <211> 123 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 49

61п Уа1 1

б1п

Ьеи

Уа1 5

61п

Зег

61у А1а 61и 10

Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

61 у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

61у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

61у

Туг

20

25

30

Туг

МеЬ

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

61у

61п

С1у

Ьеи

61и

Тгр

МеЬ

35

40

45

61у

Тгр

Не

Азп

Рго

Азп

Азп

61у

61 у

ТЬг

Азп

Туг

А1а

61п

Ьуз

РЬе

50

55

60

61 п

61 у

Агд

Уа1

ТЬг

МеЬ

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

11е

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

61 и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Нхз

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азп

ТЬг

Уа1

61у

Зег

61 у

Туг

Туг

Туг

Туг

61у

МеЬ

Азр

Уа1

100

105

110

Тгр

61 у

61п

61у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

- 73 015534 <210> 50 <211> 370 <212> ДНК <213> Ното зархепн <400> 50 саддЕдсадс ЕддЕдсадЕс ЕддддсЕдад дЕдаадаадс сЕддддссЕс адЕдааддЕс60

ЕсеЕдсаадд еЕЕсЕддаЕа сассЕЕсасс ддсЕасЕаЕа ЕдсасЕдддЕ дсдасаддсс120 ссЕддасаад ддсЕЕдадЕд даЕдддаЕдд аЕсаасссЕа асааЕддЕдд сасааасЕаЕ180 дсасадаадЕ ЕЕсадддсад ддЕсассаЕд ассадддаса сдЕссаЕсад сасадссЕас240 аЕддадсЕда дсаддсЕдад аЕсЕдасдас асддссдЕдЕ аЕсасЕдЕдс дадаааЕасд300 дЕдддаадЕд ддЕасЕасЕа скасддЕаЕд дасдЕсЕддд дссаадддас сасддЕсасс360 дЕсЕссЕсад370 <210> 51 <211> 112 <212> Белок <213> Ното зарЪепз <400> 51

Азр 1

Не Уа1

МеЕ

ТЬг 5

СЪп

Зег

Рго

Ъеи

Зег 10

Ъеи

Рго

Уа1

ТЬг

Рго 15

61у

61 и

Рго

АЪа

Зег 20

Не

Зег

Суз

Агд

Зег 25

Зег

61 п

Зег

Ьеи

Ьеи 30

ΗΪ5

Зег

Азп

61у

Туг 35

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр 40

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Зег 45

61у

61п

Зег

Рго

61п

Ьеи

Не

НЪз

Клп

ΚΙ чг

5$ г

Α^ϊΐ

Δ гп

А1а

Зег

КТ чг

Уа1

Рго

50

55

Л

— -д

60

—л

Айр 65

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег 70

61у

Зег

61у

ТЬг

Азр 75

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е 80

Зег

Агд

Уа1

61и

А1а 85

61 и

Азр

УаЪ

61у

УаЪ 90

Туг

Туг

Суз

МеЕ

61п 95

Уа1

Ьеи

61п

ТЬг

Рго 100

Ьеи

ТЬг

РЬе

61 у

61 у 105

61 у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61и 110

11е

Ьуз

<210> 52 <211> 337 <212> ДНК <213> Ното зар!епз <400> 52 даЕаЕЕдЕда ЕдасЕсадЕс ЕссасЕсЕсс сЕдсссдЕса ссссрддада дссддссЕсс60 аЕсЕссЕдса ддЕсЕадЕса дадссЕссЕд саЕадЕааЕд даЕасаасЕа ЕЕЕддаЕЕдд120

ЕассЕдсада адЕсадддса дЕсЕссасад сЕссЕдаЕсс аЕЕЕдддЕЕс ЕааЕсдддсс180

ЕссддддЕсс сЕдасаддЕЕ садЕддсадЕ ддагсаддаа садаЕЕЕЕас асЕдааааЕс240 адсададЕдд аддсЕдадда ЕдЕЕддддЕЕ ЕаЕЕасЕдса ЕдсаадЕЕсЕ асааасЕссд300 сЕсасЕЕЕсд дсддадддас сааддЕддад аЪсааас337 <210> 53 <211> 119 <212> Белок <213> Ното зарЪепз

- 74 015534 <400> 53

51и 1

Уа1

ΘΙη

Ьеи Уа1 51и 5

Зег

51 у

51 у

51 у 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

51 у 15

51 у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

АЬа

АЬа

Зег

СЬу

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

туг

20

25

30

Зег

Мер

Азп

Тгр

УаЬ

Агд

С1п

АЬа

Рго

61у

Ьуз

61у

Ьеи

51 и

Тгр

УаЬ

35

40

45

Зег

Зег

Не

Зег

Зег

Зег

Зег

Зег

Туг

Не

Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

УаЬ

50

55

60

Ьуз

51 у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

АЬа

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

ΘΙη

Мер

Азп

Зег

Ьеи

Агд

АЬа

СЬи

Азр

ТЬг

АЬа

Уа!

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азр

Агд

51 у

Туг

Зех

Туг

51у

Т1е

Азр

Туг

Тгр

51 у

51п

51 у

100

105

110

ТЬг

Ьеи

УаЬ

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 <210> 54 <211> 358 <212> ДНК .

<213> Ното зархепз <400> 54 даддрдсадс РссРдРдсад ссадддаадд дсадасРсад срдсааарда ддаРасадсР

РддРддадРс ссРсРддаРР ддсРддадРд Рдаадддссд асадссРдад аРддРаРРда

Рдддддаддс сассРРсадР ддРсРсаРсс аРРсассаРс адссдаддас сРасРдддда срддрсаадс адсРаРадса аРРадРадРа Рссададаса асддсРдРдР садддаассс сРддддддРс РдаасРдддР дРадРадРРа асдссаадаа аРРасРдРдс рддрсассдр ссРдадасРс ссдссаддсР саРаРасРас сРсасРдРаР дададаРсдР сРссРсад

120

180

240

300

358 <210> 55 <211> 107 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 55

Азр 1

Не

Б1п

Мер

ТЬг 5

51п

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

АЬа

Зех

Уа1 15

СЬу

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Агд

АЬа

Зег

С1п

СЬу

Не

Агд

Азп

АЬа

20

25

30

Ьеи

51 у

Тгр

Туг

СЬп

5111

Ьуз

Рго

СЬу

Ьуз

АЬа

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

АЬа

АЬа

Зег

Зег

Ьеи

СЬп

Зех

е1у

УаЬ

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

51 у

Зег

51у

ТЬг

СЬи

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Пе

Зег

Зег

Ьеи

51 п

Рго

65

70

75

80

51 и

Азр

РЬе

АЬа

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

СЬп

НЬз

Азп

Зег

Туг

Рго

Агд

85

90

95

- 75 015534

ТЬг РЬе 61 у С1п 61у ТЬг Ьуз Уа1 01и 11е Ьуз

100 105 <210> 56 <211> 322 <212> ДНК <213> Ното зарлепз <400> 56 дасаЬссада ЬдасссадРс ЬссаЬссЬсс с-СдЬсПдсар сХдЬаддада сададЬсасс60 аЬсасЫдсс дддсаадЪса дддсаЬЬада ааЬдсЬЬЬад дсЬддЬаЬса дсадааасса120 дддааадссс сЬаадсдссЕ даЬсЬаЬдсЬ дсаЬссадЫ ЬдсааадЬдд ддЬсссаЬса180 аддЫсадсд дсадЬддаЬс ьдддасадаа ЬЬсасЬсЬса сааЬсадсад ссЕдсадссЕ240 даадаЕЕЕЕд саасЕЕаЕЕа сЕдЕсЕасад саЕааЕадЕЕ асссЕсддас дЕЕсддссаа300 дддассаадд ЕддаааЕсаа ас322 <210> 57 <211> 119 <212> Белок <213> Ното зарлепз <400> 57

<31 и 1

Уа1 61п

Ьеи

Уа1 5

01 и

Зег

61 у

61у С1у Ьеи 10

Уа1

Ьуз

Рго

61 у 15

О1у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

АЬа

АЬа

Зег

01 у

РЬе

ТЬл

РЬе

Вег

Зел

Туг

20

25

30

Зег

МеЕ

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1 п

АЬа

Рго

01 у

Ьуз

01 у

Ьеи

61и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

Зег

11е

Зег

Зег

Зег

Зег

Зег

Туг

11е

Туг

Тул

АЬа

Азр

Зел

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1 у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

5ел

Алд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зел

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

61п

Меб

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

АД а

Агд

Азр

Агд

01 у

Туг

Туг

Туг

61у

МеЕ

Азр

Уа1

Тгр

61 у

01 п

01 у

100

105

110

ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115 <210> 58 <211> 358 <212> ДНК <213> Ното зарлепз <400> 58 даддЕдсадс ЕддЕддадЕс Едддддаддс сЕддЕсаадс сЕддддддЕс ссЕдадасЕс60

ЕссЕдЕдсад ссЕсЕддаЕЕ сассЕЕсадЕ адсЕаЕадса ЕдаасЕдддЕ ссдссаддсЕ120 ссадддаадд ддсЕддадЕд ддЕсЕсаЕсс аЕЕадЕадЕа дЕадЕадЕЕа саЕаЕасЕас180 дсадасЕсад Едаадддссд аЕЕсассаЕс Ессададаса асдссаадаа сЕсасЕдЕаЕ240 сЕдсаааЕда асадссЕдад адссдаддас асддсЕдЕдЕ аЕЕасЕдЕдс дададаЬадд300 ддаЕасЕасЕ асддЕаЕдда сдЕсЕддддс саадддасса сддЕсассдЕ сЕссЕсад358 <210> 59

- 76 015534 <211> 107 <212> Белок <213> Ното зарпепз <400> 59

Азр 1

Не

51 η

МеЬ

ТЬг 51п 5

Бег

Рго

Бег

Бег 10

Ьеи

Бег

А1а

Бег

Уа1 15

61у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Бег

С1п

61 у

Не

Агд

Азп

А1а

20

25

30

Ьеи

(31у

Тгр

Туг

51п

51п

Ьуз

Рго

51 у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

51у

А1а

Зег

Бег

Ьеи

61п

Бег

51у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Бег

51 у

50

55

60

Зег

51у

Зег

51у

ТЬг

51 и

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Бег

Бег

Ьеи

51п

Рго

65

70

75

80

51 и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

С1п

ΗΪ3

Азп

Бег

Туг

Рго

РЬе

85

90

95

ТЬг

РЬе

51 у

Рго

51 у

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Не

Ьуз

100

105

<210> 60 <211> 322 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 60 даса+ссада с+сасХХдсс дддааадссс адд+Ьсадсд даадаЬ+++д дддассааад

Ьдасссад+с дддсаадЬса сЬаадсдсс+ дсадрдда+с саасЬ+а+Ьа ЬддаСаЬсаа

Ьсса+сс+сс дддса+Ьада да+с+а+ддР Ьдддасадаа с+д+с+асад ас сЬд+с+дса+ аа+дс+++ад дсаЬссад+Ь Ь+сас+с+са са+аа+ад+Р с+д+аддада дс+дд+а+са ЬдсааадЪдд саа+садсад асссаЪ+сас сададЬсасс 60 дсадааасса 120 дд+сссаЬса 180 сс+дсадссЬ 240

ЬЬ+сддсссЬ 300

322 <210> 61 <211> 119 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 61

61 и 1

Уа1

51п

Ьеи Уа1 5

61и

Бег 61у

51у 51у 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

51у 15

51у

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Бег

51 у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

Бег

МеЬ

Азп

Тгр

Уа1

Агд

51п

А1а

Рго

51 у

Ьуз

εΐγ

Ьеи

51и

Тгр

Уа1

35

40

45

Бег

Зег

Не

Зег

Зег

Бег

Бег

Бег

Туг

Не

Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

51 у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Бег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

51 п

Мер

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

51и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

- 77 015534

А1а Агд Азр Агд 51 у Зег Туг РЬе Ьеи РЬе Азр Туг Тгр 51 у 51п 61 у 100 105 110

ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115 <210> 62 <211> 353 <212> ДНК, <213> Ното зарЬепз <400> 62 даддЬдсадс ЬддЬддадЬс Ьдддддаддс сЬддЬсаадс сЬддддддЬс ссЬдадасЬс60

ЬссЬдЬдсад ссЬсЬддаЬЬ сассЬЬсадЬ адсЬаЬадса ЬдаасЬдддЬ ссдссаддсЬ120 ссадддаадд ддсЬддадЬд ддЬсЬсаЬсс аЬЬадЬадЬа дЬадЬадЬЬа саЬаЬасЬас180 дсадасЬсад Ьдаадддссд аЬЬсассаЬс Ьссададаса асдссаадаа сЬсасЬдЬаЬ240 сЬдсаааЬда асадссЬдад адссдаддас асддсЬдЬдЬ аЬЬасЬдЬдс дададассдЬ300 дддадсЬасЬ ЬссЬсЬЬЬда сЬасЬддддс садддаассс ЬддЬсассдЬ сЬссЬсад359 <210> 63 <211> 107 <212> Белок <213> Ното зариепз <400> 63

Аар 1

МеЬ

С1п МеЬ

ТЬг С1п 5

Зег

Рго Зег

Зег 10

Ьеи Зег

А1а

Зег

Уа1 15

51 у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

51п

51у

Не

Агд

Азп

Азр

20

25

30

Ьеи

С1у

Тгр

Туг

51п

<31п

Ьуз

Рго

51 у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

51 у

А1а

Зег

Зег

Ьеи

51 η

Зег

51у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

51у

50

55

60

Зег

61у

Зег

51 у

ТЬг

Б1и

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

61п

Рго

65

70

75

80

51 и

Азр

Зег

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

51п

ΗΪ3

Азп

Зег

Туг

Рго

Ьеи

85

90

95

ТЬг

РЬе

С1у

С1у

61у

ТЬг

Ьуз

Уа1

51и

Не

Ьуз

100

105

<210> 64 <211> 322 <212> ДНК <213> Ното еарЬепз <400> 64 дасаЬдсада ЬдасссадЬс ЬссаЬссЬсс сЬдЬсЬдсаЬ оЬдЬаддада сададЬсасс60 аьсасььдсс дддсаадЬса дддсаЬЬада ааЬдаЬЬЬад дсЬддЬаЬса дсадааасса120 дддааадссс сЬаадсдссЬ даЬсЬаЬддЬ дсаЬссадЬЬ ЬдсааадЬдд ддЬсссаЬса180 аддЬЬсадсд дсадЬддаЬс Ьдддасадаа ЬЬсасЬсЬса сааЬсадсад ссЬдсадссЬ240 даадаЬЬсЬд саасЬЬаЬЬа сЬдЬсЬасад саЬааЬадЬЬ асссдсьсас ЬЬЬсддсдда300 дддассаадд ЬддадаЬсаа ас322

- 78 015534 <210> 65 <211> 119 <212> Белок <213> Ното зарХепз <400> 65

61и 1

Уа1

61П

Ьеи Уа1 5

61и

Зег

61у

С1у

С1у 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

61у 15

61у

Зег

Ьеи

Алд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

61 у

РЬе

ТЬх

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

Зег

Мер

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

61у

Ьеи

б1и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

Зег

11е

Зел

Зег

Зег

Зег

Зел

Туг

Не

Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

61у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

61п

Мер

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

ТЬг

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азр

Агд

61 у

Туг

Ьеи

Туг

61 у

Мер

Азр

Уа1

Тгр

С1у

61п

61 у

100

105

110

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 <210> 66 <211> 358 <212> ДНК <213> Нойю зарлепз <400> 66 даддрдсадс ЪддРддадЬс Ьдддддаддс сЬддРсаадс сЬддддддЬс ссЬдадасЬс60

ЬссЬд-Ьдсад ссСсЬсдаС! сассЫсадР адсРаЬадса ЬдаасЬдддР ссдссаддсР120 ссадддаадд ддсРддадЬд ддРсРсаРсс аЬРадЬадЬа дРадРадЫа саЬаЬасЬас180 дсадасРсад Ьдаадддссд аЬРсасааЬс Рссададаса асдссаадаа сЬсасРдРаР24 0 сЬдсаааРда асадссСдад адссдаддас асдасРдЬдР аЬЪасЬдЬдс дададаРсда300 ддаРассРсР асддРаРдда сдрсрддддс: саадддасса сддРсассдР сРссРсад358 <210> 67 <211> 107 <212> Белок <213> Ното зарлепз <400> 67

Азр 1

Не

61п

Мер

ТЬг 5

61п

Зег

Рго

Зег

Зел 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

61у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг 20

Не

ТЬг

Суз

Алд

А1а 25

Зег

61 п

А1а

Не

Агд 30

Азп

Азр

Ьеи

61 у

Тгр 35

Туг

61 п

61 п

Ьуз

Рго 40

61 у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз 45

Алд

Ьеи

Не

Туг

А1а 50

А1а

Зег

Зег

Ьеи

С1п 55

Зег

61 у

Уа1

Рго

Зег 60

Агд

РЬе

Зег

61 у

Зег

61 у

Зег

61 у

ТЬг

61и

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

61 п

Рго

- 79 015534

65

70

75

80

61и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

Ьеи

61п

Низ Азп

Зег Туг Рго

Агд

85

90

95

ТЬг

РЬе

61у

61п

61у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61и

Не

Ьуз

100

105

<210> 68 <211> 322 <212> ДНК <213> Ното зариепз <400> 68 даса+ссада а+сасС+дсс дддааадссс адд+Ссадсд даада+СССд дддассаадд

Сдасссад+с дддсаад+са с+аадсдссС дсадСдда+с саас+Са+Са Сддааа+саа

ЕссаСсс+сс ддссаССада да+с+аСдсЬ Едддасадаа с+д+с+асад ас сСдСсСдсаС аа+даСЕ+ад дса+ссадСР ССсасСс+са са+аа+адЪЪ с+д+аддада дсСдд+а+са РдсааадСдд саа+садсад ассс+сддас садад+сасс дсадааасса дд+сссаСса ссСдсадссС дССсддссаа

120

180

240

300

322 <210> 69 <211> 123 <212> Белок <213> Ното зариепз <400> 69

61п 1

Уа1 61п

Ьеи

Уа1 5

51п Зег 61у

А1а 61и Уа1 10

Ьуз

Ьуз

Рго

61 у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

61 у

Туг

20

25

30

Туг

МеС

Η18

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

61п

61 у

Ьеи

61и

Тгр

Мес

35

40

45

61 у

Тгр

11е

Азп

Рго

Азп

Зег

61 у

61у

ТЬг

Азп

Туг

А1а

61п

Ьуз

РЬе

50

55

60

61 п

61у

Агд

Уа1

ТЬг

МеС

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Не

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1и

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

Азр

Авр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азп

ТЬг

Уа1

61 у

ТЬг

61 у

Туг

Туг

Туг

Туг

61 у

Ме+

Азр

Уа1

100

105

110

Тгр

61 у

С1п

61 у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Зег

115

120

<210> 70 <211> 370 <212> ДНК <213> Ното эар1епз <400> 70 садд+дсадс ЕссСдсаадд сс+ддасаад дсасадаадС

СддСдсад+с сСЕсЕдда+а ддсС+дад+д ЕСсадддсад

СддддсЕдад ЕассССсасс да+ддда+дд дд+сасса+д д+даадаадс ддс+асСаСа а+саасссСа ассадддаса сЕддддссСс ЕдсасСдддС асад+дд+дд сд+сса+сад ад+дааддЕс дсдасаддос сасааасЕаЕ сасадсс+ас

120

180

240

- 80 015534 сЬддадсЬда дсаддсЬдад аЬсЬдасдас асддссдСдЬ дСдддаасЬд даЬасбасСа сСасддСаЕд дасдСоЬддд дСсЬссСсад аСЬасЕдЬдс дадаааЬасд 300 дссаадддас сасддСсасс 360

370 <210> 71 <211> 112 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 71

Азр 1

Не

Уа1

МеЬ

ТЬг 5

61п

Зег

Рго

Ьеи

Зех 10

Ьеи

Рго

Уа1

ТЬг

Рго 15

С1у

61 и

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Ахд

Зег

Зег

61п

Зег

Ьеи

Ьеи

Нхз

Зех

20

25

30

Азп

С1у

Тух

Азп

Туг

Ьеи

Аар

Тгр

Тух

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

С1у

61п

Зег

35

40

45

Рго

С1п

Уа1

Ьеи

Не

Туг

Ьеи

Уа1

Зег

Азп

Агд

А1а

Зег

61 у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

61 у

Зег

61 у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬх

Ьеи

Ьуз

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

61и

А1а

61и

Азр

Уа1

61 у

Уа1

Туг

Туг

Суз

Меб

61п

А1а

35

90

95

Ьеи

61 η

ТЬх

Рго

Рго

ТЬг

РЬе

61 у

61 у

61 у

ТЬх

Ьуз

Уа1

61и

Не

Ьуз

100

105

110

<210> 72 <211> 337 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 72 даЬаЬ'ЬдЬда ЬдасСсадСс ЬссасЬсСсс сЬдсссдСса сасоСддада досддссЬсс60 аЬсЬссСдса ддСсСадЬса дадссЬссСд саСадРааЬд даСасаасСа СССдда+Сдд120

ЬассСдсада адссадддса дЬсЬссасад дЬссРдаСсС аЬГСддЫЬс ЬааСсдддсс130

ЕссддддЬсс сЬдасаддЫ садСддсадС ддаЬсаддса сада+СЫас асС.дааааЬс:240 адсададЬдд аддсСдадда 'ЬдСХддддСЕ СаССасЕдса СдсаадсСсЬ асааасСссЬ300 сссасЫЬсд дсддадддас сааддСддад аСсааас337 <210> 73 <211> 119 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 73

61 и 1

Уа1

61п

Ьеи

νβΐ 5

61и

Зег

31 у

61 у

61 у 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рхо

61 у 15

61 у

Зех

Ьеи

Ахд

Ьеи 20

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег 25

61у

РЬе

ТЬх

РЬе

Зех 30

Зех

Туг

Зех

Мер

Азп 35

Тгр

Уа1

Ахд

61п

А1а 40

Рго

61у

Ьуз

61у

Ьеи 45

61и

Тгр

Уа1

Зех

Зех 50

Не

Зег

Зег

Зех

Зег 55

Зег

Туг

Не

Туг

Тух 60

А1а

Азр

Зег

Уа1

- 81 015534

Ьуз 65

61у

Агд

РЬе

ТЬг

11е 70

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а 75

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг 80

Ьеи

С1п

МеЬ

Азп

Бег 85

Ьеи

Агд

А1а

51и

Авр 90

ТЬг

А1а

Уа1

Тух

Туг 95

Суз

А1а

Агд

Азр

Агд 100

С1у

Туг

Зег

Туг

01у 105

Ьеи

Азр

Тух

Тгр

61у 110

С1п

е1у

ТЬг

Ьеи

Уа1 115

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

<210> 74 <211> 358 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400 74 даддЬдсадс ЁддЬддадЬс Ьдддддаддс сЬдд+саадс сХддддддбс ссЬдадасЬс60

ЬссЬдЬдсад ссЬсСддаСЁ сассЬСсадЬ адсьаьадса ЬдаасЬдддЁ ссдссаддсЬ120 ссадддаадд ддсЬддадЬд ддЬсЬсаЬсс аЬ+адРадРа дЬадЁ.адЬЬа саЁаЬасЬас180 дсадасЕсад Ъдаадддссд аЬЬсассаРс Ёссададаса асдссаадаа сЪсасЪдЁаЁ240 сСдсаааЬда асадссЬдад адссдаддас асддсЬдЬдЬ аЬЬасЁдЬдс дададаЬсдЬ300 ддаЬасадсЬ аЕддЁсЬЕда сЬасЬддддс садддаассс ЁддЬсассдЬ сРссЬсад358 <210 75 <211> 107 <212> Белок <213> Ното зархепз <400 75

Азр 1

Не

С1п

МеЬ

ТЬг 5

01п

Зег

Рхо

Зег

Бег Ьеи 10

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

01 у

11е

Агд

Азп

Азр

20

25

30

Ьеи

01 у

Тгр

Тух

01п

С1п

Ьуз

Рхо

01 у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

А1а

А1а

Зех

Зех

Ьеи

С1п

Зег

01у

Уа1

Рхо

Зех

Ахд

РЬе

Бег

С1у

50

55

60

Зег

51 у

Зег

51 у

ТЬг

<31и

РЬе

ТЬх

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

01 и

Азр

РЬе

А1а

ТЬх

Туг

Туг

Суз

Ьеи

01 п

Ьеи

Азп

Зех

Тух

Рго

РЬе

85

90

95

ТЬг

РЬе

61у

Рго

61у

ТЬх

Ьуз

Уа1

Азр

Не

Ьуз

100

105

<210> 76 <211> 322 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400 76 дасаЬссада ЬдасссадЁс ЁссаЬссЁсс сЬдЬсЬдсаЬ сЬдЬаддада сададбсасс 60 аЬсасЬЬдсс дддсаад+са дддсаЬЬада ааЬдаЁЬЬад дсЬддЬаЬса дсадааасса 120

- 82 015534 дддааадссс сЬаадсдссЬ даИсИаИдсИ дсаЬссадЬЬ аддЫсадсд дсадЬддаЬс Гдддасадаа НсасЬсСса даздаИЕИНд сдасЬЬаЬЕа сЬдЬсЬасад сЫзааЬадЬЬ дддассааад ЕддаСаСсаа ас

РдсааадЕдд ддСсссакса 180 сааЬсадсад ссЬдсадссЬ 240 асссаЬРсас РИсддсссЬ 300

322 <210> 77 <211> 122 <212> Белок <213> Ното зархепз

<400> 77	Ьеи	Ьеи 5	61и	Зег	εΐγ
61и 1	Уа1	Б1п
Зег	Ьеи	Алд	Ьеи 20	Зег	Суз	А1а	А1а
А1а	Мер	Зег 35	Тгр	Уа1	Агд	С1п	А1а 40
Зег	ТЬг 50	Не	Зег	61у	Зег	61у 55	61 у
Ьуз 65	61 у	Агд	РЬе	ТЬг	Не 70	Зег	Агд
Ьеи	<31п	МеЕ	Азп	Зег 85	Ьеи	Агд	А1а
А1а	Ьуз	Азр	Б1у 100	Агд	Туг	Азп	Тгр
С1у	61п	61у ТЬг 115	МеЬ	Уа1	ТЬг	Уа1 12 0

61 у	61у 10	Ьеи	Не	С1п	Рго	61 у 15	61 у
Зег 25	61у	РЬе	ТИг	РЬе	Зег 30	Зег	РЬе
Рго	61у	Ьуз	Б1у	Ьеи 45	61и	Тгр	Уа1
Туг	ТЬг	РЬе	Туг 60	А1а	Азр	Зег	Уа1
Азр	Азп	Зег 75	Ьуз	Азп	ТЬг	Ьеи	Туг 80
51 и	Азр 90	ТЬг	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
Азп 105	Туг	61у	А1а	РЬе	Азр НО	Не	Тгр
Зег	Зег

<210> 78 <211> 367 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 78 даддЬдсадс РаЕрддадЬс Ьдддддаддс ЬИдаЕасадс сЬддддддЬс ссИдадасЬс60

ЬссЬдЬдсад ссРсИддаГХ сассЬЬЬадс адсРЬЬдсса ЬдадсЬдддЬ ссдссаддсЬ120 ссадддаадд ддсЬддааЬд ддЬсЬсаасЬ аПадЬддИа дЬддЬддЬЬа сасаГЛ.сЬ.ас180 дсадасЬссд Ьдаадддссд дЬЕсассаЬс Ьссададаса аИЬссаадаа сасдсИдРаР240 сИдсаааЬда асадссЬдад адссдаддас асддссдЬаЬ аЬЬасЬдЬдс дааадаЬдда300 аддЬаЬаасЬ ддаасЕасдд ддсЬЬЬЬдаЬ аЬсЬддддсс аадддасааЬ ддЬсассдЬс360

ЬсЬЬсад367 <210> 79 <211> 107 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 79

61и Не 1

Уа1

Мер

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

А1 а

ТЬг 10

Ьеи

Зег

Уа1

Зег

Рго 15

61у

61 и Агд

А1а

ТЬг 20

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а 25

Зег

Б1п

Зег

Уа1

Зег 30

Зег

Азп

- 83 015534

Ьей

АЬа Тгр 35

Туг

С1П

61п

Ьуз

Рго 40

51у 61п

АЬа

Рго Агд Ьей 45

Ьей

Не

Туг

С1у

А1а

Зег

ТЬг

Агд

АЬа

ТЫ

51у

РЬе

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

50

55

60

Зег

61у

Зег

С1у

ТЬг

51 и

РЬе

ТЬг

Ьей

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьей

51п

Зег

65

70

75

80

С1и

Азр

РЬе

А1а

11е

Туг

Туг

Суз

61п

61П

Туг

Азп

Азп

Тгр

Рго

Ьей

85

90

95

ТЬг

РЬе

61 у

61у

61 у

ТЬг

Ьуз

Уа1

61 и

11е

Ьуз

100 105 <210> 80 <211> 322 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 80 даааРадРда сРсРссРдса ддссаддсРс аддЫсадРд даадаРРРРд дддассаадд

РдасдсадРс дддссадРса ссаддсРссР дсадрдддрс сааРРРаРРа РддадаРсаа рссадссасс дадрдррадр саРсРаРддР Рдддасадад сРдРсадсад ас сРдРсРдРдР адсаасРРад дсаРссасса РРсасЬсРса РаРааРаасР сРссадддда ссРддРасса дддссасРдд ссарсадсад ддссдсРсас аададссасс дсадааассР РРРсссадсс ссрдсадрср РРРсддсддд

120

180

240

300

322 <210> 81 <211> 122 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 81

61 и 1

Уа1

61п

Ьей.

Ьей 5

61и Зег

61у 61у

61у Ьей 10

Не 61п Рго

61 у 15

61у

Зег

Ьей

Агд

Ьей

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

51 у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

РЬе

20

25

30

АЬа

Мер

Зег

Тгр

Уа1

Ахд

51п

АЬа

Рго

51у

Ьуз

61у

Ьей

51 и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

ТЬг

11е

Зег

61 у

Зех

С1у

С1у

Зег

ТЬг

Туг

Туг

А1а

Азр

РЬе

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьей

Туг

65

70

75

80

Ьей

51п

Мер

Азп

Зег

Ьей

Агд

А1а

61 и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

АЬа

Ьуз

Азр

61у

Агд

Туг

Азп

Тгр

Азп

Туг

51 у

А1а

РЬе

Азр

11е

Тгр

100

105

110

61 у

61п

61у

ТЬг

Мер

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 82 <211> 367 <212> ДНК

- 84 015534

61и 1

Т1е

УаЬ

Ме!

ТЬг 5

51 η

Зег

Рго

АЬа

ТЬг 10

Ьеи

Зег

УаЬ

Зег

Рго 15

С1у

С1и

Агд

АЬа

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

АЬа

Зег

61 п

Зег

Уа1

Агд

Зег

Азп

20

25

30

Ьеи

АЬа

Тгр

РЬе

51 η

С1п

Ьуз

Рго

51 у

51 п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

61 у

А1а

Зег

ТЬг

Агд

АЬа

ТЬг

СЬу

Не

Рго

АЬа

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

51 у

Зег

51у

ТЬг

51 и

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

СЬп

Бег

65

70

75

30

51 и

Азр

РЬе

АЬа

УаЬ

Туг

Туг

Суз

СЬп

С1п

Туг

Азп

Азп

Тгр

Рго

Ьеи

Θ5

90

95

Ткг

РЬе

СЬу

С1у

СЬу

ТЬг

Ьуз

Уа1

СЬи

11е

Ьуз

100

105

- 85 015534

20

25

30

А1а

Мер

Зег

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

51 у

Ьуз

С1у

Ьеи

51 и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

А1а

11е

Зег

51 у

Зег

51у

61у

Зег

ТЬг

РЬе

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

ТЬг

61у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

РЬе

65

70

75

80

Ьеи

С1л

Ьеи

Азп

Зех

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Нхз

Суз

85

90

95

А1а

Ьуз

Азр

С1у

Агд

РЬе

Азп

Тгр

Азп

Туг

61у

А1а

Зег

Азр

Не

Тгр

100

105

110

61у

51п

51у

ТЬг

МеР

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

120

<210> 86 <211> 367 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 86 даддрдсадс РссРдРдсад ссадддаадд дсадас+ссд сРдсааРРда аддрррааср РсРРсад

РдРРддадРс ссРсРддаРР ддсРддадРд Ьдасдддссд асадссРдад ддаасРасдд рдддддаддс сассРРРадс ддРсРсадсР дРЬсасса+с адссдаддас ддсЬРсЬдаР

РРддРасадс с+ддддддРс ссРдадасРс 60 адсРаРдсса Рдадс+дддР ссдссаддсР 120 аРЬадРддРа дРддРддРад сасаРРсРас 180

Рссададаса аРРссаадаа сасдсРдНР 240 асддссдЬаР аРсасРдРдс дааадаРдда 300 аРс+ддддсс аадддассаР ддРсассдЬс 360

367 <210> 87 <211> 107 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 87

51и 1

Не Уа1

Мер ТЬг 5

61п

Зег

Рго

А1а

ТЬг 10

Ьеи

Зег

Уа1

Зег

Рго 15

61у

61 и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

ТЬг

Зег

51П

Зег

Уа1

Зег

Зег

Азп

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

61п

61п

Ьуз

Рго

61 у

61л

А1а

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

61 у

А1а

Зег

ТЬг

Агд

А1а

ТЬг

61 у

Не

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

61у

50

55

60

Зег

61 у

Зег

61у

ТЬг

61и

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

61 п

Зег

65

70

75

ео

51 и

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

61п

С1п

Туг

Азп

Азп

Тгр

Рго

Ьеи

85

90

95

ТЬг

РЬе

51у

61у

61 у

ТЬг

Ьуе

Уа1

61 и

11е

Ьуз

100 105

- 86 015534 <210> 68 <211> 322 <212> ДНК <213> Ното зарЪепэ <400> 88 даааЕадЕда ЬдасдсадЕс ЕссадссасЕ сЬдЕсЕдЕдЕ сйссадддда аададссасс сЕсЕссЕдса ддассадЕса дадЬдЕСадс адсаасЕЕад ссЕддЕасса дсадааассЕ ддссаддсЕс сааддсЕссЕ саЕсЕаЕддЕ дсаЕссасса дддасасЕдд ЕаЕсссадсс аддЕЕсадЕд дсадЕдддЕс Едддасадад ЕЕсасЕсЕса ссаЕсадсад ссЕдсадЕсЕ даадаЕЕЕЕд садЕЕЕаЕЕа сЕдЕсадсад ЕаЕааЕаасЕ ддссдсЕсас ЕЕЕсддсдда дддассаадд ЕддадаЕсаа ас

120

180

240

300

322 <210> 89 <211> 109 <212> Белок <213> Ното зарЪепз <400> 89

Азр 1

РЬе

СЪу

Ьеи

Азр 5

Суз

Азр

С1и

НЪз

Зег 10

ТЬг

С1и

Зег

Агд

Суз 15

Суз

Агд

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг

УаЪ

Азр

РЬе

СЪи

АЪа

РЬе

СЪу

Тгр

Азр

Тгр

11е

20

25

30

11е

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Туг

Ьуз

АЪа

Азп

Туг

Суз

Зег

еъу

С1и

Суз

61 и

35

40

45

РЬе

УаЪ

РЬе

Ьеи

СЪп

Ъуз

Туг

Рго

НЪз

ТЬг

НЪз

Ьеи

УаЪ

Н15

СЪп

АЪа

50

55

60

Азп

Рго

Агд

СЪу

Зег

АЪа

СЪу

Рго

Суз

Суз

ТЬг

Рго

ТЬг

Ьуз

МеЕ

Зег

65

70

75

80

Рго

Не

Азп

МеЕ

Ъеи

Туг

РЬе

Азп

СЪу

Ьуз

СЪи

СЪп

11е

11е

Туг

61у

85

90

95

Ьуз

Не

Рго

АЪа

МеЕ

УаЪ

УаЪ

Азр

Агд

Суз

СЪу

Суз

Зег

100 105 <210> 90 <211> 109 <212> Белок <213> Ното зарЪепз <400> 90

Азп 1

Ьеи

СЪу

Ьеи

Азр 5

Суз

Азр

С1и

НЪз

Зег 10

Зег

СЪи

Зег

Агд

Суз 15

Суз

Агд

Туг

Рго

Ьеи 20

ТЬг

УаЪ

Азр

РЬе

СЪи 25

А1а

РЬе

СЪу

Тгр

Азр 30

Тгр

11е

Не

АЪа

Рго 35

Ьуз

Агд

Туг

Ьуз

АЪа 40

Азп

Туг

Суз

Зег

СЪу 45

СЪп

Суз

СЪи

Туг

МеЕ 50

РЬе

МеЕ

СЪп

Ьуз

Туг 55

Рго

НЪз

ТНг

НЪз

Ьеи 60

УаЪ

СЪп

СЪп

АЪа

Азп 65

Рго

Агд

СЪу

Зег

АЪа 70

СЪу

Рго

Суз

Суз

ТНх 75

Рго

ТНг

Ьуз

МеЕ

Зег 80

Рго

Не

Азп

МеЕ

Ьеи

Туг

РЬе

Азп

Авр

Ьуз

СЪп

СЪп

Не

Не

Туг

СЪу

- 87 015534

<210> 91 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <220>

<221> модифицированное_основание <222> (21) <223> Инозин <400> 91 саддЕдсадс ЕддадсадЕс пдд 23 <210> 92 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 92 дсЕдадддад ЕададЕссЕд адда 24 <210> 93 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22 0>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 93

ЕасдЕдссаа дсаЕссЕсдс 20 <210> 94 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 94 аддсЕддаас Едаддадсад дЕд 23 <210> 95

- 88 015534 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 95 сссЬдададс аДсаутуагт аасс 24 <210> 96 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 96 йттЫтГссасД уддДда+сгд сасДд 25 <210> 97 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 97 аДДугдДдаД садзастдаа сазад <210> 98 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22 0>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 98 дзагЬсадис усичусадда сасадс 26 <210> 99 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22 0>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 99 сассаддкда ДЫздсаГаДД ггссс 25

- 89 015534 <210> 100 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 100 аЕсааЬдссЕ дкдЕсададс у у Ед 24 <210> 101 <211> 9 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 101 адссадаса 9 <210> 102 <211> 8 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид <400> 102 дЕсЕадас 8 <210> 103 <211> 18 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 103

Азр РЬе 01 у Ьеи Азр Суз Азр 61и Нхз Зег ТЬг С1и Зег Агд Суз Суз

10 15

Агд Тух <210> 104 <211> 18 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

- 90 015534 <400> 104

Рго Ьеи Ткг Уа1 Азр РЬе С1и А1а РЬе С1у Тгр Азр Тгр Не 11е А1а

5 10 15

Рго Ьуз .

<210> 105 <211> 18 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 105

Агд Туг Ьуз АЬа Азп Тух Суз Зег С1у С1и Суз б1и РЬе Уа1 РЬе Ьеи 15 10 15

С1п Ьуз <210> 106 <211> 18 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 106

Туг Рго ΗΪ5 Ткг Н1з Ьеи Уа1 Нхз 61 η А1а Азп Рго Агд 61 у Зег А1а

10 15

61у Рго <210> 107 <211> 18 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 107

Суз Суз ТЬг Рго Ткг Ьуз Мек Зег Рго Не Азп Мек Ьеи Туг РЬе Азп

10 15

61у Ьуз <210> 108 <211> 19 <212> Белок <213> Искусственная последовательность

- 91 015534 <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 103

61и 61п Не 11е Туг С1у Ьуз 11е Рго А1а МеЕ Уа1 Уа1 Азр Агд Суз

10 15

61у Суз Зег <210 109 <211> 18 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 109

ΗΪ5 Зег ТЬг 61и Зег Агд Суз Суз Агд Туг Рго Ьеи ТЬг Уа1 Азр РЬе

10 15

С1и А1а <210> 110 <211> 18 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности; синтетический пептид <400> 110

РЬе С1у Тгр Азр Тгр 11е 11е А1а Рго Ьуз Агд Туг Ьуз А1а Азп Туг

10 15

Суз Зег <210> 111 <211> 18 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 111

61у С1и Суз 61и РЬе Уа1 РЬе Ьеи ΘΙη Ьуз Туг Рго ΗΪΒ ТЬг ΗΪ3 Ьеи

10 15

Уа1 Н1з

- 92 015534 <210> 112 <211> 18 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 112

61п А1а Азп Рго Агд С1у Зег А1а 61у Рго Суз Суз ТЬг Рго ТЬг Ьуз

10 15

Мей Зег <210> 113 <211> 16 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 113

Рго Не Азп Мей Ьеи Туг РЬе Аеп 51 у Ьуз С1и С1п Не 11е Туг С1у 15 10 15

Ьуз Не <210> 114 <211> 1347 <212> ДНК <213> Ното зараепз <400> 114 даддйдсадс йссйдйдсад ссадддаадд дсадасйссд сйдсааайда аддйайаасй йесйсадссй йссдададса дйдйсдйдда йссйсаддас садассйаса дадсдсааай дйсййесйсй асдйдсдйдд дасддсдйдд ййссдйдйдд аадйдсаадд ааадддсадс аадаассадд дадйдддада йссдасддсй дддаасдйсй адссйсйссс йдРРддадйс ссйсйддайй ддсйддаайд йдаадддссд асадссйдад ддаасйасдд ссассааддд садсддсссй асйсаддсдс йсйасйсссй ссйдсаасдй дййдйдйсда йссссссааа йддйддасдй аддйдсайаа йсадсдйссй йсйссаасаа сссдадаасс Рсадссйдас дсаайдддса ссййсййссй йсйсайдсйс йдйсйссддд йдддддаддс сассйййадс ддйсйсаасй дййсассайс адссдаддас ддсййййдай сссайсддйс дддсйдссйд Рейдассадс садсадсдйа адайсасаад дйдсссассд асссааддас дадссасдаа йдссаадаса сассдйсдйд аддссйссса асаддйдйас сйдссйддйс дссддадаас сйасадсаад сдйдайдеай йааайда ййддйасадс адсйййдсса аййадйддйа йссададаса асддссдйай айсйддддсс ййсссссйдд дйсааддасй ддсдйдсаса дйдассдйдс сссадсааса Рдсссадеас асссйсайда даеессдадд аадссасддд сассаддасй дсссссайсд асссйдсссс аааддеййей аасйасаада сйсассдйдд даддсйсйдс сйддддддйс йдадсйдддй дйддйддййа аййссаадаа аййасйдйдс аадддасаай сдсссйдсйс асййссссда ссййсссддс ссйссадсаа ссааддйдда сассйдйддс йсйсссддас йссадййсаа аддадсадйй ддейдааедд адаааассай сайсссддда ассссадсда ссасассйсс асаададсад асаассасйа ссйдадасйс ссдссаддсй сасаййсйас сасдсйдйай дааадайдда ддйсассдйс саддадсасс ассддйдасд йдйссйасад сййсддсасс саадасадйй аддассдйса сссйдаддйс сйддйасдйд саасадсасд сааддадйас сйссаааасс ддадайдасс сайсдссдйд сайдсйддас дйддсадсад сасасадаад

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1347

- 93 015534 <210> 115 <211> 44Θ <212> Белок <213> Ното зархепз

<400> 115

Ьеи

Ьеи 5

61и

Зег 61у 61у

61у 10

Ьеи

Уа1

61п

Рго

61 у 15

61 у

51и Уа1 1

61п

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

51 у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

РЬе

20

25

30

А1а

МеЬ

Зег

Тгр

Уа1

Агд

61 п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

61 у

Ьеи

61и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

ТЬг

11е

Зег

61 у

Зег

61 у

61 у

Туг

ТЬг

РЬе

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

51 у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

61п

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Ьуз

Азр

51 у

Агд

Туг

Азп

Тгр

Азп

Туг

61у

А1а

РЬе

Азр

11е

Тгр

100

105

110

51 у

51п

61 у

ТЬг

МеЬ

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

61 у

Рго

115

120

125

Зег

ν^Ί

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

ТЬг

Зег

С1и

Зег

ТЬг

130

135

140

А1а

А1а

Ьеи

51 у

Суз

Ьеи

Уа1

ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

61 и

Рго

Уа1

ТЬг

145

150

155

160

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

61 у

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

Уа1

Нхз

ТЬг

РЬе

Рго

165

170

175

А1а

Уа1

Ьеи

51п

Зег

Зег

<31у

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

Уа1

ТЬг

180

185

190

Уа1

Рго

Зег

Зег

Азп

РЬе

61у

ТЬг

61п

ТЬг

Туг

ТЬг

Суз

Азп

Уа1

Азр

195

200

205

Нхз

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

ТЬг

Уа1

61и

Агд

Ьуз

Суз

210

215

220

Суз

νβΐ

51и

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

Рго

Уа1

А1а

61 у

Рго

Зег

225

230

235

240

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЬ

11е

Зег

Агд

245

250

255

ТЬг

Рго

61и

Уа1

ТЬг

Суз

νβΐ

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Нхз

61 и

Азр

Рго

260

265

270

С1и

Уа1

61п

РЬе

Азп

Тгр

туг

Уа1

Азр

61у

Уа1

61 и

Уа1

Нхз

Азп

А1а

275

280

285

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

61и

61и

61п

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

РЬе

Агд

Уа1

Уа1

290

295

300

- 94 015534

Зег 305

УаЬ

Ъеи

ТЬг

Уа1 Уа1 310

Нхз

61п

Азр

Тгр

Ьеи 315

Азп

61 у

Ъуз

01и

Туг 320

Ъуз

Суз

Ъуз

Уа1

Зег

Азп

Ъуз

61у

Ьеи

Рго

АЬа

Рго

Не

С1и

Ьуз

ТЬг

32 5

330

335

Не

Зег

Ъуз

ТЬг

Ъуз

С1у

С1п

Рго

Агд

61и

Рго

61п

УаЬ

Туг

ТЬг

Ьеи

340

345

350

Рго

Рго

Зег

Агд

61и

61и

МеЕ

ТЫ

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ъеи

ТЬг

Суз

355

360

365

Ъеи

Уа1

Ъуз

61 у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

АЬа

Уа1

61и

Тгр

61 и

Зег

370

375

380

Азп

61у

61 п

Рго

61и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

МеЕ

Ьеи

Азр

385

390

395

400

Зег

Азр

61у

Зег

РЬе

РЬе

Ъеи

Туг

Зег

Ъуз

Ъеи

ТЬг

УаЬ

Азр

Ьуз

Зег

405

410

415

Агд

Тгр

61п

О1п

61у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЕ

Нхз

61и

АЬа

420

425

430

Ъеи

Нхз

Азп

Нхз

Туг

ТЬг

61η

Ъуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61 у

Ьуз

435 440 445 <210> 116 <211> 645 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 116 даааЕадЕда сЕсЕссЕдса ддссаддсЕс аддЕЕсадЕд даадаЕЕЕЕд дддассаадд ЕсЕдаЕдадс сссадададд дададЬдЕсга сЕдадсааад сЕдадсЕсдс

ЕдасдсадЕс дддссадЕса ссаддсЕссЕ дсадЕдддЕс садЕЕЕаЕЕа ЕддадаЕсаа адЕЕдаааЕс ссааадЕаса сададсадда садасЕасда ссдЕсасааа

Ессадссасс дадЕдЕЕадЕ саЕсЕаЕддЕ Едддасадад сЕдЕсадсад асдаасЕдЕд ЕддаасЕдсс дЕддааддЕд садсааддас дааасасааа дадсЕЕсаас сЕдЕсЕдЕдЕ адсаасЕЕад дсаЕссасса ЕЕсасЕсЕса ЕаЕааЕаасЕ дсЕдсассаЕ ЕсЕдЕЕдЕдЕ даЕаасдссс адсассЕаса дЕсЕасдссЕ аддддададЕ сЕссадддда ссЕддЕасса дддссасЕдд ссаЕсадсад ддссдсЕсас сЕдЕсЕЕсаЕ дссЕдсЕдаа ЕссааЕсддд дссЕсадсад дсдаадЕсас дЕЕад аададссасс 60 дсадааассЕ 120

ЕаЕсссадсс 180 ссЕдсадЕсЕ 240

ЕЕЕсддсдда 300 сЕЕсссдсса 360

ЕаасЕЕсЕаЕ 420

ЕаасЕсссад 480 сасссЕдасд 540 ссаЕсадддс 600

645 <210> 117 <211> 214 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 117

О1и 1

Не

Уа1

МеЕ

ТЬг 5

61п

Зег

Рго

А1а

ТЬг 10

Ьеи

Зег

Уа1

Зег

Рго 15

61у

61и

Агд

А1а

ТЬг 20

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а 25

Зег

61п

Зег

Уа1

Зег 30

Зег

Азп

Ъеи

АЬа

Тгр 35

Туг

61п

61п

Ьуз

Рго 40

61 у

61п

АЬа

Рго

Агд 45

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

61у 50

А1а

Зег

ТЬг

Агд

АЬа 55

ТЬг

61 у

Не

Рго

АЬа 60

Агд

РЬе

Зег

61 у

- 95 015534

Зег 65

51 у

Зег

51 у

ТЬг

61и 70

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не 75

Зег

Зег

Ьеи

51 п

Зег 80

51 и

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

51п

51п

Туг

Азп

Азп

Тгр

Рго

Ьеи

85

90

95

ТЬг

РЬе

51 у

51у

61У

ТЬг

Ьуз

Уа1

61и

11е

Ьуз

Агд

ТЬх

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Рго

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

51и

51п

Ьеи

Ьуз

Зег

51 у

115

120

125

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

61 и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

51 п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

51 п

Зег

51у

Азп

Зех

61п

145

150

155

160

51 и

Зег

Уа1

ТЬг

61и

51п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

5ег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

165

170

175

Зег

ТЬх

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

61и

Ьуз

Нхз

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

51и

Уа1

ТЬг

Нхз

51 п

61у

Ьеи

Зег

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

195

200

205

РЬе

Азп

Агд

61у

51и

Суз

210 <2ΐο> на <211> 122 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 118

51 и Уа1 1

61п Ьеи

Ьеи 5

51и

Зег 61у 61 у

61 у 10

Ьеи

Уа1 51п

Рго

61 у 15

51у

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зех

51у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Зег

РЬе

20

25

30

А1а

МеЬ

Зех

Тгр

Уа1

Агд

61п

А1а

Рго

51у

Ьуз

61у

Ьеи

61и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

ТЬг

Не

Зег

61 у

Зег

61у

61 у

Туг

ТЬг

РЬе

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

61у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

61п

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

Ахд

А1а

61и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Ьуз

Азр

С1у

Агд

Туг

Азп

Тгр

Азп

Туг

61у

А1а

РЬе

Азр

11е

Тгр

100

105

НО

61у

61п

61 у

ТЬг

МеЬ

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115 120 <210> 119

- 96 015534 <211> 367 <212> ДНК <213> Ното зарЬепй <400> 119 даддрдсадс РдРЬддадЬС Рдддддаддс РРддЬасадс сРддддддРс ссРдадасРс60

ЬсоРдЬдсад ссРсРддаЬЬ сассРРРадс адсРРРдсса РдадсРдддР ссдссаддсР120 ссадддаадд ддсЬддааРд ддРсРсаасР аЬРадРддЬа дрддрддрра сасаРЬсРас180 дсадасРссд Рдаадддссд дЬЬсассаРс Рссададаса аРХссаадаа сасдсРдРаР240 сРдсаааРда асадссРдад адссдаддас асддссдРаР аРРасРдРдс дааадардда300 аддРаРаасР ддаасрасдд ддсРРРЬда! аРсРддддсс аадддасааР ддРсассдРс360

РссРсад367 <210> 120 <211> 107 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 120

61 и 1

Не

УаЬ

МеР ТЬг СЬп 5

Зег

Рго АЬа ТЬг 10

Ьеи Зег УаЬ

Зег

Рго 15

С1у

61 и

Агд

АЬа

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

61п

Зег

УаЬ

Зег

Зег

Азп

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

СЬп

СЬп

Ьув

Рго

СЬу

СЬп

АЬа

Рго

Агд

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

61 у

АЬа

Зег

ТЬг

Агд

АЬа

ТЬг

61 у

Не

Рго

АЬа

Агд

РЬе

Зег

СЬу

50

55

60

Зег

СЬу

Зег

61 у

ТЬг

СЬи

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

СЬп

Зег

55

70

75

80

61и

Авр

РЬе

А1а

УаЬ

Туг

Туг

Суз

СЬп

СЬп

Туг

Азп

Азп

Тгр

Рго

Ьеи

85

90

95

ТНг

РЬе

СЬу

СЬу

СЬу

ТЬг

Ьуз

Уа!

СЬи

ЬЬе

Ьуз

100 105 <210> 121 <211> 322 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 121 даааЬадРда сРсРссРдса ддссаддсРс аддРРсадбд даадаРРСРд дддассаадд

РдасдсадРс дддссадХса ссаддсРссР дсадрдддрс садРРРаСРа РддадаРсаа

Рссадссасс дадРдРРадР саРсРаРддР Рдддасадад сСдРсадсад ас сРдРсРдРдР адсаасроад дсаРссасса РРсасЬсРса РаРааРаасР сРссадддда ссЪддРасса дддссасРдд ссаРсадсад д.дссдсРсас аададссасс 60 дсадааассР 120

РаРсссадсс 180 ссРдсадРсР 240

РРРсддсдда 300

322 <210> 122 <211> 15 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 122

С1у СЬу С1у СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег 6Ьу СЬу СЬу СЬу Зег

10 15

- 97 015534

Claims (17)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Химерное, человеческое или гуманизированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с миостатином, где указанное антитело или часть ингибируют связывание миостатина с рецептором активина типа Ι или типа ΙΙ и где указанное антитело представляет собой не конкурирующее нейтрализующее антитело, содержащее по крайней мере СЭВЕ СЭВ2 и СЭВ3 тяжелой цепи или указанные СОВ, имеющие менее 8 консервативных аминокислотных замен, и СЭКЕ СЭВ2 и СЭВ3 легкой цепи или указанные СОВ, имеющие менее 3 консервативных аминокислотных замен, со следующими последовательностями:

   (a) 51Е0 ΙΌ N0: 38 и 8Е0 ΙΌ N0: 40 соответственно;

   (b) 51Е0 ΙΌ N0: 42 и 8Е0 ΙΌ N0: 44 соответственно или (c) 51Е0 ΙΌ N0: 115 и 8Е0 ΙΌ N0: 117 соответственно.
2. 2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из:

   (a) антитела, содержащего аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей 8Е0 ΙΌ N0: 38 и 8Е0 ΙΌ N0: 40 соответственно;

   (b) антитела, содержащего аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей 8Е0 ΙΌ N0: 42 и 8Е0 ΙΌ N0: 44 соответственно; и (c) антитела, содержащего аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей 8Е0 ΙΌ N0: 115 и 8Е0 ΙΌ N0: 117 соответственно.
3. 3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из:

   (a) антитела, содержащего вариабельные домены последовательностей тяжелой и легкой цепей 8Е0 ΙΌ N0: 38 и 8Е0 ΙΌ N0: 40 соответственно;

   (b) антитела, содержащего вариабельные домены последовательностей тяжелой и легкой цепей 8Е0 ΙΌ N0: 42 и 8Е0 ΙΌ N0: 44 соответственно; и (c) антитела, содержащего вариабельные домены последовательностей тяжелой и легкой цепей 8Е0 ΙΌ N0: 115 и 8Е0 ΙΌ N0: 117 соответственно.
4. 4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие аминокислотную последовательность тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 115 и аминокислотную последовательность легкой цепи 5ЕО ΙΌ N0: 117.
5. 5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие вариабельные домены в составе последовательностей тяжелой и легкой цепей 8Е0 ΙΌ N0: 115 и 8Е0 ΙΌ N0: 117 соответственно.
6. 6. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело включает последовательности СЭВЕ СЭВ2 и СЭВ3 тяжелой цепи, содержащиеся в 8Е0 ΙΌ N0: 115 и последовательности СЭВЕ СЭВ2 и СЭВ3 легкой цепи, содержащиеся в 8Е0 ΙΌ N0:117.
7. 7. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, которые связываются с пептидом 1 и пептидом 5 миостатина, причем пептид 1 содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 103 и пептид 5 содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 107.
8. 8. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, продуцируемые гибридомной клеточной линией, выбранной из группы, включающей АТСС РТА-6574, АТСС РТА-6575 и АТСС РТА-6576.
9. 9. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.
10. 10. Способ увеличения мышечной массы, активизации развития скелетной мышцы, лечения заболевания, истощающего мышцу, или усиления роста скелетной мышцы, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8 или фармацевтической композиции по п.9, которые ингибируют активность миостатина.
11. 11. Выделенная клеточная линия, которая продуцирует антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-8 или тяжелую цепь или легкую цепь указанного антитела или указанной антигенсвязывающей части.
12. 12. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, которая кодирует тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть или легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела по любому из пп.1-8.
13. 13. Способ улучшения гомеостаза глюкозы; уменьшения жировой массы; увеличения чувствительности к инсулину; улучшения функции почки; уменьшения накопления жира; лечения, профилактики или подавления заболевания или состояния, характеризующегося разрушением кости, причем указанное заболевание или состояние включает остеопороз, остеопению, остеоартрит и переломы кости; лечения метаболического синдрома или противодействия мышечному истощению от длительного введения глюкокортикоидного или стероидного гормона в то время, когда субъект проходит лечение глюкокортикоидным или стероидным гормоном; включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или

    - 98 015534 его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8, которые ингибируют активность миостатина.
14. 14. Способ снижения активности миостатина у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8, которые ингибируют активность миостатина.
15. 15. Способ устранения связанного с возрастом сокращения мышечной массы у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8, которые ингибируют активность миостатина.
16. 16. Линия клеток-хозяев млекопитающих, содержащая полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи человеческого, химерного или гуманизированного моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части, где антитело продуцируется гибридомной клеточной линией, выбранной из группы, включающей АТСС РТА-6574, АТСС РТА-6575 и АТСС РТА-6576.
17. 17. Способ стимуляции роста мышцы или увеличения веса или предотвращения слабости у крупного рогатого скота, свиней, овец, цыплят, индюков, лошадей, рыб, собак и кошек, нуждающихся в этом, включающий введение животному антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8, которые ингибируют активность миостатина.