KR102558839B1 - 다가 b형 간염 바이러스 항원 결합 분자 및 그의 용도 - Google Patents

다가 b형 간염 바이러스 항원 결합 분자 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 각각 적어도 2개의 항체 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하는 적어도 2개의 2가의 결합 단위 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 다량체 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질 결합 분자, 예를 들어 이량체 IgA 또는 오량체 또는 육량체 IgM의 결합 분자를 제공하고, 각각의 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편은 HBV 항원 결합 도메인과 회합된다. 또한, 본 개시내용은 다량체 결합 분자, 다량체 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 다량체 결합 분자의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

Description

다가 B형 간염 바이러스 항원 결합 분자 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2015년 3월 25일 출원된 미국 특허 가출원 제62/137,881호의 이익을 주장하고, 이 출원은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 다가 B형 간염 바이러스 항원 결합 분자 및 그의 용도에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(HBV)는 이중 가닥 DNA 바이러스의 클래스에 속하고, 4개의 주요 혈청형(adr, adw, ayr 및 ayw) 및 8개의 주요 유전자형(A 내지 H)을 포함하는 것으로 현재 알려져 있다. 혈청형은 외피 단백질 서열의 변화를 기반으로 하는 반면, 8개의 유전자형은 특정 지리적 영역에 걸쳐 전세계적으로 뚜렷하게 분포되어 있다. 유전자형 차이는 질환의 중증도 및 치료에 대한 반응의 효과와 관련되었다(문헌 [Kramvis et al., Vaccine, 23(19):2409-23, 2005], 및 [Magnius et al., Intervirology, 38(1-2):24-34, 1995] 참조).
HBV 게놈은 부분적으로 이중 가닥인 원형 DNA로 이루어진다. 즉, 게놈의 일부가 단일 가닥이다. HBV 게놈의 더 긴 부분의 길이는 3020 내지 3320개 뉴클레오티드이고, 더 짧은 부분의 길이는 1700 내지 2800개 뉴클레오티드이다. HBV 게놈의 더 긴 부분은 바이러스 DNA 폴리머라제에 연결된다.
HBV-감염 세포는 감염성 바이러스 입자 이외에, 코어가 없는 구형 및 섬유상(filamentous) 비감염성 입자를 생성할 수 있다. 이 비감염성 입자는 HBV에 감염된 개체의 감염성 입자보다 1,000배 내지 100,000배나 더 많은 수를 차지할 수 있다(문헌 [Chai et al. J. Virol. 82:7812-7817, 2005] 참조).
다음을 포함하는, HBV에 의해 생산되는 5가지 바이러스 단백질이 존재한다:
1. 외피 단백질(S 유전자에 의해 코딩되는 표면 항원, 즉 HBsAg로도 알려짐);
2. 폴리머라제(P 유전자에 의해 코딩되는 pol);
3. B형 간염 X-단백질(X 유전자에 의해 코딩되는 HBxAg, 즉 X-항원);
4. 뉴클레오캡시드 또는 코어 항원(C 유전자에 의해 코딩되는 HBcAg); 및
5. 프리코어(precore)(코어 및 프리-C 유전자에 의해 코딩되는 HBeAg).
HBsAg는 HBV 게놈에서 3개의 독립적인 개시 코돈으로부터 3개의 크기로 생산된다. 이 유전자 산물의 소형(Small), 중형(Medium) 및 대형(Large) 버전은 3개의 지정된 도메인, 즉 (i) S 단독(S), (ii) 프리-S2 및 S(M), 또는 (iii) 프리-S1 및 프리-S2 및 S(L) 중 하나 이상의 조합이다(도 1A). 감염성 입자는 가장 빈번하게 이 항원의 세 가지 버전을 모두 보유하고 있으며, 프리-S1 단백질(도 1B)과 NTCP 수용체(SLC10A1 유전자에 의해 코딩되는 타우로콜산나트륨 동시 수송 폴리펩티드 또는 간 담즙산 수송체) 사이의 상호 작용을 통해 간세포에 진입할 수 있다. 따라서, 프리-S1 항원은 감염과 관련되고, 우선적으로 감염성 바이러스 입자에서 발현된다([Hong et al., Virology, 318:134-141, 2004]; [Park et al., Antiviral Res., 68:109-115, 2005]).
HBeAg은 프리코어 단백질이고, 분비된다. 프리코어 단백질은 면역 조절 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. HBeAg은 코어 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 것으로 밝혀졌다(Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:14913-14918, 2004).
캡시드, 폴리머라제 및 표면 항원 단백질의 기능은 명확한 것으로 보이지만, "X" 유전자의 기능은 간세포 암종(HCC: hepatocellular carcinoma)의 발달에서 역할을 수행하는 것으로 알려져 있지만, 아직 완전히 밝혀지지 않았다([Tang et al., Cancer Sci ., 97:977-983, 2006], [Ng et al., J. Gastroent ., 46:974-990, 2011], 및 [Kew, Michael C., J. Gastro . Hepat., 26 Suppl. 1:144-152, 2011]).
B형 간염 바이러스는 전 세계적으로 20억 명 초과의 사람들을 감염시킨 것으로 여겨진다. 전 세계적으로 만성적으로 또는 지속적으로 감염된 개체는 3억 5천 내지 4억 명으로 생각되고, HBV 또는 HBV 감염에 의한 합병증으로 인해 전 세계적으로 매년 78만 명이 사망한다. HBV는 인간 면역결핍 바이러스(HIV: human immunodeficiency virus)보다 50배 내지 100배 더 많이 감염된다. HBV는 감염성 혈액 또는 체액에 노출되어 전염된다. 감염 증상은 식욕 상실, 피로, 미열, 황달, 근육 및 관절의 통증, 메스꺼움 및 구토, 노란 피부 및 어두운 소변을 포함한다. 일부 개체는 자신의 시스템으로부터 바이러스를 완전히 제거할 수 없기 때문에, 간 손상 및 간경변을 일으킬 수 있는 만성 감염이 발생한다. 만성 HBV 환자의 약 15 내지 40%에서 간경변 및/또는 HCC가 발생한다(Xu et al., Canc . Lett ., 345:216-222, 2014). HBV 바이러스 게놈은 숙주의 게놈에 지속적으로 존재하고, 청소된 후에 재활성화되어 새로운 HBV 증상을 유발할 수 있다. 간암의 비율은 HBV 감염이 있는 사람들에서 훨씬 더 높다.
바이러스의 청소(clearance) 및 발병은 모두 적응 또는 획득 면역 반응에 의해 매개된다. 여기에는 체액성(항체 매개) 면역 성분 및 세포 매개 면역 성분이 모두 포함된다. 특히, 감염은 만성 감염에서 간 조직의 관찰된 손상의 대부분을 생산하는 바이러스 특이적 세포독성 T 림프구(CTL: cytotoxic T lymphocyte)의 반응을 촉발한다.
HBV 감염을 퇴치하기 위한 많은 예방 전략이 개발되어 왔다. 백신은 바이러스의 재조합 표면 항원을 기초로 하여 개발되었다(WO 2014/0489101 및 문헌 [Shouval, D., J. Hepatol . 39 (Suppl. 1):70-76, 2003] 참조). 또한, HBV 면역글로불린(HBV)은 높은 역가의 개체로부터의 인간 혈청에서 개발되었다. HBIG는 일반적으로 아동에게 전염되지 않도록 HBV 감염 모체의 유아에게 제공된다. HBIG가 노출이 알려진 후 24시간 이내에 투여되면, HBV 감염을 예방할 수 있다. HBIG는 또한 일반적으로 새로운 조직의 재 감염을 예방하기 위해 HBV에 감염된 간 이식 환자에게 투여된다.
만성적으로 감염된 개체는 치료를 위한 후보자이다. 그러나, 현재 만성 HBV 감염을 치료하는 것으로 알려진 승인된 치료법은 존재하지 않는다. 이용가능한 치료법은 복제로부터 바이러스를 배제함으로써 추가 감염을 차단할 수 있다. 만성 HBV 감염을 포함한 HBV 감염을 치료 및/또는 치유할 목적으로 다양한 모노클로날 항체 및 조합 요법이 연구되었지만, 아직 상업화된 것은 존재하지 않는다.
만성 감염에 대한 치료 옵션, 예를 들어, 인터페론 및 라미부딘은 중간 정도로만 효과적이고, 심각한 부작용을 야기하는 것으로 알려져 있다. HBV 감염의 치료 또는 예방을 위한 치료제 개발에 대한 노력에도 불구하고, HBV 감염, 예를 들어 만성 HBV 감염을 표적으로 하는 새로운 치료제 개발이 계속 필요하다.
개요
하나 이상의 B형 간염 항원에 결합하기 위한 특이성을 갖는 다량체 결합 분자의 다양한 실시양태가 개시되어 있다. 본 개시내용은 적어도 2개의 2가 결합 단위 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 다가 결합 분자를 제공하고; 여기서 각각의 결합 단위는 항원 결합 도메인과 각각 회합된 적어도 2개의 항체 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하고; 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 감염성 바이러스 입자의 표면 상에서, B형 간염 바이러스(HBV) 감염된 세포의 경우 표면 상에서 또는 이들의 조합 상에서 발현되는 HBV 항원에 특이적으로 결합하고, 결합 분자는 HBV 항원에 특이적으로 결합하는 동일한 항원 결합 도메인을 포함하는 참조 단일 2가 결합 단위보다 더 효능이 있다. 특정 측면에서, 참조 단일 2가 결합 단위는 IgG 항체이다.
특정 측면에서, 결합 분자는 2개의 2가 IgA 결합 단위 또는 그의 단편 및 J-쇄 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 이량체 결합 분자일 수 있고, 여기서 각각의 결합 단위는 항원 결합 도메인과 각각 회합된 2개의 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 측면에서, 이량체 결합 분자는 분비 성분, 또는 그의 단편 또는 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편은 각각 Cα2 도메인 또는 Cα3-tp 도메인을 포함하고, Cα1 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, IgA 중쇄 불변 영역은 인간 IgA 불변 영역이다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 이량체 결합 분자의 각각의 결합 단위는 IgA 불변 영역 또는 그의 단편에 대하여 아미노 말단에 위치하는 VH를 각각 포함하는 2개의 IgA 중쇄 및 면역글로불린 경쇄 불변 영역에 대하여 아미노 말단에 위치하는 VL을 각각 포함하는 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 결합 분자는 각각 5 또는 6개의 2가 IgM 결합 단위를 포함하는 오량체 또는 육량체 결합 분자일 수 있고, 여기서 각각의 결합 단위는 항원 결합 도메인과 각각 회합된 2개의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 측면에서, IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편은 각각 Cμ3 도메인 및 Cμ4-tp 도메인을 포함하고, Cμ2 도메인, Cμ1 도메인 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, J-쇄, 또는 그의 단편, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하는 오량체 결합 분자가 제공된다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 육량체 또는 오량체 결합 분자의 적어도 하나의 중쇄 불변 영역은 인간 IgM 불변 영역이다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 육량체 또는 오량체 결합 분자의 각각의 결합 단위는 불변 영역 또는 그의 단편에 대하여 아미노 말단에 위치하는 VH를 각각 포함하는 2개의 중쇄 및 면역글로불린 경쇄 불변 영역에 대하여 아미노 말단에 위치하는 VL을 각각 포함하는 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
특정 측면에서, 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, 본원에서 제공되는 IgM 항체의 적어도 하나의 결합 단위는 감염성 바이러스 입자의 표면 상에서, HBV 감염된 세포의 표면 상에서 또는 이들의 조합 상에서 발현되는 B형 간염 바이러스(HBV) 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하고, 결합 단위 내의 2개의 중쇄는 동일하다. 특정 측면에서, 결합 단위 내의 2개의 경쇄는 동일하다. 특정 측면에서, 결합 단위의 경쇄 불변 영역은 인간 람다 불변 영역 또는 인간 카파 불변 영역이다. 특정 측면에서, 결합 분자는 감염성 바이러스 입자의 표면 상에서, HBV 감염된 세포의 표면 상에서 또는 이들의 조합 상에서 발현되는 B형 간염 바이러스(HBV) 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 또는 적어도 12개의 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 측면에서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 또는 적어도 12개의 결합 도메인이 동일하다.
결합 분자가 오량체인 경우, 결합 분자는 J-쇄 또는 그의 단편, 또는 그의 기능적 단편, 또는 그의 기능적 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, J-쇄 또는 그의 단편은 서열 번호(SEQ ID NO) 54의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 특정 측면에서, J-쇄 또는 그의 단편은 이종(성) 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 이종 폴리펩티드는 직접적으로 또는 간접적으로 J-쇄 또는 그의 단편에 융합될 수 있다. 특정 측면에서, 이종 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 J-쇄 또는 그의 단편에 간접적으로 융합될 수 있다. 특정 측면에서, 펩티드 링커는 예를 들어, 적어도 5개의 아미노산 내지 25개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 펩티드 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 72)로 이루어진다. 이종 폴리펩티드는 J-쇄의 N-말단 또는 그의 단편에, J-쇄의 C-말단 또는 그의 단편에, 또는 J-쇄의 N-말단 및 C-말단 둘 모두 또는 그의 단편에 또는 그 근처에서 융합될 수 있다. 특정 측면에서, 이종 폴리펩티드는 결합 도메인, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 항원 결합 단편은 예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일쇄 Fv(scFv) 단편, 디술피드 연결된 Fv(sdFv) 단편, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 특정 측면에서, 이종 폴리펩티드는 CD3ε에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 특정 측면에서, 변형된 J-쇄는 서열 번호 68(V15J) 또는 서열 번호 71(J15V)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 특정 측면에서, 이들 변형된 특정 J-쇄는 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 변형된 J-쇄는 서열 번호 67(V15J) 또는 서열 번호 70(J15V)의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어 IgM 항체에 의해 결합된 HBV 항원은 HBV 항원이 비감염성 서브바이러스(sub-viral) 입자 상에서 발현되는 것보다 높은 밀도로 감염성 바이러스 입자의 표면 상에서, HBV 감염된 세포의 표면 상에서 또는 이들의 조합 상에서 발현된다. 특정 측면에서, HBV 항원은 B형 간염 표면 항원(HBsAg), 프리코어 항원, 코어 항원, X-항원 또는 이들의 임의의 조합이다. 결합 분자가 HBsAg에 결합하는 특정 측면에서, 이는 S 영역(S), 프리-S2 및 S 영역, 또는 프리-S1, 프리-S2 및 S 영역, 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, IgM 항체의 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 3, 서열 번호 2 및 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 3, 서열 번호 5 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8, 서열 번호 7 및 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11, 서열 번호 14 및 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 21, 서열 번호 17 및 서열 번호 22, 서열 번호 18 및 서열 번호 23, 서열 번호 19 및 서열 번호 24, 서열 번호 20 및 서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 27, 서열 번호 26 및 서열 번호 28, 서열 번호 26 및 서열 번호 29, 서열 번호 30 및 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33, 서열 번호 34 및 서열 번호 35, 서열 번호 34 및 서열 번호 36, 서열 번호 37 및 서열 번호 38, 서열 번호 39 및 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42, 서열 번호 43 및 서열 번호 44, 서열 번호 45 및 서열 번호 46, 서열 번호 47 및 서열 번호 48, 서열 번호 49 및 서열 번호 50, 서열 번호 51 및 서열 번호 52, 서열 번호 62 및 서열 번호 6, 서열 번호 73 및 서열 번호 74, 또는 서열 번호 75 및 서열 번호 76의 VH 및 VL 아미노산 서열에 포함되는, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 1 또는 2개의 단일 아미노산 치환을 포함하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 1 또는 2개의 단일 아미노산 치환을 함유하는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역을 포함한다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, IgM 항체의 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 VH 아미노산 서열 서열 번호 12 또는 서열 번호 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 1 또는 2개의 단일 아미노산 치환을 함유하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함한다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, IgM 항체의 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH 및 VL은 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 3, 서열 번호 2 및 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 3, 서열 번호 5 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8, 서열 번호 7 및 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11, 서열 번호 14 및 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 21, 서열 번호 17 및 서열 번호 22, 서열 번호 18 및 서열 번호 23, 서열 번호 19 및 서열 번호 24, 서열 번호 20 및 서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 27, 서열 번호 26 및 서열 번호 28, 서열 번호 26 및 서열 번호 29, 서열 번호 30 및 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33, 서열 번호 34 및 서열 번호 35, 서열 번호 34 및 서열 번호 36, 서열 번호 37 및 서열 번호 38, 서열 번호 39 및 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42, 서열 번호 43 및 서열 번호 44, 서열 번호 45 및 서열 번호 46, 서열 번호 47 및 서열 번호 48, 서열 번호 49 및 서열 번호 50, 서열 번호 51 및 서열 번호 52, 서열 번호 62 및 서열 번호 6, 서열 번호 73 및 서열 번호 74, 또는 서열 번호 75 및 서열 번호 76과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, IgM 항체의 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 항체 VH를 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호 12 또는 서열 번호 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 본원에 제공되는 결합 분자는 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 IgM 중쇄 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 육량체 또는 오량체 IgM 항체 또는 그의 단편이다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 결합 분자는 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 IgM 중쇄 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 육량체 또는 오량체 IgM 항체 또는 그의 단편이다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, IgM 항체는 만성적으로 감염된 세포에서 바이러스 중화, 감염된 세포의 사멸, 바이러스 청소의 향상, HBV 증식, 잠복 또는 유지에 있어서 동일한 HBV-결합 항원 결합 도메인을 포함하는 참조 단일 결합 단위보다 효능이 더 클 수 있다.
본 개시내용은 J-쇄 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체, 및 각각 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 5개의 결합 단위를 포함하는 단리된 IgM 항체 또는 그의 단편을 추가로 제공하고, 여기서 각각의 중쇄 또는 그의 단편은 인간 Mu 불변 영역 또는 그의 단편, 및 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 서열 번호 62를 포함하고, 각각의 경쇄는 인간 카파 불변 영역 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 서열 번호 6을 포함할 수 있고; 항체 또는 그의 단편은 HBV 표면 항원의 프리-S1 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 오량체 IgM 항체로 조립될 수 있다. 특정 측면에서, IgM 항체 또는 그의 단편의 중쇄는 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하고, IgM 항체 또는 그의 단편의 경쇄는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, J-쇄 또는 그의 단편은 서열 번호 54의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 특정 측면에서, J-쇄 또는 그의 단편은 이종 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 이종 폴리펩티드는 직접적으로 또는 간접적으로 J-쇄 또는 그의 단편에 융합될 수 있다. 특정 측면에서, 이종 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 J-쇄 또는 그의 단편에 간접적으로 융합될 수 있다. 특정 측면에서, 펩티드 링커는 예를 들어, 적어도 5개 내지 25개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 펩티드 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 72)로 이루어진다. 이종 폴리펩티드는 J-쇄의 N-말단 또는 그의 단편에, J-쇄의 C-말단 또는 그의 단편에, 또는 J-쇄의 N-말단 및 C-말단 둘 모두 또는 그의 단편에 또는 그 근처에서 융합될 수 있다. 특정 측면에서, 이종 폴리펩티드는 결합 도메인, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 항원 결합 단편은 예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일쇄 Fv(scFv) 단편, 디술피드 연결된 Fv(sdFv) 단편, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 특정 측면에서, 이종 폴리펩티드는 CD3ε에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 특정 측면에서, 변형된 J-쇄는 서열 번호 68(V15J) 또는 서열 번호 71(J15V)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 특정 측면에서, 이들 변형된 특정 J-쇄는 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 변형된 J-쇄는 서열 번호 67(V15J) 또는 서열 번호 70(J15V)의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용은 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자 또는 본원에서 제공되는 단리된 IgM 항체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 또한 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, 본원에서 제공되는 IgM 항체의 폴리펩티드 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 폴리펩티드 서브유닛은 IgM 중쇄 불변 영역 및 감염성 바이러스 입자의 표면 상에서, HBV 감염된 세포의 경우 표면 상에서 또는 이들의 조합 상에서 발현되는 B형 간염 바이러스(HBV) 항원에 특이적으로 결합하는 항체 결합 도메인의 적어도 항체 VH 부분을 포함한다. 특정 측면에서, 폴리펩티드 서브유닛은 VH 아미노산 서열 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 26, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 62, 서열 번호 73, 또는 서열 번호 75의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 도메인, 또는 하나 이상의 HCDR에 1 또는 2개의 단일 아미노산 치환을 포함하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 도메인; 또는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 26, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 62, 서열 번호 73 또는 서열 번호 75와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH의 C-말단부에 융합된 인간 IgA 또는 IgM 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다.
본 개시내용은 또한 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, 본원에서 제공되는 IgM 항체의 폴리펩티드 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 폴리펩티드 서브유닛은 감염성 바이러스 입자의 표면 상에서, HBV 감염된 세포의 표면 상에서 또는 이들의 조합 상에서 발현되는 B형 간염 바이러스(HBV) 항원에 특이적으로 결합하는 항체 결합 도메인의 항체 VL 부분을 포함한다. 특정 측면에서, 폴리펩티드 서브유닛은 VL 아미노산 서열 서열 번호 3, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 15, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 74 또는 서열 번호 76의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 도메인, 또는 하나 이상의 LCDR에 1 또는 2개의 단일 아미노산 치환을 포함하는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 도메인; 또는 서열 번호 3, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 15, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 74 또는 서열 번호 76과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열의 VL의 C-말단부에 융합된 인간 항체 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물에 포함된 폴리뉴클레오티드는 단일 벡터에 포함될 수 있거나, 별개의 벡터들 상에 위치할 수 있다. 특정 측면에서, 상기 조성물은 J-쇄, 또는 그의 단편, 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 중쇄 코딩 폴리뉴클레오티드 및/또는 경쇄 코딩 폴리뉴클레오티드와 완전히 별개의 벡터 상에 또는 동일한 벡터 또는 벡터들 상에 존재할 수 있다.
상기 설명된 하나, 둘 또는 그 초과의 벡터가 또한 본 개시내용에 의해 제공된다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 제공된 폴리뉴클레오티드, 제공되는 조성물 또는 제공되는 벡터 또는 벡터들을 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포는 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어 본원에서 제공되는 단리된 IgM 항체 또는 그의 서브유닛을 발현할 수 있다. 본 개시내용은 또한 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어 본원에서 제공되는 단리된 IgM 항체를 생산하는 방법을 제공하고, 이 방법은 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 결합 분자를 회수하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 만성적으로 감염된 세포에서 B형 간염 바이러스(HBV)의 증식, 잠복, 또는 유지를 제어하는, 예를 들어 바이러스 부착, 감염성, 복제, 잠복, 배출 등을 제어하는 방법을 추가로 제공하고, 이 방법은 HBV와 HBV 감수성 세포의 혼합물을 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어 본원에서 제공되는 단리된 IgM 항체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 HBV 복제는 결합 분자와 공통적인 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 IgG 항체보다 큰 효능으로 제어된다.
본 개시내용은 환자에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염에 의해 야기되거나 악화되는 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 HBV에 감염된 또는 HBV 감염에 감수성인 환자에게 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어 본원에서 제공되는 단리된 IgM 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 결합 분자는 참조 단일 결합 단위 항체, 예를 들어 결합 분자 또는 IgM 항체와 동일한 HBV 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 IgG 항체보다 더 큰 효능을 보일 수 있다. 특정 측면에서, 질환 또는 병태는 예를 들어 급성 간염, 만성 간염, 간 염증, 간경화, 간부전, 간세포 암종(HCC), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 특정 측면에서, 환자는 예컨대 증가된 바이러스 부하, 바이러스 배출(shedding), 복통, 어두운 소변, 발열, 관절통, 식욕 상실, 메스꺼움 및 구토, 쇠약 및 피로, 황달 또는 이들의 조합을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 HBV 질환 증상을 나타낼 수 있다.
본 개시내용은 비감염성 바이러스 입자에 결합하는 것보다 더 큰 친화도(affinity), 더 큰 결합활성(avidity) 또는 이들의 조합으로 감염성 바이러스 입자의 표면, 바이러스 감염된 세포의 표면, 또는 이들의 조합에 결합하는 결합 분자를 확인하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 (a) 시험 결합 분자를 감염성 바이러스 입자와 접촉시키고 감염성 바이러스 입자에 결합하기 위한 시험 결합 분자의 친화도 또는 결합활성을 측정하는 단계; (b) 시험 결합 분자를 비감염성 버전의 바이러스 입자와 접촉시키고 비감염성 입자에 결합하기 위한 시험 결합 분자의 친화도 또는 결합활성을 측정하는 단계; (c) 단계 (a) 및 (b)의 결과를 비교하는 단계; 및 (d) 단계 (a)에서 측정된 친화도 또는 결합활성이 단계 (b)에서 측정된 친화도 또는 결합활성보다 더 높은 시험 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 바이러스에 감염되지 않은 세포보다 더 큰 친화도, 더 큰 결합활성 또는 이들의 조합으로 관심 바이러스에 감염된 세포의 표면에 결합하는 결합 분자를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 시험 결합 분자를 바이러스 감염 세포와 접촉시키고, 바이러스 감염 세포에 결합하기 위한 시험 결합 분자의 친화도 또는 결합활성을 측정하는 단계; (b) 시험 결합 분자를 바이러스에 감염되지 않은 세포와 접촉시키고, 비감염 세포에 결합하기 위한 시험 결합 분자의 친화도 또는 결합활성을 측정하는 단계로서, 비감염 세포가 감염되지 않은 것을 제외하고 바이러스 감염 세포와 동일한 것인 단계; (c) 단계 (a) 및 (b)의 결과를 비교하는 단계; 및 (d) 단계 (a)에서 측정된 친화도 또는 결합활성이 단계 (b)에서 측정된 친화도 또는 결합활성보다 더 높은 시험 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 HBV 서브바이러스 입자에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 더 큰 결합활성 또는 이들의 조합으로 감염성 B형 간염 바이러스(HBV) 바이러스 입자의 표면, HBV 감염 세포의 표면, 또는 이들의 조합에 결합하는 결합 분자를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 시험 결합 분자를 HBV 바이러스 입자와 접촉시키고, HBV 바이러스 입자에 결합하기 위한 시험 결합 분자의 친화도 또는 결합활성을 측정하는 단계; (b) 시험 결합 분자를 HBV 서브바이러스 입자와 접촉시키고, HBV 서브바이러스 입자에 결합하기 위한 시험 결합 분자의 친화도 또는 결합활성을 측정하는 단계; (c) 단계 (a) 및 (b)의 결과를 비교하는 단계; 및 (d) 단계 (a)에서 측정된 친화도 또는 결합활성이 단계 (b)에서 측정된 친화도 또는 결합활성보다 더 높은 시험 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 B형 간염 바이러스(HBV)에 감염되지 않은 세포보다 더 큰 친화도, 더 큰 결합활성 또는 이들의 조합으로 HBV에 감염된 세포의 표면에 결합하는 결합 분자를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 시험 결합 분자를 HBV 감염 세포와 접촉시키고, HBV 감염 세포에 결합하기 위한 시험 결합 분자의 친화도 또는 결합활성을 측정하는 단계; (b) 시험 결합 분자를 HBV에 감염되지 않은 세포와 접촉시키고, HBV에 감염되지 않은 세포에 결합하기 위한 시험 결합 분자의 친화도 또는 결합활성을 측정하는 단계로서, 비감염 세포가 감염되지 않은 것을 제외하고 HBV 감염 세포와 동일한 것인 단계; (c) 단계 (a) 및 (b)의 결과를 비교하는 단계; 및 (d) 단계 (a)에서 측정된 친화도 또는 결합활성이 단계 (b)에서 측정된 친화도 또는 결합활성보다 더 높은 시험 화합물을 확인하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, HBV 감염 세포는 인간 세포이다. 특정 측면에서, 시험 결합 분자는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, 본원에서 제공되는 IgM 항체이다.
도 1A: HBV 표면 단백질의 선형 구조.
도 1B: 막 내의 HBV 표면 단백질의 입체형태.
도 2a: 다양한 HBV24 IgM 구축물로부터의 발현 산물을 보여주는 SDS 폴리아크릴아미드 겔.
도 2b: HBV23 IgG 및 IgM 구축물로부터의 발현 산물을 보여주는 SDS 폴리아크릴아미드 겔.
도 2c: HBV19 IgG 및 IgM 구축물로부터의 발현 산물을 보여주는 SDS 폴리아크릴아미드 겔.
도 3a: HBsAg-L에 대한 정제된 HBV24M2V15J(삼각형), 정제된 HBV24G(사각형) 및 HBV24G 상청액(원형)의 결합을 보여주는 ELISA 결과.
도 3b: HBsAg-L에 대한 정제된 HBV23MJ(삼각형), 정제된 HBV24G(정사각형)의 결합을 보여주는 ELISA 결과.
도 4: PLC 간암종 세포에 대한 HBV 항체 결합의 FACS 분석. 상부 열: 항-S 항체(HBV23 항-HBsAg), IgG 및 IgM + 인간 J-쇄; 하부 열: 항 프리S1 항체(HBV24G 및 HBV24M2V15J), IgG 및 IgM + V15J. 각각의 패널에서 표지되지 않은 히스토그램은 염색되지 않은 PLC 세포 및 적절한 인간 항체 이소형 대조군(IgG 또는 IgM)으로 염색된 PLC 세포를 나타낸다.
정의
용어 "a" 또는 "an" 엔티티는 하나 이상의 엔티티를 지칭하고; 예를 들어, "a binding molecule"는 하나 이상의 결합 분자를 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 용어 "a"(또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다.
또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 다른 하나가 있거나 없으면서, 각각의 2개의 특정된 특징 또는 성분에 대한 구체적인 개시로 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B(단독)"을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용된 용어 "및/또는"은 각각의 다음 실시양태를 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C;, A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독), B(단독) 및 C(단독).
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련되는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; [The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 [Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 개시내용에서 사용된 많은 용어에 대한 일반적인 사전을 통상의 기술자에게 제공한다.
단위, 접두사(prefix) 및 기호는 그들의 SI(Systeme International de Unites) 승인 형식으로 표시된다. 숫치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 명시하지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측에서 우측으로 기술된다. 본원에서 제공되는 표제는 본 명세서를 전체적으로 참조하여 파악될 수 있는 본 개시내용의 다양한 측면 또는 측면들을 제한하는 것이 아니다. 따라서, 바로 아래에서 정의되는 용어는 본 명세서 전체를 참조함으로써 더욱 완전하게 정의된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비천연 생성" 물질, 조성물, 엔티티, 및/또는 물질, 조성물 또는 엔티티의 임의의 조합, 또는 이의 임의의 문법적 변형은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 "천연 생성"인 것으로 잘 이해되거나, 또는 판사 또는 행정 또는 사법 기관에 의해 언제든 "천연 생성"이라고 결정되거나 해석될 수 있는 물질, 조성물, 엔티티, 및/또는 물질, 조성물 또는 엔티티의 임의의 조합 형태를 명시적으로 배제하지만, 단지 배제하는 조건부 용어이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 단수 "폴리펩티드"뿐만 아니라 복수 "폴리펩티드"를 포함하는 것으로 의도되며, 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 이루어진 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하고, 생성물의 특정 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄" 또는 2 이상의 아미노산의 쇄를 나타내기 위해 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에 또는 교환가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화 및 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해성 절단 또는 비천연 생성 아미노산에 의한 변형을 포함하고 이로 제한되지 않는, 폴리펩티드의 발현 후 변형 산물을 의미하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 그것은 화학 합성을 포함한 임의의 방법으로 생성될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드의 크기는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상 또는 2,000개 이상의 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드는 반드시 그런 구조를 가질 필요는 없지만, 정의된 3차원 구조를 가질 수 있다. 정의된 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 폴딩된 것으로 언급되고, 정의된 3차원 구조를 갖지 않고 매우 많은 상이한 입체형태를 채택할 수 있는 폴리펩티드는 비폴딩된 것으로 언급된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 당단백질은 아미노산, 예를 들면, 세린 또는 아스파라긴의 산소 함유 또는 질소 함유 측쇄를 통해 단백질에 부착된 적어도 하나의 탄수화물 모이어티(moiety)에 커플링된 단백질을 지칭한다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 그의 자연 환경에 존재하지 않는 폴리펩티드를 의도한다. 특정 수준의 정제를 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그의 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합 방식으로 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분별 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드처럼 본원에 개시된 바와 같이 단리된 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비천연 생성" 폴리펩티드 또는 그의 임의의 문법적 변형은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 "천연 생성"인 것으로 잘 이해되거나, 또는 판사 또는 행정 또는 사법 기관에 의해 언제든 "천연 생성"이라고 결정되거나 해석될 수 있는 폴리펩티드를 명시적으로 배제하지만, 단지 배제하는 조건부 용어이다.
본원에 개시된 다른 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체 및 이들의 임의의 조합이다. 본원에 개시된 바와 같은 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 상응하는 천연 항체 또는 폴리펩티드의 특성 중 적어도 일부, 예를 들어 항원에 특이적으로 결합하는 특성을 보유하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 단편은 본원의 다른 곳에서 논의된 특정 항체 단편에 추가하여, 예를 들어 결실 단편뿐만 아니라 단백질 분해 단편을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드의 변이체는 상기 설명한 단편, 및 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 측면들에서, 변이체는 천연 생성되지 않을 수 있다. 비천연 생성 변이체는 관련 기술 분야에 알려진 돌연변이 유발 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 유도체는 원래의 폴리펩티드에서 발견되지 않는 추가의 특징을 나타내기 위해 변경된 폴리펩티드이다. 그 예는 융합 단백질을 포함한다. 변이체 폴리펩티드는 또한 본원에서 "폴리펩티드 유사체"로 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 "유도체"는 기능적 측쇄 기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 아미노산을 갖는 대상 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 또한, "유도체"로 포함되는 것은 20개의 표준 아미노산의 하나 이상의 유도체를 포함하는 펩티드이다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린은 프롤린을 치환할 수 있고; 5-히드록시라이신은 라이신을 치환할 수 있고; 3-메틸히스티딘은 히스티딘을 치환할 수 있고; 호모 세린은 세린을 치환할 수 있고; 오르니틴은 라이신을 치환할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산으로 대체된 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산의 패밀리가 관련 기술 분야에 정의되어 있다. 예를 들어, 페닐알라닌으로 티로신을 치환하는 것은 보존적 치환이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드 및 항체의 서열에서 보존적 치환은 결합 분자가 결합하는 항원에 대한, 그 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 또는 항체의 결합 능력을 제거하지 않는다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌 [Brummell et al., Biochem . 32:1180-1 187 (1993)]; [Kobayashi et al., Protein Eng . 12(10):879-884 (1999)]; 및 [Burks et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:412-417 (1997)] 참조).
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 핵산뿐만 아니라 복수의 핵산을 포함하고, 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA), cDNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다.. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비통상적 결합(예를 들어, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 바와 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 의미한다.
"단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 천연 환경으로부터 분리된 임의의 형태의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 겔-정제된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터에 함유된 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 "단리된" 것으로 간주될 것이다. 또한, 클로닝을 위한 제한 효소를 갖도록 조작된 폴리뉴클레오티드 분절, 예를 들어 PCR 산물은 "단리된" 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가의 예는 이종 숙주 세포에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 완충제 또는 염수와 같은 비천연 용액 내의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 폴리뉴클레오티드의 생체 내 또는 시험관 내 RNA 전 사체를 포함하고, 전사체는 자연에서 발견되는 것이 아니다. 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성 방식으로 생산된 상기 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자와 같은 조절 요소일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비천연 생성" 폴리뉴클레오티드 또는 그의 임의의 문법적 변형은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 "천연 생성"인 것으로 잘 이해되거나, 또는 판사 또는 행정 또는 사법 기관에 의해 언제든 "천연 생성"이라고 결정되거나 해석될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 형태를 명시적으로 배제하지만, 단지 배제하는 조건부 용어이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어진 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않음에도 코딩 영역의 일부로 간주될 수 있지만, 임의의 인접 서열, 예를 들어, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구축물, 예를 들어 단일 벡터 상에 위치할 수 있거나, 별개의 폴리뉴클레오티드 구축물, 예를 들어 별개의(상이한) 벡터 상에 위치할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유할 수 있거나, 2개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있으며, 예를 들어 단일 벡터는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로블린 경쇄 가변 영역을 개별적으로 코딩할 수 있다. 또한, 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 또 다른 코딩 영역에 융합되거나 융합되지 않는 이종 코딩 영역을 포함할 수 있다. 이종 코딩 영역은 비제한적으로, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인과 같은 특수화된 요소 또는 모티프를 코딩하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 하나 이상의 코딩 영역과 작동가능하게 연결된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소를 포함할 수 있다. 작동가능한 결합은 유전자 산물, 예를 들어 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이, 유전자 산물의 발현이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에 이루어지는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합한 경우를 말한다. 2개의 DNA 단편(예컨대, 폴리펩티드 코딩 영역 및 이와 결합된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 코딩하는 mRNA의 전사를 초래하고, 두 DNA 단편 사이의 연결 특성이 유전자 산물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력 또는 DNA 주형이 전사되는 능력을 방해하지 않는다면 "작동가능하게 결합된" 것이다. 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 그 핵산의 전사를 수행할 수 있다면 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 작동가능하게 결합된 것일 것이다. 프로모터는 미리 결정된 세포에서 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호는 세포 특이적 전사를 지시하기 위해 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다.
다양한 전사 제어 영역이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들은 비제한적으로, 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 관련된 최조기(immediate early) 프로모터), 원숭이 바이러스 40(초기 프로모터) 및 레트로바이러스(예컨대, 라우스(Rous) 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 다른 전사 제어 영역은 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유래한 영역뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 조직 특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 림포카인 유도성 프로모터(예를 들어, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도가능한 프로모터)를 포함한다.
유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코르나바이러스로부터 유래된 요소(특히 내부 리보솜 진입 부위 또는 IRES(CITE 서열로도 언급됨))를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA 또는 리보솜 RNA 형태의 RNA일 수 있다.
폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본원에서 개시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩티드를 코딩하는 추가의 코딩 영역과 결합될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비되는 단백질은 거친 소포체를 가로지른 성장하는 단백질 쇄의 방출이 시작되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가질 수 있고, 신호 펩티드는 완전한 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 절단되어 분비되는 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생성함을 알고 있다. 특정 실시양태에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드 또는 그와 작동가능하게 결합된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능적 유도체가 사용된다. 대안으로, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 그의 기능성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
특정 결합 분자, 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체가 본원에서 개시된다. 구체적으로 전체 크기의 항체를 언급하지 않는 한, "결합 분자"라는 용어는 전체 크기의 항체뿐만 아니라, 상기 항체의 항원 결합 서브유닛, 단편, 변이체, 유사체 또는 유도체, 예를 들어 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하지만 다른 스캐폴드를 사용하는 조작된 항체 분자 또는 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합 분자"는 그의 가장 넓은 의미에서 수용체, 예를 들어 에피토프 또는 항원 결정자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이, 결합 분자는 본원에서 설명되는 하나 이상의 "항원 결합 도메인"을 포함할 수 있다. 결합 분자의 비제한적인 예는 항원 특이적 결합을 보유하는 항체 또는 그의 단편이다.
용어 "결합 도메인" 및 "항원 결합 도메인"은 본원에서 교환가능하게 사용되고, 에피토프에 특이적으로 결합하기 위해 필요하고 충분한 결합 분자의 영역을 지칭한다. 예를 들어, "Fv", 예를 들어 2개의 분리된 폴리펩티드 서브유닛으로서 또는 단일 쇄로서의 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 "결합 도메인"으로 간주된다.
다른 항원 결합 도메인은 카멜리드(camelid) 종으로부터 유래된 항체의 가변 중쇄(VHH), 또는 피브로넥틴 스캐폴드에서 발현된 6개의 면역글로불린 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본원에서 설명되는 바와 같은 "결합 분자"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 초과의 "항원 결합 도메인"을 포함할 수 있다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다. 항체(또는 본원에 개시된 바와 같은 그의 단편, 변이체 또는 유도체)는 적어도 중쇄의 가변 영역(카멜리드 종에 대해) 또는 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 포함한다. 척추동물 시스템에서 기본적인 면역글로불린 구조는 비교적 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]을 참조한다. 달리 언급하지 않는 한, 용어 "항체"는 항체의 작은 항원 결합 단편으로부터 완전한 크기의 항체, 예를 들어 2개의 완전한 중쇄 및 2개의 완전한 경쇄를 포함하는 IgG 항체, 4개의 완전한 중쇄 및 4개의 완전한 경쇄를 포함하고 J-쇄 및/또는 분비 성분을 포함할 수 있는 IgA 항체, 또는 10개 또는 12개의 완전한 중쇄 및 10개 또는 12개의 완전한 경쇄를 포함하고 J-쇄를 포함할 수 있는 IgM 항체에 이르는 모든 것을 포함한다.
아래에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 클래스의 폴리펩티드를 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되고, 이들 중에 일부 하위클래스(예를 들어, γ1-γ4 또는 α1-α2)가 존재함을 이해할 것이다. 항체의 "클래스"를 IgG, IgM, IgA IgG 또는 IgE로 각각 결정하는 것은 바로 상기 쇄의 특성이다. 면역글로불린 하위클래스(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등은 그 특성이 잘 파악되어 있고, 기능적 특수성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 클래스 및 이소형의 각각의 변형된 버전은 본 개시내용에 비추어 통상의 기술자에 의해 용이하게 인식될 수 있고, 따라서 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되어 있고, 2개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때 공유 디술피드 연결 또는 비공유 연결에 의해 서로 결합되어 있다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 입체형태의 갈라진(forked) 말단부에 있는 N 말단으로부터 각각의 쇄의 기부에 있는 C 말단으로 이어진다. 특정 항체, 예를 들어, IgG 항체의 기본 구조는 본원에서 "H2L2" 구조로도 지칭되는 "Y" 구조 또는 "결합 단위"를 형성하기 위해 디술피드 결합을 통해 공유 연결된 2개의 중쇄 서브유닛 및 2개의 경쇄 서브유닛을 포함한다.
용어 "결합 단위"는 결합 분자의 일부, 예를 들어 표준 면역글로불린 구조, 즉 2개의 중쇄 또는 그의 단편 및 2개의 경쇄 또는 그의 단편, 또는 카멜리드 또는 콘드릭토이드(condricthoid) 항체로부터 유래된 2개의 중쇄 또는 그의 단편에 상응하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 결합 분자가 단일 결합 단위 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 특정 측면에서, 용어 "결합 분자" 및 "결합 단위"는 동등한 것이다. 예를 들어, 결합 분자가 IgA 이량체, IgM 오량체 또는 IgM 육량체인 다른 측면에서, 결합 분자는 "다량체"이며, 2 이상의 "결합 단위"를 포함한다. IgA 이량체의 경우 결합 단위는 2개, 또는 IgM 오량체 또는 육량체의 경우에는 5 또는 6개이다. 결합 단위는 전장 항체 중쇄 및 경쇄를 포함할 필요는 없지만, 전형적으로 2가, 즉 아래에서 정의되는 바와 같은 2개의 "항원 결합 도메인"을 포함할 것이다. 본 개시내용에서 제공되는 특정 결합 분자는 오량체 또는 육량체이고, IgM 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하는 5 또는 6개의 2가 결합 단위를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 2개 이상의 결합 단위, 예를 들어 2개, 5개 또는 6개의 결합 단위를 포함하는 결합 분자는 "다량체"로 언급될 수 있다. 용어 "다량체"는 하나 초과의 단위를 보유함을 의미한다. 따라서, 예를 들어, "다량체 결합 분자"는 하나 초과의 결합 단위를 보유할 것이다. 다량체 결합 분자는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 심지어 6개 이상의 결합 단위를 보유할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "천연 서열 J-쇄" 또는 "천연 J-쇄"는 그의 아미노산 서열이 서열 번호 54로서 제시되는 성숙한 인간 J-쇄를 포함하는, 임의의 동물 종의 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체의 J-쇄를 의미한다.
용어 "변형된 J-쇄"는 이종 모이어티, 예를 들어 이종 폴리펩티드, 예를 들어 천연 서열 내에 도입된 외인성 결합 도메인을 포함하는 천연 서열 J-쇄 폴리펩티드의 변이체를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 도입은 이종 폴리펩티드 또는 다른 모이어티의 직접적 또는 간접적인 융합을 포함하는 임의의 수단에 의해 또는 펩티드 또는 화학적 링커를 통한 부착에 의해 달성될 수 있다. 용어 "변형된 인간 J 쇄"는 비제한적으로, 이종 모이어티, 예를 들어 이종 폴리펩티드, 예를 들어 외인성 결합 도메인의 도입에 의해 변형된 서열 번호 54의 아미노산 서열의 천연 서열 인간 J-쇄 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 특정 측면에서, 이종 모이어티는 오량체 내로의 IgM의 또는 이량체 내로의 IgA의 효율적인 중합, 및 이러한 중합체의 표적에 대한 결합을 방해하지 않는다. 예시적인 변형된 J-쇄는 예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 포함된 PCT 공개 WO2015/153912에서 볼 수 있다.
용어 "결합가", "2가", "다가" 및 문법적 등가물은 제시된 결합 분자 또는 결합 단위 내의 항원 결합 도메인의 수를 지칭한다. 따라서, 제시된 결합 분자와 관련하여 "2가", "4가" 및 "6가"라는 용어는 각각 2개의 항원 결합 도메인, 4개의 항원 결합 도메인 및 6개의 항원 결합 도메인의 존재를 나타낸다. 전형적인 IgM 유래 결합 분자에서, 각각의 결합 단위는 2가인 반면, 결합 분자 자체는 10 또는 12의 결합가를 가질 수 있다. 2가 또는 다가 결합 분자는 단일 특이적일 수 있으며, 즉, 모든 항원 결합 도메인이 동일하거나, 예를 들어 2개 이상의 항원 결합 도메인이 상이한 경우, 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있고, 예를 들어 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 완전히 상이한 항원에 결합한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 결정자를 포함한다. 특정 측면에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기를 포함할 수 있으며, 특정 측면에서 3차원 구조적 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 표적 영역이다.
"다중특이적 결합 분자 또는 항체" 또는 "이중특이적 결합 분자 또는 항체"는 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 결합 분자, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. "단일 특이적"은 오직 하나의 에피토프에만 결합하는 능력을 의미한다.
용어 "표적"은 결합 분자에 의해 결합될 수 있는 물질을 포함하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 표적은 예를 들어 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 다른 분자일 수 있다. 또한, "표적"은 예를 들어 결합 분자에 의해 결합될 수 있는 에피토프를 포함하는 세포, 기관 또는 유기체일 수 있다.
항체 경쇄 및 중쇄는 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 분할된다. "불변" 및 "가변"라는 용어는 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH) 부분 둘 모두의 가변 영역(본원에서 "가변 도메인"으로 교환가능하게 언급될 수 있음)이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것을 알 것이다. 이와 달리, 경쇄(CL) 및 중쇄(예를 들어, CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 분비, 태반을 통한 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 생물학적 특성을 부여한다. 관례에 따라, 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노 말단으로부터 더 멀어지면서 불변 영역 도메인의 번호는 증가한다. N 말단 부분은 가변 영역이고 C 말단 부분은 불변 영역이고; CH3(또는 IgM의 경우 CH4) 및 CL 도메인은 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시 말단에 존재한다.
"전장 IgM 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 영역(VH), 항체 불변 중쇄 불변 도메인 1(CM1 또는 Cμ1), 항체 중쇄 상수 도메인 2(CM2 또는 Cμ2, 항체 중쇄 불변 도메인 3(CM3 또는 Cμ3) 및 항체 중쇄 불변 도메인 4(CM4 또는 Cμ4)를 포함하고 또한 테일피스(tailpiece)를 포함할 수 있는 폴리펩티드이다.
"전장 IgA 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 영역(VH), 항체 불변 중쇄 불변 도메인 1(CA1 또는 Cα1), 항체 중쇄 불변 도메인 2(CA2 또는 Cα2), 항체 중쇄 불변 도메인 3(CA3 또는 Cα3), 및 테일피스를 포함한다. 단량체 및 분비 IgA의 구조는 예를 들어 문헌 [Woof, JM and Russell, MW, Mucosal Immunology 4:590-597 (2011)]에 기재되어 있다.
상기한 바와 같이, 가변 영역, 즉 "항원 결합 도메인"은 결합 분자가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합하는 것을 허용한다. 즉, 결합 분자, 예를 들어, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 하위세트가 조합되어 3차원 항원 결합 부위를 규정하는 가변 영역을 형성한다. 보다 구체적으로, 항원 결합 부위는 각각의 VH 및 VL 쇄 상의 3개의 CDR에 의해 규정된다. 특정 항체는 더 큰 구조를 형성한다. 예를 들어, IgA는 모두가 디술피드 결합을 통해 공유 연결되는 2개의 H2L2 단위 및 J-쇄를 포함하는 분자를 형성할 수 있고, IgM은 디술피드 결합을 통해 공유 연결된 5 또는 6개의 H2L2 단위, 및 일부 실시양태에서 J-쇄를 포함하는 오량체 또는 육량체 분자를 형성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 중합체 IgA 및 IgM 분자는 또한 디술피드 결합을 통해 공유 연결될 수 있는 분비 성분을 함유할 수 있다.
항체 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 그의 3차원 입체형태를 취할 때 항원 결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 위치한 아미노산의 짧은 비연속적인 서열이다. "프레임워크" 영역으로 언급되는 항원 결합 도메인의 나머지 아미노산은 보다 낮은 분자간 가변성을 보인다. 프레임워크 영역은 주로 β-시트 입체형태를 취하고, CDR은 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 쇄간 비공유 상호작용에 의해 CDR을 정확한 배향으로 위치시키는 것을 제공하는 스캐폴드를 형성하도록 작용한다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보성인 표면을 규정한다. 이 상보성 표면은 그의 동족(cognate) 에피토프에 대한 항체의 비공유 결합을 촉진한다. CDR 및 프레임워크 영역을 각각 구성하는 아미노산은 다양한 상이한 방식으로 규정되었기 때문에 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 임의의 제시된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 용이하게 확인될 수 있다(그 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌 ["Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983)]; 및 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)] 참조).
관련 기술 분야에서 사용되고/되거나 허용되는 용어의 정의가 2개 이상인 경우, 본원에서 사용된 용어의 정의는 명시적으로 반대되는 경우를 제외하고는 모든 그러한 의미를 포함하는 것이 의도된다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비인접 항원 조합 부위를 설명하기 위한 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")의 사용이다. 이러한 특정 영역은 예를 들어 본원에 참고로 포함된 문헌 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 [Chothia et al., J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987)]에 기재되어 있다. 카바트(Kabat) 및 코티아(Chothia) 정의에는 서로 비교할 때 아미노산의 중첩 또는 하위세트가 포함된다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 지칭하는 정의(또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 정의)의 적용은 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 정의되고 사용된 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 인용된 참고문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 적절한 아미노산은 비교로서 하기 표 1에 제시된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 아미노산 번호는 CDR의 서열 또는 크기에 따라 다양할 것이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 아미노산이 특정 CDR을 포함한다는 것을 일상적으로 결정할 수 있다.
<표 1> CDR 정의*
*표 1의 모든 CDR 정의의 넘버링(numbering)은 카바트 등에 의해 제시된 넘버링 규칙에 따른다(아래 참조).
면역글로불린 가변 도메인은 또한 예를 들어 CDR을 포함하는 가변 영역 분절을 확인하기 위해 EV1GT 정보 시스템(www://imgt.cines.fr/)(IMGT®/V-Quest)을 사용하여 분석될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Brochet et al., Nucl . Acids Res., 36:W503-508, 2008] 참조).
카바트 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 규정하였다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 서열 자체를 넘어서는 어떠한 실험 데이터에 의존하지 않고도 임의의 가변 도메인 서열에 상기 "카바트 넘버링" 시스템을 분명하게 할당할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "카바트 넘버링"은 문헌 [Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 의해 제시된 넘버링 시스템을 나타낸다. 그러나, 카바트 넘버링 시스템의 사용이 명시적으로 언급되지 않는 한, 본 개시내용에서 모든 아미노산 서열에 대해 연속적인 넘버링이 사용된다.
결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 에피토프 결합 단편, 예를 들어 Fab, Fab '및 F(ab')2, Fd, Fv, 단일쇄 Fv(scFv), 단일쇄 항체, 디술피드 연결된 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. ScFv 분자는 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호에 기재되어 있다. 본 개시내용에 포함되는 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 종류(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위클래스의 것일 수 있다. 또한, 2가이고 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR) 가변 도메인(VNAR)을 포함하는 단일쇄를 포함하는 IgNAR 이소형이 고려된다(문헌 [Walsh et al., Virol., 411:132-141, 2011] 참조).
"특이적으로 결합하다"는 것은 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체가 그의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프 사이의 약간의 상보성을 수반한다는 것을 일반적으로 의미한다. 이 정의에 따르면, 결합 분자는 무작위로 선택된 관련되지 않는 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 그의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합할 때 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 언급된다. 용어 "특이성"은 특정 결합 분자가 특정 에피토프에 결합하는 상대 친화도를 수식하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 결합 분자 "A"는 결합 분자 "B"보다 제시된 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 결합 분자 "A"는 관련 에피토프 "D"보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 언급될 수 있다.
본원에 개시된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 5 x 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5 x 10-3 sec-1, 10-3 sec-1, 5 x 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 x 10-5 sec-1, 또는 10-5 sec-1, 5 x 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 x 10-7 sec-1 또는 10-7 sec-1 이하의 오프 레이트(k(off))로 표적 항원에 결합한다고 언급될 수 있다.
본원에 개시된 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 103 M-1 sec-1, 5 x 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1, 5 x 104 M-1 sec-1, 105 M-1 sec-1, 5 x 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, 또는 5 x 106 M-1 sec-1 또는 107 M-1 sec-1 이상의 온 레이트(k(on))로 표적 항원에 결합한다고 언급될 수 있다.
결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 참조 항체 또는 항원 결합 단편의 제시된 에피토프에 대한 결합을 어느 정도 차단하는 정도로 그 에피토프에 우선적으로 결합하면, 참조 항체 또는 항원 결합 단편의 에피토프에 대한 결합을 경쟁적으로 억제한다고 언급된다. 경쟁적 억제는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 경쟁 ELISA 검정에 의해 결정될 수 있다. 결합 분자는 제시된 에피토프에 대한 참조 항체 또는 항원 결합 단편의 결합을 경쟁적으로 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50% 억제한다고 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화도"는 예를 들어 면역글로불린 분자의 하나 이상의 항원 결합 도메인과 개개의 에피토프의 결합 강도의 척도를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988), pages 27-28]을 참조한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합활성"은 항원 결합 도메인의 집단과 항원 사이의 복합체의 전체 안정성을 나타낸다. 예를 들어 상기 할로우(Harlow)의 문헌 29-34 페이지를 참조한다. 결합활성은 집단 내의 개별 항원 결합 도메인의 특정 에피토프에 대한 친화도 및 면역글로불린 및 항원의 결합가 둘 모두와 관련된다. 예를 들어, 2가 모노클로날 항체와, 고도로 반복적인 에피토프 구조, 예컨대 중합체를 갖는 항원 사이의 상호 작용은 높은 결합활성 중 하나일 것이다. 세포 표면에서 고밀도로 존재하는 수용체와 2가 모노클로날 항체 사이의 상호작용 또한 높은 결합활성을 가질 것이다.
본원에서 개시되는 결합 분자 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 그의 교차반응성의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "교차반응성"은 한 항원에 특이적인 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체가 제2 항원과 반응하는 능력, 즉 2개의 상이한 항원 물질 사이의 관련성의 척도를 나타낸다. 따라서, 결합 분자는 그의 형성을 유도한 것 이외의 다른 에피토프에 결합할 경우 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도 에피토프와 동일한 많은 상보성의 구조적 특징을 포함하고, 일부 경우에 실제로 원래의 에피토프보다 더 적합할 수 있다.
결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 항원에 대한 그의 결합 친화도의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 예를 들어, 결합 분자는 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8, 10-8 M, 5 x 10-9, 10-9 M, 5 x 10-10, 10-10 M, 5 x 10-11, 10-11 M, 5 x 10-12, 10-12 M, 5 x 10-13, 10-13 M, 5 x 10-14, 10-14 M, 5 x 10-15, 또는 10-15 M 이하의 해리 상수 또는 KD로 항원에 결합할 수 있다.
단일쇄 항체 또는 다른 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편은 단독으로 또는 힌지(hinge) 영역, CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인, J-쇄 또는 분비 성분 중 하나 이상과 조합하여 존재할 수 있다. 또한, 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인, J-쇄 또는 분비 성분 중 하나 이상과 가변 영역(들)의 임의의 조합을 포함할 수 있는 항원 결합 단편이 포함된다. 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 조류 및 포유동물을 비롯한 임의의 동물로부터 유래될 수 있다. 항체는 인간, 뮤린(murine), 당나귀, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 야마, 말 또는 닭 항체일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 가변 영역은 콘드릭토이드(예를 들어, 상어)에서 유래될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "인간" 항체는 아래에서 및 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호(Kucherlapati et al.)에서 설명된 바와 같이, 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 트랜스제닉(transgenic)인 동물로부터 단리된 항체를 포함하고, 일부 경우에는 내인성 면역글로불린을 발현할 수 있고 일부는 그렇지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중쇄 서브유닛" 또는 "중쇄 도메인"은 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지(예를 들어, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인 또는 그의 변이체 또는 단편 중 적어도 하나를 포함할 수 있는 중쇄 서브유닛을 포함하는 면역글로불린 중쇄, 결합 분자, 예를 들어 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 VH 도메인 이외에, CH1 도메인; CH1 도메인, 힌지 및 CH2 도메인; CH1 도메인 및 CH3 도메인; CH1 도메인, 힌지 및 CH3 도메인; 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체는 VH 도메인 이외에, CH3 도메인 및 CH4 도메인; 또는 CH3 도메인, CH4 도메인 및 J-쇄를 포함할 수 있다. 또한, 본 개시내용에 사용하기 위한 결합 분자는 특정 불변 영역 부분, 예를 들어 CH2 도메인의 전부 또는 일부가 결여될 수 있다. 이들 도메인(예를 들어, 중쇄 서브유닛)이 본래의 면역글로불린 분자로부터 아미노산 서열이 변하도록 변형될 수 있다는 것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다.
결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 단편의 중쇄 서브유닛은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래된 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 중쇄 서브유닛은 IgG1 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 서브유닛은 부분적으로는 IgG1 분자로부터, 부분적으로는 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 서브유닛은 부분적으로는 IgG1 분자로부터, 부분적으로는 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "경쇄 서브유닛" 또는 "경쇄 도메인"은 면역글로불린 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 서브유닛은 VL 또는 CL(예를 들어, Cκ 또는 Cλ) 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.
결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 그들이 인식하거나 또는 특이적으로 결합하는 항원의 에피토프(들) 또는 부분(들)의 측면에서 설명되거나 특정될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 항원의 부분은 "에피토프" 또는 "항원 결정자"이다. 표적 항원은 단일 에피토프 또는 적어도 2개의 에피토프를 포함할 수 있으며, 항원의 크기, 입체형태 및 유형에 따라 임의의 수의 에피토프를 포함할 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 다양한 면역글로불린 클래스의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 입체형태는 잘 알려져 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "VH 영역" 또는 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고, 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 제1(가장 먼 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고, 전형적인 IgG 중쇄 분자의 힌지 영역에 대해 아미노 말단이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CH2 도메인"은 통상적인 넘버링 방식을 사용하여 IgG 항체의 대략 아미노산 244 내지 아미노산 360(아미노산 244 내지 360, 카바트 넘버링 시스템; 및 아미노산 231-340, EU 넘버링 시스템; 상기 카바트 등의 문헌 참조)으로 연장되는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. CH3 도메인은 IgG 분자의 CH2 도메인에서 C-말단으로 연장되고, 대략 108개의 아미노산을 포함한다. 특정 면역글로불린 클래스, 예를 들어 IgM은 CH4 영역을 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 IgG, IgA 및 IgD 중쇄에서 CH2 도메인에 CH1 도메인을 연결하는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이 힌지 영역은 대략 25개의 아미노산을 포함하고, 가요성이고, 따라서 2개의 N-말단 항원 결합 영역이 독립적으로 움직일 수 있게 된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "디술피드 결합"은 2개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올기와 함께 디술피드 결합 또는 다리를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 특정 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 디술피드 결합에 의해 연결되고, 2개의 중쇄는 카바트 넘버링 시스템을 사용한 239 및 242(위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에 상응하는 위치에서 2개의 디술피드 결합에 의해 연결된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 수득되거나 유래되고 불변 영역(무손상, 부분 또는 변형될 수 있는)은 제2 종으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 비인간 공급원(예를 들어, 마우스 또는 영장류)으로부터 유래될 것이고, 불변 영역은 인간으로부터 유래된다.
용어 "다중특징적 항체", 또는 "이중특이적 항체"는 단일 항체 분자(또는 "결합 단위") 내의 2 이상의 상이한 에피토프에 특이적인 항원 결합 도메인을 갖는 항체를 지칭한다. 표준(canonical) 항체 구조 이외에 2개의 상이한 결합 특이성을 갖는 다른 결합 분자가 구축될 수 있다. 이중특이적 또는 다중특이적 항체에 의한 에피토프 결합은 동시적이거나 순차적일 수 있다. 트리오마(Trioma) 및 하이브리드 하이브리도마는 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 세포주의 두 가지 예이다. 이중특이적 항체는 또한 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다([Stroehlein and Heiss, Future Oncol .6:1387-94 (2010)]; [Mabry and Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010)]. 이중특이적 항체는 또한 디아바디(diabody)일 수 있다. 따라서, 다량체인 이중특이적 결합 분자는 각각 상이한 특이성을 갖는 여러 가지 상이한 항원 결합 도메인을 잠재적으로 보유할 수 있다. 예를 들어, IgM 결합 분자는 5개 또는 6개의 결합 단위를 함유하는 다량체로 간주될 수 있고, 각각의 결합 단위는 가능하게는 2개의 항원 결합 도메인을 보유한다. 이러한 IgM 결합 분자에서, 각각의 항원 결합 도메인은 다른 구별할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있기 때문에, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11개 또는 심지어 12개의 많은 상이한 특이성이 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조작된 항체"는 중쇄 및 경쇄 중 어느 하나 또는 둘 모두의 가변 도메인이 CDR 또는 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 아미노산의 적어도 부분적인 치환에 의해 변경되는 항체를 지칭한다. 특정 측면에서, 공지된 특이성을 갖는 항체로부터의 전체 CDR은 이종 항체의 프레임워크 영역 내로 이식될 수 있다. 대체 CDR은 프레임워크 영역이 유래된 항체와 동일한 클래스 또는 심지어 하위클래스의 항체로부터 유래될 수 있지만, CDR은 또한 상이한 클래스의 항체, 예를 들어 상이한 종의 항체로부터 유래될 수 있다. 공지된 특이성을 갖는 비인간 항체로부터의 하나 이상의 "공여자" CDR을 인간 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 영역에 이식한 조작된 항체는 본원에서 "인간화 항체"로 언급된다. 특정 측면에서, 모든 CDR이 공여자 가변 영역으로부터의 완전한 CDR로 대체되는 것은 아니지만, 공여자의 항원 결합 능력은 여전히 수여자 가변 도메인으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호 및 제6,180,370호에 기재된 설명을 고려하여, 기능적으로 조작된 또는 인간화된 항체는 통상적인 실험을 수행하거나 시행착오 시험을 수행함으로써 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 능력에 의해 얻을 수 있을 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "조작된"은 합성 수단(예를 들어, 재조합 기술, 시험관 내 펩티드 합성, 펩티드의 효소적 또는 화학적 커플링 또는 이들 기술의 일부 조합)에 의한 핵산 또는 폴리펩티드 분자의 조작을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합" 또는 다른 문법적 등가물은 교환가능하게 사용될 수 있다. 이들 용어는 화학적 접합 또는 재조합 수단을 포함한 모든 수단에 의한 2개 이상의 요소 또는 성분의 연결을 의미한다. "인-프레임(in-frame) 융합"은 원래의 개방 판독 프레임(ORF: open reading frame)의 번역 판독 프레임을 유지하는 방식으로 연속적인 더 긴 ORF를 형성하기 위해 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 ORF를 연결하는 것을 말한다. 따라서, 재조합 융합 단백질은 원래의 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 상응하는 2개 이상의 분절을 포함하는 단일 단백질이다(분절은 통상 자연에서 그렇게 연결되어 있지 않다). 따라서, 판독 프레임은 융합된 분절 전체에 걸쳐 연속적으로 만들어지지만, 분절은 예를 들어 인-프레임 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 가변 영역의 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인-프레임으로 융합될 수 있지만, "융합된" CDR이 연속적인 폴리펩티드의 일부로서 동시 번역되는 한, 적어도 하나의 면역글로불린 프레임워크 영역 또는 추가의 CDR 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
폴리펩티드의 측면에서, "선형 서열" 또는 "서열"은 서열에서 서로 인접한 아미노산이 폴리펩티드의 1차 구조에서 연속적으로 존재하는, 아미노 말단에서 카르복실 말단 방향으로의 폴리펩티드 내의 아미노산의 정렬이다.
폴리펩티드의 또 다른 부분의 "아미노 말단" 또는 "N-말단"에 존재하는 폴리펩티드의 부분은 순차적 폴리펩티드 쇄에서 보다 일찍 존재하는 부분이다. 유사하게, 폴리펩티드의 또 다른 부분의 "카르복시 말단" 또는 "C-말단"인 폴리펩티드의 부분은 순차적 폴리펩티드 쇄의 보다 나중에 존재하는 부분이다. 예를 들어 전형적인 항체에서, 가변 도메인은 불변 영역의 "N-말단"이고, 불변 영역은 가변 도메인의 "C-말단"이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 유전자가 생화학적 물질, 예를 들어 폴리펩티드를 생산하는 과정을 의미한다. 이 과정은 일시적 발현 및 안정한 발현 둘 모두뿐만 아니라 유전자 낙다운(knockdown)을 포함하고 이로 제한되지 않는 세포 내 유전자의 기능적 존재의 임의의 표시를 포함한다. 여기에는 비제한적으로 메신저 RNA(mRNA)로의 유전자의 전사 및 그러한 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 번역이 포함된다. 원하는 최종 산물이 생화학적 물질이라면, 발현은 이 생화학적 물질 및 임의의 전구체의 생성을 포함한다. 유전자의 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 산물은 핵산, 예를 들어, 유전자의 전사에 의해 생성되는 메신저 RNA 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에서 설명되는 유전자 산물은 전사후 변형, 예를 들어 폴리아데닐화를 갖는 핵산, 또는 번역후 변형, 예를 들어 메틸화, 글리코실화, 지질 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 회합, 단백질 분해 절단 등을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
"치료하기" 또는 "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화시키기" 또는 "완화시키는"과 같은 용어는 존재하는 진단된 병리학적 상태 또는 장애를 치유하고/하거나, 지연시키고/시키거나, 증상을 완화하고/하거나, 진행을 중지 또는 지연시키는 치료 수단을 지칭한다. "예방하다", "예방", "회피하다", "억지" 등과 같은 용어는 진단되지 않은 표적 병리학적 상태 또는 장애의 발생을 억제하는 예방 또는 억제 조치를 지칭한다. 따라서, "치료를 필요로 하는 사람"은 이미 장애가 있는 사람; 장애가 발생하기 쉬운 사람; 및 장애가 예방되어야 하는 사람을 포함할 수 있다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 치료가 요구되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 돼지, 소, 곰 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료로부터 이익을 얻는 대상체" 및 "치료를 필요로 하는 동물"과 같은 문구는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항체와 같은 결합 분자의 투여로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체, 예컨대 포유동물 대상체를 포함한다. 이러한 결합 분자, 예를 들어, 항체는 예를 들어 진단 절차 및/또는 질병의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, B형 간염 표면 항원 또는 "HBsAg"는 HBV의 표면 당단백질을 지칭한다. HBsAg는 HBV 게놈에서 3개의 독립적인 개시 코돈으로부터 3가지 크기로 생산되었다. 이 유전자 산물의 소형(Small), 중형(Medium) 및 대형(Large) 버전은 3개의 지정된 도메인, 즉 (i) S 단독(S), (ii) 프리-S2 및 S(M), 또는 (iii) 프리-S1 및 프리-S2 및 S(L) 중 하나 이상의 조합이다(도 1A). HBsAg는 혈청형 및 균주 간에 다양하지만, HBsAg의 예시적인 "L" 버전은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
프리S1 영역은 밑줄로 표시되고, 프리S2 영역은 이중 밑줄로 표시된다. 신호 펩티드를 포함하는 전구체 HBsAg가 아래에 제시된다:
본원에서 사용되는 바와 같이, HBsAg의 "프리S1 영역"은 HBsAg의 108개 아미노산의 N-말단을 지칭하고, 이는 하기 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
서열 번호 60은 HBV의 ad 혈청형으로부터 유래되지만, 상기 HBsAg의 영역은 HBV 혈청형에 걸쳐 보존된다. 중화 모노클로날 항체는 아미노산 20-47(밑줄로 표시됨)에 걸쳐있는 영역에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 뮤린 항체 KR127에 관련된 항체(예를 들어, 미국 특허 제7,115,723호, 미국 특허 제8,420,353호, 문헌 [Hong et al., Virol., 318:131-141, 2004], 및 [Kim, J.H., et al. FEBS Letters 589:193-200 (2015)] 참조)는 서열 번호 60의 아미노산 37-47 내의 에피토프에 결합한다. 모노클로날 항체 2D028(WO 2011/045079A1)은 서열 번호 60의 아미노산 38 내지 47 내의 에피토프에 결합한다. 또 다른 프리-S1 항체인 F35.25(Petit, et al., Mol Immunol. 1989 Jun;26(6):531-7)는 서열 번호 60의 아미노산 32-53 내의 에피토프에 결합한다. 또 다른 프리-S1 항체인 5a19(Pizarro, et al., FEBS Letters 509:463-468 (2001))는 프리-S1의 아미노산 37-43(NTANPDW, 서열 번호 77) 내의 에피토프에 결합한다. 프리-S1 영역은 간세포 수용체 결합에 관여한다(도 1A 및 1B).
본원에서 사용되는 바와 같이, B형 간염 X 단백질 또는 X 항원(HBxAg)은 B형 간염 바이러스에 의해 생성된 154개 아미노산의 X 단백질을 지칭한다. HBxAg는 하기 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
단백질은 간세포 암종(HCC)의 발병에 관여할 수 있다(Seifer, M., et al., J Hepatology; 13 (suppl. 4): S61-S65). HBxAg에 대한 항체는 종양 크기를 줄이고 HCC 종양이 있는 마우스에서 생존율을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(Li et al. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 1996 Apr;76(4):271-4).
IgM 결합 분자
IgM은 항원에 의한 자극에 반응하여 B 세포에 의해 생성된 최초의 면역글로불린이고, 5일의 반감기로 혈청 중에 약 1.5 mg/ml로 존재한다. IgM은 전형적으로 다량체, 예를 들어, 오량체 또는 육량체 분자이다. 따라서 IgM 분자는 "다량체" 결합 분자이다. 5개 또는 6개의 IgM 결합 단위는 각각 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함한다. 상기 설명한 바와 같이, IgG는 3개의 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 함유하지만, IgM의 중쇄(μ)는 C-말단 "테일피스"를 포함하는 제4 불변 도메인(CH4)을 추가로 포함한다. 인간 IgM 불변 영역은 전형적으로 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함한다. 인간 Cμ1 영역은 서열 번호 53의 약 아미노산 5 내지 약 아미노산 102의 범위이고; 인간 Cμ2 영역은 서열 번호 53의 약 아미노산 114 내지 약 아미노산 205의 범위이고, 인간 Cμ3 영역은 서열 번호 53의 약 아미노산 224 내지 약 아미노산 319의 범위이고, Cμ4 영역은 서열 번호 53의 약 아미노산 329 내지 약 아미노산 430의 범위이고, 테일피스는 서열 번호 53의 약 아미노산 431 내지 약 아미노산 453의 범위이다. 인간 IgM 불변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 53)가 아래에 제공된다:
IgM 결합 분자는 추가의 작은 폴리펩티드 쇄(J-쇄)와 복합체를 형성하여 오량체 IgM 결합 분자를 형성할 수 있는 5개의 결합 단위(각각 "IgM 결합 단위")를 포함할 수 있다. 인간 J-쇄는 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함한다. J-쇄가 없으면, IgM 결합 단위는 전형적으로 육량체 IgM 결합 분자로 조립된다. 이론에 매이기를 바라지는 않지만, 육량체 또는 오량체 결합 분자로의 IgM 결합 단위의 조립은 Cμ3 및 Cμ4 도메인을 수반하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 개시내용에서 제공되는 육량체 또는 오량체 IgM 결합 분자는 전형적으로 적어도 Cμ3 및 Cμ4 도메인을 포함하는 IgM 불변 영역을 포함한다. 인간 J-쇄(서열 번호 54)의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
IgM 중쇄 불변 영역은 Cμ2 도메인 또는 그의 단편, Cμ1 도메인 또는 그의 단편, 및/또는 다른 IgM 중쇄 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 결합 분자는 완전한 IgM 중쇄(μ) 불변 도메인, 예를 들어 서열 번호 53, 또는 그의 변이체, 유도체 또는 유사체를 포함할 수 있다.
오량체 또는 육량체 IgM HBV 결합 분자
본 개시내용은 오량체 또는 육량체의 HBV 결합 분자, 즉 HBV 항원, 예를 들어 HBsAg, 예를 들어, HBsAg의 프리-S1 영역에 특이적으로 결합할 수 있는, 본원에서 정의된 바와 같은 5 또는 6개의 "결합 단위"를 갖는 결합 분자를 제공한다. 본원에서 제공되는 결합 분자는 단일 결합 단위로 구성된 결합 분자, 예를 들어, IgG 항체와 비교하여 개선된 결합 특징 또는 생물학적 활성을 가질 수 있다. 즉, 본원에서 제공되는 오량체 또는 육량체 IgM 결합 분자는 일부 실시양태에서 바이러스 청소를 향상시킬 수 있으며, 예를 들어 단지 2개의 HBV 특이적 항원 결합 도메인을 포함하는 참조 단일 결합 단위와 비교하여 효능이 더 클 수 있다. 용어 "개선된 결합 특징"은 다음과 같이 보다 명확하게 설명된다. 본원에서 제공되는 오량체 또는 육량체 IgM 결합 분자는 그것을 필요로 하는 개체에게 투여될 때, 본원에서 제공되는 오량체 또는 육량체 IgM 결합 분자의 서열과 서열이 동일한 항원 결합 도메인을 갖는 단지 하나의 결합 단위를 포함하는 단일, 즉 비다량체 결합 분자에 비해, (i) 감염성 HBV 비리온의 감염성을 중화하고, 예를 들어 감소시키고/시키거나, (ii) HBV 감염 세포(HCC 세포, 잠복 감염된 세포 및 만성적으로 감염된 세포 포함)의 수를 감소시키고/시키거나, (iii) HBV 감염을 예방하고/하거나, (iv) 예를 들어 감염된 세포의 향상된 사멸을 통한 바이러스 청소를 향상시키고/시키거나, (v) HBV 감염의 징후 및 증상을 개선하기 위해 보다 강하거나, 효능이 더 크거나, 또는 질량 또는 몰 당량에 의해 보다 적은 결합 분자를 요구하는 것으로 경험적으로 결정된 활성을 보일 수 있다.
본원에서 제공되는 결합 분자는 마찬가지로 합성 또는 키메라 구조로 이루어진 다가 결합 분자와 비교하여 특유한 특징을 보유할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgM 불변 영역의 사용은 키메라 불변 영역 또는 합성 구조를 함유하는 결합 분자와 비교하여 감소된 면역원성을 제공하고 따라서 안전성을 증가시킬 수 있다. 또한, IgM 기반 결합 분자는 보다 균일한 발현 산물을 생성하는 육량체 또는 오량체 올리고머를 지속적으로 형성할 수 있다. 우수한 보체 고정이 또한 IgM 기반 결합 분자의 유리한 이펙터 기능일 수 있다.
상기 언급된 참조 단일 결합 단위는 IgG 결합 단위일 수 있다. 참조 IgG 결합 단위는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 등과 같은 임의의 이소형일 수 있다. 참조 결합 단위는 전형적으로 동일한 동물로부터 유래한다. 따라서, 다량체 결합 분자가 인간인 경우, 참조 단일 결합 단위는 인간일 것이지만, 반드시 인간일 필요는 없다. 즉, 참조 단일 결합 단위는 IgG 유형의 인간화 항체일 수 있다. 반대로, 다량체 결합 분자가 토끼 결합 분자인 경우, 참조 단일 결합 단위는 또한 토끼 결합 단위일 것이다. 또한, 다량체 결합 분자가 하나 이상의 결합 단위 단편으로 이루어지는 경우, 참조 단일 결합 단위는 또한 동등한 단일 결합 단위 단편일 것이다. 즉, 참조 단일 결합 단위는 참조 단일 결합 단위가 동등한 단일 결합 단위인 것을 제외하고는 그 서열 및 구조가 다량체 결합 분자에 함유된 결합 단위와 동일하다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 각각 5개 또는 6개의 결합 단위를 포함하는 오량체 또는 육량체 결합 분자를 제공하고, 여기서 각각의 결합 단위는 2개의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 측면에서, 2개의 IgM 중쇄 불변 영역은 인간 중쇄 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, IgM 결합 분자 내의 항원 결합 도메인은 인간 기원의 것이거나, 인간화된 것이거나 또는 이들의 조합이다.
본원에서 제공되는 다량체 결합 분자가 오량체인 경우, 결합 분자는 J-쇄 또는 그의 기능적 단편, 또는 그의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 오량체 IgM 결합 분자가 J-쇄를 함유하는 경우, J-쇄는 IgM 결합 분자와 동일한 종으로부터 유래될 수 있다. 즉, 오량체 IgM 결합 분자가 인간 유래이면, J-쇄 또한 인간 유래일 수 있다. 특정 측면에서, J-쇄는 이종 모이어티 또는 하나 이상의 이종 모이어티, 예를 들어 이종 폴리펩티드 서열, 예를 들어 천연 서열 내에 도입된 외부 결합 도메인을 포함하는 변형된 J-쇄이다. 특정 측면에서, 외부 결합 도메인은 CD3, 예를 들어, CD3ε에 특이적으로 결합한다. 특정 측면에서, 성숙한 변형된 J-쇄는 V15J(서열 번호 68) 또는 J15V(서열 번호 71)를 포함한다.
IgM 중쇄 불변 영역은 불변 영역이 결합 분자에서 원하는 기능을 제공할 수 있는 한, 예를 들어 항원 결합 도메인을 형성하기 위해 제2 IgM 불변 영역과 회합하거나, 또는 다른 결합 단위와 회합하여 육량체 또는 오량체를 형성할 수 있는 한, 하나 이상의 Cμ1 도메인, Cμ2 도메인, Cμ3 도메인 및/또는 Cμ4 도메인을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 개별 결합 단위 내의 2개의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편은 각각 Cμ3 도메인 또는 그의 단편, Cμ4 도메인 또는 그의 단편, 테일피스(TP) 또는 그의 단편, 또는 Cμ3 도메인 Cμ 도메인, 및 TP 또는 그의 단편의 임의의 조합을 포함한다. 특정 측면에서, 개별 결합 단위 내의 2개의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편은 각각 Cμ2 도메인 또는 그의 단편, Cμ1 도메인 또는 그의 단편, 또는 Cμ1 도메인 또는 그의 단편 및 Cμ2 도메인 또는 그의 단편을 추가로 포함한다.
특정 측면에서, 결합 단위 내의 2개의 IgM 중쇄 불변 영역은 각각 항원 결합 도메인, 예를 들어 항체의 Fv 부분, 예를 들어 인간 또는 뮤린 항체의 VH 및 VL과 회합된다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 결합 분자의 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 교차반응성 HBV 항원 결합 도메인, 예를 들어 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 HBV 아형에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이다. 다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 IgM 결합 분자는 각각의 결합 단위가 상이한 구별가능한 특이성을 갖는 결합 단위를 포함할 수 있다. 따라서, 오량체 IgM 결합 분자는 5개의 많은 상이한 특이성을 가질 수 있고, 그에 따라 현재 알려진 모든 상이한 HBV 아형에 결합할 수 있다. 더욱이, 오량체 IgM 결합 분자의 각각의 결합 단위가 2개의 항원 결합 도메인을 보유하고, 각각의 이들 2개의 항원 결합 도메인이 동일한 항원 상의 상이한 항원 또는 상이한 에피토프에 독립적으로 결합할 수 있기 때문에, 오량체 IgM 결합 분자는 상이한 HBV 아형에 걸쳐 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 심지어 10개의 많은 상이한 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 마찬가지로, 육량체 IgM 결합 분자는 각각의 결합 단위가 상이한 구별가능한 특이성을 갖는 결합 단위를 포함할 수 있다. 따라서, 육량체 IgM 결합 분자는 12개의 많은 상이한 특이성을 가질 수 있고, 따라서 현재 알려진 모든 상이한 HBV 아형에 결합할 수 있다. 또한, 육량체 IgM 결합 분자의 각각의 결합 단위가 2개의 항원 결합 도메인을 보유하고, 각각의 이들 2개의 항원 결합 도메인은 동일한 항원 상의 상이한 항원 또는 상이한 에피토프에 독립적으로 결합할 수 있기 때문에, 본원에 개시된 육량체 IgM 결합 분자는 상이한 HBV 아형에 걸쳐 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 심지어 12개의 많은 상이한 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다.
특정 측면에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 HBV 비리온 표면 외피 단백질(HBsAg) 또는 HBV X 단백질의 S 영역, 프리-S2 영역 및/또는 프리-S1 영역에 결합한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 프리-S1 영역에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, 다량체 결합 분자는 프리-S1, 프리-S2 및 S를 포함하는 HBV 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, HBV 항원은 프리-S1 및 프리-S2, 또는 프리-S1 및 S, 또는 프리-S2 및 S이다. 프리-S1 항원에 결합하는 결합 단위는 프리-S1 항원에 대한 하나 이상의 상이한 특이성을 가질 수 있다. 즉, 본원에서 제공되는 다량체 결합 분자의 적어도 하나의 결합 단위는 HBV 외피 단백질의 프리-S1 단백질에 특이적이고, 각각의 결합 단위는 2개의 많은 항원 결합 도메인을 가질 수 있기 때문에 각각의 항원 결합 도메인은 프리-S1 단백질 상의 상이한 구별가능한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 실시양태에서, 다량체 결합 분자가 하나 초과의 결합 단위를 포함할 때, 각각의 결합 단위는 상이한 HBV 항원에 대해 독립적으로 특이적일 수 있다. 따라서, 적어도 2개의 결합 단위를 포함하는 다량체 결합 분자에서, 하나의 결합 단위는 프리-S1 항원에 대한 특이성을 가질 수 있고, 또 다른 결합 단위는 S 항원에 대한 특이성을 가질 수 있다. 대안으로, 모든 결합 단위는 예를 들어 프리-S1에 대해 동일한 특이성을 가질 수 있다. 따라서, 각각의 결합 단위가 상이한 항원 결합 도메인으로 이루어질 수 있는 것과 같이, 다량체 결합 분자는 상이한 HBV 항원에 대해 하나 이상의 특이성을 가질 수 있다. 일부 측면에서, 다량체 결합 분자의 모든 결합 단위는 프리-S1 항원에 대한 특이성을 갖는다.
본원에서 제공되는 다량체 결합 분자의 결합 단위에 대한 HBV 항원 표적은 감염성 HBV 비리온의 표면 상에서, HBV 감염 세포의 표면 상에서 또는 이들의 조합에서, HBV 항원이 비감염성 서브바이러스 입자 상에서 발현되는 것보다 더 높은 밀도로 발현될 수 있다. 예를 들어, 프리-S1은 비감염성 구형 및 섬유상 HBV 비리온 입자 상에서보다 감염성 HBV 비리온 입자 상에서 더 높은 밀도, 즉 더 많은 수로 발현된다는 것이 알려져 있다([Hong et al., Virology, 318:134-141, 2004]; [Heerman et al., J. Virol ., 52(2):396-402, 1984]; 및 [Park et al., Antiviral Res., 68:109-115, 2005]). 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 다량체 결합 분자의 결합 단위의 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 또는 적어도 12개의 항원 결합 도메인은 감염성 바이러스 입자의 표면 상에, HBV 감염 세포의 표면 상에, 또는 이들의 조합에서 발현되는 B형 간염 바이러스(HBV) 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 이론에 매이기를 바라지는 않지만, 감염성 HBV 비리온에서 보다 고도로 발현되는 HBV 항원에 대한 특이성을 갖는 다량체 결합 분자는 상기 논의된 바와 같이, 참조 단일 결합 단위보다 더 효과적이고, 더 높은 활성을 갖거나, 효능이 더 크거나, 또는 감염된 개체, 예를 들어 급성, 만성, 또는 잠복 감염된 개체에서 예를 들어 감염된 세포의 사멸을 통해 바이러스 청소를 향상시키고/시키거나, 예를 들어 바이러스 중화를 통해 감염성을 억제하고/하거나, HBV 바이러스의 성장 또는 유지를 억제하는 원하는 활성을 달성하기 위해 더 적은 분자를 필요로 할 수 있다.
대안으로, HBV 항원은 외피 단백질(S, M 및/또는 L), 프리코어 항원(예를 들어, HBeAg), 코어 항원(예를 들어, HBcAg) 및 X-항원(예를 들어, HBx)을 포함하는 임의의 하나 이상의 HBV 단백질일 수 있다. 또한, 본원에서 제공되는 다량체 결합 분자는 이들 HBV 항원 중 임의의 하나 이상에 대해 특이성을 독립적으로 각각 갖는 결합 단위를 가질 수 있다. 따라서, 단일 다량체 결합 분자는 예를 들어 외피 단백질(S, M 및/또는 L), 프리코어 항원, 코어 항원 및 X-항원을 포함하는 하나 이상의 HBV 항원에 대해 특이성을 가질 수 있다.
IgA 결합 분자
IgA는 점막 면역에서 결정적인 역할을 수행하고, 생산된 전체 면역글로불린의 약 15%를 차지한다. IgA는 단량체 또는 이량체 분자이다. 본원에서 제공되는 이량체 결합 분자는 5 또는 6개의 결합 단위를 포함하는 결합 분자, 예를 들어, 육량체 또는 오량체 IgM 항체와 구별될 수 있는 결합 특징 또는 생물학적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 이량체 결합 분자는 더 작을 것이고, 더 양호한 조직 침투를 달성할 수 있다. IgA 결합 분자는 2개의 IgA 단량체 및 J-쇄를 포함하도록 시험관 내 발현에 의해 제조될 수 있다. 이어서, IgA 분자는 예를 들어 정맥내 주입을 통해 개체에 투여될 수 있고, 점막 또는 점막 조직으로 이동하는 IgA 분자는 상피 세포에 의해 생성된 분비 성분과 결합하여 복합체를 형성하여, sIgA를 형성할 수 있다. 올리고머 sIgA는 궁극적으로 sIgA가 점막 표면으로 전달되는 상피 세포를 가로질러 전좌된다(Kaetzel et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 88(19):8796-8800). 따라서, 혈류에 IgA를 전달하면, 점막 조직을 표적화할 수 있다.
IgA 결합 단위는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함한다. IgA는 3개의 중쇄 불변 도메인(Cα1, Cα2 및 Cα3)을 포함하고, C-말단 "테일피스"를 포함한다. 인간 IgA에는 IgA1 및 IgA2라는 2개의 아형이 있다. 인간 IgA1 불변 영역은 전형적으로 하기 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함한다:
인간 Cα1 영역은 서열 번호 55의 약 아미노산 6 내지 약 아미노산 98의 범위이고; 인간 Cα2 영역은 서열 번호 55의 약 아미노산 125 내지 약 아미노산 220의 범위이고, 인간 Cα3 영역은 서열 번호 55의 약 아미노산 228 내지 약 아미노산 330의 범위이고, 테일피스의 범위는 서열 번호 55의 아미노산 331 내지 약 아미노산 352이다. 인간 IgA2 불변 영역은 전형적으로 하기 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함한다:
인간 Cα1 영역은 서열 번호 56의 약 아미노산 6 내지 약 아미노산 98의 범위이고; 인간 Cα2 영역은 서열 번호 56의 약 아미노산 112 내지 약 207의 범위이고, 인간 Cα3 영역은 서열 번호 56의 약 아미노산 215 내지 약 아미노산 317의 범위이고, 테일피스는 서열 번호 56의 아미노산 318 내지 약 아미노산 340의 범위이다.
2개의 IgA 결합 단위는 2개의 추가의 폴리펩티드 쇄, 즉 J-쇄(서열 번호 54) 및 분비 성분(서열 번호 57)과 복합체를 형성하여 분비 IgA(sIgA) 항체를 형성할 수 있다. 이론에 매이기를 바라지는 않지만, IgA 결합 단위의 이량체 sIgA 결합 분자로의 조립은 Cα3 및 테일피스 도메인을 수반하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 개시내용에서 제공되는 이량체 IgA 결합 분자는 전형적으로 적어도 Cα3 및 테일피스 도메인을 포함하는 IgA 불변 영역을 포함한다. 분비 성분의 아미노산 서열(서열 번호 57)이 아래에 제공된다:
IgA 중쇄 불변 영역은 Cα2 도메인 또는 그의 단편, Cα1 도메인 또는 그의 단편 및/또는 다른 IgA 중쇄 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 결합 분자는 완전한 IgA 중쇄(α) 불변 도메인, 예를 들어, 서열 번호 55 또는 서열 번호 56, 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
이량체 HBV 결합 분자
본 개시내용은 다량체 결합 분자, 예를 들어 2개 이상의 IgA 분자를 포함하는 다량체 결합 분자를 제공하고, 여기서 각각의 IgA 분자는 HBV 항원, 예를 들어 HBsAg, 예를 들어 HBsAg의 프리-S1 영역에 특이적으로 결합할 수 있는, 본원에서 정의된 바와 같은 1개 또는 2개의 "결합 단위"를 포함할 수 있다. IgM 다량체 결합 분자와 관련하여 위에서 설명한 바와 같이, 본원에서 제공되는 IgA 다중 결합 분자는 참조 단일 결합 단위, 예를 들어 단일 결합 단위 IgG 항체로 이루어진 결합 분자와 비교하여 개선된 결합 특징 또는 생물학적 활성을 보유할 수 있다. 즉, 본원에서 제공되는 IgA 결합 분자는 일부 실시양태에서 바이러스 제거를 향상시킬 수 있고/있거나, 감염된 개체, 예를 들어 급성, 만성, 또는 잠복 감염된 개체에서, 2개의 HBV 특이적 항원 결합 도메인을 포함하는 참조 단일 결합 단위에 비해 예를 들어 감염된 세포의 사멸을 통해 바이러스 청소를 향상시키고/시키거나, 예를 들어 바이러스 중화를 통해 감염성을 억제하고/하거나, HBV 바이러스의 성장 또는 유지를 억제하기 위해 더 큰 효능을 보일 수 있다. "개선된 결합 특징"이라는 용어는 다음과 같이 보다 명확하게 설명될 수 있다. 본원에서 제공되는 IgA 결합 분자는 그것을 필요로 하는 개체에게 투여될 때, 본원에서 제공되는 IgA 결합 분자의 서열과 서열이 동일한 항원 결합 도메인을 갖는 단지 하나의 결합 단위를 포함하는 단일, 즉 비다량체 결합 분자에 비해, 바이러스 청소를 향상시키고/시키거나, 감염성 HBV 비리온의 감염성을 감소시키고/시키거나, 감염성 HBV 비리온의 성장을 감소시키기 위해 보다 강하거나, 효능이 더 크거나, 또는 질량 또는 몰 당량에 의해 보다 적은 결합 분자를 요구하는 것으로 경험적으로 결정된 활성을 보일 수 있다.
상기 언급된 참조 단일 결합 단위는 IgG 결합 단위일 수 있다. 참조 IgG 결합 단위는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 등과 같은 임의의 이소형일 수 있다. 참조 결합 단위는 전형적으로 동일한 동물로부터 유래한다. 따라서, 다량체 결합 분자가 인간인 경우, 참조 단일 결합 단위는 인간일 것이지만, 반드시 인간일 필요는 없다. 즉, 참조 단일 결합 단위는 IgG 유형의 인간화 항체일 수 있다. 반대로, 다량체 결합 분자가 토끼 결합 분자인 경우, 참조 단일 결합 단위는 또한 토끼 결합 단위일 것이다. 또한, 다량체 결합 분자가 하나 이상의 결합 단위 단편으로 이루어지는 경우, 참조 단일 결합 단위는 또한 동등한 단일 결합 단위 단편일 것이다. 즉, 참조 단일 결합 단위는 참조 단일 결합 단위가 동등한 단일 결합 단위인 것을 제외하고는 그 서열 및 구조가 다량체 결합 분자에 함유된 결합 단위와 동일하다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 2개의 2가 결합 단위를 포함하는 다량체 결합 분자를 제공하고, 여기서 각각의 결합 단위는 2개의 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 측면에서, 2개의 IgA 중쇄 불변 영역은 인간 중쇄 불변 영역이다. IgA 결합 단위는 인간 또는 인간화된 결합 단위 또는 이들의 조합일 수 있다. 대안으로, IgM 결합 단위는 단일 IgM 결합 분자에서 혼합된 종일 수 있다.
본원에서 제공되는 다량체, 예를 들어 이량체 IgA 결합 분자는 J-쇄, 또는 그의 기능적 단편 또는 그의 변이체를 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, J-쇄는 이종 모이어티 또는 하나 이상의 이종 모이어티들, 예를 들어 이종 폴리펩티드 서열, 예를 들어 천연 서열 내에 도입된 외부 결합 도메인을 포함하는 변형된 J-쇄이다. 특정 측면에서, 외부 결합 도메인은 CD3, 예를 들어, CD3ε에 특이적으로 결합한다. 특정 측면에서, 성숙한 변형된 J-쇄는 V15J(서열 번호 68) 또는 J15V(서열 번호 71)를 포함한다. 본원에서 제공되는 다량체의 IgA 결합 분자는 분비 성분 또는 그의 단편, 또는 그의 변이체를 추가로 포함할 수 있다.
IgA 중쇄 불변 영역은 불변 영역이 결합 분자에서 원하는 기능을 제공할 수 있는 한, 예를 들어 항원 결합 도메인을 형성하기 위해 제2 IgA 불변 영역과 회합하거나, 또는 또 다른 IgA 결합 단위와 회합하여 이량체 결합 분자를 형성할 수 있는 한, 하나 이상의 Cα1 도메인, Cα2 도메인, 및/또는 Cα3 도메인을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 개별 결합 단위 내의 2개의 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편은 각각 Cα3 도메인 또는 그의 단편, 테일피스(TP) 또는 그의 단편, 또는 Cα3 도메인, TP 또는 그의 단편의 임의의 조합을 포함한다. 특정 측면에서, 개별 결합 단위 내의 2개의 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편은 각각 Cα2 도메인 또는 그의 단편, Cα1 도메인 또는 그의 단편, 또는 Cα1 도메인 또는 그의 단편 및 Cα2 도메인 또는 그의 단편을 추가로 포함한다.
특정 측면에서, 제시된 항원 결합 도메인 내의 2개의 IgA 중쇄 불변 영역은 각각 항원 결합 도메인, 예를 들어 항체의 Fv 부분, 예를 들어 인간 또는 뮤린 항체의 VH 및 VL과 회합된다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 결합 분자의 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 교차반응성 HBV 항원 결합 도메인, 예를 들어 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 HBV 아형에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인이다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 HBV 비리온의 프리-S1 또는 X 항원에 결합한다.
다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 IgA 결합 분자는 서로 상이한 구별가능한 특이성을 각각 갖는 2개의 항원 결합 도메인을 각각 가질 수 있는 결합 단위를 포함할 수 있다. 따라서, 이량체 IgA 결합 분자는 4개의 상이한 특이성을 가질 수 있다.
특정 측면에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 HBV 비리온 외피 단백질(HBsAg)의 S 영역, 프리-S2 영역 및/또는 프리-S1 영역에 결합한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 프리-S1 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, 다량체 결합 분자는 프리-S1, 프리-S2 및 S를 포함하는 HBV 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, HBV 항원은 프리-S1 및 프리-S2, 또는 프리-S1 및 S, 프리-S2 및 S이다. 프리-S1 항원에 결합하는 결합 단위는 프리-S1 항원에 대해 하나 이상의 상이한 특이성을 가질 수 있다. 즉, 본원에서 제공되는 다량체 결합 분자의 하나 이상의 결합 단위는 HBV 외피 단백질의 프리-S1 단백질에 특이적이고, 각각의 결합 단위는 2개의 많은 항원 결합 도메인을 가질 수 있기 때문에, 각각의 항원 결합 도메인은 프리-S1 단백질 상의 상이한 구별가능한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 실시양태에서, 다량체 결합 분자가 하나 초과의 결합 단위를 포함할 때, 각각의 결합 단위는 상이한 HBV 항원에 대해 독립적으로 특이적일 수 있다. 따라서, 적어도 2개의 2가 결합 단위를 포함하는 다량체 결합 분자에서, 하나의 결합 단위는 프리-S1 항원에 대한 특이성을 가질 수 있고; 또 다른 결합 단위는 S 항원 등에 대한 특이성을 가질 수 있다. 대안으로, 모든 결합 단위는 예를 들어 프리-S1에 대해 동일한 특이성을 가질 수 있다. 따라서, 각각의 결합 단위가 상이한 항원 결합 도메인으로 이루어질 수 있는 것과 같이, 다량체 결합 분자는 상이한 HBV 항원에 대해 하나 이상의 특이성을 가질 수 있다. 본 개시내용의 측면에서, 다량체 결합 분자의 모든 결합 단위는 프리-S1 항원에 대한 특이성을 갖는다. 특정 측면에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 HBV X 항원(HBxAg)에 결합한다.
제공된 다량체 결합 분자의 결합 단위가 특이성을 갖는 HBV 항원은 감염성 HBV 비리온의 표면 상에서, HBV 감염 세포의 표면 상에서 또는 이들의 조합에서, HBV 항원이 비감염성 서브바이러스 입자 상에서 발현되는 것보다 더 높은 밀도로 발현될 수 있다. 예를 들어, 프리-S1은 비감염성 구형 및 섬유상 HBV 비리온 입자 상에서보다 감염성 HBV 비리온 입자 상에서 더 높은 밀도, 즉 더 많은 수로 발현된다는 것이 알려져 있다([Hong et al., Virology, 318:134-141, 2004]; [Park et al., Antiviral Res., 68:109-115, 2005]). 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 다량체 결합 분자의 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 항원 결합 도메인은 감염성 바이러스 입자의 표면 상에, HBV 감염 세포의 표면 상에, 또는 이들의 조합에서 발현되는 B형 간염 바이러스(HBV) 항원에 특이적으로 결합한다. 감염된 세포의 표면에 발현될 때, 보다 고밀도의 HBV 항원은 감염된 세포의 표면 상에서 발현되는 MHC 분자의 맥락에서 발견될 수 있다. 이론에 매이기를 바라지는 않지만, 감염성 HBV 비리온에서 보다 고도로 발현되는 HBV 항원에 대한 특이성을 갖는 다량체 결합 분자는 상기 논의된 바와 같이, 참조 단일 결합 단위보다 더 효과적이고, 더 높은 활성을 갖거나, 효능이 더 크거나, 또는 감염된 개체에서 바이러스 청소를 향상시키고/시키거나, 감염성을 억제하고/하거나, HBV 바이러스의 성장을 억제하는 원하는 활성을 달성하기 위해 더 적은 분자를 필요로 할 수 있다.
대안으로, HBV 항원은 HBsAg 외피 단백질(S, M 및/또는 L), 프리코어 항원(예를 들어, HBeAg), 코어 항원(예를 들어, HBcAg) 및 X-항원(예를 들어, HBx)을 포함하는 임의의 하나 이상의 HBV 단백질일 수 있다. 또한, 본원에서 제공되는 다량체 결합 분자는 이들 HBV 항원 중 임의의 하나 이상에 대해 특이성을 독립적으로 각각 갖는 결합 단위를 가질 수 있다. 따라서, 단일 다량체 결합 분자는 예를 들어 외피 단백질(S, M 및/또는 L), 프리코어 항원, 코어 항원 및 X-항원을 포함하는 하나 이상의 HBV 항원에 대해 특이성을 가질 수 있다.
변형된 J-쇄
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 HBV 결합 분자는 이중특이적이고, 변형된 J-쇄를 포함할 수 있다. 본원에서 및 PCT 공개 WO 2015/153912에 제시된 바와 같이, 변형된 J-쇄는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 결합 도메인을 포함할 수 있는 이종 모이어티, 예를 들어 이종 폴리펩티드, 예를 들어 외부 결합 도메인을 포함할 수 있다. 결합 도메인은 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항체-약물 접합체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 항체 유사 분자일 수 있다. 폴리펩티드 결합 도메인은 부가 위치 및 유형(예를 들어, 직접 또는 간접 융합, 화학적 테더링(tethering) 등)을 적절히 선택함으로써 J-쇄 내로 도입될 수 있다.
특정 측면에서, 결합 도메인은 단일특이적, 이중특이적 및 다중특이적 항체 및 항체 단편을 포함하는, 항체 또는 항체의 항원 결합 단편일 수 있다. 항체 단편은 비제한적으로, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, (scFv)2 단편, 단일쇄 항체 분자, 미니바디(minibody) 또는 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체일 수 있다. 특정 측면에서, 항체 단편은 scFv이다.
다른 측면에서, 결합 도메인은 항체 유사 분자, 예를 들어 인간 도메인 항체(dAb), 이중 친화도 재표적화(DART: Dual-Affinity Re-Targeting) 분자, 디아바디, 디-디아바디, 이중 가변 도메인 항체, 적층(Stacked) 가변 도메인 항체, 소형 모듈 면역 약제(SMIP: Small Modular Immuno Pharmaceutical), 서로바디(Surrobody), 가닥 교환 조작 도메인(SEED: strand-exchange engineered domain)-바디 또는 TandAb일 수 있다.
결합 도메인은 수여자 IgM 또는 IgA 분자의 그의 결합 표적 또는 결합 표적들에 대한 결합 또는 J-쇄가 IgA 이량체 또는 IgM 오량체 내에 효과적으로 혼입될 수 있는 능력을 저해하지 않으면서, 결합 도메인의 그의 결합 표적에 대한 결합을 허용하는 임의의 위치에서 천연 J-쇄 서열 내에 도입될 수 있다. 특정 측면에서, 결합 도메인은 C-말단 또는 그 근처에서, 성숙한 N-말단(즉, 신호 펩티드의 절단 후 서열 번호 54의 아미노산 번호 23) 또는 그 근처에서 또는 J-쇄의 3차원 구조를 기초로 하여 접근가능한 내부 위치에서 삽입될 수 있다. 특정 측면에서, 결합 도메인은 서열 번호 54의 인간 J-쇄의 C-말단으로부터 약 10개 잔기가 없는 또는 성숙 N-말단으로부터 약 10개 아미노산 잔기가 없는 천연 서열 J-쇄 내에 도입될 수 있다. 또 다른 측면에서, 결합 도메인은 서열 번호 54의 시스테인 잔기 114와 123 사이의 서열 번호 54의 천연 서열 인간 J-쇄 내에 또는 또 다른 천연 서열 J-쇄의 동등한 위치에 도입될 수 있다. 또 다른 측면에서, 결합 도메인은 글리코실화 부위 또는 그 근처에서 서열 번호 54의 J-쇄와 같은 천연 서열 J-쇄 내에 도입될 수 있다. 특정 측면에서, 결합 도메인은 C-말단으로부터 약 10개 아미노산 잔기 내에서 서열 번호 54의 천연 서열 인간 J-쇄 내로 도입될 수 있다.
도입은 직접 또는 간접 융합, 즉 펩티드 링커와 함께 또는 펩티드 링커 없이 그들의 코딩 뉴클레오티드 서열의 인 프레임 조합에 의한 하나의 폴리펩티드 쇄 내의 J-쇄와 결합 도메인의 조합에 의해 달성될 수 있다. 사용되는 경우, 펩티드 링커(간접 융합)는 약 1 내지 50개, 또는 약 1 내지 40개, 또는 약 1 내지 30개, 또는 약 1 내지 20개, 또는 약 1 내지 10개, 또는 약 1 내지 5개, 또는 약 10 내지 20개 아미노산 길이일 수 있고, J-쇄 서열에 도입될 결합 도메인의 한쪽 또는 양쪽 말단에 존재할 수 있다. 특정 측면에서, 펩티드 링커는 약 1 내지 5개, 약 10 내지 20개, 또는 약 10 내지 15개 아미노산 길이이다. 특정 측면에서, 펩티드 링커는 15개 아미노산 길이이다. 특정 측면에서, 펩티드 링커는 (GGGGS)3(서열 번호 72)이다.
하나 초과의 이종 폴리펩티드, 예를 들어 하나 초과의 결합 도메인을 J-쇄 내에 도입하는 것도 가능하다.
변형된 J-쇄는 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 유기체에서 변형된 J-쇄를 코딩하는 핵산을 발현시킴으로써, 재조합 DNA 기술의 잘 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다.
변형된 J-쇄는 또한 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 수여자 IgM 또는 IgA 결합 분자의 중쇄 및 경쇄와 함께 동시 발현될 수 있다. 수여자 결합 분자는 변형된 J-쇄 혼입 이전에, 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적, 예를 들어 단일특이적, 이중특이성 또는 다중특이적 IgA 또는 IgM 항체일 수 있다. 항체를 비롯한 이중특이적 및 다중특이적 IgM 및 IgA 결합 분자는 예를 들어 미국 특허 가출원 제61/874,277호 및 제61/937,984호에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 명백하게 참고로 포함된다.
특정 측면에서, 본원에서 설명되는 항-HBV IgM 또는 IgA 결합 분자는 면역 이펙터 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포, 대식세포 또는 호중구에 대한 결합 특이성을 갖는 변형된 J-쇄를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 이펙터 세포는 T 세포이고, 결합 표적은 CD3이다(아래에서 논의됨). 이펙터 세포, 예를 들어 이펙터 T 세포(T 세포 의존성 사멸 또는 TDCC)를 활성화하여, HBV 항원, 예를 들어 HBsAg을 그 표면에 발현하는 감염된 세포로 재유도함으로써, 본원에서 제공되는 이중특이적 항-HBV x 항-CD3 IgM 또는 IgA 결합 분자는 표적에 대한 증강된 면역 반응, 예를 들어, 보체 매개 세포독성, 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC), TDCC 및/또는 NK 세포 매개 사멸을 포함하는 반응을 생성하여, 효력 및 효능을 추가로 증가시킬 수 있다. 특정 측면에서, 변형된 J-쇄를 포함하는 본원에서 제공되는 이중특이적 항-HBV x 항-CD3 IgM 또는 IgA 결합 분자는 B형 간염 바이러스 감염에 의해 야기되거나 악화되는 질환 또는 병태의 치료에 사용될 수 있다.
T 세포의 경우, 분화 클러스터 3(CD3: cluster of differentiation 3)은 역사적으로 T3 복합체로 알려진 다량체 단백질 복합체이고, 조립되어 3쌍의 이량체(εγ, εδ, ζζ)로 기능하는 4개의 별개의 폴리펩티드 쇄(ε, γ, δ, ζ)로 이루어진다. CD3 복합체는 T 세포 수용체(TCR)와 비공유 회합하는 T 세포 공수용체로서 기능한다. 이 CD3 복합체의 성분, 특히 CD3ε는 본원에서 제공되는 이중특이적 IgM 또는 IgA 결합 분자의 변형된 J-쇄에 대한 표적이 될 수 있다.
특정 측면에서, 이중특이적 항-HBV x 항-CD3 IgM 또는 IgA 결합 분자는 항체 결합 도메인을 통해 HBV 감염 세포 또는 HBV 바이러스 입자에 결합하는 반면, J-쇄는 CD3ε에 결합하도록 변형된다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 변형된 J-쇄의 항-CD3ε 결합 도메인은 scFv이다. 항 CD3ε scFv는 J-쇄의 N 말단 또는 그 근처에서, 또는 J 쇄의 C 말단 또는 그 근처에서 직접 또는 scFv와 J-쇄 서열 사이에 도입된 합성 링커, 예를 들어 (GGGGS)3 링커(서열 번호 72)로 간접적으로 융합될 수 있다. 특정 측면에서, scFv는 비실리주맙(Nuvion)의 VH 및 VL 영역을 포함한다. 특정 측면에서, 변형된 J-쇄는 비실리주맙의 VH, (GGGGS)3 링커 및 비실리주맙의 VL을 포함하는 scFv를 포함한다.
특정 측면에서, 본원에서 V15J로 언급되는 변형된 J-쇄는 15개 아미노산 (GGGGS)3 링커를 통해 인간 J-쇄의 N-말단에 융합된 비실리주맙의 scFv를 포함한다. V15J는 IgM 또는 IgA 결합 분자 내로의 수송 및 조립을 용이하게 하는 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 성숙한 V15J 단백질은 서열 번호 68로서 제시되며, 19개 아미노산의 면역글로불린 중쇄 신호 펩티드를 포함하는 전구체 버전은 서열 번호 67로서 제시된다. 특정 측면에서, 본원에서 J15V로 언급되는 변형된 J-쇄는 15개 아미노산의 (GGGGS)3 링커 통해 인간 J-쇄의 C 말단에 융합된 비실리주맙의 scFv를 포함한다. J15V는 IgM 또는 IgA 결합 분자 내로의 수송 및 조립을 용이하게 하는 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 성숙한 J15V 단백질은 서열 번호 71로서 제시되며, 22개 아미노산의 인간 J-쇄 신호 펩티드를 포함하는 전구체 버전은 서열 번호 70으로서 제시된다. 특정 측면에서, 다른 신호 펩티드가 사용될 수 있다. 변형된 J-쇄의 발현, 분비 및 본원에서 제공되는 항-HBV IgM 또는 IgA 결합 분자 내로의 혼입을 용이하게 하기 위한 적합한 신호 펩티드의 선택 및 포함은 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
조작된 HBV 항원 결합 도메인
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 HBV 항원 결합 도메인은 6개의 많은 면역글로불린 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있고, 여기서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 CDR은 하기 표 2에 제시된 HBV mAb의 대응하는 CDR에 관련되거나 또는 일부 실시양태에서는 동일하다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 HBV 항원 결합 도메인은 6개의 많은 면역글로불린 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있고, 여기서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 CDR은 미국 특허 제7,115,723호에 개시된 HBV mAb KR127의 대응하는 CDR에 관련되거나 또는 일부 실시양태에서는 동일하다. KR127 항체 및 그의 유도체는 HBsAg 프리-S1 에피토프에 특이적이다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 HBV 항원 결합 도메인은 KR127의 인간화된 버전, 예를 들어 KR127I일 수 있으며, 여기에서 VH 및 VL 영역은 각각 서열 번호 1 및 3(KR127III)의 아미노산 서열을 포함하고, VH 및 VL 영역은 둘 모두 미국 특허 제7,115,723호에 개시된 서열 번호 1 및 3의 아미노산 서열을 각각 포함한다. 또 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 HBV 항원 결합 도메인은 미국 특허 제8,420,353호(각각 VH 및 VL 서열 번호 5 및 6)에서, 문헌 [Hong et al., Virol., 318:131-141, 2004](각각 VH 및 VL 서열 번호 4 및 3) 또는 문헌 [Kim, J.H., et al. FEBS Letters 589:193-20, 2015](각각 VH 및 VL 서열 번호 47 및 48)에서 제공되는 KR127의 인간화된 친화도 성숙 버전일 수 있다.
클로닝된 가변 영역을 면역글로불린 도메인 내로 유전공학적으로 조작하고, 그러한 구축물을 발현 및 정제하는 방법은 공개되어 있고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 능력 내에서 실시가능하다(예를 들어, 문헌 [Wu et al.,　MAbs,　1:339-47, 2009], 및 [Wu et al.,　Nat. Biotechnol.,　25:1290-7, 2007] 참조).
표 2는 본원에서 제공되는 다량체 결합 분자에 사용될 수 있는 예시적이고 비제한적인 HBV 결합 도메인의 VH 및 VL 아미노산 서열, 및 결합 도메인이 결합하는 확인된 에피토프를 제공한다. 이들 서열, 또는 그의 변이체, 단편 또는 유도체는 표준 오량체 또는 육량체 IgM 또는 IgA 구조로 조작될 수 있다.
<표 2> HBV에 특이적인 모노클로날 항체에 대한 VH 및 VL 아미노산 서열
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 이량체, 육량체 또는 오량체 결합 분자의 HBV 항원 결합 도메인은 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH 영역, VL 영역 또는 VH와 VL 영역 둘 모두는 상기 표 2에 제시된 참조 문헌에 개시된 HBV 모노클로날 항체의 상응하는 VH 및 VL에 관련된다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 결합 분자는 표 2에 열거된 항체의 VH 및 VL을 포함하는 IgG 항체보다 더 큰 효능을 나타낸다. 항-HBV의 IgA 또는 IgM 형태의 증가된 결합활성은 감염된 세포를 매우 낮은 밀도의 HBV 표면 단백질과 결합시켜 감염된 환자로부터 HBV를 보다 효과적으로 청소할 수 있는 더 큰 효능을 유도할 수 있다. 특정 측면에서, VH는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 7, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 26, 서열 번호 26, 서열 번호 26, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 34, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 62, 서열 번호 73, 또는 서열 번호 75 중 임의의 하나 이상과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, VL은 서열 번호 3, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 15, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 74 또는 서열 번호 76 중 임의의 하나 이상과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, VH/VL 서열은 각각 다음 서열 쌍 중 임의의 하나 이상을 포함한다: 서열 번호 1 및 서열 번호 3, 서열 번호 2 및 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 3, 서열 번호 5 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8, 서열 번호 7 및 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11, 서열 번호 14 및 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 21, 서열 번호 17 및 서열 번호 22, 서열 번호 18 및 서열 번호 23, 서열 번호 19 및 서열 번호 24, 서열 번호 20 및 서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 27, 서열 번호 26 및 서열 번호 28, 서열 번호 26 및 서열 번호 29, 서열 번호 30 및 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33, 서열 번호 34 및 서열 번호 35, 서열 번호 34 및 서열 번호 36, 서열 번호 37 및 서열 번호 38, 서열 번호 39 및 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42, 서열 번호 43 및 서열 번호 44, 서열 번호 45 및 서열 번호 46, 서열 번호 47 및 서열 번호 48, 서열 번호 49 및 서열 번호 50, 서열 번호 51 및 서열 번호 52, 서열 번호 62 및 서열 번호 6, 서열 번호 73 및 서열 번호 74, 또는 서열 번호 75 및 서열 번호 76을 포함한다.
다양한 상이한 이량체, 육량체 및 오량체 결합 분자가 본 개시내용에 기초하여 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 수 있고, 따라서 본 개시내용에 포함되고, 특정 측면에서, 각각의 결합 단위가, IgM 불변 영역 또는 그의 단편에 대하여 아미노 말단에 위치하는 VH를 각각 포함하는 2개의 IgM 중쇄 및 면역글로불린 경쇄 불변 영역에 대하여 아미노 말단에 위치하는 VL을 각각 포함하는 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는, 상기 설명된 바와 같은 결합 분자가 제공된다. 특정 측면에서, 각각의 결합 단위가, IgA 불변 영역 또는 그의 단편에 대하여 아미노 말단에 위치하는 VH를 각각 포함하는 2개의 IgA 중쇄 및 면역글로불린 경쇄 불변 영역에 대하여 아미노 말단에 위치하는 VL을 각각 포함하는 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는, 상기 설명된 바와 같은 결합 분자가 제공된다.
또한, 특정 측면에서, 결합 분자의 적어도 하나의 결합 단위, 또는 결합 분자의 2, 3, 4, 5 또는 6개의 결합 단위는 상기한 바와 같은 HBV 항원 결합 도메인 중 2개를 포함한다. 특정 측면에서, 결합 분자의 하나의 결합 단위 또는 결합 분자의 2, 3, 4, 5 또는 6개의 결합 단위 내의 2개의 HBV 항원 결합 도메인은 서로 상이할 수 있거나, 또는 동일할 수 있다.
특정 측면에서, 결합 분자의 하나의 결합 단위 또는 결합 분자의 2개의 결합 단위 내의 2개의 IgA 중쇄는 동일하다. 특정 측면에서, 결합 분자의 하나의 결합 단위, 또는 결합 분자의 2, 3, 4, 5 또는 6개의 결합 단위 내의 2개의 IgM 중쇄는 동일하다.
특정 측면에서, 결합 분자의 하나의 결합 단위, 또는 결합 분자의 2, 3, 4, 5 또는 6개의 결합 단위 내의 2개의 경쇄는 동일하다. 특정 측면에서, 결합 분자의 적어도 하나의 결합 단위 내, 또는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 결합 단위 내의 2개의 동일한 경쇄는 카파 경쇄, 예를 들어 인간 카파 경쇄, 또는 람다 경쇄, 예를 들어, 인간 람다 경쇄이다.
특정 측면에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 결합 단위는 2개의 동일한 IgA 또는 IgM 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함하거나 또는 각각 포함한다. 이러한 측면에 따르면, 결합 분자의 하나의 결합 단위 또는 결합 분자의 2, 3, 4, 5 또는 6개의 결합 단위 내의 HBV 항원 결합 도메인은 동일할 수 있다. 또한, 상기 측면에 따르면, 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자는 상기 설명된 바와 같은 HBV 항원 결합 도메인의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 카피를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 결합 단위가 동일할 수 있고, 특정 측면에서 결합 단위는 동일한 항원 결합 도메인을 포함할 수 있고, 예를 들어 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 또는 적어도 12개의 HBV 항원 결합 도메인이 동일할 수 있다.
특정 측면에서, 이량체, 육량체 또는 오량체 결합 분자는 VH 및 VL을 포함하는 적어도 하나의 HBV 항원 결합 도메인을 포함하며, 여기서 VH 영역, VL 영역, 또는 VH과 VL 영역 둘 모두는 각각 다음 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 VH 및 VL 영역에 관련된다: 서열 번호 1 및 서열 번호 3, 서열 번호 2 및 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 3, 서열 번호 5 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8, 서열 번호 7 및 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11, 서열 번호 14 및 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 21, 서열 번호 17 및 서열 번호 22, 서열 번호 18 및 서열 번호 23, 서열 번호 19 및 서열 번호 24, 서열 번호 20 및 서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 27, 서열 번호 26 및 서열 번호 28, 서열 번호 26 및 서열 번호 29, 서열 번호 30 및 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33, 서열 번호 34 및 서열 번호 35, 서열 번호 34 및 서열 번호 36, 서열 번호 37 및 서열 번호 38, 서열 번호 39 및 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42, 서열 번호 43 및 서열 번호 44, 서열 번호 45 및 서열 번호 46, 서열 번호 47 및 서열 번호 48, 서열 번호 49 및 서열 번호 50, 서열 번호 51 및 서열 번호 52, 서열 번호 62 및 서열 번호 6, 서열 번호 73 및 서열 번호 74, 또는 서열 번호 75 및 서열 번호 76. 특정 측면에서, 이량체, 육량체 또는 오량체 결합 분자는 VH를 포함하는 적어도 하나의 HBV 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 VH 영역은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 VH 영역에 관련된다.
특정 측면에서, 이량체, 육량체 또는 오량체 결합 분자는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 1 또는 2개의 단일 아미노산 치환을 포함하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하는 VH, 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 1 또는 2개의 단일 아미노산 치환을 함유하는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역을 포함하는, 각각 VH 및 VL 아미노산 서열 서열 번호 1 및 서열 번호 3, 서열 번호 2 및 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 3, 서열 번호 5 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8, 서열 번호 7 및 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11, 서열 번호 14 및 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 21, 서열 번호 17 및 서열 번호 22, 서열 번호 18 및 서열 번호 23, 서열 번호 19 및 서열 번호 24, 서열 번호 20 및 서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 27, 서열 번호 26 및 서열 번호 28, 서열 번호 26 및 서열 번호 29, 서열 번호 30 및 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33, 서열 번호 34 및 서열 번호 35, 서열 번호 34 및 서열 번호 36, 서열 번호 37 및 서열 번호 38, 서열 번호 39 및 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42, 서열 번호 43 및 서열 번호 44, 서열 번호 45 및 서열 번호 46, 서열 번호 47 및 서열 번호 48, 서열 번호 49 및 서열 번호 50, 서열 번호 51 및 서열 번호 52, 서열 번호 62 및 서열 번호 6, 서열 번호 73 및 서열 번호 74, 또는 서열 번호 75 및 서열 번호 76의 적어도 하나의 HBV 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 측면에서, 이량체, 육량체 또는 오량체 결합 분자는 VH 아미노산 서열 서열 번호 12 또는 서열 번호 13의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 1 또는 2개의 단일 아미노산 치환을 함유하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하는 VH를 포함하는 적어도 하나의 HBV 항원 결합 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 이량체, 육량체 또는 오량체 결합 분자는 VH 및 VL을 포함하는 적어도 하나의 HBV 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 VH 영역, VL 영역, 또는 VH와 VL 영역 둘 모두는 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 3, 서열 번호 2 및 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 3, 서열 번호 5 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8, 서열 번호 7 및 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11, 서열 번호 14 및 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 21, 서열 번호 17 및 서열 번호 22, 서열 번호 18 및 서열 번호 23, 서열 번호 19 및 서열 번호 24, 서열 번호 20 및 서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 27, 서열 번호 26 및 서열 번호 28, 서열 번호 26 및 서열 번호 29, 서열 번호 30 및 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33, 서열 번호 34 및 서열 번호 35, 서열 번호 34 및 서열 번호 36, 서열 번호 37 및 서열 번호 38, 서열 번호 39 및 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42, 서열 번호 43 및 서열 번호 44, 서열 번호 45 및 서열 번호 46, 서열 번호 47 및 서열 번호 48, 서열 번호 49 및 서열 번호 50, 서열 번호 51 및 서열 번호 52, 서열 번호 62 및 서열 번호 6, 서열 번호 73 및 서열 번호 74, 또는 서열 번호 75 및 서열 번호 76과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, 이량체, 육량체 또는 오량체 결합 분자는 VH를 포함하는 적어도 하나의 HBV 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 VH 영역은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에서, VH 및 VL은 미국 특허 제7,115,723호에 기재된 HBV 프리-S1 mAb로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, HBV 항원 결합 도메인은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 VH 아미노산 서열, 및 서열 번호 3과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 측면에서, VH 및 VL은 문헌 [Hong et al., Virol ., 318:131-141, 2004]에 기재된 HBV 프리-S1 mAb로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, HBV 항원 결합 도메인은 서열 번호 4와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 VH 아미노산 서열, 및 서열 번호 3과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 측면에서, VH 및 VL은 미국 특허 제8,420,353호에 기재된 HBV mAb로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, HBV 항원 결합 도메인은 서열 번호 5와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 VH 아미노산 서열, 및 서열 번호 6과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 측면에서, HBV 항원 결합 도메인은 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 3, 서열 번호 2 및 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 3, 서열 번호 5 및 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8, 서열 번호 7 및 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11, 서열 번호 14 및 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 21, 서열 번호 17 및 서열 번호 22, 서열 번호 18 및 서열 번호 23, 서열 번호 19 및 서열 번호 24, 서열 번호 20 및 서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 27, 서열 번호 26 및 서열 번호 28, 서열 번호 26 및 서열 번호 29, 서열 번호 30 및 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33, 서열 번호 34 및 서열 번호 35, 서열 번호 34 및 서열 번호 36, 서열 번호 37 및 서열 번호 38, 서열 번호 39 및 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42, 서열 번호 43 및 서열 번호 44, 서열 번호 45 및 서열 번호 46, 서열 번호 47 및 서열 번호 48, 서열 번호 49 및 서열 번호 50, 서열 번호 51 및 서열 번호 52, 서열 번호 62 및 서열 번호 6, 서열 번호 73 및 서열 번호 74, 또는 서열 번호 75 및 서열 번호 76을 포함하는 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, HBV 항원 결합 도메인은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13을 포함하는 VH 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 IgM 중쇄 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄를 포함하는, 본원에서 HBV24M으로 명명된 육량체 또는 오량체 항체가 제공된다. 서열 번호 58 및 59가 여기에 제공된다:
>HBV24 IgM 중쇄(서열 번호 58)
>HBV24 카파 경쇄(서열 번호 59)
특정 측면에서, 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄 가변 영역(VH)이 제공된다:
>HBV24M2 IgM 중쇄(서열 번호 62)
특정 측면에서, 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 IgM 중쇄 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄를 포함하는, 본원에서 HBV24M2로 명명된 육량체 또는 오량체 항체가 제공된다. 서열 번호 63 및 59가 여기에 제공된다:
> HBV24M2 IgM 중쇄(서열 번호 63)
>HBV24 카파 경쇄(서열 번호 59)
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체의 HBV 결합 분자는 다른 단일 결합 분자, 예컨대 동일한 항원 결합 도메인을 포함하는 참조 단일 결합 단위와 비교할 때 유리한 구조적 및/또는 기능적 특성, 또는 "개선된 결합 특징"을 가질 수 있다. 예를 들어, 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자는 상응하는 참조 단일 결합 단위, 예를 들어 상기 설명된 바와 같은 다량체 결합 분자에 존재하는 동일한 VH 및 VL 영역 서열을 포함하는 IgG1 결합 분자에 비해 시험관 내 또는 생체 내 생물학적 검정에서 개선된 활성 또는 효능을 가질 수 있다. 생물학적 검정은 바이러스 중화 검정, 검정, 세포 부착 검정, 바이러스 배출 검정, 면역조직화학적 검정, 직접 세포독성 검정, 보체 매개 세포독성(CDC) 검정, T 세포 매개 사멸(TDCC) 검정, NK 세포 매개 사멸 검정 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 측면에서, 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, 본원에서 제공되는 IgM 항체는 HBV 항원 결합 도메인과 동일한 HBV 에피토프에 특이적으로 결합하는 동등한 양의 단일특이적 단일 결합 단위 IgG1 항체 또는 그의 단편보다 더 높은 효능으로 HBV 중화 또는 HBV 감염 세포의 사멸을 유도할 수 있다.
"효능" 또는 "개선된 결합 특징"은 제시된 검정에서 제시된 생물학적 결과, 예를 들어, 바이러스 접종물의 20%, 50% 또는 90%의 중화를 달성하는데 필요한 제시된 결합 분자의 최소량(EC20, EC50, 또는 EC90)을 의미한다. 효능은 예를 들어 바이러스 중화 %, 감염된 세포의 사멸 %, 또는 다른 측정가능한 파라미터가 Y축에 있고 결합 분자 농도(예를 들어, ㎍/ml 또는 nM)는 X축에 있는 곡선으로 표현될 수 있다.
특정 측면에서, TDCC는 예를 들어, HBsAg 발현 세포 및 조작된 CD3 발현 T 세포를 본원에서 제공되는 이중특이적 항-HBsAg x 항-CD3 IgM 결합 분자의 존재 하에 동시 배양하고 사이토카인 방출, 표적 세포 용해 또는 다른 검출 방법을 통해 T 세포 활성화를 측정함으로써 시험관 내에서 측정될 수 있다. 특정 측면에서, TDCC는 T 세포 유도 표적 세포 사멸을 통해 측정될 수 있다.
특정 측면에서, HBsAg 발현 세포는 불멸화된 세포주, 예를 들어 간세포 암종(HCC) 세포주, 예를 들어 PLC/PRF/5 세포, 또는 HBV 항원, 예를 들어 HBsAg 또는 HBsAg-L에 감염된 세포주, 예를 들어 HEK293, CHO, HepG2, 또는 HepaRG 세포, 또는 HBV 감염된 세포, 예를 들어 HBV 감염된 HepaRG 세포, 또는 HBV를 생산하는 세포, 예를 들어 HepG2.2.15 세포일 수 있다. 유사한 세포주가 공지되어 있고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 수득될 수 있다. 특정 측면에서, HBV 항원 발현 세포주는 HBV 감염, HCC 또는 관련 암을 앓고 있는 환자로부터 유래될 수 있다.
특정 측면에서, 예를 들어, CDC, TDCC, ADCC 및 다른 사멸 방법, 예를 들어 아폽토시스에 의한 HBV 항원 발현 세포의 전체적인 사멸은 단리된 T 세포 및/또는 보체 또는 T 세포와 보체 둘 모두를 포함하는 전혈을 사용하는 검정으로 시험관 내에서 시험할 수 있다.
예를 들어, 결합 분자가 본원에서 제공되는 2개의 동일한 항-HBsAg 결합 도메인을 각각 포함하는 5개의 동일한 결합 단위를 포함하는 오량체 결합 분자이고 예를 들어 HBsAg 발현 PLC/PRF/5 세포주 또는 HepG2.2.15 세포를 사용한 CDC 검정에서 시험되는 특정 측면에서, 결합 분자는 예를 들어 ㎍/ml 또는 nM 단위로 측정된, 동일한 항-HBsAg 결합 도메인을 갖는 항-HBsAg 단일특이적 IgG1 항체의 당량(중량 또는 몰 농도에서 동등함)의 IC50보다 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 150배, 적어도 200배 또는 그 초과로 더 낮은 IC50으로 보체 매개 사멸을 유도할 수 있다. HBsAg 발현 세포가 PLC/PRF/5 세포주 또는 HBsAg 형질감염 세포인 특정 측면에서, 결합 분자는 예를 들어 몰 또는 분자량 당량으로 측정될 때 동일한 항-HBsAg 결합 도메인을 갖는 항-HBsAg 단일특이적 IgG1 항체의 당량의 IC50보다 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배 더 낮은 IC50으로 보체 매개 사멸을 유도할 수 있다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 2개의 동일한 항-HBsAg 결합 도메인 + 본원에서 제공되는 야생형 또는 변형된 J-쇄를 각각 포함하는 5개의 동일한 결합 단위를 포함하는 오량체 결합 분자는 보다 낮은 HBV 항원 발현 수준을 나타내는 세포에서 수행된 CDC 검정에서 증가된 효능을 나타낼 수 있다. 예를 들어, HBV 발현 PLC/PRF/5 세포 또는 HepG2.2.15 세포를 사용하는 CDC 검정에서 시험된, 본원에서 제공되는 야생형 또는 변형된 J-쇄를 갖는 오량체 항-HBsAg 결합 분자는 예를 들어 몰 또는 분자량 당량으로 측정될 때 동일한 항-HBsAg 결합 도메인을 갖는 항-HBsAg 단일특이적 IgG1 항체의 당량의 IC50보다 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 150배, 적어도 200배 또는 그 초과로 더 낮은 IC50으로 보체 매개 사멸을 유도할 수 있다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 2개의 동일한 항-HBV 결합 도메인을 각각 포함하는 5개의 동일한 결합 단위 + 인간 CD3에 결합할 수 있는 변형된 J-쇄, 예를 들어, 본원에서 제공되는 V15J 또는 J15V를 포함하는 이중특이적 오량체 결합 분자는 TDCC 검정에서 증가된 효능을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 조작된 Jurkat T 세포와 함께 동시 배양된 HBsAg 발현 PLC/PRF/5 세포 또는 HepG2.2.15 세포를 사용하는 T 세포 활성화 검정에서 시험된, 인간 CD3에 결합할 수 있는 변형된 J-쇄, 예를 들어 본원에서 제공되는 V15J 또는 J15V를 갖는 오량체 항-HBsAg 결합 분자는 예를 들어 몰 또는 분자량 당량으로 측정될 때 HBV 항원 발현 세포 및 T 세포에 결합하는 동일한 항-HBsAg 결합 도메인(들)을 갖는 이중특이적 항-HBsAg IgG1 항체, 예를 들어 단일 결합 단위 이중특이적 항-HBsAg x 항-CD3 분자의 당량의 IC50보다 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 150배, 적어도 200배 또는 그 초과로 더 낮은 IC50으로 T 세포 매개 사멸을 용이하게 할 수 있다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 2개의 동일한 항-HBsAg 결합 도메인을 각각 포함하는 5개의 동일한 결합 단위 + 야생형 J-쇄 또는 인간 CD3에 결합할 수 있는 변형된 J-쇄, 예를 들어, 본원에서 제공되는 V15J 또는 J15V를 포함하는 단일특이적 또는 이중특이적 오량체 결합 분자는 전혈 시험관 내 세포독성 검정에서 증가된 효능을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 히루딘 항응고된 인간 혈액과 함께 동시 배양된 HBsAg 발현 PLC/PRF/5 세포주를 사용하는 적절한 시험관 내 세포독성 검정에서 시험된, 오량체 항-HBV 결합 분자 + 야생형 또는 인간 CD3에 결합할 수 있는 변형된 J-쇄, 예를 들어 본원에서 제공되는 V15J 또는 J15V는 예를 들어 몰 또는 분자량 당량으로 측정될 때 동일한 항-HBsAg 결합 도메인을 갖는 항-HBsAg 단일특이적 IgG1 항체의, 또는 예를 들어 몰 또는 분자량 당량으로 측정될 때 HBV 항원 발현 세포 및 T 세포에 결합하는 동일한 항-HBsAg 결합 도메인(들)을 갖는 이중특이적 항-HBsAg IgG1 항체, 예를 들어 이중특이적 단일 결합 단위 항-HBsAg x 항-CD3 분자의 당량의 IC50보다 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 150배, 적어도 200배 또는 그 초과로 더 낮은 IC50으로 PLC/PRF/5 세포 또는 HepG2.2.15 세포의 사멸을 달성할 수 있다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 2개의 동일한 항-HBsAg 결합 도메인을 각각 포함하는 5개의 동일한 결합 단위 + 야생형 J-쇄 또는 인간 CD3에 결합할 수 있는 변형된 J-쇄, 예를 들어, 본원에서 제공되는 V15J 또는 J15V를 포함하는 단일특이적 또는 이중특이적 오량체 결합 분자는 예를 들어 본원의 다른 곳에서 설명되는 인간화된 마우스 모델에서 생체 내에서 HBsAg 발현 또는 HBV 감염 세포의 증가된 사멸을 나타낼 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포
본 개시내용은 상기 설명된 이량체, 육량체 또는 오량체 결합 분자의 폴리펩티드 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 단리된, 재조합 및/또는 비천연 생성 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. "폴리펩티드 서브유닛"은 독립적으로 번역될 수 있는 결합 분자, 결합 단위 또는 항원 결합 도메인의 일부를 의미한다. 그 예는 비제한적으로, 항체 가변 도메인, 예를 들어 VH 또는 VL, 단일쇄 Fv, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 불변 영역, 항체 경쇄 불변 영역 및/또는 그의 임의의 단편을 포함한다.
특정 측면에서, 폴리펩티드 서브유닛은 IgM 또는 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편, 및 HBV 항원 결합 도메인의 VH 부분을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 VH의 C-말단부에 융합된 인간 IgM 또는 IgA 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드 서브유닛을 코딩할 수 있고, 여기서 VH는 아미노산 서열 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 26, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 62, 서열 번호 73, 또는 서열 번호 75를 포함하는 VH의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 1 또는 2개의 단일 아미노산 치환을 포함하는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함한다.
특정 측면에서, 폴리펩티드 서브유닛은 상기한 바와 같은 HBV 항원 결합 도메인의 항체 VL 부분을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 폴리펩티드 서브유닛은 VL의 C-말단부에 융합된 인간 항체 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함할 수 있고, 여기서 VL은 아미노산 서열 서열 번호 3, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 15, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 74 또는 서열 번호 76을 포함하는 VL의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 1 또는 2개의 단일 아미노산 치환을 포함하는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역을 포함한다.
특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 VH의 C-말단부에 융합된 인간 IgM 또는 IgA 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드 서브유닛을 코딩할 수 있고, 여기서 VH는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 7, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 26, 서열 번호 26, 서열 번호 26, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 34, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 62, 서열 번호 73, 또는 서열 번호 75의 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 VL의 C-말단부에 융합된 인간 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드 서브유닛을 코딩할 수 있고, 여기서 VL은 서열 번호 3, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 15, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 74 또는 서열 번호 76 중 임의의 하나 이상과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 항원 결합 도메인을 형성하기 위해, B형 간염 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 가변 영역을 IgM 및/또는 IgA 구조를 위한 발현 벡터 주형에 삽입함으로써 적어도 2개의 2가 결합 단위를 갖는 다량체 결합 분자를 생성할 수 있다. 간단히 설명하면, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 코딩하는 핵산 서열은 기존 분자로부터 합성되거나 증폭될 수 있고, 발현시 벡터가 전장 중쇄 또는 경쇄를 생성하도록 적절한 배향으로 및 인 프레임으로 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이러한 목적에 유용한 벡터는 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 이러한 벡터는 또한 인핸서 및 원하는 쇄의 발현을 달성하는데 필요한 다른 서열을 포함할 수 있다. 여러 벡터 또는 단일 벡터를 사용할 수 있다. 이들 벡터를 숙주 세포에 형질감염시킨 후, 쇄를 발현시키고 정제한다. 발현시, 쇄는 문헌에서 보고된 바와 같이, 완전 기능성의 다량체 결합 분자를 형성한다. 이어서, 완전히 조립된 다량체 결합 분자를 표준 방법으로 정제할 수 있다. 발현 및 정제 공정은 필요하다면, 상업적 규모로 수행될 수 있다.
본 개시내용은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 추가로 제공하고, 여기서 2개 이상의 폴리뉴클레오티드는 집합적으로 상기 설명한 이량체, 육량체 또는 오량체 결합 분자를 코딩할 수 있다. 특정 측면에서, 조성물은 IgM 및/또는 IgA 중쇄 또는 그의 단편, 예를 들어 IgM 및/또는 IgA 중쇄가 HBV 항원 결합 도메인의 적어도 VH를 포함하는 상기 설명한 인간 IgM 및/또는 IgA 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 경쇄 또는 그의 단편, 예를 들어 HBV 항원 결합 도메인의 적어도 VL을 포함하는 인간 카파 또는 람다 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제공되는 폴리뉴클레오티드 조성물은 J-쇄, 예를 들어, 인간 J-쇄 또는 그의 단편 또는 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 조성물을 구성하는 폴리뉴클레오티드는 2개 또는 3개의 별개의 벡터, 예를 들어, 발현 벡터 상에 위치할 수 있다. 이러한 벡터는 본 개시내용에 의해 제공된다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 조성물을 구성하는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드는 단일 벡터, 예를 들어, 발현 벡터 상에 위치할 수 있다. 그러한 벡터는 본 개시내용에 의해 제공된다.
본 개시내용은 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자, 또는 그의 임의의 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 2 이상의 폴리뉴클레오티드, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 조성물, 또는 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자 또는 그의 임의의 서브유닛을 집합적으로 코딩하는 벡터 또는 2개, 3개 또는 그 초과의 벡터를 포함하는 숙주 세포, 예를 들어 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 추가로 제공한다. 특정 측면에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 숙주 세포는 본 개시내용에 의해 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자 또는 그의 서브유닛을 발현할 수 있다.
관련 측면에서, 본 개시내용은 상기 개시 내용에 의해 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 설명된 숙주 세포를 배양하고 결합 분자를 회수하는 것을 포함한다.
사용 방법
본 개시내용은 이량체 IgA 기반 HBV 결합 분자, 또는 오량체 또는 육량체 IgM 기반 HBV 결합 분자 사용하여, 예를 들어 2 이상의 아형에 걸쳐 만성적으로 감염된 세포에서 B형 간염 바이러스(HBV)의 증식, 잠복, 또는 유지를 제어하는, 예를 들어 바이러스 부착, 감염성, 복제, 잠복, 배출 등을 제어하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 아래에서 설명되는 방법은 표 2에 제시된 참조 문헌에 개시된 항체 및 상응하는 VH 및 VL 서열, 또는 그의 변이체, 유도체 또는 유사체를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 신규한 또는 기존의 HBV 항체로부터 유래된 HBV 항원 결합 도메인을 포함하는 다량체 결합 분자를 이용할 수 있고, 여기서 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어 IgM 항체는 상기 개시되고 설명된 상응하는 단일 결합 단위 항체, 단편, 변이체, 유도체 또는 유사체와 비교하여 개선된 효능을 제공할 수 있다. 이러한 개시에 기초하여, 임의의 관심 HBV 특이적 항원 결합 도메인을 포함하는 이량체 IgA 결합 분자, 또는 오량체 또는 육량체 IgM 결합 분자의 구축은 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 능력 내에서 수행될 수 있다. 항-HBV 항체의 IgA 또는 IgM 형태의 증가된 결합활성은 매우 낮은 밀도의 HBV 표면 단백질을 갖는 HBV 감염 세포에 결합하여, 바이러스 중화 개선, 예를 들어 보체 또는 T 세포 매개 세포독성을 통한 HBV 감염 세포 사멸의 개선, 급성 간염, 만성 간염, 간 염증, 간경화, 간부전, 간세포 암종(HCC) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고 이로 제한되지 않는, HBV 감염에 의해 야기되거나 악화되는 질환 또는 병태의 예방, 및 감염된 환자로부터의 HBV의 보다 효율적인 청소를 허용하는 보다 효능 있는 치료 항체를 유도할 수 있다. 상기 조성물의 개선된 결합 특징은 예를 들어 사용되는 투여량을 감소시킬 수 있거나, 상응하는 단일 결합 단위 항체에 내성인 바이러스 또는 바이러스 감염 세포의 보다 효과적인 중화 및/또는 청소를 유도할 수 있다. "내성"은 HBV 중화, HBV 또는 HBV 감염 세포의 청소, 감염성, 복제, 방출 등의 제어에 대한 HBV 항체의 임의의 정도의 감소된 활성을 의미한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 HBV에 감염된 또는 HBV 감염에 감수성인 환자에게 이량체, 오량체, 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, 본원에서 제공되는 IgM 항체를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염에 의해 야기되거나 악화되는 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 본원의 다른 곳에서 설명되는 바와 같이, 제공된 결합 분자는 동등하거나 동일한 항원 결합 도메인(들)을 포함하는 참조 단일 결합 단위 항체, 예를 들어 서열 번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항원 결합 도메인과 동일한 HBV 에피토프, 예를 들어 HBV 표면 항원의 프리-S1 영역 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일특이적 단일 결합 단위 IgG 항체 또는 그의 단편에 비해 증가된 효능을 나타낼 수 있다. 특정 측면에서, 질환 또는 병태는 급성 간염, 만성 간염, 간 염증, 간경화, 간부전, 간세포 암종(HCC) 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 측면에서, 결합 분자, 예를 들어, 본원에서 제공되는 IgM 항체로 치료되는 환자는 증가된 바이러스 부하, 바이러스 배출, 복통, 어두운 소변, 발열, 관절통, 식욕 상실, 메스꺼움 및 구토, 쇠약 및 피로, 황달 또는 이들의 조합을 포함하고 이로 제한되지 않는 특정 질환 증상을 보일 수 있다. 특정 측면에서, 질환 증상은 동등한 단일 결합 단위 항체에 의한 것보다 본원에서 제공되는 결합 분자에 의해 더 큰 정도로 완화되거나 감소될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 HBV 또는 HBV 감염 세포를 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어 본원에서 설명되는 IgM 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, HBV의 개선된 중화를 유도하는 방법을 제공하고, 여기서 결합 분자는 당량의 참조 단일 결합 단위 결합 분자, 예를 들어, 서열 번호 62의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항원 결합 도메인과 동일한 HBV 에피토프, 예를 들어 HBV 표면 항원의 프리-S1 영역 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일특이적 단일 결합 단위 IgG 항체 또는 그의 단편보다 더 높은 효능으로 바이러스 중화를 유도할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 VH 아미노산 서열, 및 서열 번호 3과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 항원 결합 도메인은 서열 번호 5 또는 서열 번호 62와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 VH 아미노산 서열, 및 서열 번호 6과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어 본원에서 제공되는 IgM 항체는 당량의 단일특이적 단일 결합 단위 HBV 모노클로날 항체, 예를 들어 표 2에 제시된 VH 및 VL 서열과 동일한 VH 및 VL 영역이거나 이들 영역을 포함하는 상응하는 IgG 항체 또는 그의 단편보다 더 높은 효능으로 2개 이상의 HBV 아형의 바이러스 중화를 유도할 수 있다. 특정 측면에서, 육량체 또는 오량체 결합 분자, 예를 들어, IgM 항체 또는 그의 단편은 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 측면에서, 육량체 또는 오량체 결합 분자, 예를 들어, IgM 항체 또는 그의 단편은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
예를 들어, 방법은 감염성 HBV 바이러스 입자 또는 다른 감염성 바이러스 입자에 대한 그의 친화도 및/또는 결합활성이 결정되지 않은 다양한 결합 분자의 스크리닝을 포함한다. 본원에서 제공되는 방법은 HBV 서브바이러스 입자에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 더 큰 결합활성, 또는 이들의 조합으로, 감염성 B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 입자의 표면에, HBV 감염 세포의 표면에, 또는 이들의 조합에 결합하는 결합 분자를 확인하는데 사용될 수 있다. 항-HBV의 IgA 또는 IgM 형태의 증가된 결합활성은 매우 낮은 밀도의 HBV 표면 단백질로 감염된 세포에 결합하여 감염된 환자로부터 HBV를 보다 효율적으로 청소할 수 있게 하는 보다 효능 있는 치료 항체를 생성할 수 있다. 유사하게, 본원에서 제공되는 방법은 동일한 바이러스의 비감염성 버전에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 더 큰 결합활성, 또는 이들의 조합으로 다른 감염성 바이러스 입자 또는 바이러스 감염 세포의 표면에 결합하는 결합 분자를 확인하는데 사용될 수 있다. 따라서, 앞서 논의된 유리한 특성을 갖는 본원에서 제공되는 결합 분자는 감염성 HBV 또는 다른 바이러스 입자에 결합시키는 방법에 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 다량체 결합 분자의 유리한 특성으로 인해, 서브바이러스(비감염성) HBV 바이러스 입자 또는 다른 비감염성 바이러스 입자에 대한 결합보다 더 높은 결합활성 또는 친화도, 또는 이들의 조합으로 감염성 HBV 입자 또는 다른 비감염성 바이러스 입자에 결합하는 결합 분자를 확인할 수 있다. 따라서, 감염성 및 비감염성 바이러스 입자에 대한 결합을 검출하고 결합 친화도 및/또는 결합활성을 비교하여 유리한 성질을 갖는 추가의 결합 분자를 확인함으로써 상기 특성을 갖는 상기 결합 분자를 확인할 수 있는 방법이 개시된다. 서브바이러스(비감염성) 바이러스 입자에 대한 결합보다 더 높은 결합활성 또는 친화도, 또는 이들의 조합으로 감염성 입자에 결합하는 결합 분자를 이 방법에 의해 선택할 수 있다.
상기 방법은 일반적으로 시험 결합 분자를 감염성 바이러스 입자와 접촉시키고 감염성 바이러스 입자에 대한 결합을 위한 시험 결합 분자의 친화도 및/또는 결합활성을 측정함으로써 수행될 수 있다. 동일한 시험 결합 분자는 또한 비감염성 HBV 서브바이러스 입자 또는 다른 비감염성 바이러스 입자와 접촉되고, HBV 서브바이러스 입자 또는 다른 비감염성 입자에 대한 결합을 위한 시험 결합 분자의 친화도 및/또는 결합활성이 검출될 수 있다. 이들 2가지 시험의 결과를 비교함으로써, 감염성 HBV 입자 또는 다른 감염성 바이러스 입자에 대한 결합을 위해 측정된 친화도 및/또는 결합활성이 비감염성 HBV 서브바이러스 입자 또는 다른 비감염성 입자에 대한 결합을 위한 친화도보다 및/또는 더 높은 시험 화합물(결합 분자)을 확인한다.
이러한 방식으로, 본원에서 제공되는 방법에 유용한 추가의 결합 분자가 확인되고 이용될 수 있다.
유사하게, HBV 감염 세포 또는 다른 바이러스 감염 세포에 대한 그의 친화도 및/또는 결합활성이 결정되지 않은 다양한 시험 화합물(결합 분자)에 대한 방법이 개시된다. 본원에서 제공되는 방법은 바이러스에 감염되지 않은 동일한 세포에 대한 결합 또는 비감염성 바이러스 입자에 대한 결합보다 더 큰 친화도, 더 큰 결합활성 또는 이들의 조합으로 HBV 감염 세포 또는 다른 바이러스 감염 세포의 표면에 결합하는 결합 분자를 확인하는데 사용될 수 있다. 따라서, 상기 논의된 유리한 특성을 갖는 결합 분자는 HBV 감염 세포 또는 다른 바이러스 감염 세포에 대한 우선적인 결합을 위한 방법에 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 다량체 결합 분자의 유리한 특성 때문에, 결합 분자는 유사한 비감염 세포 또는 비감염성 바이러스 입자에 결합하는 것보다 더 높은 결합활성 및/또는 친화도로 HBV 감염 세포 또는 다른 바이러스 감염 세포에 결합할 수 있다. 따라서, 바이러스 감염 및 비감염 세포뿐만 아니라 비감염성 바이러스 입자에 대한 결합의 차이를 확인하기 위해 결합 친화도 및/또는 결합활성을 비교하는 방법이 개시된다. HBV 또는 다른 바이러스에 감염되지 않은 유사한 세포 또는 비감염성 바이러스 입자에 결합하는 것보다 더 높은 결합활성 및/또는 친화도로 HBV 감염 세포 또는 다른 바이러스 감염 세포에 결합하는 결합 분자는 이 방법에 의해 선택될 수 있다.
이 스크리닝 방법은 시험 결합 분자를 HBV 감염 세포(또는 다른 바이러스 감염 세포)와 접촉시키고, HBV 또는 다른 바이러스 감염 세포에 결합하기 위한 시험 결합 분자의 친화도 및/또는 결합활성을 측정하고, 동일한 시험용 결합 분자를 HBV 또는 다른 바이러스에 감염되지 않은 세포 또는 비감염성 바이러스 입자에 접촉시키고, HBV 또는 다른 바이러스에 감염되지 않은 세포 또는 비감염성 바이러스 입자에 결합하기 위한 시험 결합 분자의 친화도 및/또는 결합활성을 측정함으로써 수행될 수 있고, 여기서 감염되지 않은 세포는 감염되지 않은 것을 제외하고는 HBV 감염 세포와 동일하다. 이어서, 상기 시험 화합물 또는 임의의 수의 시험 화합물에 대한 결합 결과를 비교하여, 친화도 및/또는 결합활성이 감염되지 않은 세포 또는 비감염성 바이러스 입자보다 감염된 세포에 대해 더 높은 시험 화합물을 확인할 수 있다.
상기 방법에서의 세포는 HBV 또는 다른 바이러스, 예컨대 인간 세포에 의해 감염될 수 있는 임의의 세포일 수 있다.
특정 측면에서, 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자의 HBV 항원 결합 도메인, 예를 들어 IgM 항체는 6개의 면역글로불린 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 여기서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 CDR은 표 2에 제시된 HBV 항체 중 임의의 하나의 상응하는 CDR, 예를 들어 B형 간염 에피토프 HBsAg, 예를 들어, 프리-S1 영역에 대한 친화도를 갖는 것에 관련된다.
본원에서 제공되는 방법에서 사용하기 위한 이량체, 육량체 또는 오량체 결합 분자는 2개 이상의 HBV 아형, 예를 들어 A, B, C, D, E, F, G 및/또는 H에 특이적으로 결합할 수 있는, 본원에서 규정되는 2, 5 또는 6개의 "결합 단위"를 갖는 결합 분자이다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 방법에서 사용하기 위한 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자는 각각 2개, 5개 또는 6개의 2가 결합 단위를 포함하고, 여기서 각각의 결합 단위는 2개의 IgA 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편(IgA 기반 결합 분자에 대해) 또는 2개의 IgM 중쇄 불변 영역 또는 그의 단편(IgM 기반 분자에 대해)을 포함한다. 특정 측면에서, 2개의 IgA 또는 IgM 중쇄 불변 영역은 인간 중쇄 불변 영역이다.
본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위한 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자는 다른 결합 분자와 비교하여 유리한 구조적 또는 기능적 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법에서 사용하기 위한 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 상기 설명된 생물학적 검정에서 상기에서 또한 설명된 상응하는 참조 단일 결합 단위, 예를 들어, IgG 또는 그의 변이체, 유사체 또는 유도체보다 개선된 결합 특징을 가질 수 있다. 생물학적 검정은 시험관내 중화 검정, 혈구응집 억제 검정, 세포 부착 검정, 바이러스 방출 검정, 면역조직화학 검정, 직접 세포독성 검정, 보체 매개 세포독성 검정 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 생체내 효능 검정은 내인성 간 기능이 저하되고 인간 간세포로 재구성된 면역 손상된 뮤린 모델을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 대안으로, 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자는 HBV 청소를 평가하기 위해 HBV 감염의 비인간 영장류 모델을 사용하여 생체 내에서 시험될 수 있다(하기 실시예 7 참조).
제약 조성물 및 투여 방법
본원에서 제공되는 다량체, 예를 들어, 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, IgM 항체를 제조하고 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있거나 본 개시내용에 비추어 쉽게 결정될 수 있다. 다량체 결합 분자의 투여 경로는 예를 들어, 경구, 비경구, 흡입 또는 국소 투여일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 비경구는 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질내 투여를 포함한다. 이러한 투여 형태가 적합한 형태로 고려되지만, 투여 형태의 또 다른 예는 주사, 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 점적주입을 위한 용액일 것이다. 적합한 제약 조성물은 완충제(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 및 일부 실시양태에서 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자는 B 세포를 고갈시키는 것이 바람직한 질환 또는 장애의 생체내 치료를 위한 제약상 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 개시된 다량체 결합 분자는 활성 작용제의 투여를 용이하게 하고 안정성을 촉진하도록 제제화될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 비독성 멸균 담체, 예컨대 생리학적 염수, 비독성 완충제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자의 제약상 유효량은 표적에 효과적인 결합을 달성하고 치료 효과를 달성하기에 충분한 양을 의미한다. 적합한 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)]에 기재되어 있다.
본원에서 제공되는 특정 제약 조성물은 예를 들어 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하는 허용되는 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 특정 제약 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 벤질 알콜 또는 다른 적절한 보존제, 생체이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제 및/또는 다른 통상적인 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수 내 용액으로 제조될 수 있다.
단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자의 양은 예를 들어 치료되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 다양할 것이다. 상기 조성물은 단일 투여, 다중 투여로서 또는 확립된 시간에 걸친 주입으로 투여될 수 있다. 투여 요법은 또한 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 또는 예방 반응)을 제공하도록 조정할 수 있다.
본 개시내용의 범위와 일치하게, 본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자는 치료 효과를 생성하기에 충분한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에서 제공되는 다량체 결합 분자는 공지된 기술에 따라 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 통상적인 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 제조된 통상적인 투여 형태로 대상체에게 투여될 수 있다. 제약상 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특성은 조합될 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 잘 알려진 변수에 의해 결정될 수 있다.
"치료 유효 용량(투여량) 또는 양" 또는 "유효량"은 투여될 때, 치료되는 질환 또는 병태가 존재하는 환자의 치료에 관해 긍정적인 치료 반응을 유발하는 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자의 양을 의미한다.
B형 간염 바이러스에 의한 감염에 의해 야기되거나 악화되는 질환 또는 병태의 치료를 위한, 본원에 개시된 조성물의 치료 유효량은 투여 방법, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부를 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 달라질 수 있다. 특정 측면에서, 대상체 또는 환자는 인간이지만, 트랜스제닉 포유동물을 비롯한 비인간 포유동물도 치료될 수 있다. 치료 용량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 일상적인 방법을 사용하여 적정될 수 있다.
투여될 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자, 예를 들어, IgM 항체의 양은 본 개시내용을 고려하여 과도한 실험을 수행하지 않으면서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다. 투여 방식 및 다량체 결합 분자의 각각의 양에 영향을 미치는 인자는 질환의 중증도, 질환의 병력, 및 치료되는 개체의 연령, 신장, 체중, 건강 및 신체 상태를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 유사하게, 투여될 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자의 양은 투여 방식 및 대상체에게 상기 작용제의 단일 투여 또는 다중 투여를 시행하는지의 여부에 따라 결정될 것이다.
본 개시내용은 또한 B형 간염 바이러스 감염에 의해 야기되거나 악화되는 질환 또는 병태를 치료, 예방 또는 관리하기 위한 의약의 제조에서 이량체, 오량체 또는 육량체 HBV 결합 분자의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 달리 지시되지 않는 한, 관련 기술의 범위 내에 해당하는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명되어 있다(예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; [Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)]; [D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II]; [Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis]; 미국 특허 제4,683,195호(Mullis et al.); [Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization]; [Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation]; [Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)]; [Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)]; [Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; [Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)]; [Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155]; [Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)]; [Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV]; [Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)]; 및 [Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)] 참조).
항체공학의 일반적인 원리는 문헌 [Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)]에 제시되어 있다. 단백질공학의 일반적인 원리는 문헌 [Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)]에 제시되어 있다. 항체 및 항체-합텐 결합의 일반적인 원리는 문헌 [Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.)]; 및 [Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)]에 제시되어 있다. 추가로, 관련 기술 분야에 공지되어 있고 구체적으로 기술되지 않은 면역학의 표준 방법은 문헌 [Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York]; [Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.)] 및 [Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
면역학의 일반적인 원리를 제시하는 표준 참고 문헌은 다음을 포함한다: [Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY)]; [Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY)]; [Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevier, Amsterdam)]; [Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunology (4th ed.; W.H. Freeman & Co.)]; [Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby)]; [Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division)]; [Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlag)]; [Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)]; [Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall, 2003)]; [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)]; [Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)].
상기 인용된 모든 참고 문헌 및 본원에서 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
하기 실시예는 제한적인 것이 아니라 예시로서 제공된다.
실시예
실시예 1: 표면 항원 제조
표면 항원은 이전에 보고된 바와 같이 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Short et al., J. Mol . Biol . (2009) 390, 135-141] 참조). 한 방법에서, HBsAg는 HBV 보균자의 혈액으로부터 단리된다. HBV를 함유하는 냉동 혈청은 내셔널 블러드 써비스(National Blood Service)의 다이어그노스틱스, 리벨럽먼트 앤드 리써치 디비젼(Diagnostics, Development and Research Division)(영국 런던 콜린데일 센터 소재)로부터 얻을 수 있다. 이어서, 개별 팩을 해동하고, 원심분리(20분 동안 3700 x g)하고, 상청액을 TBS(5.1 ml 튜브 내의) 내의 20% 수크로스 0.5 ml 상에 적층하고, 원심분리(30분 동안 266,000 x g)한다. 펠렛을 20 mM Tris 클로라이드(pH 7.4) 및 140 mM NaCl(Tris-완충 염수, TBS)에 재현탁하고(4℃에서 밤새 습윤 상태로 두어 부드럽게 만든 후), 한데 모으고, CsCl(0.22 g/ml 초기 농도)을 사용한 평형 원심분리(72시간 동안 266,000 x g)에 적용한다. 분획(250 ㎕)를 구배로부터 채취하고, 전자 현미경 및 DNA 추출 및 B형 간염 DNA 분석에 의해 모니터링한다. B형 간염 DNA(및 따라서 바이러스)가없는 가장 적합한 HBsAg 입자를 함유하는 분획을 채취하고, 사용하기 위해 TBS에 대해 투석한다. 다른 HBV 단백질의 형태와 마찬가지로, 표면 항원 HBsAg의 여러 형태(긴 형태, 프리S1-프리S2-S; 중간 형태, 프리S2-S; 짧은 형태, S)가 상업적 공급원으로부터 입수하였다.
실시예 2: HBV 캡시드 및 비리온 단리
캡시드 및 비리온 단리 방법은 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있으며, 임의의 수의 공지된 수단에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Dryden, Molecular Cell, 22:843-850, June 23, 2006, suppl.] 참조). 한 캡시드 단리 방법에서, 신선하게 절제된 전체 간에 염수를 관류시킨다. 이어서, 간을 용해 완충제(예를 들어, 0.25 M 수크로스, 1 mM MgCl2, 5 mM Tris(pH 7.4))에서 균질화하고, 완전한 프로테아제 억제제(Roche Applied Science, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)를 보충한다. 각각의 균질물의 상청액은 SW40 로터에서 4℃ 및 11,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 얻는다. HBV 특이적 서던 블롯 분석을 수행하기 위해 상청액의 분취액을 제거한다. 나머지는 30% 수크로스 쿠션(인산염 완충 염수(PBS) 내의 0.73M 수크로스) 위에 적층하고, 바이러스 입자는 SW40 로터에서 4℃ 및 40,000 rpm에서 5시간 동안 원심분리하여 펠렛화한다. 이어서, 펠렛을 1 ml의 CsCl 용액 [10 ml PBS 용액(1x PBS, 20 mM EDTA 및 1x 완전한 프로테아제 억제제 칵테일)에 용해된 3.3 g CsCl]에 재현탁한다. 이어서, 재현탁된 물질은 빠른 밀봉 튜브(Beckman Instruments, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재) 내로 옮긴다. 튜브에 CsCl 용액을 채우고, 밀봉하고, TI80 로터에서 11℃ 및 60,000 rpm에서 18시간 동안 원심분리하여 HBV 입자를 구분한다.
튜브 바닥을 천공하고, 분획을 수집한다. 캡시드를 함유하는 분획을 모으고, PBS로 희석한 후, 농축한다. 여액을 합하고, 추가로 30분 동안 펠렛화한다. 이어서, 샘플을 나누어 미리 형성된 CsCl 구배(ρ 1.2-1.4)에 로딩한다. 4℃, 38,000 rpm에서 3시간 동안 원심분리한 후, 분획(각각 200 ㎕)을 피펫으로 수집하고, 이들의 굴절률을 측정하고, 동등한 분획을 모은다.
CsCl을 제거하고 모은 분획을 농축하기 위해, 샘플을 펠렛화하고, PBS 내에 3회, 예를 들어 TLA100.4 로터를 사용하여 2회, 최종적으로 예를 들어 TLA100.2 로터를 사용하여 1회 (각각 1시간 동안 45,000 rpm 및 4℃에서) 재현탁한다.
한 비리온 단리 방법에서, 하나 이상의 HBV 양성 개체로부터 수득된 다수의 혈장분리(plasmapheresis) 단위를 모으고, 무균 무명천을 통해 여과하고, 비리온을 문헌 [Kaplan 1973; J. Virol . 12,995-1005]에 기재된 바와 같이 정제한다. 간단히 설명하면, 폴리카르보네이트 튜브에 65 ml의 혈장 풀을 로딩하고, SW30 로터에서 5℃에서 21,000 rpm에서 3시간 동안 원심분리를 실시한다. 상청액을 따라내고, 튜브에 65 ml의 혈장 풀을 다시 로딩하고, 원심분리를 반복한다. 각각 130 ml의 출발 물질로부터 나온 2개의 펠렛을 ~7 ml의 PBS에 각각 재현탁하고, 30,000 rpm 및 5℃에서 PBS 내의 20%(w/w) 수크로스의 7 ml 쿠션을 통해 SW30 로터에서 4시간 동안 원심분리한다. 펠렛을 본래의 출발 물질과 비교하여 50X의 최종 농도로 PBS에 재현탁하고, 50 ㎕ 분취액으로 나누고, -80℃에서 동결시켰다.
대안으로, HBV 비리온은 문헌 [Kim, FEBS Letters 2015; 589,193-200]에 의해 약술된 방법에 따라 제조될 수 있다. 간단히 말하자면, 바이러스 입자는 HepG2 세포(ATCC HB-8065)를 전장 HBV 게놈을 포함하는 벡터(예를 들어, pHBVEcoR1-; [Gripon 1995; Virol. 213(2),292-299])로 일시적으로 형질감염시킴으로써 생산된다. 이어서, 바이러스 입자를 PEG 침전(Le Seyed 1999; J. Virol . 73(3), 2052-2057)에 의해 50배 농축한다. HBV 바이러스의 유전자형은 사용된 벡터에 따라 결정될 것이다.
실시예 3: HBV에 특이적인 조작된 IgM 결합 분자
본원에서 제공되는 다양한 HBV 항체의 VH 및 VL 영역은 표준 방법 또는 상업적 계약자에 의해 IgG 및 IgM 배경으로 클로닝될 수 있다.
HBV24: 각각 서열 번호 84 및 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG 및 IgM 중쇄, 및 서열 번호 59를 포함하는 카파 경쇄를 코딩하도록, 본원에서 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 나타낸, 미국 특허 제8,420,353호에 제시된 프리-S1 항원에 특이적인 인간화 항체의 VH 및 VL을 적절한 벡터에 클로닝하였다. 서열 번호 58 및 58은 상기 기재되어 있다. 벡터는 (적절한 경우, 아래에서 설명되는 바와 같이 인간 야생형 또는 변형된 J-쇄를 코딩하는 벡터와 함께) HEK293 세포를 형질감염시키고 발현시켜, IgG 분자 HBV24G 및 IgM 분자 HBV24M을 생성시켰다.
서열 번호 84 HBV24G 중쇄
HBV23: 각각 서열 번호 85 및 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG 및 IgM 중쇄, 및 서열 번호 81을 포함하는 람다 경쇄를 코딩하도록, 본원에서 서열 번호 73 및 서열 번호 74로 나타낸, 문헌 [Cerino, et al., (2015) PLOS one 10(4):e0125704. doi: 10.1371]에 제시된 S 영역에 특이적인 인간 항체의 VH 및 VL을 적절한 벡터에 클로닝하였다. 벡터는 (적절한 경우, 아래에서 설명되는 바와 같이 인간 야생형 또는 변형된 J-쇄를 코딩하는 벡터와 함께) HEK293 세포를 형질감염시키고 발현시켜, IgG 분자 HBV23G 및 IgM 분자 HBV23M을 생성시켰다.
서열 번호 85 HBV23G 중쇄
서열 번호 80 HBV23M 중쇄
서열 번호 81 HBV23M 경쇄
HBV19: 각각 서열 번호 86 및 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG 및 IgM 중쇄, 및 서열 번호 83을 포함하는 카파 경쇄를 코딩하도록, 본원에서 서열 번호 75 및 서열 번호 76으로 나타낸, 문헌 [Pizarro, et al., FEBS Letters 509:463-468 (2001)]에 제시된 HBsAg 혈청형 ay의 프리S1 영역에 특이적인 인간 항체의 VH 및 VL을 적절한 벡터에 클로닝하였다. 벡터는 (적절한 경우, 아래에서 설명되는 바와 같이 인간 야생형 또는 변형된 J-쇄를 코딩하는 벡터와 함께) HEK293 세포를 형질감염시키고 발현시켜, IgG 분자 HBV19G 및 IgM 분자 HBV19M을 생성시켰다.
서열 번호 86 HBV19G 중쇄
서열 번호 82 HBV19M 중쇄
서열 번호 83 HBV19M 경쇄
항-CD3 항체 비실리주맙(Nuvion)의 가변 영역을 포함하는 별개의 융합 부위를 갖는 2개의 상이한 J-쇄 변이체를 구축하였다. 2개의 상이한 배향으로 15개의 아미노산을 함유하는, (GGGGS)3 링커(서열 번호 72, 밑줄로 표시됨)를 통해 J-쇄(이탤릭체)에 융합된 비실리주맙(V)(VH-(GGGGS)3-VL, 이중 밑줄로 표시됨)에 상응하는 scFv를 갖는 2개의 J-쇄에 대한 서열, 즉 VI5J 및 J15V가 아래에 제시된다. 각각의 서열은 밑줄이나 이탤릭체 없이 표시되는 N-말단 신호 펩티드를 함유한다. 특정 측면에서, 다른 신호 펩티드 서열이 여기에 나타낸 신호 펩티드를 대체할 수 있다.
서열 번호 67: V15J(DNA 서열: 서열 번호 66)에 대한 전구체 변형된 J-쇄 서열:
서열 번호 68: V15J에 대한 성숙한 변형된 J-쇄 서열:
서열 번호 66:
서열 번호 70: J15V(DNA 서열: 서열 번호 69)에 대한 전구체 변형된 J-쇄 서열:
서열 번호 71: J15V에 대한 성숙한 변형된 J-쇄 서열:
서열 번호 69:
성숙한 구축물은 각각 약 45 kD의 분자량을 갖고, CD3(Sino Biological) 또는 T 세포의 가용성 엡실론 쇄에 결합할 수 있다(데이터는 나타내지 않음).
다양한 항-HBsAg 중쇄 및 경쇄에 상응하는 DNA 구축물뿐만 아니라 야생형(wt) J-쇄, V15J 또는 J15V J-쇄 서열에 상응하는 구축물을 HEK293 세포 내로 동시 형질감염시키고, 표준 방법에 따라 단백질을 발현시키고 정제하였다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함된 PCT 공개 WO 2015/153912를 참조한다. HBV19, HBV23 및 HBV24 항체의 IgG 또는 IgM+J 버전으로 형질감염된 HEK293 세포는 표준 방법으로 정제할 수 있는 충분한 단백질을 생산하였다.
아가로스 -아크릴아미드 하이브리드 겔. IgM 구축물은 이전에 설명된 방법(US 2010/0172899 A1(Chugai Seiyaki Kabushiki Kaisha))으로부터 변형된 비환원성 SDS-PAGE로 분리하였다. 간단히 설명하면, 하이브리드 겔을 0.375 M 트리스 완충제(pH 8.8) 및 15% 글리세롤 중 각각 3.6% 및 0.5%의 최종 농도로 40% 아크릴아미드/비스 아크릴아미드(37.5:1)(Sigma-Aldrich) 및 울트라퓨어 아가로스(Ultrapure Agarose)(Invitrogen)와 혼합하였다. 생성된 혼합물을 50℃로 가열하고, 0.08% TEMED 및 0.08% 과황산암모늄을 첨가하여 중합을 개시하였다. 생성된 용액을 2개의 플레이트 사이에 붓고, 아크릴아미드를 37℃에서 1시간 동안 중합시킨 다음, 실온에서 30분 동안 방치하여 완전히 중합시켰다. 단백질 샘플을 생성된 하이브리드 겔에 로딩하고, 겔을 트리스-아세테이트 SDS 러닝 완충제(Novex)에서 800 Vh 동안 이동시켰다. 이어서, 겔을 40% 메탄올, 10% 아세트산에서 10분간 고정하고, 콜로이드 블루 염색 키트(Colloidal Blue Staining Kit)(Novex)를 사용하여 적어도 3시간 동안 염색한 후, 물에서 탈색시켰다.
비환원성 SDS-천연-PAGE. 단백질 샘플을 NativePAGE 3-12% Bis-Tris 겔(Novex)에 로딩하였다. 트리스-아세테이트 SDS 러닝 완충제(Novex)를 첨가하고, 겔을 40V에서 15분 동안, 이어서 90V에서 2시간 동안 이동시켰다. 이어서, 겔을 40% 메탄올, 10% 아세트산에서 10분간 고정하고, 콜로이드 블루 염색 키트(Novex)를 사용하여 적어도 3시간 동안 염색한 후, 물에서 탈색시켰다.
비환원성 SDS 천연-PAGE에 의해 측정된 HBV24의 발현 및 조립은 도 2a에 도시되어 있다. HBV23의 발현 및 조립은 도 2b에 도시되어 있다. HBV19의 발현 및 조립은 도 2c에 도시되어 있다. 각각의 IgG의 중쇄 및 경쇄는 잘 발현되어 IgG 항체(HBV24, 도시되지 않음, HBV23, 도 2b, 레인 2, HBV19, 도 2c, 레인 2)로 조립된다.
HBV24M의 중쇄 및 경쇄는 잘 발현되었지만, 인간 J 쇄와 동시 발현될 때에는 IgM 오량체로 적절히 조립되지 않았다(도 2a, "Hu/Hu"). 다른 한편으로, 서열 번호 59를 포함하는 경쇄는 뮤린 IgM 중쇄 불변 영역을 갖는 키메라 HBV24와 조합될 때 적절히 조립되었다(도 2a, "Ch/Hu").
서열 번호 5와 관련된 IgM 중쇄 가변 영역은 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 생성하는 특정 아미노산의 부위 지정 돌연변이 유발을 통해 구축되었다. 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 IgM 중쇄를 코딩하기 위해 서열 번호 62를 상기 설명된 방법에 따라 적절한 벡터 내에 클로닝하였다. 상기 벡터는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄를 포함하는 벡터 및 인간 J-쇄(서열 번호 54)를 코딩하는 벡터 또는 변형된 J-쇄 V15J(서열 번호 68)를 포함하는 벡터와 함께 HEK293 세포를 형질감염시키고 발현시켜, IgM 분자 HBV24M2J 및 HBV24M2V15J를 생성 하였다. 두 발현 산물은 모두 오량체 IgM 분자로 적절하게 조립되었다. 이중특이적 결합 분자 HBV24M2V15J를 도 2a에 도시한다("M2/Hu").
실시예 4: 결합 검정
HBV24M2V15J 및 HBV23MJ를 ELISA 검정에 의해 전장 HBsAg-L(프리S1, 프리S2 및 S)에 대한 결합에 대해 평가하였다. HBV24M2V15J의 경우, 결합은 미국 특허 제8,420,353호에 제공된 프리-S1 항원에 특이적인 인간화 IgG 항체와 비교되었고, HBV23MJ의 경우, 결합은 Cerino 등이 제공한 인간 IgG 항체와 비교되었다(Cerino et al. (2015) PLOS one 10(4):e0125704. doi: 10.1371).
검정은 다음과 같은 방법에 의해 수행되었다. HBV24에 대해, 96웰 폴리스티렌 MaxiSorp ELISA 플레이트(Nunc)를 4℃에서 밤새 100 ㎕ 코팅 완충제(100 mM 중탄산염, pH 9.5) 내의 1 ㎍/mL HBsAg-L 항원(Beacle, BCL-AG-001)으로 코팅하였다. HBV23의 경우, 플레이트를 HBsAg(Prospec HBS-872)로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 0.05% PBS-Tween으로 세척하고, 2% BSA-PBS로 차단하였다. 차단 후, 100 ㎕의 연속 희석된 샘플(정제된 단백질 또는 세포 배양 상청액)을 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고, HBV24 항체에 대해 HRP 접합된 마우스 항-인간 카파 항체(Southern Biotech, 9230-05. 2% BSA-PBS 내에 1:6000으로 희석)와 함께 및 HBV23 항체에 대해 HRP 접합된 마우스 항-인간 람다(Southern Biotech, Cat 9180-05. 2% BSA-PBS 내에 1:6000으로 희석)와 함께 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 0.05% PBS-Tween을 사용하여 최종적으로 5회 세척한 후, 100 ㎕의 TMB 기질(BD Biosciences, 555214)을 각각의 웰에 첨가하고, 어두운 곳에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 웰당 50 ㎕의 2N HCl을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어서, A450 데이터를 수집하고, 4 파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)으로 분석하였다.
HBV24에 대한 결과는 몰 농도에 의해 IgM 대 IgG를 비교한 도 3a에 제시한다. HBV24M2V15J는 IgG 상청액에 대한 57 pM 및 정제된 IgG에 대한 61 pM에 비해 26 pM의 EC50을 나타내어, IgG 대응물(HBV24G)보다 더 효과적인 결합을 나타냈다.
HBV23에 대한 결과는 중량 농도에 의해 IgM 대 IgG를 비교한 도 3b에 제시한다. HBV23MJ는 IgG에 대한 30 ng/ml에 비해 64 ng/ml의 EC50을 나타내어, IgG 대응물(HBV23G)보다 더 효과적인 결합을 나타냈다. 또한, 최대 A450으로 측정된 HBV23 MJ 결합 용량은 HBV23G보다 훨씬 더 높았다.
HBV24M2V15J, HBV24G, HBV23MJ, 및 HBV23G는 다음과 같은 방법에 의해 세포 표면 상에 HBsAg를 발현하는 간세포 암종 세포주인 PLC 세포에 대한 결합에 대해 추가로 평가하였다.
알렉산더(Alexander) 간암 세포(PLC/PRF/5; ATCC CRL-8024)를 10% HI FBS(Gibco, cat#10082-147)를 함유하는 DMEM(Gibco, cat#11965-084)에서 배양하고, 염색 하루 전에 신선한 배지로 보충하였다. 염색일에, 세포 해리 완충제(Gibco, cat#131510-14)을 사용하여 세포를 제거하였다. 모든 배지를 흡인한 후, 세포를 칼슘 또는 마그네슘이 없는 10 ml의 PBS로 헹구었다. PBS를 흡인한 후, 세포를 37℃에서 20-30분 동안 세포 10 ml의 해리 완충제와 함께 인큐베이팅하였다. 이어서, 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 플라스크를 가볍게 두드려 세포를 제거하였다. 동일한 양의 배지를 첨가하여 세포 해리 완충제를 중화시키고, 세포 계수기(BioRad TC20)에서 트리판 블루(Trypan Blue) 배제를 사용하여 살아있는 세포수를 결정하였다. 세포 밀도를 60 ㎕의 FACS 2% FBS 완충제(BD Pharmingen, cat# 554656)당 1.5 x 10e4 세포로 조정하고, 60 ㎕를 "v" 바닥 96웰 플레이트에 첨가하였다. 모든 항체는 30 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 3 ㎍/mL 및 1 ㎍/mL의 최종 농도에서 시험하고, 50 ㎕의 각각의 항체를 각각의 웰에 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 150 ㎕의 FACS 2% FBS 완충제로 세포를 세척한 후, 플레이트를 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리(Sorvall Legend XIR 원심분리기)하고, 상청액을 세포 펠렛을 교란하지 않으면서 부드럽게 흡인하였다. 항체 결합은 세포를 30분 동안 4℃에서 적절한 AlexaFluor-647 표지된 2차 항체, 항-인간 카파 경쇄(BioLegend, cat#316514) 또는 AF647 항-인간 람다 경쇄(BioLegend, cat#316614)와 함께 인큐베이팅함으로써 검출하였다. 세척 단계를 상기한 바와 같이 반복하고, 세포를 1:100 7_AAD(BD Pharm, cat#51-68981E)를 함유하는 60 ㎕의 FACS 2% FBS에 재현탁하였다. FACSCalibur™(Becton Dickinson)에서 각각의 샘플에 대해 1,000개의 이벤트를 수집하고, 플로우조 엘엘씨(FlowJo LLC)의 FlowJo에서 데이터 분석을 수행하였다. 각각의 연구에서, 항체 결합은 염색되지 않은 세포 및 적절한 인간 이소형 대조군 항체로 염색된 세포와 비교하였다.
HBV24G 및 HBV23G의 결합은 FACS 분석에 의해 검출될 수 없었다. 다른 한편으로, HBV23MJ 및 이중특이적 HBV24M2V15J는 검출가능한 결합을 나타냈다(도 4).
실시예 5: 감염성 비리온 및/또는 HBV에 감염된 세포에
우선적으로 결합하는 항체의 스크리닝
본 실시예에서, 라이브러리는 관심 바이러스, 또는 그 바이러스의 감염성 버전에 의해 감염된 세포에 더 큰 정도, 예를 들어 친화도, 결합활성 또는 다른 특징으로 결합하는 결합 분자에 대해 스크리닝된다. 예를 들어, 결합 분자 라이브러리, 예를 들어 항체 라이브러리(파지/하이브리도마/등), 예를 들어 바이러스 감염 포유동물, 예를 들어 HBV 감염 포유동물의 B 세포로부터 유래된 VH 및 VL 영역의 라이브러리가 생성된다. 이어서, 라이브러리는 감염된 세포에 결합하는 항체(비감염성 입자에도 결합하는지의 여부와 상관없이 모든 항체를 포함할 것임)를 풍부하게 하기 위해 고체 지지체, 예를 들어 96웰 플레이트 또는 비드 상의 바이러스 감염 세포, 예를 들어 HBV 감염 세포, 예를 들어 감세포 암종(HCC) 세포주 또는 감염성 바이러스 입자, 예를 들어 HBV 입자와 접촉된다. 감염된 세포에 결합하는 항체가 수거되어 증폭된다. 이어서, 회수된 항체를 비감염성 바이러스 입자, 예를 들어 HBV 서브바이러스 입자 및/또는 이전에 사용된 바이러스 감염 세포와 동일한 유형의 비감염 세포와 접촉되고, 여기서 비감염성 입자 및/또는 세포는 고체 지지체, 예컨대 플레이트, 비드, 컬럼 등에 부착된다. 비감염성 바이러스 입자 또는 비감염 세포에 결합하지 않는 항체가 회수되고 증폭된다. 이 단계를 1회 이상 반복하여 바이러스에 감염된 세포 또는 감염성 바이러스 입자에 우선적으로 결합하는 항체를 풍부하게 한다. 풍부화된/선택적으로 고갈된 라이브러리는 다시 회수되고 증폭된다. 마지막으로, 관심 항체를 회수하고, 클론을 정제하고, 추가로 특성화한다.
실시예 6: 바이러스 중화 검정
시험관내 HBV 바이러스 중화 분석은 문헌 [Maeng et al., Virology 270:9-16, 2000]에 기재된 것과 같은 다양한 표준 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 간단히 설명하면, 인간 간세포(비암성 간 파편의 효소에 의한 해리에 의해 제조됨)를 2 ml의 정상 성장 배지를 함유하는 웰당 106 세포의 밀도로 접종하고, 3일 후에 HBV 입자(약 3 x 107 바이러스 게놈 당량)로 감염시켰다.
중화 검정을 위해, 바이러스 입자를 다양한 농도의 항체(및 적절한 대조군)와 함께 실온에서 1시간 동안 예비 인큐베이팅하고, 배양된 간세포에 접종한다. 간세포는 4% 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 함유하는 1 ml의 무혈청 배양 배지로 덮는다. 감염된 세포를 성장 배지로 세척하고, 배지를 2일마다 새로 교체하면서 17일 동안 추가로 인큐베이팅한다.
감염 후 제17일에, 배양 배지의 분취액을 제거하고, 10배 희석하고, HBV 항원(예를 들어, HBsAg)의 농도를 예를 들어 HBsAg에 대해 적절한 검정 키트, 예를 들어 방사면역 검정 키트(Abbott Laboratories, 미국 일리노이주 시카고 소재)를 사용하여 결정한다.
대안으로, HBV 바이러스 중화 연구는 문헌 [Kim, FEBS Letters 2015; 589,193-200]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 간단히 설명하면, HepaRG 세포(예를 들어, ThermoFisher HPRGC10)를 100 ㎕의 배양 배지를 포함하는 웰당 6 x 104 세포의 밀도로 접종하고, 6일 동안 배양한다. 이어서, 바이러스 입자(5 ㎕)를 다양한 농도의 5 ㎕의 항체와 함께 실온에서 30분 동안 예비 인큐베이팅한 후, 4% PEG 8000의 부재 또는 존재하에 24시간 동안 배양한 HepaRG 세포와 함께 배양하였다. 감염된 세포를 배지로 세척하고, 2일마다 배지를 교체하면서 10일 동안 추가로 인큐베이팅하였다. 감염 후 제10일에, 배양 상청액을 검정의 정량 범위에 유지되도록 희석하고, HBsAg 농도를 ELISA 키트(Bio-Rad)로 결정한다.
실시예 7: 생체 내 모델
본원에서 제공되는 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자는 비제한적으로 uPA/RAG-2 마우스(Dandri Hepatology 2001; 33(4): 981-988), 면역결핍 유로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제(uPA)/재조합 활성화 유전자-2(RAG-2) 마우스를 포함하는 마우스 모델에서 생체 내에서 시험될 수 있다. 마우스는 인간 간세포를 재이식하고, HBV에 감염시켜 결합 분자를 생체 내에서 효능에 대해 시험할 수 있다. 트리메라(trimera) 마우스 모델(llan Hepatology 1999; 29: 553-562)에는 SCID 마우스 골수 세포로 방사선 보호된 치사적으로 방사선 조사된 마우스가 포함된다. Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/- 모델([Grompe Nat Biotech 2007, 25 (8): 903-910], [Verma PNAS 2007; 104 (51):20507-20511])은 간에 인간 간세포를 재이식시키기 위한 조절가능한 시스템을 가지고 있는 면역결핍 푸마릴 아세토아세테이트 히드롤라제-결핍(fah(-/-)) 마우스를 수반한다. TK-NOG에 기반한 인간화된 마우스 모델(Kosaka Biochem Biophys Res Commun, 2013 Nov 8;441(1):230-5)은 간 제한 알부민 프로모터의 제어 하에 티미딘 키나제의 트랜스제닉 발현을 갖는 수퍼 면역결핍 NOG 마우스를 수반한다. MUP-uPA/SCID/Bg 모델(Tesfave PLoS ONE 2013; 8(10):e77298)은 SCID/베이지 배경에서 주요 요 단백질 프로모터에 의해 유도되는 uPA 유전자를 지닌 마우스를 수반한다. 이량체, 오량체 또는 육량체 결합 분자는 비인간 영장류에서 생체 내에서 시험될 수 있다. As/HSG-hu HSC/Hep 마우스 모델(Bility PLoS ONE 2014; 10(3):e1004032)은 인간 면역 세포와 간세포 둘 모두가 재이식된 마우스를 수반하고, 지속적인 HBV 감염을 지원한다.
실시예 8: HBV 항체의 보체 의존성 세포독성
IgM 표현형의 항체는 표적 세포에 대한 보체 의존성 세포독성(CDC) 활성에 영향을 주는 보체 단백질 C1q의 효과적인 결합을 사용하는데 특히 매우 적합하다. CDC를 측정하기 위해, HBsAg을 발현하는 간세포 암종 세포(예를 들어, 알렉산더 간암종 세포(PLC/PRF/5; ATCC CRL-8024)) 또는 HBsAg-L을 발현하는 재조합 세포가 사용된다. 표적 세포를 세척하고, CDC 검정 배지(RPMI 1640, 10% 열불활성화된 FBS)에 1.0 x 106 세포/ml의 밀도로 재현탁하고, 10 ㎕/웰을 Nunc 384웰 조직 배양 처리된 백색 폴리스티렌 플레이트에 첨가한다. 시험 항체의 연속 3배 희석액을 검정 배지로 제조하고, 10 ㎕/웰을 검정 플레이트에 첨가하고, 옵소닌화(opsonization)가 발생할 수 있도록 플레이트를 5% C02 인큐베이터에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이팅한다. 정상 인간 혈청 보충 물(Quidel)을 검정 배지에서 30%로 희석하고, 10 ㎕/웰을 검정 플레이트에 첨가한다. 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이팅한다. Cell Titer-Glo 시약(Promega)을 사용하기 위해 해동하고, 15 ㎕/웰을 검정 플레이트에 첨가한다. 플레이트를 플레이트 진탕기에서 2분 동안 부드럽게 혼합하여 세포를 용해시킨 후, EnVision 플레이트 판독기(Perkin-Elmer)에서 발광을 측정하기 전에 실온에서 10분간 더 혼합한다. 배경 신호를 뺀 후, 생존율(%)을 항체 농도에 대해 플로팅하고, 그래프패드 프리즘을 사용하여 EC50 값을 결정한다.
실시예 9: HBVXCD3 이중특이적 항체에 의한 T 세포 활성화
이중특이적 항-HBsAg/항-CD3 항체가 HBsAg 표적에 대한 결합시 T 세포를 활성화할 수 있는지 입증하기 위해, 하기 검정을 수행하였다. 조작된 Jurkat T 세포(Promega CS176403) 및 HBsAg을 발현하는 간세포 암종 세포(예를 들어, 알렉산더 간암종 세포(PLC/PRF/5; ATCC CRL-8024)) 또는 HBsAg-L을 발현하는 재조합 세포를 10% 태아 소 혈청(Invitrogen)이 보충된 RPMI(Invitrogen)에서 배양한다. 정제된 이중특이적 및 단일특이적 항-HBV 항체의 연속 희석액을 5% C02와 함께 37℃에서 2시간 동안 백색 384웰 검정 플레이트에서 20 ㎕의 HBsAg 발현 세포와 함께 인큐베이팅한다. 조작된 Jurkat 세포(25000)를 혼합물에 첨가하여 40 ㎕의 최종 부피로 만든다. 혼합물을 5% C02와 함께 37℃에서 5시간 동안 인큐베이팅한다. 이어서, 세포 혼합물을 루시페린(Promega, Cell Titer Glo)을 함유하는 용해 완충제(20 ㎕)과 혼합하여 루시페라제 리포터 활성을 측정한다. 광 출력은 EnVision 플레이트 판독기로 측정한다. EC50은 프리즘 소프트웨어를 사용하여 4 파라미터 곡선 피트(curve fit)에 의해 결정된다.
실시예 10: T 세포 유도 B-세포 사멸 - LDH 방출 검정
이중특이적 HBV x CD3 IgM 결합 분자가 CD8+ T 세포 급성 림프구성 백혈병(TALL) 세포의 존재 하에 표적 세포를 사멸시킬 수 있는지를 입증하기 위해, 동시 배양 실험을 수행할 수 있다. HBsAg 발현 세포(약 6 x 103 세포), 예를 들어 간세포 암종 세포, 예컨대 알렉산더 간암종 세포(PLC/PRF/5; ATCC CRL-8024) 또는 HBsAg-L을 발현하는 재조합 세포를, 384웰 흑색 조직 배양 플레이트에서 웰당 10% 열불활성화 FBS가 보충된 총 부피 45 ㎕의 RPMI 1640 배지 내에서 상이한 농도의 시험 화합물의 존재 하에 3 x 104 TALL 세포(ATCC CRL-11386)와 동시 배양한다. 5% C02 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이팅하고 24시간 후에, 15 ㎕의 CytoTox-ONE 기질 시약(Promega, G7891)을 각각의 웰에 첨가하여 죽은 세포에서 방출되는 LDH의 수준을 측정한다. 플레이트를 잠시 흔들어 시약을 혼합한 후, EnVision 플레이트 판독기(Perkin-Elmer)에서 형광 신호(여기에는 485 nm, 방출에는 615 nm)를 측정하기 전에 실온에서 90분 동안 인큐베이팅한다. 그래프패드 프리즘으로 데이터를 분석하여 EC50을 결정한다.
본 개시내용의 폭 및 범위는 상기 설명한 임의의 예시적인 실시양태에 의해서 제한되지 않아야 하고, 아래의 청구범위 및 그의 균등물에 따라 정의되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> IGM BIOSCIENCES, INC. <120> MULTI-VALENT HEPATITIS B VIRUS ANTIGEN BINDING MOLECULES AND USES THEREOF <130> 57912-152122 <140> PCT/US2016/024348 <141> 2016-03-25 <150> 62/137,881 <151> 2015-03-25 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Tyr Asp Glu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Ala Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ala 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Tyr Arg Val Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Asn Thr Pro Tyr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 9 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Thr Asp Gly Met Ser Thr Ser Tyr Ala Glu Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Gly Ser Gly Ser Leu Asn Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Ile Gly Asn Tyr 20 25 30 Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr 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115 120 125 Ser <210> 17 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Lys Tyr 20 25 30 Lys Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Thr Ser Arg Asp Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Gly Trp Leu Trp Gly Trp Asp Val Arg Ser Asn Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Asn Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 18 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly His Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Trp Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Pro Thr Trp Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Glu 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Lys Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser 85 90 95 Thr Gln Phe Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 30 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Gly Phe Val Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Trp His Asp Gly Ser Asn Arg Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Ile Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Ser Ser Val Gly Arg Asn 100 105 110 Tyr Asp Gly Met Asp Val Trp Gly Leu Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 33 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Ser Gly Asn Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly His Ser 35 40 45 Pro Gln 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Ile Thr Thr Asn 20 25 30 Asn Phe Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Asp Thr Asn Asn Arg Val Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Asn Asn 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 36 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Ile Thr Thr Asn 20 25 30 Asn Phe Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Asp Thr Asn Asn Arg Val Pro Gly Val Pro Ala 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Thr Lys Asn Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Ala Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Val Ser Tyr His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 39 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 39 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Arg Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Arg Tyr Asp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Pro Thr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95 Leu Tyr Leu Thr Met Asn Gly Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser 130 <210> 42 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 42 Met Asp Thr Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp 1 5 10 15 Val Pro Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Val Thr Gln Ser Pro Leu Ser 20 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly 1 5 10 15 Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Arg Leu Asp Pro Ser Ala Ser Ser Ala Ile Phe Ser 65 70 75 80 Pro Ser Leu Gln Gly His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Met Arg 85 90 95 Thr Ala Tyr Val Gln Trp Arg Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Val Arg Glu Lys Ser Met Val Gln Gly Val 115 120 125 Ile Ile Lys Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 130 135 140 Val Ser Ser 145 <210> 46 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 46 Gln Ser Gln Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 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593 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 82 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala 35 40 45 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser 50 55 60 Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Glu Val Ser Ser Asp Gly Ser 65 70 75 80 Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Thr Leu Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Met Thr Ser Leu Arg Ser 100 105 110 Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Phe Asn Trp Asp Val Ala 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ser Ala Ser 130 135 140 Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp 145 150 155 160 Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp 165 170 175 Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 83 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Thr Arg Thr Arg Lys Ser Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Met Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr 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Claims (89)

  1. 5개의 2가 결합 단위 및 J-쇄를 포함하는 오량체 결합 분자로서,
    각각의 결합 단위는, 감염성 바이러스 입자의 표면 상에서, B형 간염 바이러스(HBV) 감염된 세포의 표면 상에서, 또는 이들의 조합 상에서 발현되는 HBV 프리-S1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인과 각각 회합된 2개의 IgM 중쇄 불변 영역을 포함하고,
    각각의 항원 결합 도메인은 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH 및 VL은 각각 서열 번호 62 및 서열 번호 6의 VH 및 VL 아미노산 서열의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 영역 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 영역을 포함하며,
    결합 분자는 HBV 프리-S1 항원에 특이적으로 결합하는 동일한 항원 결합 도메인을 포함하는 참조 IgG 항체보다 HBV 증식을 억제하고/거나, HBV 청소(clearance)를 향상시키고/거나, HBV 감염성을 제어하고/거나, HBV 성장을 제어하는 데 더 효능이 있는 것인, 오량체 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, VH가 중쇄 불변 영역에 대하여 아미노 말단에 위치하고, 각각의 결합 단위가 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하고, VL이 면역글로불린 경쇄 불변 영역에 대하여 아미노 말단에 위치하고, IgM 중쇄 불변 영역은 각각 Cμ3 도메인 및 Cμ4-tp 도메인, 및 임의로 Cμ2 도메인 및 Cμ1 도메인을 포함하고, IgM 중쇄 불변 영역은 임의로 인간 IgM 불변 영역인, 결합 분자.
  3. 제1항에 있어서, J-쇄는 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 인간 J-쇄인, 결합 분자.
  4. 제1항에 있어서, J-쇄는 이종 폴리펩티드를 추가로 포함하는 변형된 J-쇄이고, 여기서 이종 폴리펩티드는 J-쇄에 직접 또는 간접적으로 융합되고, 이종 폴리펩티드는 임의로 항체 또는 scFv 단편을 포함하는 것인, 결합 분자.
  5. 제4항에 있어서, 이종 폴리펩티드가 J-쇄의 N-말단, J-쇄의 C-말단, 또는 J-쇄의 N-말단과 C-말단 둘 모두에 융합되는 것인 결합 분자.
  6. 제5항에 있어서, 이종 폴리펩티드가 CD3ε에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 결합 분자.
  7. 제1항에 있어서, VH 및 VL이 각각 서열 번호 62 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 분자.
  8. 제7항에 있어서, 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 결합 분자.
  9. J-쇄, 및 각각 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 5개의 결합 단위를 포함하는 단리된 IgM 항체로서, 각각의 중쇄는 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하고, 각각의 경쇄는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하고; 항체는 HBV 표면 항원의 프리-S1 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 오량체 IgM 항체로 조립될 수 있고, J-쇄는 서열 번호 68(V15J) 또는 서열 번호 71(J15V)의 아미노산 서열을 포함하도록 변형된 것인, 단리된 IgM 항체.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 결합 분자 또는 제9항의 IgM 항체의 폴리펩티드 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드로서, 여기서 폴리펩티드 서브유닛은 IgM 중쇄 불변 영역, 및 감염성 바이러스 입자의 표면 상에서, B형 간염 바이러스(HBV) 감염된 세포의 표면 상에서 또는 이들의 조합 상에서 발현되는 HBV 프리-S1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인의 적어도 항체 VH 부분을 포함하고/하거나, 폴리펩티드 서브유닛은 감염성 바이러스 입자의 표면 상에서, HBV 감염된 세포의 표면 상에서 또는 이들의 조합 상에서 발현되는 HBV 프리-S1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인의 항체 VL 부분을 포함하는 것인 제1 폴리뉴클레오티드;
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 결합 분자 또는 제9항의 IgM 항체의 항원 결합 도메인의 항체 VL 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드; 및
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 결합 분자 또는 제9항의 IgM 항체의 J-쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 결합 분자 또는 제9항의 IgM 항체를 포함하는,
    환자에서 HBV 감염에 의해 야기되거나 악화되는 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 제약 조성물로서, 상기 질환 또는 병태는 급성 간염, 만성 간염, 간 염증, 간경화, 간부전, 간세포 암종(HCC) 또는 이들의 임의의 조합이고;
    결합 분자는 HBV 프리-S1 항원에 특이적으로 결합하는 동일한 항원 결합 도메인을 포함하는 참조 단일 결합 단위 항체보다 HBV 증식을 억제하고/거나, HBV 청소(clearance)를 향상시키고/거나, HBV 감염성을 제어하고/거나, HBV 성장을 제어하는 데 더 효능이 있는 것인, 제약 조성물.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3041862T3 (da) 2013-09-05 2020-07-27 Igm Biosciences Inc Modificerede bispecifikke, penta- og hexavalente ig-m-antistoffer med konstant kæde
AU2015213593B2 (en) 2014-02-10 2020-09-03 Igm Biosciences, Inc. IgA multi-specific binding molecules
PL3126383T3 (pl) 2014-04-03 2019-08-30 Igm Biosciences, Inc. Zmodyfikowany łańcuch J
HUE051013T2 (hu) 2015-01-20 2021-01-28 Igm Biosciences Inc Tumor nekrózis faktor (TNF) szupercsalád receptor kötõ molekulák és ezek alkalmazása
EP3265575B1 (en) 2015-03-04 2021-04-21 IGM Biosciences, Inc. Cd20 binding molecules and uses thereof
KR102558839B1 (ko) 2015-03-25 2023-07-25 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 다가 b형 간염 바이러스 항원 결합 분자 및 그의 용도
EP3283112A4 (en) 2015-04-17 2018-12-05 IGM Biosciences A/S Multi-valent human immunodeficiency virus antigen binding molecules and uses thereof
CN108463245A (zh) 2015-09-30 2018-08-28 Igm生物科学有限公司 具有修饰的j链的结合分子
JP7058213B2 (ja) 2015-09-30 2022-04-21 アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 改変ｊ鎖を有する結合分子
CA3021669A1 (en) 2016-05-09 2017-11-16 Igm Biosciences, Inc. Anti-pd-l1 antibodies
SG11201908051RA (en) 2017-04-07 2019-09-27 Igm Biosciences Inc Modified human igm constant regions for modulation of complement-dependent cytolysis effector function
KR20200128391A (ko) 2018-03-01 2020-11-12 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 IgM 혈청 반감기에 영향을 미치는 IgM Fc 및 J-쇄 돌연변이
JP2022532388A (ja) * 2019-05-15 2022-07-14 カイマブ・リミテッド 改善されたラムダ抗体
MX2022013334A (es) 2020-04-22 2022-12-06 Igm Biosciences Inc Moleculas de union multimerica de agonistas de pd-1.
EP4188951A2 (en) * 2020-07-27 2023-06-07 IGM Biosciences, Inc. Multimeric coronavirus binding molecules and uses thereof
EP4357360A1 (en) * 2021-06-15 2024-04-24 ApitBio, Inc. Human antibody specifically binding to binding site of hepatocyte receptor of hepatitis b virus pres1 antigen, and use thereof
WO2023039243A2 (en) * 2021-09-13 2023-03-16 Achelois Biopharma, Inc. Hepatitis b virus antivirus (hbv-antivirus) compositions and methods of use
CN117624340B (zh) * 2024-01-23 2024-04-30 北京臻知医学科技有限责任公司 识别人乙型肝炎病毒（hbv）抗原的t细胞受体（tcr）及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1600856A (zh) * 2003-09-26 2005-03-30 陕西九州科技股份有限公司 分泌抗乙肝人单克隆抗体的异种杂交瘤细胞系的构建方法

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4433059A (en) * 1981-09-08 1984-02-21 Ortho Diagnostic Systems Inc. Double antibody conjugate
JPS6358260A (ja) * 1986-08-29 1988-03-14 Chemo Sero Therapeut Res Inst ＩｇＭ型抗体の測定法
US5061619A (en) * 1987-11-05 1991-10-29 Connaught Laboratories Limited Immunoassay using antibody-antigen conjugates
EP0507587A3 (en) 1991-04-03 1993-03-03 Syntex (U.S.A.) Inc. Immunoassay for immunoglubulins
GB9401987D0 (en) 1994-02-02 1994-03-30 Imperial College Modified nucleic acid
US6417324B1 (en) 2000-04-21 2002-07-09 Tripep Ab Synthetic peptides that bind to the hepatitis B virus core and e antigens
GB9608626D0 (en) * 1996-04-25 1996-07-03 Univ College Of London Hepatitis b monoclonal antibodies
US6063905A (en) 1997-01-07 2000-05-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant human IGA-J. chain dimer
KR100345463B1 (ko) 1998-11-19 2003-01-08 주)녹십자 B형간염바이러스의표면항원프리-s1에대한인간화항체및이의제조방법
AU2003210060B2 (en) * 2002-03-22 2010-02-25 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing same
US20050014932A1 (en) 2003-05-15 2005-01-20 Iogenetics, Llc Targeted biocides
JP5452835B2 (ja) 2003-07-15 2014-03-26 中外製薬株式会社 形質転換細胞によるＩｇＭの産生とその定量方法
KR20080007425A (ko) 2004-11-05 2008-01-21 팔링겐, 인코포레이티드 항체 유도된 세포막 손상
ATE529436T1 (de) * 2007-04-20 2011-11-15 Hoffmann La Roche Erkennung von primären infektionen mit krankheitserregern
WO2011045079A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Intercell Ag Hepatitis b virus specific human antibodies
CN102321720B (zh) * 2011-07-28 2014-09-03 万晓春 一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法
CA2849765C (en) * 2011-09-26 2021-10-19 Jn Biosciences Llc Hybrid constant regions
JP6335796B2 (ja) 2012-02-08 2018-06-06 アイジーエム バイオサイエンシズ インク．Ｉｇｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． Ｃｄｉｍ結合タンパク質及びその使用
JP2015524821A (ja) * 2012-08-02 2015-08-27 ジェイエヌ バイオサイエンシーズ エルエルシー システイン変異及びμ尾部を介して多量体化した抗体又は融合タンパク質
KR20150070181A (ko) 2012-09-27 2015-06-24 크루셀 홀란드 비.브이. B형 간염 바이러스에 결합하고 이를 중화시킬 수 있는 인간 결합 분자 및 그의 용도
DK3041862T3 (da) 2013-09-05 2020-07-27 Igm Biosciences Inc Modificerede bispecifikke, penta- og hexavalente ig-m-antistoffer med konstant kæde
US10167333B2 (en) 2014-01-16 2019-01-01 Mario Umberto Francesco Mondelli Neutralizing human monoclonal antibodies against hepatitis B virus surface antigen
AU2015213593B2 (en) 2014-02-10 2020-09-03 Igm Biosciences, Inc. IgA multi-specific binding molecules
PL3126383T3 (pl) 2014-04-03 2019-08-30 Igm Biosciences, Inc. Zmodyfikowany łańcuch J
HUE051013T2 (hu) 2015-01-20 2021-01-28 Igm Biosciences Inc Tumor nekrózis faktor (TNF) szupercsalád receptor kötõ molekulák és ezek alkalmazása
EP3265575B1 (en) 2015-03-04 2021-04-21 IGM Biosciences, Inc. Cd20 binding molecules and uses thereof
KR102558839B1 (ko) 2015-03-25 2023-07-25 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 다가 b형 간염 바이러스 항원 결합 분자 및 그의 용도
EP3283112A4 (en) * 2015-04-17 2018-12-05 IGM Biosciences A/S Multi-valent human immunodeficiency virus antigen binding molecules and uses thereof
JP7058213B2 (ja) 2015-09-30 2022-04-21 アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 改変ｊ鎖を有する結合分子
CN108463245A (zh) 2015-09-30 2018-08-28 Igm生物科学有限公司 具有修饰的j链的结合分子
CA3021669A1 (en) 2016-05-09 2017-11-16 Igm Biosciences, Inc. Anti-pd-l1 antibodies
MX2019000799A (es) 2016-07-20 2019-06-03 Igm Biosciences Inc Moleculas de union a gitr multimericas y usos de las mismas.
CA3030640A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Igm Biosciences, Inc. Multimeric cd40 binding molecules and uses thereof
CA3030647A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Igm Biosciences, Inc. Multimeric ox40 binding molecules and uses thereof
CA3030634A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Igm Biosciences, Inc. Multimeric cd137/4-1bb binding molecules and uses thereof
SG11201908051RA (en) 2017-04-07 2019-09-27 Igm Biosciences Inc Modified human igm constant regions for modulation of complement-dependent cytolysis effector function
AU2019224136A1 (en) 2018-02-26 2020-09-10 Igm Biosciences, Inc. Use of a multimeric anti-DR5 binding molecule in combination with a chemotherapeutic agent for treating cancer
KR20200128391A (ko) 2018-03-01 2020-11-12 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 IgM 혈청 반감기에 영향을 미치는 IgM Fc 및 J-쇄 돌연변이
MX2021004660A (es) 2018-10-23 2021-05-28 Igm Biosciences Inc Moleculas de union multivalentes a base de igm- e iga-fc.
WO2020163646A1 (en) 2019-02-08 2020-08-13 Igm Biosciences, Inc. Anti-gitr antigen-binding domains and uses thereof
CA3147291A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Igm Biosciences, Inc. Immunostimulatory multimeric binding molecules
CA3147767A1 (en) 2019-08-17 2021-02-25 Igm Biosciences, Inc. Multimeric bispecific anti-cd123 binding molecules and uses thereof
AU2020337333A1 (en) 2019-08-23 2022-03-03 Igm Biosciences, Inc. IgM glycovariants
WO2021055765A2 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Igm Biosciences, Inc. Multimeric antibodies with enhanced selectivity for cells with high target density
CN114945384A (zh) 2020-01-06 2022-08-26 Igm生物科学股份有限公司 高度唾液酸化的多聚体结合分子
MX2022013334A (es) 2020-04-22 2022-12-06 Igm Biosciences Inc Moleculas de union multimerica de agonistas de pd-1.
JP2023526224A (ja) 2020-05-12 2023-06-21 アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド がんを治療するための、がん治療薬との組合せでの多量体抗ｄｒ５結合分子の使用
EP4188951A2 (en) 2020-07-27 2023-06-07 IGM Biosciences, Inc. Multimeric coronavirus binding molecules and uses thereof
US20240002526A1 (en) 2020-11-17 2024-01-04 Igm Biosciences, Inc. Uses of effector cell engaging molecules with moieties of differing potencies

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1600856A (zh) * 2003-09-26 2005-03-30 陕西九州科技股份有限公司 分泌抗乙肝人单克隆抗体的异种杂交瘤细胞系的构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
US10604559B2 (en) 2020-03-31
AU2016238246A1 (en) 2017-10-12
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CN107921285B (zh) 2022-06-07

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