EA020508B1 - ВЫДЕЛЕННЫЕ АНТИТЕЛА К Sp35 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

ВЫДЕЛЕННЫЕ АНТИТЕЛА К Sp35 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Download PDF

Info

Publication number
EA020508B1
EA020508B1 EA200900971A EA200900971A EA020508B1 EA 020508 B1 EA020508 B1 EA 020508B1 EA 200900971 A EA200900971 A EA 200900971A EA 200900971 A EA200900971 A EA 200900971A EA 020508 B1 EA020508 B1 EA 020508B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
fragment
region
antibodies
human
Prior art date
Application number
EA200900971A
Other languages
English (en)
Other versions
EA020508B9 (ru
EA200900971A1 (ru
Inventor
Ша Ми
Р. Блэйк Пепински
Чжаохуэй Шао
Эллен Э. Гарбер
Стивен Д. Миклас
Original Assignee
Байоджен Айдек Эмэй Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байоджен Айдек Эмэй Инк. filed Critical Байоджен Айдек Эмэй Инк.
Publication of EA200900971A1 publication Critical patent/EA200900971A1/ru
Publication of EA020508B1 publication Critical patent/EA020508B1/ru
Publication of EA020508B9 publication Critical patent/EA020508B9/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

Эндогенный Sp35 представляет собой отрицательный регулятор выживаемости нейронов, регенерации аксонов, дифференцировки олигодендритов и миелинизации. Молекулы, такие как выделенные антитела к Sp35, которые блокируют функцию эндогенного Sp35, можно использовать как лекарственные препараты для лечения дисфункции нейронов и олигодендритов. Изобретение предусматривает антитела, специфические в отношении Sp35, и способы применения данных антител в качестве антагонистов функции эндогенных Sp35. Изобретение далее предусматривает нуклеиновые кислоты, кодирующие данные антитела, и векторы и клетки-хозяева, включающие данные антитела. Кроме того, изобретение предусматривает способы, стимулирующие выживаемость олигодендритов и миелинизацию позвоночных, включающие введение нуждающимся в данном лечении позвоночным эффективного количества антитела к Sp35.

Description

Данное изобретение относится к неврологии, нейробиологии и молекулярной биологии. Более детально данное изобретение относится к способам лечения неврологических заболеваний, нарушений и повреждений, таких как повреждение спинного мозга.
Сведения о предшествующем уровне техники
Аксоны и дендриты тянутся из нейронов. Дистальный конец вытягивающегося аксона или неврита включает специализированный участок, известный как конус роста. Конусы роста воспринимают локальную окружающую среду и направляют роста аксона в направлении клетки-мишени нейрона. Конусы роста отвечают на сигналы окружающей среды, например адгезионность поверхности, факторы роста, нейромедиаторы и электрические поля. Конусы роста, как правило, продвигаются вперед со скоростью от одного до двух миллиметров в день. Конус роста использует площадь впереди него и с любой из сторон посредством удлинений, классифицируемых как ламеллиподии и филоподии. Когда удлинение контактирует с неблагоприятной поверхностью, оно отодвигается. Когда удлинение контактирует с благоприятной для роста поверхностью, оно продолжает продвигаться и направляет конус роста в данном направлении. Когда конус роста достигает соответствующей клетки-мишени, образуется синаптическая связь.
Влияние на функцию нервных клеток осуществляется посредством контакта между нейронами и другими клетками в их непосредственной окружающей среде (см. статью КиПзЬаизег, е! а1., 1988, РЬузю1. Кеу. 68:819). Данные клетки включают специализированные клетки глии, олигодендроциты в центральной нервной системе (ЦНС) и шванновские клетки в периферической нервной системе (ПНС), которые окружают аксон нейрона миелином (см. раздел Ьетке, 1992, монографии 1п1гойис1юп !о Мо1еси1аг ИеигоЪю1оду (Введение в молекулярную нейробиологию) под ред. Ζ. На11, с. 281, §шаиег).
Нейроны ЦНС имеют присущую им потенциальную возможность регенерировать после повреждения, но эту функцию в них подавляют ингибирующие белки, присутствующие в миелине (см. статьи Вп!Пз е! а1., 2001, Иеигоп 30:11-14; 1опез е! а1., 2002, 1. Иеигозск 22:2792-2803; Оптре е! а1., 2002, 1. Иеигозск 22:2144-3160).
Охарактеризован ряд миелиновых ингибирующих белков, обнаруженных на олигодендроцитах. Известные примеры миелиновых ингибирующих белков включают ИодоА (см. статьи СНеп е! а1., Иа!иге, 2000) роста достигает соответствующей клетки-мишени, образуется синаптическая связь.
Известные примеры миелиновых ингибирующих белков (Огапйрге е! а1., Иа!иге 2000, 403, 439-444), миелин-ассоциированный гликопротеин (МАО) (см. статьи МсКеггасНег е! а1., 1994, Иеигоп 13:805-811; МикНорайНуау е! а1., 1994, Иеигоп 13:757-767) и гликопротеин олигодендроцитов (ОМ-др), (см. статью М1ко1 е! а1., 1988, 1. Се11. Вю1., 106:1273-1279). Отдельно показано, что каждый из данных белков является лигандом рецептора Иодо 1 нейронов ИдК1 (см. статьи \7апд е! а1., Иа!иге 2002, 417, 941-944; Огапйрге е! а1., Иа!иге 2000, 403, 439-444; СНеп е! а1., Иа!иге, 2000, 403, 434-439; Иотешсош е! а1., Иеигоп 2002, опубликовано в режиме прямого доступа 28 июня 2002).
Рецептор Иодо 1 (ИдК1) представляет собой ОР1-заякоренный мембранный белок, который включает 8 богатых лейцином повторов (см. статью Роигшег е! а1., 2001, Иа!иге 409:341-346). При взаимодействии с ингибирующими белками (например, Иодо А, МАО и ОМ-др) комплекс ИдК1 трансдуцирует сигналы, которые приводят к разрушению конуса роста и ингибированию отрастания неврита.
Имеется неудовлетворенная потребность в молекулах и способах ингибирования ИдК1опосредованного разрушения конуса роста и происходящего в результате подавления отрастания невритов. Кроме того, существует потребность в молекулах, которые повышают выживаемость нейронов и регенерацию аксонов. В частности, для лечения заболеваний, нарушений или повреждений, которые включают повреждение аксонов, гибель клеток нейронов и олигодендроцитов, демиелинизацию или димиелинизацию или в целом относятся к нервной системе.
Данные заболевания, нарушения или повреждения включают, но без ограничения перечисленным, рассеянный склероз (М§), прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию (РМЬ), энцефаломиелит (ЕРЬ), центральный миелолиз варолиевого моста (СРМ), адренолейкодистрофию, болезнь Александра, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (РМΖ), лейкодистрофию глобоидных клеток (болезнь Краббе) и дегенерацию Валлериана, ретробульбарный неврит, поперечный миелит, боковой амиотрофический склероз (АЬ§), болезнь Гентингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, повреждение спинного мозга, травматическое повреждение головного мозга, повреждение после облучения, неврологические осложнения при химиотерапии, инсульт, острую ишемическую ретробульбарную невропатию, дефицит витамина Е, синдром выделенного дефицита витамина Е, АК, синдром Басен-Корнцвейга, синдром Маркиафавы-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва и паралич Белла. Среди данных заболеваний М§ является самой распространенной, поражая приблизительно 2,5 млн человек во всем мире.
М§, как правило, начинается с рецидивирующего-временно ослабевающего типа неврологического участия, которое затем развивается в хроническую фазу с возрастающим неврологическим повреждением. М§ связан с деструкцией миелина, олигодендроцитов и аксонов, локализованных в областях хронических повреждений. Демиелинизация, наблюдаемая при М§, не всегда постоянна, и на ранних стадиях
- 1 020508 болезни документирована ремиелинизация. Для ремиелинизации нейронов необходимы олигодендроциты.
Для М§ имеются различные модифицирующие заболевание способы лечения, включая использование кортикостероидов и иммуномодуляторов, таких как интерферон-β и ТукаЪп®. Кроме того, вследствие центральной роли олигодендроцитов и миелинизации при М§ предприняты попытки разработать лекарственные препараты для повышения количества олигодендроцитов или усиления миелинизации; см., например, статьи СоЬеп е! а1., патент США № 5574009; СЬапд е! а1., N. Εη§1. 1. Мей., 346: 165-73 (2002). Однако остается острая необходимость в изобретении дополнительных лекарственных препаратов для лечения М§ и других нарушений демиелинизации и дисмиелинизции.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что δρ35 (§р35 в литературе называют также ΕΙΝΟΟ-Ι и ΕΚΚΝ6) экспрессируется в олигодендроцитах и клетках нейронов и отрицательно регулирует дифференцировку олигодендроцитов/нейронов, выживаемость и миелинизацию аксонов. Кроме того, некоторые антагонисты §р35 способствуют выживаемости, пролиферации и дифференцировке олигодендроцитов и клеток нейронов, а также миелинизации нейронов. Основываясь на данных обнаруженных фактах, изобретение относится в основном к антителам, их антиген-связывающим фрагментам или производным, которые можно использовать в качестве антагониста 8р35. Кроме того, изобретение в основном относится к способам лечения различных заболеваний, нарушений или повреждений, ассоциированных с демиелинизацией, дисмиелинизацией, гибелью олигодендроцитов/клеток нейронов или повреждением аксонов, путем введения антагонистического антитела к §р35 или антиген-связывающего фрагмента.
В ряде вариантов осуществления изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с тем же эпитопом §р35, что и эталонное моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 201', 3А3, 3А6, 1А7, 1Ο7, 2В10, 2С11, 2Р3, 3РГО10.2С3, 3Ρ1Ε11.3Β7, 3Р2С6.3О10.2Н7, 3Р2С9.2О4, 3Ρ4Α6.1Ό9, 3Р4А1.2В9, 3Р4С2.2Н2, 3Р4С5.ГО8, 3Р4С8.2О9, 30-С12 (ЬЮ1), 38-Ό01 (ЬЮ2), 35-Е04 (ЬЮ3), 36-С09 (ЬЮ4), 30-Α1 1 (ЮО), 34-Р02 (ЬЮ6), 29Ε07 (Ы07), 34-О04 (ЬЮ8), 36-Α12 (ЬЮ9), 28-Ό02 (ЬН0), 30-Β01 (ЬН1), 34-Β03 (Ю12), Ы13, Ю32, Ю33, Ы34, 3383 (Ь1а.1), 3495 (Ь1а.2), 3563 (Ь1а.3), 3564 (Ъ1а.4), 3565 (Ь1а.5), 3566 (Ь1а.6), 3567 (Ь1а.7), 3568 (Ь1а.8), 3569 (Ь1а.9), 3570 (Ъ1а.10), 3571 (Ь1а.11), 3582 (Ъ1а.12), 1968 (Ь1а.13), 7РГО5.1О9, 3Β5.2 и Ы81.
Некоторые варианты осуществления изобретения включают выделенный полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (νΗ), в которой участки СЭК.1, СЭК2 и СЭР3 выбраны из последовательностей полипептидов, показанных в табл. 4, или по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичных последовательностям полипептидов, показанным в табл. 4, или по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичных участкам СЭК.1, СЭР2 и СЭР3 νΗ тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемым гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС, номер депозита РТА-8106) или участкам СГОКЕ СЭР2 и СЭР3 νΗ тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемым гибридомой 7.Р1Э5.1.О9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
Некоторые варианты осуществления изобретения включают выделенный полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (УД, в которой участки СЭР1, СЭР2 и СЭР3 выбраны из последовательностей полипептидов, показанных в табл. 5, или по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям полипептидов, показанным в табл. 5, или по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичны участкам СОРТ, СЭР2 и СЭР3 V,, легкой цепи иммуноглобулина, продуцируемым гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106) или участкам СНР1, СГОР2 и СГОР3 ν7 легкой цепи иммуноглобулина, продуцируемым гибридомой 7.Р1Э5.1.О9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
Некоторые варианты осуществления изобретения включают выделенный полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (νΗ), выбранный из группы, состоящей из §ЕД ГО N0:158-172, 372, 376, 380, 384 и 416, как показано в табл. 6, или по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичный указанным §ЕД ГО N0:158-172, 372, 376, 380, 384 и 416, как показано в табл. 6, или по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичный тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемой гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106), или тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемой гибридомой 7.РГО5.1.О9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
Некоторые варианты осуществления изобретения включают выделенный полипептид, содержащий вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (УД, выбранный из группы, состоящей из §ЕД ГО N0:273-286, 373, 377, 381, 385 и 417, как показано в табл. 8, или по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичный указанным §ЕД ГО N0:273-286, 373, 377, 381, 385 и 417, как показано в табл. 8, или по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичный легкой цепи иммуноглобулина, продуцируемой гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106), или легкой цепи иммуноглобулина, продуцируемой гибридомой 7.РГО5.1.О9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
В дополнительных вариантах осуществления изобретение включает выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (νΗ), в которой участки СЭР1, СГОР2 и СГОР3 выбраны из группы, выбранной из последовательностей
- 2 020508 полинуклеотидов, показанных в табл. 4, или по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичных последовательностям полинуклеотидов, показанным в табл. 4.
В других вариантах осуществления изобретение включает выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (Уъ), в которой участки СГОКЕ СЭК2 и СЭК3 выбраны из последовательностей полинуклеотидов, показанных в табл. 5, или по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичных последовательностям полинуклеотидов, показанных в табл. 5.
Другие варианты осуществления изобретения включают выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (Ун), выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:173-184, 370, 374, 378, 382 и 422, как показано в табл. 7, или по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичную указанным 8ЕЦ ГО N0:173-184, 370, 374, 378, 382 и 422, как показано в табл. 7.
Другие варианты осуществления изобретения включают выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (Уь), выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:185-194, 371, 375, 379, 383 и 423, как показано в табл. 9, или по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичную указанным 8ЕЦ ГО N0:185-194, 371, 375, 379, 383 и 423, как показано в табл. 9.
В ряде вариантов осуществления изобретение включает композиции, содержащие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном контексте.
В дополнительных вариантах осуществления изобретение включает способы лечения повреждения ЦНС, АЬ8, болезнь Гентингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, диабетическую невропатию и инсульт, предусматривающие введение нуждающемуся в данном лечении животному эффективного количества агента, выбранного из группы, состоящей из выделенного антитела 8р35 или его фрагмента или композиций, содержащих указанное антитело или его фрагмент.
В других вариантах осуществления изобретение включает способы лечения заболевания или нарушений, ассоциированных с ингибированием роста или дифференцировки олигодендроцитов; демиелинизацией или дисмиелинизацией нейронов ЦНС, включающих рассеянный склероз (М8), прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию (РМЬ), энцефаломиелит (ЕРЬ), центральный миелолиз варолиевого моста (СРМ), адренолейкодистрофию, болезнь Александра и болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (ΡΜΖ), путем введения нуждающемуся в указанном лечении животному эффективного количества агента, выбранного из группы, состоящей из выделенного антитела к 8р35 или его фрагмента, либо композиции, содержащей указанное антитело или его фрагмент.
Другие варианты осуществления настоящего изобретения включают способ ингибирования сигнальной трансдукции посредством рецептора N030 1 (N§^1), включающий контактирование N§^1 с эффективным количеством агента, выбранным из группы, состоящей из выделенного антитела к 8р35 или его фрагмента, либо композициями, содержащими указанное антитело или его фрагмент.
Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения включают способ снижения уровня ингибирования роста аксонов нейронов центральной нервной системы (СЛ8), включающий контактирование нейрона с эффективным количеством агента, выбранного из группы, состоящей из выделенного антитела к 8р35 или его фрагмента, либо композиций, содержащих указанное антитело или его фрагмент.
Другие варианты осуществления настоящего изобретения включают способ ингибирования разрушения конуса роста нейрона ЦНС, предусматривающий контактирование нейрона с эффективным количеством агента, выбранного из группы, состоящей из выделенного антитела к 8р35 или его фрагмента либо композиций, содержащих указанное антитело или его фрагмент.
Перечень фигур, чертежей и иных материалов
Фиг. 1 - гель 8Э8-РАСЕ (электрофорез в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия), показывающий иммунопреципитацию 8р35 моноклональными антителами 1А7 и 2Р3.
Фиг. 2 - результат РАС8 (сортинга клеток по возбужденной флуоресценции), показывающий, что МАЬк 1А7 и 2Р3 связываются с клетками С08-7 или 293, экспрессирующими 8р35, но не с контрольными клетками без экспрессии 8р35.
Фиг. 3 - МАТ 1А7 и 2Р3 защищали нейроны ΌΚΟ от миелин-опосредованного ингибирования отрастания нейритов.
Фиг. 4 А-С - иммуногистохимическое окрашивание (ИГХ) сокультур нейронов ΌΚΟ и олигодендроцитов, обработанных моноклональными антителами 1А7 и 2Р3 или контрольным антителом. Изображения Ό и Е представляют собой увеличения изображений В и С соответственно. Окрашивание антителом к бета-111-тубулину для выявления аксонов или антителом к МВР для выявления олигодендроцитов. Изображение Р - количественная оценка МВР+-миелинизирующих клеток при обработке сокультур 1А7 или 2Р3. Изображение С - анализ вестерн-блоттинг с целью количественной оценки МВР, продуцируемых в сокультурах нейронов ΌΡΟ и олигодендроцитов, обработанных моноклональными антителами 1А7 и 2Р3.
Фиг. 5 А-С - изображение А - окрашивание антителом СС1 мышиных олигодендроцитов на модели
- 3 020508 с купризоном. Изображение В - окрашивание антителом к белку МВР или луксолом быстрым синим мышиных нейронов на модели с купризоном. Изображение С - количественная оценка антитело СС1положительных олигодендроцитов через четыре недели и 6 недель.
Фиг. 6 - выживаемость РОСТ. Лечение моноклональным антителом 1А7 к 8р35. Животные, леченные антителом 1А7, показывают существенную выживаемость нейронов (80%) по сравнению с животными, леченными контрольным антителом или РВ8, каждый из которых показывает только приблизительно 50% выживаемость нейронов.
Фиг. 7 - показатели ВВВ мышей, получающих антитело к 8р35 1А7 после повреждения спинного мозга, как показано в примере 8.
Фиг. 8 - вестерн-блот сокультивируемых олигодендроцитов и ΌΚΟδ после инкубирования с антителами к 8р35 Ы05, Ы06 и 3, 10 и 30 мг 8р35-Ре (ЬГИОО-Ыд), как описано в примере 9.
Фиг. 9 - фотографии зрительных нервов А) нормальных крыс; В) крыс с вызванным гликопротеином олигодендроцитов миелина (МОО) экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЕАЕ) и С) крыс с вызванным гликопротеином олигодендроцитов миелина (МОО) экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЕАЕ), леченных антителом к 8р35 1А7. Электронные микрофотографии каждого зрительного нерва показаны ниже каждой фотографии зрительного нерва.
Фиг. 10 - график числа регенеративных нервных волокон/срез, подсчитанного у животных, получающих инъекцию в стекловидное тело антитела к 8р35 1А7 после разрушения зрительного нерва.
Фиг. 11 - результат РАС8, показывающий, что МАЬк 3В5.2 (3В5) и 7Р1Э5.1О9 (105) связываются с клетками СНО, стабильно трансфицированными 8р35 (ΕΙΝΟΟ-Ι).
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Ι. Определения.
Следует заметить, что термин какой-либо элемент относится к одному или более данных элементов, например имеют в виду, что выражение антитело к 8р35 представляет одно или более антител к 8р35. В таком случае термины какой-либо, один или более и по меньшей мере один можно использовать взаимозаменяемо в данном контексте.
Как используют в данном контексте, термин полипептид предназначен для того, чтобы охватывать полипептид в единственном числе, а также полипептиды во множественном числе, и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (известными так же, как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот и не относится к специфической длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, цепь аминокислот или любой другой термин, используемый в отношении цепи или цепей из двух или более аминокислот, включены в определение полипептид, и термин полипептид можно использовать вместо или взаимозаменяемо с любым из данных терминов. Предусматривают также, что термин полипептид относится к продуктам постэкспрессионных модификаций полипептида, включая без ограничения гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификацию неприродными аминокислотами. Полипептид может быть выделен из природного биологического источника или получен рекомбинантным способом, но необязательно, чтобы он транслировался с обозначенной последовательностью нуклеиновой кислоты. Его можно генерировать любым путем, включая химический синтез.
Полипептид, соответствующий изобретению, может быть размером приблизительно 3 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру, хотя они необязательно имеют данную структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой называют складчатыми, а полипептиды, которые не обладают определенной трехмерной структурой, но предпочтительнее могут принимать большое число различных конформаций, называют нескладчатыми. Как используют в данном контексте, термин гликопротеин относится к белку, связанному по меньшей мере с одной углеводной молекулой, которая присоединена к белку через кислородсодержащую или азотсодержащую боковую цепь остатка аминокислоты, например остатка серина или остатка аспарагина.
Под выделенным полипептидом или его фрагментом, вариантом или производным подразумевают полипептид, который не находится в своей естественной среде. Не требуется никакого определенного уровня очистки. Например, выделенный полипептид можно удалить из его нативной или естественной окружающей среды. Рекомбинантно полученные полипептиды и белки, экспрессируемые в клеткаххозяевах, считают выделенными для целей изобретения, как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые выделены, фракционированы или частично либо в существенной степени очищены любым подходящим способом.
В качестве полипептидов, соответствующих настоящему изобретению, включены также фрагменты, производные, аналоги или варианты вышеупомянутых полипептидов и любая их комбинация. Термины фрагмент, вариант, производное и аналог касательно антител к 8р35 или полипептидов антител, соответствующих настоящему изобретению, включают любые полипептиды, которые сохраняют,
- 4 020508 по меньшей мере, некоторые из антигенсвязывающих свойств соответствующего нативного антитела или полипептида. Фрагменты полипептидов, соответствующих настоящему изобретению, включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты в дополнение к специфическим фрагментам антитела, обсуждаемым в других разделах данного материала. Варианты антител к полипептид §р35ов антител, соответствующих настоящему изобретению, включают фрагменты, как описано выше, а также полипептиды с измененными последовательностями аминокислот вследствие замен, делеций и инсерций аминокислот. Варианты могут существовать в естественных условиях или быть неприродными. Неприродные варианты можно получить при использовании известных в области техники способов мутагенеза. Варианты полипептидов могут включать консервативные или неконсервативные замены аминокислот, делеции или добавления. Производные антител к §р35 и полипептиды антитела, соответствующие настоящему изобретению, представляют собой полипептиды, которые изменены так, чтобы проявлять дополнительные свойства, не обнаруживаемые у нативного полипептида. Примеры включают слитые белки. Варианты полипептидов могут быть в данном контексте названы аналогами полипептидов. Как используют в данном контексте, производное антитела к §р35 или полипептида антитела относится к данному полипептиду, имеющему один или более остатков, химически дериватизированных реакций функциональной боковой группы. В качестве производных включены также те пептиды, которые содержат одно или более производных природных аминокислот из двадцати стандартных аминокислот. Например, 4-гидроксипролином можно заместить пролин; 5-гидроксилизином можно заместить лизин; 3метилгистидином можно заместить гистидин; гомосерином можно заместить серин и орнитином можно заместить лизин. Термин полинуклеотид предназначен для того, чтобы охватывать отдельную нуклеиновую кислоту, а также множество нуклеиновых кислот и относится к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например информационной РНК (мРНК) или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может включать традиционную фосфодиэфирную связь или нетрадиционную связь (например, амидную связь, такую как обнаружена в пептид-нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин нуклеиновая кислота относится к одному или более сегментов нуклеиновой кислоты, например фрагментам ДНК и РНК, присутствующим в полинуклеотиде. Под выделенной нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом подразумевают молекулу нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая удалена из своей нативной окружающей среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий антитело к 8р35, содержащийся в векторе, считают выделенным в целях настоящего изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, поддерживаемые в гетерологичных клетках-хозяевах или очищенные (частично или в существенной степени) полинуклеотиды в растворе. Выделенные молекулы РНК включают ίη νίνο или ίη νίίτο транскриптов РНК полинуклеотидов, соответствующих настоящему изобретению. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты, соответствующие настоящему изобретению, кроме того, включают данные, полученные синтетическим путем. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут представлять собой или могут включать регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосомы или терминатор транскрипции.
Как используют в данном контексте, кодирующий участок представляет собой часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя стоп-кодон (ТАС, ТСА или ТАА) не транслируется в аминокислоту, его можно рассматривать как часть кодирующего участка, но никакие фланкирующие последовательности, например промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и т.п., не являются частью кодирующего участка. Два или более кодирующих участков, соответствующих настоящему изобретению, могут присутствовать в одной полинуклеотидной конструкции, например на одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например на отдельных (различных) векторах. Более того, любой вектор может включать один кодирующий участок или может включать два или более кодирующих участка, например один вектор может отдельно кодировать вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота, соответствующие изобретению, могут кодировать гетерологичные кодирующие участки либо слитые, либо неслитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело к §р35 или его фрагмент, вариант либо производное. Гетерологичные кодирующие участки включают, без ограничения перечисленным, специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен. В ряде вариантов осуществления полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляют собой ДНК. В случае ДНК полинуклеотид, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, в норме может включать промотор и/или другие элементы контроля транскрипции или трансляции, функционально связанные с одним или более кодирующих участков. Функциональная связь осуществляется, когда кодирующий участок продукта гена, например полипептида, связан в одной или более регуляторных последовательностей таким образом, чтобы поместить экспрессию продукта гена под влияние или контроль регуляторной последовательности(ей). Два фрагмента ДНК (такие как участок, кодирующий полипептид, и связанный с ним промотор) являются функционально связанными, если индукция функции промотора приводит в результате к транскрипции мРНК, кодирующей требуемый продукт гена, и если природа связи между двумя фрагментами ДНК не нарушает способности экспрессионных регуля- 5 020508 торных последовательностей направлять экспрессию продукта гена или не нарушает способность к транскрипции ДНК-матрицы. Таким образом, участок промотора будет функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор способен осуществлять транскрипцию данной нуклеиновой кислоты. Промотор может представлять собой специфический в отношении клетки промотор, который направляет существенную транскрипцию ДНК только в заданных клетках. Другие элементы контроля транскрипции, кроме промотора, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут быть функционально связаны с полинуклеотидом, чтобы направлять специфическую в отношении клеток транскрипцию. Подходящие промоторы и другие участки контроля транскрипции описаны в данном контексте.
Компетентным специалистам в области техники известен ряд участков контроля транскрипции. Они включают, без ограничения перечисленным, участки контроля транскрипции, которые работают в клетках позвоночных, например, но без ограничения перечисленным, промоторные и энхансерные сегменты из цитомегаловирусов (средне-ранний промотор в сочетании с интроном А), обезьяний вирус 40 (ранний промотор) и ретровирусы (такие как вирус саркомы Роуса). Другие участки контроля транскрипции включают выделенные из генов позвоночных, таких как актин, белок теплового шока, гормон роста крупного рогатого скота и бета-глобин кроликов, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию гена в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие участки контроля транскрипции включают тканеспецифические промоторы и энхансер, а также лимфокининдуцируемые промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами).
Аналогично специалистам в области техники известно множество элементов контроля трансляции. Они включают, но без ограничения перечисленным, сайты связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, выделенные и пикорнавирусов (в частности, внутренний сайт входа в рибосому или ΙΚΕδ, обозначаемый так же, как последовательность С1ТЕ).
В других вариантах осуществления полинуклеотид, соответствующий настоящему изобретению, представляет собой РНК, например, в форме информационной РНК (т-РНК).
Полинуклеотид и нуклеиновая кислота, кодирующие участки, соответствующие настоящему изобретению, могут быть связаны с дополнительными кодирующими участками, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, которые направляют секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом, соответствующим настоящему изобретению. Согласно гипотезе сигнала белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которая отщепляется от зрелого белка после инициации экспорта растущего белка через шероховатый эндоплазматический ретикулюм. Обычные специалисты в области техники знают, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных, как правило, имеют сигнальный пептид, слитый с Ν-концом полипептида, который отщепляется от полного или полной длины полипептида с образованием секретируемой или зрелой формы полипептида. В ряде вариантов осуществления используют нативный сигнальный пептид, например сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина или функциональное производное данной последовательности, которая сохраняет способность направлять секрецию полипептида, который функционально связан с ней. Альтернативно, можно использовать гетерологичный сигнальный пептид млекопитающих или его функциональное производное. Например, лидерную последовательность дикого типа можно заменить лидерной последовательностью человеческого тканевого активатора плазминогена (ТРА) или мышиной бета-глюкуронидазы.
Настоящее изобретение направлено на некоторые антитела к δρ35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные. До тех пор пока специально не ссылаются на антитела полного размера, такие как природные антитела, термин антитела к δρ35 охватывает антитела полного размера, а также антигенсвязывающие фрагменты, варианты, аналоги или производные данных антител, например молекулы природного антитела или иммуноглобулина или молекулы инженерного антитела или фрагменты, которые связывают антиген аналогично молекулам антитела.
Термины антитело и иммуноглобулин в данном контексте используют взаимозаменяемо. Антитело или иммуноглобулин включает, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи и в норме включает, по меньшей мере, вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи. Базовые структуры иммуноглобулина в системах позвоночных относительно хорошо изучены; см., например, монографию Наг1о№ с1 а1., АпОЪоШез: А ЬаЪогаЮгу Мапиа1 (Антитела: лабораторное руководство) (Со1б δρπημ НагЬог ЬаЪога1огу Рге88, 2-е изд. 1988).
Как будет подробно обсуждаться ниже, термин иммуноглобулин включает различные широкие классы полипептидов, которые можно различить биохимически. Компетентные специалисты в области техники будут иметь в виду, что тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта и эпсилон (γ, μ, α, δ, ε) с рядом подклассов в них (например, γ1-γ4). Природа данной цепи является тем, что определяет класс антитела как 1дС. 1дМ, 1дА, 1§С или 1дЕ соответственно. Подклассы (изотипы) иммуноглобулинов, например 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА1 и т.п., хорошо охарактеризованы и, как известно, обусловливают функциональную специализацию. Модифицированные варианты каждого из данных подклассов и изотипов легко отличимы для компетентного специалиста в свете данного описания и соответственно входят в объем данного изобретения. Хотя все классы иммуноглобулина несомненно входят в
- 6 020508 объем настоящего изобретения, последующее обсуждение будет в основном направлено на класс 1дС молекул иммуноглобулина. Что касается 1дС. то стандартная молекула иммуноглобулина включает два идентичных полипептида легкой цепи молекулярной массы приблизительно 23000 Д и два идентичных полипептида тяжелой цепи молекулярной массы 53000-70000. Четыре цепи, как правило, связаны дисульфидными связями в Υ''-конфигурации, в которой легкие цепи окружают как скобками тяжелые цепи, начиная от входа в Υ и продолжаясь через вариабельный участок.
Легкие цепи классифицируют как либо каппа, либо лямбда (κ, λ). Каждый класс тяжелых цепей может быть связан либо с каппа-, либо с лямбда-легкой цепью. Как правило, легкие и тяжелые цепи ковалентно связаны друг с другом и хвостовые части двух тяжелых цепей связаны друг с другом ковалентными дисульфидными связями или нековалентными связями, когда иммуноглобулины генерируются либо гибридомами, В-клетками, либо генно-инженерными клетками-хозяевами. В тяжелой цепи последовательности аминокислот выходят из Ν-конца и в раздвоенных концах Υ-конфигурации к С-концу в нижней части каждой цепи.
Как легкие, так и тяжелые цепи делятся на участки структурной и функциональной гомологии. Термины константный и вариабельный используют функционально. В этом плане следует иметь в виду, что вариабельные домены частей как легкой (Уъ), так и тяжелой (Ун) цепи определяют распознавание антигеном и специфичность. Напротив, константные домены легкой цепи (Съ) и тяжелой цепи (Сн1, Сн2 или Сн3) обусловливают важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарная подвижность, связывание Ре-рецептора, связывание комплемента и т.п. По договоренности нумерация доменов константной области возрастает по мере из удаления от антигенсвязывающего центра или аминоконца антитела. Ν-концевая часть представляет собой вариабельную область и С-концевая часть представляет собой константную область, Сн3-и Сь-домены фактически включают карбоксиконец тяжелой и легкой цепи соответственно.
Как указано выше, вариабельная область позволяет антителу избирательно распознавать и специфически связывать эпитопы на антигенах. Это значит, что домен Уъ и домен Ун или подгруппа участков, определяющих комплементарность (СЭКъ) антитела, комбинируются с формированием вариабельной области, которая определяет трехмерный центр связывания антигена. Данная четвертичная структура антитела образует центр связывания антигена, присутствующий на конце каждого плеча Υ. Более детально центр связывания антигена определен тремя СЭК5 на каждой из Ун- и Уъ-цепей. В ряде случаев, например в случае некоторых молекул иммуноглобулина, выделенных у видов верблюжьих или сконструированных на основе иммуноглобулинов верблюжьих, полная молекула иммуноглобулина может состоять только из тяжелых цепей при отсутствии легких цепей; см., например, статью Иатсш-СаЧсппап с! а1., \а1игс 363:446-448 (1993).
В природных антителах шесть участков, определяющих комплементарность или СЭРУ, присутствующие в каждом антигенсвязывающем домене, представляют собой короткие не прилегающие друг к другу последовательности аминокислот, которые специфически расположены с образованием антигенсвязывающего домена, когда антитело принимает свою трехмерную конфигурацию в водной среде. Остальные аминокислоты в антигенсвязывающих доменах, называемых скелетными участками, демонстрируют меньшую межмолекулярную вариабельность. Скелетные участки в большой степени принимают конформацию бета-складки и СЭК образуют петли, которые связаны и в ряде случаев образуют часть структуры бета-складки. Таким образом, скелетные участки действуют с образованием основы, которая обеспечивает расположение СЭК в правильной ориентации посредством межцепочечных нековалентных взаимодействий. Антигенсвязывающий домен, сформированный расположенными в определенных положениях СЭКх определяет поверхность, комплементарную эпитопу на иммунореактивном антигене. Данная комплементарная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела с его родственным эпитопом. Обычный специалист в области техники может легко идентифицировать аминокислоты, включающие СЭК и скелетные участки соответственно для заданной вариабельной области тяжелой или легкой цепи, поскольку они точно определены (см. работы §сс.|испсс5 о£ РгоЮиъ о£ 1ттиио1од1са1 бЦсгсЧ (Последовательности белков, представляющих иммунологический интерес) КаЬаб Е., с! а1., и.§. Эсраг1тсп1 о£ нсаИЪ апб Человеческий §сгуюс8, (1983) и СНобиа апб Ьскк, 1. Мо1. ΒίοΙ., 796:901-917 (1987), которые включены в данном контексте в виде ссылки во всей своей полноте).
В случае, когда имеются два или более определений термина, который используют и/или применяют в области техники, определение термина, как используют в данном контексте, предусматривает включение всех данных значений, пока специально не установлено обратное. Специальным примером является использование термина участок, определяющий комплементарность (СЭК) для описания неродственных центров комбинирования антигена, обнаруженных в вариабельной области полипептидов обеих, тяжелой и легкой цепей. Данный конкретный участок описан в работе КаЬа! с! а1., и.§. Эср1. о£ нсаНЪ апб Человеческий §сгуюс8, §сс.|испсс5 о£ Рго1сш8 о£ 1ттипо1одюа1 1п1сгс81 (Последовательности белков, представляющих иммунологический интерес) (1983) и СНобиа с! а1., ί. Мо1. Вю1. 196:901-917 (1987), которые включены в данном контексте в виде ссылки, где определения включают перекрывания подгрупп остатков аминокислот при сравнении друг с другом. Тем не менее, предусматривают, что применение каждого из определений для обозначения СЭК антитела или его вариантов входит в объем тер- 7 020508 мина, как определяют и используют в данном контексте. Соответствующие остатки аминокислот, которые охватывают СБКз, как определено каждой из вышеприведенных ссылок, представлены ниже в табл. 1 для сравнения. Точные номера остатков, которые охватывают определенный СБК, будут варьировать в зависимости от последовательности и размера СБК. Компетентные специалисты в области техники могут рутинно определить, какие остатки включают конкретный СБК заданной последовательности аминокислот вариабельной области антитела.
Таблица 1
Определения СБК
КаЬа1 СГю1Ыа
νΗ СНП1 31-35 26-32
νΗ СОВ2 50-65 52-58
νΗ СОКЗ 95-102 95-102
УкСОВ1 24-34 26-32
Уи СЭВ2 50-56 50-52
Ук сэвз 89-97 91-96
1 Нумерация всех определений СБК в табл. 1 дана в соответствии с условиями нумерации, приведенными в работе КаЬа! е! а1. (см. ниже).
КаЬа! е! а1. определили также систему нумерации последовательностей вариабельного домена, которая применима для любого антитела. Обычный специалист в области техники может однозначно применить данную систему нумерации по КаЬа! в отношении последовательности любого вариабельного домена вне зависимости от экспериментальных данных, не относящихся к самой последовательности. Как используют в данном контексте, термин нумерация по КаЬа! относится к системе нумерации, предложенной в работе КаЬа! е! а1., и.8. Бер!. οί НеаНГ апб Человеческий 8егу1сез, 8ециепсез οί Рго!етз οί 1ттипо1о§1са1 1п!егез! (Последовательности белков, представляющих иммунологический интерес) (1983). Пока не указано иначе, ссылки на нумерацию специфических положений остатков аминокислот в антителе к 8р35 или его антигенсвязывающем фрагменте, варианте или производном, соответствующим настоящему изобретению, соответствуют системе нумерации, предложенной КаЬа!.
У видов верблюжьих вариабельная область тяжелой цепи, обозначаемая УНН, формирует полный антигенсвязывающий домен. Главные отличия между вариабельными областями УНН верблюжьих и теми, которые выделены из традиционных антител (Ун), включают (а) более гидрофобные аминокислоты в поверхности контакта легкой цепи УН по сравнению с соответствующим участком УНН, (Ь) более длинный СБК3 в УНН и (с) частое присутствие дисульфидной связи между СБК1 и СБК3 в УНН.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, поликлональные, моноклональные, мультиспецифические, человеческие, гуманизированные, приматизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитопсвязывающие фрагменты, например ТаЬ, РаЬ' и Р(аЬ')2, Тб, Туз, одноцепочечные Туз (зсРу), одноцепочечные антитела, дисульфид-связанные Туз (збРу), фрагменты, включающие либо УЕ-, либо УН-домен, фрагменты, продуцируемые библиотекой, экспрессирующей РаЬ и антиидиотипические (анти-1б) антитела (включая, например, анти-1б антитела к антителам к 8р35, описанным в данном контексте). Молекулы 8сРу известны в области техники и описаны, например, в патенте США 5892019. Молекулы иммуноглобулина или антитела, соответствующие изобретению, могут быть любого типа (например, 1§С, 1§Е, 1§М, 1§Б, 1§Л и Ι§Υ), класса (например, 1§С1, 1§С2, 1§С3, 1§С4, 1§Л1 и 1§А2) или подкласса молекулы иммуноглобулина.
Фрагменты антитела, в том числе одноцепочечные антитела, могут включать вариабельную область(и) одну или в сочетании с полным набором или частью следующих элементов: шарнирная область, домены СН1, СН2 и СН3. Кроме того, в изобретение включены антигенсвязывающие фрагменты, также включающие любую комбинацию вариабельной области(ей) с шарнирной областью, доменами СН1, СН2 и СН3. Антитела или их иммуноспецифические фрагменты, предназначенные для использования в диагностических и терапевтических способах, описанных в данном контексте, могут быть любого животного происхождения, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно, когда антитела представляют собой человеческие, мышиные, ослиные, кроличьи, козьи, морской свинки, верблюжьи, ламы, лошадиные или куриные антитела. В другом варианте осуществления вариабельная область может происходить из хрящевых рыб (например, из акул). Как используют в данном контексте, человеческие антитела включают антитела, имеющие последовательность аминокислот человеческого иммуноглобулина, и включают антитела, выделенные из библиотек человеческого иммуноглобулина или у животных, трансгенных по одному или более человеческим иммуноглобулинам и не экспрессирующих эндогенные иммуноглобулины,
- 8 020508 как описано ниже и, например, в патенте США № 5939598, выданном КисЬег1арай с1 а1.
Как используют в данном контексте, термин часть тяжелой цепи включает последовательности аминокислот, выделенные из тяжелой цепи иммуноглобулина. Полипептид, содержащий часть тяжелой цепи, включает по меньшей мере один элемент из домена Сн1, шарнирного (например, верхнего, среднего и/или нижнего шарнирного участка) домена, домена Сн2, домена Сн3 или его варианта либо фрагмента. Например, связывающий полипептид, предназначенный для применения в изобретении, может включать полипептидную цепь, содержащую домен Сн1; полипептидную цепь, содержащую домен Сн1, по меньшей мере часть шарнирного домена и домен Сн2; полипептидную цепь, содержащую домен Сн1 и домен Сн3; полипептидную цепь, содержащую домен Сн1, по меньшей мере часть шарнирного домена и домен Сн3 или полипептидную цепь, содержащую домен Сн1, по меньшей мере часть шарнирного домена, домен Сн2 и домен Сн3. В другом варианте осуществления полипептид, соответствующий изобретению, включает полипептидную цепь, содержащую домен Сн3. Кроме того, в связывающем полипептиде, предназначенном для использования в изобретении, может отсутствовать по меньшей мере часть домена Сн2 (например, весь или часть домена Сн2). Как представлено выше, обычный специалист в области техники будет иметь в виду, что данные домены (например, части тяжелой цепи) могут быть модифицированы так, что они отличаются по последовательности аминокислот от природной молекулы иммуноглобулина.
У ряда антитела к §р35 или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных, описанных в данном контексте, части тяжелых цепей полипептидной цепи мультимера идентичны данным частям на второй полипептидной цепи мультимера. Альтернативно, мономеры, содержащие часть тяжелой цепи, соответствующие изобретению, неидентичны. Например, каждый мономер может включать иной центр связывания мишени, образуя, например, биспецифическое антитело.
Части тяжелой цепи связывающего полипептида, предназначенного для использования в способах диагностики и лечения, описанных в данном контексте, могут быть выделены из различных молекул иммуноглобулина. Например, часть тяжелой цепи полипептида может включать домен Сн1, выделенный из молекулы 1дО1, и шарнирную область, выделенную из молекулы 1дО3. В другом примере часть тяжелой цепи может включать шарнирную область, выделенную частично из молекулы 1дС1 и частично из молекулы 1дО3. В другом примере часть тяжелой цепи может включать химерный шарнир, выделенный частично из молекулы 1§О1 и частично из молекулы 1дО4.
Как используют в данном контексте, термин часть легкой цепи включает последовательности аминокислот, выделенные из легкой цепи иммуноглобулина. Предпочтительно, когда часть легкой цепи включает по меньшей мере один из доменов Уь или Сь.
Антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, представленные в данном контексте, можно описать или определить в терминах эпитопа(ов) или части(ей) антигена, например полипептида-мишени (§р35), который они распознают или специфически связывают. Часть полипептида-мишени, которая специфически взаимодействует с антигенсвязывающим доменом антитела, представляет собой эпитоп или антигенную детерминанту. Полипептид-мишень может включать один эпитоп, но, как правило, включает по меньшей мере два эпитопа и может включать любое число эпитопов в зависимости от размера, конформации и типа антигена. Более того, следует отметить, что эпитоп на полипептиде-мишени может представлять собой или включать неполипептидные элементы, например эпитоп может включать углеводную боковую цепь.
Минимальный размер пептидного или полипептидного эпитопа для антитела, как считают, составляет приблизительно от четырех до пяти аминокислот. Предпочтительно, когда пептидный или полипептидный эпитопы содержат по меньшей мере семь, более предпочтительно по меньшей мере девять и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно от 15 до приблизительно 30 аминокислот. Поскольку СЭК может распознавать антигенный пептид или полипептид в его третичной форме, аминокислоты, включающие эпитоп, не обязательно должны следовать друг за другом и в ряде случаев могут даже не располагаться на одной и той же пептидной цепи.
В настоящем изобретении пептидный или полипептидный эпитоп, распознаваемый антителами к 8р35, соответствующими настоящему изобретению, включает последовательность из по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, более предпочтительно из по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или от приблизительно 15 до приблизительно 30 следующих друг за другом или не следующих друг за другом аминокислот §р35.
Под выражением специфически связывает обычно подразумевают, что антитело связывается в эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена и что связывание обусловливает некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. Согласно данному определению, говорят, что антитело специфически связывается с эпитопом, когда оно связывается с данным эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена легче, чем оно связывалось бы со случайным неродственным эпитопом. Термин специфичность используют в данном контексте для определения относительной аффинности, с которой некоторое антитело связывается с некоторым эпитопом. Например, можно считать, что антитело А имеет более высокую специфичность в отношении заданного эпитопа,
- 9 020508 чем антитело В, или можно сказать, что антитело А связывается с эпитопом С с более высокой специфичностью, чем оно имеет в отношении родственного эпитопа Ό.
Выражение предпочтительно связывает означает, что антитело специфически связывается с эпитопом легче, чем оно связывалось бы с родственным, подобным, гомологичным или аналогичным эпитопом. Таким образом, антитело, которое предпочтительно связывается с данным эпитопом, с большей вероятностью связывалось бы с данным эпитопом, чем с родственным эпитопом, даже если данное антитело может перекрестно реагировать с родственным эпитопом.
В качестве неограничивающего примера можно считать, что антитело связывает первый эпитоп предпочтительно, если оно связывает указанный первый эпитоп с константой диссоциации (Кс), которая меньше, чем К антитела в отношении второго эпитопа. В другом неограничивающем примере можно считать, что антитело связывает первый антиген предпочтительно, если оно связывает первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на один порядок величины меньше, чем К антитела в отношении второго эпитопа. В другом неограничивающем примере можно считать, что антитело связывает первый эпитоп предпочтительно, если оно связывает первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на два порядка величины меньше, чем К антитела Кс в отношении второго эпитопа.
В другом неограничивающем примере можно считать, что антитело связывает первый эпитоп предпочтительно, если оно связывает первый эпитоп со скоростью диссоциации (к(оГГ)), которая ниже, чем к(оГГ) антитела в отношении второго эпитопа, в другом неограничивающем примере можно считать, что антитело связывает первый эпитоп предпочтительно, если оно связывает первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на один порядок величины меньше, чем к(оГГ) антитела в отношении второго эпитопа. В другом неограничивающем примере можно считать, что антитело связывает первый эпитоп предпочтительно, если оно связывает первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на два порядка величины меньше, чем к(оГГ) антитела в отношении второго эпитопа.
Можно говорить, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, описанные в данном контексте, связывают полипептид-мишень, описанный в данном контексте, либо его фрагмент или вариант со скоростью диссоциации (к(оГГ)) меньше чем или равной 5х10-2 с-1, 10-2 с-1, 5х10-3 с-1 или 10-3 с-1. Более предпочтительно, когда можно считать, что антитело, соответствующее изобретению, связывает полипептид-мишень, описанный в данном контексте, или его фрагмент либо вариант со скоростью диссоциации (к(оГГ)) меньше чем или равной 5х10-4 с-1, 10-4 с-1, 5х10-5 с-1 или 10-5 с-1, 5х10-6 с-1, 10-6 с-1, 5х10-7 с-1 или 10-7 с-1.
Можно говорить, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, описанные в данном контексте, связывают полипептид-мишень, описанный в данном контексте, либо его фрагмент или вариант со скоростью ассоциации (к(оп)) больше чем или равной 103 М-1 с-1, 5х103 М-1 с-1, 104 М-1 с-1 или 5х104 М-1 с-1. Более предпочтительно, когда можно считать, что антитело, соответствующее изобретению, связывает полипептид-мишень, описанный в данном контексте, или его фрагмент либо 10 6 М-1 с вариант со скоростью ассоциации (к(оп)) больше чем или равной 105 М-1 с-1, 5х105 М-1 с-
5х106 М-1 с-1 или 107 М-1 с-1.
Говорят, что антитело конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела с заданным эпитопом, если оно предпочтительно связывается с эпитопом в той степени, что оно блокирует до некоторой степени связывание эталонного антитела с эпитопом. Конкурентное ингибирование можно определить способом, известным в области техники, например конкурентными анализами ЕЫ§А. Можно сказать, что антитело конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела с заданным эпитопом по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 50%.
Как используют в данном контексте, термин аффинность относится к мере силы связывания отдельного эпитопа с СЭЕ молекулы иммуноглобулина; см., например, монографию Наг1о\у с1 а1., АпйЫШез: А Б-аЬогаЮгу Мапиа1 (Лабораторное руководство по антителам), (Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота1оту Рте88, 2-е изд., 1988), с. 27-28. Как используют в данном контексте, термин авидность относится к общей стабильности комплекса между популяцией иммуноглобулинов и антигеном, т.е. силе функционального комбинирования смеси иммуноглобулинов с антигеном; см., например, монографию Наг1о\у, с. 29-34. Авидность связана с обеими, аффинностью молекул отдельных иммуноглобулинов в популяции со специфическими эпитопами, а также с валентностями иммуноглобулинов и антигена. Например, взаимодействие между бивалентным моноклональным антителом и антигеном со структурой эпитопа с высокой частотой повторов, такой как полимер, была бы высокоавидной.
Антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно также описать или определить в терминах их перекрестной реактивности. Как используют в данном контексте, термин перекрестная реактивность относится к способности антитела, специфического в отношении одного антигена, реагировать со вторым антигеном; мере родства двух различных антигенных субстанций. Таким образом, антитело является перекрестно реактивным, если оно связывается в эпитопом, отличным от того, который индуцировал его образование. Перекрестно реактивный эпитоп, как правило, включает много одинаковых комплементарных структурных признаков
- 10 020508 с индуцирующим эпитопом и в ряде случаев может действительно подходить больше, чем исходный.
Например, некоторые антитела имеют некоторую степень перекрестной реактивности в том, что они связывают родственные, но неидентичные эпитопы, например эпитопы с по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% и по меньшей мере 50% идентичностью (как рассчитано с использованием способов, известных в области техники и описанных в данном контексте) с эталонным эпитопом. Можно сказать, что антитело имеет низкую или не имеет перекрестной реактивности, если он не связывает эпитопы с меньше чем 95%, меньше чем 90%, меньше чем 85%, меньше чем 80%, меньше чем 75%, меньше чем 70%, меньше чем 65%, меньше чем 60%, меньше чем 55% и меньше чем 50% идентичностью (как рассчитано с использованием способов, известных в области техники и описанных в данном контексте) с эталонным эпитопом. Можно считать, что антитело высокоспецифично в отношении определенного эпитопа, если оно не связывает никакой другой аналог, ортолог или гомолог данного эпитопа.
Антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно также описать или определить в терминах из аффинности связывания с полипептидом, соответствующим изобретению. Предпочтительные аффинности связывания включают имеющие константу диссоциации или Кб меньше чем 5х10-2 М, 10-2 М, 5х10-3 М, 10-3 М, 5х10-4 М, 10-4 М, 5х10-5 М, 10-5 М, 5х10-6 М, 10-6 М, 5х10-7 М, 10-7 М, 5х10-8 М, 10-8 М, 5х10-9 М, 10-9 М, 5х10-10 М, 10-10 М, 5х10-11 М, 10-11 М, 5х10-12 М, 10-12 М, 5х10-13 М, 10-13 М, 5х10-14 М, 10-14 М, 5х10-15 М или 10-15 М.
Антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, могут быть мультиспецифическими, например биспецифическими, триспецифическими или большей мультиспецифичности, означающей, что они распознают и связываются с двумя или более различными эпитопами, присутствующими на одном или более антигенов (например, белков) в одно и то же время. Таким образом, вопрос, является ли антитело к §р35 моноспецифическим или мультиспецифическим, например биспецифическим, относится к числу различных эпитопов, с которыми реагирует связывающий полипептид. Мультиспецифические антитела могут быть специфическими в отношении различных эпитопов полипептида-мишени, описанного в данном контексте, или может быть специфическим в отношении полипептида-мишени, а также в отношении гетерологичного эпитопа, такого как гетерологичный полипептид или материал твердой основы.
Как используют в данном контексте термин валентность относится к числу потенциальных связывающих доменов, например антигенсвязывающих доменов, присутствующих в антителе к §р35, связывающем полипептиде или антителе. Каждый связывающий домен специфически связывает один эпитоп. Когда антитело к §р35, связывающий полипептид или антитело включает больше чем один связывающий домен, то каждый связывающий домен может специфически связывать один и тот же эпитоп у антитела с двумя связывающими доменами, называемого двухвалентным моноспецифическим или различные эпитопы у антитела с двумя связывающими доменами, называемого двухвалентным биспецифическим. Антитело может быть также биспецифическим и двухвалентным для каждой специфичности (называют биспецифическими тетравалентными антителами). В другом варианте осуществления могут быть получены тетравалентные минибоди или антитела с делецией доменов.
Биспецифические бивалентные антитела и способы их получения описаны, например, в патентах США №№ 5731168, 5807706, 5821333 и публикациях заявок США №№ 2003/020734 и 2002/0155537, описание всех из которых включено в данном контексте в виде ссылки. Биспецифические тетравалентные антитела и способы их получения описаны, например в νθ 02/096948 и νθ 00/44788, описания обоих из них включено в данном контексте в виде ссылки; см. в основном публикации РСТ νθ 93/17715, νθ 92/08802, νθ 91/00360, νθ 92/05793, статью ТиИ е1 а1., 1. 1ттипо1., 147:60-69 (1991), патенты США №№ 4474893, 4714681, 4925648, 5573920, 5601819, статью Ко§1е1пу е1 а1., 1. 1ттипо1., 745:1547-1553 (1992).
Как указано ранее, структуры субъединиц и трехмерная конфигурация константных областей иммуноглобулинов различных классов хорошо известны. Как используют в данном контексте, термин Ундомен включает аминоконцевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и термин Сн1домен включает первый (наиболее близкий к аминоконцу) домен константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Сн1-домен прилегает к Ун-домену и является аминоконцом шарнирной области молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина.
Как используют в данном контексте, термин Сн2-домен включает часть молекулы тяжелой цепи, которая располагается, например, от приблизительно остатка 244 до остатка 360 антитела при использовании принятых схем нумерации (остатки 244-360, система нумерации КаЬа1 и остатки 231-340, система нумерации ЕЙ; см. работу КаЬа1 Е.А. е1 а1. выше). Домен Сн2 уникален, поскольку он не является тесно спаренным с другим доменом. Точнее две Ν-связанных разветвленных углеводных цепи находятся между двумя доменами Сн2 интактной нативной молекулы 1дС. Кроме того, хорошо документировано, что домен Сн3 располагается от домена Сн2 к С-концу молекулы 1дС и включает приблизительно 108 остатков.
- 11 020508
Как используют в данном контексте, термин шарнирная область включает часть молекулы тяжелой цепи, которая связывает домен СН1 с доменом Сн2. Данный шарнирный участок включает приблизительно 25 остатков и является гибким, позволяя, таким образом, двум Ν-концевым антигенсвязывающим участкам двигаться независимо. Шарнирные области можно подразделить на три отдельных домена: верхний, средний и нижний шарнирные домены (см. статью Коих с1 а1., 1. 1ттипо1. 767:4083 (1998)).
Как используют в данном контексте, термин дисульфидная связь включает ковалентную связь, образованную между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин включает тиоловую группу, которая может формировать дисульфидную связь или мостик со второй тиоловой группой. В большинстве природных молекул 1§О участки СН1 и Сь связаны дисульфидной связью и две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих 239 и 242, используя систему нумерации КаЬа! (положение 226 или 229, система нумерации ЕЙ).
Как используют в данном контексте, термин химерное антитело будут вводить для обозначения любого антитела, в котором иммунореактивный участок или центр получают или выделяют из первого вида и константную область (которая может быть интактной, частичной или модифицированной в соответствии с изобретением) получают из второго вида. В предпочтительных вариантах осуществления целевой связывающий участок или центр будут из нечеловеческого источника (например, мыши или примата) и константная область - человеческая.
Как используют в данном контексте, термин инженерное антитело относится к антителу, в котором вариабельный домен либо в тяжелой, либо в легкой цепи, либо в обеих изменен путем, по меньшей мере, частичной замены одного или более СГОК из антитела известной специфичности и, при необходимости, путем частичной замены скелетной области и изменения последовательности. Хотя СГОК можно выделить из антитела того же класса или даже подкласса, что антитело, из которого получают скелетные области, предусматривают, что СГОК будут выделены из антитела другого класса и предпочтительно из антитела, полученного из другого вида. Инженерное антитело, в котором один или более донорных СИК из нечеловеческого антитела известной специфичности привиты в человеческую скелетную область тяжелой или легкой цепи, называют в данном контексте гуманизированным антителом. Может быть необязательной замена всех СИК полными СИК из вариабельной области донора с целью переноса антигенсвязывающей способности одного вариабельного домена на другой. Напротив, может быть необходимым только перенести те остатки, которые требуются для поддержания активности связывающего центра-мишени. При наличии объяснений, приведенных, например, в патентах США №№ 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370, вполне в компетенции специалистов в области техники будет либо осуществление рутинных экспериментов, либо тестирование методов проб и ошибок с целью получения функционального инженерного или гуманизированного антитела.
Как используют в данном контексте, термин правильно уложенный полипептид включает полипептиды (например, антитела к §р35), в которых все из функциональных доменов, содержащих полипептид, являются несомненно активными. Как используют в данном контексте, термин неправильно уложенный полипептид включает полипептиды, в которых по меньшей мере один из функциональных доменов полипептида неактивен, в одном варианте осуществления правильно уложенный полипептид содержит полипептидные цепи, связанные по меньшей мере одним дисульфидным мостиком и, напротив, неправильно уложенный полипептид содержит полипептидные цепи, не связанные по меньшей мере одним дисульфидным мостиком.
Как используют в данном контексте, термин инженерный включает манипуляцию с молекулами нуклеиновой кислоты или полипептида синтетическими средствами (например, рекомбинантными технологиями, синтезом пептидов ίη νίίτο, ферментным или химическим связыванием пептидов или какойлибо комбинацией данных способов).
Как используют в данном контексте, термины связанный, слитый или слияние используют взаимозаменяемо. Данные термины относятся к соединению двух или более элементов или компонентов какими-либо средствами, включая химическое конъюгирование или рекомбинантные средства. Слияние в рамке считывания относится к соединению двух или более открытых рамок считывания (ОКЕк) полинуклеотидов с образованием непрерывной более длинной ОКЕ таким образом, что поддерживается правильная трансляционная рамка считывания исходной ОКЕк. Таким образом, рекомбинантный слитый белок представляет собой один белок, содержащий два или более сегментов, которые соответствуют полипептидам, кодируемым исходными ОКЕк (данные сегменты в норме не связаны в естественных условиях). Хотя рамка считывания, таким образом, становится непрерывной на протяжении слитых сегментов, сегменты могут быть физически или пространственно разделены, например, находящейся в рамке считывания линкерной последовательностью. Например, полинуклеотиды, кодирующие СИК вариабельной области иммуноглобулина, могут быть слиты в рамке считывания, но разделены полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одну скелетную область иммуноглобулина или дополнительные области СИК так долго, как слитые СИК сотранслируются как часть непрерывного полипептида.
В контексте полипептидов линейная последовательность или последовательность представляет собой порядок аминокислот в полипептиде в направлении от амино- до карбоксильного конца, где остатки, которые прилегают друг к другу в последовательности, следуют друг за другом в первичной структу- 12 020508 ре полипептида.
Термин экспрессия, как используют в данном контексте, относится к процессу, посредством которого ген образует биохимический продукт, например РНК или полипептид. Процесс включает любое проявление функционального присутствия гена в клетке, включая, без ограничения перечисленным, выбивание гена, а также как временную экспрессию, так и стабильную экспрессию. Он включает, без ограничения перечисленным, транскрипцию гена в информационную РНК (т-РНК), транспортную РНК (ΐРНК), маленькую шпилечную РНК (8Й-РНК), маленькую интерферирующую РНК (δί-РНК) или любой другой продукт РНК, и трансляцию данной т-РНК в полипептид(ы). Если конечный требуемый продукт является биохимическим, экспрессия включает создание данного биохимического продукта и любых предшественников. Экспрессия гена дает продукт гена. Как используют в данном контексте, продукт гена может представлять собой либо нуклеиновую кислоту, например информационную РНК, продуцируемую путем транскрипции гена, либо полипептид, который транслируется с транскрипта. Продукты гена, описанные в данном контексте, далее включают нуклеиновые кислоты с пост-транскрипционными модификациями, например полиаденилированием, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например метилированием, гликозилированием, введением липидов, связыванием с другими белковыми субъединицами, протеолитическим расщеплением и т.п.
Как используют в данном контексте, термины лечить или лечение относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим и предупредительным мерам, в которых целью является предупредить или замедлить (уменьшить) нежелательное физиологическое изменение или нарушение, такое как развитие рассеянного склероза. Благоприятные или желательные клинические результаты включают, но без ограничения перечисленным, облегчение симптомов, снижение уровня заболевания, стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) состояние болезни, задержку или замедление развития болезни, улучшение или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию (либо частичную, либо полную), либо определяемую, либо неопределяемую. Лечение может также означать увеличение периода жизни по сравнению с ожидаемым периодом жизни без получения лечения. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже имеет состояние или нарушение, а также тех, кто предрасположен к тому, чтобы иметь состояние или нарушение, или тех, которым необходимо предупреждение развития состояния или нарушения.
Под субъектом, или лицом, или животным, или пациентом, или млекопитающим подразумевают любого субъекта, особенно субъекта-млекопитающего, которому требуется диагноз, прогноз или лечение. Субъекты-млекопитающие включают человека, домашних животных, сельскохозяйственных животных, животных из зоопарка, спортивных или животных-компаньонов, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы и т.п.
Как используют в данном контексте, такие выражения, как субъект, на которого оказало бы благоприятное воздействие введение антитела к 8р35 и животное, нуждающееся в лечении, включают таких субъектов, как субъекты-млекопитающие, на которых оказало бы благоприятное воздействие введение антитела к 8р35, используемого, например, для детекции полипептида 8р35 (например, для способа диагностики) и/или лечение, т.е. временное облегчение или предупреждение заболевания, такого как М8, с помощью антитела к 8р35. Как описано более детально в данном контексте, антитело к 8р35 можно использовать в неконъюгированной форме или оно может быть конъюгированным, например, с лекарственным препаратом, пролекарственной формой или изотопом.
II. 8р35.
Природный человеческий 8р35 (8р35) представляет собой гликозилированный специфический для центральной нервной системы белок, который, как предсказывают, имеет 614 аминокислот (8Еф ГО N0:2), включая 33 аминокислоты сигнальной последовательности. 8р35 также известен в области техники под названиями ΜΝΟ0-Ι, ЬККШ, ΕΡΚΝ6Α, РИ14594, ЬЕКМ, МОС17422 и υΝφ201. Человеческий полипептид 8р35 полной длины дикого типа содержит домен ЬРК, состоящий из 14 богатых лейцином повторов (включая Ν- и С-концевые кэпы), домен Ι§, трансмембранный домен и цитоплазматический домен. Цитоплазматический домен содержит канонический тирозиновый центр фосфорилирования. Кроме того, природный белок 8р35 содержит сигнальную последовательность, короткий основной участок между ЬККСТ и доменом Ι§ и трансмембранный участок между доменом Ι§ и цитоплазматическим доменом. Человеческий ген 8р35 (8Еф ГО N0:1) содержит альтернативные кодоны инициации трансляции, поэтому шесть дополнительных аминокислот, т.е. МЦУ8КК (8Еф ГО N0:3) могут присутствовать или не присутствовать на Ν-конце сигнальной последовательности 8р35. В табл. 2 перечисляют домены и другие участки 8р35 согласно номерам аминокислотных остатков на основе последовательности аминокислот 8р35, присутствующей в данном контексте как 8Еф ГО Ν0:2. Полипептид 8р35 характеризуют более детально в публикации РСТ № №0 2004/085648, которая включена в данном контексте в виде ссылки во всей своей полноте.
- 13 020508
Таблица 2
Домены 8р35
Домен или участок Начальный остаток Конечный остаток
Сигнальная 1 33 или 35
последовательность
Ι.ΒΒΝΤ 34 или 36 64
1_ВВ 66 89
Домен или участок Начальный остаток Конечный остаток
ьвв 90 113
1_ВВ 114 137
1_ВВ 138 161
1_ВВ 162 185
1_ВВ 186 209
1_ВВ 210 233
Ι_ΒΒ 234 257
1_ВВ 258 281
1_ВВ 282 305
1_ВВ 306 329
кВ в 330 353
1_ВВСТ 363 414 или 416
Основной 415 или 417 424
|д 419 493
Соединяющая 494 551
последовательность
Трансмембранный 552 576
Цитоплазматический 577 614
Распределение в ткани и связанную с развитием экспрессию 8р35 изучают на человеке и крысах. Биология 8р35 изучена на экспериментальной модели на животных (крысах). Экспрессия крысиного 8р35 локализована в нейронах и олигодендроцитах, как определено нозерн-блотом и иммуногистохимическим окрашиванием. Уровень экспрессии мРНК крысиного 8р35 регулируется стадией развития, имея максимальное значение после рождения, т.е. примерно в первый день после рождения. На модели повреждения в поперечном сечении спинного мозга крысы 8р35 регулируется повышающим образом в области повреждения, как определено с помощью ОТ-ПЦР (полимеразной цепной реакции с участием обратной транскриптазы); см. статью Μι еί а1. №Шге №иго§ет 7:221-228 (2004).
В контексте аминокислот, содержащих различные структурные и функциональные домены полипептида полипептид 8р35, термин приблизительно включает, в частности, представленное значение и значения, которые больше или меньше на несколько (например, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1) аминокислот. Хотя положение данных доменов, как перечислено в табл. 1, предсказано с помощью компьютерной графики, обычный специалист должен иметь в виду, что остатки аминокислот, составляющие домены, могут немного отличаться (например, приблизительно на 1-15 остатков) в зависимости от критерия, ис- 14 020508 пользуемого для определения домена.
Авторы обнаружили, что 8р35 полной длины дикого типа связывается с Ν^Κί; см. публикацию РСТ № ЖЭ 2004/085648. Авторы обнаружили также, что 8р35 экспрессируется в олигодендроцитах и что белок 8р35 включен в регуляцию олигодендроцит-опосредованной миелинизации аксонов; см. патентную публикацию США № 2006/0009388 А1, которая включена в данном контексте в виде ссылки во всей своей полноте.
Нуклеотидная последовательность для молекулы 8р35 полной длины представляет собой следующую:
АТОСТСССОСССССССТСАССАОСАТССССАССССССТССТССССТССТСССАССССАТССТСС
ТССТССТССТССССТСАОТССТОТСАСССТСССССАСССССТСССССССССОСТОССАСТССТС
СеСССАСбАССССССТСТССТСТСССАССССААССССТТТСТеССАСТСССССАССССАТСССС
АСССАСАССССССТССТССАССТАСССААСААССССАТСААААСССТСААССАССАССАСТТСС
ССАССТТСССССАССТббАССАОСТеСАеСТСААССАбААСАТССТСАССбСССТССАСССССС
ССССТТСААСААССТСТТСААССТССбСАСССТббСТСТССССАеСААССбССТбААССТСАТС
ССССТАбеСбТСТТСАСТееССТСАеСААССТСАССААбСТСеАСАТСАеСбАСААСААбАТТб
ТТАТССТеСТееАСТАСАТеТТТСАееАССТбТАСААССТСААСТСАСТСеАСбТТебССАСАА теАсстсетстАСАтстстсАссесбссттсАесб(зсстсААСАесстееАесАестбАсесте
САСАААТССААССТОАССТССАТССССАСССАООСОСТОТСССАССТССАСООССТСАТСОТСС
ТСАОССТСССССАССТСААСАТСААТСССАТССОССАСТАСТССТТСААСАСССТСТАСССАСТ
СААСОТСТТСеАСАТСТСССАСТСССССТАСТТеСАСАССАТеАСАСССААСТеССТСТАССОС
СТСААССТбАСеТСССТеТССАТСАСАСАСТбСААТСТбАССССТСТССССТАССТееССбТСС еССАССТАСТСТАТСТССССТТССТСААССТСТССТАСААССССАТСАбСАССАТТСАбееСТС
САТсттссАТСАССтсстссссстссАесАСАтссАбстсстссбсссссАССтеессетеете бАеСССТАТбССТТССесееССТСААСТАССТССССеТбСТСААТСТСТСТСССААССАССТСА
ССАСАСТССАССААТСАСТСТТССАСТСеетееССААССТСеАСАСАСТСАТССТеСАСТССАА сссестсбсстссеАстетсссстсстстееететтсссссссссстессесстсААСттсААС ссссАесАесссАСбтесессАСОссссАСтттетссАееесААееАсттсААееАСттсссте
АтетсстАСтесссААСТАСттсАСстессессосесссесАтссеееАссесААеесссАесА сетстттетбеАсеАееоссАСАсеетесАотттбтетесссессссАтеесеАссссссессс ессАтсстстесстстсАссссеАААбСАСстббтстсАессААеАбСААТбеесеестсАСАе
ТСТТСССТСАТСССАСеСТСеАССТССеСТАСеСССАССТАСАССАСААССССАСеТАССТСТе
САТСССССССААСССеСССееСААССАСТССАТССССеСССАССТССАТСТеСОСАССТАСТСе
СССбАСТСеССССАТСАССССААСААеАССТТСССТТТСАТСТССААССАССССеесеАСЗОеАС
АееССААСАССАСССбСеССАСТбТеССТТТССССТТСбАСАТСААеАСССТСАТСАТСеССАС
САссАтесесттсАТСтстттсстсеесетсбтсстсттстесстбетестестетттстстсс
АССС0ССССААССССААСАСАААССАСААСАТССА6АТССАСТАТСТ0СССССААА0ТС60АС0
САСОСАТСАССТССССССАСОССССССССААСТТСААСАТСААСАТСАТАТОА (ЗЕО Ю N0:1).
Полипептидная последовательность для полипептида 8р35 полной длины представляет собой следующую:
М1_АСО\/Р5МРЗР1-1_АС7\/С1Р1Ш_\/1-С5\/1_5С5АТССРРРСЕС5АС1ОВА\/1_СНВКВР\/А\/РЕС1Р
ΤΕΤΚΙ_Ι_0Ι_ΘΚΝΚΙΚΤΙ_Ν00ΕΡΑ5ΡΡΗΙ-ΕΕΙ_ΕΙ.ΝΕΝΐν5ΑνΕΡ0ΑΡΝΝΙ.ΡΝΙ_ΚΙΙ_ΘΙ_Κ5ΝΒΙ-ΚΙ.Ι
ΡΙθνΡΤΟΙ_5ΝΙ_ΤΚί.ΟΙ5ΕΝΚΙ\/ΙΙ_Ι_ΟΥΜΡΟΟΙ_ΥΝΙ_Κ3Ι_ΕνθΟΝΟΙ_\/ΥΙ3ΗΡΑΡ50Ι_Ν3Ι_ΕΟΙ_ΤΙ_
ΕΚΟΝΙΤ5ΙΡΤΕΑΙ-5ΗΙ.Η<3υνΐ_ΒΙΒΗΙ_ΝΙΝΑΙΒΟΥ3ΡΚΒΙ-ΥΚΙ_Κνΐ_ΕΙ5ΗννΡΥΙ-ΟΤΜΤΡΝΟΙ-ΥΟ
Ι-ΝΙ.Τ3Ι_3ΙΤΗ0ΝΙ_ΤΑνΡΥΙ_ΑνΒΗΙ-νΥΙΡΡΙ-ΝΙ_3ΥΝΡΙ3ΤΙΕΟ5ΜΙ-ΗΕΙΙ-ΡΙ_ΟΕΙΟΐν6ΘΟΙ_Ανν
ΕΡΥΑΡΡ01ΝΥΙΡνΐ_Νν50Ν0Ι_ΤΤΙ-ΕΕ3νΡΗ5ν0ΝΙ_ΕΤΙ-ΙΙ_03ΝΡΙ_Α000ΒΙ-ΐνννΡΒΡΡννΒΙ_ΝΡΝ
ΡΟΟΡΤΟΑΤΡΕΕνΟΟΚΕΡΚΟΡΡΟνίΙΡΝΥΡΤΟΡΡΑΒΙΡΟΒΚΑΟΟνΡνΟΕΟΗΤνΟΡνΟΡΑΟΘΟΡΡΡ
ΑΙΐννΐ5ΡΒΚΗΐν3ΑΚ3ΝΟΒ1ΤνΡΡΟΟΤΙ_ΕνΒΥΑθνθΟΝΟΤΥΙ-ΟΙΑΑΝΑΟΟΝ05ΜΡΑΗΙΗνΒ3Υ5
ΡθννΡΗΟΡΝΚΤΡΑΡΙ3ΝΟΡ6ΕΘΕΑΝ5ΤΡΑΤνΡΡΡΡΟΙΚΤυΐΑΤΤΜΘΡΙ5ΡΙ_Θννΐ-ΡΟΙ-νΐ_Ι-ΡΙ_νν 3ΡΘΚΟΝΤΚΗΝΙΕΙΕΥνΡΡΚ30ΑΟΙ35ΑΟΑΡΡΚΡΝΜΚΜΙ (ЗЕО Ю N0:2).
ΙΙΙ. Антитела к 8р35.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение направлено на антитела к 8р35 либо их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные. Например, настоящее изобретение включает, по меньшей мере, антигенсвязывающие домены ряда моноклональных антител и их фрагменты, варианты и производные, показанные в табл. 3А-3Е.
- 15 020508
В табл. 3А описывают участки полипептида 8р35, которые связываются рядом антител полной длины, выделенных из библиотеки на фагах. Данные антитела имеют те же самые вариабельные области, что фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1, как указано в табл. 3В (например, Ό05 в табл. 3А имеет такую же вариабельную область, как Ы05 в табл. 3В, Ό06 в табл. 3А имеет такую же вариабельную область, как Ы06 в табл. 3В, и т.д.). Антитела тестируют на связывание фрагментов 8р35, как определено в табл. 3А, используя способы, хорошо известные в области техники.
В табл. 3В-3Е описывают способность указанных моноклональных антител или фрагментов РаЬ выявлять 8р35 в различных анализах, таких как сортинг клеток по активации флуоресценции (РАС8), иммунопреципитация (ΙΡ), анализ вестерн-блоттинг, иммуногистохимия (ИГХ) и твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А). Детальные протоколы проведения данных анализов описаны в данном контексте или хорошо известны обычным специалистам в области техники. Полученные из гибридомы моноклональные антитела, перечисленные в табл. 3В и 3С, получают путем инъекции растворимого 8р35 мышам с последующим выделением с использованием гибридомного способа, который хорошо известен в области техники и описан в данном контексте. Моноклональные антитела и фрагменты РаЬ антител, перечисленные в табл. 3В, выделяют из двух различных библиотек представления на фагах с использованием способов, известных в уровне техники.
Таблица 3А
Фрагмент 5р35 003 (ПОЗ вариабельная область 005(Ы05 вариабельная область 006 (ϋ06 вариабельная область 008 (Ы08 вариабельная область 0011 (ЫОЗ вариабельная область 013 (ίϊ13 вариа- бельная область озз (изз вариа- бельная область
1-432 крысиный Рс + + + +
417-493 крысиный Рс +/- +/-
АР-Зр35 (1-419) НО* + -/+ -/+ НО НО НО
Фрагмент ооз (иоз 005(Ы05 006 (Ы06 008(Ы08 ООП (иоз 013 (ШЗ озз (изз
3р35 вариабель- вариабель- вариабель- вариабель- вариабель- вариа- вариа-
ная область ная область ная область ная область ная область бельная область бельная область
АР-5р35 (418-498) НО НО НО НО
417-498 Человеческ ий Рс
417-503 Человеческ ий Рс
Фрагмент ооз (иоз 005 (Ы05 006 (Ы06 008 (Ы08 ООП (иоз 013 (ШЗ озз (изз
5р35 вариабель- вариабель- вариабель- вариабель- вариабель- вариа- вариа-
ная область ная область ная область ная область ная область бельная область бельная область
363-498 Человеческ ий Рс
244-498 Человеческ ий Рс
* - не определяют.
- 16 020508
Моноклональные антитела, выделенные из гибридомы
Таблица 3 В
Моноклональные антитела к δρ35
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
Ки5р35 т5р35 зр35Р с Ьи5р35 гп5р35 КиВрЗ 5 Мышиный/кры синый зр35
201' Да Да Нет (мышиный или крысиный)
ЗАЗ + Нет Нет (мышиный или крысиный)
ЗА6 ++ +/- ++ +++ -/+ Нет Нет (мышиный или крысиный)
1А7 ++ ++ +++ -/+ Нет Нет (мышиный или крысиный)
Моноклональные антитела, выделенные из гибридомы
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
Ьи5р35 тЗрЗб зр35Р с КиЗрЗб т5р35 КиЗрЗ 5 Мышиный/кры синый зр35
1С7 ++ +/- ++ +++ + Нет Нет (мышиный или крысиный)
2В10 ++ +/- + +++ -/+ Нет Нет (мышиный или крысиный)
2С11 Нет Нет (мышиный или крысиный)
2РЗ +/- +/- +++ +++ Да Да со сверхэкспресси ей т5р35
Моноклональные антитела, выделенные из гибридомы
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
Ни5р35 т5р35 зр35Р Ьи5р35 т5р35 ЬиВрЗ Мышиный/кры
с 5 синый зр35
ЗР1В1.1Р9 +++
ЗРЮ10.2СЗ +++
3Ρ1Ε11.3Β7 +++
ЗР2С6. +++
ЗС10.2Н7
ЗР2С9.2С4 +++
ЗР4А6.Ю9 +++
3Ρ4ΑΙ.2Β9 +++
- 17 020508
Моноклональные антитела, выделенные из гибридомы
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
Ни5р35 т8р35 зр35Р НиЗрЗб т8р35 НиЗрЗ Мышиный/кры
с 5 синый зр35
ЗР4С2.2Э2 +++ +++
ЗР4С5.Ю8 +++
ЗР4С8.2С9 +++ +++ да Да (мышиный)
7РЮ5.1С9 + + +++ +++ Нет Нет (мышиный)
(АТСС: РТА-
8107)
1В6.4 +++ +++ +++ +++ Нет Нет (мышиный)
(верхняя (нижняя
полоса) полоса)
Моноклональные антитела, выделенные из гибридомы
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
НиЗрЗб т8р35 зр35Р НиЗрЗб т8р35 НиЗрЗ Мышиный/кры
с 5 синый зр35
2С7.2 +++ +++ +++ +++ Нет Нет (мышиный)
(верхняя (НИЖНЯЯ
полоса) полоса)
2ϋ6.Ι ++ ++ Нет Нет (мышиный)
(связывается с (связывается
клетками 293) с клетками
293)
Моноклональные антитела, выделенные из гибридомы
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
Ни5р35 т8р35 зр35Р с Ни5р35 т3р35 НиЗрЗ 5 Мышиный/кры синый зр35
2Р7.3 ++ ++ +++ (нижняя полоса) +++ (нижняя полоса) Да Да (мышиный)
2Н3.2 ++ ++ +++ (нижняя полоса) +++ (нижняя полоса) Да Да (мышиный)
ЗС11.1 ++ ++ +++ (нижняя полоса) +++ (нижняя полоса) Да Да (мышиный)
Моноклональные антитела, выделенные из гибридомы
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
НиЗрЗб т3р35 зр35Р с НиЗрЗб т3р35 НиЗрЗ 5 Мышиный/кры синый зр35
3Ε3.1 +++ +++ +++ (верхняя полоса) +++ (нижняя полоса) Нет Нет (мышиный)
ЗН11.2 ++ ++ +++ (нижняя полоса) +++ (нижняя полоса) Да Да (мышиный)
ЗС8.1 + + +++ (верхняя полоса) +++ Нет Нет (мышиный)
- 18 020508
Моноклональные антитела, выделенные из гибридомы
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
Ьи5р35 гп5р35 зр35Р Ьи8р35 т8р35 ЬиЗрЗ Мышиный/кры
с 5 синый зр35
2В8.1 ++ ++ +++ +++ Нет Нет (мышиный)
(верхняя (нижняя
полоса) полоса)
ЗВ5.2 +++ +++ +++ +++ Нет Нет (мышиный)
(АТСС: РТА- (верхняя
8106) полоса)
Моноклональные антитела, выделенные из гибридомы
Иммуногистохи мия на трансфицирова нных клетках Иммуногистохимия на тканях ΕΙ.Ι8Α
Ки5р35 т5р ДТ КО 34-417 417-493 419-495 1-532 34-
35 (парафин) (парафин) 532
201' НО НО Да Да
ЗАЗ нет нет Да Да
ЗА6 Да νν Фон нет
1А7 Да νν Фон нет +/- Да Да
107 Да \л/ Фон нет
Моноклональные антитела, выделенные из гибридомы
Иммуногистохи мия на трансфицирова нных клетках Иммуногистохимия на тканях ЕЫ8А
Ки8р35 т5р ДТ КО 34-417 417-493 419-495 1-532 34-
35 (парафин) (парафин) 532
2В10 Да ν/ Фон нет Да Да
2С11 нет нет
2РЗ Да Да Да Да Да Да
ЗР1В1.1Р9
ЗРЮ10.2СЗ +/- Да Да
3Ρ1Ε11.3Β7 +/- Да Да
Моноклональные антитела, выделенные из гибридомы
Иммуногистохи мия на трансфицирова нных клетках Иммуногистохимия на тканях ΕΙ.Ι5Α
Ни8р35 т8р 35 ДТ (парафин) КО (парафин) 34-417 417-493 419-495 1-532 34- 532
ЗР2С6. ЗОЮ.2Н7 +/- Да Да
ЗР2С9.2О4 +/- Да Да
ЗР4А6.Ю9 +/- Да Да
ЗР4А1.2В9
ЗР4С2.2О2 Да Да
- 19 020508
Моноклональные антитела, выделенные из гибридомы
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
Ьи5р35 т5р35 зр35Рс Ьи5р35 т5р35 Ьи5р35 Мышиный/ крысиный зр35
30-С12(Н01) ++ ++
38ΌΟ1 (1_Ю2) -/+ -/+
38-ЕО4(иоз) ++ +++
36-С09(1_Ю4) -/+ -/+
30-А11 (1_Ю5) + ++ ++
34-РО2(1_Ю6) ++ ++
- 20 020508
Моноклональные фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1
Иммуногистохи мия на трансфицирова иных клетках Иммуногистохимия на тканях ΕΙ.Ι5Α
Ьи8р35 т8рЗ ДТ КО 34-417 417- 419- 1-532 34-532
5 (парафин) (парафин) 493 495
30-С12(П01)
38-ϋΟ1 (1_Ю2)
35-ΕΟ4(Ι_ϊΟ3)
36-С09(Ы04)
30-А11 (Ι_ίΟ5)
Моноклональные фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1
И м му н огистохи мия на трансфицирова иных клетках Иммуногистохимия на тканях ΕΙ.Ι5Α
Ьи3р35 т5рЗ ДТ КО 34-417 417- 419- 1-532 34-532
5 (парафин) (парафин) 493 495
34-РО2(ЫО6)
29-Е07(и07)
34-004(008)
36-А12(009)
28-Э02 (ОЮ)
30-В01 (ОН)
Моноклональные фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1
Иммуногистохи мия на трансфицирова нных клетках Иммуногистохимия на тканях ΕΙ.Ι5Α
Ьи5р35 т5рЗ ДТ КО 34-417 417- 419- 1-532 34-532
5 (парафин) (парафин) 493 495
34-ВОЗ (ΟΙ2)
- 21 020508
Моноклональные фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
Ьи5р35 ш5р35 зр35Рс Ьи5р35 т8р35 Ьи5р35 Мышиный/крысиный зр35
3383 (1) + Да Нет
3495 (2) +
3563 (3) +
3564 (4) +
3565 (5) +
3566(6) +
3567 (7) +
Моноклональные фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
Ьи5р35 гп5р35 зр35Рс Ьи5р35 т5р35 Ьи5р35 Мышиный/крысиный зр35
3568 (8) +
3569 (9) +
3570 (10) +
3571 (11) +
3582 (12) +
1968 (13) +/- ++ слабое Нет
3011 +/-
3012
Моноклональные фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
ЬиВрЗб ш5р35 зрЗбРс Ьи5р35 т5р35 Ьи5р35 Мышиный/крысиный зр35
3013 Прилипающий +
3418 Прилипающий
3422 -
3562 Прилипающий
Моноклональные фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1
Иммуногистохимия на трансфицированных клетках Иммуногистохимия на тканях ΕΙ.Ι5Α
Ьи5р35 т5р35 ДТ КО 34-417 417- 419- 1- 34-
(парафи (параф 493 495 532 532
н) ин)
3383 (1) НО НО Да Да Да Да
3495 (2) слабое НО Да Да Да Да
3563 (3) Нет Нет Да Да
3564 (4) Нет Нет Да Да
3565 (5) Нет Нет Да Да
- 22 020508
Моноклональные фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1
Иммуногистохимия на трансфицированных клетках Иммуногистохимия на тканях ΕΙ.Ι3Α
Ьи3р35 т8р35 ДТ (парафи н) КО (параф ин) 34-417 417- 493 419- 495 1- 532 34- 532
3566 (6) Да Очень слабое Да Да +/- Да Да
3567 (7) Да Нет Да Да +/- Да Да
3568 (8) Нет Нет Да Да
3569 (9) Нет Нет Да Да
3570 (10) Нет Нет
3571 (11) Нет Нет
Моноклональные фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1
Иммуногистохимия на Иммуногистохимия на тканях ΕΙ.Ι3Α
трансфицированных клетках
Ьи5р35 т5р35 ДТ КО 34-417 417- 419- 1- 34-
(парафи (параф 493 495 532 532
н) ин)
3582(12) Нет Нет
1968 (13) Очень слабое Да с Да Да +/- Да Да
высоким
ьд
3011 Окрашивает только слабое
очень немногие
клетки
Моноклональные фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1
Иммуногистохимия на трансфицированных клетках Иммуногистохимия на тканях ΕΙ.Ι3Α
Ьи3р35 т5р35 ДТ КО 34-417 417- 419- 1- 34-
(парафи (параф 493 495 532 532
н) ин)
3012 Нет Нет
3013 Да с высоким Ьд Да
3418 Да с высоким Ьд
3422 Очень слабое Да с
высоким
ьд
3562 Нет Нет
Моноклональные фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1
РАСз Иммунопреципитация Вестерн
Ьи5р35 т5р35 зр35Рс Ьи5р35 т5р35 Ьи5р35 Мышиный/ крысиный 5р35
Э05 ++
Э07 +++
ϋ08 ++
ϋ10 +++
ϋ11 +++
- 23 020508
Моноклональные фрагменты РаЬ, выделенные из библиотеки представления на фагах 1
Иммуногистохи мия на трансфицирова нных клетках Иммуногистохимия на тканях ЕЫ5А
Ьи5р35 т5рЗ ДТ КО 34-417 417- 419- 1-532 34-532
5 (парафин) (парафин) 493 495
Э05
Э07
Э08
ЭЮ
Э11
Пояснение:
Ни8р35 - человеческий белок 8р35, ш8р35 - мышиный белок 8р35,
ДТ - дикого типа,
КО - выбитый,
ИГХ - иммуногистохимия,
РАС8 - сортинг клеток по активации флуоресценции.
Таблица 3С
Моноклональные антитела 8Р35, выделенные из гибридомы
Таблица 3Ό
- 24 020508
- 25 020508
Антитело Вид Подтип РАС5 на клетках 293 РАС5 на стабильных СНО
3Ε3.1 мышиное 1дС 1 /карра тАЬ +++ +++
ЗН11.2 мышиное 1дС 1 /карра тАЬ ++ ++
ЗС8.1 мышиное тАЬ + +
2В8.1 мышиное тАЬ ++ ++ 5,4 нМ
ЗВ5.2 мышиное 1дС 1 /карра тАЬ +++ +++ < 0,4 нМ 0,4 нМ
(АТСС: РТА-8106)
ЗРЗС10.2 мышиное тАЬ 5,1 нМ 4,4 нМ
ЗР4Е4.6 мышиное тАЬ 4,6 нМ 6 нМ
Антитело Вид Подтип ΚΙ_ΙΝ(3Ο-1 ЕЫ5А Ы1ЧСО-1
<9
30-С12 человеческое карра ЕаЬ ++ +
(ΌΙΪ01)
38-001 человеческое 1атЬс1а ЕаЬ +
(ΟΙΪ02)
35-Е04 человеческое карра ЕаЬ +++ + +++
(ΟΙΪ03) АЬ
36-С09 человеческое ЕаЬ +
(ΟΙΪ04)
Антитело Вид Подтип ЕЫ5А
κκΝαο-ι ЬПП |д Ы-ΙΝΟΟ-Ι
30-А11 человеческое 1атЬс!а ЕаЬ +++ +(СС), +++
(ΟΙΪ05) ++(Ζδ)
АЬ
34-Е02 человеческое карра ЕаЬ ++ +(С6), ++
(ОП06) +/-(Ζδ)
АЬ
29-Е07 человеческое 1атЬс1а ЕаЬ ++ + +/-
(ΟΙΪ07)
34-004 человеческое карра ЕаЬ +(СС), -(СС),
(ОН08) ++(Ζδ) +/-(Ζδ)
АЬ
Антитело Вид Подтип ЕЫ5 А
ни νοο-ι ЬПН <9 Μ.ΙΝΟΟ-1
36-А12 человеческое карра ЕаЬ
(ЭНОЭ)
28-002 человеческое карра ЕаЬ ++ -
(ϋΙί10) АЬ
30-В01 человеческое карра ЕаЬ +++ + -
(σΐίΐ η АЬ
34-В03 человеческое ЕаЬ ++ +/- -
(ΟΙΪ12)
- 26 020508
ы.шсо-1 шп |д ниысо-1
72-ϋ03 человеческое ЕаЬ ++++ ++++
(ϋΐί13)
АЬ
73-С08 человеческое ЕаЬ +++ - +++
(ϋΐί17)
74-Ε08 человеческое ЕаЬ +++ + +++
(ΟΙΪ21)
75-Η04 человеческое ЕаЬ ++++ ++++
(ΟΙΪ24)
76-Ε10 человеческое ЕаЬ ++++ + ++++
(ϋΐί28)
Антитело Вид Подтип ЕЫ8 А
киысо-1 ίΗΠ |д ΗΙ_ΙΝ6ίΟ-1
79-СО2 человеческое ЕаЬ ++++ + - ++++
(ΟΙΪ32)
80-Α08 человеческое ЕаЬ ++++ ++ - ++++
(ЭИЗЗ)
АЬ
80-002 человеческое ЕаЬ +++++ ++ - +++++
(ΟΙί34)
АЬ ++++ ++ - ++++
81-С01 человеческое ЕаЬ ++++ ++ - ++++
(ΟΗ36)
Антитело Вид Подтип ЕЫЗА
к и νοο-1 ЬВВ <д ни νοο-ι
74-ϋΟδ человеческое ЕаЬ ++++ ++++
(ΟΙΪ39)
74-Ε02 человеческое ЕаЬ ++++ ++++
(ΟΙΪ40)
75-Β09 человеческое ЕаЬ ++++ ++++
(ΟΙΪ42)
94-Ε07 человеческое ЕаЬ ++++ ++++
(ΟΙΪ54)
98-Β10 человеческое ЕаЬ ++++ +++
(ΟΙΪ55)
Антитело Вид Подтип ЕЫЗА
Ы_11ЧСО-1 Ι.ΠΠ >д ήίΙΝΟΟ-1
δ44Ι_- человеческое ЕаЬ ++++
Μ00δ4-Ε03 (ΰΐϊ62)
1дС 1 Ад!у АЬ
544Ι_- человеческое ЕаЬ ++++
Μ0059-609 (ΟΙΪ63)
δ44Ι_- человеческое ЕаЬ ++++
М0063-С06 (ΟΙΪ64)
δ44Ι_- человеческое ЕаЬ ++++
Μ0069-012 (ϋΐίδδ)
δ44Ι_- человеческое ЕаЬ ++++
Μ0070-Η12 (ΟΠ67)
- 27 020508
544ЬМ0090-Е09 (ϋϊ73) человеческое
1д61Ад1у
544ЬМ0090-Е12 (0ΙΪ74) человеческое
5441_М0090-Е08 (ΟΙΪ75) человеческое
5441_М0104-В01 (ΟΙΪ77) человеческое
5441_М0120-Е08 (ϋΐί81) человеческое
Μ.ΙΝΟΟ-1 1_КП 1д ήΜΝΟΟ-1
1дС1Ад1у
АЬ 0,25 нМ
Антитело Вид Подтип РАС5 на клетках 293 РАС5 на стабильных
СНО
Μ.ΙΝΟΟ-1 тиЫСО1 ΚίΙΝΟΟ-Ι ΓηίΙΝΟΟΙ
30-С12 человеческое карра РаЬ
(ϋΠ01)
38-001 человеческое 1атЬЬа РаЬ
(ΩΙΪ02)
Антитело Вид Подтип РАС5 на клетках 293 РАС5 на стабильных
СНО
ΚίΙΝΟΟ-1 πιΙ_ΙΝΟΟ1 Μ.ΙΝΟΟ-1 πιίΙΝΟΟΙ
35-Е04 человеческое карра РаЬ
(ϋΙίΟ3)
АЬ
36-С09 человеческое РаЬ
(ϋϋΟ4)
30-А11 человеческое 1атЬЬа РаЬ + 22,8 нМ
(ΩΙίΟδ)
АЬ по Ы 5,5 нМ
34-Р02 человеческое карра РаЬ 21 нМ > 200 нМ
(υΐί06)
Антитело Вид Подтип РАС5 на клетках 293 РАС5 на стабильных
СНО
Μ.ΙΝΟΟ-1 ηιίΙΝΟΟΙ Μ.ΙΝΟΟ-1 тиыСО1
АЬ 2,32 нМ 26,6 нМ
29-Ε07 человеческое 1атЬЬа РаЬ
(ϋΙί07)
34-004 человеческое карра РаЬ +/- 206 нМ 190 нМ
(ϋΙίΟδ)
АЬ ++ 3,3 нМ 18,6 нМ
36-Α12 человеческое карра РаЬ
(ΟΙί09)
28-002 человеческое карра РаЬ
(ϋΙί10)
- 28 020508
Антитело Вид Подтип РАС5 на клетках 293 ЕАСЗ на стабильных СНО
ΗΙ_ΙΝΟΟ-1 ΓηίΙΝΟΟΙ НИ N00-1 ιηίΙΝΟΟΙ
АЬ +++ 0,49 нМ > 400 нМ
30-В01 (ϋΐί11) человеческое карра ЕаЬ
АЬ +++
34-ВОЗ (ΟΙΪ12) человеческое ЕаЬ
72ГО03 (ΟΙΪ13) человеческое ЕаЬ 0,74 нМ, 3,2 (СС) 24,7 нМ
АЬ
Антитело Вид Подтип ЕАСЗ на клетках 293 ЕАСЗ на стабильных СНО
ΗίΙΝΟΟ-1 т1ЛЧСО1 Μ-ΙΝ00-1 ηιίΙΝΟΟΙ
73-С08 (ΟΙΪ17) человеческое ЕаЬ
74-Е08 (ϋΐί21) человеческое ЕаЬ
75-Н04 (ϋΐί24) человеческое ЕаЬ
76-Ε10 (ΟΙΊ28) человеческое ЕаЬ
79-002 (ϋΙΪ32) человеческое ЕаЬ
Антитело Вид Подтип ЕАСЗ на клетках 293 ЕАСЗ на стабильных СНО
ниысо-1 ΓηίΙΝΟΟΙ ΗίΙΝΟΟ-1 ιηίΙΝΟΟΙ
80-Α08 (ЭПЗЗ) человеческое ЕаЬ 1,39 нМ, 4 (СС) по ίίί
АЬ 0,208 нМ, 1ог 1д62
80Ό02 (ϋΐί34) человеческое ЕаЬ
АЬ
81-С01 (ΟΠ36) человеческое ЕаЬ
Антитело Вид Подтип ЕАСЗ на клетках 293 ЕАСЗ на стабильных СНО
ΗίΙΝΟΟ-1 ΓηίΙΝΟΟΙ Ηί.ΙΝΟΟ-1 ιηίΙΝΟΟΙ
74-005 (ΟΙΪ39) человеческое ЕаЬ 7,6 нМ (СС)
74-Ε02 (Ο1Ϊ40) человеческое ЕаЬ 11 нМ (СС)
75-Β09 (ϋϋ42) человеческое ЕаЬ 28 нМ (СС)
94-Ε07 (ϋΐϊ54) человеческое ЕаЬ 33 нМ (СС)
98-Β10 (ОИ55) человеческое ЕаЬ 50 нМ (СС)
- 29 020508
Антитело Вид Подтип РАС8 на клетках 293 РАСЗ на стабильных СНО
N□N00-1 тИИОО1 N□N00-1 ΓηίΙΝΟΟΙ
5441.- М0054-Е03 (ΟΙΪ62) человеческое ЕаЬ
1дС1Ад1у АЬ 0,261 нМ
5441.- М0059-С09 (01(63) человеческое ЕаЬ
5441.- М0063-С06 (ОП64) человеческое ЕаЬ
Антитело Вид Подтип РАСЗ на клетках 293 РАСЗ на стабильных СНО
N□N00-1 ΓηίΙΝΟΟ! N□N00-1 тЫИСО!
544Ь- М0069-012 (ΟΙΪ65) человеческое ЕаЬ
5441.- М0070-Н12 (ОН67) человеческое ЕаЬ
544Ι.- М0090-Е09 (ϋί73) человеческое ЕаЬ
1дС1Ад1у АЬ 0,12 нМ
Антитело Вид Подтип РАСЗ на клетках 293 РАСЗ на стабильных СНО
N□N00-1 ηιΜΝΟΟΙ N□N00-1 ηιίΙΝΟΟΙ
544Ь- М0090-Е12 (0ΙΪ74) человеческое ЕаЬ
544Ь- М0090-Е08 (ОН75) человеческое ЕаЬ
5441.- М0104-В01 (0Н77) человеческое ЕаЬ
Антитело Вид Подтип РАС5 на клетках 293 РАСЗ на стабильных СНО
ήΜΝΟΟ-Ι πιίΙΝΟΟΙ N□N00-1 ικιίΙΝΟΟΙ
544Ι.- М0120-Е08 (0ΙΪ81) человеческое ЕаЬ
1дС1Ад1у АЬ 0,156 нМ
- 30 020508
Таблица 3Е
- 32 020508
Антитело Вид Подтип Внутрибрюшинно ИГХ
ΜΙΝΟΟ-1 тЫ№О1 Эндо- Блоки- заморо- пара-
генное рующее женный фин
грызунов
5441_- Человеческое ЕаЬ
М0059-609
(БП63)
5441_- Человеческое ЕаЬ
М0063-С06
(БП64)
5441_- Человеческое ЕаЬ
М0069-Б12
(БП65)
Антитело Вид Подтип Внутриб рюшинно ИГ X
ΚΜΝβΟ-Ι ΓηίΙΝΟΟ! Эндо- Блоки- заморо- пара-
генное рующее женный фин
грызунов
5441_- Человеческое ЕаЬ
М0070-Н12
(БН67)
5441_- Человеческое ЕаЬ
М0090-Е09
1дО1Ад1у АЬ
(БН73)
5441_- Человеческое ЕаЬ
М0090-Е12
(БН74)
Антитело Вид Подтип Внутрибрюшинно ИГХ
Μ-ΙΝ<30-1 ΜίΙΝΟΟΙ Эндо- Блоки- заморо- пара-
генное рующее женный фин
грызунов
5441_- Человеческое ЕаЬ
М0090-Р08
(0ΙΪ75)
5441_- Человеческое ЕаЬ
М0104-В01
(БН77)
5441_- Человеческое ЕаЬ
М0120-Е08
1дС1Ад1у АЬ Да Да Да
(БН81)
=====
Миелинизация в сокультуре
ОтрастаКупризон невритов
Разрушение зрительного нерва
Лизолецитин
1дС1/кар ра
Да
Да
Да
Да
Да
1дС2а
- 34 020508
Антитело Вид Подтип Миелинизация в сокультуре Отраста- ние неври- тов ЗС1 Разруше- ние зритель- ного нерва Купри- зон Лизо- леци- тин
тАЬ Да Да Нет
ЗРЮ10.2 Мышиное |дС1 тАЬ Да/Нет
сз
3Ρ1Ε11.3Β Мышиное |дС1 тАЬ Да/Нет
7
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
6Ρ4Ε4.1Ό3 Мышиное 1дС1/кар тАЬ Да
ра
6Р4Е4.1Е9 Мышиное 1дС1/кар тАЬ
ра
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Л изо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
7РЮ5.1С Мышиное 1дС 1 /кар ЕаЬ Да Да
9 ра
(АТСС
РТА-8107) тАЬ Да Нет?
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
1В6.4 Мышиное 1дС1/кар тАЬ Нет
ра
2С7.2 Мышиное 1дС1/кар тАЬ Нет
ра
2Ό6.1 Мышиное 1дС2а/ка тАЬ Да
рра
- 35 020508
- 36 020508
Антитело Вид Подтип Миелинизация в сокультуре Отраста- ние неври- тов 5С1 Разруше- ние зритель- ного нерва Купри- зон Лизо- леци- тин
35-Е04 Человеческое РаЬ
(ЭНОЗ) карра АЬ
36-С09 Человеческое ЕаЬ
(ϋΙίΟ4)
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон ле ци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
30-А11 Человеческое ЕаЬ Да Да
(ϋΙϊΟδ) 1атЬс1а АЬ Да Да
34-А02 Человеческое ЕаЬ Да
(ϋϋΟ6) карра АЬ Да
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 8С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
29-Е07 Человеческое 1атЬс)а ЕаЬ
(ΟΙΪ07)
34-004 Человеческое ЕаЬ Да Да
(ϋΙίΟ8) карра АЬ Да Да/Нет
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Л изо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
36-А12 Человеческое карра ЕаЬ
(ΟΙΪ09)
28-Э02 Человеческое ЕаЬ
(ΟΙΪ10) карра АЬ
30-В01 Человеческое ЕаЬ
(ЭНН) карра
- 37 020508
Антитело Вид Подтип Миелинизация в сокультуре Отраста- ние неври- тов 5С1 Разруше- ние зритель- ного нерва Купри- зон Лизо- леци- тин
АЬ Нет
34-В03 Человеческое РаЬ
(ΌΝ12)
72-ЭОЗ Человеческое РаЬ Да Да
(ЭП13) АЬ
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
73-С08 Человеческое РаЬ
(ΌΙΪ17)
74-Е08 Человеческое РаЬ
(ЭН21)
75-Н04 Человеческое РаЬ Нет
(ЭН24)
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
75-Р10 Человеческое РаЬ Да
(ΌΙΪ28)
79-002 Человеческое РаЬ
(ΌΙΪ32)
80-А08 Человеческое РаЬ Да Да
(ΌΙΪ33)
Антитело Вид Подтип Миелинизация в сокультуре Отраста- ние неври- тов ЗС1 Разруше- ние зритель- ного нерва Купри- зон Л изолецитин
АЬ Да
80-Э02 Человеческое РаЬ Нет
(ЭН34) АЬ
81-С01 Человеческое РаЬ Нет
(ЭН36)
- 38 020508
Антитело Вид Подтип Миелинизация в сокультуре Отраста- ние неври- тов ЗС1 Разруше- ние зритель- ного нерва Купри- зон Лизо- леци- тин
74-Ω05 Человеческое ЕаЬ
(ОМ39)
74-Э02 Человеческое РаЬ
(ϋΙΐ40)
75-В09 Человеческое РаЬ
(ϋΙΐ42)
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
94-Ε07 Человеческое РаЬ
(ϋΙί54)
98-Β10 Человеческое РаЬ
(ΟΗ55)
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
5441_- Человеческое РаЬ Да
Μ0054-
Ε03 1дС 1 Ад1у АЬ Да
(ϋΐΐ62)
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
544Ь- Человеческое РаЬ Нет
Μ0059-
009
(0Π63)
- 39 020508
Антитело Вид Подтип Миелинизация в сокультуре Отраста- ние неври- тов 5С1 Разруше- ние зритель- ного нерва Купри- зон Лизо- леци- тин
5441.- Человеческое РаЬ Нет
М0063-
еоб
(ОН64)
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
544Ь- Человеческое РаЬ Да
М0069-
Ω12
(ϋΐί65)
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
5441_- Человеческое РаЬ Да
М0070-
Н12
(ОП67)
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
5441.- Человеческое РаЬ Да
М0090- Е09 (0ΙΪ73) 1дС1 Ад!у АЬ Да
- 40 020508
Антитело Вид Подтип Миелинизация в сокультуре Отраста- ние неври- тов 5С1 Разруше- ние зритель- ного нерва Купри- зон Лизо- леци- тин
5440 Человеческое ЕаЬ Нет
М0090-
Е12
(ЭН74)
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
5440 Человеческое РаЬ Нет
М0090-
Р08
(ЭН75)
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С1 Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
5440 Человеческое РаЬ Да
М0104-
В01
(ЭН77)
Антитело Вид Подтип Миелиниза- Отраста- 5С! Разруше- Купри- Лизо-
ция в ние ние зон леци-
сокультуре неври- зритель- тин
тов ного
нерва
5440 Человеческое РаЬ Да
М0120-
Е08 1дС1Ад1у АЬ Да Да
(ЭН81)
Как используют в данном контексте, термин антигенсвязывающий домен включает центр, который специфически связывает эпитоп на антигене (например, эпитоп 8р35). Антигенсвязывающий домен антитела, как правило, включает по меньшей мере часть вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина и по меньшей мере часть вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина. Связывающий центр, образованный данными вариабельными областями, определяет специфичность антитела.
Настоящее изобретение более специально направлено на антитело к 8р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производные, причем антитело к 8р35 связывается с тем же эпитопом, что моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 201', 3А3, 3А6, 1А7, 1С7, 2В10, 2С11, 2Е3, 3Р1Б10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 3Р2С6.3С10.2Н7, 3Р2С9.2С4, 3Р4А6.1Б9, 3Р4А1.2В9, 3Р4С2.2Б2,
- 41 020508
3Р4С5.ГО8, 3Р4С8.209, 30-С12 (П01), 38-Ό01 (Л02), 35-Е04 (П03), 36-С09 (П04), 30-А11 (Л05), 34-Р02 (ЬЮб), 29-Е07 (ЬЮ7), 34-004 (П08), 36-А12(П09), 28-Ό02(Π10), 30-В01 (Ц11), 34-В03 (Ы12), Ш3, Ы32, Ы33, Ы34, 3383 (Ь1а.1), 3495 (Ь1а.2), 3563 (Ь1а.3), 3564 (Ь1а.4), 3565 (Ь1а.5), 3566 (Ь1а.6), 3567 (Ь1а.7), 3568 (Ь1а.8), 3569 (Ь1а.9), 3570 (Ь1а.10), 3571 (Ь1а.11), 3582 (Ь1а.12), 1968 (Ь1а.13), 7РГО5.109, 3В5.2 и
Ы81.
Изобретение, кроме того, направлено на антитело к 8р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант либо производные, причем антитело к 8р35 конкурентно ингибирует моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 201', 3А3, 3А6, 1А7, 107, 2В10, 2С11, 2Р3, 3РГО10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 3Р2С6.3010.2Н7, 3Р2С9.204, 3Р4А6.ГО9, 3Р4А1.2В9, 3Р4С2.2П2, 3Р4С5.ГО8, 3Р4С8.209, 30-С12 (П01), 38-Ό01 (ЬЮ2), 35-Е04 (П03), 36-С09 (П04), 30-А11 (П05), 34-Р02 (Л06), 29-Е07 (П07), 34-004 (П08), 36-А12 (ЬЮ9), 28-Ό02 (И10), 30-В01 (П11), 34-В03 (ЬИ2), Ш3, Ы32, Ы33, П34, 3383 (Ь1а.1), 3495 (Ь1а.2), 3563 (Ь1а.3), 3564 (Ь1а.4), 3565 (Ь1а.5), 3566 (Ь1а.6), 3567 (Ь1а.7), 3568 (Ь1а.8), 3569 (Ь1а.9), 3570 (Ь1а.10), 3571 (Ь1а.11), 3582 (Ь1а.12), 1968 (Ь1а.13), 7РГО5.109, 3В5.2 и Ы81, в плане связывания с 8р35.
Изобретение также направлено на антитело к 8р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант либо производные, причем антитело к 8р35 включает, по меньшей мере, антигенсвязывающий участок моноклонального антитела, выбранного из группы, состоящей из 201', 3А3, 3А6, 1А7, 107, 2В10, 2С11, 2Р3, 3Р1И10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 3Р2С6.3010.2Н7, 3Р2С9.204, 3Р4А6.ГО9, 3Р4А1.2В9, 3Р4С2.2П2, 3Р4С5.1И8, 3Р4С8.209, 30-С12 (П01), 38-Ό01 (П02), 35-Е04 (П03), 36-С09 (П04), 30-А11 (П05), 34-Р02 (П06), 29-Е07 (ЬЮ7), 34-004 (П08), 36-А12 (П09), 28-Ό02 (И10), 30-В01 (П11), 34-В03 (Ы12), Ш3, Ы32, Ы33, Ы34, 3383 (Ь1а.1), 3495 (Ь1а.2), 3563 (Ь1а.3), 3564 (Ь1а.4), 3565 (Ь1а.5), 3566 (Ь1а.6), 3567 (Ь1а.7), 3568 (Ь1а.8), 3569 (Ь1а.9), 3570 (Ь1а.10), 3571 (Ь1а.11), 3582 (Ь1а.12), 1968 (Ь1а.13), 7РГО5.109, 3В5.2 и Ы81.
декабря 2006 г. следующие гибридомы депонированы в Американской коллекции типовых культур (АТСС) в Манассасе, УА: 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106), 7.РЮ5.1.09 (АТСС номер депозита РТА-8107). Депонированная гибридома 2.Р3В5.2 продуцирует моноклональное антитело 3В5.2, описанное в данном контексте, и депонированная гибридома 7.РГО5.1.09 продуцирует антитело 7РГО5.1.09, описанное в данном контексте. Гибридомы можно культивировать согласно способам, хорошо известным в области техники и описанным в данном контексте.
В ряде вариантов осуществления настоящее изобретение направлено на антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант либо производное, которое специфически или предпочтительно связывается с определенным фрагментом или доменом полипептида 8р35. Данные фрагменты полипептида 8р35 включают, но без ограничения перечисленным, полипептид 8р35, включающий, в основном состоящий или состоящий из аминокислот 34-532; 34-417; 34-425; 34-493; 66-532; 66-417; 66-426; 66-493; 66-532; 417-532; 417-425 (основной участок 8р35); 417-493; 417-532; 419-493 (1д-область 8р35); или 425532 8ЕЦ ГО N0:2 или вариант полипептида 8р35, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентичный аминокислотам 34-532; 34-417; 34-425; 34-493; 66-532; 66-417; 66-426; 66-493; 66-532; 417-532; 417-425 (основной участок 8р35), 417-493; 417-532; 419-493 (область 1д 8р35) или 425-532 8ЕО ГО N0:2.
Дополнительные пептидные фрагменты 8р35, с которыми связываются некоторые антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, те фрагменты, которые включают, в основном состоят или состоят из одного или более богатых лейцином повторов (БРР) 8р35. Данные фрагменты включают, например, фрагменты, включающие, в основном состоящие или состоящие из аминокислот 66-89; 66-113; 66-137; 90-113; 114-137; 138-161; 162-185; 186-209; 210-233; 234-257; 258-281; 282-305; 306-329 или 330-353 8ЕЦ ГО N0:2. Предусматривают также соответствующие фрагменты варианта полипептида 8р35, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентичные аминокислотам 66-89; 66113; 90-113; 114-137; 138-161; 162-185; 186-209; 210-233; 234-257; 258-281; 282-305; 306-329 или 330-353 8ЕО ГО N0:2.
Дополнительные пептидные фрагменты 8р35, с которыми связываются некоторые антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, те фрагменты, которые включают, в основном состоят или состоят из одного или более богатых цистеином участков, фланкирующих БРР 8р35. Данные фрагменты включают, например, фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из аминокислот 34-64 8ЕЦ ГО N0:2 (участок, фланкирующий Юконцевой ЬРР (ЬКРЫТ)), или фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из аминокислот 363-416 8ЕЦ ГО N0:2 (участок, фланкирующий С-концевой БРР (ЬРРСТ)), предусматривают также аминокислоты, соответствующие фрагментам варианта полипептида 8р35, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентичного аминокислотам 34-64 и 363-416 8ЕО ГО N0:2.
Как известно в области техники, идентичность последовательности между двумя полипептидами определяют сравнением последовательности аминокислот одного полипептида с последовательностью второго полипептида. При обсуждении в данном контексте можно определить, является ли какой-либо конкретный полипептид по меньшей мере приблизительно на 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентичным
- 42 020508 другому полипептиду, используя способы и компьютерные программы/пакеты программ, известные в области техники, такие как, но без ограничения перечисленным, программа ΒΕδΤΡΙΤ (^18соп81п §есщепсе Апа1ук1к Раскаде, УегУоп 8 для Итх, Оепебск СотрШет Огоир, иШуегкЬу КекеагсЬ Рагк, 575 δαепсе Όπ\ό, Маб1коп, XVI 53711). В ΒΕδΤΡΙΤ используют алгоритм локальной гомологии, предложенный в статье διηίΐΐι апб Vаΐе^тап, Абуапсек ш АррЬеб МаГОетабск 2:482-489 (1981), чтобы найти наилучший сегмент гомологии между двумя последовательностями. При использовании ΒΕδΤΡΙΤ или любой другой программы выравнивания последовательностей для определения, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной эталонной последовательности, соответствующей настоящему изобретению, конечно, задают такие параметры, что процент идентичности рассчитывают по полной длине последовательности эталонного полипептида и допускают гэпы в гомологии до 5% от общего числа аминокислот в эталонной последовательности.
Дополнительные пептидные фрагменты δр35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, те фрагменты, которые включают, в основном состоят или состоят из аминокислот 41-525 δΕΟ ΙΌ N0:2; 40-526 δΕΟ ΙΌ N0:2; 39-527 δΕΟ ΙΌ N0:2; 38528 δΕΟ ΙΌ N0:2; 37-529 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-530 δΕΟ ΙΌ N0:2; 35-531 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-531 δΕΟ ΙΌ N0:2; 46-520 δΕΟ ΙΌ N0:2; 45-521 δΕΟ ΙΌ N0:2; 44-522 δΕΟ ΙΌ N0:2; 43-523 δΕΟ ΙΌ N0:2 и 42-524 δΕΟ ΙΌ N0:2.
Еще дополнительные пептидные фрагменты δр35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, те фрагменты, которые включают, в основном состоят или состоят из аминокислот 1-33 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-35 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-64 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-64 δΕΟ ΙΌ N0:2; 66-89 δΕΟ ΙΌ N0:2; 90-113 δΕΟ ΙΌ N0:2; 114-137 δΕΟ ΙΌ N0:2; 138-161 δΕΟ ΙΌ N0:2; 162-185 δΕΟ ΙΌ N0:2; 186-209 δΕΟ ΙΌ N0:2; 210-233 δΕΟ ΙΌ N0:2; 234-257 δΕΟ ΙΌ N0:2; 258-281 δΕΟ ΙΌ N0:2; 282-305 δΕΟ ΙΌ N0:2; 306-329 δΕΟ ΙΌ N0:2; 330-353 δΕΟ ΙΌ N0:2; 363-416 δΕΟ ΙΌ N0:2; 417-424 δΕΟ ΙΌ N0:2; 419-493 δΕΟ ΙΌ N0:2 и 494-551 δΕΟ ΙΌ N0:2.
Дальнейшие пептидные фрагменты δр35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, те фрагменты, которые включают, в основном состоят или состоят из аминокислот 1-33 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-35 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-64 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-89 δΕΟ ΙΌ
N0:2; 1-113 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-137 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-161 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-185 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-209 δΕΟ ΙΌ
N0:2; 1-233 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-257 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-281 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-305 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-329 δΕΟ ΙΌ
N0:2; 1-353 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-416 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-424 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-493 δΕΟ ΙΌ N0:2; 1-551 δΕΟ ΙΌ
N0:2; 1-531 δΕΟ ΙΌ N0:2 и 1-532 δΕΟ ΙΌ N0:2.
Дополнительные пептидные фрагменты δр35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, те фрагменты, которые включают, в основном состоят или состоят из аминокислот 34-64 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-89 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-113 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34137 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-161 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-185 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-209 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-233 δΕΟ ΙΌ N0:2;
34- 257 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-281 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-305 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-329 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-353 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-416 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-424 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-493 δΕΟ ΙΌ N0:2 и 34-551 δΕΟ ΙΌ N0:2.
Больше дополнительных фрагментов пептида δр35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, те фрагменты, которые включают, в основном состоят или состоят из аминокислот 34-530 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-531 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-532 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-533 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-534 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-535 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-536 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-537 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-538 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-539 δΕΟ ΙΌ N0:2; 30-532 δΕΟ ΙΌ N0:2; 31-532 δΕΟ ΙΌ N0:2; 32-532 δΕΟ ΙΌ N0:2; 33-532 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-532 δΕΟ ΙΌ N0:2; 35-532 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-532 δΕΟ ΙΌ N0:2; 30531 δΕΟ ΙΌ N0:2; 31-531 δΕΟ ΙΌ N0:2; 32-531 δΕΟ ΙΌ N0:2; 33-531 δΕΟ ΙΌ N0:2; 34-531 δΕΟ ΙΌ N0:2;
35- 531 δΕΟ ΙΌ N0:2 и 36-531 δΕΟ ΙΌ N0:2.
Еще дальнейшие пептидные фрагменты δр35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, те фрагменты, которые включают, в основном состоят или состоят из аминокислот 36-64 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-89 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-113 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36137 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-161 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-185 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-209 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-233 δΕΟ ΙΌ N0:2;
36- 257 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-281 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-305 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-329 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-353 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-416 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-424 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-493 δΕΟ ΙΌ N0:2 и 36-551 δΕΟ ΙΌ N0:2.
Дополнительные пептидные фрагменты δр35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, те фрагменты, которые включают, в основном состоят или состоят из аминокислот 36-530 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-531 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-532 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36533 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-534 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-535 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-536 δΕΟ ΙΌ N0:2; 36-537 δΕΟ ΙΌ N0:2;
- 43 020508
36-538 8ЕО ΙΌ N0:2 и 36-539 8ЕО ΙΌ N0:2.
Многие пептидные фрагменты 8р35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают, но без ограничения перечисленным, те фрагменты, которые включают, в основном состоят или состоят из аминокислот 417-493 8ЕО ГО N0:2; 417-494 8ЕО ГО N0:2; 417-495 8ЕО ГО N0:2; 417-496 8ЕО ГО N0:2; 417-497 8ЕО ГО N0:2; 417-498 8ЕО ГО N0:2; 417-499 8ЕО ГО N0:2; 417-500 8ЕО ГО N0:2; 417-492 8ЕО ГО N0:2; 417-491 8ЕО ГО N0:2; 412-493 8ЕО ГО N0:2; 413-493 8ЕО ГО N0:2; 414-493 8ЕО ГО N0:2; 415-493 8ЕО ГО N0:2; 416-493 8ЕО ГО N0:2; 411-493 8ЕО ГО N0:2; 410-493 8ЕО ГО N0:2; 410494 8ЕО ГО N0:2; 411-494 8ЕО ГО N0:2; 412-494 8ЕО ГО N0:2; 413-494 8ЕО ГО N0:2; 414-494 8ЕО ГО N0:2; 415-494 8ЕО ГО N0:2; 416-494 8ЕО ГО N0:2; 417-494 8ЕО ГО N0:2 и 418-494 8ЕО ГО N0:2.
В дополнительном варианте осуществления пептидные фрагменты 8р35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают, полипептид 8р35, содержащий, в основном состоящий или состоящий из пептидов домена 1д 8р35 или фрагментов, вариантов или производных данных полипептидов. В частности, полипептиды включают, в основном состоят или состоят из следующих полипептидных последовательностей: ΙΤΧ1Χ2Χ3 (8ΙΑ) ГО N0:287), АСХ1Х2Х3 (8ЕО ГО N0:288), УСХ1Х2Х3 (8Е0 ГО N0:289) и 8РХ1Х2Х3 (8ЕЦ ГО N0:290), где Х1 представляет собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин, Х2 представляет собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин и Х3 представляет собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин. Например, пептидные фрагменты 8р35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают те фрагменты, которые включают, в основном состоят или состоят из следующих полипептидных последовательностей: 8РККН (8ЕО ГО N0:291), 8РККК (8ЕО ГО N0:292), 8РККК (8ЕО ГО N0:293), 8РККН (8ЕО ГО N0:294), 8РНКН (8ЕО ГО N0:295), 8РККН (8ЕО ГО N0:296), 8РКНН (8ЕО ГО N0:297), 8РККК (8ЕО ГО N0:298), 8РННН (8ЕО ГО N0:299) 8РККК (8ЕО ГО N0:300), Ь8РККН (8ЕО ГО N0:301), Б8РККК (8ЕО ГО N0:302), 1.8РНКН (8ЕО ГО N0:303), Б8РККН (8ЕО ГО N0:304), Б8РНКН (8ЕО ГО N0:305), 1.8РННН (8РО ГО N0:306), Р8РН1П1 (8РО ГО N0:307), Р8РННН (8РО ГО N0:308), Р8РНН11 (8РО ГО N0:309) Б8РККК (8РО ГО N0:310), УР8РРКН (8РО ГО N0:311), УР8РРКК (8РО ГО N0:312), УР8РРКР (8РО ГО N0:313), УБ8РККН (8РО ГО N0:314), УБ8РНКН (8РО ГО N0:315), УР8РРРН (8РО ГО N0:316), УР8РННН (8РО ГО N0:317), УР8РРРР (8РО ГО N0:318), УБ8РННН (8РО ГО N0:319) УБ8РККК (8Е0 ГО N0:320). Данные полипептиды 8р35 включают основную петлю ККН (аргинин-лизингистидин, аминокислоты 456-458) в домене Ιβ 8р35. Дополнительные пептиды 8р35, которые включают основной трипептид, представляют собой ИРККК. (8ЕЦ ГО N0:321), АСННК (8ЕЦ ГО N0:322) и УСННК (8РО ГО N0:323).
Дополнительные пептидные фрагменты 8р35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают полипептид 8р35, включающий, в основном состоящий или состоящий из следующих пептидов домена Ι§ 8р35 или фрагментов, вариантов или производных данных полипептидов. В частности, пептиды включают, в основном состоят или состоят из следующих полипептидных последовательностей: Х4Х5ККН (8РО ГО N0:324), Х4Х5ККК (8РО ГО N0:325), Х4Х5ККК (8РО ГО N0:326), Х4Х5ННН (8РО ГО N0:327), Х4Х5ККК (8РО ГО N0:328), Х4Х5ККК (8РО ГО N0:329), Х4Х5ККН (8РО ГО N0:330), Х4Х5НКН (8РО ГО N0:331), Х4Х5ККН (8РО ГО N0:332) и Х4Х5КНН (8РО ГО N0:333), где Х4 представляет собой любую аминокислоту и Х5 представляет собой любую аминокислоту.
В других вариантах осуществления пептидные фрагменты 8р35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают полипептид 8р35, включающий, в основном состоящий или состоящий из пептидов домена Ι§ 8р35 или фрагментов, вариантов или производных данных полипептидов. В частности, полипептиды включают, в основном состоят или состоят из следующих полипептидных последовательностей: ГГХ6Х7Х8 (8ЕО ГО N0:334), АСХ6Х7Х8 (8ЕО ГО N0:335), УСХ6Х7Х8 (8ЕО ГО N0:336) и 8РХ6Х7Х8 (8ЕЦ ГО N0:337), где Х6 представляет собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин, Х7 представляет собой любую аминокислоту и Х8 представляет собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин. Например, полипептид включает, в основном состоит или состоит из следующей полипептидной последовательности: 8РКГН (8Е0 ГО N0:338).
Пептидные фрагменты 8р35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают полипептид 8р35, включающий, в основном состоящий или состоящий из пептидов, которые содержат аминокислоты 452-458 домена Ι§ 8р35 или его производных, причем аминокислота 452 представляет собой остаток триптофана или фенилаланина.
Дополнительные пептидные фрагменты 8р35, с которыми связываются определенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты либо производные, соответствующие настоящему изобретению, включают полипептид 8р35, включающий, в основном состоящий или состоящий из пептидов основного домена 8р35. В частности, пептиды включают, в основном состоят или состоят из следующих
- 44 020508 полипептидных последовательностей: ΚΚΆΚΙΚΌΚΚ (5>ЕО ГО N0:339), ККУКУКЕКК (5>Е0 ГО N0:340), ККЬКЬКИКК (АТ) ГО N0:341), ККОКОКИКК (АТ) ГО N0:342) и КК1КАКИКК (АТ) ГО N0:343).
Дополнительные примеры растворимых полипептидов 8р35, способов и материалов для получения данных молекул с целью получения антител или фрагментов антител, соответствующих настоящему изобретению, можно найти, например, в Международной патентной заявке № РСТ/И82004/008323, включенной в данном контексте в виде ссылки во всей своей полноте.
Способы получения антител хорошо известны в области техники и описаны в данном контексте. После получения антител к различным фрагментам или к 8р35 полной длины без сигнальной последовательности определение, какие аминокислоты или эпитоп 8р35, с которым связывается антитело или антиген-связывающий фрагмент, можно установить с помощью протоколов картирования эпитопов, как описано в данном контексте, а также способами, известными в области техники (например, сэндичевым ЕЫ8А с двойным антителом, как описано в главе 11 - 1ттипо1оду (Иммунология) монографии СиггсШ РгоЮсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду (Современные протоколы молекулярной биологии) под ред. Аи5иЪе1 с1 а1., т. 2, 1оЪп ХУПеу & 8опз, 1пс. (1996)). Дополнительные протоколы картирования эпитопов можно найти в монографии Моте, О. Ерйоре Марртд РгоЮсок (Протоколы картирования эпитопов), №ν 1ет5еу: Нитапа Ртевв (1996), обе из которых включены в данном контексте путем ссылки в своей полноте. Картирование эпитопов можно также провести с помощью коммерчески доступных средств (т.е. Рго1оРК0ВЕ, 1пс. (Мйтаикее, Аксопвш)).
Кроме того, полученные антитела, которые связываются с любой частью 8р35, затем могут быть подвергнуты скринингу на способность действовать как антагонист 8р35 и, таким образом, способствовать отрастанию невритов, выживаемости нейронов и олигодендроцитов, пролиферации и дифференцировке, а также способствовать миелинизации. Антитела можно подвергнуть скринингу на выживаемость олигодендроцитов/нейронов с использованием способа, как описано в примерах 10 и 11. Кроме того, антитела можно подвергнуть скринингу на их способность способствовать миелинизации с использованием способа, предложенного в примере 9. Наконец, антитела можно подвергнуть скринингу на их способность способствовать пролиферации и дифференцировке олигодендроцитов, а также отрастанию невритов с использованием способа, как описано в примере 7. Другие антагонистические функции антител, соответствующих настоящему изобретению, можно тестировать с помощью других анализов, как описано в примерах в данном контексте.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, которое специфически или предпочтительно связывается по меньшей мере с одним эпитопом 8р35, причем эпитоп включает, состоит в основном или состоит из по меньшей мере приблизительно четырех-пяти аминокислот 5>Е0 ГО N0:2, по меньшей мере семи, по меньшей мере девяти или по меньшей мере от приблизительно 15 до приблизительно 30 аминокислоты 5>Е0 ГО N0:2. Аминокислоты заданного эпитопа 5>Е0 ГО N0:2, как описано, могут быть, но необязательно являются прилегающими друг к другу или линейными. В ряде вариантов осуществления по меньшей мере один эпитоп 8р35 включает, состоит в основном или состоит из нелинейного эпитопа, образованного внеклеточным доменом 8р35, в виде экспрессирующегося на поверхности клетки или в виде растворимого фрагмента, например, слитого с Рс-участком 1§О. Таким образом, в ряде вариантов осуществления по меньшей мере один эпитоп 8р35 включает, состоит в основном или состоит из по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, от приблизительно 15 до приблизительно 30 или по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 следующих или не следующих друг за другом аминокислот 5>Е0 ГО N0:2, где не следующие друг за другом аминокислоты образуют эпитоп посредством укладки белка.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, которое специфически или предпочтительно связывается по меньшей мере с одним эпитопом 8р35, где эпитоп включает, состоит в основном или состоит из в дополнение к одной, двум, трем, четырем, пяти, шести или более следующих или не следующих друг за другом аминокислот 5>Е0 ГО N0:2, как описано выше, и дополнительной группы, которая модифицирует белок, например, можно включить углеводную группу, так что антитело к 8р35 связывается с более высокой аффинностью с модифицированным белком-мишенью, чем оно связывается с немодифицированным вариантом белка. Альтернативно, антитело к 8р35 совсем не связывает немодифицированный вариант белка-мишени.
В ряде аспектов настоящее изобретение направлено на антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, которое специфически связывается с полипептидом 8р35 или его фрагментом либо вариантом полипептида 8р35 с аффинностью, характеризующейся константой диссоциации (Кс), которая меньше чем К для указанного эталонного моноклонального антитела.
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, соответствующее изобретению, специфически связывается по меньшей мере с одним эпитопом 8р35 или фрагментом либо вариантом, описанными выше, т.е. связывается с данным эпитопом легче, чем оно связывалось бы с неродственным или случайным эпитопом; связывается предпочтительно
- 45 020508 по меньшей мере с одним эпитопом 8р35 или фрагментом либо вариантом, описанными выше, т.е. связывается с данным эпитопом легче, чем оно связывалось бы с родственным, близким, гомологичным или аналогичным эпитопом; конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела, которое само специфически или предпочтительно связывается с определенным эпитопом 8р35 или фрагментом либо вариантом, описанным выше; или связывается по меньшей мере с одним эпитопом 8р35 или фрагментом либо вариантом, описанным выше с аффинностью, характеризующейся константой диссоциации Кс меньше чем приблизительно 5х10-2 М, приблизительно 10-2 М, приблизительно 5х10-3 М, приблизительно 10-3 М, приблизительно 5х10-4 М, приблизительно 10-4 М, приблизительно 5х10-5 М, приблизительно 10-5 М, приблизительно 5х10-6 М, приблизительно 10-6 М, приблизительно 5х10-7 М, приблизительно 10-7 М, приблизительно 5х10-8 М, приблизительно 10-8 М, приблизительно 5х10-9 М, приблизительно 10-9 М, приблизительно 5х10-10М, приблизительно 10-10 М, приблизительно 5х10-11 М, приблизительно 10-11 М, приблизительно 5х10- М, приблизительно 10- М, приблизительно 5х10- М, приблизительно 10- М, приблизительно 5х10-14 М, приблизительно 10-14 М, приблизительно 5х10-15 М или приблизительно 10-15
М. В конкретном аспекте антитело или его фрагмент предпочтительно связываются с человеческим полипептидом 8р35 или его фрагментом относительно мышиного полипептида 8р35 или его фрагмента. Как используют в контексте констант диссоциации связывания антитела, термин приблизительно допускает степень вариации, присущую способам, используемым для измерения аффинности антитела. Например, в зависимости от уровня точности используемой измерительной аппаратуры, стандартной ошибки, основанной на числе измеренных образцов, и ошибки округления, термин приблизительно 10-2 М мог бы включать, например, от 0,05 до 0,005 М.
В специфических вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, соответствующие изобретению, связывает полипептиды 8р35 или их фрагменты либо варианты со скоростью диссоциации (к(ой)) меньше чем или равной 5х10-2 с-1, 10-2 с-1, 5х10-3 с-1 или 10-3 с-1. Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, соответствующее изобретению, связывает полипептиды 8р35 или их фрагменты либо варианты со скоростью диссоциации (к(ой)) меньше чем или равной 5х10-4 с-1, 10-4 с-1, 5х10-5 с-1 или 10-5 с-1, 5х10-6 с-1, 10-6 с-1, 5х10-7 с-1 или 10-7 с-1.
В других вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, соответствующее изобретению, связывает полипептиды 8р35 или их фрагменты либо варианты со скоростью ассоциации (к(оп)) больше или равной 103 М-1 с-1, 5х103 М-1 с-1, 104 М-1 с-1 или 5х104 М-1 с-1. Альтернативно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, соответствующее изобретению, связывает полипептиды 8р35 или их фрагменты либо варианты со скоростью ассоциации (к(оп)) больше или равной 105 М-1 с-1, 5х105 М-1 с-1, 106 М-1 с-1 или 5х106 М-1 с-1 или 107 М-1 с-1.
В различных вариантах осуществления антитело к 8р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, как описано в данном контексте, является антагонистом активности 8р35. В ряде вариантов осуществления, например, связывание антагонистического антитела к 8р35 с 8р35, как экспрессируется на нейронах, блокирует миелин-ассоцированное ингибирование отрастания невритов или гибель нервных клеток. В других вариантах осуществления связывание антитела к 8р35 с 8р35, как экспрессируется на олигодендроцитах, блокирует ингибирование роста или дифференцировки олигодендроцитов или блокирует демиелинизацию или дисмиелинизацию нейронов ЦНС.
Пока специально не указано, как используют в данном контексте, его фрагмент, эталонный в отношении антитела, относится к антигенсвязывающему фрагменту, т.е. части антитела, которая специфически связывается с антигеном. В одном варианте осуществления антитело к 8р35, например антитело, соответствующее изобретению, представляет собой биспецифическое антитело к 8р35, связывающий полипептид или антитело, например биспецифическое антитело, минибоди, антитело с делецией домена или слитый белок, обладающий специфичностью связывания в отношении более чем одного эпитопа, например более чем одного антигена или более чем одного эпитопа на одном и том же антигене. В одном варианте осуществления биспецифическое антитело к 8р35, связывающий полипептид или антитело имеет по меньшей мере один связывающий домен, специфический в отношении по меньшей мере одного эпитопа на полипептиде-мишени, описанном в данном контексте, например 8р35. В другом варианте осуществления биспецифическое антитело к 8р35, связывающий полипептид или антитело имеет по меньшей мере один связывающий домен, специфический в отношении эпитопа на полипептиде-мишени, и по меньшей мере один связывающий мишень домен, специфический в отношении лекарственного препарата или токсина. В еще одном варианте осуществления биспецифическое антитело к 8р35, связывающий полипептид или антитело, имеет по меньшей мере один связывающий домен, специфический в отношении эпитопа на полипептиде-мишени, описанном в данном контексте, и по меньшей мере один связывающий домен, специфический в отношении пролекарственной формы. Биспецифическое антитело к 8р35, связывающий полипептид или антитело может представлять собой тетравалентное антитело, которое имеет два связывающих мишень домена, специфических в отношении эпитопа полипептида-мишени, описанного в данном контексте, и два связывающих мишень домена, специфических в отношении вто- 46 020508 рой мишени. Таким образом, тетравалентное биспецифическое антитело к §р35, связывающий полипептид или антитело могут быть бивалентными в отношении каждой специфичности. Антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, как известно обычным специалистам в области техники, могут включать константную область, которая опосредует одну или более эффекторных функций. Например, связывание компонента С1 комплемента с константной областью антитела может активировать систему комплемента. Активация комплемента важна в опсонизации и лизисе клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительную реакцию и может быть также включена в аутоиммунную гиперчувствительность. Кроме того, антитела связываются с рецепторами на различных клетках посредством Рс-участка с центром связывания Рс-рецептора на Рс-участке антитела, связывающимся с Рс-рецептором (РсК) на клетке. Имеется ряд Рс-рецепторов, которые специфичны в отношении различных классов антитела, включая 1§С (гаммарецепторы), 1дЕ (эпсилон-рецепторы), 1дА (альфа-рецепторы) и 1дМ (мю-рецепторы). Связывание антитела с Рс-рецепторами на клеточных поверхностях переключает ряд важных и разнообразных биологических ответов, включая поглощение и разрушение покрытых антителом частиц, выведение иммунных комплексов, лизис покрытых антителом клеток-мишеней клетками-киллерами (называемый антителозависимой опосредованной клетками цитотоксичностью или АИСС), высвобождение воспалительных медиаторов, плацентарный перенос и контроль продукции иммуноглобулина. Соответственно некоторые варианты осуществления изобретения включают антитело к §р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, в котором, по меньшей мере, фракция одного или более доменов константных участков исключена или иным образом изменена, чтобы обеспечить требуемые биохимические свойства, такие как пониженные эффекторные функции, способность к нековалентной димеризации, повышенная способность к локализации области опухоли, уменьшенный полупериод существования в сыворотке или увеличенный полупериод существования в сыворотке по сравнению с целым неизмененным антителом приблизительно такой же иммуногенности. Например, некоторые антитела, предназначенные для использования в способах диагностики и лечения, описанных в данном контексте, представляют собой антитела с делецией домена, которые включают полипептидную цепь, подобную тяжелой цепи иммуноглобулина, но в которых отсутствует по меньшей мере часть одного или более доменов тяжелой цепи. Например, в некоторых антителах один целый домен константной области модифицированного антитела будет исключен, например, весь или часть домена Сн2 будет исключена.
В ряде антител к §р35 или их антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или производных, описанных в данном контексте, часть Рс может быть подвергнута мутации с целью снижения эффекторной функции с использованием способов, известных в области техники. Например, делеция или инактивация (путем точечных мутаций или других средств) домена константной области может снизить уровень связывания Рс-рецептора циркулирующего модифицированного антитела, повышая тем самым опухолевую локализацию. В других случаях может быть, что модификации константной области, согласующиеся с данным изобретением, замедляют связывание комплемента и, таким образом, уменьшают полупериод существования и неспецифическое связывание конъюгированного цитотоксина. Еще одни модификации константной области могут быть использованы для модификаций дисульфидных связей или олигосахаридных групп, которые дают возможность повышения уровня локализации вследствие повышенной специфичности антигена или гибкости антитела. Полученный в результате физиологический профиль, биодоступность и другие биохимические эффекты модификаций, такие как опухолевая локализация, биораспределение и полупериод существования в сыворотке, можно легко измерить и количественно определить, используя хорошо известные иммунологические способы без проведения излишних экспериментов.
Модифицированные формы антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно получить из целого предшественника или родительского антитела с использованием способов, известных в области техники. Примеры способов более подробно обсуждаются в данном контексте.
В ряде вариантов осуществления как вариабельные, так и константные области антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные являются полностью человеческими. Полностью человеческие антитела можно получить, используя способы, которые известны в области техники и как описано в данном контексте. Например, полностью человеческие антитела к специфическому антигену можно получить путем введения антигена трансгенному животному, которое модифицировано так, чтобы получить данные антитела в ответ на введение антигена, но эндогенные локусы дезактивированы. Примеры способов, которые можно использовать для получения данных антител, описаны в патентах США 6150584, 6458592, 6420140, которые включены в виде ссылки во всей их полноте. Другие способы известны в области техники. Полностью человеческие антитела можно аналогичным образом получить различными способами представления, например представления на фагах или с помощью систем представления на других вирусах, как более подробно описано в других разделах данного материала.
Антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно получить или изготовить с использованием способов, которые известны в области техники. В ряде вариантов осуществления молекулы антитела или их фрагменты получают ре- 47 020508 комбинантным путем, т.е. получают с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Примеры способов получения молекул антитела или их фрагментов более подробно обсуждают в других разделах данного материала.
Антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, также включают производные, которые модифицированы, например, посредством ковалентного присоединения молекулы любого типа к антителу, так что ковалентное присоединение не препятствует антителу специфически связываться с родственным ему эпитопом. Например, но не в порядке ограничения, производные антитела включают антитела, которые модифицированы, например, гликозилированием, ацетилированием, пегилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией известными защитными/блокирующими группами, протеолитическим расщеплением, связыванием с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Любые из множества химических модификаций можно осуществить известными способами, включая, но без ограничения перечисленным, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникмицина и т.п. Кроме того, производное может включать одну или более неклассических аминокислот.
В ряде вариантов осуществления антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, не будут вызывать вредный иммунный ответ у животного, которого лечат, например у человека. В одном варианте осуществления антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, модифицируют, чтобы снизить их иммуногенность с использованием признанных в области техники способов. Например, антитела могут представлять собой гуманизированные, приматизированные, деиммунизированные или можно получить химерные. Данные типы антител получены из нечеловеческого антитела, как правило, антитела мышей или приматов, которое сохраняет или в существенной степени сохраняет антигенсвязывающие свойства исходного антитела, но которое менее иммуногенно для человека. Этого можно достигнуть различными способами, включая (а) прививание целых нечеловеческих вариабельных доменов на человеческие константные области с получением химерных антител, (Ъ) прививание по меньшей мере части одного или более нечеловеческих участков, определяющих комплементарность (СЭКк) на человеческий скелет и константных участков с сохранением или без сохранения важных скелетных остатков или (с) трансплантацию целых нечеловеческих вариабельных областей, но маскирование их подобным человеческому отделом путем замены поверхностных остатков. Данные способы описаны в статьях Μοιτίδοη еί а1., Ргос. Ναίΐ. Асай. 8с1. 57:6851-6855 (1984); Μοιτίδοη еί а1., Айт. 1ттипо1. 44:65-92 (1988); Vе^Ьοеуеη еί а1., Бгаегсе 239:1534-1536 (1988); Рай1ац Μο^. 1ттию 28:489-498 (1991); Рай1аи Μο^. Ιιηιηιιη. 57:169-217 (1994) и патенты США №№ 5585089 5693761 5693762 и 6190370, все из которых включены в данном контексте в виде ссылки в их полноте.
Деиммунизацию можно также использовать для снижения иммуногенности антитела. Как используют в данном контексте, термин деиммунизация включает изменение антитела с целью модификации Т-клеточных эпитопов (см., например, νθ 9852976А1, \νϋ 0034317А2). Например, анализируют последовательности УН и Уь из исходного антитела и человеческий Т-клеточный эпитоп картируют из каждой У-области, показывая положение эпитопов относительно участков, определяющих комплементарность (СЭКъ), и других ключевых остатков в последовательности. Отдельные Т-клеточные эпитопы из карты Т-клеточных эпитопов анализируют с целью идентификации альтернативных замен аминокислот с низким риском изменения активности конечного антитела. Создают диапазон альтернативных последовательностей УН и Уъ, включающий комбинации замен аминокислот, и затем данные последовательности вводят в круг связывающих полипептидов, например 8р35-специфические антитела или их иммуноспецифические фрагменты, предназначенные для использования в способах диагностики и лечения, описанные в данном контексте, которые затем тестируют на действие. Как правило, генерируют и тестируют от 12 до 14 вариантов антител. Потом гены полной тяжелой и легкой цепей, включающие модифицированную У- и человеческую С-области, клонируют в экспрессирующие векторы и впоследствии плазмиды вводят в клеточные линии для получения целого антитела. Затем антитела сравнивают в подходящих биохмических и биологических анализах и идентифицируют оптимальный вариант.
Антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно генерировать любым подходящим способом, известным в области техники. Поликлональные антитела к представляющему интерес антигену можно получить различными способами, хорошо известными в области техники. Например, антитело к 8р35, например связывающий полипептид, например 8р35-специфическое антитело или его иммуноспецифический фрагмент, можно ввести различным животным-хозяевам, включая, но без ограничения перечисленным, кроликам, мышам, крысам, курам, хомячкам, козам, ослам и т.п. с целью индукции образования сыворотки, содержащей поликлональные антитела, специфические в отношении антигена. Можно использовать различные адъюванты для повышения иммунологического ответа в зависимости от вида хозяина, и они включают, но без ограничения перечисленным, адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные субстанции, такие как лизолецитин, плуроновые полиолы, полианионы, масляные эмульсии, гемоцианины блюдечка, динитрофенол и потенциально используемые человеческие адъюванты, такие как ВСС (бацилла Кальметта-Герена) и Сο^уηеЪасίе^^ит рагтит. Данные
- 48 020508 адъюванты также хорошо известны в области техники.
Моноклональные антитела можно получить, используя широкий круг способов, известных в области техники, включая использование гибридом, рекомбинантных технологий и технологий представления на фагах или их комбинации. Например, моноклональные антитела можно получить, используя гибридомные способы, включая известные в области техники и описанные, например, в монографиях Наг1о\у е! а1., АпйЪоЛек: Α ЬаЪога!огу Мапиа1 (Лабораторное руководство по антителам), Со1й §ргшд НагЪог ЬаЪога!огу Ргевв, 2-е изд., (1988); Наттегйпд е! а1., в сборнике: Мопос1опа1 ΑΛ^^δ апй Т-Се11 НуЪпйотав (Моноклональные антитела и Т-клеточные гибридомы) ЕЕеЛег, N. Υ., 563-681 (1981) (указанные источники включены в виде ссылки во всей своей полноте). Термин моноклональное антитело, как используют в данном контексте, не ограничен антителами, продуцируемыми гибридомной технологией. Термин моноклональное антитело относится к антителу, которое выделено из одного клона, включая эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу, которым оно получено. Таким образом, термин моноклональное антитело не ограничен антителами, полученными гибридомной технологией. Моноклональные антитела можно получить, используя мышей с выбитым §р35 для увеличения участков распознавания эпитопов. Моноклональные антитела можно получить, используя широкий круг способов, известных в области техники, включая использование гибридом и рекомбинантных технологий и технологий представления на фагах, как описано в других разделах в данном контексте.
При использовании признанных в области техники протоколов в одном примере антитела образуются у млекопитающих при множестве подкожных или внутрибрюшинных инъекций соответствующего антигена (например, очищенных опухоль-ассоциированных антигенов, таких как §р35, или клеток либо клеточных экстрактов, содержащих данные антигены) и адъюванта. Данная иммунизация, как правило, вызывает иммунный ответ, который включает продукцию антиген-реактивных антител активированными спленоцитами или лимфоцитами. Хотя полученные в результате антитела можно собрать из сыворотки животного с получением поликлональных препаратов, часто требуется выделить отдельные лимфоциты из селезенки, лимфатических узлов или периферической крови для получения гомогенных препаратов моноклональных антител (МΑЪδ). Предпочтительно, когда лимфоциты получают из селезенки.
В данном хорошо известном способе (см. статью КоЫег е! а1., Ш!иге 256:495 (1975)) относительно короткоживущие или смертные лимфоциты, выделенные у млекопитающего, которому инъецирован антиген, сливают с линией бессмертных опухолевых клеток (например, клеточной линией миеломы), таким образом образуя гибридные клетки или гибридомы, которые как бессмертны, так и способны продуцировать генетически закодированное антитело В-клетки. Полученные в результате гибриды разделяют на отдельные генетические штаммы с помощью отбора, разведения и повторного выращивания каждого отдельного штамма, содержащего специфические гены для формирования одного антитела. Они продуцируют антитела, которые являются гомогенными в отношении требуемого антигена и в отношении их чистого генетического происхождения их называют моноклональными.
Гибридомные клетки, таким образом, получают, высевают и выращивают в подходящей среде для культивирования, которая предпочтительно содержит одну или более субстанций, которые ингибируют рост или выживаемость неслитых клеток миеломы. Специалисты в области техники будут иметь в виду, что реагенты, клеточные линии и среды для формирования, селекции и роста гибридом коммерчески доступны в ряде источников и стандартизированные протоколы вполне разработаны. Как правило, культуральную среду, в которой выращивают гибридомные клетки, оценивают на продукцию моноклональных антител к требуемому антигену. Предпочтительно, когда специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомой клеток, определяют в анализах ш уйго, таких как иммунопреципитация, радиоиммуноанализ (ΡΙΑ) или твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЕ-ΙδΑ). Затем идентифицируют гибридомные клетки, которые продуцируют антитела требуемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны можно субклонировать способами ограничивающего разведения и выращивать стандартными способами (см. монографию Оойшд, Мопос1опа1 ЛпйЬоШев: РппарШ апй Ргасйсе; Моноклональные антитела - принципы и практический подход, Αсайет^с Ргевв, с. 59-103 (1986)). Далее следует иметь в виду, что моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделить от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки принятыми способами очистки, такими как, например, с использованием белка-А, хроматография на гидроксиапатите, гельэлектрофорез, диализ или аффинная хроматография.
Фрагменты антитела, которые распознают специфические эпитопы, можно генерировать известными способами. Например, фрагменты РаЪ и Р(аЪ')2 можно получить потеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулина с использованием ферментов, таких как папаин (для получения фрагментов РаЪ) или пепсин (для получения фрагментов Р(аЪ')2). Фрагменты Р(аЪ')2 включают вариабельную область, константную область легкой цепи и домен СН1 тяжелой цепи.
Компетентные специалисты в области техники будут также иметь в виду, что ДНК, кодирующая антитела или фрагменты антител (например, центры связывания антигена) также может быть получена из библиотек антител, таких как библиотеки представления на фагах. В частности, данный фаг можно использовать для представления антигенсвязывающих доменов, экспрессируемых из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (например, человеческих или мышиных). Фаг, экспрессирующий
- 49 020508 антигенсвязывающий домен, который связывает представляющий интерес антиген, может быть выбран или идентифицирован с помощью антигена, например с использованием меченого антигена или антигена, связанного или захваченного твердой поверхностью или частицей. Фаг, используемый в данных способах, как правило, представляет собой филаментозный фаг, включающий связывающие домены £б и М13, экспрессируемые с фага, с РаЪ, Ρν ОЕ ΌΆΒ (отдельный участок Ρν из легкой или тяжелой цепей), или стабилизированные дисульфидом Ρν-домены антитела, рекомбинантным образом слитые с белком либо фагового гена III, либо гена УШ. Примеры способов приведены, например, в ЕР 368684 В1, патенте США 5969108, статьях ноодспЪоот, н.К. апб СЪатс8, 1ттипо1. Тобау 27:371 (2000); №-1дус1 с! а1. №1. Мсб. 5:801 (2002); ншс с! а1., Ргос. №!1. Асаб. §с и§А 95:2682 (2001); Ьш с! а1., 1. Мо1. Вю1. 375:1063 (2002), каждая из которых включена в данном контексте в виде ссылки. В ряде публикаций (например, в статье Магк8 с! а1., Вю/ТссЪпо1оду 70:779-783 (1992)) описано получение высокоаффинных человеческих антител путем перестановки цепи, а также комбинаторной инфекции и рекомбинации ш νί\Ό в качестве стратегии конструирования больших библиотек фагов. В другом варианте осуществления можно использовать рибосомное представление для замены бактериофага в качестве представляющей платформы (см., например, статьи напс8 с! а1., Вю!ссЪпо1. 75:1287 (2000); \УП8оп с! а1., Ргос. Асаб. §сг и§А
95:3750 (2001) или Ιινίπ§ с! а1., 1. 1ттипо1. Мс!Ноб8 248:31 (2001)). В еще одном варианте осуществления библиотеки на клеточных поверхностях подвергают скринингу на антитела (см. статьи Вобсг с! а1., Ргос. №!1. Асаб. §с1. и§А 97:10701 (2000); ОаидЪсЪу с! а1., 1. 1ттипо1. Мс!Ноб8 243:211 (2000)). Данные способы представляют альтернативы традиционным гибридомным технологиям в плане выделения и последующего клонирования моноклональных антител.
В способах представления на фагах функциональные домены антитела представляют на поверхности фаговых частиц, которые несут кодирующие их последовательности полинуклеотидов. Например, последовательности ДНК, кодирующие области Ун и Уъ, амплифицируют из библиотек кДНК животных (например, библиотек человеческой или мышиной кДНК лимфоидной ткани) или библиотек синтетических кДНК. В ряде вариантов осуществления ДНК, кодирующая области Ун и Уъ, связаны друг с другом линкером 8сΡν посредством ПЦР и клонированы в фагемидный вектор (например, р САКТАВ 6 или рСотЪ 3 н§§). Вектор вводят электропорацией в Е. соЪ и Е. соЪ инфицируют хелперным фагом. Фаг, используемый в данных способах, как правило, представляет собой филаментозный фаг, включающий £б и М13, и области Ун или Уъ обычно рекомбинантным путем слиты либо с геном III, либо с геном УШ фага. Фаг, экспрессирующий антигенсвязывающий домен, который связывается с представляющим интерес антигеном (т.е. полипептидом §р35 или его фрагментом), можно выбрать или идентифицировать с помощью антигена, например, с использованием меченого антигена или антигена, связанного или захваченного твердой поверхностью или частицей.
Дополнительные примеры способов представления на фагах, которые можно использовать для получения антител, включают описанные в статьях Вппктап с! а1., 1. Iттиηο1. Мс11юб8 752:41-50 (1995); Атс8 с! а1., 1. Iттиηο1. Мс!Ноб8 754:177-186 (1995); КсШсЪогоидЪ с! а1., Еиг. 1. Iттиηο1. 24:952-958 (1994); Рсг8Ю с! а1., Оспс 757:9-18 (1997); Виг!оп с! а1., Абνаηсс8 ш Ъптшкйоду 57:191-280 (1994); заявке АррЪсаЪоп № РСТ/ОВ91/01134; публикациях РСТ νΟ 90/02809; νΟ 91/10737; νΟ 92/01047; νΟ 92/18619; νθ 93/11236; νθ 95/15982; νθ 95/20401 и патентах США №№ 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108, каждый из которых включен в данном контексте в виде ссылки во всей полноте.
Как описано в вышеуказанных ссылках, после селекции фага кодирующие антитело участки из фага можно выделить и использовать для генерации полных антител, включая человеческие антитела или любой другой требуемый антигенсвязывающий фрагмент, и экспрессировать в любом требуемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии. Например, технологии рекомбинантного получения фрагментов РаЪ, РаЪ' и Р(аЪ')2 можно также использовать с помощью способов, известных в области техники, таких как описаны в публикации РСТ νθ 92/22324; статьях МиШпах с! а1., ВюТсс1тк.]ис8 12(6):864-869 (1992), §а\\зи с! а1., А1К1 34:26-34 (1995) и Всйсг с! а1., §сюпсс 240:1041-1043 (1988) (указанные материалы включены в виде ссылки во всей своей полноте).
Примеры способов, которые могут быть использованы для получения одноцепочечных Ρν8 и антител, включают описанные в патентах США №№ 4946778 и 5258498; статьях ни8!оп с! а1., Мс11юб8 ш Еп/лпю1оу\ 205:46-88 (1991); §Ни с! а1., Р\А§ 90:7995-7999 (1993) и §ксгга с! а1., §сюпсс 240:1038-1040 (1988). Для некоторых вариантов применения, включая использование антител ш νί\Ό у человека и в анализах определения ш νίϋΌ, может быть предпочтительным использовать химерные, гуманизированные или человеческие антитела. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части антитела выделены у животных разных видов, например антитела, имеющие вариабельную область, выделенную из мышиного моноклонального антитела, и константную область человеческого иммуноглобулина. Способы получения химерных антител известны в области техники; см., например, статьи Мот8оп, §сюпсс 229:1202 (1985); Οί с! а1., ВюТсс1тк.]ис8 4:214 (1986); 0ПЪс8 с! а1., 1. Iттиηο1 Мс!Ноб8 725:191-202 (1989); патенты США №№ 5807715, 4816567 и 4816397, которые включены в данном контексте в виде ссылки во всей своей полноте. Гуманизированные антитела представляют собой молекулы антител, выделенные из антитела видов, отличных от человека, которое связывает требуемый анти- 50 020508 ген, имеющий один или более участков определения комплементарности (СГОМ). полученный у вида, отличного от человека, и скелетные участки из молекулы человеческого иммуноглобулина. Часто скелетные остатки на человеческих скелетных участках будут заменены соответствующим остатком из СОК донорного антитела, чтобы изменить, предпочтительно повысить уровень связывания антигена. Данные скелетные замены идентифицируют способами, хорошо известными в области техники, например путем моделирования взаимодействий СОК и скелетных остатков с целью идентификации скелетных остатков, важных для связывания антигена, и сравнения последовательностей с целью идентификации необычных скелетных остатков в определенных положениях (см., например, Оиееп е! а1., патент США № 5585089; статью ШесЬтаип е! а1., Иа!иге 332:323 (1988), которые включены в данном контексте путем ссылки во всей своей полноте). Антитела можно гуманизировать с использованием ряда способов, известных в области техники, включая, например, СГОК-прививание (см. ЕР 239400; публикацию РСТ АО 91/09967; патенты США №№ 5225539, 5530101 и 5585089), покрытие или перекладку поверхности (см. ЕР 592106, ЕР 519596, статьи Рай1ап, Мо1еси1аг 1ттипо1оду 28(4/5):489-498 (1991); §!ийтска е! а1., Рго!еш Епдтеегшд 74:805-814 (1994); Кодизка. е! а1., РИА8 97:969-973 (1994)) и перестановку цепи (см. патент США № 5565332, который включен посредством ссылки в своей полноте).
Полностью человеческие антитела особенно необходимы для терапевтического лечения больных людей. Человеческие антитела можно получить рядом способов, известных в области техники, включая вышеописанные способы представления на фагах с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей человеческого иммуноглобулина; см. также патенты США №№ 4444887 и 4716111 и публикации РСТ АО 98/46645, АО 98/50433, АО 98/24893, АО 98/16654, АО 96/34096, АО 96/33735 и АО 91/10741, каждая из которых включена в данном контексте в виде ссылки в своей полноте.
Человеческие антитела можно также получить, используя трансгенных мышей, которые не способны к экспрессии функциональных эндогенных иммуноглобулинов, но которые могут экспрессировать гены человеческого иммуноглобулина. Например, комплексы генов тяжелой и легкой цепей человеческого иммуноглобулина можно интродуцировать случайным образом или путем гомологичной рекомбинации в эмбриональные стволовые клетки мыши. Альтернативно, человеческую вариабельную область, константную область и область разнообразия можно интродуцировать в эмбриональные стволовые клетки мыши в дополнение к генам тяжелой и легкой цепи человека. Гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина мыши можно сделать нефункциональными отдельно или одновременно с интродукцией локусов человеческого иммуноглобулина путем гомологичной рекомбинации. В частности, гомозиготная делеция участка Ш препятствует продукции эндогенного антитела. Модифицированные эмбриональные стволовые клетки размножают и микроинъекцией вводят в бластоциты для получения химерных мышей. Затем химерных мышей скрещивают для получения гомозиготного потомства, которое эспрессирует человеческие антитела. Трансгенных мышей иммунизируют нормальным образом выбранным антигеном, например всем или частью требуемого полипептида-мишени. Моноклональные антитела, направленные на антиген, можно получить от иммунизированных трансгенных мышей при использовании принятой гибридомной технологии. Трансгены человеческого иммуноглобулина, которые несут трансгенные мыши, реаранжируются в процессе дифференцировки В-клеток и затем подвергаются переключению класса и соматической мутации. Таким образом, используя данный способ, возможно получить терапевтически эффективные антитела 1дО, 1дА, 1дМ и 1дЕ. В плане обзора данного способа получения человеческих антител см. статью ЬопЪегд апй Нп5/аг 1п!. Кеу. 1ттипо1. 73:65-93 (1995). В плане подробного обсуждения данного способа получения человеческих антител и человеческих моноклональных антител и способов получения данных антител см., например, публикации РСТ АО 98/24893, АО 96/34096, АО 96/33735, патенты США №№ 5413923, 5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, 5814318 и 5939598, которые включены в виде ссылки в данном контексте в их полноте. Кроме того, таким фирмам, как АЪдетх, 1пс. (Ргеетоп!, СаПГ.) и ОепРЬагт (§ап 1озе, СаПГ.) можно сделать заказ на получение человеческих антител, направленных на выбранный антиген, с использованием технологии, аналогичной вышеописанной.
Полностью человеческие антитела, которые распознают выбранный эпитоп, можно генерировать с использованием способа, называемого направленной селекцией. В данном подходе выбранное нечеловеческое моноклональное антитело, например мышиное антитело, используют для того, чтобы направлять селекцию полностью человеческого антитела, распознающего тот же самый эпитоп (см. статью 1езрегз е! а1., ВюТесЬпо1оду 72:899-903 (1988); см. также патент США № 5565332, который включен в виде ссылки в своей полноте).
Кроме того, антитела к полипептидам-мишеням, соответствующим изобретению, могут, в свою очередь, быть использованы для генерации антиидиотипических антител, которые имитируют полипептиды-мишени, с использованием способов, хорошо известных компетентным специалистам в области техники (см., например, статьи Огеепзрап & Вопа, РА8ЕВ 1. 7(5):437-444 (1989) и №88шо£Г, 1. 1ттипо1. 147(8):2429-2438 (1991)). Например, антитела, которые связываются и конкурентно ингибируют мультимеризацию полипептида и/или связывание полипептида, соответствующего изобретению, с лигандом, могут быть использованы для генерации антиидиотипов, которые имитируют мультимеризацию полипептида и/или домен связывания и, вследствие этого, связываются и нейтрализуют полипептид и/или его
- 51 020508 лиганд. Данные нейтрализующие антиидиотипы или фрагменты РаЪ данных антиидиотипов могут быть использованы в терапевтических схемах для нейтрализации лиганда полипептида. Например, данные антиидиотипические антитела могут быть использованы для связывания требуемого полипептидамишени и/или связывания его лигандов/рецепторов и, таким образом, блокирования его биологической активности.
В другом варианте осуществления ДНК, кодирующую требуемые моноклональные антитела, легко можно выделить и секвенировать с использованием принятых способов (например, при использовании олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Выделенные и субклонированные гибридомные клетки служат предпочтительным источником данной ДНК. После выделения ДНК можно поместить в экспрессирующие векторы, которыми затем трансфицируют прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, такие как клетки Е. соИ, клетки С08 обезьян, клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые в иных случаях не продуцируют иммуноглобулины. Более подробно, выделенную ДНК (которая может быть синтетической, как описано в данном контексте) можно использовать для клонирования последовательностей константной и вариабельной областей для получения антител, как описано №\утап с1 а1., см. патент США № 5658570, поданный 25 января 1995 г., который включен в виде ссылки в данном контексте. В основном способ предусматривает экстракцию РНК из выбранных клеток, превращение в кДНК и амплификацию с помощью ПЦР с использованием ^-специфических праймеров. Подходящие праймеры для данной цели также описаны в патенте США № 5658570. Как более подробно будет обсуждаться ниже, трансформированные клетки, экспрессирующие требуемое антитело, можно вырастить в относительно больших количествах для получения клинических и коммерческих запасов иммуноглобулина.
В одном варианте осуществления антитело к 8р35, соответствующее изобретению, включает по меньшей мере один СОК тяжелой или легкой цепи молекулы антитела, в другом варианте осуществления антитело к 8р35, соответствующее изобретению, включает по меньшей мере два СГОК из одной или более молекул антитела, в другом варианте осуществления антитело к 8р35, соответствующее изобретению, включает по меньшей мере три СГОК из одной или более молекул антитела. В другом варианте осуществления антитело к 8р35, соответствующее изобретению, включает по меньшей мере четыре СОК из одной или более молекул антитела, в другом варианте осуществления антитело к 8р35, соответствующее изобретению, включает по меньшей мере пять СОК из одной или более молекул антитела, в другом варианте осуществления антитело к 8р35, соответствующее изобретению, включает по меньшей мере шесть СГОК из одной или более молекул антитела. Примеры молекул антитела, содержащих по меньшей мере один СОК, которые могут быть включены в представленные антитела к 8р35, описаны в данном контексте.
В специальном варианте осуществления может быть проверена последовательность аминокислот вариабельных доменов тяжелой и/или легкой цепей с целью идентификации последовательностей участков, определяющих комплементарность (СОК), способами, которые хорошо известны в области техники, например путем сравнения с известными последовательностями аминокислот других вариабельных участков тяжелой и легкой цепей для определения участков гипервариабельности последовательности. С использованием рутинных технологий рекомбинантной ДНК один или более СГОК можно ввести в скелетные области, например в человеческие скелетные области, с целью гуманизации нечеловеческого антитела. Скелетные участки могут быть природными или консенсусными скелетными участками и предпочтительно человеческими скелетными участками (см., например, статью С'ЪоЪйа с1 а1., ί. Мо1. ΒίοΙ. 278:457-479 (1998) в плане перечня человеческих скелетных участков). Предпочтительно, когда полинуклеотид, генерируемый путем комбинирования скелетных участков и СГОК, кодирует антитело, которое специфически связывается по меньшей мере с одним эпитопом требуемого полипептида, например 8р35. Предпочтительно, когда одну или более замен аминокислот можно сделать в скелетных участках и предпочтительно, когда замены аминокислот повышают уровень связывания антитела с его антигеном. Кроме того, данные способы можно использовать для получения замен или делеций аминокислот одного или более остатков цистеина вариабельной области, участвующих в межцепочечной дисульфидной связи с целью генерации молекул антитела, в которых отсутствует одна или более из межцепочечных дисульфидных связей. Другие изменения в полинуклеотиде охватываются настоящим изобретением и входят в компетенцию специалистов в области техники.
Кроме того, можно использовать способы, разработанные для получения химерных антител (см. статьи Моткой е! а1., Ргос. Ναΐ1. Асай. 8с1. 57:851-855 (1984); ШиЪегдег е! а1., Ш1иге 572:604- 608 (1984); Такейа е! а1., №1иге 314:452-454 (1985)) путем сплайсинга генов из молекулы мышиного антитела соответствующей специфичности к антигену вместе с генами из молекулы человеческого антитела подходящей биологической активности. Как используют в данном контексте, химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части получены от животных разных видов, такую как имеющую вариабельную область, выделенную из мышиного моноклонального антитела, и константную область человеческого иммуноглобулина, например гуманизированные антитела.
Альтернативно, способы, описанные для получения одноцепочечных антител (см. патент США №
- 52 020508
4694778; статьи Вий, 8с1епсе 242:423-442 (1988); НикЮп е! а1., Ргос. №И1 Асай. 8с1. И8А 55:5879-5883 (1988) и \Уагй е! а1., №йиге 354:544-554 (1989)), можно адаптировать для получения одноцепочечных антител. Одноцепочечные антитела образуются посредством связывания фрагментов тяжелой и легкой цепей Ρν-участка аминокислотным мостиком, дающего в результате одноцепочечное антитело. Можно также использовать способы сборки функциональных Ρν-фрагментов в Е. сой (см. статью 8кегга е! а1., 8иепсе 242:1038-1041 (1988)).
Еще одни варианты осуществления настоящего изобретения включают генерацию человеческих или в существенной степени человеческих антител в трансгенных животных (например, мышах), которые не способны к продукции эндогенного иммуноглобулина (см., например, патенты США №№ 6075181, 5939598, 5591669 и 5589369, каждый из которых включен в данном контексте в виде ссылки). Например, было описано, что гомозиготная делеция участка, связывающего тяжелые цепи антитела, у химерных и мутантных по зародышевой линии мышей приводит в результате к полному ингибированию эндогенной продукции антитела. Перенос последовательности гена человеческого иммуноглобулина данным мышам, мутантным по зародышевой линии, будет в результате приводить к продукции человеческих антител при введении антигена. Другие предпочтительные средства генерации человеческих антител с использованием мышей 8СГО раскрыты в патенте США № 5811524, который включен в данном контексте в виде ссылки. Следует иметь в виду, что генетический материал, связанный с данными человеческими антителами, также можно выделить и провести с ним манипуляции, как описано в данном контексте.
Еще одно высокоэффективное средство генерации рекомбинантных антител описано в статье №\\тап, Вю!есЬио1оду 10: 1455-1460 (1992). В частности, данный способ приводит в результате к генерации приматизированных антител, которые включают вариабельные домены обезьян и человеческие константные последовательности. Данный материал включен в виде ссылки в своей полноте в данном контексте. Более того, данный способ описан также, как правило, в переуступленных патентах США №№ 5658570, 5693780 и 5756096, каждый из которых включен в данном контексте в виде ссылки.
В другом варианте осуществления лимфоциты можно отселектировать путем микроманипуляций и выделить вариабельные гены. Например, можно выделить мононуклеарные клетки периферической крови у иммунизированного животного и культивировать в течение приблизительно 7 дней ш νίΐΓΟ. Культуры можно подвергнуть скринингу на специфические 1§С8, которые соответствуют критериям скрининга. Клетки из положительных лунок можно выделить. Отдельные 1д-продуцирующие В-клетки можно выделить посредством РАС8 или путем идентификации их в комплемент-опосредованном анализе гемолитических бляшек. С 1д-продуцирующими В-клетками можно проводить микроманипуляции в пробирке и гены Ун и Уъ можно амплифицировать, используя, например, ОТ-ПЦР. Гены Ун и Уъ можно клонировать в экспрессирующий антитело вектор и трансфицировать ими клетки (например, эукариотические или прокариотические клетки) для экспрессии.
Альтернативно, клеточные линии, продуцирующие антитело, можно отселектировать и культивировать, используя способы, хорошо известные опытному специалисту. Данные способы описаны в множестве лабораторных руководств и первичных публикаций. В данном аспекте способы, подходящие для использования в изобретении, как описано ниже, представлены в монографии Сиггеп! РгоЮсоЕ ш 1ттипо1оду (Современные протоколы в иммунологии), под ред. Сойдап е! а1., Сгееп РиЬШЫпд А88ос1а!е8 апй ^йеу-1п!ег8аепсе, 1о1т \УПеу апй 8оп8, №ν Уогк (1991), которая в данном контексте включена в виде ссылки в своей полноте, включая дополнения.
Антитела, предназначенные для использования в диагностических и терапевтических способах, описанных в данном контексте, можно получить любым способом, известным в области техники, предназначенным для антител, в частности, путем химического синтеза или предпочтительно путем способов рекомбинантной экспрессии, как описано в данном контексте.
В одном варианте осуществления антитело к 8р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, соответствующее изобретению, включает синтетическую константную область, в которой один или более доменов частично или полностью удален (антитела с делецией домена). В ряде вариантов осуществления совместимые модифицированные антитела будут включать конструкции с делецией домена или варианты, в которых удален целый домен Сн2 (конструкции АСн2). Для других вариантов осуществления короткий связывающий пептид может заменять удаленный домен, чтобы обеспечить гибкость и свободу движения вариабельной области. Компетентные специалисты в области техники будут иметь в виду, что данные конструкции являются особенно предпочтительными вследствие регуляторных свойств домена СН2 в отношении скорости катаболизма антитела. Конструкции с делецией домена можно выделить с помощью вектора (например, фирмы Вюдеп ГОЕС 1псогрога!ей), кодирующего человеческие константны домен 1дС1 (см., например, \У0 02/060955 А2 и \У0 02/096948А2, которые включены в виде ссылки в своей полноте). Данный пример вектора разработан для удаления домена Сн2 и получения синтетического вектора, экспрессирующего константную область 1дС1 с делецией домена.
В ряде вариантов осуществления антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, представляют собой минибоди. Минибоди можно получить с использованием способов, описанных в области техники (см., например, патенты США
- 53 020508
5837821 или №О 94/09817 А1, которые включены в виде ссылки в своей полноте).
В одном варианте осуществления антитело к §р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, соответствующее изобретению, включает тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую делецию или замену нескольких или даже одной аминокислоты в той мере, в которой позволяет связь между мономерными субъединицами. Например, мутации одной аминокислоты в выбранных областях домена Сн2 может быть достаточно для существенного снижения связывания Рс и, следовательно, повышения уровня опухолевой локализации. Аналогично может потребоваться просто удалить ту часть одного или более доменов константной области, которая контролирует эффекторную функцию (например, связывание комплемента), которую предусматривают модулировать. Данные частичные делеции константных областей могут улучшать выбранные свойства антитела (полупериод существования в сыворотке), сохраняя при этом интактными другие требуемые функции, связанные с данным доменом константной области. Более того, как упомянуто выше, константные области описанных антител могут быть синтетическими, несмотря на мутацию или замену одной или более аминокислоты, которая улучшает профиль полученной в результате конструкции. В этом плане может быть возможным нарушение активности, обеспечиваемой консервативным центром связывания (например, связывания Ес) при поддержании в существенной степени конфигурации и иммуногенного профиля модифицированного антитела. Еще одни варианты осуществления включают введение одной или более аминокислот в константную область для усиления требуемых свойств, таких как эффекторная функция или обеспечение повышенного уровня связывания цитотоксина или углевода. В данных вариантах осуществления может требоваться инсерция или репликация специфических последовательностей, выделенных из выбранных доменов константных областей.
Настоящее изобретение предусматривает также антитела, которые включают, состоят в основном или состоят из вариантов (в том числе производных) молекул антитела (например, областей Ун и/или областей Уь), описанных в данном контексте, причем данные антитела или их фрагменты иммуноспецифически связываются с полипептидом §р35 или его фрагментом либо вариантом. Стандартные способы, известные компетентным специалистам в области техники, можно использовать для интродукции мутаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к §р35, включая, но без ограничения перечисленным, сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез, который приводит в результате к замене аминокислот. Предпочтительно, когда варианты (включая производные) кодируют меньше чем 50 замен аминокислот, меньше чем 40 замен аминокислот, меньше чем 30 замен аминокислот, меньше чем 25 замен аминокислот, меньше чем 20 замен аминокислот, меньше чем 15 замен аминокислот, меньше чем 10 замен аминокислот, меньше чем 5 замен аминокислот, меньше чем 4 замены аминокислот, меньше чем 3 замены аминокислот или меньше чем 2 замены аминокислот относительно эталонной области Ун, УнСИК1, \®С1)Н2. У..С1Ж® области Уь УЬСИК1, V СГОН2 или V С1Ж® Консервативная замена аминокислоты представляет собой замену, в которой остаток аминокислоты заменяют остатком аминокислоты, имеющим боковую цепь с аналогичным зарядом. Семейства остатков аминокислот, имеющих боковые цепи с аналогичными зарядами, определены в области техники. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Альтернативно, мутации можно интродуцировать случайным образом во всей или по части кодирующей последовательности, например, путем насыщающего мутагенеза и полученные в результате мутанты могут быть подвергнуты скринингу на биологическую активность с целью идентификации мутантов, которые сохраняют активность (например, способность связывать полипептид §р35). Например, возможно интродуцировать мутации только в скелетные области или только в участки СОК молекулы антитела. Интродуцированные мутации могут быть молчащими или нейтральными миссенс-мутациями, т.е. не иметь или иметь маленький эффект в отношении способности антитела связываться с антигеном. Данные типы мутаций могут быть эффективными в плане оптимизации использования кодона или повышения продукции антитела гибридомой. Альтернативно, ненейтральные миссенс-мутации могут изменять способность антитела связывать антиген. Местоположением большинства молчащих или нейтральных миссенсмутаций, вероятно, являются скелетные участки, тогда как местоположением большинства ненейтральных миссенс-мутаций, по-видимому, является СОК, хотя это не является абсолютным требованием. Компетентный специалист в области техники смог бы создать и тестировать мутантные молекулы с требуемыми свойствами, такие как отсутствие изменений в антигенсвязывающей активности или изменение связывающей активности (например, усовершенствования в антигенсвязывающей активности или изменение в специфичности антитела). После мутагенеза кодируемый белок можно рутинно экспрессировать и функциональную и/или биологическую активность кодируемого белка (например, способность к иммуноспецифическому связыванию по меньшей мере одного эпитопа полипептида 8р35) можно определить, используя способы, описанные в данном контексте, или путем рутинной модификации способов,
- 54 020508 известных в области техники.
Ιν. Полинуклеотиды, кодирующие антитела к δр35.
Настоящее изобретение предусматривает также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела к δр35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (νΗ), в которой по меньшей мере один из СЭКк вариабельной области тяжелой цепи или по меньшей мере два из СЭКк вариабельной области тяжелой цепи по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны эталонным последовательностям аминокислот СЭК1, СЭК2 или С1Ж3 тяжелой цепи из моноклональных антител к δр35, описанных в данном контексте. Альтернативно, участки СЭК1, СЭК2 и С1Ж3 νΗ по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны эталонным последовательностям аминокислот ТСПК1,СЭК2 или С1Ж3 тяжелой цепи из моноклональных антител к δр35, описанных в данном контексте. Таким образом, согласно данному варианту осуществления вариабельная область тяжелой цепи, соответствующая изобретению, имеет последовательности полипептидов СЭК1, С1Ж2 или СЭК3, родственные последовательностям полипептидов, показанным в табл. 4.
Таблица 4
Эталонные последовательности аминокислот νΗ СЭК1, С1Ж2 и СЭК3*
Название антитела ун-сши УН-СНИ νΗ-стаи
1лЮ Ρ-ΤΥΡΜν (δΕΟ ГО N0:6) Ρ-νΠΟΡδΟανΤΑΥΑΟβνΚΟ (ЗЕО ГО N0:8) Ρ-ΡΎδδΟΠννΠΡΜ, (ЗЕО ГО N0:10)
№АСТТАОССТАТСО1 (ЗЕО ГО N0:5) Ν-ТОСАТСССТССТТСТ ООТСОСОТТАСТОСТТА ТОСТОАСГССОТТАААООТ (ЗЕО ГО N0:7) РМХХЯГЛТАССАСТОССГ ООТОООАСТГСОАТСТС (δΕΟ ГО N0:9)
1л07 ΡΜ4ΥΡΜ0 (8ΕΟΠ)ΝΟ:12) Ρ-δΚΡδΟΟΡΤδΥΑϋδνΚΟ (8ΕΟΠ3ΝΟ:14) РЧЖНАПМ (δΕΟ ГО N0:16)
Ν-АТОТАСГГТАТОСС (ЗЕО ГО N0:11) НИСТАТСТСТСХТТСТСОТОССПТА< ТТСТГАТОСТСАСТССОТГАААООТ (δΕΟ ГО N0:13) Ν-ОАТСООСАТОСТТТГОАТАТС (8Е0 ГО N0:15)
Ь05 Ρ-ΑΥΑΜΟ (δΕΟ Πϊ N0:18) ρ-δίνδδοογτοΥΑΟδνκο (δΕΟ Ш N020) Ρ-ΒΟΟΗΝΑΡΜ (δΕΟ ГО N0:22)
ν-сттасостатсоо: (ЗЕО ГО N0:17) Н-ТСТАТСОТГГСТГСТСОГООСГ АТАСТОАТТАТОСГОАСТСООТГ ΑΑΑΟΟΤ (δΕΟ Ю N0:19) Ν-ОАСООТОАССАТААТОСПТТ ОАТАТС (δΕΟ ГО N0:21)
ин Ρ-δΥΑΜΥ (8Ε0 Π>ΝΟ;24) ρ-δΒΤδοογτσΥΑϋδνκα (3Ε0Π)ΝΟ26) Ρ-ΟΤδΙΜΦΥΥΥΜΟν (ЗЕО ГО N0:2 8)
' Ν-ТСТТАСССТАТОТА (δΕΟ ГО N0:23) Ν-ТСГАТСТСТАСТТСГООТОССТА ТАСТОСТТАТОСГСАСТСССТТАААС ОТ (δΕΟ ГО N025) Ν-ОАТАССАСССАТААТОАС ТАСТАСТАСАТО0АСОТС (ЗЕО ГО N0:27)
ио1 Ρ=ΚΥ0ΜΤ (δΕΟ Π) N0:30) Ρ=8ΙΥΡ3ΟΟΝΤνΥΑΟ8νκα (δΕΟ ГО N0:32) Р-ОТТВАУГОУ (ЗЕО ГО N0:34)
Название антитела УН-СВИ УН-СОИ УН-СОИ
№=ААОТАССАОАТО, АСТ (ЗЕО ГО N029) Ν-ТСТАТСТАТССТТСТООТООСАА ТАСТОТТТАТССТСАСТССОТГАА АООТ (8ΕΟΠ>ΝΟ:31) Ν-ОООАСГАСАОАООСАСТСГТ ТОАСТАС (ЗЕО ГО N0:33)
и 12 Ρ=0ΥΝΜΕ (8ΕΟΠ3ΝΟ:36) Р=М88800МТМУАО8УК0 (ЗЕО ГО N0:38) Ρ-ΒΛΙΛΗΥΟδΟΟδΟΥδΟΥΥΎΥΟΜΟν (δΕΟ ГО N0:40)
Ν- САСТАСААТАТОТ ΓΓ (5Е0 ГО N0:35) Ν- СОТАТСТСГГСГГСТООТООСАТ ОАСГАТОТАТОСТСАСТССОТТААА СОТ (8Ε0©ΝΟ:37) Ν- ОААОССТТАСООССГГАТТО ТАОТСОТООТАаСТаСТАСГССО АСТАСТАСТАСТАСОСТАТООАС ОТС (ЗЕО ГО N0:39)
иоб Ρ-ΕΥΡΜΟ (δΕΟ ГО N0:42) ρ-δΐΥδδοοδτνΥΑΟδίκο (δΕΟ ГО N0:44) Р—ЕОГКЮАПИ (δΕΟ ГО N0:46)
№ЮАОТАСССТАТОО ΑΤ (δΕΟ ГО N0:41) Н=ТСГАТСГАТТСГТСТООТООСГС ТАСТОТГГАТОСГОАСТССАТТАА АООТ (ЗЕО ГО N0:43) Ν-ОАОООТОАСТСТОАТОСТТТТ ОАТАТС (ЗЕО ГО N0:45)
иов Ρ=ΗΥΕΜν (8Ε(2 ГО N0:48) Р=51К55ООАТКУА ΏδνΚΟ(δΕΟΙΟΝΟ^Ο) Ρ-ΒδΡΟΟΥΡΟΥ (ЗЕО ю N0:52)
Ν= САТТАСОАОАТСС ΤΤ (δΕΟ ГО N0:47) Ν- ТСТАТСССТТСТГСТООТООСОСТ АСТААОТАТССГОАСТССОТТАААО ОТ (8Е<3 ГО N0:49) Ν- САСТССССАСАСОАСТАСТТТ ОАСТАС (ЗЕО ГО N0:51)
иоз Ρ-ΟΥΡΜΕ (5Б0ГО N0:54) ΡΌΙΥΡδΟΟδΤνΥΑΟδνΚΟ (8ЕОГОЮ:5б) Р=АООЯТХЮИЗУ (8Е0 ГО N0:58)
Ν-САОТАСССТАТО ОАО (ЗЕО ГО N0:53) М^СТАТСТАТССТТСТОСТООСТСТА СТОТГГАТОСТОАСТССОТГАААООТ (ЗЕО ГО N0:55) №=ОСССООСАОТОССГОйСССАС ТТТСАСТАС (ЗЕО ГО N0:57)
- 55 020508
Название антитела УН-СОШ УН-СОШ ун-стжз
ьк» Ρ-ΜΥ5ΜΥ (ЗЕО ГО N0:60) Ρ-ΥΒΡδΟΟΚΤΜΥΑϋδνΚΟ (ЗЕО ГО N0:62) Ρ°Ο5ΚΚΚΥΥΟΡΥ3ΟΥΗΝΥΥΥΥΥΜ ϋν (ЗЕО ГО N0:64)
м=атотастстатсс ТТ (ЗЕО ГО N0:59) Ν-ТАТАТСГСТССТГСТООТаОСААО АСТАТОТАТаСТОАСТССОТГАААОО! (ЗЕО ГО N0:61) Ν-ОАТГСОАОАСОССООТАТТАСО АТПТГОСАОтеСТГАТСАСААСТА СТАСТАСТАСТАСАТООАОЗТС (ЗЕО ГО N0:63)
1д04 Ρ=ΚΥΝΜΟ (ЗЕО ГО N0:66) ' Р=УПГР8ССОТНУАО8УКО (ЗЕО ГО N0:68) Р*81АМЭЛПЛ (ЗЕО ГО N0:70)
Ν-СОТТАСААТАТОО ОТ (ЗЕО ГО N0:65) НЧГГТАТСГАТССГТСТООТСОСООТ АСТСАТГАТОСГОАСТССОТТАААСС1 (ЗЕО ГО N0:67) Ν-ТСТАТАОСАОАТОАТОСТТТТаА ТАТС (ЗЕО ГО N0:69)
йог Ρ-ΤΥΕΜΙ (ЗЕО ГО N0:72) Р-ЗКЗРЗСССПУУАОЗУКС (ЗЕО ГО N0:74) Р-МУУСУИШЭ88О)УАПЯ (ЗЕО ГО N0:76)
Г*=АСТТАСОАОАТС АТТ (ЗЕО ГО N0:71) Ν-ТСТАТСООТССГГСГООТСССС ТТАСГГООТАТОСТСАСТСССГГААА (ЗЕО ГО N0:73) Ν-АТОТАТТАСГОТОТАСООАТГСА ТОАТАСТАОТООТТССОСГПТОАТ АТС (ЗЕО ГО N0:75)
1л 13 Р=НУЕМУ(5Е0ГО N0:389) Р-ЫУЗЗООРТКУАОЗУКО (ЗЕО ГО N0:390) Ρ=Β00ΝΠΑΡ01 (ЗЕО ГО N0:391)
1л32 Ρ-ΑΥΜΜ0 (ЗЕО ГО N0:395) Ρ-3Ι5Ρ50ΟΝΤΚΥΑΕ>5νΚ0 (ЗЕО ГО N0:396) Ρ-ΟϋΥΟΥ4ΤΠΡ (ЗЕО ГО N0:397)
ызз Р-1УРМР(ЗЕ0ГО N0:401) Р-АУЮРЗССГГКУАОЗУКО (ЗЕО ГО N0:402) Ρ-ΕΟΗΝΟΨΥΗΜ. (ЗЕО ГО N0:403)
1д34 Ρ-ΝΥΕΜΥ(3Ε0Π5 N0:407) Р=01У3800ГГУУА05УКС (ЗЕО ГО N0:408) Р-ААПХЛУУИЯ. (ЗЕО ГО N0:409)
ΙΑ7 Ρ-ΝΥΟΜΝ (ЗЕО ГО N0:77) Ρ-υΛΝΤΟΤΟΕΡΤΥΤΕϋΡΟΟ (ЗЕО ГО N0:78) Ρ-ΕΟνΗΡΟΥ (ЗЕО ГО N0:79)
2РЗ Р-ГЗОАМХ» (ЗЕО ГО N0:80) Ρ-ΕΠ15ΚΑΝΝΗΑΤΝΥΑΕ5νΚΟ (ЗЕО ГО N0:81) Ρ-8ΡΑΥ (ЗЕО ГО N0:82)
Название антитела УН-СОШ УН-СОШ УН-ОМО
ЗРИМО 2СЗ и ЗР1Е11 ЗВ7 Ρ-85ΨΤ0 (ЗЕО ГО N0:83) Р-АГУКЙХГОТКУГОКРКС (ЗЕО ш N0:84) Ρ-ΗΝ3Υ0Μ0Υ (8В0 ГО N0:85)
Ыа.01 Ρ-0Υ8ΡΤΝΥΤνΐα (ЗЕО ГО N0:195) РИГОРШЭЗПТУЗРЗРОО (ЗЕО ГО N0:196) ρ-ΑΕΓΥλνοΛΥυα (ЗЕО Го N0:197)
Ыа.02 Ρ-ΟΟ3ΙΚΟΝΥΨ3 (ЗЕО ГО N0:198) Ρ-3ΙΝΥ3ΟΠΝΡ8ΙΧΟ (ЗЕО ГО N0:199) Р-УКН\УУРОУ (ЗЕО ГО N0:200)
Ыа.ОЗ Ρ-ΟΥΤΡΝΟΠ>ΜΗ (ЗЕО ГО N0:201) Ρ-νίΒΡΥΝΟδΤΤΥΑΟΚΡΟΟ (ЗЕО ГО N0:202) р-этумпснууотуу (8Е0 ГО N0:203)
Ыв.04 Ρ-ΟΥ5Ρ5ΝΥΥΜ (ЗЕО ГО N0:204) Ρ-ΠΟΡΟΟ3ΡΤ3Υ5Ρ3Ρ0Ο (ЗЕО ГО N0:205) Р-ТОЬАДУГОУОГОУ (ЗЕО ГО N0:206)
Ыа.05 Р-СРТРТ5НТУ8 (ЗЕО ГО N0:207) Ρ=5ΓΓΟΝ63ΤΤΥΎΑϋ3νΚ6 (ЗЕО ГО N0:208) р-руогате (ЗЕО ГО N0:209)
Ыа.06 Р-ОПТЗЗЫАУМЗ (ЗЕО ГО N0:210) Р-ПРУЗОЗЗТУУАОЗУКС (ЗЕО ГО N0:211) РЧМРМКОИООКУСИГОУ (ЗЕО Го N0:212)
Ыа.07 Ρ-ΟΡΤΡ5ΟΥΑ35 (ЗЕО ГО N0:213) Ρ^ΓΡΥΟ3Ο3ΤΤΥΥΑΟ8νΚ0 (ЗЕО ГО N0:214) Ρ-ΕΥΨΥΥΙΧ}ΡΓΑν (ЗЕО ГО N0:215)
Ыа.08 Ρ=0Ο8ν33Ν3ΑΑνΓ5 (ЗЕО ГО N0:216) Р-ЕГУУКЗГОАГПГОУАУЗУКЗ (ЗЕО ГО N0:217) . Р-ВУУЗАСЯМЛУ (ЗЕО ГО N0:218)
Ыа.09 Ρ=ΟΥ3ΡΤΝΗλνΐΟ (ЗЕО ГО N0:219) Ρ=ΠΟΡ3Ο3ΠΓΝΥ3Ρ3Ρ0Ο (ЗЕО ГО N0:220) Р-ОТУСНАППГОУ (ЗЕО ГО N0:221)
Ыа.Ю Ρ-ΟΥ5ΡΤΝΥ\νΐΑ (ЗЕО ГО N0:222) Ρ-ΜΙΥΡΟΟ5ΝΤΝΥ8Ρ8Ρ0Ο (ЗЕО ГО N0:223) Ρ-ΤΝΥΙΌΡΥΙ» (ЗЕО ГО N0:224)
На. 11 Ρ=ΟΠΤ30ΥΟΙ8 (ЗЕО ГО N0:225) Ρ-ΝΗ.ΥΟ05ΕΤΥΥΑϋ8νΚ0 (ЗЕО ГО N0:226) Ρ-0ΥΡΤ00Υ8Ρ0Ι (3Ε0Π>ΝΟ227)
Ыа.12 Ρ=003ν5ϋΝ5ΑΑ\ν0 (ЗЕО ГО N0:228) Ρ=«ΙΥΥΚ3Κ)ΥΥΝΟΥΑν3νΚ3 (ЗЕО ГО N0:229) ΡΜ3ΚΗΕΥ«Η.0ΥΑΕΑΜΕ« (ЗЕО ГО N0:230)
Название антитела УН-СОШ УН-СОШ УН-СОКЗ
Ыа.13 Р=СТТР55УАМ5 (ЗЕО ГО N0:231) Р-АВОЗООЗТУТАОЗУКО (ЗЕО ГО N0:232) Ρ-ΗΥΤΥΜΗΡΕΟΥ (ЗЕО ГО N0:233)
ЗВ5.2 Р-ЗУУТМН (ЗЕО ГО N0:410) Ρ-νΠ>Ρ8Ο3ΥτΝΥΝ0ΚΗΙΟ (ЗЕО ГО N0:411) Ρ-ΡΥΥ08ΗΥΤΡΙ>ν (ЗЕО ГО N0:412)
Ν-АОСТАСТООАТО САС (ЗЕО ГО N0:424) Ν-ОТОАТГОАТССТТСТ САТАСТТАТАСТААСТАСААТСАА ААОТТСАОСООС (ЗЕО ГО N0:425) Ν-ССТТАСТАСОСТАОТСАСТ ООТТСТГСОАТСТС (ЗВОГО N0:426
Ь81 Ρ=ΑΥΕΜΚ (ЗЕО ГО N0:436) №*ОСТТАСОАОАТОА АС (ЗЕО ГО N0:439) Р= УЮРЗСОЕГРУАОЗУКО (ЗЕО ГО N0:437) Ν-ОТТАТСООТССТТСТООТООСТ ТТАСГГПТАТОСТОАСТССОГТ АААООТ (ЗЕО ГО N0:440) Н-КМАГИ (ЗВОГО N0:438) РМЗАОООТОАТААТОАТОСТТТТО/ АТС (ЗЕО ГО N0:441)
*Определено по системе КаЪа! (см. выше).
N - нуклеотидная последовательность.
Р - последовательность полипептида.
В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий УН, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с δρ35.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (УН), в которой участки СЭК1, СЭК2 и СГЖ3 имеют последовательности полипептида, которые идентичны группам СЭК1, С1Ж2 и СЭК3, показанным в табл. 4. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий УН, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с δρ35.
В дополнительном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение предусматривает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (УН), в которой участки СЭК1, С1Ж2 и СЭК3 кодируются нуклеотидными последовательностями, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичными участкам СЭК1, С1Ж2 и С1Ж3 УН полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106) или участками СЭК1, СЭК2 и СЭК3 УН полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой 7.Ρ1Ό5.1.Θ9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
В следующем аспекте настоящее изобретение предусматривает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (УН), в которой участки СЭК1, СЭК2 и СЭК3 кодируются нуклеотидными последовательностями, которые идентичны нуклеотидным последовательностям, которые кодируют группы СЭК1, С1Ж2 и С1Ж3- показанные в табл. 4. В ряде вариантов осуществления антитело
- 56 020508 или антигенсвязывающий фрагмент, включающий Ун, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В дополнительном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение предусматривает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (Ун), в которой участки СБК1, СБК2 и СБК3 кодируются нуклеотидными последовательностями, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичными полинуклеотиду, кодирующему участки СБК1, СБК2 и СБК3 Ун тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемые гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106) или полинуклеотиду, кодирующему участки С1Ж1, С1Ж2 и С1Ж3 Ун тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемые гибридомой 7.Ρ1Ό5.1.Ο9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из Ун, кодируемого одним или более из вышеописанных полинуклеотидов, специфически или предпочтительно связывается с тем же эпитопом, что моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 201', 3А3, 3А6, 1А7, 107, 2В10, 2С11, 2Р3, 3Р1Б10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 3Р2С6.3010.2И7, 3Р2С9.2О4, 3Р4А6.1Б9, 3Р4А1.2В9, 3Р4С2.2Б2, 3Р4С5.1Б8, 3Р4С8.2О9, 30-С12 (Ы01), 38-Ό01 (Ы02), 35-Е04 (Ы03), 36-С09 (Ы04), 30-А11 (Ы05), 34-Р02 (Ы06), 29-Е07 (Ы07), 34-004 (П08), 36-А12 (Ы09), 28-Ό02 (Ы10), 30-В01 (Ш1), 34-В03 (Ш2), Ш3, Ы32, Ы33, Ы34, 3383 (Ь1а.1), 3495 (Ь1а.2), 3563 (Ь1а.3), 3564 (Ь1а.4), 3565 (Ь1а.5), 3566 (Ь1а.6), 3567 (Ь1а.7), 3568 (Ь1а.8), 3569 (Ь1а.9), 3570 (Ыа.10), 3571 (Ыа.11), 3582 (Ыа.12), 1968 (Ыа.13), 7Р1Б5.1О9, 3В5.2 и Ы81, или будет конкурентно ингибировать связывание данного моноклонального антитела с 8р35.
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из Ун, кодируемой одним или более из вышеописанных полинуклеотидов, специфически или предпочтительно связывается с полипептидом 8р35 или его фрагментом либо вариантом полипептида 8р35 с аффинностью, характеризующейся константой диссоциации (Ко) не больше чем 5х10-2М, 10-2М, 5х10-3М, 10-3М, 5х10-4 М, 10-4 М, 5х10-5 М, 10-5М, 5х10-6 М, 10-6 М, 5х10-7 М, 10-7 М, 5х10-8 М, 10-8 М, 5х10-9 М, 10-9 М, 5х10-|° М, 10-10 М, 5х10-11 М, 10-11 М, 5х10-12 М, 10-12 М, 5х10-13 М, 10-13 М, 5х10-14 М, 10-14 М, 5х10-15 М или 10-15 М.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (Уь), в которой по меньшей мере один из СБК вариабельной области легкой цепи или по меньшей мере два из СБК§ вариабельной области легкой цепи по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны эталонным последовательностям аминокислот СБК1, С1Ж2 или С1Ж3 легкой цепи из моноклональных антител к 8р35, описанных в данном контексте. Альтернативно, участки СБК1, С1Ж2 и С1Ж3 Уь по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны последовательностям аминокислот СБК1, СБК2 или СБК3 легкой цепи из моноклональных антител к 8р35, описанных в данном контексте. Таким образом, согласно данному варианту осуществления вариабельная область легкой цепи, соответствующая изобретению, имеет последовательности полипептидов СБК1, С1Ж2 или С1Ж3, родственные последовательностям полипептидов, показанным в табл. 5.
Таблица 5
Эталонные последовательности аминокислот Уь СБК1, СБК2 и С1Ж3*
Название антитела УЬСОИ УЬ-СШЦ УЬСЮИ
ЬПО Ρ=ΚΑ50<3ίΟΝν/Ι.Α (8ΕΟΠ>ΝΟ:87) Р-ААЗЗЬЕЗ (ЗЕО ГО N0:89) Р-ООАОТРРЬТ (ЗЕО ГО N0:91)
ИСССССОАСТСАСОО ТАТТСОСААСТССТТАС СС (5ΕςΠ3ΝΟ:86) №Ч5СТССАТССАСТТТС (ЗАДАСТ (ЗЕО ГО N0:88) Ν-СААСАСОСТСАСАС ТТТСССССГСАСС (ЗЕОГОИОЛО)
1407 Р=8С1ХгЬ0ПКНУА (ЗЕО ГО N0:93) Р-ЦЖНРА (ЗЕО ГО N0:95) Ρ-ΟΑΥνϋΚΤν (ЗЕО ГО N0^7)
Ν-ТСТСОАОАТСЛОТТО СОТСАСАААСАТСТОС СТ (ЗЕО ГО N0:92) Ν-СТАОАСАТТААО АОССССССА (ЗЕО ГО N0:94) Ν-САССССТСССАСАТС 1АСАОООТС (ЗЕО ГО N0:96)
ΕΪ05 Ρ-ΟΟϋΝΙΟδΚδνΗ (ЗЕО ГО N0:99) ГОЮУОКРЗ (ЗЕО ГО N0:101) Р=ОУИ38КТЕЕКУ (ЗЕОГОЯОЛОЗ)
ГЧ=ОСОООАОАСААСАТ ТССААОТААСАОТОТ ССАС (ЗЕО ГО N0:98) Ν-ОАТОАТТАТОАСС СССССТСА (ЗЕО ГО N0:100) 9-САССТСАСССАСАСССО ТАСТСАСОААСООСТО (ЗЕО ГО N0:102)
1411 Ρ=ΚΑ80ΕΙΑΝΥΕΑ (ЗЕО ГО N0:105) Ρ-ΕΠΎΠ.0Τ (ЗЕО ГО N0:107) Р-ООАЛПТЬЗ (ЗЕО ГО Να 109)
Ν=ΟΟΟΟΟΟΑΟΤΟΑΟΟΑΟ АТТОССААСТАСТТАОСС (ЗЕО ГО N0:104) Ν-САТАСАТАСАС ГГТОСАОАСГ (ЗЕО ГО N0:106) Ν-СААСАОССТСАСАТТТТ СССССТСТСТ (ЗЕО ГО N0:108)
υοι Ρ^φΑδςϋΙδΝΥΕΝ (ЗЕО ГО N0:111) Ρ-ϋΑδΝΙΈΤ (ЗЕО ГО N0:113) Ρ-ΟΟΑΟΚΕΡΑνΤ (ЗЕО ГО N0:115)
- 57 020508
Название антитела УЬ-СОК1 уьсгаа УЬСОКЗ
М=САООСОАОТСАООА САТТАССААСТАТТТАААТ (ЗВО ГО N0:110) Ν-ОАТОСАТССААТТ ТОСАААСА (ЗЕО ГО N0:112) КААСАСОСТОАСАООТТС ССТОСООТСАСТ (ЗЕО ГО N0:114)
Р=КА5О8138\УЬА (ЗВО ©N0:117) Р=АА881АТ (ЗЕО ГО N0:119) РЧЛЮУЗУРЬТ (ЗЕО ©N0:121)
ЕЮб Н=СОСОССАОТСАОАОТА зтАогАосгостгоа СС (ЗЕО Π) N0:116) Ν-ССТОСАТССАОТ ТТАСОААСТ (ЗЕО ГО N0:118) Г-СТАСААОАТГАСАОТТАС . ОСТСТСАСТ (ЗЕО ГО N0:120)
ЕЮ8 Ρ-ΟΑδΟϋΙδΥΥΣΝ (ЗЕО ГО ΝΟ: 123) .М=САООСОАОТСАООАС АТГАСТГАСТАТГГ АААТ (ЗЕ0ГО N0:122) ρ-ι>ν5Νΐ.οτ (ЗЕО ГО N0:125) №=САТСТАТССААТ ТТССАААСА (ЗЕО ГО N0:124) Р=003О№ТЬТ (ЗЕО ГО N0:127) Ν-СААСАОТСТОАТА АТСГОССТСТСАСТ (ЗЕО ГО N0:126)
ьоз , Ρ=ΚΑ8Ο8Ι85Υ0Ί (ЗЕО ГО N0:129) Н=ССОСААОТСАСАОС АТТАОСАОСГАТТТА ΑΑΤ (ЗЕО ГО N0:128) Ρ-ΑΑ35ΙΧ)8 (ЗЕО ГО N0:131) ^ССТССАТССАС ТТТССАААОТ (ЗЕО ГО N0:130) Ρ-008Υ8ΤΡΐνΤ (ЗЕО ©N0:133) КСААСАСАСТГАСА ОТАССССОТООАСО (ЗЕО ГО N0:132)
009 Р=КА808ГОТ¥Ш (ЗЕО ГО N0:135) N=00000ААОТСАОА ОСАТСОАСАССТАТГ ТАААТ (8Е() ГО ΝΟ: 134) Г=АА5К1.ЕЕ> (ЗЕО ГО N0:137) Ν-ССТОСАТССАА СТТОСААОАС (ЗЕО ГО N0:136) Р-ООЗУЗРРЬТ (ЗЕО ©N0:139) Ν=ΟΑΑΟΑΟΑΟΤΤΑΟΑΟ ТСССССТСТСАС (ЗЕО ГО N0.138)
Название антитела 002 013 032 033 034 1А7 2РЗ ЗР1ОЮ.2( 3ΡΙΕ11.3Ι Ыа.01 Ыа.02 Ыа.03 УЬ-СЦН1 Ρ=5σϋΚ03ϋΚΡΛ5 (ЗЕО ГО N0:141) Ν-ТСТССАОАТАААТ ТОСОССАТАААТГТССТ ТСС (ЗЕО ГО N0:140) УЬ-СМО Р=0ПКККЬ5 (ЗЕО ГО N0:143) Ν-СААОАТАСОА АОООТСТСГСА (ЗЕО ГО N0:142) УЬ-СЮКЗ Р-ОАУГОТЬГГУУ (ЗЕО ©N0:145) Ν=ΟΑΟΟΟΟΤΟΟΟΑΟΛ ССААСАСТОТООТС (ЗЕО110 N0:144)
Р=КА8О5У58УЬА (ЗЕО ГО N0:386) Ρ=0Α50ϋΙ5ΥΥΙ,Ν (ЗЕО ГО N0:392) Р=КАЗОЗУЗЗУЕА (ЗЕО ГО N0:398) Ρ-ΗΑ80ϋΙ8ΝΥΙ,δ (ЗЕО ГО N0:404) Р-5А555У5¥МН (ЗЕО ГО N0:146) Ρ=ΚΑ8αΝΙΥΝΥΙΛ (ЗЕО ГО N0:149) Ρ=Κ8303ΕΕΝ5ΟΝ0ΚΝΥΕΤ (ЗЕО ГО N0:152) Р-К55ОЗШ95ОЫОК8УЬТ (ЗЕО ГО N0:155) Р=5ОП51.Р5КРУН (ЗЕО ГО N0:234) Ρ=ΚΑ5081ΤΝ8ΥΙΛ3 (ЗЕО ГО N0:237) Ρ=ΧΑ500ΙΝηΥί.Ν (ЗЕО ГО N0:240) Ρ=ϋΑ5ΝΚΑΤ(5Ε0Π5 N0:387) Р-ОАПЬЕС (ЗЕО ГО N0:393) Ρ-0Λ5ΝΚΑΤ (ЗЕО ГО N0:399) Ρ-ϋΑΡΝΙΈΤ (ЗЕО ГО N0:405) Р-ЕУГЗКЬАЗ (ЗЕО ГО N0:147) Ρ-ΝΑΚΤ0Έ (ЗЕО ГО N0:150) Р=У/А5ТКЕЗ (ЗЕО ГО N0:153) Р=\УА8ТКЕ8 (ЗЕО ГО N0:156) Ρ=ΚϋΝΝΚΡ3 (ЗЕО ГО N0:235) Ρ=ϋΑ35ΚΑΤ (ЗЕО ГО N0:238) Р-АСЗЫЬОЗ (ЗЕО ГО N0:241) Ρ-00Ε5ΝΐνΡΜΥΤ (ЗЕО Ш N0:388) ρ-ΟΟ8ϋθυντ (ЗЕО ГО N0:394) Р=00УОК1УРЬТ (ЗЕО ГО N0:400) Р-ОНУОЫШТ (ЗЕО ГО N0:406) Ρ=00ν35ΝΡΡΤ (ЗЕО ГО N0:148) Р-0НР1УА1РУТ (8ΕΟ©ΝΟ:151) Ρ-ΟΝΟΥδΥΡΙΤΤ (ЗВОГО N0:154) Ρ=0ΝΟΥ5ΥΡίΕΤ (ЗЕО ГО N0:157) Р-ЗЗУОАЬТО (ЗВО ГО N0:236) Ρ=00Α3βΑΡΕ (ЗЕО ГО N0:239) Р-М0158ОРРР (ЗЕО ГО N0:242)
Название антитела У1ХГОК1 УЬ-С0К2 УЬ-СЮКЗ
Ыа.04 Ρ-Τ0335ΝΙθΑθΥθν5 (ЗЕО ГО N0:243) Ρ“ΚΝΝΝΚΡ3 (ЗЕО ГО N0:244) Ρ-0ΤΥΟΝ8ΤΟ (ЗВО ГО N0:245)
Ыа.05 Ρ=8ΟΟΝΙΚ8ΥΎνΗ (ЗЕО ГО N0:246) Ρ-ΕΟ5ΝΚΡ3 (ЗЕО ГО N0:247) Р=05УОЗАЦ,ЬН (ЗЕО ГО N0:248)
Ыа.06 Р-К35О5ЬУ0<ТОУТУ1П (ЗЕО ГО N0:249) Р-ЬУЗМКАЗ (ЗЕО ГО N0:250) Р-ООУУОМРЬ (ЗВО ГО N0:251)
Ыа.07 Ρ=ΚΑ805ν3Υ0ΥΕΑ (ЗЕО ГО N0:252) Р-ОАЗЗЕАТ (ЗЕО ГО N0:253) Р-ООУОЗУРВ (ЗЕО ГО N0:254)
Ыа.08 Р-ЗСЭЗЬОЗУУУН (ЗЕО ГО N0:25 5) Ρ=βΟΝϋΚΡ3 (ЗЕО ГО N0:256) Ρ=8ΑΥΟΥ3ΑΚΤ (ЗЕО ГО N0257)
Ыа.09 Р=5ОГ>№.О5КУУ5 (ЗЕО ГО N0:258) Р-ИМГОКРЗ (ЗЕО ГО N0:259) Р-ЗЗУОПМСЬ (ЗВО ГО N0:260)
Ыа.10 Р-ЗСОЗЬСККЗУН (ЗЕО ГО N0:261) Р-ЕОЗБКРЗ (ЗЕО ГО N0:262) Ρ=83ΥΤΝ5νο (ЗВО ГО N0:263)
Ыа.П Ρ=50ϋΝίΟΚΚΥνθ (ЗЕО ГО N0:264) Ρ=0ϋϋΝΚΡ5 (ЗЕО ГО N0:265) Ρ=05ΥϋΕΤΓ31 (ЗЕО ГО N0:266)
Ыа.12 Р=5СОЗЬОЫКУУН (ЗЕО ГО N0:267) Ρ=βΟ3βΚΡ3 (ЗЕО ГО N0:268) ρ-οτνογνογ (ЗЕО ГО N0:269)
Ыа.13 ρ=τατ33ϋνοοΥΝΥνδ (ЗЕО ГО N0:270) Р-ОУЗЛКРЗ (ЗЕО ГО N0271) Ρ-Ο3ΥΟΚΥΚ0ΚΝ (ЗЕО ГО N0:272)
Р=5А58ВУ5УУН (ЗЕО ГО N0:413) Ρ=Ε>Τ3Ν1Λ3 (ЗЕО ГО N0:414) Ρ=00ν5ΤΝΡΡΤ (ЗЕО ГО N0:415)
ЗВ5.2 №=АОТСССАОСТСАС СТОТААОТТАССТС САС (ЗЕО ГО N0:427) К=ОАСАСАТССААС СТООСТТСТ (ЗЕО ГО N0:428) Ν-САОСАОТООАОТА СТААСССАОССАСО (ЗЕО ГО N0:429)
081 Р= КАЗОЗУЗЗУЬА (ЗЕО ГО N0:442) Ν-АСССССАОТСАСА ОТОТТАОСАОСГАСТ ТАОСС (ЗЕО ГО N0:445) Ρ=ϋΑ5ΝΕΑΤ (ЗВО ГО N0:443) Ν-ОАТОСАТССААСАООС САСТ (ЗЕО ГО N0:446) Ρ-00Β5ΝΥ¥ΡΜΥΤ (ЗЕО ГО N0:444) М-САОСАОСОТАОСААСТОС ССАТОТАСАСГ (ЗВО ГО N0:447)
* Определено по системе КаЪа! (см. выше). N=нуклеотидная последовательность. Р=последовательность полипептида.
В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий Уь кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В дополнительном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение предусматривает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (Уь), в которой участки СБК1, С1Ж2 и СБК3, кодируемые нуклеотидными последовательности, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичны участкам СБК1, С1Ж2 и СТЖ3 Уь полипептида легкой цепи иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106) или участкам СБЕГ, С1Ж2 и
- 58 020508
СГОР3У[, полипептида легкой цепи иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой 7.РГО5.1.09 (АТСС номер депозита РТ А-8107).
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область легкой цепи (Уъ) иммуноглобулина, в которой участки СЭК.1, СЭР2 и СЭР3 имеют полипептидные последовательности, которые идентичны группам СЭР1, СЭР2 и СЭР3, показанным в табл. 5. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий Уъ, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В следующем аспекте настоящее изобретение предусматривает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область легкой цепи (Уъ) иммуноглобулина, в которой участки СГОРИ СЭР2 и СЭР3 кодируются нуклеотидными последовательностями, которые идентичны нуклеотидным последовательностям, которые кодируют группы СГОР1, СЭР2 и СЭР3, показанные в табл. 5. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий Уъ, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В дополнительном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение предусматривает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область (Уъ) легкой цепи иммуноглобулина (Ун), в которой участки СЭК.1, СЭР2 и СЭР3 кодируются нуклеотидными последовательностями, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичными полинуклеотиду, кодирующему участки СЭК.1, СЭР2 и СЭР3 (Уъ) легкой цепи иммуноглобулина, продуцируемые гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106), или полинуклеотиду, кодирующему участки СГОР1, СЭР2 и СЭР3 (Уъ) легкой цепи иммуноглобулина, продуцируемые гибридомой 7.Ρ1Ό5.1.Ο9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из Уь, кодируемой одним или более из вышеописанных полинуклеотидов, специфически или предпочтительно связывается с тем же эпитопом, что моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 201', 3А3, 3А6, 1А7, 107, 2В10, 2С11, 2Р3, 3РГО10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 3Р2С6.3010.2н7, 3Р2С9.204, 3Ρ4Α6.1Ό9, 3Р4А1.2В9, 3Р4С2.2О2, 3Р4С5.ГО8, 3Р4С8.209, 30-С12 (Ы01), 38-Ό01 (ЬЮ2), 35-Е04 (Л03), 36-С09 (ЬЮ4), 30-А11 (Л05), 34-Р02 (ЬЮ6), 29-Е07 (ЬЮ7), 34-004 (Ы08), 36-А12 (ЬЮ9), 28-Ό02 (Ы10), 30-В01 (Ы11), 34-В03 (Ы12), Ы13, Ь132, Ь133, Ы34, 3383 (Ь1а.1), 3495 (Ь1а.2), 3563 (Ь1а.3), 3564 (Ь1а.4), 3565 (Ь1а.5), 3566 (Ь1а.6), 3567 (Ь1а.7), 3568 (Ь1а.8), 3569 (Ь1а.9), 3570 (Ь1а.10), 3571 (Ь1а.11), 3582 (Ь1а.12), 1968 (Ь1а.13), 7РГО5.109, 3В5.2 и Ы81, или будет конкурентно ингибировать связывание данного моноклонального антитела с 8р35.
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из Уь, кодируемой одним или более из вышеописанных полинуклеотидов, специфически или предпочтительно связывается с полипептидом 8р35 или его фрагментом либо вариантом полипептида 8р35 с аффинностью, характеризующейся константой диссоциации (Кс) не больше чем 5х10-2 М, 10-2 М, 5х10-3 М, 10-3 М, 5х10-4 М, 10-4 М, 5х10-5 М, 10-5 М, 5х10-6 М, 10-6 М, 5х10-7 М, 10-7 М, 5х10-8 М, 10-8 М, 5х10-9 М, 10-9 М, 5х10-10 М, 10-10 М, 5х10-11 М, 10-11 М, 5х10-12 М, 10-12 М, 5х 10-13 М, 10-13 М, 5х 10-14 М, 10-14 М, 5х 10-15 М или 10-15 М.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей Ун, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичную последовательности эталонного полипептида Ун, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:158-172, 372, 376, 380, 384 и 416, показанных в табл. 6. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающие Ун, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связываются с 8р35.
В другом аспекте настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей Ун, имеющую последовательность полипептида, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:158-172, 372, 376, 380, 384 и 416, показанных в табл. 6. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающие Ун, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связываются с 8р35.
- 59 020508
УН ио2
ЬГО9 иоб
БЮ5 □04 ио8
Ш1 то
Последовательности полипептида VΗ
Последовательность
Таблица 6
ЕУ0ЬЬЕ8СООЬУ0РОО81ЛЕ8САА8ОРТР8ТУЕМ1АУК.рАРОКОЕЕАУ5 ОР δΟΟΕΤΑΥΑϋδνΚΟΚΡΤΙδΚηΝδΚΝΤΕ^ΜΝδΙΑΑΕΟΤΑΜΥΥϋνΜΟΟί С\У
АРРПУОООТТУТУ88А8ТКСР8УРРЕАР
ЕУ0ЕЬЕ8СОСЬУ0РОС5и<Ь8САА8СРТР8МУ8МУАУК0АРСКСЬЕУА^ 18
Ρ8ΟΟΚΤΜΥΑΟ8νΚΟΚΚΠ8ΚΟΝ8ΚΝΤΡγΕ0ΜΝ8ΙΛΑΕΟΤΑνΥΥ0ΑΜ)8Ι ΚΥ
ΥϋΡΑδΟΥΗΝΥΥΥΥΥΜΟν^ΟΚΟΤΤντνδδΑδτΚΟΡδνΡΡΕΑΡ
ЕУрЬЬЕ800ОЕУрР0О8ЬКЬ8САА80Р1Р8ЕУРМ0АУКрАР0К0ЕЕАУ( Υ δδΟΟδΤνΥΑβδΙΚΟΚίΤΙδΚΌΝδΚΝΤΕΥΕΟΜΝδΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΚΕΟΟί АР
РЛУОООТМУТУЗЗАЗТКОРЗУРРЕАР
ЕУ0ЕЕЕ8ОООЕУ0РОО8ЕИЕ8САА8ОРТР8АУАМОАУК0АРОКеЕЕАУ IV δδΟΟΥτΟΥΑΟδνΚΟΚΡΉδΚΡΝδΚΝΤΕΥΕΟΜΝδΕΚΑΕΡΤΑνΥΥΟΑΚΕΟΙ ΝΑ
ΡΡΙΑΟ0ΟΤΜντνδ8Α8ΤΚΟΡ8νΡΡΕΑΡ
Εν0ΕΕΕ8ΟΟΟΕνρΡ0Ο8ΕΚΕ8εΑΑ80ΡΤΡ8ΚΥΝΜΟΑνκρΑΡ0Κ0ΕΕΑν ΙΥ
ΡδΟΟΟΤΗΥΑΟδνΚΟΚΡΤΙ8ΐωΝ8ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΑ8δΙΑΙ ΑΡ
ОГАС0ОТМУТУ88А8ТКОР8УРРЕАР
ΕνΟΕΕΕδΟΟΟΕνΟΡΟΟδΕΚΕδΟΑΑδΟΡΤΡδΗΥΕΜνΑνΚΟΑΡΟΚΟΕΕΑν Κ8
80<5ΑΤΚ.ΥΑΟδνΚΟΚΡΤΙδΚΟΝδΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΚΕδΡΕ ΥΡ ργλνοοοτΕντνδδΑδτκοΡδνρρίΑΡ
ЕУЦЕЕЕЗСССЕУ0РСО5ЬКЕ5САА8СРТР55УАМУАУК0АРОКСЬЕАУ δΤ
80ΟΥΤΟΥΑϋ3νΚΟΚΡΤ18Μ>Ν3ΚΝΤΕΥΕ0ΜΝ8ΙΑΑΕΡΤΑνΥΥεΑΚΡΤδΕ ϋΥ
ΥΥΜΡνν/ΟΚΟΤΤντνδδΑδΊΚΟΡδνΡΡΕΑΡ
5ЕЦ го
N0:
158
159
160
161
162
163
164
ΕνθΕΕΕδΟΟΟΕνθΡΟΟδΕΚΕ5ε?νΑ50ΡΤΡδΤΥΡΜνΑνΚΟΑΡΟΚΟΙ.Ε\νν: ΙΟ
ΡδΟΟνΤΑΥΑΟδνΚΟΚΡΤΙδΚΟΝδΚΝΤΕΥΕΟΜΝδΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΚΡΥδ Α
АОЕОЕАСКОТЕУТУ58А8ТКСР8УРРЕАЕ
165
- 60 020508
УН
Последовательность
8Ε<3
Ю
ΝΟ
ЬЮ1
ЕУ9ЬЬЕ5ОООЕУ0Р0О5ЬКЬ8САА8ОКГР5К¥рМТ№УК0АРОКОЬЕ№У Ϋ
ΡδΟΟΝΤνΥΑΡδνΚΟΚΕΠδΚΡΝδΚΝΤΕΥΕρΜΝδΕΚΑΕΡΤΑνΥΥΟΑδΟΤΊ V
ГОУ№О9ОТЕУТУ55АЗТК(ЗРЗУЕРЕАР
166
П07
ЕУрЕЬЕЗСООЕУрРООЗиИЗСААЗСРТРЗМУРМО^ГУКрАРОКОЬЕ^У 15
Ρ50ΟΡΤ8ΥΑϋδνΚΟί<ΡΤΙ5ΚΟΝ8ΚΝΤΕΥΕΡΜΝ5ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ0ΑΜ)ΡΗ ϋ
1У/ОООТМУТУ85АЗТКОР5УРРЕАР
167
ГлОЗ
ΕνΟΕΕΕδΟΟΟΕνρΡΟΟδΙΛΕδΟΑΑδΟΡΤΡδΟΥΡΜΕΑννκρΑΡΟΚΟΕΕλννί
Υ
ΡδΟΌ5ΤνΥΑϋδνΚΟΚΡΤΙδΚΟΝδΚΝΤΕΥΕ9ΜΝ5ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΚΑΟ< Б
ΟϋΡΟΥΨΟΟΟΤΕνΤΥδδΑδΤΚΟΡδνΡΡΕΑΡ
168
1л12
ΕνρΕΕΕδΟΟΟΕνΟΡΟΟδΕΚΕδΟΑΑδΟΡΤΡδςΥΝΜΡνζνΚΟΑΡΟΚΟΕΕννν δδ δΟΟΜΤΜΎΑϋδνΚΟΚΡΤΙδΚϋΝδΚΝΓΓΕΥΕΟΜΝδΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΚΕΑΕ Υ
С5ОО5СУ5ОУУУУ0МОУ№00ОТТУТУ55А5'1ХОР5УРРЕАР
169
1А7 ρνρΕν08ΟΡΕΕΚΚΡ0ΕΤνΚΙ50ΚΑδΟΥΤΓΤΝΥΟΜΝ№νΚ0ΑΡΘΚΟΕΚ№ί №
ΙΝΤΟΤΟΕΡΤΥΤΕΡΡρΟΚΡΑΡδΕΕΤδΑδΤνΥΕηΡΝΝΕΚΝΕΡΤΑΤΥΡΟΑΚΕΟ Ρ
РУ№СООТТУТУ88
170
2РЗ
Е¥КЕЕЕ8ОООЕУ0РОО5МКЕ8САА8ОРТР5ОА№ЪО№УК05РЕКОЬЕ№У ΙΚ δΚΑΝΝΗΑΤΝΥΑΕδνΚΟΚΡΤΙδΚΡΡδΚδδνΥΕρΜΝδΕΚΑΕΡΤΟΙΥΡσΤΡδΡ №
Ο2θΤΤντν88
171
ЗР1
Р10
2СЗ
И
ЗР1 ΕΙ I, ЗВ7
0У0Е005ОАЕЬиО,0А8УК1^СКА80УТРТ88\УТ(5'№УКрКРОрОЕЕ\У11
1Υ
ΡΟΟΟΡΤΚΥΤ<}ΚΓΚΟΚΑΤΕΤΑΡΚ333ΤΑΥΜ9Ε38ΕΑ5ΕΡ5ΑνγΥΟΑΚΗΝ
Ο
МЕ)У№СООТ8УТУ88
172
УН
ЕУрЬЕЕ5(Х;ОЕУ9РО65ии>5САА$ОРТР5НУЕШ^/УК<2АР0КОЕЕ№ νδΜνδδΟΟΡΤΚΥΑΟδνΚΟΚΡΤΙδΚΟΝδΚΝΤΕΥΕρΜΝδΕΚΑΕϋΤΑνΥΥ
ΟΑΤΕΟΡΝΡΑΡΡΙΨΟΟΟΤΤντνδδ
ЕУ0Е1£8О<ЮЕУрР<Ю311иЗСАА8ОРТРЗАУММ<ЗЧУУК<ЗАРСКСЕЕ^ νδδΙδΡδαΟΝΤΚΥΑΡδνΚΟΕΡΤΙδίωΝδΚΝΤΕΥΕρΜΝδΕΚΑΕΡΤΑνγγα
АКСРУСУЛУГРРУУСООТЕУТУЗЗ
Последовательность
ΕνςΕΕΕ5ΟΟ0ΕνρΡσθ8ΕΚΕδ0ΑΑ3ΟΡΤΡδΙΥΡΜΡνΑΉ.ρΑΡΟΚΟΕΕ№ν δ^ΙΟΡδΟΟΠΚΥΑΡδνΚΟΚΚΠδΚΡΝδΚΝΊΕΥΕςΜΝδΕΚΑΕΡΤΑΤΥΥΟΑ
ΡΕΟΗΝΡΑνΥΡΡΕλνΟΚΟΤΕντνδδ
Εν0ΕΕΕ8(3(3ΟΕνρΡ0<2ΒΕΚΕ80ΑΑ80ΡΤΡ8ΝΥΕΜΥΤννΚ9ΑΡΟΚΟΕΕνν ν8ΟΙΥδ8ΟΟΙΤνΥΑΡδνκσΚΡΤΙ8ΡΌΝ8ΚΝΤΕΥΕ9ΜΝδΕΡΑΕΡΤΑνΥΥα
ΑΚΑΑΙΕΡννΥΡΡΕΨΟΚΟΤΕντνδδ
ΡνΟΙΧ^ΡΟΑΕΕνΚΡΟΤδνΚΙΉΟΚΑδΟΥΤΡΤδΥλΝΉΉίλννκρΚΡΟΟΟΕΕ νΠθνΐΡΡ3Ρ3ΥΤΝΥΝΟΚΡΚΟΚΑΤΕΤνΡΤδ33ΤΑΥΜΟΕ8δΕΤ3ΕΡ8ΑνΥΥ
ΟΑΚΡΥΥΟδΗΐνίψρνψοτσΓτντνδδ
0У0ЕУр5СНЕУКрРОА5УКУ5СКА5ОУТРтаУСМК№Ук0АРС0ОЕк №ΜΟ\νϊΝΤΡΤΟΕΡΤΥΤΕΡΡ0ΟΚΡνΡ81ΡΤδΑδΤνΥΕ0Ι58ΕΚΑΕΡΜΑΜΥ
ΥΟΑΚΕΟνΗΡΡΥ^ΟΟσΓΕντνδδ
ЕУ9ЕЕЕ8СС0ЕУ2РС08ЕКЕ8САА50РТР8АУЕМК1УУК<5АР0КОЕЕ^ νδνίΟΡδΟΟΡΤΡΥΑΡδνΚΟΚΡΤΙδΡΡΝδΚΝΤΕΥΕρΜΝδΕΚΑΕΡΤΑνΥΥΟ ΑΤΕΟΡΝΡΑΓΡΠν<3<3ΟΤΤνΤνδ5ΑδΤΚ0Ρ8νΡΡΕΑΡδδΚδΤδ0<3ΤΑΑΕ0α ΕνΚΡΥΡΡΕΡντνδλνΝδΟΑΕΤδΟνΗΤΡΡΑνΕρδδΟΕΥδΕδδνντνΡδδδΕ ΟΤρΤΥΙϋΝνΝΗΚΡδΝΓΚνΡΚΚνΕΡΚδεΡΚΤΗΤΟΡΡόΡΑΡΕΕΕΟΟΡδνΡΕ РРРКРКРТЕМ18аТРЕУТСУУУРУ8НЕРРЕУКРЫ¥/УУРОУЕУНМАКТК ΡΚΕΕ0ΥΝ5ΤΥΚνν8νΕΤνΕΗ0Ό№ΙΉΟΚΕΥΚΟΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙ5Κ ΑΚΟρΡΚΕΡρνΥΤΕΡΡδΚΡΕΕΤΚΝςνδΕΤΟΕνΚΟΡΥΡδΡΙΑνΕΑνΕδΝΟρΡ ΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΡδΡΟδΡΡΕΥδΚΕΤνΡΚδΚλνΟΡΟΝνΡδεδνΜΗΕΑΕΗΝ НУТОКЗЬЗЬЗРС
ЕУОЕЕЕЗСООЬУСгРеОЗЕКЕЗСААЗСРТРЗАУЕМКУ/УКОАРОКСЕЕУ/ νδνΐΟΡδΟΟΓΤΡΥΑΡ5νΚΟΚΡΤΙδΚΡΝδΚΝΤΕΥΕ(3ΜΝδΕΚΑΕΡΤΑνΥΥ€
ΑΤΕΟΡΝΡΑΡΡΓ№<Χ)σΤΤντνδδΑδΤΚΟΡ8νΕΡΕΑΡ85ΚδΤ8ΟΟΤΑΑΕ6Ο
ΕνΚΡΥΡΡΕΡνΤνδνΖΝδΟΑΕΤδΟνΗΤΡΡΑνΕςδδΟΕΥδΕδδνντνΡδδδΕ
СТ0ТУ1СМУКНКР8?4ТКУРККУЕРК8СРКТНТСРРСРАРЕЕЕССРЗУРЕ
ΕΡΡΚΡΚΡΤΕΜ1δΚΤΡΕνΤθνννΡνδΗΕΟΡΕνΧΕΝ№ΥνΡθνΕνΗΝΑΚΤΚ
ΡΚΕΕΟΥΝ5ΑΥΚνν8νΕΤνΕΗΟΡ№ΕΝΟΚΕΥΚΟΚνδΝΚΑ1,ΡΑΡΙΕΚΤΙ5Κ
ΑΚΟΟΡΚΕΡΟνΥΤΕΡΡδΚΡΕΕΤΚΝΟνδΕΤΟΕνΚΟΓΥΡδΡΙΑνΕν/ΕδΝΟΟΡ
ΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΡδΡΟδΡΡΕΥδΚΕΤνΡΚ8Κ№00ΟΝνΡ5ΟδνΜΗΕΑΕΗΝ
НУТОКЗШЛРС
372
376 δΕ<5
ΙΡ
ΝΟ:
380
384
416
432
433
435
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей νΗ, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичную эталонной последовательности полипептида νΗ, выбранной из группы, состоящей из 8Е^ ΙΌ №№ 158-172, 372, 376, 380, 384 и 416. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий νΗ, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается в 8р35.
- 61 020508
В другом аспекте настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей Ун, соответствующую изобретению, выбранной из группы, состоящей из δΕβ ΙΌ ЫО:158-172, 372, 376, 380, 384 и 416. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий Ун, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с δр35.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей Ун, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичную эталонной последовательности полипептида Ун, выбранной из группы, состоящей из полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106), и полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой 7.Ρ1Ό5.1.Ο9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из Ун, кодируемой одним или более из вышеописанных полинуклеотидов, специфически или предпочтительно связывается с тем же эпитопом, что моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 201', 3А3, 3А6, 1А7, 107, 2В10, 2С11, 2Р3, 3РГО10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 3Р2С6.3010.2Н7, 3Р2С9.204, 3Ρ4Α6.1Ό9, 3Р4А1.2В9, 3Р4С2.2О2, 3Р4С5.ГО8, 3Р4С8.209, 30-С12 (Ы01), 38-Ό01 (ЪЮ2), 35-Е04 (Ы03), 36-С09 (Ы04), 30-А11 (Ы05), 34-Р02 (Ы06), 29-Е07 (Ы07), 34-004 (Ы08), 36-А12 (Ы09), 28-Ό02 (Ы10), 30-В01 (Ы11), 34-В03 (Ы12), Ы13, Ы32, Ы33, Ы34, 3383 (Ь1а.1), 3495 (Ь1а.2), 3563 (Ь1а.3), 3564 (Ь1а.4), 3565 (Ь1а.5), 3566 (Ь1а.6), 3567 (Ь1а.7), 3568 (Ь1а.8), 3569 (Ь1а.9), 3570 (Ь1а.10), 3571 (Ь1а.11), 3582 (Ь1а.12), 1968 (Ь1а.13), 7РГО5.109, 3В5.2 и Ы81, или будет конкурентно ингибировать связывание данного моноклонального антитела с δр35.
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из Ун, кодируемой одним или более из вышеописанных полинуклеотидов, специфически или предпочтительно связывается с полипептидом δр35 или его фрагментом либо вариантом полипептида δр35 с аффинностью, характеризующейся константой диссоциации (Кс) не больше чем 5х10-2 М, 10-2 М, 5х10-3 М, 10-3 М, 5х10-4 М, 10-4 М, 5х10-5 М, 10-5 М, 5х10-6 М, 10-6 М, 5х10-7 М, 10-7 М, 5х10-8 М, 10-8 М, 5х10-9 М, 10-9 М, 5х10-10 М, 10-10 М, 5х10-11 М, 10-11 М, 5х10-12 М, 10-12 М, 5х 10-13 М, 10-13 М, 5х 10-14 М, 10-14 М, 5х 10-15 М или 10-15 М.
В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, который кодирует тяжелую цепь иммуноглобулина, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичную полинуклеотиду δΕβ ΙΌ ЫО: 420, как показано ниже. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий тяжелую цепь, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с δр35 и/или тем же эпитопом, что моноклональное антитело 3В5.2.
- 62 020508
Последовательность полинуклеотида тяжелой цепи иммуноглобулина человеческого и мышиного химерного моноклонального антитела 3В5.2
АТеССАТеСАеСТетеТААТОСТСТТОСТАТСААСАССТАСАССТеТССАСТСССА сстссААСтесАесАбсстсееостеАсстеетеАеесстебеАсттсАстоААе
ТТеТССТССАССбСТТСТббСТАСАССТТСАССАССТАСТССАТбСАСТеееТААА
ОСАОАООССТООАСААСОССТТСАОТОСАТСОСАОТОАТТОАТССТТСТСАТАСЗТТ
АТАСТААСТАСААТСААААСТТСАССОССААССССАСАТТСАСТОТАСАСАСАТС
СТССАООАСАеССТАСАТеСАССТСАССАСССТСАСАТСТеАССАСТСТесеОТСТ
АТТАСТетеСААСАССТТАСТАСебТАСТСАСТОеТТСТТСбАТСТСТеееССАСА ееСАССАСеСТСАСССТСТССТСАеССТССАССААССССССАТСОСТСТТСССССТ еССАСССТССТССААСАеСАССТСТСОеОССАСАССееСССТСбОСТСССТОСТС
ААССАСТАСТТСССССААССееТбАСССТСТССТССААСТСАСССССССТСАССА
ОСОеСОТеСАСАССТТСССееСТСТССТАСАСТССТСАбОАСТСТАСТСССТСАеС
АСССТСОТСАССОТОСССТССАОСАССТТССОСАСССАОАССТАСАТСТОСААСе
Т6ААТСАСААССССАССААСАССААС0ТССАСАА6АААСТТСАССССАААТСТТС
ТОАСААСАСТСАСАСАТОСССАССОТОСССАОСАССТСААСТССТССООСОАССС
ТСА0ТСТТССТСТТССССССААААСССААС6АСАСССТСАТСАТСТССС0САСССС тоАеотсАСАтесотестеетееАсетеАсссАссААеАСсстсАсстсААеттс
ААСТСОТАСеТОеАСССССТОСАССТбСАТААТОССААеАСАААОСССССССАе
САССАСТАСААСАССАССТАСССТСТСеТСАСССТССТСАСССТССТССАССАСС
АСТееСТбААТееСААееАСТАСААеТОСААеОТСТССААСАААеСССТСССАСС
ССССАТСОАСААААССАТСТССАААСССАААОООСАСССССОАОААССАСАООТО
ТАСАСССТССССССАТССССССАТОАССТОАССААОААССАССТСАСССТСАССТ
СССТССТСАААСССТТСТАТСССА0ССАСАТСССС6ТС0АСТСС0АСАССААТСС
ССАССССОАСААСААСТАСААСАССАССССТССССТеТТССАСТСССАССССТСС
ТТСТТССТСТАСАССААССТСАССОТСОАСААОАОСАСеТООСАбСАССЗебААСО
ТСТТСТСАТОСТССОТОАТОСАТСАООСТСТССАСААССАСТАСАСОСАОААОАОС
СТСТСССТОТСТСССОСТТОА (8ΕΘ Ю N0:420).
В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, которые кодирует вариабельную область тяжелой цепи (УН), причем полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты УН, выбранную из группы, состоящей из 8Е^ ΙΌ N0 173184, 370, 374, 378, 382 и 422, как показано в табл. 7. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий УН, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
Таблица 7
Последовательности полинуклеотидов УН
УН Последовательность ЗЕф ю ΝΟ:
ио2 СААСТТСААТТСт’АСАСГГСТСеТбССССТСТТСТТСАСССТССТССТТС ТТТАСОТСТТТСТТОСОСТССТТСССОАТТСАСТТТСТСТАСТТАССАСА ТСАТТТССОТТССССААССТССТССЗТАААОСТТТССАеТОССТТТСТТСТ АТСССТССТТСТСОТССССТТАСТТООТАТСЗСТ(ЗАСТСС(ЗТТАААССТСС СТТСАСТАТСТСТАСЗАСАСААСТСТААСААТАСТСТСТАСТТССАСАТОА АСАССТТААСООСТаАСОАСАСССССАТаТАТТАСТаТСТАССОАТТСАТ ОАТАСТАОТСОТТССЗССТТТТСАТАТСТССССССААСССАССАСОСТСАС ССТСТСААОСеССТССАССААОСССССАТСОСТСТТСССССТАаСАССС 173
□09 ОААОТТСААТТОТТАОАСТСТСОТССССОТСТТОТТСАСССТСОТССТТС ТТТАСОТСТТТСТТОСОСтеСТТССОСЗАТТСАСТТТСТСТАТСТАСТСТА ТССТТТСССТТООССААССТССТССТАААСОТТТСОАСТСЗООТТТСТТАТ АТСТСТССТТСТСаТСССААСАСТАТСТАТССТОАСТСССТТАААССТСС СТТСАСТАТСТСТАОА6АСААСТСТААОААТАСТТТСТАСТТССАСАТОА АСАССТТААССССТОАССАСАСОССССТСТАТТАСТСТСССАСАСАТТСС АОАСССССеТАТТАССАТТТТТОСАСТСОТТАТСАСААСТАСТАСТАСТА СТАСАТООАСОТСТОССССАААОСОАССАСебТСАСССТСТСААССеССТ ССАССААСООСССАТСССТСТТСССОСТАбСАССС 174
□06 бААбТТСААТТбТТАВАВТСТббТббСббТСТТбТТСАбССТббТСбТТС ТТТАСВТСТТТСТТВСбСТбСТТСССОАТТСАСТТТСТСТСАСТАСССТА ТбСАТТббОТТССССААбСТССТСаТАААСВТТТСбАСТССбТТТСТТСТ АТСТАТТСТТСТббТСбСТСТАСТбТТТАТВСТбАСТССАТТАААССТСО СТТСАСТАТСТСТАОАСАСААСТСТААСААТАСТСТСТАСТТССАСАТСА АСАбСТТААОООСТаАОбАСАСОСССВТбТАТТАСТОТбССАбАОАСОСТ ОАСТСТОАТбСТТТТОАТАТСТбСббССААббОАСААТббТСАСССТСТС ААбСбССТССАССААбббСССАТСбОТСТТСССбСТАССАССС 175
- 63 020508
- 64 020508
νΗ Последовательность δΕΟ Ш N0:
Ьх32 ТТТАССТСТТТСТТССССТССТТССССЗАТТСАСТТТСТСТССТТАСАТОА ТССАСТСССТТССССААССТССТССТАААССТТТССАСТСССТТТСТТСТ АТСТСТССТТСТаатааСААТАСТААаТАТОСТОАСТССОТТАААООТСб СТТСАСТАТСТСТАОАСАСААСТСТААСААТАСТСТСТАСТТССАСАТОА АСАСЮТТААООаСТОАООАСАСааССаТОТАТТАСТСТОССАаАОбАСАТ ТАТОТАТАСТСЮТТС^ССССТССССССАСеОСАСССТССТСАСССТСТС ААСС 374
ЬхЗЗ СААСТТСААТТОГТАСАСТСТССТСаСССТХЛТСТТСАСССТССТОСТТС тттАсстстттсттессстасттссоаАТТСАстттстстАтттАссстА ТОТТТ1Х^ТТССССААССТССТ(^АААССТТГе<Ж<ЗТ<ЮСТТГСТТС^ АТСтетсСТТСТаСТОаСАТТАСТААОТАТаСТОАСТССОТТАААООТСС СТТСАСТАТСТСТАСАСАСААСТСТААОААТАСТСТСТАСТТССАСАТСА АСАССТТААССССТСАССАСАСАСССАСАТАТТАСТСТСССАСАСАСССС САТААССАСТСОТАСТТССАТСТСТСОССССОТСССАСССТССТСАСССТ стсаасс 378
Ы34 (ЗААСТТСААТТСТТАСАСТСТСОТСОСОСТСТТСТТСАСССТССТССТТС ТТТАССТСТТТСТТССССТССТТССССАТТСАСТТТСТСТААТТАССАСА ТСТАТТОСОТТСОССААОСТССТООТАААССТТТОСАСТСОСТТТСТСеТ АТСТАТТСТТСТССТСССАТТАСТСТТТАТССТСАСТСССТТАААССТСС СТТСАСТАТСТСТАСАСАСААСТСТААСААТАСТСТСТАСТТССАСАТСА АСАССТТААССССТСАССАСАССССССТСТАТТАСТСТССТАССССАССС АТССТССАСТССЗТАСТТССАТСТСТОССССССТСССАСССТССТСАСССТ СТСААСС 382
ЗВ5. 2 САССТССААСТССАССАСССТСЗССССТСАССТССТСАССССТСССАСТТС АСТСАА6ТТСТССТССАССССТТСТСССТАСАССТТСАССЛССТАСТССА тссАСтоебТАААОСАаАОссстаоАСААаасстгаАатосАтсссАстс АТТСАТССТТСТСАТАСТТАТАСТААСТАСААТСААААСТТСАСССССАА ССССАСАТТСАСТСТАСАСАСАТССТССАССАСАСССТАСАТССАССТСА ССАСССТСАСАТСТСАОСАСТСТССССТСТАТТАСТСТССААСАССТТАС ТАСССТАСТСАСТССТТСТТССАТСТСТСССССАСАСССАССАСССТСАС ССТСТССТСА 422
УН Последовательность δΕΟ Ю ΝΟ:
Ы81 ОААСТАСААТТОТТАОАОТСТООТСОСООТСТТОТТСАОССТОО Т(ХЗТТСТТТАСОТСТТГСТТОСОСТ<КЛТССООАТТСАСТТТСТСТ ССТТАСОАОАТОААОТОООТТСОССААОСТССТОСТАААООТТТ ООАСТОООТТГСТОТТАТСООТС(ЛТСТССТООС1ТТАСТТТГТА ТОСТОАСТССОТТАААОСЗТСССТТСАСТАТСТСТАСАОАСААСТ СТААОААТАСТСТСТАСТТССАСАТСААСАОСТТААСООСТОАС ОАСАССОСССТСТАТТАСГСТОСААСАОАОООТОАТААТОАТО СТТТТОАТАТСТОООСЗССААСХЮАССАССОТСАССОТСТСААОС СССТССАССААССССССАТССОТСТТСССССТООСАСССТССТС СААОАОСАССТСТСООСССАСАОССОСССТООССТСССТСОТС ААООАСТАСТТССССОААССООТОАСССТОТСОТСОААСТСАС ССОСССТОАССАОССССОТОСАСАССТТСССООСТОТССТАСАО ТССТСАООАСТСТАСТСССТСАОСАОСОТООТОАССОТОСССТС САССАСЮТТСЗСССАСССАОАССГАСАТСТОСААСОТОААТСАС ААОСССАССААСАССААООТООАСААОАААОТТОАССССАААТ СТТОТСАСААСАСТСАСАСАТССССАССОТОСССАОСАССТОАА СТССТООООООАССОТСАОТСТТССТСТТССССССААААСССАА СОАСАСССТСАТСАТСТСССССАССССТОАСОТСАСАТОСОТСС ТООТООАСОТОАОССАСОААСАСССТОАООТСААОТТСААСТС ОТАССТССАССОСОТООАСОТОСАТААТОССААОАСАААОССО ССЮОАООАОСАСТАСААСАОСАСОТАССОТОТССТСАОСОТСС ТСАССОТССТОСАССАООАСТСССТОААТООСААООАОТАСАА СТССААСОТСТССААСАААООССТСССАОСССССАТССАОААА АССАТСТССАААОССАААСОССАСССССОАОААССАСАССТСТ АСАСССТССССССАТСССОООАТСАОСТОАССААОААССАООТ САОССТОАССТОССТСОТСАААООСТТСТАТСССАСССАСАТСС ССОТООАОТОООАОАССААТСООСАСССООАОААСААСТАСА АОАССАСОССТСССОТеТТСОАСТССОАССССТССТТСТТССТС ТАСАССААОСТСАСССТСОАСААОАОСАОСТОССАОСАООССА АСОТСТТСТСАТОСТСССТСАТССАТОАОССТСТОСАСААССАС ТАСАСОСАСААОАСССТСТСССТОТСТСССОСТ 448
- 65 020508
УН Последовательность 5Е(} ГО N0:
Ы81 ад1у созу 1аЪе а ОААОТАСААТТОТТАОАОТСТООТООСООТСТТОТТСАСССТОО ТООТТСТТТАССТСТТТСТТОСОСТСЮТТ’ССССАТТСАСТТТСТСТ ОСТТАСОАОАТОААОТОСЮТТСОССААОСТССТООТАААООТТТ (ЮАСТОСОТТТСТСТТАТС(ЮТССГТСТ<ЮТ<ХЗСтА(ЛТПТА ТССТОАСТССОТТАААСОГСОСТТСАСТАТСТСТАОАОАСААСТ СТААОААТАСТСТСТАСТТОСАОАТОААСАОСТТААС5СОСТОАО ОАСАССОССОТОТАТГАСТОТССААСАОАСССТОАТААТОАТС СТТТТОАТАТСТОООСЗССААОСОАССАССОТСАСССТСТСААОС ОССТССАССААОООСССАТСООТСТТСССССТООСАСССТССТС СААОАОСАОСТСТСЗСКХКЗСАСАОССХЗСССТОСССТСССТСОТС ААОСАСТАСТТССССОААССООТОАССОТСТСОТСОААСТСАС ОСОСССТОАССАОССОСОТССАСАССТТССССОСТОТССТАСАО ТССТСАООАСТСТАСТСССТСАОСАСССТССТОАССОТССССТС САОСАОСТТОООСАСССАОАССТАСАТСТССААССТОААТСАС ААОСССАОСААСАССААСОТООАСААОАААОТТОАОСССАААТ СТТСТОАСААОАСТСАСАСАТОСССАСССТОСССАССАССТОАА СТССТССОСОСАССОТСАОТСТТССТСТТССССССААААСССАА ООАСАСССТСАТСАТСТССССОАССССТОАООТСАСАТОСОТОО ТООТООАССТОАОССАСОААОАСССТОАОСТСААОТТСААСТО ОТАСОТООАСООСОТООАООТОСАТААТОССААСАСАААОССО СОООАООАОСАОТАСААСАССОСОТАССОТСТООТСАОСОТСС ТСАССОТССТОСАССАООАСТСССТОААТСССААССАОТАСАА ОТОСААССТСТССААСАА.АСЗСССТСССАОСССССАТСОАОААА АССАТСТССАААОССАААОСССАОСССССАОААССАСАССТОТ АСАСССТОСССССАТССССЮОАТОАОСТОАССААОААССАООТ САСССТСАССТОССТООТСАААООСТТСТАТСССАОСОАСАТСО ССОТСОАСТСССАСАССААТСЮССАСССССАОААСААСТАСА АОАССАСОССТСССОТОТТООАСТССОАССОСТССТТСТТССТС ТАСАССААОСТСАСССТСОАСААОАОСАОСТОССАОСАСОООА АСОТСТТСТСАТССТССОТСАТОСАТОАСОСТСТССАСААССАС ТАСАСОСАОААСАСССТСТСССТОТСТСССОСТ 450
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из кодирующей νΗ нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичной эталонной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из 8ЕР Ю N0:173-184, 370, 374, 378, 382 и 422, представленных в табл. 7. В ряде вариантов осуществления полинуклеотид кодирует полипептид νΗ, который специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из νΗ, кодируемой одним или более из вышеописанных полинуклеотидов, специфически или предпочтительно связывается с тем же эпитопом, что моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 201', 3А3, 3А6, 1А7, 1О7, 2В10, 2С11, 2Е3, 3РШ10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 3Р2С6.3О10.2Н7, 3Р2С9.2О4, 3Ρ4Ά6.1Ό9, 3Р4А1.2В9, 3Р4С2.2О2, 3Р4С5.Ю8, 3Р4С8.2О9, 30-С12 (П01), 38-001 (П02), 35-Е04 (П03), 36-С09 (П04), 30-А11 (П05), 34-Е02 (П06), 29-Е07 (П07), 34-О04 (Ы08), 36-А12 (П09), 28-002 (П10), 30-В01 (П11), 34-В03 (П12), Ы13, Ы32, Ы33, Ы34, 3383 (Ыа.1), 3495 (Ь1а.2), 3563 (Ь1а.3), 3564 (Ь1а.4), 3565 (Ь1а.5), 3566 (Ь1а.6), 3567 (Ь1а.7), 3568 (Ь1а.8), 3569 (Ь1а.9), 3570 (Ыа.10), 3571 (Ыа.11), 3582 (Ыа.12), 1968 (Ыа.13), 7РЮ5.1О9, 3В5.2 и Ы81, или будет конкурентно ингибировать связывание данного моноклонального антитела с 8р35.
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из νΗ, кодируемой одним или более из вышеописанных полинуклеотидов, специфически или предпочтительно связывается с полипептидом 8р35 или его фрагментом либо вариантом полипептида 8р35 с аффинностью, характеризующейся константой диссоциации (Ко) не больше чем 5х10-2 М, 10- 2 М, 5х10-3 М, 10-3 М, 5х10-4 М, 10-4 М, 5х10-5 М, 10-5 М, 5х10-6 М, 10-6 М, 5х10'7 М, 10-7 М, 5х10-8 М, 10-8 М, 5х10-9 М, 10-9 М, 5х10-10 М, 10-10 М, 5х10-11 М, 10-11 М, 5х10-12 М, 10-12 М, 5х10-13 М, 10-13 М, 5х10-14 М, 10-14 М, 5х10-15 М или 10-15 М.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей νΗ, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичную эталонной последовательности полинуклеотида νΗ, выбранной из группы, состоящей из полинуклеотида, кодирующего тяжелую цепь иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106), и полинуклеотида, кодирующего тяжелую цепь иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой 7.РЮ5.1.О9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей ν^ по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичную эталонной последовательности полипептида νΕ, выбранной из группы, состоящей из 8ЕР Ю N0:273-286, 373, 377, 381, 385 и 417, показанных в табл. 8. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающие νΕ, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В другом аспекте настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ν^ имеющую последовательность полипептида, выбранную из группы, состоящей из 8ЕР Ю N0:273-286,
- 66 020508
373, 377, 381, 385 и 417, показанных в табл. 8. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий Уь кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
Таблица 8
Последовательности полипептида УЕ
УЬ Последовательность 8Е0 ГО ΝΟ:
ЬЮ2 РУЗНЗАрУЕЬТОРРЗУЗУЗРООТАЗГГСЗООКЬСЖКРАЗАУУРфКАОфЗ РУЬУ ΕΡφϋΚΚΚΕδΟΙΡΕΚΡδ6δΝδΟΝΤΑΤ1ΤΙδΟΤρΑΜϋΕΑΟΥΥΟφΑ\νθΤΝΤ УУРОООТКЬТУЬООРКААР 273
ЬЮ9 РУЗНЗАООЗОМТОЗРбЗЬЗАРУООКУАГГСКАЗОЗГОТУЬЪПУУООКРС КАРКЬЫУАА8КЬЕЕ>ОУРЗКР8С8ОТОТОРТЫТК8Ь0РЕОРОТУУС00 ЗУЗРРЬТРООСТКУЕЖКТУААР 274
ЬЮб ГУ5Н8АрО1рМТр8Р8ТЬ5А5УООКУТ1ТСКА508188\УЬА\У¥00КРО КАРКЬЫУАА88ЬКТСУР8КРКО8О8СТПРТЬН88Ь0РЕОРАТУУСЬ0 ОУЗУРЬТРОООТКЬЕЖКТУААР 275
ЬЮб ΡΥδΗδΑςδνΕΤςΡΡδνδνΑΡΟΟΤΑΚΙδΟΟΟϋΝΪΟδΚδνΗνΑ'φρΚΡΟΟΑ ΡνΕννΥϋϋΥΟΚΡδΟΙΡΕΚΡδΟδΝδΟΟΤΑΧΤΙΤΚνΕνΟΟΕΑϋΡΥΟΟνΚ ПЗКТЕЕКУРСССЗТКУТУЬСОРКААР 276
ЬЮ8 ГУ8Н8АфО10МТ<35Р88Ь8АЗУООК.УТГГС0А5(Д)15У¥ЬМАУУ00КРС ΚΑΡΚνυΥΒνδΝΤςΤΟνΡδΚΡδαδΑδΑΤΟΡΤίΤΙδδίΟΡΕΟΙΑΤΥΥΟΟΟ ЗОРОЬТРОООТКУЕЖКТУААР 277
Ь>11 ΓΥδΗδΑΟϋΙΟΜΤΟδΡδδνδΑΡΙΟΟΚνΤΠΌΚΑδΟΕΙΑΝΥίΑνΤΥΡΟΚΡΟ ΚΑΡΚ ЬЬПЮТУТЬОТЛУРРКРЗОЗОЗОТОРТЬТВЗЬОРЕОТАТУРСООАЫРР Ь5РС ООТКУЕГККТУААР 278
1Л0 Р¥8Н8АрО1<ЗМТр8РЗЗМЗА8У0ОТУТГГСКА5<2О1СЬПУЬА\¥¥0(2КР СКАР ТЬЫУАА53ЬЕ8ОУРЗКРТО8С338ОГОРТЬТ18ОЬНРЕОЬАТУ¥С00А0 ТТРЬТРОООТКУОЬККТУААР 279
ЬЮ1 ΕΥδΗδΑςϋίΟΜΤΟδΡδδΐ^ΑδνοοκντιτοοΑδοοίδΝΥίΝλνγςοκΡΟ КАРКЬЬтЭА5НЬЕТОУРЗКР8СЗС8ОТОГТЬТ133Ь0РЕОГАТ¥УС00 АЬКРРАУТРОООТКУЕККТУААР 280
ЬЮ7 РУ8НЗА03ЕЬТ0РР8У5У8Р00ТАПТС8СО0ЬСОКНУА\УУ00КРО08 РУЬУГУЬОЖКРАОВЕКРЗОЗКЗОМТАТЬТЖОТОАМОЕАОУУСОА^ Е)1К1'УЕСОСТК.ЬТУТСОРКААР 281
ьюз ΡΥδΗ8Α0ΟΙ0ΜΤ05Ρ53ΙΉΑδνθΟΚνΤΙΤ0ΚΑ50δΙ88ΥΕΚν/Υ0ρΚΡΟ КАРКЬЫУАА35Ьр8ОУР5КГ5О8ОЗОТОЕТЬТ138Ь0РЕПРАТУУС0Р5 ΥδΤΡν/ΤΡΟΟΟΤΚνΕΙΚΚΤνΑΑΡ • 282
1А7 ф1УЬТф8РА1М8А5РОЕКУТМТС5А855У8УМНЛУУ00К8ОТ8РККУЯУ ОТ8КЬА8СУРАКР8О8С8СТ8У8ЬТ188МЕАЕОААТУ¥С0р\У88МРРТ РОЗОТКЬЕЕК 283
2РЗ О10МТ08РА8Ь8А8УОЕТУТ1ТСКА8СН1¥Н¥ЬА5УР00К0ОК8Р0ЬЬУ ΥΝΑΚΤΕΡΟθνΡ8ΚΡ8Ο3Ο3<3Τ0ΥΡΕΚΙΝ3Ε0ΡΕΕ>ΡΟ3ΥΥΟ0ΗΓ\νΑΙΡΥ ТРССОТКЬЕ ЖК 284
УЬ Последовательность ЗЕр ГО ΝΟ: 285
ЗРЮ 10.2С 3 ΟΙΥΜΤΟδΡδδΕΤνΤΑσΕΚνΤΜδΟΚδδρδΙΧΝδΟΝςΚΝΥΕΤλνΥΟςΚΡΟ ОРРКЬЬтУАЗТКЕЗСУРОКРТОЗОЗОТОГТЬТЖЗУОАЕОЬАУУУСО ΝΟΥδΥΡΕΡΤΡΟδΟΤΚΣΕΙΚ
ЗРЮ п.зв 7 ЬПЗ Ы32 1ЛЗЗ Ы34 ЗВ5. 2 Р1А 7 уаг. О1УМТ03РЗЗЬТУТАОЕКУТМ8СК8803Ы243СМ0К8УЬ'ПУУ00КРО 0?РК ΕίΙΥλνΑδΤΚΕδΟνΡΟΚΡΤΟδΟδΟΙΌΡΤΕΤΙΝδνρΑΒϋΕΑνΥΥΟΟΝΟΥδ ΥΡ1Γ ТРОЗОТКЬЕЕК ШОМТОЗРАТЬЗЬЗРОЕКАТЕЗСКАЗОЗУЗЗУЬА^УУООКРООАРКЬЫ ΥΟΑ8ΝΚΑΤΟΙΡΑΚΡ80δΟδαΊΈΐΠΤΤΙ8δ1ΕΡΕΟΡΑνΥΥΟΟΡΚδ1ΉνΡΜ УТРСООТКЬЕЖ Р1<ЗМТ03РО5Ь8А8УОРКУТТГС0А80О18¥УЬРВУУ00КРСМАРКЬЬ ΙΥΌΑΡΙΕΕΟΟΑΡδΚΡδΟδΟδΟΤΟΡδΡΤΙδΝΕΟΡΕΟΙΑΤΥΡΟΟΟδΌΟΕΡνΤ РОООТКУЕЖ В10МТ03РОТЬ8Ь8РОЕКАТЬ8СКА803У88УЬА1УУ00КРС0АРКЬЫ ΥϋΑδΝΚΑΤΟίΡΑΚΡδΟδΟδΟΤΕΡΤΕΤΙδδίΟδΕΟΡΑνΥΥΟφρΥΟΚΧνΡΕ ТРСССЗТКУЕЖ О1рМТр8Р83ТСА5УООКУТПСНА30О15НП5АУУ0<ЗКРОКАРКЬЫ ΥΟΑΡΝΕΕΤΟνΡδΚΡδΟδΟδΟΤΟΕΓΡπδδΕΟΡΕϋΡΑΤΥΥΟΟΗΥΏΝίΡΡ ТРСРСТКУАЖ ОГУЬТОЗРММЗАЗРОЕКУТМТСЗАЗЗКУЗУУНРАЧЗСЖЗСТЗРККУ/Ь ΥΟΤδΝΕΑδΟνΡΑΚΡΟΟΝΟδΟΤδΥδΕΤΙδδΜΕΑΕϋΑΑΤΥΥΟΟΟΛνδΤΝΡ РТТСССТКЬЕК Е1УЬТ08РАТЬ8Ь8РОЕКАТЬ8С8А888У8УМНАУУ00КРО0АРКгЫУ ОТ8КЬА8С1РАКР5С8О5ОТЬуТЬТ188ЬЕРЕОРАУУУСр0У/88ЧРРТР ОООТКУЕЖ 286 373 377 381 385 417 430
Р1А 7 νβι. 2 Ч1УЬТ08РАТЬ5Ь5РОЕКАТЬ8С8А853У5¥МН\У¥00КРО0АРКгЕГУО Т8КЬАЗО1РАКРЗСЗОЗСТОуТЬ'П88ЬЕРЕПРАУУУС00\УЗЗМРРТРО ОСТКУЕЖ 431
Ы81 О10МТ03РАТЬ8Ь8РСЕКАТЬ8СКА508У88¥ЬАУ7У00КРС0АРКЬи ¥ОА81ЧКАТО1РАКР8СЗС8СТСРТЬТ188ЬЕРЕРРАУУУС00К8ЬПУРМ УТРСОСТКЬЕЖКТУААРЗУИРРРЗПЕфЬКЗСТАЗУУСЬЬКМРУРКЕ АКУрУ/КУОКАЬрЗСЫЗрЕЗУТЕфОЗКОЗТУЗЬЗЗТЬТЬЗКАОУЕКН КУУАСЕУТН0ОЬ85РУТК5РЫКСЕС ' 434
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей Уь по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичной эталонной последовательности полипептида Уь выбранной из группы, состоящей из 8Ер ГО N0:273-286, 373, 377, 381, 385 и 417, как показано в табл. 8.
- 67 020508
В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий Уь кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В другом аспекте настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей Уь соответствующую изобретению, выбранной из группы, состоящей из 8Ер ГО N0:273-286, 373, 377, 381, 385 и 417. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий Уь, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей Уь, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичную эталонной последовательности полипептида Уь, выбранной из группы, состоящей из полипептида легкой цепи иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106), и полипептида легкой цепи иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой 7.РГО5.1.С9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из Уь, кодируемой одним или более из вышеописанных полинуклеотидов, специфически или предпочтительно связывается с тем же эпитопом, что моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 201', 3А3, 3А6, 1А7, 1С7, 2В10, 2С11, 2Р3, 3РГО10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 3Р2С6.3С10.2н7, 3Р2С9.2С4, 3Р4А6.ГО9, 3Р4А1.2В9, 3Р4С2.2О2, 3Р4С5.ГО8, 3Р4С8.2С9, 30-С12 (П01), 38-001 (П02), 35-Е04 (П03), 36-С09 (П04), 30-А11 (П05), 34-Р02 (П06), 29-Е07 (П07), 34-С04 (П08), 36-А12 (Ы09), 28-002 (П10), 30-В01 (П11), 34-В03 (П12), Ы13, Ы32, Ы33, Ы34, 3383 (Ь1а.1), 3495 (Ь1а.2), 3563 (Ь1а.3), 3564 (Ь1а.4), 3565 (Ь1а.5), 3566 (Ь1а.6), 3567 (Ь1а.7), 3568 (Ь1а.8), 3569 (Ь1а.9), 3570 (Ь1а. 10), 3571 (Ыа.11), 3582 (Ыа.12), 1968 (Ыа.13), 7РЮ5.1С9, 3В5.2 и Ы81, или будет конкурентно ингибировать связывание данного моноклонального антитела с 8р35.
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из Уь, кодируемой одним или более из вышеописанных полинуклеотидов, специфически или предпочтительно связывается с полипептидом 8р35 или его фрагментом либо вариантом полипептида 8р35 с аффинностью, характеризующейся константой диссоциации (Ко) не больше чем 5х10-2 М, 10-2 М, 5х10-3 Μ, 10-3 М, 5х10’4 М, 10-4 М, 5х10-5 М, 10’5 М, 5х10-6 М, 10-6 М, 5х10’7 М, 10-7 М, 5х10-8 М, 10’8 М, 5х10-9 М, 10-9 М, 5х10-10 М, 10-10 М, 5х10’11 М, 10-11 М, 5х10’12 М, 10’12 М, 5х10-13 М, 10’13 М, 5х10-14 М, 10’14 М, 5х10’15 М или 10’15 М.
В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, который кодирует легкую цепь иммуноглобулина, где полинуклеотид представляет собой выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичную полинуклеотиду 8Ер ГО N0: 421, как показано ниже. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий легкую цепь, кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с 8р35 и/или тем же эпитопом, что моноклональное антитело 3В5.2.
Последовательность полинуклеотида легкой цепи иммуноглобулина мышиного и человеческого химерного антитела 3В5.2
АТееАТТТТСАееТеСАбАТТТТСАССТТССТССТААТСАСТОССТСАеТСАТААТ
АТССАСАееАСАААТТеТТСТСАСССАСТСТССАеСААТСАТСТСТССАТСТССАе
СССАСАА66ТСАССАТСАССТ6САСТ6ССАССТСАССТСТАА6ТТАССТеСАСТ6
СТАССАССАСААСТСАСОСАССТСССССААААСАТСССТТТАТСАСАСАТССААС стеесттстееАетссстсстсбсттсеетеесААтссетстеееАсстсттАстс
ТСТСАСААТСАССАССАТССАСССТСААСАТССТСССАСТТАТТАСТСССАССАСТ
ССАСТАСТААСССАСССАС6ТТСССАССССССАССААССТ6САААТААААССТАС
ССТСССТеСАССАТСТСТСТТСАТСТТССССССАТСТеАТбАССАСТТСАААТСТе
СААСТбССТСТСТТСТеТСССТССТеААТААСТТСТАТСССАСАСАССССАААеТА
САСТеСААеСТеСАТААСССССТССААТССССТААСТСССАбСАСАСТСТСАСАС
АССАеСАСАССААеСАСАССАССТАСАеССТСАбСАеСАСССТСАСеСТеАССА
ААОСАСАСТАССАСАААСАСАААСТСТАССССТСССААОТСАСССАТСАСССССТ
САОСТССССССТСАСАААСАССТТСААСАССССАСАСТСТТАС (5ΕΩ ГО N0:421).
В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, который кодирует вариабельную область легкой цепи (Уь), причем полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты Уь выбранную из группы, состоящей из 8Ер ГО N0 185-194, 371, 375, 379, 383 и 423, как показано в табл. 9. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий Уь кодируемую полинуклеотидом, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
- 68 020508
Последовательности полинуклеотидов Уь
Таблица 9
УЬ Последовательность ЗΕ^ ГО ΝΟ:
йог 1ТСТАТТСТСАСАОТ(ЗСАСАСТАССААТТаАСТСАОССАСССТСА(ЗТСТССС ТОТССССАООАСАОАСАаССАОСАТСАССТОСТСТООАОАТАААТТСЗаеСЗСА ТАААТТТССТТССТаОТАТСАССАСААСССАССССАСТССССТСТССТССТС АТСТТТСААОАТАСОААОСОТСТСТСАОССАТСССТСАССОАТТСТСТаОСТ ССААСТСТОСОААСАСАСССАСТСТОАССАТСАССССОАСССАООСТАТССА ТСАСССТСАСТАТТАСТСТС?АССССТСССАСА(?СААСАСТСТССТСТТСССС ССАСССАССААбСТОАСССТССТАООТСАОСССААООСТСССССС 185
□09 ТТСТАТТСТСАСАСТССАСААСАСАТССАОАТСАСССАаТСТССАТССТССС ТОТСТОСАТТТ<ЗТ<ЗОСАСАСА6А<ЗТССССАТСАСТТОССС5СОСААОТСА(ЗАО САТСОАСАССТАТТТАААТТССТАТСАССАОАААССАСССАААСССССТААА СТССТСАТСТАТССТССАТССААСЗТТООААОАССССОТСССАТСААСАТТСА СТаССАСТСОААСТеССАСАОАТТТСАСТСТСАССАТСАОААСТСТССААСС ТОААОАТТТТСОААСТТАСТАСТСТСААСАСАСТТАСАСТСССССТСТСАСТ ТТСОССССАСССАССААООТССАСАТСАААССААСТСТСССТССАССА 186
□06 ТТСТАТТСТСАСАОТССАСААСАСАТССАСАТОАСССАОТСТССТТССАССС ТСТСТССАТСТСТАССАСАСАСАСТСАССАТСАСТТССССССССАСТСАСАС ГАТТАОТАССТССТТОвССТОСТАТСАССАСАААССАССЗОАААаССССТААС СТССТСАТСТАТССТССАТССАСТТТАСОААСТССССТСССАТСААЙАТТСА СЮООСАСТСОАТСТСССАСАОАТТТСАСТСТСАССАТСАССАСССТОСАОСС ТСААСЗАТТТТОСААССТАТТАСТСТХЗТАСААОАТТАСАСТТАСССТСТСАСТ ТТТООССАССЗОСАССААаСтеОАСАТСАААСОААСТСТОССТССАССА 187
ЬЮ5 ТТСТАТТСТСАСАСТССАСАОАСССТСТТОАСТСАСССАСССТССОТОТСАС ТССССССАССССАСАСССССАССАТТТССТСТСССССАСАСААСАТТССААС ТААОАСТСТССАСТОСТАССАОСАОАОСЗССАОаССАббССССТСТССТССТС ОТОТАТОАТОАТТАТОАССаССССТСАСОСАТСССТОАССОАТГСТСТСССТ ССААСТСТСОаОАСАСООССАТССТСАССАТСАССАСССТССААСТСССССА ТСАСССССАСТТТТАТТСТСАОСТСАСССАСАСССОТАСТОАССЗААСОССТд ТТССССССАСССЗАССААСОТСАСССТСТТАССТСАОСССААОССТСССССС 188
□08 ТТСТАТТСТСАСАСТССАСААСАСАТССАСАТСАСССАСТСТССАТСТТССС ТОТСТССАТСТСТАССАСАСАСАСТСАССАТСАСТТСССАСОССАСТСАЕСА САТТАСТТАСТАТТТАААТТССТАТСАССАСААСССАСССАААСССССТААО СТССТСАТСТАССАТСГАТССААТГГССАААСАСОССТСССАТСААСетТСА СТСОААеТССОТСТОСеАСКОАТТТТАСТСТСАССАТСАОСАОССТССАОСС ТСААСАТАТТСССАСАТАТТАСТСТСААСАСТСТОАТААТСТСССТСТСАСТ ТТССССССАСССАССААССТОСАСАТТАААССААСТЕТСССТОСАССА 189
УЬ Последовательность 5Е(5 ГО ΝΟ:
□ 11 ТТСТАТТСТСАСАОТОСАСААОАСАТССАОАТСАСССАСТСТССАТСТТСТС ТСТСТССАССТАТАСОАСАСАСАСТСАССАТСАСТТСТССССССАСТСДССА САТТСССААСТАСТТАСССТаСТАТСАаСАаАААССАОСОАААСССССТААС СТССТОАТСТАТОАТАСАТАСАСТТТССАСАСТСАСОТСССАСССАСеТТСА ассзосАотаоттсааааАСАОАтттсАСТСтсАСТАТСАдсАОсстссАбсс ТОААОАТАСТОСААСТТАСТТТТСТСААСАСССТОАСАТТТТСССОСТСТСТ ТТСООСООАОСЗОАССААСЗОТООАСЗАТСАААСОААСТОТСССТССАССА 190
□10 ТТСТАТТСТСАСАОТОСАСААОАСАТССАСАТСАСССАСТСТССАТСТТССА ТСТСТССТТСТОТАООООАСАСАСТСАССАТСАСТТСТСОСССОАОТСАОСС ТАТТООСААСТССТТАаССТССТАТСАСЗСАОАААССАСССАААСССССААСТ СТССТОАТСТАТССТССАТССАОТТТООАААСТССООТСССАТСААССТТСА ССООСАСЗССКЗСАОТТССТСТОООАТАбАТТТСАСТСТСАССАТСАСССАССТ ОСАСССТОААОАТТТСКЗСААСТТАСТАТТОТСААСАОССТСАСАСТТГСССС СТСАССТТСООСааАСЗООАССАОаОТвОАССТСААОСаААСТаТООСТОСАС СА 191
□01 ТТСТАТТСТСАСАСТССАСААОАСАТССАОАТОАСССАОТСТССАТССТССС ТСТСТССАТСТСТАССАСАСАСАСТСАССАТСАСТГСССАОСССАСТСАССА САТТАССААСТАТТТАААТТОСТАТСАССАСЗАААССАСССАААСССССТААС СТССТСАТСТАСаАТССАТССААТТТССАААСАССССТСССАТСААССТТСА ССОССАСТаОАТСТОССАСАОАТТТСАСТСТСАССАТСАССАСССТССАССС ТОААСЗАТТТТССААСТТАСТАТТСТСААСАСССТСАСАСОТТСССТССССТС АСТГГССССССАССеАССААССТСОАСАТСАААССААСТСТСССТССАССА 192
□07 ТТСТАТТСТСАСАСТССАСАОАСССААТТСАСТСАСССАСССТСАСТСТССС ТСТССССАССАСАСАСАСССАТСАТСАССТССТСТССАСАТСАСТТХЗССТСА САААСАТСТСОСТГООТАТСААСАОААСССАССССАСТССССТСТССТССЗТС АТСТАТСТАСЗАСАТТААСАСХЗСССеСАСССЗАТТТСТСАСССАТТСТСТСССТ ССААСТСТСОАААТАСАОССАСТСТСАССАТСАОАСССАСССАСССТАТССА ТСААССТСАСТАТТАСТОТСАССССТСССАСАТСААСАССОТСТТСССССОС ССОАССААОСТОАССОТССТСАОТСАОСССААСбСТОССССС 193
□03 ТТСТАТТСТСАСАСТССАСААОАСАТССАСАТСАСССАОТСТССАТССТССС ТаТСТССАТСТСТАСЗСАОАСАСАСТСАССАТСАСТТСССССССААСТСАСАС САТТАОСАССТАТТТАААТТОСТАТСАССАСАААССАОССЗАААСССССТААС СТССТОАТСТАТССТОСАТССАСТТТССАААСТСССаТСССАТСААССТТСА СТООСАСТССАТСТСССАСАСАТТТСАСТСТСАССАТСАССАОТСТССААСС ТОААаАТТТТОСААСТТАСТАСТаТСААСАОАОТТАСАОТАССССаТООАСО ТТСССССААСССАССААССТССАААТСАААССААСТОТСССТССАССА 194
□ 1 3 ОАСАТССАОАТСАСССАСТСТССАОССАСССТСТСТТТатСТССАССССАА АСАСССАСССТСТССТССАСССССАСТСАСАСТСТТАОСАССТАСТТАССС ТСОТАССААСАОАААССТОСССАООСТСССАООСТССТСАТСТАТСЗАТССА ТССААСАСССССАСТСССАТСССАСССАССТТСАОТСССАСТОСОТСТССС АСАОАСТТСАСТСТСАССАТСАССАСССТАСАСССТСААСАТТТТССАСТТ ТАТТАСТСТСАССАСССТАССААСТСаСССАТСТАСАСТТТТССССАССОЗ АССААССТССАСАТСААА 371
- 69 020508
УЬ Последовательность 8Е(3 ГО ΝΟ:
из 2 ОАСАТССАОАТОАСССАОТСТССАОАСТСССТОТСТОСАТСТСТТССАОАС АСАОТа^ССАТСАСТТСССАСОСОАОТСААСЗАСАТТАССТАСТАТТТАААТ ТОСТАТСАОСАСАААССАССС5АТСЙССССТАААСТССТСАТСТАССАТЗСС ТТСАТТТТОеААаЗАОеССССССАТСАСССТТСАОТОСОАССОССТСТООО АСАОАТТТТТСТТТСАССАТСАОСААТСТАСАеССТСАСЗСАТАТТССААС’Г ТАТТТСТСТСААСАСТСТСАТСААСТСССССТСАССТТСССССААССОАСС ААСОТСОАААТСАСА 375
из 3 САСАТССАОАТОАСССАОТСТССАООСАСССТОТСТТТСТСТССАССОСАА АСЗАСССАСССТСТССТОСАСССССАЗТСАОАСТСТТАССАССТАСТТАССС ТСаТАССААСАСАААСХТССССАСССТСССАаССТССТСАТСТАТСАТССА ТССААСАОССССАСТСССАТСССАСССАССТТСАСТеССАСТСеСТСТСеС АСАОАеТТСАСТСТСАССАТСАОСАЗССТОСАОТСТСАСОАТТТТССАОТТ ТАТТАСТСТСАССАСТАТСАТААОТаОССОСТСАСТТТСООССаАаООАСС ААССТССАСАТСААА 379
из 4 СЗАСАТССАСАТСАСССАСТСТССАТССТСССТОТСТеСАТСТСТАООАОАС АОАСТСАССАТСАСТТСЗССАТССОАСТСАССАСАТТАССААСТАТТТААСТ ТССТАТСАССАСАААССАССТАААСССССТАААСТССТСАТСТАССАТССТ ТТСААТТТСОАСАСАСЗСАСЗТСССАТСОАСаТТСАСТаОААОТСОАТСТООС АСАаАТТТТАСАТТСАССАТСАОСАаССТОСАОССТОААОАТТТТССААСА ТАТТАСТСТСАаСАСТАТаАТААТСТСССАТТСАСТГГСООСССТСООАСС АСАСТОСССАТСАСА 383
ЗВ 5.2 САААТТСТТСТСАСССАСТСТССАССААТСАТСТСТССАТСТССАСОССАС ААССТСАССАТСАССТССАСТСССАССТСАССТСТААСТТАССТССАСТСС ТАССАССАСААСТСАСССАССТСССССААААСАТСССТТТАТСАСАСАТСС ААССТСССТТСТССАСТСССТССТСССТТСССТСССААТСССТСТСССАСС ТСТТАСТСТСТСАСААТСАОСАССАТСОАСССТСААОАТССТСССАСТТАТ ТАСТСССАССАСТССАСТАСТААСССАСССАССТТСССАССССССАССААС СТССАААТАААА 423
ие 1 САТАТССАСАТСАСССАСТСТССАСССАСССТСТСТТТСТСТССАССССАА АСАОССАСССТСТССТССАСССССАОТСАСАСТСТТАССАССТАСТТАССС ТССТАССААСАСАААССТССССАСССТСССАСССТССТСАТСТАТСАТССА ТССААСАСССССАСТСССАТСССАСССАССТТСАСТСССАСТСССТСТССС АСАСАСТТСАСТСТСАССАТСАССАСССТАСАСССТСААСАТТТТССАСТТ ТАТТАСТСТСАССАСССТАССААСТСССССАТСТАСАСТТТТССССАСССС АССААССТССАСАТСАААССТАСССТСОСТОСАССАТСТСТСТТСАТСТТС СССССАТСТСАТеАССАОТГСАААТС'ГССААСТОССТСТСТТСТСТСССТС СТСААТААСТТСТАТСССАСАСАССССАААСТАСАОТСОААСОТССАТААС ССССТССААТССССТААСТСССАССАСАСТСТСАСАСАССАССАСАССААС САСАОСАССТАСАСССТСАССАССАСССТСАСССТОАССАААССАСАСТАС ОАСАААСАСАААСТСТАССССТСССААаТСАСССАТСАаОаССТСАССТСС ССССТСАСАААСАССТТСААСАССССАСАСТСТТАС 449
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей Уь, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичную полинуклеотиду УЕ, выбранному из группы, состоящей из §Е^ ГО N0:185-194, 371, 375, 379, 383 и 423, представленных в табл. 9. В ряде вариантов осуществления полинуклеотид кодирует полипептид Уь который специфически или предпочтительно связывается с §р35.
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из Уь кодируемой одним или более вышеописанных полинуклеотидов, специфически или предпочтительно связывается с тем же эпитопом, что моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 201', 3А3, 3А6, 1А7, 107, 2В10, 2С11, 2Р3, 3РГО10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 3Р2С6.3010.2И7, 3Р2С9.2О4, 3Р4А6.ГО9, 3Р4А1.2В9, 3Р4С2.2П2, 3Р4С5.ГО8, 3Р4С8.2О9, 30-С12 (Ы01), 38-001 (П02), 35-Е04 (П03), 36-С09 (П04), 30-А11 (ЬЮ5), 34-Р02 (ЬЮ6), 29-Е07 (П07), 34-004 (ЬЮ8), 36-А12 (П09), 28-Ό02 (Ы10), 30-В01 (Ш1), 34-В03 (Ш2), П13, Ы32, Ьг33, П34, 3383 (Ь1а.1), 3495 (Ь1а.2), 3563 (Ь1а.3), 3564 (Ь1а.4), 3565 (Ь1а.5), 3566 (Ь1а.6), 3567 (Ь1а.7), 3568 (Ь1а.8), 3569 (Ь1а.9), 3570 (Ыа.10), 3571 (Ыа.11), 3582 (Ыа.12), 1968 (Ыа.13), 7РГО5.1О9, 3В5.2 и Ы81, или будет конкурентно ингибировать связывание данного моноклонального антитела с §р35.
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из Уь кодируемой одним или более из вышеописанных полинуклеотидов, специфически или предпочтительно связывается с полипептидом §р35 или его фрагментом либо вариантом полипептида §р35 с аффинностью, характеризующейся константой диссоциации (Ко) не больше чем 5х10-2 М, 10-2 М, 5х10-3 М, 10-3 М, 5х10-4 М, 10-4 М, 5х10-5 М, 10-5 М, 5х10-6 М, 10-6 М, 5х10-7 М, 10-7 М, 5х10-8 М, 10-8 М, 5х10-9 М, 10-9 М, 5х10-10 М, 10-10 М, 5х10-11 М, 10-11 М, 5х10-12 М, 10-12 М, 5х10-13 М, 10-13 М, 5х10-14 М, 10-14 М, 5х10-15 М или 10-15 М.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, включающий, в основном состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей Уь, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичную эталонной последовательности полинуклеотида Уь выбранной из группы, состоящей из полинуклеотида, кодирующего легкую цепь иммуноглобулина, продуцируемую гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106), и полинуклеотида, кодирующего легкую цепь иммуноглобулина, продуцируемую гибридомой 7.РГО5.1.О9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
Любой из вышеописанных полинуклеотидов может далее включать дополнительные нуклеиновые кислоты, кодирующие, например, сигнальный пептид, чтобы направлять секрецию кодируемого полипептида, константные области антитела, как описано в данном контексте или другие гетерологичные
- 70 020508 полипептиды, как описано в данном контексте.
Кроме того, как более подробно описано в других разделах данного материала, настоящее изобретение включает композиции, содержащие полинуклеотиды, включающие один или более вышеописанных полинуклеотидов. В одном варианте осуществления изобретение включает композиции, содержащие первый полинуклеотид и второй полинуклеотид, причем указанный первый полинуклеотид кодирует полипептид Ун, как описано в данном контексте, и причем указанный второй полинуклеотид кодирует полипептид Уъ, как описано в данном контексте. В частности, композицию, которая включает, состоит в основном или состоит из полинуклеотида Ун, как показано в табл. 7, и полинуклеотида Уъ, как показано в табл. 9, где указанный полинуклеотид Ун и указанный полинуклеотид Уъ выбраны из группы, состоящей из:
1) δΙΥ) ΙΌ ЫО: 173 и δΙΥ) ΙΌ ЫО:185; ίί) δΙΥ) ΌΌ ЫО:174 и δΙΥ) ΙΌ ЫО:186; ίίί) δΙΥ) ΙΌ ЫО: 175 и δΙΥ) ΌΌ ЫО:187; ίν) δΙΥ) ΙΌ ЫО:176 и δΙΥ) ΌΌ ЫО:188; ν) δΙΥ) ΌΌ ЫО:178 и δΙΥ) ΌΌ ЫО:189; νί) δΙΥ) ΌΌ ЫО:179 и δΙΥ) ΌΌ ЫО:190; νίί) δΙΥ) ΌΌ ЫО:180 и δΙΥ) ΌΌ ЫО:191; νίίί) δΙΥ) ΌΌ ΝΘ:181 и δΙΥ) ΌΌ ЫО:192; ίχ) δΙΥ) ΌΌ ЫО:182 и δΙΥ) ΌΌ ЫО:193; χ) δ НС) ΌΌ ЫО:183 и δΙΥ) ΙΌ ЫО:194; χί) δΙΥ) ΌΌ ЫО:370 и δΙΥ) ΌΌ ЫО:371; χίί) δΙΥ) ΌΌ ЫО:374 и δΙΥ) ΌΌ ЫО:375; χίίί) δΙΥ) ΌΌ ЫО:378 и δΙΥ) ΌΌ ЫО:379; χίν) δΙΥ) ΌΌ ЫО:382 и δΙΥ) ΌΌ ЫО:385; χν) δΙΥ) ΌΌ ЫО:422 и δΙΥ) ΙΌ ЫО:423; χνί) δΙΥ) ΌΌ ЫО: 448 и δΙΥ) ΌΌ ЫО: 449; χνίί) δΙΥ) ΌΌ ЫО:450 и δΙΥ) ΌΌ ЫО:449.
Настоящее изобретение также включает фрагменты полинуклеотидов, соответствующих изобретению, как описано в других разделах. Кроме того, полинуклеотиды, которые кодируют слитые полинуклеотиды, фрагменты ЕаЬ и другие производные, как описано в данном контексте, также предусмотрены изобретением.
Полинуклеотиды можно продуцировать или изготовить любым способом, известным в области техники. Например, если нуклеотидная последовательность антитела известна, полинуклеотид, кодирующий антитело, можно собрать из полученных химическим синтезом олигонуклеотидов (например, как описано в статье Кийнскг с1 а1., ВюТесйпкщек 17:242 (1994)), который, вкратце, включает синтез перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих части последовательности, кодирующей антитело, отжиг и лигирование данных олигонуклеотидов, и затем амплификацию лигированных олигонуклеотидов с помощью ПЦР.
Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий антитело к δр35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, можно генерировать из нуклеиновой кислоты, полученной из подходящего источника. Если клон, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую определенное антитело, недоступен, но последовательность молекулы антитела известна, то нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, можно синтезировать химическим путем или получить из подходящего источника (например, библиотеки кДНК антител или библиотеки кДНК, генерированной, или нуклеиновой кислоты, предпочтительно поли-А+РНК, выделенной из любой ткани или клеток, экспрессирующих данное антитело или другое антитело к δр35, таких как гибридомные клетки, отобранные для экспрессии антитела), путем ПЦР-амплификации с использованием синтетических праймеров, гибридизующихся с 3'- и 5'-концами последовательности, или клонированием с использованием олигонуклеотидного зонда, специфического в отношении последовательности конкретного гена, с целью идентификации, например, клона кДНК из библиотеки кДНК, которая кодирует данное антитело или другое антитело к δр35. Амплифицированные нуклеиновые кислоты, генерированные посредством ПЦР, затем можно клонировать в реплицирующиеся клонирующие векторы, используя любой способ, хорошо известный в области техники.
После установления нуклеотидной последовательности и соответствующей последовательности аминокислот антитела к δр35 или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного с его нуклеотидной последовательностью можно произвести манипуляции с помощью способов, хорошо известных в области техники, предназначенных для манипуляций с нуклеотидными последовательностями, например технологий рекомбинантной ДНК, сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и т.п. (см., например, способы, описанные в монографии δΗπΛίΌοΚ с1 а1., Мо1еси1аг С1отпд, А ЬаЬогаЮгу Мапиа1 (Молекулярное клонирование, лабораторное руководство), 2-е изд., Сок δр^^ηд нагЬог ЬаЬогакгу, Сок δр^^ηд нагЬог, N. Υ. (1990) и под ред. АикиЬе1 еί а1., Снггеп! Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (Современные протоколы в молекулярной биологии), кйп №йеу & δοη5, ΝΥ (1998), обе из которых включены в виде ссылки в данном контексте в своей полноте), с целью генерации антител, имеющих разные последовательности
- 71 020508 аминокислот, например, для создания замен, делеций и/или инсерций аминокислот.
Полинуклеотид, кодирующий антитело к 8р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может состоять из любого полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, которые могут представлять собой немодифицированную РНК или ДНК либо модифицированную РНК или ДНК. Например, полинуклеотид, кодирующий антитело к 8р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может состоять из одно- или двухцепочечной ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных участков, одно- и двухцепочечной РНК и РНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных участков, гибридных молекул, включающих ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, более типично, двухцепочечными или смесью одно- и двухцепочечных участков. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий антитело к 8р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может состоять из трехцепочечных участков, включающих РНК или ДНК либо обе - РНК и ДНК. Полинуклеотид, кодирующий антитело к 8р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может также содержать одно или более модифицированных оснований или скелеты ДНК или РНК, модифицированные для стабильности или по другим причинам. Модифицированные основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. Можно осуществить множество модификаций ДНК и РНК; таким образом, термин полинуклеотид охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы.
Выделенный полинуклеотид, кодирующий неприродный вариант полипептида, выделенный из иммуноглобулина (например, часть тяжелой цепи или часть легкой цепи иммуноглобулина), можно создать путем интродукции одной или более замен, добавлений или делеций нуклеотидов в нуклеотидной последовательности иммуноглобулина, так что одна или более замен, добавлений или делеций аминокислот интродуцируются в кодируемый белок. Мутации можно интродуцировать стандартными способами, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Предпочтительно, когда делают консервативные замены аминокислот в одном или более неосновных остатков аминокислот.
У. Полипептиды антитела к 8Р35.
Настоящее изобретение далее направлено на выделенные полипептиды, которые образуют антитела к 8р35, их антиген-связывающие фрагменты, варианты или производные. Антитела к 8р35, соответствующие настоящему изобретению, включают полипептиды, например последовательности аминокислот, кодирующие 8р35-специфические антигенсвязывающие участки, выделенные из молекул иммуноглобулина. Полипептид или последовательность аминокислот, выделенная из определенного белка, относятся к природе полипептида. В ряде случаев полипептид или последовательность аминокислот, которые выделены из определенного исходного полипептида или последовательности аминокислот, имеет последовательность аминокислот, в основном идентичную исходной последовательности или ее части, причем часть состоит из по меньшей мере 10-20 аминокислот, по меньшей мере 20-30 аминокислот, по меньшей мере 30-50 аминокислот или тех, которые иным идентифицируются обычным специалистом в области техники, как происходящие из исходной последовательности.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (Ун), где по меньшей мере один из СГОР5 вариабельной области тяжелой цепи или по меньшей мере два из СГОР5 вариабельной области тяжелой цепи по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны эталонной последовательности аминокислот СГОРИ СГОР2 или СГОР3 тяжелой цепи из моноклональных антител к 8р35, описанных в данном контексте. Альтернативно, участки СЭР1, СГОР2 и СГОР3 Ун по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны эталонной последовательности аминокислот СЭК.1, СГОР2 или СГОР3 Ун из моноклональных антител к 8р35, описанных в данном контексте. Таким образом, согласно данному варианту осуществления вариабельная область тяжелой цепи, соответствующая изобретению, имеет последовательности полипептидов СЭК.1, СГОР2 и СГОР3, родственные группам, показанным в табл. 4, см. выше. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий полипептид Ун, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (Ун), в которой участки СЭК.1, СГОР2 и СГОР3 имеют последовательности полипептида, которые идентичны группам СЭК.1, СГОР2 и СГОР3, показанным в табл. 4. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий полипептид Ун, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (Ун), где по меньшей мере один из СГОР5 вариабельной области тяжелой цепи или по меньшей мере два из СГОР5 вариабельной области тяжелой цепи по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичны эталонной последовательности аминокислот СЭК.1, СГОР2 и СГОР3 тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из последовательности аминокислот СЭК.1, СГОР2 и СГОР3 Ун тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемой гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106), последовательно- 72 020508 сти аминокислот СГОРИ СГОР2 и СГОР3 Ун тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемой гибридомой 7.РЮ5.1.09 (АТСС номер депозита РТА-8107).
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из полипептида Ун, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичного эталонной последовательности полипептида Ун, выбранного из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:158-172, 372, 376, 380, 384, 416 и 433, как показано в табл. 6, и 8ЕЦ ГО N0:435. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий полипептид Ун, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В другом аспекте настоящее изобретение включает выделенный полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из полипептида Ун, выбранного из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:158-172, 372, 376, 380, 384, 416 и 433, как показано в табл. 6, и 8ЕЦ ГО N0:435. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий полипептид Ун, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из полипептида Ун, по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичного эталонной последовательности полипептида Ун, выбранного из группы, состоящей из тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемой гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106), и тяжелой цепи иммуноглобулина, продуцируемой гибридомой 7.РГО5.1.09 (АТСС номер депозита РТА-8107).
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из одного или более вышеописанных полипептидов Ун, специфически или предпочтительно связывается с тем же эпитопом, что моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 201', 3А3, 3А6, 1А7, 107, 2В10, 2С11, 2Р3, 3РГО10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 3Р2С6.3010.2н7, 3Р2С9.204, 3Р4А6.ГО9, 3Р4А1.2В9, 3Р4С2.2О2, 3Р4С5.ГО8, 3Р4С8.209, 30-С12 (Л01), 38-Ό01 (Ы02), 35-Е04 (ЬЮ3), 36-С09 (ЬЮ4), 30-А11 (Л05), 34-Р02 (Л06), 29-Е07 (ЬЮ7), 34-004 (Л08), 36-А12 (Ы09), 28-Ό02 (Ы10), 30-В01 (Ы11), 34-В03 (Ы12), Ы13, Ь132, Ь133, Ь134, 3383 (Ь1а.1), 3495 (Ь1а.2), 3563 (Ь1а.3), 3564 (Ь1а.4), 3565 (Ь1а.5), 3566 (Ь1а.6), 3567 (Ь1а.7), 3568 (Ь1а.8), 3569 (Ь1а.9), 3570 (Ь1а.10), 3571 (Ыа.11),3582(Ыа.12), 1968 (Ь1а.13), 7РГО5.109, 3В5.2 и Ы81, или будет конкурентно ингибировать связывание данного моноклонального антитела с 8р35.
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из одного или более их вышеописанных полипептидов Ун, специфически или предпочтительно связывается с полипептидом 8р35 или его фрагментом либо вариантом полипептида 8р35 с аффинностью, характеризующейся константой диссоциации (Кс) не больше чем 5х10-2 М, 10-2 М, 5х10-3 Μ, 10-3 М, 5х10-4 М, 10-4 М, 5х10-5 М, 10-5 М, 5х10-6 М, 10-6 М, 5х10-7 М, 10-7 М, 5х10-8 М, 10-8 М, 5х10-9 М, 10-9 М, 5х10-10 М, 10-10 Μ, 5х10-11 М, 10-11 М, 5х10-12 М, 10-12 М, 5х10-13 М, 10-13 М, 5х10-14 М, 10-14 М, 5х10-15 М или 10-15 М.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (Уь), где по меньшей мере один из СГОР5 вариабельной области легкой цепи или по меньшей мере два из СГОР5 вариабельной области легкой цепи по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны эталонным последовательностям аминокислот СЭК.1, СГОР2 или СГОР3 легкой цепи из моноклональных антител к 8р35, описанных в данном контексте. Альтернативно, участки СЭК.1, СГОР2 и СГОР3 Уь по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентичны эталонным последовательностям аминокислот СЭК.1, СГОР2 или СГОР3 легкой цепи из моноклональных антител к 8р35, описанных в данном контексте. Таким образом, согласно данному варианту осуществления вариабельная область легкой цепи, соответствующая изобретению, имеет последовательности полипептидов СЭК.1, СГОР2 и СГОР3, родственные полипептидам, показанным в табл. 5, см. выше. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий полипептид Уъ, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (Уь), в которой участки СЭК.1, СГОР2 и СГОР3 имеют последовательности полипептида, которые идентичны группам СЭК.1, СГОР2 и СГОР3, показанным в табл. 5. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий полипептид Уъ, специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина (Уь), где по меньшей мере один из СГОР5 вариабельной области легкой цепи или по меньшей мере два из СГОР5 вариабельной области легкой цепи по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичны эталонным последовательностям аминокислот СЭК.1, СГОР2 или СГОР3 легкой цепи иммуноглобулина, выбранным из группы, состоящей из последовательностей аминокислот СЭК.1, СГОР2 и СГОР3
- 73 020508 ν легкой цепи иммуноглобулина, продуцируемых гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА8106), и последовательностей аминокислот СГОКЕ СГОК2 или СГОК3 легкой цепи иммуноглобулина, продуцируемых гибридомой 7.РГО5.1.О9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из полипептида по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% идентично эталонной последовательности полипептида У^ выбранного из группы, состоящей из 8ЕД ГО N0:273-286, 373, 377, 381, 385, 417 и 434, показанных в табл. 8. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий полипептид ν^ специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В другом аспекте настоящее изобретение включает выделенный полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из полипептида У^ выбранного из группы, состоящей из 8ЕД ГО N0:273-286, 373, 377, 381, 385, 417 и 434, показанных в табл. 8. В ряде вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, включающий полипептид ν^ специфически или предпочтительно связывается с 8р35.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из полипептида У^ по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичного эталонной последовательности полипептида У^ выбранного из группы, состоящей из легкой цепи ν иммуноглобулина, продуцируемой гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106), и легкой цепи ν иммуноглобулина, продуцируемой гибридомой 7.РГО5.1.О9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, состоящий в основном из одного или более из вышеописанных полипептидов У^ специфически или предпочтительно связывается с тем же эпитопом, что моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 201', 3А3, 3А6, 1А7, 1О7, 2В10, 2С11, 2Р3, 3РГО10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 3Р2С6.3О10.2Н7, 3Р2С9.2О4, 3Р4А6.ГО9, 3Р4А1.2В9, 3Р4С2.2О2, 3Р4С5.ГО8, 3Р4С8.2О9, 30-С12 (ЬЮ1), 38-Ό01 (Ы02), 35Е04 (Л03), 36-С09 (Л04), 30-А11 (Ы05), 34-Р02 (Л06), 29-Е07 (Л07), 34-О04 (Ы08), 36-Α12 (ЬЮ9), 28Ό02 (Ы10), 30-Β01 (Ы11), 34-Β03 (Ы12), Ы13, Ы32, Ы33, Ы34, 3383 (Ь1а.1), 3495 (Ь1а.2), 3563 (Ь1а.3), 3564 (Ь1а.4), 3565 (Ь1а.5), 3566 (Ь1а.6), 3567 (Ь1а.7), 3568 (Ь1а.8), 3569 (Ь1а.9), 3570 (Ь1а.10), 3571 (Ь1а.11), 3582 (Ь1а.12), 1968 (Ь1а.13), 7РГО5.1О9, 3Β5.2 и Ы81, или будет конкурентно ингибировать связывание данного моноклонального антитела с 8р35.
В ряде вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий, в основном состоящий или состоящий из одного или более их вышеописанных полипептидов ν^ специфически или предпочтительно связывается с полипептидом 8р35 или его фрагментом либо вариантом полипептида 8р35 с аффинностью, характеризующейся константой диссоциации (Кс) не больше чем 5х10-2 М, 10-2 М, 5х10-3 М, 10-3 М, 5х10-4 М, 10-4 М, 5х10-5 М, 10-5 М, 5х10-6 М, 10-6 М, 5х10-7 М, 10-7 М, 5х10-8 М, 10-8 М, 5х10-9 М, 10-9 М, 5х10-10 М, 10-10 М, 5х10-11 М, 10-11 М, 5х10-12 М, 10-12 М, 5х10-13 М, 10-13 М, 5х 10-14 М, 10-14 М, 5х10-15 М или 10-15 М.
В других вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает, в основном состоит или состоит из полипептида У^ как показано в табл. 6, и полипептида У^ как показано в табл. 8, выбранных из группы, состоящей из:
1) 8ЕД ГО N0:170 и /ЕС) ГО N0:283; ίί) /ЕС) ΙΌ N0:171 и /ЕС) ΙΌ N0:284; ίίί) /ЕС) ΙΌ N0:172 и /ЕС) ΙΌ N0:285; ΐν) /ЕС) ΙΌ N0:172 и /ЕС) ΙΌ N0:286; ν) /ЕС) ΙΌ N0:158 и /ЕС) ΙΌ N0:273; νΐ) /ЕС) ΙΌ N0:159 и /ЕС) ΙΌ N0:274; νΐΐ) /ЕС) ΙΌ N0:160 и /ЕС) ΙΌ N0:275; νίίί) /ЕС) ΙΌ N0:161 и /ЕС) ΙΌ N0:276; ίχ) /ЕС) ΙΌ N0:163 и /ЕС) ΙΌ N0:277; χ) /ЕС) ΙΌ N0:164 и /ЕС) ΙΌ N0:278; χί) /ЕС) ΙΌ N0:165 и /ЕС) ΙΌ N0:279; χίί) /ЕС) ΙΌ N0:166 и /ЕС) ΙΌ N0:280; χίίί) /ЕС) ΙΌ N0:167 и /ЕС) ΙΌ N0:281; χίν) /ЕС) ΙΌ N0:168 и /ЕС) ΙΌ N0:282; χν) /ЕС) ΙΌ N0:372 и /ЕС) ΌΌ N0:373; χνί) /ЕС) ΙΌ N0:376 и /ЕС) ΙΌ N0:377; χνίί) /ЕС) ΙΌ N0:380 и /ЕС) ΙΌ N0:381; χνίίί) /ЕС) ΙΌ N0:384 и /ЕС) ΙΌ N0:385; χίχ) /ЕС) ΙΌ N0:416 и /ЕС) ΙΌ N0:417; χχ) /ЕС) ΙΌ N0:433 и /ЕС) ΙΌ N0:434; χχί) /ЕС) ΙΌ N0:435 и /ЕС) ΙΌ N0:434.
- 74 020508
В других вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает, в основном состоит или состоит из полипептида Ун и полипептида Уь, выбранных из группы, состоящей из полипептида Ун и полипептида Уъ, продуцируемых гибридомой 2.Р3В5.2 (АТСС номер депозита РТА-8106), полипептида Ун и полипептида Уъ, продуцируемых гибридомой 7.РГО5.1.С9 (АТСС номер депозита РТА-8107).
Любой из вышеописанных полипептидов может далее включать дополнительные полипептиды, например сигнальный пептид, чтобы направлять секрецию кодируемого полипептида, константные области антитела, как описано в данном контексте, или другие гетерологичные полипептиды, как описано в данном контексте.
Дополнительно полипептиды, соответствующие изобретению, включают фрагменты полипептида, как описано в других разделах. Дополнительно полипептиды, соответствующие изобретению, включают слитый полипептид, фрагменты РаЬ и другие производные, как описано в данном контексте.
Кроме того, как описано более подробно в других разделах данного материала, настоящее изобретение включает композиции, содержащие вышеописанные полипептиды.
Обычный специалист в области техники будет также иметь в виду, что полипептиды антител к 8р35, как описано в данном контексте, могут быть модифицированы, так что они отличаются по последовательности аминокислот от природного связывающего полипептида, из которого они получены. Например, полипептид или последовательность аминокислот, выделенные из обозначенного белка, могут быть близки, например иметь определенный процент идентичности с исходной последовательностью, например она может быть на 60, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентичной исходной последовательности.
Более того, могут быть проведены замены, делеции или инсерции аминокислот, приводящие к консервативным заменам или изменениям на неосновных участках аминокислот. Например, полипептид или последовательность аминокислот, выделенная из обозначенного белка, может быть идентичной исходной последовательности, за исключением одной или более замен, инсерций или делеций отдельных аминокислот, например одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, пятнадцати, двадцати или более замен, инсерций или делеций отдельных аминокислот. В ряде вариантов осуществления полипептид или последовательность аминокислот, выделенная из обозначенного белка, имеет от одной до пяти, от одной до десяти, от одной до пятнадцати или от одной до двадцати замен, инсерций или делеций отдельных аминокислот относительно исходной последовательности.
Некоторые полипептиды антител к 8р35, соответствующие настоящему изобретению, включают, в основном состоят или состоят из последовательности аминокислот, выделенной из человеческой последовательности аминокислот. Однако некоторые полипептиды антитела к 8р35 включают одну или более следующих друг за другом аминокислот, выделенных у другого вида млекопитающих. Например, антитело к 8р35, соответствующее настоящему изобретению, может включать часть тяжелой цепи, шарнирную часть или антигенсвязывающий участок приматов. В другом примере одна или более выделенных у мышей аминокислот могут присутствовать в полипептиде немышиного антитела, например в антигенсвязывающем центре антитела к 8р35. В ряде терапевтических приложений разработаны 8р35специфические антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или аналоги, чтобы они не были иммуногенными у животного, которому вводят антитело.
В ряде вариантов осуществления полипептид антитела к 8р35 включает последовательность аминокислот или одну или более групп, не связанных с антителом. Примеры модификаций детально описаны ниже. Например, одноцепочечный фрагмент антитела Γν, соответствующий изобретению, может включать последовательность гибкого линкера или может быть модифицирован введением функциональной группы (например, ПЭГ (полиэтиленгликоля), лекарственного препарата, токсина или метки).
Полипептид антитела к 8р35, соответствующий изобретению, может включать, в основном состоять или состоять из слитого белка. Слитые белки представляют собой химерные молекулы, которые включают, например, антигенсвязывающий домен иммуноглобулина по меньшей мере с одним центром связывания мишени и по меньшей мере одну гетерологичную часть, т.е. часть, с которой он не связан естественным образом в природных условиях. Последовательности аминокислот могут в норме находиться в отдельных белках, которые помещают вместе в слитом полипептиде или они могут в норме находиться в том же белке, но их помещают в новом расположении в слитом полипептиде. Слитые белки можно получить, например, путем химического синтеза или путем создания и трансляции полинуклеотида, в котором участки пептида кодируются в требуемой связи.
Термин гетерологичный, как применяют в отношении полинуклеотида или полипептида, означает, что полинуклеотид или полипептид выделен из элемента, отличного от остальных элементов, с которыми его сравнивают. Например, как используют в данном контексте, гетерологичный полипептид, предназначенный для слияния с антителом к 8р35 или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или аналогом, выделяют из неиммуноглобулинового полипептида того же вида или иммуноглобулинового либо неиммуноглобулинового полипептида другого вида.
Консервативная замена аминокислоты представляет собой замену, в которой остаток аминокислоты заменяют остатком аминокислоты, имеющим подобную боковую цепь. Семейства остатков аминокислот, имеющих подобные боковые цепи, определены в области техники, включая основные боковые
- 75 020508 цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предпочтительно, когда остаток неосновной аминокислоты в полипептиде иммуноглобулина заменяют остатком другой аминокислоты из того же семейства боковых цепей. В другом варианте осуществления цепь аминокислоты может быть заменена структурно близкой цепью, которая отличается порядком и/или композицией членов семейства боковых цепей.
Альтернативно, в другом варианте осуществления могут быть случайным образом интродуцированы мутации по всей или части последовательности, кодирующей иммуноглобулин, например путем насыщающего мутагенеза, и полученные в результате мутанты могут быть введены в антитела к δр35, предназначенные для использования в способах диагностиики и лечения, описанные в данном контексте, и подвергнуты скринингу на способность связывать требуемый антиген, например δр35.
УТ. Слитые белки и конъюгаты антител.
Как обсуждают более подробно в других разделах данного материала, антитела к δр35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно далее рекомбинантным образом слить с гетерологичным полипептидом по Ν- или С-концу или химическим путем конъюгировать (включая ковалентные и нековалентные конъюгирования) с полипептидами или другими композициями. Например, δр35-специфические антитела к δр35 могут быть рекомбинантным образом слиты или конъюгированы с молекулами, используемыми в качестве меток в анализах детекции, и эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные препараты, радионуклиды или токсины; см., например, публикации РСТ №О 92/08495; №О 91/14438; №О 89/12624; патент США № 5314995 и ЕР 396387, которые включены в данном контексте в виде ссылки в своей полноте.
Антитела к δр35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, включают производные, которые модифицированы, т.е. путем ковалентного присоединения любого типа молекулы к антителу, так что данное ковалентное присоединение не препятствует связыванию антитела с δр35. Например, но не путем ограничения, производные антитела включают антитела, которые модифицированы, например, гликозилированием, ацетилированием, пегилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитическим расщеплением, связью с клеточным лигандом или другим белком и т.п. Любая из многочисленных химических модификаций может быть осуществлена известными способами, включая, но без ограничения перечисленным, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.п. Кроме того, производное может включать одну или более неклассических аминокислот.
Антитела к δр35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, могут состоять из аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидных изостеров, и могут включать аминокислоты, отличные от 20 кодируемых генами аминокислот. δр35-специфические антитела можно модифицировать посредством естественных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, или химическими способами модификации, которые хорошо известны в области техники. Данные модификации хорошо описаны в основных руководствах и более подробных монографиях, а также в обширной исследовательской литературе. Модификации могут находится в какой-либо части δр35-специфического антитела, включая пептидный скелет, боковые цепи аминокислот и амино- или карбоксильные концы, или на группах, таких как углеводы. Следует иметь в виду, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одних и тех же или варьирующих степенях в нескольких центрах в заданном δр35специфическом антителе. Кроме того, заданное δр35-специфическое антитело может включать многие типы модификаций. δр35-специфические антитела могут быть разветвленными, например, в результате убиквитинирования и могут быть циклическим с разветвлением или без него. Циклические, разветвленные или разветвленные циклические δр35-специфические антитела могут быть результатом посттрансляционных естественных процессов или могут быть получены способами синтеза. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение группы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, поперечное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование ОРЬякоря, гидроксилирование, йодинирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитическое процессирование, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, опосредованное переносом РНК введение аминокислот в белки, такое как аргинилирование и убиквитинирование (см., например, монографии Рго1етк - δίπκΐι.^ Апб Мо1еси1аг Ргорегйек
- 76 020508 (Белки - структура и молекулярные свойства), Т.Е. Сге1дй!оп, \.н. Ргеетап апй Сотрапу, №ν Уогк, 2-е изд., (1993); Ро8!!гап81айопа1 Соνа1еп! МойШсайоп 0Γ Рго!е1И8 (Посттрансляционная ковалентная модификация белков), под ред. В.С. 1оНп8оп. Асайетк Рге88, №ν Уогк, с. 1-12 (1983); статьи 8е1йег е! а1., Ме!1 Нп/\ то1 182:626-646 (1990); Кайап е! а1., Апп Ы.У. Асай 8с 663:48-62 (1992)).
Настоящее изобретение предусматривает также слитые, включающие антитело к 8р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное и гетерологичный полипептид. Гетерологичный полипептид, с которым слито антитело, может быть использован для действия или эффективен для получения направленности на клетки, экспрессирующие полипептид 8р35. В одном варианте осуществления слитый белок, соответствующий изобретению, включает, состоит в основном или состоит из полипептида, имеющего последовательность аминокислот любой одной или более из областей Ун антитела, соответствующего изобретению, или последовательности аминокислот любой одной или более областей Уъ антитела, соответствующего изобретению, или его фрагментам либо вариантам, и последовательности гетерологичного полипептида. В другом варианте осуществления слитый белок, предназначенный для использования в способах диагностики и лечения, описанных в данном контексте, включает, состоит в основном или состоит из полипептида, имеющего последовательность аминокислот любых одного, двух, трех из СЭК8 Ун 8р35-специфического антитела или его фрагментов, вариантов или производных или последовательность аминокислот любых одного, двух, трех из СГОК8 Уъ 8р35-специфического антитела или его фрагментов, вариантов или производных последовательности гетерологичного полипептида. В одном варианте осуществления слитый белок включает полипептид, имеющий последовательность аминокислот СЭК3 Ун 8р35-специфического антитела, соответствующего настоящему изобретению, или его фрагмент, производное или вариант и последовательность гетерологичного полипептида, причем слитый белок специфически связывается по меньшей мере с одним эпитопом 8р35. В другом варианте осуществления слитый белок включает полипептид, имеющий последовательность аминокислот по меньшей мере одного участка Ун 8р35-специфического антитела, соответствующего изобретению, и последовательность аминокислот по меньшей мере одного участка Уь 8р35-специфического антитела, соответствующего изобретению, или его фрагменты, производные или варианты и последовательность гетерологичного полипептида. Предпочтительно, когда участки Ун и Уъ слитого белка соответствуют антителу из одного источника (или фрагменту 8сРν либо РаЬ), который специфически связывает по меньшей мере один эпитоп 8р35.
В еще одном варианте осуществления слитый белок, предназначенный для использования в способах диагностики и лечения, описанных в данном контексте, включает полипептид, имеющий последовательность аминокислот любых одного, двух, трех из СГОК8 Ун 8р35-специфического антитела и последовательность аминокислот любых одного, двух, трех из СГОК8 Уъ 8р35-специфического антитела или его фрагментов, вариантов или производных и последовательность гетерологичного полипептида. Предпочтительно, когда два, три, четыре, пять, шесть или более из УнСЭК(8) или УЬСЭК(8) соответствуют антителу, полученному из одного источника (или фрагменту 8сРν либо РаЬ), соответствующим изобретению. Изобретение охватывает также молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие данные слитые белки.
Примеры слитых белков, описанные в литературе, включают слияния Т-клеточного рецептора (см. статью Са8со1дпе е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8а. И8А 54:2936-2940 (1987)); СЭ4 (см. статьи Сароп е! а1., Кайне 357:525-531 (1989); Тгаипескег е! а1., №11иге 339:68-70 (1989); Ζейте^881 е! а1., ЭУА Се11 Вю1. И8А 9:347-353 (1990) и Вугп е! а1., №Ииге 344:667-670 (1990)); Ь-селектина (хоуминг-рецептора) (см. статьи \а!8оп е! а1., 1. Се11. Вю1. 110:2221-2229 (1990) и \а!8оп е! а1., Уинге 349:164-167 (1991)); СЭ44 (см. статью АгиГГо е! а1., Се11 67:1303-1313 (1990)); СЭ28 и В7 (см. статью Пп81еу е! а1., 1. Ехр. Мей. 173:721-730 (1991)); СТЬА-4 (см. статью Ь181еу е! а1., 1. Ехр. Мей. 174:561-569 (1991)); СГО22 (см. статью 81атепкоУс е! а1., Се11 66:1133-1144 (1991)); рецептора ФНО (фактора некроза опухоли) (см. статьи А8Йкепа/1 е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асай. 8ск И8А 55:10535-10539 (1991); Ье881аиег е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 27:2883-2886 (1991) и Рерре1 е! а1., 1. Ехр. Мей. 774:1483-1489 (1991)) и рецептора 1дЕ (см. статью К|йдиау апй Согтап, 1. Се11. Вю1. Уо1. 115, реферат № 1448 (1991)).
В ряде вариантов осуществления антитела к 8р35, фрагменты антитела, их производные и варианты далее включают направленную группу. Направленные группы включают белок или пептид, который направляет локализацию в определенной части тела, например в головном мозге или его отделах. В ряде вариантов осуществления антитела к 8р35, фрагменты антитела, их производные и варианты присоединены или слиты с группой, направленной на головной мозг. Группы, направленные на головной мозг, присоединяют ковалентно (например, путем прямого трансляционного слияния или посредством химической связи, либо прямой, либо через спейсерную молекулу, которая необязательно может быть расщепляемой) или присоединяют ковалентно (например, посредством обратимых взаимодействий, таких как авидин, биотин, белок А, 1дС и т.п.). В других вариантах осуществления антитела к 8р35, фрагменты антитела, их производные и варианты присоединяют к одной или более групп, направленных на головной мозг. В дополнительных вариантах осуществления группу, направленную на головной мозг, присоединяют к множеству антител к 8р35, фрагментов антитела, их производным и вариантам.
Группа, направленная на головной мозг, связанная с антителом к 8р35, фрагментом антитела, его производным или вариантом, усиливает доставку в головной мозг данных антител к 8р35, фрагментов
- 77 020508 антитела, его производных и вариантов. Описан ряд полипептидов, которые при слиянии с белком или терапевтическим агентом доставляют белок или терапевтический агент через гематоэнцефалический барьер (ВВВ).
Неограничивающие примеры включают однодоменное антитело РС5 (см. статью АЬи1тоЬ е! а1. (2005) 1. №итосЬет. 95, 1201-1214); тАВ 83-14, моноклональное антитело к человеческому инсулиновому рецептору (см. статью Рагбпбде е! а1. (1995) РЬагтасо1. Рек. 12, 807-816); пептиды В2, В6 и В8, связывающие человеческий трансферриновый рецептор (ЬТГР) (см. статью Х1а е! а1. (2000) 1. У1то1. 74, 11359-11366); моноклональное антитело 0X26 к трансферриновому рецептору (см. статью Рагбпбде е! а1. (1991) 1. РЬагтасо1. Ехр. ТЬег. 259, 66-70) и 8ЕЦ ГО N0:1-18 из патента США № 6306365. Содержание вышеприведенных материалов включено в данном контексте в виде ссылки в их полноте.
Повышенный уровень доставки в головной мозг антитела к 8р35, фрагмента антитела, его производного или варианта определяют рядом средств, хорошо разработанных в области техники. Например, введение животному радиоактивно, ферментно или флуоресцентно меченного антитела к 8р35, фрагмента антитела, его производного и варианта, связанного с группой, направленной на головной мозг; определение локализации в головном мозге и сравнение локализации с эквивалентным радиоактивно, ферментно или флуоресцентно меченным антителом к 8р35, фрагментом антитела, его производным или вариантом, которые не связаны с группой, направленной на головной мозг. Другие средства определения повышенной направленности описаны в вышеуказанных ссылках.
Как обсуждают в других разделах данного материала, антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, могут быть связаны с гетерологичными полипептидами для повышения полупериода существования ш νί\Ό полипептидов или для использования в иммуноанализах с помощью способов, известных в области техники. Например, в одном варианте осуществления ПЭГ можно конъюгировать с антителами к 8р35, соответствующими изобретению, для увеличения из полупериодов существования ш νί\Ό; см. статьи Ьеопд, 8.Р., е! а1., СуЮкте 76:106 (2001); Абу. ш Эгид ЭеЬу. Кеу. 54:531 (2002) или \Уеп е! а1., ВюсЬет. 8ос. ТгапзасЬопк 30:512 (2002).
Более того, антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно слить с маркерными последовательностями, такими как пептид, для облегчения их очистки или детекции. В предпочтительных вариантах осуществления маркерная последовательность аминокислот представляет собой гексагистидиновый пептид, такой как метка, предусматриваемая в векторе рОЕ (01А0ЕК 1пс., 9259 ЕЮп Ауепие, СЬа18уопЬ, СаЬГ., 91311), в числе прочих, многие из которых коммерчески доступны. Как описано, например, в статье 0еп1/ е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 5 (5:821-824 (1989), гексагистидин обеспечивает удобную очистку слитого белка. Другие пептидные метки, используемые для очистки, включают, но без ограничения перечисленным, метку НА, которая соответствует эпитопу, выделенному из белка гемагглютинина гриппа (см. статью ХУПюп е! а1., Се11 37:767 (1984)) и метку Г1ад.
Слитые белки можно получить при использовании способов, которые хорошо известны в области техники (см., например, патенты США №№ 5116964 и 5225538). Точный центр, в котором делают слияние, можно выбрать эмпирически для оптимизации секреции и характеристики связывания слитого белка. ДНК, кодирующей слитый белок, затем трансфицируют клетку-хозяин для экспрессии.
Антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие настоящему изобретению, можно использовать в неконъюгированной форме или можно конъюгировать по меньшей мере с одной из множества молекул, например, для улучшения терапевтических свойств молекулы, для того, чтобы способствовать направленной детекции или для визуализации либо лечения пациента. Антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно пометить или конъюгировать до или после очистки, когда проводят очистку.
В частности, антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно конъюгировать с терапевтическими агентами, пролекарственными формами, пептидами, белками, ферментами, вирусами, липидами, модификаторами биологического ответа, фармацевтическими агентами или ПЭГ.
Компетентные специалисты в области техники будут иметь в виду, что конъюгаты можно также собрать с использованием многочисленных способов в зависимости от выбранного для конъюгирования агента. Например, конъюгаты с биотином получают, например, посредством реакции связывающего полипептида с активированным сложным эфиром биотина, таким как сложный Югидроксисукцинимидный эфир биотина. Аналогично, конъюгаты с флуоресцентным маркером можно получить в присутствии связывающего агента, например, тех, которые перечислены в данном контексте, или путем реакции с изотиоцианатом, предпочтительно флуоресцеин-изотиоцианатом. Конъюгаты антител к 8р35 или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных, соответствующие изобретению, получают аналогичным образом.
Настоящее изобретение далее охватывает антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, конъюгированные с диагностическим или
- 78 020508 лечебным фактором. Антитела к δр35 можно использовать диагностически, например, для мониторирования развития или прогресса неврологического заболевания как части способа клинического тестирования, например, с целью определения эффективности заданной схемы лечения и/или предупреждения. Детекцию можно облегчить путем связывания антитела к δр35 или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного с определяемой субстанцией. Примеры определяемых субстанций включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, испускающие позитрон металлы для использования в различных способах томографии с эмиссией позитрона и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов; см., например, патент США № 4741900 в плане ионов металлов, которые можно конъюгировать с антителами для использования в качестве диагностических агентов, соответствующих настоящему изобретению. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорд или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин и примеры подходящего радиоактивного материала включают 125Ι, 131Ι, 11 Пп или 99Тс.
Антитело к δр35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное могут быть также определяемо помечены связыванием их с хемилюминесцентным соединением. Затем присутствие хемилюминесцентно меченного антитела к δр35 определяют по детекции присутствия люминесценции, которая появляется во время химической реакции. Примерами особенно эффективных хемилюминесцентно метящих соединений являются люминол, изолминол, тероматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный оксалатный эфир.
Одним из путей, которым антитело к δр35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное можно определяемо пометить, является связывание его с ферментом и использование связанного продукта в ферментном иммуноанализе (ΕIΑ) (см. работу Уо11ег, А., ТЬе Εηζуте Ыпкеб IттипокогЬеШ Аккау (БСША) (Иммуноферментный твердофазный анализ (Ε^IδΑ), МюгоЬю1од1са1 АккоааЮк Оиаг1ег1у РнЬНсайоп, №а1кегкуШе, Мб., И1адпокбс Иоп/опк 2:1-7 (1978)); статьи УоЬег еί а1., 1. СЬп. РаШо1. 31:501-520 (1978); Вибег, ΤΕ., Ме1Ь. Нпгуток 73:482-523 (1981); монографию под ред. Маддю, Ε., Εпζуте Iттипοаккау (Иммуноферментный анализ), СКС Ргекк, Воса КаЮп, Р1а., (1980); монографию под ред. ЫЫкцуа, Ε. еί а1., Εпζуте Iттипοаккау (Иммуноферментный анализ), Кдаки δЬο^п. Токуо (1981). Фермент, который связан с антителом к δр35, будет реагировать с подходящим субстратом, предпочтительно хромогенным субстратом, так, чтобы образовать химическую группу, которую можно определить, например, спектрометрическими, флуориметическими или визуальными средствами. Ферменты, которые можно использовать для определяемого мечения антитела, включают, но без ограничения перечисленным, малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5-стероид-изомеразу, алкогольдегидрогеназу дрожжей, альфа-глицерофосатазу, дегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Кроме того, детекцию можно осуществить колориметрическими способами, в которых используют хромогенный субстрат фермента. Детекцию можно также осуществить путем визуального сравнения степени ферментной реакции субстрата по сравнению с аналогично приготовленными стандартами.
Детекцию можно также осуществить, используя любой из многочисленных других иммуноанализов. Например, путем введения радиоактивной метки в антитело к δр35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное возможно определить антитело при использовании радиоиммуноанализа (КГА) (см., например, монографию №е1п1гаиЬ, В., Рбпс1р1ек оГ Кабю1ттипоаккаук, δеνепίЬ Тгашшд Соигке оп Кабюбдапб Аккау ТесЬпищек, ТЬе Бпбосппе δοс^еίу (Принципы радиоиммуноанализов, седьмой учебный курс по методам анализа радиолигандов, эндокринологическое общество) (март, 1986)), которая включена в виде ссылки в данном контексте). Радиоактивный изотоп можно определить с помощью средств, включающих, но без ограничения перечисленным, гамма-счетчик, сцинтилляционный счетчик или авторадиографию.
Антитело к δр35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное можно также определяемо пометить с использованием металлов, испускающих флуоресценцию, таких как 152Ευ или других из группы лантанидов. Данные металлы можно присоединить к антителу с помощью таких металл-хелатирующих групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ИТРА) или этилендиаминтетрауксусная кислота (ПЭТА).
Способы конъюгирования различных групп с антителом к δр35 или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным хорошо известны; см., например, раздел Агпоп еί а1., Мопос1опа1 АпбЬоб1ек Рог ЬптипоЦцдеЬпд ОГ Игидк Ш Сапсег ТЬегару (Моноклональные Антитела для получения иммунонаправленности лекарственных препаратов в лечении рака), в монографии Мопос1опа1 АпПЬоб1ек Апб Сапсег ТЬегару (Моноклональные Антитела и лечение рака), под ред. КекГе1б еί а1., с. 243-56 (А1ап К. Ыкк, бю. (1985); раздел Ие11к1гот еί а1., АпбЬоб1ек Рог Эгид Иебуегу (Антитела для доставки
- 79 020508 лекарственных препаратов) в монографии Соп1го11еб Эгид Эейусгу (Контролируемая доставка лекарственных препаратов) (2-е изд.), под ред. КоЬтзоп е1 а1., Магсе1 Иеккег, 1пс., с. 623-53 (1987); раздел ТНогре, АиНЬобу Сатеге О£ Су1о1ох1с АдеШз 1п Сапсег ТЬегару: А Ксу1С\у (Антитела-носители цитотоксических агентов в лечении рака. Обзор), в монографии Мопос1опа1 АпбЬоб1ез'84: Вю1одюа1 Апб С1ш1са1 Аррйсайопз (Моноклональные Антитела'84: Биологическое и клиническое применение) под ред. РшсЬега е1 а1., с. 475-506 (1985); раздел Апа1уз1з, КезиНз и Ри1иге Ргозресбуе О£ ТЬе ТЬегареиЬс Иве О£ Каб1о1аЬе1еб Антитело ш Сапсег ТЬегару (Анализ, результаты и будущие перспективы терапевтического применения антител с радиоактивной меткой в лечении рака), в монографии Мопос1опа1 АпбЬоб1ез Рог Сапсег ОеЮсбоп Апб ТЬегару (Моноклональные Антитела для выявления и лечения рака), под ред. Ва1б\νίπ е1 а1., Асабетю Ргезз с. 303-16 (1985) и статью ТЬогре е1 а1., ТЬе РгерагаЬоп Апб Су1о1о\1с РгореЫез О£ АпбЬобу-Тохш Соп]ида1ез (Получение и цитотоксические свойства конъюгатов антитело-токсин), 1ттипо1. Кеу. (52:119-58 (1982).
VII. Экспрессия полипептидов антител.
Как хорошо известно, РНК можно выделить из исходных клеток гибридомы или из других трансформированных клеток стандартными способами, такими как экстракция гуанидинизотиоцианатом и осаждение с последующим центрифугированием или хроматографией. При необходимости мРНК можно выделить из общей РНК стандартными способами, такими как хроматография на олиго-бТ-целлюлозе. Подходящие способы известны в области техники.
В одном варианте осуществления кДНК, которые кодируют легкие и тяжелые цепи антитела, можно получить либо одновременно, либо раздельно, используя обратную транскриптазу и ДНК-полимеразу в соответствии с хорошо известными способами. ПЦР можно инициировать с помощью консенсусных константным областям праймеров или с помощью более специфических праймеров на основе опубликованных ДНК и последовательностей аминокислот тяжелой и легкой цепей. Как обсуждают выше, ПЦР можно также использовать для выделения клонов ДНК, кодирующих легкие и тяжелые цепи антитела. В данном случае можно провести скрининг библиотек с помощью консенсусных праймеров или более крупных гомологичных зондов, таких как зонды мышиной константной области.
ДНК, как правило, плазмидную ДНК, можно выделить из клеток с использованием способов, известных в области техники, провести рестрикционное картирование и секвенировать в соответствии со стандартными хорошо известными способами, приведенными в деталях, например, в предшествующих ссылках, относящихся к технологиям рекомбинантной ДНК. Конечно, ДНК может быть синтетической согласно настоящему изобретению на любой стадии процесса выделения или последующего анализа.
После манипуляций с выделенным генетическим материалом для получения антител к §р35 или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных, соответствующих изобретению, полинуклеотиды, кодирующие антитела к §р35, как правило, вводят в экспрессирующий вектор для интродукции в клетки-хозяева, которые можно использовать для получения требуемого количества антитела к 8р35.
Для рекомбинантной экспрессии антитела или его фрагмента, производного или аналога, например, тяжелой или легкой цепи антитела, которое связывается с молекулой-мишенью, описанной в данном контексте, например 8р35, требуется конструирование экспрессирующего вектора, включающего полинуклеотид, который кодирует антитело. После получения полинуклеотида, кодирующего молекулу антитела или тяжелую либо легкую цепь антитела, или его части (предпочтительно включающей вариабельный домен тяжелой или легкой цепи), соответствующего изобретению, можно получить вектор для продукции молекулы антитела технологией рекомбинантной ДНК с использованием способов, хорошо известных в области техники. Так, способы получения белка путем экспрессии полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, описаны в данном контексте. Способы, которые хорошо известны компетентным специалистам в области техники, можно использовать для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих последовательности, кодирующие антитело и соответствующие сигналы контроля транскрипции и трансляции. Данные способы включают, например, технологии рекомбинантной ДНК ш уЬго, способы синтеза и генетическую рекомбинацию ш νί\Ό. Изобретение, таким образом, предусматривает реплицирующиеся векторы, включающие нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулу антитела, соответствующую изобретению, или ее тяжелую либо легкую цепь или вариабельный домен тяжелой либо легкой цепи, функционально связанную с промотором. Данные векторы могут включать нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область молекулы антитела (см., например, публикацию РСТ \УО 86/05807; публикацию РСТ \УО 89/01036 и патент США № 5122464), и вариабельный домен антитела можно клонировать в данный вектор для экспрессии целой тяжелой или легкой цепи.
Клетку-хозяин можно сотрансфицировать двумя экспрессирующими векторами, соответствующими изобретению, первым вектором, кодирующим полипептид, выделенный из тяжелой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид, выделенный из легкой цепи. Два вектора могут содержать идентичные селектируемые маркеры, которые делают возможной равную экспрессию полипептидов тяжелой и легкой цепи. Альтернативно, можно использовать один вектор, который кодирует полипептиды как тяжелой, так и легкой цепи. В данных случаях легкую цепь лучше помещать перед тяжелой цепью, чтобы
- 80 020508 избежать избытка нетоксичной тяжелой цепи (см. статьи РгоиЛоо!, №!иге 322:52 (1986); КоЫег, Ргос. №11. Асай. 8с1. И8А 77:2197 (1980)). Кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей могут включать кДНК или геномную ДНК.
Термин вектор или экспрессирующий вектор используют в данном контексте для обозначения векторов, используемых в соответствии с настоящим изобретением в качестве носителя для интродукции и экспрессии требуемого гена в клетке-хозяине. Как известно компетентным специалистам в области техники, данные векторы можно легко выбрать из группы, состоящей из плазмид, фагов, вирусов и ретровирусов. Как правило, векторы, совместимые с данным изобретением, будут включать селекционный маркер, соответствующие сайты рестрикции для облегчения клонирования требуемого гена и способность входить и/или реплицироваться в эукариотических или прокариотических клетках.
В целях данного изобретения могут быть использованы многочисленные системы экспрессирующих векторов. Например, в одном классе векторов используют элементы ДНК, которые выделены из вирусов животных, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус полиомы, аденовирус, вирус вакцинии, бакуловирус, ретровирусы (Κ8ν, ΜΜΤν или МОМЬУ) либо вирус 8ν40. Другие включают использование полицистронных систем с внутренними сайтами связывания рибосом. Кроме того, клетки, в хромосомы которых интегрирована ДНК, можно селектировать путем интродукции одного или более маркеров, которые обеспечивают возможность селекции трансфицированных клеток-хозяев. Маркер может обеспечивать прототрофность ауксотрофному хозяину, устойчивость к биоцидам (например, антибиотикам) или устойчивость к тяжелым металлам, таким как медь. Ген селектируемого маркера может быть либо прямо связан с последовательностями ДНК, предназначенными для экспрессии, либо интродуцирован в ту же клетку посредством сотрансформации. Дополнительные элементы могут также потребоваться для оптимального синтеза мРНК. Данные элементы могут включать сигнальные последовательности, сплайс-сигналы, а также транскрипционные промоторы, энхансеры и сигналы терминации.
В особенно предпочтительных вариантах осуществления клонированные гены вариабельной области вводят в экспрессирующий вектор вместе с генами константной области тяжелой и легкой цепей (предпочтительно человеческими), синтетическими, как обсуждают выше. В одном варианте осуществления это осуществляют при использовании патентованного экспрессирующего вектора фирмы Вюдеп ГОЕС, Юс., называемого NЕΟ8Р^А (см. патент США 6159730). Данный вектор включает промотор/энхансер цитомегаловируса, главный промотор мышиного бета-глобина, ориджин репликации 8ν40, последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста, экзон 1 и экзон 2 неомицинфосфотрансферазы, ген и лидерную последовательность дигидрофолатредуктазы. Данный вектор, как обнаружено, приводит в результате к очень высокому уровню экспрессии антител при инкорпорации генов вариабельной и константной области, трансфекции клеток СНО с последующей селекцией на О418содержащей среде и амплификации с метотрексатом. Конечно, любой экспрессирующий вектор, который способен вызвать экспрессию в эукариотических клетках, можно использовать в настоящем изобретении. Примеры подходящих векторов включают, но без ограничения перечисленным, плазмиды рс^NА3, рНСМ^2ео, рСК3.1, рЕИ/Ηΐδ, рПМБ/О8, рКс/НС\1У2, р8V40/Ζео2, рТКАСЕК-НСМУ р1/В6Л+-111+ рVАXI и рΖео8V2 (доступны в фирме Юуйгодеп, 8ап О1едо, СА) и плазмиду рС/Ι (доступна в фирме Рготеда, Майкоп, νΙ). Как правило, скрининг среди большого количества трансформированных клеток, тех, которые экспрессируют достаточно высокие уровни тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, является рутинным экспериментированием, которое можно осуществить, например, в роботизированных системах. Векторные системы описаны также в патентах США №№ 5736137 и 5658570, каждый из которых включен в виде ссылки в своей полноте в данном контексте. Данная система обеспечивает высокие уровни экспрессии, например > 30 пг/клетка/день. Другие примеры векторных систем раскрыты, например, в патенте США № 6413777.
В других предпочтительных вариантах осуществления антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно экспрессировать с использованием полицистронных конструкций, таких как описанные в публикации патентной заявки США № 2003-0157641 А1, поданной 18 ноября 2002 г. и включенной в данном контексте в своей полноте. В данных новых системах экспрессии множество продуктов генов, представляющих интерес, таких как тяжелая и легкая цепи антител, можно получить из одной полицистронной конструкции.
В данных системах преимущественно используют сайт внутреннего входа в рибосому (ГК/Е8) для получения относительно высоких уровней антител к 8р35, например связывающих полипептидов, в частности 8р35-специфических антител или их иммуноспецифических фрагментов, в эукриотических клетках-хозяевах. Совместимые последовательности ΙΚΞ8 раскрыты в патенте США № 6193980, который также включен в данном контексте. Компетентные специалисты в области техники будут иметь в виду, что данные системы экспрессии можно использовать для эффективного получения полного круга антител к 8р35, раскрытых в данной заявке.
В более общих чертах после получения вектора или последовательности ДНК, кодирующей мономерную субъединицу антитела к 8р35, экспрессирующий вектор может быть интродуцирован в подходящую клетку-хозяин. Интродукцию плазмиды в клетку-хозяин можно осуществить различными способами, хорошо известными компетентным специалистам в области техники. Они включают, но без огра- 81 020508 ничения перечисленным, трансфекцию (включая электрофорез и электропорацию), слияние протопластов, осаждение фосфатом кальция, слияние клеток с покрытой оболочкой ДНК, микроинъекцию и инъекцию интактного вируса; см. раздел Юбдгау, А.А.О. Маттабап Ехргеввюп уесЮгв (Экспрессирующие векторы млекопитающих) в монографии УесЮю (Векторс) под ред. Кобпдие/ апб ОепНагб!, Вибег\\ΌΠΐΐ5, Вобоп, Маев., гл. 24.2, с. 470-472 (1988). Как правило, интродукцию плазмиды в хозяина осуществляют путем электропорации. Клетки-хозяева, несущие экспрессирующую конструкцию, выращивают в условиях, подходящих для продукции легких цепей и тяжелых цепей и оценивают на синтез белка тяжелой и/или легкой цепи.
Примеры способов анализа включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), радиоиммуноанализ (К1А) или анализ путем сортинга клеток по активации флуоресценции (РАСЗ), иммуногистохимию и т.п.
Экспрессирующий вектор переносят в клетку-хозяин принятыми способами и трансфицированные клетки затем культивируют принятыми способами с целью получения антитела для использования в способах, описанных в данном контексте. Таким образом, изобретение включает клетки-хозяева, включающие полинуклеотид, кодирующий антитело, соответствующее изобретению, или его тяжелую или легкую цепь, функционально связанный с гетерологичным промотором. В предпочтительных вариантах осуществления для экспрессии двухцепочечных антител векторы, кодирующие как тяжелую, так и легкую цепи, можно соэкспрессировать в клетке-хозяине для экспрессии целой молекулы иммуноглобулина, как подробно описано ниже.
Как используют в данном контексте, термин клетки-хозяева относится к клеткам, которые несут векторы, сконструированные с использованием технологий рекомбинантной ДНК и кодирующие по меньшей мере один гетерологичный ген. В описаниях способов выделения антител из рекомбинантных хозяев термины клетка и клеточная культура используют взаимозаменяемо для обозначения источника антитела до тех пор, пока ясно не определено иначе. Другими словами, выделение полипептида из клеток может означать либо из отцентрифугированных клеток, либо из клеточной культуры, содержащей как среду, так и суспендированные клетки.
Многочисленные системы хозяин-экспрессирующий вектор можно использовать для экспрессии молекул антитела, предназначенных для использования в способах, описанных в данном контексте. Данные системы экспрессии в хозяине представляют носители, с помощью которых можно получить и затем очистить кодирующие последовательности, представляющие интерес, но, кроме того, представляют клетки, которые могут при трансформации или трансфекции подходящими нуклеотидными кодирующими последовательностями экспрессировать молекулу антитела, соответствующую изобретению, ш βίΐι.ι. Они включают, но без ограничения перечисленным, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. сой, В. виЪббв), трансформированные рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, экспрессирующей векторы, содержащие последовательности, кодирующие антитело; дрожжи (например, Зассбаготусев, РюЫа), трансформированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессирующими векторами, содержащими последовательности, кодирующие антитело; системы клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусными), содержащими последовательности, кодирующие антитело; системы клеток растений, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, СаМУ; вирусов табачной мозаики, ТМУ) или трансформированных рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами (например, Τί-плазмидой), содержащими последовательности, кодирующие антитело, или системы клеток млекопитающих (например, клеток С0З, СН0, ВЕК, 293, 3Т3), несущие рекомбинантные экспрессирующие конструкции, содержащие промоторы, выделенные из генома клеток млекопитающих (например, металлотионеиновый промотор) или из вирусов млекопитающих (например, аденовирусный поздний промотор, промотор 7.5К вируса вакцинии). Предпочтительно, когда бактериальные клетки, такие как ЕвсбебсЫа сой, и более предпочтительно эукариотические клетки, особенно предназначенные для экспрессия целой молекулы рекомбинантного антитела, используют для экспрессии молекулы рекомбинантного антитела. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичников китайского хомячка (СНО), в сочетании с вектором, таким как промоторный элемент средне-раннего гена из человеческого цитомегаловируса, представляют собой эффективную экспрессирующую систему для антител (см. статьи Роескшд е1 а1., Оепе 45:101 (1986); СоскеИ е1 а1., Вю/Тесбпо1оду 8:2 (1990)).
Линия клеток-хозяев, используемая для экспрессии белка, часто происходит от млекопитающих; компетентные специалисты в области техники обладают способностью предпочтительно определять конкретные линии клеток-хозяев, которые наиболее подходят для экспрессии в них требуемого продукта гена. Примеры линий клеток-хозяев включают, но без ограничения перечисленным, СНО (яичники китайского хомячка), ΌΟ44 и ЭИХВН (линии яичников китайского хомячка, ЭНРК минус), НЕЬА (человеческая карцинома шейки матки), СУ1 (линия почки обезьяны), С0З (производное СУ1 с Т-антигеном ЗУ40), УЕКУ, ВНК (почка хомячка), МЭСК, 293, ^138, К1610 (фибробласт китайского хомячка) ВАЕВС/3Т3 (мышиный фибробласт), НАК (линия почки хомячка), ЗР2/О (мышиная миелома), Р3х63Ад3.653 (мышиная миелома), ВРА-1с1ВРТ (коровьи эндотелиальные клетки), КАЛ (человеческий лим- 82 020508 фоцит) и 293 (человеческая почка). Клетки СНО особенно предпочтительны. Линии клеток-хозяев, как правило, доступны из коммерческих источников, Американской коллекции типовых культур или из опубликованной литературы.
Кроме того, можно выбрать штамм клеток-хозяев, который модулирует экспрессию введенной последовательности или модифицирует и процессирует продукт гена требуемым специфическим образом. Данные модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важными для функции белка. Различные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы пост-трансляционного процессинга и модификации белков и продуктов гена. Можно выбрать подходящие клеточные линии или системы хозяев, чтобы обеспечить правильную модификацию и процессинг экспрессируемого чужеродного белка. В этом плане можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным механизмом надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования продукта гена.
Для длительной продукции рекомбинантных белков с высоким выходом предпочтительна стабильная экспрессия. Например, можно сконструировать клеточные линии, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела. Лучше, чем использовать экспрессирующие векторы, которые содержат вирусные ориджины репликации, можно трансформировать клетки-хозяева ДНК, контролируемой соответствующими элементами контроля экспрессии (например, промотором, энхансерными последовательностями, терминаторами транскрипции, сайтами полиаденилирования и т.п.) и селектируемым маркером. После интродукции чужеродной ДНК инженерным клеткам можно дать возможность расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде и затем перевести в селективные среды. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде дает устойчивость к селективному фону и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в их хромосомы и расти с образованием областей, которые, в свою очередь, можно клонировать и размножить с получением клеточных линий. Данный способ можно преимущественно использовать для конструирования клеточных линий, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела.
Можно использовать ряд систем селекции, включая, но без ограничения перечисленным, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (см. статью А1д1ег е! а1., Се11 11:223 (1977)), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (см. статью //уЬайка & δ/γόπΕΙα, Ргос. №Ш. Αсай. 8с1 υδΑ 48:202 (1992)) и аденинфосфорибозилтрансферазы (см. статью Ьогоу е! а1., Се11 22:811 1980), которые могут быть использованы в 1к-, Ьдрй- или арй-клетках соответственно. Кроме того, устойчивость к антиметаболитам можно использовать как основу селекции для следующих генов: йЬГг, который обусловливает устойчивость к метотрексату (см. статьи А1д1ег е! а1., №!1. Αсай. δα υδΑ 77:357 (1980); 0'Наге е! а1., Ргос. №И. Αсай. δα υδΑ 78:1521 (1981)); др!, который обусловливает устойчивость к микофеноловой кислоте (см. статью МиШдап & Бегд, Ргос. №И. Αсай. δα υδΑ 78:2012 (1981)); пео, который обусловливает устойчивость к аминогликозиду О-418 (см. статьи СЬтса1 РЬагтасу 72:488-505; Аи апй Аи, БюШегару 3:87-95 (1991); Τо18!о8Ьеν, Лηη. Кет. РЬагтасо1. Токсок 32:513-596 (1993); МиШдап, δ^ιτ^ 260:926-932 (1993) и Могдап апй Αηйе^8оη, Лηη. Кеу. НюсЬет. 62:191-211 (1993); ΊΊΒ ТЕСН 11(5): 155215 (май, 1993) и Ьудго, который обусловливает устойчивость к гидромицину (см. статью δаη!е^^е е! а1., Оепе 30:141 (1984)). Способы, общеизвестные в области технологии рекомбинантной ДНК, которые могут быть использованы, описаны в монографиях под ред. Αи8иЪе1 е! а1., Сиггеп! Рго!осо18 ш Мо1еси1аг Βίо1оду (Современные протоколы в молекулярной биологии), 1оЬп АПеу & δоηδ, NΥ (1993); Кпед1ег, Оепе ТгапвГег апй Е\рге881оп, Α ЬаЪога!огу Мапиа1 (Лабораторное руководство по переносу и экспрессии генов), δ!оск!оη Рге88, NΥ (1990) и в гл. 12 и 13 монографии под ред. ИгасороЬ е! а1., Сиггеп! Рго1осок ш Нитап Оепейсв (Современные протоколы в генетике человека), 1оЬп АПеу & δоη8, NΥ (1994); статье Со1Ъегге-Оагарш е! а1., 1. Мо1. Е|о1. 150:1 (1981), которые включены в виде ссылки в данном контексте в своей полноте.
Уровни экспрессии молекул антитела можно повысить путем амплификации вектора (в качестве обзора см. монографию ЕеЬЫпдЮп апй Неп!8сЬе1, ТЬе иве оГ уесЮгв Ъавей оп депе атрНЛсаПоп Гог !Ье еxргеввюп оГ с1опей депев ш таттаЬап се11в ш ^NΑ с1ошпд (Использование векторов на основе амплификации генов для экспрессии клонированных генов в клетках млекопитающих при клонировании ДНК), Λсайет^с Рге88, №ν Υо^к. т. 3. (1987)). Когда маркер в векторной системе, экспрессирующей антитело, амплифицируется, повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клетки-хозяина, будет увеличивать число копий маркерного гена. Поскольку амплифицированный участок связан с геном антитела, продукция антитела будет также повышаться (см. статью Сгои8е е! а1., Мо1. Се11. Е|о1. 3:257 (1983)).
Продукция ш уПго дает возможность масштабирования с получением больших количеств требуемых полипептидов. Способы культивирования клеток млекопитающих в условиях тканевой культуры известны в области техники и включают гомогенную суспензионную культуру, например в эрлифтном реакторе или в реакторе с непрерывным перемешиванием или иммобилизованную или инкапсулированную клеточную культуру, например, в полых волокнах, микрокапсулах или агарозных микрочастицах или керамических картриджах. Если необходимо и/или требуется, растворы полипептидов можно очистить принятыми хроматографичекими способами, например гель-фильтрацией, ионообменной хроматографией, хроматографией на ^ΕЛΕ-целлюлозе или (иммуно-)аффинной хроматографией, например, после предпочтительного биосинтеза синтетического полипептида шарнирной области или перед либо по- 83 020508 сле стадии н1С-хроматографии, описанной в данном контексте.
Гены, кодирующие антитела к 8р35, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно также экспрессировать в клетках немлекопитающих, таких как клетки бактерий или дрожжей либо растений. Бактерии, которые легко поглощают нуклеиновые кислоты, включают представителей энтеробактерий, таких как штаммы ЕксЬепсЫа сой или 8а1топе11а; ВасШасеае, таких как ВасШик киЬййк; Рпеитососсик; 81гер1ососсик и наеторЬйик ФЛиеп/ае. Кроме того, следует иметь в виду, что при экспрессии в бактериях гетерологичные полипептиды, как правило, становятся частью телец включения. Гетерологичные полипептиды должны быть выделены, очищены и затем собраны в функциональные молекулы. Когда требуются тетравалентные формы антител, субъединицы будут затем самособираться в тетравалентные антитела (см. \У0 02/096948А2).
В бактериальных системах можно преимущественно отобрать ряд экспрессирующих векторов в зависимости от предназначенного использования экспрессируемой молекулы антитела. Например, когда нужно получить большое количество данного белка для генерации фармацевтических композиций молекул антитела, могут потребоваться векторы, которые направляют экспрессию высоких уровней продуктов слитого белка, которые легко очистить. Данные векторы включают, но без ограничения перечисленным, экспрессирующий вектор Е. сой рИИ278 (см. статью РиШег е! а1., ЕМВ0 1. 2:1791 (1983)), в котором кодирующая последовательность антитела может быть лигирована отдельно в вектор в рамке считывания с кодирующим участком 1;κΖ, так что образуется слитый белок; векторы рШ (см. статьи 1поиуе & 1поиуе, №с1ею Ашбк Рек. 73:3101-3109 (1985); Уап нееке & 8сЬик1ег, 1. Вю1. СЬет. 24:5503-5509 (1989)) и т.п. Векторы р0ЕХ можно также использовать для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков в глутатион δ-трансферазой (08Т). Как правило, данные слитые белки растворимы и легко могут быть очищены из лизированых клеток путем адсорбции и связывания с частицами глутатионагарозной матрицы с последующей элюцией в присутствии свободного глутатиона. Векторы р0ЕХ сконструированы так, что включают сайты протеазного расщепления тромбина или фактора Ха, так что клонированный целевой продукт гена может высвобождаться из группы 0δΈ
Кроме прокариот можно также использовать эукариотические микробы. δассЬа^отусек сетеуШае или обычные пекарские дрожжи являются наиболее часто используемыми среди эукариотических микроорганизмов, хотя обычно доступен ряд других штаммов, например РюЫа ракЮпк.
Для экспрессии в δассЬа^отусек обычно используют плазмиду УРр7, например, см. статьи δΐίικίιсотЬ е! а1., №йиге 282:39 (1979); Кшдктап е! а1., 0епе 7:141 (1979); ТксЬетрег е! а1., 0епе 70:157 (1980). Данная плазмида уже включает ген ТРР1, который представляет собой селективный маркер для мутантного штамма дрожжей, которые лишены способности расти на триптофане, например АТСС № 44076 или РЕР4-1 (см. статью Шпек, Оепейск 55:12 (1977)). Присутствие нарушения !гр1 в качестве характеристики генома дрожжевой клетки-хозяина затем дает эффективную окружающую среду для детекции трансформации роста в отсутствие триптофана.
В системах насекомых вирус ядерного полиэдроза Аи!одгарЬа саПГогтса (АсЖУ), как правило, используют в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Вирус растет в клетках δробор!е^а Ггид1регба. Последовательность, кодирующую антитело, можно клонировать отдельно в неосновные участки (например, ген полиэдрина) вируса и поместить под контроль промотора Ас№У (например, полиэдиринового промотора).
После рекомбинантной экспрессии молекулы антитела, соответствующего изобретению, ее можно очистить любым способом, известным в области техники, предназначенным для очистки молекулы иммуноглобулина, например, с помощью хроматографии (например, ионообменной, аффинной, особенно с аффинностью в отношении специфического антигена после колоночной хроматографии с белком А и по размеру), центрифугированием, с помощью дифференцированной растворимости или любым другим стандартным способом очистки белков. Альтернативно, предпочтительный способ повышения аффинности антител, соответствующих изобретению, раскрывают в υδ 20020123057 А1.
УШ. Способы лечения с использованием терапевтических антител к δр35.
Как описано в данном контексте, антитела к δр35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, могут облегчить NдР1-опосредованное ингибирование удлинения аксонов, которое в норме имеет место в нейронах ЦНС. Это благоприятно в случаях, когда удлинение аксонов или отрастание невритов требуется в головном или спинном мозге. Повреждение спинного мозга, включая частичное или полное разрушение или разрыв, иллюстрирует случай, в котором необходимо удлинение аксонов, но оно, как правило, ингибируется посредством операции пути №до. Примеры заболевания или нарушений, при которых было бы благоприятным удлинение аксонов и/или отрастание невритов в головном мозге, включают инсульт, рассеянный склероз и другие нейродегенеративные заболевания или нарушения, такие как рассеянный склероз (Μδ), прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию (РМЬ), энцефаломиелит (ЕРЬ), центральный миелолиз варолиевого моста (СРМ), адренолейкодистрофию, болезнь Александра, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера ΉΜΖ), лейкодистрофию глобоидных клеток (болезнь Краббе) и дегенерацию Валлериана, ретробульбарный неврит, поперечный миелит, боковой амиотрофический склероз (Ай-δ), болезнь Гентингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, повреждение спинного мозга, травматическое повреждение головного мозга,
- 84 020508 повреждения после облучения, неврологические осложнения при химиотерапии, инсульт, невропатию, острую ишемическую ретробульбарную невропатию, дефицит витамина Е, синдром дефицита выделенного витамина Е, АК, синдром Басен-Корнцвейга, синдром Маркиафавы-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва, паралич Белла, повреждение спинного мозга и все неврологические заболевания, связанные с гибелью нервных клеток.
Авторы, кроме того, обнаружили, что 8р35 экспрессируется в олигодендроцитах и вносит вклад в биологию олигодендроцитов. Растворимые производные 8р35, ряд полинуклеотидов (например, РНК-ί), а также некоторые антитела, которые специфически связываются с 8р35, как описано в данном контексте, действуют как антагонисты функции §р35 в олигодендроцитах, способствуя пролиферации, дифференцировке и выживаемости олигодендроцитов и способствуя миелинизации нейронов ш νίΙΐΌ и ш У1уо. Это благоприятно при заболеваниях, нарушениях или состояниях, включающих демиелинизацию и дисмиелинизацию. Примеры заболеваний или нарушений, в которых была бы благоприятной пролиферация, дифференцировка и выживаемость и/или миелинизация либо ремиелинизация олигодендроцитов, включают рассеянный склероз (М§), прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию (РМЬ), энцефаломиелит (ЕРЬ), центральный миелолиз варолиевого моста (СРМ), адренолейкодистрофию, болезнь Александра, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (РМ2), лейкодистрофию глобоидных клеток (болезнь Краббе), дегенерацию Валлериана, ретробульбарный неврит, поперечный миелит, боковой амиотрофический склероз (АЬ§), болезнь Гентингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, повреждение спинного мозга, травматическое повреждение головного мозга, повреждения после облучения, неврологические осложнения при химиотерапии, инсульт, острую ишемическую ретробульбарную невропатию, дефицит витамина Е, синдром дефицита выделенного витамина Е, АК, синдром Басен-Корнцвейга, синдром Маркиафавы-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва и паралич Белла.
Соответственно один вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает способы лечения повреждения спинного мозга, заболевания или нарушения, связанные с ингибированием роста нейронов в ЦНС, заболевания или нарушения, связанные с ингибированием роста и дифференцировки олигодендроцитов, и заболевания, включающие демиелинизацию или дисмиелинизацию нейронов ЦНС у животного, страдающего от данного повреждения или заболевания либо предрасположенного к развитию данного заболевания, причем способ, включающий, в основном состоящий или состоящий из введения животному эффективного количества антитела к §р35 или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного. Антитела, соответствующие изобретению, описаны в данном контексте и включают моноклональные антитела, перечисленные в табл. 3А и 3В, антитела, которые специфически связываются с тем же самым эпитопом, что моноклональные антитела, перечисленные в табл. 3А и 3В, антитела, которые конкурентно ингибируют связывание моноклональных антител, перечисленных в табл. 3А и 3В, с 8р35, и антитела, включающие полипептиды, выделенные из моноклональных антител, перечисленных в табл. 3А и 3В.
Терапевтическое антитело к §р35, предназначенное для использования в способах лечения, описанных в данном контексте, можно получить и использовать в качестве лечебного фактора, который способствует отрастанию невритов ЦНС, выживаемости нейронов, направленности аксонов и регенерации аксонов, который способствует выживаемости, росту и/или дифференцировке олигодендроцитов, и который способствует миелинизации или ремиелинизации нейронов ЦНС. Свойства подходящих терапевтических антител к §р35 включают связывание с эпитопами §р35, которое приводит в результате к блокированию активности §р35, связыванию с 8р35 с достаточной аффинностью, чтобы вызвать терапевтический эффект, и связывание с 8р35 предпочтительно по отношению к нормальным партнерам связывания, например рецептору Иодо.
Терапевтические антитела к §р35 могут быть моноклональными, химерными или гуманизированными антителами или фрагментами антител, которые специфически связываются с 8р35. Антитела могут быть моновалентными, бивалентными, поливалентными или бифункциональными антителами. Фрагменты антител включают, без ограничения перечисленным, фрагменты РаЬ, Р(аЬ')2 и Ру.
Терапевтические антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно использовать в немеченой или неконъюгированной форме, или они могут быть спарены или связаны с лекарственными препаратами, метками или стабилизирующими агентами, которые могут давать или не давать дополнительные терапевтические эффекты.
Специальная доза и схема лечения для любого конкретного пациента будет зависеть от ряда факторов, включая конкретное используемое антитело к §р35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету, а также время введения, скорость выведения, комбинацию лекарственных препаратов и тяжесть конкретного заболевания, которое лечат. Оценка данных факторов ухаживающим за больным медицинским персоналом находится в компетенции обычного специалиста в области техники. Количество будет также зависеть от конкретного пациента, проходящего лечение, способа введения, типа препарата, свойств используемого соединения, тяжести заболевания и требуемого эффекта. Используемое количество можно установить с помощью фармакологических и фармакокинетических принципов, хорошо известных в области техники.
В способах, соответствующих изобретению, антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагмен- 85 020508 ты, варианты или производные могут быть введены непосредственно в нервную систему, интрацеребровентрикулярно или интратекально, например, в область хронического повреждения М8, как более подробно обсуждают ниже.
В различных вариантах осуществления антитело к δр35, как описано выше, является антагонистом активности δр35. В ряде вариантов осуществления, например, связывание антагонистического антитела к δр35 с δр35, поскольку он экспрессируется на нейронах, блокирует миелин-ассоциированое ингибирование отрастание невритов или гибель нервных клеток. В других вариантах осуществления связывание антитела к δр35 с δр35, поскольку он экспрессируется на олигодендроцитах, блокирует ингибирование роста или дифференцировки олигодендроцитов или блокирует демиелинизацию или дисмиелинизацию нейронов ЦНС.
В способах, соответствующих настоящему изобретению, антитело к δр35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, в частности антитела к δр35, описанные в данном контексте, могут быть введены непосредственно в виде предварительно полученного полипептида или опосредованно через вектор нуклеиновой кислоты, чтобы создать возможность благоприятного отрастания аксонов, способствовать пролиферации, дифференцировке и выживаемости олигодендроцитов и/или способствовать миелинизации или ремиелинизации.
В ряде вариантов осуществления пациента можно лечить молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело к δр35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или аналог, например, в векторе. Дозы нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, лежат в интервале от приблизительно 10 нг до 1 г, 100 нг до 100 мг, 1 мкг до 10 мг или 30-300 мкг ДНК/пациента. Дозы для инфекционных вирусных векторов варьируют от 10-100 или более вирионов/дозу.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к δр35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное вводят в способе лечения, который включает: (1) трансформацию или трансфекцию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой, например вектором, который экспрессирует антитело к δр35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, и (2) имплантацию трансформированной клетки-хозяина млекопитающему в область заболевания, нарушения или повреждения. Например, трансформированную клетку-хозяин можно имплантировать в область повреждения спинного мозга или в область дисмиелинизации. В ряде вариантов осуществления изобретения имплантируемую клетку-хозяин удаляют из организма млекопитающего, временно культивируют, трансформируют или трансфицируют выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело к δр35, и имплантируют обратно тому же самому млекопитающему, у которого ее удалили. Клетка может, но это необязательное требование, быть удалена из той же области, в которую ее имплантируют. Данные варианты осуществления, в ряде случаев известные как генотерапия еχ νί\Ό, могут обеспечить постоянное снабжение полипептидом δр35, локализованное в области действия, в течение ограниченного периода времени.
Способы лечения повреждений, заболеваний или нарушений спинного мозга, связанные с ингибированием роста нейронов в ЦНС, заболеваний или нарушений, связанных с ингибированием роста и дифференцировки олигодендроцитов, и заболеваний, включающих демиелинизацию или дисмиелинизацию нейронов ЦНС, включающие введение антитела к δр35 или антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, соответствующих изобретению, как правило, тестируют ш νίΙΐΌ и затем ш νί\Ό на приемлемой модели на животном на требуемую терапевтическую или профилактическую активность перед использованием у человека. Подходящие модели на животном, включая трансгенных животных, будут известны обычным специалистам в области техники. Например, анализы ш νίΙΐΌ для демонстрации терапевтической применимости антитела к δр35, описанные в данном контексте, включают эффект антитела к δр35 на клеточную линию и образец ткани пациента. Эффект антитела к δр35 на клеточную линию и/или образец ткани можно установить с использованием способов, известных компетентным специалистам в области техники, таких как анализы, описанные в других разделах данного материала. Согласно изобретению анализы ш уНго, которые можно использовать для определения, показано ли введение специфического антитела к δр35, включают анализы на клеточных культурах ш уНго, в которых образец ткани пациента выращивают в культуре и подвергают воздействию или иным образом обрабатывают соединением и наблюдают эффект данного соединения на образец ткани.
Дополнительные активные соединения также могут быть введены в композиции, соответствующие изобретению. Например, антитело к δр35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, соответствующие изобретению, могут быть приготовлены совместно и/или введены совместно с одним или более дополнительных лечебных факторов.
Изобретение охватывает любой подходящий способ доставки антитела к δр35 или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, соответствующего изобретению, в выбранную тканьмишень, включая болюсную инъекцию водного раствора или имплантацию системы с контролируемым высвобождением. Использование имплантата с контролируемым высвобождением уменьшает необходимость повторных инъекций.
ΙΧ. Фармацевтические композиции и способы введения.
Способы получения и введения антител к δр35 или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов
- 86 020508 или производных, соответствующих изобретению, нуждающемуся в этом пациенту, хорошо известны или могут быть легко установлены компетентными специалистами в области техники. Путь введения антитела к 8р35 или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного может быть, например, пероральным, парентеральным, посредством ингаляции или местным. Термин парентеральный, как используют в данном контексте, включает, например, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. Хотя ясно предусматривают, что все данные формы введения входят в объем изобретения, форма для введения будет представлять собой раствор для инъекций, в частности для внутривенной или внутриартериальной инъекции или капельницы. Как правило, подходящая фармацевтическая композиция для инъекции может содержать буфер (например, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат), необязательно стабилизирующий агент (например, человеческий альбумин) и т.п. Однако в других способах, совместимых в приведенных в данном материале, антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, могут быть доставлены непосредственно в область патологической клеточной популяции, повышая, таким образом, воздействие лечебного фактора на больную ткань. Как обсуждалось ранее, антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно вводить в фармацевтически эффективном количестве для лечения ίη νί\Ό повреждения спинного мозга, заболеваний или нарушений, связанных с ингибированием роста нейронов в ЦНС, заболеваний или нарушений, связанных с ингибированием роста или дифференцировки олигодендроцитов, и заболеваний, включающих демиелинизацию или дисмиелинизацию ЦНС. В этом плане следует иметь в виду, что описанные антитела будут получены так, чтобы облегчить введения и способствовать стабильности активного агента. Предпочтительно, когда фармацевтические композиции, соответствующие настоящему изобретению, включают фармацевтически приемлемый, нетоксичный стерильный носитель, такой как физиологический раствор, нетоксичные буферы, консерванты и т.п. Для целей данной заявки фармацевтически эффективное количество антитела к 8р35 или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, конъюгированного или неконъюгированного, следует подбирать так, чтобы оно соответствовало количеству, достаточному для достижения эффективного связывания с мишенью и для достижения положительного эффекта, например, для облегчения симптомов заболевания или нарушения или для детекции субстанции или клетки.
Фармацевтические композиции, используемые в данном изобретении, включают фармацевтически приемлемые носители, в том числе, например, ионообменники, квасцы, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферные субстанции, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси частичных глицеридов, насыщенных растительных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, гидрофосфат динатрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный оксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, субстанции на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрий карбоксиметилцеллюлоза, полиакрилаты, воска, полиэтилен-полиоксипропиленовые блок-сополимеры и ланолин.
Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе солевой раствор и забуференные среды. В данном изобретении фармацевтически приемлемые носители включают, но без ограничения перечисленным, 0,01-0,1 М и предпочтительно 0,05 М фосфатный буфер или 0,8% солевой раствор. Другие распространенные парентеральные носители включают растворы фосфата натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, среду Рингера с лактатом или нелетучие масла. Внутривенные носители включают текучие и питательные добавки, добавки электролитов, такие как на основе декстрозы Рингера и т.п. Могут также присутствовать консерванты и другие дополнительные компоненты, такие как, например, антимикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы и т.п.
Более подробно фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного использования, включают стерильные водные растворы (при водорастворимых агентах) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного применения. В данных случаях композиция должна быть стерильной и должна быть текучей в той степени, чтобы ее было легко использовать в шприце. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и будет предпочтительно защищенной консервантом от заражающего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может быть представлен растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, спирт, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), и подходящими смесями. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и посредством использования поверхностно-активных веществ. Подходящие препараты, предназначенные для использования в терапевтических способах, описанных в данном контексте, приведены в справочнике КетшдЮп'к РйагтасеиИса! 8шепсе5 (Фармацевтические науки Реминг- 87 020508 тона), Маск РиЬШЫпд Со., 16-е изд. (1980).
Предупреждение действия микроорганизмов может достигаться с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях будет предпочтительным включить в композицию изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций можно осуществить включением в композицию агента, который замедляет всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.
В любом случае стерильные инъекционные растворы можно приготовить введением активного соединения (например, антитела к 8р35 или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, как в виде монокомпонента, так и в сочетании с другими активными агентами) в требуемое количество подходящего растворителя с одним или комбинацией перечисленных в данном контексте ингредиентов, как требуется, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии получают введением активного соединения в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофилизация, которая дает порошок активного ингредиента с добавлением любого дополнительного требуемого ингредиента из его ранее стерилизованного фильтрованием раствора. Препараты для инъекций обрабатывают, наполняют ими контейнеры, такие как ампулы, пакеты, бутылочки, шприцы или флаконы, и запечатывают в асептических условиях согласно способам, известным в области техники. Кроме того, препараты могут быть упакованы и проданы в форме набора, такого как описан в одновременно рассматриваемой заявке и.З.З.М. 09/259337 (И8-2002-0102208 А1), которая включена в данном контексте в виде ссылки в своей полноте. Предпочтительно, когда данные изделия будут иметь этикетки или вкладыши в упаковку, указывающие, что прилагаемые композиции используют для лечения пациента, страдающего от аутоиммунных или неопластических нарушений или предрасположенного к ним.
Парентеральные препараты могут представлять собой однократную болюсную дозу, вливание или ударную болюсную дозу с последующей поддерживающей дозой. Данные композиции можно вводить через специфические фиксированные или варьирующие интервалы, например один раз в день или по мере необходимости.
Некоторые фармацевтические композиции, используемые в данном изобретении, можно вводить перорально в приемлемой лекарственной форме, включая, например, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. Некоторые фармацевтические композиции можно также вводить с помощью назального аэрозоля или ингаляции. Данные композиции можно получить в виде растворов в солевом растворе с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, стимуляторов всасывания для повышения биодоступности и/или других традиционных солюбилизирующих или диспергирующих агентов.
Количество антитела к 8р35 или его фрагмента, варианта или производного, которое можно смешивать с материалами носителя, чтобы получить разовую лекарственную форму, будет варьировать в зависимости от хозяина, которого лечат, и конкретного способа введения. Композицию можно вводить в разовой дозе, множестве доз или в течение установленного периода времени в виде инфузии. Схемы дозирования также можно подобрать, чтобы обеспечить оптимальный требуемый ответ (например, терапевтический или профилактический ответ).
Находясь в объеме настоящего описания, антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, могут быть введены человеку или другому животному в соответствии с вышеуказанными способами лечения в количестве, достаточном для получения терапевтического эффекта. Антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, могут быть введены данному человеку или другому животному в традиционной лекарственной форме, полученной при смешивании антитела, соответствующего изобретению, с принятым фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем в соответствии с известными способами. Компетентный специалист в области техники будет иметь в виду, что форма и характер фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя обусловлены количеством активного ингредиента, в котором его следует смешать, путем введения и другими хорошо известными переменными. Компетентные специалисты в области техники будут, кроме того, иметь в виду, что коктейль, включающий один или два вида антител к 8р35 или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных, соответствующих изобретению, может быть, как полагают, особенно эффективным.
Эффективные дозы композиций, соответствующих настоящему изобретению, для лечения повреждения спинного мозга, заболеваний или нарушений, связанных с ингибированием роста нейронов в ЦНС, заболеваний или нарушений, связанных с ингибированием роста или дифференцировки олигодендроцитов, и заболеваний, включающих демиелинизацию или дисмиелинизацию ЦНС, варьируют в зависимости от многих различных факторов, включая средства введения, область-мишень, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, другие вводимые лекарственные сред- 88 020508 ства и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациент является человеком, но можно также лечить отличных от человека млекопитающих, в том числе трансгенных животных. Лечебные дозы можно оттитровать, используя рутинные способы, известные компетентному специалисту в области техники, для оптимизации безопасности и эффективности.
Для лечения повреждения спинного мозга, заболеваний или нарушений, связанных с ингибированием роста нейронов в ЦНС, заболеваний или нарушений, связанных с ингибированием роста или дифференцировки олигодендроцитов, и заболеваний, включающих демиелинизацию или дисмиелинизацию ЦНС антителом к §р35 или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, доза может лежать в интервале, например, от приблизительно 0,0001-100 и чаще 0,01-5 мг/кг (например, 0,02, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2 мг/кг и т.п.) массы тела хозяина. Например, дозы могут составлять 1 или 10 мг/кг массы тела или лежать в интервале 1-10 мг/кг, предпочтительно по меньшей мере 1 мг/кг. Предусматривают также, что промежуточные дозы в вышеуказанных интервалах входят в объем изобретения. Пациентам можно вводить данные дозы ежедневно, через день, каждую неделю или согласно любой другой схеме, определенной с помощью эмпирического анализа. Пример лечения предусматривает введение в множестве доз в течение длительного периода, например по меньшей мере шести месяцев. Дополнительные примеры схем лечения предусматривают введение один раз каждые две недели, или один раз в месяц, или один раз каждые 3-6 месяцев. Примеры схем дозирования включают 1-10 или 15 мг/кг в следующие друг за другом дни, 30 мг/кг через день или 60 мг/кг в неделю. В некоторые месяцы одновременно вводят два или более моноклональных антител с различными специфичностями связывания, в данном случае доза каждого вводимого антитела входит в указанные интервалы.
Антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно вводить во многих случаях. Интервалы между однократными дозами могут составлять день, неделю, месяц или год. Интервалы могут быть также нерегулярными, как показано по измерению уровней в крови полипептида-мишени или молекулы-мишени в организме пациента. В ряде способов дозу подбирают, чтобы достигнуть концентрации полипептида в плазме 1-1000 мкг/мл и в некоторых способах - 25-300 мкг/мл. Альтернативно, антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно вводить как препарат с замедленным высвобождением, в таких случаях требуется менее частое введение. Доза и частота варьируют в зависимости от полупериода существования антитела в организме пациента. Полупериод существования антитела к §р35 можно также пролонгировать путем слияния со стабильным полипептидом или группой, например альбумином или ПЭГ. Как правило, гуманизированные антитела демонстрируют самый длинный полупериод жизни, затем следуют химерные антитела и нечеловеческие антитела. В одном варианте осуществления антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, могут быть введены в неконъюгированной форме. В другом варианте осуществления антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, могут быть введены многократно в конъюгированной форме. В еще одном варианте осуществления антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, могут быть введены в неконъюгированной форме, затем в конъюгированной форме и наоборот.
Композиции, соответствующие настоящему изобретению, можно ввести любым подходящим способом, например парентерально, интравентрикулярно, перорально, с помощью ингаляционного спрея, местно, ректально, назально, защечно, вагинально или с помощью имплантированного резервуара. Термин парентерально, как используют в данном контексте, включает подкожный, внутривенный, внутримышечный, внутрисуставный, интрасиновиальный, внутригрудинный, интратекальный, внутрипеченочный, в область поражения и внутричерепной способы инъекции или инфузии. Как описано ранее, антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, действуют в нервной системе, способствуя выживаемости, пролиферации и дифференцировке олигодендроцитов и миелинизации нейронов и выживаемости нервных клеток, регенерации аксонов и направленности аксонов. Согласно этому в способах, соответствующих изобретению, антитела к 8р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные вводят таким путем, чтобы они проходили через гематоэнцефалический барьер. Данное прохождение может быть результатом физико-химических свойств, присущих самой молекуле антитела к §р35, действия других компонентов в фармацевтическом препарате или использования механического устройства, такого как игла, канюля или хирургические инструменты, для нарушения гематоэнцефалического барьера. Когда антитело к §р35 представляет собой молекулу, которая в силу своих свойств не пересекает гематоэнцефалический барьер, например слияние с группой, которая облегчает пересечение, подходящими способами введения являются, например, интратекальный или внутричерепной, например, непосредственно в хроническое поражение М§. Когда антитело к §р35 представляет собой молекулу, которая в силу своих свойств пересекает гематоэнцефалический барьер, путь введения может представлять собой один или более из различных путей, описанных ниже. В некоторых способах антитела вводят в виде композиций с замедленным высвобождением или устройств, таких как устройство МеФрай™. Доставка через гематоэнцефалический барьер может быть усилена несущей молекулой, такой как антитело к Рс-рецептору, трансферрин, анти- 89 020508 тело к инсулиновому рецептору или конъюгат токсина либо агент, усиливающий проникновение. Антитела к δр35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, используемые в способах, соответствующих изобретению, могут быть непосредственно введены инфузией в головной мозг. Различные имплантаты для прямой инфузии в головной мозг известны и эффективны в плане доставки терапевтических соединений больным людям, страдающим от неврологических нарушений. Они включают постоянную инфузию в головной мозг с использованием насоса, стереотаксически имплантированных временных интерстициальных катетеров, постоянных имплантатов внутричерепных катетеров и хирургически имплантированных биоразрушаемых имплантатов; см., например, статьи ОШ е! а1., Э|гес1 Ьташ 1пГикюп оГ дЬа1 се11 Ьпе-бепуеб пеитоборШс Гас!ог ш Раткшкоп бкеаке (Прямая инфузия в головной мозг нейротрофического фактора, выделенного из глиальной клеточной линии при болезни Паркинсона), №Циге Меб. 9: 589-95 (2003); δсЬа^Геп е! а1., ШдЬ АсбуНу 1обше-125 ЬИегкИШЬ Ттр1аЩ Рог ОЬотак (Высокоактивный йод-125 интерстициальный имплантат при глиомах) Шб 1. Каб1а!юп 0псо1оду Вю1. РЬук. 24(4):583-91 (1992); Оакраг е! а1., РегтапеШ 1251 ^ркпк Гог Кеситтеп! МаЬдпап! ОЬотак(Постоянные имплантаты 125Ι при рецидивирующих злокачественных глиомах), Шб 1. Каб1а!юп 0псо1оду Вю1. РЬук. 43(5):977-82 (1999); гл. 66, с. 577-580, раздел Ве11е//а е! а1., '^1егео1асбс ЬИегкЬШЬ ВтасЬуШетару (Стереотактическая интерстициальная брахитерапия) в монографии ОПбепЬегд е! а1., Тех!Ьоок оГ δ!е^ео!асί^с апб Рипс!юпа1 №игокигдегу (Руководство по стереотактической и функциональной нейрохирургии), МсОтау-НШ (1998) и статью Вгет е! а1., ТЬе δаГеίу оГ ЬИегкбШЬ СЬето!Ьегару уЬЬ ВСХи-боабеб Ро1утег Ро11оуеб Ьу Каб1а!юп ТЬегару ш !Ье Тгеа!теп! оГ №у1у Э|адпокеб МаЬдпап! ОЬотак: РЬаке Ι Тпа1 (Безопасность интерстициальной химиотерапии с помощью ВСХИ-нагруженного полимера с последующей радиотерапией при лечении вновь диагностированных злокачественных глиом), 1. №ито-0псо1оду 26: 111-23 (1995).
Композиции могут также включать антитело к δр35, диспергированное в материале биосовместимого носителя, который действует как подходящая система доставки или поддержки для соединений. Подходящие примеры носителей с замедленным высвобождением включают полупроницаемые полимерные матрицы в виде формованных изделий, таких как суппозитории или капсулы. Имплантируемые или микрокапсулярные матрицы с замедленным высвобождением включают полилактиды (см. патент США № 3773319; ЕР 58481), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата (см. статью δ^бтаη е! а1., Вюро1утетк 22:547-56 (1985)); поли(2-гидроксиэтилметакрилат), этиленвинилцетат (см. статьи Ьапдет е! а1., I Вютеб. Ма!ег. Кек. 15:167-277 (1981); Ьапдет, СЬет. ТесЬ. 12:98-105 (1982)) или поли-Э-(-)-3-гидроксимасляную кислоту (ЕР 133988).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к δр35 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, соответствующее изобретению, вводят пациенту путем прямой инфузии в соответствующую область головного мозга, см., например, работу ОШ е! а1., кирга. Имеются альтернативные способы, и их можно использовать для введения антитела к δр35, соответствующего изобретению. Например, стереотаксическое помещение катетера или имплантата можно осуществить с использованием установки Ричерта-Мундингера и многоцелевой локализационной установки ΖΌ (2атотапо-Эфоупу). Сканирование с использованием компьютерной томографии с повышенным контрастом (СТ) при инъекции 120 мл омнипак, 350 мг йода/мл при толщине среза 2 мм может дать возможность планирования трехмерного многоплоскостного лечения (ЬТР, РксЬет, РтеШитд, Оегтапу). Данное оборудование позволяет осуществлять планирование на основе исследований изображений магнитного резонанса, объединяя целевую информацию, полученную с помощью СТ и МКГ, для ясного подтверждения мишени.
Для данной цели можно использовать стереотаксическую систему Лекселла (Эо\упк 8игдГса1, Шс., ИесаШт, ОА), модифицированную для применения со сканнером ОΕ СТ ксаппег (Оепега1 ΕΚ^γΚ Сотрапу, МЬуаикее, νΙ), а также стереотаксическую систему Брауна-Робертса-Уэллса (ΒКV) (Кабютск, ВитЬпдГоп, МА). Таким образом, утром в день имплантации круговое базовое кольцо стереотаксической рамки ВК-ν может быть присоединено к черепу пациента. Серийные СТ -срезы можно получить с интервалами 3 мм на участке (ткани-мишени) с помощью рамки локализатора с графитовым стержнем, прикрепленным к базовой плате. Компьютеризированную программу планирования лечения можно запустить на компьютере VАX 11/780 (П1дЬа1 Ε^и^ртеη! СотротаЬоп, Маупагб, Макк.), используя СТкоординаты изображений графитовым стержнем для картирования области между СТ-пространством и ΒКV -пространством.
Антитела к δр35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, необязательно могут быть введены в комбинации с другими агентами, которые эффективны при лечении нарушения или состояния, требующего лечения (например, профилактического или терапевтического).
X. Диагностические агенты.
Далее изобретение предусматривает диагностический способ, используемый во время диагностики нервных нарушений или повреждений, который включает измерение уровня экспрессии белка или транскрипта δр35 в ткани или других клетках или жидкости тела, полученных от пациента, и сравнение измеренного уровня экспрессии со стандартными уровнями экспрессии δр35 в нормальной ткани или жид- 90 020508 кости тела, при этом повышение уровня экспрессии относительно стандарта является показателем нарушения.
§р35-специфические антитела можно использовать для анализа уровней белка в биологическом образце с использованием классических иммуногистологических способов, известных компетентным специалистам в области техники (например, см. статьи 1а1капсп, с! а1., 1. Сс11. Вю1. 707:976-985 (1985); 1а1капсп, с! а1., 1. Сс11. Вю1. 705:3087-3096 (1987)). Другие способы на основе антител, используемые для детекции экспрессии белка, включают иммуноанализы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ§А), иммнопреципитацию и вестерн-блоттинг. Подходящие анализы описаны более детально в других разделах данного материала.
Под выражением оценка уровня экспрессии полипептида §р35 подразумевают качественное или количественное измерение или установление уровня полипептида §р35 в первом биологическом образце либо непосредственно (например, путем определения или оценки абсолютного уровня белка), либо относительно (например, путем сравнения в ассоциированным с раком уровнем полипептида во втором биологическом образце). Предпочтительно, когда измеряют или оценивают уровень экспрессии полипептида §р35 в первом биологическом образце и сравнивают со стандартным уровнем полипептида §р35, причем стандарт берут из второго биологического образца, полученного от субъекта, не имеющего нарушения, или определяют усреднением уровней, полученных в популяции субъектов, не имеющих нарушения. Как будут иметь в виду в области техники, когда стандартный уровень полипептида §р35 известен, его можно использовать повторно в качестве стандарта для сравнения.
Под термином биологический образец подразумевают любой биологический образец, полученный от субъекта, клеточную линию, тканевую культуру или другой источник клеток, потенциально экспрессирующих §р35. Способы получения биоптатов тканей и жидкостей тела у млекопитающих хорошо известны в области техники.
Антитела к §р35, предназначенные для использования в вышеописанных диагностических способах, включают любое антитело к §р35, которое специфически связывается с продуктом гена §р35, как описано в других разделах данного материала.
XI. Иммуноанализы.
Антитела к §р35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, можно проанализировать на иммуноспецифическое связывание любым способом, известным в области техники. Иммуноанализы, которые можно использовать, включают, но без ограничения перечисленным, системы конкурентного и неконкурентного анализов с использованием таких методов, как вестерн-блоты, радиоиммуноанализы, ЕЫ§А (твердофазный иммуноферментный анализ), сэндвичевые иммуноанализы, анализы на основе иммунопреципитации, реакции преципитина, реакции на основе диффузии преципитина в геле, анализы на основе иммунодиффузии, анализы агглютинации, анализы связывания комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы, иммуноанализы с использованием белка А, в числе прочих. Данные анализы являются рутинными и хорошо известны в области техники (см., например, монографию под ред. Аи8иЪс1 с! а1., Сиггсп! Рго!осо18 ш Мо1сси1аг Вю1оду (Современные методы в молекулярной биологии), 1оЪп \УПсу & §оп8, Шс., №\ν Уогк, т. 1 (1994), которая включена в виде ссылки в данном контексте в своей полноте). Примеры иммуноанализов вкратце описаны ниже (но не подразумеваются как ограничивающие).
Протоколы иммунопреципитации, как правило, включают лизирование популяции клеток в лизирующем буфере, таком как буфер К1РА (1% ΝΈ-40 или Тгйоп Х-100, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% §Ό§ (додецилсульфат натрия), 0,15 М Ν;ι(Ί, 0,01 М фосфат натрия при рН 7,2, 1% трасилол) с добавлением ингибиторов протеинфосфатазы и/или протеазы (например, ЕИТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты), РМ§Р, апротинина, ванадата натрия), добавление представляющего интерес антитела к клеточному лизату, инкубирование в течение периода времени (например, 1-4 ч) при 4°С, добавление белка А и/или белка О на частицах сефарозы к клеточному лизату, инкубирование в течение приблизительно 1 ч или более при 4°С, промывание частиц в буфере для лизиса и ресуспендирование частиц в §И§/буфере для образцов. Способность представляющего интерес антитела к имунопреципитации определенного антигена можно оценить, например, с помощью анализа вестерн-блот. Компетентный специалист в области техники должен быть знаком с параметрами, которые можно модифицировать для повышения уровня связывания антитела с антигеном и снижения уровня фона (например, предварительное осветление клеточного лизата с помощью частиц сефарозы). В плане дальнейшего обсуждения протоколов иммунопреципитации см., например, монографию под ред. Аи8иЪс1 с! а1., Сиггсп! Рго!осо18 ш Мо1сси1аг Вю1оду (Современные методы в молекулярной биологии), 1оЪп \УПсу & §оп8, бзс., №\ν Уο^к. т. 1 (1994), раздел 10.16.1.
Анализ вестерн-блот в основном включает получение образцов белка, электрофорез образцов белка в полиакриламидном геле (например, 8-20% §И§-РАОЕ (электрофорез в полиакриламидном геле с использованием 8-20% додецилсульфата натрия) в зависимости от молекулярной массы антигена), перенос образца белка из полиакриламидного геля на мембрану, такую как нитроцеллюлоза, РУЭР или нейлон, блокирование мембраны в блокирующем растворе (например, РВ§ (забуференный фосфатом солевой раствор) с 3% В§А (бычий сывороточный альбумин) или обезжиренное молоко), промывание мембраны
- 91 020508 в буфере для промывания (например, РВЗ-Т»ееп 20), блокирование мембраны первичным антителом (антителом, представляющим интерес), разведенным в блокирующем буфере, промывание мембраны в буфере для промывания, блокирование мембраны вторичным антителом (которое распознает первичное антитело, например антитело к человеку), конъюгированным с субстратом фермента (например, пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы) или радиоактивной молекулой (например, 32р ог 1251), разведенной в блокирующем буфере, промывание мембраны в буфере для промывания и детекцию присутствия антигена. Компетентный специалист в области техники должен быть осведомлен относительно параметров, которые могут быть модифицированы, чтобы повысить определяемый сигнал и понизить фоновый шум. В плане дальнейшего обсуждения, касающегося протоколов вестерн-блота, см., например, монографию под ред. АивиЪе1 е1 а1., Сиггей РгоЮсок ш Мо1еси1аг Вю1оду (Современные методы в молекулярной биологии), Юбп \УПеу & Зопв, 1пс., бе» Уогк, т. 1 (1994), раздел 10.8.1.
ЕЫЗАв включают получение антигена, покрытие лунок 96-луночного планшета для титрования антигеном, добавление представляющего интерес антитела, конъюгированного с определяемым соединением, таким как субстрат фермента (например, пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы), в лунку, инкубирование в течение периода времени и детекцию присутствия антигена. В ЕЫЗАв представляющее интерес антитело не должно быть конъюгировано с определяемым соединением; вместо этого в лунку может быть добавлено второе антитело (которое распознает представляющее интерес антитело), конъюгированное с определяемым соединением. Кроме того, вместо покрытия лунки антигеном лунку можно покрыть антителом. В данном случае второе антитело, конъюгированное с определяемым соединением, можно добавить после добавления представляющего интерес антигена в лунку с покрытием. Компетентный специалист в области техники должен быть осведомлен относительно параметров, которые могут быть модифицированы, чтобы повысить определяемый сигнал, а также других вариантов ЕЫЗА, известных в области техники. В плане дальнейшего обсуждения, касающегося ЕЫЗАв, см., например, монографию под ред. АивиЪе1 е1 а1., Сиггей РгоЮсок ш Мо1еси1аг Вю1оду (Современные методы в молекулярной биологии), Юбп ^беу & Зопв, 1пс., №» Уогк, т. 1 (1994), раздел 11.2.1.
Аффинность связывания антитела с антигеном и скорость диссоциации взаимодействия антителоантиген можно определить с помощью анализов конкурентного связывания. Одним примером анализа конкурентного связывания является радиоиммуноанализ, включающий инкубирование меченого антигена (например, 3Н или 125Ι) с представляющим интерес антителом в присутствии повышающихся количеств немеченого антигена и детекцию антитела, связанного с меченым антигеном. Аффинность представляющего интерес антитела в отношении конкретного антигена и скорости диссоциации связывания можно определить на основании данных с помощью графического анализа по Скетчарду. Конкуренцию с вторым антителом также можно определить, используя радиоиммуноанализы. В данном случае антиген инкубируют с представляющим интерес антителом, конъюгированным с меченым соединением (например, 3Н или 125Ι) в присутствии повышающихся количеств немеченого второго антитела.
Антитела к Зр35 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, соответствующие изобретению, кроме того, используют гистологически, например, в иммунофлуоресцентных, иммуноэлектронномикроскопических или неиммунологических анализах, для детекции ш βίΐυ продуктов гена ракового антигена или консервативных вариантов либо их пептидных фрагментов. Детекция ш βίΐυ может быть осуществлена удалением гистологического образца у пациента и обработкой его меченым антителом к Зр35 или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, предпочтительно обработкой наслоением меченого антитела (или фрагмента) на биологический образец. При использовании данного способа возможно установить не только присутствие белка Зр35 или его консервативных вариантов либо пептидных фрагментов, но также его распределение в исследуемой ткани. Используя настоящее изобретение, обычный специалист легко поймет, что любой из широкого круга гистологических способов (таких как способы окрашивания) можно модифицировать для достижения данной детекции ш вби.
Иммуноанализы и неиммуноанализы продуктов гена Зр35 или его консервативных вариантов или пептидных фрагментов будут, как правило, включать инкубирование образца, такого как биологическая жидкость, тканевый экстракт, свежесобранные клетки или лизаты клеток, которые инкубировали в клеточной культуре в присутствии определяемо меченого антитела, способного связываться с Зр35 или его консервативными вариантами или пептидными фрагментами, и детекцию связанного антитела любым из множества способов, хорошо известных в области техники.
Биологический образец можно привести в контакт и иммобилизовать на твердофазной основе или носителе, таком как нитроцеллюлоза или другой твердый носитель, который способен к иммобилизации клеток, клеточных частиц или растворимых белков. Затем основу можно промыть подходящими буферами с последующей обработкой определяемо меченым антителом к Зр35 или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным. Затем твердофазную основу можно второй раз промыть буфером для удаления несвязанного антитела. Затем антитело необязательно метят. Количество связанной метки на твердой основе можно затем определить принятыми средствами.
Под выражением твердофазная основа или носитель подразумевают любую основу, способную к связыванию антигена или антитела. Хорошо известные основы или носители включают стекло, полисти- 92 020508 рол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро или магнетит. Для целей настоящего изобретения носитель по природе может быть либо растворимым до некоторой степени, либо нерастворимым. Материал носителя может иметь практически любую возможную конфигурацию до тех пор, пока связанная молекула способна связываться с антигеном или антителом. Таким образом, конфигурация основы может быть сферической, как в гранулах, или цилиндрической, как во внутренней поверхности тест-пробирки или наружно поверхности стержня. Альтернативно, поверхность может быть плоской, такой как лист, тест-полоска и т.п. Предпочтительные основы включают полистироловые гранулы. Компетентным специалистам в области техники будут известны многие другие подходящие носители для связывания антитела или антигена, или они будут способны установить это с использованием рутинного экспериментирования.
Активность связывания заданной партии антитела к δр35 или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного можно определить согласно хорошо известным способам. Компетентные специалисты в области техники будут способны определить функциональные и оптимальные условия анализа для каждого определения при использовании рутинного экспериментирования.
Имеется множество способов измерения аффинности взаимодействия антитело-антиген, но относительно немного для измерения констант скорости. Большинство способов основано либо на введении метки в антитело или антиген, которая неизбежно затрудняет рутинные измерения и вводит элементы неопределенности в измеряемые количества.
Поверхностный плазмонный резонанс ^РР), как проводят на приборе В1Асоге, представляет ряд преимуществ относительно традиционных способов измерения аффинности взаимодействий антителоантиген: (ί) не требуется вводить мету ни в антитело, ни в антиген; (ίί) необязательно предварительно очищать антитела, супернатант клеточной культуры можно использовать непосредственно; (ίίί) измерения в режиме реального времени, обеспечивающие быстрое полуколичественное сравнение взаимодействий различных моноклональных антител, дают возможность и достаточны для многих целей оценки, (ίν) биспецифическую поверхность можно регенерировать, так что серию различных моноклональных антител можно легко сравнить в идентичных условиях, (ν) аналитические процедуры полностью автоматизированы и широкие серии измерений можно проводить без участия пользователя; см. В1АаррНса!юпк напбЬоок, версия АВ (переизд. 1998), код В1АС0РЕ № ВР-1001-86; В1А!есЬпо1оду напбЬоок, версия АВ (переизд. 1998), код В1АС0РЕ № ВР-1001-84.
Для исследований связывания на основе δΡК необходимо, чтобы один член пары связывания был иммобилизован на поверхности датчика. Иммобилизованный партнер связывания называют лигандом.
Партнер связывания в растворе называют аналитом. В ряде случаев лиганд непрямо присоединяют к поверхности посредством связывания с другой иммобилизованной молекулой, которую называют захватывающей молекулой. Ответ δΡК отражает изменение концентрации массы на поверхности детектора, когда аналиты связываются или диссоциируют.
Основываясь на δΡК, измерения, проведенные на В1Асоге в режиме реального времени, непосредственно мониторируют взаимодействия, когда они происходят. Способ хорошо подходит для определения кинетических параметров. Сравнительное ранжирование аффинности провести чрезвычайно просто и обе константы, кинетическую и аффинности, можно вывести из данных сенсограммы.
Когда аналит впрыскивают в дискретный импульс через поверхность лиганда, полученную в результате сенсограмму можно разделить на три основные фазы: (ί) связывание аналита с лигандом во время впрыскивания образца, (ίί) уравновешивание или стабильная стадия во время впрыскивания образца, когда скорость связывания аналита уравновешивается диссоциацией из комплекса, (ίίί) диссоциация аналита с поверхности во время протекания буфера.
Фазы ассоциации и диссоциации дают информацию относительно кинетики взаимодействия аналит-лиганд (ка и кб, скорости образования и диссоциации комплекса, кб/ка=Кб). Фаза равновесия дает информацию относительно аффиности взаимодействия аналит-лиганд (Кб).
Пакет программ В1Аеуа1иа1юп представляет большие возможности для построения кривой с использованием как численного интегрирования, так и общих алгоритмов построения. При использовании подходящего анализа данных можно получить отдельные константы скорости и аффинности взаимодействия на основании простых исследований с помощью В1Асоге. Интервал аффинностей, измеряемых данным способом, лежит в очень широком интервале от мМ до пМ.
Специфичность эпитопов является важной характеристикой моноклонального антитела. Картирование эпитопа с помощью В1Асоге в противоположность традиционным способам с использованием радиоиммунонализа, ЕЫБА или других способов поверхностной адсорбции не требует введения метки или очистки антител и дает возможность проведения тестов многоцентровой специфичности с использованием последовательности нескольких моноклональных антител. Кроме того, большие количества анализов можно обработать автоматически.
Эксперименты по попарному связыванию тестируют способность двух МАЬк одновременно связываться с одним и тем же антигеном. МаЬк, направленные на разные эпитопы, будут связывать независимо, тогда как МаЬк, направленные на идентичные или близко родственные эпитопы, будут мешать связыванию друг друга. Данные эксперименты по связыванию с использованием В1Асоге просты в осущест- 93 020508 влении.
Например, можно использовать захватывающую молекулу для связывания первого МаЬ с последующим добавлением антигена и затем второго МАЬ. Сенсограммы будут показывать: 1) как много антигена связывается с первым МаЬ, 2) до какой степени второе МАЬ связывается с присоединенным к поверхности антигеном, 3) если второе МАЬ не связывается, изменяет ли результаты обратный порядок попарного теста.
Ингибирование пептидом представляет собой другой способ, используемый для картирования эпитопа. Данный способ может дополнить исследования попарного связывания антител и может связать функциональные эпитопы со структурными свойствами, когда известна первичная последовательность антигена. Пептиды или фрагменты антигена тестируют на ингибирование связывания различных МАЬк с иммобилизованным антигеном. Пептиды, которые нарушают связывание заданного МаЬ, считают структурно близкими эпитопу, определенному с помощью данного МАЬ.
В практической реализации настоящего изобретения будут использовать, пока не указано иначе, традиционные способы, применяемые в биологии клетки, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые входят в компетенцию специалистов в области техники. Данные способы полностью объясняются в литературе; см., например, монографии Мо1еси1аг С1ошпд А ЬаЬога!огу Мапиа1 (Лабораторное руководство по молекулярному клонированию), 2-е изд., под ред. δатЬ^οοк е! а1., Со1б δр^^ηд нагЬог ЬаЬога!огу Ргекк: (1989); Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (Лабораторное руководство по молекулярному клонированию), под ред. δатЬ^οοк е! а1., Со1б δр^^ηдк нагЬог ЬаЬога!огу, №\у Υο^к (1992), ЭЫА С1отпд (Клонирование ДНК) под ред. Ό.Ν. 01оуег, т. Ι и ΙΙ (1985); Обдопискоббе δγώ^^ (Синтез олигонуклеотидов) под ред. М.1. 0ай (1984); МиШк е! а1., патент США № 4683195; Шскк Ас1б нуЬпб1/абоп (Гибридизация нуклеиновых кислот) под ред. ВИ. натек & δ.1. Шддшк, (1984); ТгапкспрРоп Апб Тгапк1абоп (Транскрипция и трансляция) под ред. ВИ. натек & δ.1. Шддшк (1984); СиЙиге ОГ Атта1 Се11к (Культура клеток животных), КГ. РгекЬпеу, А1ап К. Ыкк, бю., (1987); ЬптоЫП/еб Се11к Апб Εпζутек (Иммобилизованные клетки и ферменты), ΙΒΗ Ргекк, (1986); В. РегЬа1, А Ргасбса1 Ошбе То Мо1еси1аг С1отпд (Практическое руководство по молекулярному клонированию) (1984); учебник Мебюбк Ы Εиζутο1ο§у (Методы в энзимологии), Асабетк Ргекк, бю., Ν.Υ.; монографии 0епе ТгапкГег Уес1огк Рог МаттаПап Се11к (Векторы для переноса генов для клеток млекопитающих), под ред. 1.Ш МШег апб М.Р. Са1ок, Со1б δр^^пд нагЬог ЬаЬогаЮгу (1987); Ме!Ьобк Ы Εиζутο1ο§у (Методы в энзимологии), т. 154 и 155 (под ред. №и е! а1.); IттипοсЬет^са1 Ме!Ьобк Ы Се11 Апб Мо1еси1аг Вю1оду (Иммунохимические методы в клеточной и молекулярной биологии), под ред. Мауег апб №а1кег, Асабетк Ргекк, Ьопбоп (1987); напбЬоок ОГ Εχре^^тепίа1 Iттипο1ο§у (Руководство по экспериментальной иммунологии), т. ЫУ, под ред. Э.М. №еи апб С.С. В1аскуе11, (1986); Машри1абпд !Ье Мойке ΕηιΠγλό (манипуляции с мышиными эмбрионами), Со1б δр^^пд нагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со1б δр^^пд нагЬог, Ν.Υ. (1986) и АикиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (Современные методы молекулярной биологии), 1оЬп №Пеу апб δοпк, Ва1бшоге, Магу1апб (1989).
Основные принципы конструирования антител приведены в монографии АпбЬобу Нпдтееппд (Конструирование антител), 2-е изд., под ред. С.А.К. ВоггеЬаеск, ОχГο^б Шим. Ргекк (1995). Основные принципы конструирования белков приведены в монографии Рго!еш Нпдтееппд, А Ргасбса1 АрргоасЬ (Практический подход к конструированию белков), под ред. Кккуооб, Ό., е! а1., ШЬ Ргекк а! ОМогб Иик. Ргекк, ОχГο^б. бид. (1995). Основные принципы связывания антител или антител с гаптеном приведены в монографиях ШкопоГГ, А., Мо1еси1аг Iттиηο1ο§у (Молекулярная иммунология), 2-е изд., δίικιιΚΓ Аккосб а!ек, δипбе^1апб. М.А. (1984) и δ!еуа^б, М.№., АпбЬобкк, ТЬеи δΙπκΙΐΗΌ апб Рипсбоп (Антитела, их структура и функция), СЬартап апб на11, №у Уогк, ΝΥ (1984). Кроме того, стандартные способы в иммунологии, известные в области техники, не описанные специально, в основном соответствуют тем, что представлены в монографиях Сиггеп! Рго!осо1к ш Iттиηο1ο§у (Современные методы в иммунологии), 1оЬп №Пеу & δοпк, Уο^к; под ред. δΐί^ е! а1., Вакк апб СПпка1 Iттипο1ο§у (Общая и клиническая иммунология) (8 изд.), Арр1е!оп & Ьапде, №гуа1к, С.Т. (1994) и под ред. МкЬе11 апб δЬ^^д^, δе1ес!еб Ме!Ьобк 1п Се11и1аг Iттипο1ο§у (Избранные методы клеточной иммунологии), №.н. Ргеетап апб Со., №у Υο^к (1980).
Стандартные работы, на которые ссылаются, представляющие основные принципы иммунологии, включают монографии Сиггеп! Рго!осо1к ш Iттипο1ο§у (Современные методы в иммунологии), 1оЬп №Пеу & δοпк, №у Уο^к; К1еш, 1., Iттипο1ο§у: ТЬе δс^епсе оГ δе1Г-Nοиδе1Г Оксбтшабоп (Иммунология наука распознавания: свой-несвой), 1оЬп №Пеу & δοи8, №у Уο^к (1982); под ред. Кеппе!!, К., е! а1., Мопос1опа1 АпбЬобкк, нуЬббота: А №у Оипепкюп ш Вю1одка1 Апа1укек (Моноклональные антитела, гибридома - новое измерение в биологических анализах), Р1епит Ргекк, Уο^к (1980); раздел СатрЬе11,
А., Мопос1опа1 АпбЬобу ТесЬпо1оду (Технология моноклональных антител) в монографии под ред. Вигбеп, К., е! а1., ЬаЬога!огу ТесЬшциек ш ВюсЬешкбу апб Мо1еси1аг Вю1оду (Лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии), т. 13, Вбемет, Атк!егбат (1984), КиЬу Iттиипο1ο§у (Иммунология Кьюби), 4-е изд. под ред. КкЬагб А. 0о1бкЬу, ТЬотак 1. Ктпб! апб ВагЬага А. ОкЬогпе, н. Ргеетапб & Со. (2000); Кой!, Ь., Вгок!оГГ, 1. апб Ма1е Ό., Iттипο1ο§у (Иммунология), 6-е изд. Ьопбоп: МокЬу (2001); АЬЬак А., АЬи1, А. апб ЬкЬ!тап, А., Се11и1аг апб Мо1еси1аг Iттипο1ο§у (Клеточная и молекулярная имму- 94 020508 нология), 5-е изд., Е1зеу1ег неаИЬ §аепсез О1у1зюп (2005); Копкегшапп апб ЭнЬек АпНЬобу Епдшеегтд (Конструирование Антител), 8ргшдег Уег1ап (2001); 8ашЬгоок апб Киззе11, Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогакогу Мапиа1 (Лабораторное руководство по молекулярному клонированию). Со1б 8ргшд нагЬог Ргезз (2001); Ьетп, Оепез VIII (Гены VIII), Ргепйсе на11 (2003); наг1оте апб Ьапе, АпНЬоб1ез: А ЬаЬогакогу Мапиа1 ((Лабораторное руководство по антителам), Со1б 8ргшд нагЬог Ргезз (1988); О|сГГепЬасН апб Иуекзкг, РСК Рптег (Праймер для ПЦР) Со1б 8ргшд нагЬог Ргезз (2003).
Все из вышеприведенных ссылок, а также все ссылки, приведенные в данном контексте, включены в данном контексте в виде ссылки в своей полноте.
Примеры
Пример 1. 8р35 включен в биологию олигодендроцитов.
Олигодендроциты созревают на протяжении нескольких стадий развития, дифференцируясь из клеток-предшественников А2В5 (которые экспрессируют А2В5) в премиелинизирующие олигодендроциты (которые экспрессируют 01 и 04) и, наконец, в зрелые миелинизирующие олигодендроциты (которые экспрессируют 01, 04 и МВР). Таким образом, по мониторированию присутствия и отсутствия маркеров А2В5, 01, 04 и МВР возможно определить стадию развития данной клетки и оценить роль 8р35-Рс в биологии олигодендроцитов. В качестве общего обзора биологии олигодендроцитов см., например, статью Ваитапп апб РЬат-ЭтЬ, РЬузю1. Кеу. 81: 871-927 (2001).
Моноклональные антитела к 04, МВР и СИР-азе получают от фирмы §кегпЬегдег Мопос1опа1з; антитело к АРС (клон СС-1; ссылка 29) - от фирмы Са1ЬюсЬет. Другими антителами являются антитело к бета-Ш-тубулину (Соуапсе), 8р35 (Вюдеп Мее), Руп (8апка Сги/ В1о1есНпо1оду) и фосфо-Руп (Вюзоигсе). Моноклональные антитела к А2В5 доступны в фирме СЬетюоп.
8р35 экспрессируется в олигодендроцитах.
Экспрессию 8р35 в культурах очищенных крысиных нейронов Р13 СО, олигодендроцитов Р2 и астроцитов Р4 анализируют с помощью полимеразной цепной реакции после обратной транскрипции (ОТПЦР). Набор фирмы АтЬюп, Шс. используют для экстракции мРНК из клеток головного мозга крыс согласно инструкциям изготовителя. Полуколичественная ОТ-ПЦР, проводимая с использованием прямого праймера 5' - АОАОАСАТОСОАТТООТОА - 3' (8ЕЦ Ш ИО:344) и обратного праймера 5' - АОАОАТОТАОАСОАООТСАТТ - 3' (8ЕЦ Ш ИО:345), показывает высокий уровень экспрессии в нейронах, более низкий уровень экспрессии в олигодендроцитах и отсутствие экспрессии в астроцитах.
Экспрессию 8р35 в олигодендроцитах подтверждают путем гибридизации ш з11и в срезах, полученных из глазного нерва взрослой крысы. Срезы зрительного нерва крысы получают и обрабатывают, как описано в статье М1 е1 а1. 3р35 1з а сотропепк оГ 1Не Иодо-66 гесерког/р75 з1дпа1шд сотр1ех (3р35 - компонент комплекса передачи сигнала рецептора Иодо-66/р75) Иак Иеигозск 7: 221-28 (2004) и зондируют меченной дигоксигенином антисмысловой или смысловой РНК 8р35, используя первые 500 нуклеотидов кодирующей последовательности 8р35. Срезы окрашивают согласно инструкциям изготовителя, используя набор Тугаппбе 81дпа1 Атрййсайоп ΚίΙ (АтегзЬат Вюзшепсез) и набор с антителом к дигоксигенину, конъюгированному с флуоресцентной меткой (Регкш Е1тег). Для комбинированных т з11и и иммунофлуоресцентных анализов срезы сначала зондируют РНК, меченными дигоксигенином, и затем антителами, например антителом СС1 (Са1ЬюсЬет; маркером зрелых олигодендроцитов) или антителом к 8р35. Авторы наблюдают, что олигодендроциты, которые гибридизуются с антисмысловым зондом 8р35, также совместно окрашиваются антителом к СС1 (данные не показаны). Никакого специфического мечения не наблюдают при использовании смыслового зонда 8р35. Экспрессию 8р35 в олигодендроцитах подтверждают также иммуногистохимическими исследованиями срезов тканей из области бокового желудочка коры головного мозга крысы Р7. Большинство кортикальных клеток, которые метятся антителом СС1, метятся также антителом к 8р35. Данные не показаны. Специфичность взаимодействия подтверждают предварительной адсорбцией антитела к 8р35 на 8р35-Рс (см. Ехатр1е 2), которая элиминирует сигнал.
Выбивание экспрессии 8р35 посредством 8р35-специфической РЖ! способствует росту и дифференцировке олигодендроцитов.
8р35-специфическое РнК1 используют для устранения экспрессии 8р35 в клеткахпредшественниках олигодендроцитов, чтобы исследовать, как 8р35 участвует в росте и дифференцировке олигодендроцитов. 50000 клеток-предшественников олигодендроцитов А2В5 инфицируют лентивирусом, несущим 8р35-специфическую последовательность РнК1 или контрольную РнК1, полученную следующим образом.
Мышиную и крысиную последовательности ДНК 8р35 сравнивают, чтобы найти гомологичные области для использования потенциальных маленьких шпилечных РНК (зЬ-РНК). Для экспрессии в лентивирусах РНК-ί 8р35 СН324 конструируют путем отжига олигонуклеотидов ЬУ 1-035 и ЬУ 1-036 и лигирования в разрезанную нра1 и ХЬо1 рЬЬ3.7. Вектор рЬЬ3.7, дополнительные способы и продукцию вируса используют, как описано в статье КиЬшзоп е1 а1., Иак Оепек 33, 401-06 (2003). Олигонуклеотиды РНК1 8р35 приобретают в фирме М\УО, и они имеют следующие последовательности: ЬУ!- 035 (смысловой олиго) 5' - ТОАТСОТСАТССТОСТАОАСТТСААОАОАОТСТАОСАООАТОАСОАТСТТТТТТС - 3' (ЗЕЦ II) ИО:346) и ЬУ1-036 (антисмысловой олиго) 5' - ТСОАОААААААОАТСОТСАТССТОСТА- 95 020508
ОАСТСТСТТОААОТСТАОСАООАТОАСОАТСА - 3' (81®) ΙΌ ^:347).
Контрольную РНК1 конструируют с теми же олигонуклеотидными последовательностями, за исключением изменений нуклеотидов, показанных строчными буквами: 5' - ТОАТСсТСАТсСйСТа1АСТТСААОАОАОТдТАОСАООАТОАсОАТСТТТТТТСТСОА-3' (81®) ΙΌ ^:348) и 5' - ТСОАОААААААОАТСОТСАТССТОСТАОАСТСТСТТОААОТаТАОаАООАТОАСОАТСА - 3' (81®) ΙΌ Ш:349).
Перед получением лентивируса ДНК из рЬЬ3.7 или потенциальной зЬРНК в рЬЬ3.7 клетки СНО сотрансфицируют с мышиной меченой 8р35-НА плазмидой в соотношении 5 к 1 в 6-луночном формате. Выбивание анализируют детекцией вестерн-блотом метки 8р35-НА из лизатов трансфицированных клеток СНО, а также нозерн-блотом общей РНК, полученной из лунок в двух повторностях. Блот зондируют фрагментом ДНК 8р35. Анализы проводят через 48 ч после трансфекции. Как ожидают, имеется 1кратное уменьшение мРНК 8р35 в клетках СНО, обработанных РНК-ί СН324 относительно клеток, обработанных контролем. Данные не показывают. Лентивирусы ЕШАР несущие белок зеленой флуоресценции (ОРР), генерируют, как описано в статье КиЬшзоп е( а1. В культурах, обработанных либо контролем, либо РНК-ί 8р35 приблизительно 80% олигодендроцитов является ОРР-положительными. Общее число клеток не изменяется при обработках РНК-ί. Для количественной оценки эффектов РНК-ί на дифференцировку подсчитывают только ОРР-экспрессирующие олигодендроциты.
Обогащенные популяции олигодендроцитов выращивают из самок крыс Ьопд Еуапз Р2, как описано в статье Сопп, Ме(Н. №игозст 2:1-4 (Асайетю Ргезз; 1990) со следующими модификациями. Вкратце, передний мозг препарируют и помещают в забуференный солевой раствор Хенка (НВ88; ЮуПгодеп). Ткань разрезают на фрагменты по 1 мм и инкубируют при 37°С в течение 15 мин в 0,01% трипсине и 10 мкг/мл ДНКазы. Отделившиеся клетки помещают на колбы для тканевых культур Т75, покрытые полиЬ-лизином и выращивают при 37°С в течение 10 дней в среде ПМЕМ с 20% сывороткой телячьих эмбрионов Дпуйгодеп). Предшественники олигодендроцитов (А2В5+) собирают путем встряхивания колбы в течение ночи при 200 об/мин при 37°С, получая в результате популяцию 95% чистоты. Культуры поддерживают с среде Игла в модификации Дальбекко с высоким содержанием глюкозы (ПМЕМ) с добавлением РСЕ/РЭСЕ (10 нг/мл; Рерго(есН) в течение 1 недели. Удаление РСР/РЭСЕ позволяет клеткам А2В5+ дифференцироваться в О4+ премиелинизирующие олигодендроциты через 3-7 дней и дифференцироваться в О4+ и МВР+ зрелые олигодендроциты через 7-10 дней. Данные состояния дифференцировки легко видеть по изменениям морфологии: А2В5+ клетки биполярны по форме, О4+ премиелинизирующие олигодендроциты имеют более длинные и более разветвленные отростки и МВР+ зрелые олигодендроциты включают структуры миелиновой оболочки между отростками.
Клетки-предшественники олигодендроцитов А2В5 инфицируют лентивирусом, содержащим РНК-ί СН324. Полученные в результате клетки культивируют в течение 3 дней и подсчитывают число 04положительных (маркер дифференцировки олигодендроцитов) олигодендроцитов. Уровень эндогенной экспрессии 8р35 снижают инфекцией лентивируса РНК-ί 8р35 и подтверждают с помощью ОТ-ПЦР. Снижение уровня 8р35 дает в результате более высокодифференцированные зрелые олигодендроциты по сравнению с контрольными инфицированными клетками, что очевидно по увеличению длины отростков клеток и присутствию большого количества структур миелиновой оболочки (данные не показывают). Среди клеток, которые экспрессируют РНК-ί 8р35, в три раза больше зрелых (04-положительных) олигодендроцитов по сравнению с контрольными культурами. Данные результаты показывают, что 8р35 может отрицательно регулировать дифференцировку олигодендроцитов.
Доминантно-отрицательный 8р35 способствует росту и дифференцировке олигодендроцитов.
Конструируют лентивирусные векторы, которые экспрессируют дикий тип и доминантноотрицательную форму 8р35. Последовательность ДНК, кодирующую мышиный 8р35 полной длины (РЬ8р35, остатки аминокислот 34-614 8ЕО ΙΌ NΟ:2), амплифицируют с помощью ПЦР, используя праймеры 5' - ОАООАТСТСОАСОСООССОСАТООАОАСАОАСАСАСТССТО - 3' (8Р®) ΙΌ ^:350) и 5' ООООСООААТТООАТССТСАСАОАТССТСТТСТОАОАТОАО - 3' (8Р®) ΙΌ ^:351) и вводят в лентивирусный вектор НК8Т-ШЕ8еОРР в сайты №(Ι и ВатНР Аналогично последовательность ДНК, кодирующую доминантный отрицательный 8р35 (Э№8р35, остатки аминокислот 34-581 8ЕО ΙΌ NΟ:2), амплифицируют с помощью ПЦР, используя праймеры 5' ОАООАТСТСОАСОСООССОСАТООАОАСАОАСАСАСТССТО - 3' (8Е®) ΙΌ ^:352) и 5' - ОАТАСООАТССТСАОССТТТО ССССООСТССАТАОАААСАОС-3' (8Е®) ΙΌ ^:353). Плазмидами РЬ-8р35 и Э^8р35 трансфицируют клетки 293 с получением лентивируса, как описано в статье РиЫпзоп е( а1., А 1еп11У1ги8-Ьа8ей зуз!ет (о Гипсйопайу зйепсе депез т рптагу таттайап се11з, з(ет се11з апй (гапздешс тюе Ьу РНК иЛегГегепсе (Система на основе лентивирусов для получения функционально молчания генов в первичных клетках млекопитающих, стволовых клетках и у трансгенных мышей посредством интерференции РНК) №1 Оепе(. 33: 401-06 (2003). Олигодендроциты инфицируют лентивирусом в концентрации 2 ΜΟI на клетку и подтверждают экспрессию РЬ-8р35 и Э^8р35 с помощью вестерн-блота.
Э^8р35 способствует дифференцировке олигодендроцитов, давая повышение числа зрелых олигодендроцитов. Напротив, сверхэкспрессия 8р35 полной длины (РЬ-8р35) имеет противоположный эффект и ингибирует дифференцировку, что является доказательством уменьшения числа зрелых олигодендро- 96 020508 цитов по сравнению с контролем (данные не приводят).
Пример 2. Конструирование и очистка слитого белка 8р35-Рс.
Получают конструкцию, сливая внеклеточную часть человеческого 8р35 (остатки 1-532) с шарнирным и Рс-участком человеческого 1дС1, чтобы исследовать биологическую функцию 8р35. Частичную кодирующую последовательность человеческого 8р35 получают с помощью ПЦР из клона 227.2, используя прямой праймер 5' - САССАССТССАСССССССССАТССТСССССССССССТ - 3' (81 А) ГО N0:354) и обратный праймер 5' - САССАССТССАССТССССССССТССТТССССААССАССССССССАССТССАССТССАСС - 3' (81 А) ГО N0:355).
Продукт ПЦР с тупыми концами субклонируют в сайт 8гГ1 вектора РСК 8СК1РТ АМР (8!га!адепе) с целью создания РСК 8СК1РТ АМР-8р35. Фрагмент 8а11 выделяют из РСК 8СК1РТ АМР-8р35 и субклонируют в вектор РСКСАМР 1д (производное вектора 8!га!адепе РСК 8СК1РТ АМР). В вектор РСКСАМР субклонируют шарнирную последовательность и последовательность Рс-γ как фрагмент 8а11(5') Мо11(3'). Фрагмент 8а11 8р35 субклонируют в сайт 8а11 вектора РСКСАМР 1д, тем самым сливая сигнальную последовательность и внеклеточный домен 8р35 (кодоны 1-532) в рамке считывания с последовательностями, кодирующими шарнирный и Рс-участок человеческого 1д1. Идентифицируют корректные изоляты и фрагмент ИоИ, охватывающий фрагмент Рс 8р35 субклонируют в единственный сайт клонирования №11 экспрессирующего вектора СНО, РУ90 (Бюдеп 1йее). Полученную в результате плазмиду подтверждают секвенированием ДНК и называют СТ 123.
Стабильные клеточные линии, экспрессирующие слитый белок 8р35-Рс, генерируют электопорацией клеток-хозяев СНО ЭС44 плазмидой СТ 123. Трансфицированные клетки СНО культивируют в альфа-минус МЕМ в присутствии 10% диализованной сыворотки и 4 мМ глутамина для селекции нуклеозид-независимого роста. Через четырнадцать дней после трансфекции клетки подпитывают свежей средой. Для скрининга клеток, экспрессирующих 8р35-Рс, клетки СНО метят козьим антителом к человеческому 1дС, меченным фикоэритрином (РЕ) (1аск8оп ЬаЬ8) и подвергают сортингу с использованием высокоскоростной проточной цитометрии в приборе РАС8 Мо-Р1о (Су!ота!юп). Отбирают клетки, которые экспрессируют самые высокие уровни 8р35-Рс. Данные клетки размножают в культуре в течение 7 дней, затем повторно метят и проводят повторный сортинг. Клетки, экспрессирующие самые высокие уровни 8р35-Рс, выделяют как индивидуальные клоны в 96-луночных планшетах. Данные клоны выращивают в течение двух недель и затем подпитывают свежими средами за один день до проведения анализа РАС8 с целью проверки уровней экспрессии. Клоны, которые экспрессируют самые высокие уровни 8р35-Рс, размножают и создают банки замороженных клеток. Клеточные линии адаптируют к росту в суспензионной культуре в бессывороточной среде ВСМ16. Титр 8р35-Рс, продуцируемого данными клонами, определяют по росту клеточных линий при 37°С в течение 4-5 пассажей, затем выращивают клетки до 50% максимальной густоты клеток и культивируют их в течение 10-15дней при 28°С, пока густота жизнеспособных клеток не упадет до 75%. В это время собирают культуральную среду, очищают от клеток и дебриса центрифугированием и титруют культуральные супернатанты на уровни 8р35-Рс с помощью анализа вестерн-блот с использованием антитела к человеческому 1д Оаск8оп ЬаЬ) в качестве зонда.
Слитый белок 8р35-Рс очищают из осветленной культуральной среды следующим образом: 9 мл 1 М нЕРЕ8 рН 7,5 добавляют к 900 мл кондиционированной среды. Среду порционно загружают на 3 ч при 4°С на 3 мл белок А-сефарозу (Атегейат Вю8аепсе). Смолу собирают в колонке 1,5 см (Ι.Ό.) и промывают четыре раза 3 мл РВ8, два раза 4 мл РВ8, содержащим 800 мМ №С1, и затем снова 3 мл РВ8. 8р35-Рс элюируют с колонки 25 мМ NаН2Ρ04, рН 2,8 и 100 мМ №С1 во фракциях по 1,5 мл и нейтрализуют добавлением 75 мкл 0,5 М NаН2Ρ04, рН 8,6. Фракции, содержащие пики белка, идентифицируют по поглощению при 280 нм, объединяют и подвергают дальнейшей очистке на колонке с белком А объемом 1 мл. Перед нагрузкой добавляют №·ιθ до 600 мМ и нЕРЕ8, рН 7,5 до 50 мМ. Колонку промывают два раза 600 мкл 10 мМ нЕРЕ8 рН 7,5 и 1 М №·ιθ и затем 1 мл РВ8. 8р35-Рс элюируют с колонки 25 мМ NаН2Ρ04, рН 2,8 и 100 мМ №С1, собирая фракции по 0,5 мл, и нейтрализуют добавлением 25 мкл 0,5 М NаН2Ρ04, рН 8,6. Фракции, содержащие пики белка, идентифицируют по поглощению при 280 нм и объединяют. При восстанавливающем 8Э8-РАСЕ белок 8р35-Рс двигается в виде одной полосы (чистота >95%) при видимой массе 90 кД. В невосстанавливающих условиях белок идет как димер с приблизительной массой 180 кД. Берут аликвоты очищенного белка 8р35-Рс и хранят при -70°С.
Пример 3. Получение специфических в отношении 8р35 моноклональных антител.
Антитела к 8р35, которые специфически связывают полипептид 8р35, соответствующий изобретению, получают, используя следующие способы и процедуры.
А. Анализы антитела путем скрининга.
1. Анализ ЕЫ8А.
8р35-Рс (0,5 мкг в 50 мкл 0,1 М буфера на основе бикарбоната натрия, рН 9,0) добавляют в каждую лунку 96-луночных планшетов Мах18огр™ (Пипс ™). Затем планшеты инкубируют при 37°С в течение 1 ч или при 4°С в течение 16 ч. Центры неспецифического связывания на планшетах блокируют, используя 25 мМ нЕРЕ8, рН 7,4, включающий 0,1% В8А, 0,1% овальбумин, 0,1% (5% (мас./об.) обезжиренного сухого молока в 150 мМ NАСЕ) и 0,001% азид. Разведения сыворотки или супернатантов гибридомы
- 97 020508 (например, серийные трехкратные разведения) добавляют по каждому ряду планшета и инкубируют при 25°С в течение 1 ч. После трехкратного промывания РВ8 в каждую лунку добавляют 50 мкл разведения 1:10000 козьего вторичного антитела к мыши, конъюгированного с пероксидазой хрена Цаскхоп 1ттипоРсхсагск 1пс.) и инкубируют в течение еще 1 ч. После трех промываний проявляют окраску ТМВ (Р1егсе) и блокируют 2 М серной кислотой. Интенсивность окрашивания мониторируют в спектрофотометре при длине волны 450 нм.
2. Анализ РАС8.
Клетки С08-7 или клетки СНО метят 0,1 мкМ Се11Тгаскег™ 0гееп СМРЭА (Мо1еси1аг РгоЬек, Еидепе 0Р), как описано изготовителем. Равные объемы меченных Се11Тгаскег™ контрольных клеток смешивают с промытыми клетками 8р35-С08-7 или клетками 8р35-СН0 (полученным путем временной трансфекции 8р35-экспрессирующим вектором) перед инкубированием с тест-антисывороткой к 8р35 или супернатантами гибридомы. 50 мкл смеси клеток вносят в каждую лунку 96-луночных полистироловых планшетов с У-образным дном (Со§1аг® 3877, Сотшпд, №У) и добавляют 100 мкл мышиной сыворотки, супернатанта гибридомы или контрольного антитела к 8р35. После инкубирования при 4°С в течение 30 мин клетки промывают и инкубируют с 50 мкл конъюгированного с фикоэритрином аффинно чистого фрагмента Р(аЬ')2 Рс гамма-специфического козьего вторичного антитела к мышиному 1д0 (1:200, 1аск§оп ПпшипоРехеагск ЬаЬога!огу, ХУеЧ Сгоуе, РА) в РВ8. В конце инкубирования клетки дважды промывают РВ8 и суспендируют в 200 мкл РВ8, содержащего 1% сыворотку телячьих эмбрионов (РВ8), и подвергают анализам РАС8. Альтернативно, клетки 8р35-С08-7 или клетки 8р35-СН0 смешивают с мышиной сывороткой или супернатантом гибридомы и затем обрабатывают конъюгированным с Р-фикоэриторином вторичным козьим антителом к мыши и непосредственно подвергают стандартному анализу РАС8.
В. Получение с помощью гибридомы мышиных моноклональных антител к 8р35.
Самок мышей РВР в возрасте восьми недель Цасккоп ЬаЬк, Ваг НагЬог, МЕ) иммунизируют внутрибрюшинно эмульсией, содержащей 50 мкг 8р35-Рс (аминокислоты 34-532 8ЕЦ ГО N0:2, слитые с шарнирным и Р-участком человеческого 1д01), полученным, как описано в примере 2, или иммунизируют внутрибрюшинно эмульсией, содержащей 50 мкг человеческого 8р35-Рс и 50 мкл полного адъюванта Фрейнда (81дта® СБетка1 Со., 8ΐ. Ьошк, МО) один раз каждые две недели. Сыворотки иммунизированных мышей собирают перед первой иммунизацией и через 1 неделю после второй и третьей иммунизаций и измеряют титры антитела к 8р35 с помощью анализа РАС8 на 8р35-экспрессирующих клетках С08-7, как описано выше. Бустерную конечную дозу дают после третьей иммунизации и за три дня до того, когда начинают слияния гибридом.
Сыворотки, полученные от мышей, иммунизированных различными пептидами 8р35, подвергают скринингу с помощью ЕЫ8А, как описано выше. Мышей, положительных по антителам, которые специфически связывают экспрессирующие 8р35 клетки С08-7, идентифицируют проточной цитометрией (РАС8), как описано выше, и умерщвляют. У мышей выделяют спленоциты и сливают с миеломой РБ653 (АРРТ-производное мышиной миеломы 1д-/Н0РРТ-Ва1Ь/с, поддерживаемой в ЭМЕМ, содержащей 10% РВ8, 4500 мг/л глюкозы, 4 мМ Ь-глутамин и 20 мг/мл 8-азагуанина), как описано в монографии Мопос1опа1 АпБЬоФек, НуЬпботак: А №ν ЭипегМоп ш Вю1одюа1 Апа1у§е8 (Моноклональные антитела, гибридома - новое измерение в биологических анализах), под ред. КеппеИ, Р.Н., МсКеагп, Т.1. апб ВесШок К.В. №ν Уогк: Р1епит Рге88 (1982). Слитые клетки помещают в 24- или 48-луночные планшеты (Сотшпд 01а88 ^огкк, Сотшпд, №У) и подпитывают средой для культивирования, содержащей аденин, аминоптерин и тимидин (ААТ, доступный в фирме 81дта® СБетка1 Со., 8ΐ. Ьошк, МО). Устойчивые к ААТ культуры подвергают скринингу с помощью ЕЫ8А или проточной цитометрии, как описано выше, в отношении связывания либо с клетками 8р35-С08-7, либо с 8р35-Рс. Положительные гибридомы далее субклонируют путем ограничивающего разведения.
Выделяют семнадцать гибридомных клеточных линий, продуцирующих моноклональные антитела, полученные от мышей, иммунизированных 8р35-Рс. Свойства полученных из гибридом моноклональных антител показаны в табл. 3А и 3В.
Полинуклеотиды, кодирующие вариабельные домены (УН и Уъ) моноклональных антител 1А7, 2Р3, 3РГО10.2С3 и 3Р1Е11.3В7, выделяют посредством ПЦР, клонируют и подвергают анализу последовательности следующим способом. Общую РНК экстрагируют из клеток гибридомы, используя мининабор Цкщеп® РЫеаку®, и генерируют кДНК из выделенной РНК посредством ОТ-ПЦР, используя стандартные условия. Для ОТ-ПЦР используют коктейль праймеров. Предпочтительный набор праймеров включает праймер с 5'-концом праймера, гибридизующегося с сигнальной последовательностью, и 3'-концом праймера, гибридизующегося с константным доменом, находящимся 3' от соединения РР4/константного домена. Это дает возможность амплификации интактного вариабельного домена без неопределенных моментов относительно Юконца моноклонального антитела и соединения У/С. Компетентный специалист в области техники признает, что наборы праймеров должны быть модифицированы для амплификации различных матриц и для различных условий ПЦР. Иногда может случиться наличие большого количества непродуктивной информации (например, СЭР3-РР4, непродуктивной легкой цепи со сдвигом
- 98 020508 рамки считывания из партнера слияния) или неспецифической продуктивной информации и осложнить клонирование вариабельных цепей. Одним из решений является использование данных по Шконцевой последовательности из аутентичного очищенного антитела для создания вырожденного праймера для получения возможности клонирования. Альтернативно, можно использовать универсальные скелетные праймеры, такие как описаны в статье 0г1апй1 е! а1., ΡNΑδ 86:3833 (1989), которые фиксируют N и Сконцы вариабельных доменов (т.е. Шконец РК1 и С-конец РК4 являются праймер-определенными). Кроме того, данные по последовательностям для конструирования более эффективных праймеров можно получить из основной массы продуктов ОТ-ПЦР, которые очищают гель-хроматографией и затем секвенируют. Продукт ПЦР также можно субклонировать, используя, например, набор ТОРО С1ошпд Κί! ^пуйгодеп), затем секвенировать. Данные по последовательностям затем получают из множества независимых субклонов или гель-очищенных фрагментов для точного определения консенсусной последовательности.
Последовательность легкой цепи Р1Е11.3В7 определяют, используя коктейль 5'-праймеров сигнальной последовательности мышиной каппа-легкой цепи: (ί) 5'ΟΟΟΟΑΤΑΤССΑССΑΤΟΟΑΤΤΤΤСΑΟΟΤΟСΑΟΑΤΤΤΤСΑΟ-3' (δΙΤ) ΙΌ N0:356), (ίί) 5'ΟΟΟΟΑΤΑΤССΑССΑΤΟΚΑΟΤСΑСЛΚΑСΥСΑΟΟΤСΤΤΥΚΤΑ-3' (δΗΟ ΙΌ N0:357), (ίίί) 5'ΟΟΟΟΑΤΑΤССΑССΑΤΟΑΑΟΤΤΟССΤΟΤΤΑΟΟСΤΟΤΤΟ-3' (δΗΟ ΙΌ N0:358) и (ΐν) 5'ΟΟΟΟΑΤΑΤССΑССΑΤΟΑΟΟΚССССАΟСΤСΑΟΥΤΥСΤΚΟΟΑ-3' (δΗΟ ΙΌ N0:359), с одним 3'праймером мышиного каппа-константного домена: 5'-ΟСΟΤСΤΑΟΑΑСΤΟΟΑΤΟΟΤΟΟΟΑΟΑΤΟΟΑ-3' (ЬЕО ΙΌ N0:4), где Κ^Α, ^Α^, А=А/Т и Υ=Ο/Έ Полученный в результате продукт ПЦР субклонируют и секвенируют множество независимых субклонов. Выведенная консенсусная последовательность согласуется с данными деградационного секвенирования Эдмана. Секвенирование показывает, что 5'праймер вырожденной сигнальной последовательности 5'ΟΟΟΟΑΤΑΤССΑССΑΤΟΚΑΟΤСΑСЛΚΑСΥСΑΟΟΤСΤΤΥΚΤΑ-3' (δΗΟ ΙΌ N0:357) представляет собой праймер, который дает вариабельный домен легкой цепи 3Р1Е11.3В7 при амплификации.
Последовательность тяжелой цепи 3Р1Е11.3В7 определяют, используя коктейль 5' ПЦР-праймеров сигнальной последовательности мышиной тяжелой цепи: (ί) 5'ΟΟΟΟΑΤΑΤССΑССΑΤΟΟΚΑΤΟδΑΟСΤΟΚΟΤМΑΤδСΤСΤΤ-3' (δΗΟ ΙΌ N0:360) (ίί) 5'ΟΟΟΟΑΤΑΤССΑССΑΤΟΚΑСΤΤСΟΟΟΥΤΟΑΟСΤΚΟΟΤΤΤΤ-3' (δΗΟ ΙΌ N0:361) и (ίίί) 5'ΟΟΟΟΑΤΑΤССΑССΑΤΟΟСΤΟΤСΤΤΟΟΟΟСΤΟСΤСΤΤСΤ-3' (δΗΟ ΙΌ N0:362) с 3'-праймером вырожденного константного домена СН1 мышиного ^1 5'ΑΟΟΤСΤΑΟΑΑΥСΤССΑСΑСΑСΑΟΟΚΚССΑΟΤΟΟΑΤΑΟΑС-3' (δΗΟ ΙΌ N0:363), где К=О/Т, М^С, Κ=Α^ и Υ=0/Γ С помощью ПЦР при использовании данного коктейля праймеров с множеством различных условий циклинга не удается получить последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, в которой выведенный Шконец согласуется с определенной по деградации Эдмана последовательностью очищенного антитела 3Р1Е11.3В7. Вследствие этого авторы используют универсальные праймеры тяжелой цепи: ΡΚΙ 5'-ΑΟΟΤδМЛΚСΤΟСΑΟδΑΟΤСАΟΟ-3' (δΗΟ ΙΌ N0:364) и РК4 5'ΤΟΑΟΟΑΟΑСΟΟΤΟΑССΟΤΟΟΤСССΤΤΟΟССССΑΟ-3' (δΗΟ ΙΌ N0:365), где М^С, К^О, 5=С/О и Α^Α/Γ
Данный набор дает вариабельный домен мышиной тяжелой цепи, выведенная последовательность которого согласуется с эмпирическими данными 3Р1Е11.3В7.
Для проверки того, что N и С-концы вариабельного домена тяжелой цепи аутентичны и не определены праймером, проводят другую реакцию ПЦР с праймером вырожденной сигнальной последовательности 5'-ΑΤΟΟЛΚΤΟΥΑΑΥΤΟΟΑΤΗСΤNССNΤΤΥΑ-3' (δΗΟ ΙΌ N0:366) и вышеупомянутым 3'праймером константного домена 5'-ΑΟΟΤСΤΑΟΑΑΥСΤССΑСΑСΑСΑΟΟΚΚССΑΟΤΟΟΑΤΑΟΑС-3' (ЬЕО ΙΌ N0:367), где Н=А/С/Т, N=Л/С/Ο/Τ, К^/О и Υ=Ο/Γ Конструкция праймера вырожденной сигнальной последовательности основана на сигнальных последовательностях лучших вариантов, выделенных при поиске ΤРΑδΤΑ в базе данных последовательностей грызунов ОепЪапк, запрашиваемых с использованием консенсусной выведенной последовательности РК1 3Р1Е11.3В7 из реакции ПЦР с вышеописанным универсальным праймером. Данная ПЦР дает продукт с полным вариабельным доменом мышиной тяжелой цепи.
Полные мышиные вариабельные домены 3Р1Е11.3В7 используют (с молчащим мутагенезом при необходимости интродуцировать сайты рестрикции) в сочетании с кДНК человеческого ЦО1 и каппаконстантного домена для конструирования химерных кДНК тяжелой и легкой цепей соответственно. кДНК иммуноглобулина полной длины субклонируют в экспрессирующий вектор, названный ρNΕ001, производное коммерческого эписомного экспрессирующего вектора рСЕР4 для клеток млекопитающих на основе ΕΒV. Экспрессирующими векторами тяжелой и легкой цепей (называемые рХА372 и рХА363 соответственно) сотрансфицируют клетки 293-ΕΒNΑ. Анализ вестерн-блот (зондируемый реагентами, специфическими в отношении человеческого ^О) кондиционированной среды временно трансфицированных клеток подтверждает экспрессию химерных 3ΡIΕ11.3Β7-ЬиIдΟI, каппа тЛЪ. Полученные в результате последовательности полипептидов и ν7 3Р1Е11.3В7 показаны в табл. 6 и 8 и представляют собой δΞΟ ΙΌ N0:173 и 209 соответственно. Последовательности тяжелой и легкой цепей для монокло- 99 020508 нальных антител 1А7, 2Р3 и 3Р1Э10.2С3 определяют аналогичными способами.
С. Идентификация моноклональных антител к Зр35 путем представления на фагах.
Фрагменты РаЪ моноклонального антитела к Зр35 идентифицируют и выделяют из библиотек представления на фагах, как описано в статьях Ное!, е! а1., Иа!. Вю!есН. 23:344-348 (2005); КаисЬепЪегдег, е! а1., 1. Вю1. СНет. 278:194-205 (2003) и Кпарр1к, е! а1., 1. Мо1. Вю1. 296:57-86 (2000), все из которых включены в данном контексте в виде ссылки в своей полноте.
Библиотеку представления на фагах РаЪ МогрЬоЗуз НиСАЬ® ООЬЭ (Библиотека представления на фагах-2 в табл. 3В), которая включает вариабельные области гуманизированного синтетического антитела подвергают скринингу в отношении рекомбинантного человеческого растворимого белка Зр35-Рс стандартными способами скрининга ЕЫЗА ΛΝΌ 1НС; см., например, монографию Оз!епйогр, К., РпзсН, С. апФ ИгЪап М, Оепегайоп, епдшеегшд апФ ргойисйоп оГ Нитап апйЪоФез изшд НиСАЬ® (Генерация, конструирование и продукция человеческих антител с использованием НиСАЬ®), т. 2 Иоме1 ТесЬпо1од1ез апФ ТНегареийс Изе (Новые технологии и терапевтическое применение), Ие\у Уогк: К1и^ег АсаФетю/Р1епит 13-52 (2004). Очищены и охарактеризованы РаЪ-фаги, которые специфически связываются с Зр35. Свойства данных фрагментов РаЪ моноклональных антител, выделенных из представления на фагах, показаны в табл. 3В, как моноклональные фрагменты РаЪ, выделенные из библиотеки представления на фагах-2. Выделенный РаЪ-фаг 1968 выбран для дальнейшего анализа.
Пример 4. Иммунопреципитация Зр35 моноклональными антителами к Зр35.
Для проведения иммунопреципитации клетки СОЗ-1, экспрессирующие Зр35, слитые с гемагглютининовой (НА) меткой на Ν-конце, получают путем временной трансфекции клеток СОЗ-1 конструкцией ДНК, которая экспрессирует белок Зр35 полной длины с меткой НА. Клетки собирают через 48 ч после трансфекции и лизируют в 1 мл буфера для лизиса (50 мМ НЕРЕЗ, рН 7,5, 150 мМ ИаС1, 1,5 мМ МдС12, 1 мМ ЕОТА, 1% ТгПоп Х-100 и 10% глицерин) в течение 30 мин при 4°С. После центрифугирования при 14000хд в течение 15 мин супернатанты инкубируют с частицами белок А/О-сефарозы (Зап!а Сги/) при 4°С в течение 1 ч и затем инкубируют при 4°С в течение 1 ч с мышиными моноклональными антителами к Зр35 либо 1А7, либо 2Р3. Частицы промывают 3 раза буфером для лизиса, кипятят в буфере для образцов Леммли, подвергают 4-20% ЗЭЗ-РАОЕ и анализируют вестерн-блоттингом, используя антитело, которое распознает метку НА. Как показано на геле, полученном при ЗЭЗ-РАОЕ, моноклональные антитела 1А7 и 2Р3 иммунопреципитируют человеческий и мышиный Зр35 (см. фиг. 1). Как показано на фиг. 1, моноклональное антитело 2Р3 сильно иммунопреципитирует как человеческий, так и мышиный Зр35, тогда как моноклональное антитело 1А7, которое сильно иммунопреципитирует человеческий Зр35, только слабо распознает мышиный белок Зр35. Аналогично моноклональные антитела 1О7, 2В10, 2Р3, 3Р4С2.2О2, 3Р4С8.2О9, Ы01, Ы03, Ы05, Ы06, Ы07, Ы08, Ы11, Ы12, 7РГО5.1О9 и 3В5.2 иммунопреципитируют человеческий или мышиный либо человеческий и мышиный Зр35 (см. табл. 3В и 3С). Кроме того, Ы08 иммунопреципитирует АР-Зр35 и моноклональные антитела 1В6.4 и 3Е3.1 иммунопреципитируют эндогенный Зр35 (см. табл. 3В).
Пример 5. Специфическое связывание антитела к Зр35 с Зр35 определено посредством ЕЫЗА.
Для того чтобы определить, какие участки полипептида Зр35 связаны различными полученными из гибридом и представления на фагах моноклональных антител, полученных в примере 2, осуществляют анализ ЕЫЗА с использованием панели укороченных полипептидов Зр35, каждый из которых слит с шарнирным и Рс-участками 1дО1 способами, описанными в примере 1. Панель состоит из следующих фрагментов Зр35: аминокислоты 34-425 ЗЕО ГО ИО:2, аминокислоты 417-532 ЗЕО ГО ИО:2, аминокислоты 417-493 ЗЕО ГО ИО:2 и аминокислоты 34-532 ЗЕО ГО ИО:2. В качестве контролей используют овальбумин и ВЗА. Как показано в табл. 3В, все, полученные из гибридомы тАЪз 2Р3, 2В10, 3А3, 3Р4с2.2Ф2 и 3Р4с8.2д9 и полученные из РаЪ-фага тАЪз 3383, 3563, 3564, 3565, 3568, 3569, 3570 и 3582, специфически связываются с фрагментами 1-417 и 1-534 Зр35, позволяя предположить, что данные антитела связываются с эпитопами в области ЬКК Зр35. Полученные из гибридомы МаЪз 1А7, 3Р1В11Р9, 3Р1Э10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 3Р2С63О10.2Н7, 2Р2С9.2О4, 3Р4А6ГО9 и 394С5ГО8 и полученные из РаЪ-фага МаЪз 3495, 3566, 3567 и 1968 специфически связываются с фрагментом 34-532 Зр35 и слабо связываются с 417-532 Зр35, позволяя предположить, что данные антитела, вероятно, связываются с эпитопами, которые, по меньшей мере, включают часть С-конца Зр35 до участка ЬКК. В аналогичных экспериментах данные последние антитела, кроме того, специфически связывают полипептид Зр35, состоящий из аминокислот 34-534 человеческого Зр35, и обладают низкой аффинностью в отношении мышиного и крысиного Зр35. Аффиность данных последних антител в отношении мышиного и крысиного Зр35 восстанавливается до уровня, наблюдаемого при использовании человеческого Зр35, когда аминокислота 419 мышиного или крысиного Зр35 изменена из гистидина (Н) на аргинин (К). Аргинин представляет собой аминокислоту в положении 419 в человеческом Зр35. Кй для моноклонального антитела 1А7, как определяют, составляет 10 нМ (1х10-9 М) для связывания человеческого Зр35 и 20 мкМ (2х10-5 М) для связывания мышиного Зр35. Для ЕЫЗА Ар-Зр35 с целью детекции антител, связанных с участком 417-532, ЕЫЗА проводят следующим образом: МаЪз покрывают планшеты для ЕЫЗА, затем инкубируют либо со слитым белком Зр35-АР при 4°С в течение ночи с последующей обработкой АР-связанным антителом к человеку (Н+Ь)
- 100 020508 (1:5000, .Тасккоп ПптипоКекеагск) при комнатной температуре в течение 1 ч или АР-слитыми белками при 4°С в течение ночи. Субстрат АР потом затем проявляют 10 мг/мл 4ΝΡΡ в 0,1 М глицине, 1 мМ М§С12, 1 мМ ΖπΟ2, рН 10,5 и читают при 0.Ό. (оптической плотности) 405.
В аналогичных экспериментах моноклональные антитела 3В5.2 и 7Р1Э5.1О9, а также фрагмент РаЪ антитела 7Р1Э5.1О9 тестируют в анализах ЕЫ8А на способность связывать человеческий 8р35, полный участок ЬКК 8р35, область Ι§ 8р35 и мышиный 8р35. Как показано в табл. 3С, фрагмент РаЪ 3Β5.2, 7Ρ1Ό5.1Ο9 и 7Ρ1Ό5.1Ο9 связывает человеческий и мышиный 8р35. Моноклональные антитела 3В5.2 и 7Ρ1Ό5.1Ο9 связывают также участок ЬКК 8р35; см табл. 3С.
В анализе связывания 8р35 с моноклональными антителами 3В5.5, фиксированными на дне лунки для тканевой культуры, следующие антитела не блокируют связывание 3В5.2 8р35: Ы03, Ы05, Ы08, Ы011 и фрагмент РаЪ фрагмент Ы013.
Пример 6. Специфическое связывание антитела к 8р35 с 8р35 определено посредством РАС8.
Для дальнейшей характеризации связывающих свойств, полученных из гибридомы тАЪк к 8р35 1А7 и 2Р3, полученных, как описано в примере 3, сравнивают связывание как фиксированных, так и живых клеток С08-7 или 293, экспрессирующих мышиный или человеческий 8р35. Трансфицированные и нетрансфицированные 8р35 клетки фиксируют и подвергают анализу РАС8 (РАС8: клетки, трансфицированные человеческим или мышиным 8р35 контрольным вектором отделяют от планшетов для культивирования, промывают 2% ΡΒ8/ΡΒ8 и инкубируют с первичным антителом к концентрации 1 мкг/мл на льду в течение 1 ч. Клетки промывают 3 раза 2% ΡΒ8/ΡΒ8, затем инкубируют с РЕ-меченным вторичным антителом (1:100, ГОсккопИптипоРекеагск) на льду в течение 30 мин. После двух промываний 2% ΡΒ8/ΡΒ8 клетки фиксируют в 2% ΡРΑ и подвергают анализу РАС8 с РЕ). Результаты, полученные при РАС8, показывают, что МАЪк 1А7 и 2Р3 связываются с клетками С08-7 или 293, экспрессирующими 8р35, но не связываются с контрольными клетками с отсутствием экспрессии 8р35 (см. фиг. 2-5).
В аналогичных экспериментах клетки СНО, стабильно трансфицированные 8р35, используют в анализе РАС8 для дальнейшей характеризации связывающих свойств 3В5.2 и 7Ρ1Ό5.1Ο9. Как показано на фиг. 15, 3В5.2 и 7Ρ1Ό5.1Ο9 связываются с 8р35 на трансфицированных клетках СНО. В частности, антитела 3В5.2 и 7Ρ1Ό5.1Ο9 тестируют на способность связывать клетки СНО, трансфицированные и экспрессирующие человеческий или мышиный 8р35. Как показано на фиг. 15, число клеток, связанных антителами 3В5.2 и 7Ρ1Ό5.1Ο9, как измеряют по средней флуоресценции (МСР), возрастает с концентрацией используемого антитела. Кроме того, антитело 3В5.2 связывает больше клеток, как измерено по средней флуоресценции (МСР), чем 7Ρ1Ό5.1Ο9.
Пример 7. Анализ отрастания невритов.
Для тестирования способности выделенных из гибридомы и выделенных из РаЪ-фага моноклональных антител, полученных выше, к реверсии ингибирующего эффекта ингибиторов миелина ЦНС, например 0Мдр, на нейроны, стекла для культур ЬаЪ-Тек® (4-луночные) покрывают 0,1 мг/мл поли-Όлизином (8щта®). Ар-0Мдр (1 мкг/пятно) или ΡΒ8 наносят пятном в виде капель по 3 мкл. Затем стекла ЬаЪ-Тек® промывают и покрывают 10 мкг/мл ламинина (ΟΛ^™). Ганглии задних корешков (ΌΚΟ'δ) крысят 8ргадие Эа\у1еу Ρ6-7 разъединяют с помощью 1 мг/мл коллагеназы типа 1 (№ог1Ып§1оп), тритурируют проведенными через огонь пастеровскими пипетками, предварительно помещают в планшеты для обогащения клеток нейронов и, наконец, помещают по 10000 клеток/лунку на предварительно покрытые ЬаЪ-Тек® стекла для культур. Сразу после помещения ΌΚΟ добавляют десять мкг/мл тАЪ 1А7 или 2Р3. Средой для культивирования является Р12 (доступная в фирме Ο^Ъсο/1ην^ί^οдеη), содержащая 5% инактивированной нагреванием донорской лошадиной сыворотки, 5% инактивированной нагреванием сыворотки телячьих эмбрионов и 50 нг/мл мышиного фактора роста нервов (тNΟР), инкубируют при 37°С и 5% С02 в течение 6 ч. После инкубирования стекла фиксируют в 4% параформальдегиде/20% сахарозе и окрашивают антителом к бета-Ш-тубулину ТиЛ (Соуапсе) через 16 ч.
В качестве вторичного антитела к стеклам добавляют А1еха-Р1иог® 594 к мыши (Мо1еси1аг Ρ^οЪе8), разведенное 1:300, и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Стекла накрывают покровными стеклами Οе1/Мοиηΐ™ (Бютейа™). 5х цифровые фотографии получают с помощью пакета программ 0репЬаЪ™ Отргслакюп, Шс., Ьехт§1оп, МА) и анализируют фотографии для количественной оценки отрастания невритов, используя пакет программ ΟΡЕN^ΑΒ™, осуществляя все в соответствии со специальными параметрами изготовителя.
Оба МаЪк, 1А7 и 2Р3, защищают нейроны ΌΚΟ от 0М§р-опосредованного ингибирования отрастания невритов (см. фиг. 6). 3В5.2 также защищает нейроны ΌΚΟ от 0Мдр-опосредованного ингибирования отрастания невритов (данные не приводят).
Пример 8. Моноклональное антитело 1А7 способствует функциональному восстановлению на модели повреждения спинного мозга на крысах.
Повреждение спинного мозга ('^СР') вызывают дорсальным полурассечением сверху следующим образом, модифицированным на основании ранее описанных способов (см. статью Ы, 8. е1 а1. ί. Шигокст 24, 10511-10520 (2004)). Анестезированным самкам крыс Ьопд Еуапк (в возрасте 7 недель, СЬаг1е8 Куег) делают предоперационное обезболивание (бупренорфин/бупренекс, 0,05 мг/кг подкожно), дают успокаи- 101 020508 вающее (мидазолам, 2,5 мг/кг внутрибрюшинно) и проводят дорсальное полурассечение в области грудных позвонков 6/7, полностью прерывая основной дорсомедиальный и дорсолатеральный кортикоспинальный путь (СЗТ). Дорсальные и дорсолатеральные компоненты кортикоспинального пути (СЗТ) полностью рассекают и вентральную часть СЗТ оставляют интактной. Мостик вентральной ткани, остающийся после полурассечения, составляет приблизительно 20% спинного мозга в обоих группах, получающих лечение (данные не приводят).
Функцию задней конечности количественно оценивают, используя способ оценки в открытом поле Бассо-Беатти-Бреснаана (ВВВ) (см. статью ЕЪу, М.Т. е! а1., 1. Вю1. Сбет. 275, 15336-15342 (2000), включенную в данном контексте в виде ссылки), и все животные испытывают заметные функциональные недостатки после ЗС1 при почти полном параличе задних конечностей через день после хирургического вмешательства. Сразу после рассечения СЗТ вводят интратекальный катетер в субарахноидное пространство в области Т7 и соединяют его с заправленным миниосмотическим насосом (модель А1/е1 2004, А1/а Согр.), введенным в подкожное пространство. Миниосмотические насосы доставляют контрольный белок изотипа человеческого 1дО (5 мг/мл) или моноклональное антитело 1А7 (4,8 мг/мл), постоянно со скоростью 0,25 мкл/ч в течение 5 недель. Контрольные (леченные человеческим 1дО) животные восстанавливают основную функцию в течение 5 недель в течение эксперимента, но выходят на плато в 3-4 недели, в конечном счете достигая среднего показателя ВВВ 9±0,45 (см. фиг. 11). Напротив, постоянная интратекальная инфузия 1А7 в течение 5 недель после рассекания спинного мозга приводит в результате в существенной степени улучшенным показателям ВВВ относительно контрольных животных к 5 неделям при продолжающемся улучшении функции в интервале времени 2-5 недель, достигая среднего показателя ВВВ 11,1±0,7 (см. фиг. 7). Данные результаты демонстрируют, что лечение моноклональным антителом 1А7 к Зр35 способствует восстановлению функции после повреждения спинного мозга, как продемонстрировано по повышению показателя ВВВ, регенерации аксонов и уменьшенной ретракции аксонов, наблюдаемой при иммуногистохимическом окрашивании аксонов. Антитело 3В5.2 также способствует выздоровлению после повреждения спинного мозга (данные не приводят).
Пример 9. Антитела к Зр35 1А7, 2Р3, 3РГО10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 6Р4Р4.ГО3, 6Р4Р4.1Р9, 7РГО5.1О9, Ы05, Ы06, Ы08, Ы13, Ы28, Ы33, Ό05, Ό08 и 3В5.2 способствуют миелинизации ш убго.
Роль антител к Зр35 1А7 и 2Р3 в миелинизации исследуют ш \бго посредством обработки сокультур нейронов ганглиев задних корешков (ИКО) и олигодендроцитов антителами к Зр35 1А7 и 2Р3 и тестирования миелинизации с помощью иммуногистохимии и вестерн-блоттинга. Для данных исследований необходимо сначала генерировать первичные культуры нейронов ИКО и олигодендроцитов.
Эмбриональные ганглии задних корешков самок крыс Ьопд Еуапв Е14-Е17 культивируют, как описано в статье Р1ап! е! а1., 1. №иговб. 22:6083-91 (2002). Вырезанные ИКОв помещают на покрытые полиЬ-лизином покровные стекла (100 мкг/мл) в течение 2 недель. Клетки инкубируют в присутствии фтордезоксиуридина в дни 2-6 и в среде МбА, содержащей 1хВ27, 100 нг/мл NОР (ОФсо) в дни 8-11.
Олигодендроциты самок крыс Ьопд Еуапв в возрасте 2 дней (Р2) культивируют, как описано в статье Сопп, Ме!б. №иговск 2:1-4 (Асабетю Ргевв; 1990), со следующими модификациями. Вкратце, передний мозг удаляют у крыс Р2 и помещают в холодную среду НВЗЗ (ОФсо). Фрагменты ткани разрезают на кусочки 1 мм и инкубируют при 37°С в течение 15 мин в 0,01% трипсине и 10 мкг/мл ДНКазе. Разделенные клетки помещают на покрытые поли-Ь-лизином колбы для тканевых культур Т75 и выращивают в среде ИМЕМ с добавлением 20% сыворотки телячьих эмбрионов при 37°С в течение 10 дней. А2В5положительные олигодендроциты собирают встряхиванием колб в течение ночи при 200 об/мин при 37°С. Олигодендроциты А2В5 культивируют в течение 7 дней в ИМЕМ (ОФсо), содержащей 25 мМ Όглюкозу, 4 мМ Ь-глутамин, 1 мМ пируват натрия, 50 мкг/мл человеческого апо-трансферрина, 5 мкг/мл бычьего панкреатического инсулина, 30 нМ селенат натрия, 10 нМ гидрокортизона, 10 нМ Ό-биотин, 1 мг/мл ВЗА, 10 нг/мл РОР и РИОР (Рерго1есб). Затем клетки собирают путем трипсинизации. Затем клетки сокультивируют с нейронами ИКО в присутствии или в отсутствие 1, 3, 10 или 30 мкг/мл моноклональных антител к Зр35 1А7 или 2Р3 или отрицательного контрольного антитела в среде НЬА, содержащей 2% сыворотки телячьих эмбрионов, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 100 нг/мл NОР (ОЛсо). Определяют, что эффективная доза для внесения в данном анализе лежит в интервале от 0,1 до 10 мкг/мл в зависимости от антитела. Компетентный специалист в области техники мог бы определить эффективную дозу при использовании анализов, описанных в данном контексте.
Культуральную среду заменяют и различные моноклональные антитела снова добавляют каждые три дня. Через 30 дней при 37°С сокультивируемые клетки окрашивают иммуногистологическим способом окрашивания (ИГХ) на нейрофиламенты антителом к бета-111-тубулину с целью идентификации аксонов или антителом к МВР с целью идентификации олигодендроцитов (см. фиг. 7). Сокультивируемые клетки также лизируют и подвергают анализу вестерн-блот для количественной оценки МВР (см. изображение О фиг. 8). Основываясь на данных анализов ИГХ и вестерн-блота, сокультивируемые клетки, обработанные антителами к Зр35 1А7 и 2Р3, показывают повышенную выживаемость олигодендроцитов и нейронов, повышенное количество пучков аксонов и повышенные количества МВРположительных клеток (см. изображение Р фиг. 8), в 10 раз больше МВР-положительных клеток по срав- 102 020508 нению с культурами, обработанными контрольным антителом.
В аналогичном эксперименте сокультуры олигодендроцитов и ΌΚ0 инкубируют в присутствии или в отсутствие антител к §р35 Ы05 и Ы06 или отрицательного контрольного антитела. Сокультивируемые клетки лизируют и подвергают анализу вестерн-блот, чтобы количественно оценить МВР (см. фиг. 12). Основываясь на данных анализов вестерн-блот, сокультивируемые клетки, обработанные антителами к §р35 Ы05 и Ы06, показывают повышенные количества МВР-положительных клеток, аналогично сокультивируемым клеткам, обработанным 3, 10 и 30 мкг §р35-Рс (ЬШОО-КРс).
В аналогичном эксперименте сокультуры олигодендроцитов и ΌΚ0 инкубируют в присутствии или в отсутствие антител к §р35 3В5.2, 3РЮ10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 6Р4Р4.Ш3, 6Р4Р4.1Р9, 7РШ5.1О9, П08, Ы13, Ы28 и Ы33 и также стимулируют миелинизацию. Аналогично антитела Ό05 и Ό08 полной длины также способствуют миелинизации. Наименьшая эффективная доза антитела 3В5.2 и 7РШ5.1О9, необходимая для стимуляции миелинизации в эксперименте с сокультурой ΌΡΟ, составляет 0,1 мкг/мл.
Кроме того, фрагмент РаЪ 7РШ5.1О9 тестируют в подобном анализе миелинизации ш уйго. Фрагмент РаЪ 7РШ5.1О9 стимулирует миелинизацию в концентрации 1,0 мкг/мл.
Данные результаты показывают, что обработка сокультур ΌΡΟ-олигодендроцитов антителами к §р35 1А7,2Р3, 3РШ10.2С3, 3Р1Е11.3В7, 6Р4Р4.Ш3, 6Р4Р4.1Р9, 7РШ5.1О9, П05, П06, П08, Ш3, П28, Ы33, Ό05, Ό08 и 3В5.2 способствует взаимодействиям зрелый олигодендроцит-аксон и миелинизации по сравнению с сокультурами, обработанными контрольным антителом.
Пример 10. Антитела к §р35 фрагменты РаЪ способствуют выживаемости олигодендроцитов и миелинизации ш νί\Ό.
Взрослых самцов мышей дикого типа С57В1/6 кормят купризоном (0,2% измельченного с перемолотым мышиным кормом по массе) в течение 6 недель, чтобы вызвать демиелинизацию в мозолистом теле, согласно способу, описанному в статье Могс11 Р. с! а1., Мо1 Сс11 №иго8с1. 12:220-7 (1998). Вкратце, моноклональное антитело к §р35 1А7 стереотаксически инъецируют в демиелинизированное мозолистое тело через 2, 2,5 и 3 недели кормления купризоном по способу, описанному ниже. Контрольным мышам стереотаксически инъецируют через такие же интервалы стерилизованную среду, содержащую контрольное антитело. Через 6 недель кормление купризоном заканчивают, мышей возвращают к нормальной диете в течение 2, 4 и 6 недель (только перемолотый мышиный корм), чтобы дать возможность ремиелинизации.
1А7 и контрольные моноклональные антитела доставляют следующим образом. Обработанных купризоном мышей анестезируют кетамином (80 мг/кг массы тела) и ксилазином (10 мг/кг массы тела) и помещают в иммобилизационный аппарат, разработанный для стереотаксической хирургии (Эаззб Кор£ ^йишспЦ). Открывают кожу головы и инъецируют стерильные соединения (1 мкМ в 1 мл нВ§§) односторонне в сильно демиелинизированное мозолистое тело мыши-реципиента дикого типа с помощью шприца Гамильтона объемом 10 мкл, используя стереотаксические координаты 0,7 мм сзади и 0,3 мм сбоку от брегмы на глубину 1,7 мм (см. статью Мс881сг с! а1., РНагтасо1. ВюсНст. ВсНах. 63: 313-18 (1999)). Дополнительным контрольным мышам-реципиентам стереотаксически инъецируют нВ§§, не содержащий соединения. Отверстие в черепе заполняют Ос1£оаш, поле смазывают пенициллином и стрептомицином (01Ъсо) и зашивают рану. Мышей умерщвляют каждую неделю эксперимента после инъекции и из головного мозга удаляют и обрабатывают для проведения молекулярного, биохимического и гистологического анализа.
Животные, получающие лечение антителом к §р35 1А7, показывают повышенную выживаемость зрелых олигодендроцитов (основываясь на окрашивании антителом СС1, см. изображение А на фиг. 9) и миелинизацию аксонов по данным ИГХ с использованием антитела к белку МВР или луксола быстрого синего (см. изображение В на фиг. 9). Антитело СС1 - положительные олигодендроциты количественно оценивают через 4 и 6 недель (см. изображение С на фиг. 9). Данные результаты показывают, что лечение антителом к §р35 1А7 способствует выживаемости зрелых олигодендроцитов и миелинизации аксонов по сравнению с мышами, леченными контрольным антителом. Аналогично у животных, получающих антитело 1А7 или 1 мкг/мл фрагмента РаЪ 7РШ5.1О9 в лизолецитиновой модели демиелинизации, также происходит стимуляция миелинизации аксонов по сравнению с контрольными животными.
Пример 11. Антитело к §р35 1А7 способствует выживаемости клеток ганглиев сетчатки (КОС) на модели рассечения зрительного нерва.
Антитело к §р35 1А7 тестируют на модели рассечения зрительного нерва, в которой исследуют факторы, которые воздействуют на функцию нейронов. В данном исследовании используют молодых самок крыс §ргадис Оа\у1су (§Ό). Правый зрительный нерв каждого животного рассекают внутрглазично в 1,5 мм от диска зрительного нерва. Кусочек гелевой пены, пропитанный 6% Р1иого-ОоИ (РО), наносят на свежерассеченную область непосредственно сзади диска зрительного нерва, чтобы пометить выживающие клетки ганглия сетчатки (КОС8). Животных делят на три группы (п=6 в каждой группе), которые получают либо антитело к §р35 1А7, либо контрольное антитело, либо только РВ§ путем инъекции в стекловидное тело. Объем каждой инъекции в стекловидное тело составляет 4 мкл, тогда как доза каждой инъекции составляет 2 мкг. Инъекции в стекловидное тело проводят сразу после рассечения зрительного нерва.
- 103 020508
Всем животным позволяют выживать в течение 1 недели. За два дня до умерщвления животных левый зрительный нерв каждого животного рассекают и вводят 6% Р0, как описано выше, чтобы пометить жизнеспособные Р0Ск, которые служат внутренним контролем. Животных умерщвляют сверхдозой нембутала и разрезают сетчатки в 4% парафоральдегиде. Делают четыре радиальных разреза, чтобы разделить сетчатки на четыре квадранта (верхний, нижний, носовой и височный). Затем сетчатки повторно фиксируют в том же фиксаторе в течение 1 ч, прежде чем из них монтируют плоский препарат с использованием заливочной среды (ТОако). Предметные стекла исследуют под флуоресцентным микроскопом, используя ультрафиолетовый фильтр (возбуждающая длина волны=330-380 нм). Меченые Р0Ск подсчитывают вдоль срединной линии каждого квадранта, начиная от диска зрительного нерва к периферической границе сетчатки с интервалами 500 мкм при сетке окуляра 200x200 мкм2. Процент выживших Р0Ск, полученный в результате каждого типа лечения, выражают путем сравнения числа выживших Р0Ск в поврежденных глазах с глазами, расположенными на противоположной стороне. Все данные выражают как среднее ± δЕΜ (стандартная ошибка). Статистическую достоверность оценивают однофакторной ΑNОУΑ с последующим повторным Ьос-тестом Таки-Крамера. Разницы считают достоверными для р<0,05. Животные, леченные антителом к δр35 1А7, показывают повышенный уровень выживаемости нейронов (80%) по сравнению с животными, леченными контрольным антителом или ΡВδ, каждое из которых показывает только приблизительно 50% выживаемость нейронов (см. фиг. 10).
Пример 12. Тестирование антител к δр35 на ремиелинизацию на модели разрушения зрительного нерва.
Правый зрительный нерв полностью разрушают хирургическими щипцами № 5 в течение 10 с приблизительно в 1,5 мм позади глазного яблока внутриглазнично непосредственно перед введением 2 мкл моноклонального антитела 1А7, 2Р3, Ы05 и Ы06 в 2 мл путем инъекции в стекловидное тело.
Животные получают вторую инъекцию в стекловидное тело того же препарата через одну неделю после хирургического вмешательства. Через две недели после хирургического вмешательства животным вливают фиксаторы ЕМ, вторично фиксируют и обрабатывают срезы семитином и алтратином. Продольные срезы зрительного нерва окрашивают и готовят для исследования миелина. Миелинизацию проксимальных и дистальных частей разрушенного зрительного нерва сравнивают в различных группах лечения. Животных, леченных δр35-Ρс и 1А7, 2Р3, Ы05 и Ы06, а также соответствующих контрольных животных анализируют на ремиелинизацию в дистальной части зрительного нерва по сравнению с контролями.
Пример 13. Тестирование антител к δр35 на регенерацию аксонов на модели разрушения зрительного нерва.
Правый зрительный нерв разрушают хирургическими щипцами № 5 в течение 10 с приблизительно в 1,5-2 мм позади глазного яблока внутриглазнично непосредственно перед введением 2 мкг моноклонального антитела 1А7 в ΡВδ путем инъекции в стекловидное тело. 4 крыс тестируют с использованием антитела 1А7 и 8 крыс используют в качестве контрольных животных. Животные получают вторую инъекцию в стекловидное тело того же препарата через одну неделю после хирургического вмешательства. За три дня до умерщвления тест-животных (день 11 эксперимента), 2 мл СТВ-Р1ТС инъецируют в стекловидное тело, чтобы пометить антироградные регенерирующие аксоны зрительного нерва. В день 14 после хирургического вмешательства животным делают вливание и повторно фиксируют. Разрешенный зрительный нерв обрабатывают для получения замороженных продольных срезов. Меченные СТВ-РГТС аксоны, которые пересекают область повреждения, подсчитывают как регенерирующие волокна на различных расстояниях после области разрушения. Когда 1А7 инъецируют в глаз, наблюдают регенерацию аксонов до 250 мкм за областью разрушения; см. фиг. 14.
Пример 14. Антитела к δр35 способствуют ремиелинизации и восстановлению зрительного нерва при использовании модели вызываемого М00 ЕАЕ на крысах.
Для данных экспериментов используют модель вызываемого гликопотеином миелина олигодендроцитов (М00) экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) на крысах. Это модель на животных человеческого рассеянного склероза. 50 мкл 200 нг полного адъюванта Фрейнда (СЬопбгех Гпс.) с добавлением 50 мкл 50 мкг М00 в солевом растворе эмульгируют (1:1) и сохраняют на льду до внутрикожной инъекции в основание хвоста каждого животного. Во всех экспериментах используют самок бурых норвежских крыс в возрасте 8-10 недель. Общее наблюдение в области техники показывает, что модель ЕАЕ вызывается приблизительно через 15 дней после инъекции М00. Крыс оценивают по клиническим признакам ЕАЕ. Оцениваемыми признаками являются следующие: степень 0,5, дистальный парез хвоста; степень 1, полный паралич хвоста; степень 1,5, парез хвоста и слабый парез задних конечностей; степень 2,0, односторонний сильный парез задних конечностей; степень 2,5, двусторонний сильный парез задних конечностей; степень 3,0, полный двусторонний паралич задних конечностей; степень 3,5, полный двусторонний паралич задних конечностей и парез одной передней конечности; степень 4, полный паралич (тетраплегия), состояние агонии или смерть. Животные получают лечение после индукции модели ЕАЕ.
мкг/мкл антитела к δр35 (1А7) инъецируют в стекловидное тело в день 15 после индукции М00ЕАЕ. 2 мкг/мкл антитела к δр35, 1А7, инъецируют дополнительно два раза в день 22 и день 28. После
- 104 020508 окончания эксперимента животным делают вливание 4% РРА. Зрительные нервы повторно фиксируют в 1% 0к04, обезвоживают и заключают в эпон. Делают семитиновые срезы (1 мкм) и окрашивают толуидином синим для оценки миелинизации. Зрительные нервы леченых животных сравнивают с нелечеными животными в плане регенерации аксонов и ремиелинизации в зрительном нерве. Все процедуры проводят, следуя протоколу, одобренному комитетом по уходу и использованию животных института ЦАСиС).
Животные, получающие лечение антителом к δр35 1А7, показывают ремиелинизацию и восстановление зрительного нерва по сравнению с нормальными зрительными нервами или животными, которые подвергаются вызываемой М0О ЕАЕ, но не получают лечения (см. фиг. 13). На изображении С фиг. 13 стрелки указывают на миелинизированные аксоны. Животные, получающие антитело, которое распознает домен ΙΙΙ белка О из δ!^ер!ососсик (МОРС21), неспецифическое в отношении δр35, не проявляют признаков ремиелинизации или восстановления зрительного нерва по сравнению с нормальными зрительными нервами или зрительными нервами нелеченых животных (данные не приводят). Антагонистическое антитело к δр35 1А7 способствует ремиелинизации и восстановлению зрительных нервов на модели вызываемого М0О ЕАЕ у крыс (см. фиг. 13).
Пример 15. Тестирование антител к δр35 на стимуляцию ремиелинизации ЦНС при использовании модели вызываемого М0О ЕАЕ на мышах.
ЕАЕ вызывают у смешанной линии мышей 129В6 путем внутрикожной иммунизации (бау 0) 100 мкг белка М0О1-125, эмульгированного полным адъювантом Фрейнда (СРА). Инъецируемый объем составляет 100 мкл/мышь и распределяется на 3 области (ушная раковина, спина и кожа). Эмульсию готовят на основе соотношения объемов 1:1, и она содержит 1 мг/мл М0О1-125 и 2 мг/мл М. !иЬегси1ок1к (штамм Н37Ка, СЬопбгех). Токсин коклюша (200 нг/мышь) вводят внутрибрюшинно во время иммунизации и через 2 дня после нее. Массу тела и клинические показатели ЕАЕ (0=отсутствие клинических признаков; 1=мягкий хвост; 2=слабость задних конечностей, нарушенный рефлекс выпрямления или утиная походка; 3=полный паралич задних конечностей или отсутствующий рефлекс выпрямления; 4=полный паралич задних конечностей при некоторой степени включения передних конечностей; 5=животное полностью парализовано; 6=агония или смерть) регистрируют ежедневно. Все процедуры проводят, следуя протоколу, одобренному комитетом по уходу и использованию животных института ЦАСиС). Животные получают лечение моноклональными антителами 1А7, 2Р3, ЬЮ5 и ЬЮ6 или контрольным антителом в день 0 исследования. Образцы крови берут в различное время на протяжении экспериментов способом ретроорбитального кровопускания. Плазму отделяют от РВМС центрифугированием и фенотипирование клеток осуществляют окрашиванием ΡАСδ. Профилирование гуморального ответа антител к М0О проводят с помощью Ε^IδА, используя подкласс/изотип-специфические тАЬк (РЬагттдеп). В конце каждого эксперимента собирают головной мозг, спинной мозг, зрительные нервы и седалищные нервы после вливания.
Такой же протокол используют, чтобы вызвать ЕАЕ у мышей с выбитым δр35 и особей из приплода. Мыши с выбитым δр35, как правило, показывают более низкий показатель ЕАЕ (1,5) и никаких рецидивов по сравнению с контролем (в течение 45-дневного периода), чем особи из приплода дикого типа (показатель ЕАЕ 3,5).
Животных, леченных δр35-Ρс и 1А7, 2Р3, анализируют на ремиелинизацию по сравнению с контролем.
Меченный Н1к белок М0О1-125 экспрессируют в РюЫа рак!опк, используя индуцируемый доксоциклином промотор Те!0-А0Х1 (М. Ьеуекцие, Ώ. КгикЬшкк1е и К. δύ^^Η, рукопись на стадии подготовки). Внеклеточную кодирующую последовательность (О1у1-О1у125 зрелого белка после удаления сигнальной последовательности) крысиного М0О амплифицируют с помощью ПЦР, используя следующие праймеры:
5’ООООТАТСТСТСОАОААААСАСАОСАТСАТСАТСАТСАТСАТАТСООАСАОТТС
АОАСТОАТАООС 3' (ЗЕО Ю N0:368) и 5'ТТСОСОСССОСТАТТАОССАССОТТО
АТССАОТАСААОСОЗ' (ЗЕО Ю N0:369).
Пример 16. Конструирование варианта 3В5.2.
Следующее представляет собой последовательность аминокислот вариабельной легкой цепи (νί) антитела 3В5.2, СЭКк подчеркнуты и N-связанный сайт гликозилирования выделен жирным шрифтом и двойным подчеркиванием
Οΐνΐ_ΤΟ5ΡΑΙ МЗАЗРОЕКУТ МТСЗАЗЗРУЗ УУНУУУООКЗС
ТЗРКРУУ1_УрТ ЗИЬАЗСУРАР Ε00Ν050Τ5Υ 5Ι_ΤΙ55ΜΕΑΕ раатуусооуу 3ΤΝ РРТ РОСС ΤΚΙ_ΕΙΚ (ЗЕО ΙΡ N0:417).
Чтобы определить, влияет ли на экспрессию антитела 3В5.2 и/или связывание антитела к δр35 удаление сайта гликозилирования, конструируют вариант 3В5.2. В частности, положения КаЬа! позиции 6368 в РК3 подвергают мутации до консенсусной последовательности человеческой и мышиной каппа- 105 020508 легкой цепи δΟδΟδΟ (δΕρ ΙΌ N0:418). Полученная в результате мутантная вариабельная легкая цепь 3В5.2 представляет собой следующее, причем подвергнутые мутации аминокислоты выделены жирным шрифтом и двойным подчеркиванием
Οΐνΐ_ΤΟ5ΡΑΙ ΜδΑδΡΟΕΚνΤ ΜΤΟδΑδδΚνδ ΥνΗννΥΟΟΚδδ ΤδΡΚΡννΐ_ΥρΤ δΝίΑδΟνΡΑΒ ΕδΟδΟδΟΤδΥ δΙ-ΤΙδδΜΕΑΕ ΡΑΑΤΥΥΟΟΟ\ΛΖ δΤΝΡΡΤΕΟΟΟ ΤΚΙ_ΕΙΚ (δΕΟ Ю N0:419).
При тестировании способность обоих, антитела 3В5.2 и варианта антитела 3В5.2, связываться с белком δρ35 одинакова. Кроме того, основываясь на данных по электрофоретической подвижности, предполагают, что вариабельная легкая цепь 3В5.2 гликозилирована, тогда как вариант легкой цепи не гликозилирован. Наконец, уровни экспрессии обоих антител в трансфициованных клетках одинаковы.
Пример 17. Конструирование гуманизированного антитела 1А7. Последовательности легкой и тяжелой цепей 1А7.
Легкая цепь
Тяжелая цепь
101. ΟΤΚΙ-ΕΙΚ (5ЕО Ю N0: 283)
1. ΟνΟίλ/ΟδΟΡΕ Ι,ΚΚΡΟΕΤνΚΙ δϋΚΑδΘΥΤΡΤ ΝΥΟΒΙΝΜ/ΚΟΑ
Р0КС1_КММСМ/ 50
51. ΙΝΤΡΤΟΕΡΤΥΤ ΕΡΡΟΟΡΕΑΕδ |ΕΤδΑδΤ\/ΥΙ_ ΟΡΝΝΙ_ΚΝΕϋΤΑΤΥ
ГСАЯЕОУНР 100
101. ργννοοοττντ νδδ (δΕΟ Ю ΝΟ 170)
Выделено жирным шрифтом и подчеркнуто: остатки СЭК по КаЪа1.
Выделено курсивом и подчеркнуто: остатки СОК по Сйо1Ыа.
Черным фоном выделены канонические остатки.
Нумерацию приводят согласно схеме КаЪа1.
Анализ мышиных вариабельных областей.
Участки, определяющие комплементарность (СОКз), включают остатки, с наибольшей вероятностью связывающие антиген, и они должны быть сохранены в новой форме антитела. СЭКз определяют по последовательности согласно работе КаЪа! е! а1 (1991) δе^иеηсе5 о£ Рго1еш5 о£ 1ттипо1о§юа1 1п1егез1. (Последовательности белков, представляющих иммунологический интерес), 5-е изд., ϋ.δ. Эер1. НеаКй апд Нитап δе^ν^се5. ϋ.δ. Ооу1. Рппйпд ОШсе, которая включена в данном контексте в виде ссылки в своей полноте. СЭКз входят в канонические классы (см. статью Сйо1Ыа, С., Ьезк, А.М., Тгатоп1апо, А., Ьеуй1, М., δт^ίй-О^11, δ.Ι., Ай, О., δΙ'Κ'πΙΪ, δ., Рад1ап, Е.А., Оау1е5, Ό., Тийр, \.К., Со1тап, Р.М., δρΐ^11ΐ, δ., Акап, Р.М. апд РоЦак, КЛ. (1989) №1иге 342:877-883, которая включена в данном контексте в виде ссылки в своей полноте), где ключевые остатки в значительной степени определяют структурную конформацию петли СЭК. Данные остатки почти всегда остаются в новой форме антитела. СЭКз тяжелой и легкой цепи разделяют на канонические классы следующим образом:
Легкая цепь
Тяжелая цепь
10 остатков Класс 1 Н1: 5 остатков Класс 1
7 остатков Класс 1 Н2: 17 остатков Класс 2
9 остатков Класс 1 НЗ: 7 остатков Нет
канонического
Канонические остатки, важные для данных СЭК, указаны в табл. 10.
- 106 020508
Таблица 10
1_1 Класс 1 2(1) 25(А) 30(У) 33 (М) 71 (У)
1_2 Класс 1 48(1) 51 (Т) 52 (5) 64 (6)
1_3 Класс 1 90 (О) 95 (Р)
ΗΙ Класс 1 24(А), 26(0), 27(Р), 29(Е), 34(М), 94 (В)
Н2 Класс 2 52а (Т) 55 (О) 71 (1_)
НЗ Нет канонического класса
Вариабельные легкие и тяжелые цепи сравнивают с консенсусными последовательностями (см. работу КаЬа! е! а1., 1991) последовательностями зародышевой линии (см. статьи Вгеп81п§-Киррег8 I., 2осйег I., ТЫеЬе К., /асИаи н.С. (1997), Сепе. 191 (2): 173-81 и Ма!8ийа Р., 18Йп К., Воигуадпе! Р., Кита К., науа8Ыйа н., М1уа!а Т., 11оп)о Т. (1998) I. Ехр. Мей. 188(11):2151-62, которые включены в виде ссылки в своей полноте) мышиной и человеческой подгрупп, используя программу ВЬА8Т и внутренние сводные базы данных консенсусных последовательностей и последовательностей зародышевой линии белка Ь1а8!.
Вариабельная легкая цепь является членом мышиной подгруппы каппа 6 с идентичностью 94% в перекрывании 109 аминокислот и происходит из мышиной зародышевой линии кк4 (100% ГО) (см. ниже) > тикк4
Запрос: 1 οινιτοδΡΑίΜδΑδΡΟΕκντΜτοδΑδδδνδΥΜΗννγοακδοτδΡΚΒννίΥοτδκίΑδονΡΑΒ αινιτοδΡΑίΜδΑδΡΟΕκντΜτοδΑδδδνδΥΜΗννγοοκδοτδΡΚΒννίΥοτδκι-Αδον
РАВ
Объект: 1
ΟίνίΤΟδΡΑΙΜδΑδΡΟΕΚνΤΜΤΟδΑδδδνδΥΜΗννΥΟΟΚδΟΤδΡΚΒννίΥΟΤδΚΕΑδΟνΡΑΒ
Запрос: 61 ΕδΟδΟδΟΤδΥδΠΊδδΜΕΑΕϋΑΑΤΥΥΟΟΟννδδΝΡ 94 (ЗЕО Ю
N0:451)
ΕδΟδΟδΟΤδΥδί-ΤΙδδΜΕΑΕϋΑΑΤΥΥΟΟΟννδδΝΡ (ЗЕО Ю N0:451)
Объект: 61 ΕδΟδΟδΟΤδΥδΕΠδδΜΕΑΕΟΑΑΤΥΥΟΟΟννδδΝΡ 94 (ЗЕО ю
N0:451)
Вариабельная тяжелая цепь является членом мышиной подгруппы нУМ8 с идентичностью 55% в перекрывании 132 аминокислот и происходит из мышиной зародышевой линии УСК6 (92% ГО) (см. ниже) > тиЛ/ОКб
Запрос : 1
0ν0Εν030ΡΕί_ΚΚΡ0ΕΤνΚΙ30ΚΑ30ΥΤΠ·ΝΥ0ΜΝνννΚ0ΑΡ0Κ0Ι_ΚννΜ0ννΐΝΤ0Τ0
ΕΡΤΥ
Ο+ΟίνΟδΟΡΕΙΚΚΡΟΕΤνΚΙδΟΚΑδΟΥΤΕΤΝΥΟΜΝνννΚΟΑΡΟΚΟΙΚννΜΟννίΝΤ+ΤΟ
ΕΡΤΥ
Объект: 1
0Ι0Εν030ΡΕΕΚΚΡ0ΕΤνΚΙ30ΚΑ30ΥΤΠΉΥ0ΜΝνννΚ0ΑΡ0Κ0Ι_ΚννΜ0ννΐΝΤΕΤ0Ε
ΡΤΥ 60
Запрос: 61 ΤΕΟΕΟΟΒΕΑΕ3Ι_ΕΤ3Α3ΤνΥΙ_ΟΕΝΝΙ.ΚΝΕΟΤΑΤΥΕΟ 96 (ЗЕО Ю
N0:452) + 0Ε+0ΗΕΑΕ3Ι-ΕΤ3Α3Τ ΥΙ_Ο ΝΝΙ_ΚΝΕϋΤΑΤΥΕΟ (ЗЕО Ю N0:453)
Объект: 61 Α00ΕΚ0ΒΕΑΕ3Ι_ΕΤ3Α3ΤΑΥΙ_0ΙΝΝΙ_ΚΝΕϋΤΑΤΥΕ0 96 (ЗЕО Ю
N0:454)
Вариабельная легкая цепь соответствует человеческой подгруппе каппа 3 с идентичностью 67% в
- 107 020508 перекрывании 109 аминокислот и является наиболее близкой к человеческой зародышевой линии Б6 (64% К)) (см. ниже) > Ни1_6
Запрос: 1 О I V Ι.Τ О 3 Ρ А I М 3 А 3 Р С Е К УТ Μ Т С δ А 5 5 3 V 5 ΥΜΗννΥΟΟΚδΟΤδΡΚΗννίΥϋΤδΚΕΑδΟνΡΑ 59
ΉνυΤΟδΡΑ +δ ЗРОЕ+ Т++С Αδ δνδ Υ+ \Λ/ΥΟΟΚ О +Ρ+ ΙΥϋ δ Α+Ο+ΡΑ
Объект: 1
ΕΐνΐΤ03ΡΑΤΙ_3Ι_3Ρ0ΕΑΑΤΙ_30ΑΑ303ν33ΥΕΑννΥ00ΚΡ00ΑΡΡΙΙ_Ι_ΙΥ0Α3ΝΑΑΤ0ΙΡΑ
Запрос: 60 ΡίΡδΟδΟδΟΤδΥδί-ΤΙδδΜΕΑΕϋΑΑΤΥΥΟΟΟννδδΝΡ 94 (δΕΟ Ю N0:455)
ΑΡδΟδΟδΟΤ ++Ι_ΤΙδδ+Ε Εϋ Α ΥΥΟΟΟ δ+ Ρ (δΕΟ Ю N0:456)
Объект: 61 ΑΡδΟδΟδΟΤΟΡΤΙ_ΤΙδδΙ_ΕΡΕΟΡΑνΥΥΟΟΟΑδΝν\/Ρ 95 (δΕΟ Ю
N0:457)
Вариабельная тяжелая цепь соответствует человеческой подгруппе МНУ1 с идентичностью 59% в перекрывании 129 аминокислот и является наиболее близкой к человеческой зародышевой линии ЕиУН7-81 (70% ГО) (см. ниже) > НиУН7-81
Запрос: 1
0ν0Ι_ν050ΡΕΙ_ΚΚΡ0ΕΤνΚΙ50ΚΑ50ΥΤΡΤΝΥ0ΜΝ\/\/νΚ0ΑΡ0Κ01-ΚννΜ0ννΐΝΤ0Τ0
ΕΡΤΥ
0ν0Ι_ν056ί Ε+Κ+ΡΟ+νΚ+δΟΚΑδΟΥ+ΡΤΥΟΜΝνννΟΑΡΟ+ΟΙ+ννΜΟννΝΤΤΟ ΡΤΥ
Объект: 1
0ν0ΐν0δΘΗΕνΚ0ΡαΑδνκνδ0ΚΑδαΥδπΤΥΘΜΝνννΡ0ΑΡΘ0ΘΙ_Εννΐ\/ΐαννΡΝΤΥΤ
ΟΝ ΡΤΥ 60
Запрос: 61 ΤΕΟΡΟΟΒΡΑΡδΙ_ΕΤδΑδΤνΥΙ_ΟΡΝΝΙ_ΚΝΕϋΤΑΤΥΡΟΑΗ 98 (δΕΟ ГО
ΝΟ: 458) + Ρ ΟΒΡ Ρδ++ΤδΑδΤ ΥΙ_Ο ++1_Κ Εϋ Α Υ+САВ (δΕΟ ГО N0:459)
Объект: 61 ΑΟΟΡΤΟΒΡνΡδΜΟΤδΑδΤΑΥΙ_ΟΙδδΙ_ΚΑΕϋΜΑΜΥΥΟΑΒ 98 (5ΕΟ Ю N0:460)
Моделирование структуры вариабельных областей.
Для данной гуманизации строят модель вариабельных областей Р1А7, основываясь на кристаллических структурах антител 0КТ3 (РБВ ЕБ 18Υ6 используют для моделирования легкой цепи) и ТЕ33 (РБВ ЕБ ΙΤΗΤ используют для моделирования тяжелой цепи).
Анализ вариабельных областей измененной формы.
Авторы делают попытку найти наиболее близкие последовательности человеческих экспрессируемых антител, для которых не требуются обратные мутации в положениях (Б4, 38, 43, 44, 58, 62, 65-69, 73, 85, 98 и Н2, 4, 36, 39, 43, 45, 69, 70, 74, 92) (см., например, патент США № 6407213, который включен в виде ссылки в своей полноте), и использовать их в качестве скелетов антител. Используют базу данных внутренне излеченных последовательностей антител и инструменты запроса для идентификации подходящих матриц, которые имеют самую высокую степень близости к мышиным последовательностям Р1А7 в остатках канонических, пограничных и маскирующих зон для минимизации числа обратных мутаций. Последовательности зародышевой линии, заполненные консенсусными остатками на участке РК4, рассматривают отдельно. После рассмотрения множества скелетов последовательности зародышевой линии ЕиБ6 и УН7-81 выбирают как акцепторные скелеты для тяжелой и легкой цепей соответственно. Конструируют три варианта вариабельной легкой цепи измененной формы и три варианта вариабельной тяжелой цепи измененной формы. Первый вариант включает минимальное число обратных мутаций и третий вариант включает наибольшее число (т.е., по меньшей мере, гуманизировано).
Обратные мутации в УЕ измененной формы.
ЕиБ6.
Е1р. Точка 01 в отношении антигена и изменения заряда может изменить связывание. Присутствует в варианте 2 и 3.
Б46К. К46 представляет собой необычный остаток на границе УН/Уь который поддерживает СБК- 108 020508
Ь1 и СЭР-н3. Присутствует во всех вариантах.
Ρ47Ψ-Ψ47 находится в кластере ниже СЭР-Р2. Присутствует только в варианте 3.
158У-У58 находится в кластере ниже СЭР-Р2. Присутствует только в варианте 3.
Ρ71Υ-Υ71 представляет собой канонический остаток для поддержки СЭР-Ы и СПР-Ь3. Присутствует во всех вариантах.
Обратные мутации в Ун измененной формы ЬиУн7-81.
Р38К. К38 поддерживает СЭР-Ш. Присутствует в вариантах 2 и 3.
Е46К. К46 поддерживает СЭР-Ш. Присутствует в вариантах 2 и 3.
М71Ь. Ь71 представляет собой канонический остаток, поддерживающий СЭР-Ш. Присутствует во всех вариантах.
А78У. У78 получен гипермутацией из зародышевой линии А и поддерживает СЭР-Ш.
Г82Р. Р82 представляет собой остаток упаковки кора. Присутствует только в варианте 3.
Υ91Ρ. Р91 представляет собой остаток на границе Ун/Уц. Присутствует только в варианте 3. Конструкции гуманизации для Р1А7.
Скелет, взятый из последовательностей: легкая цепь: ЬиР6, тяжелая цепь: ЬиУн7-81, обратные мутации показаны строчными буквами жирным шрифтом.
СЭРз подчеркнуты, >вариант легкой цепи 1
Е1У1_ТО8РАТ1_81-8РОЕРАТ1_8С5А588У8УМНУУУООКРСОАРВг1_1 ΥΡΤ3Κ1-Α80ΙΡΑΡ
Р365650ТРуТ1_Т135[-ЕРЕРРАУУУС00УУ53МРГТГС00ТКУЕ1К (ЗЕО ΙΡ N0:430) >вариант легкой цепи 2 а! У1_ТО5РА~П.31.8РСЕРАТ1_5С5А535У5УМНУУУООКРСОАРВг11УРТ8К1-А8(д1РАВ
Ρ505050ΤΡνΤΙ_ΤΙ331-ΕΡΕΡΡΑνΥΥ000\Λ/38ΝΡΡΤΡΘ00ΤΚνΕΙΚ (ЗЕО ΙΡ N0:431) >вариант легкой цепи 3 а1У1.Т05РАТ1_51_5Р0ЕКАТ1-5С5А555У5УМНУУУ00КР00АРКпл/1УРТ5К1_А5(ЗуРАК
Ρ50305ΘΤΡνΤΙ_ΤΙ53ί.ΕΡΕΡΡΑνΥΥ000\/ν55ΝΡΡΤΡ000ΤΚνΕΙΚ(5Ε0 ΙΡ N0:471) >вариант тяжелой цепи 1
0ν0ί-ν030ΗΕνΚ0Ρ0Α8νκν80ΚΑ80ΥΤΓΤΝΥ0ΜΝνννΡ0ΑΡ000Ι_ΕννΜ0ννΐΝΤΡΤ0ΕΡΤΥ
ТЕРРОСРРУР51РТ5А5ТуУ1_О1551_КАЕРМАМУУСАРЕОУНРРУ\/УООСТ1_УТУ55(5ЕО1Р N0:472) >вариант тяжелой цепи 2 θνθΙ.νθ50ΗΕνΚΟΡΟΑ5νκν50ΚΑ50ΥΤΕΤΝΥΟΜΝνννΚΟΑΡΟΟΟΙ.ΚννΜθννΐΝΤΡΤΟΕΡΤΥ
ΤΕΡΓ00ΚΕνΕ5ΙΡΤ3Α5ΤνΥΙ_0Ι55Ι_ΚΑΕΡΜΑΜΥΥ0ΑΚΕ0νΗΕΡΥνν000ΤΙ_ντν55(5Ε01ΡΝ0:432) >вариант тяжелой цепи 3
0ν0ί-ν05(3ΗΕνΚ0ΡΘΑ5νΚν50ΚΑ50ΥΤΕΤΝΥ0ΜΝνννΚ0ΑΡ0001_ΚννΜ0ννΐΝΤΡΤ(3ΕΡΤΥ
ТЕРР0СРРУР51РТ5А5ТуУ1_0Т551_КАЕРМАМУГСАРЕ0УНРРУУУС00Т1_УТУ55 (ЗЕО ΙΡ N0:473)
Последовательность полипептида и полинуклеотида полной длины тяжелой цепи для тяжелого варианта 2.
Последовательность ДНК тяжелой цепи ЬиР1А7-ГдОГ н2 (рХ^465).
атооастооа сстеоАоеет сттстостте стоостотао сассаоотос ссастсссао отссаастсс тасастстос асассасстс ааосаосстс
101 оассатсаот саасстстсс тссаасссст стссстатас сттсасааас
151 ΤΑΤΟΟΑΑΤΟΑ АСТ000Т0АА 0СА00СТССТ ООАСААООТТ ΤΑΑΑΟΤΟΟΑΤ
201 ОееСТООАТА аасасссаса стосасаосс аасататаст саасатттсс
251 АОООАСССТТ ТСТСТТСТСТ ТТССАСАССТ СТОССАОСАС ТОТТТАТТТО
301 САСАТСАССА СССТСАААСС ТСАССАСАТС ССААТОТАТТ АСТОТССААО
351 АОАСООООТС САСТТТОАСТ АСТССССССА АОООАСССТТ ОТСАССОТСТ
- 109 020508
401 сстсассстс сассаасссс ссатссстст тссссстеес АСССТССТСС
451 ААСАССАССТ СТССССССАС АСССССССТС СССТСССТСС ТСААССАСТА
501 СТТСССССАА ССССТСАССС ТСТССТССАА СТСАСССССС СТСАССАССС
551 СССТССАСАС сттессссст стсстасаст ССТСАССАСТ СТАСТСССТС
601 АССАСССТСС ТСАСССТССС стссассасс ттссссассс асасстасат
651 СТССААССТС ААТСАСААСС ССАССААСАС СААССТССАС ААСАААСТТС
701 АССССАААТС ТТСТСАСААС АСТСАСАСАТ ССССАСССТС СССАССАССТ
751 СААСТССТСС ССССАСССТС АСТСТТССТС ТТССССССАА ААСССААССА
801 САСССТСАТС АТСТСССССА ССССТСАССТ САСАТ6ССТ6 СТбСТбСАСС
851 ТСАСССАССА АСАСССТСАС СТСААСТТСА АСТССТАССТ ССАСОСССТС
901 ОАООТОСАТА АТСССААСАС АААССССССС САССАССАСТ АСААСАССАС
951 етАСсетете стсассстсс тсассстсст ссассаосас тссстсаатс
1001 ССААССАСТА САА0Т6САА6 СТСТССААСА ААССССТССС А6СССССАТС
1051 САСААААССА ТСТССАААСС САААССССАС СССССАСААС САСАССТСТА
1101 САСССТСССС ССАТСССОСС АТОАССТОАС СААСААССАС СТСАСССТСА
1151 ССТСССТССТ САААСССТТС ТАТСССА6С6 АСАТСССССТ ССАСТСССАС
1201 АССААтееес асссссасаа саастасаас ассасссстс ссететтесА
1251 СТСССАСССС ТССТТСТТСС ТСТАСАССАА ССТСАСССТС САСААСАССА
1301 ССТСССАССА ССССААССТС ТТСТСАТССТ СССТСАТССА ТСАСССТСТС
1351 САСААССАСТ АСАСССАСАА САСССТСТСС СТСТСТСССС СТТСА (ЗЕО ГО N0:461)
Предсказанная последовательность белка тяжелой цепи НиР1А7 Н2 (сигнальная последовательность подчеркнута)
МРУУТУУВУРСЬ ЬАУАРСАНЗО УОЬУОЗСНЕУ КОРСА5УКУ5 ΟΚΑδΟΥΤΡΤΝ
Υ6ΜΝνννΚΩΑΡ 0001_КУУМ0УУ1 ΝΤ0Τ6ΕΡΤΥΤ ЕРР06ВРУР5 ШТЗАЗТУУ!.
101 ΟΙ55Ι.ΚΑΕΡΜ АМУУСАРЕСУ НРРУМООСТЬ УТУ35А5ТКС РЗУРРЬАРЗЗ
151 КЗТЗОСТААБ ССЬУКРУРРЕ РУТУЗМЫЗСА ЬТЗСУНТРРА УЮЗЗСЬУЗЬ
201 ЗЗМТУРЗЗЗ ΙΌΤΟΤΥΙΟΝν ΝΗΚΡδΝΤΚνϋ ККУЕРКЗСРК ТНТСРРСРАР
251 ЕПССРЗУП РРРКРКРТЬМ 13РТРЕУТСУ \ЛГОУЗНЕРРЕ УКРММУУРСУ
301 ЕУНЫАКТКРР ЕЕОУЫЗТУРУ У5У1_ТУ1_НСЮ \Λ/Ι_Ν(3ΚΕΥΚΟΚ ν5ΝΚΑΙ_ΡΑΡΙ
351 ΕΚΤΙ5ΚΑΚΟΟ РРЕРОУУНР Ρ5ΒΡΕΙ_ΤΚΝΟ У51_ТС1_УК6Р УР5Р1АУЕ\Л/Е
401 3ΝΟΟΡΕΝΝΥΚ ТТРРУШЗРС ЗЕПУЗКИУ ϋΚδρννοοοΝν РЗСЗУМНЕАЬ
451 ΗΝΗΥΤΟΚ51.5 1_5РС* (ЗЕО ГО N0:462)
Последовательность полипептида и полинуклеотида полной длины тяжелой цепи для легкого варианта 1.
Последовательность ДНК каппа-легкой цепи НиР1А7 Р-1 (рХШ480)
АТ66АТТТТС А06ТТСА6АТ ТТТСА6СТТС СТССТААТСА СТСССТСАСТ
САТААТАТСС А6АС6А6ААА ТТ6ТТСТСАС ССАСТСТССА ССААССТТСТ
101 СТТТАТСТСС АССССАСАСА СССАССТТСТ ССТССАСТСС СА6СТСАА6Т
151 6ТАА6ТТАСА ТССАСТССТА ССАССАСААС ССАССССААС СССССАСААС
201 АСТ6АТТТАТ САСАСАТССА ААСТСССТТС Т66ААТСССТ ССТСССТТСА
251 етеесАСтсс стстсссасс саттасастс тсассатсас сассттссас
301 ССТСААСАТТ ТСССССТТТА ТТАСТСССАС САСТССАСТА СТААСССАТТ
351 САсеттсеес сассссасаа асстссааат аааасстасс стссстссас
401 САТСТСТСТТ САТСТТСССС ССАТСТСАТС АССАСТТСАА АТСТССААСТ
451 СССТСТСТТС ТСТСССТССТ 6ААТААСТТС ТАТСССАСАС АССССАААСТ
501 АСАСТССААС СТССАТААСС СССТССААТС СССТААСТСС СА66АСАСТ6
551 ТСАСАСАССА ССАСАССААС САСАССАССТ АСАСССТСАС САССАСССТС
601 АСССТСАССА ААССАСАСТА ССАСАААСАС АААСТСТАСС ССТСССААСТ
651 САСССАТСАС ССССТСАССТ ССССССТСАС ААА6А6СТТС ААСАССС6А6
701 А6Т6ТТАС (ЗЕО ГО N0:463)
- 110 020508
Предсказанная последовательность легкой цепи НиР1А7 Ь1 (сигнальная последовательность подчеркнута)
МРРОУО1РЗР Ш5А5У115 РОЕ1У1_ТО5Р АТ1_51_5РОЕР АТ1_ЗС5АЗЗЗ
У5УМН\Л/УООК ΡΟΟΑΡΡΡΙ_ΙΥ ΡΤ5ΚΙ.Α56ΙΡ ΑΡΡ5Θ5Ο5ΘΤ ΡΥΤΠΊ551.Ε
101 РЕРРАУУУСО (ЖЗЗЫРРТРС 06ТКУЕКРТ УААРЗУР1РР Ρ5ΡΕΟΙ_Κ5ΟΤ
151 Α3ννθΙ±ΝΝΡ УРРЕАКУОМК УДНКЮЗСЫЗ ОЕЗУТЕОРЗК РЗТУЗЬЗЗТЬ
201 ТЬЗКАОУЕКН КУУАСЕУТНО С1_55РУТК5Р ΝΡΟΕΟ* (ЗЕО Ю N0:464)
Последовательность полипептида и полинуклеотида полной длины тяжелой цепи для легкого варианта 2.
Последовательность ДНК каппа-легкой цепи НиР1А7 Ь2 φΧν476)
АТ66АТТТТС АССТТСАСАТ ТТТСАОСТТС СТОСТААТСА СТСССТСАСТ
САТААТАТСС АСАССАСААА ТТСТТСТСАС ССАСТСТССА ССААССТТСТ
101 СТТТАТСТСС АССССАСАСА СССАССТТСТ ССТССАСТСС САССТСААСТ
151 СТААСТТАСА ТССАСТССТА ССАССАСААС ССАССССААС СССССАСААС
201 АСТСАТТТАТ САСАСАТССА ААСТСССТТС ТССААТСССТ ССТСССТТСА
251 ОТСССАСТСС СТСТСССАСС САТТАСАСТС ТСАССАТСАС САССТТССАС
301 ССТОААСАТТ ТСССССТТТА ТТАСТСССАС САСТССАСТА СТААСССАТТ
351 САССТТСССС САССССАСАА АССТССАААТ ААААССТАСС СТСССТССАС
401 САТСТСТСТТ САТСТТСССС ССАТСТСАТС АССАСТТСАА АТСТССААСТ
451 ссстстсттс тетссстест саатаасттс татсссасас ассссаааст
501 АСАСТССААС СТССАТААСС СССТССААТС СССТААСТСС САССАСАСТС
551 ТСАСАОАССА ССАСАССААС САСАССАССТ АСАСССТСАС САССАСССТС
601 АСССТСАССА ААССАСАСТА ССАСАААСАС АААСТСТАСС ССТСССААСТ
651 САСССАТСАС ССССТСАССТ ССССССТСАС АААСАССТТС ААСАССССАС
701 АСТСТТАС (5Е0 Βϋ N0:465)
Предсказанная последовательность белка легкой цепи НиР1А7 Ь2 (сигнальная последовательность подчеркнута)
МРРОУО1РЗР Ш5АЗУН5 Р601УЬТ03Р АТЬЗЬЗРеЕР АТЬЗСЗАЗЗЗ
У5УМН\Л/УООК РООАРРРИУ РТЗКЬАЗе1Р ΑΡΡ3Ο363ΟΤ РУТ1Л1551_Е
101 РЕРРАУУУСО 0νν33ΝΡΡΤΡΘ 06ТКУЕ1КРТ УААР5УР1РР Р5РЕО1.КЗСТ
151 Α3νν0Ι_Ι_ΝΝΡ УРРЕАКУОМК УДНКЮЗеЫЗ ОЕЗ УТЕОРЗК РЗТУЗЬЗЗТЬ 201 ТЬЗКАРУЕКН КУУАСЕУТНО СЬЗЗРУТКЗР ΝΡΟΕΟ* (ЗЕО ΙΡ ΝΟΝΟ:466)
Последовательность полипептида и полинуклеотида тяжелой и легкой цепи из мышиного и человеческого химерного антитела 1А7 следующая.
Последовательность ДНК каппа-легкой цепи сЬР1А7 (рЕАО2110)
АТССАТТТТС АССТССАСАТ ТТТСАОСТТС СТОСТААТСА СТСССТСАСТ
САТААТАТСС АСАССАСААА ТТСТТСТСАС ССАСТСТССА ССААТСАТСТ
101 стссатстсс ассссасаас стсассатса ССТССАСТСС САССТСААСТ
151 СТААСТТАСА ТССАСТССТА ССАССАСААС ТСА66САССТ СССССААААС
201 АТССАТТТАТ САСАСАТССА ААСТ66СТТС Т66А6ТСССТ ССТСССТТСА
251 етеесАстее стстсссасс тсттастстс тсасаатсас сассатссас
301 ССТСААСАТС СТСССАСТТА ТТАСТСССАС САСТССАСТА СТААСССАТТ
351 САССТТСССС ТСССССАСАА АСТТССАААТ ААААССТАСС СТСССТССАС
401 САТСТСТСТТ САТСТТСССС ССАТСТСАТС АССАСТТСАА АТСТССААСТ
451 СССТСТСТТС ТСТСССТССТ СААТААСТТС ТАТСССАСАС АССССАААСТ
501 АСАСТССААС СТССАТААСС СССТССААТС СССТААСТСС САССАСАСТС
551 ТСАСАОАССА ССАСАССААС САСАССАССТ АСАСССТСАС САССАСССТС
601 АСССТСАССА ААССАСАСТА ССАСАААСАС АААСТСТАСС ССТСССААСТ
651 САСССАТСАС ССССТСАССТ ССССССТСАС АААСАССТТС ААСАССССАС
701 АСТСТТАС (ЗЕО ГО N0:467)
- 111 020508
Предсказанная последовательность белка легкой цепи сЬР1А7 (сигнальная последовательность подчеркнута)
М0РОУО1Р5Р Ш5А8УН5 ΡΟΟΐνΐ.ΤΟ3Ρ А1М5АЗРСЕК УТМТС5А535 νδΥΜΗννγοοκ δοτδρκκννιγ отзкьазсур аррзсзсзст 3Υ3πί33ΜΕ
ΑΕϋΑΑΤΥΥΟΟ СМ/ЗЗЫРРТРС ЗСТКЬЕ1КРТ УААР5УР7РР Ρ5ϋΕΟΙ_Κ5ΟΤ
151 Α5\Λ/0Ι_Ι_ΝΝΡ УРРЕАКУОМК УДНКЮЗбМЗ ОЕЗУТЕСЮЗК 03ΤΥ3Ι.33ΤΙ 201 Τ1.3ΚΑΟΥΕΚΗ ΚνΥΑΟΕνΤΗΟ СЬЗЗРУТКЗР ЫРСЕС* (ЗЕО Ю N0:468)
Последовательность ДНК тяжелой цепи сЬР1А7 НсИдСИ (рЕАО2112)
АТССАСТееА сстбсдееет сттстссттс стссстстас сассасстсс
ССАСТСССАС СТССААСТСС ТАСАСТСТСС АССТСАССТС ААСААСССТС
101 САСАСАСАСТ СААСАТСТСС ТССААССССТ СТСОСТАТАС СТТСАСАААС
151 ТАТССААТСА АСТС66ТСАА ССАСССТССА ОСАААСССТТ ТАААСТССАТ
201 ОееСТСОАТА аасассоаса стосасаосс аасататаст оааоатттсс
251 АСССАСССТТ ТСССТТСТСТ ТТССАААССТ СТСССАССАС ТСТТТАТТТС
301 САСТТСААСА АССТСААААА ТСАССАСАСС ОСТАСАТАТТ ТСТСТССААО
351 АСАСССССТС САСТТТеАСТ АСТС6ССССА АСССАССАСС 6ТСАСС6ТСТ
401 ССТСАСССТС САССААСССС ССАТСССТСТ ТСССССТССС АСССТССТСС
451 ААСАССАССТ СТССССССАС АСССССССТС СССТСССТСС ТСААССАСТА
501 СТТСССССАА ССССТСАССС ТСТССТССАА СТСАСССССС СТОАССАССС
551 СССТССАСАС СТТССССССТ ОТССТАСАСТ ССТСАССАСТ СТАСТСССТС
601 АССАСССТСС ТСАСС0Т6СС СТССАССАСС ТТОСеСАССС АСАССТАСАТ
651 СТССААССТС ААТСАСААСС ССАССААСАС СААССТССАС ААСАААСТТС
701 АССССАААТС ТТСТСАСААС АСТСАСАСАТ ССССАСССТС СССАССАССТ
751 СААСТССТСС ССССАСССТС АСТСТТССТС ТТССССССАА ААСССААССА
801 САСССТСАТО АТСТСССОСА ССССТСАССТ САСАТССОТС СТССТССАСС
851 ТСАСССАССА АСАСССТСАС ОТСААОТТСА АСТССТАССТ бОАССССОТе
901 САССТССАТА АТСССААОАС АААССССССС сассассаст асаасассас
951 СТАСССТСТС СТСАСССТСС ТСАСССТССТ ССАССАССАС ТСССТСААТС
1001 ССААССАСТА СААСТССААС СТСТССААСА ААССССТССС АОСССССАТС
1051 6А6ААААССА ТСТССАААСС САААССССАС СССССАСААС САСАССТСТА
1Ю1 сассстсссс ссАтсссеее атоаостоас сааоаассао отсаосстса
1151 сстесстоет сааасосттс татсссассс асатссссст ссастсссас
1201 АССААТСССС АСССОСАСАА СААСТАСААС АССАССССТС СССТСТТССА
1251 СТСССАССОС ТССТТСТТСС ТСТАСАССАА ССТСАСССТС САСААСАССА
1301 66Т66СА6СА ССССААССТС ТТСТСАТССТ СССТСАТССА ТСАСССТСТС
1351 САСААССАСТ АСАСССАСАА САСССТСТСС СТ6ТСТССС6 СТТСА (ЗЕО Ю N0:469)
Предсказанная последовательность белка тяжелой цепи сЬР1А7 (сигнальная последовательность подчеркнута)
МРУУТУУРУРСЬ ЬАУАРОАНЗО УО1_УО5СРЕ1_ ККРСЕТУК13 СКАЗСУТРТЫ
ΥΘΜΝνννΚΟΑΡ СКС1_К\Л/МОУУ1 ΝΤΡΤΟΕΡΤΥΤ ЕРРОСРРАРЗ Ι_ΕΤ3Α5ΤνΥΙ_
101 ΟΡΝΝίΚΝΕΡΤ АТУРСАРЕСУ ΗΡΡΥννΟΟΟΤΤ УТУЗЗАЗТКС РЗУРРЬАРЗЗ
151 КЗТЗССТААЬ ΟΟΙ_νΚΡΥΡΡΕ Ρντν3\Λ/Ν3ΟΑ ЬТЗСУНТРРА νΐ_Ο53ΟΙ_Υ51201 35νντνΡ333 Ι,ΟΤΟΤΥΙΟΝν ΝΗΚΡδΝΤΚνϋ ККУЕРКЗСОК ТНТСРРСРАР
251 ЕПСеРЗУП ΡΡΡΚΡΚΟΤΙ.Μ 15РТРЕУТСУ ννϋνδΗΕϋΡΕ νΚΡΝννΥνϋΟν
301 ΕνΗΝΑΚΤΚΡΡ ΕΕΟΥΝδΤΥΡν УЗУЬТУЬНОР ννΐ,ΝΟΚΕΥΚΟΚ νδΝΚΑί,ΡΑΡΙ
351 ЕКТ13КАКС0 РРЕРОУУТЬР Ρ5ΡΟΕΙΤΚΝΟ УЗЬТСБУКСР УРЗО1АУЕ\Л/Е
401 3ΝΟΟΡΕΝΝΥΚ ТТРРУЮЗОС ЗРРЬУЗКкТУ ΟΚδΡννΟΟΟΝν РЗСЗУМНЕАЬ
451 ΗΝΗΥΤΟΚδίδ Ι.5Ρ6* (ЗЕО Ю N0:470)
Пример 18. Повторное конструирование 1.133^2 для снижения эффекторной функции, гликирования и агрегации.
Осуществляют различные мутации в Ы33 с целью потенциального снижения эффекторной функции, гликирования и агрегации. Определяют эффект каждой из данных мутаций на экспрессию белка, растворимость, активность антитела в анализе сокультуры олигодендроцитов-ЭКО и гликирования или
- 112 020508 связывания СБ32. Результаты суммируют ниже в табл. 11.
Таблица 11
Повторное конструирование ΡΙ33Ι«2
Эффекторная функция Экспрес- сируемая конструк- ция Раствори- мость (мг/мл) 1С50 связывания СЭ32 (мкг/мл) Анализ активнос- ти (сокульту- ра)
1_|221д2\лЛ Υ > 20 4,3 +
Эффекторная функция Экспрес- сируемая конструк- ция Раствори- мость (мг/мл) 1С50 связывания СЭ32 (мкг/мл) Анализ активнос- ти (сокульту- ра)
Ы331д2 ад1у Υ 0,3 25 +
и331д2 В|па1 Υ > 5 9,5 +
Ы331д2 ΡϋΙ_ Υ 5,8 > 100 +
Ы331д2 ΑΙθχϊοη ип0ег\л/ау НО НО
Гликирование Экспрес- Раствори- % Анализ
сируемая мость гликирова- активнос-
конструк- ция (мг/мл) ния ти (сокульту- ра)
изз\лд Υ > 20 25 +
Ы331д2 РЭЬ Υ 5,8 15(5) +
Ы331д2 ΡϋΙ_νν94Θ Υ НО >2
Ы331д2 РО1_\Л/94У Υ НО <2 +
- 113 020508
Эффекторная функция Экспрес- сируемая конструк- ция Раствори- мость (мг/мл) 1С50 связывания СЭ32 (мкг/мл) Анализ активнос- ти (сокульту- ра)
1_1331д2 ΡϋΙ_\/ν94Ο Υ НО <2
Ы331д2 Ρϋ1_νν93Ν Υ НО <2
Ы331д2 ΡϋΙ_Κ93Π Υ 0,4 <2 +
Агрегация Экспрес- сируемая конструк- ция Раствори- мость (мг/мл) % гликирова- ния Анализ активнос- ти (сокультур а)
и331д1а94У 157Р Υ НО НО +
и331д1а94У 1575 Υ НО НО +
и331д1а94У 157Т Υ но но
- 114 020508
Эффекторная функция Экспрес- сируемая конструк- ция Раствори- мость (мг/мл) 1С50 связывания СЭ32 (мкг/мл) Анализ активнос- ти (сокульту- ра)
и331д1а94У 157У Υ НО НО +
и331д2РР1_94У 1573 Υ но НО +
1_|331д2РО1_94У 157А Υ но НО +
и331д2РО1_94У \л/юзо Υ НО НО
1_|331д2РР1_94У М103А Υ НО НО
и331д2РР1_94У 1030578 Υ но <2 +
1_|331д2РР1_94У ЮЗО57А Υ но <2 +
- не определяют
Пример 19. Конструирование варианта Ы81.
Антитело Ы81 представляет собой аффино зрелый вариант антитела Ы13. Агликозилированный вариант антитела Ы81 создают изменением одной аминокислоты в последовательности тяжелой цепи Ы81. Следующее представляет собой последовательность аминокислот вариабельной тяжелой цепи (УН) агликозилированного варианта.
М0тМШУРС1-ЬАУАРаАНЗЕУ01_1_Е5ССС1_У0РСС51-В1_5САА5С π ЕЗАУЕМКУУУВОАРС КС 1ЕУУУЗУ1СРЗССГТРУАРЗУКС в ГТ I ЗВ Р
Ν3ΚΝΤΙΥΕΟΜΝ51ΒΑΕΡΤΑνΥΥΟΑΤΕΟΡΝΡΑΡΡΐννθΟΘΤΤντν55Α
5ТКСР5УРРЬАР55К5Т5ССТАА1_СС1_УКРУРРЕРУТУЗММ5СА1_Т5С νΗΤΡΡΑνΐ_055ΘΙ_Υ51_55νντνΡ555Ι_0Τ0ΤΥΙ0ΝνΝΗΚΡ5ΝΤΚνΡΚΚ
УЕРК5СРКТНТСРРСРАРЕЫССР5УР1ЕРРКРКРТ1М13ВТРЕУТСУУ
УРУ5НЕРРЕУКРЫ\/\/УУРСУЕУНМАКТКРВЕЕОУЫ5АУВ\/У5У1_ТУ1_
Η0Ρν\/1_ΝΘΚΕΥΚ0Κν5ΝΚΑΙ_ΡΑΡΙΕΚΤΙ5ΚΑΚ00ΡΒΕΡ0νΥΤΙ_ΡΡ5ΒΡΕ
Ι_ΤΚΝ0ν5Ι_Τ0Ι_νΚΘΡΥΡ5ΡΙΑνΕννΕ5Ν00ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΐ_Ρ5Ρ05ΡΕ
Ι_Υ5ΚΙΤνΡΚ5Β\Λ/ΟΟΟΝνΕ5Ο5νΜΗΕΑΙ_ΗΝΗΥΤΟΚ5Ι_5Ι_5ΡΟ (ЗЕО ΙΡ
ΝΟ: 474)
Лидерная последовательность (первые 19 аминокислоты), которая не будет присутствовать в зрелом белке, показана жирным шрифтом и СЭКЗз подчеркнуты. Замена одной аминокислоты по сравнению с последовательностью вариабельной тяжелой цепи Ы81 (ЗЕр ГО ΝΘ: 433) показана жирным шрифтом и двойным подчеркиванием. Следующее представляет собой последовательность нуклеотидов вариабельной тяжелой цепи (УН) агликозилированного варианта.
- 115 020508 (ЗААСТАСААТТСТТАСАеТСТССТССССеТСТТСТТСАСССТССТС
СТТСТТТАССТСТТТСТТОСССТССТТССССАТТСАСТТТСТСТССТТ
АССАСАТСААСТСССТТССССААССТССТССТАААССТТТОСАОТ
СССТТТСТСТТАТСССТССТТСТеСТООСТТТАСТТТТТАТССТСАС
ТСССТТАААССТСССТТСАСТАТСТСТАСАСАСААСТСТААСААТА
СТСТСТАСТТОСАСАТСААСАССТТААОСССТОАССАСАССССССТ
СТАТТАСТСТОСААСАСАСССТСАТААТСАТССТТТТСАТАТСТСС еСССААСССАССАСССТСАСССТСТСААбССССТССАССААСеСС
ССАТСОСТСТТСССССТСССАСССТССТССААОАССАССТСТСООО
ССАСАСССССССТССССТСССТССТСААССАСТАСТТСССССААСС
СОТСАСССТСТССТССААСТСАСОСССССТСАССАССССССТеСА
САССТТССССОСТСТССТАСАСТССТСАССАСТСТАСТСССТСАСС
АСССТССТСАСССТССССТССАССАССТТССССАСССАСАССТАС
АТСТССААССТСААТСАСААССССАССААСАССААССТССАСААС
АААСТТСАССССАААТСТТСТСАСААСАСТСАСАСАТССССАССеТ
ССССАССАССТСААСТССТССССССАСССТСАСТСТТССТСТТССС
СССААААСССААССАСАСССТСАТ6АТСТСССССАССССТСАССТС
АСАТСССТССТССТССАССТСАСССАССААСАСССТСАСОТСААС
ТТСААСТССТАССТССАССОССТССАССТССАТААТСССААСАСА
ААССССССеСАбСАССАСТАСААСАеССССТАСССТеТССТСАСС
СТССТСАССОТССТОСАССАССАСТСССТСААТСССААССАСТАС
ААСТОСААОСТСТССААСАААССССТСССАОСССССАТССАСААА
АССАТСТССАААСССАААССССАССССССАСААССАСАССТСТАС
АСССТССССССАТССССССАТСАССТСАССААСААССАССТСАСС
СТСАССТ6ССТССТСАААСССТТСТАТСССА0ССАСАТСССССТСС
АОТСССАОАОСААТОСССАССССОАСААСААСТАСААСАССАСО
ССТССССТСТТСОАСТССОАССОСТССТТСТТССТСТАСАССААССТ
САССОТОСАСААСАССАССТСССАССАССОСААССТСТТСТСАТС
СТСССТСАТССАТСАСССТСТССАСААССАСТАСАСеСАСААСАС
ССТСТСССТСТСТСССССТТСАССАТСССТСССССС (5Е0 Ю N0:450).
Настоящее изобретение не следует ограничивать в объеме описанными специфическими вариантами осуществления, которые предназначены для отдельных иллюстраций характерных аспектов изобретения, и любые композиции или способы, которые являются функционально эквивалентными, входят в объем данного изобретения. В действительности различные модификации изобретения в дополнение к показанным и описанным в данном контексте станут очевидными для компетентных специалистов в области техники из предшествующего описания и сопровождающих чертежей. Предусматривают, что данные модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Все публикации и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены в данном контексте в виде ссылки в той же самой степени, как если бы для каждой отдельной публикации или патентной заявки было специально и отдельно указано, что она включена в виде ссылки.
- 116 020508
Перечень последовательностей < 110> Байоджен Айдек эМЭй Инк.
< 120> Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (варианты), выделенный полинуклеотид (варианты), выделенный полипептид (варианты), клетка-хозяин, композиция (варианты) и способ лечения заболеваний или нарушений цнс животного организма (варианты) <130> 2159.128РС01 <150> И8 60/879,324 <151> 2007-01-09 <160> 474 <170> Ра1еп11п Версия 3.3 <210> 1 <211> 1845 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 1
аРдсРддсдд ддддсдрдад дадсаЬдссс адсссссРсс РддссРдсРд дсадсссаРс 60
сЕссСдсЬдд СдсСдддсСс адЬдсРдРса ддсРсддсса сдддсСдссс дссссдсЬдс 120
дадЬдсРссд сссаддассд сдсРдЕдсРд Рдссассдса ададсСРСдР ддсадРсссс 180
дадддсаРсс ссассдадас дсдссРдсСд дассРаддса адаасадсаС саааасдсЕс 240
аассаддасд адЕЪсдссад сРСсссдсас сСддаддадс РддадсРсаа сдадаасаРс 300
дЕдадсдссд Еддадасадд сдссССсаас аассСсСРса ассЕссддас дсЬдддСсСс 360
сдсадсаасс дасЬдаадаС саСсссдсСа ддадРсЬЬаа сСддссСсад саассЬдасс 420
аадсрддаса Раадададаа саадаРЪдЬР аРасРдаЕдд асРасаРдСР РсаддассЕд 480
СасаассСса адСсасРдда ддСРддсдас ааЕдассСсд РсРасаСсРс Рсассдсдсс 540
РРсадсддсс РсаасадссЬ ддадсадсСд аадсРддада ааЬдаааасЪ дассРссаСс 600
сссассдадд сдсЬдРссса ссСдсасддс сЬсаРсдСсс РдаддсЕссд дсассРсаас 660
аРаааЕдаса РаадддасРа сРссРРсаад аддсРсСасс дасРсааддР сСЕддадаСс 720
РсссасРддс ссЕасРРдда сассаРдаса сссаасРдсс РсЪасддссР саассЬдасд 780
РсссЪдЪсса ЕсасасасРд сааСсСдасс дсЕдРдсссР ассРддссдР ссдссассРа 840
дРсРаксРсс дсЕРссРсаа ссЕсСссЕас аассссабса дсассаРСда дддсЕссаРд 900
РЬдааЬдада ЕдсРссддсЕ дсаддадаЬс садсЕддРдд дадддсадаР ддссдЬддЬд 960
дадассЬаСд ссЕРссдсдд ссСсаасРас сСдсдсдЬдс ЪсааСдСсРс Рддсаассад 1020
сРдассасас СддаддааРс адСсЬЬссас РсддРдддса ассСддадас асРсаЬссСд 1080
дасРссаасс сдсРддссРд адасСдРадд сРссСдЬддд СдРРссддсд ссдсРддсдд 1140
- 117 020508
сРсаасРРса ассддсадса дсссасдРдс дссасдсссд адРРРдРсса дддсааддад 1200
РРсааддасР РсссРдаРдР дсРасРдссс аасРасРРса ссРдссдссд сдсссдсаРс 1260
сдддассдса аддсссадса ддрдрррдрд дасдадддсс асасддрдса дрррдрдрдс 1320
сдддссдаРд дсдасссдсс дсссдссаРс сРсРддсРсР сассссдааа дсассРддРс 1380
Рсадссаада дсааРдддсд дсРсасадРс РРсссРдаРд дсасдсРдда ддРдсдсРас 1440
дсссаддРас аддасаасдд сасдРассРд РдсаРсдсдд ссаасдсддд сддсаасдас 1500
РссаРдсссд сссассРдса РдРдсдсадс РасРсдсссд асРддсссса Рсадсссаас 1560
аадассРРсд сРРРсаРсРс саассадссд ддсдадддад аддссаасад сасссдсдсс 1620
асРдРдссРР РссссРРсда саРсаадасс сРсаРсаРсд ссассассаР дддсРРсаРс 1680
РсРРРссРдд дсдРсдРссР сРРсРдссРд дРдсРдсРдР РРсРсРддад ссддддсаад 1740
ддсаасасаа адсасаасаР сдадаРсдад РаРдРдсссс дааадРсдда сдсаддсаРс 1800
адсРссдссд асдсдссссд саадРРсаас аРдаадаРда РаРда 1845
<210> 2 <211> 614 <212> ΠΡΤ <213> Ното зар1еп8
<400> 2
МеР Ьеи А1а С1у С1у Уа1 Агд Зег МеР Рго Зег Рго Ьеи Ьеи А1а Суз
1 5 10 15
Тгр О1п Рго Не Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи С1у Зег Уа1 Ьеи Зег <31у Зег
20 25 30
А1а ТНг О1у Суз Рго Рго Агд Суз <31и Суз Зег А1а С1п Азр Агд АЬа
35 40 45
Уа1 Ьеи Суз Нтз Агд Ьуз Агд РНе Уа1 А1а Уа1 Рго С1и С1у 11е Рго
50 55 60
ТНг О1и ТНг Агд Ьеи Ьеи Азр Ьеи С1у Ьуз Азп Агд 11е Ьуз ТНг Ьеи
65 70 75 80
Азп С1п Азр С1и РНе А1а Зег РНе Рго Нтз Ьеи С1и <31и Ьеи С1и Ьеи
85 90 95
Азп С1и Азп 11е Уа1 Зег А1а Уа1 61и Рго С1у А1а РНе Азп Азп Ьеи
100 105 110
РНе Азп Ьеи Агд ТНг Ьеи С1у Ьеи Агд Зег Азп Агд Ьеи Ьуз Ьеи Х1е
115 120 125
118
Рго Ьеи 01у Уа1 РЬе ТЬг О1у
130 135
Зег С1и Азп Ьуз Не Уа1 11е
145 150
Туг Азп Ьеи Ьуз Зег Ьеи С1и
165
Зег Нхз Агд А1а РЬе Зег С1у
180
С1и Ьуз Суз Азп Ьеи ТЬг Зег
195
Нхз О1у Ьеи 11е Уа1 Ьеи Агд
210 215
Агд Азр Туг Зег РЬе Ьуз Агд
225 230
Зег Нхз Тгр Рго Туг Ьеи Азр
245
Ьеи Азп Ьеи ТЬг Зег Ьеи Зег
260
Рго Туг Ьеи А1а А7а1 Агд Нтз
275
Зег Туг Азп Рго 11е Зег ТЬг
290 295
Ьеи Агд Ьеи О1п <31и 11е О1п
305 310
С1и Рго Туг А1а РЬе Агд О1у
325
Зег С1у Азп С1п Ьеи ТЬг ТЬг
340 <31у Азп Ьеи О1и ТЬг Ьеи 11е
355
Суз Агд Ьеи Ьеи Тгр Уа1 РЬе
370 375
Агд <31п <31п Рго ТЬг Суз А1а
385 390
Ьеи Зег Азп
Ьеи Ьеи Азр
Уа1 О1у Азр
170
Ьеи Азп Зег
185
Не Рго ТЬг
200
Ьеи Агд Нхз
Ьеи Туг Агд
ТЬг МеЕ ТЬг
250
Не ТЬг Нхз
265
Ьеи Уа1 Туг
280
Не <31и С1у
Ьеи Уа1 О1у
Ьеи Азп Туг
330
Ьеи С1и С1и
345
Ьеи Азр Зег
360
Агд Агд Агд
ТЬг Рго С1и
Ьеи ТЬг Ьуз
140
Туг МеЕ РЬе
155
Азп Азр Ьеи
Ьеи С1и С1п
С1и А1а Ьеи
205
Ьеи Азп 11е
220
Ьеи Ьуз Уа1
235
Рго Азп Суз
Суз Азп Ьеи
Ьеи Агд РЬе
285
Зег МеЕ Ьеи
300
С1у С1п Ьеи
315
Ьеи Агд Ή
Зег Уа1 РЬе
Азп Рго Ьеи
365
Тгр Агд Ьеи
380
РЬе Уа1 С1п
395
Ьеи Азр Не
Θΐη Азр Ьеи
160
Уа1 Туг Не
175
Ьеи ТЬг Ьеи
190
Зег Нхз Ьеи
Азп А1а Не
Ьеи <31и Не
240
Ьеи Туг С1у
255
ТЬг А1а Уа1
270
Ьеи Азп Ьеи
Нхз <31и Ьеи
А1а Уа1 Уа1
320
Ьеи Азп Уа1
335
Нхз Зег Уа1
350
А1а Суз Азр
Азп РЬе Азп
О1у Ьуз О1и
400
- 119 020508
РНе Ьуз Азр РНе Рго Азр 405 Уа1 Ьеи Ьеи Рго Азп Туг РНе ТНг Суз Агд
410 415
Агд А1а Агд Не Агд Азр Агд Ьуз А1а О1п С1п Уа1 РНе Уа1 Азр С1и
420 425 430
О1у НХЗ ТНг Уа1 СЯп РНе Уа1 Суз Агд А1а Азр СЯу Азр Рго Рго Рго
435 440 445
А1а Не Ьеи Тгр Ьеи Зег Рго Агд Ьуз Нхз Ьеи Уа1 Зег А1а Ьуз Зег
450 455 460
Азп О1у Агд Ьеи ТНг Уа1 РНе Рго Азр С1у ТНг Ьеи О1и Уа1 Агд Туг
465 470 475 480
А1а Θΐη Уа1 61п Азр Азп <31у ТНг Туг Ьеи Суз Не А1а А1а Азп А1а
485 490 495
С1у СЯу Азп Азр Зег МеР Рго А1а Нхз Ьеи Нхз Уа1 Агд Зег Туг Зег
500 505 510
Рго Азр Тгр Рго Нхз С1п Рго Азп Ьуз ТНг РНе А1а РНе Не Зег Азп
515 520 525
С1п Рго С1у О1и 61у 61и А1а Азп Зег ТНг Агд А1а ТНг Уа1 Рго РНе
530 535 540
Рго РНе Азр Не Ьуз ТНг Ьеи Не Не А1а ТНг ТНг Мер С1у РНе Не
545 550 555 560
Зег РНе Ьеи СЯу Уа1 Уа1 Ьеи РНе Суз Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи РНе Ьеи Тгр
565 570 575
Зег Агд СЯу Ьуз О1у Азп ТНг Ьуз Нхз Азп Не <31и Не С1и Туг Уа1
580 585 590
Рго Агд Ьуз Зег Азр А1а С1у Не Зег Зег А1а Азр А1а Рго Агд Ьуз
595 600 605
РНе Азп МеЬ Ьуз Мер Не
610 <210> 3 <211> 6 <212> ПРТ <213> Ното зар1еп8 <400> 3
- 120 020508
МеС С1п Уа1 Зег Ьуз Агд
5 <210> 4 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для определения легкой цепи Р1Е11.3В7 <400> 4 дсдНсНадаа сНддаНддНд ддадаНдда 29 <210> 5 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ШО, которая кодирует УН-СО К.1 <400> 5 асССасссСа СддСС 15 <210> 6 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы1О, которая кодирует УН-СОК1 <400> 6
ТНг Туг Рго МеН Уа1
5 <210> 7 <211> 51 <212> ДНК
- 121 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬПО, которая кодирует УН-СКП2 <400> 7
ЬддаРсддРс сЬРсЬддЬдд сдРРасЬдсР РаСдсСдасС ссдССааадд Ь 51 <210> 8 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ШО, которая кодирует УН-СИ К2 <400> 8
Тгр Не О1у Рго Зег С1у С1у Уа1 ТЬг А1а Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
О1у <210> 9 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ШО, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 9 сссЬаСадса дЬддсРддЬд ддасРРсдаС еРс 33 <210> 10 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ШО, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 10
- 122 020508
Рго Туг Зег Зег С1у Тгр Тгр Азр РЬе Азр Ьеи
10 <210> 11 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО7, которая кодирует УН-СИК1 <400>11 аЬдЬасЬЬЬа ЬдддЬ 15 <210> 12 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО7, которая кодирует УН-СИК1 <400> 12
Мер Туг РЬе Мер О1у
5 <210> 13 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО7, которая кодирует УН-СОК2 <400> 13
ЬсЬаЬсЬсЬс сЬЬсЬддЬдд сЬЬЬасЬЬсЬ ЬаЬдсЬдасЬ ссдЬЬааадд Ь 51 <210> 14 <211> 17 <212> ПРТ
- 123 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО7, которая кодирует УН-СОК2 <400> 14
Зег Не Зег Рго Зег С1у О1у РНе ТНг Зег Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 15 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО7, которая кодирует УН-СОКЗ <400> 15 даНсддсаНд сННННдаНаН с 21 <210> 16 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО7, которая кодирует УН-СОК.З <400> 16
Азр Агд Ηί3 А1а РНе Азр 11е
5 <210> 17 <211> 14 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО5, которая кодирует УН-СОКЛ
- 124 020508 <400> 17 сЬСасдсСаС дддс 14 <210> 18 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО5, которая кодирует УН-СЭК.1 <400> 18
А1а Туг А1а МеС С1у
5 <210> 19 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО5, которая кодирует УН-СОК2 <400> 19
РсРаСсдССС сЪСсСддРдд сСаЬасСдаС ЬаСдсСдасС ссдСЬааадд С 51 <210> 20 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО5, которая кодирует УН-СОК2 <400> 20
Зег Не Уа1 Зег Зег <31у О1у Туг ТНг Азр Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 21
- 125 020508 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО5, которая кодирует УН-СОКЗ <400> 21 дадддНдасс аНааНдсННН НдаНаНс 27 <210> 22 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО5, которая кодирует УН-СОКЗ <400> 22
С1и 01у Азр Нтз Азп А1а РНе Азр Не
5 <210> 23 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬШ, которая кодирует УН-СОК1 <400> 23
НсННасдсНа НдНаН 15 <210> 24 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 126 020508 <223> Синтетическая последовательность из антитела ЬШ, которая кодирует УН-СПК1 <400> 24
Зег Туг А1а МеН Туг
5 <210> 25 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬШ, которая кодирует УН-СИК2 <400> 25 есЬаЬсЬсеа сННсНддНдд сНаНасНддН НаНдсЬдасН ссдННааадд Н 51 <210> 26 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬШ, которая кодирует УН-СИК2 <400> 26
Зег Не Зег ТНг Зег <31у О1у Туг ТНг С1у Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 27 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬШ, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 27 даНассадсд аНааНдасНа сНасНасаНд дасдНс 36
- 127 020508 <210> 28 <211> 12 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы11, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 28
Азр ТНг Зег Азр Азп Азр Туг Туг Туг МеЕ Азр Уа1
10 15 <210> 29 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО1, которая кодирует УН-СИК1 <400> 29 аадЕассада ЕдасЕ 15 <210> 30 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО1, которая кодирует УН-СИК1 <400> 30
Ьуз Туг Οίη МеЕ ТНг
5 <210> 31 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 128 020508 <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО1, которая кодирует УН-СЭК2 <400> 31
ЬсЬаЬсЬаЬс сЬЬсЬддЬдд сааЬасЬдЬЬ ЬаЪдсЬдасЬ ссдЬЬааадд Ь 51 <210> 32 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО1, которая кодирует УН-СИ К.2 <400> 32
Зег Не Туг Рго Зег С1у С1у Азп ТЬг Уа1 Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 33 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО1, которая кодирует УН-СИ КЗ <400> 33 дддасЬасад аддсадЬсЬЬ ЬдасЬсс 27 <210> 34 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО1, которая кодирует УН-СБКЗ <400> 34
О1у ТЬг ТЬг С1и А1а Уа1 РЬе Азр Туг
- 129 020508
5 <210> 35 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы12, которая кодирует УН-СОК.1 <400> 35 садНасааНа НдННН 15 <210> 36 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы12, которая кодирует УН-СЭЯ1 <400> 36 <31п Туг Азп Мер РНе
5 <210> 37 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы12, которая кодирует УН-СОК2 <400> 37 сдНаНсНсНН сННсНддНдд саНдасНаНд НаНдсНдасН ссдННааадд Н 51 <210> 38 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 130 020508 <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела П12, которая кодирует УН-СПК2 <400> 38
Агд 11е Бег Зег Зег С1у <31у МеН ТНг МеН Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15 <31у <210> 39 <211> 69 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ц12, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 39 даадсдННас ддссННаННд НадНддНддН адсНдсНасН ссдасНасНа сНасНасддН 60 аНддасдНс 69 <210> 40 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 012, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 40
С1и А1а Ьеи Агд Рго Туг Суз Зег С1у С1у Зег Суз Туг Зег Азр Туг
10 15
Туг Туг Туг С1у МеН Азр Уа1 <210> 41 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 131 020508 <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО6, которая кодирует УН-СОК1 <400> 41 дадНасссНа НддаН 15 <210> 42 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1406, которая кодирует УН-СОК.1 <400> 42
О1и Туг Рго МеЕ Азр
5 <210> 43 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1406, которая кодирует УН-СОК2 <400> 43
ЕсЕаЕсЕаЕЕ сЕЕсЕддЕдд сЕсНасЕдЕЬ ЕаНдсЕдасЕ ссаЕЕааадд Е 51 <210> 44 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1406, которая кодирует УН-СОК2 <400> 44
Зег 11е Туг Зег Зег С1у С1у Зег ТНг Уа1 Туг А1а Азр Зег 11е Ьуз
10 15
- 132 020508
С1у <210> 45 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1лО6, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 45 дадддНдасН сНдаНдсННН НдаНаНс 27 <210> 46 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬЮ6, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 46
С1и С1у Азр Зег Азр А1а РНе Азр Не
5 <210> 47 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО8, которая кодирует УН-СИК1 <400> 47 саННасдада НддНН 15 <210> 48 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 133 020508 <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО8, которая кодирует УН-СРК.1 <400> 48
НЬз Туг С1и МеЬ Уа1
5 <210> 49 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1408, которая кодирует УН-СРК2 <400> 49
ЬсЬаЬссдЬЬ сЬЬсЬддЬдд сдсЬасЬаад ЬаЪдсЪдасЬ ссдЬЬааадд С 51 <210> 50 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО8, которая кодирует УН-СРК2 <400> 50
Зег Не Агд Зег Зег С1у С1у А1а ТНг Ьуз Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 51 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО8, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 51
- 134 020508 дадЕсдссад асдасЕасЕЕ ЕдасЕсс 27 <210> 52 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО8, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 52
О1и Зег Рго Азр Азр Туг РНе Азр Туг
5 <210> 53 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫОЗ, которая кодирует УН-СИК1 <400> 53 садЕасссЕа Еддад 15 <210> 54 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫОЗ, которая кодирует УН-СИК1 <400> 54
О1п Туг Рго МеЕ О1и
5 <210> 55 <211> 51 <212> ДНК
- 135 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ПОЗ, которая кодирует УН-СОК2 <400> 55 ддЕаЕсЕаЕс сЕЕсЕддЕдд сЕсЕасЕдЕЕ ЕаЕдсЕдасЕ ссдЕЕааадд Е 51 <210> 56 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ПОЗ, которая кодирует УН-СОК2 <400> 56
О1у Не Туг Рго Зег <31у О1у Зег ТЬг Уа1 Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 57 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ПОЗ, которая кодирует УН-СОК.З <400> 57 дсддддсадЕ ддсЕддддда сЕЕЕдасЕсс 30 <210> 58 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ПОЗ, которая кодирует УН-СОК.З <400> 58
- 136 020508
А1а (31у С1п Тгр Ьеи О1у Азр РНе Азр Туг
10 <210> 59 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬЮ9, которая кодирует УН-СОК.1 <400> 59 аРдРасРсРа РддРР 15 <210> 60 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО9, которая кодирует УН-СОК.1 <400> 60
МеР Туг Зег Мер Уа1
5 <210> 61 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО9, которая кодирует УН-СНК2 <400> 61
РаРаРсРсРс сРРсРддРдд саадасРаРд РаРдсРдасР ссдРРааадд Р 51 <210> 62 <211> 17 <212> ПРТ
- 137 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 009, которая кодирует УН-СОК2 <400> 62
Туг 11е Зег Рго Зег О1у С1у Ьуз ТНг МеН Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
О1у <210> 63 <211> 69 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО9, которая кодирует УН-СОК.З <400> 63 даНЬсдадас дссддНаННа сдаНННННдд адНддННаНс асаасЬасЬа сНасНасНас 60 аНддасдНс 69 <210> 64 <211> 23 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ПО9, которая кодирует УН-СО КЗ <400> 64
Азр Зег Агд Агд Агд Туг Туг Азр РНе Тгр Зег С1у Туг Ηίβ Азп Туг
10 15
Туг Туг Туг Туг МеН Азр Уа1 <210> 65 <211> 15 <212> ДНК
- 138 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы04, которая кодирует УН-СИК1 <400> 65 сдЬЪасааЬа ЬдддН 15 <210> 66 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы04, которая кодирует УН-СИКЛ <400> 66
Агд Туг Азп МеЪ О1у
5 <210> 67 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ПО4, которая кодирует УН-СПК2 <400> 67 дССаСсСаСс сСЬсСддСдд сддбасСсаЬ СаСдсНдасЪ ссдЫааадд С 51 <210> 68 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 004, которая кодирует УН-СИЯ2 <400> 68
- 139 020508
Уа1 11е Туг Рго Зег С1у С1у 61у ТНг ΗΪ3 Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 69 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1л04, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 69
НсНаНадсад аНдаНдсННН НдаНаНс 27 <210> 70 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела П04, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 70
Зег 11е А1а Азр Азр А1а РНе Азр 11е
5 <210> 71 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО2, которая кодирует УН-СИК1 <400> 71 асННасдада НдаНЬ 15 <210> 72 <211> 5
- 140 020508 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО2, которая кодирует УН-СОК.1 <400> 72
ТЬг Туг С1и МеЬ Не
5 <210> 73 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1лО2, которая кодирует УН-СОК2 <400> 73
ЬсЬаЬсддЬс сЬЬсЬддЬдд ссЬЬасЬЬдд ЬаЬдсЬдасЬ ссдЬСааа 48 <210> 74 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО2, которая кодирует УН-СОК2 <400> 74
Зег 11е О1у Рго Зег О1у <31у Ьеи ТЬг Тгр Туг А1а Азр Зег 7а1 Ьуз
10 15 <31у <210> 75 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 141 020508 <223> Синтетическая последовательность из антитела 1лО2, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 75 аНдНаННасН дНдНасддаЬ НдаНдаНадН адНддННддд сННННдаНаН с 51 <210> 76 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО2, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 76
МеН Туг Туг Суз Уа1 Агд 11е Азр Азр Зег Зег С1у Тгр А1а РНе Азр
10 15
Не <210> 77 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1А7, которая кодирует УН-СИК1 <400> 77
Азп Туг С1у Мер Азп
5 <210> 78 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1А7, которая кодирует УН-СИК2 <400> 78
Тгр Не Азп ТНг Азр ТНг О1у С1и Рго ТНг Туг ТНг С1и Азр РНе С1п
- 142 020508
10 15
С1у <210> 79 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1А7, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 79 <31и С1у Уа1 Ше РНе Азр Туг
5 <210> 80 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 2РЗ, которая кодирует УН-СИК1 <400> 80
РНе Зег Азр А1а Тгр Ьеи Азр
5 <210> 81 <211> 19 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 2РЗ, которая кодирует УН-СПК2 <400> 81
С1и Не Агд Зег Ьуз А1а Азп Азп Нхз А1а ТНг Азп Туг А1а С1и Зег
10 15
Уа1 Ьуз С1у
- 143 020508 <210> 82 <211> 4 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 2РЗ, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 82
Зег РЬе А1а Туг <210> 83 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗРШ10.2СЗ или 3Ρ1Ε11.3Β7, которая кодирует УН-СИК1 <400> 83
Зег Зег Тгр ТЬг Θΐη
5 <210> 84 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗРЮ10.2СЗ или 3Ρ1Ε11.3Β7, которая кодирует УН-СИК2 <400> 84
А1а 11е Туг Рго С1у Азр С1у Азр ТЬг Агд Туг ТЬг С1п Ьуз РЬе Ьуз
10 15
О1у
- 144 020508 <210> 85 <211> 8 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗРШ10.2СЗ или 3Ρ1Ε11.3Β7, которая кодирует УН-СЭКЗ <400> 85
Нхз Азп Зег Туг О1у МеС Азр Туг
5 <210> 86 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы1О, которая кодирует УЬ-СОК.1 <400> 86 сдддсдадЬс адддЬаЬЬдд саасСддЪЪа дсс 33 <210> 87 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы1О, которая кодирует УЬ-СОК1 <400> 87
Агд А1а Зег С1п О1у Не С1у Азп Тгр Ьеи А1а
10 <210> 88 <211> 21 <212> ДНК
- 145 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1ЛО, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 88 дсРдсаРсса дРРРддааад Р 21 <210> 89 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬПО, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 89
А1а А1а Зег Зег Ьеи О1и Зег
5 <210> 90 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы1О, которая кодирует УЬ-СОК.3 <400> 90 саасаддсРс адасРРРссс дсРсасс 27 <210> 91 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы1О, которая кодирует УЬ-СЭКЗ <400> 91
146 020508 (31η Οίη А1а Οίη ТНг РНе Рго Ьеи ТНг
5 <210> 92 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1407, которая кодирует УЬ-СЭКЛ <400> 92
ЕсЕддадаЕс адЕЕдддЕда сааасаЕдЕд даЕ 33 <210> 93 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1407, которая кодирует УЬ-СОК.1 <400> 93
Зег <31у Азр С1п Ьеи С1у Азр Ьуз Нхз Уа1 А1а
10 <210> 94 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1407, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 94 сЕадасаЕЕа ададдсссдс а 21 <210> 95 <211> 7 <212> ПРТ
- 147 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО7, которая кодирует УЬ-СРК2 <400> 95
Ьеи Азр 11е Ьуз Агд Рго А1а
5 <210> 96 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1407, которая кодирует УЬ-СЭКЗ <400> 96 саддсдЬддд асаЬсаадас ддЬс 24 <210> 97 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1407, которая кодирует УЬ-СОК.3 <400> 97
С1п А1а Тгр Азр Не Ьуз ТНг Уа1
5 <210> 98 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1405, которая кодирует УЬ-СОК.1 <400> 98
- 148 020508 дддддадаса асаРРддаад РаададРдРс сас 33 <210> 99 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬЮ5, которая кодирует УЬ-СОКЛ <400> 99
О1у <31у Азр Азп 11е С1у Зег Ьуз Зег Уа1 Ηί3
10 <210> 100 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО5, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 100 даРдаРРаЬд ассддсссРс а 21 <210> 101 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО5, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 101
Азр Азр Туг Азр Агд Рго Зег
5 <210> 102 <211> 33 <212> ДНК
- 149 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО5, которая кодирует УЬ-СОКЗ <400> 102 саддЕдаддд асадссдЕас Едаддаасдд дЕд 33 <210> 103 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы05, которая кодирует УЬ-СОК.3 <400> 103
С1п Уа1 Агд Азр Зег Агд ТЬг С1и С1и Агд Уа1
10 <210> 104 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬШ, которая кодирует УЬ-СОК.1 <400> 104 сдддсдадЕс аддадаЕЕдс саасЕасЕЕа дсс 33 <210> 105 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬШ, которая кодирует УЬ-СОК1 <400> 105
150 020508
Агд А1а Зег С1п С1и 11е А1а Азп Туг Ьеи А1а
10 <210> 106 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬШ, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 106 даНасаНаса сНННдсадас Н 21 <210> 107 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬШ, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 107
Азр ТНг Туг ТНг Ьеи С1п ТНг
5 <210> 108 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬШ, которая кодирует УЬ-СИК.3 <400> 108 саасаддсНд асаННННссс дсНсНсН 27 <210> 109 <211> 9 <212> ПРТ
- 151 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬП1, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 109
Οίη О1п А1а Азр Не РЬе Рго Ьеи Зег
5 <210> ПО <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО1, которая кодирует УЬ-СИКЛ <400> 110 саддсдадСс аддасаЬЬад саасРаЬЬСа аа 32 <210> 111 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО1, которая кодирует УЬ-СИК.1 <400> 111
О1п А1а Зег С1п Азр 11е Зег Азп Туг Ьеи Азп
10 <210> 112 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО1, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 112
- 152 020508 даЕдсаЕсса аЕЕЕддааас а 21 <210> ИЗ <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО1, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 113
Азр А1а Зег Азп Ьеи О1и ТНг
5 <210> 114 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО1, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 114 саасаддсЕд асаддЕЕссс ЕдсддЕсасЕ 30 <210> 115 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ПО1, которая кодирует УЬ-СИК.3 <400> 115
С1п С1п А1а Азр Агд РНе Рго А1а Уа1 ТНг
10 <210> 116 <211> 33 <212> ДНК
- 153 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1ЛО6, которая кодирует УЬ-СЭКЛ <400> 116 сдддссадЬс ададЪаЪЬад ЬадсЬддЪЪд дсс 3 3 <210> 117 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО6, которая кодирует УЬ-СЭКЛ <400> 117
Агд А1а Зег Οίη Зег Не Зег Зег Тгр Ьеи А1а
10 <210> 118 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО6, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 118 дсЬдсаЬсса дЬЬЬасдаас Ь 21 <210> 119 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО6, которая кодирует УЬ-СЭКД <400> 119
- 154 020508
А1а А1а Зег Зег Ьеи Агд ТНг
5 <210> 120 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы06, которая кодирует УЬ-СРЯЗ <400> 120 сЬасаадаЬН асадЬНассс ЬсНсасЬ 27 <210> 121 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО6, которая кодирует УЬ-СРЯЗ <400> 121
Ьеи С1п Азр Туг Зег Туг Рго Ьеи ТНг
5 <210> 122 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО8, которая кодирует УЬ-СРЯ1 <400> 122 саддсдадНс аддасаННад ННасНаНННа ааН 33 <210> 123 <211> 11 <212> ПРТ
- 155 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1лО8, которая кодирует УЬ-СОК.1 <400> 123
С1п А1а Зег Θΐη Азр 11е Зег Туг Туг Ьеи Азп
10 <210> 124 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬЮ8, которая кодирует УЬ-СЭК2 <400> 124 даНдРаРсса аЬЪЪдсааас а 21 <210> 125 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ПО8, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 125
Азр Уа1 Зег Азп Ьеи С1п ТНг
5 <210> 126 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО8, которая кодирует УЬ-СОКЗ <400> 126
156 020508 саасадНсНд аНааНсНссс НсНсасН 27 <210> 127 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО8, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 127 <31п (31п Зег Азр Азп Ьеи Рго Ьеи ТНг
5 <210> 128 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫОЗ, которая кодирует УЬ-СИК1 <400> 128 дддсаадНса дадсаННадс адсНаНННаа аН 32 <210> 129 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫОЗ, которая кодирует УЬ-СОК.1 <400> 129
Агд А1а Зег С1п Зег Не Зег Зег Туг Ьеи Азп
10 <210> 130 <211> 21 <212> ДНК
- 157 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1403, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 130 дсЬдсаЬсса дЬЬЬдсааад Ь 21 <210> 131 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1403, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 131
А1а А1а Зег Зег Ьеи О1п Зег
5 <210> 132 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1403, которая кодирует УЬ-СОКЗ <400> 132 саасададЬЬ асадЬасссс дЬддасд 27 <210> 133 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫОЗ, которая кодирует УЬ-СОКЗ <400> 133
- 158 020508 (31η 01η Зег Туг Зег ТЬг Рго Тгр ТЬг
5 <210> 134 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО9, которая кодирует УЬ-СИК.1 <400> 134 сдсдсаадЬс ададсаЬсда сассЬаЬЬЬа ааЬ 33 <210> 135 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО9, которая кодирует УЬ-СИК.!
<400> 135
Агд А1а Зег О1п Зег 11е Азр ТЬг Туг Ьеи Азп
10 <210> 136 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО9, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 136 дсЬдсаЬсса адЬЬддаада с 21 <210> 137 <211> 7 <212> ПРТ
- 159 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО9, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 137
А1а А1а Зег Ьуз Ьеи С1и Азр
5 <210> 138 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО9, которая кодирует УЬ-СОКЗ <400> 138 саасададРР асадРссссс РсРсас 26 <210> 139 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО9, которая кодирует УЬ-СОК.3 <400> 139 (31п (31п Зег Туг Зег Рго Рго Ьеи ТЬг
5 <210> 140 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО2, которая кодирует УЬ-СОК1 <400> 140
- 160 020508
ЪсНддадаНа ааННддддда НаааНЬЬдсЬ Ссс 33 <210> 141 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО2, которая кодирует УЪ-СИК1 <400> 141
Зег О1у Азр Ьуз Ьеи С1у Азр Ьуз РНе А1а Зег
10 <210> 142 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО2, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 142 саадаСадда адсдСсСсСс а 21 <210> 143 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО2, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 143 <31п Азр Агд Ьуз Агд Ьеи Зег
5 <210> 144 <211> 27 <212> ДНК
- 161 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО2, которая кодирует УЬ-СЭКЗ <400> 144 саддсдНддд асассаасас НдНддНс 27 <210> 145 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫО2, которая кодирует УЬ-СОК.3 <400> 145
Θΐη А1а Тгр Азр ТНг Азп ТНг Уа1 Уа1
5 <210> 146 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1А7, которая кодирует УЬ-СОК.1 <400> 146
Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеТ Нхз
10 <210> 147 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1А7, которая кодирует УЬ-СЭК2 <400> 147
- 162 020508
Азр ТНг Зег Ьуз Ьеи А1а Зег
5 <210> 148 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1А7, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 148
О1п С1п Тгр Зег Зег Азп Рго РНе ТНг
5 <210> 149 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 2РЗ, которая кодирует УЬ-СИКЛ <400> 149
Агд А1а Зег С1у Азп 11е Туг Азп Туг Ьеи А1а
10 <210> 150 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 2РЗ, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 150
Азп А1а Ьуз ТНг Ьеи Рго Азр
5 <210> 151
- 163 020508 <211>9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 2РЗ, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 151
Θΐη Ηίβ РНе Тгр А1а 11е Рго Туг ТНг
5 <210> 152 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3 > Синтетическая последовательность из антитела 3 Ρ1 ϋ 10.2 СЗ, которая кодирует УЬ-С И К1 <400> 152
Ьуз Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Азп Зег <31у Азп <31п Ьуз Азп Туг Ьеи
10 15
ТНг <210> 153 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Синтетическая последовательность из антитела 3 Ρ1 ϋ 10.2СЗ, которая кодирует УЬ- СИ К2 <400> 153
Тгр А1а Зег ТНг Агд С1и Зег
5 <210> 154 <211> 10 <212> ПРТ
- 164 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗРЮ10.2СЗ, которая кодирует
УЬ-СОК.3 <400> 154
Οίη Азп Азр Туг Зег Туг Рго Ьеи РНе ТНг
10 <210> 155 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗР1Е11.3В7, которая кодируетУЬ-СОКЛ <400> 155
Ьуз Зег Зег О1п Зег Ьеи Ьеи Азп Зег С1у Азп С1п Ьуз Зег Туг Ьеи
10 15
ТНг <210> 156 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Синтетическая последовательность из антитела ЗР1Е11 .ЗВ7, которая кодирует УЬ-СО К2 <400> 156
Тгр А1а Зег ТНг Агд С1и Зег
5 <210> 157 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 165 020508 <220>
<223 > Синтетическая последовательность из антитела ЗР1Е11 .ЗВ7, которая кодирует УЬ-СИ КЗ <400> 157
С1п Азп Азр Туг Зег Туг Рго Ьеи РНе ТНг
10 <210> 158 <211> 133 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи П02 <400> 158
О1и 1 Уа1 Οίη Ьеи Ьеи <31и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 (31п Рго С1у С1у
5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег ТНг Туг
20 25 30
С1и МеЕ Не Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Зег Х1е 61у Рго Зег <31у О1у Ьеи ТНг Тгр Туг А1а Азр Зег \7а1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЕ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а МеЕ Туг Туг Суз
85 90 95
Уа1 Агд 11е Азр Азр Зег Зег С1у Тгр А1а РНе Азр 11е Тгр С1у С1п
100 105 110
С1у ТНг ТНг Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у Рго Зег Уа1
115 120
РНе Рго Ьеи А1а Рго
130
<210> 159
<211> 145
166 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы09 <400> 159
О1и Уа1 О1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег МеЕ Туг
20 25 30
Зег МеЕ Уа1 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи О1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг Не Зег Рго Зег <31у С1у Ьуз ТНг МеЕ Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг РНе Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЕ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Зег Агд Агд Агд Туг Туг Азр РНе Тгр Зег С1у Туг ΗΪ8
100 105 но
Азп Туг Туг Туг Туг Туг МеЕ Азр Уа1 Тгр С1у Ьуз С1у ТНг ТНг Уа1
115 120
ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а
130 135 140
Рго
145 <210> 160 <211> 131 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы06 <400> 160
- 167 020508
С1и Уа1 Οίη Ьеи Ьеи С1и Зег О1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго О1у О1у
10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег С1и Туг
25 30
Рго Мее Азр Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи О1и Тгр Уа1
40 45
Зег Зег Не Туг Зег Зег О1у С1у Зег ТНг Уа1 Туг А1а Азр Зег Не
55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
70 75 80
Ьеи О1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а <31и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
90 95
А1а Агд С1и О1у Азр Зег Азр А1а РНе Азр Не Тгр С1у С1п С1у ТНг
100 105 110
Мер Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз О1у Рго Зег Уа1 РНе Рго
115 120
Ьеи А1а Рго
130 <210> 161 <211> 131 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы05 <400> 161
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у <31у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго О1у б!у
5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РНе ТНг РНе Зег А1а Туг
20 25 30
А1а МеР С1у Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз <31у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Зег Не Уа1 Зег Зег С1у С1у Туг ТНг Азр Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
- 168 020508
Ьуз <31у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи О1п МеН Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд С1и С1у Азр Нхз Азп А1а РНе Азр Не Тгр <31у <31п С1у ТНг
100 105 110
МеН Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РНе Рго
115 120
Ьеи А1а Рго
130
<210> 162 <211> 131 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы04 <400> 162
О1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи О1и Зег О1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго О1у С1у
10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Агд Туг
25 30
Азп МеН С1у Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи С1и Тгр Уа1
40 45
Зег Уа1 Не Туг Рго Зег О1у С1у С1у ТНг Щз Туг А1а Азр Зег Уа1
55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
70 75 80
Ьеи С1п МеН Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
90 95
А1а Зег Зег Не А1а Азр Азр А1а РНе Азр Не Тгр С1у О1п С1у ТНг
100 105 110
МеН Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз <31у Рго Зег Уа1 РНе Рго
115 120
- 169 020508
Ьеи А1а Рго
130 <210> 163 <211> 131 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы08 <400> 163
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи 5 б1и Зег С1у С1у С1у Ьеи 10 Уа1 <31п Рго 61у <31у 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Η13 Туг
20 25 30
С1и МеЬ Уа1 Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Зег 11е Агд Зег Зег С1у С1у А1а ТНг Ьуз Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз О1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи Θΐη МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз С1и Зег Рго Азр Азр Туг РНе Азр Туг Тгр О1у С1п С1у ТНг
100 105 110
Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РНе Рго
115 120
Ьеи А1а Рго
130 <210> 164 <211> 134 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 170 020508 <223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы11 <400> 164
С1и Уа1 О1п Ьеи Ьеи <31и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у О1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег <31у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а МеЬ Туг Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго О1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Зег Не Зег ТНг Зег О1у С1у Туг ТНг О1у Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи σΐη Мее Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр ТНг Зег Азр Азп Азр Туг Туг Туг Мее Азр Уа1 Тгр С1у
100 105 но
Ьуз С1у ТНг ТНг Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у Рго Зег
115 120
Уа1 РНе Рго Ьеи А1а Рго
130 <210> 165 <211> 133 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы10 <400> 165
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и 5 Зег С1у С1у С1у Ьеи 10 Уа1 С1п Рго С1у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег ТНг Туг
20 25 30
Рго Мее Уа1 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
- 171 020508
Зег Тгр Не О1у Рго Зег С1у С1у Уа1 ТЬг А1а Туг А1а Азр Зег Уа1
55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
70 75 80
Ьеи Θΐη Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
90 95
А1а Агд Рго Туг Зег Зег С1у Тгр Тгр Азр РЬе Азр Ьеи Тгр С1у Агд
100 105 110
О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Х7а1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег Уа1
115 120
РЬе Рго Ьеи А1а Рго
130 <210> 166 <211> 131 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы01 <400> 166
С1и Уа1 1 С1п Ьеи Ьеи 5 С1и Зег С1у С1у С1у 10 Ьеи Уа1 С1п Рго С1у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Ьуз Туг
20 25 30
Θΐη МеЬ ТЬг Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Зег 11е Туг Рго Зег С1у С1у Азп ТЬг Уа1 Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи О1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Зег С1у ТЬг ТЬг С1и А1а Уа1 РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг
100 105 110
172 020508
Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РНе Рго
115 120
Ьеи А1а Рго
130 <210> 167 <211> 129 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы07 <400> 167
С1и 1 Уа1 <31п Ьеи Ьеи 5 О1и Зег СЯу С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Мер Туг
20 25 30
РНе Мер С1у Тгр Уа1 Агд СЯп А1а Рго О1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Зег Не Зег Рго Зег СЯу СЯу РНе ТНг Зег Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Агд Ηίβ А1а РНе Азр 11е Тгр С1у СЯп СЯу ТНг МеН Уа1
100 105 110
ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз СЯу Рго Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а
115 120
Рго
<210> 168
<211> 132
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
- 173 <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи ПОЗ <400> 168
С1и 1 Уа1 О1п Ьеи Ьеи <31и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 Θΐη Рго С1у С1у
5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег 61п Туг
20 25 30
Рго МеР С1и Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи <31и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1у Не Туг Рго Зег СЯу <31у Зег ТЬг Уа1 Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи Θΐη МеР Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд А1а С1у С1п Тгр Ьеи СЯу Азр РЬе Азр Туг Тгр О1у <31п СЯу
100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РЬе
115 120
Рго Ьеи А1а Рго
130
<210> 169
<211> 145
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи П12 <400> 169
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 Θΐη Рго С1у С1у
10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег С1п Туг
25 30
- 174
Азп Мер РНе Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Агд Не Зег Зег Зег 61у С1у Мер ТНг МеН Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз О1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд С1и А1а Ьеи Агд Рго Туг Суз Зег С1у С1у Зег Суз Туг Зег
100 105 110
Азр Туг Туг Туг Туг С1у МеН Азр Уа1 Тгр С1у Θΐη О1у ТНг ТНг Уа1
115 120
ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз (31у Рго Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а
130 135 140
Рго
145 <210> 170 <211> 116 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи 1А7 <400> 170
С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у Рго С1и Ьеи Ьуз Ьуз Рго О1у С1и
1 5 10 15
ТНг Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТНг РНе ТНг Азп Туг
20 25 30
С1у МеН Азп Тгр Уа1 Ьуз (31η А1а Рго <31у Ьуз С1у Ьеи Ьуз Тгр Мер
35 40 45
С1у Тгр Не Азп ТНг Азр ТНг <31у <31и Рго ТНг Туг ТНг С1и Азр РНе
50 55 60
О1п С1у Агд РНе А1а РНе Зег Ьеи С1и ТНг Зег А1а Зег ТНг Уа1 Туг
65 70 75 80
175
Ьеи С1п РЬе Азп Азп Ьеи Ьуз Азп О1и Азр ТЬг А1а ТЬг Туг РЬе Суз
85 90 95
А1а Агд С1и О1у Уа1 ΗΪ3 РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1
100 105 но
ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> 171 <211> 115 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи 2РЗ <400> 171
С1и 1 Уа1 Ьуз Ьеи С1и 5 О1и Зег С1у <31у <31у Ьеи Уа1 <31п Рго С1у С1у
10 15
Зег мер Ьуз Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а
20 25 30
Тгр Ьеи Азр Тгр Уа1 Агд С1п Зег Рго <31и Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а С1и Не Агд Зег Ьуз А1а Азп Азп ΗΪ8 А1а ТЬг Азп Туг А1а С1и
50 55 60
Зег Уа1 Ьуз 61у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Зег Зег
65 70 75 80
Ча1 Туг Ьеи Θΐη МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг О1у Не Туг
85 90 95
РЬе Суз ТЬг Рго Зег РЬе А1а Туг Тгр О1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг
100 105 110
Уа1 Зег Зег
115
<210> 172
<211> 117
<212> ПРТ
176 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи ЗРШ10.2СЗ и
3Ρ1Ε11.3Β7 <400> 172
Θΐη Уа1 Οίη Ьеи С1п С1п Зег С1у А1а С1и Ьеи А1а Агд Рго С1у А1а
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег О1у Туг ТНг РНе ТНг Зег Зег
20 25 30
Тгр ТНг <31п Тгр Уа1 Ьуз <31п Агд Рго С1у <31п С1у Ьеи С1и Тгр 11е
35 40 45
С1у А1а Не Туг Рго О1у Азр С1у Азр ТНг Агд Туг ТНг <31п Ьуз РНе
50 55 60
Ьуз О1у Ьуз А1а ТНг Ьеи ТНг А1а Азр Ьуз Зег Зег Зег ТНг А1а Туг
65 70 75 80
Мер С1п Ьеи Зег Зег Ьеи А1а Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Н13 Азп Зег Туг С1у МеН Азр Туг Тгр С1у С1п <31у ТНг Зег
100 105 но
Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115 <210> 173 <211> 399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы02 <400> 173
даадЬЬсааН НдНЬададНс ндд^ддсддь сННдННсадс сНддЬддЬНс ЬННасдНсЬН 60
НсНЬдсдсНд сННссддаЫ; сасЬЬЬсЬсЬ асЬЬасдада НдаЬЬЬдддН НсдссаадсЬ 120
ссЬддНааад дНЬЬддадЬд ддЬЬНсЬНсН аНсддЬссЬЬ сНддНддссЬ ЬасННддНаЬ 180
дсНдасНссд ЬЬаааддНсд сННсасНаЬс ЬсЬададаса асЬсНаадаа НасЬсНсНас 240
- 177 020508
ССдсадаСда асадсССаад ддсСдаддас ассдссаСдС аССасСдСдС асддаССдаС 300 даСадСадСд дССдддсССС СдаСаСсСдд ддссааддда ссасддСсас сдСсСсаадс 360 дссСссасса адддсссаСс ддСсССсссд сСадсассс 399 <210> 174 <211> 435 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы09 <400> 174
даадСЬсааС СдССададСс СддСддсддС сССдССсадс сСддСддССс СССасдСсСС 60
СсССдсдсСд сССссддаСС сасСССсСсС аСдСасСсСа СддСССдддС СсдссаадсС 120
ссСддСааад дСССддадСд ддСССсССаС аСсСсСссСС сСддСддсаа дасСаСдСаС 180
дсСдасСссд ССаааддСсд сССсасСаСс СсСададаса асСсСаадаа СасСССсСас 240
ССдсадаСда асадсССаад ддсСдаддас асддссдСдС аССасСдСдс дададаССсд 300
адасдссддС аССасдаССС ССддадСддС СаСсасаасС асСасСасСа сСасаСддас 360
дСсСддддса аадддассас ддСсассдСс СсаадсдссС ссассааддд сссаСсддСс 420
ССсссдсСад сассс 435 <210> 175 <211> 393 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы06 <400> 175
даадССсааС СдССададСс СддСддсддС сССдССсадс сСддСддССс СССасдСсСС 60
СсССдсдсСд сССссддаСС сасСССсСсС дадСасссСа СддаССдддС СсдссаадсС 120
ссСддСааад дСССддадСд ддСССсССсС аСсСаССсСС сСддСддсСс ЬасСдСССаС 180
дсСдасСсса ССаааддСсд сССсасСаСс СсСададаса асСсСаадаа СасСсСсСас 240
ССдсадаСда асадсССаад ддсСдаддас асддссдСдС аССасСдСдс садададддС 300
дасСсСдаСд сССССдаСаС сСддддссаа дддасааСдд СсассдСсСс аадсдссЬсс 360
ассаадддсс саСсддСсСС сссдсСадса ссс 393
- 178 020508 <210> 176 <211> 393 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи 1405 <400> 176
даадЕЕсааЕ ЕдЕЕададЕс ЕддЕддсддЕ сЕЕдЕЕсадс сЕддЕддЕЕс ЕЕЕасдЕсЕЕ 60
ЕсЕЕдсдсЕд сЕЕссддаЕЕ сасЕЕЕсЕсЕ дсЕЕасдсЕа ЕдддЕЕдддЕ ЕсдссаадсЕ 120
ссЕддЕааад дЕЕЕддадЕд ддЕЕЕсЕЕсЕ аЕсдЕЕЕсЕЕ сЕддЕддсЕа ЕасЕдаЕЕаЕ 180
дсЕдасЕссд ЕЕаааддЕсд сЕЕсасЕаЕс ЕсЕададаса асЕсЕаадаа ЕасЕсЕсЕас 240
ЕЕдсадаЕда асадсЕЕаад ддсЕдаддас асддссдЕдЕ аЕЕасЕдЕдс садададддЕ 300
дассаЕааЕд сЕЕЕЕдаЕаЕ сЕддддссаа дддасааЕдд ЕсассдЕсЕс аадсдссЕсс 360
ассаадддсс саЕсддЕсЕЕ сссдсЕадса ссс 393
<210> 177 <211> 393 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи 1404 <400> 177
даадЕЕсааЕ ЕдЕЕададЕс ЕддЕддсддЕ сЕЕдЕЕсадс сЕддЕддЕЕс ЕЕЕасдЕсЕЕ 60
ЕсЕЕдсдсЕд сЕЕссддаЕЕ сасЕЕЕсЕсЕ сдЕЕасааЕа ЕдддЕЕдддЕ ЕсдссаадсЕ 120
ссЕддЕааад дЕЕЕддадЕд ддЕЕЕсЕдЕЕ аЕсЕаЕссЕЕ сЕддЕддсдд ЕасЕсаЕЕаЕ 180
дсЕдасЕссд ЕЕаааддЕсд сЕЕсасЕаЕс ЕсЕададаса асЕсЕаадаа ЕасЕсЕсЕас 240
ЕЕдсадаЕда асадсЕЕаад ддсЕдаддас асддссдЕдЕ аЕЕасЕдЕдс дадЕЕсЕаЕа 300
дсадаЕдаЕд СЕЕЕЕдаЕаЕ сЕддддссаа дддасааЕдд ЕсассдЕсЕс аадсдссЕсс 360
ассаадддсс саЕсддЕсЕЕ сссдсЕадса ссс 393
<210> 178 <211> 393 <212> ДНК
- 179 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи П08 <400> 178
даадРРсааР РдРРададРс РддРддсддР сРРдРРсадс сРддРддРРс РРРасдРсРР 60
РсРРдсдсРд сРРссддаРР сасРРРсРсР саРРасдада РддРРРдддР РсдссаадсР 120
ссРддРааад дрррддадрд ддРРРсРРсР аРссдРРсРР сРддРддсдс РасРаадРаР 180
дсРдасРссд РРаааддРсд сРРсасРаРс РсРададаса асРсРаадаа РасРсРсРас 240
РРдсадаРда асадсРРаад ддсРдаддас асддссдРдР аРРасРдРдс дааададРсд 300
ссадасдасР асРРРдасРа сРддддссад ддаасссРдд РсассдРсРс аадсдссРсс 360
ассаадддсс саРсддРсРР сссдсРадса ссс 393
<210> 179 <211> 402 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы11 <400> 179
даадРРсааР РдРРададРс РддРддсддР сРРдРРсадс сРддРддРРс РРРасдРсРР 60
РсРРдсдсРд сРРссддаРР сасРРРсРсР РсРРасдсРа РдРаРРдддР РсдссаадсР 120
ссРддРааад дрррддадрд ддРРРсРРсР аРсРсРасРР сРддРддсРа РасРддРРаР 180
дсРдасРссд РРаааддРсд сРРсасРаРс РсРададаса асРсРаадаа РасРсРсРас 240
РРдсадаРда асадсРРаад ддсРдаддас асддссдРдР аРРасРдРдс дададаРасс 300
адсдаРааРд асРасРасРа саРддасдРс Рддддсааад ддассасддр сассдРсРса 360
адсдссРсса ссаадддссс аРсддРсРРс ссдсРадсас сс 402
<210> 180 <211> 399 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы10
- 180 020508 <400> 180
даадЬЬсааЬ ЬдЬЬададЬс ЬддЬддсддЬ сЬЬдЬЬсадс сЬддЬддЬЬс ЬЬЬасдЬсЬЬ 60
ЬсЬЬдсдсЬд сЬЬссддаЬЬ сасЬЬЬсЬсЬ асЬЬасссЬа ЬддЬЬЬдддЬ ЬсдссаадсЬ 120
ссЬддЬааад дЬЬЬддадЬд ддЬЬЬсЬЬдд аЬсддЬссЬЬ сЬддЬддсдЬ ЬасЬдсЬЬаЬ 180
дсЬдасЬссд ЬЬаааддЬсд сЬЬсасЬаЬс ЬсЬададаса асЬсЬаадаа ЬасЬсЬсЬас 240
ЬЬдсадаЬда асадсЬЬаад ддсЬдаддас асддссдЬдЬ аЬЬасЬдЬдс дадасссЬаЬ 300
адсадЬддсЬ ддЬдддасЬЬ сдаЬсЬсЬдд ддссдЬддса сссЬддЬсас сдЬсЬсаадс 360
дссЬссасса адддсссаЬс ддЬсЬЬсссд сЬадсассс 399
<210> 181 <211> 393 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы01 <400> 181
даадЬЬсааЬ ЬдЬЬададЬс ЬддЬддсддЬ сЬЬдЬЬсадс сЬддЬддЬЬс ЬЬЬасдЬсЬЬ 60
ЬсЬЬдсдсЬд сЬЬссддаЬЬ сасЬЬЬсЬсЬ аадЬассада ЬдасЬЬдддЬ ЬсдссаадсЬ 120
ссЬддЬааад дЬЬЬддадЬд ддЬЬЬсЬЬсЬ аЬсЬаЬссЬЬ сЬддЬддсаа ЬасЬдЬЬЬаЬ 180
дсЬдасЬссд ЬЬаааддЬсд сЬЬсасЬаЬс ЬсЬададаса асЬсЬаадаа ЬасЬсЬсЬас 240
ЬЬдсадаЬда асадсЬЬаад ддсЬдаддас асддссдЬдЬ аЬЬасЬдЬдс дадЬдддасЬ 300
асададдсад ЬсЬЬЬдасЬа сЬддддссад ддаасссЬдд ЬсассдЬсЬс аадсдссЬсс 360
ассаадддсс саЬсддЬсЬЬ сссдсЬадса ссс 393
<210> 182 <211> 387 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи 1407 <400> 182 даадЬЬсааЪ ЬдЬЬададЬс ЬддЬддсддЬ сЬЬдЬЬсадс сЬддЬддЬЬс ЬЬЬасдЬсЬЬ 60
ЬсЬЬдсдсЬд сЬЬссддаЬЬ сасЬЬЬсЬсЬ аЬдЬасЬЬЬа ЬдддЬЬдддЬ ЬсдссаадсЬ 120
- 181 020508
ссЕддЕааад дЕЕЕддадЕд ддЕЕЕсЕЕсЕ аЕсЕсЕссЕЕ сЕддЕддсЕЕ ЕасЕЕсЕЕаЕ 180
дсЕдасЕссд ЕЕаааддЕсд сЕЕсасЕаЕс ЕсЕададаса асЕсЕаадаа ЕасЕсЕсЕас 240
ЕЕдсадаЕда асадсЕЕаад ддсЕдаддас асЕдсадЕсЕ асЕаЕЕдЕдс дададаЕсдд 300
саЕдсЕЕЕЕд аЕаЕсЕдддд ссаадддаса аЕддЕсассд ЕсЕсаадсдс сЕссассаад 360
ддсссаЕсдд ЕсЕЕсссдсЕ адсассс 387
<210> 183 <211> 396 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи ЫОЗ <400> 183
даадЕЕсааЕ ЕдЕЕададЕс ЕддЕддсддЕ сЕЕдЕЕсадс СЕддЕддЕЕс ЕЕЕасдЕсЕЕ 60
ЕсЕЕдсдсЕд сЕЕссддаЕЕ сасЕЕЕсЕсЕ садЕасссЕа ЕддадЕдддЕ ЕсдссаадсЕ 120
ссЕддЕааад дЕЕЕддадЕд ддЕЕЕсЕддЕ аЕсЕаЕссЕЕ сЕддЕддсЕс ЕасЕдЕЕЕаЕ 180
дсЕдасЕссд ЕЕаааддЕсд сЕЕсасЕаЕс ЕсЕададаса асЕсЕаадаа ЕасЕсЕсЕас 240
ЕЕдсадаЕда асадсЕЕаад ддсЕдаддас асддссдЕдЕ аЕЕасЕдЕдс дададсдддд 300
садЕддсЕдд дддасЕЕЕда сЕасЕддддс садддаассс ЕддЕсассдЕ сЕсаадсдсс 360
Ессассаадд дсссаЕсддЕ сЕЕсссдсЕа дсассс 396
<210> 184 <211> 435 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы12 <400> 184
даадЕЕсааЕ ЕдЕЕададЕс ЕддЕддсддЕ сЕЕдЕЕсадс сЕддЕддЕЕс ЕЕЕасдЕсЕЕ 60
ЕсЕЕдсдсЕд сЕЕссддаЕЕ сасЕЕЕсЕсЕ садЕасааЕа ЕдЕЕЕЕдддЕ ЕсдссаадсЕ 120
ссЕддЕааад дЕЕЕддадЕд ддЕЕЕсЕсдЕ аЕсЕсЕЕсЕЕ сЕддЕддсаЕ дасЕаЕдЕаЕ 180
дсЕдасЕссд ЕЕаааддЕсд сЕЕсасЕаЕс ЕсЕададаса асЕсЕаадаа ЕасЕсЕсЕас 240
ЕЕдсадаЕда асадсЕЕаад ддсЕдаддас асддсЕдЕдЕ аЕЕасЕдЕдс дададаадсд 300
ЕЕасддссЕЕ аЕЕдЕадЕдд ЕддЕадсЕдс ЕасЕссдасЕ асЕасЕасЕа сддЕаЕддас 360
- 182 020508 дРсРддддсс аадддассас ддРсассдРс РсаадсдссР ссассааддд сссаРсддРс 420
РРсссдсРад сассс 435 <210> 185 <211> 357 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы02 <400> 185
РРсРаРРсРс асадрдсаса драсдааррд асРсадссас ссРсадРдРс сдрдрсссса 60
ддасадасад ссадсаРсас сРдсРсРдда даРаааРРдд дддаРаааРР РдсРРссРдд 120
РаРсадсада аддсаддсса дрссссрдрд сРддРсаРсР РРсаадаРад даадсдРсРс 180
РсадддаРсс сРдадсдаРР сРсРддсРсс аасРсРддда асасадссас РсРдассаРс 240
адсдддассс аддсРаРдда РдаддсРдас РаРРасРдРс аддсдРддда сассаасасР 300
дРддРсРРсд дсддадддас саадсРдасс дРссРаддРс адсссааддс Рдссссс 357
<210> 186 <211> 360 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы09 <400> 186
РРсРаРРсРс асадрдсаса адасаРссад аРдасссадР сРссаРссРс ссРдРсРдса 60
РРРдРдддад асададРсдс саРсасРРдс сдсдсаадРс ададсаРсда сассРаРРРа 120
ааРРддРаРс адсадааасс адддааадсс ссРааасРсс РдаРсРаРдс РдсаРссаад 180
РРддаадасд дддРсссаРс аадаРРсадР ддсадрддаа сРдддасада РРРсасРсРс 240
ассаРсадаа дРсРдсаасс РдаадаРРРР ддаасРРасР асРдРсааса дадРРасадР 300
сссссРсРса сРРРсддсдд адддассаад дрддадарса аасдаасрдр ддсРдсасса 360
<210> 187 <211> 360 <212> ДНК
- 183 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы06 <400> 187
РРсРаРРсРс асадрдсаса адасаРссад аРдасссадР сРссРРссас ссРдРсРдса 60
РсРдРаддад асададРсас саРсасРРдс сдддссадРс ададРаРРад РадсРддРРд 120
дссРддРаРс адсадааасс адддааадсс ссРаассРсс РдаРсРаРдс РдсаРссадР 180
РРасдаасРд дддРсссаРс аадаРРсадд ддсадРддаР сРддсасада РРРсасРсРс 240
ассаРсадса дссРдсадсс РдаадаРРРР дсаасдРаРР асРдРсРаса адаРРасадР 300
РасссРсРса сРРРРддсса ддддассаад сРддадаРса аасдаасРдР ддсРдсасса 360
<210> 188 <211> 363 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы05 <400> 188
РРсРаРРсРс асадрдсаса дадсдРсРРд асРсадссас ссРсддРдРс адрддсссса 60
ддссадасдд ссаддаРРРс сРдРддддда дасаасаРРд даадРаадад РдРссасРдд 120
Рассадсада ддссаддсса ддссссРдРс срддрсдрдр аРдаРдаРРа Рдассддссс 180
РсадддаРсс срдадсдарр сРсРддсРсс аасРсРдддд асасддссаР ссРдассаРс 240
ассадддРсд аадРсдддда Рдаддссдас РРРРаРРдРс аддрдаддда садссдРасР 300
даддаасддд РдРРсддсдд адддассаад дрдассдрср РаддРсадсс сааддсРдсс 360
ссс 363
<210> 189 <211> 360 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы08 <400> 189
- 184 020508
ННсНаННсНс асадНдсаса адасаНссад аНдасссадН сНссаНсННс ссНдНсНдса 60
НсНдНаддад асададНсас саНсасННдс саддсдадНс аддасаННад ННасНаНННа 120
ааННддНаНс адсадаадсс адддааадсс ссНааддНсс НдаНсНасда НдНаНссааН 180
ННдсааасад дддНсссаНс ааддННсадН ддаадНдсдН сНдсдасада ННННасНсНс 240
ассаНсадса дссНдсадсс НдаадаНаНН дсдасаНаНН асНдНсааса дНсНдаНааН 300
сЬсссНсНса сНННсддсдд адддассаад дНддадаННа аасдаасНдН ддсНдсасса 360
<210> 190 <211> 360 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы11 <400> 190
ННсНаННсНс асадНдсаса адасаНссад аНдасссадН сНссаНсННс НдНдНсНдса 60
ссНаНаддад асададНсас саНсасННдН сдддсдадНс аддадаННдс саасНасННа 120
дссНддНаНс адсадааасс адддааадсс ссНаадсНсс НдаНсНаНда НасаНасасН 180
ННдсадасНд асдНсссасс даддННсадс ддсадНддНН сддддасада НННсасНсНс 240
асНаНсадса дссНдсадсс НдаадаНасН дсаасННасН НННдНсааса ддсНдасаНН 300
ННсссдсНсН сНННсддсдд адддассаад дНддадаНса аасдаасНдН ддсНдсасса 360
<210> 191 <211> 366 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи 1л 10 <400> 191
ННсНаННсНс асадНдсаса адасаНссад аНдасссадН сНссаНсННс саНдНсНдсН 60
НсНдНадддд асасадНсас саНсасННдН сдддсдадНс адддНаННдд саасНддННа 120
дссНддНаНс адсадааасс адддааадсс ссаасНсНсс НдаНсНаНдс НдсаНссадН 180
ННддааадНд дддНсссаНс ааддННсасс ддсадсддса дННссНсНдд даНадаНННс 240
асНсНсасса НсадсдассН дсасссНдаа даНННддсаа сННасНаННд НсаасаддсН 300
садасНННсс сдсНсассНН сддсддаддд ассадддНдд ассНсаадсд аасНдНддсН 360
- 185 020508 дсасса 366 <210> 192 <211> 363 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы01 <400> 192
РРсРаРРсРс асадРдсаса адасаРссад аРдасссадР сРссаРссРс ссРдРсРдса 60
РсРдРаддад асададРсас саРсасРРдс саддсдадРс аддасаРРад саасРаРРРа 120
ааРРддРаРс адсадааасс адддааадсс ссРаадсРсс РдаРсРасда РдсаРссааР 180
РРддааасад дддРсссаРс ааддРРсадс ддсадРддаР сРдддасада РРРсасРсРс 240
ассаРсадса дссРдсадсс РдаадаРРРР дсаасРРасР аРРдРсааса ддсРдасадд 300
РРсссРдсдд РсасРРРсдд сддадддасс ааддРддада Рсааасдаас РдРддсРдса 360
сса 363 <210> 193 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы07 <400> 193
РРсРаРРсРс асадРдсаса дадсдааррд асРсадссас ссРсадРдРс сдРдРсссса 60
ддасадасад ссаРсаРсас сРдсРсРдда даРсадРРдд дрдасаааса РдРддсРРдд 120
РаРсаасада адссаддсса дрссссрдрд сРддРсаРсР аРсРадасаР Раададдссс 180
дсадддаРРР сРдадсдаРР сРсРддсРсс аасРсРддаа аРасадссас РсРдассаРс 240
ададддассс аддсРаРдда РдаадсРдас РаРРасРдРс аддсдрддда саРсаадасд 300
дРсРРсддсд дддддассаа дсрдассдрс сРдадРсадс ссааддсРдс сссс 354
<210> 194 <211> 360 <212> ДНК
- 186 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи 1Л03 <400> 194
РРсРаРРсРс асадрдсаса адасаРссад аРдасссадР сРссаРссРс ссРдРсРдса 60
РсРдРаддад асададРсас саРсасРРдс сдддсаадРс ададсаРРад садсРаРРРа 120
ааРРддРаРс адсадааасс адддааадсс ссРаадсРсс РдаРсРаРдс РдсаРссадР 180
РРдсааадРд дддРсссаРс ааддРРсадР ддсадрддар срдддасада РРРсасРсРс 240
ассаРсадса дРсРдсаасс рдаадарррр дсаасРРасР асРдРсааса дадРРасадР 300
ассссдРдда сдРРсддсса адддассаад дРддаааРса аасдаасрдр ддсРдсасса 360
<210> 195 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела На.01, которая кодирует УН-СИКЛ <400> 195
61у Туг Зег РНе ТНг Азп Туг Тгр 11е С1у
10 <210> 196 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.01, которая кодирует УН-СПК2 <400> 196
11е 11е Азр Рго Азр Азр Зег Туг ТНг ТНг Туг Зег Рго Зег РНе О1п
10 15
С1у <210> 197
- 187 020508 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.01, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 197
А1а <31и РНе Туг Тгр С1у А1а Туг Азр С1у
10 <210> 198 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.02, которая кодирует УН-СИК1 <400> 198
С1у О1у Зег 11е Агд С1у Азп Туг Тгр Зег
10 <210> 199 <211> 14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.02, которая кодирует УН-СИК2 <400> 199
Зег 11е Азп Туг Зег С1у РНе ТНг Азп Рго Зег Ьеи Ьуз С1у
10 <210> 200 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 188 020508 <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.02, которая кодирует УН-СОК.З <400> 200
Уа1 Агд ΗΪ3 Тгр Туг РНе Азр Уа1
5 <210> 201 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.03, которая кодирует УН-СЭК!
<400> 201 (31у Туг ТНг РНе Азп С1у РНе Азр МеЕ Нтз
10 <210> 202 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.03, которая кодирует УН-СОК2 <400> 202
Тгр Не Азр Рго Туг Азп С1у Зег ТНг ТНг Туг А1а С1п Ьуз РНе С1п
10 15
О1у <210> 203 <211> 13 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.03, которая кодирует УН-СОК.З
- 189 020508 <400> 203
Азр РНе Туг МеР Азр О1у Нхз Туг Туг 11е РНе Азр Уа1
10 <210> 204 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.04, которая кодирует УН-СОК.1 <400> 204
О1у Туг Зег РНе Зег Азп Туг Туг 11е Нхз
10 <210> 205 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.04, которая кодирует УН-СОК2 <400> 205
Не Не Азр Рго <31у Азр Зег РНе ТНг Зег Туг Зег Рго Зег РНе О1п
10 15
О1у <210> 206 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.04, которая кодирует УН-СЫКЗ <400> 206
Азр Ьеи А1а Тгр Не Азр Туг С1у РНе Азр Туг
- 190 020508
10 <210> 207 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.05, которая кодирует УН-СИК1 <400> 207
О1у РНе ТНг РНе ТНг Зег ΗΪ3 ТНг Уа1 Зег
10 <210> 208 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.05, которая кодирует УН-СИК2 <400> 208
Зег Не ТНг С1у Азп С1у Зег ТНг ТНг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 209 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.05, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 209
РНе Туг О1у Азр РНе Азр Зег
5 <210> 210
- 191 020508 <211> 10 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.06, которая кодирует УН-СИК1 <400> 210
С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Азп Тгр МеЬ Зег
10 <210> 211 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.06, которая кодирует УН-СИК2 <400> 211
ТЬг 11е РЬе Туг Зег О1у Зег Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 212 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.06, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 212
Азр Ьеи Рго МеЬ Ьуз О1у РЬе 11е С1п С1п Агд Туг <31у РЬе Азр Азр
10 15
Ча1 <210> 213 <211> 10
- 192 020508 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.07, которая кодирует УН-СИКЛ <400> 213
С1у РНе ТНг РНе Зег С1у Туг А1а 11е Зег
10 <210> 214 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.07, которая кодирует УН-СИК2 <400> 214
ТНг 11е Тгр <31у Зег С1у Зег ТНг ТНг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 215 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.07, которая кодирует УН-СИК.З <400> 215 <31и Туг Тгр Туг Туг Азр <31п РНе ТНг А1а Уа1
10 <210> 216 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 193 020508 <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.08, которая кодирует УН-СОК.1 <400> 216
С1у Азр Зег Уа1 Зег Зег Азп Зег А1а А1а Тгр Зег
10 <210> 217 <211> 18 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.08, которая кодирует УН-СОК2 <400> 217
Агд 11е Туг Туг Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азр Туг А1а Уа1 Зег Уа1
10 15
Ьуз Зег <210> 218 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.08, которая кодирует УН-СЭКЗ <400> 218
С1и Уа1 Туг Зег А1а С1у 11е Мер Азр Туг
10 <210> 219 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.09, которая кодирует УН-СОК1
- 194 020508 <400> 219
С1у Туг Зег РНе ТНг Азп Шз Тгр Не С1у
10 <210> 220 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.09, которая кодирует УН-СОК2 <400> 220
Не Не Азр Рго Зег Азр Зег Азр ТНг Азп Туг Зег Рго Зег РНе С1п
10 15
С1у <210> 221 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.09, которая кодирует УН-СОКЗ <400> 221
С1у РНе Туг С1у Не А1а Азр ТНг РНе Азр Уа1
10 <210> 222 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.10, которая кодирует УН-СОК1 <400> 222
О1у Туг Зег РНе ТНг Азп Туг Тгр Не А1а
- 195 020508
10 <210> 223 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.Ю, которая кодирует УН-СИК2 <400> 223
Мер 11е Туг Рго Азр Азр Зег Азп ТНг Азп Туг 5ег Рго Зег РНе О1п
10 15
С1у <210> 224 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.Ю, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 224
ТНг Азп Туг Ьеи <31у РНе Туг Азр Зег
5 <210> 225 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.11, которая кодирует УН-СИК1 <400> 225
О1у РНе ТНг РНе Зег Азр Туг 61у Не Зег
10 <210> 226
- 196 020508 <211> 17 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.11, которая кодирует УН-СИК2 <400> 226
Азп 11е Ьеи Туг Азр С1у Зег О1и ТНг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 227 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.11, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 227
С1у Туг Рго ТНг Азр Азр Туг Зег РНе Азр 11е
10 <210> 228 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.12, которая кодирует УН-СИК1 <400> 228
О1у Азр Зег Уа1 Зег Азр Азп Зег А1а А1а Тгр С1у
10 <210> 229 <211> 18 <212> ПРТ
- 197 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.12, которая кодирует УН-СИК2 <400> 229
Агд Не Туг Туг Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азр Туг А1а Уа1 Зег Уа1
10 15
Ьуз Зег <210> 230 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.12, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 230
С1у Агд Ηί3 С1и Туг С1у <31у Ьеи О1у Туг А1а С1и А1а МеС Азр Нтз
10 15 <210> 231 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа. 13, которая кодирует УН-СИКЛ <400> 231
С1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг А1а МеЬ Зег
10 <210> 232 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 198 020508 <223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.13, которая кодирует УН-СИК2 <400> 232
А1а Не Зег О1у Зег С1у О1у Зег ТНг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 233 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.13, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 233
Ηίβ Туг ТНг Туг МеР Ηίβ РНе С1и Азр Туг
10 <210> 234 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.01, которая кодирует УЬ-СИК1 <400> 234
Зег О1у Азр Зег Ьеи Рго Зег Ьуз РНе Уа1 Нхз
10 <210> 235 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.01, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 235
- 199 020508
Агд Азр Азп Азп Агд Рго Зег
5 <210> 236 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.01, которая кодирует УЬ-СИЯЗ <400> 236
Зег Зег Туг Азр А1а Ьеи ТНг Азр
5 <210> 237 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.02, которая кодирует УЬ-СИЯ1 <400> 237
Агд А1а Зег С1п Зег 11е ТНг Азп Зег Туг Ьеи С1у
10 <210> 238 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.02, которая кодирует УЬ-СИЯ2 <400> 238
Азр А1а Зег Зег Агд А1а ТНг
5 <210> 239
- 200 020508 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.02, которая кодирует УЬ-СОКЗ <400> 239
Οίη Θΐη А1а Зег Азр А1а Рго С1и
5 <210> 240 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.03, которая кодирует УЬ-СОК.1 <400> 240
Агд А1а Зег О1п <31у 11е Азп РЬе Тгр Ьеи Азп
10 <210> 241 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.03, которая кодирует УЬ-СЬК2 <400> 241
А1а С1у Зег Азп Ьеи <31п Зег
5 <210> 242 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 201 020508 <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела На.03, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 242
МеЕ 51η Азр Зег Азр РЬе Рго РЬе
5 <210> 243 <211> 14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.04, которая кодирует УЬ-СИК.1 <400> 243
ТЬг С1у Зег Зег Зег Азп Не С1у А1а С1у Туг Азр Уа1 Зег
10 <210> 244 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 12а.04, которая кодирует УЬ-СИЯ2 <400> 244
Агд Азп Азп Азп Агд Рго Зег
5 <210> 245 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.04, которая кодирует УЬ-СИК.3 <400> 245
- 202 020508
Οίη ТНг Туг Азр Азп Зег ТНг Азр
5 <210> 246 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.05, которая кодирует УЬ-СОК.1 <400> 246
Зег О1у Азр Азп 11е Агд Зег Туг Туг Уа1 Нхз
10 <210> 247 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.05, которая кодирует УЫСОК2 <400> 247
С1и Азр Зег Азп Агд Рго Зег
5 <210> 248 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.05, которая кодирует УЬ-СЭКЗ <400> 248
Θΐη Зег Туг Азр Зег А1а 11е Ьеи Ьеи Нхз
10 <210> 249
- 203 020508 <211> 16 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.06, которая кодирует УЬ-СИК.1 <400> 249
Агд Зег Зег Οίη Зег Ьеи Уа1 Ьеи Агд ТНг С1у Туг ТНг Туг Ьеи Азп
10 15 <210> 250 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.06, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 250
Ьеи Уа1 Зег Азп Агд А1а Зег
5 <210> 251 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.06, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 251
С1п С1п Туг Туг О1у МеН Рго Ьеи
5 <210> 252 <211> 12 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 204 020508 <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.07, которая кодирует УЫСОК1 <400> 252
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Туг Θΐη Туг Ьеи А1а
10 <210> 253 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.07, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 253
С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг
5 <210> 254 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.07, которая кодирует УЬ-СОКЗ <400> 254 <31п С1п Туг С1у Зег Уа1 Рго Агд
5 <210> 255 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.08, которая кодирует УЬ-СОК1 <400> 255
- 205 020508
Зег О1у Азр Зег Ьеи С1у Зег Туг Туг Уа1 НЬз
10 <210> 256 <211>7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.08, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 256
Азр Азр Азп Азр Агд Рго Зег
5 <210> 257 <211>9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.08, которая кодирует УЬ-СОКЗ <400> 257
Зег А1а Туг Азр Туг Зег А1а Агд ТНг
5 <210> 258 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.09, которая кодирует УЬ-СОК1 <400> 258
Зег О1у Азр Азп Ьеи 61у Зег Ьуз Туг Уа1 Зег
10 <210> 259
- 206 020508 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.09, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 259
Азр Азр Азр Азр Агд Рго Зег
5 <210> 260 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.09, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 260
Зег Зег Туг Азр РЬе Ьеи Азп 11е С1у Ьеи
10 <210> 261 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.10, которая кодирует УЬ-СИКД <400> 261
Зег 61у Азр Зег Ьеи С1у Ьуз Ьуз Зег Уа1 Нтз
10 <210> 262 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 207 020508 <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа. 10, которая кодирует УЫ-СИК2 <400> 262
О1и Азр Зег С1и Агд Рго Зег
5 <210> 263 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.Ю, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 263
Зег Зег Туг ТЬг Азп Зег Ча1 Азр
5 <210> 264 <211> И <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.11, которая кодирует УЬ-СИК1 <400> 264
Зег С1у Азр Азп Ьеи О1у Ьуз Ьуз Туг Ча1 <31у
10 <210> 265 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.11, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 265
- 208 020508
Азр Азр Азр Азп Агд Рго Зег
5 <210> 266 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.11, которая кодирует УЬ-СОКЗ <400> 266
С1п Зег Туг Азр Азр ТНг Зег 11е
5 <210> 267 <211> И <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.12, которая кодирует УЬ-СОК1 <400> 267
Зег С1у Азр Зег Ьеи О1у Азп Ьуз Туг Уа1 Нтз
10 <210> 268 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.12, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 268
Азр Азр Зег Азр Агд Рго Зег
5 <210> 269
- 209 020508 <211> 8 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.12, которая кодирует УЬ-СОКЗ <400> 269 <31п ТНг Тгр Азр Туг Уа1 С1у Туг
5 <210> 270 <211> 14 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.13, которая кодирует УЬ-СОК1 <400> 270
ТНг О1у ТНг Зег Зег Азр Уа1 С1у С1у Туг Азп Туг Уа1 Зег
10 <210> 271 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.13, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 271
Азр Уа1 Зег Азп Агд Рго Зег
5 <210> 272 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 210 020508 <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ыа.13, которая кодирует УЬ-СИК.3 <400> 272
О1п Зег Туг Азр Аг§ Туг Аг§ Ьеи Ьуз Азп
5 10 <210> 273 <211> 119 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы02 <400> 273
РНе Туг Зег Нхз Зег А1а Θΐη Туг С1и Ьеи ТНг 61п Рго Рго Зег Уа1
1 5 10 15
Зег Уа1 Зег Рго СЯу СЯп ТНг А1а Зег Не ТНг Суз Зег СЯу Азр Ьуз
20 25 30
Ьеи СЯу Азр Ьуз РНе А1а Зег Тгр Туг СЯп С1п Ьуз А1а С1у С1п Зег
35 40 45
Рго Уа1 Ьеи Уа1 11е РНе С1п Азр Агд Ьуз Агд Ьеи Зег СЯу Не Рго
50 55 60
С1и Агд РНе Зег СЯу Зег Азп Зег <31у Азп ТНг А1а ТНг Ьеи ТНг 11е
65 70 75 80
Зег О1у ТНг σΐη А1а МеЕ Азр 61и А1а Азр Туг Туг Суз С1п А1а Тгр
85 90 95
Азр ТНг Азп ТНг Уа1 Уа1 РНе С1у СЯу С1у ТНг Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Ьеи
100 105 110
С1у С1п Рго Ьуз А1а А1а Рго 115
<210> 274 <211> 120 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 211 020508 <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы09 <400> 274
РНе Туг 1 Зег Н±з Зег А1а С1п 5 Азр Не С1п 10 МеР ТНг С1п Зег Рго 15 Зег
Зег Ьеи Зег А1а РНе Уа1 С1у Азр Агд Уа1 А1а Не ТНг Суз Агд А1а
20 25 30
Зег С1п Зег Не Азр ТНг Туг Ьеи Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у
35 40 45
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг А1а А1а Зег Ьуз Ьеи С1и Азр С1у
50 55 60
Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у Зег С1у ТНг С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи
65 70 75 80
ТНг Не Агд Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РНе С1у ТНг Туг Туг Суз С1п
85 90 95
С1п Зег Туг Зег Рго Рго Ьеи ТНг РНе С1у С1у С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и
100 105 110
Не Ьуз Агд ТНг Уа1 А1а А1а Рго
115 120
<210> 275 <211> 120 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы06 <400> 275
РНе Туг Зег Нхз Зег А1а С1п Азр 11е С1п Мер ТНг С1п Зег Рго Зег
10 15
ТНг Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд 25 Уа1 ТНг Не ТНг Суз 30 Агд А1а
20
Зег С1п Зег Не Зег Зег Тгр Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго СЬу
35 40 45
212
Ьуз А1а 50 Рго Азп Ьеи Ьеи 11е Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи Агд ТНг С1у
55 60
57а 1 Рго Зег Агд РНе Агд С1у Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи
65 70 75 80
ТНг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз Ьеи
85 90 95
С1п Азр Туг Зег Туг Рго Ьеи ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Ьеи С1и
100 105 110
11е Ьуз Агд ТНг Уа1 А1а А1а Рго
115 120
<210> 276 <211> 121 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы05 <400> 276
РНе Туг Зег Нтз Зег А1а С1п Зег Уа1 Ьеи ТНг С1п Рго Рго Зег Уа1
10 15
Зег Уа1 А1а Рго С1у С1п ТНг А1а Агд 11е Зег Суз О1у С1у Азр Азп
25 30
11е С1у Зег Ьуз Зег Уа1 Нтз Тгр Туг С1п С1п Агд Рго С1у С1п А1а
40 45
Рго Уа! Ьеи Уа1 Уа1 Туг Азр Азр Туг Азр Агд Рго Зег О1у 11е Рго
55 60
С1и Агд РНе Зег С1у Зег Азп Зег С1у Азр ТНг А1а 11е Ьеи ТНг Не
70 75 80
ТНг Агд Уа1 С1и Уа1 С1у Азр С1и А1а Азр РНе Туг Суз С1п Уа1 Агд
90 95
Азр Зег Агд ТНг С1и С1и Агд Уа1 РНе С1у С1у С1у ТНг Ьуз Уа1 ТНг
100 105 110
А7а1 Ьеи С1у С1п Рго Ьуз А1а А1а Рго
115 120
- 213 020508 <210> 277 <211> 120 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы08
<400> 277
РНе Туг Зег Н13 Зег А1а С1п Азр Не 61п МеЬ ТНг О1п Зег Рго Зег
1 5 10 15
Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз О1п А1а
20 25 30
Зег С1п Азр 11е Зег Туг Туг Ьеи Азп Тгр Туг <31п С1п Ьуз Рго С1у
35 40 45
Ьуз А1а Рго Ьуз Уа1 Ьеи Не Туг Азр Уа1 Зег Азп Ьеи С1п ТНг С1у
50 55 60
Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у Зег А1а Зег А1а ТНг Азр РНе ТНг Ьеи
65 70 75 80
ТНг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 61и Азр Не А1а ТНг Туг Туг Суз С1п
85 90 95
С1п Зег Азр Азп Ьеи Рго Ьеи ТНг РНе С1у С1у С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и
100 105 110
11е Ьуз Агд ТНг Уа1 А1а А1а Рго
115 120
<210> 278
<211> 120
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы11 <400> 278
РНе Туг Зег Нтз Зег А1а Θΐη Азр 11е С1п МеЬ ТНг С1п Зег Рго Зег
10 15
- 214 020508
Зег Уа1 Зег АЬа Рго 11е С1у Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а
25 30
Зег С1п С1и 11е А1а Азп Туг Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп С1п Ьуз Рго СЬу
40 45
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг Азр ТНг Туг ТНг Ьеи СЬп ТНг Азр
55 60
Уа1 Рго Рго Агд РНе Зег СЬу Зег С1у Зег СЬу ТНг Азр РНе ТНг Ьеи
70 75 80
ТНг 11е Зег Зег Ьеи СЬп Рго СЬи Азр ТНг А1а ТНг Туг РНе Суз СЬп
90 95
СЬп АЬа Азр Не РНе Рго Ьеи Зег РНе СЬу СЬу СЬу ТНг Ьуз Уа1 С1и
100 105 110
Не Ьуз Агд ТНг Уа1 АЬа АЬа Рго
115 120 <210> 279 <211> 122 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы10 <400> 279
РНе 1 Туг Зег НЬз Зег 5 АЬа Οίη Азр Не СЬп МеР 10 ТНг СЬп Зег Рго 15 Зег
Зег МеР Зег АЬа Зег Уа1 СЬу Азр ТНг Уа1 ТНг Не ТНг Суз Агд АЬа
20 25 30
Зег С1п СЬу Не СЬу Азп Тгр Ьеи А1а Тгр Туг СЬп Οίη Ьуз Рго СЬу
35 40 45
Ьуз АЬа Рго ТНг Ьеи Ьеи Не Туг АЬа АЬа Зег Зег Ьеи СЬи Зег СЬу
50 55 60
Уа1 Рго Зег Агд РНе ТНг СЬу Зег СЬу Зег Зег Зег СЬу Не Азр РНе
65 70 75 80
ТНг Ьеи ТНг Не Зег Азр Ьеи НЬз Рго СЬи Азр Ьеи АЬа ТНг Туг Туг
85 90 95
215
Суз С1п С1п А1а С1п ТНг РНе Рго Ьеи ТНг РНе С1у С1у С1у ТНг Агд
100 105 110
Уа1 Азр Ьеи Ьуз Агд ТНг Уа1 А1а А1а Рго
115 120 <210> 280 <211> 121 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы01 <400> 280
РНе Туг Зег 1 ΗΪ8 Зег 5 А1а С1п Азр Не С1п 10 МеЬ ТНг С1п Зег Рго 15 Зег
Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз С1п А1а
20 25 30
Зег С1п Азр Не Зег Азп Туг Ьеи Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у
35 40 45
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг Азр А1а Зег Азп Ьеи С1и ТНг С1у
50 55 60
Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи
65 70 75 80
ТНг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз С1п
85 90 95
С1п А1а Азр Агд РНе Рго А1а Уа1 ТНг РНе С1у С1у СТу ТНг Ьуз Уа1
100 105 110
С1и Не Ьуз Агд ТНг Уа1 А1а А1а Рго
115 120
<210> 281 <211> 118 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 216 020508 <223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи П07 <400> 281
РНе 1 Туг Зег Нтз Зег А1а 5 Θΐη Зег С1и Ьеи ТНг 61п 10 Рго Рго Зег 15 Уа1
Зег Уа1 Зег Рго 61у С1п ТНг А1а Не Не ТНг Суз Зег О1у Азр О1п
20 25 30
Ьеи О1у Азр Ьуз Нтз Уа1 А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у О1п Зег
35 40 45
Рго Уа1 Ьеи Уа1 11е Туг Ьеи Азр Не Ьуз Агд Рго А1а С1у Не Зег
50 55 60
С1и Агд РНе Зег С1у Зег Азп Зег С1у Азп ТНг А1а ТНг Ьеи ТНг Не
65 70 75 80
Агд О1у ТНг О1п А1а МеЕ Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз О1п А1а Тгр
85 90 95
Азр Не Ьуз ТНг Уа1 РНе <31у О1у С1у ТНг Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Ьеи Зег
100 105 но
Θΐη Рго Ьуз А1а А1а Рго
115 <210> 282 <211> 120 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи ЫОЗ <400> 282
РНе 1 Туг Зег НТЗ Зег 5 А1а <31п Азр Не С1п 10 МеЕ ТНг С1п Зег Рго 15 Зег
Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз Агд А1а
20 25 30
Зег С1п Зег Не Зег Зег Туг Ьеи Азп Тгр Туг С1п <31п Ьуз Рго О1у
35 40 45
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи О1п Зег С1у
50 55 60
- 217
Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег <31у Зег С1у Зег 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи
65 70 75 80
ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п
85 90 95
С1п Зег Туг Зег ТЬг Рго Тгр ТЬг РЬе С1у Θΐη О1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и
100 105 110
11е Ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго
115 120
<210> 283 <211> 106 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи 1А7 <400> 283
С1п 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго А1а Не 10 МеР Зег А1а Зег Рго 15 СЯу
С1и Ьуз Уа1 ТЬг МеР ТЬг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеР
20 25 30
Нхз Тгр Туг СЯп С1п Ьуз Зег СЯу ТЬг Зег Рго Ьуз Агд Тгр Не Туг
35 40 45
Азр ТЬг Зег Ьуз Ьеи А1а Зег СЯу Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег <31у Зег
50 55 60
С1у Зег С1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Зег МеР С1и А1а СЯи
65 70 75 80
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз αΐη С1п Тгр Зег Зег Азп Рго РЬе ТЬг
85 90 95
РЬе СЯу Зег С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
100 105
<210> 284
<211> 108
<212> ПРТ
- 218 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи 2РЗ <400> 284
Азр Не 1 С1п МеР ТНг С1п Зег Рго А1а Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 С1у
5 10
С1и ТНг Уа1 ТНг Не ТНг Суз Агд А1а Зег <31у Азп Не Туг Азп Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр РНе 61п С1п Ьуз С1п С1у Ьуз Зег Рго <31п Ьеи Ьеи Уа1
35 40 45
Туг Азп А1а Ьуз ТНг Ьеи Рго Азр О1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у
50 55 60
Зег 61у Зег 61у ТНг С1п Туг РНе Ьеи Ьуз Не Азп Зег Ьеи (31п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РНе <31у Зег Туг Туг Суз С1п Нхз РНе Тгр А1а Не Рго Туг
85 90 95
ТНг РНе С1у С1у С1у ТНг Ьуз Ьеи <31и Не Ьуз Агд
100 105
<210> 285
<211> 114
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи ЗРЮ10.2СЗ <400> 285
Азр 11е Уа1 МеР ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи ТНг \7а1 ТНг А1а О1у
10 15 <31и Ьуз Уа1 ТНг МеР Зег Суз Ьуз Зег Зег Θΐη Зег Ьеи Ьеи Азп Зег
25 30
С1у Азп <31п Ьуз Азп Туг Ьеи ТНг Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п
40 45
Рго Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг Тгр А1а Зег ТНг Агд О1и Зег С1у Уа1
- 219
50 55 60
Рго Азр Агд РЬе ТЬг С1у Зег О1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг
65 70 75 80
11е Азп Зег Уа1 С1п А1а О1и Азр Ьеи А1а Уа1 Туг Туг Суз <31п Азп
85 90 95
Азр Туг Зег Туг Рго Ьеи РЬе ТЬг РЬе О1у Зег <31у ТЬг Ьуз Ьеи С1и
100 105 110
11е Агд <210> 286 <211> 114 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи 3Ρ1Ε11.3Β7 <400> 286
Азр 1 Не Уа1 МеЕ ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи ТЬг Уа1 10 ТЬг А1а 15 (31у
С1и Ьуз Уа1 ТЬг МеЕ Зег Суз Ьуз Зег Зег О1п Зег Ьеи Ьеи Азп Зег
20 25 30
С1у Азп С1п Ьуз Зег Туг Ьеи ТЬг Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п
35 40 45
Рго Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг Тгр А1а Зег ТЬг Агд С1и Зег С1у Уа1
50 55 60
Рго Азр Агд РЬе ТЬг О1у Зег О1у Зег 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг
65 70 75 80
11е Азп Зег Уа1 51п А1а <31и Азр Ьеи А1а Уа1 Туг Туг Суз 61п Азп
85 90 95
Азр Туг Зег Туг Рго Ьеи РЬе ТЬг РЬе 61у Зег С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и
100 105 110
Не Агд
<210> 287
<211> 5
- 220 020508 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (3).. (5) <223> Хаа может представлять собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин <400> 287
Не ТНг Хаа Хаа Хаа
5 <210> 288 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (3).. (5) <223> Хаа может представлять собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин <400> 288
А1а Суз Хаа Хаа Хаа
5 <210> 289 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 221 020508 <223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (3)..(5) <223> Хаа может представлять собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин <400> 289
Уа1 Суз Хаа Хаа Хаа
5 <210> 290 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (3) .. (5) <223> Хаа может представлять собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин <400> 290
Зег Рго Хаа Хаа Хаа
5 <210> 291 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 291
Зег Рго Агд Ьуз Нхз
5
- 222 020508 <210> 292 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <400> 292
Зег Рго Агд Ьуз Ьуз
5 <210> 293 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 293
Зег Рго Агд Ьуз Агд
5 <210> 294 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <400> 294
Зег Рго Ьуз Ьуз Нтз
5 <210> 295 <211> 5 <212> ПРТ
- 223 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <400> 295
Зег Рго Нтз Ьуз Нтз
5 <210> 296 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <400> 296
Зег Рго Агд Агд Нтз
5 <210> 297 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 3р35 <400> 297
Зег Рго Агд Нтз Нтз
5 <210> 298 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35
- 224 020508 <400> 298
Зег Рго Агд Агд Агд
5 <210> 299 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <400> 299
Зег Рго НЬз Нтз ΗΪ8
5 <210> 300 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <400> 300
Зег Рго Ьуз Ьуз Ьуз
5 <210> 301 <211>6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 301
Ьеи Зег Рго Агд Ьуз Нтз
5
- 225 020508 <210> 302 <211> 6 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида δρ35 <400> 302
Ьеи Зег Рго Агд Ьуз Ьуз
5 <210> 303 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <400> 303
Ьеи Зег Рго Агд Ьуз Агд
5 <210> 304 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <400> 304
Ьеи Зег Рго Ьуз Ьуз Нхз
5 <210> 305 <211> 6 <212> ПРТ
- 226 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида δρ35 <400> 305
Ьеи Зег Рго Ηίε Ьуз Нтз
5 <210> 306 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида δρ35 <400> 306
Ьеи Зег Рго Агд Агд Нтз
5 <210> 307 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 307
Ьеи Зег Рго Агд Нтз Нтз
5 <210> 308 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида δρ35
- 227 020508 <400> 308
Ьеи Зег Рго Агд Агд Агд
5 <210> 309 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 309
Ьеи Зег Рго Нтз Нтз Нтз
5 <210> 310 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 310
Ьеи Зег Рго Ьуз Ьуз Ьуз
5 <210> 311 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 311
Тгр Ьеи Зег Рго Агд Ьуз Нтз
5
- 228 020508 <210> 312 <211> Ί <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида δρ35 <400> 312
Тгр Ьеи Зег Рго Агд Ьуз Ьуз
5 <210> 313 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 313
Тгр Ьеи Зег Рго Агд Ьуз Агд
5 <210> 314 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <400> 314
Тгр Ьеи Зег Рго Ьуз Ьуз НЬз
5 <210> 315 <211> 7 <212> ПРТ
- 229 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 315
Тгр Ьеи Зег Рго Нтз Ьуз Нтз
5 <210> 316 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <400> 316
Тгр Ьеи Зег Рго Агд Агд Нтз
5 <210> 317 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида δρ35 <400> 317
Тгр Ьеи Зег Рго Агд Нтз Нтз
5 <210> 318 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35
- 230 020508 <400> 318
Тгр Ьеи Зег Рго Агд Агд Агд
5 <210> 319 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 319
Тгр Ьеи Зег Рго Нхз Нхз Нхз
5 <210> 320 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <400> 320
Тгр Ьеи Зег Рго Ьуз Ьуз Ьуз
5 <210> 321 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 321
11е ТНг Рго Ьуз Агд Агд
5
- 231 020508 <210> 322 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 3р35 <400> 322
А1а Суз Нхз ΗΪ5 Ьуз
5 <210> 323 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 323
Уа1 Суз НЬз Нтз Ьуз
5 <210> 324 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (1)..(2) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <400> 324
- 232 020508
Хаа Хаа Агд Ьуз Нтз
5 <210> 325 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (1) . . (2) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <400> 325
Хаа Хаа Агд Агд Агд
5 <210> 326 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (1)..(2) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <400> 326
Хаа Хаа Ьуз Ьуз Ьуз
5 <210> 327 <211> 5
- 233 020508 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (1)..(2) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <400> 327
Хаа Хаа Нхз Нхз Нхз
5 <210> 328 <211>5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (1) . . (2) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <400> 328
Хаа Хаа Агд Ьуз Ьуз
5 <210> 329 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 234 020508 <223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (1)..(2) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <400> 329
Хаа Хаа Агд Ьуз Агд
5 <210> 330 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (1)..(2) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <400> 330
Хаа Хаа Ьуз Ьуз Нхз
5 <210> 331 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <220>
<221> Нестандартная особенность
- 235 020508 <222> (1)..(2) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <400> 331
Хаа Хаа Нтз Ьуз Нтз
5 <210> 332 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (1)..(2) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <400> 332
Хаа Хаа Агд Агд Нтз
5 <210> 333 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 3р35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (1)..(2) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <400> 333
- 236 020508
Хаа Хаа Агд Шз Шз
5 <210> 334 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида δρ35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (3) . . (3) <223> Хаа может представлять собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (4) . . (4) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (5).. (5) <223> Хаа может представлять собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин <400> 334
Не ТНг Хаа Хаа Хаа
5 <210> 335 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида δρ35
- 237 020508 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (3) . . (3) <223> Хаа может представлять собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (4)..(4) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (5)..(5) <223> Хаа может представлять собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин <400> 335
А1а Суз Хаа Хаа Хаа
5 <210> 336 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида δρ35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (3) . . (3) <223> Хаа может представлять собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (4)..(4) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту
- 238 020508 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (5) . . (5) <223> Хаа может представлять собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин <400> 336
Уа1 Суз Хаа Хаа Хаа
5 <210> 337 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида δρ35 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (3).. (3) <223> Хаа может представлять собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (4)..(4) <223> Хаа может представлять собой любую аминокислоту <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (5)..(5) <223> Хаа может представлять собой лизин, аргинин, гистидин, глутамин или аспарагин <400> 337
Зег Рго Хаа Хаа Хаа
5 <210> 338
- 239 020508 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 338
Зег Рго Агд Ьеи Нхз
5 <210> 339 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 339
Агд Агд А1а Агд 11е Агд Азр Агд Ьуз
5 <210> 340 <211>9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 340
Ьуз Ьуз Уа1 Ьуз А/а1 Ьуз О1и Ьуз Агд
5 <210> 341 <211>9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 240 020508 <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 8р35 <400> 341
Агд Агд Ьеи Агд Ьеи Агд Азр Агд Ьуз
5 <210> 342 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 342
Агд Агд С1у Агд С1у Агд Азр Агд Ьуз
5 <210> 343 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический фрагмент пептида 5р35 <400> 343
Агд Агд 11е Агд А1а Агд Азр Агд Ьуз
5 <210> 344 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический прямой праймер, используемый для того, чтобы показать экспрессию 5р35
- 241 020508 <400> 344 ададасаЬдс даЬЬддЬда 19 <210> 345 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический обратный праймер, используемый для того, чтобы показать экспрессию 8р35 <400> 345 ададаЬдЬад асдаддЬсаЬ Ь 21 <210> 346 <211> 55 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический нуклеотид ΡΗΚΐ 5р35 <400> 346
ЬдаЬсдЬсаЬ ссЬдсЬадас ЬЬсаададад ЬсЬадсадда ЬдасдаЬсЬЬ ЬЬЬЬс 55 <210> 347 <211> 59 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический нуклеотид ΡΗΚΐ 5р35 <400> 347
Ьсдадааааа адаЬсдЬсаЬ ссЬдсЬадас ЬсЬсЬЬдаад ЬсЬадсадда ЬдасдаЬса 59 <210> 348 <211> 59
- 242 020508 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический нуклеотид ΡΗΚΐ δρ35 <400> 348
РдаРссРсаР ссРРсРаРас РРсаададад РдРадсадда РдасдаРсРР РРРРсРсда 59 <210> 349 <211> 59 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический нуклеотид ΡΗΚΐ δρ35 <400> 349
Рсдадааааа адаРсдРсаР ссРдсРадас РсРсРРдаад РаРадаадда РдасдаРса 59 <210> 350 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для амплификации 8р35 полной длины <400> 350 даддаРсРсд асдсддссдс аРддадасад асасасРссР д 41 <210> 351 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для амплификации δρ35 полной длины <400> 351
- 243 020508 ддддсддааС СддаЪссСса садакссЬсС СсЬдадаСда д 41 <210> 352 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для амплификации доминантного отрицательного 8р35 <400> 352 даддаСсСсд асдсддссдс аСддадасад асасасСссС д 41 <210> 353 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для амплификации доминантного отрицательного δρ35 <400> 353 даРасддаСс сЬсадссСЬС дссссддсЬс саСадаааса дс 42 <210> 354 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для получения частичной кодирующей последовательности человеческого 5р35 <400> 354 садсаддСсд асдсддссдс аСдсСддсдд ддддсдЪ 37 <210> 355
- 244 020508 <211> 59 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для получения частичной кодирующей последовательности человеческого 3р35 <400> 355 садсаддРсд ассРсдсссд дсРддРРддс саассадссд ддсдаддРсд ассРсдадд 59 <210> 356 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для определения последовательности легкой цепи Р1Е11.3В7 <400> 356 ддддаРаРсс ассаРддаРР РРсаддРдса даРРРРсад 39 <210> 357 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для определения последовательности легкой цепи Р1Е11.3В7 <400> 357 ддддаРаРсс ассардгадр сасакасуса ддРсРРугРа 40 <210> 358 <211> 37 <212> ДНК
- 245 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для определения последовательности легкой цепи Р1Е11.3В7 <400> 358 ддддаСаСсс ассаСдаадС ЪдссСдССад дсСдССд 37 <210> 359 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для определения последовательности легкой цепи Р1Е11.3В7 <400> 359 ддддаЬаЬсс ассаЬдаддк сссст/дсСса дуСусСкдда 4 0 <210> 360 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
< 223 > Синтетический праймер, используемый для определения последовательности тяжелой цепи Р1Е11.3В7 <400> 360 ддддаСаЬсс ассаСддгаС дзадсСдкдС таСзсСсСС 39 <210> 361 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 246 020508 <223> Синтетический праймер, используемый для определения последовательности тяжелой цепи Р1Е11.3В7 <400> 361 ддддаРаРсс ассаРдгасР ЕсдддуРдад сРкддРРРР 39 <210> 362 <211> 38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для определения последовательности тяжелой цепи Р1Е11.3В7 <400> 362 ддддаРаРсс ассаРддсРд РсРРддддсР дсРсРРсР 38 <210> 363 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для определения последовательности тяжелой цепи Р1Е11.3В7 <400> 363 аддРсРадаа усРссасаса саддггссад РддаРадас 39 <210> 364 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический универсальный праймер тяжелой цепи <400> 364
- 247 020508 аддЕзтагсЬ дсадзадСсм дд 22 <210> 365 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический универсальный праймер тяжелой цепи <400> 365
Сдаддадасд дСдассдЬдд ЬсссССддсс ссад 34 <210> 366 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер вырожденной сигнальной последовательности <220>
<221> нестандартная особенность <222> (21)..(21) <223> η может представлять собой любой нуклеотид <220>
<221> нестандартная особенность <222> (24) . . (24) <223> η может представлять собой любой нуклеотид <400> 366 аЕддагСдуа ауСддаЬЬсС псспЪЬуа 28 <210> 367 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 248 020508 <220>
<223> Синтетический праймер константного домена <400> 367 аддЬсЬадаа усСссасаса саддггссад ЪддаСадас 39 <210> 368 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для амплификации крысиного МОО <400> 368 ддддЬаесЪс Ссдадаааад ададсаЬсаЬ саСсаесаЬс айаЬдддаса дЪНсададСд 60 аСаддд 66 <210> 369 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер, используемый для амплификации крысиного МОО <400> 369
ЬЬсдсддссд сСаЪЬадсса дддНСдаЬсс адСадааддд 40 <210> 370 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы13 <400> 370 даадЬЬсааС СдСНададСс ЬддЬддсддС сЫздЬЬсадс сСддСддЪЪс ССЬасдЪсЬС 60
ЬсССдсдсЬд сЬЬссддаЬС сасЬСЬсЬсС саССасдада ЬдСаССдддС СсдссаадсС 120
- 249 020508
ссЕддЕааад дЕЕЕддадЕд ддЕЕЕсЕсдЕ аЕсдЕЕЕсЕЕ сЕддЕддсЕЕ ЕасЕаадЕаЕ 180
дсЕдасЕссд ЕЕаааддЕсд сЕЕсасЕаЕс ЕсЕададаса асЕсЕаадаа ЕасЕсЕсЕас 240
ЕЕдсадаЕда асадсЕЕаад ддсЕдаддас асддссдЕдЕ аЕЕасЕдЕдс аасададддЕ 300
даЕааЕдаЕд сЕЕЕЕдаЕаЕ сЕддддссаа дддассасдд ЕсассдЕсЕс аадс 354
<210> 371 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы13 <400> 371
дасаЕссада ЕдасссадЕс Ессадссасс сЕдЕсЕЕЕдЕ сЕссадддда аададссасс 60
сЕсЕссЕдса дддссадЕса дадЕдЕЕадс адсЕасЕЕад ссЕддЕасса асадааассЕ 120
ддссаддсЕс ссаддсЕссЕ саЕсЕаЕдаЕ дсаЕссааса дддссасЕдд саЕсссадсс 180
аддЕЕсадЕд дсадЕдддЕс Едддасадас ЕЕсасЕсЕса ссаЕсадсад ссЕададссЕ 240
даадаЕЕЕЕд садЕЕЕаЕЕа сЕдЕсадсад сдЕадсаасЕ ддссдаЕдЕа сасЕЕЕЕддс 300
саддддасса адсЕддадаЕ сааа 324
<210> 372 <211> 118 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы13 <400> 372
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи (31и Зег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Нхз Туг
20 25 30
О1и МеЕ Туг Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз СЯу Ьеи <31и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Агд Не Уа1 Зег Зег С1у <31у РНе ТНг Ьуз Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
250 020508
Ьуз 61у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи Θΐη Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а ТНг б1и С1у Азр Азп Азр А1а РНе Азр 11е Тгр С1у С1п С1у ТНг
100 105 но
ТНг Уа1 ТНг Уа! Зег Зег
115
<210> 373 <211> 108 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Гл 13 <400> 373
Азр 1 Не <31п МеР ТНг 5 С1п Зег Рго А1а ТНг Ьеи 10 Зег Ьеи Зег Рго 15 <31у
С1и Агд А1а ТНг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТНг О1у Не Рго А1а Агд РНе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи С1и Рго
65 70 75 80
С1и Азр РНе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго МеР
85 90 95
Туг ТНг РНе О1у С1п С1у ТНг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
100 105
<210> 374
<211> 354
<212> ДНК
- 251 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы32 <400> 374
даадРРсааР РдРРададРс РддРддсддР сРРдРРсадс сРддРддРРс РРРасдРсРР 60
РсРРдсдсРд сРРссддаРР сасРРРсРсР дсРРасаРда РдсадРдддР РсдссаадсР 120
ссРддРааад дрррддадрд ддРРРсРРсР аРсРсРссРР сРддРддсаа РасРаадРаР 180
дсРдасРссд РРаааддРсд сРРсасРаРс РсРададаса асРсРаадаа РасРсРсРас 240
РРдсадаРда асадсРРаад ддсРдаддас асддссдРдР аРРасРдРдс дададдадаР 300
РаРддаРасР ддррсдассс сРддддссад ддсасссРдд РсассдРсРс аадс 354
<210> 375 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы32 <400> 375
дасаРссада РдасссадРс РссадасРсс сРдРсРдсаР сРдРРддада сададРсасс 60
аРсасРРдсс аддсдадРса адасаРРадс РасРаРРРаа аРРддРаРса дсадааасса 120
дддаРддссс сРааасРссР саРсРасдаР дссРРсаРРР Рддааддадд ддссссаРса 180
сддРРсадРд ддадсддсРс РдддасадаР РРРРсРРРса ссаРсадсаа РсРасадссР 240
даддаРаРРд саасРРаРРР сРдРсаасад РсРдаРсаас РдсссдРдас сРРсддссаа 300
дддассаадд РддаааРсад а 321
<210> 376 <211> 118 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы32 <400> 376
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у О1у С1у Ьеи Уа1 Θΐη Рго С1у С1у
- 252 020508
10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег А1а Туг
25 30
МеН МеН О1п Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр А7а1
40 45
Зег Зег Не Зег Рго Зег С1у <31у Азп ТНг Ьуз Туг А1а Азр Зег Уа1
55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
70 75 80
Ьеи С1п МеН Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
90 95
А1а Агд С1у Азр Туг <31у Туг Тгр РНе Азр Рго Тгр С1у 61п С1у ТНг
100 105 110
Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115 <210> 377 <211> 107 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы32 <400> 377
Азр Не С1п МеН ТНг Θΐη Зег Рго Азр Зег Ьеи Зег А1а Зег Ча1 С1у
10 15
Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз С1п А1а Зег С1п Азр Не Зег Туг Туг
25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у МеН А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
40 45
Туг Азр А1а РНе Не Ьеи С1и <31у С1у А1а Рго Зег Агд РНе Зег С1у
55 60
Зег 61у Зег 61у ТНг Азр РНе Зег РНе ТНг Не Зег Азп Ьеи С1п Рго
70 75 80
С1и Азр Не А1а ТНг Туг РНе Суз С1п С1п Зег Азр С1п Ьеи Рго Уа1
253 020508
90 95
ТНг РНе (31у (31п <31у ТНг Ьуз Уа1 О1и Не Агд
100 105 <210> 378 <211> 357 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи ЫЗЗ <400> 378
даадРРсааР РдРРададРс РддРддсддР сРРдРРсадс сРддРддРРс РРРасдРсРР 60
РсРРдсдсРд сРРссддаРР сасРРРсРсР аРРРасссРа РдРРРРдддР РсдссаадсР 120
ссРддРааад дрррддадрд ддРРРсРРдд аРсддРссРР сРддРддсаР РасРаадРаР 180
дсРдасРссд РРаааддРсд сРРсасРаРс РсРададаса асРсРаадаа РасРсРсРас 240
РРдсадаРда асадсРРаад ддсРдаддас асадссасаР аРРасРдРдс дадададддд 300
саРаасдасР ддРасРРсда РсРсРддддс сдрддсассс РддРсассдР сРсаадс 357
<210> 379 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи ЫЗЗ <400> 379
дасаРссада РдасссадРс Рссаддсасс сРдРсРРРдР сРссадддда аададссасс 60
сРсРссРдса дддссадРса дадРдРРадс адсРасРРад ссРддРасса асадааассР 120
ддссаддсРс ссаддсРссР саРсРаРдаР дсаРссааса дддссасРдд саРсссадсс 180
аддРРсадРд дсадРдддРс Рдддасадад РРсасРсРса ссаРсадсад ссРдсадРсР 240
даддаРРРРд садРРРаРРа сРдРсадсад РаРдаРаадР ддссдсРсас РРРсддсдда 300
дддассаадд РддадаРсаа а 321
<210> 380 <211> 119
- 254 020508 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический последовательность вариабельной области тяжелой цепи 1433 <400> 380
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Не Туг
20 25 30
Рго МеЬ РНе Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Тгр 11е С1у Рго Зег С1у С1у Не ТНг Ьуз Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а ТНг Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд С1и С1у ΗΪ8 Азп Азр Тгр Туг РНе Азр Ьеи Тгр С1у Агд С1у
100 105 110
ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115
<210> 381
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи 1433 <400> 381
Азр 11е С1п МеЬ ТНг С1п Зег Рго С1у ТНг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
10 15
С1и Агд А1а ТНг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг
25 30
- 255
Ьеи А1а Тгр Туг Θΐη Οίη Ьуз Рго С1у <31п А1а Рго Агд 45 Ьеи Ьеи Не
35 40
Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг С1у Не Рго А1а Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг <31и РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Зег
65 70 75 80
О1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз <31п С1п Туг Азр Ьуз Тгр Рго Ьеи
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 382
<211> 357
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы34 <400> 382
даадРРсааР РдРРададРс рддрддсддр сРРдРРсадс сРддРддРРс РРРасдРсРР 60
РсРРдсдсРд сРРссддаРР сасРРРсРсР ааРРасдада РдРаРРдддР РсдссаадсР 120
ссРддРааад дрррддадрд ддрррсрддр аРсРаРРсРР сРддРддсаР РасРдРРРаР 180
дсРдасРссд РРаааддРсд сРРсасРаРс РсРададаса асРсРаадаа РасРсРсРас 240
РРдсадаРда асадсРРаад ддсРдаддас асддссдрдр аРРасРдРдс Радддсадсс 300
аРссРсдасР ддРасРРсда РсРсРддддс сдрддсассс РддРсассдР сРсаадс 357
<210> 383 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы34 <400> 383 дасаРссада РдасссадРс РссаРссРсс сРдРсРдсаР сРдРаддада сададРсасс 60 аРсасРРдсс аРдсдадРса ддасаРРадс аасРаРРРаа дРРддРаРса дсадааасса 120
- 256 020508
ддРааадссс сРааасРссР даРсРасдаР дсРРРсааРР Рддадасадд адРсссаРсд 180
аддРРсадРд даадРддаРс РддсасадаР РРРасаРРса ссаРсадсад ссРдсадссР 240
даадаРРРРд саасаРаРРа сРдРсадсас РаРдаРааРс РсссаРРсас РРРсддсссР 300
дддассадад РддсдаРсад а 321
<210> 384 <211> 119 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы34 <400> 384
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи 5 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго О1у С1у
10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег Азп Туг
20 25 30
С1и МеР Туг Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз О1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег (31у 11е Туг Зег Зег С1у О1у 11е ТНг Уа1 Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеР Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд А1а А1а 11е Ьеи Азр Тгр Туг РНе Азр Ьеи Тгр С1у Агд С1у
100 105 110
ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115
<210> 385
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
257 020508 <223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы34 <400> 385
Азр 1 Не О1п МеР ТНг 5 О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 О1у
10 15
Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз НЬз А1а Зег СЯп Азр Не Зег Азп Туг
20 25 30
Ьеи Зег Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр А1а РНе Азп Ьеи О1и ТНг С1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег О1у
50 55 60
Зег О1у Зег О1у ТНг Азр РНе ТНг РНе ТНг Не Зег Зег Ьеи О1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз О1п Ηίβ Туг Азр Азп Ьеи Рго РНе
85 90 95
ТНг РНе СЯу Рго ОТу ТНг Агд Уа1 А1а Не Агд
100 105
<210> 386 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Синтетическая последовательность из антитела Ы13, которая кодирует УЬ-СИК.1 <400> 386
Агд А1а Зег Οίη Зег Уа1 Зег Зег Туг Ьеи А1а
10 <210> 387 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы13, которая кодирует УЬ-СИК2
- 258 020508 <400> 387
Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТНг
5 <210> 388 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы13, которая кодирует УЬ-СЭИЗ <400> 388
Θΐη σΐη Агд Зег Азп Тгр Рго МеН Туг ТНг
10 <210> 389 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы13, которая кодирует УН-СОК.1 <400> 389
Нхз Туг С1и МеН Туг
5 <210> 390 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы13, которая кодирует УН-СОК2 <400> 390
Агд Не Уа1 Зег Зег С1у С1у РНе ТНг Ьуз Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
- 259 020508 <31у <210> 391 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЬПЗ, которая кодирует УН-СОКЗ <400> 391
С1и С1у Азр Азп Азр А1а РНе Азр 11е
5 <210> 392 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы32, которая кодирует УЬ-СОК.1 <400> 392
С1п А1а Зег С1п Азр 11е Зег Туг Туг Ьеи Азп
10 <210> 393 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы32, которая кодирует УЬ-СЭК2 <400> 393
Азр А1а РНе 11е Ьеи С1и О1у
5 <210> 394 <211> 9
- 260 020508 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1232, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 394
С1п Θΐη Зег Азр О1п Ьеи Рго Уа1 ТНг
5 <210> 395 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1232, которая кодирует УН-СИК2 <400> 395
А1а Туг МеЕ МеЕ С1п
5 <210> 396 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1232, которая кодирует УН-СИК2 <400> 396
Зег 11е Зег Рго Зег С1у С1у Азп ТНг Ьуз Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 397 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 261 020508 <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы32, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 397
С1у Азр Туг О1у Туг Тгр РЬе Азр Рго
5 <210> 398 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫЗЗ, которая кодирует УЬ-СПК1 <400> 398
Агд А1а Зег <31п Зег Уа1 Зег Зег Туг Ьеи А1а
10 <210> 399 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫЗЗ, которая кодирует УИ-СИК2 <400> 399
Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг
5 <210> 400 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫЗЗ, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 400
- 262 020508
01η 01η Туг Азр Ьуз Тгр Рго Ьеи ТЬг
5 <210> 401 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫЗЗ, которая кодирует УН-СИК1 <400> 401
Не Туг Рго Мер РЬе
5 <210> 402 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫЗЗ, которая кодирует УН-СИК2 <400> 402
Тгр 11е С1у Рго Зег С1у С1у 11е ТЬг Ьуз Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 403 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЫЗЗ, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 403
С1и (31у Нхз Азп Азр Тгр Туг РЬе Азр Ьеи
10
- 263 020508 <210> 404 <211> 11 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы34, которая кодирует УЬ-СИКЛ <400> 404
Нтз А1а Зег <31п Азр 11е Зег Азп Туг Ьеи Зег
10 <210> 405 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы34, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 405
Азр А1а РНе Азп Ьеи С1и ТНг
5 <210> 406 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы34, которая кодирует УЬ-СИК.3 <400> 406
С1п Нхз Туг Азр Азп Ьеи Рго РНе ТНг
5 <210> 407 <211> 5 <212> ПРТ
- 264 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы34, которая кодирует УН-СПК1 <400> 407
Азп Туг С1и МеР Туг
5 <210> 408 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
<400> 408
О1у Не Туг Зег Зег 61у СЬу 11е ТНг УаЬ Туг АЬа Азр Зег Уа1 Ьуз
10 15
СЬу <210> 409 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы34, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 409
А1а АЬа 11е Ьеи Азр Тгр Туг РНе Азр Ьеи
10 <210> 410 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
- 265 020508 <223> Синтетическая последовательность из антитела ЗВ5.2, которая кодирует УН-СОК1 <400> 410
Зег Туг Тгр МеР Нхз
5 <210> 411 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗВ5.2, которая кодирует УН-СОК2 <400> 411
Уа1 Не Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТНг Азп Туг Азп С1п Ьуз РНе Агд
10 15
С1у <210> 412 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗВ5.2, которая кодирует УН-СИКЗ <400> 412
Рго Туг Туг С1у Зег Нхз Тгр РНе РНе Азр Уа1
10 <210> 413 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗВ5.2, которая кодирует УЬ-СИК1 <400> 413
- 266 020508
Зег А1а Зег Зег Агд Уа1 Зег Туг Уа1 НЬз
10 <210> 414 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗВ5.2, которая кодирует УЬ-СИКД <400> 414
Азр ТНг Зег Азп Ьеи А1а Зег
5 <210> 415 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗВ5.2, которая кодирует УЬ-СОКЗ <400> 415
С1п С1п Тгр Зег ТНг Азп Рго Рго ТНг
5 <210> 416 <211> 120 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи ЗВ5.2 <400> 416
О1п Уа1 С1п Ьеи С1п <31п Рго С1у А1а С1и Ьеи Уа1 Агд Рго С1у ТНг
10 15
- 267 020508
Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1у Туг ТНг РНе ТНг Зег Туг
25 30
Тгр МеС Нхз Тгр Уа1 Ьуз <31п Агд Рго С1у Θΐη <31у Ьеи б1и Тгр Не
40 45
С1у Уа1 Не Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТНг Азп Туг Азп С1п Ьуз РНе
55 60
Агд С1у Ьуз А1а ТНг Ьеи ТНг Уа1 Азр ТНг Зег Зег Зег ТНг А1а Туг
70 75 80
МеЬ С1п Ьеи Зег Зег Ьеи ТНг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз
90 95
А1а Агд Рго Туг Туг С1у Зег Нхз Тгр РНе РНе Азр Уа1 Тгр 61у ТНг
100 105 110 <31у ТНг ТНг Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 417 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи ЗВ5.2 <400> 417
С1п Не \7а1 Ьеи ТНг С1п Зег Рго А1а Не МеН Зег А1а Зег Рго О1у
10 15
С1и Ьуз ν3ΐ ТНг МеН ТНг Суз Зег А1а Зег Зег Агд Уа1 Зег Туг Уа1
25 30
Нхз Тгр Туг 61п С1п Ьуз Зег С1у ТНг Зег Рго Ьуз Агд Тгр Ьеи Туг
40 45
Азр ТНг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго А1а Агд РНе С1у С1у Азп
55 60
С1у Зег <31у ТНг Зег Туг Зег Ьеи ТНг Не Зег Зег МеН С1и А1а С1и
70 75 80
Азр А1а А1а ТНг Туг Туг Суз С1п (31п Тгр Зег ТНг Азп Рго Рго ТНг
90 95
268
РНе (31у С1у <31у ТНг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз
100 105 <210> 418 <211> 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая консенсусная последовательность человеческой и мышиной каппа-легкой цепи <400> 418
Зег С1у Зег С1у Зег С1у
5 <210> 419 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность мутантной вариабельной областилегкой цепи ЗВ5.2 <400> 419
С1п 1 11е Уа1 Ьеи ТНг 5 С1п Зег Рго А1а Не 10 МеЕ Зег А1а Зег Рго 15 С1у
С1и Ьуз Уа1 ТНг МеЕ ТНг Суз Зег А1а Зег Зег Агд Уа1 Зег Туг Уа1
20 25 30
ΗΪ3 Тгр Туг С1п С1п Ьуз Зег С1у ТНг Зег Рго Ьуз Агд Тгр Ьеи Туг
35 40 45
Азр ТНг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго А1а Агд РНе Зег О1у Зег
50 55 60
С1у Зег С1у ТНг Зег Туг Зег Ьеи ТНг 11е Зег Зег МеЕ С1и А1а С1и
65 70 75 80
Азр А1а А1а ТНг Туг Туг Суз С1п С1п Тгр Зег ТНг Азп Рго Рго ТНг
85 90 95
- 269
РНе <31у С1у С1у ТНг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз
100 105 <210> 420 <211> 1404 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность мышиного и человеческого химерного антитела
ЗВ5.2 <400> 420
аРдддаРдда дсРдРдРааР дсРсРРддРа РсаасадсРа саддрдрсса сРсссаддРс 60
саасРдсадс адссРддддс РдадсРддРд аддссРддда сРРсадРдаа дРРдРссРдс 120
адддсРРсРд дсРасассРР сассадсРас РддаРдсасР дддРааадса даддссРдда 180
сааддссРРд адРддаРсдд адРдаРРдаР ссРРсРдаРа дРРаРасРаа сРасааРсаа 240
аадРРсаддд дсааддссас аРРдасРдРа дасасаРссР ссадсасадс сРасаРдсад 300
сРсадсадсс РдасаРсРда ддасРсРдсд дРсРаРРасР дрдсаадасс РРасРасддР 360
адРсасРддР РсРРсдаРдР сРддддсаса дддассасдд РсассдРсРс сРсадссРсс 420
ассаадддсс саРсддРсРР сссссРддса сссРссРсса ададсассРс Рдддддсаса 480
дсддсссРдд дсРдссРддР сааддасРас РРссссдаас сддрдасддр дрсдрддаас 540
Рсаддсдссс Рдассадсдд сдрдсасасс РРсссддсРд РссРасадРс сРсаддасРс 600
РасРсссРса дсадсдрддр дассдрдссс РссадсадсР Рдддсассса дассРасаРс 660
рдсаасдрда аРсасаадсс садсаасасс ааддрддаса адааадРРда дсссаааРсР 720
рдрдасаада сРсасасаРд сссассдРдс ссадсассРд аасРссРддд дддассдРса 780
дРсРРссРсР Рссссссааа асссааддас асссРсаРда РсРсссддас сссРдаддРс 840
асаРдсдРдд РддРддасдР дадссасдаа дасссРдадд РсаадРРсаа сРддРасдРд 900
дасддсдрдд аддРдсаРаа Рдссаадаса аадссдсддд аддадсадРа саасадсасд 960
РассдРдРдд РсадсдРссР сассдРссРд сассаддасР ддсРдааРдд сааддадРас 1020
аадРдсаадд РсРссаасаа адсссРссса дсссссаРсд адаааассаР сРссааадсс 1080
ааадддсадс сссдадаасс асаддРдРас асссРдсссс саРсссддда рдадсРдасс 1140
аадаассадд РсадссРдас сРдссРддРс аааддсРРсР аРсссадсда саРсдссдРд 1200
дадРдддада дсааРдддса дссддадаас аасРасаада ссасдссРсс сдРдРРддас 1260
РссдасддсР ссРРсРРссР сРасадсаад сРсассдРдд асаададсад дрддсадсад 1320
дддаасдРсР РсРсаРдсРс сдРдаРдсаР даддсРсРдс асаассасРа сасдсадаад 1380
- 270 020508 адссЕсЕссс ЕдЕсЕсссдд ЕЕда 1404 <210> 421 <211> 708 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность мышиного и человеческого химерного антитела
ЗВ5.2 <400> 421
аЕддаЕЕЕЕс аддЕдсадаЕ ЕЕЕсадсЕЕс сЕдсЕааЕса дЕдссЕсадЕ саЕааЕаЕсс 60
ададдасааа ЕЕдЕЕсЕсас ссадЕсЕсса дсааЕсаЕдЕ сЕдсаЕсЕсс аддддадаад 120
дЕсассаЕда ссЕдсадЕдс садсЕсасдЕ дЕаадЕЕасд ЕдсасЕддЕа ссадсадаад 180
ЕсаддсассЕ сссссаааад аЕддсЕЕЕаЕ дасасаЕсса ассЕддсЕЕс ЕддадЕсссЕ 240
дсЕсдсЕЕсд дЕддсааЕдд дЕсЕдддасс ЕсЕЕасЕсЕс ЕсасааЕсад садсаЕддад 300
дсЕдаадаЕд сЕдссасЕЕа ЕЕасЕдссад садЕддадЕа сЕаасссасс сасдЕЕсдда 360
ддддддасса адсЕддаааЕ аааасдЕасд дЕддсЕдсас саЕсЕдЕсЕЕ саЕсЕЕсссд 420
ссаЕсЕдаЕд адсадЕЕдаа аЕсЕддаасЕ дссЕсЕдЕЕд ЕдЕдссЕдсЕ дааЕаасЕЕс 480
ЕаЕсссадад аддссааадЕ асадЕддаад дЕддаЕаасд сссЕссааЕс дддЕаасЕсс 540
саддададЕд Есасададса ддасадсаад дасадсассЕ асадссЕсад садсасссЕд 600
асдсЕдадса аадсадасЕа сдадааасас ааадЕсЕасд ссЕдсдаадЕ сасссаЕсад 660
ддссЕдадсЕ сдсссдЕсас ааададсЕЕс аасаддддад адЕдЕЕад 708
<210> 422 <211> 360 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи ЗВ5.2 <400> 422
саддЕссаас Едсадсадсс ЕддддсЕдад сЕддЕдаддс сЕдддасЕЕс адЕдаадЕЕд 60
ЕссЕдсаддд сЕЕсЕддсЕа сассЕЕсасс адсЕасЕдда ЕдсасЕдддЕ ааадсададд 120
ссЕддасаад дссЕЕдадЕд даЕсддадЕд аЕЕдаЕссЕЕ сЕдаЕадЕЕа ЕасЕаасЕас 180
- 271 020508 ааЕсаааадЕ Есаддддсаа ддссасаЕЕд асЕдЕадаса саЕссЕссад сасадссЕас 240 аЕдсадсЕса дсадссЕдас аЕсЕдаддас ЕсЕдсддЕсЕ аЕЕасЕдЕдс аадассЕЕас 300
ЕасддЕадЕс асЕддЕЕсЕЕ сдаЕдЕсЕдд ддсасаддда ссасддЕсас сдЕсЕссЕса 360 <210> 423 <211> 318 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи ЗВ5.2 <400> 423 саааСЕдСЕс ЕсасссадЕс ЕссадсааЕс аЕдЕсЕдсаЕ сЕссадддда дааддЕсасс 60 аЕдассЕдса дЕдссадсЕс асдЕдЕаадЕ ЕасдЕдсасЕ ддЕассадса даадЕсаддс 120 ассЕссссса ааадаЕддсЕ ЕЕаЕдасаса ЕссаассЕдд сЕЕсЕддадЕ сссЕдсЕсдс 180
ЕЕсддЕддса аЕдддЕсЕдд дассЕсЕЕас ЕсЕсЕсасаа ЕсадсадсаЕ ддаддсЕдаа 240 даЕдсЕдсса сЕЕаЕЕасЕд ссадсадЕдд адЕасЕаасс сасссасдЕЕ сддадддддд 300 ассаадсЕдд аааЕаааа 318 <210> 424 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗВ5.2, которая кодирует УН-СИКЛ <400> 424 адсЕасЕдда Едсас 15 <210> 425 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗВ5.2, которая кодирует УН-СИК2
- 272 020508 <400> 425 дРдаРРдаРс сРРсРдаРад РРаРасРаас РасааРсааа адРРсадддд с 51 <210> 426 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗВ5.2, которая кодирует УН-СО К.3 <400> 426 ссРРасРасд дРадРсасРд дРРсРРсдаР дРс 33 <210> 427 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗВ5.2, которая кодирует УБ-СОК1 <400> 427 адрдссадср сасдРдРаад РРасдРдсас 30 <210> 428 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗВ5.2, которая кодирует УЬ-СОК2 <400> 428 дасасаРсса ассРддсРРс Р 21 <210> 429 <211> 27 <212> ДНК
- 273 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела ЗВ5.2, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 429 садсадЬдда дЬасЬаассс асссасд 27 <210> 430 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический вариант легкой цепи 1 <400> 430
С1и 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг 5 О1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго О1у
10 15
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеС
20 25 30
Ηίβ Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго С1у О1п А1а Рго Агд Агд Ьеи Не Туг
35 40 45
Азр ТЬг Зег Ьуз Ьеи А1а Зег С1у Не Рго А1а Агд РЬе Зег О1у Зег
50 55 60
С1у Зег С1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1и Рго С1и
65 70 75 80
Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Тгр Зег Зег Азп Рго РЬе ТЬг
85 90 95
РЬе 61у С1п <31у ТЬг Ьуз Уа1 О1и Не Ьуз
100 105
<210> 431
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
274 <223> Синтетический вариант легкой цепи 2
<400> 431
С1п Не ν&1 Ьеи ТНг О1п Зег Рго А1а ТНг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго <31у
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТНг Ьеи Зег Суз Зег А1а Зег Зег Зег ν3ι Зег Туг МеР
20 25 30
Нхз Тгр Туг О1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Агд Ьеи Не Туг
35 40 45
Азр ТНг Зег Ьуз Ьеи А1а Зег С1у 11е Рго А1а Агд РНе Зег С1у Зег
50 55 60
С1у Зег С1у ТНг Азр Туг ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи С1и Рго С1и
65 70 75 80
Азр РНе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Тгр Зег Зег Азп Рго РНе ТНг
85 90 95
РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105 <210> 432 <211> 116 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический вариант тяжелой цепи 2
<400> 432
61п Уа1 С1п Ьеи А/а1 С1п Зег С1у Нхз С1и Уа1 Ьуз С1п Рго О1у А1а
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТНг РНе ТНг Азп Туг
20 25 30
С1у МеР Азп Тгр Уа1 Ьуз О1п А1а Рго 61у 61п С1у Ьеи Ьуз Тгр Мер
35 40 45
О1у Тгр Не Азп ТНг Азр ТНг С1у С1и Рго ТНг Туг ТНг С1и Азр РНе
50 55 60
С1п О1у Агд РНе Уа1 РНе Зег Ьеи Азр ТНг Зег А1а Зег ТНг Уа1 Туг
65 70 75 80
- 275 020508
Ьеи С1п Не Зег Зег Ьеи Ьуз А1а С1и Азр МеН А1а Мер Туг Туг Суз
90 95
А1а Агд С1и С1у Уа1 Нтз РНе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1
100 105 110
ТНг Уа1 Зег Зег
115
<210> 433 <211> 447 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы81 <400> 433
С1и 1 Уа1 Θΐη Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у <31у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Зег А1а Туг
20 25 30
<31и МеС Ьуз Тгр νβΐ Агд С1п А1а Рго <31у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Уа1 11е С1у Рго Зег С1у С1у РНе ТНг РНе Туг А1а Азр Зег 37а 1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а ТНг С1и С1у Азр Азп Азр А1а РНе Азр Не Тгр С1у С1п С1у ТНг
100 105 110
ТНг Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз <31у Рго Зег Уа1 РНе Рго
115 120
Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТНг Зег С1у С1у ТНг А1а А1а Ьеи С1у
130 135 140
Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РНе Рго С1и Рго Уа1 ТНг Уа1 Зег Тгр Азп
145 150 155 160
276
Зег ОЬу АЬа Ьеи ТНг Зег ОЬу УаЬ Ηίε ТНг РНе Рго А1а УаЬ Ьеи СЬп
165 170 175
Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТНг УаЬ Рго Зег Зег
180 185 190
Зег Ьеи ОЬу ТНг СЬп ТНг Туг Пе Суз Азп УаЬ Азп Н1з Ьуз Рго Зег
195 200 205
Азп ТНг Ьуз УаЬ Азр Ьуз Ьуз УаЬ СЬи Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТНг
210 215 220
ΗίΒ ТНг Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу ОЬу Рго Зег
225 230 235 240
УаЬ РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи Мер 11е Зег Агд
245 250 255
ТНг Рго СЬи УаЬ ТНг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго
260 265 270
СЬи УаЬ Ьуз РНе Азп Тгр Туг УаЬ Азр С1у УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа
275 280 285
Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи С1п Туг Азп Зег ТНг Туг Агд УаЬ УаЬ
290 295 300
Зег УаЬ Ьеи ТНг УаЬ Ьеи НЬз С1п Азр Тгр Ьеи Азп ОЬу Ьуз О1и Туг
305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго Пе О1и Ьуз ТНг
325 330 335
Не Зег Ьуз АЬа Ьуз ОЬу ОЬп Рго Агд ОЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТНг Ьеи
340 345 350
Рго Рго Зег Агд Азр СЬи Ьеи ТНг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТНг Суз
355 360 365
Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РНе Туг Рго Зег Азр Пе АЬа УаЬ СЬи Тгр ОЬи Зег
370 375 380
Азп ОЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр
385 390 395 400
Зег Азр ОЬу Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТНг УаЬ Азр Ьуз Зег
405 410 415
Агд Тгр СЬп СЬп СЬу Азп УаЬ РНе Зег Суз Зег УаЬ МеН НЬз СЬи АЬа
420 425 430
- 277 020508
Ьеи ΗΪ5 Азп НЬз Туг ТНг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу
435 440 445 <210> 434 <211> 215 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы81 <400> 434
Азр 1 Не СЬп МеР ТНг 5 СЬп Зег Рго АЬа ТНг Ьеи Зег Ьеи 10 Зег Рго 15 СЬу
СЬи Агд АЬа ТНг Ьеи Зег Суз Агд АЬа Зег СЬп Зег УаЬ Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп АЬа Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр АЬа Зег Азп Агд АЬа ТНг СЬу Не Рго А1а Агд РНе Зег СЬу
50 55 60
Зег СЬу Зег СЬу ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи СЬи Рго
65 70 75 80
СЬи Азр РНе А1а Уа1 Туг Туг Суз СЬп СЬп Агд Зег Азп Тгр Рго МеР
85 90 95
Туг ТНг РНе СЬу СЬп СЬу ТНг Ьуз Ьеи СЬи Не Ьуз Агд ТНг УаЬ АЬа
100 105 110
АЬа Рго Зег Уа1 РНе Не РНе Рго Рго Зег Азр СЬи СЬп Ьеи Ьуз Зег
115 120
СЬу ТНг А1а Зег УаЬ Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РНе Туг Рго Агд СЬи
130 135 140
АЬа Ьуз УаЬ СЬп Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп А1а Ьеи СЬп Зег СЬу Азп Зег
145 150 155 160
СЬп СЬи Зег УаЬ ТНг С1и СЬп Азр Зег Ьуз Азр Зег ТНг Туг Зег Ьеи
165 170 175
Зег Зег ТНг Ьеи ТНг Ьеи Зег Ьуз АЬа Азр Туг СЬи Ьуз НЬз Ьуз УаЬ
180 185 190
- 278
Туг А1а Суз <31и Уа1 ТНг Шз <31п С1у Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТНг Ьуз
195 200 205
Зег РНе Азп Агд О1у О1и Суз
210 215 <210> 435 <211> 447 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Синтетическая последовательность вариабельной области агликозилированной тяжелой цепи 1481 <400> 435
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи 5 С1и Зег О1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго <31у С1у
10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РНе ТНг РНе Зег А1а Туг
20 25 30
С1и МеЬ Ьуз Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго О1у Ьуз СЯу Ьеи <31и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Уа1 Не <31у Рго Зег С1у О1у РНе ТНг РНе Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а ТНг С1и <31у Азр Азп Азр А1а РНе Азр Не Тгр С1у <31п С1у ТНг
100 105 110
ТНг Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз (31у Рго Зег Уа1 РНе Рго
115 120
Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТНг Зег С1у С1у ТНг А1а А1а Ьеи СЯу
130 135 140
Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РНе Рго О1и Рго Уа1 ТНг Уа1 Зег Тгр Азп
145 150 155 160
Зег С1у А1а Ьеи ТНг Зег С1у Уа1 ΗΪ3 ТНг РНе Рго А1а Уа1 Ьеи <31п
279
165 170 175
Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег А/а1 Уа1 ТНг Уа1 Рго Зег Зег
180 185 190
Зег Ьеи СЬу ТНг СЬп. ТНг Туг Не Суз Азп УаЬ Азп НЬз Ьуз Рго Зег
195 200 205
Азп ТНг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТНг
210 215 220
НЬз ТНг Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу Рго Зег
225 230 235 240
УаЬ РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеР 11е Зег Агд
245 250 255
ТНг Рго СЬи Уа1 ТНг Суз УаЬ УаЬ Уа1 Азр ν3ΐ Зег НЬз СЬи Азр Рго
260 265 270
СЬи Уа1 Ьуз РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр СЬу λ/аЬ СЬи Уа1 НЬз Азп А1а
275 280 285
Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег АЬа Туг Агд Уа1 УаЬ
290 295 300
Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг
305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго АЬа Рго 11е СЬи Ьуз ТНг
325 330 335
11е Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп Уа1 Туг ТНг Ьеи
340 345 350
Рго Рго Зег Агд Азр СЬи Ьеи ТНг Ьуз Азп СЬп Уа1 Зег Ьеи ТНг Суз
355 360 365
Ьеи Уа1 Ьуз СЬу РНе Туг Рго Зег Азр 11е АЬа УаЬ СЬи Тгр С1и Зег
370 375 380
Азп СЬу Οίη Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр
385 390 395 400
Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег
405 410 415
Агд Тгр СЬп СЬп СЬу Азп Уа1 РНе Зег Суз Зег УаЬ МеН НЬз С1и А1а
420 425 430
Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТНг О1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу
- 280 020508
435 440 445 <210> 436 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы81, которая кодирует УН-СИКЛ <400> 436
А1а Туг С1и МеС Ьуз
5 <210> 437 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы81, которая кодирует УН-СИК2 <400> 437
Уа1 11е С1у Рго Зег С1у 61у РНе ТНг РНе Туг А1а Азр Зег \7а1 Ьуз
10 15
С1у <210> 438 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы81, которая кодирует УН-СИК.З <400> 438
С1и С1у Азр Азп Азр А1а РНе Азр 11е
5 <210> 439
- 281 020508 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы81, которая кодирует УН-СОК.1 <400> 439 дсРРасдада Рдаад 15 <210> 440 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы81, которая кодирует УН-СОК2 <400> 440 дРРаРсддРс сРРсРддРдд сРРРасРРРР РаРдсРдасР ссдРРааадд Р 51 <210> 441 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы81, которая кодирует УН-СОКЗ <400> 441 дадддРдаРа аРдаРдсРРР РдаРаРс 27 <210> 442 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы81, которая кодирует УЬ-СОК1
- 282 020508 <400> 442
Агд А1а Зег Οίη Зег Уа1 Зег Зег Туг Ьеи А1а
10 <210> 443 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1281, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 443
Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг
5 <210> 444 <211> 10 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Синтетическая последовательность из антитела 1281, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 444
С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Мер Туг ТЬг
10 <210> 445 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела 1281, которая кодирует УЬ-СОК.1 <400> 445 адддссадРс ададРдРРад садсРасРРа дсс 33 <210> 446
- 283 020508 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы81, которая кодирует УЬ-СИК2 <400> 446 даЕдсаЕсса асадддссас Е 21 <210> 447 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность из антитела Ы81, которая кодирует УЬ-СИКЗ <400> 447 садсадсдЕа дсаасЕддсс даЕдЕасасЕ 30 <210> 448 <211> 1341 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области тяжелой цепи Ы81 <400> 448
даадЕасааС ЕдЕЕададЕс ЕддЕддсддЕ сЕЕдЕЕсадс сЕддЕддЕЕс ЕЕЕасдЕсЕЕ 60
ЕсЕЕдсдсЕд сЕЕссддаЕЕ сасЕЕЕсЕсЕ дсЕЕасдада ЕдаадЕдддЕ ЕсдссаадсЕ 120
ссЕддЕааад дЕЕЕддадЕд ддЕЕЕсЕдЕЕ аЕсддЕссЕЕ сЕддЕддсЕЕ ЕасЕЕЕЕЕаЕ 180
дсЕдасЕссд ЕЕаааддЕсд сЕЕсасЕаЕс ЕсЕададаса асЕсЕаадаа ЕасЕсЕсЕас 240
ЕЕдсадаЕда асадсЕЕаад ддсЕдаддас асддссдЕдЕ аЕЕасЕдЕдс аасададддЕ 300
даЕааЕдаЕд сЕЕЕЕдаЕаЕ сЕддддссаа дддассасдд ЕсассдЕсЕс аадсдссЕсс 360
ассаадддсс саЕсддЕсЕЕ сссссЕддса сссЕссЕсса ададсассЕс Ндддддсаса 420
дсддсссЕдд дсЕдссЕддЕ сааддасЕас ЕЕссссдаас сддЕдасддЕ дЕсдЕддаас 480
- 284 020508
Ссаддсдссс Сдассадсдд сдЬдсасасс ЪЪсссддсЬд СссЬасадЬс сЬсаддасЬс 540
СасСсссСса дсадсдСддЬ дассдЪдссс ЬссадсадсС Сдддсассса дассЬасаЬс 600
СдсаасдЬда аЪсасаадсс садсаасасс ааддЬддаса адааадЬЬда дсссаааЬсЬ 660
СдЪдасаада сЬсасасаСд сссассдСдс ссадсассСд аасСссСддд дддассдСса 720
дСсССссЬсЬ Сссссссааа асссааддас асссЪсаЬда ЬсЪсссддас сссСдаддЪс 780
асаСдсдЬдд СддСддасдС дадссасдаа дасссЬдадд ЬсаадЬСсаа сЬддЬасдЬд 840
дасддсдСдд аддЬдсаЬаа Ьдссаадаса аадссдсддд аддадсадСа саасадсасд 900
СассдСдСдд НсадсдСссЬ сассдСссСд сассаддасС ддсЬдааЬдд сааддадЬас 960
аадЬдсаадд ЪсЬссаасаа адсссСссса дсссссаСсд адаааассаС сСссааадсс 1020
ааадддсадс сссдадаасс асаддСдСас асссСдсссс саСсссддда СдадсСдасс 1080
аадаассадд ЬсадссСдас сСдссЬддСс аааддсЪЬсС аСсссадсда саСсдссдСд 1140
дадЬдддада дсааЬдддса дссддадаас аасСасаада ссасдссСсс сдЪдССддас 1200
СссдасддсС ссЬЬсЪЬссЬ сЪасадсаад сСсассдСдд асаададсад дСддсадсад 1260
дддаасдЬсЬ ЬсЬсаЬдсСс сдЬдаЬдсаС даддсСсСдс асаассасСа сасдсадаад 1320
адссЬсЬссс ЬдЪсСсссдд ύ 1341
<210> 449 <211> 648 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность вариабельной области легкой цепи Ы81 <400> 449
даЪаЬссада ЬдасссадНс Сссадссасс сЬдЬсСЬСдС сСссадддда аададссасс 60
сЬсЬссСдса дддссадСса дадСдССадс адсЬасСЬад ссЬддСасса асадааассС 120
ддссаддсСс ссаддсСссЬ саЪсЪаЬдае дсаСссааса дддссасЬдд саЬсссадсс 180
аддССсадСд дсадЪдддЪс Сдддасадас СНсасЪсЪса ссаСсадсад ссСададссЪ 240
даадаЬЬЬЬд садЪЬЪаЬЪа сЪдСсадсад сдЬадсаасЬ ддссдаЬдЪа сасЬЬЬЬддс 300
саддддасса адсСддадаС сааасдСасд дСддсСдсас саЪсЪдЬсСС саСсССсссд 360
ссаСсСдаСд адсадНСдаа аесСддаасС дссСсСдССд ЬдЪдссСдсС дааСаасССс 420
ЪаЬсссадад аддссааадС асадЬддаад дЪддаСаасд сссЪссааЬс дддЬаасСсс 480
саддададЬд Ьсасададса ддасадсаад дасадсассЬ асадссЬсад садсасссСд 540
асдсСдадса аадсадасЬа сдадааасас ааадЬсЪасд ссЬдсдаадС сасссаЬсад 600
ддссЬдадсС сдсссдСсас ааададсЬЪс аасаддддад адСдССад 648
- 285 020508 <210> 450 <211> 1341 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Синтетическая последовательность вариабельной области агликозилированной тяжелой цепи Ы81 <400> 450
даадЬасааС СдССададЬс СддСддсддЪ сЬЬдЬЬсадс сЬддЬддССс ЪЪЪасдЪсЪС 60
СсССдсдсЬд сЪНссддаЕС сасСССсСсС дсССасдада СдаадСдддС СсдссаадсС 120
ссСддСааад дСССддадСд ддеъесЬдСН аЪсддЬссЬС сЬддЬддсСЬ СасЪСЬЪЬаЪ 180
дсСдасСссд ЬЬаааддСсд сССсасЬаЬс СсЪададаса асСсСаадаа СасСсСсСас 240
ССдсадаСда асадсССаад ддсЪдаддас асддссдСдС аЪСасСдСдс аасададддС 300
даСааЪдаЬд сЬЬССдаЪаЕ сСддддссаа дддассасдд СсассдСсСс аадсдссЪсс 360
ассаадддсс саСсддСсЬЬ сссссЬддса сссЕссСсса ададсассСс бдддддсаса 420
дсддсссСдд дсСдссСддС сааддасСас ССссссдаас сддСдасддС дСсдСддаас 480
Ссаддсдссс Ьдассадсдд сдбдсасасс ССсссддсЪд ЬссЕасадЪс сЬсаддасЬс 540
СасСсссСса дсадсдСддС дассдСдссс СссадсадсЬ Ьдддсассса дассСасаСс 600
СдсаасдСда аСсасаадсс садсаасасс ааддСддаса адааадССда дсссаааСсС 660
СдСдасаада сЕсасасаСд сссассдедс ссадсассЬд аасЕссСддд дддассдЪса 720
дСсССссСсС Ъссссссааа асссааддас асссЬсаЬда СсЬсссддас сссСдаддЬс 780
асаСдсдСдд СддСддасдС дадссасдаа дасссСдадд СсаадССсаа сСддСасдСд 840
дасддсдСдд аддСдсаСаа Сдссаадаса аадссдсддд аддадсадСа саасадсдсд 900
СассдЬдСдд СсадсдСссС сассдСссСд сассаддасЕ ддсЪдааСдд сааддадЬас 960
аадЕдсаадд ЬсЕссаасаа адсссЬссса дсссссаЕсд адаааассаЬ сЬссааадсс 1020
ааадддсадс сссдадаасс асаддСдСас асссСдсссс сабсссддда СдадсСдасс 1080
аадаассадд СсадссСдас сСдссЬддНс аааддсЬСсЬ аЪсссадсда саЬсдссдСд 1140
дадЬдддада дсааЬдддса дссддадаас аасЬасаада ссасдссЬсс сдЬдЬЪддас 1200
СссдасддсС ссССсССссС сЬасадсаад сСсассдЬдд асаададсад дСддсадсад 1260
дддаасдСсС ЬсСсаЬдсЬс сдЬдаЬдсаЬ даддсЬсЬдс асаассасСа сасдсадаад 1320
адссСсСссс СдСсСсссдд С 1341
<210> 451
- 286 020508 <211> 94 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность мышиной вариабельной области легкой цепи подгруппы каппа 6 <400> 451
С1п 1 Не Уа1 Ьеи ТНг 5 О1п Зег Рго АТа Х1е 10 МеЕ Зег А1а Зег Рго 15 О1у
О1и Ьуз Уа1 ТНг МеЕ ТНг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЕ
20 25 30
Нхз Тгр Туг Охп Охп Ьуз Зег О1у ТНг Зег Рго Ьуз Агд Тгр Не Туг
35 40 45
Азр ТНг Зег Ьуз Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго А1а Агд РНе Зег О1у Зег
50 55 60
О1у Зег С1у ТНг Зег Туг Зег Ьеи ТНг Не Зег Зег МеЕ О1и А1а О1и
65 70 75 80
Азр А1а А1а ТНг Туг Туг Суз Охп Охп Тгр Зег Зег Азп Рго
85 90 95
<210> 452 <211> 96 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность мышиной вариабельной области тяжелой цепи подгруппы НУМ5 <400> 452
Охп А/а1 Οίη Ьеи Уа1 Οίη Зег О1у Рго О1и Ьеи Ьуз Ьуз Рго О1у О1и
10 15
ТНг Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТНг РНе ТНг Азп Туг
25 30
- 287 020508
СЬу МеЬ Азп 35 Тгр Уа1 Ьуз Οίη А1а Рго СЬу Ьуз О1у Ьеи Ьуз Тгр МеЬ
40 45
СЬу Тгр Не Азп ТНг Азр ТНг СЬу СЬи Рго ТНг Туг ТНг СЬи Азр РНе
50 55 60
Οίη СЬу Агд РНе АЬа РНе Зег Ьеи СЬи ТНг Зег А1а Зег ТНг УаЬ Туг
65 70 75 80
Ьеи Οίη РНе Азп Азп Ьеи Ьуз Азп СЬи Азр ТНг А1а ТНг Туг РНе Суз
85 90 95
<210> 453 <211> 96 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая мышиная консенсусная последовательност <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (2).. (2) <223> Хаа представляет собой либо изолейцин либо валин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (54) . . (54) <223> Хаа представляет собой либо аспартат, либо глутамат <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (61)..(61) <223> Хаа представляет собой либо треонин, либо аланин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (62) . . (62) <223> Хаа представляет собой либо глутамат либо аспартат
- 288 020508 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (65) . . (65) <223> Хаа представляет собой либо глутамин либо лизин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (79)..(79) <223> Хаа представляет собой либо валин либо аланин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (83) . . (83) <223> Хаа представляет собой либо фенилаланин либо изолейцин <400> 453
СЯп 1 Хаа О1п Ьеи Уа1 5 СЯп Зег 61у Рго СЯи Ьеи 10 Ьуз Ьуз Рго С1у 15 С1и
ТНг Уа1 Ьуз 11е Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТНг РНе ТНг Азп Туг
20 25 30
С1у МеР Азп Тгр Уа1 Ьуз <31п А1а Рго С1у Ьуз СЯу Ьеи Ьуз Тгр МеР
35 40 45
<31у Тгр Не Азп ТНг Хаа ТНг СЯу <31и Рго ТНг Туг Хаа Хаа Азр РНе
50 55 60
Хаа СЯу Агд РНе А1а РНе Зег Ьеи С1и ТНг Зег А1а Зег ТНг Хаа Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Хаа Азп Азп Ьеи Ьуз Азп СЯи Азр ТНг А1а ТНг Туг РНе Суз
85 90 95
<210> 454 <211> 96 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мышиная зародышевая линия ΥΟΚ6
- 289 020508 <400> 454
СТп Пе 1 СТп Ьеи УаТ СТп Зег СТу Рго СТи Ьеи Ьуз Ьуз Рго СТу СТи
5 10 15
ТНг УаТ Ьуз 11е Зег Суз Ьуз АТа Зег СТу Туг ТНг РНе ТНг Азп Туг
20 25 30
С1у МеР Азп Тгр УаТ Ьуз СТп А1а Рго СТу Ьуз СТу Ьеи Ьуз Тгр МеР
35 40 45
СТу Тгр Пе Азп ТНг ОТи ТНг СТу <31и Рго ТНг Туг АТа Азр Азр РНе
50 55 60
Ьуз СТу Агд РНе А1а РНе Зег Ьеи СТи ТНг Зег АТа Зег ТНг АТа Туг
65 70 75 80
Ьеи СТп Пе Азп Азп Ьеи Ьуз Азп СТи Азр ТНг АТа ТНг Туг РНе Суз
85 90 95
<210> 455
<211> 94
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность человеческой вариабельной области легкой цепи подгруппы каппа 3 <400> 455
СТп Пе 1 УаТ Ьеи ТНг 5 СТп Зег Рго АТа Не 10 МеР Зег АТа Зег Рго 15 СТу
СТи Ьуз УаТ ТНг МеР ТНг Суз Зег А1а Зег Зег Зег УаТ Зег Туг МеР
20 25 30
ΗΪ3 Тгр Туг СТп СТп Ьуз Зег СТу ТНг Зег Рго Ьуз Агд Тгр Пе Туг
35 40 45
Азр ТНг Зег Ьуз Ьеи АТа Зег СТу УаТ Рго А1а Агд РНе Зег СТу Зег
50 55 60
СТу Зег СТу ТНг Зег Туг Зег Ьеи ТНг Пе Зег Зег МеР СТи АТа СТи
65 70 75 80
Азр АТа АТа ТНг Туг Туг Суз СТп С1п Тгр Зег Зег Азп Рго
90
- 290 <210> 456 <211> 95 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая консенсусная последовательность <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (1)..(1) <223> Хаа может представлять собой либо глутамин либо глутамат <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (10)..(10) <223 > Хаа может представлять собой либо изолейцин либо треонин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (11)..(11) <223> Хаа может представлять собой либо метионин либо лейцин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (13) . . (13) <223> Хаа может представлять собой либо аланин либо лейцин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (18) . . (18) <223> Хаа может представлять собой либо лизин либо аргинин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (19)..(19)
- 291 020508 <223> Хаа может представлять собой либо валин либо аланин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (21)..(21) <223> Хаа может представлять собой либо метионин либо лейцин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (22)..(22) <223> Хаа может представлять собой либо треонин либо серин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (24)..(24) <223> Хаа может представлять собой либо серин либо аргинин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (27)..(27) <223> Хаа может представлять собой либо серин либо глутамин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (31)..(31) <223> Хаа может либо представлять собой серин либо отсутствовать <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (33) . . (33) <223> Хаа может представлять собой либо метионин либо лейцин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (34) . . (34) <223> Хаа может представлять собой либо гистидин либо аланин
- 292 020508 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (40)..(40) <223> Хаа может представлять собой либо серин либо пролин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (42) . . (42) <223> Хаа может представлять собой либо треонин или глутамин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (43)..(43) <223> Хаа может представлять собой либо серин либо аланин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (45)..(45) <223> Хаа может представлять собой либо лизин либо аргинин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (46)..(46) <223> Хаа может представлять собой либо аргинин либо лейцин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (47)..(47) <223> Хаа может представлять собой либо триптофан либо лейцин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (51)..(51) <223> Хаа может представлять собой либо треонин либо аланин <220>
- 293 020508 <221> Нестандартная особенность <222> (53) . . (53) <223> Хаа может представлять собой либо лизин либо аспарагин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (54) . . (54) <223> Хаа может представлять собой либо лейцин либо аргинин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (56)..(56) <223> Хаа может представлять собой либо серин либо треонин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (58)..(58) <223> Хаа может представлять собой либо валин либо изолейцин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (70) . . (70) <223> Хаа может представлять собой либо серин либо аспартат <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (71)..(71) <223> Хаа может представлять собой либо тирозин либо фенилаланин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (72) . . (72) <223> Хаа может представлять собой либо серин либо треонин <220>
<221> Нестандартная особенность
- 294 020508 <222> (78)..(78) <223> Хаа может представлять собой либо метионин либо лейцин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (80) . . (80) <223> Хаа может представлять собой либо аланин либо пролин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (83) . . (83) <223> Хаа может представлять собой либо аланин либо фенилаланин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (85)..(85) <223> Хаа может представлять собой либо треонин либо валин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (91)..(91) <223> Хаа может представлять собой либо триптофан либо аргинин <220>
<221> М15С особенность <222> (93) . . (93) <223> Хаа может представлять собой либо серин либо аспарагин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (94)..(94) <223> Хаа может представлять собой либо аспарагин либо трипфтофан <400> 456
Хаа Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а Хаа Хаа Зег Хаа Зег Рго О1у
10 15
- 295 020508
С1и Хаа Хаа ТЬг Хаа Хаа Суз Хаа А1а Зег Хаа Зег Уа1 Зег 30 Хаа Туг
20 25
Хаа Хаа Тгр Туг С1п С1п Ьуз Хаа <31у Хаа Хаа Рго Хаа Хаа Хаа 11е
35 40 45
Туг Азр Хаа Зег Хаа Хаа А1а Хаа С1у Хаа Рго А1а Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Хаа Хаа Хаа Ьеи ТЬг Не Зег Зег Хаа С1и Хаа
65 70 75 80
С1и Азр Хаа А1а Хаа Туг Туг Суз <31п Θΐη Хаа Зег Хаа Хаа Рго
90 95 <210> 457 <211> 95 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Человеческая зародышевая линия Ь6 <400> 457
С1и 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 61у
5 10
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг О1у 11е Рго А1а Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1и Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а Ча1 Туг Туг Суз С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго
85 90 95
<210> 458 <211> 98 <212> ПРТ
- 296 020508 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическая последовательность человеческой вариабельной области тяжелой цепи подгруппы МНУ1 <400> 458
С1п 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у Рго С1и Ьеи Ьуз Ьуз Рго С1у С1и 15
5 10
ТНг Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТНг РНе ТНг Азп Туг
20 25 30
С1у МеЕ Азп Тгр Уа1 Ьуз С1п А1а Рго С1у Ьуз О1у Ьеи Ьуз Тгр МеЕ
35 40 45
С1у Тгр 11е Азп ТНг Азр ТНг С1у С1и Рго ТНг Туг ТНг С1и Азр РНе
50 55 60
С1п С1у Агд РНе А1а РНе Зег Ьеи С1и ТНг Зег А1а Зег ТНг Уа1 Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п РНе Азп Азп Ьеи Ьуз Азп С1и Азр ТНг А1а ТНг Туг РНе Суз
85 90 95
А1а Агд
<210> 459
<211> 98
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая консенсусная последовательность <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (9)..(9) <223> Хаа может представлять собой либо пролин либо гистидин <220>
<221> М15С особенность
- 297 020508 <222> (11)..(11) <223> Хаа может представлять собой либо лейцин либо валин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (13). . (13) <223> Хаа может представлять собой либо лизин либо глутамин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (16) . . (16) <223> Хаа может представлять собой либо глутамат либо аланин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (17)..(17) <223> Хаа может представлять собой либо треонин либо серин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (20) . . (20) <223> Хаа может представлять собой либо изолейцин либо валин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (28) . . (28) <223> Хаа может представлять собой либо треонин либо серин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (31) . . (31) <223> Хаа может представлять собой либо аргинин либо треонин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (38)..(38)
- 298 020508 <223> Хаа может представлять собой либо лизин либо пролин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (43) . . (43) <223> Хаа может представлять собой либо лизин либо глутамин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (46) . . (46) <223> Хаа может представлять собой либо лизин либо глутамат <220>
<221> М15СРЕАТХ1КЕ <222> (51)..(51) <223> Хаа может представлять собой либо изолейцин либо фенилаланин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (54) . . (54) <223> Хаа может представлять собой либо аспартат либо тирозин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (57)..(57) <223> Хаа может представлять собой либо глутамат либо аргинин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (61)..(61) <223> Хаа может представлять собой либо треонин либо аланин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (62) . . (62) <223> Хаа может представлять собой либо глутамат либо глутамин
- 299 020508 <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (63)..(63) <223> Хаа может представлять собой либо аспартат либо глицин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (65) . . (65) <223> Хаа может представлять собой либо глутамин либо треонин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (69) . . (69) <223> Хаа может представлять собой либо аланин либо валин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (72) . . (72) <223> Хаа может представлять собой либо лейцин либо метионин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (73) . . (73) <223> Хаа может представлять собой либо глутамат либо аспартат <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (79)..(79) <223 > Хаа может представлять собой либо валин либо аланин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (83)..(83) <223> Хаа может представлять собой либо фенилаланин либо изолейцин <220>
- 300 020508 <221> Нестандартная особенность <222> (84) . . (84) <223> Хаа может представлять собой либо аргинин либо серин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (85)..(85) <223> Хаа может представлять, собой либо аргинин либо серин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (88)..(88) <223> Хаа может представлять собой либо аргинин либо аланин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (91)..(91) <223> Хаа может представлять собой либо треонин либо метионин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (93)..(93) <223> Хаа может представлять собой либо треонин либо метионин <220>
<221> Нестандартная особенность <222> (95) . . (95) <223> Хаа может представлять собой либо фенилаланин либо тирозин <400> 459
СЬп 1 Уа1 Οίη Ьеи УаЬ 5 σΐη Зег СЬу Хаа СЬи 10 Хаа Ьуз Хаа Рго СЬу 15 Хаа
Хаа УаЬ Ьуз Хаа Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу Туг Хаа РЬе ТЬг Хаа Туг
20 25 30
СЬу МеС Азп Тгр УаЬ Хаа СЬп АЬа Рго СЬу Хаа СЬу Ьеи Хаа Тгр МеЬ
35 40 45
301
61у Тгр Хаа Азп ТЬг Хаа ТЬг О1у Хаа 55 Рго ТЬг Туг Хаа Хаа 60 Хаа РЬе
50
Хаа С1у Агд РЬе Хаа РЬе Зег Хаа Хаа ТЬг Зег А1а Зег ТЬг Хаа Туг
65 70 75 80
Ьеи <31п Хаа Хаа Хаа Ьеи Ьуз Хаа О1и Азр Хаа А1а Хаа Туг Хаа Суз
90 95
А1а Агд <210> 460 <211> 98 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Человеческая зародышевая линия НиУН7-81 <400> 460
О1п Уа1 1 О1п Ьеи Уа1 5 Θΐη Зег С1у Ηϊβ <31и 10 Уа1 Ьуз Θΐη Рго С1у 15 А1а
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг Зег РЬе ТЬг ТЬг Туг
20 25 30
С1у МеЕ Азп Тгр Уа1 Рго С1п А1а Рго О1у С1п С1у Ьеи С1и Тгр МеЕ
35 40 45
С1у Тгр РЬе Азп ТЬг Туг ТЬг С1у Азп Рго ТЬг Туг А1а С1п С1у РЬе
50 55 60
ТЬг С1у Агд РЬе Уа1 РЬе Зег МеЕ Азр ТЬг Зег А1а Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи О1п Не Зег Зег Ьеи Ьуз А1а О1и Азр МеЕ А1а МеЕ Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд <210> 461 <211> 1395 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 302 020508 <223> Человеческая последовательность тяжелой цепи Н2 ΗυΡ1Α7-ΙβΟ1 <400> 461
аЕддасЕдда ссЕддадддЕ сЕЕсЕдсЕЕд сЕддсЕдЕад сассаддЕдс ссасЕсссад 60
дЕссаасЕдд ЕасадЕсЕдд асасдаддЕд аадсадссЕд дадсаЕсадЕ сааддЕсЕсс 120
ЕдсааддссЕ сЕдддЕаЕас сЕЕсасааас ЕаЕддааЕда асЕдддЕдаа дсаддсЕссЕ 180
ддасааддЕЕ ЕааадЕддаЕ дддсЕддаЕа аасассдаса сЕддададсс аасаЕаЕасЕ 240
даадаЕЕЕсс адддасддЕЕ ЕдЕсЕЕсЕсЕ ЕЕддасассЕ сЕдссадсас ЕдЕЕЕаЕЕЕд 300
садаЕсадса дссЕсааадс ЕдаддасаЕд дсааЕдЕаЕЕ асЕдЕдсаад ададддддЕс 360
сасЕЕЕдасЕ асЕддддсса адддасссЕЕ дЕсассдЕсЕ ссЕсадссЕс сассаадддс 420
ссаЕсддЕсЕ ЕсссссЕддс асссЕссЕсс аададсассЕ сЕдддддсас адсддсссЕд 480
ддсЕдссЕдд ЕсааддасЕа сЕЕссссдаа ссддЕдасдд ЕдЕсдЕддаа сЕсаддсдсс 540
сЕдассадсд дсдЕдсасас сЕЕсссддсЕ дЕссЕасадЕ ссЕсаддасЕ сЕасЕсссЕс 600
адсадсдЕдд ЕдассдЕдсс сЕссадсадс ЕЕдддсассс адассЕасаЕ сЕдсаасдЕд 660
ааЕсасаадс ссадсаасас сааддЕддас аадааадЕЕд адсссаааЕс ЕЕдЕдасаад 720
асЕсасасаЕ дсссассдЕд сссадсассЕ даасЕссЕдд ддддассдЕс адЕсЕЕссЕс 780
ЕЕссссссаа аасссаадда сасссЕсаЕд аЕсЕсссдда ссссЕдаддЕ сасаЕдсдЕд 840
дЕддЕддасд Едадссасда адасссЕдад дЕсаадЕЕса асЕддЕасдЕ ддасддсдЕд 900
даддЕдсаЕа аЕдссаадас ааадссдсдд даддадсадЕ асаасадсас дЕассдЕдЕд 960
дЕсадсдЕсс ЕсассдЕссЕ дсассаддас ЕддсЕдааЕд дсааддадЕа саадЕдсаад 1020
дЕсЕссааса аадсссЕссс адсссссаЕс дадаааасса ЕсЕссааадс сааадддсад 1080
ссссдадаас сасаддЕдЕа сасссЕдссс ссаЕсссддд аЕдадсЕдас саадаассад 1140
дЕсадссЕда ссЕдссЕддЕ саааддсЕЕс ЕаЕсссадсд асаЕсдссдЕ ддадЕдддад 1200
адсааЕдддс адссддадаа саасЕасаад ассасдссЕс ссдЕдЕЕдда сЕссдасддс 1260
ЕссЕЕсЕЕсс ЕсЕасадсаа дсЕсассдЕд дасаададса ддЕддсадса ддддаасдЕс 1320
ЕЕсЕсаЕдсЕ ссдЕдаЕдса ЕдаддсЕсЕд сасаассасЕ асасдсадаа дадссЕсЕсс 1380
сЕдЕсЕсссд дЕЕда 1395
<210> 462 <211> 464 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Человеческая последовательность тяжелой цепи Н2 ЬиР1А7 Н2 <400> 462
- 303 020508
МеЬ 1 Азр Тгр ТНг Тгр Агд 5 Уа1 РНе Суз Ьеи 10 Ьеи А1а Уа1 А1а Рго 15 <31у
А1а Ηί3 Зег <31п Уа1 СЯп Ьеи Уа1 С1п Зег С1у Нтз С1и Уа1 Ьуз СЯп
20 25 30
Рго С1у А1а Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТНг РНе
35 40 45
ТНг Азп Туг С1у МеЬ Азп Тгр Уа1 Ьуз С1п А1а Рго СЯу С1п СЯу Ьеи
50 55 60
Ьуз Тгр МеЬ С1у Тгр Не Азп ТНг Азр ТНг СЯу С1и Рго ТНг Туг ТНг
65 70 75 80
О1и Азр РНе СЯп СЯу Агд РНе Уа1 РНе Зег Ьеи Азр ТНг Зег А1а Зег
85 90 95
ТНг Уа1 Туг Ьеи С1п Не Зег Зег Ьеи Ьуз А1а СЯи Азр МеЬ А1а МеЬ
100 105 110
Туг Туг Суз А1а Агд 61и СЯу Уа1 Нтз РНе Азр Туг Тгр С1у С1п СЯу
115 120
ТНг Ьеи \7а1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз СЯу Рго Зег Уа1 РНе
130 135 140
Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТНг Зег СЯу СЯу ТНг А1а А1а Ьеи
145 150 155 160
61у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РНе Рго О1и Рго Уа1 ТНг Уа1 Зег Тгр
165 170 175
Азп Зег СЯу А1а Ьеи ТНг Зег О1у Уа1 Нтз ТНг РНе Рго А1а Уа1 Ьеи
180 185 190
СЯп Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТНг Уа1 Рго Зег
195 200 205
Зег Зег Ьеи СЯу ТНг СЯп ТНг Туг Не Суз Азп Уа1 Азп Нтз Ьуз Рго
210 215 220
Зег Азп ТНг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 <31и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз
225 230 235 240
ТНг Нтз ТНг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи О1у СЯу Рго
245 250 255
Зег Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеЬ Не Зег
260 265 270
- 304 020508
Агд ТНг Рго 275 С1и Уа1 ТНг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Нхз С1и Азр
280 285
Рго С1и Уа1 Ьуз РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Нхз Азп
290 295 300
А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и СЯп Туг Азп Зег ТНг Туг Агд Уа1
305 310 315 320
Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Ьеи Нхз С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и
325 330 335
Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз
340 345 350
ТНг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд 61и Рго С1п Уа1 Туг ТНг
355 360 365
Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТНг Ьуз Азп СЯп Уа1 Зег Ьеи ТНг
370 375 380
Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и
385 390 395 400
Зег Азп СЯу С1п Рго СЯи Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг Рго Рго Уа1 Ьеи
405 410 415
Азр Зег Азр СЯу Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТНг Уа1 Азр Ьуз
420 425 430
Зег Агд Тгр СЯп СЯп С1у Азп Уа1 РНе Зег Суз Зег Уа1 Мер Нхз С1и
435 440 445
А1а Ьеи НХЗ Азп Нхз Туг ТНг СЯп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго О1у
450 455 460
<210> 463
<211> 708
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<22 3> Человеческая последовательность каппа-легкой цепи Ы НиР1А7 <400> 463 аРддаРРРРс аддРРсадаР РРРсадсРРс сРдсРааРса дрдссрсадр саРааРаРсс 60 ададдадааа РРдРРсРсас ссадРсРсса дсаассРРдР сРРРаРсРсс аддддадада 120
305
дссассССдС ссСдсадСдс садсСсаадС дСаадССаса СдсасСддСа ссадсадаад 180
ссаддссаад сдсссадаад асСдаСССаС дасасаСсса аасСддсССс СддааСсссС 240
дсСсдсССса дСддсадСдд дСсСдддасс даССасасСс СсассаСсад садсССддад 300
ссСдаадаСС СсдссдСССа ССасСдссад садСддадСа дСаасссаСС сасдССсддс 360
саддддасаа аддСддаааС аааасдСасд дСддсСдсас саСсСдСсСС саСсССсссд 420
ссаСсСдаСд адсадССдаа аСсСддаасС дссСсСдССд СдСдссСдсС дааСаасССс 480
СаСсссадад аддссааадС асадСддаад дСддаСаасд сссСссааСс дддСаасСсс 540
саддададСд Ссасададса ддасадсаад дасадсассС асадссСсад садсасссСд 600
асдсСдадса аадсадасСа сдадааасас ааадСсСасд ссСдсдаадС сасссаСсад 660
ддссСдадсС сдсссдСсас ааададсССс аасаддддад адСдССад 708
<210> 464 <211> 235 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Человеческая последовательность легкой цепи ЫЬиР1А7 <400> 464
МеС 1 Азр РЬе С1п Уа1 5 О1п Не РЬе Зег РЬе Ьеи 10 Ьеи Не Зег А1а 15 Зег
Уа1 11е Не Зег Агд С1у С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а ТЬг
20 25 30
Ьеи Зег Ьеи Зег Рго <31у С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег А1а Зег
35 40 45
Зег Зег Уа1 Зег Туг МеС Η13 Тгр Туг С1п (31п Ьуз Рго <31у С1п А1а
50 55 60
Рго Агд Агд Ьеи Не Туг Азр ТЬг Зег Ьуз Ьеи А1а Зег <31у Не Рго
65 70 75 80
А1а Агд РЬе Зег С1у Зег О1у Зег С1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Не
85 90 95
Зег Зег Ьеи О1и Рго О1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Тгр
100 105 110
Зег Зег Азп Рго РЬе ТЬг РЬе С1у С1п (31у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
115 120
- 306
Агд ТЬг 130 Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 135 РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Азр 140 <31и
С1п Ьеи Ьуз Зег С1у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе
145 150 155 160
Туг Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п
165 170 175
Зег С1у Азп Зег С1п <31и Зег Уа1 ТЬг <31и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег
180 185 190
ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и
195 200 205
Ьуз Нхз Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТЬг Нхз С1п О1у Ьеи Зег Зег
210 215 220
Рго Уа1 ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд <31у С1и Суз
225 230 235
<210> 465
<211> 708
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223 > Человеческая последовательность каппа-легкой цепи Ы Нитап НиР1А7 <400> 465
аРддаРРРРс аддРРсадаР РРРсадсРРс сРдсРааРса дРдссРсадР саРааРаРсс 60
ададдасааа РРдРРсРсас ссадРсРсса дсаассРРдР сРРРаРсРсс аддддадада 120
дссассРРдР ссРдсадРдс садсРсаадР дРаадРРаса РдсасРддРа ссадсадаад 180
ссаддссаад сдсссадаад асРдаРРРаР дасасаРсса аасРддсРРс РддааРсссР 240
дсРсдсРРса дрддсадрдд дРсРдддасс даРРасасРс РсассаРсад садсРРддад 300
ссРдаадаРР РсдссдРРРа РРасРдссад садРддадРа дРаасссаРР сасдРРсддс 360
саддддасаа аддРддаааР аааасдРасд дрддсрдсас саРсРдРсРР саРсРРсссд 420
ссаРсРдаРд адсадРРдаа аРсРддаасР дссРсРдРРд РдРдссРдсР дааРаасРРс 480
РаРсссадад аддссааадр асадрддаад дРддаРаасд сссРссааРс дддРаасРсс 540
саддададрд Рсасададса ддасадсаад дасадсассР асадссРсад садсасссРд 600
асдсРдадса аадсадасРа сдадааасас ааадРсРасд ссРдсдаадР сасссаРсад 660
ддссРдадсР сдсссдРсас ааададсРРс аасаддддад адРдРРад 708
- 307 020508 <210> 466 <211> 235 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Человеческая последовательность легкой цепи Ь2 ЬиР1А7 <400> 466
МеР Азр РЬе С1п УаЬ С1п Не РЬе Зег РЬе Ьеи Ьеи 11е Зег АЬа Зег
10 15
УаЬ Не Не Зег Агд СЬу СЬп Не УаЬ Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго АЬа ТЬг
25 30
Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу СЬи Агд АЬа ТНг Ьеи Зег Суз Зег АЬа Зег
40 45
Зег Зег УаЬ Зег Туг Мер НЬз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп АЬа
55 60
Рго Агд Агд Ьеи Не Туг Азр ТЬг Зег Ьуз Ьеи АЬа Зег СЬу Не Рго
70 75 80
АЬа Агд РНе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТНг Азр Туг ТНг Ьеи ТНг 11е
90 95
Зег Зег Ьеи СЬи Рго СЬи Азр РНе АЬа УаЬ Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр
100 105 110
Зег Зег Азп Рго РНе ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз УаЬ С1и 11е Ьуз
115 120
Агд ТНг УаЬ А1а А1а Рго Зег УаЬ РНе 11е РНе Рго Рго Зег Азр СЬи
130 135 140
СЬп Ьеи Ьуз Зег СЬу ТНг АЬа Зег УаЬ λ/аЬ Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РНе
145 150 155 160
Туг Рго Агд С1и А1а Ьуз УаЬ С1п Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп А1а Ьеи СЬп
165 170 175
Зег СЬу Азп Зег С1п СЬи Зег УаЬ ТНг СЬи СЬп Азр Зег Ьуз Азр Зег
180 185 190
ТНг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТНг Ьеи ТНг Ьеи Зег Ьуз АЬа Азр Туг СЬи
195 200 205
- 308 020508
Ьуз Нхз Ьуз Уа1 Туг А1а Суз <31и Уа1 ТНг Нхз 61п С1у Ьеи Зег Зег
210 215 220
Рго Уа1 ТНг Ьуз Зег РНе Азп Агд О1у <31и Суз
225 230 235 240 <210> 467 <211> 708 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мышиная и человеческая последовательность каппа-легкой цепи химерного СЙР1А7 <400> 467
аРддаРРРРс аддРдсадаР РРРсадсРРс сРдсРааРса дРдссРсадР саРааРаРсс 60
ададдасааа РРдРРсРсас ссадРсРсса дсааРсаРдР сРдсаРсРсс аддддадаад 120
дРсассаРда ссрдсадрдс садсРсаадР дРаадРРаса РдсасРддРа ссадсадаад 180
РсаддсассР сссссаааад аРддаРРРаР дасасаРсса аасРддсРРс РддадРсссР 240
дсРсдсРРса дрддсадрдд дРсРдддасс РсРРасРсРс РсасааРсад садсаРддад 300
дсРдаадаРд сРдссасРРа РРасРдссад садРддадРа дРаасссаРР сасдРРсддс 360
Рсддддасаа адРРддаааР аааасдРасд дрддсрдсас саРсРдРсРР саРсРРсссд 420
ссаРсРдаРд адсадРРдаа аРсРддаасР дссРсРдРРд РдРдссРдсР дааРаасРРс 480
РаРсссадад аддссааадр асадрддаад дрддараасд сссРссааРс дддРаасРсс 540
саддададРд Рсасададса ддасадсаад дасадсассР асадссРсад садсасссРд 600
асдсРдадса аадсадасРа сдадааасас ааадрсРасд ссРдсдаадр сасссаРсад 660
ддссРдадсР сдсссдРсас ааададсРРс аасаддддад адРдРРад 708
<210> 468 <211> 235 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Мышиная и человеческая последовательность легкой цепи химерного сНР1А7 <400> 468
Мер Азр РНе <31п Уа1 С1п Не РНе Зег РНе Ьеи Ьеи 11е Зег А1а Зег
10 15
- 309 020508
Уа1 11е Не Зег Агд С1у С1п Не Уа1 Ьеи ТНг С1п Зег Рго А1а Не
25 30
Мер Зег А1а Зег Рго С1у С1и Ьуз Уа1 ТНг Мер ТНг Суз Зег А1а Зег
40 45
Зег Зег Уа1 Зег Туг МеР НЛз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Зег С1у ТНг Зег
55 60
Рго Ьуз Агд Тгр Не Туг Азр ТНг Зег Ьуз Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго
70 75 80
АЬа Агд РНе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТНг Зег Туг Зег Ьеи ТНг Не
90 95
Зег Зег Мер С1и А1а С1и Азр А1а А1а ТНг Туг Туг Суз Οίη С1п Тгр
100 105 110
Зег Зег Азп Рго РНе ТНг РНе С1у Зег <31у ТНг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
115 120
Агд ТНг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РНе Не РНе Рго Рго Зег Азр С1и
130 135 140
С1п Ьеи Ьуз Зег С1у ТНг А1а Зег А7а1 А/а1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РНе
145 150 155 160
Туг Рго Агд С1и А1а Ьуз 1/а1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п
165 170 175
Зег С1у Азп Зег С1п С1и Зег Уа1 ТНг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег
180 185 190
ТНг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТНг Ьеи ТНг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и
195 200 205
Ьуз Нхз Ьуз Уа1 Туг А1а Суз <31и Уа1 ТНг Нхз С1п С1у Ьеи Зег Зег
210 215 220
Рго Уа1 ТНг Ьуз Зег РНе Азп Агд С1у С1и Суз
225 230 235 <210> 469 <211> 1395 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 310 020508 <223> Мышиная и человеческая последовательность тяжелой цепи химерного сЬР1А7 Ьи1дО1 <400> 469
аРддасРдда ссРддадддР сРРсРдсРРд сРддсРдРад сассаддрдс ссасРсссад 60
дРссаасРдд РасадРсРдд ассРдадсРд аадаадссрд дададасадР саадаРсРсс 120
РдсааддссР сРдддРаРас сРРсасааас РаРддааРда асрдддрдаа дсаддсРсса 180
ддааадддРР РааадРддаР дддсРддаРа аасассдаса сРддададсс аасаРаРасР 240
даадаРРРсс адддасддРР РдссРРсРсР РРддааассР сРдссадсас РдРРРаРРРд 300
садРРсааса ассРсааааа Рдаддасасд дсРасаРаРР РсРдРдсаад ададддддРс 360
сасРРРдасР асРддддсса адддассасд дРсассдРсР ссРсадссРс сассаадддс 420
ссаРсддРсР РсссссРддс асссРссРсс аададсассР сРдддддсас адсддсссРд 480
ддсрдссрдд РсааддасРа сРРссссдаа ссддрдасдд РдРсдРддаа сРсаддсдсс 540
срдассадсд дсдрдсасас сРРсссддсР дРссРасадР ссРсаддасР сРасРсссРс 600
адсадсдРдд РдассдРдсс сРссадсадс РРдддсассс адассРасаР срдсаасдрд 660
ааРсасаадс ссадсаасас сааддрддас аадааадРРд адсссаааРс РРдРдасаад 720
асРсасасаР дсссассдрд сссадсассР даасРссРдд ддддассдРс адРсРРссРс 780
РРссссссаа аасссаадда сасссРсаРд аРсРсссдда ссссРдаддР сасаРдсдРд 840
дрддрддасд Рдадссасда адасссРдад дРсаадРРса асрддрасдр ддасддсдрд 900
даддРдсаРа аРдссаадас ааадссдсдд даддадсадр асаасадсас дРассдРдРд 960
дрсадсдрсс РсассдРссР дсассаддас РддсРдааРд дсааддадРа саадрдсаад 1020
дРсРссааса аадсссРссс адсссссаРс дадаааасса РсРссааадс сааадддсад 1080
ссссдадаас сасаддРдРа сасссРдссс ссаРсссддд аРдадсРдас саадаассад 1140
дРсадссРда ссРдссРддР саааддсРРс РаРсссадсд асаРсдссдР ддадрдддад 1200
адсаардддс адссддадаа саасРасаад ассасдссРс ссдРдРРдда сРссдасддс 1260
РссРРсРРсс РсРасадсаа дсРсассдРд дасаададса ддрддсадса ддддаасдРс 1320
РРсРсаРдсР ссдРдаРдса РдаддсРсРд сасаассаср асасдсадаа дадссРсРсс 1380
сРдРсРсссд дРРда 1395
<210> 470 <211> 464 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Мышиная и человеческая последовательность тяжелой цепи химерного СЙР1А7 <400> 470
- 311 020508
МеЬ Азр Тгр ТНг Тгр Агд УаЬ РНе Суз Ьеи 10 Ьеи АЬа УаЬ АЬа Рго 15 СЬу
1 5
АЬа НЬз Зег СЬп УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег СЬу Рго СЬи Ьеи Ьуз Ьуз
20 25 30
Рго СЬу СЬи ТНг УаЬ Ьуз Не Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу Туг ТНг РНе
35 40 45
ТНг Азп Туг СЬу МеЬ Азп Тгр Уа1 Ьуз СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи
50 55 60
Ьуз Тгр МеН СЬу Тгр Не Азп ТНг Азр ТНг СЬу СЬи Рго ТНг Туг ТНг
65 70 75 80
СЬи Азр РНе СЬп СЬу Агд РНе АЬа РНе Зег Ьеи СЬи ТНг Зег АЬа Зег
85 90 95
ТНг Уа1 Туг Ьеи СЬп РНе Азп Азп Ьеи Ьуз Азп СЬи Азр ТНг АЬа ТНг
100 105 110
Туг РНе Суз АЬа Агд СЬи СЬу УаЬ НЬз РНе Азр Туг Тгр СЬу СЬп СЬу
115 120
ТНг ТНг УаЬ ТНг УаЬ Зег Зег АЬа Зег ТНг Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ РНе
ьзо 135 140
Рго Ьеи АЬа Рго Зег Зег Ьуз Зег ТНг Зег СЬу СЬу ТНг АЬа АЬа Ьеи
145 150 155 160
СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РНе Рго СЬи Рго УаЬ ТНг УаЬ Зег Тгр
165 170 175
Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТНг Зег СЬу УаЬ НЬз ТНг РНе Рго АЬа УаЬ Ьеи
180 185 190
СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТНг УаЬ Рго Зег
195 200 205
Зег Зег Ьеи СЬу ТНг СЬп ТНг Туг Не Суз Азп УаЬ Азп НЬз Ьуз Рго
210 215 220
Зег Азп ТНг Ьуз УаЬ Азр Ьуз Ьуз УаЬ СЬи Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз
225 230 235 240
ТНг НЬз ТНг Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу Рго
245 250 255
Зег УаЬ РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеЬ Пе Зег
260 265 270
- 312 020508
Агд ТНг Рго С1и Ча1 ТНг Суз Ча1 280 Ча1 Ча1 Азр Ча1 Зег Ηίβ 285 С1и Азр
275
Рго С1и Ча1 Ьуз РНе Азп Тгр Туг Ча1 Азр С1у Ча1 С1и Ча1 ΗΪ3 Азп
290 295 300
А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег ТНг Туг Агд Ча1
305 310 315 320
Ча1 Зег Ча1 Ьеи ТНг Ча1 Ьеи Ηί3 С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и
325 330 335
Туг Ьуз Суз Ьуз Ча1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не С1и Ьуз
340 345 350
ТНг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Ча1 Туг ТНг
355 360 365
Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТНг Ьуз Азп С1п Ча1 Зег Ьеи ТНг
370 375 380
Суз Ьеи Ча1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр Не А1а Ча1 С1и Тгр С1и
385 390 395 400
Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг Рго Рго Ча1 Ьеи
405 410 415
Азр Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТНг Ча1 Азр Ьуз
420 425 430
Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Ча1 РНе Зег Суз Зег Ча1 МеЕ Нхз С1и
435 440 445
А1а Ьеи Нхз Азп ΗΪ3 Туг ТНг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
450 455 460 <210> 471 <211> 106 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический вариант легкой цепи 3 <400> 471
СТп Не Ча1 Ьеи ТНг Οίη Зег Рго А1а ТНг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
- 313 020508
С1и Агд АЬа ТНг 20 Ьеи Зег Суз Зег АЬа 25 Зег Зег Зег УаЬ Зег 30 Туг МеН
НЬз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп АЬа Рго Агд Агд Тгр Пе Туг
35 40 45
Азр ТНг Зег Ьуз Ьеи АЬа Зег СЬу УаЬ Рго АЬа Агд РНе Зег СЬу Зег
50 55 60
СЬу Зег СЬу ТНг Азр Туг ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи СЬи Рго СЬи
65 70 75 80
Азр РНе АЬа \7а1 Туг Туг Суз СЬп СЬп Тгр Зег Зег Азп Рго РНе ТНг
85 90 95
РНе СЬу СЬп СЬу ТНг Ьуз УаЬ СЬи Не Ьуз
100 105 <210> 472 <211> 116 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический вариант тяжелой цепи 1 <400> 472
СЬп УаЬ СЬп 1 Ьеи λ/аЬ 5 СЬп Зег СЬу НЬз СЬи 10 УаЬ Ьуз СЬп Рго СЬу 15 АЬа
Зег УаЬ Ьуз УаЬ Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу Туг ТНг РНе ТНг Азп Туг
20 25 30
СЬу МеН Азп Тгр УаЬ Рго СЬп АЬа Рго СЬу СЬп СЬу Ьеи СЬи Тгр МеН
35 40 45
СЬу Тгр Не Азп ТНг Азр ТНг СЬу СЬи Рго ТНг Туг ТНг СЬи Азр РНе
50 55 60
СЬп СЬу Агд РНе УаЬ РНе Зег Ьеи Азр ТНг Зег АЬа Зег ТНг УаЬ Туг
65 70 75 80
Ьеи СЬп Не Зег Зег Ьеи Ьуз АЬа СЬи Азр МеН АЬа МеН Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Агд СЬи СЬу УаЬ НЬз РНе Азр Туг Тгр СЬу СЬп СЬу ТНг Ьеи УаЬ
100 105 110
- 314 020508
ТНг Уа1 Зег Зег
115 <210> 473 <211> 116 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический вариант тяжелой цепи 3 <400> 473
С1п \7а1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у Нхз С1и Уа1 Ьуз С1п Рго С1у А1а
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТНг РНе ТНг Азп Туг
20 25 30
С1у МеЕ Азп Тгр Уа1 Ьуз С1п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи Ьуз Тгр МеЕ
35 40 45
С1у Тгр Не Азп ТНг Азр ТНг С1у С1и Рго ТНг Туг ТНг С1и Азр РНе
50 55 60
С1п С1у Агд РНе Уа1 РНе Зег Ьеи Азр ТНг Зег А1а Зег ТНг Уа1 Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п РНе Зег Зег Ьеи Ьуз А1а С1и Азр МеЕ А1а МеЕ Туг РНе Суз
85 90 95
А1а Агд С1и С1у Уа1 Нхз РНе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТНг Ьеи Уа1
100 105 110
ТНг Уа1 Зег Зег
115 <210> 474 <211> 466 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Синтетическая последовательность вариабельной области агликозилированной тяжелой цепи Ы81
- 315 020508
<400> 474
МеР Азр Тгр ТНг Тгр Агд УаЬ РНе Суз Ьеи Ьеи А1а УаЬ АЬа Рго СЬу
1 5 10 15
АЬа Нхз Зег СЬи УаЬ <31п Ьеи Ьеи СЬи Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи УаЬ СЬп
20 25 30
Рго С1у СЬу Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РНе ТНг РНе
35 40 45
Зег АЬа Туг СЬи МеР Ьуз Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи
50 55 60
С1и Тгр УаЬ Зег УаЬ Не СЬу Рго Зег СЬу СЬу РНе ТНг РНе Туг АЬа
65 70 75 80
Азр Зег УаЬ Ьуз СЬу Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп
85 90 95
ТНг Ьеи Туг Ьеи СЬп Мер Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр ТНг АЬа УаЬ
100 105 110
Туг Туг Суз А1а ТНг СЬи СЬу Азр Азп Азр АЬа РНе Азр Не Тгр СЬу
115 120
Θΐη СЬу ТНг ТНг УаЬ ТНг УаЬ Зег Зег АЬа Зег ТНг Ьуз СЬу Рго Зег
130 135 140
Уа1 РНе Рго Ьеи АЬа Рго Зег Зег Ьуз Зег ТНг Зег СЬу СЬу ТНг АЬа
145 150 155 160
А1а Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РНе Рго СЬи Рго УаЬ ТНг УаЬ
165 170 175
Зег Тгр Азп Зег СЬу А1а Ьеи ТНг Зег СЬу УаЬ Нхз ТНг РНе Рго АЬа
180 185 190
УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ Уа1 ТНг УаЬ
195 200 205
Рго Зег Зег Зег Ьеи СЬу ТНг СЬп ТНг Туг Не Суз Азп УаЬ Азп Нхз
210 215 220
Ьуз Рго Зег Азп ТНг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз УаЬ СЬи Рго Ьуз Зег Суз
225 230 235 240
Азр Ьуз ТНг Нхз ТНг Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу
245 250 255
СЬу Рго Зег УаЬ РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеН
- 316 020508
260 265 270
11е Зег Агд ТНг Рго С1и Уа1 ТНг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Нхз
275 280 285
С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РНе Азп Тгр Туг А7а1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1
290 295 300
Нхз Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег А1а Туг
305 310 315 320
Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Ьеи Нхз С1п Азр Тгр Ьеи Азп СЯу
325 330 335
Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не
340 345 350
61и Ьуз ТНг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у СЯп Рго Агд С1и Рго СЯп Уа1
355 360 365
Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТНг Ьуз Азп СЯп Уа1 Зег
370 375 380
Ьеи ТНг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и
385 390 395 400
Тгр С1и Зег Азп СЯу С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг Рго Рго
405 410 415
Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТНг Уа1
420 425 430
Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п СЯп СЯу Азп Уа1 РНе Зег Суз Зег Уа1 МеР
435 440 445
Нхз С1и А1а Ьеи Нхз Азп Нхз Туг ТНг СЯп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег
450 455 460
Рго С1у
465
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (27)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, характеризующиеся специфическим связыванием с Зр35 и включающие область νΗ, включающую аминокислотные последовательности участков ΟΌΚ1, С1Ж2 и С1Ж3 тяжелой цепи, представленные в ЗЕО ГО N0:436, ЗЕО ГО N0:437 и ЗЕО ГО N0:438 соответственно, и область ν^ включающую аминокислотные последовательности участков С1ЖЕ С1Ж2 и С1Ж3 легкой цепи, представленные в ЗЕО ГО N0:442, ЗЕО ГО N0:443 и ЗЕО ГО N0:444 соответственно.
  2. 2. Антитело или его фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что указанное антитело или фрагмент антитела включает в себя область Ж, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ГО N0:434.
  3. 3. Антитело или его фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что указанное антитело или фрагмент антитела включает в себя область νΗ, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ГО N0:433.
  4. 4. Антитело или его фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что указанное антитело или фрагмент антитела включает в себя область Ж, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ГО N0:434, и область νΗ, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ГО N0:433.
  5. 5. Антитело или его фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что указанное антитело или фрагмент антитела представляет собой негликозилированный вариант.
  6. 6. Антитело или его фрагмент по п.5, отличающиеся тем, что указанное антитело или фрагмент антитела включает зрелую форму области νΗ, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ГО N0:474.
  7. 7. Антитело или его фрагмент по п.6, отличающиеся тем, что указанное антитело или фрагмент антитела включает зрелую форму области ν^ имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ГО N0:434.
  8. 8. Антитело или его фрагмент по п.1, которые дополнительно включают слитый с ними гетероло- 317 020508 гичный полипептид.
  9. 9. Антитело или его фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что указанное антитело конъюгировано с агентом, выбранным из группы, включающей терапевтический агент, пролекарственную форму, пептид, белок, фермент, вирус, липид, модификатор биологического ответа, фармацевтический агент или ПЭГ.
  10. 10. Антитело или его фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент слит с группой, направленной на клетки головного мозга, выбранной из группы, состоящей из полипептидов РС5, тАВ 83-14, В2, В6 и В8, антитела к Рс рецептору, трансферрина и антитела к инсулиновому рецептору.
  11. 11. Выделенный полинуклеотид, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи Ун антитела или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп.1-10, причем участки СЭК1, СЭК2 и СЭК3 указанной Ун включают последовательности 8ЕЦ ГО N0:436, 8ЕЦ ГО N0:437 и 8ЕО ГО N0:438.
  12. 12. Выделенный полинуклеотид по п.11, отличающийся тем, что указанная область Ун включает область Ун, имеющую аминокислотную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0:433.
  13. 13. Выделенный полинуклеотид по п.12, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид кодирует зрелую форму области Ун, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0:474.
  14. 14. Вектор, включающий полинуклеотид по любому из пп.11-13.
  15. 15. Клетка-хозяин, включающая полинуклеотид, кодирующий область Ун, и полинуклеотид, кодирующий Уь, причем указанная область Ун включает аминокислотные последовательности участков СЭВ1. СГОВ2 и СГОВ3 тяжелой цепи, представленные в 8ЕЦ ГО N0:436, 8ЕЦ ГО N0:437 и 8ЕЦ ГО N0:438 соответственно, и указанная область Уъ включает аминокислотные последовательности СЭРЕ СГОВ2 и СЭК3 легкой цепи, представленные в 8ЕЦ ГО N0:442, 8ЕЦ ГО N0:443 и 8ЕЦ ГО N0:444 соответственно, при этом указанные полинуклеотиды Ун и Уъ совместно кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10, которые способны к специфическому связыванию 8р35.
  16. 16. Клетка-хозяин по п.15, отличающаяся тем, что полинуклеотиды, кодирующие Ун и Уь, содержатся в одном или более векторах.
  17. 17. Способ ίη νίίτο получения антитела или к 8р35 его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10, включающий культивирование клетки-хозяина по п.16 и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры.
  18. 18. Антитело к 8р35, полученное способом по п.17, или его антигенсвязывающий фрагмент.
  19. 19. Выделенный полипептид, включающий вариабельную область тяжелой цепи Ун антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по любому из пп.1-10, причем СЭК.1, СЭК2 и СГОВ3 указанной области Ун включают последовательности 8ЕЦ ГО N0:436, 8ЕЦ ГО N0:437 и 8ЕЦ ГО N0:438 соответственно.
  20. 20. Применение выделенного антитела к 8р35 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10 в получении лекарственного средства для лечения повреждения ЦНС у животного.
  21. 21. Применение выделенного антитела к 8р35 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10 в получении лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения, связанного с ингибированием роста нейронов в ЦНС, у животного.
  22. 22. Применение выделенного антитела к 8р35 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10 в получении лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения, связанного с ингибированием роста или дифференцировки олигодендроцитов, у животного.
  23. 23. Применение выделенного антитела к 8р35 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10 в получении лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения, связанного с демиелинизацией или дисмиелинизацией нейронов ЦНС, у животного.
  24. 24. Применение по п.23, в котором заболевание или нарушение представляет собой рассеянный склероз.
  25. 25. Применение выделенного антитела к 8р35 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-10 в получении лекарственного средства для лечения острой ишемической нейропатии зрительного нерва.
  26. 26. Способ ίη νίίτο ингибирования сигнальной трансдукции посредством N§^1, включающий обеспечение контакта N§^1 с эффективным количеством выделенного антитела к 8р35 или его фрагмента по любому из пп.1-10.
  27. 27. Способ ίη νίίτο снижения уровня ингибирования роста аксонов нейрона центральной нервной системы (ЦНС), включающий контактирование нейрона с эффективным количеством выделенного антитела к 8р35 или его фрагмента по любому из пп.1-10.
EA200900971A 2007-01-09 2008-01-09 ВЫДЕЛЕННЫЕ АНТИТЕЛА К Sp35 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ EA020508B9 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87932407P 2007-01-09 2007-01-09
PCT/US2008/000316 WO2008086006A2 (en) 2007-01-09 2008-01-09 Sp35 antibodies and uses thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200900971A1 EA200900971A1 (ru) 2010-02-26
EA020508B1 true EA020508B1 (ru) 2014-11-28
EA020508B9 EA020508B9 (ru) 2015-05-29

Family

ID=39609291

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201490693A EA036660B1 (ru) 2007-01-09 2008-01-09 АНТИТЕЛО К Sp35 ИЛИ ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ
EA200900971A EA020508B9 (ru) 2007-01-09 2008-01-09 ВЫДЕЛЕННЫЕ АНТИТЕЛА К Sp35 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201490693A EA036660B1 (ru) 2007-01-09 2008-01-09 АНТИТЕЛО К Sp35 ИЛИ ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Country Status (27)

Country Link
EP (2) EP2068887B1 (ru)
JP (4) JP2010515456A (ru)
KR (1) KR101496479B1 (ru)
CN (2) CN103360495B (ru)
AU (1) AU2008205244B2 (ru)
BR (1) BRPI0806340B8 (ru)
CA (1) CA2674603C (ru)
CY (2) CY1115105T1 (ru)
DK (2) DK2068887T3 (ru)
EA (2) EA036660B1 (ru)
ES (2) ES2673153T3 (ru)
GE (1) GEP20125693B (ru)
HK (2) HK1131067A1 (ru)
HR (2) HRP20140475T1 (ru)
HU (1) HUE036793T2 (ru)
IL (1) IL199754A (ru)
LT (1) LT2740744T (ru)
MX (1) MX2009007375A (ru)
NO (1) NO2740744T3 (ru)
NZ (1) NZ577976A (ru)
PL (2) PL2068887T3 (ru)
PT (2) PT2740744T (ru)
SG (1) SG177966A1 (ru)
SI (2) SI2068887T1 (ru)
TR (1) TR201807425T4 (ru)
UA (1) UA99120C2 (ru)
WO (1) WO2008086006A2 (ru)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101106441B1 (ko) 2003-03-19 2012-01-18 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 노고 수용체 결합 단백질
PL1776136T3 (pl) 2004-06-24 2013-03-29 Biogen Ma Inc Leczenie stanów związanych z demielinizacją
JP2009502123A (ja) 2005-07-08 2009-01-29 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｓｐ３５抗体およびその使用
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
US8058406B2 (en) 2008-07-09 2011-11-15 Biogen Idec Ma Inc. Composition comprising antibodies to LINGO or fragments thereof
CA2742817A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Biogen Idec Ma Inc. Arginine inactivation of viruses
US9005926B2 (en) 2009-10-02 2015-04-14 Biogen Idec Ma Inc. Methods of preventing and removing trisulfide bonds
EP3388443A1 (en) 2011-05-13 2018-10-17 Biogen MA Inc. Methods of preventing and removing trisulfide bonds
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
MX2014013950A (es) 2012-05-14 2015-02-17 Biogen Idec Inc Antagonistas de proteina que interactua con el receptor nogo 2 que contiene repeticion rica en leucina y dominio de inmunoglobulina (lingo-2) para el tratamiento de afecciones que involucran neuronas motoras.
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
MX2015004436A (es) * 2012-10-09 2015-06-24 Biogen Idec Inc Tratamientos conjuntos y usos para tratar trastornos desmielinizantes.
SG11201506088RA (en) 2013-03-11 2015-09-29 Genzyme Corp Hyperglycosylated binding polypeptides
WO2015057939A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Biogen Idec Ma Inc. Anti-s1p4 antibodies and uses thereof
WO2015066379A2 (en) 2013-10-30 2015-05-07 Genzyme Corporation Methods for enhancing immunosuppressive therapy by multiple administration of alpha beta tcr-binding polypeptide
RS64072B1 (sr) 2014-03-19 2023-04-28 Genzyme Corp Mesto-specifični glikoinženjering ciljnih delova
WO2016057769A2 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
WO2016112270A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 Biogen Ma Inc. Lingo-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders
EP3302465A1 (en) 2015-06-05 2018-04-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Triazoles for the treatment of demyelinating diseases
US20200031924A1 (en) * 2016-07-13 2020-01-30 Biogen Ma Inc. Dosage Regimens of Lingo-1 Antagonists and Uses for Treatment of Demyelinating Disorders
WO2018106641A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pyrazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106646A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Aminotriazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106643A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heterocyclic azoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018112362A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Biogen Ma Inc. Stabilized proteolytically activated growth differentiation factor 11
BR112021018688A2 (pt) * 2019-03-20 2021-11-30 Good T Cells Inc Composição para prevenir ou tratar doença cerebral e do sistema nervoso
US11197910B1 (en) 2020-08-19 2021-12-14 Vitruviae LLC Fusion proteins for the diagnosis, prophylaxis and treatment of infectious diseases
US11124568B1 (en) * 2020-08-19 2021-09-21 Vitruviae LLC CD3/CD25 antibodies for neuro-immune diseases
JP2024500093A (ja) * 2020-12-10 2024-01-04 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド Ｐ－カドヘリンに対する抗体及びその使用
CN114805579B (zh) * 2022-06-08 2023-06-06 郑州大学 一种抗人ace2蛋白单克隆抗体、核酸分子及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060009388A1 (en) * 2004-06-24 2006-01-12 Sha Mi Treatment of conditions involving demyelination

Family Cites Families (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773319A (en) 1971-12-16 1973-11-20 Fabcor Ind Inc Corrugated sheet inverting machine
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
DE68921982T4 (de) 1988-06-14 1996-04-25 Cetus Oncology Corp Kupplungsmittel und sterisch gehinderte, mit disulfid gebundene konjugate daraus.
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
EP1541682A3 (en) 1988-09-02 2005-07-06 Dyax Corp. Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
ATE356869T1 (de) 1990-01-12 2007-04-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
JP3319594B2 (ja) 1990-03-20 2002-09-03 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク 定常領域の代わりに受容体結合性リガンドを有するキメラ抗体
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5219837A (en) 1990-06-21 1993-06-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of stimulating myelination of cells
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
AU667460B2 (en) 1990-10-05 1996-03-28 Medarex, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
DE69128253T2 (de) 1990-10-29 1998-06-18 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
ATE218889T1 (de) 1990-11-09 2002-06-15 Stephen D Gillies Cytokine immunokonjugate
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
US5573920A (en) 1991-04-26 1996-11-12 Surface Active Limited Antibodies, and methods for their use
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
CA2110799A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Arnold H. Horwitz Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
WO1993016177A1 (en) 1992-02-11 1993-08-19 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
ES2193143T3 (es) 1992-03-05 2003-11-01 Univ Texas Uso de inmunoconjugados para la diagnosis y/o terapia de tumores vascularizaos.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
WO1994009817A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 City Of Hope Novel antibody construct
PT669986E (pt) 1992-11-13 2003-08-29 Idec Pharma Corp Sequencia do marcador de seleccao dominante alterada e estrategias de insercao intronica para melhoria de expressao de produto genico e sistemas de vector de expressao que o compreendem
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
AU696293B2 (en) 1993-12-08 1998-09-03 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
DK0744958T3 (da) 1994-01-31 2003-10-20 Univ Boston Polyklonale antistofbiblioteker
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
AU5632296A (en) 1995-04-27 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
US6068829A (en) 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
WO1998024893A2 (en) 1996-12-03 1998-06-11 Abgenix, Inc. TRANSGENIC MAMMALS HAVING HUMAN IG LOCI INCLUDING PLURAL VH AND Vλ REGIONS AND ANTIBODIES PRODUCED THEREFROM
PL191251B1 (pl) 1997-03-14 2006-04-28 Idec Pharma Corp Sposób wprowadzania żądanego DNA w docelowe miejsce w genomie ssaka i układ wektorów
JP3876002B2 (ja) 1997-04-14 2007-01-31 ミクロメート・アクチエンゲゼルシャフト 抗ヒト抗原受容体を産生するための斬新な方法およびそれらの使用
US20030207346A1 (en) 1997-05-02 2003-11-06 William R. Arathoon Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
AU736549B2 (en) 1997-05-21 2001-08-02 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Method for the production of non-immunogenic proteins
WO1999004705A1 (en) 1997-07-25 1999-02-04 Tsui Ban C H Devices, systems and methods for determining proper placement of epidural catheters
CN1202128C (zh) 1998-12-08 2005-05-18 拜奥威神有限公司 修饰蛋白的免疫原性
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
JP4368196B2 (ja) 2000-11-17 2009-11-18 ユニバーシティー オブ ロチェスター 真核細胞において免疫グロブリン分子を製造および同定するインビトロにおける方法
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
CN1494553A (zh) 2001-01-29 2004-05-05 IDECҩ�﹫˾ 改变的抗体及其使用方法
US20030157641A1 (en) 2001-11-16 2003-08-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
KR101106441B1 (ko) * 2003-03-19 2012-01-18 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 노고 수용체 결합 단백질
AU2004266159A1 (en) * 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
KR100694862B1 (ko) 2004-07-20 2007-03-13 (주)인텔리안테크놀로지스 위성 안테나의 광대역 위성 탐색 장치 및 방법
JP2009502123A (ja) * 2005-07-08 2009-01-29 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｓｐ３５抗体およびその使用
US8058406B2 (en) * 2008-07-09 2011-11-15 Biogen Idec Ma Inc. Composition comprising antibodies to LINGO or fragments thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060009388A1 (en) * 2004-06-24 2006-01-12 Sha Mi Treatment of conditions involving demyelination

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20140475T1 (hr) 2014-06-20
BRPI0806340A2 (pt) 2011-09-06
CN103360495B (zh) 2016-06-08
EP2068887B1 (en) 2014-03-12
JP2013135695A (ja) 2013-07-11
JP2010515456A (ja) 2010-05-13
CN101636168A (zh) 2010-01-27
AU2008205244A1 (en) 2008-07-17
HUE036793T2 (hu) 2018-07-30
SI2740744T1 (en) 2018-06-29
EA020508B9 (ru) 2015-05-29
WO2008086006A3 (en) 2008-11-06
LT2740744T (lt) 2018-05-10
EA201490693A1 (ru) 2014-10-30
DK2068887T3 (da) 2014-05-19
DK2740744T3 (da) 2018-04-23
EA200900971A1 (ru) 2010-02-26
HRP20180596T1 (hr) 2018-07-27
JP5716206B2 (ja) 2015-05-13
WO2008086006A2 (en) 2008-07-17
CY1120285T1 (el) 2019-07-10
KR101496479B1 (ko) 2015-02-26
EP2740744B1 (en) 2018-03-28
CN101636168B (zh) 2013-05-29
MX2009007375A (es) 2009-07-21
SI2068887T1 (sl) 2014-06-30
UA99120C2 (en) 2012-07-25
EP2740744A3 (en) 2014-09-10
GEP20125693B (en) 2012-11-26
TR201807425T4 (tr) 2018-06-21
KR20090101958A (ko) 2009-09-29
JP5847881B2 (ja) 2016-01-27
PL2740744T3 (pl) 2019-01-31
AU2008205244B2 (en) 2013-02-07
JP2015180704A (ja) 2015-10-15
NZ577976A (en) 2011-12-22
PT2740744T (pt) 2018-06-06
BRPI0806340B1 (pt) 2020-06-02
HK1199041A1 (en) 2015-06-19
NO2740744T3 (ru) 2018-08-25
EA036660B1 (ru) 2020-12-04
CY1115105T1 (el) 2016-12-14
EP2068887A4 (en) 2010-11-03
CA2674603C (en) 2016-03-29
BRPI0806340B8 (pt) 2021-05-25
EP2068887A2 (en) 2009-06-17
PT2068887E (pt) 2014-06-23
HK1131067A1 (en) 2010-01-15
IL199754A (en) 2015-07-30
CN103360495A (zh) 2013-10-23
JP2014155501A (ja) 2014-08-28
CA2674603A1 (en) 2008-07-17
SG177966A1 (en) 2012-02-28
ES2673153T3 (es) 2018-06-20
EP2740744A2 (en) 2014-06-11
IL199754A0 (en) 2010-04-15
ES2464815T3 (es) 2014-06-04
WO2008086006A9 (en) 2008-09-12
PL2068887T3 (pl) 2014-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020508B1 (ru) ВЫДЕЛЕННЫЕ АНТИТЕЛА К Sp35 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
US20230295297A1 (en) Anti-trem2 antibodies and methods of use thereof
JP6499700B2 (ja) Ｌｉｎｇｏ抗体または断片を含む組成物
JP2022081543A (ja) 抗ｔｒｅｍ２抗体及びその使用方法
JP5118491B2 (ja) ｔｏｌｌ様レセプターを標的とする併用療法およびその使用
CN101495509B (zh) Sp35抗体及其用途
UA123390C2 (uk) Терапія і діагностика на основі білків тау-опосередковуваної патології при хворобі альцгеймера
JP2014144017A5 (ru)
EA016193B1 (ru) Антитела, направленные против бета-амилоидного пептида, и способы их использования
SA519401906B1 (ar) أجسام مضادة ومتعددات ببتيد موجهة ضد cd127
JP2009517340A (ja) ドーパミン作動性ニューロンの神経突起成長および生存を促進するための方法
WO2003048301A2 (en) Anti-hla-dr antibodies and the methods of using thereof
CN104394880A (zh) 用于调节toso活性的方法和组合物
KR20070007291A (ko) 면역 반응을 유도하거나 조절하는 방법
US8440185B2 (en) Compositions and methods for the treatment of immunologic disorders
JP5704722B2 (ja) 細胞接着阻害剤およびその用途
CN109689689A (zh) 糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(gitr)抗体及其使用方法
US20210214429A1 (en) Antibodies for the treatment of synucleinopathies and neuroinflammation
US7901678B2 (en) Medicinal compositions containing Fc receptor γ chain activator
JPWO2012157589A1 (ja) 細胞接着阻害剤、細胞増殖阻害剤、並びに癌の検査方法および検査用キット
KR101268562B1 (ko) Ｔｌｔ-6 단백질에 대한 항체 및 그 응용
JP2022515226A (ja) 検出・処理の構成と方法
JP2022513082A (ja) 免疫応答を調節するためのＩＲＥ１α－ＸＢＰ１シグナル伝達経路バイオマーカーの使用
TW202019482A (zh) Htlv-1關聯性脊髓病(ham)之治療或預防劑、及ham之治療方法
WANG et al. Temporal variability of neurography

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent