CN102351947A

CN102351947A - Ev71早期诊断方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102351947A
Application number: CN2011103144294A
Authority: CN
Inventors: 王华林; 张涛; 王志英; 周敏; 苏正元; 胡志红
Original assignee: HUBEI NEW ZONGKE VIRUS DESEASE ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HUBEI NEW ZONGKE VIRUS DESEASE ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-10-17
Filing date: 2011-10-17
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2031-10-17
Also published as: CN102351947B

Abstract

本发明涉及EV71的早期诊断方法及试剂盒。具体地，本发明使用源自EV71病毒的重组蛋白作为抗原，以及该重组蛋白免疫动物后产生的抗体(单抗、多抗)，结合酶联免疫和其他方法检测人血清样品中的早期抗EV71抗体IgM或IgG，或直接检测血清样品中EV71病原体。

Description

EV71早期诊断方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子免疫学领域，特别涉及一种肠道病毒的诊断方法及试剂盒。

背景技术

手足口病(Hand-Foot-Mouth disease，HFMD)又名发疹性水疱口腔炎，是由肠道病毒引起的全球性常见传染病。病毒学和流行病学的研究证实：人肠道病毒71型(Entrovirus 71，EV71)是近年来爆发的人手足口病的主要病原体。EV71病毒属于小RNA病毒科，病毒颗粒为典型的正二十面体结构，其基因组为单股正链RNA，长度约为7,408个核苷酸。该病毒具有很强的感染性和传染性，除手足口病外，其还能引起无菌性脑膜炎(aseptic meningitis)、脑干脑炎(brain stemencephalitis)等多种神经系统疾病。

目前已经发展并使用的诊断方法包括：

1.RT-PCR检查病毒。能及时检查带毒者，当痊愈后，显阴性。但受到仪器设备、样品收集处理、实验场地等条件的限制，易产生较多的假阴性和假阳性而导致漏诊或误诊。

2.通过临床症状综合评价诊断。这种方法在疾病的早期，因症状不典型，而无法准确诊断。在疾病的晚期，虽然可以准确诊断，但延误了对疾病的治疗。

3.血清免疫检查病毒抗体(荧光免疫法或ELISA)。抗体产生需要在发病后至少14天，因此，这种方法不能做早期诊断。但是从免疫学角度来说，机体产生病原体特异性抗体IgM较早，选择合适的抗原与之结合也可以用作诊断参考。

目前正在使用的大多数是前三种方法，这些方法在临床使用过程中，不能简便、快速、准确的判断与区分患者与疑似病例。

4.抗原检测(ELISA)。通过制备病原体特异性的抗体(单抗与多抗)检测病人血液或组织中病原体，该方法准确率高，操作简便，适合临床推广。但目前缺少病原体的特异性抗体。

因此，本领域迫切需要开发新的更加有效的早期诊断EV71的方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、简便、准确率高的EV71检测方法和试剂盒。

本发明的第一方面，提供一种源自EV71病毒的重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8或9。这些EV71特异性重组蛋白可特异性地与抗EV71病毒的抗体结合。

本发明的第二方面，提供了一种抗体，所述抗体特异性地与本发明的EV71特异性重组蛋白结合。

在一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

本发明的第三方面，提供了一种检测试剂盒，它含有本发明的EV71特异性重组蛋白、抗本发明重组蛋白的抗体、或其组合。

本发明的第四方面，提供了一种本发明的EV71特异性重组蛋白用于制备体外检测样品中是否存在抗EV71病毒抗体的试剂盒的用途。

在一优选例中，所述样品为血清或血浆。

本发明的第五方面，提供了一种抗本发明重组蛋白的抗体用于制备体外检测样品中是否存在EV71病毒的试剂盒的用途。

在一优选例中，所述抗体为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述样品为血清、血浆或病毒培养上清。

附图说明

图1本发明的重组蛋白的电泳图。图中箭头所示为目标蛋白，分子量marker从下往上分别是：14.4、18.4、25、35、45、66.2、116kDa

图2本发明的试剂盒对EV71病毒的特异性检测

图3本发明的试剂盒对Vp1的灵敏度检测

图4本发明的试剂盒对EV71病毒的定量检测

图5试剂盒抗体组合配对的灵敏度和线性范围选择实验

具体实施方式

本发明人基于自身多年对全国不同疫区的EV71病毒的研究，结合最近与以往的文献资料，对不同EV71毒株的基因和蛋白序列进行了分析，确定所需表达的基因序列，然后采用不同的表达系统表达选定的基因序列并纯化重组蛋白(即潜在抗原靶位)，再由这些重组蛋白免疫获得抗体，研制出一种通过检测EV71病毒或抗EV71病毒抗体，进行临床早期EV71诊断的酶联免疫方法和试剂盒。本发明可显著提高诊断效率，并且简便、准确率高。

已有的研究表明：病毒在人体内十天左右达到复制高峰，而EV71-IgM抗体在发病10-14天时出现并很快达到高峰，60天时约有1/3的患者仍可检测到IgM抗体，大部分患者中该抗体基本消失。IgG抗体亦可在10-14天时检测到，60天时达到高峰，90天时仍维持在高水平。所以采用抗体检测病原体可以在病人感染后最短时间内做出有效诊断：采用IgM检测可以在感染后一个星期左右做出诊断；而检测病人体内IgG则最不理想。

研究证实：EV71基因组编码的多聚蛋白(polyprotein)约含2,193个氨基酸，该多聚蛋白在合成的同时，不断被由其自身水解产生的蛋白酶所切割，进一步水解为P1、P2和P3三个前体蛋白。P1前体蛋白可降解为VP1、VP2、VP3和VP4四个病毒外壳蛋白，P2和P3前体蛋白编码7个非结构蛋白。VP1蛋白是EV71病毒主要的中和抗原决定簇，其编码基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，也是EV71基因分型和遗传进化分析的最重要目标。

因此，本发明人选择EV71的VP1蛋白作为抗原靶位的主要研究对象。在确定靶蛋白后，本发明人综合利用各种生物信息数据库及生物信息学软件对不同病毒株的VP1基因及其编码蛋白的结构和功能特性、抗原表位等进行分析，综合考虑氨基酸序列的亲水性(高亲水性)和多级结构(多为α-螺旋，β-折叠)，优先考察那些存在于膜表面部分，剔除包含在膜内的部分，进而从VP1蛋白的氨基酸序列中筛选出了以下多个潜在抗原位点(表1)。

如本文所用“本发明重组蛋白”或“EV71特异性重组蛋白”指氨基酸序列如表1所示的重组蛋白。

本发明重组蛋白可用本领域的常规方法进行表达和分离纯化。在本发明重组蛋白的表达过程中采用了不同的表达系统，以使制备的抗原具备更加天然的成分，以保证制备抗体的特异性。

本发明重组蛋白可以直接用于检测抗EV71的抗体，也可用于与BSA等分子量的蛋白偶联，从而形成蛋白偶联物。通常，所述的偶联物由多肽、交联剂、和BSA构成，其中所述的交联剂优选戊二醒(当与本发明多肽的N-端偶联时)、EDAC(当与本发明多肽的c-端偶联时)。

本发明的重组蛋白及其偶联物可用于免疫兔、鼠等动物，从而获得抗本发明重组蛋白的抗体(“本发明抗体”)。本发明抗体包括特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里“特异性”是指抗体能结合于EV71病毒、基因产物或片段。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段。(如Fab′或(Fab)₂片段)、抗体重链、抗体轻链、嵌合抗体、人源化抗体等。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明重组蛋白或偶联物，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.lmmunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

本发明的重组蛋白、偶联物和抗体都可用检测样品中是否存在EV71病毒或抗EV71病毒抗体，从而作为早期检测EV71的有效指标之一。

除了用于检测，本发明的EV71特异性重组蛋白还可在体内与病毒竞争受体，阻止病毒与膜融合，抑制病毒感染正常细胞。此外，本发明的重组蛋白和偶联物还可用于制各治疗性的药物组合物或预防性的疫苗组合物。

因此，另一方面，本发明还提供了一种组合物，它含有(a)安全有效量的本发明重组蛋白、偶联物或其组合物：以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。

本发明的组合物可通过常规方法进行制备。以本发明重组蛋白计，其用量例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的重组蛋白还可与其他治疗剂一起使用。

本发明的主要优点在于：

(a)因为本发明的EV71特异性重组蛋白、多肽偶联物与抗EV71病毒抗体的亲和力高，本发明抗体与EV71病毒的亲和力高，因此，本发明的检测方法灵敏、简便、准确率高。

(b)本发明的EV71特异性重组蛋白还可在体内与病毒竞争受体，阻止病毒与膜融合，抑制病毒感染正常细胞，所以本发明具有很高的临床应用价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

重组蛋白抗原的表达和纯化分离

将克隆的基因序列用pET28a载体进行表达，并按照GE的HisTrap^TM FF纯化程序进行纯化，目标蛋白的分子量约为35kDa。本发明表达、纯化和分离出的目标蛋白(图1)如表1所示。

表1：本发明重组蛋白的氨基酸序列

编号(位点)	氨基酸序列	SEQ ID NO
			VP1蛋白
VP1-1(11-18)	SIGDSVSK	1
			VP1-2(27-45)	PTGQNTQVSSHRLDTGKVP	2
VP1-3(53-61)	GASSNASDE	3
			VP1-4(99-106)	GTTNPNGY	4
VP1-5(158-170)	PGAPKPDSRDSLA	5
			VP1-6(211-222)	FGEHKQEKDLEY	6
VP1-7(250-246)	SSKSKYP	7
			VP1-8(262-271)	IPRPMRNQNYL	8
VP1-9(275-292)	SNPNYAGDSTKPTGTSRT	9

实施例2

重组蛋白抗原免疫动物制备抗体

用实施例1制备的重组蛋白免疫兔子，剂量根据兔子体重确定，首次抗原量为50ug/20g，与完全佐剂等体积混合；后续免疫的抗原量为25ug/20g，与不完全佐剂等体积混合；ELISA评价免疫效果，达到预期的抗体滴度后按50ug/20g的剂量静脉加强。

取脾脏分离脾细胞，与骨髓瘤细胞按一定的比例进行融合，随后进行筛选得到多株抗体。

实施例3

检测应用

(1)重组抗原检测病人血清样品

使用经过处理的实施例1制备的重组抗原包被，与病人血清混合反应，结果本发明的重组抗原可以识别病人血清中早期针对EV71的特异性抗体，并与之结合，洗涤后加入HRP酶连二抗反应：最后加入显色底物，进行检测。

结果表明，本发明的重组抗原可特异性地与抗EV71病毒的抗体结合。

(2)抗体(单抗与多抗)检测病原体

对于实施例2获得的抗体(多抗和单抗)，用ELISA法与病人血清反应，检测病人血液中的病毒结合，对病原体进行检测。

结果表明，本发明的多抗和单抗可特异性地与EV71病毒结合。

实施例4

病毒裂解反应验证抗体位点特异性

培养的EV71病毒离心去细胞碎片收集后，用含SDS的样品处理液煮沸裂解，对实施例2获得的抗体进行Western-blot验证其特异性。

实施例5

试剂盒抗体组的选择

根据抗体特异性的差异，得到12个合适的抗体。将这12个抗体通过ELISA进行两两配对的组合实验，得到A(1+5)、B(4+7)、C(5+9)和D(6+9)共4组有效的组合。

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													1	1.523
2		1.489
													3		1.521
4				1.497
													5	3.011			1.601
6						1.554
													7			2.998			1.567
8								1.467
													9				3.010	3.125		1.467
10										1.521
													11								1.545
12												1.510

这4组组合中分别进行包被和标记的组合，D组即抗体6与抗体9的灵敏度和线性范围的配合最优(图5)。

实施例6

本试剂盒的EV71特异性和灵敏度评价试验

操作步骤：

1、将浓缩洗涤液用蒸馏水做20倍稀释；

2、取出包被有抗EV71抗体(实施例5的D组抗体)的微孔板孔板，平衡至室温。设立阳性对照、阴性对照各2孔；加入待检样品，100ul/孔；

3、37℃恒温水浴箱避光孵育60分钟，用洗液洗涤4-5遍，拍干；

4、将标记抗体用加入各反应孔，100μl/孔；

5、37℃恒温水浴箱避光孵育45分钟；

6、用洗涤液洗涤4-5遍，拍干；

7、加入显色液A 50ul/孔，再加入显色液B 50ul/孔，轻柔震荡5秒将其混匀；

8、37℃恒温水浴箱避光孵育8～10分钟；

9、滴加终止液50/孔，轻柔震荡15秒混匀；

10、10分钟内用酶标仪于450nm波长下读数。

结果判定方法：

1、确定Cut off值。Cut off值＝2.1×N(N为阴性对照平均A值，如小于0.05按0.05计)；

2、阴性对照平均A值应小于0.2，否则实验不成立；

3、标本A值小于Cut off值为阴性，大于等于Cut off值为阳性。

结果显示：该检测试剂盒的特异性高，与HSV、腺病毒、RSV、麻疹病毒等多种病毒没有交叉。

特异性评价：组装的EV71病毒ELISA检测试剂盒用于检测肠道病毒以及其它病毒，结果表明该试剂盒的特异性很高(图2)。

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
										0.274	0.262	0.226	0.268	0.279	0.22	0.54	0.329	2.145	0.253
HSV-1	HSV-333	腺VII	RSV	麻疹	COXB3	ECHO	H1N1疫苗株	阳性对照	阴性对照

灵敏度评价：

Vp1的检测(图3)

检测的Vp1范围5ng～1000ng/ml。

病毒定量检测(原液TCID50＝10⁷/100ul)(图4)

培养的EV71病毒的滴度为10⁷/100ul，4倍稀释后作为检测的起始浓度进行倍比稀释后进行检测。

Claims

1.一种重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8或9。

2.一种抗体，其特征在于，所述抗体特异性地与权利要求1的重组蛋白结合。

3.权利要求3的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。

4.一种检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1的重组蛋白、权利要求2的抗体、或其组合。

5.权利要求1的重组蛋白用于制备体外检测样品中是否存在抗EV71病毒抗体的试剂盒。

6.权利要求5的用途，其特征在于，所述样品为血清或血浆

7.权利要求2的抗体用于制备体外检测样品中是否存在EV71病毒的试剂盒。

8.权利要求7的用途，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。

9.权利要求7的用途，其特征在于，所述样品为血清、血浆或病毒培养上清。