CN115925867A - 一种肿瘤标志物单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种肿瘤标志物单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CK7蛋白的抗原多肽和使用该抗原多肽制备的单克隆抗体，所述的编码单克隆抗体1的重链可变区序列和轻链可变区序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；所述的编码单克隆抗体2的的重链可变区序列和轻链可变区序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明制备的单克隆抗体可用于CK7蛋白的检测。本发明制备的单克隆抗体具有良好的特异性、准确性和敏感性。

Description

一种肿瘤标志物单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种肿瘤标志物单克隆抗体及其应用。
背景技术
细胞角蛋白(cytokeratin CK)主要分布于上皮细胞，是角质细胞中的主要骨架蛋白，这种结构蛋白的主要功能是维持上皮组织的完整性及连续性。研究发现细胞角蛋白(CK)具有极高的保守性和组织分化特异性，与上皮细胞的增殖分化密切相关。已得到证实的细胞角蛋白有20多种。根据不同的酸碱性，可将细胞角蛋白进一步分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型细胞角蛋白偏酸性，相对分子质量偏小，主要包括CK9～CK20；Ⅱ型细胞角蛋白偏碱性，相对分子质量较大，主要包括CK1～CK8。在不同的上皮组织中，其所表达的细胞角蛋白亚型也不同细胞角蛋白是一种常用的肿瘤免疫组织化学标记物，阳性表达见于上皮细胞、间皮细胞；癌，间皮瘤等。
CK7是CK家族中的一种偏碱性的中间丝蛋白，相对分子质量大约是54KDa，在上消化道肿瘤胆管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢、子宫内膜和乳腺癌表达；主要标记腺上皮和移行上皮，卵巢、肺和乳腺上皮为CK7阳性，而结肠、前列腺和胃肠道上皮为CK7阴性，在胰腺癌、胆管癌、卵巢浆液性癌、子宫内膜样腺癌、移行细胞癌中阳性。常与CK20联合用于乳腺癌、肺腺癌与胃肠道腺癌的诊断与鉴别诊断，也可用于卵巢癌(CK7+)和结肠癌(CK7-)的鉴别。与EMA联合用于滑膜肉瘤的诊断。主要用于上皮来源的肿瘤的研究。因此，很有必要开发一种用于CK7检测的单克隆抗体，以用于CK7蛋白的临床检测。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种CK7的单克隆抗体及其制备方法；本发明的目的之二，提供了一种使用本发明制备CK7单克隆抗体检测CK7的应用。
因此，本发明一方面公开了一种CK7蛋白的抗原多肽，所述的抗原多肽包括抗原多肽1和抗原多肽2，所述的抗原多肽1和抗原多肽2的氨基酸序列为：
抗原多肽1：DVVEDFKNKYEDEINHRTAA；
抗原多肽2：QRAKLEAAIAEAEERGELAL。
另一方面，本发明还公开了一种使用所述的抗原多肽制备的单克隆抗体，所述的单克隆抗体能特异性结合CK蛋白，所述的单克隆抗体包括单克隆抗体1和单克隆抗体2，所述的单克隆抗体1的的重链可变区序列和轻链可变区序列如SEQ ID NO.1所示和SEQ IDNO.2所示；所述的单克隆抗体2的的重链可变区序列和轻链可变区序列如SEQ ID NO.3所示和SEQ ID NO.4所示。
优选地，本发明所述的单克隆抗体1的重链可变区序列包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的序列分别为：
CDR-H1：YPSFWMT；
CDR-H2：LIYPGNSDTSYNDFFKG；
CDR-H3：RSGYKYIALDY；
所述的单克隆抗体1的轻链可变区序列包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述的轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的序列分别为：
CDR-L1：RSKRAQSIVHSNGNTYEWI；
CDR-L2：KVRFS；
CDR-L3：FQGSLVPT。
优选地，本发明所述的单克隆抗体1的重链可变区序列还包含FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4，所述的重链可变区的FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4的序列分别为：
FR-H1：SVQHQQSGTMLARPSACVKMSCKASGYSFT；
FR-H2：WVKQRPGQGIEPIA；
FR-H3：KAKLTAVTSKQTAYMEWSNLTNEDSAVFYCTR；
FR-H4：EGQGTSVTVSS；
所述的单克隆抗体1的轻链可变区序列还包含FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述的轻链可变区的FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4的序列分别为：
FR-L1：DVLMTQTPLSLPVSLGQASISC；
FR-L2：FYLQKPQSPKLLIY；
FR-L3：GVPFSGSGSGTDFLKISRVEEDLGVPSSYYC；
FR-L4：FGGGTEIKRA。
优选地，本发明所述的单克隆抗体2的重链可变区序列包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的序列分别为：
CDR-H1：FYKIDE；
CDR-H2：MIDPSEDRESRLNQKFKD；
CDR-H3：SNYRYDYFV；
所述的单克隆抗体2的轻链可变区序列包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述的轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的序列分别为：
CDR-L1：SASSVSYMY；
CDR-L2：DTSNLAS；
CDR-L3：QQERSYPLDT。
优选地，本发明所述的单克隆抗体2的重链可变区序列还包含FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4，所述的重链可变区的FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4的序列分别为：
FR-H1：QVQLQQSGPELVKPGSVSCKASGYSFN；
FR-H2：WVKQRPGQGLEWIG；
FR-H3：KALTVDRSSSTAHMQCTLSSPTEDSAVYYCTR；
FR-H4：WGAGTTETTVSS；
所述的单克隆抗体2的轻链可变区序列还包含FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述的轻链可变区的FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4的序列分别为：
FR-L1：QIVLTQSPAIMSAFPDGESVTMTC；
FR-L2：WYETQKPGSSPRDLLIY；
FR-L3：GVRFSGSGSGTSYSLDTINRLESEDGATYYC；
FR-L4：FGAGTKLLKR。
再一方面，本发明还公开了一种所述的CK7蛋白抗原多肽在制备抗CK7蛋白单克隆抗体中的应用。
再一方面，本发明还公开了一种所述的单克隆抗体在制备CK7蛋白诊断试剂中的应用。
本发明公开的CK7蛋白的抗原多肽适合制备特定抗原表位的单克隆抗体，以用于临床CK7蛋白的检测。本发明制备的抗CK7蛋白抗原多肽的单克隆抗体能特异性识别CK7蛋白，且具有良好的特异性、准确性和敏感性，适用于制备不同的CK7蛋白的诊断试剂，如免疫组化、ELISA等。
附图说明
图1CK7(91aa～403aa)二级结构。
图2两株杂交瘤细胞图。
图3单克隆抗体SDS-PAGE图，其中1是单克隆抗体1，2是单克隆抗体2，M为marker。
图4单克隆抗体特异性检验图(werstern blot)，其中其中1是单克隆抗体1，2是单克隆抗体2。
图5单克隆抗体免疫组化部分结果，1是单克隆抗体1结果，2是对照抗体结果。
图6夹心ELISA检测的定标曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1：CK7抗原的制备
对CK7(UniProtKB-P08729)进行分析，去除头部和尾部，选择中间的91aa～403aa进行分析。对这段序列进行二级结构解析，结果见图1所示。结合二级结构设计多肽抗原，共设计并合成了2段抗原多肽，序列分别为：
抗原多肽1(81aa～100aa)：DVVEDFKNKYEDEINHRTAA；
抗原多肽2(238aa～257aa)：QRAKLEAAIAEAEERGELAL。
实施例2：抗CK7单克隆抗体的制备
1小鼠免疫与检测
将实施例1制备的CK7抗原多肽分别作为抗原。取6周龄雌性BALB/c小鼠5只进行免疫，共进行三次免疫，采取皮下多点注射。每次每只小鼠抗原免疫用量为25μg，初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第三次免疫用等量生理盐水混合，腹腔注射。具体免疫程序见表1。
表1制备单克隆抗体制备免疫方案
免疫次数 间隔天数 佐剂类型 免疫部位及方式
第一次 0 弗氏完全佐剂 皮下多点注射
第二次 14 弗氏不完全佐剂 皮下多点注射
第三次 14 弗氏不完全佐剂 皮下多点注射
第三次免疫后7天尾静脉采血，通过间接法测抗体效价，以此确定是否有针对抗原的抗体生成。比较5只小鼠效价，最后选择抗体效价较高的小鼠(2155-87和2155-94)用于细胞融合。具体结果见表2所示。
表2小鼠免疫后ELISA效价检测结果
Figure BDA0003936888720000051
2单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
2.1骨髓瘤细胞(Sp2/0细胞)的复苏
从液氮中取出冻存细胞,立即放入37℃水浴中融化，离心，弃上清,用少量完全培养液打散细胞团，加入约完全培养基于冻存管中，用吸管吹打均匀，全部吸出转至细胞培养瓶中,置于37℃二氧化碳培养箱中培养。待细胞长满瓶底后传至另一细胞瓶中培养,在倒置显微镜下观察其细胞状态，状态良好的细胞备做融合用。
3.2小鼠脾细胞的制备
取效价最高的小鼠(2155-87和2155-94)，眼球摘除采血,分离血清作为检测时的阳性对照血清。将小鼠颈椎脱臼致死，浸泡于酒精消毒，移入超净工作台内,固定于解剖板上，用灭菌剪刀、镊子分别剪开左侧皮肤和腹膜，无菌取出脾脏置于已盛有基础培养液的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入另一盛约有基础培养液的平皿内的滤膜中，用两个注射器上的弯针头将脾脏刺孔,然后其中一个弯针头固定滤膜，另一个弯针头挤压滤膜，使脾细胞完全释放到平皿中的基础培养液中。用无菌滴管吹打细胞制成单细胞悬液，收获脾细胞悬液。将平皿中脾细胞悬液转移到离心管中，离心，弃上清，用细胞培养液离心洗涤一次。
3.3细胞融合
使用PEG法将小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞株按照9:1的比例进行融合，将融合后的细胞用含有HAT的20％新生牛血清的完全RPMI 1640培养基重悬，然后均匀铺于96孔板内，每孔100μl，37℃，5％CO2培养。15天后改用含HT的20％犊牛血清的完全RPMI 1640培养基培养。取培养上清，用CK7抗原多肽包被的ELISA方法进行阳性克隆的检测。采用有限稀释法，将筛选出的抗体效价高、形态良好的细胞株进行克隆化培养，直至获得单克隆，扩大培养并保存杂交瘤细胞。经此步骤，每条抗原多肽均筛选了一株杂交瘤细胞，分别命名为杂交瘤细胞1(抗原多肽1免疫后筛选获得，如图2)和杂交瘤细胞2(抗原多肽2免疫后筛选获得，如图2)。
实施例3：单克隆抗体腹水制备和纯化
4.1小鼠腹水的制备
取8周龄BALB/c雌性小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7日后每只小鼠注射杂交瘤细胞0.8～1×106个，7～10日后可见小鼠腹部明显膨大，注射针头抽取小鼠腹水，4℃8000rpm离心10min，收集上清液即为单抗腹水。
4.2单克隆抗体的纯化
使用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，取1倍体积腹水加2倍体积醋酸盐缓冲液(0.06mol/L，pH值4.8)稀释，室温下边搅拌边加辛酸(30μl/ml腹水)，4℃澄清1h，12000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2h，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24h后即获纯化的腹水抗体，透析好的单克隆抗体用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，0.1ml/管。
使用BCA试剂盒(Thermo Scientific)对单克隆抗体进行浓度检测，单克隆抗体1(由杂交瘤细胞1制备)和单克隆抗体2(由杂交瘤细胞2制备)的检测结果分别为1.58mg/ml和1.36mg/ml。
使用SDS-PAGE对纯化的单克隆抗体进行检验，检测结果如图3所示，纯化后的单克隆抗体的SDS-PAGE纯度均在95％以上。
实施例4：单克隆抗体的检测
4.1单克隆抗体类型及亚类鉴定用ELISA试剂盒鉴定单抗的类型及亚类，鉴定结果显示(表3)两株单克隆抗体重链恒定区为lgG1型，轻链恒定区为Kappa型。
表3单克隆抗体类型及亚类鉴定结果
抗体亚类 单克隆抗体1 单克隆抗体2
IgG1 0.656 0.633
IgG2a 0.055 0.055
IgG2b 0.054 0.055
IgG3 0.054 0.056
IgA 0.054 0.055
IgM 0.056 0.056
Kappa 0.962 0.875
Lambda 0.053 0.058
4.2两株单克隆抗体亲和常数检测
参见CN 113061184 A第【0042】～【0044】段，使用购买的CK7重组蛋白(上海泽叶生物科技有限公司)作为包被抗原，按照此方法学对制备的2株单克隆抗体的亲和常数进行检测，结果显示，本发明制备的2株单克隆抗体的亲和常数分别为5.0×109和5.4×109。
4.3两株单克隆抗体亲可变区序列进行分析
使用Trizol试剂提取杂交瘤细胞的总RNA。使用oligo(dT)作为引物，将提取的总RNA逆转录为cDNA，获得的cDNA保存于-15℃以下。设计特异性的巢式PCR引物(CN111393525 B)，该引物序列可与抗体可变区第一框架区和恒定区互补，采用常规PCR方法扩增目的基因。经过测序，编码单克隆抗体1的重链可变区和轻链可变区的序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示。编码单克隆抗体2的重链可变区和轻链可变区的序列如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示。两株单克隆抗体的可变区氨基酸序列信息见表4所示。
表4单克隆抗体氨基酸序列信息
Figure BDA0003936888720000081
实施例5单克隆抗体的应用
5.1特异性检验
使用购买的CK7重组蛋白(上海泽叶生物科技有限公司)作为抗原进行wersternblot检测，将单克隆抗体稀释5000倍后作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG二抗稀释10000倍作为二抗，结果显示，两株单克隆抗体对CK7蛋白均具有良好的特异性(图4)。
5.2免疫组化检验
参见CN 113061184 A实施例6，按此方法，将本研究制备的两株单克隆抗体对不同小鼠肝脏组织(石蜡包埋后切片，用于免疫组化检测)进行检验，结果显示，本研究制备的两株单克隆抗体对小鼠肝脏组织中的CK7蛋白均具有良好的特异性、准确性和敏感性(图5)。
5.3夹心ELISA检测使用单克隆抗体1包被ELISA板(50ng/0.1ml/孔)，使用单克隆抗体2作为检测抗体(使用前用HRP进行标记，其中HRP标记为常规的高碘酸钠方法)，使用购买的CK7蛋白作为标准品，建立ELISA检测方法，以用于定量检测血清或组织中的CK7蛋白含量。经过调试和检测，使用本研究的两株单克隆抗体对CK7蛋白含量的检测，具有良好的特异性、准确性和敏感性，灵敏度能达到0.5ng/ml，线性范围最低为50ng/ml。其定标曲线如图6所示，R2为0.995。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种CK7蛋白的抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽包括抗原多肽1和抗原多肽2，所述的抗原多肽1和抗原多肽2的氨基酸序列为：
抗原多肽1：DVVEDFKNKYEDEINHRTAA；
抗原多肽2：QRAKLEAAIAEAEERGELAL。
2.一种能特异性结合权利要求1所述的CK7抗原多肽的单克隆抗体，其特征在于，所述的编码特异性结合抗原多肽1的单克隆抗体1的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的编码特异性结合抗原多肽1的单克隆抗体1的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述的编码特异性结合抗原多肽2的单克隆抗体2的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的编码特异性结合抗原多肽2的单克隆抗体2的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体1的重链可变区序列包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的序列分别为：
CDR-H1：YPSFWMT；
CDR-H2：LIYPGNSDTSYNDFFKG；
CDR-H3：RSGYKYIALDY；
所述的单克隆抗体1的轻链可变区序列包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述的轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的序列分别为：
CDR-L1：RSKRAQSIVHSNGNTYEWI；
CDR-L2：KVRFS；
CDR-L3：FQGSLVPT。
4.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体1的重链可变区序列还包含FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4，所述的重链可变区的FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4的序列分别为：
FR-H1：SVQHQQSGTMLARPSACVKMSCKASGYSFT；
FR-H2：WVKQRPGQGIEPIA；
FR-H3：KAKLTAVTSKQTAYMEWSNLTNEDSAVFYCTR；
FR-H4：EGQGTSVTVSS；
所述的单克隆抗体1的轻链可变区序列还包含FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述的轻链可变区的FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4的序列分别为：
FR-L1：DVLMTQTPLSLPVSLGQASISC；
FR-L2：FYLQKPQSPKLLIY；
FR-L3：GVPFSGSGSGTDFLKISRVEEDLGVPSSYYC；
FR-L4：FGGGTEIKRA。
5.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体2的重链可变区序列包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的序列分别为：
CDR-H1：FYKIDE；
CDR-H2：MIDPSEDRESRLNQKFKD；
CDR-H3：SNYRYDYFV；
所述的单克隆抗体2的轻链可变区序列包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述的轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的序列分别为：
CDR-L1：SASSVSYMY；
CDR-L2：DTSNLAS；
CDR-L3：QQERSYPLDT。
6.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体2的重链可变区序列还包含FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4，所述的重链可变区的FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4的序列分别为：
FR-H1：QVQLQQSGPELVKPGSVSCKASGYSFN；
FR-H2：WVKQRPGQGLEWIG；
FR-H3：KALTVDRSSSTAHMQCTLSSPTEDSAVYYCTR；
FR-H4：WGAGTTETTVSS；
所述的单克隆抗体2的轻链可变区序列还包含FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，所述的轻链可变区的FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4的序列分别为：
FR-L1：QIVLTQSPAIMSAFPDGESVTMTC；
FR-L2：WYETQKPGSSPRDLLIY；
FR-L3：GVRFSGSGSGTSYSLDTINRLESEDGATYYC；
FR-L4：FGAGTKLLKR。
7.一种如权利要求1所述的CK7蛋白抗原多肽在制备抗CK7蛋白单克隆抗体中的应用。
8.一种如权利要求2所述的单克隆抗体在制备CK7蛋白诊断试剂中的应用。
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