CN103833830A - 柯萨奇病毒a16型的保守中和表位多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及柯萨奇病毒A16型的保守中和表位多肽及其用途。具体而言，本发明提供了柯萨奇病毒A16型中和表位多肽；本发明还提供了可特异性结合上述中和表位多肽的结合分子、包含所述结合分子的抗血清、检测柯萨奇病毒A16型的试剂盒、检测方法以及抑制柯萨奇病毒A16型的组合物；本发明还提供了上述中和表位多肽、结合分子和抗血清在制备预防、治疗手足口病药物以及诊断手足口病诊断剂中的用途。其优点在于：首次鉴定出6个在CA16VP1上的线性中和表位，不同基因型CA16序列比对结果显示这些表位非常保守，将中和表位多肽免疫小鼠引起的血清可以中和同源和异源的CA16株型，这些结果对于柯萨奇病毒A16型疫苗及诊断试剂盒的开发有重要的指导意义。

Description

柯萨奇病毒A16型的保守中和表位多肽及其用途

技术领域

本发明涉及抗原的表位及其应用，具体地说，是柯萨奇病毒A16型的保守中和表位多肽及其用途。

背景技术

柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16, CA16, CVA16）属于小RNA病毒科肠道病毒属，病毒基因组是约7410bp的单股正链RNA，包含一个编码长肽链的开放阅读框，长肽链分为结构蛋白P1和非结构蛋白P2和P3区域，P1被病毒蛋白酶切割为病毒衣壳蛋白VP1、VP0和VP3；部分VP0进一步自切割为VP2和VP4。

CA16是儿童中常见的手足口病（hand, foot and mouth disease, HFMD）的一个主要致病原。CA16感染的多数患者临床病症较轻微，大多能自愈，包括发热、口腔溃疡、手足部红色疱疹。但越来越多的证据显示CA16的感染也能引起患儿严重病症甚至死亡。例如最近Xu等报道了92例严重神经症状的HFMD，其中19例是由于感染了CA16（Xu W, Liu CF, Yan L, Li JJ, Wang LJ, Qi Y, et al. Distribution of enteroviruses in hospitalized children with hand, foot and mouth disease and relationship between pathogens and nervous system complications. Virol J 2012;9(1):8.）。目前还没有针对CA16的有效疫苗和药物。但是最近中国大陆的几家疫苗公司开始研发CA16的全病毒灭活苗。另外，上海巴斯德研究所已制备了基于病毒样颗粒的CA16新型疫苗，该疫苗能在小鼠体内引起较好的中和抗体反应，所产生的抗血清在CA16病毒攻击实验中能够有效保护小鼠，具体可参见期刊文献：Liu Q, Yan K, Feng Y, Huang X, Ku Z, Cai Y, et al. A virus-like particle vaccine for coxsackievirus A16 potently elicits neutralizing antibodies that protect mice against lethal challenge. Vaccine 2012 Oct 19;30(47):6642-8.）；还可参见专利文献：申请号201010553419.1，申请日2010年11月19日，发明名称“柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒疫苗”。Mao等报道的CA16灭活病毒免疫小鼠抗血清中的中和抗体也能在一定程度保护小鼠致死剂量的攻击（Mao Q, Wang Y, Gao R, Shao J, Yao X, Lang S, et al. A Neonatal Mouse Model of Coxsackievirus A16 for Vaccine Evaluation. J Virol 2012 Sep 5.）。这些发现都证明了中和抗体在体内可以抵抗CA16病毒感染。

许多研究表明，肠道病毒的VP1衣壳蛋白是主要的中和位点所在。如期刊文献：Foo DG, Alonso S, Phoon MC, Ramachandran NP, Chow VT, Poh CL. Identification of neutralizing linear epitopes from the VP1 capsid protein of Enterovirus 71 using synthetic peptides. Virus Res 2007 Apr;125(1):61-8，鉴定出的EV71的两个中和表位在VP1上。然而，截至目前CA16的中和表位却仍未被鉴定出。而CA16中和表位的鉴定对于CA16预防或治疗药物以及诊断剂的制备，其意义十分重大。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种分离的多肽。

本发明的再一的目的是，提供上述多肽的用途。

本发明的另一的目的是，提供一种另一种多肽。

本发明的第四个目的是，提供上述的另一种多肽的用途。

本发明的第五个目的是，提供一种基于上述多肽的结合分子。

本发明的第六个目的是，提供上述结合分子的用途。

本发明的第七个目的是，提供一种抗血清。

本发明的第八个目的是，提供上述抗血清的用途。

本发明的第九个目的是，提供一种检测柯萨奇病毒A16型Coxsackievirus A16的试剂盒。

本发明的第十个目的是，提供一种非治疗目的的检测柯萨奇病毒A16型的方法。

本发明的第十一个目的是，提供一种抑制柯萨奇病毒A16型的组合物。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种分离的多肽，所述的多肽选自SEQ ID NO.1-6所示氨基酸序列的任一种。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：如上所述的多肽在制备预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染的疾病药，或制备诊断柯萨奇病毒A16型感染的疾病诊断剂中的用途；所述的柯萨奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种多肽，所述的多肽选自：

a）SEQ ID NO.1-6所示氨基酸序列中任一种氨基酸序列的串联排列；或

b）SEQ ID NO.1-6所示氨基酸序列中任两种或两种以上氨基酸序列的组合，

所述的多肽用于制备预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染的疾病药，或制备诊断柯萨奇病毒A16型感染的疾病诊断剂。在该多肽中，串联多肽即序列如SEQ ID NO.1-6所示的多肽，其顺序和每条多肽的拷贝数是随机选择的。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：上述多肽在制备预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染的疾病药，或制备诊断柯萨奇病毒A16型感染的疾病诊断剂中的用途；所述的柯萨奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：一种结合分子，所述的结合分子可特异性结合如上所述的多肽；优选的，所述的结合分子是抗体；更优选的，所述的抗体是广谱中和单克隆抗体。

为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：如上所述的结合分子在制备预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染的疾病药，或制备诊断柯萨奇病毒A16型感染的疾病诊断剂中的用途；所述的柯萨奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。

为实现上述第七个目的，本发明采取的技术方案是：一种抗血清，所述的抗血清包含如上任一所述的结合分子。

为实现上述第八个目的，本发明采取的技术方案是：如上所述的抗血清在制备预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染的疾病药，或制备诊断柯萨奇病毒A16型感染的疾病诊断剂中的用途；所述的柯萨奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。

为实现上述第九个目的，本发明采取的技术方案是：一种检测柯萨奇病毒A16型的试剂盒，所述的试剂盒包含如上所述的任一种多肽或如上所述的任一种结合分子。

为实现上述第十个目的，本发明采取的技术方案是：一种非治疗目的的检测柯萨奇病毒A16型的方法，包括步骤：a）将样品与选自下组的物质接触：如上所述的任一种多肽、如上任一所述的抗体、或其组合；b）检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在柯萨奇病毒A16型或抗柯萨奇病毒A16型的抗体。所述的非治疗目的的检测柯萨奇病毒A16型的方法诸如检测土壤样本中的柯萨奇病毒A16，或者是在科学研究中检测人血液样本中是否存在柯萨奇病毒A16等。

为实现上述第十一个目的，本发明采取的技术方案是：一种抑制柯萨奇病毒A16型的组合物，所述的组合物包含：a）如上所述的任一种结合分子；和b）药学上可接受的载体。

本发明优点在于：

本发明利用具有中和活性的抗CA16病毒样颗粒抗血清筛选涵盖整个VP1蛋白的95条合成多肽，鉴定出15个结合力较强的多肽。通过体外中和抑制试验进一步筛选出对抗CA16病毒样颗粒抗血清的中和效果有显著抑制能力的6条不重叠的多肽。用这些多肽免疫小鼠所产生的抗血清能够与同源多肽结合，并在免疫荧光和免疫印记检测中特异性识别CA16的VP1蛋白。更重要的是，这些抗血清可以在体外中和CA16病毒感染，表明这6条多肽代表的是中和表位。通过序列比对发现，这些表位在不同基因型的CA16毒株间非常保守。因此本发明对开发基于中和表位多肽的CA16疫苗和诊断剂具有重要指导意义。

附图说明

附图1是多肽ELISA测定鼠抗VLP血清与合成多肽的结合反应。用包括CA16 VP1蛋白上所有序列的95条多肽包被ELISA板，将VLP抗血清1:1000稀释检测包被的多肽，数值代表的是三次独立实验的其中一次结果。

附图2是PEP32和PEP91抑制抗VLP血清的中和能力。多肽和抗血清的混合物，与CA16孵育后，加入RD 细胞，其中，（B）未加抗血清和多肽的对照；（C）只有VLP抗血清；（D）VLP抗血清和PEP21；（E）抗血清和PEP32；（F）抗血清和PEP91；（A）为未感染病毒的RD细胞。

附图3是通过免疫荧光用多肽抗血清检测感染CA16的细胞。感染CA16的VERO细胞与1:100稀释的免疫前血清和多肽抗血清在37?C温浴1小时，然后与Alexa Fluor 488标记的抗小鼠IgG的抗体在37?C温浴30分钟。豚鼠抗CA16重组VP0蛋白的多抗血清作为阳性对照。用DAPI染色细胞。分别在Alexa Fluor 488和DAPI的滤光器下采集图像，然后合并。

附图4是免疫印记分析。灭活CA16蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，用如图所示的抗体作为一抗和HRP标记的二抗去检测。

附图5是多肽抗血清在体外中和CA16。免疫前血清和对照血清（抗HCV多肽）在最低稀释度1:8浓度下依然没有显示出中和效果，为计算GMT定义其中和滴度为4。每个图标代表一只小鼠。直线代表的是各组的GMT。

附图6是中和表位的序列比对。用DNAMAN软件比对了11株CA16的VP1蛋白的序列。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1  中和表位多肽的合成、筛选和鉴定

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒与血清

RD细胞和VERO细胞的培养请参考文献：Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, Huang Z. Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 using polyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins. J Virol Methods 2011 Apr;173(1):115-20。

所用毒株CA16-SZ05（GeneBank ID: EU262658）请参考文献：（1）Wu Z, Gao Y, Sun L, Tien P, Jin Q. Quick identification of effective small interfering RNAs that inhibit the replication of coxsackievirus A16. Antiviral Res 2008 Dec;80(3):295-301和（2）Yang F, Jin Q, He Y, Li L, Hou Y. The complete genome of Enterovirus 71 China strain. Sci China C Life Sci 2001 Apr;44(2):178-83。

毒株CA16-G08从一手足口病人的粪便样品中分离得到，分离程序请参考文献：Li L, He Y, Yang H, Zhu J, Xu X, Dong J, Zhu Y, Jin Q. Genetic characterization of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen, People’s Republic of China. J Clin Microbiol 2005 Aug;43(8):3835-9。

扩增病毒使用RD细胞。

病毒滴度测定方法请参考文献：Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, Huang Z. Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 using polyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins. J Virol Methods 2011 Apr;173(1):115-20。

所用的抗CA16 VLP的小鼠血清的制备请参考文献：Liu Q, Yan K, Feng Y, Huang X, Ku Z, Cai Y, et al. A virus-like particle vaccine for coxsackievirus A16 potently elicits neutralizing antibodies that protect mice against lethal challenge. Vaccine 2012 Oct 19;30(47):6642-8。

1.2 多肽合成

在上海吉尔生化有限公司合成了95条多肽，这些多肽覆盖了毒株CA16-SZ05的整个VP1蛋白的氨基酸序列。每条多肽含有15个氨基酸，其中12个残基与相邻多肽相重叠。另外，氨基酸序列如SEQ ID NO.1-6所示的多肽均化学偶联了KLH。

1.3 多肽ELISA

    用ELISA方法来检测95条多肽与CA16 VLP抗血清的反应。简短的说，将每条多肽50μl（10μg/ml）包被于96孔ELISA板，37?C温浴2小时。用含5%脱脂牛奶的PBST每孔200μl 37?C封闭1小时。50μl每孔加入用含1%牛奶的PBST 1:1000稀释的小鼠血清，37?C温浴2小时。每孔加入50μl用含1%牛奶的PBST 1:5000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗小鼠IgG，37?C温浴1小时。每次温浴后，ELISA板用PBST洗5遍。最后每孔加入50μl TMB显色底物，避光孵育5-10分钟，然后每孔加入50μl 1N H₃PO₄ 终止反应。在读板机上测定OD₄₅₀。

1.4 中和实验和中和抑制实验

    中和实验方法请参考文献：Liu Q, Yan K, Feng Y, Huang X, Ku Z, Cai Y, et al. A virus-like particle vaccine for coxsackievirus A16 potently elicits neutralizing antibodies that protect mice against lethal challenge. Vaccine 2012 Oct 19;30(47):6642-8，其不同之处仅在于所使用的病毒量由100TCID₅₀改为50TCID₅₀。能够阻止细胞出现病变（细胞变圆、聚集并且漂浮）的血清最高稀释度判定为中和滴度。

进一步通过多肽抑制实验来研究多肽对CA16 VLP抗血清的中和能力的影响。简短的说，将含2% FBS的DMEM倍比稀释的CA16 VLP抗血清与不同浓度的合成多肽混合，在37?C温浴1小时，然后将混合物做中和实验，方法如前所述。

1.5 小鼠免疫

Balb/c雌性小鼠，每组5只，腹腔注射50μg KLH偶联的合成多肽，初次免疫使用的是弗氏完全佐剂。每隔两周用弗氏不完全佐剂同样抗原剂量加免，共加免三次。在最后一次免疫后的两周杀掉小鼠采血。所有动物操作符合上海巴斯德研究所的IACUC法则规定。

1.6 抗体滴度测定

多肽特异的IgG滴度测定采用如文献：Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, Huang Z. Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 using polyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins. J Virol Methods 2011 Apr;173(1):115-20所述的终点滴度ELISA方法，但有如下改变：每孔500ng多肽包被ELISA板，二抗为HRP标记的兔抗小鼠IgG（购自Sigma公司）。将吸光值比空白对照（免疫前血清）≥0.1的对应的血清最高稀释度的倒数作为终点滴度。

1.7 SDS-PAGE及免疫印记分析

SDS-PAGE及Western blot 请参考文献：Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, Huang Z. Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 using polyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins. J Virol Methods 2011 Apr;173(1):115-20。简短的说，将灭活的CA16通过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白条带后转移到PVDF膜上。然后用多肽的鼠抗血清和HRP标记的兔抗小鼠IgG（购自Sigma公司）检测膜上的CA16蛋白。

1.8 免疫荧光染色

    免疫荧光染色方法请参考文献：Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, Huang Z. Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 using polyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins. J Virol Methods 2011 Apr;173(1):115-20。有如下改变：多肽抗血清用PBS进行1:100稀释，用1:1000稀释的Alexa Fluor 488-标记的抗小鼠IgG（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）为检测二抗。用5μg/ml 4,6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚（DAPI）室温孵育5分钟对细胞核染色。染色细胞用荧光显微镜（Leica, Wetzlar, Germany）观察。

1.9 序列比对

从NCBI的PubMed网站下载了十一株CA16基因组序列，用DNAMAN软件比对了这些毒株的VP1蛋白序列。

2 结果

2.1 多肽ELISA鉴定出VP1线性优势表位

如前所述，用CA16 VLP免疫小鼠能引起中和抗体（Liu Q, Yan K, Feng Y, Huang X, Ku Z, Cai Y, et al. A virus-like particle vaccine for coxsackievirus A16 potently elicits neutralizing antibodies that protect mice against lethal challenge. Vaccine 2012 Oct 19;30(47):6642-8.）。为了鉴定出这些中和表位，我们首先用CA16 VLP抗血清来筛选，该抗血清针对CVA16-SZ05毒株中和滴度达到32,000，用该抗血清与CA16 VP1蛋白的95条合成多肽反应。图1显示了抗血清与各条多肽的结合特性。部分多肽显示出了高结合特性，证明其包含了B细胞表位。根据ELISA读值，选出了15条结合力最高的多肽（多肽编号如表1所示）来进一步分析。

表1  多肽对不同稀释度VLP抗血清中和能力的抑制

注：多肽浓度为50 μg/ml，通过多肽处理，细胞出现病变则可认为多肽抑制了该稀释度下VLP抗血清的中和能力，则标记为“+”，否则，为“－”。

2.2 多肽削弱了VLP抗血清的中和能力

我们进一步检测了这些多肽结合VLP抗血清后是否会影响其中和效果。以与VLP抗血清无显著结合的#21多肽（命名为PEP21）作为阴性对照。如表1所示，选出的有高结合力的15条多肽中，8条多肽如PEP21一样，对VLP抗血清的中和能力没有明显抑制效果；而其他7条多肽抑制了VLP抗血清的中和能力，使其在1:8000时不能保护细胞而出现CPE。其中，有两条多肽PEP32和PEP91可以更有力地削弱VLP抗血清的中和能力，使其在1:4000时不能保护细胞而出现CPE。图2为PEP32和PEP91抑制血清中和能力示例。表2所示的为有抑制能力的7条多肽在100 和200 μg/ml浓度时可以发挥抑制中和效果，其中，PEP91在浓度低至25 μg/ml依然可以抑制中和。这些结果显示，这7条多肽可能代表的是中和表位。

表2 筛选出的有抑制中和能力的多肽在不同浓度下的抑制中和效果

注：中和血清1:5000稀释。通过多肽处理，细胞出现病变，可认为多肽在此浓度下抑制了抗血清中和能力，标记为“+”，否则标记为“－”。

2.3 抑制性多肽在小鼠上的免疫原性

为进一步分析这些抑制性多肽的免疫原性，除了与PEP91多肽有重叠且显示出稍弱抑制效果的PEP90外，其余6条多肽化学偶联KLH后免疫小鼠。用相对应的多肽包板作为捕获抗原通过ELISA方法来检测多肽抗血清的抗体滴度。免疫的小鼠都可以检测到多肽特异的抗体，但各组之间的滴度差别较大，如表3所示。将每组的抗血清混合后进一步评价其检测CA16的能力。如图3所示，通过免疫荧光实验，6条多肽的抗血清都可以如阳性对照（豚鼠抗CA16 VP0多克隆抗体）（Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, Huang Z. Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 using polyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins. J Virol Methods 2011 Apr;173(1):115-20.）一样，能检测到CA16感染的细胞，而免疫前血清则不能。如图4所示，免疫印记分析进一步显示了所有的多肽抗血清都可以特异地识别大约34kDa代表CA16 VP1的条带，与VP1抗血清识别的条带一致（Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, Huang Z. Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 using polyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins. J Virol Methods 2011 Apr;173(1):115-20.）；其中，只能被抗VP0多抗识别的一条28kDa的主带和一条38kDa小带分别代表VP2和VP0蛋白（Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, Huang Z. Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 using polyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins. J Virol Methods 2011 Apr;173(1):115-20.）。

表3 抗多肽抗体的功能活性

2.4 多肽抗血清的中和能力

通过微量中和实验来检测多肽抗血清的中和能力。如图5所示，所有的多肽抗血清都可以中和同源病毒株CA16-SZ05，中和滴度在8-64范围内；而免疫前血清和对照血清（HCV多肽抗血清）即便在实验中的最低稀释度1:8也没有中和能力（因此被赋予中和滴度为4，以用于计算几何平均值GMT）。另外，如表3所示，每组的多肽混合抗血清可以中和CA16-SZ05和异源株CA16-G08。

2.5序列比对

我们比较了11株包括A,B1(B1a和B1b),和B2基因型的CA16的VP1氨基酸序列。比对的结果如图6所示，PEP55、PEP63和PEP91在这些株中序列是一致的；而PEP32 和PEP37也是高度保守的，有93.3%的一致性。有意思的是，PEP71在11株中一致性并不高，但差异仅仅是由于属于A基因型的G10株所致，而对于除了A基因型外的其他株的序列来说是完全一致的。

实施例2  单克隆抗体的制备

    1、抗原：KLH偶联的合成多肽，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-6所述。

2、小鼠的免疫：纯种BALB/C小鼠，鼠龄6-8周。腹腔注射50μg KLH偶联的合成多肽，初次免疫使用的是弗氏完全佐剂。每隔两周用弗氏不完全佐剂同样抗原剂量加免，共加免三次。在最后一次免疫后的两周杀掉小鼠采血。所有动物操作符合上海巴斯德研究所的IACUC法则规定。将免疫过程中的小鼠取血，用ELISA检测小鼠血清中抗体表达情况，从而判断小鼠的免疫效果。

3、与SP2/0骨髓瘤细胞株融合：将免疫好的小鼠处死，取脾细胞。将骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞以1:10混合在一起，采用PEG1500作为融合剂融合。

4、融合后的细胞以有限稀释的方式接种到96孔板中，在HAT培养基中筛选。

5、收取细胞上清，ELISA检测不同的单克隆细胞群分泌抗体的能力，获得单克隆抗体。

将本实施例制备的单克隆抗体通过微量中和实验来检测其中和能力，中和实验具体操作同实施例1步骤1.4。结果证实针对SEQ ID NO.1-6任一中和表位制备的单克隆抗体都可以中和CA16-SZ05，也可以中和异源株CA16-G08。

实施例3  多克隆抗体的制备

1、抗原的选择及获得：合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1-6所述的多肽，将多肽对应的核酸序列加入His标签，构建入原核表达载体Pet28a中。将该多肽的表达载体转化入大肠杆菌BL21中进行表达，对可溶性蛋白上清用镍柱进行纯化。测量纯化后获得的多肽浓度，并用His抗体对多肽进行western检测。western检测阳性，准备免疫动物；

2、免疫动物：选择新西兰兔两只，每次免疫200μg免疫原，初期使用弗氏完全佐剂，后期使用不完全佐剂。分别在第0、2、4、5、6、7、8、9周进行免疫，从第5周开始，静脉取血跟踪检测免疫效果；

3、取动物的抗血清，经过抗原偶联的亲和层析柱纯化，即得多克隆抗体。

将本实施例制备的多克隆抗体通过微量中和实验来检测其中和能力，中和实验具体操作同实施例1步骤1.4。结果证实针对SEQ ID NO.1-6任一中和表位制备的多克隆抗体都可以中和CA16-SZ05，也可以中和异源株CA16-G08。

实施例4  CA16的诊断试剂

CA16的诊断试剂，包括以下试剂：

1、包被缓冲液（pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液）：Na₂CO₃ 1.59克，NaHCO₃ 2.93克，加蒸馏水至1000ml；

2、洗涤缓冲液（pH7.4 PBS）：0.15M KH₂PO₄ 0.2克，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9克，NaCl 8.0克，KCl 0.2克，Tween-20 0.05%（体积分数）0.5ml，加蒸馏水至1000ml；

3、稀释液：牛血清白蛋白（BSA）0.1克，加洗涤缓冲液至100ml，或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成质量分数5-10%使用；

4、终止液（2M H₂SO₄）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml；

5、底物缓冲液（pH5.0磷酸枣柠檬酸）：0.2M Na₂HPO₄（28.4克/L）25.7ml，　　0.1M柠檬酸（19.2克/L）24.3ml，加蒸馏水50ml；

6、TMB（四甲基联苯胺）使用液：TMB（10mg/5ml无水乙醇）0.5ml，　　底物缓冲液（pH5.5）10ml，0.75% H₂O₂ 32μl；

7、ABTS使用液：ABTS 0.5mg，底物缓冲液（pH5.5）1ml，3% H₂O₂ 2μl；

8、抗原、实施例2或3制备的抗体和酶标记抗体；

9、正常人血清和阳性对照血清。

利用本实施例的CA16诊断试剂，测试了经CA16柯萨奇病毒A16型（CA16）核酸检测试剂盒（RT-PCR-荧光探针法，购于北京富众科技发展有限公司）检测呈阳性的血清样品100例，以及正常人血清样品100例，检测结果如表4所示。

表4 实施例4的CA16诊断试剂的诊断结果

实施例5  抑制性多肽联合1的免疫原性

1、抗原的选择及获得：将如SEQ ID NO.1-6所述的六条多肽的氨基酸序列串联在一起，串联多肽顺序为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6，串联多肽的序列为：TMPTMGTQNTDGYANWDIDLMGYAQLRRKCPTSRDSFAWQTATNPPAQVSVPFMSPASAY FGEHLQANDLDYGQCYLFKTNPNYKGNDIK（如SEQ ID NO.9所示）。将串联多肽对应的序列加入His标签，构建入原核表达载体Pet28a中。将该串联多肽的表达载体转化入大肠杆菌BL21中进行表达，对可溶性蛋白上清用镍柱进行纯化。测定纯化后获得的多肽浓度，并用His抗体对多肽进行western检测。western检测阳性，准备免疫动物；

2、免疫动物：纯种BALB/C小鼠，鼠龄6-8周。腹腔注射50μg表达的串联多肽，初次免疫使用的是弗氏完全佐剂。每隔两周用弗氏不完全佐剂同样抗原剂量加免，共加免三次。在最后一次免疫后的两周杀掉小鼠采血，获得抗血清。

将本实施例制备的抗血清通过微量中和实验来检测其中和能力，中和实验具体操作同实施例1步骤1.4。结果证实针对串联多肽的抗血清可以中和CA16-SZ05，也可以中和异源株CA16-G08。

实施例6  抑制性多肽联合2的免疫原性

1、抗原的选择及获得：将如SEQ ID NO.1-6所述的六条多肽的氨基酸序列串联在一起，串联多肽顺序为SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.2，串联多肽的序列为：YLFKTNPNYKGNDIKFGEHLQANDLDYGQCFGEHLQANDLDYGQCWDIDLMGYAQLRRKC（如SEQ ID NO.10所示）。将串联多肽对应的序列加入His标签，构建入原核表达载体Pet28a中。将该串联多肽的表达载体转化入大肠杆菌BL21中进行表达，对可溶性蛋白上清用镍柱进行纯化。测定纯化后获得的多肽浓度，并用His抗体对多肽进行western检测。western检测阳性，准备免疫动物；

2、免疫动物：纯种BALB/C小鼠，鼠龄6-8周。腹腔注射50μg表达的串联多肽，初次免疫使用的是弗氏完全佐剂。每隔两周用弗氏不完全佐剂同样抗原剂量加免，共加免三次。在最后一次免疫后的两周杀掉小鼠采血，获得抗血清。

将本实施例制备的抗血清通过微量中和实验来检测其中和能力，中和实验具体操作同实施例1步骤1.4。结果证实针对串联多肽的抗血清可以中和CA16-SZ05，也可以中和异源株CA16-G08。

需要说明的是，本领域技术人员均知，联合的抑制性多肽中，串联多肽的顺序和每条多肽的拷贝数是随机选择的，而不仅限于实施例5和6。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>  中国科学院上海巴斯德研究所

<120>  柯萨奇病毒A16型的保守中和表位多肽及其用途

<130>  /

<160>  10   

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  1

Thr Met Pro Thr Met Gly Thr Gln Asn Thr Asp Gly Tyr Ala Asn

1               5                   10                  15 

<210>  2

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  2

Trp Asp Ile Asp Leu Met Gly Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Cys

1               5                   10                  15 

<210>  3

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  3

Pro Thr Ser Arg Asp Ser Phe Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro

1               5                   10                  15 

<210>  4

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  4

Pro Ala Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr

1               5                   10                  15 

<210>  5

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  5

Phe Gly Glu His Leu Gln Ala Asn Asp Leu Asp Tyr Gly Gln Cys

1               5                   10                  15 

<210>  6

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  6

Tyr Leu Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys

1               5                   10                  15 

<210>  7

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  7

Asn Gln Pro Tyr Leu Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn

1               5                   10                  15 

<210>  8

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  8

Lys Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn His His Ser Thr

1               5                   10                  15 

<210>  9

<211>  90

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  9

Thr Met Pro Thr Met Gly Thr Gln Asn Thr Asp Gly Tyr Ala Asn Trp

1               5                   10                  15     

Asp Ile Asp Leu Met Gly Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Cys Pro Thr

            20                  25                  30         

Ser Arg Asp Ser Phe Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro Pro Ala Gln

        35                  40                  45             

Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Phe Gly Glu His

    50                  55                  60                 

Leu Gln Ala Asn Asp Leu Asp Tyr Gly Gln Cys Tyr Leu Phe Lys Thr

65                  70                  75                  80 

Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys

                85                  90 

<210>  10

<211>  60

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  10

Tyr Leu Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys Phe

1               5                   10                  15     

Gly Glu His Leu Gln Ala Asn Asp Leu Asp Tyr Gly Gln Cys Phe Gly

            20                  25                  30         

Glu His Leu Gln Ala Asn Asp Leu Asp Tyr Gly Gln Cys Trp Asp Ile

        35                  40                  45             

Asp Leu Met Gly Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Cys

    50                  55                  60

Claims (17)

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽选自SEQ ID NO.1-6所示氨基酸序列的任一种。

2.权利要求1所述的多肽在制备预防或治疗柯萨奇病毒A16型Coxsackievirus A16感染的疾病药，或制备诊断柯萨奇病毒A16型感染的疾病诊断剂中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的柯萨奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。

4.一种多肽，其特征在于，所述的多肽选自：

a）SEQ ID NO.1-6所示氨基酸序列中任一种氨基酸序列的串联排列；或

b）SEQ ID NO.1-6所示氨基酸序列中任两种或两种以上氨基酸序列的组合，

所述的多肽用于制备预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染的疾病药，或制备诊断柯萨奇病毒A16型感染的疾病诊断剂。

5.权利要求4所述的多肽在制备预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染的疾病药，或制备诊断柯萨奇病毒A16型感染的疾病诊断剂中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的柯萨奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。

7.一种结合分子，其特征在于，所述的结合分子可特异性结合权利要求1或4所述的多肽。

8.根据权利要求7所述的结合分子，其特征在于，所述的结合分子是抗体。

9.根据权利要求8所述的结合分子，其特征在于，所述的抗体是广谱中和单克隆抗体。

10.权利要求7-9任一所述的结合分子在制备预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染的疾病药，或制备诊断柯萨奇病毒A16型感染的疾病诊断剂中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的柯萨奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。

12.一种抗血清，其特征在于，所述的抗血清包含权利要求7-9任一所述的结合分子。

13.权利要求12所述的抗血清在制备预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染的疾病药，或制备诊断柯萨奇病毒A16型感染的疾病诊断剂中的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的柯萨奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。

15.一种检测柯萨奇病毒A16型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1或4所述的多肽或权利要求7-9任一所述的结合分子。

16.一种非治疗目的的检测柯萨奇病毒A16型的方法，其特征在于，包括步骤：

 a）将样品与选自下组的物质接触：权利要求1或4所述的多肽、权利要求7-9任一所述的抗体、或其组合；

 b）检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在柯萨奇病毒A16型或抗柯萨奇病毒A16型的抗体。

17.一种抑制柯萨奇病毒A16型的组合物，其特征在于，所述的组合物包含：

a）权利要求7-9任一所述的结合分子；和

b）药学上可接受的载体。

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