CN113817052A

CN113817052A - 抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN113817052A
Application number: CN202110676477.1A
Authority: CN
Inventors: 覃喜建; 吴东明; 程朝霞
Original assignee: Nanjing Jinsirui Science and Technology Biology Corp
Current assignee: Nanjing Jinsirui Science and Technology Biology Corp
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2021-06-18
Publication date: 2021-12-21

Abstract

本发明属于病毒检测、诊断领域，涉及抗SARS‑CoV‑2病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法和用途。本发明提供了抗SARS‑CoV‑2病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体、其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。本发明提供的抗SARS‑CoV‑2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体能够特异性地与核衣壳蛋白结合。本发明提供的抗SARS‑CoV‑2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体为SARS‑CoV‑2病毒检测和诊断提供了可能和便利。

Description

抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于病毒免疫检测领域，尤其是涉及抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体。本发明还涉及该抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法以及它们的用途。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病原体SARS-CoV-2病毒，又称2019新型冠状病毒(2019 Novel coronavirus,2019-nCoV)，SARS-CoV-2病毒是一类单股正链的RNA病毒。它的基因组长度约三万个核苷酸左右。它的四个主要结构蛋白是刺突糖蛋白(S蛋白)、小包膜蛋白(E蛋白)、基质蛋白(M蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。同时， N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大。而N蛋白是病毒的主要抗原,诱导机体产生强的免疫应答,在冠状病毒的发病机理和免疫学诊断上有重要作用。N蛋白是 SARS-CoV-2病毒抗原抗体检测的潜在重要靶标。N蛋白的GenBank登录号为 QHD43423.2，该蛋白由419个氨基酸组成，分子量是45.6KD。

目前国内外常用的针对SARS-CoV-2病毒的检测方法主要有两种：(1)应用荧光定量RT-PCR等检测病毒RNA；(2)应用重组N蛋白或重组S蛋白及其片段检测SARS-CoV-2 病毒抗体。通过RT-PCR检测病毒RNA比较敏感,对SARS-CoV-2早期病原诊断有一定价值，但是RT-PCR方法容易发生样品交叉污染而出现假阳性结果。病人血液里的IgM 抗体通常在感染7d后出现，14d出现高峰，所以抗体检测显然不适用于早期诊断。因此，寻找快速有效的诊断方法，早期发现、早期治疗就十分重要。双抗体夹心法检测病毒具有灵敏度高，特异性好等优点，是SARS-CoV-2病毒早期检测的理想指标。但目前市场上没有用于SARS-CoV-2病毒抗原检测诊断产品，主要原因是SARS-CoV-2病毒是新型病毒，尚没有合格的用于开发SARS-CoV-2病毒抗原检测的抗体原料。为此，我们制备的抗 SARS-CoV-2N蛋白的单克隆抗体，为开发SARS-CoV-2病毒抗原检测试剂盒奠定基础。

发明内容

在一方面，本发明提供了一种抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段包含重链可变区和轻链可变区，其中

(a)所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，

所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:16、22、28、34、40、46或52所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个(例如，一个、二个或三个)氨基酸突变的变体；所述HCDR2 包含选自SEQ ID NO:17、23、29、35、41、47或53所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体；所述HCDR3包含选自SEQ ID NO:18、24、30、36、42、48 或54所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体；以及

(b)所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，

所述LCDR1序列包含选自SEQ ID NO:19、25、31、37、43、49或55所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体；所述LCDR2序列包含选自SEQ ID NO:20、26、32、38、44、50或56所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体；所述LCDR3序列包含选自SEQ ID NO:21、27、33、39、45、51或57所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体。

在一些实施方案中，所述HCDR1序列包含选自SEQ ID NO:16、22、28、34、40、46或52所示的氨基酸序列，所述HCDR2序列包含选自SEQ ID NO:17、23、29、35、41、47或53 所示的氨基酸序列，所述HCDR3序列包含选自SEQ ID NO:18、24、30、36、42、48或54 所示的氨基酸序列；以及所述LCDR1序列包含选自SEQ ID NO:19、25、31、37、43、49 或55所示的氨基酸序列，所述LCDR2序列包含选自SEQ ID NO:20、26、32、38、44、50 或56所示的氨基酸序列，所述LCDR3序列包含选自SEQ ID NO:21、27、33、39、45、51 或57所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自如下序列：

(a)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:16、17和18所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3 分别包含SEQ ID NO:19、20和21所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；

(b)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:22、23和24所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3 分别包含SEQ ID NO:25、26和27所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；

(c)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:28、29和30所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3 分别包含SEQ ID NO:31、32和33所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；

(d)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:34、35和36所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3 分别包含SEQ ID NO:37、38和39所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；

(e)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:40、41和42所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3 分别包含SEQ ID NO:43、44和45所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；

(f)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:46、47和48所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3 分别包含SEQ ID NO:49、50和51所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；或

(g)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和54所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3 分别包含SEQ ID NO:55、56和57所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体。

(a)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:16、17和18所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:19、20和21所示的氨基酸序列；

(b)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:22、23和24所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:25、26和27所示的氨基酸序列；

(c)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:28、29和30所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:31、32和33所示的氨基酸序列；

(d)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:34、35和36所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:37、38和39所示的氨基酸序列；

(e)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:40、41和42所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:43、44和45所示的氨基酸序列；或

(f)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:46、47和48所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:49、50和51所示的氨基酸序列；或

(g)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和54所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:55、56和57所示的氨基酸序列。

(a)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:16、17和18所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、20和21所示；

(b)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:22、23和24所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:25、26和27所示；

(c)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:28、29和30所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:31、32和33所示；

(d)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:34、35和36所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:37、38和39所示；

(e)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:40、41和42所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:43、44和45所示；

(f)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:46、47和48所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:49、50和51所示；或

(g)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:52、53和54所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:55、56和57所示。

在一些实施方案中，所述重链可变区序列包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12或14所示氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列；以及所述轻链可变区序列包含与SEQID NO:3、5、7、9、11、13或15所示氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链可变区序列包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12或14所示氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；所述轻链可变区序列包含与SEQID NO:3、5、7、9、11、13或15所示氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述重链可变区序列包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12或14 所示氨基酸序列；所述轻链可变区序列包含SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13或15所示氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列：

(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:2所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:3所示序列具有至少80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；

(b)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:4所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:5所示序列具有至少80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；

(c)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:7所示序列具有至少80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；

(d)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:8所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:9所示序列具有至少80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；

(e)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:10所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:11所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；

(f)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:12所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:13所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或

(g)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:14所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:15所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。

(a)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如 SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

(b)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如 SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

(c)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如 SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

(d)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如 SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；

(e)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如 SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；

(f)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如 SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；或

(g)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如 SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列：

(a)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

(b)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

(c)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；

(d)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

(e)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

(f)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；或

(g)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。

在另一方面，本发明提供了编码上述的抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体或其功能片段的分离的多核苷酸。

在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码上述抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体或其功能片段的重链可变区的核苷酸序列，和编码所述抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体或其功能片段的轻链可变区的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述的单克隆抗体或其功能片段，其特征在于，所述抗体是鼠源的、嵌合的、人源化的或者人的。

在另一方面，本发明提供了包含所述多核苷酸的表达载体。

在另一方面，本发明提供了包含所述表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体或其功能片段和药学上可接受的载体。

在另一方面，本发明提供了所述的抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体或其功能片段在制备治疗冠状病毒药物中的应用。在另一方面，本发明提供了一种检测试剂，所述检测试剂中包含所述的抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体或其功能片段。

在另一方面，本发明提供了所述的抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体或其功能片段在冠状病毒检测和诊断产品中的应用。在另一方面，本发明提供了所述的抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体或其功能片段在制备检测试剂中的应用。

在另一方面，本发明提供了一种检测冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒中包含所述的单克隆抗体或其功能片段。

在一些实施方案中，所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-Cov或SARS-Cov-2，优选为SARS-Cov-2。在另一些实施方案中，所述冠状病毒为SARS-Cov-2。

在另一方面，本发明提供了一种制备抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体或其功能片段的方法，包括

1)以SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白免疫动物，在所述动物中产生针对SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白的免疫反应；

2)取所述动物的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得的杂交瘤细胞，并进行筛选，得到特异性识别SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白的阳性克隆；

3)对所述阳性母克隆进行亚克隆，以获得稳定的杂交瘤细胞株；

4)对所述杂交瘤细胞株进行基因测序，获得抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白抗体的重链和轻链的可变区编码序列；以及

5)用所述可变区编码序列进行重组抗体生产，获得功能性抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体。

在一些实施方案中，所述的单克隆抗体是鼠源、嵌合的、人源化的或人的抗体。在一些优选实施方案中，所述的单克隆抗体是鼠源的。在另一些优选实施方案中，所述的单克隆抗体是人源化的。

有益效果

与PCR检测相比，血清学检测具有检测周期短、通量高和工作量少的优势。本发明开发的抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体能够特异性地与N蛋白结合。本发明提供的单克隆抗体为开发SARS-CoV-2病毒抗原检测试剂盒奠定基础，提供了便利。

附图说明

图1为经SARS-CoV-2病毒N蛋白免疫后的小鼠的血清ELISA效价检测结果图，结果表明4只小鼠血清中都产生了针对SARS-CoV-2病毒N蛋白的抗体，其中#1小鼠产生的免疫应答最强。

图2为本发明的抗SARS-CoV-2病毒N蛋白单克隆抗体纯化鉴定图，M：ProteinLadder； 1：N15纯化抗体，2：纯化前N15抗体细胞培养上清，3：纯化后N15抗体流出液，4：N21纯化抗体，5：纯化前N21抗体细胞培养上清，6：纯化后N21抗体流出液，7：N25 纯化抗体，8：纯化前N25抗体细胞培养上清，9：纯化后N25抗体流出液，10：N22纯化抗体，11：纯化前N22抗体细胞培养上清，12：纯化后N22抗体流出液，13：N26纯化抗体，14：纯化前N26抗体细胞培养上清，15：纯化后N26抗体流出液；结果表明抗体的分子量在150-180kDa。

图3为本发明的抗SARS-CoV-2病毒N蛋白单克隆抗体与SARS-CoV-2病毒N蛋白重组蛋白特异性结合的曲线图，结果表明获得的5株SARS-CoV-2病毒N蛋白单克隆抗体 (N15、N21、N22、N25和N26)都能特异性识别SARS-CoV-2病毒N蛋白。

图4为本发明的抗SARS-CoV-2病毒N蛋白单克隆抗体配对图，结果表明SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体(N25)可以与抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白抗体(23F2D10) 配对，在500-100000pg的检测范围内存在线性关系。

具体实施方式

除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。

术语“新型冠状病毒”(SARS-CoV-2)，亦称为2019-nCoV，其属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARSr-Cov 和MERSr-CoV有明显区别。研究显示，其与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45) 同源性达85％以上。体外分离培养时，2019-nCov 96个小时左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现，而在VeroE6和Huh-7细胞系中分离培养需约6天。

本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子，其通常为由2个相同重链和2个相同轻链通过二硫键相互连接组成的四聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分为位于氨基端的可变区(V)和位于羧基端的恒定区(C)。在重链和轻链的可变区内，分别有三个局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变异程度，为抗体与抗原结合的关键位置，因而也称为互补决定区(CDR)。在本文中，三个重链互补决定区分别称为HCDR1、 HCDR2和HCDR3，三个轻链互补决定区分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。一条重链和一条轻链的可变区相互作用形成了抗原结合部位(Fv)。根据它们重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体分为不同类别。有五种主要类型的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可进一步分为亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象在本领域内是已知的。本发明旨在包括任何前述类或亚类的抗体。

本文使用的术语“抗体”还旨在涵盖其消化片段或功能性变体，例如，能够结合SARS-COV-2病毒N蛋白或其部分的抗体片段，包括但不限于Fab(例如，抗体经木瓜蛋白酶消化而得到、F(ab’)2(例如，通过胃蛋白酶消化得到)、Fv或scFv(例如通过分子生物学技术得到)。

本文使用的术语“单克隆抗体”指均一的、仅针对某一特定抗原表位的抗体。与典型地包括针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的普通多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的均一特征，不解释为需要通过任何特定方法产生的抗体。本发明的单克隆抗体优选通过重组DNA方法产生，或通过本文其它地方描述的筛选方法获得。

术语“突变”是指单克隆抗体或其功能片段包含一个或多个(数个)位置的一个或多个(数个)氨基酸残基的变更，即取代、插入和/或缺失的多肽。取代是指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失是指除去占据某位置的氨基酸；而插入是指在占据某位置的氨基酸邻接处且在之后添加1-3个氨基酸。

本文使用的术语“分离的多核苷酸”指非自然界中天然存在状态的多核苷酸，包括通过生物学技术从自然界(包括生物体内)分离出的多核苷酸，也包括人工合成的多核苷酸。分离的多核苷酸可以是基因组DNA、cDNA、mRNA或合成的其它RNA，或者它们的组合。本文提供了多个用于编码抗SARS-CoV-2病毒N蛋白单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列，需要指出的是，本领域技术人员可以根据本文所提供的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，基于密码子简并性，设计出与以上提供的核苷酸序列不完全相同的核苷酸序列，但都编码相同的氨基酸序列。这些经改动的核苷酸序列也包括在本发明的范围内。

当涉及多核苷酸时，本文所用的术语“载体”指用于将核苷酸编码信息转移到宿主细胞内的任一种分子(例如，核酸、质粒、或病毒等)。术语“表达载体”或“表达盒”指适于在宿主细胞内表达目的基因(待表达核苷酸序列)的载体，通常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。

本文所用的术语“宿主细胞”指已经或者能够用核酸序列转化并从而表达所选的目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论该后代与原来的亲本细胞在形态或基因组成上是否相同，只要后代存在所选目的基因即可。常用的宿主细胞包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。

术语“抗体功能片段”意即抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。例如，能够结合冠状病毒核衣壳(N)蛋白或其部分的抗体片段，包括但不限于sdAb(单域抗体)、Fab(例如，抗体经木瓜蛋白酶消化而得到)、 F(ab’)2(例如，通过胃蛋白酶消化得到)、Fv或scFv(例如通过分子生物学技术得到)。

术语“药学上可接受的载体”包括与药物给药相容的任何或所有溶剂，分散剂，包被物，抗细菌和抗真菌药剂，等渗和缓释剂，及其类似物。包括各种赋形剂、稀释剂和缓冲剂等，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。合适的载体在Remington’s Pharmaceutical Sciences最新版中的标准参考文件中有所叙述，其通过在此引述而全部合并于本文。合适的载体或稀释液例子包括，但不局限于，水，盐溶液，ringer’s液，葡萄糖溶液，和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和疏水介质如不挥发油。药物活性物质的介质和药剂的使用在本领域中是熟知的。除了那些对于活性成分不相容的常规介质或试剂以外，其在成分中的使用都可以达到预期效果。

关于肽或多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列一致性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。

术语“氨基酸替换”，指在预先确定的(初始)氨基酸序列中，用不同的氨基酸残基代替现有的氨基酸残基。一般而言，本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等，Molecular Biology of the Gene(基因的分子生物学)，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第四版，1987))。这样的示例性取代优选依照以下所示的取代来进行：

示例性保守氨基酸取代

原残基	保守取代
		Ala(A)	Gly；Ser
Arg(R)	Lys；His
		Asn(N)	Gln；His
Asp(D)	Glu；Asn
		Cys(C)	Ser；Ala
Gln(Q)	Asn
		Glu(E)	Asp；Gln
Gly(G)	Ala
		His(H)	Asn；Gln
Ile(I)	Leu；Val
		Leu(L)	Ile；Val
Lys(K)	Arg；His
		Met(M)	Leu；Ile；Tyr
Phe(F)	Tyr；Met；Leu

本文所用的术语“转染”指外来或外源DNA被细胞摄入，该技术可用于将一种或多种外源DNA部分导入适宜的宿主细胞。可通过理化方法(例如通过氯化钙处理)诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，即“感受态”。

当用“给予”和“治疗”提及动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物液时，是指将外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受治疗者、细胞、组织、器官或生物液接触。“给予”和“治疗”可指例如治疗方法、药动学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。治疗细胞包括让试剂与细胞接触以及让试剂与流液接触，其中所述流液与细胞接触。“给予”和“治疗”还意味着例如通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过其他细胞对细胞进行体外和离体治疗。

如本文使用的术语“受试者”指需要缓解、预防和/或治疗疾病或病症如病毒感染的动物，优选哺乳动物，更优选人。术语包括具有冠状病毒如SARS-CoV-2感染或处于具有冠状病毒如SARS-CoV-2感染风险的人受试者。

提及药物组合物时，本文所使用的术语“有效量的”指可对人和/或动物产生功能或活性且可被人和/或动物所接受的量。

除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。除非另外特别说明，否则词语“一个 (a)”或“一个(an)”意指“至少一个”。除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。短语“至少一个”的含义等同于短语“一个或多个”的含义。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，否则术语诸如“要素”或“组分”包括包含一个单元的元素或组分以及包含多于一个单元的元素和组分。

除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1：SARS-CoV-2病毒N蛋白杂交瘤细胞株的获得

1)动物免疫

抗原采用重组SARS-CoV-2病毒N蛋白(南京金斯瑞生物科技有限公司，CatNo.T80103, SEQ ID NO:1)。用含50μg SARS-CoV-2病毒N蛋白的200μl弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich) 的1:1乳液皮下免疫雌性Balb/c小鼠。随后，每二周腹腔/皮下交替注射含25μg SARS-CoV-2 病毒N蛋白的弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich)的1:1乳液最多达3次，从而对小鼠进行加强免疫。骨髓瘤融合前4天，对表现出最高抗体滴度(参见图1，用血清ELISA法测定抗体效价)的#1小鼠进行了25μg SARS-CoV-2病毒N蛋白(不含佐剂)腹腔加强免疫。

SARS-CoV-2病毒N蛋白序列(SEQ ID NO:1):

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQ HGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTG PEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEG SRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKM SGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQV ILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQ SMSSADSTQA

2)杂交瘤融合和筛选

在无菌条件下提取脾脏并碾磨形成单细胞悬液，同时准备骨髓瘤细胞(SP2/0)单细胞悬液。使用电融合将8.1×10⁷个脾细胞与3.8×10⁷个SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合。将融合后的细胞重悬于100ml含胸腺核苷嘧啶、次黄嘌呤和氨基喋呤的DMEM/10％FBS选择培养基中，用移液管将细胞悬液移至96孔板中，每孔100μl的体积。在6％CO₂，37℃条件下培养6天。孵育7天后，用间接ELISA检测每孔中SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体的存在情况。

用PBS缓冲液将重组SARS-CoV-2病毒N蛋白稀释成0.5μg/ml，用100μl/孔包被ELISA 板(Nunc)，4℃下过夜。用PBS-T(0.05％吐温)洗涤板孔一次，并用200μl/孔的含1％BSA 的PBST在37℃温度下封闭0.5小时。随后弃去封闭液，向每个板孔中加入100μl杂交瘤细胞培养上清液，然后在室温下孵育1小时。用PBST洗板三次，并用100μl/孔的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Fab-特异性)工作液(南京金斯瑞生物科技有限公司)37℃孵育0.5小时。用PBST洗板五次，然后加入TMB显色液(南京金斯瑞生物科技有限公司) 并在室温条件下避光孵育15分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应。用酶标仪(TECAN)在450nm下读板。

3)杂交瘤亚克隆

使用有限稀释法进行亚克隆。使用血球细胞计数器并在含胸腺核苷嘧啶、次黄嘌呤和氨基喋呤的DMEM/10％FBS选择培养基中对细胞进行系列稀释来确定细胞数量，直至细胞密度达到5～15个细胞/ml。对于每个杂交瘤，将200μl的细胞溶液用移液管移至96孔中，密度为1～3个细胞/孔。在37℃下，6％CO₂中培养1周，对上清液进行上述ELISA 检测评估针对SARS-CoV-2病毒N蛋白的抗体存在情况。

实施例2：单克隆抗体的可变区测序及抗体重组生产

1)使用快速ELISA小鼠抗体亚型鉴定试剂盒(Clonotyping System-HRP SouthernBiotech)对杂交瘤细胞培养上清中的抗体进行亚型鉴定，鉴定结果显示重链为IgG1,轻链为 Kappa型；使用TRIzol(Ambion)从3×10⁶～5×10⁶个杂交瘤细胞提取总RNA，并利用抗体亚型特异性引物和通用引物(PrimeScriptTM 1stStrand cDNA Synthesis Kit，Takara)将其逆转录为cDNA。

2)随后通过RACE PCR(南京金斯瑞生物科技有限公司)扩增鼠免疫球蛋白重链和轻链 V-区域片段，将所得的PCR片段亚克隆至pMD18-T载体系统(Takara)中，并使用载体特异性引物对插入片段进行测序。

3)最终获得了克隆N4、N15、N20、N21、N22、N25和N26的独特V区域氨基酸序列。

4)分别合成包含编码轻链可变区和Kappa型轻链恒定区的DNA片段与编码重链可变区和人IgG1重链恒定区的DNA片段，将其分别插入pTT5表达载体(NRC BiotechnologyResearch Institute,National Research Council of Canada)中，形成表达质粒。

5)将上述表达质粒共转染CHO-3E7细胞，并于37℃摇瓶中培养10天后，收取上清用于抗体纯化。

6)纯化之前将管道和蛋白A柱用0.2M NaOH去热原。将柱用含有0.05M Tris和1.5MNaCl(pH8.0)的缓冲液重新平衡。随后将收获的细胞培养物上清液，使用2×上述缓冲液1:1稀释并过滤除菌。

7)将过滤的上清液和蛋白A柱室温孵育2小时，用1×上述缓冲液洗涤柱后，使用无菌0.1M柠檬酸钠(pH3.5)洗脱IgG，收集了洗脱液并用九分之一体积的无菌1M Tris-HCl(pH9)中和。

8)在无菌条件下，将所述产品缓冲液交换为PBS(pH7.4)以除去任何的洗脱缓冲液并浓缩所述样品。浓缩之后，使用1.43的消光系数Ec(0.1％)通过OD280nm对抗体进行定量。9)纯化的抗体、纯化前细胞上清和纯化后流出液通过BioRad电泳系统用10％预制胶(南京金斯瑞生物科技有限公司)通过SDS-PAGE来分析。将所述凝胶用Estain2.0(南京金斯瑞生物科技有限公司)染色并通过比较染色带与Protein Ladder(Takara-bio,货号3452)来估计分子大小和纯度，见图2。

N4重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:2):

LKQWYQRRVMGVKPGASVRISCKAYGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWLGYISPGNDD IQYNAKFKGKATMTADKSSSTAYMQLNSLTSDDSAVYFCKRSMANSFDYWGQGTTLT VSS

N4轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:3):

ENVLTQSPALMAASLGQRITMTCSASSSVSSSHLHWYQQKSGASPKPLILRTSNLASGVP TRFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDDATYFCQQWSGYPYTFGGGTKLEIK

N15重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:4):

QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDK YYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARTNYVGVMDYWGQGTSVIVS S

N15轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:5):

ENVLTQSPAIMAASLGQKVTMTCSARSSVSSSYLNWYQQKSGASPKPLIHRTSNLASGV PARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPYTFGGGTKLEIK

N20重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:6):

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTNTGE PTYAEEFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARSGGYYAMDYWGQGTSVT VSS

N20轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:7):

SDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK

N21重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:8):

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASDYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEP TYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARGGDYYAMDYWGQGTSVT VFS

N21轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:9):

DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWAST RESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPPTFGGGTKLEIK

N22重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:10):

QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYVMHWVKQSHAKSLEWIGVISTYSGNT NYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARGSSSFDYWGQGTTLTVSS

N22轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:11):

DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGV PDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGGGTKLEIK

N25重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:12):

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNH NSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARDRSYGSCYNYAMDYWGQGT SVTVSS

N25轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:13):

DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLADGVP SRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWGSPYTFGGGTKLEIK

N26重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:14):

QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKASGYTFTSSWMHWAKQRPGQGLEWIGEIHPNSGNT NYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYVDLSSLTSEDSAVYYCAREAYYRYGFAYWGQGTLVT VSA

N26轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:15):

ETTVTQSPASLSVATGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRPGVPSR FSSSGYGTDFVFTIENTLSEDVADYYCLQSDNMPLTFGSGTKLEIK

表1抗体的CDR区序列

实施例3：单克隆抗体对重组SARS-CoV-2病毒N蛋白的结合

1)用PBS缓冲液将重组SARS-CoV-2病毒N蛋白稀释成0.5μg/ml。

2)向ELISA板(Nunc)每孔中加入100μl稀释后的SARS-CoV-2病毒N蛋白溶液，4℃下包被反应过夜。

3)用PBS-T(0.05％吐温)洗板一次，弃去上清。向每孔中加入200μl的封闭液(PBST100ml；牛血清白蛋白1g)，在37℃下孵育0.5小时。

4)弃去封闭液，向首孔加入100μl的10μg/ml的纯化抗体，用PBS缓冲液按照3倍梯度稀释，共计7个测试浓度梯度。

5)室温下孵育1小时。用PBST洗板三次，弃上清。

6)向每孔中加入100μl的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(南京金斯瑞生物科技有限公司)，37℃孵育0.5小时。

7)用PBST洗板五次，弃上清。

8)向每孔中加入100μl的TMB显色液(南京金斯瑞生物科技有限公司)，在室温下避光反应15分钟。

9)向每孔中加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。SARS-CoV-2病毒N蛋白抗体(N15、N21、N22、N25、N26)对于重组蛋白 SARS-COV-2病毒N蛋白的结合能力如图3。

实施例4：抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体配对

1)用0.05M碳酸盐包被缓冲液(NaCO₃ 1.59g；NaHCO₃ 2.93g；加蒸馏水至1000ml，pH 9.0)将SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体(N25)稀释至2.5μg/ml。

2)每孔中加入0.1ml的SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体(N25)，4℃包被12-16小时。

3)弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(KH₂PO₄ 0.2g；Na₂HPO₄ 12H₂O 2.9g；NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Tween-20 0.05％0.5ml加蒸馏水至1000ml)洗板3次。

4)用样本稀释液(8.5g氯化钠，1.4g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钠，0.5ml Tween20，10g BSA，1000ml ddH₂O,pH 7.4)将SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白(100000pg/ml,20000pg/ml,4000pg/ml,1000pg/ml,500pg/ml,0pg/ml)的浓度梯度溶液。

5)向不同孔中加入0.1ml SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白浓度梯度溶液，置37℃孵育30-90分钟，优选45分钟。

6)弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3次。

7)用样本稀释液将生物素标记的抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白抗体(23F2D10)(南京金斯瑞生物科技有限公司，A02050)稀释成1μg/ml。

8)向每孔中加入0.1ml稀释后的生物素标记的抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白抗体(23F2D10)。37℃孵育20-60分钟，优选30分钟。

9)弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3次。

10)用样本稀释液按1：5000稀释Streptavidin-HRP(南京金斯瑞生物科技有限公司， M00091)。

11)每孔中加入稀释后的0.1ml的Streptavidin-HRP，37℃孵育10-15分钟，优选15分钟。

12)弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3次。

13)向每孔中加入TMB底物溶液，37℃反应10-15分钟，优选15分钟。

14)向各孔中加入0.1M终止液(Sigma)终止反应。

15)酶标仪450nm读数,检测曲线见图4。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京金斯瑞生物科技有限公司

<120> 抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法和用途

<130> 1

<150> CN202010566590.X

<151> 2020-06-19

<160> 56

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 137

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN5502 重链可变区氨基酸序列

<400> 1

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro

20 25 30

Asp Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser

35 40 45

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Ile Ile Ala Tyr Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu

85 90 95

Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

100 105 110

Arg Glu Ala Met Thr Met Val Thr Leu Asp Arg Leu Asp Val Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 2

<211> 132

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN5502 轻链可变区氨基酸序列

<400> 2

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser

20 25 30

Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser

35 40 45

Gln Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Tyr Ser Tyr Ser Asn Leu Glu Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu

115 120 125

Val Val Val Lys

130

<210> 3

<211> 141

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN8105 重链可变区氨基酸序列

<400> 3

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro

20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser

35 40 45

Ser Tyr Thr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Ile Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser

65 70 75 80

Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp

85 90 95

Leu Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

100 105 110

Ala Arg Val Glu Trp Asp Thr Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Tyr Ile Phe

115 120 125

Gly Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 4

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN8105 轻链可变区氨基酸序列

<400> 4

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala

20 25 30

Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala

35 40 45

Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gly Gly Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly Thr Gly Gly Phe Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Glu Val Val Val Lys

130

<210> 5

<211> 136

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN0510 重链可变区氨基酸序列

<400> 5

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro

20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser

35 40 45

Ser Tyr Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Gly Ile Gly Gly Asn Ser Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu

85 90 95

Lys Val Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

100 105 110

Arg Asp Asp Asp Tyr Gly Asp Trp Phe Ala Phe Asp Pro Trp Gly Pro

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 6

<211> 135

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN0510 轻链可变区氨基酸序列

<400> 6

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro

20 25 30

Val Ser Ala Ala Val Gly Ser Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser

35 40 45

Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asp Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Glu Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gly Glu Phe Ser Cys Ser Ser Ala Asp Cys Thr Ala Phe Gly Gly

115 120 125

Gly Thr Glu Val Val Val Lys

130 135

<210> 7

<211> 140

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN2604 重链可变区氨基酸序列

<400> 7

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro

20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Asn

35 40 45

Asn Tyr Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Tyr Ile Gly Ile Ile Ser Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

65 70 75 80

Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu

85 90 95

Lys Leu Thr Ser Pro Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

100 105 110

Arg Phe Ser Thr Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Tyr Phe Arg Ala Phe Asp

115 120 125

Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 8

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN2604 轻链可变区氨基酸序列

<400> 8

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser

20 25 30

Thr Ser Glu Pro Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser

35 40 45

Gln Ser Ile Gly Ser Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly

100 105 110

Val Tyr Gly Phe Ser Ser Asp Asp Gly Ile Ala Phe Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Val Val Val Val Lys

130

<210> 9

<211> 134

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1245 重链可变区氨基酸序列

<400> 9

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser

35 40 45

Ser Tyr Asn Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Tyr Ile Gly Tyr Ile Gly Pro Thr Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp

65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu

85 90 95

Gln Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

100 105 110

Arg Glu Asp Ala Thr Asp Trp Gly Leu Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 10

<211> 132

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1245 轻链可变区氨基酸序列

<400> 10

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser

20 25 30

Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser

35 40 45

Glu Ser Ile Gly Asn Ala Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln

50 55 60

Arg Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val

65 70 75 80

Ser Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Ile Phe Ser Gly Ala Asn Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu

115 120 125

Val Val Val Lys

130

<210> 11

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1279 重链可变区氨基酸序列

<400> 11

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro

20 25 30

Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser

35 40 45

Ser Tyr Asn Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Thr Thr Ser Asp Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu

85 90 95

Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly

100 105 110

Arg Gly Trp Leu Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 12

<211> 132

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 279 轻链可变区氨基酸序列

<400> 12

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro

20 25 30

Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ser Ser

35 40 45

Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asn Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ala Gly Gly Tyr Ser Asp Ala Ile Val Asn Phe Gly Gly Gly Thr Glu

115 120 125

Val Val Val Lys

130

<210> 13

<211> 149

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1248 重链可变区氨基酸序列

<400> 13

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Ala Glu Gly Gly

20 25 30

Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Glu Leu Cys Cys Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Ser Leu Ser Asn Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro

50 55 60

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Gly

65 70 75 80

Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg

85 90 95

Asp Ile Asp Gln Ser Thr Gly Cys Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ala

100 105 110

Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Ser Tyr Asp Asp

115 120 125

Tyr Gly Asp Tyr Pro Asp Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu

130 135 140

Val Thr Val Ser Ser

145

<210> 14

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1248 轻链可变区氨基酸序列

<400> 14

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Val Thr Phe Ala Ile Glu Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser

20 25 30

Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser

35 40 45

Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Gly Val Gln Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser

100 105 110

Ala Tyr Tyr Glu Ser Ser Val Val Tyr Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Glu Val Val Val Lys

130

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN5502 VH CDR1

<400> 15

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN5502 VH CDR2

<400> 16

Ile Ile Ala Tyr Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN5502 VH CDR3

<400> 17

Ala Arg Glu Ala Met Thr Met Val Thr Leu Asp Arg Leu Asp Val

1 5 10 15

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN5502 VL CDR1

<400> 18

Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN5502 VL CDR2

<400> 19

Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser

1 5

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN5502 VL CDR3

<400> 20

Gln Gln Gly Tyr Ser Tyr Ser Asn Leu Glu Tyr Ala

1 5 10

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN8105 VH CDR1

<400> 21

Ser Tyr Thr Met Gly

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN8105 VH CDR2

<400> 22

Ile Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN8105 VH CDR3

<400> 23

Val Glu Trp Asp Thr Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Tyr Ile Phe Gly Ile

1 5 10 15

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN8105 VL CDR1

<400> 24

Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN8105 VL CDR2

<400> 25

Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser

1 5

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN8105 VL CDR3

<400> 26

Gln Gly Gly Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly Thr Gly Gly

1 5 10

<210> 27

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN0510 VH CDR1

<400> 27

Ser Tyr Asp Met Thr

1 5

<210> 28

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN0510 VH CDR2

<400> 28

Gly Ile Gly Gly Asn Ser Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 29

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN0510 VH CDR3

<400> 29

Asp Asp Asp Tyr Gly Asp Trp Phe Ala Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 30

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN0510 VL CDR1

<400> 30

Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asp Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN0510 VL CDR2

<400> 31

Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN0510 VL CDR3

<400> 32

Ser Ser Ala Asp Cys Thr Ala

1 5

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN2604 VH CDR1

<400> 33

Asn Tyr Ala Met Gly

1 5

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN2604 VH CDR2

<400> 34

Ile Ile Ser Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly

1 5 10 15

<210> 35

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN2604 VH CDR3

<400> 35

Phe Ser Thr Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Tyr Phe Arg Ala Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 36

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN2604 VL CDR1

<400> 36

Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asp Leu Ser

1 5 10

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN2604 VL CDR2

<400> 37

Tyr Ser Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 38

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN2604 VL CDR3

<400> 38

Leu Gly Val Tyr Gly Phe Ser Ser Asp Asp Gly Ile Ala

1 5 10

<210> 39

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1245 VH CDR1

<400> 39

Ser Tyr Asn Met Gln

1 5

<210> 40

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1245 VH CDR2

<400> 40

Tyr Ile Gly Pro Thr Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 41

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1245 VH CDR3

<400> 41

Glu Asp Ala Thr Asp Trp Gly Leu Asp Ile

1 5 10

<210> 42

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1245 VL CDR1

<400> 42

Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Asn Ala Leu Ser

1 5 10

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1245 VL CDR2

<400> 43

Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 44

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1245 VL CDR3

<400> 44

Gln Gln Ile Phe Ser Gly Ala Asn Ile Asp Asn Ala

1 5 10

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1279 VH CDR1

<400> 45

Ser Tyr Asn Met Gly

1 5

<210> 46

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1279 VH CDR2

<400> 46

Thr Thr Ser Asp Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1279 VH CDR3

<400> 47

Gly Trp Leu Tyr Phe Asn Leu

1 5

<210> 48

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1279 VL CDR1

<400> 48

Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asn Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1279 VL CDR2

<400> 49

Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser

1 5

<210> 50

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1279 VL CDR3

<400> 50

Ala Gly Gly Tyr Ser Asp Ala Ile Val Asn

1 5 10

<210> 51

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1248 VH CDR1

<400> 51

Asn Ser Tyr Trp Ile Cys

1 5

<210> 52

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1248 VH CDR2

<400> 52

Cys Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Val

1 5 10 15

Asn Gly

<210> 53

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1248 VH CDR3

<400> 53

Gly Arg Ser Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Tyr Pro Asp Tyr Phe Asn Leu

1 5 10 15

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1248 VL CDR1

<400> 54

Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 55

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1248 VL CDR2

<400> 55

Ala Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

1 5 10

<210> 56

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RN1248 VL CDR3

<400> 56

Gln Ser Ala Tyr Tyr Glu Ser Ser Val Val Tyr Thr Val

1 5 10

Claims

1.一种抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段包含重链可变区和轻链可变区，其中

(a)所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，

所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:16、22、28、34、40、46或52所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体；所述HCDR2包含选自SEQ ID NO:17、23、29、35、41、47或53所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体；所述HCDR3包含选自SEQ ID NO:18、24、30、36、42、48或54所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列包含至多三个氨基酸突变的变体；以及

(b)所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其功能片段，其中，

所述HCDR1序列包含选自SEQ ID NO:16、22、28、34、40、46或52所示的氨基酸序列；所述HCDR2序列包含选自SEQ ID NO:17、23、29、35、41、47或53所示的氨基酸序列；所述HCDR3序列包含选自SEQ ID NO:18、24、30、36、42、48或54所示的氨基酸序列；以及

所述LCDR1序列包含选自SEQ ID NO:19、25、31、37、43、49或55所示的氨基酸序列；所述LCDR2序列包含选自SEQ ID NO:20、26、32、38、44、50或56所示的氨基酸序列；所述LCDR3序列包含选自SEQ ID NO:21、27、33、39、45、51或57所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其功能片段，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自如下序列：

(a)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:16、17和18所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQID NO:19、20和21所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；

(b)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:22、23和24所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQID NO:25、26和27所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；

(c)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:28、29和30所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQID NO:31、32和33所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；

(d)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:34、35和36所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQID NO:37、38和39所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；

(e)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:40、41和42所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQID NO:43、44和45所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；

(f)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:46、47和48所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQID NO:49、50和51所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；或

(g)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和54所示氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体；以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQID NO:55、56和57所示的氨基酸序列或所示氨基酸序列分别包含至多三个氨基酸突变的变体。

4.根据权利要求3中所述的单克隆抗体或其功能片段，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自如下序列：

(e)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:40、41和42所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:43、44和45所示的氨基酸序列；

5.根据权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体或其功能片段，其中，所述重链可变区序列包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12或14所示氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列；以及

所述轻链可变区序列包含与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13或15所示氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。

6.根据权利要求5中所述的单克隆抗体或其功能片段，其中，

所述重链可变区序列包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列；以及所述轻链可变区序列包含SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13或15所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求1～6中任一项所述单克隆抗体或其功能片段，所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列：

(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:2所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:3所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列；

(b)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:4所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:5所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列；

(c)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:7所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列；

(d)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:8所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:9所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列；

(e)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:10所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:11所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列；

(f)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:12所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:13所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列；或

(g)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:14所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:15所示序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。

8.根据权利要求7所述单克隆抗体或其功能片段，所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列：

(a)所述重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQID NO:3所示的氨基酸序列；

(b)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

(c)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

(d)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；

(e)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；

(f)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；或

(g)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的单克隆抗体或其功能片段，其特征在于，所述抗体是鼠源的、嵌合的、人源化的或者人的。

10.编码权利要求1～8中任一项所述的抗SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白单克隆抗体或其功能片段的分离的多核苷酸。

11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含编码所述单克隆抗体或其功能片段的重链可变区的核苷酸序列，和编码所述单克隆抗体或其功能片段的轻链可变区的核苷酸序列。

12.包含根据权利要求10或11所述的多核苷酸的表达载体。

13.包含根据权利要求12所述表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。

14.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1～8中任一项所述的单克隆抗体或其功能片段和药学上可接受的载体。

15.一种检测试剂，所述试剂组分中包含权利要求1～8中任一项所述的单克隆抗体或其功能片段。

16.权利要求1～8中任一项所述单克隆抗体或其功能片段在冠状病毒检测和诊断产品中的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-Cov或SARS-Cov-2，优选为SARS-Cov-2。

18.一种检测冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒中包含权利要求1～8中任一项所述的单克隆抗体或其功能片段。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-Cov或SARS-Cov-2，优选为SARS-Cov-2。