CN114805579B

CN114805579B - 一种抗人ace2蛋白单克隆抗体、核酸分子及应用

Info

Publication number: CN114805579B
Application number: CN202210647531.4A
Authority: CN
Inventors: 张改平; 王爱萍; 丁培阳; 刘红亮; 丁梦浩; 张守涛; 陈玉梅; 朱习芳; 梁超; 周景明; 祁艳华; 牛艳
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2022-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2042-06-08
Also published as: CN114805579A

Abstract

本发明属于单克隆抗体领域，具体涉及一种抗人ACE2蛋白单克隆抗体、核酸分子及应用。本发明的抗人ACE2蛋白单克隆抗体能够通过与人ACE2分子特异结合，阻断人ACE2与SARS‑CoV‑2 RBD的结合，从而使利用ACE2作为受体的冠状病毒失去入侵宿主的能力，达到预防及治疗病毒感染的效果。经实验证实，该单克隆抗体对SARS‑CoV‑2野生型、Delta（B.1.617.2）、Omicron（B.1.1.529）冠状病毒均具有良好的阻断效果。

Description

一种抗人ACE2蛋白单克隆抗体、核酸分子及应用

技术领域

本发明属于单克隆抗体领域，具体涉及一种抗人ACE2蛋白单克隆抗体、核酸分子及应用。

背景技术

冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。已经有七种冠状病毒已被确定为人类易感病毒，其中α属冠状病毒HCoV-229E和HCoV-NL63，以及低致病性的β属冠状病毒HCoV-HKU1和HCoV-OC43，会引起类似于普通感冒的轻微呼吸道症状。SARS-CoV-2与SARS-CoV和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)同属β冠状病毒属(分别具有80％和50％的同源性)。SARS、MERS和现在的COVID-19的爆发证明了冠状病毒具有跨越物种传播能力并且能够在人类之间迅速传播，导致严重且可能致命的呼吸道感染。在这些冠状病毒中，SARS-CoV、SARS-CoV-2和HCoV-NL63都是以血管紧张素转化酶2(ACE2)作为受体，完成感染宿主细胞的生物学过程，感染人源宿主细胞和人。

目前亟需针对SARS-CoV和SARS-CoV-2等冠状病毒的特效药物。治疗性抗体药物不但在肿瘤和自身免疫疾病方面占有重要地位，在传染性疾病的治疗中也同样有效。目前已经上市的治疗和预防病毒感染的药物有预防小儿呼吸道合胞病毒(RSV)感染的帕利珠单抗(Synagis)，治疗HIV感染的艾巴利珠单抗(Trogarzo)，以及用于狂犬病毒暴露后预防的Rabishield。

病毒要感染细胞，首先需要通过囊膜蛋白结合宿主的受体。抗体，尤其是阻断型抗体可通过结合到受体蛋白上而阻断病毒与细胞受体的结合，从而阻断病毒感染，达到阻断病毒入侵宿主细胞的过程，实现预防及治疗效果。

ACE2作为病毒进入细胞的功能性受体以及肾素-血管紧张素系统(RAS)的重要组成部分，ACE2可以作为阻断SARS-CoV-2感染并保护宿主器官免受伤害的潜在靶标。因此靶向人ACE2受体并且阻断RBD与人ACE2结合的抗体，可能成为抑制病毒感染的有效抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人ACE2蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体能够特异性结合人ACE2受体。

本发明的第二个目的是提供一种核酸分子。

本发明的第三个目的是提供上述抗人ACE2蛋白单克隆抗体的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种抗人ACE2蛋白单克隆抗体，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。

本发明的抗人ACE2蛋白单克隆抗体能够通过与人ACE2分子特异结合，阻断人ACE2与SARS-CoV-2RBD的结合，从而使利用ACE2作为受体的冠状病毒失去入侵宿主的能力，达到预防及治疗病毒感染的效果。经实验证实，该单克隆抗体对SARS-CoV-2野生型、Delta(B.1.617.2)、Omicron(B.1.1.529)冠状病毒均具有良好的阻断效果。

优选地，所述抗人ACE2蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。在此基础上，可以采用常规基因工程或蛋白质工程的方法获得本发明的单克隆抗体，进一步的，还可采用一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异体，为进一步提升抗体的特异性和亲和力奠定基础。

优选地，所述抗人ACE2蛋白单克隆抗体的轻链型为Kappa，亚型为IgG 2a。

一种核酸分子，其编码上述抗人ACE2蛋白单克隆抗体。

采用该核算分子得到的抗人ACE2蛋白单克隆抗体对人ACE2分子具有特异结合能力。

优选地，编码所述抗人ACE2蛋白单克隆抗体重链可变区的基因核苷酸序列如SEQID NO：9所示；编码所述抗人ACE2蛋白单克隆抗体轻链可变区的基因核苷酸序列如SEQ IDNO：10所示。

本发明涉及的抗体核酸分子可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。本领域技术人员显然知晓，在本发明提供的上述核酸分子经一个或多个核苷酸添加、删除、替换、修饰等突变后得到的重链可变区核苷酸序列和/或轻链可变区核苷酸序列的变异序列，其所编码的氨基酸序列组成的单链抗体或嵌合单克隆抗体或改型单克隆抗体或其他形式的单克隆抗体或抗体片段，仍保留与人ACE2蛋白特异性结合的能力。

根据上述抗人ACE2蛋白单克隆抗体在制备用于预防及治疗以ACE2作为受体的病毒感染的药物中的应用。

上述抗人ACE2蛋白单克隆抗体能够用于病毒作用原理的基础研究、鉴别诊断、快速测定、流行病学调查、动物模型制备等广泛的领域中。进一步优选地，所述病毒为SARS-CoV-2。

附图说明

图1为本发明实施例中纯化的hACE2-ecto蛋白SDS-PAGE纯度检测结果图；其中泳道M为蛋白分子量Marker；泳道1为真核表达的hACE2-ecto蛋白；

图2为本发明实施例中抗ACE2蛋白单克隆抗体2D6亚型鉴定结果的图；

图3为本发明实施例中抗ACE2蛋白单克隆抗体2D6 SDS-PAGE纯度检测结果的图；其中泳道M为蛋白分子量Marker；泳道1为纯化的单克隆抗体2D6；

图4为本发明实施例中表示2D6抗体与人ACE2蛋白ELISA反应性的图；其中2D6为抗体2D6，Isotype IgG为阴性对照；

图5为本发明实施例中表示2D6抗体能够阻断SARS-CoV-2假病毒感染293T-hACE2细胞的图；其中野生型、B.1.617.2及B.1.1.529分别为SARS-CoV-2野生型、Detal和Omicron毒株的假病毒。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的实施过程进行详细说明。

实施例1免疫原的选择与制备

1.hACE2-ecto重组表达质粒的构建

以GenBank提供的序列(NM_001371415.1)为模板，全基因合成了人ACE2胞外区(hACE2-ecto)全长的编码DNA序列，并且在3′端添加6×His标签序列，通过5′端EcoRⅠ和3′端XhoⅠ酶切位点克隆入表达载体pCAGGS(Addgene公司)，构建人ACE2胞外域蛋白的重组真核表达质粒，即hACE2-ecto重组质粒DNA。

2.hACE2-ecto重组蛋白的表达与纯化

(1)转染前一天：以2×10⁶cells/mL的密度将HEK293F细胞接种于20mL SMM 293-TII培养基中。在37℃，175rpm，5％ CO₂的条件下培养。

(2)转染当天，取样计数细胞密度和活率。细胞密度应该在3-5×10⁶cells/mL，活率高于90％。调整细胞密度至3×10⁶cells/mL，每瓶细胞液体积为20mL；

(3)转染液的配制：用150mM的NaCl稀释20μg DNA至总体积为0.5mL，温和混匀；用150mM的NaCl稀释100μL Sinofection转染试剂至总体积为0.5mL，温和混匀；将稀释好的DNA和转染试剂同时单独静置约5min后温和混匀，总体积1mL，之后室温静置10min。

(4)将转染液逐滴加入到细胞培养液中，摇匀后旋紧瓶口放回摇床(37℃，5％CO₂，175rpm)。

(5)转染20-24h后，加入SMS 293-SUPI培养基加料液(0.7mL/瓶)，以后隔天加料培养6-10d。

(6)收获上清：转染7d后，收集细胞培养上清，4℃离心，过滤。

(7)His Trap亲和层析柱纯化：将上清以1mL/min的速度，流过His Trap亲和层析柱；完成后，用5个柱体积的20mM Tris-HCl、150mM NaCl pH 8.0平衡液冲洗层析柱；用5个柱体积的20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0-500mM咪唑pH 8.0洗脱液冲洗层析柱(连续梯度洗脱)，收集洗脱峰。纯化后的hACE2-ecto蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，将结果示于图1。

结果显示：电泳获得的蛋白条带清晰，无杂质，大小约为85kDa，与hACE2-ecto蛋白预期分子量大小相符，纯度大于95％，可以用于后续实验(图1)。

实施例2分泌抗人ACE2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

1.动物免疫

经过纯化的hACE2-ecto抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下多点注射方法免疫6-8周龄BALB/C小鼠(购自郑州大学实验动物中心，5只)，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行加强免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。第二次加强免疫后尾部采血，以间接ELISA法测定血清效价。选取抗体效价最高的免疫小鼠进行细胞融合，在融合前3-5天，不加佐剂，按照50μg/只静脉注射进行加强免疫。

2.细胞融合及杂交瘤细胞的筛选

采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量8：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用HAT选择培养基进行筛选；于融合后12天，以hACE2蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA法初步筛选阳性杂交瘤细胞。

间接ELISA法步骤：

(1)用CBS缓冲液将hACE2蛋白稀释成浓度为2μg/mL的包被液包被酶标板，100μl/孔，37℃2h；

(2)弃去包被液，PBST洗板，5％脱脂奶每孔100μL，37℃封闭2h；

(3)将杂交瘤上清(一抗)依次加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育30min；

(4)弃去一抗，用PBST洗板，洗干净，拍干；

(5)将稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG(二抗)加入反应孔中100μL/孔。37℃孵育30min；

(6)弃去二抗，用PBST冲洗干净，拍干；

(7)每孔加入现配的TMB显色液100μL，暗室反应10min；

(8)每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应；

(9)酶标仪读取每孔的OD₄₅₀。

3.通过有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆

对阳性孔细胞进行有限稀释法亚克隆，每次亚克隆后7-8天测定间接ELISA值，挑取OD450值高于1.5的单克隆进行有限稀释法进行亚克隆3-4次，直至获得稳定分泌抗人ACE2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D6。

实施例3抗人ACE2蛋白单克隆抗体腹水的制备及纯化

选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500μL灭菌石蜡，一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为1×10⁶个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清。用ProteinA亲和层析柱法对腹水进行纯化，SDS-PAGE对纯化得到的单抗2D6纯度进行鉴定。

结果显示：纯化的单抗2D6纯度大于90％(图3)。

实施例4抗人ACE2蛋白单克隆抗体性能测定及在阻断冠状病毒方面的应用

1.单克隆抗体亚型鉴定

单抗亚类和型的鉴定按Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit使用说明书操作。

测定结果如图2所示，单抗亚类和亚型的鉴定结果显示单克隆抗体2D6亚型为IgG2a，轻链型为Kappa型。

2.单克隆抗体的效价测定

间接ELISA测定方法参照实施例2进行，将纯化的单克隆抗体用5％的脱脂奶从20μg/mL开始进行2倍倍比稀释，依次加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育30min；其他步骤参照实施例2进行，ELISA检测结果显示该单克隆抗体EC50为：8.406ng/mL(图4)。

3.假病毒阻断试验

2×10⁴个293T-hACE2细胞接种于96孔细胞培养板中，将倍比稀释的纯化单抗2D6加入到细胞培养板中，37℃培养箱中孵育1h，每孔加入1.3×104TCID₅₀ SARS-CoV-2假病毒55μL，置于37℃细胞培养箱中孵育24h。24h后弃去100μL细胞上清，加入显色液，避光显色3min，利用多功能酶标仪测量荧光素酶活性。

假病毒阻断试验结果如图5所示，结果显示抗人ACE2单抗阻断SARS-CoV-2野生型、Delta(B.1.617.2)、Omicron(B.1.1.529)假病毒的IC₅₀分别为0.1639μg/mL、0.3463μg/mL和0.1386μg/mL。

实施例5单克隆抗体可变区基因扩增与序列测定

将前期筛选出的2D6单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，Trizol法提取总RNA；利用RT-PCR获得鼠源抗体可变区编码片段并进行测序。

测序结果如下：本发明的单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示。

进一步分析得到单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。

单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。

本实施例涉及的各序列的详情如下：

2D6抗体重链可变区CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：GFTFTDYY

2D6抗体重链可变区CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：FIRNRPNDYTTEYSASVKG

2D6抗体重链可变区CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO：3)：ARDRGLRQAMDY

2D6抗体轻链可变区CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO：4)：TASSSVTYMH

2D6抗体轻链可变区CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO：5)：DTSKLAS

2D6抗体轻链可变区CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO：6)：QQWSFNPLT

2D6抗体重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：7)：EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNRPNDYTTE YSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCARDRGLRQAMDYWGQGTSVTVSS

2D6抗体轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：8)：QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCTASSSVTYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRF SGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYFCQQWSFNPLTFGSGTKLEIK

2D6抗体重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：9)：GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCGACTTCTGGGTTCACCTTCACTGATTACTACATGAGTTGGGTCCGCCAGCCTCCTGGAAAGGCACTTGAGTGGTTGGGTTTTATTAGAAACCGACCTAATGATTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGGTTCACCATCTCCCGAGATAATTCCCAAAGCATCCTCTATCTTCAAATGAACACCCTGAGAGCTGAGGACAGTGCCACTTATTATTGTGCAAGAGATAGGGGATTACGACAAGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

2D6抗体轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：10)：

CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCAC

CATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAACTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAG

GCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGGT

CGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGC

TGAAGATGCTGCCACTTATTTCTGCCAGCAGTGGAGTTTTAACCCACTCACGTTCGGCTC

GGGGACAAAGTTGGAAATAAAA。

<110> 郑州大学

<120> 一种抗人ACE2蛋白单克隆抗体、核酸分子及应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> VHCDR1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> VHCDR2

<400> 2

Phe Ile Arg Asn Arg Pro Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> VHCDR3

<400> 3

Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Gln Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> VLCDR1

<400> 4

Thr Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met His

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> VLCDR2

<400> 5

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> VLCDR3

<400> 6

Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 重链可变区氨基酸序列

<400> 7

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asn Arg Pro Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Gln Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 轻链可变区氨基酸序列

<400> 8

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 重链可变区核苷酸序列

<400> 9

gaggtgaagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60

tcctgtgcga cttctgggtt caccttcact gattactaca tgagttgggt ccgccagcct 120

cctggaaagg cacttgagtg gttgggtttt attagaaacc gacctaatga ttacacaaca 180

gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctccc gagataattc ccaaagcatc 240

ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ttgtgcaaga 300

gataggggat tacgacaagc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 10

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 轻链可变区核苷酸序列

<400> 10

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaact tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctggtcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttatttctg ccagcagtgg agttttaacc cactcacgtt cggctcgggg 300

acaaagttgg aaataaaa 318

Claims

1.一种抗人ACE2蛋白单克隆抗体，其特征在于，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。

2.如权利要求1所述的抗人ACE2蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗人ACE2蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：8所示。

3.如权利要求1或2所述的抗人ACE2蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗人ACE2蛋白单克隆抗体的轻链型为Kappa，亚型为IgG 2a。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1或2所述的抗人ACE2蛋白单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，编码所述抗人ACE2蛋白单克隆抗体重链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；编码所述抗人ACE2蛋白单克隆抗体轻链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

6.根据权利要求1~3中任一项所述的抗人ACE2蛋白单克隆抗体在制备用于预防及治疗以ACE2作为受体的病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述病毒为SARS-CoV-2。