CN100467485C - Sars冠状病毒相关多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及SARS冠状病毒相关多肽及其应用。具体地，本发明使用人工合成的源自SARS病毒N蛋白的多肽作为抗原，以及该多肽免疫动物后产生的抗体(单抗、多抗)，结合酶联免疫和其他方法检测人血清样品中的早期抗SARS抗体IgM或IgG，或直接检测血清样品中SARS病原体。

Description

SARS冠状病毒相关多肽及其应用

技术领域

本发明涉及SARS冠状病毒相关多肽及其应用。具体地，本发明使用人工合成的源自SARS病毒核衣壳蛋白(N蛋白)的多肽，以及该多肽免疫动物后产生的抗体(单抗、多抗)，结合酶联免疫和其他方法检测人血清样品中的早期抗SARS抗体IgM或IgG，或直接检测血清样品中SARS病原体。

背景技术

非典型肺炎即严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的病原体最近已经确认，是一种冠状病毒。该病毒是一种正链RNA病毒，基因组为单链RNA，含有Poly(A)，总长接近30kb。病毒表面有约20nm左右的棒状结构，呈皇冠状。该病原体具有很强的感染性和传染性，病毒在患者体内经过早期复制过程后，在肺部引发大规模炎症反应，最终导致肺部组织损伤。由于临床缺少有效的治疗药物，所以现阶段将感染病人迅速隔离治疗是最有效的防治手段。

目前已经发展并使用的诊断方法包括：

1.RT-PCR检查病毒。能及时检查带毒者，当痊愈后，显阴性。但受到仪器设备的限制，易产生较多的假阴性和假阳性而导致漏诊或误诊。

2.通过临床症状综合评价诊断。这种方法在疾病的早期，因症状不明显，而无法准确的诊断。在疾病的晚期，虽然可以准确诊断，但延误了对疾病进行有效的治疗。

3.血清免疫检查病毒抗体(荧光免疫法或ELISA)。抗体产生需要在发病后至少14天，因此，这种方法不能做早期诊断。但是从免疫学角度来说，机体产生病原体特异性抗体IgM较早，选择合适的抗原与之结合也可以用作诊断参考。

目前正在使用的大多数是前三方法，这些方法在临床使用过程中，不能简便、快速、准确的判断与区分患者与疑似病例。

4.抗原检测(ELISA)。通过制备病原体特异性的抗体(单抗与多抗)检测病人血液或组织中病原体，该方法准确率高，操作简便，适合临床推广。但目前缺少病原体的特异性抗体。

因此，本领域迫切需要开发新的更加有效的早期诊断SARS的方法和试剂盒。

发明内容

本发明目的就是提供一种快速、简便、准确率高的SARS检测方法和试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种源自SARS病毒的多肽，其氨基酸序列为SEQID NO：1、2、或3。这些SARS特异性多肽可特异性地与抗SARS病毒的抗体结合。

在本发明的第二方面，提供了一种多肽偶联物，所述的偶联物由多肽、交联剂、和BSA构成，其中所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、2、或3，所述的交联剂选自戊二醛或EDAC。

在本发明的第三方面，提供了一种抗体，所述抗体特异性地与本发明的SARS特异性多肽结合。

在一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体。

在本发明的第四方面，提供了一种检测试剂盒，它含有本发明的SARS特异性多肽、多肽偶联物、抗本发明多肽的抗体、或其组合。

在本发明的第五方面，提供了一种体外检测样品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体的方法，包括步骤：

(a)将样品与选自下组的物质接触：本发明的SARS特异性多肽、多肽偶联物、抗本发明多肽的抗体、或其组合；

(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体。

在一优选例中，所述的样品为血清样品或痰液。

在另一优选例中，所述的物质是氨基酸序列为SEQ ID NO：1、2、或3的多肽。

在另一优选例中，所述的物质是单克隆抗体。

在另一优选例中，步骤(b)的检测方法是荧光检测法。

附图说明

图1显示了在SARS病毒感染后，IgG和IgM抗体的产生情况。

图2显示了对SARS病毒S蛋白的结构分析。

图3显示了纯化的重组N蛋白和GST对照蛋白的SDS-PAGE电泳图谱(12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。)。其中泳道1：低分子量蛋白标准物；泳道2：GST对照蛋白；泳道3：纯化后的重组N蛋白。

图4先生了肽段诱导产生的抗体与SARS冠状病毒N蛋白亲和力检测(Western印迹实验)结果。其中，泳道1，3，5：纯化后的重组N蛋白；泳道2，4，6：GST对照蛋白。泳道1，2以肽段N1免疫后兔血清为一抗；泳道3，4以肽段N2免疫后兔血清为一抗；泳道5，6以免疫前兔血清为一抗。蛋白经12％ SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜。封闭后，加入相应的兔抗血清(1/1000稀释)，以HRP标记的羊抗兔的IgG为二抗，ECL显色。

具体实施方式

本发明通过对SARS病毒潜在抗原蛋白的序列分析，找到了具有很强抗原性的氨基酸序列，通过合成多肽合成这些潜在抗原靶位，再由这些多肽免疫获得的抗体，研制出一种通过检测SARS病毒或抗SARS病毒抗体，进行临床早期SARS诊断的酶联免疫方法和试剂盒。本发明可显著提高诊断效率，并且简便、准确率高。

参见图1。已有的研究表明：病毒在人体内十天左右达到复制高峰，而SARS-IgM抗体在发病10～14天时出现并很快达到高峰，60天时约有1/3的患者仍可检测到IgM抗体，大部分患者中该抗体基本消失。IgG抗体亦可在10—14天时检测到，60天时达到高峰，90天时仍维持在高水平。所以采用抗体检测病原体可以在病人感染后最短时间内作出有效诊断；采用IgM检测可以在感染后一个星期左右作出诊断；而检测病人体内IgG则最不理想。

为了获得检测SARS病毒所需的相关抗原与抗体，本发明人通过对SARS病毒基因组的分析与比对，结合最近与以往文献资料，对SARS的潜在抗原蛋白进行分析。

通过与冠状病毒的分析与比对，本发明人发现，冠状病毒通过与细胞表面受体结合，随即与细胞膜发生融合，病毒粒子进入细胞。病毒的生活周期完全在细胞质中进行，不需细胞核参与。SARS病毒本身编码两大类蛋白质，结构蛋白和非结构蛋白：

(a)结构蛋白主要包括结合在病毒膜表面的S(棒状结构的主要构成成分)，M蛋白，以及与RNA结合构成螺旋状核衣壳样结构的N蛋白。

(b)非结构蛋白则是病毒RNA复制密切相关的聚合酶。

在病毒表达的众多蛋白之中，S、M蛋白构成了病毒最外层的结构，S蛋白是一种十分重要的结构蛋白，众多的冠状病毒在这一部分差异很大，这可能和它针对不同的靶细胞有关。

参见图2。S蛋白分为S1，S2两部分，其中通过序列分析表明，S1区包括：1-668；S2区：669-1162。S1蛋白它主要与靶细胞受体结合有关；S2蛋白则介导病毒与细胞的融合。由于S蛋白对于病毒感染的重要性，因此很可能在其中筛选出能够用于治疗的中和性抗体；而且已知的冠状病毒中和性抗体都是作用于S蛋白区。

因此，本发明选择SARS的Spike蛋白(S蛋白)作为抗原靶位的主要研究对象，同时考虑到M，N蛋白也有潜在的抗原性，适当的选择部分抗原决定表位，从临床的角度来说，这些部位产生的抗体对于疾病的早期诊断可能有些意义。

确定靶蛋白后，本发明使用多种抗原性分析软件和网站对蛋白完整序列，综合考虑氨基酸序列的亲水性(高亲水性)和多级结构(多为α-螺旋，β-折叠)，优先考察那些存在于膜表面部分，剔除包含在膜内的部分，这样从N蛋白序列中挑选了部分多肽序列(表1)。检测到N蛋白就表明病毒处于复制期。

如本文所用，“本发明多肽”或“SARS特异性多肽”指氨基酸序列如表1所示的多肽。

本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

本发明多肽可以直接用于检测抗SARS的抗体，也可用于与BSA等分子量的蛋白偶联，从而形成多肽偶联物。通常，所述的偶联物由多肽、交联剂、和BSA构成，其中所述的交联剂优选戊二醛(当与本发明多肽的N-端偶联时)、EDAC(当与本发明多肽的C-端偶联时)。

本发明的偶联物可用于免疫兔、鼠等动物，从而获得抗本发明多肽的抗体(“本发明抗体”)。本发明抗体包括特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于SARS病毒、基因产物或片段。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段(如Fab′或(Fab)₂片段)、抗体重链、抗体轻链、嵌合抗体、人源化抗体等。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明多肽或偶联物，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

本发明的多肽、偶联物和抗体都可用检测样品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体，从而作为早期检测SARS的有效指标之一。

除了用于检测，本发明的SARS特异性多肽还可在体内与病毒竞争受体，阻止病毒与膜融合，抑制病毒感染正常细胞。此外，本发明的多肽和偶联物还可用于制备治疗性的药物组合物或预防性的疫苗组合物。

因此，另一方面，本发明还提供了一种组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽、偶联物或其组合物；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。本发明的组合物可通过常规方法进行制备。以本发明多肽计，其用量例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

本发明的主要优点在于：

(a)因为本发明的SARS特异性多肽、多肽偶联物与抗SARS病毒抗体的亲和力高，本发明抗体与SARS病毒的亲和力高，因此，本发明的检测方法灵敏、简便、准确率高。

(b)本发明的SARS特异性多肽还可在体内与病毒竞争受体，阻止病毒与膜融合，抑制病毒感染正常细胞，所以本发明具有很高的临床应用价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

多肽的人工合成

按表1所示的氨基酸序列，在多肽合成仪上用合成多肽。合成后经质谱法验证，证明合成的多肽与设计相符。

表1：本发明多肽的氨基酸序列

 

编号：	序列	SEQ ID NO：
			N蛋白
N1-(21-44)	PTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQ	1
			N2-(138-160)	GALNTPKDHIGTRNPNNNAATVL	2
N3-(365-388)	PPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQK	3

实施例2

抗原多肽的与载体的连接(偶联物的制备)

对于实施例1合成的各多肽，先用PBS溶解(对某些不溶的多肽，可以先用半量PBS溶解，若不溶则用1M NaOH调节PH使之全溶)，取0.5ml多肽(浓度分别为0.5mg/ml、1mg/ml)与15mg BSA(1.5ml)混匀，然后加入交联剂(针对交联方向的不同，选择不同的交联剂，N-端交联加入戊二醛，C-端加入EDAC)，混合后于室温反应5小时，避光不断摇晃；交联结束后，放入透析袋中，对PBS 4℃透析过夜；量体积，以BSA计算浓度，于-20℃保存备用。

实施例3

抗原多肽免疫动物制备抗体：

取实施例2制备的偶联物约0.5ml(偶联物含量分别为0.1mg、0.5mg)，加入PBS 1.5ml后与CFA(完全弗氏佐剂)混合，在三通管中反复推打，直至感觉费力，放置3-5分钟后，无两相分离即可。

将经过佐剂乳化处理的抗原免疫兔子和小鼠；每只兔子注射抗原3ml左右，小鼠则注射0.8ml/只。分别皮下注射动物两足垫、颈部、背部多点注射(每点0.2ml)。

初次免疫三周后，取同样剂量多肽抗原、PBS，混合2ml IFA(不完全弗氏佐剂)，乳化后对动物进行加强免疫，注射剂量不变。

三周后对动物取血，收集抗血清。使用BSA包被的层析柱，清除针对BSA的抗体。

挑选抗体滴度较高的抗原多肽，制备单克隆抗体。

实施例4

检测应用

(1)抗原多肽检测病人血清样品：

使用经过处理的实施例1制备的抗原多肽包被，与病人血清混合反应，结果本发明的抗原肽段可以识别病人血清中早期针对SARS的特异性抗体，并与之结合，洗涤后加入HRP酶连二抗反应；最后加入显色底物，进行检测。

结果表明，本发明的多肽可特异性地与抗SARS病毒的抗体结合。

(2)抗体(单抗与多抗)检测病原体：

对于实施例3获得的获得的抗体(多抗和单抗)，用ELISA法与病人血清反应，检测病人组织液、血液中的病毒结合，对病原体进行检测。

结果表明，本发明的多抗和单抗可特异性地与SARS病毒结合。

实施例5

免疫印迹实验

在本实施例中，所用抗体分别为免疫前血清，N1-抗血清、N2-抗血清和N3-抗血清(免疫兔后的血清中抗体，未纯化)。

免疫印迹实验流程如下：

1.SDS-PAGE：

样品：SARS病毒感染的细胞裂解液

上样量：100ul

上层胶3.5％，下层胶7％，上层胶100V 1小时，下层胶200V 15小时

2.转膜：

电流：1.0mA/cm2，2小时

3.封闭：

5％脱脂奶粉封闭6小时

4.杂交

一抗，1：100稀释在TBS-Tween中，4度杂交过夜

二抗(goat-anti-rabbit-HRP，购自Santa Cruze公司)：1：4000稀释，杂交1小时

显色：ECL-Plus(购自Amersham公司)

结果表明，抗N1、N2和N3抗体特异性地与SARS病毒的N蛋白结合。

实施例6

酶联免疫吸附实验(ELISA)：

用BSA-N1、BSA-N2交联产物包被96孔板，4℃过夜。封闭液(3％Gelatin，0.1％吐温20溶于PBS)封闭后，加入倍比稀释的免疫后兔血清，37℃孵育2小时，洗涤后加入HRP标记的羊抗兔的IgG，37℃孵育1小时，充分洗涤后加入底物显色并测定450nm处光吸收值。采集9例临床诊断SARS病人及4例正常人血清，以病毒裂解液为抗原通过ELISA和免疫荧光分析的方法确定其IgG阳性。抗血清对合成的肽段(N1、N2)的反应性通过ELISA方法检测。大致过程同上。血清稀释度为1：10，HRP标记的羊抗人的IgG作为二抗。所有用到病人血清的实验均在三级生物安全实验室操作。

结果：

如表2

表2  ELISA法测定肽段N1、N2免疫后兔血清中抗体滴度

实施例7

肽段N1能与SARS病人血清中的IgG结合

既然肽段N1是SARS冠状病毒N蛋白的一个很好的表位，那么它能否与SARS病人血清中的IgG结合呢？为了回答这个问题，在本实施例中，采集9例临床诊断SARS病人及4例正常人血清，用肽段N1、N2作为抗原进行筛选。

结果发现33％SARS病人对肽段N1呈阳性反应而所有血清对肽段N2呈阴性反应。同时，4例正常人血清对两者都呈阴性(表3)。

表3  ELISA法测定SARS病人及正常人血清中针对肽段N1、N2特异性的抗体检测

 

包被抗原	正常人序号1 2 3 4	SARS病人序号(临床诊断)1 2 3 4 5 6 7 8 9
			N1-BSA	- - - -	+ - - + - + - - -
N2-BSA	- - - -	- - - - - - - - -

血清稀释度：1：10

+：阳性-：阴性

实施例8

SARS冠状病毒N蛋白原核表达及纯化：

在本实施例中，将SARS冠状病毒N蛋白的全长基因克隆(Genbank登录号NC_004718)至原核表达载体pQE30中(Qi agen公司)的多克隆位点。将重组质粒转化大肠杆菌M15诱导表达蛋白。挑单克隆在相应的抗性培养液中培养过夜后，以1：10比例接种至相同抗性的培养液中振荡培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L诱导表达蛋白。重组的N蛋白按照操作手册经Ni-NTA亲和层析纯化后，SDS-PAGE检测。

Western印迹：

纯化后的N蛋白经12％ SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜。用封闭液(3％Gelatin)封闭后，加入免疫后兔抗血清(1/1000稀释)，37℃孵育1小时，洗涤后加入HRP标记的羊抗兔的IgG(H+L)，37℃孵育1小时，充分洗涤后ECL显色。

结果

肽段N1诱导产生的抗体对原核表达的SARS冠状病毒N蛋白有较高亲和力

为了验证肽段N1、N2诱导产生的抗体是否能与SARS冠状病毒N蛋白结合，本实施例中用原核系统表达了全长的N蛋白(422氨基酸)，通过Western印迹的方法来验证其亲和力的强弱。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，结果显示在47kD处有一条清晰的蛋白条带(图3)。

Western印迹结果(图4)显示肽段N1免疫后兔血清对原核表达的SARS冠状病毒N蛋白有较高亲和力，而N2较弱。而对照GST(无关蛋白)及正常兔血清均无反应。这些数据再次表明：肽段N1是SARS冠状病毒N蛋白的一个很好的表位且其诱导产生的抗体能够与表达的N蛋白结合。

讨论

本发明首次证明了SARS冠状病毒N蛋白的表位(如N1等)有助于进一步研究N蛋白的功能。

首先，通过计算机软件分析从SARS冠状病毒N蛋白中选出两个肽段N1、N2。理论上，基于其抗原性指数两者均有较好的抗原性。从免疫后兔抗血清中抗体的滴度分析来看，两者类似。

其次，本发明合成的肽段是否能够模拟天然状态的N蛋白是肽段应用的一个关键。实验结果显示肽段N1诱导产生的抗体对原核表达的SARS冠状病毒N蛋白有较高亲和力，提示肽段N1是SARS冠状病毒N蛋白的一个很好的表位。而且肽段N1诱导产生的抗体将有助于对N蛋白的研究。另外，仅用合成的肽段可以诱导产生高滴度的抗体且此抗体能与天然状态的蛋白结合。

为了进一步证实两个肽段诱导产生的抗体与表达蛋白的结合是否真实的反映了它们在体内的免疫原性的异同，本发明人通过ELISA的方法来检测了两种肽段与SARS病人血清的反应性。结果表明肽段N1是一个能在SARS病人体内诱导产生抗体的很好的抗原表位。尽管只有33％的病人呈阳性，但是可以解释的。因为用完整的N蛋白作为抗原来检测也只有40％的临床诊断SARS病人呈阳性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>SARS冠状病毒相关多肽及其应用

<130>033332

<150>CN 03128831.6

<151>2003-05-26

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>24

<212>PRT

<213>非典病毒(SARS virus)

<400>1

<210>2

<211>23

<212>PRT

<213>非典病毒(SARS virus)

<400>2

<210>3

<211>24

<212>PRT

<213>非典病毒(SARS virus)

<400>3

Claims (9)

1.一种多肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种多肽偶联物，其特征在于，所述的偶联物由多肽、交联剂、和BSA构成，其中所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述的交联剂选自戊二醛或EDAC。

3.一种抗体，其特征在于，所述的抗体特异性地与权利要求1所述的多肽结合。

4.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述的抗体是单克隆抗体。

5.一种检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的多肽偶联物、权利要求3所述的抗体、或其组合。

6.一种物质的用途，所述的物质是权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的多肽偶联物、或权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述物质用于制备体外检测样品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗体的试剂盒。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的样品为血清或痰液。

8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的物质是氨基酸序列为SEQID NO:1的多肽。

9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的物质是权利要求3所述的抗体，且所述抗体是单克隆抗体。

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