CN117736312A - 一种抗hpv59抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本申请涉及生物技术领域,尤其涉及一种抗HPV 59抗体。所述抗HPV 59抗体包括重链可变区和轻链可变区,所述抗HPV 59抗体的重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR‑H1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR‑H2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR‑H3;所述抗HPV 59抗体的轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR‑L1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR‑L2和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR‑L3。所述抗HPV59抗体与其它16种亚型HPV无交叉反应,检测灵敏度高。
Description
技术领域
本说明书涉及生物技术领域,特别涉及一种抗HPV 59抗体及其制备方法和应用。
背景技术
宫颈癌和宫颈癌前病变是威胁全世界妇女健康的一个重要因素。临床学、分子生物学和流行病学调查已经证明人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是宫颈癌和宫颈非典型增生的主要病因。目前HPV已经发现200多种亚型,根据致病性不同分为高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45等;低危型包括HPV6、11等。HPV为无包膜的环状双链DNA病毒,其衣壳是由72个主要衣壳蛋白Ll蛋白五聚体构成的二十面体结构,1个病毒粒子上含有360个Ll蛋白单体。目前中国批准上市的宫颈癌疫苗有3种,包括:葛兰素史克(GSK)公司的HPV2价疫苗Cervarix(亚型为HPV 16、18),默沙东公司HPV4价疫苗 和9价疫苗/>9(亚型为HPV 6、11、16、18、31、33、45、52、58)。世界卫生组织国际癌症研究署已明确的13种能够导致宫颈癌和高度痛前宫颈上皮内病变的HR-HPV包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68。其中仅HPV59在IARC致痛物分级中属于2A级,其余12种均属于I类致癌物。由于目前市售疫苗最多为9个亚型,因此越来越多的公司也在不断研发更多价型(如包括HPV 59)的HPV疫苗。根据世界卫生组织(WHO)对HPV疫苗质量、安全性及有效性指导原则,以及国家食品药品监督管理局(CFDA)的相关规定,在多价HPV疫苗的研制和生产过程中,需要建立鉴别试验、抗原含量、吸附完全性和体外相对效力测定的方法,这些方法均可采用酶联免疫法(ELISA),因此ELISA法中单克隆抗体具有型别特别性以及较高中和活性对于HPV疫苗的质量控制来说至关重要。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种抗HPV 59抗体及其制备方法和用途,用于解决现有技术中的问题。
本申请提供一种抗HPV 59抗体,所述抗HPV 59抗体包括重链可变区和轻链可变区,所述抗HPV 59抗体的重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR-H3;和/或,所述抗HPV 59抗体的轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR-L3。
本申请还提供一种分离的多核苷酸,编码上述的抗HPV 59抗体。
本申请还提供一种表达载体,含有上述的分离的多核苷酸。
本申请还提供一种抗体的表达系统,所述表达系统含有上述的表达载体或基因组中整合有外源的上述的多核苷酸。
本申请还提供一种制备上述的抗HPV 59抗体的方法,其包括,在允许所述抗体表达的条件下,培养上述的表达系统中的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。
本申请还提供一种检测试剂盒,所述检测试剂盒包括上述的抗HPV 59抗体。
本申请还提供上述的抗HPV 59抗体、多核苷酸、表达载体、表达系统或检测试剂盒在肿瘤诊断药物筛选或质控、肿瘤治疗药物筛选或质控、肿瘤预防药物筛选或质控中的用途,或在制备肿瘤诊断或治疗药物中的用途。
本说明书提出的抗HPV 59抗体及其制备方法和用途,带来的有益效果包括但不限于:本申请的人乳头瘤病毒59型(HPV 59)特异性的单克隆抗体与其它16种亚型HPV无交叉反应,用于HPV疫苗的鉴别试验具有高特异性的优点,具有中和抗体活性,可以准确检测HPV多价疫苗中HPV 59型有中和活性的抗原含量和吸附完全性,具有检测灵敏度高的优点,HPV疫苗质量控制方面将会得到广泛应用。
附图说明
本申请将以示例性实施例的方式进一步说明,这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的,其中:
图1为根据本申请一些实施例所示的免疫印迹法测定HPV 59L1单抗图;
图2为根据本申请一些实施例所示的测定HPV 59L1体外相对效力筛选单克隆抗体;
图3为根据本申请一些实施例所示的测定HPV 59L1体外相对效力筛选单克隆抗体;
图4为根据本申请一些实施例所示的测定HPV 59L1体外相对效力筛选单克隆抗体;
图5为根据本申请一些实施例所示的测定HPV 59L1体外相对效力筛选单克隆抗体;
图6为根据本申请一些实施例所示的测定HPV 59L1体外相对效力筛选单克隆抗体;
图7为根据本申请一些实施例所示的HPV 59L1原液体外相对效力测定图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例,对于本领域的普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明,图中相同标号代表相同结构或操作。
如本说明书和权利要求书中所示,除非上下文明确提示例外情形,“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数,也可包括复数。一般说来,术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素,而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列,方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是,前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反,可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时,也可以将其他操作添加到这些过程中,或从这些过程移除某一步或数步操作。
本申请提供一种抗HPV 59抗体,所述抗HPV 59抗体包括重链可变区和轻链可变区,所述抗HPV 59抗体的重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR-H3;和/或,所述抗HPV 59抗体的轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR-L3。
本文中的“序列”一般应理解为既包括相关氨基酸序列,又包括编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列,除非本文需要更限定的解释。
自然产生的抗体结构单元通常包含四聚体。每个这样的四聚体都可由两对相同的多肽链组成,每对多肽链具有一条全长“轻”链(如:约25000道尔顿分子量(25kDa))和一条全长“重”链(如:约50000~70000道尔顿分子量(50~70kDa))。每条链的氨基末端部分通常包含大约100~110个或更多氨基酸的可变区,其通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常限定可能负责效应子功能的恒定区。人轻链通常被归类为K和λ轻链。重链通常被归类为μ、δ、γ、α或ε,并分别限定抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有几个亚类,包括但不限于:IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM有亚类,包括但不限于:IgM1和IgM2。相似地,IgA细分为亚类,包括但不限于:IgA1和IgA2。在轻链和重链内,可变区和恒定区可通过约12个或更多氨基酸的“J”区连接,且重链还包括约10个或更多氨基酸的“D”区。每条轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
可变区通常显示相同的基本结构,由三个超变区(也称为互补决定区或CDR)连接相对保守的框架区(FR)。通常,来自每一对的两条链的CDRs由框架区对齐,其能结合特异性表位。从氨基端到羧基端,轻链和重链的可变区通常都包含FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。
本领域知晓,并非完整的四聚体才能发挥抗体的功效,包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')或F(ab')2、纳米抗体(VHH)、单链抗体(scFv)等形式的抗体均可发挥特异性结合抗原的功效。
在一些实施例中,所述抗HPV 59抗体的重链可变区的氨基酸序列可以包括:a)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列;或b)与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有80%以上同源性、且具有a)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。
在一些实施例中,所述抗HPV 59抗体的轻链可变区的氨基酸序列可以包括:c)如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列;或d)与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有80%以上同源性、且具有c)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。
两个多肽序列之间的“同源性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“同源性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的同源性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如,氨基酸序列同源性通常使用序列分析软件来测量。例如,可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定同源性。
在一些实施例中,所述抗HPV 59抗体可以为鼠源抗体。在一些实施例中,所述抗HPV 59抗体可以为单克隆抗体。在一些实施例中,所述抗HPV 59抗体可以为单链抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体,即构成该群体的各种抗体是相同的,除了通常以极少量存在的可能的天然存在的突变体。单克隆抗体具有高度特异性,即针对抗原上的单个表位。此外,不同于包含针对不同决定区(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂,每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定区。除了它们的特异性外,单克隆抗体的一个优点是,它们现在可以在合成时不受其他抗体的污染。修饰词“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的性质,不应解释为需要任何特定的方法来产生抗体。
本文中的单克隆抗体明确地包括“嵌合”抗体,其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的相应序列相同或同源,剩余部分与衍生自另一特定物种或属于另一特定抗体类型或亚型的相应序列相同或同源,以及这些抗体的片段,只要它们表现出所需的生物活性即可。
本申请还提供一种分离的多核苷酸,编码上述的抗HPV 59抗体。
多核苷酸是指通常从一个脱氧核糖或核糖连接至另一个脱氧核糖或核糖的核苷酸的聚合物,且取决于上下文,其指DNA以及RNA。本申请中的多核苷酸并不包含任一大小限制,并且也包括包含修饰,特别是包含修饰的核苷酸的多核苷酸。在一些实施例中,多核苷酸可以是RNA、DNA或cDNA等。提供所述分离的多核苷酸的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的,例如,可以通过自动DNA合成和/或重组DNA技术等制备获得,也可以从适合的天然来源加以分离。
本申请还提供一种表达载体,含有上述的分离的多核苷酸。
本文中的“载体”是指能携带至少一个多核苷酸片段的多核苷酸。载体可以将核酸的片段、各个多核苷酸递送到宿主细胞中。它可以包含至少一种包含调节序列的表达盒,用于正确地表达掺入其中的多核苷酸。待引入到细胞中的多核苷酸(例如编码目的产物或选择标记的多核苷酸)可以插入到载体的表达盒中以从其表达。根据本申请的载体可以以环状或线性(线性化)形式存在,并且也包括载体片段。术语“载体”也包含允许转移外源核酸片段的人工染色体或类似的各个多核苷酸。
本申请还提供一种抗体的表达系统,所述表达系统含有上述的表达载体或基因组中整合有外源的上述的多核苷酸。
所述表达系统可以是宿主细胞,所述宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞、丝状真菌细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS、293细胞或Bowes黑素瘤细胞等动物细胞。将表达载体导入宿主细胞的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的,例如,可以显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等方法。表达系统的选择取决于多种因素,包括细胞生长特性、表达水平、胞内和胞外表达、目的蛋白质的翻译后修饰和生物学活性,以及在生产治疗性蛋白质中的监管问题和经济考虑。
本申请还提供一种制备上述的抗HPV 59抗体的方法,其包括,在允许所述抗体表达的条件下,培养上述的表达系统中的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。
本申请还提供一种检测试剂盒,所述检测试剂盒包括上述的抗HPV 59抗体。
在一些实施例中,所述检测试剂盒可以为酶联免疫试剂盒。
术语“试剂盒”是指相关组分的包装集合,如一种或多种多核苷酸或组合物,以及一种或多种相关材料,如递送装置(例如,注射器)、溶剂、溶液、缓冲液、说明书或干燥剂。
在一些实施例中,所述试剂盒中可根据需要包括:容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等,本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。
本申请还提供上述的抗HPV 59抗体、多核苷酸、表达载体、表达系统或检测试剂盒在肿瘤诊断药物筛选或质控、肿瘤治疗药物筛选或质控、肿瘤预防药物筛选或质控中的用途,或在制备肿瘤诊断或治疗药物中的用途。
在一些实施例中,所述肿瘤可以为宫颈癌或宫颈癌前病变。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
本申请实施例使用的抗HPV 59抗体是杂交瘤细胞株产生的。基于实施例6提供的序列,本申请实施例的抗体也可以采用现有技术中体外重组表达获得。
实施例1-免疫印迹法检测抗HPV 59抗体
实验步骤如下:配制10%凝胶,分别取300μl HPV 59L1原液加60μl 6×上样缓冲液混匀,100℃水浴煮沸5分钟,10000转/分离心5分钟,上样,浓缩胶电压100V,分离胶电压120V。SDS-PAGE湿法转膜条件:100V,90min;5%奶粉封闭过夜;含有编号分别为1-18的不同单克隆抗体的细胞上清作为一抗,按1:20稀释,孵育温度为室温,时间为20h。羊抗小鼠HRP(BIO-RAD批号L1706516)按1:1000稀释作为二抗,室温孵育3小时;显色:DAB显色,并用水终止。
如图2所示,结果表明:识别HPV 59L1的30株单克隆抗体中11、17、18、29号共4株为线性表位,其它26株均为空间表位。
实施例2-抗体的亚型之间的交叉特异性鉴定
HPV亚型种类多达200种以上,因为生产HPV多价疫苗时需要对各亚型进行鉴别试验,这样各亚型抗原含量检验时不存在相互交叉的反应以保证每个亚型抗原含量检验结果的准确性。本实验对于HPV17种亚型进行鉴定,确定此单克隆抗体对HPV 59为阳性,而对于其它16种亚型均为阴性。
实验步骤:
包被:用碳酸盐包被液按稀释倍数稀释纯化兔抗HPV6L1、11L1、16L1、18L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1、35L1、39L1、51L1、53L1、56L1、66L1、68L1,100μl/孔加入酶标板,2~8℃放置过夜。
封闭:300μl/孔洗涤液洗板5次,每孔加入200μl封闭液(5%脱脂奶粉-PBS),置37±2℃封闭2小时。
加样:300μl/孔洗涤液洗板5次;各亚型原液稀释至40μg/ml;100μl/孔加样;37±2℃温育1小时。
加一抗:300μl/孔洗涤液洗板5次。细胞上清分别用稀释液按1:100稀释后,100μl/孔分别加入酶标板37±2℃孵育1小时。
加酶标抗:300μl/孔洗涤液洗板5次。用稀释液5000倍稀释HRP-山羊抗小鼠lgG,100μl/孔加入酶标抗,37±2℃孵育1小时。
显色:300μl/孔洗涤液洗板5次,100μl/孔加入新鲜配制的显色液,37±2℃避光保温10min。
终止读数:将终止液以50μl/孔加至板内,稍振荡混匀后,用酶标仪读数,测定波长450nm,参比波长620nm。结果如表1和表2所示。
表1
表2
结果表明:16株单克隆抗体,抗体编号为3、17、6、11、30在HPV59L1亚型显色结果呈阳性;与其余亚型显色结果呈阴性,无交叉反应。其他11株单克隆抗体均与其它16种亚型或者有交叉。
实施例3-抗体的亚型鉴定
包被:用磷酸盐包被液按5μg/孔稀释HPV 59L1原液,100μl/孔加入酶标板,2~8℃放置过夜。
封闭:300μl/孔洗涤液洗板5次,每孔加入200μl封闭液(5%脱脂奶粉-PBS),置37℃封闭2小时。
加样:300μl/孔洗涤液洗板5次,HPV59L1细胞上清编号:3、17、6、11、30;分别按1:10和1:100稀释。100μl/孔加样;37℃温育1小时。
加酶标抗:300μl/孔洗涤液洗板5次。用稀释液5000倍稀释HRP-山羊抗小鼠lgG,100μl/孔加入酶标抗;用稀释液2000倍稀释Goat anti-mouse-lgG1-HRP、Goat anti-mouse-lgG2a-HRP、Goat anti-mouse-lgG2b-HRP,100μl/孔加入酶标抗,37℃孵育1小时。
显色:300μl/孔洗涤液洗板5次,100μl/孔加入新鲜配制的显色液,37℃避光保温10min。
终止读数:将终止液以50μl/孔加至板内,稍振荡混匀后,用酶标仪读数,测定波长450nm,参比波长620nm。
结果表明:HPV 59L11细胞上清编号3、7、11、30较偏重于lgG2a;HPV59L1细胞上清编号6较偏重于lgG1。
实施例4-抗体的中和活性检测
通过假病毒中和法检测各株单克隆抗体的中和抗体效价。
细胞铺板:将293FT细胞按1.5×104/well的密度预铺于96孔细胞培养板中,每孔体积为100μl,37℃,5% CO2培养箱中培养至细胞贴壁。将含各株抗体的细胞上清液分别用完全培养基进行连续倍比稀释适当稀释倍数。
中和:在60μl血清稀释液中加入60μl假病毒稀释液,混匀后置于25±2℃恒温培养箱中孵育60±2分钟。
加样:准确吸取血清-假病毒混合液100μl,缓慢小心加入96孔预铺的细胞板中。
培养:于37℃,5% CO2培养箱中培养68~76小时后用倒置荧光显微镜观察结果。中和假病毒对照荧光数50%的最大稀释倍数即为中和抗体效价。
表3细胞上清液中和抗体效价
编号 | 中和抗体效价 |
1 | <40 |
2 | <40 |
3 | <40 |
5 | <40 |
6 | 80 |
9 | 160 |
11 | <40 |
13 | 80 |
17 | <40 |
18 | <40 |
19 | <40 |
22 | <40 |
24 | <40 |
26 | <40 |
29 | <40 |
30 | 320 |
如表3所示,结果表明:HPV 59L1的16株单克隆抗体中,6、9、13、30具有中和活性。
实施例5-HPV 59体外相对效力测定单克隆抗体的筛选
包被:用包被液按一定稀释倍数适当稀释HPV 59L1兔抗,100μl/孔加入酶标板,2~8℃放置过夜或37±2℃2小时。
封闭:300μl/孔洗涤液洗板6次,每孔加入200μl封闭液,置37±2℃封闭2小时。
样品、参考品处理及加样:300μl/孔洗涤液洗板6次。重组人乳头瘤病毒68L1原液、参考品用稀释液预稀释适当倍数后,按2倍或适当倍数递增稀释9~11个稀释度,100μl/孔加入酶标板,每个稀释度供试品溶液测定双复孔,37±2℃孵育1小时。
加一抗:300μl/孔洗涤液洗板6次。用稀释液按适当稀释倍数稀释HPV 59单抗,100μl/孔加入酶标板,37±2℃孵育1小时。
加酶标二抗:300μl/孔洗涤液洗板6次。用稀释液适当倍数稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L),100μl/孔加入酶标板,37±2℃孵育1小时。
显色:300μl/孔洗涤液洗板6次,100μl/孔加入新鲜配制的显色液,37±2℃显色5~20分钟。
终止读数:将终止液以50μl/孔加至板内,稍振荡混匀后,用酶标仪读数,测定波长为450nm,参比波长620nm。
数据分析:使用软件SoftMax Pro软件分析,选择四参数拟合(4-parameter)浓度为X轴,吸光度值做Y轴拟合曲线,拟合方程为Y=(A-D)/(1+(X/C)∧B)+D,C值即为供试品EC50。
表4单克隆抗体的EC50值汇总表(单位:μg/ml)
编号 | HPV 59-1 | 编号 | HPV 59-2 | 编号 | HPV 59-3 |
1 | 0.256 | 7 | 15.5 | 13 | 0.684 |
2 | 4.78 | 8 | 4.44 | 14 | 6.66 |
3 | 0.29 | 9 | 0.449 | 15 | / |
4 | 8.48 | 10 | / | 16 | 14.7 |
5 | 1.47 | 11 | 0.705 | 17 | 0.625 |
6 | 0.336 | 12 | 0.0539 | 18 | / |
编号 | HPV 59-4 | 编号 | HPV 59-5 | / | / |
19 | 1.71 | 25 | 45.3 | ||
20 | 1.98 | 26 | 0.242 | / | / |
21 | 17.2 | 27 | 1.63 | / | / |
22 | 2.34 | 28 | 2.66 | / | / |
23 | 9.12 | 29 | 0.401 | / | / |
24 | 2.09 | 30 | 0.811 | / | / |
如表4(表4中HPV 59-1、HPV 59-2、HPV 59-3、HPV 59-4、HPV 59-5代表5块不同的酶标板号,每块酶标板上做6个单克隆抗体)、图2~图7所示,结果表明:HPV59L1的30株单克隆抗体中,编号为1、3、6、9、11、12、13、17、26、29、30的单克隆抗体的EC50值较低,适合用于抗原的体外相对效力测定。
综合以上所有实验,选择编号为30的单克隆抗体应用于体外相对效力测定试剂盒。
实施例6-HPV 59编号为30单克隆抗体的序列测定
HPV 59编号为30单克隆抗体记为代号:59H30,细胞培养后分别提取mRNA进行可变区序列测定(送检至第三方公司检测),并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基酸序列如下:
CDRH1序列:GLY TYR THR PHE THR ASP TYR SER(SEQ ID NO:1)
CDRH2序列:ILE ASN THR GLU THR GLY GLU PRO(SEQ ID NO:2)
CDRH3序列:THR ARG ASP GLY TYR VAL TRP TYR PHE ASP VAL(SEQ ID NO:3)
CDRL1序列:SER SER VAL ASN TYR(SEQ ID NO:4)
CDRL2序列:ALA THR SER(SEQ ID NO:5)
CDRL3序列:GLN GLN TRP SER SER ASN PRO ILE PHE THR(SEQ ID NO:6)
59H30 VH:
CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATACCTTCACAGACTATTCAATGCACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGTGAGCCAACATATGCAGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAATTGAGGACACGGCTACATATTTCTGTACTAGGGATGGTTACGTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCACAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATACCTTCACAGACTATTCAATGCACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGTGAGCCAACATATGCAGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAATTGAGGACACGGCTACATATTTCTGTACTAGGGATGGTTACGTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:7)
59H30 VL:
CAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTTAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCAATATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTTAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCAATATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGG AAATAAAA(SEQ ID NO:8)
59H30 VH:
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKIEDTATYFCTRDGYVWYFDVWGAGTTVTVSSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKIEDTATYFCTRDGYVWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:9)
59H30 VL:
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPIFTFGSGTKLEIKQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPIFTFGSGTKLEIK(SEQ IDNO:10)
实施例7-抗HPV 59抗体的重组表达
根据抗体基因序列合成基因,将含有抗体基因的表达载体pTT5转染至哺乳动物细胞HEK293。收获培养瓶生长的含有抗体克隆的哺乳动物细胞上清液,使用protein A柱纯化,并且使用100mM醋酸pH3.0洗脱抗体蛋白。然后将纯化的抗体蛋白上样到分子排阻层析柱上进一步分离纯化。将对应于单体的抗体蛋白配制于PBS缓冲液中,配制品缓冲液补充有20%甘油。
抗HPV59抗体的体外重组表达、纯化、亲和力测定等均可以采用现有技术中的实验步骤进行。
上文已对基本概念做了描述,显然,对于本领域技术人员来说,上述详细披露仅仅作为示例,而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明,本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议,所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时,本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此,应强调并注意的是,本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外,本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字,应当理解的是,此类用于实施例描述的数字,在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明,“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20%的变化。相应地,在一些实施例中,说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值,该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中,数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值,在具体实施例中,此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
最后,应当理解的是,本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此,作为示例而非限制,本说明书实施例的替代可视为与本说明书的教导一致。相应地,本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。
Claims (10)
1.一种抗HPV 59抗体,所述抗HPV 59抗体包括重链可变区和轻链可变区,所述抗HPV59抗体的重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR-H2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR-H3;
和/或,所述抗HPV 59抗体的轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR-L2和氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR-L3。
2.如权利要求1所述的抗HPV 59抗体,其特征在于,所述抗HPV 59抗体的重链可变区的氨基酸序列包括:
a)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列;或
b)与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有80%以上同源性、且具有a)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列;
和/或,所述抗HPV 59抗体的轻链可变区的氨基酸序列包括:
c)如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列;或
d)与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有80%以上同源性、且具有c)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列;
和/或,所述抗HPV 59抗体为单克隆抗体。
3.一种分离的多核苷酸,编码如权利要求1或2所述的抗HPV 59抗体。
4.一种表达载体,含有如权利要求3所述的分离的多核苷酸。
5.一种抗体的表达系统,所述表达系统含有如权利要求4所述的表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求3所述的多核苷酸。
6.一种制备如权利要求1或2所述的抗HPV 59抗体的方法,其包括,在允许所述抗体表达的条件下,培养如权利要求6所述的表达系统中的宿主细胞,和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。
7.一种检测试剂盒,所述检测试剂盒包括如权利要求1或2所述的抗HPV 59抗体。
8.如权利要求7所述的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒为酶联免疫试剂盒。
9.如权利要求1或2所述的抗HPV 59抗体、权利要求3所述的多核苷酸、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的表达系统或权利要求7或8所述的检测试剂盒在肿瘤诊断药物筛选或质控、肿瘤治疗药物筛选或质控、肿瘤预防药物筛选或质控中的用途,或在制备肿瘤诊断或治疗药物中的用途。
10.如权利要求9所述的用途,其特征在于,所述肿瘤为宫颈癌或宫颈癌前病变。
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