KR20150070181A - B형 간염 바이러스에 결합하고 이를 중화시킬 수 있는 인간 결합 분자 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스에 결합하며, 이러한 B형 간염 바이러스에 대하여 넓은 중화 활성을 갖는 결합 분자, 예를 들어, 인간 모노클로널 항체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자 및 결합 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 결합 분자는 B형 간염의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

Description

B형 간염 바이러스에 결합하고 이를 중화시킬 수 있는 인간 결합 분자 및 그의 용도{HUMAN BINDING MOLECULES CAPABLE OF BINDING TO AND NEUTRALIZING HEPATITIS B VIRUSES AND USES THEREOF}

본 발명은 의학에 관한 것이다. 본 발명은 특히, B형 간염 바이러스에 결합하고 이를 중화시킬 수 있는 인간 결합 분자, 예를 들어, 모노클로널 항체(monoclonal antibody) 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 B형 간염 바이러스에 의해 야기되는 감염의 진단, 예방 및/또는 치료에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 전세계적으로 20억명 넘는 사람이 감염되었으며, 일시성 간 질병(disease) 및 만성 간 질병을 야기한다. HBV에 대한 백신이 1982년도에 도입되었지만, 전세계적으로 3억 5천만명이 만성 감염되었다. 만성 감염의 위험은 감염 시의 환자의 연령과 상호관련이 있다. 감염은 생후 1년 동안 감염된 유아의 약 90%에서 지속된다. 대조적으로, 감염은 성인으로서 감염된 환자의 1 내지 5%에서만 지속된다.

HBV의 능동 복제는 아마도 면역 반응성에 기인한 간 손상을 특징으로 한다. 만성 HBV 감염은 간암과 사망을 야기할 수 있다. 유년기 동안 만성 감염된 성인의 약 25%가 HBV-관련 간경화증 또는 간암으로 사망하며, 매년 50만명 내지 120만명으로 추정된다.

HBV에 대한 면역 반응은 HBV 감염 세포의 제거를 위한 세포성 면역 반응 및 순환 바이러스 입자의 제거에 기여하는 체액성 항체 반응 둘 모두로 구성된다. HBV 항체의 중화의 유도를 담당하는 주요 바이러스 성분은 작은 HBV 표면 항원(HBsAg)이다.

모든 재조합 백신은 HBsAg를 함유하며, 이들 백신의 효능은 높으며(유아, 소아 및 청소년의 95% 초과에서의 보호), 장기간 지속된다(20년 초과). 또한, 모든 백신은 혈청형에 대하여 면역성을 유도한다. HBsAg는 하나의 N-연결 글리코실화 부위와 함께, 226개 아미노산으로 구성된다. 순환하는 HBV 균주의 비교에 의해, 다양한 HBsAg 서열 간에 높은 수준의 상동성이 존재하는 것으로 나타났다.

만성 HBV 감염의 치료 시장에 다양한 항-바이러스 제품이 존재한다. 그러나, 이용가능한 항-바이러스 약물 중 어느 것도 감염을 제거할 수 없으며; 그들은 단지 복제를 억제하여, 간 손상을 최소화시킨다. 따라서, 간 이식은 HBV 말기 간 질병이 있는 환자를 위한 유일한 치료 옵션이다. HBV-이환 간은 미국에서 모든 간 이식의 5%에 해당하는 것으로 추정되는 한편, 중국에서는 모든 간 이식의 대략 85%가 HBV 감염 때문에 이루어진다.

환자는 현재, 간 이식 후에 새로운 간의 재감염을 예방하기 위해 항바이러스제와 병용되는 폴리클로널 HBV 면역글로불린(HBIg)으로 처치된다. 폴리클로널 HBIg는 면역화된 공여자 유래의 풀링된 혈장으로부터 제조되며, 독립적으로 또는 백신과 병용하여 노출 후 예방으로서도 사용된다. HBIg 제제는 HBsAg를 함유하는 혈액에 대한 급성 노출, HBsAg-양성 어머니에게서 태어난 유아의 주산기 노출, HBsAg 양성 인간에 대한 성적 노출 및 급성 B형 간염 바이러스 감염이 있는 인간에 대한 가정의 노출의 치료를 위해 권고된다. 입수가능성, 원가, 많은 주사량, 유해 사례(adverse event) 및 혈액-매개 감염의 위험과 같은 HBIg와 관련된 몇몇 제약이 존재하기 때문에, HBV에 대한 모노클로널 항체 제품이 의학적으로 필요하다.

HBV에 대한 몇몇 모노클로널 항체가 이전에 기술된 적이 있다. PCT 특허 출원 제PCT/IL97/00183호 및 제PCT/IL97/00184호에서는 각각 HBV 표면 항원에 대한 인간 모노클로널 항체 mAb 17.1.41 및 mAb 19.79.5가 개시되어 있다. 이들 항체는 다양한 HBV 하위유형(subtype)에 결합한다. 그러나, 하위유형 adw2의 HBsAg(유전형 C)는 상기 항체에 의해 인식되지 않는다(문헌[Eren et al., 2000, Hepatology 32, 588]). 유전형 C는 다수의 만성 감염 개체가 거주하는 중국에서 매우 널리 퍼져있다.

PCT 특허 출원 제WO2009069917호에서는 B형 간염 감염의 예방 및 치료를 위하여 B형 간염 바이러스를 중화시킬 수 있는 인간 항체가 개시되어 있다. 이러한 항체가 모든 주요 혈청- 및 유전형의 HBV에 결합하는지는 입증된 적이 없다. 또한, 지금까지 개시된 항체 중 어느 것도 흔히 알려져 있는 대다수의 백신-유도 및 항-바이러스-유도 도피 돌연변이체(escape mutant)를 중화시키는 것으로 밝혀지지 않았다.

따라서, 가능한 도피 돌연변이체에 더하여 광범위한 혈청- 및 유전형의 HBV에 결합하고 이를 중화시키며, 산업적으로 대규모로 제조될 수 있는 항체가 해당 분야에 필요하다.

본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)에 특이적으로 결합하고 이를 중화시킬 수 있는 결합 분자, 특히 인간 결합 분자를 제공한다. 본 발명은 주요 혈청- 및 유전형의 HBV에 결합하여, 이에 의해 광범위한 보호를 제공하는 결합 분자를 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 결합 분자는 모든 주요 백신-유도 및 항-바이러스-유도 HBV 도피 돌연변이체에 결합한다. 마지막으로, 본 발명의 HBV에 대한 결합 분자는 효율적으로 대규모로 제조될 수 있으며, 이는 그들이 산업적 생성에 적절하게 한다.

본 발명에 따른 결합 분자는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

또한, 본 발명은 B형 간염 바이러스 단백질 상의 에피토프로의 결합을 위하여, 본 발명에 따른 결합 분자와 특이적으로 경쟁하는 결합 분자에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 결합 분자는 인간 모노클로널 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 결합 분자를 포함하고, 적어도 하나의 태그(tag)를 더 포함하는 면역접합체(immunoconjugate)에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 결합 분자를 암호화(인코딩)하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명의 결합 분자, 면역접합체 및/또는 핵산 분자는 의약(medicament)으로서 사용하기에, 바람직하게는 소정의 B형 간염 바이러스 하위유형에 의해 야기되는 B형 간염 감염의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용하기에 적절하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 분자의 기능적 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 분자 및/또는 면역접합체, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 분자 및 추가의 B형 간염 중화 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 하기의 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염의 검출 방법에 관한 것이다:

(a) 본 발명에 따른 결합 분자 및/또는 면역접합체를 사용하여 생물학적 시료 중의 B형 간염 바이러스 항원의 수준을 검정하는 단계; 및

(b) 검정된 B형 간염 바이러스 항원의 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계로서, 대조군 B형 간염 바이러스 항원의 수준에 비한 검정된 B형 간염 바이러스 항원의 수준의 증가가 B형 간염 바이러스 감염을 나타내는 단계.

도 1 CR8096(분리된 피크가 있는 굵은 선) 및 CR8097(단일의 피크가 있는 얇은 선)의 HP-SEC 프로파일의 오버레이, 및 MALS 검출에 의해 검출되는 바와 같은 분자량의 지정.
도 2 각각이 주요 혈청/유전형의 HBV를 나타내는 HBsAg 발현 작제물(construct)로 트랜스펙션된(transfected) HEK293F 세포로의 CR8097의 세포내 FACS 결합의 개요. 모의감염(mock) HEK293F 세포를 GFP 발현 작제물로 트랜스펙션시켰다.
도 3 HBsAg의 2가지 상이한 하위유형의 폴리펩티드 서열의 개요: ayw3(SEQ ID NO: 11) 및 adr(SEQ ID NO: 12). 컨센서스(consensus) 서열은 SEQ ID NO: 13과 동일하다.
도 4 각각이 흔히 관찰되는 HBsAg 도피 돌연변이체를 나타내는 HBsAg 발현 작제물로 트랜스펙션된 HEK293F 세포로의 CR8097의 세포내 FACS 결합의 개요. 모의감염 HEK293F 세포를 GFP 발현 작제물로 트랜스펙션시켰다.
도 5 HBV 유전형 C, 혈청형 adr에 대한 CR8097의 시험관내 중화 효능.
도 6 HBV 유전형 D, 혈청형 ayw3에 대한 CR8097의 시험관내 중화 효능.
도 7 HBV 유전형 C, 혈청형 adr에 대한 CR8097의 예측적 생체내 효능.

본 발명에 사용되는 바와 같은 용어의 정의는 하기에 제공된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "포함된다" 또는 "포함하는"은 단어 "제한 없이"가 뒤따르는 것으로 간주된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "결합 분자"는 모노클로널 항체, 예를 들어, 키메라, 인간화 또는 인간 모노클로널 항체를 포함하는 무손상(intact) 면역글로불린, 또는 면역글로불린의 결합 파트너에 특이적으로 결합하기 위해 무손상 면역글로불린과 경쟁하는 면역글로불린의 단편을 포함하는 항원-결합 및/또는 가변 도메인을 말한다. 구조와 상관없이, 항원-결합 단편은 무손상 면역글로불린에 의해 인식되는 것과 동일한 항원과 결합한다. 항원-결합 단편은 결합 분자의 아미노산 서열의 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 또는 250개의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "결합 분자"는 당해 분야에 알려진 모든 면역글로불린 분류 및 하위분류를 포함한다. 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 결합 분자는 무손상 항체의 5가지의 주요 분류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 나뉠 수 있으며 이들 중 몇몇은 하위분류, 예를 들어, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 나뉠 수 있다.

항원-결합 단편은, 특히, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정영역(CDR) 단편, 단쇄 항체(scFv), 2가 단쇄 항체, 단쇄 파지 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), (폴리)펩티드 등에 특이적인 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 하나의 단편을 함유하는 (폴리)펩티드를 포함한다. 상기 단편은 합성에 의해, 또는 무손상 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성될 수 있거나, 또는 그들은 재조합 DNA 기술에 의해 유전적으로 조작될 수 있다. 생성 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow and D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York]에 기술되어 있고, 이는 본 명세서에 참조로 포함된다. 결합 분자 또는 그의 항원-결합 단편은 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 하나 초과의 결합 부위가 존재하는 경우, 결합 부위는 서로 동일하거나 또는 그들은 상이할 수 있다.

결합 분자는 네이키드(naked) 또는 비접합된 결합 분자일 수 있지만, 또한 면역접합체의 일부일 수도 있다. 네이키드 또는 비접합된 결합 분자는, 이펙터 모이어티(effector moiety) 또는 태그, 예를 들어, 특히, 독성 물질, 방사성 물질, 리포좀, 효소와 접합되지 않거나, 작동가능하게 연결되지 않거나, 또는 다르게는 물리적으로 또는 기능적으로 회합되지 않은 결합 분자를 말하는 것으로 의도된다. 네이키드 또는 비접합된 결합 분자가 이펙터 모이어티 또는 태그의 부착에 의한 것 이외에, 안정화되거나, 다량체화되거나, 인간화되거나 또는 임의의 다른 방법으로 조작된 결합 분자를 배제하지 않는 것이 이해될 것이다. 따라서, 모든 번역 후 변형된 네이키드 및 비접합된 결합 분자가 여기에 포함되고, 변형이 재조합 결합 분자-생성 세포에 의해, 천연 결합 분자-생성 세포 환경에서 이루어지고, 초기 결합 분자 제조 후 인간의 손에 의해 도입되는 것을 포함한다. 물론, 용어 네이키드 또는 비접합된 결합 분자는 신체로의 투여 후에 이펙터 세포 및/또는 분자와 기능적 회합을 형성하는 결합 분자의 능력을 배제하지 않는데, 이는 이와 같은 상호작용의 일부가 생물학적 효과를 발휘하기 위해 필요하기 때문이다. 따라서, 생체내에서가 아니라 시험관 내에서 회합된 이펙터 기 또는 태그의 결여는 네이키드 또는 비접합된 결합 분자에 대한 정의에 적용된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "생물학적 시료"는 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 시료, 고형 조직 시료, 예를 들어, 생검 시편 또는 조직 배양물, 또는 그로부터 유래된 세포 및 그의 자손을 포함하는, 다양한 시료 유형을 포함한다. 또한, 상기 용어는 그들의 입수 후, 임의의 방식으로, 예를 들어, 시약으로 처리, 가용화, 또는 특정 성분, 예를 들어, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 농축에 의해 조작된 시료를 포함한다. 상기 용어는 임의의 종으로부터 얻은 임상적 시료의 다양한 종류를 포함하고, 또한 배양물 중의 세포, 세포 상청액 및 세포 용해물을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "상보성 결정 영역(CDR)"은 결합 분자, 예를 들어, 면역글로불린의 가변 영역 내의 서열을 의미하고, 이는 보통 광범위하게 형태와 전하 분포가 항원에서 인식되는 에피토프와 상보적인 항원 결합 부위의 원인이 된다. CDR 영역은 그의 고유 입체형태(conformational)로 단백질 상에 존재하거나 또는 일부 경우에, 예를 들어, SDS에서의 가용화에 의해 변성시 단백질 상에 존재하는 바와 같이, 단백질 또는 단백질 단편의 선형 에피토프, 불연속 에피토프 또는 입체형태 에피토프에 특이적일 수 있다. 또한, 에피토프는 단백질의 번역후 변형으로 구성될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "결실"은 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기가 각각 참조물질, 종종 천연 발생 분자와 비교하여 부재인 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변화를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "발현-조절 핵산 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요하고/거나 영향을 미치는 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 발현-조절 핵산 서열, 예를 들어, 특히 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터, 인핸서 서열; 억제자(repressor) 또는 활성자(activator) 서열; 효율적인 RNA 가공 신호, 예를 들어, 스플라이싱(splicing) 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증진시키는 서열(예를 들어, 리보솜 결합 부위); 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 필요한 경우, 단백질 분비를 증진시키는 서열은 선택된 숙주 유기체에서 활성을 나타내는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 숙주 유기체에 동종 또는 이종인 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래될 수 있다. 발현-조절 서열의 확인 및 사용은 당해 분야의 당업자들에게는 통상적인 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "기능적 변이체"는 참조 핵산 분자 또는 결합 분자의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산이 변경된 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 결합 분자를 말한다. 본 발명에 따른 결합 분자의 기능적 변이체는 결합 파트너, 즉, B형 간염 바이러스로의 결합을 위해 참조 결합 분자와 경쟁할 수 있다. 다시 말하면, 참조 결합 분자의 아미노산 및/또는 뉴클레오티드 서열의 변형은 그 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되거나 그 아미노산 서열을 함유하는 결합 분자의 결합 특성에 상당한 영향을 미치거나 그를 변형시키지 않고, 다시 말하면, 결합 분자는 여전히 그의 표적을 인식하고 그에 결합할 수 있다. 기능적 변이체는 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함하는 보존적 서열 변형을 가질 수 있다. 이들 변형은 당해 분야에 공지되어 있는 표준 기술, 예를 들어, 위치-지정 돌연변이유발 및 무작위 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있고, 천연, 및 비-천연 뉴클레오티드 및 아미노산을 포함할 수 있다.

보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 과가 당해 분야에 정의되어 있다. 이들 과는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판)를 갖는 아미노산을 포함한다. 또한, 상기에서 사용된 것 이외의 아미노산 잔기 과의 다른 분류도 또한 사용될 수 있는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 게다가, 변이체는 비-보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 상이한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 아미노산 잔기에 의한 아미노산의 대체를 가질 수 있다. 유사한 적은 변이는 또한 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 어떤 아미노산 잔기가 면역학적 활성을 없애지 않고, 치환되거나, 삽입되거나 결실될 수 있는지의 결정에 관한 지침은 당해 분야에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용하여 찾을 수 있다.

뉴클레오티드 서열의 돌연변이는 유전자좌(locus)에서 이루어지는 단일의 변경(점 돌연변이), 예를 들어, 전이 또는 전위 돌연변이이거나, 또는 대안적으로, 다중의 뉴클레오티드가 단일 유전자좌에서 삽입, 결실 또는 변화될 수 있다. 또한, 하나 이상의 변경이 뉴클레오티드 서열 내의 임의의 수의 유전자좌에서 이루어질 수 있다. 돌연변이는 당해 분야에 알려진 임의의 적절한 방법으로 수행될 수 있다.

용어 B형 간염 바이러스 "혈청형"은 구체적으로 특정 혈청형 내의 모든 개별 B형 간염 바이러스 균주를 포함한다. HBV 바이러스 균주의 혈청형 분류는 알고리즘/의사결정수(문헌[Purdy et al. 2007 Intervirology])를 통하여 HBsAg 분자 내의 제한된 수의 아미노산 잔기에 기초하여 이루어진다. 현재까지, 11개 혈청형의 HBV가 기술되어 있으며, 이는 adw1, adw2, adw3, adw4q+, adw4q-, adrq+, adrq-, ayw1, ayw2, ayw3, ayw4이다. 또한, 혈청형은 "하위유형"으로 지칭될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "혈청형" 및 "하위유형"은 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

용어 HBV "유전형"은 구체적으로 각 유전형 내의 모든 개별 HBV 바이러스 균주를 포함한다. HBV 유전형의 분류는 전체 HBV 게놈의 계통발생 관련성에 기초한다. 특정 유전형 내의 HBV 게놈은 정의상, 계통발생 분기군 내에서 4% 미만의 서열 차이를 보이고, 분기군 외 서열과 8% 초과의 차이를 보인다. 현재까지, A 내지 I로 표기되는 9개의 HBV 유전형이 정의되었다.

본 발명의 결합 분자와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "중화시키는"은 중화가 달성되는 메카니즘과 관련 없이, 시험관내 및/또는 대상체 내에서 B형 간염 바이러스의 복제를 억제하는 결합 분자를 말한다. 따라서, 중화는 예를 들어, 세포 표면으로의 바이러스의 부착 또는 결착을 억제함으로써, 또는 표적 세포로의 바이러스의 부착 후에 바이러스 및 세포 막의 융합을 억제함으로써, 또는 감염된 세포로부터의 바이러스 유출을 억제함으로써 등으로 달성될 수 있다.

본 발명의 결합 분자와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "교차-중화시키는" 또는 "교차-중화"는 상이한 혈청형 및/또는 유전형의 B형 간염 바이러스를 중화시키는 본 발명의 결합 분자의 능력을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "숙주"는 벡터, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터가 도입되는 유기체 또는 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 유기체 또는 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 바람직하게, 숙주는 분리된 숙주 세포, 예를 들어, 배양물 중의 숙주 세포이다. 용어 "숙주 세포"는 단지 본 발명의 결합 분자의 (과)-발현을 위해 변형된 세포를 의미하며, 원래 이들 결합 분자를 발현하는 B-세포를 포함하며, 이 세포는 불멸화, 증폭, 발현의 증진 등에 의해 결합 분자를 과발현하도록 변형된다. 용어 숙주가 특정 대상 유기체 또는 세포뿐 아니라 이러한 유기체 또는 세포의 자손도 또한 지칭하고자 하는 것이 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경 영향 때문에, 이후의 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모 유기체 또는 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "숙주"의 범주 내에 여전히 포함된다.

용어 "인간"은, 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 분자에 적용될 때, 인간으로부터 직접 유래되거나 또는 인간 생식계열 서열을 기반으로 하는 분자를 말한다. 결합 분자가 인간 서열로부터 유래되거나 이를 기반으로 하고 이후에 변형되는 경우, 그것은 여전히 본 명세서에 전반적으로 사용된 바와 같은 인간으로 간주되어야 한다. 다시 말하면, 용어 인간은 결합 분자에 적용될 때, 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되거나, 인간 또는 인간 림프구에서 발생하는 가변 또는 불변 영역을 기반으로 하고, 몇몇 형태로 변형된 가변 및 불변 영역을 갖는 결합 분자를 포함하고자 한다. 그러므로, 인간 결합 분자는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 치환 및/또는 결실을 포함한다(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 위치-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이).

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "기반으로 하는"은 핵산 서열이 주형으로부터 정확히 카피되거나, 또는 오류-유발(error-prone) PCT 방법에 의한 것과 같이 적은 돌연변이를 갖거나, 또는 주형과 정확히 매치되거나 적은 변형을 갖도록 인공적으로 제조될 수 있는 상황을 말한다.

용어 "부가"로도 알려져 있는 용어 "삽입"은 모 분자와 비교하여, 각각 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기의 부가를 야기하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 변화를 말한다.

용어 "분리된"은, 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 분자에 적용되는 경우, 실질적으로 다른 단백질 또는 폴리펩티드가 없는, 특히 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 결합 분자가 없고, 또한 실질적으로 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 없는 결합 분자를 말한다. 예를 들어, 결합 분자가 재조합에 의해 생성되는 경우, 그들은 바람직하게는 실질적으로 배양 배지 성분이 없고, 결합 분자가 화학적 합성에 의해 생성되는 경우, 그들은 바람직하게는 실질적으로 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 없고, 다시 말하면, 그들은 단백질의 합성에 수반되는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 용어 "분리된"은, 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자에 적용되는 경우, 결합 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 다른 뉴클레오티드 서열, 특히 다른 결합 파트너에 결합하는 결합 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 없는 핵산 분자를 말하고자 한다. 또한, 용어 "분리된"은 그의 천연 숙주에서 천연적으로 고유 핵산 분자와 동반되는 다른 세포 성분, 예를 들어, 그것이 천연적으로 회합되어 있는 리보솜, 중합효소 또는 게놈 서열로부터 실질적으로 분리된 핵산 분자를 말한다. 더욱이, cDNA 분자와 같은 "분리된" 핵산 분자에는 다른 세포 물질 또는 재조합 기술에 의해 생성되는 경우에는 배양 배지가 실질적으로 없을 수 있거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우에는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "모노클로널 항체"는 단일의 특이성의 항체 분자의 제제를 말한다. 모노클로널 항체는 특정 에피토프에 대해 단일의 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로널 항체"는 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래되거나 또는 그를 기반으로 하거나, 또는 완전히 합성 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일의 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다. 모노클로널 항체의 제조 방법은 결합 특이성과 관련이 없다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "천연적으로 발생하는"은 대상에 적용시, 대상 또는 화합물이 천연에서 발견될 수 있는 사실을 말한다. 예를 들어, 천연 공급원으로부터 분리될 수 있는 유기체에 존재하고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연적으로 발생하는 것이다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 용어 "핵산 분자"는 뉴클레오티드의 폴리머 형태를 말하고, RNA, cDNA, 게놈 DNA 및 합성 형태 및 상기의 것의 혼합된 폴리머의 센스 및 안티-센스 가닥 둘 모두를 포함한다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 어느 하나의 유형의 변형된 형태를 말한다. 상기 용어는 또한 DNA의 단일- 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 천연적으로 발생하는 뉴클레오티드 및 천연적으로 발생하는 및/또는 비-천연적으로 발생하는 뉴클레오티드 연결기에 의해 함께 연결된, 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나의 것 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나 또는 비-천연적 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있고, 이는 당해 분야의 당업자에 의해 용이하게 이해될 것이다. 이러한 변형은, 예를 들어, 표지, 메틸화, 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어, 비하전된 연결기(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등), 하전된 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 모이어티(예를 들어, 폴리펩티드), 인터칼레이터(intercalator)(예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터(chelator), 알킬레이터(alkylator) 및 변형된 연결기(예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)를 포함한다. 상기 용어는 또한, 단일-가닥, 이중-가닥, 특히 듀플렉스, 트리플렉스, 헤어핀형(hairpinned), 환형 및 패드록(padlock) 입체형태를 포함하는 임의의 위상 입체형태를 포함하고자 한다. 또한, 수소 결합 및 다른 화학적 상호작용을 통해 지정된 서열에 결합하는 그들의 능력에서 폴리뉴클레오티드를 모방하는 합성 분자가 포함된다. 이러한 분자는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 펩티드 연결기가 분자의 백본에서 포스페이트 연결기를 대체하는 것을 포함한다. 핵산 서열에 대한 참조는 다르게 명시되지 않는 한 그의 상보체를 포함한다. 그러므로, 특정 서열을 갖는 핵산 분자에 대한 참조는 그의 상보적 서열을 갖는, 그의 상보적 가닥을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상보적 가닥은 또한, 예를 들어, 안티-센스 치료법, 혼성화 프로브 및 PCR 프라이머에 유용하다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 보통 물리적으로 연결되고 서로 기능적 관계에 있는 2개 이상의 핵산 서열 요소를 말한다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현을 개시하거나 조절할 수 있다면, 프로모터는 암호화 서열에 작동가능하게 연결되고, 이러한 경우에, 암호화 서열은 프로모터의 "조절 하에 있다"고 이해되어야 한다.

"약제학적으로 허용되는 부형제"는 알맞은 또는 편리한 투여형의 제조를 위해 활성 분자, 예를 들어, 약물, 작용제(agent) 또는 결합 분자와 조합되는 임의의 불활성 물질을 의미한다. "약제학적으로 허용되는 부형제"는 사용되는 투여량과 농도에서 수여자에 비-독성이고, 약물, 작용제 또는 결합 분자를 포함하는 제형의 다른 성분과 양립할 수 있는 부형제이다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 당해분야에서 널리 적용되고 공지되어 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "특이적으로 결합하는"은, 결합 분자, 예를 들어 항체 및 그의 결합 파트너, 예를 들어 항원의 상호작용을 참조로 하여, 상호작용이 결합 파트너 상의 특정 구조, 예를 들어 항원 결정인자 또는 에피토프의 존재에 좌우되는 것을 의미한다. 다시 말하면, 항체는 결합 파트너가 다른 분자 또는 유기체의 혼합물 중에 존재하는 경우에도 결합 파트너에 우선적으로 결합하거나 이를 인식한다. 결합은 공유 또는 비-공유 상호작용 또는 둘 모두의 조합에 의해 매개될 수 있다. 또 다시 말하면, 용어 "특이적으로 결합하는"은 소정의 항원 결정인자 또는 에피토프에 면역특이적으로 결합하고, 다른 항원 결정인자 또는 에피토프에는 면역특이적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 항원에 특이적으로 결합하는 결합 분자는, 종말점 검정, 예를 들어, 방사성면역검정(RIA) 또는 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA) 또는 무표지(label-free) 기술, 예를 들어, SPR, BLI 또는 당해 분야에 공지되어 있는 다른 검정에 의해 결정시, 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 보다 낮은 친화성으로 결합할 수 있다. 항원에 면역특이적으로 결합하는 결합 분자 또는 그의 단편은, 동일한 에피토프를 지니는 관련 항원과 교차-반응성일 수 있다. 바람직하게는 항원에 면역특이적으로 결합하는 결합 분자 또는 그의 단편은 다른 항원과 교차-반응하지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "치환"은, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 각각 상이한 아미노산 또는 뉴클레오티드로 대체된 것을 말한다.

용어 "치료적 유효량"은 B형 간염 바이러스로의 감염으로 야기되는 질환의 예방, 개선 및/또는 치료에 효과적인 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 분자의 양을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 개선은 뚜렷한 또는 인지가능한 질병 증상(symptom), 바이러스 감염 또는 B형 간염 감염의 임의의 다른 측정가능한 징후(manifestation)의 감소를 말할 수 있다.

용어 "치료"는 질병을 치유하거나, 또는 그의 진행을 정지시키거나, 적어도 지연시키기 위한 치료적 처치, 및 예방책을 말한다. 치료를 필요로 하는 대상체는 B형 간염 바이러스로의 감염으로부터 야기되는 질환으로 이미 고통받고 있는 대상체 및 B형 간염 바이러스로의 감염이 예방되어야 하는 대상체를 포함한다. B형 간염 바이러스로의 감염으로부터 불완전하게 또는 완전하게 회복된 대상체도 또한 치료를 필요로 할 수 있다. 예방은 B형 간염 바이러스의 확산의 억제 또는 감소, 또는 B형 간염 바이러스로의 감염과 관련이 있는 증상 중 하나 이상의 발병, 발생 또는 진행의 억제 또는 감소를 포함한다.

용어 "벡터"는 그것이 복제될, 일부 경우에는 발현될 숙주로의 도입을 위해 제2 핵산 분자가 삽입될 수 있는 핵산 분자를 말한다. 다시 말하면, 벡터는 그것이 연결된 핵산 분자를 수송할 수 있다. 클로닝 벡터 및 발현 벡터는 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "벡터"로 고려된다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체(BAC) 및 효모 인공 염색체(YAC), 및 박테리오파지 또는 식물 또는 동물(인간 포함) 바이러스로부터 유도된 벡터를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 벡터는 제안된 숙주에 의해 인식된 복제 원점을 포함하고, 발현 벡터의 경우에는 프로모터 및 숙주에 의해 인식되는 다른 조절 영역을 포함한다. 제2 핵산 분자를 함유하는 벡터는 형질전환, 트랜스펙션(transfection), 또는 바이러스 침투 메카니즘의 사용에 의해 세포에 도입된다. 특정 벡터는 그들이 도입되는 숙주에서 자율적으로 복제될 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 갖는 벡터는 박테리아에서 복제될 수 있다). 다른 벡터는 숙주로의 도입시에 숙주의 게놈으로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다.

제1 양태에서, 본 발명은 B형 간염 바이러스 균주에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 B형 간염 바이러스 균주를 중화시킬 수 있는 결합 분자를 제공한다. 결합 분자는 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 B형 간염 바이러스를 중화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 결합 분자는 SEQ ID NO: 1 내지 3에 제시된 CDR 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 4 내지 6에 제시된 CDR 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 본 발명에 따르면, CDR 영역은 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest]에 기술된 바와 같이, 카바트(Kabat) 등(1991)에 따라 결정된다.

따라서, 본 발명은 B형 간염 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있으며, B형 간염 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자를 제공하며, 여기서, 결합 분자는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 결합 분자는 인간 결합 분자이다. 바람직한 구현예에서, 결합 분자는 인간 모노클로널 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.

본 발명의 결합 분자는 생존가능하고/거나 살아있고/거나 감염성인, 또는 불활성화/약독화 형태인 B형 간염 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있다. 바이러스, 예를 들어, B형 간염 바이러스의 불활성화/약독화 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 포르말린, β-프로피오락톤(BPL), 메르티올레이트 및/또는 자외선으로의 처치를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 결합 분자는 B형 간염 바이러스의 하나 이상의 단편, 예를 들어, 특히, B형 간염 바이러스의 하위유형으로부터 유도된 하나 이상의 단백질 및/또는 (폴리)펩티드, 또는 B형 간염 바이러스의 재조합에 의해 생성된 하나 이상의 단백질 및/또는 폴리펩티드의 제제에 특이적으로 결합할 수 있다. 다양한 B형 간염 균주의 단백질의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열은 GenBank-데이터베이스에서 찾을 수 있다. 이러한 연구에서 사용되는 HBsAg 서열을 6000개 초과의 HBV 서열을 포함하는 대형 일본 NIG HBV 데이터베이스로부터 선택하였다(접속을 위하여, http://s2as02.genes.nig.ac.jp/ 참조). 각각의 데이터베이스에서 이러한 서열을 찾는 것은 숙련자의 범위 내에 있다.

본 발명의 결합 분자는 적어도 하기의 혈청형으로부터의 HBsAg 펩티드에 결합할 수 있다: adw2(유전형 B), ayw2(유전형 D), ayw1(유전형 B), adrq-(유전형 C), ayr(유전형 C), adw4q+(유전형 A), adrq+(유전형 C), ayw4(유전형 D), adw4q-(유전형 F), adw3, ayw3(유전형 D), adw2(유전형 I), ayw1(유전형 A), adw2(유전형 A), adw2(유전형 C). 이것은 실시예 2에 예시되어 있다. 본 명세서에서, 본 발명의 결합 분자는 놀랍게도, HBV의 주요 혈청- 및 유전형으로의 결합에 의해 매우 광범위한 보호를 제공한다.

다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 상기 언급된 단백질 및/또는 폴리펩티드의 단편에 특이적으로 결합할 수 있으며, 여기서, 단편은 적어도 본 발명의 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "에피토프"는 충분히 높은 친화성으로 본 발명의 결합 분자에 결합하여, 검출가능한 항원-결합 분자 복합체를 형성할 수 있는 모이어티이다.

또한, 본 발명에 따른 결합 분자는 놀랍게도, HBsAg의 모든 주요 백신-유도 및 항-바이러스-유도 HBV 도피 돌연변이체, 예를 들어, P120T, Q129R, M133I, D144R, G145R, G145A, E164D, I195M, W196S에 결합한다(실시예 3). 따라서, 본 발명의 결합 분자는 HBV에 대하여 보편적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 결합 분자는 무손상 면역글로불린 분자, 예를 들어, 모노클로널 항체일 수 있거나, 결합 분자는 그의 항원-결합 단편일 수 있으며, 이에는 중쇄 및 경쇄 가변 영역, Fab, F(ab'), F(ab')₂, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단쇄 항체(scFv), 2가 단쇄 항체, 단쇄 파지 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 B형 간염 바이러스 균주로의 특이적인 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 하나의 단편을 포함하는 (폴리)펩티드 또는 그의 단편이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 인간 모노클로널 항체 및/또는 그의 항원-결합 단편이다. 또한, 결합 분자는 나노바디, 알파바디(alphabody), 아피바디(affibody), FN3-도메인 스캐폴드 및 (인간) 반복 단백질 내의 도메인을 기반으로 한 다른 스캐폴드, 유사 아드넥틴(Adnectin), 안티칼린(Anticalin), 다르핀(Darpin), 센티린(Centyrin) 등 또는 에피토프 결합 서열을 포함하는 다른 스캐폴드일 수도 있다.

본 발명의 결합 분자는 비-분리형 또는 분리형으로 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명의 결합 분자는 단독으로 또는 본 발명의 적어도 하나의 결합 분자(또는 그의 변이체 또는 단편), 및 B형 간염 바이러스에 결합하며 B형 간염 바이러스 억제 효과를 갖는 하나 이상의 다른 결합 분자를 포함하는 혼합물로 사용될 수 있다. 다시 말하면, 결합 분자는 병용하여, 예를 들어, 둘 이상의 결합 분자, 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 약제학적 조성물로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 상이하지만, 상보적 활성을 갖는 결합 분자가 단일 치료법에서 병용되어, 요망되는 예방, 치료 또는 진단 효과를 달성할 수 있으나, 대안적으로, 동일한 활성을 갖는 결합 분자가 또한 단일 치료법에서 병용되어, 요망되는 예방, 치료 또는 진단 효과를 달성할 수도 있다. 선택적으로, 혼합물은 또한, 본 발명에 따른 적어도 하나의 결합 분자 및 적어도 하나의 다른 치료제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 치료제, 예를 들어, 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 라미부딘(lamivudine), 아데포비르(adefovir)) 및/또는 면역조절제(예를 들어, 인터페론 기반의 치료법)는 B형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 유용하다.

전형적으로, 본 발명에 따른 결합 분자는 0.2×10^-4 M, 1.0×10^-5 M, 1.0×10^-6 M, 1.0×10^-7 M 미만, 바람직하게는 1.0×10^-8 M 미만, 더욱 바람직하게는 1.0×10^-9 M 미만, 더욱 바람직하게는 1.0×10^-10 M 미만, 더더욱 바람직하게는 1.0×10^-11 M 미만, 특히, 1.0×10^-12 M 미만의 평형 해리 상수(K_D)로 그의 결합 파트너, 즉, B형 간염 바이러스 및/또는 그의 단편에 결합할 수 있다. 평형 해리 상수는 항체 아이소타입에 대하여 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 아이소타입에 대한 결합은 적어도 약 1.0×10^-7 M의 평형 해리 상수를 말한다. 결합 반응속도(kinetics)는 예를 들어, 무표지 기술, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 또는 바이오층 간섭법(biolayer interferometry)을 사용하여 수득될 수 있다.

본 발명의 결합 분자는 중화 활성을 나타낸다. 중화 활성은 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따른 결합 분자는 실시예 4 및 5에 기술된 바와 같은 시험관내 바이러스 중화 검정(VNA)에서 결정시, 1000 ng/㎖ 이하, 바람직하게는 500 ng/㎖ 이하, 더욱 바람직하게는 100 ng/㎖ 이하의 중화 활성, 더더욱 바람직하게는 10 ng/㎖ 이하의 중화 활성을 갖는다. 본 발명에 따른 결합 분자는 가용성 형태, 예를 들어, 시료, 또는 현탁액 중에서 B형 간염 바이러스 또는 그의 단편에 결합할 수 있거나, 담체 또는 기재, 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트, 막 및 비드 등에 결합되거나 부착된 B형 간염 바이러스 또는 그의 단편에 결합할 수 있다. 담체 또는 기재는 유리, 플라스틱(예를 들어 폴리스티렌), 다당류, 나일론, 니트로셀룰로스, 또는 테프론(Teflon) 등으로 제조될 수 있다. 이러한 지지체의 표면은 고형 또는 다공성일 수 있고 임의의 편리한 형태일 수 있다. 또한, 결합 분자는 정제형/분리형 또는 비-정제형/비-분리형의 B형 간염 바이러스에 결합될 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 특정 구현예에서, B형 간염 바이러스 상의 에피토프를 인식하고, 이에 결합할 수 있는 분리된 인간 결합 분자를 제공하며, 여기서, 상기 결합 분자는 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 B형 간염 바이러스에 대한 중화 활성을 갖는다.

본 발명의 다른 양태는 상기 정의된 바와 같은 결합 분자의 기능적 변이체를 포함한다. 분자는, 변이체 결합 분자가 B형 간염 바이러스 또는 그의 단편에 면역특이적으로 결합하기 위하여 "모" 또는 "참조" 결합 분자와 경쟁할 수 있다면, 본 발명에 따른 결합 분자의 기능적 변이체인 것으로 여겨진다. 다시 말하면, 분자는, 기능적 변이체가 B형 간염 바이러스 또는 그의 단편의 동일한 또는 중첩 에피토프에 여전히 결합할 수 있는 경우, 본 발명에 따른 결합 분자의 기능적 변이체인 것으로 여겨진다. 본 출원의 목적을 위하여, "모" 및 "참조"는 참조 또는 모 분자 또는 신체 분자 그 자체의 정보가 변이에 대한 기초를 형성할 수 있음을 의미하는 동의어로 사용될 것이다. 기능적 변이체는 일차 구조 서열이 실질적으로 유사한 유도체를 포함하나 이들에 한정되지 않으며, 이에는 Fc 수용체 또는 이펙터 기능에 수반되는 다른 영역의 변형을 갖고/거나 예를 들어, 모 결합 분자에서 관찰되지 않는 시험관내 또는 생체내 변형, 화학물질 및/또는 생화학물질을 함유하는 것들이 포함된다. 이러한 변형에는 특히, 아세틸화, 아실화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유적 부착, 가교, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 수산화, 메틸화, 산화, PEG화, 단백질분해 처리, 인산화 등이 포함된다. 대안적으로, 기능적 변이체는 모 결합 분자의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 그들의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명에 정의된 바와 같은 결합 분자일 수 있다. 더욱이, 기능적 변이체는 아미노 또는 카르복시 말단 중 어느 하나의 것 또는 둘 모두에서 아미노산 서열의절단(truncation)을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 기능적 변이체는 모 결합 분자와 비교하여 동일하거나 상이한, 더 높거나 더 낮은 결합 효능을 가질 수 있지만, 여전히 B형 간염 바이러스 또는 그의 단편에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 기능적 변이체는 B형 간염 바이러스 또는 그의 단편에 대하여 모 결합 분자와 비교하여 증가되거나 감소된 결합 효능을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 프레임워크 영역, 초가변 영역, 특히 CDR3 영역을 포함하나 이들에 한정되지 않는 가변 영역의 아미노산 서열이 변형된다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 3개의 CDR을 포함하는 3개의 초가변 영역 및 더욱 보존된 영역, 소위 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 초가변 영역은 CDR로부터의 아미노산 잔기와 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 범주에 속하는 것으로 의도되는 기능적 변이체는 본 명세서에 정의된 바와 같은 모 결합 분자와, 적어도 약 80% 내지 약 99%, 바람직하게는 적어도 약 70% 내지 약 99%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80% 내지 약 99%, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 내지 약 99%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 내지 약 99%, 특히 적어도 약 97% 내지 약 99% 아미노산 서열 동일성 및/또는 상동성을 갖는다. 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어, 특히, 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 Gap 또는 Bestfit를 사용하여, 비교할 아미노산 서열을 최적으로 정렬하고 유사하거나 동일한 아미노산 잔기를 정의할 수 있다. 기능적 변이체는 모 결합 분자 또는 그의 부분을, 오류-유발 PCR, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발 및 위치-지정 돌연변이유발 및 중쇄 및/또는 경쇄 셔플링(shuffling)을 포함하나 이들에 한정되지 않는 당해 분야에 공지되어 있는 일반 분자 생물학 방법에 의해 변경시킴으로써 수득될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 기능적 변이체는 B형 간염 바이러스에 대한 중화 활성을 갖는다. 중화 활성은 모 결합 분자와 비교하여 동일하거나 또는 더 높거나 더 낮을 수 있다. 본 출원에 사용되는 바와 같이, 용어 (인간) 결합 분자가 사용되는 경우, 이는 또한 (인간) 결합 분자의 기능적 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, 기능적 변이체는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, SEQ ID NO: 7과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 중쇄 가변 서열 및/또는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예를 들어, SEQ ID NO: 8과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 경쇄 가변 서열을 포함하는 결합 분자이다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 의약으로 사용하기 위한 것, 바람직하게는 상이한 혈청- 및 유전형으로부터의 B형 간염 바이러스에 의해 야기되는 B형 간염 감염의 치료적 및/또는 예방적 처치에 사용하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 결합 분자 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 B형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명에 따른 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 결합 분자는 새로 이식된 간의 B형 간염 바이러스의 재감염의 예방을 위해 사용된다.

추가의 양태에서, 본 발명은 면역접합체, 즉, 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 결합 분자를 포함하고, 적어도 하나의 태그, 예를 들어, 특히 검출가능한 모이어티/작용제를 더 포함하는 분자를 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 면역접합체의 혼합물, 또는 본 발명에 따른 적어도 하나의 면역접합체와 다른 분자, 예를 들어, 치료제 또는 다른 결합 분자 또는 면역접합체의 혼합물이 본 발명에서 고려된다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 하나 초과의 태그를 포함할 수 있다. 이들 태그는 동일하거나 또는 서로 구별할 수 있고 결합 분자에 비-공유적으로 연결/접합될 수 있다. 태그(들)는 또한 공유 결합을 통해 인간 결합 분자에 직접적으로 연결/접합될 수 있다. 대안으로, 태그(들)는 하나 이상의 연결 화합물에 의해 결합 분자에 연결/접합될 수 있다. 태그를 결합 분자에 접합하는 기술은 당업자들에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 면역접합체의 태그는 치료제일 수 있지만, 그들은 검출가능한 모이어티/작용제일 수도 있다. 치료 및/또는 예방에 적절한 태그는 독소 또는 그의 기능성 부분, 항생제, 효소, 식균작용 또는 면역 자극을 증진시키는 다른 결합 분자일 수 있다. 검출가능한 작용제를 포함하는 면역접합체를 진단적으로 사용하여, 예를 들어, 대상체가 B형 간염 바이러스로 감염되었는지를 평가하거나, 또는 임상 시험 절차의 일부로서 B형 간염 바이러스 감염의 발생 또는 진행을 모니터링하여, 예를 들어, 제공된 치료 요법의 효능을 결정할 수 있다. 그러나, 그들은 또한 다른 검출 및/또는 분석 및/또는 진단 목적을 위해 사용될 수 있다. 검출가능한 모이어티/작용제는 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 바이오발광 물질, 방사성 물질, 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 검출 및/또는 분석 및/또는 진단 목적을 위해 결합 분자를 표지하는데 사용되는 태그는 특정 검출/분석/진단 기술 및/또는 사용되는 방법, 예를 들어, 특히, (조직) 시료의 면역조직화학적 염색, 유세포계측법, 주사레이저세포계측법, 형광 면역검정, 효소-연결 면역흡착검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA), 생물학적 검정(예를 들어, 식세포작용 검정), 웨스턴 블롯팅 응용 등에 따라 달라진다. 당해 분야에 알려진 검출/분석/진단 기술 및/또는 방법에 적절한 표지는 당업자의 범주 내에 있다.

또한, 본 발명의 인간 결합 분자 또는 면역접합체는 고체 지지체에 부착될 수 있고, 이것은 특히 B형 간염 바이러스 또는 그의 단편의 시험관내 면역검정 또는 그의 정제에 유용하다. 이러한 고체 지지체는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비-평면일 수 있다. 본 발명의 결합 분자는 마커 서열, 예를 들어, 정제를 용이하게 하는 펩티드에 융합될 수 있다. 대안적으로, 항체는 제2 항체에 접합되어, 항체 헤테로접합체(heteroconjugate)를 형성할 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 항원에 접합/부착될 수 있다. 바람직하게는, 이들 항원은 결합 분자-항원 접합체가 투여되는 대상체의 면역계에 의해 인식되는 항원이다. 항원은 동일할 수도 있고, 서로 상이할 수도 있다. 항원과 결합 분자를 부착하기 위한 접합 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 가교제의 사용을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 결합 분자는 B형 간염 바이러스에 결합할 것이며, 결합 분자에 부착된 항원은 접합체에 대하여 강력한 T-세포 공격을 개시할 것이고, 이것은 결국 B형 간염 바이러스의 파괴를 야기할 것이다.

예를 들어 링커를 통해 직접 또는 간접적으로 접합시킴으로써 화학적으로 면역접합체를 생성한 다음, 면역접합체를 본 발명의 결합 분자와 적절한 태그를 포함하는 융합 단백질로서 생성할 수 있다. 융합 단백질은 당해 분야에 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 적절한 태그(들)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 프레임 내의(in frame) 결합 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 작제한 다음, 핵산 분자를 발현시킴으로써 재조합에 의해 생성될 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 적어도 하나의 결합 분자, 기능적 변이체 또는 면역접합체를 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 것이다. 이러한 핵산 분자는 클로닝 목적을 위한 중간체로서, 예를 들어 상기 기술된 바와 같은 친화성 성숙의 과정에 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산 분자는 분리되거나 또는 정제된다.

당업자는 이들 핵산 분자의 기능적 변이체도 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다는 것을 이해할 것이다. 기능적 변이체는, 모 핵산 분자로부터 번역된 것과 동일한 아미노산 서열을 제공하기 위해, 표준 유전 암호를 사용하여 직접적으로 번역될 수 있는 핵산 서열이다.

바람직하게는, 핵산 분자는 상기 기술된 바와 같은 CDR 영역을 포함하는 결합 분자를 암호화한다. 추가의 구현예에서, 핵산 분자는 본 발명의 결합 분자의 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 심지어 6개 모두의 CDR 영역을 포함하는 결합 분자를 암호화한다.

다른 구현예에서, 핵산 분자는 상기 기술된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 결합 분자를 암호화한다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 상기 기술된 바와 같은 가변 경쇄 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 결합 분자를 암호화한다. 본 발명의 결합 분자의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 하기에 제공된다.

본 발명의 다른 양태는 벡터, 즉, 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 핵산 작제물을 제공하는 것이다. 벡터는 플라스미드, 예를 들어, 특히 F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti 등; 코스미드; 파지, 예를 들어, 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, P1, P22, Qβ, T-even, T-odd, T2, T4, T7 등; 식물 바이러스로부터 유도될 수 있다. 벡터는 본 발명의 결합 분자의 클로닝 및/또는 발현에 사용될 수 있고, 유전자 치료법 목적을 위해서도 사용될 수 있다. 하나 이상의 발현-조절 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 벡터도 또한 본 발명에 의해 포괄된다. 벡터의 선택은 수행되는 재조합 절차와 사용되는 숙주에 따라 달라진다. 숙주 세포에서 벡터의 도입은 특히, 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 시행될 수 있다. 벡터는 자율적으로 복제되거나 또는 그들이 통합되는 염색체와 함께 복제될 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 하나 이상의 선택 마커를 함유한다. 마커의 선택은 선택된 숙주 세포에 좌우될 수 있지만, 이것이 당해 분야의 당업자에게 널리 알려진 바와 같이 본 발명에 결정적인 것은 아니다. 그들은 카나마이신, 네오마이신, 푸로마이신, 하이그로마이신, 제오신, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 유전자(HSV-TK), 마우스로부터의 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자(dhfr)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 인간 결합 분자를 분리하기 위해 사용될 수 있는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 상기 기술된 바와 같은 인간 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 벡터도 또한 본 발명에 포괄된다. 이들 단백질 또는 펩티드는 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 말토스 결합 단백질, 금속-결합 폴리히스티딘, 녹색 형광 단백질, 루시퍼라제 및 베타-갈락토시다제를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

하나 이상의 카피의, 상기 언급된 벡터를 함유하는 숙주는 본 발명의 추가의 양태이다. 바람직하게는, 숙주는 숙주 세포이다. 숙주 세포는 포유류, 식물, 곤충, 진균 또는 박테리아 기원의 세포를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 박테리아 세포는 그람(Gram)-양성 박테리아 또는 그람-음성 박테리아, 예를 들어, 에스케리키아(Escherichia) 속의 몇몇 종, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 및 슈도모나스(Pseudomonas)로부터의 세포를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 진균 세포의 군에서, 바람직하게는 효모 세포가 사용된다. 효모에서의 발현은 효모 균주, 예를 들어, 특히, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 사용하여 달성될 수 있다. 추가로, 곤충 세포, 예를 들어, 초파리로부터의 세포 및 Sf9가 숙주 세포로 사용될 수 있다. 그 외에, 숙주 세포는 식물 세포, 예를 들어, 특히, 농작 식물, 예를 들어, 산림 식물로부터의 세포, 또는 음식물 및 원료를 제공하는 식물, 예를 들어, 곡물 또는 약용 식물로부터의 세포, 또는 관상식물로부터의 세포 또는 화초구근작물로부터의 세포일 수 있다. 형질전환(유전자전이) 식물 또는 식물 세포는, 예를 들어 아그로박테리움-매개 유전자 전달, 잎 디스크의 형질전환, 폴리에틸렌 글리콜-유도 DNA 전달에 의한 원형질체 형질전환, 전기천공, 초음파분해, 미세주입법 또는 볼리스틱(bolistic) 유전자 전달과 같은 공지의 방법에 의해 생성된다. 또한, 적절한 발현 시스템은 배큘로바이러스 시스템일 수 있다. 포유류 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, BHK 세포, NSO 세포 또는 바우스(Bowes) 흑색종 세포를 사용한 발현 시스템이 본 발명에 바람직하다. 포유류 세포는 발현된 단백질에 포유류 기원의 천연 분자와 가장 유사한 번역후 변형을 제공한다. 본 발명은 인간에게 투여될 수 있는 분자를 다루기 때문에, 완전 인간 발현 시스템이 특히 바람직할 것이다. 그러므로, 더더욱 바람직하게는, 숙주 세포는 인간 세포이다. 인간 세포의 예는 특히 HeLa, 911, AT1080, A549, 293 및 HEK293T 세포이다. 바람직한 구현예에서, 인간 생성자(producer) 세포는 발현가능한 형식의 아데노바이러스 E1 영역을 암호화하는 핵산 서열의 적어도 하나의 기능성 부분을 포함한다. 더더욱 바람직한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 인간 망막으로부터 유도되고, 아데노바이러스 E1 서열을 포함하는 핵산으로 불멸화되고, 예를 들어, 911 세포 또는 유럽 세포주 은행(European Collection of Cell Cultures, ECACC)(CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britain)에 기탁 번호 96022940으로 1996년 2월 29일자로 기탁되고 상표명 PER.C6^®(PER.C6는 크루셀 홀란드 비.브이.(Crucell Holland B.V.)의 등록 상표이다)으로 시판 중인 세포주이다. 본 출원의 목적을 위하여, "PER.C6" 세포는 기탁 번호 96022940으로 기탁된 세포 또는 조상 세포, 기탁된 세포의 조상 세포로부터의 자손 세포뿐 아니라, 상류 또는 하류 계대물, 및 상기의 것 중 임의의 것의 유도체를 말한다. 숙주 세포에서의 재조합 단백질의 생성은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 대상 단백질의 생성 플랫폼으로서 상표명 PER.C6^®으로 시판되는 세포의 사용은 그 개시내용이 전체가 본 명세서에 참조로서 포함되어 있는 WO 00/63403호에 기술되어 있다.

본 발명에 따른 결합 분자의 생성 방법은 본 발명의 추가의 양태이다. 상기 방법은 a) 본 발명에 따른 숙주를 결합 분자의 발현에 도움이 되는 조건 하에서 배양하는 단계, 및 b) 선택적으로, 발현된 결합 분자를 회수하는 단계를 포함한다. 발현된 결합 분자는 무세포 추출물(cell free extract)로부터 회수될 수 있지만, 바람직하게 그들은 배양 배지로부터 회수된다. 상기 생성 방법은 본 발명의 결합 분자 및/또는 면역접합체의 기능적 변이체를 제조하는데도 사용될 수 있다. 무세포 추출물 또는 배양 배지로부터 단백질, 예를 들어, 결합 분자를 회수하는 방법은 당해 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있다. 상기 기술된 방법으로 수득가능한 결합 분자, 기능적 변이체 및/또는 면역접합체도 또한 본 발명의 일부이다.

대안적으로, 숙주, 예를 들어, 숙주 세포에서의 발현에 이어서, 본 발명의 결합 분자 및 면역접합체는 본 발명에 따른 DNA 분자로부터 유도된 RNA 핵산을 사용하여 무세포 번역 시스템에서 또는 통상의 펩티드 합성기에 의해 합성으로, 생성될 수 있다. 상기 기술된 합성 생성 방법 또는 무세포 번역 시스템에 의해 수득가능한 바와 같은 결합 분자 및 면역접합체도 또한 본 발명의 일부이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 유전자전이, 비-인간 포유류, 예를 들어, 특히 토끼, 염소 또는 소에서도 생성될 수 있고, 예를 들어 그의 모유로 분비될 수 있다.

또 다른 대안적인 구현예에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 유전자전이 비-인간 포유류, 예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 유전자전이 마우스 또는 토끼에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 유전자전이 비-인간 포유류는 상기 기술된 바와 같은 인간 결합 분자의 전체 또는 일부를 암호화하는 인간 중쇄 전이유전자 및 인간 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는다. 유전자전이 비-인간 포유류는 B형 간염 바이러스, HBsAg 또는 그의 단편의 정제된 또는 농축된 제제로 면역화될 수 있다. 비-인간 포유류를 면역화시키기 위한 프로토콜은 당해 분야에 널리 확립되어 있다. 문헌[Using Antibodies: A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York and Current Protocols in Immunology, Edited by: J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., New York]을 참조하며, 그 개시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 면역화 프로토콜은 종종 보조제(adjuvant), 예를 들어, 프로인트(Freund's) 완전 보조제와 프로인트 불완전 보조제를 사용하거나 사용하지 않는 다중의 면역화를 포함하지만, 네이키드 DNA 면역화도 또한 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 결합 분자는 유전자전이 동물로부터 유래된 B 세포, 형질 및/또는 기억 세포에 의해 생성된다. 또 다른 구현예에서, 인간 결합 분자는 상기 기술된 유전자전이 비-인간 포유류로부터 얻어진 B 세포의 불멸화 세포로의 융합에 의해 제조되는 하이브리도마에 의해 생성된다. B 세포, 형질 세포 및 상기 기술된 유전자전이 비-인간 포유류로부터 수득가능한 하이브리도마, 및 상기 기술된 유전자전이 비-인간 포유류, B-세포, 형질 세포 및/또는 기억 세포 및 하이브리도마로부터 수득가능한 바와 같은 인간 결합 분자도 또한 본 발명의 일부이다.

또 다른 추가의 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 결합 분자, 바람직하게는 본 발명에 따른 인간 모노클로널 항체, 그의 적어도 하나의 기능적 변이체, 본 발명에 따른 적어도 하나의 면역접합체 및/또는 그들의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 이에 더하여 조성물은 특히, 안정화 분자, 예를 들어, 알부민 또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 염을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 사용된 염은 결합 분자의 요망되는 생물학적 활성을 유지하고 임의의 요망되지 않는 독성 효과를 부여하지 않는 염이다. 필요에 따라, 본 발명의 인간 결합 분자는 결합 분자를 불활성화할 수 있는 산의 작용 또는 다른 천연 또는 비천연 조건으로부터 그들을 보호하기 위해 물질 내에 또는 그 위에 코팅될 수 있다.

또 다른 추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 수용액, 예를 들어, 염(예를 들어, NaCl 또는 상기 기술된 바와 같은 염), 세제(예를 들어, SDS) 및/또는 다른 적절한 성분을 함유하는 수용액을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 적어도 하나의 결합 분자, 예를 들어, 본 발명의 인간 모노클로널 항체(또는 그의 기능성 단편 또는 변이체), 본 발명에 따른 적어도 하나의 면역접합체, 본 발명에 따른 적어도 하나의 조성물 또는 그들의 조합을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 더 포함한다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 하나의 다른 치료제를 더 포함할 수 있다. 적절한 작용제도 또한 당업자에게 널리 공지되어 있다.

단일의 에피토프에 대해 유도된 모노클로널 항체 산물은 때때로 폴리클로널 항체에 비하여 바이러스의 변이에 더욱 감수성일 수 있다. 이는 도피 돌연변이체의 생성 위험을 증가시킬 수 있다. 별개의 에피토프를 인식하는 2개의 모노클로널 항체의 병용에 의해 이러한 단점을 피할 수 있었다.

따라서, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 하나의 추가의 결합 분자를 포함하며, 다시 말하면, 약제학적 조성물은 결합 분자의 칵테일 또는 혼합물일 수 있다. 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 적어도 2개의 결합 분자 또는 본 발명에 따른 적어도 하나의 결합 분자 및 적어도 하나의 추가의 B형 간염 바이러스 결합 및/또는 중화 분자, 예를 들어, HBsAg 단백질 상의 다른 에피토프에 대해, 또는 B형 간염 바이러스 상에 존재하는 다른 항원 구조에 대해 유도된 다른 항체 및/또는 하나 이상의 다른 병원체를 중화시키는 결합 분자를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 추가의 결합 분자는 동시의 개별 또는 순차 투여를 위해 제형화될 수 있다.

특정 구현예에서, 결합 분자는 병용되는 경우 상승적 중화 활성을 나타낸다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "상승적"은 병용되는 경우 결합 분자의 병용 효과가 개별적으로 사용되는 경우의 그들의 상가적 효과보다 더 큰 것을 의미한다. 상승적으로 작용하는 결합 분자는 B형 간염 바이러스의 동일한 또는 별개의 단편 상의 상이한 구조에 결합할 수 있다. 상승작용을 계산하는 방법은 복합 인덱스에 의한다. 복합 인덱스(CI)의 개념은 문헌[Chou and Talalay (1984)]에 기술되어 있다. 조성물은 예를 들어, 중화 활성을 갖는 하나의 결합 분자 및 하나의 비-중화 결합 분자를 포함할 수 있다. 또한, 비-중화 및 중화 결합 분자는 B형 간염 바이러스의 중화에서 상승적으로 작용할 수 있다.

특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 적어도 하나의 결합 분자 및 적어도 하나의 추가의 결합 분자, 바람직하게는 추가의 B형 간염 바이러스 중화 결합 분자를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물에서 결합 분자는 바람직하게는 상이한 하위유형의 B형 간염 바이러스와 반응할 수 있다. 결합 분자는 높은 결합 효능과 넓은 특이성을 가질 수 있다. 바람직하게는 둘 모두의 결합 분자는 그들이 각각 상이한 하위유형의 B형 간염 바이러스를 중화시킨다는 점에서 교차-중화 분자이다. 또한, 그들은 바람직하게는, 가능한 많은 각각의 상이한 B형 간염 바이러스 하위유형의 균주를 중화시킨다.

특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 다른 예방제 및/또는 치료제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 추가의 치료제 및/또는 예방제는 B형 간염 바이러스 감염 및/또는 이러한 감염으로부터 야기되는 질환을 예방하고/거나 치료할 수 있는 작용제이다. 치료제 및/또는 예방제는 항바이러스제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 작용제는 결합 분자, 소분자, 유기 또는 무기 화합물, 효소, 폴리뉴클레오티드 서열, 항바이러스 펩티드 등일 수 있다. 이들은 본 발명의 결합 분자와 병용하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 "병용하여"는 개별 제형으로서 또는 하나의 단일의 조합된 제형으로서 동시에, 또는 개별 제형으로서 임의의 순서로 순차적 투여 요법에 따름을 의미한다. 실험 단계에 있는 B형 간염 바이러스로의 감염 및/또는 이러한 감염으로부터 야기되는 질환을 예방하고/거나 치료할 수 있는 작용제도 또한 본 발명에 유용한 다른 치료제 및/또는 예방제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 결합 분자 또는 약제학적 조성물은 인간에서 사용하기 전에 적절한 동물 모델 시스템에서 시험될 수 있다. 이러한 동물 모델 시스템은 마우스, 흰담비(ferret) 및 원숭이를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

통상적으로, 약제학적 조성물은 멸균이며 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 한다. 본 발명의 결합 분자, 면역접합체 또는 조성물은 전달시 또는 전달 전에 적절한 약제학적으로 허용되는 부형제 중에서의 재구성을 위해 분말 형태로 존재할 수 있다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 그것의 미리 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 요망되는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.

대안적으로, 본 발명의 결합 분자, 면역접합체 또는 조성물은 용액 중에 존재할 수 있고, 적절한 약제학적으로 허용되는 부형제가 주사가능한 단위 투여형을 제공하기 위해 전달 전 또는 전달 시에 첨가 및/또는 혼합될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 약제학적으로 허용되는 부형제는 높은 약물 농도에 적절하고, 적절한 유동성을 유지할 수 있고, 필요에 따라 흡수를 지연시킬 수 있다.

약제학적 조성물의 최적의 투여 경로의 선택은 조성물 내의 활성 분자의 물리-화학적 특성, 임상적 상황의 긴급성 및 요망되는 치료적 효과에 대한 활성 분자의 혈장 농도의 관계를 포함하는 여러 인자들에 의해 영향을 받을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자는 필요에 따라, 임플란트, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는, 조절된 방출 제형과 같이 그들의 신속한 방출을 막는 담체와 함께 제조될 수 있다. 특히, 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 또한, 결합 분자를 인간 결합 분자의 불활성화를 막는 물질 또는 화합물로 코팅시키거나 또는 그와 함께 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 결합 분자는 적절한 담체, 예를 들어 리포좀 또는 희석제에서 대상체로 투여될 수 있다.

투여 경로는 2개의 주요 카테고리, 경구 및 비경구 투여로 나뉠 수 있다. 바람직한 투여 경로는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내 또는 흡입에 의한 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형은 특히 수성 또는 비수성 등장성 멸균 비독성 주사 또는 주입 용액 또는 현탁액의 형태로 존재할 수 있다. 용액 또는 현탁액은 사용된 투여량 및 농도에서 수여자에 비독성인 작용제, 예를 들어, 1,3-부탄디올, 링거 용액, 행크스(Hank's) 용액, 등장성 염화나트륨 용액, 오일, 지방산, 국소마취제, 보존제, 완충제, 점도 또는 용해도 증가제, 수용성 항산화제, 유용성 항산화제 및 금속 킬레이트화제를 포함할 수 있다.

추가의 양태에서, 결합 분자, 예를 들어, 본 발명의 인간 모노클로널 항체(그의 기능성 단편 및 변이체), 면역접합체, 조성물 또는 약제학적 조성물은 약제 또는 진단제로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 결합 분자, 면역접합체, 조성물 또는 약제학적 조성물을 사용한 B형 간염 바이러스 감염의 진단, 치료 및/또는 예방 방법은 본 발명의 다른 양태이다. 상기 언급된 분자는 특히 B형 간염 바이러스에 의해 야기되는 감염의 진단, 예방, 치료 또는 그들의 조합에 사용될 수 있다. 그들은 B형 간염 바이러스 감염을 앓고 있는 미처치 환자 및 B형 간염 바이러스 감염에 대해 처치된 적이 있거나 처치되는 환자의 치료에 적절하다. 특정 구현예에서, 그들은 이식 후 새로운 간의 B형 간염 바이러스에 의한 재감염의 예방에 적절하다.

상기 언급된 분자 또는 조성물은 진단, 예방 및/또는 치료에 유용한 다른 분자와 함께 사용될 수 있다. 그들은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자, 예를 들어, 인간 모노클로널 항체(또는 그의 기능적 변이체), 면역접합체, 조성물 또는 약제학적 조성물은 (이용가능하다면) B형 간염 바이러스에 대한 백신과 함께 동시 투여될 수 있다. 대안적으로, 백신은 또한 본 발명의 분자를 투여하기 전 또는 후에 투여될 수 있다. 백신 대신에, 항바이러스제도 또한 본 발명의 결합 분자와 함께 사용될 수 있다. 적절한 항바이러스제는 상기 언급되어 있다.

분자는 전형적으로 치료적 유효량 또는 진단적 유효량으로 본 발명의 조성물 및 약제학적 조성물에서 제형화된다. 대안적으로, 그들은 개별적으로 제형화되고 투여될 수 있다. 예를 들어, 다른 분자, 예컨대 항-바이러스제가 전신으로 적용될 수 있는 한편, 본 발명의 결합 분자는 정맥내 적용될 수 있다.

치료는 B형 간염 바이러스에 노출된 환자 그룹에 표적화될 수 있다. 이러한 환자 그룹은 예를 들어, HBV 때문에 간 이식을 겪는 환자, HBsAg 양성 어머니에게서 태어난 유아, HBsAg를 함유하는 혈액에 노출된 의료계 종사자, HBsAg 양성 개체에 대한 성적 및/또는 가정 접촉 때문에 HBV에 노출된 사람, 및 항바이러스 화합물로 처치된 적이 있으나, 부적당한 항바이러스 반응을 보이는 만성 감염 환자를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

투여 요법은 요망되는 최적의 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 적절한 투여량 범위는 예를 들어, 0.01 내지 100 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 0.1 내지 50 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 0.01 내지 15 ㎎/㎏(체중)일 수 있다. 또한, 예를 들어, 단일의 볼루스(bolus)가 투여되거나, 몇몇 분할된 용량이 시간에 걸쳐 투여되거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 나타나는 바와 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 본 발명에 따른 분자 및 조성물은 바람직하게는 멸균이다. 이들 분자와 조성물이 멸균이 되게 하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 진단, 예방 및/또는 치료에 유용한 다른 분자는 본 발명의 결합 분자에 제안되는 바와 유사한 투여 요법으로 투여될 수 있다. 다른 분자가 개별적으로 투여된다면, 그들은 본 발명의 인간 결합 분자 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상의 투여 이전에(예를 들어, 2분, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분, 60분, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 4주 또는 6주 전), 그와 동시에, 또는 그 이후에 (예를 들어, 2분, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분, 60분, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 4주 또는 6주 후)에 환자에게 투여될 수 있다. 정확한 투여 요법은 보통 인간 환자에서의 임상 시험 동안 밝혀진다.

투여된 항체에 대한 수여자 면역 반응이 종종 모노클로널 뮤린(murine), 키메라 또는 인간화 결합 분자의 투여에 의해 발생하는 것보다 실질적으로 더 적을 것이기 때문에, 인간 결합 분자, 및 인간 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 인간에게 생체내 치료제로서 투여될 때 특히 유용하고, 종종 바람직하다.

다른 양태에서, 본 발명은 B형 간염 바이러스 감염의 진단, 예방, 치료 또는 그들의 조합을 위한 의약의 제조에서의 본 발명에 따른 결합 분자, 예를 들어, 중화 인간 모노클로널 항체(그것의 기능성 단편 및 변이체), 면역접합체, 핵산 분자, 조성물 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

그 다음, 본 발명에 따른 적어도 하나의 결합 분자, 예를 들어, 중화 인간 모노클로널 항체(그의 기능성 단편 및 변이체), 적어도 하나의 면역접합체, 적어도 하나의 핵산 분자, 적어도 하나의 조성물, 적어도 하나의 약제학적 조성물, 적어도 하나의 벡터, 적어도 하나의 숙주 또는 그들의 조합을 포함하는 키트도 또한 본 발명의 일부이다. 선택적으로, 본 발명의 키트의 상기 기술된 성분은 적절한 용기(container)에 포장되고, 표기된 질환의 진단, 예방 및/또는 치료를 위해 표지된다. 상기 언급된 성분은 수성, 바람직하게는 멸균, 용액으로서, 또는 재구성을 위한 동결건조, 바람직하게는 멸균 제형으로서 단위 또는 다중-용량 용기에 보관될 수 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있고 멸균 엑세스 포트(access port)를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하주사기용 주사 바늘이 꽂힐 수 있는 마개를 갖는 바이얼 또는 정맥내 용액 주머니일 수 있다). 키트는 약제학적으로 허용되는 완충제를 포함하는 더 많은 용기를 더 포함할 수 있다. 그것은 시판 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 더 포함할 수 있으며, 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 하나 이상의 적절한 숙주용 배양 배지 및 가능하게는 심지어 적어도 하나의 다른 치료제, 예방제 또는 진단제를 포함한다. 키트와 관련된 것은, 치료, 예방 또는 진단 제품의 시판 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서일 수 있고, 이는, 예를 들면, 이러한 치료, 예방 또는 진단 제품의 사용에 관한 적응증(indication), 용도, 투여량, 제조, 투여, 사용 금지 사유 및/또는 경고에 대한 정보를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 결합 분자는 B형 간염 바이러스의 검출을 위한 시험관내 방법에서 진단제로서 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 시료 중의 B형 간염 바이러스 하위유형의 검출 방법에 관한 것이며, 상기 방법은

(a) 본 발명에 따른 결합 분자 및/또는 본 발명에 따른 면역접합체를 사용하여 생물학적 시료 중 B형 간염 바이러스 항원의 수준을 검정하는 단계; 및

(b) 검정된 B형 간염 바이러스 항원의 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계로서, 이에 의해, 대조군 B형 간염 바이러스 항원의 수준에 비한 검정된 B형 간염 바이러스 항원의 수준의 증가가 B형 간염 바이러스 감염을 나타내는 단계를 포함한다.

생물학적 시료는 혈액, 혈청, 대변, 객담, 비인강 흡입물, 기관지폐포세척액, 소변, 조직 또는 (잠재적으로) 감염된 대상체의 다른 생물학적 물질을 포함하나 이들에 한정되지 않는 생물학적 시료, 또는 비-생물학적 시료, 예를 들어, 물, 음료 등일 수 있다. (잠재적으로) 감염된 대상체는 인간 환자일 수 있지만, 또한 B형 간염 바이러스의 전달자라고 의심되는 동물이 본 발명의 인간 결합 분자 또는 면역접합체를 사용하여 바이러스의 존재에 대해 시험될 수 있다. 시료는 우선 검출방법에 더욱 적절하도록 조작될 수 있다. 조작은 특히 바이러스를 함유하는 것으로 의심되고/거나 이를 함유하는 시료를, 바이러스가 항원 성분, 예를 들어, 단백질, (폴리)펩티드 또는 다른 항원 단편으로 분해되도록 하는 방법으로 처리하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 인간 결합 분자 또는 면역접합체는, 인간 결합 분자와 시료 중에 존재할 수 있는 바이러스 또는 그의 항원성 성분 간의 면역 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 시료와 접촉한다. 그 다음, 존재한다면, 시료 중 바이러스의 존재를 나타내는 면역 복합체의 형성은 적절한 방법에 의해 검출되고 측정된다. 이러한 방법은, 특히, 동종 및 이종 결합 면역검정, 예를 들어, 방사성면역검정(RIA), ELISA, 면역형광법, 면역조직화학, FACS, SPR, BLI 및 웨스턴 블롯 분석을 포함한다.

특히 환자 혈청 및 혈액과 혈액-유도 산물의 대규모 임상 스크리닝을 위한 바람직한 검정 기술은 ELISA 및 웨스턴 블롯 기술이다. ELISA 시험이 특히 바람직하다. 이들 검정에서 시약으로 사용하기 위해, 본 발명의 결합 분자 또는 면역접합체는 통상적으로 마이크로타이터 웰의 내표면에 결합된다. 본 발명의 결합 분자 또는 면역접합체는 마이크로타이터 웰에 직접 결합될 수 있다. 그러나, 본 발명의 결합 분자 또는 면역접합체의 웰에 대한 최대 결합은 본 발명의 결합 분자 또는 면역접합체의 첨가 전에 웰을 폴리라이신으로 예비처리하는 것에 의해 달성될 수 있다. 추가로, 본 발명의 결합 분자 또는 면역접합체는 공지의 수단에 의해 웰에 공유 부착될 수 있다. 일반적으로 본 결합 분자 또는 면역접합체는 더 높거나 낮은 양도 사용될 수 있지만, 코팅을 위해 0.01 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 그 다음, 시료를 본 발명의 결합 분자 또는 면역접합체가 코팅된 웰에 첨가한다.

본 발명은 대상체에서의 B형 간염 바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법을 더 제공하며, 이는 치료적 또는 예방적 유효량의, 본 발명의 결합 분자, 면역접합체 및/또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 포유류, 바람직하게는 인간이다.

추가로, 본 발명의 결합 분자를 사용하여, B형 간염 바이러스의 특이적 결합 구조를 확인할 수 있다. 결합 구조는 단백질 및/또는 폴리펩티드 상의 에피토프일 수 있다. 그들은 선형일 수 있고, 구조적 및/또는 입체형태적 에피토프일 수도 있다. 한 구현예에서, 결합 구조는 PEPSCAN 분석 수단에 의해 분석될 수 있다(특히, WO 84/03564, WO 93/09872, 문헌[Slootstra et al. 1996] 참조). 대안적으로, B형 간염 바이러스의 단백질 유래의 펩티드를 포함하는 무작위 펩티드 라이브러리는 본 발명의 결합 분자에 결합할 수 있는 펩티드에 대하여 스크리닝될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예 및 도면에 추가로 예시된다. 실시예는 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로든 제한하고자 하지 않는다.

실시예 1

CR8097 항체의 안정적인 입체형태

몇몇 항체의 패널을 상이한 HBV의 혈청/유전형에 결합하고 이를 중화시키는 그들의 능력에 대하여 시험하였다. 한 항체가 놀랍게도 패널의 나머지를 능가하였다. 그러나, 이러한 항체는 SEC-MALS(크기 배제 크로마토그래피 - 매트릭스 보조 광산란) 분석에 의해 입증되는 불균일 입체형태를 나타내었다. 도 1은 상기 항체가 g3000SW_XL 컬럼으로부터 2개의 개별 피크(굵은 선)로 용리되는 것을 보여주며, 이는 유사한 분자량을 갖는 2개의 모노머 종에 상응한다. 이러한 문제를 다루기 위하여, 항체를 돌연변이시켰다. 도 1에 입증된 바와 같이, 이는 SEC 컬럼으로부터, MALS에 의해 직접 측정시 IgG1에 대하여 예상되는 분자량을 갖는 단일의 균일 피크(가는 선)로 용리되는 안정적인 모노머 항체 제제의 생성을 야기하였다.

따라서, 본 발명에 따른 HBV에 대한 결합 분자(CR8097)가 효율적으로 제조되는 것으로 입증되었으며, 이는 그것이 대규모의 산업적 생성에 적절하게 한다.

실시예 2

FACS에 의해 측정시 CR8097의 결합의 범위

FACS 염색을 HEK293F 세포에서 수행하고, 각각을 특정 HBsAg 혈청형을 발현하는 작제물로 트랜스펙션시켜, 얼마나 많은 HBV의 혈청형이 mAb CR8097에 의해 인식되는지를 평가하였다. 이러한 연구에 사용된 HBsAg 서열을 6000개 초과의 HBV 서열을 포함하는 대형 일본 NIG HBV 데이터베이스로부터 선택하였다(접속을 위하여, http://s2as02.genes.nig.ac.jp/ 참조). 균주 선택을 데이터베이스 내의 모든 HBsAg 서열의 혈청형 분류와, 이후의 잔기 100에서 207까지 계속되는 HBsAg의 세포외 루프 서열에 기초한 각 혈청형(현재 11개의 혈청형이 정의됨)에 대한 가장 주요한 균주의 계산에 의해 수행하였다. 다음으로, 각 혈청형에 대하여, 가장 주요한 균주에 근접한 균주를 선택하였다(표 1 참조). 이러한 방식으로, 가장 대표적인 HBV 혈청형을 선택할 수 있었다. 또한, 각각의 선택된 혈청형의 유전형을 결정하고(가능한 경우), 2개의 주요 혈청형(ayw1 및 adw2)에 대하여, 추가의 유전형을 선택하여, 가능한 많은 유전형을 포함시켰다(표 1 참조). 총 15개의 상이한 HBsAg 서열을 선택하고, 합성하고, 발현 벡터로 클로닝하였다.

세포내 FACS 염색을 트랜스펙션 48시간 후에 세포의 고정(PBS 중 3% 파라포름알데히드를 사용하여 실온에서 15분 인큐베이션), 세포의 투과화(PBS 중 0.1% 트리톤 + 1% BSA를 사용하여 실온에서 30분 인큐베이션) 후에 세포를 블로킹 완충제(0.1% Tween-20 및 1% BSA가 있는 PBS) 중 4 ㎍/㎖의 CR8097 또는 관련없는 IgG와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킴으로써 수행하였다. 실온에서 1시간 동안 알렉사플루오르(Alexafluor) 647 표지 염소-항-인간 항체(블로킹 완충제 중에 1000배 희석)와 인큐베이션시킴으로써 CR8097 또는 관련없는 IgG의 검출을 수행하였다. FACS 분석을 음성 대조군으로서 오직 2차 항체와 인큐베이션시킨 트랜스펙션된 세포를 사용하여, 비디 바이오사이언스(BD Bioscience)로부터의 칸토(Canto) II에서 수행하였다.

도 2에서 결합 데이터는 CR8097이 HBsAg 하위유형 adw2(유전형 C)를 인식하지 않는 예를 들어, PCT/IL97/00183호 및 PCT/IL97/00184호에서 종래 분야에 개시된 결합 분자와 대조적으로, 모든 HBV의 주요 하위유형을 인식함을 보여준다(문헌[Eren et al., 2000, Hepatology 32, 588]).

실시예 3

HBsAg 도피 돌연변이체로의 CR8097의 결합

HBV 감염의 치료 또는 예방을 위해 몇몇 옵션이 이용가능하며, 이는 다른 것들 중 특히, 재조합 HBsAg를 사용한 백신접종, HBIg를 사용한 면역요법 또는 중합효소 억제제를 사용한 치료이다. 이들 치료는 각각 HBsAg 단백질에서 돌연변이를 유도할 수 있으며, HBV 도피 메카니즘에 대하여 필수적이거나, 이들 돌연변이는 중첩 중합효소 유전자 내의 돌연변이의 결과로서 도입된다(검토를 위하여 문헌[Sheldon et al. JAC (2008) p766-768] 참조). 이러한 도피 돌연변이체가 CR8097의 결합에 영향을 미칠지를 평가하기 위하여, HBsAg 돌연변이체의 패널을 HEK293F 세포에서 재조합에 의해 발현시키고, 세포내 FACS 분석으로 이어졌다. 이러한 분석을 위하여, 가장 흔하게 관찰되는 HBsAg 도피 돌연변이(표 2 참조)를 선택하고, ayw 및 adr인 HBsAg의 2개의 상이한 야생형 서열에 도입하였다. 야생형 서열은 도 3에 나타나 있다. 세포내 FACS 염색을 트랜스펙션 48시간 후에 세포의 고정(PBS 중 3% 파라포름알데히드를 사용하여 실온에서 15분 인큐베이션), 세포의 투과화(PBS 중 0.1% 트리톤 + 1% BSA를 사용하여 실온에서 30분 인큐베이션) 후에 세포를 블로킹 완충제(0.1% Tween-20 및 1% BSA가 있는 PBS) 중 4 ㎍/㎖의 CR8097 또는 관련없는 IgG와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킴으로써 수행하였다. 실온에서 1시간 동안 알렉사플루오르 647 표지 염소-항-인간 항체(블로킹 완충제 중에 1000배 희석)와 인큐베이션시킴으로써 CR8097 또는 관련없는 IgG의 검출을 수행하였다. FACS 분석을 음성 대조군으로서 오직 2차 항체와 인큐베이션시킨 트랜스펙션된 세포를 사용하여, 비디 바이오사이언스로부터의 칸토 II에서 수행하였다(도 4).

데이터는 모든 생성된 HBsAg 돌연변이체가 CR8097에 의해 인식됨을 보여준다(도 4).

실시예 4

시험관내 중화 검정에 의해 측정시 HBV 특이적 IgG의 중화 효능

항-HBV 모노클로널 항체의 시험관내 중화 효능을 인간 간이 이식된 후에 혈청형 adr의 B형 간염 바이러스(유전형 C) 및 혈청형 ayw3의 B형 간염 바이러스(유전형 D)가 감염된 마우스 유래의 혈청을 사용하여 시험관내 중화 검정에서 평가하였다. 이러한 검정에서, 항체 희석액을 먼저, 고정된 양의 HBV를 함유하는 혈청과 인큐베이션시키고, 그 후에, 바이러스가 분화된 HepaRG 세포(HBV 감염에 감수성인 인간 간세포주)를 감염시키게 하고, 이를 24-웰 플레이트에서 배양하였다. 감염 11일 후에, 시판 ELISA를 사용하여 HBsAg 발현 수준을 측정함으로써 감염성을 검출하였다. 측정된 OD 값을 4-파라미터 핏(parameter fit)을 사용하여 핏팅시키고, 그로부터 IC₅₀ 값을 계산하였다(IC₅₀ 값은 50%의 중화가 관찰되는 농도를 나타내는 것을 주목한다).

이들 데이터(도 5 및 도 6 참조)로부터, CR8097의 효능이 시험된 HBIg 뱃치(batch)보다 적어도 100배 더 높은 것이 명백하다.

실시예 5

항-HBV 특이적 IgG의 생체내 효능을 PXB 마우스®를 사용하여 평가하였다. 인간 간 세포를 알부민 증진제/프로모터-추진 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 유전자전이/중증 합병성 면역결핍 질병(uPA/SCID) 수여자 마우스에 이식시킨 다음, B형 간염 바이러스(유전형 C, 혈청형 adr)로 감염시킴으로써 이들 마우스를 생성하였다. HBV 접종 1일 전에, 각 마우스의 그룹에 IgG를 정맥내 투여하였다. 0일에, 마우스에 1×10⁵ 카피의 HBV를 정맥내 접종하였다. 대조군 마우스에 오직 HBV만을 접종하고, IgG를 제공하지 않았다. Nabi로부터의 Nabi-HB를 HBIg의 공급원으로 사용하였는데, 이는 이러한 HBIg가 HBV(유전형 C, 혈청형 adr)에 대하여 가장 높은 시험관내 중화 효능을 보이기 때문이다.

마우스 혈청에서 HBV 역가(Q-PCR에 의해 HBV 게놈 당량/㎖)를 측정함으로써 HBV 감염을 주마다 모니터링하였다. IgG 용량의 보호 효과를 카플란-마이어(Kaplan-Meijer) 곡선으로부터 계산된 시간-대-감염으로 표현하였다. 그룹의 50%에서 HBV 역가가 4000 HBV 카피/㎖인 검출 한계보다 더 높다면, 마우스는 더이상 보호되지 않았다. 대조군에서, 오직 2주 동안만 보호를 얻었다. 가장 높은 용량의 CR8097(0.2 및 0.02 ㎎/㎏)이 제공되는 경우, 10주 넘게 보호를 얻었다. 0.2 ㎎/㎏ HBIg의 보호는 3주인 0.002 ㎎/㎏ CR8097의 보호와 유사하며(도 7 참조), 이는 CR8097의 보호 효능이 HBIg보다 약 100배 더 높음을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Crucell Holland B.V. <120> Human binding molecules capable of binding to and neutralizing Hepatitis B viruses and uses thereof <130> 0208 EP P00 PRI <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CR8097 VH CDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CR8097 VH CDR2 <400> 2 Ile Ser Thr Asp Gly Met Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CR8097 VH CDR3 <400> 3 Val Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Gly Ser Gly Ser Leu Asn Phe 1 5 10 15 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CR8097 VL CDR1 <400> 4 Asn Ser Asp Ile Gly Asn Tyr Asp Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR8097 VL CDR2 <400> 5 Asp Val Ser 1 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CR8097 VL CDR3 <400> 6 Ser Ser Tyr Ala Gly Thr Phe Thr Tyr Val Val 1 5 10 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CR8097 VH <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Thr Asp Gly Met Ser Thr Ser Tyr Ala Glu Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Gly Ser Gly Ser Leu Asn Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CR8097 VL <400> 8 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Ile Gly Asn Tyr 20 25 30 Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Asp Val Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ser Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Thr 85 90 95 Phe Thr Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 9 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CR8097 HC <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Asn 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Thr Asp Gly Met Ser Thr Ser Tyr Ala Glu Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Gly Ser Gly Ser Leu Asn Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 10 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CR8097 LC <400> 10 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Ile Gly Asn Tyr 20 25 30 Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Asp Val Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ser Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Thr 85 90 95 Phe Thr Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 145 150 155 160 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 180 185 190 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 195 200 205 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 11 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBsAg ayw_wt <400> 11 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys 35 40 45 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly 100 105 110 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 12 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBsAg adr_wt <400> 12 Met Glu Ser Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 13 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus seq. Fig.3 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (45)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (110)..(110) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (113)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (122)..(122) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (125)..(127) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (134)..(134) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (159)..(160) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (168)..(168) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (207)..(207) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 13 Met Glu Xaa Xaa Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Xaa Xaa Xaa Cys 35 40 45 Xaa Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Xaa Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Xaa Pro Gly 100 105 110 Xaa Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Xaa Thr Cys Xaa Xaa Xaa Ala 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Xaa Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Xaa Xaa 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Xaa Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Xaa Ile 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225

Claims (13)

1. SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
   SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
   SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
   SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
   SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
   SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 결합 분자.
2. 제1항에 있어서, 결합 분자가 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결합 분자가 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 결합 분자.
4. B형 간염 바이러스 단백질 상의 에피토프와의 결합을 위해 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자와 면역특이적으로 경쟁하는 결합 분자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자가 시험관내(in vitro) 검정에서 B형 간염 바이러스를 중화시키는 결합 분자.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자가 인간 모노클로널 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 결합 분자.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 결합 분자를 포함하며, 적어도 하나의 태그(tag)를 더 포함하는 면역접합체(immunoconjugate).
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자를 암호화하는 핵산 분자.
9. B형 간염 바이러스에 의해 야기되는 B형 감염의 의약(medicament)으로 사용하기 위한, 바람직하게는 그의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자, 제7항에 따른 면역접합체 및/또는 제8항에 따른 핵산 분자.
10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자의 기능적 변이체.
11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자, 및/또는 제7항에 따른 면역접합체, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
12. 제11항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자 및 추가의 B형 간염 중화 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물.
13. (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자 및/또는 제7항에 따른 면역접합체를 사용하여 생물학적 시료 중 B형 간염 바이러스 항원의 수준을 검정하는 단계; 및
    (b) 검정된 B형 간염 바이러스 항원의 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계로서, 대조군 B형 간염 바이러스 항원의 수준에 비한 검정된 B형 간염 바이러스 항원의 수준의 증가가 B형 간염 바이러스 감염을 나타내는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염의 검출 방법.

Images