CN108794623B - 一种抗hpv16 e6蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株抗HPV16 E6蛋白的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体的特征为具有氨基酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示的重链可变区、具有氨基酸序列如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14所示的轻链可变区。免疫印记实验显示该抗体能特异识别重组的HPV16 E6蛋白以及表达HPV16 E6蛋白的宫颈癌组织。该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色(IHC)、酶联免疫吸附(ELISA)或免疫印迹(Western Blot)方式检测细胞中HPV16 E6蛋白的表达水平，可特异性诊断HPV16病毒，这为在蛋白水平上检测HPV16型病毒提供了新手段，并可用于人类生殖系统传染性疾病及其肿瘤的研究，亦可用于食管癌、乳腺癌、肛门癌等相关恶性肿瘤的研究。

Description

一种抗HPV16 E6蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种可以识别人HPV16 E6蛋白质分子的单克隆抗体及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系。
背景技术
子宫颈癌是第二位常见女性恶性肿瘤，全球每年大约有50万女性被诊断为宫颈癌，其中超过半数的女性因此而死亡。宫颈癌早期症状并不明显，发展过程中存在较长的、可逆转的癌前病变期。据统计，约20％的低度宫颈损伤将转变为高度损伤，如果不及时治疗，其中30％将会进一步转为为恶性肿瘤。从一般的宫颈癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间，在这期间若能及早诊断癌前病变，即可以预防癌症的发生。
1976年德国科学家Harald Zur Hausen提出HPV可能是性传播致癌因素之后，HPV感染与宫颈癌关系的研究成为肿瘤病毒病因研究的热门课题。2008年Haraldzur Hausen因证明了HPV病毒是导致宫颈癌的病原体而获得了诺贝尔生理医学奖。资料显示，99.6％宫颈癌因HPV(人乳头瘤病毒)感染引起。HPV与宫颈癌发生具有密切关系，国际医学权威已经证实目前世界上唯一可以早期发现并且治愈的癌症就是宫颈癌。高危型HPV感染是导致宫颈癌的主要原因，因为几乎在所有的宫颈癌标本中都可以检测到高危型HPV的存在。一百多种HPV中有15种属于高危型，持续感染高危型HPV者患宫颈癌的概率可达未感染者的250倍，16型和18型HPV与70％宫颈癌发病有关，其中HPV16最为常见，50％～60％的宫颈癌病例中可以发现它的存在。在美国，口腔肿瘤中HPV16阳性率亦达75％；其他肿瘤，如食管癌，阴茎癌，膀脱癌等亦与HPV16有紧密联系，感染是导致宫颈癌的主要原因。
E6蛋白主要作用于P53蛋白，P53蛋白是p53基因的表达产物。P53是细胞周期调控的重要负调节因子，参与调控细胞周期、修复损伤的DNA、诱导细胞分化、引发细胞凋亡等重要的生物学功能的行使。P53蛋白的主要功能是调控细胞周期最关键的两个关卡，即G1/S和G2/M期。细胞DNA受到损伤时，P53激活p21，抑制细胞从G1期进入S期，修复损伤的DNA，完成修复后细胞才能进入下一阶段的复制过程，有效地避免了DNA信息错误的累积。若DNA损伤过重，P53激活细胞凋亡相关基因(Bak，bax-1和fas受体基因等)，诱导细胞凋亡。在HPV感染的细胞中，E6蛋白与E6相关蛋白(E6-AP)结合，激活蛋白泛素化途径进而降解P53蛋白，使细胞DNA受损时无法正常修复或者引发细胞程序性死亡，从而引起细胞生长周期的正常调控异常，细胞无限增殖并向恶性转化，成为永生化细胞。除此之外，E6蛋白与含PDZ结构域蛋白相互作用并使其降解，从而促进细胞转化及肿瘤的形成。E6蛋白与NFX1-91相互作用，激活端粒逆转录酶(human TelomeraseReverse Transcriptase，hTERT)活性，促进细胞永生化。研究表明，约85％的癌细胞中可发现端粒逆转录酶活性增加，因此端粒逆转录酶可以看做是否癌变的关键指标之一。随着宫颈病变的进展，E6蛋白激活端粒逆转录酶的阳性率及活性值呈逐渐升高的趋势，这可以提示宫颈癌变的早期发生。此外，E6蛋白还有助于评估宫颈癌的发生的危险性，因为E6在HPV感染极大多数宫颈癌及癌前期病变中均持续表达，而在正常组织中不表达。
高危型HPV16型在感染后，其基因整合到人的基因中，其中的E6致癌基因可在宫颈癌组织中持续表达E6蛋白，E6蛋白可特异性的诱导免疫反应，并且具有更强的免疫原性。目前认为HPV病毒E6检测可作为宫颈癌诊断、疗效观察和预后的标志物。然而目前对于HPV16E6抗原抗体的检测研究还较少，因此表达HPV16E6抗原、制备特异性针对HPV16 E6的抗体对于宫颈癌的筛查、诊断具有重大意义，亦可用于人类生殖系统传染性疾病及其肿瘤的研究，以及食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤的研究。目前，在市面上还没有小鼠抗HPV16 E6蛋白特异的抗体，而在市面销售的小鼠单抗仅美国Santa Cruz公司的sc-460是HPV16 E6/18 E6抗体能同时检测HPV16 E6和HPV18 E6两种蛋白，但特异性并不高；而另外一家是美国Abbiotec公司的兔单抗251401，他们公司只提供一张IHC的图片，没有提供应用于wb的相关图片。因此，本领域迫切需要研制出一种特异性高、亲和力好、市场应用范围广的小鼠抗HPV16 E6蛋白特异性抗体用于HPV16 E6蛋白的检测。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种抗HPV16 E6蛋白分子(序列如SEQ ID NO：2所示)中的多肽片段(序列如SEQ ID NO：1所示)和HPV16 E6蛋白分子的单克隆抗体，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色(IHC)、酶联免疫吸附(ELISA)或免疫印迹(Western Blot)方式检测细胞中HPV16 E6蛋白的表达水平，从而用于对宫颈癌、食管癌、乳腺癌肿瘤进行诊断的方法中。
本发明的第一方面提供了一种特异性结合HPV16 E6蛋白的单克隆抗体，所述抗体：
(i)结合具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
(ii)包含至少一个选自以下的互补决定区：
a.HPV16 E6 CDRH1，其具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
b.HPV16 E6 CDRH2，其具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
c.HPV16 E6 CDRH3，其具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列；
d.HPV16 E6 CDRL1，其具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列；
e.HPV16 E6 CDRL2，其具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列；
f.HPV16 E6 CDRL3，其具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在本发明的一种优选实施方案中，本发明的抗体的特征在于：
a.HPV16 E6 CDRH1由SEQ ID NO：3的DNA序列编码；
b.HPV16 E6 CDRH2由SEQ ID NO：5的DNA序列编码；
c.HPV16 E6 CDRH3由SEQ ID NO：7的DNA序列编码；
d.HPV16 E6 CDRL1由SEQ ID NO：9的DNA序列编码；
e.HPV16 E6 CDRL2由SEQ ID NO：11的DNA序列编码；
f.HPV16 E6 CDRL3由SEQ ID NO：13的DNA序列编码。
在本发明的一种优选实施方案中，抗体具有范围为1-10nM的针对HPV16 E6蛋白的亲和力。
在本发明的一种优选实施方案中，抗体是Fab′2、F′(ab)2、Fv、纳米抗体、单链抗体或双抗体。
本发明的第二方面提供了一种特异性结合HPV16 E6蛋白的单克隆抗体，其重链可变区的CDRH1为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，CDRH2为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，CDRH3为SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，其轻链可变区的CDRL1为SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，CDRL2为SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，CDRL3为SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
在本发明的一种优选实施方案中，抗体包含：
(1)重链可变区，所述重链可变区的DNA序列或氨基酸序列是分别具有与SEQ IDNO：15或SEQ ID NO：16至少85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或DNA序列；和
(2)轻链可变区，所述轻链可变区的DNA序列或氨基酸序列是分别具有与SEQ IDNO：17或SEQ ID NO：18至少85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或DNA序列。
在本发明的一种实施方案中，抗体为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。
在本发明的一种实施方案中，单克隆抗体具有范围为1-10nM的针对HPV16 E6蛋白的亲和力。
本发明的第三方面提供了上述抗体在制备免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法中用于检测肿瘤及正常组织细胞中的HPV16 E6表达情况的免疫组化病理诊断剂上的应用。
本发明的第四方面提供了上述抗体在制备用于治疗宫颈癌、食管癌、乳腺癌的免疫治疗药物上的应用。
本发明的第五方面提供了一种分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞系CCTCC NO：C2018152。
附图说明
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
图1示出了制备的多肽抗原通过HPLC进行纯度分析图。
图2示出了制备的多肽抗原通过ESI质谱进行分子量确认的图。
图3示出了杂交瘤细胞融合后的生长状况。
图4示出了用Western Blotting检测本发明抗体的特异性的图。
图5示出了用本发明抗体通过IHC检测确定人宫颈癌组织中HPV16 E6蛋白的组织定位图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明进行详细说明。以下实施方式将有助于本领域技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例
实验所用试剂：Fmoc保护的氨基酸(购自北京博迈杰公司，如表1所示)、水性佐剂(购自北京博奥龙公司，Cat.No KX0210042)、HAT培养基(购自Sigma公司NO.H0262)、1640基础培养液(GIBCO公司，NO：11875085)、羊抗鼠IgG-HRP抗体(北京索莱宝NO.SE131)、胎牛血清(购自GIBCO公司，NO：10099101)、DMSO(购自Sigma公司，NO.D2650)、50％PEG(购自Sigma公司分子量1450，NO.P5402)、DMEM培养基(购自GIBCO公司，NO.10569044)。
表1 Fmoc保护的氨基酸
品名 CAS号 批号 厂家
Fmoc-Arg(Pbf)-OH 154445-77-9 20170428 北京博迈杰公司
Fmoc-Asp(OtBu)-OH 71989-14-5 20170420 北京博迈杰公司
Fmoc-Cys(trt)-OH 103213-32-7 20170313 北京博迈杰公司
Fmoc-Glu(otBu)-OH 71989-18-9 20170315 北京博迈杰公司
Fmoc-Leu-OH 35661-60-0 20170321 北京博迈杰公司
Fmoc-Lys(Boc)-OH 71989-26-9 20170412 北京博迈杰公司
Fmoc-Pro-OH 71989-31-6 20170307 北京博迈杰公司
实施例1抗HPV16 E6蛋白的单克隆抗体的制备和纯化
本实施例通过杂交瘤技术制备了由保藏号为CCTCC NO：C2018152的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，并对其进行大量制备和纯化。
1、抗原制备
1.1多肽抗原筛选通过AbDesigner和DNASTAR软件分析HPV16 E6蛋白的全长序列，对蛋白质氨基酸二级结构、亲疏水性、抗原性等方面进行分析；再进一步对蛋白的立体结构进行分析，经过blast在数据库里比对这些序列的特异性，最后筛选出HPV16 E6蛋白的优秀的多肽抗原决定簇序列(SEQ ID NO：1)
SEQ ID NO：1：DPQERPRKLPQLC。
1.2合成多肽抗原
采用Fmoc保护的多肽固相合成方法对选取的多肽序列进行合成；合成好的多肽树脂直接用TFA裂解切割，合成肽链采用高效液相色谱进一步的精制、分离与纯化(如图1所示)，并冻干。最后纯化好的多肽需要进行质谱分析确认分子量(如图2所示)；
1.3抗原偶联
化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而需要与载体蛋白偶联一起免疫动物。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激辅助性T细胞，进而诱导B细胞反应。用于与多肽偶联的载体蛋白有多种，其中最常用的是KLH(keyhole limpet hemacyanin)，KLH具有更高的抗原性，是最为常用的多肽偶联载体。通过先使用SMCC法活化KLH(Thermofisher公司，货号.22322)，按照说明书操作；然后再偶联多肽，制备出完整的抗原，以备免疫。
2、动物免疫
2.1首先，取适量抗原(约100ug)与等体积的水性佐剂(北京博奥龙公司，Cat.NoKX0210042)混合，免疫动物为4-6周龄的雌性BALB/c鼠。免疫前采小鼠阴性血清，以作对照使用。按指定的免疫计划免疫动物(4周+3周+3周的免疫方式)，抗原免疫5只小鼠。
2.2免疫方案及程序为：后腿肌肉注射水性佐剂混合的抗原100ug/只；
2.33周后用同样水性佐剂混合等量抗原，后腿肌肉注射；
2.4间隔3周后，三免，200ug/只；7-10天后对小鼠采血，用ELISA法检测血清中抗体的效价，选择效价超过1×104的阳性小鼠中效价最高的小鼠，在融合前三天通过腹腔注射200ug的未偶联多肽进行加强免疫，不加佐剂。
3、细胞融合
3.1骨髓瘤(SP2/0)细胞活化：解冻并复苏SP2/0细胞，随后重悬于添加胎牛血清(GIBCO公司，NO：10099101)的1640基础培养液(GIBCO公司，NO：11875085)中，置于37℃、5％CO2条件下培养箱培养；3-5d后进行传代；收集细胞并悬浮于1640基础液中，计数后取0.5～1×106个注射于BALB/c小鼠背部皮下，持续培养9～10d。待背部肿瘤体积增大至直径约0.8cm，将小鼠拉颈处死，75％酒精浸泡5min后无菌操作取瘤。剪下肿瘤块置于灭菌的匀浆器中，添加1640基础液充分研磨后补加10mL 1640液，静置2min，吸取上层的细胞悬液置于另一离心管中，再补加10mL1640液，重复研磨两次；将上述取得的细胞悬液于1000r/min离心10min去上清，随后重悬于30mL基础1640液中。于另一离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液小心置于分离液之上；随后1200r/min离心15min，吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，使用1640液清洗细胞2遍后重悬于10mL 1640液中，计数后备用。
3.2免疫脾细胞的制备：取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，于75％酒精中浸泡5-10min消毒，随后将其固定于解剖板上进行解剖，取出脾脏并剪破，置于灭菌的匀浆器中；研磨及细胞悬液制取方法同SP2/0所述，计数后备用。
3.3饲养细胞的制备：取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。向小鼠腹腔内注入2～3mL 1640基础液，吹打后吸出置于另一离心管中备用，该液中含有腹腔巨噬细胞。同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。1000r/min离心10min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃，5％CO2培养箱中待用。
3.4融合及选择性培养：
将1～2×107个SP2/0与108个免疫细胞于50mL离心管中混匀，1000r/min，离心8min。弃净上清后将装有细胞混合物的离心管置于37℃水浴中，随后加入预温至37℃的50％PEG(sigma)0.8mL，搅拌后静置30s。静置后加入37℃预温的1640基础液10ml。混匀后1000r/min离心5min，弃上清于37℃放置5-8min。随后与饲养细胞悬浮液混合，分种于96孔培养板中，250ul/孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养。融合3天后用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换HAT培养基继续培养。加入200μL含饲养细胞和1％HAT(Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HAT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养(如图3所示)，液氮冷冻保存。
待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，用ELISA进行抗体检测。
3.5杂交瘤阳性克隆的筛选和细胞的克隆化用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，其步骤如下：
3.5.1包被已知抗原：用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至1-10ug/ml；向微孔中每孔加100ul，轻轻摇匀，4℃冰箱过夜或37℃1h；甩掉孔内液体；洗涤3次，每次2～3分钟。
3.5.2封闭酶标孔中没被抗原包被的位置：向微孔中每孔加200ul封闭液(5％的脱脂奶粉(BD公司，No.232100)或者0.1％的BSA(sigma公司，No.B2064)，轻轻摇匀，37℃1h；甩掉孔内液体；逐孔加满洗涤缓冲液，静置2～3min，甩掉孔内液体，拍干，用此法先用洗涤缓冲液洗3次。加样：将待测的杂交瘤每孔取50ul上清液按顺序加入酶标孔中，轻轻摇匀，37℃1h，洗涤，拍干。
3.5.3加酶标抗抗体：先用稀释液将酶标第二抗体按说明稀释至工作浓度，每孔加入100ul，轻轻摇匀，置37℃1h；然后洗涤，拍干。加TMB显色液(Solarbio，货号：PR1200)：每孔加新鲜配置的显色液100ul，轻轻摇匀，37℃，10min。终止反应：每孔加终止液50ul。
3.5.4结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
4、杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)：
克隆前制备小鼠饲养细胞层；将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞数；将细胞用完全培养基稀释到5、10、30个细胞/毫升；
将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板，100ul/孔，使相应的每孔分别含0.5、1和3个细胞。培养到第4天补液一滴，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录；
5、特异性抗体的检测：
在克隆后第7～9天，细胞克隆长满1/3-1/2个视野时，即可检测；阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的细胞生长良好时，可腹腔接种小鼠采制腹水，最终获得一株杂交瘤细胞株(于2018年6月24日在中国典型培养物保藏中心获得保藏号CCTCC NO：C2018152)。
6、单克隆抗体的大量制备：
对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数2～5×105，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。
7、单克隆抗体的纯化：
用HiTrapr Protein AFF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，BCA法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。用间接ELISA测定效价。
实施例2抗HPV16 E6蛋白的单克隆抗体的特性鉴定
本实施例鉴定了本发明制备的单克隆抗体的亚型并测试了其对HPV16 E6蛋白结合的亲和常数。
1亚型鉴定：用100mM PBS(pHT.4)稀释包被羊抗鼠IgG(BD公司，NO.KW09JL0510)，根据产品说明书操作。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。
2亲和常数测定：
包被合成多肽(SEQ ID NO：1)，包被浓度为1μg/ml，100μL/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μL封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。以上第7步中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μL含0.1％TMB和0.03％H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μL 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数：
亲和常数≈(150000×A)/抗体初始浓度
计算得出其亲和力常数为3.75×109，表明本发明的单克隆抗体的对HPV E6抗原的亲和力好，性质稳定。
实施例3抗HPV16 E6抗原的单克隆抗体的反应特异性
本实施例应用免疫印记法测试了本发明制备的单克隆抗体对HPV16 E6蛋白的反应特异性。
选择Caski、Hela细胞裂解蛋白和原核重组蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：每种重组蛋白上样10ng，进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体(约1mg/ml，按1∶1000稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T溶液洗膜后，加入1∶5000稀释的羊抗鼠二抗(北京索莱宝科技有限公司，No.SE131)，室温孵育1小时。再次TBS-T洗膜，加入ECL超敏显色液(北京索莱宝科技有限公司，No.PE0010)，以ChemiDoc MP多色荧光成像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。实验结果显示该发明抗体能够高度特异的识别HPV16 E6蛋白(CaSki细胞系是从宫颈癌的小肠肠系膜转移灶建立的，含有完整的HPV16病毒基因组(每个细胞大约600个拷贝)，而不识别HPV18蛋白(Hela细胞是HPV18阳性株)(如附图4所示)，表明本发明的单克隆抗体对HPV16 E6蛋白具有高特异性。
实施例4抗HPV16 E6蛋白的单克隆抗体的应用于IHC染色及分析
本实施例应用本发明制备的单克隆抗体作为免疫组化(IHC)技术中的一抗检测人宫颈癌组织切片中的HPV16 E6蛋白的存在。
将自制人宫颈癌组织切片用常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。在0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH：6.0)中高压2.5分钟进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H2O2孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加封闭液(动物非免疫血清)室温孵育10分钟。甩干切片，滴加1∶100稀释的一抗室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加1∶200羊抗鼠IgG-HRP二抗(北京索莱宝NO.SE131)室温孵育20-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的1∶500 DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85％(3分钟)-95％(3分钟)-100％(3分钟)-100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片，最后镜检(如图5A、5B和5C所示)，结果表明，HPV16 E6蛋白在粘膜鳞状上皮细胞胞浆和胞核中阳性表达；在固有层成纤维细胞、结缔组织则是显阴性。
本实施例表明，本发明的单克隆抗体可以用于IHC方法中鉴定宫颈组织中的HPV16型的存在，特异性良好。
实施例5本发明的抗HPV16 E6蛋白的单克隆抗体序列的测定
1.提取杂交瘤细胞总RNA：采用索莱宝科技有限公司总RNA提取试剂盒，并按照说明书操作从杂交瘤细胞中分离出总RNA；使用通用引物将总RNA逆转录成cDNA；合成cDNA：按照索莱宝反转录试剂盒合成cDNA第一条链；扩增VH、VL、CH和CL的抗体片段。将扩增的抗体片段分别克隆到克隆载体中。用菌落PCR方法筛选具有正确大小插入目的基因的克隆。每个片段要测序不少于五个具有正确大小的插入目的基因的菌落。将不同克隆的序列排列并提供一致序列。
2.得到基因测序结果：重链序列长1386bp(序列如SEQ ID NO：15所示)，编码461个氨基酸(序列如SEQ ID NO：16所示)；可变区序列长354bp(HPV16 E6 CDRH1，序列如SEQ IDNO：3所示；HPV16 E6 CDRH2，序列如SEQ ID NO：3所示；HPV16 E6 CDRH3，序列如SEQ ID NO：3所示)，编码118个氨基酸(HPV16 E6 CDRH1，序列如SEQ ID NO：4所示；HPV16 E6 CDRH2，序列如SEQ ID NO：6所示；HPV16 E6 CDRH3，序列如SEQ ID NO：8所示)；轻链序列长717bp(序列如SEQ ID NO：17所示)，编码238个氨基酸(序列如SEQ ID NO：18所示)；可变区序列长336bp(HPV16 E6 CDRL1，序列如SEQ ID NO：9所示；HPV16 E6 CDRL2，序列如SEQ ID NO：11所示；HPV16 E6 CDRL3，其具有SEQ ID NO：13的序列)，编码112个氨基酸(HPV16 E6 CDRL1，序列如SEQ ID NO：10所示；HPV16 E6 CDRL2，序列如SEQ ID NO：12所示；HPV16 E6 CDRL3，其具有SEQ ID NO：14的序列)。
生物材料的保藏
产生经过上述实施例鉴定的抗HPV16 E6蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株于2018年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)，保藏号为CCTCC NO：C2018152，分类命名为HPV16 E6杂交瘤细胞株。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京索莱宝科技有限公司
<120> 一种抗HPV16 E6蛋白的单克隆抗体及其应用
<130> 2018-06-28
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于HPV16 E6蛋白的人工序列
<400> 1
Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys
1 5 10
<210> 2
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6蛋白
<400> 2
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu
85 90 95
Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn
100 105 110
Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys
115 120 125
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met
130 135 140
Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
145 150 155
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的CDRH1的DNA序列
<400> 3
acctactgga tagag 15
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的CDRH1的氨基酸序列
<400> 4
Thr Tyr Trp Ile Glu
1 5
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的CDRH2基因序列
<400> 5
gagattttac ctggaagtgg tagtagtgac tacaatgaga gattcaaggg c 51
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的CDRH2氨基酸序列
<400> 6
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的CDRH3基因序列
<400> 7
ggagagtacc aggcctggtt tgcttac 27
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的CDRH3氨基酸序列
<400> 8
Gly Glu Tyr Gln Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 9
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的CDRL1基因序列
<400> 9
agatctagtc agagccttgt aaatagtaat ggaaacacct ttttagaa 48
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的CDRL1氨基酸序列
<400> 10
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asn Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu
1 5 10 15
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的CDRL2基因序列
<400> 11
aaagtttcca accgattttc t 21
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的CDRL2氨基酸序列
<400> 12
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的CDRL3基因序列
<400> 13
tttcaaggtt cacatgttcc gtggacg 27
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的CDRL3氨基酸序列
<400> 14
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 15
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的重链DNA序列
<400> 15
atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60
gttcagctgc agcagtctgg agctgaggtg atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc 120
tgcaaggcta ctggctacac attcagtacc tactggatag agtgggtaaa acagaggcct 180
ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt ttacctggaa gtggtagtag tgactacaat 240
gagagattca agggcaaggc cacattcact gcagatgcat cctccaacac agcctacatg 300
caactcacca gcctgacatc tgaggactct gccgtctatt actgtgcaag aggagagtac 360
caggcctggt ttgcttactg gggccagggg actctggtca ctgtctctgc agccaaaacg 420
acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480
accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540
ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600
ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660
gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720
tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780
cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840
agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900
gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960
cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020
gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080
caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140
tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200
ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1260
tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320
gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380
aaatga 1386
<210> 16
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的重链氨基酸序列
<400> 16
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Thr Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Arg Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ala Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Tyr Gln Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
130 135 140
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
145 150 155 160
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
210 215 220
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
225 230 235 240
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
245 250 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
260 265 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
275 280 285
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
305 310 315 320
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
325 330 335
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340 345 350
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
355 360 365
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
370 375 380
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
385 390 395 400
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
405 410 415
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
420 425 430
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
435 440 445
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 17
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的轻链DNA序列
<400> 17
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60
gttttgatga cacaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggaagtca agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcagag ccttgtaaat agtaatggaa acaccttttt agaatggtac 180
ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtggt tcagggacag atttcacact caagatcagc 300
agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttccgtgg 360
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420
atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480
aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540
aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600
agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660
actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717
<210> 18
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV16 E6单克隆抗体的轻链氨基酸序列
<400> 18
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Ser Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val Asn Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
165 170 175
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195 200 205
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235

Claims (9)

1.一种特异性结合HPV16 E6蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体包含由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的HPV16 E6 CDRH1，由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的HPV16 E6 CDRH2，由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的HPV16 E6 CDRH3，由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的HPV16 E6 CDRL1，由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的HPV16 E6 CDRL2，由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的HPV16 E6 CDRL3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：
a.HPV16 E6 CDRH1由SEQ ID NO:3的DNA序列编码；
b.HPV16 E6 CDRH2由SEQ ID NO:5的DNA序列编码；
c.HPV16 E6 CDRH3由SEQ ID NO:7的DNA序列编码；
d.HPV16 E6 CDRL1由SEQ ID NO:9的DNA序列编码；
e.HPV16 E6 CDRL2由SEQ ID NO:11的DNA序列编码；
f.HPV16 E6 CDRL3由SEQ ID NO:13的DNA序列编码。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其中所述抗体是Fab'2、F'(ab)2、Fv或双抗体。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含：
(1)重链可变区，所述重链可变区的DNA序列或氨基酸序列是分别具有与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16至少85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或DNA序列；和
(2)轻链可变区，所述轻链可变区的DNA序列或氨基酸序列是分别具有与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18至少85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或DNA序列。
5.根据权利要求1或4所述的单克隆抗体，其中，所述抗体为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。
6.根据权利要求1、2或4所述的单克隆抗体，其中，所述抗体具有范围为1-10nM的针对HPV16 E6蛋白的亲和力。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体在制备免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法中用于检测肿瘤及正常组织细胞中的HPV16 E6表达情况的免疫组化病理诊断剂上的应用。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体在制备用于治疗宫颈癌、食管癌、乳腺癌的免疫治疗药物上的应用。
9.一种分泌权利要求1-6中任一项所述的抗体的杂交瘤细胞系CCTCC NO:C2018152。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7125760B2 (ja) * 2019-06-14 2022-08-25 国立研究開発法人理化学研究所 免疫系を賦活化する細胞および当該細胞を含む医薬組成物
CN114075293B (zh) * 2020-08-14 2022-11-15 长沙诺盟生物医药有限公司 包含突变的hpv16 e6蛋白的融合蛋白和疫苗组合物
CN114409744B (zh) * 2022-03-29 2022-10-04 深圳吉诺因生物科技有限公司 Hpv抗原表位及其鉴定方法、应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101186636A (zh) * 2007-12-06 2008-05-28 三峡大学 人乳头瘤病毒外壳蛋白l1短肽及其应用
CN103342738A (zh) * 2013-07-24 2013-10-09 广州恒上医药技术有限公司 人乳头瘤病毒e6蛋白可诱发同源蛋白间交叉反应性抗体的精细表位肽
CN103483447A (zh) * 2012-06-08 2014-01-01 厦门大学 抗hpv l1 蛋白的广谱单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途
CN103865883A (zh) * 2014-03-26 2014-06-18 重庆理工大学 抗高危型人乳头瘤病毒蛋白的单克隆抗体及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101186636A (zh) * 2007-12-06 2008-05-28 三峡大学 人乳头瘤病毒外壳蛋白l1短肽及其应用
CN103483447A (zh) * 2012-06-08 2014-01-01 厦门大学 抗hpv l1 蛋白的广谱单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途
CN103342738A (zh) * 2013-07-24 2013-10-09 广州恒上医药技术有限公司 人乳头瘤病毒e6蛋白可诱发同源蛋白间交叉反应性抗体的精细表位肽
CN103865883A (zh) * 2014-03-26 2014-06-18 重庆理工大学 抗高危型人乳头瘤病毒蛋白的单克隆抗体及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＨＰＶ１６型Ｅ６蛋白单克隆抗体制备及检测;杨潇;《中华实用诊断与治疗杂志》;20160603;第30卷(第6期);第552-556页 *
Motif analysis of HLA class II molecules that determine the HPV associated risk of cervical carcinogenesis;KUNLEODUNSI等;《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE》;20011001;第8卷(第4期);第405-412页 *
人乳头瘤病毒16E6蛋白单克隆抗体的研制;刘培军等;《单克隆抗体通讯》;19951231;第11卷(第3-4期);第30-34页 *
抗 HPV16E6 全蛋白单克隆抗体的制备及鉴定;顾盼等;《重庆理工大学学报》;20170615;第31卷(第6期);第1674－8425页 *

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