CN103483447B - 抗hpv l1蛋白的广谱单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可广谱结合人乳头瘤病毒(HPV)L1蛋白的单克隆抗体及其抗原结合片段，以及编码它们的序列，产生它们的细胞株，和应用它们进行诊断、预防或治疗的方法和用途。

Description

抗HPV L1蛋白的广谱单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途

技术领域

本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体而言，本发明涉及可广谱结合人乳头瘤病毒(HPV)L1蛋白的单克隆抗体及其抗原结合片段，以及编码它们的序列，产生它们的细胞株，和应用它们进行诊断、预防或治疗的方法和用途。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV)是一种无包膜病毒,它由病毒衣壳以及包裹在衣壳内的约8kbDNA构成。HPV的病毒衣壳是由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成的直径为50-55nm的正二十面体颗粒。目前已经发现了100多种型别的HPV，其中，根据其与肿瘤发生的关系可以分为两类：低危型HPV――包括HPV6和HPV11，其致癌风险低，主要引起尖锐湿疣；高危型HPV――包括HPV16、18、31、33、35、39、45、52、58、59等，其是导致包括女性宫颈癌在内的多种肿瘤疾病的主要原因(CliffordGM，SmithJS，PlummerM，eta1.BrJCancer，2003，88(1)：63-73)。现有的研究结果表明，可以通过预防HPV感染来预防宫颈癌等疾病的发生。

HPV的疫苗研究发现，体外表达的HPVL1蛋白能自组装成病毒样颗粒(VLP)，其结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体。因此，现有的以及正在研发的HPV疫苗多以病毒样颗粒为主要疫苗成分。然而，研究发现，HPVVLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，而仅在一些同源性高的型别之间存在交叉保护(GiroglouT,SappM,FliggeC,etal.Vaccine.2001；19(13-14):1783-93；OrozcoJJ,CarterJJ,KoutskyLA.JVirol[J].2005；79(15):9503-14；FleuryMJ，TouzeA，MaurelMC,etal.ProteinSci.2009.18(7):1425-1438)。

在疫苗研究中，单克隆抗体是疫苗抗原质控的重要工具，抗体水平是评价疫苗效果的标准，而且，抗体及其表位(尤其是中和抗体对应的中和表位)以及相应的中和机制也是疫苗研发的重要指针。进一步，在应用研究中，中和抗体，特别是广谱中和抗体，在HPV的诊断，预防和治疗上也将具有特别的优势。然而，现有研究表明，HPVL1蛋白所诱导的抗体大多为型别特异性中和抗体，极少有跨型别的广谱中和抗体的报道。目前，已发现的跨型别的抗体仅有HPV16J4、HPV16I23和HPV33E12这3株交叉中和单抗，它们能对几个型别的HPV具有一定程度的交叉中和作用。但是，这三株单抗的中和滴度较低，比特异性的中和单抗(如：中和抗体V5，参见Wang等，JournalofGeneralirology，78：2209－2215(1997))小100倍以上，这大大限制了这些单抗的应用。

因此，本领域仍然需要更多、更有效的广谱抗体，尤其是广谱中和抗体，以能够对生产的疫苗及疫苗的保护效果进行更好的评价，并应用于HPV的诊断、预防和治疗中。

发明内容

本发明提供了可广谱结合HPVL1蛋白的单克隆抗体及其抗原结合片段，以及编码它们的序列，产生它们的细胞株，和应用它们进行诊断、预防或治疗的方法和用途。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“HPVL1蛋白”是指，人乳头瘤病毒(HPV)的L1蛋白，其是本领域公知的(参见，例如NCBIGENBANK数据库序列号：DQ469930.1)。在本申请中，当提及HPV的L1蛋白或VLP时，其主要涉及选自以下11种型别的HPV的L1蛋白或VLP：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59。然而，本领域技术人员理解，术语“HPVL1蛋白”还可以包括其他型别的HPV的L1蛋白。

在本申请中，为了方便起见，当描述HPVL1蛋白的氨基酸序列时，除非上下文特别指出，否则，参照HPV16L1蛋白的氨基酸序列进行描述。例如，表述“HPVL1蛋白的第303-308位氨基酸残基”是指，HPV16L1蛋白的第303-308位氨基酸残基。然而，如本文中所使用的，术语“HPVL1蛋白”意欲包括所有型别的HPV(特别是上述11种型别)的L1蛋白。因此，表述“HPVL1蛋白的第303-308位氨基酸残基”不仅包括HPV16L1蛋白的第303-308位氨基酸残基，而且包括其他型别的HPVL1蛋白中的相应序列片段。

如本文中所使用的，当提及HPV16L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQIDNO:59的氨基酸序列来进行描述。例如，表述“HPV16L1蛋白的第303-308位氨基酸残基”是指，SEQIDNO:59所示氨基酸序列的第303-308位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HPV16L1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HPV16L1蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQIDNO:59所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HPV16L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQIDNO:59的序列片段，还包括SEQIDNO:59的天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HPV16L1蛋白的第303-308位氨基酸残基”包括，SEQIDNO:59的第303-308位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(V_H)和重链恒定区(C_H)组成。重链恒定区由3个结构域(C_H1、C_H2和C_H3)组成。各轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。V_H和V_L区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各V_H和V_L由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(V_H和V_L)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987and1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，RavenPress,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由V_H和C_H1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由V_H结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature341:544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')₂片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中V_L和V_H结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-V_L-接头-V_H-COOH或NH₂-V_H-接头-V_L-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)₄的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，ProteinEng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，CancerRes.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，CancerImmunol.描述。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中V_H和V_L结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,HolligerP.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)，和PoljakR.J.等人,Structure2:1121-1123(1994))。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体4B3、13A10、12B9或4H4)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P4,816,567)。

如本文中所使用的，以编号提及的单克隆抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同。例如，单克隆抗体4B3(或13A10、12B9或4H4)分别是与从杂交瘤细胞株4B3(或13A10、12B9或4H4)或其亚克隆或后代细胞获得的抗体相同的抗体。

如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567toCabillyetal.；Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。

如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jonesetal.,Nature,321:522525(1986)；Reichmannetal.,Nature,332:323329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593596(1992)；和Clark,Immunol.Today21:397402(2000)。

如本文中所使用的，“中和抗体”是指，能清除或显著降低目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)的抗体或抗体片段。

如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。

如本文中所使用的，术语“表位肽”是指，抗原上能够用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。在另一些情况下，可能需要将表位肽与载体蛋白融合，以便表位肽能够被特异性抗体识别。如本文中所使用的，术语“载体蛋白”是指这样的蛋白，其可以充当表位肽的载体，即，其可以在特定位置处插入表位肽，以便该表位肽能够呈现出来，从而该表位肽能够被抗体或免疫系统识别。此类载体蛋白是本领域技术人员熟知的，包括例如，HPVL1蛋白(可以将表位肽插入在所述蛋白的第127-128位氨基酸之间，或在第423-424位氨基酸之间，参见例如，VarsaniA,Chimerichumanpapillomavirustype16(HPV-16)L1particlespresentingthecommonneutralizingepitopefortheL2minorcapsidproteinofHPV-6andHPV-16.JVirol.2003Aug；77(15):8386-93)，HBV核心抗原(可以用表位肽替换所述蛋白的第79-81位氨基酸，参见Schodel,F.ThepositionofheterologousepitopesinsertedinhepatitisBviruscoreparticlesdeterminestheirimmunogenicity.JVirol,1992,66:106-114)，和CRM197蛋白(可以将表位肽连接至该蛋白或其片段的N末端或C末端)。

在本发明中，CRM197(Cross-ReactingMaterials197)是指，白喉毒素(DT)的一种无毒突变体(Uchida，T.，A.M,Pappenheimer，Jr.，R.Gregory，etal.,J.Biol.Chem.1973.248:3838-3844)，其与编码DT的野生型基因相比存在单个核苷酸突变，导致第52位的氨基酸残基由Gly变为Glu(G.Giannini，R.Rappuoli，G.Rattietal.,NucleicAcidsResearch.1984.12：4063-4070)。

可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原(例如，HPVL1蛋白)的结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本发明的单克隆抗体(例如，单克隆抗体4B3、13A10、12B9或4H4)竞争结合L1蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合片段(即，抗原结合部分)。

如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

如本文中所使用的，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698,ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

如本文中使用的，术语“免疫原性(immunogenicity)”是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质，一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素：抗原的性质、宿主的反应性和免疫方式。

如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。

如本文中所使用的，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的单克隆抗体4B3、13A10、12B9或4H4)以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解离平衡常数(K_D)结合抗原(例如，L1蛋白)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。

如本文中所使用的，表述“抗HPVL1蛋白的广谱单克隆抗体”和“广谱结合HPVL1蛋白的单克隆抗体”是指，单克隆抗体能够特异性识别/结合多种型别(例如，至少4种，例如至少5种，至少6种，至少7种，至少8种，至少9种，至少10种，或11种型别)的HPV的L1蛋白。由于体外表达的HPVL1蛋白能自组装成病毒样颗粒(VLP)，因此，表述“抗HPVL1蛋白的广谱单克隆抗体”和“广谱结合HPVL1蛋白的单克隆抗体”还指，单克隆抗体能够特异性识别/结合多种型别(例如，至少4种，例如至少5种，至少6种，至少7种，至少8种，至少9种，至少10种，或11种型别)的HPV的VLP。例如，本发明的单克隆抗体4B3、13A10、12B9或4H4能够特异性识别/结合至少5种型别的HPV的L1蛋白和VLP。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤细胞株4B3时，其还指杂交瘤细胞株4B3的亚克隆和后代细胞。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences.EditedbyGennaroAR,19thed.Pennsylvania:MackPublishingCompany,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。

如本文中所使用的，术语“HPVVLP”是指，由体外表达的HPVL1蛋白自组装形成的病毒样颗粒。

如本文中所使用的，术语“HPV假病毒”是指，利用HPVVLP可非特异性包装核酸的特性,通过在细胞内表达HPV的L1和L2蛋白，且包裹细胞内的游离体病毒DNA或外源导入的报告质粒，而形成的HPV假病毒(Yeager,M.D,Aste-Amezaga,M.etal(2000)Virology(278)570－7)。用于形成假病毒的方法包括例如，重组病毒表达系统法及多质粒共转染方法。本发明中所指的HPV假病毒主要包括11个型别的HPV假病毒，分别是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58、HPV59假病毒。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如HPV感染或与HPV感染相关的疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HPV感染或与HPV感染相关的疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

在一个方面，本发明提供了能够特异性结合多个型别(例如至少4个型别)的HPV的L1蛋白和/或VLP的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，

所述的单克隆抗体包括选自下列的重链可变区(VH)：

(1)包含氨基酸序列为SEQIDNO:17-19的CDR的VH；

(2)包含氨基酸序列为SEQIDNO:23-25的CDR的VH；

(3)包含氨基酸序列为SEQIDNO:29-31的CDR的VH；和

(4)包含氨基酸序列为SEQIDNO:35-37的CDR的VH，

和/或

所述的单克隆抗体包括选自下列的轻链可变区(VL)：

(1)包含氨基酸序列为SEQIDNO:20-22的CDR的VL；

(2)包含氨基酸序列为SEQIDNO:26-28的CDR的VL；

(3)包含氨基酸序列为SEQIDNO:32-34的CDR的VL；和

(4)包含氨基酸序列为SEQIDNO:38-40的CDR的VL。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括选自下列的重链可变区(VH)：

(1)如SEQIDNO:2所示的VH；

(2)如SEQIDNO:6所示的VH；

(3)如SEQIDNO:10所示的VH；和

(4)如SEQIDNO:14所示的VH。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括选自下列的轻链可变区(VL)：

(1)如SEQIDNO:4所示的VL；

(2)如SEQIDNO:8所示的VL；

(3)如SEQIDNO:12所示的VL；和

(4)如SEQIDNO:16所示的VL。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括：

(1)包含氨基酸序列为SEQIDNO:17-19的CDR的VH，和包含氨基酸序列为SEQIDNO:20-22的CDR的VL；

(2)包含氨基酸序列为SEQIDNO:23-25的CDR的VH，和包含氨基酸序列为SEQIDNO:26-28的CDR的VL；

(3)包含氨基酸序列为SEQIDNO:29-31的CDR的VH，和包含氨基酸序列为SEQIDNO:32-34的CDR的VL；或者

(4)包含氨基酸序列为SEQIDNO:35-37的CDR的VH，和包含氨基酸序列为SEQIDNO:38-40的CDR的VL。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括：

(1)如SEQIDNO:2所示的VH，和如SEQIDNO:4所示的VL；

(2)如SEQIDNO:6所示的VH，和如SEQIDNO:8所示的VL；

(3)如SEQIDNO:10所示的VH，和如SEQIDNO:12所示的VL；或者

(4)如SEQIDNO:14所示的VH，和如SEQIDNO:16所示的VL。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株4B3、13A10、12B9或4H4产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株4B3、13A10、12B9和4H4均保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且分别具有保藏号CCTCC－C201264，CCTCC－C201267，CCTCC－C201266和CCTCC－C201265。

在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的K_D结合HPV的L1蛋白或VLP。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体能够特异性结合选自下列的至少5种型别(例如，至少6种，至少7种，至少8种，至少9种，至少10种，或11种)的HPV的L1蛋白和VLP：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59。在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体能够特异性结合至少HPV16、HPV31、HPV33、HPV35和HPV52的L1蛋白和VLP。

例如，本发明的单克隆抗体4B3能够特异性结合所述11种型别的HPV的L1蛋白和VLP；本发明的单克隆抗体13A10能够特异性结合6种型别的HPV(HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52和HPV58)的L1蛋白和VLP；本发明的单克隆抗体4H4能够特异性结合5种型别的HPV(HPV16、HPV31、HPV33、HPV35和HPV52)的L1蛋白和VLP；本发明的单克隆抗体12B9能够特异性结合6种型别的HPV(HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52和HPV58)的L1蛋白和VLP。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体是中和抗体，其能够中和至少2个型别的HPV，例如选自HPV16、31、33和58中的至少2个型别，至少3个型别，或4个型别。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体能够中和HPV16、31、33和58四个型别的HPV，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:23-25的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:26-28的CDR的VL。优选地，此类单克隆抗体包括，如SEQIDNO:6所示的VH和/或如SEQIDNO:8所示的VL。更优选地，此类单克隆抗体是单抗13A10。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体能够中和HPV33和58两个型别的HPV，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:29-31的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:32-34的CDR的VL。优选地，此类单克隆抗体包括，如SEQIDNO:10所示的VH和/或如SEQIDNO:12所示的VL。更优选地，此类单克隆抗体是单抗12B9。

在一个优选的实施方案中，所述的单克隆抗体能够中和HPV16、31和33三个型别的HPV，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:35-37的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:38-40的CDR的VL。优选地，此类单克隆抗体包括，如SEQIDNO:14所示的VH和/或如SEQIDNO:16所示的VL。更优选地，此类单克隆抗体是单抗4H4。

在另一个方面，本发明提供了能够特异性结合多个型别(例如至少4个型别)的HPV的L1蛋白和/或VLP的单克隆抗体或其抗原结合片段，其能够阻断所述L1蛋白和/或VLP与选自下列的单克隆抗体的结合的至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％或优选至少99％：

(1)由杂交瘤细胞株4B3产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株4B3保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201264；

(2)由杂交瘤细胞株13A10产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株13A10保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201267；

(3)由杂交瘤细胞株12B9产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株12B9保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201266；和

(4)由杂交瘤细胞株4H4产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株4H4保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201265。

此类单抗所识别的表位与单抗4B3、13A10、12B9或4H4识别的表位相同，或者在空间上存在重叠，从而此类单抗能够降低单抗4B3、13A10、12B9或4H4与HPV的L1蛋白(或VLP)的结合至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％或优选至少99％。

可以采用常规方法如Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中描述的方法，测定某一待测单抗降低某一已知单抗结合HPVVLP的能力。一个示例性的方法包括：先把抗原预包被在微孔板上，然后把系列稀释的未标记的待测抗体以及特定浓度的经标记的已知单抗共同加入上述预包被后的微孔板中进行孵育，然后在洗涤后测定在不同稀释度的待测抗体下，已知抗体结合到板上的数量。待测抗体竞争已知抗体结合抗原的能力越强，已知抗体结合抗原的能力就越弱，结合到板上的已知抗体就越少。通常，将抗原预包被在96孔微孔板上，并利用放射标记法或酶标记法测定待测单抗阻断经标记的已知单抗的能力。

可以采用Kohler等在Nature256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备单抗。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。将免疫原预先偶联到某些已知蛋白(如血清白蛋白)上，可能会有助于增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以利用弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内会产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂(如PEG)将其与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103,AcademicPress,1996)。

将上述制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中进行生长，所述培养基中含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养基中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养基敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21和MC-11小鼠肿瘤衍生株(THESalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.USA)，以及SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株(AmericanTypeCμltureCollection,Rockville,Md.USA)。另外，还可以利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeuretal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)。

杂交瘤细胞生长的培养基用于检测针对特异抗原的单抗的产生。可以使用下列方法来测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性：免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)中描述的Scatchard分析法可测定单抗的亲和力。

在确定杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103,AcademicPress,1996描述的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养基可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。

利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。

还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。将所得的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞(如E.coli细胞、COS细胞、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，并在合适的条件下进行培养，可以获得重组表达的目标抗体。

本发明还提供了分离的核酸分子，其编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。此类核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到，也可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。

在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，其中所述抗体重链可变区包含：

(1)氨基酸序列为SEQIDNO:17-19的CDR；

(2)氨基酸序列为SEQIDNO:23-25的CDR；

(3)氨基酸序列为SEQIDNO:29-31的CDR；或

(4)氨基酸序列为SEQIDNO:35-37的CDR。

在一个优选的实施方案中，所述抗体重链可变区具有SEQIDNO:2，SEQIDNO:6，SEQIDNO:10或SEQIDNO:14所示的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述核酸分子具有SEQIDNO:1，SEQIDNO:5，SEQIDNO:9或SEQIDNO:13所示的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，其中所述抗体轻链可变区包含：

(1)氨基酸序列为SEQIDNO:20-22的CDR；

(2)氨基酸序列为SEQIDNO:26-28的CDR；

(3)氨基酸序列为SEQIDNO:32-34的CDR；和

(4)氨基酸序列为SEQIDNO:38-40的CDR。

在一个优选的实施方案中，所述抗体轻链可变区具有SEQIDNO:4，SEQIDNO:8，SEQIDNO:12或SEQIDNO:16所示的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，所述核酸分子具有SEQIDNO:3，SEQIDNO:7，SEQIDNO:11或SEQIDNO:15所示的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。

在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。

在另一个方面，还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。

在另一个方面，还提供了制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，本发明提供了选自下列的杂交瘤细胞株：

(1)杂交瘤细胞株4B3，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201264；

(2)杂交瘤细胞株13A10，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201267；

(3)杂交瘤细胞株12B9，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201266；和

(4)杂交瘤细胞株4H4，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201265。

如本申请所证实的，单克隆抗体4B3的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示(其示例性核苷酸序列如SEQIDNO:1所示)，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示(其示例性核苷酸序列如SEQIDNO:3所示)。

单克隆抗体4B3重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQIDNO:17-19；轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQIDNO:20-22。

如本申请所证实的，单克隆抗体13A10的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示(其示例性核苷酸序列如SEQIDNO:5所示)，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示(其示例性核苷酸序列如SEQIDNO:7所示)。

单克隆抗体13A10重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQIDNO:23-25；轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQIDNO:26-28。

如本申请所证实的，单克隆抗体12B9的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示(其示例性核苷酸序列如SEQIDNO:9所示)，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示(其示例性核苷酸序列如SEQIDNO:11所示)。

单克隆抗体12B9重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQIDNO:29-31；轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQIDNos:32-34。

如本申请所证实的，单克隆抗体4H4的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:14所示(其示例性核苷酸序列如SEQIDNO:13所示)，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示(其示例性核苷酸序列如SEQIDNO:15所示)。

单克隆抗体4H4重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQIDNO:35-37；轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQIDNO:38-40。

在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记时本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。

在另一个方面，本发明提供了检测HPVL1蛋白或VLP在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。

在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了HPV的方法，其包括：使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段检测HPVL1蛋白在来自所述受试者的样品中的存在。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测HPVL1蛋白或VLP在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了HPV。

在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体是这样的抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:17-19的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:20-22的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:2所示的VH和/或如SEQIDNO:4所示的VL；更优选地，其是单抗4B3，且所述HPV选自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59。

在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体是这样的抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:23-25的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:26-28的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:6所示的VH和/或如SEQIDNO:8所示的VL；更优选地，其是单抗13A10，且所述HPV选自HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52和HPV58。

在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体是这样的抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:29-31的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:32-34的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:10所示的VH和/或如SEQIDNO:12所示的VL；更优选地，其是单抗12B9，且所述HPV选自HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52和HPV58。

在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体是这样的抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:35-37的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:38-40的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:14所示的VH和/或如SEQIDNO:16所示的VL；更优选地，其是单抗4H4，且所述HPV选自HPV16、HPV31、HPV33、HPV35和HPV52。

在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体选自下列：

(1)单克隆抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:23-25的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:26-28的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:6所示的VH和/或如SEQIDNO:8所示的VL；更优选地，其是单抗13A10；

(2)单克隆抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:29-31的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:32-34的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:10所示的VH和/或如SEQIDNO:12所示的VL；更优选地，其是单抗12B9；或者

(3)单克隆抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:35-37的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:38-40的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:14所示的VH和/或如SEQIDNO:16所示的VL；更优选地，其是单抗4H4。

在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病(例如宫颈癌)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的本发明的药物组合物。

在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病(例如宫颈癌)。

在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体是这样的抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:23-25的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:26-28的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:6所示的VH和/或如SEQIDNO:8所示的VL；更优选地，其是单抗13A10；且，所述HPV选自HPV16、31、33和58。

在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体是这样的抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:29-31的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:32-34的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:10所示的VH和/或如SEQIDNO:12所示的VL；更优选地，其是单抗12B9；且，所述HPV选自HPV33和58。

在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体是这样的抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:35-37的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:38-40的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:14所示的VH和/或如SEQIDNO:16所示的VL；更优选地，其是单抗4H4；且，所述HPV选自HPV16、31和33。

在另一个方面，本发明提供了用于中和样品中HPV的毒力的方法，其包括，将包含HPV的样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触。此类方法可以用于治疗目的，或非治疗目的(例如所述样品是细胞样品，而不是患者或来自患者的样品)。在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于中和样品中HPV的毒力。

在一个优选的实施方案中，所述HPV选自HPV16、31、33和58，且所述单克隆抗体是这样的抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:23-25的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:26-28的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:6所示的VH和/或如SEQIDNO:8所示的VL；更优选地，其是单抗13A10。

在一个优选的实施方案中，所述HPV选自HPV33和58，且所述单克隆抗体是这样的抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:29-31的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:32-34的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:10所示的VH和/或如SEQIDNO:12所示的VL；更优选地，其是单抗12B9。

在一个优选的实施方案中，所述HPV选自HPV16、31和33，且所述单克隆抗体是这样的抗体，其包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:35-37的CDR的VH，和/或包含氨基酸序列为SEQIDNO:38-40的CDR的VL；优选地，其包括：如SEQIDNO:14所示的VH和/或如SEQIDNO:16所示的VL；更优选地，其是单抗4H4。

在另一个方面，本发明还提供了一种分离的表位肽，其由HPVL1蛋白的6－15个连续氨基酸残基组成，且包含HPVL1蛋白的第303－308位氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，所述HPVL1蛋白是HPV16L1蛋白。在一个优选的实施方案中，所述HPVL1蛋白的第303－308位氨基酸残基如SEQIDNO:58所示。

在一个优选的实施方案中，本发明的表位肽由L1蛋白的不多于15个的连续氨基酸残基组成，例如，其由15个，14个，13个，12个，11个，10个，9个，8个，7个或6个连续氨基酸残基组成。例如，本发明的表位肽具有选自SEQIDNO:41-43和50-56所示的氨基酸序列。

特别地，本发明的该表位肽，不需要载体蛋白，即能够被单克隆抗体4B3特异性识别/结合。可选地，可以将本发明的表位肽与载体蛋白融合，以促进表位的呈现和增强表位肽的免疫原性。因此，本发明还提供了一种重组蛋白，其包含本发明的分离的表位肽和载体蛋白，并且不是天然存在的蛋白或其片段。在所述重组蛋白中，所述表位肽可以连接至载体蛋白的N末端或C末端，插入载体蛋白的内部，或替换载体蛋白的部分氨基酸序列，视所使用的具体载体蛋白而定。优选地，所述载体蛋白选自HBV核心抗原和CRM197蛋白。此外，任选地，所述表位肽通过连接体(刚性或柔性连接体，例如(GGGGS)₃)与载体蛋白相连接。本发明的重组蛋白不受其产生方式的限定，例如，其可以通过基因工程方法(重组技术)产生，也可以通过化学合成方法产生。

在另一个方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的表位肽或重组蛋白的核苷酸序列。在另一个方面，本发明还提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。

在另一个方面，还提供了包含如上所述的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。

在另一个方面，还提供了制备本发明的重组蛋白的方法，其包括，在合适的条件下培养如上所述的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的重组蛋白。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段具有显著的有利方面。特别地，本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段能够广谱地识别/结合多种型别(至少5种，甚至多达11种)HPV的L1蛋白和VLP，从而其在检测和诊断方面具有特别显著的优势。

此外，本发明还提供了具有广谱中和活性的单克隆抗体及其抗原结合片段，例如，单克隆抗体13A10能够中和HPV16、31、33和58四个型别的HPV；单克隆抗体12B9能够中和HPV33和58两个型别的HPV；单克隆抗体4H4能够中和HPV16、31和33三个型别的HPV。这对于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病(例如宫颈癌)具有特别显著的优势。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了蛋白质印迹分析的检测结果，其显示了不同型别的HPVL1蛋白与4B3的特异性结合。其中，各泳道所使用的蛋白样品如下：泳道1：HPV6L1蛋白；泳道2：HPV11L1蛋白；泳道3：HPV16L1蛋白；泳道4：HPV18L1蛋白；泳道5：HPV31L1蛋白；泳道6：HPV33L1蛋白；泳道7：EV71蛋白；泳道8：CRM197蛋白；泳道9：HEV495蛋白；泳道10：HPV35L1蛋白；泳道11：HPV45L1蛋白；泳道12：HPV52L1蛋白；泳道13：HPV58L1蛋白；泳道14：HPV59L1蛋白；泳道15：EV71蛋白；泳道16：CRM197蛋白；泳道17：HEV495蛋白。其中，各泳道的蛋白样品的浓度为5μg/ml，且所使用的抗体4B3的浓度为10μg/ml。结果显示，所测试的11种型别的HPVL1蛋白均能和4B3发生特异性反应，而三种无关蛋白均不能和4B3反应。这说明单抗4B3能广谱且特异性结合多种型别的HPV的L1蛋白。

图2显示了蛋白质印迹分析的检测结果，其显示了HPV16L1蛋白的10个亚克隆肽(HPV16L1A-HPV16L1J)与单抗4B3的结合情况。其中，各泳道所使用的蛋白样品如下：泳道1：HPV16L1A蛋白；泳道2：HPV16L1B蛋白；泳道3：HPV16L1C蛋白；泳道4：HPV16L1D蛋白；泳道5：HPV16L1E蛋白；泳道6：HPV16L1F蛋白；泳道7：HPV16L1G蛋白；泳道8：HPV16L1H蛋白；泳道9：HPV16L1I蛋白；泳道10：HPV16L1J蛋白；泳道M：蛋白分子量标记)。结果显示，HPV16L1蛋白的肽段HPV16L1F与HPV16L1G都能与4B3反应，而其余肽段不能与4B3反应。这表明，单抗4B3所结合的表位位于肽段HPV16L1F与HPV16L1G重叠的位置处(15氨基酸的短肽，SEQIDNO:41)。

图3显示了蛋白质印迹分析的检测结果，其显示了不同型别的HPVL1蛋白与不同浓度的单抗4B3的结合情况。其中，各泳道所使用的蛋白样品(浓度为5μg/ml)如下：

泳道1，8，15，22:HPV6L1蛋白；

泳道2，9，16，23:HPV11L1蛋白；

泳道3，10，17，24:HPV16L1蛋白；

泳道4，11，18，25:HPV18L1蛋白；

泳道5，12，19，26:HPV33L1蛋白；

泳道6，13，20，27:HPV52L1蛋白；

泳道7，14，21，28:HPV58L1蛋白。

其中，

泳道1-7使用10μg/ml的4B3进行检测；

泳道8-14使用1μg/ml的4B3进行检测；

泳道15-21使用0.1μg/ml的4B3进行检测；

泳道22-28使用0.01μg/ml的4B3进行检测。

结果显示，当使用的单抗4B3的浓度为至少0.1μg/ml时，能够检测到11种型别的HPVL1蛋白。

图4显示了蛋白质印迹分析的检测结果，其显示了不同浓度的各种型别的HPVL1蛋白与1μg/ml的单抗4B3的结合情况。其中，各泳道所使用的蛋白样品如下：

泳道1-7:HPV6L1蛋白，浓度依次分别为100μg/ml，33μg/ml，11μg/ml，3.6μg/ml，1.2μg/ml，0.4μg/ml，0.1μg/ml；

泳道8-14:HPV11L1蛋白，浓度依次分别为100μg/ml，33μg/ml，11μg/ml，3.6μg/ml，1.2μg/ml，0.4μg/ml，0.1μg/ml；

泳道15-21:HPV16L1蛋白，浓度依次分别为100μg/ml，33μg/ml，11μg/ml，3.6μg/ml，1.2μg/ml，0.4μg/ml，0.1μg/ml；

泳道22-28:HPV18L1蛋白，浓度依次分别为100μg/ml，33μg/ml，11μg/ml，3.6μg/ml，1.2μg/ml，0.4μg/ml，0.1μg/ml；

泳道29-35:HPV31L1蛋白，浓度依次分别为100μg/ml，33μg/ml，11μg/ml，3.6μg/ml，1.2μg/ml，0.4μg/ml，0.1μg/ml；

泳道36-42:HPV33L1蛋白，浓度依次分别为100μg/ml，33μg/ml，11μg/ml，3.6μg/ml，1.2μg/ml，0.4μg/ml，0.1μg/ml；

泳道43-49:HPV45L1蛋白，浓度依次分别为100μg/ml，33μg/ml，11μg/ml，3.6μg/ml，1.2μg/ml，0.4μg/ml，0.1μg/ml；

泳道50-56:HPV52L1蛋白，浓度依次分别为100μg/ml，33μg/ml，11μg/ml，3.6μg/ml，1.2μg/ml，0.4μg/ml，0.1μg/ml；

泳道57-63:HPV58L1蛋白，浓度依次分别为100μg/ml，33μg/ml，11μg/ml，3.6μg/ml，1.2μg/ml，0.4μg/ml，0.1μg/ml。

结果显示，所测试的各个型别的HPVL1蛋白与单抗4B3的结合是剂量依赖性的；并且，使用4B3进行WB检测时，不同型别的L1蛋白的检测极限存在差异，并且在0.4μg/ml-3.6μg/ml之间。

图5显示使用单抗4B3，通过蛋白质印迹法，检测65例具有不同程度的宫颈病变的病人的宫颈脱落细胞样品的分析结果。结果显示，单抗4B3能与病人组织样品中的HPVL1蛋白发生反应，且对病人样品中的HPVL1蛋白的检出率较高，这主要是由单抗4B3的广谱反应性导致的。

序列信息

本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。

序列信息

序列1(SEQIDNO:1)：471bp

ATGGACAGACTTACATCTTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTTTCCCAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGACCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTCCTCTGGGTTTTCACTGAACACCTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGACAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACACTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAATCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGAAACCTCCAGAAACCAGGTACTTCTCAAGATCACCAGTGTTGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGATATTTCTACGATAGTAACTACGGAGGGATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCTGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCGTCTATCCACTGGTCCCTGGAATCTCTA

序列2(SEQIDNO:2)：157aa

MDRLTSSFLLLIVPAYVLSQVTLKESGPGILQTSQTLSLTCSSSGFSLNTSGMGVSWIRQPSGQGLEWLAHTYWDDDKRYNPSLKSRLTISKETSRNQVLLKITSVDTADTATYYCARYFYDSNYGGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSSIHWSLESL

序列3(SEQIDNO:3)：387bp

ATGGTGTCCACAGCTCAGTTCCTTGGGATCTTGTTGCTCTGGTTTCCAGGTATCAGATGTGACATCACGATGACCCAGTCTCCATCCTCCATGTATGCATCGCTGGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAAAAGTTATTTAAGCTGGTACCAACAGAAACCAAGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGTCAGATGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGCCAAGATTATTCTCTAACCATCAGCAGCCTGGAGTCTGACGATACAGCAACTTATTACTGTCTACAACATTATGAGAGCCCGCTCACGTTCGGTCCTGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGATC

序列4(SEQIDNO:4)：129aa

MVSTAQFLGILLLWFPGIRCDITMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIKSYLSWYQQKPRKSPKTLIYYATRLSDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESDDTATYYCLQHYESPLTFGPGTKLEIKRI

序列5(SEQIDNO:5)：426bp

ATGAAATGCAGCTGGGTTATGTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGACCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGCTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAGAGACACCTTTATGCAGTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCCGGAGTACATTGGAAGGATTGATCCTGCAAATGGCTATGTTGAATATGGCCCGAAGTTCCAGGACAAGGCCACAATAACGGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACCTTCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTACTTCTGTAGTTCCTTCCATGGTCAACCTTTTGCTTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCA

序列6(SEQIDNO:6)：142aa

MKCSWVMFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGADLVKPGASVKLSCTASGFNIRDTFMQWVKQRPEQGPEYIGRIDPANGYVEYGPKFQDKATITADKSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCSSFHGQPFAYWGQGTLVTVSAAKTTPP

序列7(SEQIDNO:7)：417bp

ATGGGCTTCAAGATGAAGTCACAGTTTCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTATTAAAGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTGGGAGACAGGGTCAACATCACCTGCATGGCCAGTCAGGATGTGGGTTCTGCTGTTGCCTGGTATCAACAGAAACCCGGACAATCTCCTAAATTACTGATTTATTGGGCATCCTCCCGGCACATTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAACAATATAGCACCTATACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATC

序列8(SEQIDNO:8)：139aa

MGFKMKSQFQVFVYMLLWLSGIKGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCMASQDVGSAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASSRHIGVPDRFTGSGSGTDFTLTINNVQSEDLADYFCQQYSTYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSI

序列9(SEQIDNO:9)：459bp

ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTGGCTGTTCACAGCCTTTCCTGGTGTCGTGTCTGATGTGGCGCTTCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCGCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTTCATTACCAACAGTGATACCACTAGCTACAATCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACGCATCCAAGAACCAGTTCTTCCTACAGTTGAGTTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTATTGTGCAAGGTCCTCGGCCCCTCATTACTACGGCCTTTACTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCGCTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCACCGTCTATCCACTGGTCCCTGGAATCTCTA

序列10(SEQIDNO:10)：153aa

MRVLILLWLFTAFPGVVSDVALQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGFITNSDTTSYNPSLKSRISITRDASKNQFFLQLSSVTTEDTATYYCARSSAPHYYGLYWGQGTLVAVSAAKTTPPPSIHWSLESL

序列11(SEQIDNO:11)：435bp

ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATTCTGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGTTCAAGTGTAAATTACATGTATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCTTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCCGCCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCAAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAATCTC

序列12(SEQIDNO:12)：145aa

MDFQVQIFSFLLISASVILSRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVNYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSRLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISQMEAEDAATYYCQQWSSYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSNL

序列13(SEQIDNO:13)：459bp

ATGAAATGCACCTGGGTTATTCTCTTTTTGATAGCAACAGCAACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAACCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCGACTACTATATATTTTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACTAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACACTGGTGGTACTACCTTCAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTTACTGTAGACAAATCCTCCAGTACAACATACATCCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTACATCCTTTTACTACGGTAGTCCCTTTGACCACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCTGCCAAAACGACACCCCCATCGTTTATCCCTTGGCCCCTGGAATCTCTA

序列14(SEQIDNO:14)：153aa

MKCTWVILFLIATATGVHSQVQLQQSGAELVNPGASVKLSCKASGYTFTDYYIFWVKQRPGLGLEWIGEINPNTGGTTFNERFKGKATLTVDKSSSTTYIQLSSLTSEDSAVYYCTSFYYGSPFDHWGQGTTLTVSSAKTTPPSFIPWPLESL

序列15(SEQIDNO:15)：435bp

ATGGATTTTCAAGTGCAGATTATCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATGCTGTCCAGAGGACAAGTTGTTCTCATCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGTATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTTCCAGTTCAAGTATAGATTACATTCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCACCTCCCCCAACAGATGGATTTATGACACATCCAAATTGCCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTAGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGTAGCATGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAGCGGAATAATTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAATCTC

序列16(SEQIDNO:16)：145aa

MDFQVQIISFLLISASVMLSRGQVVLIQSPAIMSVSPGEKVTMTCSSSSSIDYIHWYQQKPGTSPNRWIYDTSKLPSGVPARFSSSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQRNNYPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSNL

序列17(SEQIDNO:17)：10aa

GFSLNTSGMG

序列18(SEQIDNO:18)：7aa

TYWDDDK

序列19(SEQIDNO:19)：14aa

ARYFYDSNYGGMDY

序列20(SEQIDNO:20)：6aa

QDIKSY

序列21(SEQIDNO:21)：3aa

YAT

序列22(SEQIDNO:22)：9aa

LQHYESPLT

序列23(SEQIDNO:23)：8aa

GFNIRDTF

序列24(SEQIDNO:24)：8aa

IDPANGYV

序列25(SEQIDNO:25)：10aa

SSFHGQPFAY

序列26(SEQIDNO:26)：6aa

QDVGSA

序列27(SEQIDNO:27)：3aa

WAS

序列28(SEQIDNO:28)：7aa

QQYSTYT

序列29(SEQIDNO:29)：9aa

GYSITSDYA

序列30(SEQIDNO:30)：7aa

ITNSDTT

序列31(SEQIDNO:31)：12aa

ARSSAPHYYGLY

序列32(SEQIDNO:32)：5aa

SSVNY

序列33(SEQIDNO:33)：3aa

DTS

序列34(SEQIDNO:34)：9aa

QQWSSYPYT

序列35(SEQIDNO:35)：8aa

GYTFTDYY

序列36(SEQIDNO:36)：8aa

INPNTGGT

序列37(SEQIDNO:37)：11aa

TSFYYGSPFDH

序列38(SEQIDNO:38)：5aa

SSIDY

序列39(SEQIDNO:39)：3aa

DTS

序列40(SEQIDNO:40)：9aa

HQRNNYPLT

序列41(SEQIDNO:41)：15aa

AQIFNKPYWLQRAQG

序列42(SEQIDNO:42)：14aa

QIFNKPYWLQRAQG

序列43(SEQIDNO:43)：13aa

IFNKPYWLQRAQG

序列44(SEQIDNO:44)：12aa

FNKPYWLQRAQG

序列45(SEQIDNO:45)：11aa

NKPYWLQRAQG

序列46(SEQIDNO:46)：10aa

KPYWLQRAQG

序列47(SEQIDNO:47)：9aa

PYWLQRAQG

序列48(SEQIDNO:48)：8aa

YWLQRAQG

序列49(SEQIDNO:49)：7aa

WLQRAQG

序列50(SEQIDNO:50)：14aa

AQIFNKPYWLQRAQ

序列51(SEQIDNO:51)：13aa

AQIFNKPYWLQRA

序列52(SEQIDNO:52)：12aa

AQIFNKPYWLQR

序列53(SEQIDNO:53)：11aa

AQIFNKPYWLQ

序列54(SEQIDNO:54)：10aa

AQIFNKPYWL

序列55(SEQIDNO:55)：9aa

AQIFNKPYW

序列56(SEQIDNO:56)：8aa

AQIFNKPY

序列57(SEQIDNO:57)：7aa

AQIFNKP

序列58(SEQIDNO:58)：6aa

IFNKPY

序列59(SEQIDNO:59)：502aa

MLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGDNVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADIMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLEAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及下列已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC,WuhanUniversity,Wuhan,China)进行保藏的生物材料：

杂交瘤细胞株4B3，保藏号为CCTCC－C201264，保藏时间为2012年5月30日；

杂交瘤细胞株4H4，保藏号为CCTCC－C201265，保藏时间为2012年5月30日；

杂交瘤细胞株12B9，保藏号为CCTCC－C201266，保藏时间为2012年5月30日；

杂交瘤细胞株13A10，保藏号为CCTCC－C201267，保藏时间为2012年5月30日。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，JohnWiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明来源的试剂均是本领域的常规试剂或市售可得的试剂。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1.抗HPVL1蛋白单克隆抗体的制备及广谱反应性的分析

本实验通过用多个型别的HPVVLP交叉免疫小鼠，将经免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并进行筛选，得到对多个型别的HPVVLP具有反应性的抗体及分泌抗体的细胞株。

抗原的制备

利用大肠杆菌表达系统，制备HPV16、33、52、58型的L1蛋白，并通过透射电镜观察和动态光散射检测法检测其形态(魏旻希等，人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性研究，病毒学报，2009，4(25))。结果显示，得到的4种L1蛋白均能形成直径约55nm、与天然病毒颗粒形态高度相似的颗粒，即，形成了可用于免疫小鼠的病毒样颗粒(HPV16、HPV33、HPV52、HPV58的VLP)。将上述得到的4种蛋白稀释至10μg/ml。

小鼠

6周龄雌性Balb/c鼠由厦门大学生命科学院实验动物中心提供。

杂交瘤的制备

我们使用标准的体内免疫方式和PEG融合方法来制备单克隆抗体。详细方法参见EdHarlowetal.,“AntibodiesALaboratoryManual”,ColdSpringHarborLaboratory1988。该方法的简要过程如下：

小鼠免疫：在上述得到的HPV16、HPV33、HPV52、HPV58的VLP中，任选一个型别的HPVVLP与弗氏完全佐剂(CFA)等体积混合乳化，进行四肢肌肉多点注射，每只每次注射250μl。首次免疫后14d、28d和42d，分别用同样剂量的另外任一型别的HPVVLP加弗氏不完全佐剂(IFA)进行加强免疫。在第3次加强免疫后，采血，检测其与HPVVLP的反应滴度。当滴度达到10⁶以上时，取小鼠脾脏细胞用于融合。融合前72hr再次进行加强免疫：经尾静脉注射1次，50μl/只。制备60块融合板。

融合：取血清滴度最高的3只小鼠的脾脏细胞，与小鼠骨髓瘤细胞相融合。先将脾脏研磨，得到脾细胞悬液；然后将其与细胞数目低十倍的处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合，并经PEG1500作用1min，将两种细胞融合一起；然后把融合细胞液(1200ml)分装到60块96孔板中培养。融合培养基为含HAT和20％FBS的RPMI1640完全筛选培养基。抗原广谱性克隆通过ELISA及中和实验筛选得到，并且经3次克隆化后，得到稳定的单克隆抗体细胞株。

杂交瘤的筛选：融合细胞在96孔板中培养10天后，吸取细胞上清，进行ELISA及中和检测。将阳性孔继续克隆化，直至细胞株所分泌的抗体能够稳定结合HPVVLP并且中和HPV假病毒为止。

筛选结果：获得四株分泌单克隆抗体的细胞株：4B3、13A10、12B9、4H4。

杂交瘤的培养：将稳定的杂交瘤细胞株在二氧化碳培养箱中扩增培养：从96孔板转移至24孔板，再转移至50ml细胞培养瓶。然后，收集细胞培养瓶内的细胞，将其注射到小鼠腹腔内，并在7－10天后从小鼠腹腔中吸取腹水。

单克隆抗体的纯化

腹水先用50％的硫酸铵沉淀处理，然后对PBS，pH7.2进行透析，然后用DEAE柱进行HPLC纯化，最终得到经纯化的单克隆抗体。SDS-PAGE检测显示，经纯化的单克隆抗体的纯度均达到95％以上。

单克隆抗体与各个型别的HPVVLP的反应性的ELISA检测

将HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58和HPV59这11个型别的VLP分别吸附至96孔板上，然后以3倍浓度梯度稀释添加所获得的单抗(最高浓度为1mg/ml)。通过ELISA检测各个单克隆抗体与各个型别的HPVVLP的结合强度。

将抗体能够与VLP反应的最大稀释度作为该抗体针对该VLP的抗体滴度。当抗体滴度高于10时，认为该抗体能与该型别的VLP结合。经计算，4B3、13A10、4H4和12B9针对各个型别的HPVVLP的抗体滴度如表2所示(结果以log₁₀抗体滴度表示)。结果显示，这4株单抗均具有广谱反应性：它们均能够和至少5个型别的HPVVLP发生反应。其中，4B3与所测试的11个型别的HPVVLP均发生反应；而13A10能与HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58的VLP发生反应；4H4能与HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52的VLP发生反应；12B9能与HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58的VLP发生反应。

表2：4种单抗与11个型别的HPVVLP的反应强度

单抗与各个型别的HPVL1蛋白的反应性的蛋白质印迹(WB)检测

用蛋白质印迹(WB)法分析4B3、13A10、4H4和12B9是否能与HPVL1蛋白反应。若能反应，则说明该抗体所识别的表位为线性表位；反之，则说明该抗体所识别的表位为构象表位。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：将HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58的L1蛋白稀释成5μg/ml，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

转膜：将SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。

封闭：将硝酸纤维素膜浸泡在5％脱脂奶中，封闭60min。

加抗体:将各抗体分别用5％脱脂奶稀释至10μg/ml，然后与硝酸纤维素膜反应1小时。

洗涤：用20mMTirs-HCl，pH8.0，0.5MNaCl，0.05％Tween20溶液洗涤硝酸纤维素膜5次，每次3min。

加酶：向硝酸纤维素膜上加GAM-AP(缀合碱性磷酸酶的羊抗鼠二抗，购自美国KPL公司，下同)，反应1小时。

洗涤：用20mMTirs-HCl，pH8.0，0.5MNaCl，0.05％Tween20溶液洗涤硝酸纤维素膜5次，每次3min。

显色：每孔加入显色剂A、B液各50ul(显色剂A液：13.4g/LNa₂HPO₄.12H₂O+4.2g/L柠檬酸.H₂O+0.3g/L过氧化氢脲；显色剂B液：0.2mM/L四甲基联苯胺(TMB)+20mM/L二甲基甲酰胺；下同)，显色10min。

抗体4B3与不同型别的HPVL1蛋白的反应性的WB检测结果如图1所示。结果显示，所测试的11种型别的HPVL1蛋白均能和4B3发生特异性反应。此外，WB检测结果还显示，抗体13A10，4H4和12B9均不能与HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58的L1蛋白发生反应。上述结果表明，抗体4B3所识别的表位为线性表位，而其余3株抗体(13A10，4H4，12B9)所识别的表位为构象表位。

实施例2.4B3所识别的表位的定位、鉴定及同源性分析

由于抗体4B3所识别的表位为线性表位，因此可以采用分段克隆的方法对其表位进行定位。

首先，将HPV16L1蛋白在大肠杆菌中分段克隆表达，共制备10个亚克隆肽，每个肽65aa，且相邻的2个肽具有15aa的重叠(aa表示氨基酸，其置于数字n前面时表示第n位氨基酸(例如，aa130表示第130位氨基酸)，置于数字之后时则表示多肽长度为n个氨基酸(下同))。将这10个亚克隆肽分别命名为：HPV16L1A-HPV16L1J，其中，HPV16L1A对应于HPV16L1蛋白的aa1-65，HPV16L1B对应于HPV16L1蛋白的aa51-115，HPV16L1C对应于HPV16L1蛋白的aa101-165，依此类推。

检测这10个亚克隆肽与单抗4B3的WB反应性，结果如图2所示。结果显示，HPV16L1F(aa251-aa315)与HPV16L1G(aa301-aa365)都能与单抗4B3发生反应，而其它亚克隆肽不能与单抗4B3发生反应。这表明，单抗4B3所识别的表位位于HPV16L1F和HPV16L1FG重叠的位置处，即，位于HPV16L1蛋白的aa301-315，其序列如SEQIDNO:41所示。

进一步，针对这15个氨基酸(SEQIDNO:41)设计合成了17段多肽，分别命名为L1FG1-L1FG17，其氨基酸序列分别为SEQIDNO:41-57(上海生工生物公司合成)。然后，通过竞争性ELISA检测分析这些多肽(L1FG1-L1FG17)与单抗4B3的结合情况。具体步骤如下：

多肽与单抗的结合：将17段多肽分别与单抗混合，且多肽过量。同时，设置阳性对照：15肽(SEQIDNO:41)；和阴性对照：只有单抗样品，而不加入多肽。所有的样品都于37℃温育1小时。

包被：将HPV16L1蛋白吸附到8K-96孔板上。

加样：将温育后的19个样品分别加至包被有HPV16L1的孔中。

孵育：用封板膜封住96孔板，于37℃生化培养箱中反应30min。

洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。

加酶：每孔加入100μlGAM-AP。

孵育：用封板膜封住96孔板，于37℃生化培养箱中反应30min。

洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。

显色：每孔加入显色剂A液和B液(见上文)各50μl，37℃显色10min。

结果判定：将待测样品的结果与阳性对照和阴性对照的结果进行对比。

结果显示，多肽L1FG1-3和L1FG10-16都能与单抗4B3发生反应。综合分析这些多肽的氨基酸序列，将4B3所识别的表位确定为6肽，其序列为SEQIDNO:58，对应于HPV16L1蛋白(SEQIDNO:59)的aa303-308。

HPV16L1蛋白上4B3所识别的表位的同源性分析

使用MEGA5.0软件将HPV16L1蛋白的氨基酸序列与NCBI数据库中收录的所有HPVL1蛋白的序列进行比对，分析对应于HPV16L1蛋白(SEQIDNO:59)的aa303-308的序列的同源性。经搜索和筛选，从NCBI数据库中得到121个型别的HPV在该区段的序列。对这些序列进行比对，并对各氨基酸的保守性进行统计分析。

分析结果表A所示。结果显示，HPV16L1蛋白的aa303-308在121个HPV型别中十分保守，其中，第303、304、305、307位氨基酸的同源性在85％以上(第304、305、307位氨基酸的同源性甚至超过了95％)；第306、308位氨基酸的差异相对较大，但同源性仍达到50％以上。这说明，4B3所识别的表位为保守表位，其在多个型别的HPV中是极其保守的区段，并因此构成了单抗4B3的广谱识别与结合活性的基础。

表A：抗体4B3所识别的表位的序列同源性分析

实施例3.HPV感染者宫颈脱落细胞中的HPVL1蛋白的WB检测

由于单抗4B3在蛋白质印迹分析中能与多种型别的HPVL1发生反应，因此可以将其用于检测患者宫颈脱落细胞中L1蛋白的表达水平。为此，首先通过蛋白质印迹分析实验，确定用于检测法的单抗4B3的合适浓度；然后测试单抗4B3对11种型别的HPVL1的检测极限；最后，通过蛋白质印迹分析，用单抗4B3检测了HPVDNA检测为阳性的63例宫颈癌前病变病人的样本。

不同浓度的4B3与各个型别的HPVL1的结合的WB分析

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：将HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58的L1蛋白稀释成5μg/ml，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

转膜：将SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。

封闭：将硝酸纤维素膜浸泡在5％脱脂奶中，封闭60min。

加抗体:将抗体4B3用5％脱脂奶稀释成10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml和0.01μg/ml四个浓度，然后分别与不同的硝酸纤维素膜反应1小时。

洗涤：用20mMTirs-HCl，pH8.0，0.5MNaCl，0.05％Tween20溶液洗涤硝酸纤维素膜5次，每次3min。

加酶：向硝酸纤维素膜上加GAM-AP，反应1小时。

洗涤：用20mMTirs-HCl，pH8.0，0.5MNaCl，0.05％Tween20溶液洗涤硝酸纤维素膜5次，每次3min。

显色：每孔加入显色剂A液和B液(见上文)显色10min。

结果如图3所示。结果显示，当4B3的浓度高于0.1μg/ml时，其对各型别的HPVL1蛋白均能发生反应。因此，可使用例如1μg/ml的单抗4B3进行WB检测。

4B3对各个型别的HPVL1蛋白的WB检测极限

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：将HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58的L1蛋白分别稀释为7个浓度：100、33、11、3.6、1.2、0.4、0.1μg/ml，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

转膜：将SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。

封闭：将硝酸纤维素膜浸泡在5％脱脂奶中，封闭60min。

加抗体:将抗体4B3用5％脱脂奶稀释成1μg/ml，然后与硝酸纤维素膜反应1小时。

洗涤：用20mMTirs-HCl，pH8.0，0.5MNaCl，0.05％Tween20溶液洗涤硝酸纤维素膜5次，每次3min。

加酶：向硝酸纤维素膜上加GAM-AP，反应1小时。

洗涤：用20mMTirs-HCl，pH8.0，0.5MNaCl，0.05％Tween20溶液洗涤硝酸纤维素膜5次，每次3min。

显色：每孔加入显色剂A液和B液(见上文)显色10min。

结果如图4和表3所示。结果表明，使用4B3进行WB检测时，不同型别的L1蛋白的检测极限存在差异，并且在0.4μg/ml-3.6μg/ml之间。

表3：HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58的L1蛋白的检测极限

宫颈脱落细胞中HPVL1蛋白的水平的检测

样品采集：来自厦门大学附属中山医院妇产科门诊(2010年6月至2011年9月)的65例病人，她们的宫颈脱落细胞的DNA检测均为高危型HPV阳性。分别采集宫颈脱落细胞，保存于PBS溶液中。

样品处理：取宫颈脱落细胞样品100μL，加入20μL6×LoadingBuffer(12％(w/v)SDS，0.6％(w/v)溴酚蓝，0.3MTris-HClpH6.8，60％(v/v)甘油，5％(v/v)β－巯基乙醇，下同)，混匀并于80℃水浴10min。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：将经处理的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

转膜：将SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。

封闭：将硝酸纤维素膜浸泡在5％脱脂奶中，封闭60min。

加抗体:将抗体4B3用5％脱脂奶稀释成0.1μg/ml，然后与硝酸纤维素膜反应1小时。

洗涤：用20mMTirs-HCl，pH8.0，0.5MNaCl，0.05％Tween20溶液洗涤硝酸纤维素膜5次，每次3min。

加酶：向硝酸纤维素膜上加GAM-AP，反应1小时。

洗涤：用20mMTirs-HCl，pH8.0，0.5MNaCl，0.05％Tween20溶液洗涤硝酸纤维素膜5次，每次3min。

显色：每孔加入显色剂A液和B液(见上文)显色10min。

图5显示使用单抗4B3，通过蛋白质印迹法，检测宫颈脱落细胞样品的结果。此外，表4显示了使用4B3检测病人样品中的HPVL1的检出率与该病人病理的关系。从这些结果可以看出，单抗4B3可用于检测宫颈病人病理组织中的HPVL1蛋白的表达情况。特别地，由于单抗4B3可结合多种型别的HPVL1蛋白(即，广谱反应性)，因此，其对样品中的HPVL1蛋白的检出率较高，显著优于已知的抗体。

表4：HPVL1蛋白的检出率与病人病理的关系

注：CIN是指宫颈上皮内瘤变；其中，CIN1-3分别代表轻度，中度及严重瘤变(CIN分级是根据美国阴道镜和宫颈病理学会(ASCCP)2003年制定的分级标准进行的)。

实施例4.单克隆抗体对假病毒的中和活性的鉴定

本实验通过假病毒-细胞中和模型，检测抗体清除假病毒或显著降低假病毒的毒力的能力。

用假病毒-细胞中和模型鉴定实施例1中获得的三株单克隆抗体(13A10，12B9和4H4)针对HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58、HPV59假病毒的中和活性(关于假病毒-细胞中和模型，参照卢五迅等，生物工程学报，2006年，22卷：990-995页)。以下以检测13A10抗体对HPV16假病毒的中和活性为例，示例性描述了此方法。

首先，将13A10抗体2倍浓度梯度倍比稀释(最高浓度1mg/ml)，然后针对每个稀释度，分别取50μl，将其与50μl的合适浓度的HPV16假病毒(MOI＝0.1)在96孔板中混合，并在4℃孵育一个小时。以假病毒和PBS的混合液作为阴性对照。然后将各混合液分别加入预先铺有293FT细胞的96孔细胞板中(每孔约1.5×10⁴的293FT细胞)，并于二氧化碳培养箱中、37℃下培养72小时。之后，使用荧光读板机(美国Beckman公司)检测每一个孔的荧光强度。

将荧光强度比阴性对照降低至少50％的最大单抗稀释度作为该单抗对该型HPV的中和滴度。如果单抗的中和滴度小于20,则认为其对于该型别的HPV无中和活性。上述三株单抗针对HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58、HPV59假病毒的中和活性概括于表5中(结果以log₁₀中和滴度表示)。其中，单抗13A10对HPV16、HPV31、HPV33、HPV58四个型别具有交叉中和活性；12B9对HPV33、HPV58两个型别具有交叉中和活性；4H4对HPV16、HPV31、HPV33三个型别具有交叉中和活性。这些结果表明，本发明所制备的这3株单抗不仅对HPVL1蛋白和VLP具有广谱的反应性，而且具有针对至少2个型别的HPV的交叉中和活性。

表5：各单抗对11个型别的HPV假病毒的中和活性

实施例5.单克隆抗体的亲和力分析

本实验使用BIACORE3000生物传感器(美国GE公司)，分析了抗原抗体结合及解离的动力学，计算了单克隆抗体13A10与各型HPVVLP的结合常数k_a，解离常数k_d和亲和力K_D，以反映该抗体与各型HPVVLP的结合程度的强弱。

首先，用pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液将羊抗鼠多抗(GAM)(购自美国KPL公司，下同)稀释为40μg/ml。按照制造商的说明书(Biacore3000生物传感器，美国GE公司)，将GAM偶联至芯片上，并设置偶联水平为15000RU。根据其自动运行的结果报告偶联水平。结果显示，最终的偶联水平为15834.5RU。

用HBS-EP缓冲液稀释抗体13A10至2μg/ml。同时，用HBS-EP缓冲液将HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV58、HPV59的VLP分别稀释至下述各个不同的浓度，即，0，1，2，4，8，16和32nmol/L。检测时，先将抗体进样90s，然后结合120s，解离420s，最后用20mM的pH2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液再生芯片。按照造商的说明书进行抗原抗体结合的动力学/亲和力分析，并且，数据用Biacore3000Evaluation软件进行分析。抗体13A10与各个型别的HPVVLP的亲和力的检测结果如表6所示。结果显示，抗体13A10与HPV16、58、31、33、35的亲和力较高，在10^-8-10^-10之间。

表6：抗体13A10对多个型别的HPVVLP的动力学分析

实施例6.单克隆抗体对血清-抗原结合的阻断实验

阻断实验包括下述两个方面。一个方面是，先将不同浓度的抗体与抗原结合，然后检测血清与抗原的结合被阻断的程度，即，抗体对某一血清的阻断率。一般认为，阻断率高于50％的，为高阻断；阻断率在20％-50％之间的，为低阻断；阻断率低于20％的，为没有阻断。另一方面是，在相同抗原产生的多份血清中进行上述阻断率的考察。若阻断率高于50％的血清占多数，则可以认为该抗体为该类免疫血清的优势抗体，其所识别的表位为用于产生该类免疫血清的抗原的优势表位(ZhaohuiWang,Amonoclonalantibodyagainstintacthumanpapillomavirustype16capsidsblockstheserologicalreactivityofmosthumansera；JournalofGeneralVirology(1997),78,2209–2215)。

我们分别使用了多份用HPVVLP免疫获得的兔血清，HPV16/18双价疫苗接种者的血清和自然HPV感染者的血清进行阻断实验，以考察抗体在对应的HPVVLP，HPV16/18疫苗抗原，和天然的HPV中识别的表位是否为优势表位，具体实验流程如下。

酶标板的制备：

在8K-96孔板(8行×12列)上分别包被HPV16、31、33、58的VLP(使用20mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)与0.3MNaCl溶液，在37℃下包被过夜)。然后，使用PBST(10mMPBS+0.05％Tween20)洗涤板一次。将板扣干后，加入封闭液(酪蛋白+蔗糖)，并于37℃封闭2hr。将板再次扣干并真空抽干，获得酶标板(8x12孔)。

阻断实验所需的其它试剂的配制：

酶标试剂：以HRP标记羊抗鼠Fc的多抗(GAM)(购自美国KPL公司)，得到酶标试剂；

阴性对照：以抗戊型肝炎病毒(HEV)ORF2的单抗8G12(本实验室自行制备保存)为阴性对照；

显色剂A液：13.4g/LNa₂HPO₄.12H₂O+4.2g/L柠檬酸.H2O+0.3g/L过氧化氢脲；

显色剂B液：0.2mM/L3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)+20mM/L二甲基甲酰胺；

终止液：2M硫酸；

浓缩洗涤液：20xPBST。

检测过程：

配液：将50ml浓缩洗涤液(20×)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml，备用。

编号：将样品对应微孔板按序编号，并且在每个阻断实验中，针对每个型别设置一排行(12个)的阴性对照孔。

待测单抗的处理及加样:

将待测单抗稀释至100μg/ml，加入酶标板的每行第一孔，然后将抗体的浓度稀释3倍加入第二孔，并依次向后倍比稀释(即，前一孔的浓度为后一孔的3倍)，共获得11个稀释度(3倍连续稀释，最高浓度为100μg/ml)。每行最后一孔加入不含抗体的稀释液。

孵育：用封口膜封板，将其置于生化培养箱，37℃温育60min。

洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。

被阻断的血清或抗体的预处理及加样：

样品为血清样本：首先，通过ELISA检测用于阻断实验的血清样本与相应型别的VLP的结合情况。然后，根据检测结果稀释血清样本，使其与相应型别的VLP的ELISA结合的OD值为1左右。将该稀释的血清样本用于进行以下实验。

孵育：用封口膜封板，将其置于生化培养箱，37℃温育60min。

洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。

加酶：分别在相应孔中加入酶标试剂100μl。

孵育：用封口膜封板，将其置于生化培养箱，37℃温育45min。

洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。

显色：每孔加入显色剂A液和B液各50μl，37℃显色10min。

测定：每孔加终止液1滴(50μl)，然后用酶标仪以单波长450nm(需设空白对照孔)或双波长450nm/630nm测定各孔OD值。

样品为抗每个型别的特异性抗体：将每株特异性抗体用HRP标记，然后直接将经标记的抗体稀释1000倍，并加入孔中。

孵育：用封口膜封板，将其置于生化培养箱，37℃温育60min。

洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。

显色：每孔加入显色剂A液和B液各50μl，37℃显色10min。

测定：每孔加终止液1滴(50μl)，然后用酶标仪以单波长450nm(需设空白对照孔)或双波长450nm/630nm测定各孔OD值。

结果判定：

a)阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔的OD值≤0.1(若阴性对照孔的OD值大于0.1，则应舍弃；若所有阴性对照孔的OD值都大于0.1，则应重复实验；若阴性对照孔的OD值小于0.03，则按0.03计算)。

b)临界值(CUTOFF)的计算：阴性对照孔OD值的均值+0.15。

c)单孔阻断率的判定：将每孔的OD值与未加待测单抗的孔的OD值进行比较，并将每孔的阻断率计算为：

阻断率＝(1-该孔OD值)/1×100％

d)抗体阻断率的计算：以每一孔所使用的单抗浓度为横坐标，以该孔的阻断率为纵坐标，作图并拟合成抛物线。计算抗体浓度为无穷大时的阻断率，将其作为该抗体对该份血清的阻断率。

利用上述方法，分别检测了抗体13A10对用HPV16、31、33或58免疫获得的兔血清(各2份)，4H4对用HPV16、31或33免疫获得的兔血清(各2份)，12B9对用HPV33或58免疫获得的兔血清(各2份)的阻断率。检测结果如表7-表9所示。

这些结果显示，抗体13A10对2份HPV58的兔血清的阻断率都高于50％，这表明抗体13A10是HPV58VLP免疫血清的优势抗体，其所识别的表位是HPV58VLP的优势表位；抗体13A10对HPV16、31、33的兔血清的阻断率都低于50％，这表明抗体13A10不是HPV16、31、33VLP免疫血清的优势抗体。同理，抗体4H4和12B9也不是HPV16、31、33、58VLP免疫血清的优势抗体。

表7：13A10对HPV16、31、33、58的兔血清的阻断

表8：4H4对HPV33、58的兔血清的阻断

表9：12B9对HPV33、58的兔血清的阻断

此外，还分别检测了抗体13A10对多份HPV16、33、58自然感染者的血清，4H4对多份HPV16、31、33自然感染者的血清的阻断率。检测结果如表10－表11所示。

这些结果显示，抗体13A10对14份HPV58自然感染者的血清的阻断率都高于50％，这表明抗体13A10是HPV58感染者的血清的优势抗体，其所识别的表位是天然HPV58的优势表位；抗体13A10对HPV16、33自然感染者的血清的阻断率都低于50％，这表明抗体13A10不是HPV16、33自然感染者的血清的优势抗体。同理，抗体4H4也不是HPV16、31、33自然感染者的血清的优势抗体。

表10：13A10对HPV16、58或33自然感染者的血清的阻断

表11：4H4对HPV16、58或33自然感染者的血清的阻断

实施例7.单克隆抗体的轻链基因和重链基因可变区的分离

半贴壁培养10⁷个杂交瘤细胞，用吹管吹起贴壁的细胞使之悬浮，并将其转移到新的4ml离心管中。以1500rpm离心3min，收集沉淀的细胞，并将其重悬于100μl无菌PBS(pH7.45)中。将细胞悬液转移到一新的1.5ml离心管中，加入800μlTrizol(Roche,Germany)，并轻轻颠倒混匀，静置10min。然后，加入200μl氯仿并剧烈振荡15s，静置10min。之后，以4℃、12000rpm离心15min，并转移上层液体至一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀并静置10min。之后，以4℃、12000rpm离心10min，弃上清；加入600μl75％乙醇进行洗涤，以4℃、12000rpm离心5min，弃上清；将沉淀于60℃真空抽干5min。之后，将透明的沉淀溶于70μlDEPCH₂O中，并分装成两管。每管分别加入1μl反转录引物，其中一管加入的反转录引物为MVJkR(5'-CCgTTT(T/g)AT(T/C)TCCAgCTTggT(g/C)CC-3')，用于扩增轻链可变区基因；另一管加入的反转录引物为MVDJhR(5'-CggTgACCg(T/A)ggT(C/g/T)CCTTg(g/A)CCCCA-3')，用于扩增重链可变区基因。向每管中加入1μldNTP(上海生工)，然后于72℃水浴10min，之后立即置于冰浴中5min；然后加入10μl5x反转录缓冲液，1μlAMV(10u/μl，Pormega)，1μlRnasin(40u/μl，Promega)，混匀后于42℃将RNA反转录成cDNA。

采用聚合酶链式反应(PCR)法分离抗体基因可变区，使用根据Novagen公司的Ig-Prime试剂盒合成的引物组(表12)以及另外的两条下游引物MVJkR和MVDJhR(上海博亚公司合成)，其中MVJkR为用于轻链可变区基因扩增的下游引物，MVDJhR为用于重链可变区基因扩增的下游引物。所使用的模板为通过上述方法获得的cDNA。PCR条件为：94℃5min；50个循环的(94℃40s，53℃1min，72℃50s)；72℃15min。回收目的片段，并克隆至pMD18-T载体中，然后进行测序(上海博亚公司)。对测序序列进行blast比对，以确定抗体可变区的核苷酸序列，并进而确定相应的氨基酸序列。

按照上述方法，从杂交瘤细胞株4B3、13A10、12B9、4H4中克隆出各细胞株所分泌的单抗的可变区基因，并确定了相应的氨基酸序列。表12显示了所使用的上游引物的序列。表13显示了4株单克隆抗体的重链和轻链可变区的核甘酸序列和氨基酸序列的序列编号。表14显示了根据KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987and1991))中描述的方法确定的4株单克隆抗体的CDR氨基酸序列。

表12：用于扩增单抗可变区基因的上游引物的序列

表13：4株单克隆抗体的可变区的序列编号

表14：4株单克隆抗体的CDR氨基酸序列

利用上述鉴定的序列，通过已知的抗体工程技术，可以制备各种基因工程抗体，例如嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，双抗体等，并保留其所源自的单克隆抗体的生物学特性(例如，对HPVL1蛋白的广谱反应性，和/或对至少2个型别的HPV的交叉中和活性)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (39)

1.能够特异性结合多个型别的HPV的L1蛋白和/或VLP并且能够中和至少2个型别的HPV的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括：包含氨基酸序列为SEQIDNO:23-25的CDR的重链可变区，和包含氨基酸序列为SEQIDNO:26-28的CDR的轻链可变区，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv和单链抗体。

2.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括：如SEQIDNO:6所示的重链可变区和如SEQIDNO:8所示的轻链可变区。

3.权利要求1-2任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体选自人源化抗体和嵌合抗体。

4.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单链抗体为scFv。

5.权利要求1或2任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体以小于10^-5M，或者小于10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的K_D结合HPV的L1蛋白或VLP。

6.权利要求1或2任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体能够特异性结合HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52和HPV58中的一种或多种的L1蛋白和VLP。

7.权利要求1或2任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体是中和抗体，其能够中和选自HPV16、31、33和58中的至少2个型别，至少3个型别，或4个型别。

8.权利要求1或2任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种。

9.权利要求8的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述非-CDR区来自人抗体。

10.权利要求1或2任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株13A10产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株13A10保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201267。

11.分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列和能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，其中所述抗体重链可变区包含氨基酸序列为SEQIDNO:23-25的CDR；并且所述抗体轻链可变区包含氨基酸序列为SEQIDNO:26-28的CDR。

12.权利要求11的分离的核酸分子，其中所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。

13.权利要求11的分离的核酸分子，其中所述能够编码抗体重链可变区的核酸序列如SEQIDNO:5所示。

14.权利要求11的分离的核酸分子，其中所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。

15.权利要求11的分离的核酸分子，其中所述能够编码抗体轻链可变区的核酸序列如SEQIDNO:7所示。

16.一种载体，其包含权利要求11-15任一项的分离的核酸分子。

17.一种宿主细胞，其包含权利要求11-15任一项的分离的核酸分子，或权利要求16的载体。

18.制备权利要求1-10任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在合适的条件下培养宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述宿主细胞包含权利要求11-15任一项的分离的核酸分子。

19.杂交瘤细胞株，其为杂交瘤细胞株13A10，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，且具有保藏号CCTCC－C201267。

20.试剂盒，其包括权利要求1-10任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段。

21.权利要求20的试剂盒，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。

22.权利要求21的试剂盒，其中所述可检测的标记选自放射性同位素，发光物质，有色物质和酶。

23.权利要求21的试剂盒，其中，所述可检测的标记为荧光物质。

24.权利要求20的试剂盒，其中所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。

25.权利要求24的试剂盒，其中所述可检测的标记选自放射性同位素，发光物质，有色物质和酶。

26.权利要求24的试剂盒，其中，所述可检测的标记为荧光物质。

27.用于检测HPVL1蛋白或VLP在样品中的存在或其水平的非诊断目的的方法，其包括使用权利要求1-10任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段。

28.权利要求27的方法，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。

29.权利要求28的方法，其中所述可检测的标记选自放射性同位素，发光物质，有色物质和酶。

30.权利要求28的方法，其中，所述可检测的标记为荧光物质。

31.权利要求27的方法，其中所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测所述单克隆抗体或其抗原结合片段。

32.权利要求31的方法，其中所述可检测的标记选自放射性同位素，发光物质，有色物质和酶。

33.权利要求31的方法，其中，所述可检测的标记为荧光物质。

34.权利要求1-10任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测HPVL1蛋白或VLP在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了HPV。

35.一种药物组合物，其包含权利要求1-10任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

36.用于中和样品中HPV的毒力的非治疗目的的方法，其包括，将包含HPV的样品与权利要求1-10任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段接触。

37.权利要求1-10任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于中和样品中HPV的毒力。

38.权利要求1-10任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗受试者的HPV感染或与HPV感染相关的疾病。

39.权利要求38的用途，其中所述与HPV感染相关的疾病为宫颈癌。