CN113150138A - 一种kpc-2单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种KPC‑2单克隆抗体及其制备方法和应用，其中KPC‑2单克隆抗体制备过程包括：合成肺炎克雷伯菌KPC‑2基因，表达纯化KPC‑2蛋白，以重组KPC‑2蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS‑1细胞融合，通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞，用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水，再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得了KPC‑2蛋白单克隆抗体。本申请所获得的KPC‑2单克隆抗体均能与KPC‑2蛋白结合；且所得的KPC‑2单克隆抗体的效价在200万以上，且KPC‑2蛋白的单克隆抗体，纯度高、特异性强、灵敏度高，可用于制备用于检测KPC‑2基因诊断试剂。

Description

一种KPC-2单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫治疗生物医药领域，具体涉及一种KPC-2单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
KPC-2首先在肺炎克雷伯菌中被发现，产KPC-2型碳青霉烯酶菌株在世界各地均有报道，已发现其宿主菌包括肺炎克雷伯菌、产酸克雷菌、阴沟肠杆菌、沙门菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌，甚至铜绿假单胞菌，表明KPC型基因在不同种属甚至科间具有很强的传播能力。重视对碳青霉烯类耐药株的检测，防止产KPC酶株的爆发流行显得尤为重要，也是抗感染面临的新挑战。
而现有的KPC-2检测方法特异性差、耗时长，延误患者的诊断和治疗；现有技术KPC-2蛋白的单克隆抗体，纯度效价低、特异性差。因此，建立一种灵敏、快速、特异性好的KPC-2检测诊断方法和制备纯度效价高、特异性强的KPC-2蛋白的单克隆抗体具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明针对现有技术的诸多缺陷，提出一种KPC-2单克隆抗体及其制备方法和应用，本发明制备了6株KPC-2单克隆抗体，制备的单克隆抗体纯度效价高、特异性强，具有重要的临床应用价值。
本申请第一方面提供一种KPC-2单克隆抗体，包含1D7与4B2单克隆抗体，该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区和轻链可变区；该单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列为如下(1)～(2)：
(1)所述1D7单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述1D7单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(2)所述4B2单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，所述4B2单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
本申请第二方面提供一种上述的KPC-2单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：合成肺炎克雷伯菌KPC-2基因，表达纯化KPC-2蛋白，以重组KPC-2蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合，通过间接ELISA 法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞，用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水,再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得KPC-2蛋白单克隆抗体。
作为本申请的进一步说明，所述方法具体包括以下步骤：
步骤1)：KPC-2基因的合成
从GenBank序列数据库中获取肺炎克雷伯菌KPC-2基因的氨基酸序列；依据大肠杆菌的密码子偏好性进行KPC-2基因的碱基序列的密码子优化，并合成密码子优化后的基因序列；
步骤2)：KPC-2基因的表达和纯化
将KPC-2基因连接至pET-28a载体中，并将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达；收集菌体，高压破碎菌体，离心后收集上清，利用Ni柱亲和层析纯化蛋白；纯化后的蛋白利用Superdex-200柱进行再次精细纯化，获得了纯度较高的KPC-2重组蛋白，收集KPC-2蛋白作为抗原备用；
步骤3)：小鼠的免疫
用纯化的KPC-2蛋白作为抗原，免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠3只，常规免疫后10天，尾部采血，并用间接ELISA检测小鼠产生的抗体滴度；在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为60μg/只，进行加强免疫一次；
步骤4)：NS-1骨髓瘤细胞的制备
于融合前一周，将保存在液氮中的NS-1骨髓瘤细胞复苏，培养在25cm2细胞培养瓶中，用15％胎牛血清DMEM培养液传代培养一周，调整细胞浓度为106个/mL；融合时，选对数生长期的骨髓瘤细胞，弃掉原来瓶内的培养基，加入适量无血清DMEM培养液，将细胞轻轻吹下，移入50mL离心管，400g离心5分钟，洗涤细胞3次，弃上清，细胞沉淀用无血清培养液重悬，计数备用；
步骤5)：免疫脾细胞的制备
取免疫效果最好的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死，75％酒精中浸泡5min消毒；在超净台内，将消毒好的小鼠固定好，取出脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；将脾脏用无血清培养液冲洗后，移入40μm细胞滤网上，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗滤网，收集脾细胞悬液；400g离心5min，洗涤细胞3次，弃上清液，细胞沉淀用无血清DMEM培养液悬浮，计数备用；
步骤6)：细胞融合
将NS-1骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以1:10比例在50mL离心管中混匀，400g离心10min，吸出上清液，轻弹离心管底部，使细胞沉淀略加松动；在lmin内慢慢滴入预温至37℃的50％PEG溶液1mL；并不断用移液管轻轻搅拌细胞1min；然后向细胞混合物中加入10mlDMEM培养基，第一分钟逐滴滴入lmL，第二分钟加lmL，第3min-4min加3mL，5min后加其余的5mL；将细胞混合物置于37℃水浴孵育15min；然后400g离心5min，除去上清，用20ml15％胎牛血清DMEM培养基重悬细胞沉淀，并转移至75cm2细胞培养瓶中，置于细胞培养箱孵育16-24h；将融合后的细胞悬液转移到50ml离心管，400g离心10min；去除上清，细胞沉淀用2.5mL15％胎牛血清DMEM培养基重悬，加入22.5mL半固体培养基混匀后倒入直径3.5cm的平皿中，每个平皿约2mL，37℃，5％CO2培养；十天后肉眼可见平皿的培养基表面有肉眼可见的白色细胞克隆团；
步骤7)：阳性杂交瘤细胞筛选
无菌条件下将平皿中的细胞团吸起放入96孔板培养液中，继续培养4天；4天后进行间接ELISA检测；同时用免疫前正常小鼠血清为阴性对照，免疫后小鼠血清作阳性对照，则吸光值大于阴性对照组2.1倍判定为阳性；检出细胞生长孔有特异性抗体，且呈单个克隆生长并形态良好的杂交瘤细胞孔，再克隆；至少3次后阳性孔的杂交瘤细胞移至24孔培养板，待24孔板中的杂交瘤细胞生长良好时，冻存杂交瘤细胞；
步骤8)：单克隆抗体的制备与纯化
注射0.5ml液体石蜡至8周龄BALB/c小鼠腹腔；将杂交瘤细胞以1×105个/ml的浓度接种于25cm2培养瓶内，培养至细胞活性状态最佳，将细胞数量调至约1×106接种到已注射液体石蜡的小鼠腹腔；7-10天后收集腹水；腹水用20mM PBS pH7.4稀释3倍以上，离心取上清，经HiTrap protein G亲和层析进行纯化，获得KPC-2蛋白单克隆抗体。
作为本申请的进一步说明，步骤1)中合成的KPC-2基因具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
作为本申请的进一步说明，步骤3)中，所述小鼠的免疫方法为：原乳化每只小鼠60μg，抗原+1×PBS总体积为350μl，与等体积福氏佐剂混合乳化3500次，200次/min；第一次免疫：用2ml注射器每只小鼠腹股沟皮下注射含60μg抗原的0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位；第二次免疫：间隔两周，用2ml注射器每只小鼠腹腔注射含60μg抗原的0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位；第三次免疫：间隔两周，用2ml注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射含60μg抗原的0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位。
作为本申请的进一步说明，步骤7)中，所述ELISA检测方法：将抗原以100ng/孔包被至酶标板，4℃过夜，洗涤三次，加200mL封闭液，于37℃温育2h，洗涤三次，然后加入杂交瘤细胞培养上清，于37℃温育2h，洗涤液洗三次后加入1:10000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃温育1h，洗涤三次后37℃避光显色10min,显色充分后加入2M H2SO4终止反应，酶标仪在波长450nm处测定吸光值(OD值)。
作为本申请的进一步说明，步骤8)中，使用Protein G柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml 0.4M的pH 7.0的PB缓冲液平衡纯化小柱；5ml 0.1M的pH 2.7的甘氨酸-盐酸缓冲液脱，结合位点上的抗体，并加入1M的pH8.0为的Tris-HCl中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性；将纯化后的抗体的杂交瘤细胞进行抗体序列测定。
本申请第三方面提供一种药物组合物，所述的药物组合物包括上述的单克隆抗体和药学上可接受的辅料。
本申请第四方面提供一种包含上述的单克隆抗体的检测试剂或试剂盒。
本申请第五方面提供了上述单克隆抗体在制备用于检测KPC-2基因诊断试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本申请所获得的KPC-2单克隆抗体均能与KPC-2蛋白结合；且所得的KPC-2单克隆抗体的效价在200万以上，且KPC-2蛋白的单克隆抗体，纯度高、特异性强、灵敏度高，可用于制备用于检测KPC-2基因诊断试剂。
附图说明
图1为本发明的重组KPC-2蛋白的纯化检测结果图。
图2为本发明的KPC-2单克隆抗体的纯度的检测结果图。
图3为本发明的6株单克隆抗体的Ig分类和亚类鉴定结果。
图4为本发明的KPC-2单克隆抗体效价的检测结果。
图5为本发明的KPC-2单克隆抗体的免疫印迹分析图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例：
实验步骤与方法
1.KPC-2基因的获得
从GenBank数据库中获取KPC-2基因的氨基酸序列，依据大肠杆菌的密码子偏好性进行KPC-2基因的碱基序列的密码子优化，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成了密码子优化后的基因序列。KPC-2编码274个氨基酸。
KPC-2氨基酸序列：
FSATALTNLVAEPFAKLEQDFGGSIGVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYGKNALVPWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIGDTTFRLDRWELELNSAIPGDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGNTTGNHRIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDKHSEAVIAAAARLALEGLGVNGQ。
KPC-2核酸序列：
ATGTTCTCTGCTACCGCTCTGACCAACCTGGTTGCTGAACCATTCGCTAAACTGGAACAGGATTTCGGTGGTTCTATCGGTGTTTACGCTATGGATACCGGTAGCGGTGCTACCGTTTCTTACCGTGCTGAAGAACGTTTCCCACTGTGTAGCTCTTTCAAAGGTTTCCTGGCTGCTGCTGTTCTGGCTCGCTCCCAGCAGCAGGCCGGACTGCTGGATACCCCAATCCGTTACGGCAAAAACGCTCTGGTTCCATGGTCTCCAATCTCTGAAAAATACCTGACCACCGGCATGACCGTTGCTGAACTGTCTGCTGCTGCTGTTCAGTACTCTGACAACGCTGCTGCTAACCTGCTGCTGAAAGAACTGGGCGGTCCAGCTGGTCTGACCGCTTTCATGCGTTCCATCGGTGACACCACCTTCCGTCTGGACCGTTGGGAACTGGAACTGAACTCTGCTATCCCAGGTGACGCTCGTGACACCTCTTCCCCTCGTGCTGTGACCGAATCTCTGCAGAAACTGACCCTGGGTTCTGCTCTGGCTGCTCCACAGCGTCAGCAGTTCGTTGATTGGCTGAAAGGTAACACCACCGGTAACCACCGTATCCGTGCTGCTGTTCCAGCTGATTGGGCTGTTGGGGATAAAACCGGTACTTGTGGCGTTTACGGTACCGCTAACGATTACGCTGTTGTTTGGCCAACCGGCCGTGCTCCAATCGTTCTGGCTGTTTACACCCGTGCTCCAAACAAAGATGATAAACACTCTGAAGCTGTTATCGCTGCTGCTGCTCGTCTGGCTCTGGAAGGTCTGGGTGTTAACGGTCAGtaa。
2.KPC-2基因的表达和纯化
将KPC-2基因连接至pET-28a载体中，并将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达。收集菌体，高压破碎菌体，离心后收集上清，利用Ni柱亲和层析纯化蛋白。纯化后的蛋白利用Superdex-200柱子进行再次精细纯化，获得了纯度较高的KPC-2重组蛋白，收集KPC-2蛋白作为抗原备用(详见附图1)。
3.小鼠的免疫
用纯化的KPC-2蛋白作为抗原，免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠3只，具体免疫方案请见表1，第三次常规免疫后10天，尾部采血，并用间接ELISA检测小鼠产生的抗体滴度。在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为60μg/只，进行加强免疫一次。
表1：小鼠的免疫方案
Figure BDA0002927380180000061
4.NS-1骨髓瘤细胞的制备
于融合前一周，将保存在液氮中的NS-1骨髓瘤细胞复苏，培养在25cm2细胞培养瓶中。用15％胎牛血清DMEM培养液传代培养一周，调整细胞浓度为106个/mL。融合时，选对数生长期的骨髓瘤细胞，弃掉原来瓶内的培养基，加入适量无血清DMEM培养液，将细胞轻轻吹下，移入50mL离心管，400g离心5分钟，洗涤细胞3次，弃上清，细胞沉淀用无血清培养液重悬，计数备用。
5.免疫脾细胞的制备
取免疫效果最好的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死，75％酒精中浸泡5min消毒。在超净台内，将消毒好的小鼠固定好，取出脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；将脾脏用无血清培养液冲洗后，移入40μm细胞滤网上，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗滤网，收集脾细胞悬液；400g离心5min，洗涤细胞3次，弃上清液，细胞沉淀用无血清DMEM培养液悬浮，计数备用。
6.细胞融合
将NS-1骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以1:10比例在50mL离心管中混匀，400g离心10min。吸出上清液，轻弹离心管底部，使细胞沉淀略加松动；在lmin内慢慢滴入预温至37℃的50％PEG溶液1mL；并不断用移液管轻轻搅拌细胞1min；然后向细胞混合物中加入10mlDMEM培养基，第一分钟逐滴滴入lmL，第二分钟加lmL，第3min-4min加3mL，5min后加其余的5mL；将细胞混合物置于37℃水浴孵育15min；然后400g离心5min，除去上清，用20ml15％胎牛血清DMEM培养基重悬细胞沉淀，并转移至75cm2细胞培养瓶中，置于细胞培养箱孵育16-24h。将融合后的细胞悬液转移到50ml离心管，400g离心10min；去除上清，细胞沉淀用2.5mL15％胎牛血清DMEM培养基重悬，加入22.5mL半固体培养基混匀后倒入直径3.5cm的平皿中，每个平皿约2mL，37℃，5％CO2培养。十天后肉眼可见平皿的培养基表面有肉眼可见的白色细胞克隆团。
7.阳性杂交瘤细胞筛选
无菌条件下将平皿中的细胞团吸起放入96孔板培养液中，继续培养4天。4天后进行间接ELISA检测。将抗原以100ng/孔包被至酶标板，4℃过夜，洗涤三次，加200mL封闭液，于37℃温育2h，洗涤三次，然后加入杂交瘤细胞培养上清，于37℃温育2h，洗涤液洗三次后加入1:10000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃温育1h，洗涤三次后37℃避光显色10min,显色充分后加入2M H2SO4终止反应,酶标仪在波长450nm处测定吸光值(OD值)。同时用免疫前正常小鼠血清为阴性对照，免疫后小鼠血清作阳性对照，则吸光值大于阴性对照组2.1倍判定为阳性。检出细胞生长孔有特异性抗体，且呈单个克隆生长并形态良好的杂交瘤细胞孔，再克隆；至少3次后阳性孔的杂交瘤细胞移至24孔培养板，待24孔板中的杂交瘤细胞生长良好时，冻存杂交瘤细胞。
8.单克隆抗体的制备与纯化
注射0.5ml液体石蜡至8周龄BALB/c小鼠腹腔。将杂交瘤细胞以1×105个/ml的浓度接种于25cm2培养瓶内，培养至细胞活性状态最佳，将细胞数量调至约1×106接种到已注射液体石蜡的小鼠腹腔。7-10天后收集腹水。
9.单克隆抗体的纯化
腹水用20mM PBS pH7.4稀释3倍以上，离心取上清，经HiTrap protein G亲和层析进行纯化。使用Protein G柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；5ml 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。分别取6株纯化后的KPC-2单克隆抗体进行蛋白质电泳，上样量为1μg，结果显示，1A10、1D7、2E12、3E7、4B2、5E6抗体均具有较高纯度，可清晰的看到抗体的重链和轻链(详见附图2)。
10.单克隆抗体的亚类鉴定
参考Sigma(货号ISO2-1KT)公司单克隆抗体亚类鉴定试剂盒操作说明，进行单克隆抗体亚类的鉴定。结果显示：1A10、1D7、2E12、3E7、5E6均为IgG1类免疫球蛋白，4B2为IgG2a类免疫球蛋白(详见附图3)。6株抗体的轻链均为Kappa链。
11.单克隆抗体的序列测定
将1D7与4B2两株抗体的杂交瘤细胞送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行抗体序列测定。方法如下：按照RNeasy Plus Micro Kit的技术手册从杂交瘤细胞中分离总RNA。然后根据SMARTScribe逆转录酶技术手册，使用同型特异性反义引物或通用引物将总RNA反转录为cDNA。根据GenScript cDNA末端快速扩增(RACE)的标准操作程序扩增重链和轻链的抗体片段。将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中。进行菌落PCR以筛选具有正确大小的插入片段的克隆。
测序结果如下：
单克隆抗体1D7的重链可变区的氨基酸序列为：
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGVTTYNQRFKDKATLTVDKSSITAYMELLSLTSEDSAVYYCARRGLLGLYAMDYWGQGTSVTVSS。
单克隆抗体1D7的轻链可变区的氨基酸序列为：
DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASESIFKFLAWYQEKPGKTNRLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPLTFGAGTKLELK。
单克隆抗体4B2的重链可变区的氨基酸序列为：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGGLYPGNGDTSYNQKFKGRATLTADKSSSTAYMKLSSLTSEDSAVYFCARVGYGHYYFDYWGQGTTLTVSS。
单克隆抗体4B2的轻链可变区的氨基酸序列为：
DIKMTQSPSSMYASLGERVTIICKASQDINNYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLAEGVPSRFSGIGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK。
12.单克隆抗体的效价测定
KPC-2蛋白以100ng/孔包被，将单抗按1：10000、1：20000、1：40000、1：80000、1：160000、1：320000、1：640000、1：1280000、1：2560000稀释，相对应的抗体使用浓度(ng/ml)分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625。通过间接ELISA法测定其A450nm值。以与免疫蛋白靶抗原发生反应的单克隆抗体的最大稀释度即为其效价，测定孔读数与阴性对照值之比大于2.1为阳性。具体的操作步骤为：包被抗原，4℃过夜包被。3％BSA封闭液，37℃封闭2h；以KPC-2单克隆抗体为一抗，37℃孵育1h；HRP－羊抗小鼠IgG为二抗，37℃孵育1h。TMB显色液显色5min；2mM硫酸终止。结果显示6株抗体效价均在200万以上(详见附图4)。
13.单克隆抗体的特异性鉴定。
以KPC-2蛋白为抗原使用Western-Blot检测抗体特异性。具体实验步骤为：KPC-2蛋白上样量为1μg，经蛋白电泳，电转至PVDF膜上，取下膜，TBS洗膜，5min×3。3％BSA4℃封闭过夜。按1:50000比例(抗体使用浓度0.02μg/ml)加入纯化的单克隆抗体，孵育1h。TBST洗膜，5min×3。加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(二抗)，孵育1h。TBST洗膜，5min×3。ECL显色液按A/B液1:1比例配制，发光仪上曝光。Western-blotting结果显示，6株抗体均能与KPC-2蛋白结合(详见附图5)。
以上所述仅是对本发明的实施方式的举例展示，并非对本发明作任何形式上的限制。本发明保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施例所限，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何简单修改或等同变化与修饰均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市龙华区疾病预防控制中心（深圳市龙华区卫生检验中心、深圳市龙华区职业病防治中心）
<120> 一种KPC-2单克隆抗体及其制备方法和应用
<141> 2021-02-01
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Phe Ser Ala Thr Ala Leu Thr Asn Leu Val Ala Glu Pro Phe Ala Lys
1 5 10 15
Leu Glu Gln Asp Phe Gly Gly Ser Ile Gly Val Tyr Ala Met Asp Thr
20 25 30
Gly Ser Gly Ala Thr Val Ser Tyr Arg Ala Glu Glu Arg Phe Pro Leu
35 40 45
Cys Ser Ser Phe Lys Gly Phe Leu Ala Ala Ala Val Leu Ala Arg Ser
50 55 60
Gln Gln Gln Ala Gly Leu Leu Asp Thr Pro Ile Arg Tyr Gly Lys Asn
65 70 75 80
Ala Leu Val Pro Trp Ser Pro Ile Ser Glu Lys Tyr Leu Thr Thr Gly
85 90 95
Met Thr Val Ala Glu Leu Ser Ala Ala Ala Val Gln Tyr Ser Asp Asn
100 105 110
Ala Ala Ala Asn Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gly Gly Pro Ala Gly Leu
115 120 125
Thr Ala Phe Met Arg Ser Ile Gly Asp Thr Thr Phe Arg Leu Asp Arg
130 135 140
Trp Glu Leu Glu Leu Asn Ser Ala Ile Pro Gly Asp Ala Arg Asp Thr
145 150 155 160
Ser Ser Pro Arg Ala Val Thr Glu Ser Leu Gln Lys Leu Thr Leu Gly
165 170 175
Ser Ala Leu Ala Ala Pro Gln Arg Gln Gln Phe Val Asp Trp Leu Lys
180 185 190
Gly Asn Thr Thr Gly Asn His Arg Ile Arg Ala Ala Val Pro Ala Asp
195 200 205
Trp Ala Val Gly Asp Lys Thr Gly Thr Cys Gly Val Tyr Gly Thr Ala
210 215 220
Asn Asp Tyr Ala Val Val Trp Pro Thr Gly Arg Ala Pro Ile Val Leu
225 230 235 240
Ala Val Tyr Thr Arg Ala Pro Asn Lys Asp Asp Lys His Ser Glu Ala
245 250 255
Val Ile Ala Ala Ala Ala Arg Leu Ala Leu Glu Gly Leu Gly Val Asn
260 265 270
Gly Gln
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Thr Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Leu Leu Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Phe Lys Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Leu Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Tyr Gly His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ile Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105

Claims (10)

1.一种KPC-2单克隆抗体，包含1D7与4B2单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区和轻链可变区；该单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列为如下(1)～(2)：
(1)所述1D7单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述1D7单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(2)所述4B2单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，所述4B2单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述的KPC-2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：合成肺炎克雷伯菌KPC-2基因，表达纯化KPC-2蛋白，以重组KPC-2蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合，通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞，用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水,再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得KPC-2蛋白单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的KPC-2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
步骤1)：KPC-2基因的合成
从GenBank序列数据库中获取肺炎克雷伯菌KPC-2基因的氨基酸序列；依据大肠杆菌的密码子偏好性进行KPC-2基因的碱基序列的密码子优化，并合成密码子优化后的基因序列；
步骤2)：KPC-2基因的表达和纯化
将KPC-2基因连接至pET-28a载体中，并将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达；收集菌体，高压破碎菌体，离心后收集上清，利用Ni柱亲和层析纯化蛋白；纯化后的蛋白利用Superdex-200柱进行再次精细纯化，获得了纯度较高的KPC-2重组蛋白，收集KPC-2蛋白作为抗原备用；
步骤3)：小鼠的免疫
用纯化的KPC-2蛋白作为抗原，免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠3只，常规免疫后10天，尾部采血，并用间接ELISA检测小鼠产生的抗体滴度；在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为60μg/只，进行加强免疫一次；
步骤4)：NS-1骨髓瘤细胞的制备
于融合前一周，将保存在液氮中的NS-1骨髓瘤细胞复苏，培养在25cm2细胞培养瓶中，用15％胎牛血清DMEM培养液传代培养一周，调整细胞浓度为106个/mL；融合时，选对数生长期的骨髓瘤细胞，弃掉原来瓶内的培养基，加入适量无血清DMEM培养液，将细胞轻轻吹下，移入50mL离心管，400g离心5分钟，洗涤细胞3次，弃上清，细胞沉淀用无血清培养液重悬，计数备用；
步骤5)：免疫脾细胞的制备
取免疫效果最好的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死，75％酒精中浸泡5min消毒；在超净台内，将消毒好的小鼠固定好，取出脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；将脾脏用无血清培养液冲洗后，移入40μm细胞滤网上，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗滤网，收集脾细胞悬液；400g离心5min，洗涤细胞3次，弃上清液，细胞沉淀用无血清DMEM培养液悬浮，计数备用；
步骤6)：细胞融合
将NS-1骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以1:10比例在50mL离心管中混匀，400g离心10min，吸出上清液，轻弹离心管底部，使细胞沉淀略加松动；在lmin内慢慢滴入预温至37℃的50％PEG溶液1mL；并不断用移液管轻轻搅拌细胞1min；然后向细胞混合物中加入10mlDMEM培养基，第一分钟逐滴滴入lmL，第二分钟加lmL，第3min-4min加3mL，5min后加其余的5mL；将细胞混合物置于37℃水浴孵育15min；然后400g离心5min，除去上清，用20ml15％胎牛血清DMEM培养基重悬细胞沉淀，并转移至75cm2细胞培养瓶中，置于细胞培养箱孵育16-24h；将融合后的细胞悬液转移到50ml离心管，400g离心10min；去除上清，细胞沉淀用2.5mL15％胎牛血清DMEM培养基重悬，加入22.5mL半固体培养基混匀后倒入直径3.5cm的平皿中，每个平皿约2mL，37℃，5％CO2培养；十天后肉眼可见平皿的培养基表面有肉眼可见的白色细胞克隆团；
步骤7)：阳性杂交瘤细胞筛选
无菌条件下将平皿中的细胞团吸起放入96孔板培养液中，继续培养4天；4天后进行间接ELISA检测；同时用免疫前正常小鼠血清为阴性对照，免疫后小鼠血清作阳性对照，则吸光值大于阴性对照组2.1倍判定为阳性；检出细胞生长孔有特异性抗体，且呈单个克隆生长并形态良好的杂交瘤细胞孔，再克隆；至少3次后阳性孔的杂交瘤细胞移至24孔培养板，待24孔板中的杂交瘤细胞生长良好时，冻存杂交瘤细胞；
步骤8)：单克隆抗体的制备与纯化
注射0.5ml液体石蜡至8周龄BALB/c小鼠腹腔；将杂交瘤细胞以1×105个/ml的浓度接种于25cm2培养瓶内，培养至细胞活性状态最佳，将细胞数量调至约1×106接种到已注射液体石蜡的小鼠腹腔；7-10天后收集腹水；腹水用20mM PBS pH7.4稀释3倍以上，离心取上清，经HiTrap protein G亲和层析进行纯化，获得KPC-2蛋白单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的KPC-2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤1)中合成的KPC-2基因具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求3所述的KPC-2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述小鼠的免疫方法为：原乳化每只小鼠60μg，抗原+1×PBS总体积为350μl，与等体积福氏佐剂混合乳化3500次，200次/min；第一次免疫：用2ml注射器每只小鼠腹股沟皮下注射含60μg抗原的0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位；第二次免疫：间隔两周，用2ml注射器每只小鼠腹腔注射含60μg抗原的0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位；第三次免疫：间隔两周，用2ml注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射含60μg抗原的0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位。
6.根据权利要求3所述的KPC-2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤7)中，所述ELISA检测方法：将抗原以100ng/孔包被至酶标板，4℃过夜，洗涤三次，加200mL封闭液，于37℃温育2h，洗涤三次，然后加入杂交瘤细胞培养上清，于37℃温育2h，洗涤液洗三次后加入1:10000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃温育1h，洗涤三次后37℃避光显色10min,显色充分后加入2M H2SO4终止反应，酶标仪在波长450nm处测定吸光值(OD值)。
7.根据权利要求3所述的KPC-2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤8)中，使用Protein G柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml 0.4M PB缓冲液(pH7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml 0.4M的pH 7.0的PB缓冲液平衡纯化小柱；5ml 0.1M的pH 2.7的甘氨酸-盐酸缓冲液脱，结合位点上的抗体，并加入1M的pH 8.0为的Tris-HCl中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性；将纯化后的抗体的杂交瘤细胞进行抗体序列测定。
8.一种药物组合物，所述的药物组合物包括权利要求1所述的单克隆抗体和药学上可接受的辅料。
9.一种包含权利要求1所述的单克隆抗体的检测试剂或试剂盒。
10.根据权利要求1-9中任一所述的单克隆抗体在制备用于检测KPC-2基因诊断试剂中的应用。
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