JP4758148B2 - インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体酵素 - Google Patents
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Description
本発明にかかる抗体酵素は、ヘマグルチニンを有するインフルエンザウイルスに対する抗体であって、ヘマグルチニンを認識し、且つ、当該ヘマグルチニンを分解する活性を有する抗体酵素であればよい。
本発明にかかる抗体酵素は、例えば、ヘマグルチニンHA1の高度保存領域に存在するアミノ酸配列および/またはヘマグルチニンHA2の高度保存領域に存在するアミノ酸配列を含む抗原ペプチドで免疫したマウス等の免疫動物の脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞等の融合パートナーとを融合させてなるハイブリドーマにより、モノクロナール抗体を産生することにより製造することができる。重鎖、軽鎖を得る場合には、得られたモノクロナール抗体を重鎖と軽鎖に分離すればよい。また、本発明の抗体断片を得る場合には、まず該当するモノクロナール抗体を取得し、その後、上記モノクロナール抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体断片が得られるように切断すればよい。
インフルエンザウイルスの表面蛋白質ヘマグルチニンHA1の高度保存領域であるTGLRNに、HA2の高度保存領域であるGITNKVNSVIEKを結合したペプチドのC末端にさらに2個のアラニン分子を結合して、19mer(TGLRNGITNKVNSVIEKAA)のペプチド(以下、適宜IAH(Influenza A型 Hemagglutinin)ペプチドと略記する。)を合成した。なお、アラニン分子を2個付加したのは、ヘリックス構造をとらせ、天然のヘマグルチニンの構造に近付けるためである。得られたIAHペプチドにHuman IgGを結合し抗原ペプチドとした。この抗原ペプチドをBlb/Cマウス(メス)に免疫し、ポリエチレングリコールによる通常の細胞融合法により、インフルエンザウイルスヘマグルチニンに対するモノクローナル抗体を作製した。
クリーンベンチ内にガラス製シリンジを2本用意し、1本のガラス製シリンジに19Gの注射針を取り付け、滅菌PBS(phosphate buffered saline、リン酸緩衝食塩水)で1mg/mLに希釈した抗原ペプチドを採取した。そして注射針をはずし、三方活栓を取り付けた。もう1本のガラス製シリンジを用意し、19Gの注射針で抗原ペプチドの1mg/mL PBS溶液と同量の完全フロイントアジュバンドを採取し、両方のガラス製シリンジを三方活栓に取り付けた。三方活栓でつないだガラス製シリンジを交互に押して抗原ペプチドとアジュバンドを白い乳液となるまでよく混合しW/O(ウオーターインオイル)の状態にした。
最終免疫の3日後に細胞融合を行った。ジエチルエーテルでマウスに麻酔を行い、半鋭バサミの先端をマウスの首の8割付近まであて、頚動脈を切断した。血液を採血管にとり、実験終了まで室温で静置させ、その後4℃で一晩静置し、翌日遠心(3000rpm、10分)後、抗血清を回収して力価測定を行った。図5に最終免疫後の力価測定の結果を示す。また、表1に最終免疫後の各マウスにおけるIAHペプチドに対する力価を示す。なお、力価はO.D.1/2をとり、そのときの希釈倍率を力価とした。
細胞融合後7日目の培地交換コロニーが確認できたウェルのスクリーニングを行った。スクリーニングは上述した力価測定のELISA法と同様に行い、コロニーが確認できたウェルの上清を96穴U底プレートに入れ、PBS−Tで1/2希釈をし、これを一次反応に用いた。一次反応の陽性コントロールとして細胞融合時の抗血清を、陰性コントロールとして未処理マウスの血清を1/100希釈したものを用いた。一次スクリーニングで陽性だった株はクローニングを行った。二次スクリーニング以降は各プレートでIAHペプチドに対して一番強く反応したものを限界希釈法によりクローニングした。スクリーニングは、コロニーが確認できたウェルがすべて陽性になるまで繰り返した。100%が2回連続して現われ、かつ、HAに特異的に反応する株をインフルエンザウイルスA型ヘマグルチニンに対するモノクローナル抗体として確立した。表3に各マウスにおける細胞融合効率と陽性出現率を示す。
確立したモノクロナール抗体(HA1−1およびHA1−2)のクラス・サブクラスの決定をIso StripTMマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いて行った。
<ペプチドとの交差反応性試験>
得られた2クローンの培養上清を用いて、いくつかのペプチドとの交差反応性をELISA法により調べた。ペプチドとしては、TP41−1、ECL2A、HIV V3 loop、およびRT−1を用いた。TP−41はHIVの表面タンパク質gp41の高度保存領域ペプチドであり、ECL2AはHIVのコレセプターであるケモカインレセプターCCR5Δ32の第2細胞外領域の欠損部位のペプチドであり、HIV V3 loopはHIVがCCR5のコレセプターと結合する部位の保存領域を元に合成したペプチドであり、RT−1はHIV逆転写酵素の部分ペプチドである。TP41−1は配列番号8に示すアミノ酸配列からなり、ECL2Aは配列番号9に示すアミノ酸配列からなり、HIV V3 loopは配列番号10に示すアミノ酸配列からなり、RT−1は配列番号11に示すアミノ酸配列からなる。また、それぞれのアミノ酸配列を以下の表5に示す。
得られた2クローンの培養上清を用いて、インフルエンザA型ウイルス(H1N1、H2N2、H3N2)および他のタンパク質との交差反応性をELISA法により調べた。他のタンパク質としては、Human IgG、BSA、HSA、KLH、Human-hemoglobinを用いた。
<HA1−1およびHA1−2の大量取得と精製>
純度の高いHA1−1およびHA1−2を得るため、精製前に50%硫安による塩析を2回行ってアルブミンを除去し、引き続いて、アフィゲルプロテインA MAPS-IIキット(BIO-RAD)を使用し精製した。
アフィゲルプロテインA MAPS-IIキットで精製した抗体HA1−1(またはHA1−2)(5mg分)溶液をセントリプレップ-10(MILLIPORE)で抗体液が約1mLになるまで限外濾過濃縮を行った。さらに5mLの50mM Tris−HCl、0.15M NaCl buffer (pH8.0)を加え、約1mLになるまで再び遠心濃縮した。この操作を再度行い、限外濾過後、50mM Tris−HCl、0.15M NaCl buffer (pH8.0)で溶液を2.7mLに調整し、褐色瓶に保存した。
HA1−1、HA−1−2をコードするmRNAを、QuickPrep mRNA Purification Kit (Amersham Bioscience製)を用いてハイブリドーマから抽出した。その後、AMV RT cDNA Synthesis Kit (Life Science Inc. 製)を用いて、得られたmRNAからcDNAを合成した。目的のHA1−1、HA−1−2をコードする遺伝子は、Ig-Prime Kits (Novagen製)を用いて、合成されたcDNAを鋳型に増幅し、TOPO TA Cloning Kits for Sequencing (Invitrogen製) にサブクローニング後、M13 forward (-20)およびreverse プライミング部位より配列決定を行った。配列決定には、全自動DNAシークエンサーを使用した。HA1−1、HA−1−2の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、決定された各DNA配列をもとに推定した。
<TP41−1ペプチドを用いたペプチダーゼ活性試験>
本実験では全てのガラス器、プラスチック用品、緩衝液は乾熱滅菌あるいはオートクレーブ滅菌して用いた。また、オートクレーブできないものは0.2μmのフィルターで濾過滅菌した。実験操作はすべてクリーンベンチ内で行った。
IAHペプチド溶液(終濃度:140μM)と終濃度0.2μMあるいは0.4μMに調製したHA1−1−H(またはHA1−1−LまたはHA1−2−HまたはHA1−2−L)とを混合した。
抗原分解活性を示す抗体サブユニットは2相性(誘導期および活性期)の曲線を描きながらペプチドを分解するため、この曲線から分解の初速度を求めるのは困難である。そこで一度、完全にペプチドを分解した反応液に再びペプチドを添加することで誘導期をなくしこの問題を解決した。酵素による基質の変化量が1割未満を初速度として定義した。HA1−2−Lを0.64mMと一定濃度にし、基質(TP41−1ペプチド)濃度を変化させた。得られたHanes-WoolfプロットからMichaelis-Menten式に従い動力学的パラメータを算出した。
<HA1−1の重鎖によるインフルエンザA型ヘマグルチニン分解試験>
まず、HA1−1抗体重鎖(HA1−1−H)でTP41−1ペプチドを完全に分解させた(HA1−1−Hの活性化)。その後、インフルエンザA型ウイルスと1:1の割合で混合し、反応させた(インフルエンザA型ウイルス 500μL + 活性化HA1−1−H500μL)。コントロールとしてインフルエンザA型ウイルスと15mM PBを1:1の割合で混合し、反応させた(インフルエンザA型ウイルス 300μL + 15mM PB 300μL)。これをSDS−PAGEで経時変化を追跡した。
HA1−1抗体軽鎖(HA1−1−L)を用いた以外は前記と同様にして、HA1−1抗体軽鎖(HA1−1−L)によるインフルエンザウイルス構成タンパク質の分解を試みた。図24にHA1−1抗体軽鎖によるインフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの分解試験結果を示す。図24に示すように、HA2分子のみが4時間で20%、8時間で40%分解していた。
HA1−2抗体重鎖(HA1−2−H)を用いた以外は前記と同様にして、HA1−1抗体重鎖(HA1−2−H)によるインフルエンザウイルス構成タンパク質の分解を試みた。図25にHA1−2抗体重鎖によるインフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの分解試験結果を示す。図25に示すように、HA1−2−Hは反応開始から約4時間で、HA2分子をほとんど分解した。一方、コントロールとして用いたヒト血清アルブミン(HSA)はほとんど分解されなかった。
Claims (4)
- ヘマグルチニンを有するインフルエンザウイルスに対する抗体の重鎖からなる抗体酵素の断片であって、
ヘマグルチニンを認識し、且つ、当該ヘマグルチニンを分解する活性を有し、
上記重鎖の可変領域が、配列番号4に示すアミノ酸配列または配列番号6に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする抗体酵素の断片。 - ヘマグルチニンHA1の高度保存領域に存在する配列番号1に示すアミノ酸配列、および/またはヘマグルチニンHA2の高度保存領域に存在する配列番号2に示すアミノ酸配列を認識することを特徴とする請求項1に記載の抗体酵素の断片。
- ヘマグルチニンHA1の高度保存領域に存在する配列番号1に示すアミノ酸配列、および/またはヘマグルチニンHA2の高度保存領域に存在する配列番号2に示すアミノ酸配列を含む抗原ペプチドを抗原として作製されたことを特徴とする請求項1または2に記載の抗体酵素の断片。
- 抗原として用いられる上記抗原ペプチドは、配列番号3に示すアミノ酸配列からなるペプチドをタンパク質と共有結合させてなることを特徴とする請求項3に記載の抗体酵素の断片。
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