JP5512824B2 - B型肝炎ウイルス表面抗原に特異的に結合するヒト抗体 - Google Patents
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Description
実施例1:RNAの分離
HBV表面抗原に特異的に結合する抗体を選別するために、ヒト抗体ライブラリを構築した。ヒト骨髄、ヒト胸腺、ヒト脾臓およびヒトB細胞から得られたRNAの混合物を使用した。ヒトB細胞RNAを除くすべてのRNAはClontech社(米国)から購入し、ヒトB細胞RNAは下記のように分離した。
実施例2:抗体遺伝子の増幅
実施例1で分離したRNA1μgおよびpd(T)12〜18(0.5μg/μL)1μLを蒸留水と混合して最終体積を12.5μLに合わせた。上記混合物を70℃で2分間反応させ氷で冷却させた。その後、これに5X反応緩衝液、10mM dNTP混合物、組換えRNase阻害剤およびMMLV逆転写酵素(Clontech、米国)を添加して最終体積を20μLに合わせた後、42℃で1時間、95℃で5分間反応させてcDNAを合成した。LiquiMix QM Premix、Magenta(Neurotics Inc、韓国)、鋳型として4μLのcDNA、19μLの蒸留水並びにそれぞれscFv領域(single chain Fv)、重鎖可変領域、および軽鎖可変領域(kappaおよびlambda)のために考案された1μL(25pmol/μL)のプライマー[ScFv:配列番号9(Forward)、10(Reverse−κ)および11(Reverse−λ);重鎖可変領域:配列番号12(Forward−VH1)、13(Forward−VH2)、14(Forward−VH3)、15(Forward−VH4)、16(Forward−VH5)、17(Forward−VH6)、18(Forward−VH7)および19(Reverse);軽鎖可変領域κ鎖:配列番号20(Forward−VK1/3A)、21(Forward−VK1/3B)、22(Forward−VK2)、23(Forward−VK4)、24(Forward−VK5)、25(Forward−VK6)、26(Reverse−JK−A)、27(Reverse−JK−B)および28(Reverse−JK−C);軽鎖可変領域λ鎖:配列番号29(Forward−VL1〜3−A)、30(Forward−VL1〜3−B)、31(Forward−VL4)、32(Forward−VL5)、33(Forward−VL6)、34(Forward−VL7)、35(Forward−VL8)、36(Forward−VL9)、37(Forward−VL10)、38(Reverse−JL−A)および39(Reverse−JL−B)]を使用してPCR反応を行った。
実施例3:抗体DNAの制限酵素切断
実施例2で準備したVHおよびVLをそれぞれ制限酵素SfiI/BspEIおよびBspEI/NotIで切断し、上記切断した断片を1.2%のアガロースゲル電気泳動で分離した後、キアゲンキットを用いて精製した。
実施例4:抗体DNAのライゲーションおよびライブラリの製造
ファージディスプレイベクターpKS4H(緑十字社、韓国、韓国特許第635370号参照)を制限酵素SfiI/BspEIを使用して切断し、1.2%アガロースゲル電気泳動を利用して分離した後、キアゲンキットを利用して精製した。40μgのpKS4Hを実施例3で用意された10μgのVHと混合し、これにT4 DNAリガーゼ(New England BioLabs、米国)を添加した後、25℃で一晩中反応させた。上記リガーゼ反応混合物を、キアゲンキットを用いて精製し、大腸菌XL1−blue(Stratagene社、米国)に電気穿孔法(electroporation)により形質転換させた。上記形質転換体を、100mLの培地で一晩培養し、プラスミドを分離した。上記のプラスミドを“pKS4H−VH−△VL”と命名した。
実施例5:HBV表面抗原に結合する抗体の選別
HBV表面抗原に結合する抗体をパンニング法(Engberg et al.,Mol.Biotechnol.,6、287−310、1996およびKim et al.,Gene、241、19−25、2000; Kim et al., Hybrid Hybridomics、21、385−392、2002)を応用して選別した。具体的に、HBVの表面抗原(緑十字社、韓国)をPBSバッファーで希釈し、それぞれのイムノチューブ(immunotube、NUNC社、デンマーク)を、上記希釈された抗原でコーティングした。そして、上記のコーティングされたイムノチューブに実施例4で製造したファージライブラリを添加し、37℃で2時間培養した。HBVに結合するファージを、0.1Mグリシンバッファー(pH2.0)を使用して溶出させた。以降、上記ファージで大腸菌XL1−blue細胞を感染させヘルパーファージ(Stratagene社、米国)を添加した。上記大腸菌(E.coli)を一晩培養し、これにPEG溶液(20%PEG8000および15%NaCl)を添加した。そして、沈殿したファージを回収して(ファージレスキュー)、上記ファージを再度HBVの表面抗原がコーティングされたイムノチューブと反応させて、上記過程を4回繰り返した。上記過程からHBVの表面抗原に結合する3つのヒト抗体を選別し、これをHB48−33、HB48−35およびHB48−59と命名した。ファージディスプレイライブラリを用いてヒト抗体を選別する過程を図3に示した。
実施例6:選別された抗体の配列分析
実施例5で選別されたヒト抗体HB48−33、HB48−35とHB48−59を分泌するコロニーを50μg/mLのカルベニシリンを含有する10 mLのLB培地で一晩培養した後、キアゲンプラスミドミニキット(Qiagen、Valencia、CA、米国)を使用して、プラスミドを分離した。上記のプラスミドをSfiI/NotIで切断した後、抗体の断片の挿入を確認するためにアガロースゲルで電気泳動を行った。プラスミドに挿入されたscFvのDNA配列を分析した。scFvのヌクレオチド配列をGenotech社(大田、韓国)にてシーケンスプライマである配列番号40のp033で分析した。
実施例7:発現ベクターの製造
上記の抗体断片を完全な免疫グロブリンに転換させるために、抗体発現ベクターpRC13およびpKC12を使用した(韓国特許第523732号参照、寄託番号KCLRF−BP−00054)。
実施例8:抗体分泌動物細胞株の製造
形質感染24時間前に、2×105個のCHO(chinese hamster ovary)細胞を10%のFBS(Life Technologies社、米国)を含有するα−MEM培地(Life Technologies社、米国)が入ったT−25フラスコ(NUNC社、デンマーク)で、培養密度(confluency)が50%に到達する直前まで、5%CO2の存在下で、37℃のインキュベーターで培養した。その後、30μgのリポペクチン(Life Technologies社、米国)を1.5mLのOpti−MEM(Life Technologies社、米国)に入れて常温で90分間放置した。同時に、8μgのHB48−33−Heavy−pRC13および7μgのHB48−33−Light−pKC12、8μgのHB48−35−Heavy−pRC13および7μgのHB48−35−Light−pKC12、8μgのHB48−59−Heavy−pRC13および7μgのHB48−59−Light−pKC12をそれぞれ混合し、1.5mLのOpti−MEMに入れてから、常温で90分間放置した。90分後、リポペクチンを含有する培地をHB48−33−Heavy−pRC13&HB48−33−Light−pKC12、HB48−35−Heavy−pRC13&HB48−35−Light−pKC12、およびHB48−59−Heavy−pRC13&HB48−59−Light−pKC12を含有する培地と混合した後、15分間室温で反応させた。反応させる間に、上記細胞から培地を除去し、細胞をPBSで3回洗浄した。上記洗浄された細胞に上記の反応混合物を入れて6時間培養した。6時間後、上記反応混合物を除去し、α−MEM培地を入れて48時間培養した。そして、上記細胞をトリプシン(Life Technologies社、米国)で処理してフラスコから外した後、α−MEM培地で希釈し、96−ウェルプレート(NUNC社、デンマーク)に継代した。このとき、α−MEM培地はリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含有していないのに対し、10%の透析されたFBS(Life Technologies社、米国)および550μg/mLのG418(Sigma社、米国)を含有する。2日ごとに上記培地を新しい培地に交換した。ELISA分析のために、コロニーを形成した培養上清を回収し、選別された細胞を12−ウェルプレートに移した。細胞が12−ウェルプレートでよく育てば、細胞を6−ウェルプレートに移して、細胞が6−ウェルプレートでもよく育つと、これにメトトレキサート(MTX、中外製薬、韓国)を処理した。MTXの初期濃度は20nMであり、細胞の適応に応じて、80nM、320nMおよび1μMで増加した。1μMの濃度で生存して高い量の抗体分泌を持つ細胞株を選別した。上記選別された細胞株を、スピナーフラスコと無血清培地とを使用して65rpm、5%CO2および37℃のインキュベーターで大量に培養した。100mLの無血清培地が入った250mLフラスコで108細胞を培養した。細胞数が初期濃度の2倍になると、1,000rpmで5分間遠心分離して細胞を回収した。上記回収した細胞を再び200mLの培地が入った500mLフラスコで培養した。細胞数が初期濃度の2倍になると、1,000rpmで5分間遠心分離して細胞を回収し、1Lの培地が入った3Lスピナーフラスコに移した。ブチル酸ナトリウム(Aldrich社、米国)を最終濃度2mMになるように添加し、上記細胞を5日間培養した後、培地から上清を回収した。スピナーフラスコから回収した上清から、Protein A−アガロースカラム(Amersham Pharmacia Biotech社、米国)を使用して抗体を精製し、SDS−PAGEにより分析した。
実施例9:抗体の親和性の測定
実施例8で得られた抗体のHBV表面抗原に対する親和性を競合ELISA法(Kim et al.,Hybridoma、20、265−272、2001)により決定し、上記の結果を図10に示した。簡略な手順は次のとおりである。
A.プレートの準備
PBS中で2μg/mLで希釈された、100μLのHBV表面抗原(緑十字社、韓国)をELISAプレートの各ウェルに入れ、4℃で一晩培養した。プレートの各ウェルをPBSTで1回洗浄し、各ウェルに300μLの1%BSA−PBS溶液を加えた後、室温で1時間培養した。
100μLのそれぞれ精製された抗体(0.5μg/mL)をプレートの各ウェルに入れ、室温で2時間反応させた後、PBSTで4回洗浄した。
1%BSA−PBSで1:5,000に希釈された100μLのヤギ抗ヒトIgG(Fab specific)−パーオキシダーゼ接合体(Sigma)を各ウェルに添加し、室温で1時間培養した後、PBSTで4回洗浄した。
100μLのTMB(3,3’、5,5’−テトラメチルベンジジン(Tetramethylbenzidine)、マイクロウェル パーオキシダーゼ サブストレート システム(KPL、MD、米国))を各ウェルに添加した後、405nmでO.D値を測定した。抗体の適正濃度を半分−最大結合値(half−maximum binding)を示す抗体濃度として決定した。
A.プレートの準備
PBS中で2μg/mLで希釈された、100μLのHBV表面抗原(緑十字社、韓国)をELISAプレートの各ウェルに入れ、4℃で一晩培養した。各ウェルをPBSTで1回洗浄し、各ウェルに300μLの1%BSA−PBS溶液を加えた後、室温で1時間培養した。
2μgのHBV表面抗原を2の倍数で連続希釈し、プレートの各ウェルに10μLの上記希釈されたHBsAgを添加した。それから、(1)で決定された適正濃度に希釈した90μLの抗体を各ウェルに添加し、室温で2時間反応させた後、PBSTで4回洗浄した。
ヤギ抗−ヒトIgG(Fab specific)−パーオキシダーゼ接合体(Sigma)1%BSA−PBS溶液で5,000倍に希釈し、各ウェルに100μLずつ添加し、室温で1時間反応させた後、PBSTで4回洗浄した。
TMB(3,3’、5,5’−テトラメチルベンジジン(Tetramethylbenzidine)、マイクロウェルパーオキシダーゼサブストレートシステム(KPL、MD、米国))溶液を100μLずつ各ウェルに添加した後、405nmでO.D値を測定した。最大結合値(競合する上皮成長因子受容体がない状態のELISA O.D値)の50%を阻害するHBV表面抗原の濃度を親和性(Kd)で算定した。
実施例10:急性B型肝炎のマウスモデルを用いたin vivoの効果テスト
急性B型肝炎の類似兆候を示すように流体力学注入法(Hydrodynamic injection)によってHBV DNAを注入して製造したC57BL6マウスモデルにおいて、HB48−33、HB48−35およびHB48−59のHBsAgに対する中和能を比較した。
Claims (12)
- a)配列番号1のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域と、
b)配列番号2、3、および4のいずれかのアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域と、
c)重鎖定常領域と、
d)軽鎖定常領域とを含む、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)に特異的に結合するヒト抗体。 - 配列番号1のアミノ酸配列を持つ抗体重鎖可変領域をコードするDNA。
- 上記DNAが配列番号5のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む、請求項2に記載のDNA。
- 配列番号2、3、および4のいずれか1つのアミノ酸配列を持つ抗体軽鎖可変領域をコードするDNA。
- 上記DNAが配列番号6、7、および8のいずれか1つのヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む、請求項4に記載のDNA。
- 請求項2のDNAを含む、HBV表面抗原に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を発現するための発現ベクター。
- 上記ベクターは、図5に地図で示す、HB48−33−Heavy−pRC13、HB48−35−Heavy−pRC13、またはHB48−59−Heavy−pRC13である、請求項6に記載の発現ベクター。
- 請求項4のDNAを含む、HBV表面抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現するための発現ベクター。
- 上記ベクターは、図6に地図で示すHB48−33−Light−pKC12、図7に地図で示すHB48−35−Light−pKC12、または図8に地図で示すHB48−59−Light−pKC12である、請求項8に記載の発現ベクター。
- 請求項6の発現ベクター及び請求項8の発現ベクターに形質転換された動物細胞株。
- 上記動物細胞株が、CHO(Chinese hamster ovary)、HEK 293、またはNS0細胞株である、請求項10に記載の動物細胞株。
- 請求項1の抗体を含むB型肝炎の予防または治療用薬学組成物。
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