CN104662041A - 能够结合到并且中和b型肝炎病毒的人类结合分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及结合到B型肝炎病毒并且针对此类B型肝炎病毒具有广泛中和活性的结合分子,诸如人类单克隆抗体。本发明进一步提供了编码这些结合分子的核酸分子,和包含这些结合分子的组合物。这些结合分子可以用于对B型肝炎进行诊断、预防和/或治疗。
Description
发明领域
本发明涉及医学。本发明具体来说涉及能够结合到并且中和B型肝炎病毒的人类结合分子,例如单克隆抗体或其抗原结合片段。另外,本发明涉及对由B型肝炎病毒引起的感染进行诊断、预防和/或治疗。
发明背景
B型肝炎病毒(HBV)在世界范围内已经感染了多于20亿人并且造成暂时性和慢性肝病。尽管在1982年引入一种针对HBV的疫苗,但在全球范围内3.5亿人受慢性感染。慢性感染的风险与患者在感染时的年龄相关。感染在约90%的在生下来后第一年期间感染的婴儿中持续。相比之下,感染仅在1%-5%的作为成人感染的患者中持续。
HBV的活性复制的特征在于肝损伤,最可能是由于免疫反应性。慢性HBV感染可以导致肝癌和死亡。约25%的在儿童时期变得慢性感染的成人死于HBV相关的肝硬化或癌症,每年估计有500000-120万人。
对HBV的免疫反应由用于消除HBV感染的细胞的细胞免疫反应以及促进循环病毒颗粒清除的体液抗体反应两者组成。引起对中和HBV抗体进行诱发的主要病毒组分是小HBV表面抗原(HBsAg)。
所有重组疫苗都含有HBsAg并且这些疫苗的功效高(在多于95%的婴儿、儿童以及年轻人中进行保护)并且长效(>20年)。另外,所有疫苗都引发跨越血清型的免疫性。HBsAg由226个氨基酸组成,有一个N-键联的糖基化位点。循环HBV病毒株的比较已经显示,不同HBsAg序列之间存在高水平均一性。
市场上存在用于治疗慢性HBV感染的不同抗病毒产品。然而,可用的抗病毒药物中无一者可以清除感染;它们仅抑制复制因此最小化肝损伤。因此,肝移植是具有HBV末期肝病的患者的唯一治疗选择。在美国估计HBV患病的肝相当于所有肝移植的5%,而在中国所有肝移植中有约85%是由于HBV感染。
为防止新的肝在肝移植之后再感染,当前用多克隆HBV免疫球蛋白(HBIg)与一种抗病毒剂组合治疗患者。多克隆HBIg由来自免疫的供体的汇集的血浆制备并且还或者单独或者与一种疫苗组合用作暴露后预防。HBIg制剂经指示用于治疗急性暴露于含有HBsAg的血液、HBsAg阳性母亲所生婴儿的围产期暴露、性暴露于HBsAg阳性人员以及家庭暴露于具有急性B型肝炎病毒感染的人员。因为存在一些与HBIg相关的限制,如可用性、制品成本、大注射体积、不良事件以及血液传播感染的风险,所以对于一种针对HBV的单克隆抗体产品存在医疗需要。
先前已经描述了数种针对HBV的单克隆抗体。PCT专利申请PCT/IL97/00183和PCT/IL97/00184分别披露了针对HBV表面抗原的人类单克隆抗体mAb 17.1.41和mAb 19.79.5。这些抗体结合到不同的HBV亚型。然而,亚型adw2(C基因型)的HBsAg不被所述抗体识别(埃伦(Eren)等人,2000,《肝脏病学》(Hepatology)32,588)。C基因型在中国非常普遍,大多数慢性感染的个体属于其中。
PCT专利申请WO 2009069917披露了一种能够中和B型肝炎病毒的人类抗体,用于预防和治疗B型肝炎感染。尚未证实此抗体结合到HBV的所有主要血清型和基因型。另外,迄今披露的抗体中无一者已经显示可中和大多数通常已知的疫苗诱导性和抗病毒诱导性逃逸突变体。
因此,在本领域中需要除了可能的逃逸突变体之外结合并且中和HBV的广泛的血清型和基因型并且可以大工业规模制造的抗体。
发明内容
本发明提供了能够特异性结合到并且中和B型肝炎病毒(HBV)的结合分子、具体来说是人类结合分子。本发明提供了结合到HBV的主要血清型和基因型、由此提供广泛保护的结合分子。另外,根据本发明的结合分子结合到所有主要疫苗诱导性和抗病毒诱导性HBV逃逸突变体。最终,本发明的针对HBV的结合分子可以大规模高效制造,这使其适于工业生产。
根据本发明的结合分子包含:一个重链CDR1,包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列;一个重链CDR2,包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;一个重链CDR3,包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;一个轻链CDR1,包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;一个轻链CDR2,包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;以及一个轻链CDR3,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在某一实施例中,本发明的结合分子包含:一个重链可变区,包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列;和一个轻链可变区,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在另一个实施例中,本发明的结合分子包含:一条重链,包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列;和一条轻链,包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
本发明还涉及结合分子,这些结合分子与一种根据本发明的结合分子为结合到一种B型肝炎病毒蛋白质上的一个表位而特异性竞争。
优选地,根据本发明的结合分子是人类单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及免疫偶联物,包含至少一种根据本发明的结合分子并且进一步包含至少一种标签。
本发明的另一个方面涉及核酸分子,编码一种根据本发明的结合分子。
本发明的结合分子、免疫偶联物和/或核酸分子适用作一种药剂,优选地用于对由一种B型肝炎病毒亚型引起的一种B型肝炎感染进行诊断、预防和/或治疗。
本发明还涉及一种根据本发明的一种结合分子的功能变异体。
本发明还涉及药物组合物,包含一种根据本发明的结合分子和/或一种免疫偶联物;和一种药学上可接受的载剂或赋形剂。
本发明还涉及药物组合物,包含一种根据本发明的结合分子;和一种额外B型肝炎中和结合分子。
本发明的另一个方面涉及一种检测一种B型肝炎病毒感染的方法,包括:
(a)使用根据本发明的一种结合分子和/或一种免疫偶联物来分析一种生物样品中B型肝炎病毒抗原的水平;并且
(b)将B型肝炎病毒抗原的该分析的水平与一个对照水平比较,其中B型肝炎病毒抗原的该分析的水平与该B型肝炎病毒抗原的该对照水平相比的一个增加指示一种B型肝炎病毒感染。
附图说明
图1CR8096(具有分开的峰的粗线)和CR8097(具有单一峰的细线)的HP-SEC特征曲线以及如通过MALS检测所测定的分子量的分配的叠加。
图2CR8097与各自用代表HBV的主要血清型/基因型的一种HBsAg表达构建体转染的HEK293F细胞的细胞内FACS结合的概述。将空白对照(Mock)HEK293F细胞用一种GFP表达构建体转染。
图3HBsAg的两种不同亚型的多肽序列的概述:ayw3(SEQ ID NO:11)和adr(SEQ ID NO:12)。共有序列与SEQ ID NO:13一致。
图4CR8097与各自用代表通常观察到的HBsAg逃逸突变体的一种HBsAg表达构建体转染的HEK293F细胞的细胞内FACS结合的概述。将空白对照HEK293F细胞用一种GFP表达构建体转染。
图5CR8097对HBV C基因型,adr血清型的体外中和效能。
图6CR8097对HBV D基因型,ayw3血清型的体外中和效能。
图7CR8097对HBV C基因型,adr血清型的预防性体内功效。
发明说明
以下给出如本发明中所用的术语的定义。
如在此所用,术语“包括(included)”或“包括着(including)”被视为后面有措辞“但不限于”。
如在此所用,术语“结合分子”是指包括单克隆抗体(诸如嵌合、人类化或人类单克隆抗体)的一种完整免疫球蛋白;或包含与该完整免疫球蛋白为特异性结合到该免疫球蛋白的结合伴侣而竞争的一种免疫球蛋白的片段的一种抗原结合和/或可变域。无关于结构,抗原结合片段与由该完整免疫球蛋白识别的相同抗原结合。一种抗原结合片段可以包含一种肽或多肽,该肽或多肽包括该结合分子的氨基酸序列的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250个连续氨基酸残基的一种氨基酸序列。
如在此所用,术语“结合分子”包括本领域中已知的所有免疫球蛋白类别和子类。取决于其重链的恒定域的氨基酸序列,结合分子可以被分成五种主要完整抗体类别:IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM,并且这些类别中的数种可以进一步被分成子类,例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4。
抗原结合片段尤其包括Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、含有一种免疫球蛋白的足以赋予(多)肽以特异性抗原结合的至少一个片段的(多)肽等。以上片段可以合成地或通过使完整免疫球蛋白酶促或化学裂解而产生,或它们可以通过重组DNA技术来遗传工程化。产生方法在本领域中是熟知的并且描述于例如《抗体:实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual),E.哈洛(E.Harlow)和D莱恩(D,Lane)编(1988),冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory),冷泉港(Cold SpringHarbor),纽约(New York)中,该文献通过引用结合在此。一种结合分子或其抗原结合片段可以具有一个或多个结合位点。如果存在多于一个结合位点,那么这些结合位点可以与彼此相同或它们可以是不同的。
结合分子可以是一种裸的或未偶联的结合分子,但也可以是一种免疫偶联物的一部分。一种裸的或未偶联的结合分子意欲指与一种效应子部分或标签(尤其诸如一种有毒物质、一种放射性物质、一种脂质体、一种酶)不偶联而可操作地连接或以其他方式物理或功能上相关的一种结合分子。应理解,裸的或未偶联的结合分子并不排除不是通过连接一种效应子部分或标签,而是已经被稳定化、多聚化、人类化或以任何其他方式操纵的结合分子。因此,所有翻译后修饰的裸的并且未偶联的结合分子包括在此,包括其中修饰在产生天然结合分子的细胞环境中通过一种产生重组结合分子的细胞进行,并且在初始结合分子制备之后通过人力引入。当然,术语裸的或未偶联的结合分子不排除该结合分子在向身体给予之后与效应细胞和/或分子形成功能相关性的能力,因为此类相互作用中的一些为发挥一种生物效应所需。缺乏相关的效应子基团或标签因此应用于体外、而非体内裸的或未偶联的结合分子的定义。
如在此所用,术语“生物样品”涵盖多种样品类型,包括生物来源的血液和其他液体样品、固体组织样品(诸如一种活检样本)或组织培养物或来源于其的细胞及其子代。该术语还包括在其采购之后已经以任何方式,诸如通过用试剂处理、溶解或针对某些组分(诸如蛋白质或多核苷酸)富集而操纵的样品。该术语涵盖获自任何物种的各种类型的临床样品,并且还包括培养物中的细胞、细胞上清液以及细胞溶解物。
如在此所用,术语“互补决定区”(CDR)意指结合分子(诸如免疫球蛋白)的可变区内通常在很大程度上促成在形状和电荷分布方面与抗原上所识别的表位互补的抗原结合位点的序列。CDR区可以对蛋白质或蛋白质片段的线性表位、非连续表位或构象表位具有特异性,这些表位或者以其天然构象存在于蛋白质上,或者在一些情况下以例如通过溶解于SDS中而变性的形式存在于蛋白质上。表位还可以由蛋白质的翻译后修饰组成。
如在此所用,术语“缺失”表示或者氨基酸或者核苷酸序列的一种变化,其中与参考物(通常是天然存在的分子)相比分别有一个或多个氨基酸或核苷酸残基不存在。
如在此所用,术语“调节表达的核酸序列”是指为一种具体宿主生物体中一种可操作地连接的编码序列的表达所需和/或影响该表达的多核苷酸序列。调节表达的核酸序列可以是在所选宿主生物体中展示出活性的任何核酸序列并且可以来源于编码与宿主生物体或者同源或者异源的蛋白质的基因,这些调节表达的核酸序列尤其是诸如适当转录起始、终止、启动子、增强子序列;阻遏子或活化子序列;高效RNA处理信号,诸如拼接和聚腺苷酸化信号;稳定化细胞质mRNA的序列;增加翻译效率的序列(例如核糖体结合位点);增加蛋白质稳定性的序列;以及当所希望时增加蛋白质分泌的序列。调节表达的序列的鉴别和采用对于本领域的普通技术人员是常规的。
如在此所用,术语“功能变异体”是指包含与参考核酸分子或结合分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比有一个或多个核苷酸和/或氨基酸变化的一种核苷酸和/或氨基酸序列的一种核酸分子或结合分子。一种根据本发明的结合分子的一种功能变异体能够与参考结合分子为结合到结合伴侣(即B型肝炎病毒)而竞争。换句话说,参考结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰并不显著影响或改变由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的结合分子的结合特征,即结合分子仍能够识别并且结合其标靶。功能变异体可以具有保守序列修饰,包括核苷酸和氨基酸取代、添加以及缺失。这些修饰可以通过本领域中已知的标准技术(诸如定点诱变和随机PCR介导的诱变)引入,并且可以包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。
保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有类似结构或化学性质的一种氨基酸残基置换的取代。本领域中已经界定了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β支链的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)的氨基酸。熟练的业内人士将清楚,还可以采用除了以上所用的分类的氨基酸残基家族分类。此外,一种变异体可以具有非保守氨基酸取代,例如用具有不同结构或化学性质的一种氨基酸残基置换一种氨基酸。类似微小变异还可以包括氨基酸缺失或插入或两者。确定哪些氨基酸残基可以在不消除免疫学活性的情况下被取代、插入或缺失的指导可以使用在领域中熟知的计算机程序找到。
一种核苷酸序列的一种突变可以是一个基因座处进行的一种单一变化(一种点突变),诸如转换或颠换突变;或可替代地,多个核苷酸可以在一个单一基因座处插入、缺失或改变。另外,一个或多个变化可以在一种核苷酸序列内的任何数目的基因座处进行。突变可以通过本领域中已知的任何适合方法进行。
术语B型肝炎病毒“血清型”具体来说包括某一血清型内的所有个体B型肝炎病毒株。一种HBV病毒株的血清型分类是经由一种算法/决策树基于HBsAg分子中的有限数目的氨基酸残基(珀迪(Purdy)等人2007《国际病毒学》(Intervirology))。迄今已经描述了十一种HBV血清型,是adw1、adw2、adw3、adw4q+、adw4q-、adrq+、adrq-、ayw1、ayw2、ayw3、ayw4。血清型也可以被称为“亚型”。因此,如在此所用,术语“血清型”和“亚型”能可互换地使用。
术语HBV“基因型”具体来说包括每种基因型内的所有个别HBV病毒株。HBV基因型的分类是基于整个HBV基因组的系统发生相关性。某一基因型内的HBV基因组按照定义展示在一个系统发生进化枝内小于4%的序列趋异和大于8%的与超-进化枝(extra-clade)序列的趋异。迄今已经界定了九种HBV基因型,表示为A到I。
如在此关于本发明的结合分子所用,术语“中和”是指一种结合分子抑制一种B型肝炎病毒体外和/或在一个受试者内复制,无关于实现中和的机制。因此,中和可以例如通过抑制病毒与细胞表面的附着或粘着或通过抑制病毒与细胞膜在病毒与标靶细胞附着之后的融合或通过抑制病毒从感染的细胞释放等来实现。
如在此关于本发明的结合分子所用,术语“进行交叉中和着(cross-neutralizing)”或“交叉中和(cross-neutralization)”是指本发明的结合分子中和B型肝炎病毒的不同血清型和/或基因型的能力。
如在此所用,术语“宿主”意欲指已经引入了一种载体(诸如一种克隆载体或一种表达载体)的一种生物体或一种细胞。生物体或细胞可以是原核或真核的。优选地,宿主是被分离的宿主细胞,例如培养物中的宿主细胞。术语“宿主细胞”仅表示这些细胞被修饰用于(过)表达本发明的结合分子并且包括最初表达这些结合分子的B细胞并且这些细胞已经通过永生化、扩增、增强表达等被修饰以过表达结合分子。应理解,术语宿主意欲不仅指具体主题生物体或细胞,而且还指此类生物体或细胞的子代。因为某些修饰可以由于或者突变或者环境影响而在后代中发生,所以此类子代可以实际上与亲本生物体或细胞不相同,但仍包括在如在此所用的术语“宿主”的范围内。
如在此所定义,术语“人类”当应用于结合分子时,是指或者直接来源于一个人类或者基于一种人类生殖系序列的分子。当一种结合分子来源于或基于一种人类序列并且接着被修饰时,它仍被视为如说明书通篇所用的人类。换句话说,术语人类当应用于结合分子时意欲包括具有来源于人类生殖系免疫球蛋白序列或基于存在于一种人类或人类淋巴细胞中的可变或恒定区并且在某一形式上被修饰的可变和恒定区的结合分子。因此,人类结合分子可以包括不由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基,包含取代和/或缺失(例如通过例如体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
如在此所用,“基于”是指以下情况:一种核酸序列可以精确地由一种模板复制或具有微小突变,诸如通过易错PCR方法或合成地进行,精确地匹配该模板或具有微小修饰。
术语“插入”(也称为术语“添加”)表示一种氨基酸或核苷酸序列中与亲本序列相比分别导致一个或多个氨基酸或核苷酸残基添加的一种变化。
如在此所定义,术语“被分离”当应用于结合分子时,是指结合分子实质上不含其他蛋白质或多肽,具体来说不含具有不同抗原特异性的其他结合分子,并且还实质上不含其他细胞物质和/或化学品。举例来说,当结合分子重组地产生时,它们优选地实质上不含培养基组分,并且当结合分子通过化学合成产生时,它们优选地实质上不含化学前体或其他化学品,即它们与蛋白质合成中所涉及的化学前体或其他化学品分离。如在此所定义,术语“被分离”当应用于编码结合分子的核酸分子时,意欲指编码结合分子的核苷酸序列不含其他核苷酸序列、具体来说编码结合其他结合伴侣的结合分子的核苷酸序列的核酸分子。此外,术语“被分离”是指实质上与在其天然宿主中天然伴随天然核酸分子的其他细胞组分(例如天然核酸分子所天然相关的核糖体、聚合酶或基因组序列)分离的核酸分子。此外,“被分离”的核酸分子(诸如cDNA分子)可以实质上不含其他细胞物质或培养基(当通过重组技术产生时),或实质上不含化学前体或其他化学品(当化学合成时)。
如在此所用,术语“单克隆抗体”是指具有单一特异性的抗体分子的一种制剂。一种单克隆抗体对于一种具体表位呈现一种单一结合特异性和亲和力。因此,术语“人类单克隆抗体”是指呈现一种单一结合特异性的一种抗体,该抗体具有来源于或基于人类生殖系免疫球蛋白序列或来源于完全合成序列的可变和恒定区。制备单克隆抗体的方法与结合特异性不相关。
如在此所用,术语“天然存在的”在应用于一种对象时,是指一种对象或化合物可以见于自然界中的事实。举例来说,可以从自然界中来源中分离并且尚未由人类在实验室中有意修饰的存在于一种生物体中的一种多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
如本发明中所用,术语“核酸分子”是指一种聚合形式的核苷酸,并且包括RNA、cDNA、基因组DNA的正义和反义链两者以及以上的合成形式和混合聚合物。一种核苷酸是指一种核糖核苷酸、脱氧核苷酸或一种被修饰形式的任一类型的核苷酸。该术语还包括单和双链形式的DNA。另外,一种多核苷酸可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键而连接在一起的天然存在的和被修饰的核苷酸中的任一者或两者。核酸分子可以被化学或生物化学修饰,或可以含有非天然或衍生化的核苷酸碱基,如本领域的技术人员将容易了解。此类修饰包括例如标记;甲基化;用一种类似物取代天然存在的核苷酸中的一者或多者;核苷酸间修饰,诸如不带电的键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等),带电的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等);侧位部分(例如多肽);嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等);螯合剂;烷基化剂;以及被修饰的键(例如α异头核酸等)。以上术语还意欲包括任何拓扑构象,包括单链的、双链的、部分二倍的、三倍的、发夹的、圆形的以及挂锁的构象。还包括在其经由氢键和其他化学相互作用而结合到一种指定序列的能力方面模拟多核苷酸的合成分子。此类分子是本领域中已知的并且包括例如肽键取代分子主链中的磷酸酯键的那些。除非另外规定,否则对一种核酸序列的提及涵盖其互补序列。因此,对具有一种具体序列的一种核酸分子的提及应理解为涵盖其互补链与其互补序列。互补链还可用于例如反义疗法、杂交探针以及PCR引物。
术语“可操作地连接”是指两个或更多个核酸序列元件通常物理地连接并且与彼此呈一种功能关系。举例来说,如果一种启动子能够起始或调节一种编码序列的转录或表达,那么该启动子可操作地连接到一种编码序列,在该情况下该编码序列应被理解为“在”该启动子“的控制下”。
“药学上可接受的赋形剂”意指与一种活性分子(诸如一种药物、药剂或结合分子)组合用于制备一种合意或适宜的剂型的任何惰性物质。“药学上可接受的赋形剂”是在所用剂量和浓度下对接受者无毒并且与包含药物、药剂或结合分子的配制品的其他成分相容的一种赋形剂。药学上可接受的赋形剂广泛适用并且在本领域中是已知的。
如在此关于一种结合分子(例如一种抗体)与其结合伴侣(例如一种抗原)的相互作用所用,术语“特异性结合”意指相互作用取决于该结合伴侣上一种具体结构(例如一种抗原决定子或表位)的存在。换句话说,即使当该结合伴侣存在于其他分子或生物体的一种混合物中时,该抗体也优先结合或识别该结合伴侣。结合可以由共价或非共价相互作用或两者的组合介导。又换句话说,术语“特异性结合”意指免疫特异性结合到一种抗原决定子或表位和非免疫特异性结合到其他抗原决定子或表位。特异性结合到一种抗原的一种结合分子可以在如通过终点分析(诸如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA))或无标记技术(诸如SPR、BLI或本领域中已知的其他分析)所测定更低的亲和力下结合到其他肽或多肽。免疫特异性结合到一种抗原的结合分子或其片段可以与携带相同表位的相关抗原具有交叉反应性。优选地,免疫特异性结合到一种抗原的结合分子或其片段与其他抗原不交叉反应。
如在此所用,“取代”表示分别由不同氨基酸或核苷酸置换一个或多个氨基酸或核苷酸。
术语“治疗有效量”是指如在此所定义的结合分子的有效预防、改善和/或治疗由一种B型肝炎病毒感染引起的一种病状的一个量。如在此所用的改善可以指减少可见或可察觉的疾病症状、病毒血症或任何其他可测量的B型肝炎感染表现。
术语“治疗”是指用以治愈或中断或至少延迟疾病进展的治疗性治疗以及预防性或防治性措施。需要治疗的那些包括已经患上由B型肝炎病毒感染引起的一种病状的那些以及B型肝炎病毒感染待预防的那些。由B型肝炎病毒感染部分或完全恢复的受试者也可能需要治疗。预防涵盖抑制或减少B型肝炎病毒的传播或抑制或减少与B型肝炎病毒感染相关的一种或多种症状的发作、发展或进展。
术语“载体”表示可以插入一种第二核酸分子以便引入到一个宿主中的一种核酸分子,在该宿主中它将被复制并且在一些情况下被表达。换句话说,一种载体能够输送它所已经连接的一种核酸分子。如在此所用,术语“载体”涵盖克隆以及表达载体。载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)以及来源于细菌噬菌体或植物或动物(包括人类)病毒的载体。载体包含由所提议的宿主识别的一种复制起点,并且在表达载体情况下是启动子;和由宿主识别的其他调节区。含有一种第二核酸分子的一种载体通过转化、转染或通过利用病毒进入机制而引入到一种细胞中。某些载体能够在它们被引入到其中的一个宿主中自主复制(例如具有一种细菌复制起点的载体可以在细菌中复制)。其他载体可以在被引入到一个宿主中后被整合到宿主的基因组中,并且从而与宿主基因组一起复制。
详细说明
在一个第一方面,本发明提供了能够特异性结合到B型肝炎病毒株并且能够中和所述B型肝炎病毒株的结合分子。这些结合分子能够在体外和体内两种情况下中和B型肝炎病毒。
根据本发明的结合分子包含:一条重链,该重链包含SEQ ID NO:1-3中阐述的CDR序列;和一条轻链,该轻链包含SEQ ID NO:4-6中阐述的CDR序列。根据本发明,CDR区根据卡巴特(Kabat)等人(1991)如《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)中所描述来测定。
因此,本发明提供了能够特异性结合到一种B型肝炎病毒并且能够中和B型肝炎病毒的结合分子,其中这些结合分子包含:一个重链CDR1,包含SEQID NO:1的氨基酸序列;一个重链CDR2,包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列;和一个重链CDR3,包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;和一个轻链CDR1,包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列;一个轻链CDR2,包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列;以及一个轻链CDR3,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在某一实施例中,本发明的结合分子包含:一个重链可变区,包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列;和一个轻链可变区,包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个实施例中,本发明的结合分子包含:一条重链,包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列;和一条轻链,包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
优选地,根据本发明的结合分子是人类结合分子。在一个优选实施例中,这些结合分子是人类单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明的结合分子能够特异性结合到有生活力的、活的和/或感染性的或呈失活/减毒的形式的B型肝炎病毒。用于使病毒(例如B型肝炎病毒)失活/减毒的方法在本领域中是熟知的并且包括但不限于用福尔马林、β-丙内酯(BPL)、硫柳汞和/或紫外光处理。
本发明的结合分子还能够特异性结合到B型肝炎病毒的一个或多个片段,尤其诸如来源于B型肝炎病毒的亚型的一种或多种蛋白质和/或(多)肽或者B型肝炎病毒的一种或多种重组产生的蛋白质和/或多肽的一种制剂。不同B型肝炎病毒株的蛋白质的核苷酸和/或氨基酸序列可以见于基因库(GenBank)-数据库中。这项研究中所用的HBsAg序列选自日本NIG HBV大数据库,它含有多于6000个HBV序列(关于链接,参看http://s2as02.genes.nig.ac.jp/)。技术人员完全能够在对应的数据库中找到此类序列。
本发明的结合分子能够结合到来自至少以下血清型的HBsAg肽:adw2(B基因型)、ayw2(D基因型)、ayw1(B基因型)、adrq-(C基因型)、ayr(C基因型)、adw4q+(A基因型)、adrq+(C基因型)、ayw4(D基因型)、adw4q-(F基因型)、adw3、ayw3(D基因型)、adw2(I基因型)、ayw1(A基因型)、adw2(A基因型)、adw2(C基因型)。这在实例2中进行展示。在此,本发明的结合分子通过结合到HBV的主要血清型和基因型而出人意料地提供了一种极广泛的保护。
在另一个实施例中,本发明的结合分子能够特异性结合到上文提及的蛋白质和/或多肽的一个片段,其中该片段至少包含由本发明的结合分子识别的一个表位。如在此所用,“表位”是能够以足够高的亲和力结合到一种本发明的结合分子以形成一种可检测的抗原结合分子复合物的一种部分。
另外,根据本发明的结合分子出人意料地结合到HBsAg中的所有主要疫苗诱导性和抗病毒诱导性HBV逃逸突变体,诸如例如P120T、Q129R、M133I、D144R、G145R、G145A、E164D、I195M,W196S(实例3)。因此,本发明的结合分子可以针对HBV通用地使用。
本发明的结合分子可以是完整免疫球蛋白分子,诸如单克隆抗体;或这些结合分子可以是其抗原结合片段,包括但不限于重和轻链可变区、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体以及含有一种免疫球蛋白的足以赋予B型肝炎病毒株以特异性抗原结合的至少一个片段的(多)肽、或其一个片段。在一个优选实施例中,本发明的结合分子是人类单克隆抗体和/或其抗原结合片段。这些结合分子还可以是纳米抗体、α抗体、亲和体(affibody)、FN3-结构域骨架和基于(人类)重复蛋白(如纤连蛋白(Adnectin)、抗运载蛋白(Anticalin)、达尔潘蛋白(Darpin)、琴都灵蛋白(Centyrin)等)中的结构域的其他骨架或包含表位结合序列的其他骨架。
本发明的结合分子可以按未被分离或被分离的形式使用。此外,本发明的结合分子可以单独使用,或以包含至少一种本发明的结合分子(或其变异体或片段)和结合到B型肝炎并且具有B型肝炎病毒抑制效应的一种或多种其他结合分子的一种混合物形式使用。换句话说,这些结合分子可以组合,例如以包含两种或更多种结合分子、其变异体或片段的一种药物组合物形式使用。举例来说,具有不同但互补活性的结合分子可以组合于一种单一疗法中以实现一种所希望的预防、治疗或诊断效应,但可替代地,具有相同活性的结合分子也可以组合于一种单一疗法中以实现一种所希望的预防、治疗或诊断效应。任选地,该混合物还可以包含至少一种根据本发明的结合分子和至少一种其他治疗剂。优选地,治疗剂(诸如例如核苷类似物(例如拉米夫定、阿德福韦))和/或免疫调节剂(例如基于干扰素的疗法)可用于预防和/或治疗一种B型肝炎病毒感染
典型地,根据本发明的结合分子可以结合到其结合伴侣(即一种B型肝炎病毒)和/或其片段,其中平衡解离常数(KD)低于0.2×10-4M、1.0×10-5M、1.0×10-6M、1.0×10-7M,优选地低于1.0×10-8M,更优选地低于1.0×10-9M,更优选地低于1.0×10-10M,甚至更优选地低于1.0×10-11M,并且特别是低于1.0×10-12M。平衡解离常数可以针对抗体同种型而不同。举例来说,针对一种IgM同种型的结合是指至少约1.0×10-7M的平衡解离常数。结合动力学可以例如使用无标记技术(诸如表面等离子体共振或生物层干涉测量)获得。
本发明的结合分子展现了中和活性。中和活性可以例如如在此所描述进行测量。典型地,根据本发明的结合分子具有如实例4和5如中所描述的一种体外病毒中和分析(VNA)中所测定1000ng/ml或更小、优选地500ng/ml或更小的中和活性,更优选地100ng/ml或更小、甚至更优选地10ng/ml或更小的中和活性。根据本发明的结合分子可以结合到呈可溶形式(诸如例如在一种样品中或在悬浮液中)的B型肝炎病毒或其一种片段,或可以结合到结合或连接到一种载剂或底物(例如微量滴定板、膜和珠子等)的B型肝炎病毒或其片段。载剂或底物可以由玻璃、塑料(例如聚苯乙烯)、多糖、尼龙、硝化纤维素或铁氟龙等制成。此类支撑体的表面可以是固体或多孔的并且具有任何适宜形状。此外,这些结合分子可以结合到呈纯化/被分离的或未被纯化/未被分离的形式的B型肝炎病毒。
如上文所论述,在某些实施例中,本发明提供了能够识别并且结合到B型肝炎病毒上的一个表位的被分离的人类结合分子,其中所述结合分子针对B型肝炎病毒具有体外和体内两种情况下的中和活性。
本发明的另一个方面包括了如在此所定义的结合分子的功能变异体。如果变异结合分子能够与“亲本”或“参考”结合分子为免疫特异性结合到一种B型肝炎病毒或其一种片段而竞争,那么分子被视为一种根据本发明的结合分子的功能变异体。换句话说,当功能变异体仍能够结合到B型肝炎病毒或其一种片段的相同或重叠表位时,分子被视为一种根据本发明的结合分子的功能变异体。为了本申请的目的,“亲本”和“参考”将用作同义语,意指参考或亲本分子或物理分子本身的信息可以形成变异的基础。功能变异体包括但不限于一级构造序列实质上类似的衍生物,包括在Fc受体或效应子功能涉及的其他区中具有修饰的衍生物,和/或含有例如未见于亲本结合分子中的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。此类修饰尤其包括乙酰化、酰化、一种核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、一种脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化等。可替代地,功能变异体可以是如本发明中定义的包含一种氨基酸序列的结合分子,该氨基酸序列与亲本结合分子的氨基酸序列相比含有一种或多种氨基酸的取代、插入、缺失或其组合。此外,功能变异体可以包含氨基酸序列在氨基或羧基末端任一者或两者处的截短。根据本发明的功能变异体与亲本结合分子相比可以具有相同或不同、或者更高或者更低的结合效能但仍能够结合到B型肝炎病毒或其一种片段。举例来说,根据本发明的功能变异体与亲本结合分子相比可以具有增加或减小的针对一种B型肝炎病毒或其一种片段的结合效能。在某些实施例中,对可变区(包括但不限于构架区、高变区、特别是CDR3区)的氨基酸序列进行修饰。一般来说,轻链和重链可变区包含三个高变区,包含三个CDR和更多保守区(所谓的构架区(FR))。高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。旨在落在本发明的范围内的功能变异体与如在此所定义的亲本结合分子具有至少约80%到约99%、优选地至少约70%到约99%、更优选地至少约80%到约99%、甚至更优选地至少约90%到约99%、最优选地至少约95%到约99%、特别是至少约97%到约99%氨基酸序列一致性和/或同源性。本领域的普通技术人员已知的计算机算法(尤其诸如Gap或Bestfit)可以用以最佳地比对待比较的氨基酸序列并且定义类似或相同氨基酸残基。功能变异体可以通过以本领域中已知的一般分子生物学方法(包括但不限于易错PCR、寡核苷酸定向诱变、定点诱变以及重和/或轻链改组)改变亲本结合分子或其部分而获得。
在某些实施例中,本发明的功能变异体针对B型肝炎病毒具有中和活性。与亲本结合分子相比,中和活性可以或者相同,或者更高或更低。如本申请中所用,当使用术语(人类)结合分子时,此术语还涵盖(人类)结合分子的功能变异体。在某些实施例中,功能变异体是包含以下的结合分子:一个重链可变序列,与SEQ ID NO:7相比包含一个或多个氨基酸突变,诸如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个氨基酸突变;和/或一个轻链可变区,与SEQ ID NO:8相比包含一个或多个氨基酸突变,诸如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个氨基酸突变。
在某些实施例中,根据本发明的结合分子用作一种药剂,并且优选地用于对由来自不同血清型和基因型的B型肝炎病毒引起的一种B型肝炎感染进行治疗性和/或预防性治疗。
本发明还涉及药物组合物,包含至少一种根据本发明的结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。
在又另一个实施例中,本发明涉及一种根据本发明的结合分子的用途,用于制备用于对一种B型肝炎病毒感染进行预防和/或治疗的一种药剂。具体来说,根据本发明的结合分子用于预防一个新鲜移植的肝的B型肝炎病毒再感染。
在又另一个方面,本发明提供了免疫偶联物(即分子),包含至少一种如在此所定义的结合分子并且进一步包含至少一种标签(尤其诸如一种可检测部分/药剂)。本发明中还涵盖根据本发明的免疫偶联物的混合物或至少一种根据本发明的免疫偶联物与另一种分子(诸如一种治疗剂或另一种结合分子或免疫偶联物)的混合物。在其他实施例中,本发明的免疫偶联物可以包含多于一种标签。这些标签可以与彼此相同或不同并且可以非共价连接/偶联到结合分子。这个或这些标签也可以通过共价键结而直接连接/偶联到人类结合分子。可替代地,这个或这些标签可以借助于一种或多种键联化合物而连接/偶联到结合分子。用于使标签偶联到结合分子的技术为熟练的业内人士所熟知。
本发明的免疫偶联物的标签可以是治疗剂,但它们还可能是可检测部分/药剂。适合于治疗和/或预防中的标签可以是毒素或其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或免疫刺激的其他结合分子。包含一种可检测药剂的免疫偶联物可以用以例如诊断上评估一个受试者是否已经感染一种B型肝炎病毒,或监测一种B型肝炎病毒感染的发展或进展作为一种临床测试程序的一部分以例如测定一种既定治疗方案的功效。然而,它们还可以用于其他检测和/或分析和/或诊断目的。可检测部分/药剂包括但不限于酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、发射正电子的金属以及非放射性顺磁性金属离子。出于检测和/或分析和/或诊断目的用以标记结合分子的标签取决于所用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法,尤其诸如(组织)样品的免疫组织化学染色、流式细胞检测、扫描激光流式细胞检测、荧光免疫分析、酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、生物分析(例如吞噬作用分析)、蛋白质印迹应用等。适用于本领域中已知的检测/分析/诊断技术和/或方法的标记完全属于熟练的业内人士的能力内。
此外,本发明的人类结合分子或免疫偶联物还可以连接到尤其可用于体外免疫分析或纯化B型肝炎病毒或其片段的固体支撑体。此类固体支撑体可以是多孔或无孔的,平面或非平面的。本发明的结合分子可以融合到标记序列(诸如一种肽)以促进纯化。可替代地,一种抗体可以偶联到一种第二抗体以形成一种抗体异源偶联物。在另一个方面,本发明的结合分子可以偶联/连接到一种或多种抗原。优选地,这些抗原是由被给予结合分子-抗原偶联物的一个受试者的免疫系统识别的抗原。这些抗原可以是相同的,但也可以与彼此不同。用于连接抗原与结合分子的偶联方法在本领域中是熟知的并且包括但不限于使用交联剂。本发明的结合分子将结合到B型肝炎病毒,并且连接到结合分子的抗原将引发对偶联物的有力的T细胞攻击,这将最终导致破坏B型肝炎病毒。
次于通过直接或经由例如一个连接子间接偶联以化学方式产生免疫偶联物,免疫偶联物可以产生为包含本发明的结合分子与一种适合标签的融合蛋白。融合蛋白可以通过本领域中已知的方法而产生,这些方法诸如例如通过构建在框架中包含编码这些结合分子的核苷酸序列与编码这个或这些适合标签的核苷酸序列的核酸分子并且然后表达这些核酸分子来重组地进行。
本发明的另一个方面是提供编码至少一种根据本发明的结合分子、功能变异体或免疫偶联物的核酸分子。此类核酸分子可以用作中间物用于克隆目的,例如用于如上文所描述的亲和力成熟过程中。在一个优选实施例中,这些核酸分子被分离或纯化。
技术人士应理解,这些核酸分子的功能变异体也旨在是本发明的一部分。功能变异体是可以使用标准遗传密码来直接翻译以提供与翻译自亲本核酸分子的氨基酸序列相同的一种氨基酸序列的核酸序列。
优选地,这些核酸分子编码包含如上文所描述的CDR区的结合分子。在另一个实施例中,这些核酸分子编码包含本发明的结合分子的两个、三个、四个、五个或甚至全部六个CDR区的结合分子。
在另一个实施例中,这些核酸分子编码包括一条重链的结合分子,该重链包含如上文所描述的可变重链序列。在另一个实施例中,这些核酸分子编码包括一条轻链的结合分子,该轻链包含如上文所描述的可变轻链序列。以下给出本发明的结合分子的重和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。
本发明的另一个方面是提供包含一种或多种根据本发明的核酸分子的载体(即核酸构建体)。载体可以来源于质粒,尤其诸如F、R1、RP1、Col、pBR322TOL、Ti等;粘粒;噬菌体,诸如λ、人字形、M13、Mu、P1、P22、Qβ、T-偶数、T-奇数、T2、T4、T7等;植物病毒。载体可以用于克隆和/或用于表达本发明的结合分子并且甚至可以用于基因治疗目的。可操作地连接到一种或多种调节表达的核酸分子、包含一种或多种根据本发明的核酸分子的载体也由本发明涵盖。载体的选择取决于所遵循的重组程序和所用的宿主。在宿主细胞中引入载体可以尤其通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂染胺转染或电穿孔来实现。载体可以自主地复制或可以与它们已经被整合进入的染色体一起复制。优选地,这些载体含有一种或多种选择标记。这些标记的选择可能取决于所选宿主细胞,但如本领域的普通技术人员所熟知,这对本发明不是关键的。它们包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、博莱霉素、来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、来自小鼠的二氢叶酸还原酶基因(dhfr)。可操作地连接到编码可以用以分离人类结合分子的蛋白质或肽的一种或多种核酸分子、包含编码如上文所描述的人类结合分子的一种或多种核酸分子的载体也由本发明涵盖。这些蛋白质或肽包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、金属结合聚组胺酸、绿色荧光蛋白、荧光素酶以及β-半乳糖苷酶。
含有上文所提及的载体的一种或多种复本的宿主是本发明的另一个方面。优选地,宿主是宿主细胞。宿主细胞包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞。细菌细胞包括但不限于来自革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌的细胞,这些细菌诸如埃希氏杆菌属(Escherichia)(诸如大肠杆菌(E.coli))和假单胞菌属(Pseudomonas)的若干物种。在真菌细胞的群组中,优选地使用酵母细胞。酵母中的表达可以通过使用酵母菌株(尤其诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))来实现。此外,昆虫细胞(诸如来自果蝇的细胞和Sf9)可以用作宿主细胞。除此之外,宿主细胞可以是植物细胞,尤其诸如来自作物植物(诸如林业植物)的细胞,或来自供应食物和原料的植物(诸如谷类植物或药用植物)的细胞,或来自观赏植物的细胞,或来自花苞作物的细胞。转化的(转基因)植物或植物细胞通过已知方法来产生,这些方法例如土壤杆菌属介导的基因转移、叶盘片的转化、通过聚乙二醇诱发的DNA转移进行的原生质体转化、电穿孔、声处理、显微注射或弹道基因转移。另外,一种适合表达系统可以是一种杆状病毒系统。使用哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞、NSO细胞或Bowes黑色素瘤细胞)的表达系统在本发明中是优选的。哺乳动物细胞为表达的蛋白提供了最类似于哺乳动物来源的天然分子的翻译后修饰。因为本发明处理可能必须被给予人类的分子,所以一种完全人类表达系统将尤其优选。因此,甚至更优选地,宿主细胞是人类细胞。人类细胞的实例尤其是海拉、911、AT1080、A549、293以及HEK293T细胞。在优选实施例中,人类生产细胞至少包含编码一种腺病毒E1区的一种核酸序列(呈可表达形式)的一个功能部分。在甚至更优选实施例中,所述宿主细胞来源于一个人类视网膜并且用包含腺病毒E1序列的核酸永生化,诸如911细胞或1996年2月29日以编号96022940寄存在欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures,ECACC),应用微生物研究中心(CAMR),索尔兹伯里(Salisbury),威尔特郡SP4OJG(Wiltshire SP4OJG),大不列颠(Great Britain)并且以商标(PER.C6是克鲁赛尔荷兰公司(Crucell Holland B.V.)的一个注册商标)市售的细胞系。出于本申请的目的,“PER.C6细胞”是指以编号96022940寄存的细胞或所寄存细胞的祖细胞、上游或下游传代细胞以及来自祖细胞的后代细胞以及前述中任一者的衍生物。在宿主细胞中产生重组蛋白可以根据本领域中熟知的方法来进行。使用以商标市售的细胞作为用于所关注的蛋白质的一个生产平台已经描述于WO 00/63403中,该文献的披露内容通过引用以其全文结合在此。
一种产生一种根据本发明的结合分子的方法是本发明的另一个方面。该方法包括以下步骤:a)在有助于该结合分子的表达的条件下培养一种根据本发明的宿主,和b)任选地回收表达的结合分子。表达的结合分子可以从无细胞提取物回收,但优选地它们从培养基回收。以上产生方法还可以用以制造本发明的结合分子的功能变异体和/或免疫偶联物。用以从无细胞提取物或培养基回收蛋白质(诸如结合分子)的方法为本领域的普通技术人员所熟知。通过上述方法可获得的结合分子、功能变异体和/或免疫偶联物也是本发明的一部分。
可替代地,次于在宿主(诸如宿主细胞)中表达,本发明的结合分子和免疫偶联物可以通过常规肽合成器或在无细胞翻译系统中使用来源于根据本发明的DNA分子的RNA核酸合成地产生。如通过上述合成生产方法或无细胞翻译系统可获得的结合分子和免疫偶联物也是本发明的一部分。
在又另一个实施例中,本发明的结合分子还可以在转基因非人类哺乳动物(尤其诸如兔、山羊或母牛)中产生,并且分泌到例如其乳汁中。
在又另一个替代性实施例中,根据本发明的结合分子可以由表达人类免疫球蛋白基因的转基因非人类哺乳动物(诸如例如转基因小鼠或兔)产生。优选地,转基因非人类哺乳动物具有一种基因组,包含一种人类重链转基因和一种人类轻链转基因,编码如上文所描述的人类结合分子的全部或一部分。转基因非人类哺乳动物可以用B型肝炎病毒的一种被纯化或富集的制剂、HBsAg或其一种片段进行免疫。用于免疫非人类哺乳动物的方案在本领域中是明确的。参看使用《抗体:实验室手册》,E.哈洛,D.莱恩编(1998),冷泉港实验室,冷泉港,纽约和《免疫学最新方案》(Current Protocols in Immunology),J.E.科利根(J.E.Coligan),A.M.克鲁伊斯贝克(A.M.Kruisbeek),D.H.马古利斯(D.H.Margulies),E.M.席瓦赫(E.M.Shevach),W.斯乔博(W.Strober)编(2001),约翰威利父子公司(John Wiley&Sons Inc.),纽约,这些文献的披露内容通过引用结合在此。免疫方案通常包括或者有或者无佐剂(诸如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)情况下的多次免疫,但还可以包括裸DNA免疫。在另一个实施例中,人类结合分子由来源于转基因动物的B细胞、浆细胞和/或记忆细胞产生。在又另一个实施例中,人类结合分子由杂交瘤产生,这些杂交瘤通过将获自上述转基因非人类哺乳动物的B细胞与永生化的细胞融合而制备。如可获自上述转基因非人类哺乳动物的B细胞、浆细胞和杂交瘤以及如可获自上述转基因非人类哺乳动物的人类结合分子、B细胞、浆细胞和/或记忆细胞和杂交瘤也是本发明的一部分。
在又另一个方面,本发明提供了组合物,包含至少一种根据本发明的结合分子(优选地人类单克隆抗体)、其至少一种功能变异体、至少一种根据本发明的免疫偶联物和/或其一个组合。除此之外,这些组合物可以尤其包含稳定化分子(诸如白蛋白或聚乙二醇)或盐。优选地,所用盐是保留结合分子的所希望的生物活性并且并不赋予任何不希望的毒理学效应的盐。必要时,本发明的人类结合分子可以涂布于一种物质之中或之上以使其防御酸或可能会使结合分子失活的其他天然或非天然条件的作用。
在又另一个方面,本发明提供了组合物,包含至少一种如本发明中所定义的核酸分子。这些组合物可以包含水溶液,诸如含有盐(例如NaCl或如上文所描述的盐)、清洁剂(例如SDS)和/或其他适合组分的水溶液。
此外,本发明涉及药物组合物,包含至少一种本发明的结合分子(诸如一种人类单克隆抗体)(或其功能片段或变异体)、至少一种根据本发明的免疫偶联物、至少一种根据本发明的组合物或其组合。本发明的药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂为技术人员所熟知。根据本发明的药物组合物可以进一步包含至少一种其他治疗剂。适合药剂也为熟练的业内人士所熟知。
针对一个单一表位的一种单克隆抗体产品与多克隆抗体相比有时可以对病毒的变异更敏感。这可能会增加产生逃逸突变体的风险。识别不同表位的两种单克隆抗体的一个组合可以避开此缺点。
因此,在某些实施例中,根据本发明的药物组合物包含至少一种额外结合分子,即该药物组合物可以是结合分子的一种混合液或混合物。该药物组合物可以包含至少两种根据本发明的结合分子;或至少一种根据本发明的结合分子,和至少一种其他B型肝炎病毒结合和/或中和分子(诸如针对HBsAg蛋白质上的另一个表位或针对存在于B型肝炎病毒上的其他抗原结构的另一种抗体),和/或中和一种或多种其他病原体的一种结合分子。在另一个实施例中,额外结合分子可以被配制用于同时分别或依序给予。
在某些实施例中,结合分子当组合使用时展现协同中和活性。如在此所用,术语“协同”意指这些结合分子当组合使用时的组合效应大于其当个别地使用时的叠加效应。协同作用的结合分子可以结合到B型肝炎病毒的相同或不同片段上的不同结构。一种计算协同作用的方式是借助于联合用药指数。联合用药指数(CI)的概念已经由周(Chou)和塔拉利(Talalay)(1984)进行了描述。组合物可以例如包含一种具有中和活性的结合分子和一种非中和结合分子。非中和以及中和结合分子也可以在中和B型肝炎病毒方面协同地作用。
在某些实施例中,药物组合物可以包含至少一种根据本发明的结合分子;和至少一种其他结合分子,优选地另一种B型肝炎病毒中和结合分子。药物组合物中的结合分子优选地能够与不同亚型的B型肝炎病毒反应。结合分子可以具有高结合效能和广泛特异性。优选地,两种结合分子都是交叉中和分子,以便它们各自中和不同亚型的B型肝炎病毒。另外,优选地,它们中和不同B型肝炎病毒亚型中的每一者的尽可能多的病毒株。
在某些实施例中,药物组合物包含至少一种其他预防和/或治疗剂。优选地,所述其他治疗和/或预防剂是能够预防和/或治疗一种B型肝炎病毒感染和/或由此类感染引起的一种病状的药剂。治疗和/或预防剂包括但不限于抗病毒剂。此类药剂可以是结合分子、小分子、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。这些药剂可以与本发明的结合分子组合使用。在此“组合”意指以分开的配制品形式同时或以一种单一组合配制品形式,或以分开的配制品形式以任何顺序根据一种依序给药方案。处于实验阶段的能够预防和/或治疗一种B型肝炎病毒感染和/或由此类感染引起的一种病状的药剂也可以用作可用于本发明中的其他治疗和/或预防剂。
本发明的结合分子或药物组合物可以在用于人类中之前在适合动物模型系统中进行测试。此类动物模型系统包括但不限于小鼠、雪貂以及猴。
典型地,药物组合物必须在制造和储存条件下无菌并且稳定。本发明的结合分子、免疫偶联物或组合物可以呈粉末形式,在递送之前或之时在适当药学上可接受的赋形剂中复水。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干),这些方法由其先前无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所希望的成分的粉末。
可替代地,本发明的结合分子、免疫偶联物或组合物可以呈溶液形式,并且适当的药学上可接受的赋形剂可以在递送之前或之时进行添加和/或混合以提供单位剂量可注射形式。优选地,本发明中所用的药学上可接受的赋形剂适合于高药物浓度,可以维持适当流动性,并且必要时可以延迟吸收。
药物组合物的最优给药途径的选择将受数种因素影响,这些因素包括组合物内的活性分子的物理化学性质、临床情况的紧急程度以及活性分子的血浆浓度与所希望的治疗作用的关系。举例来说,必要时,本发明的结合分子可以与将防止其快速释放的载剂(诸如一种控制释放配制品,包括植入物、透皮贴片以及微胶囊化递送系统)一起制备。尤其可以使用生物可降解的生物相容性聚合物,诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯以及聚乳酸。此外,可能需要用防止人类结合分子失活的一种物质或化合物涂布结合分子或与该物质或化合物共同给予结合分子。举例来说,结合分子可以于一种适当载剂(例如脂质体)或一种稀释剂中给予一个受试者。
给药途径可以分成两种主要类别,口服和肠胃外给药。优选的给药途径是肠胃外给药,诸如静脉内或通过吸入。
本发明的药物组合物可以被配制用于肠胃外给药。用于肠胃外给药的配制品尤其可以呈水性或非水性等渗无菌无毒性注射或输注溶液或悬浮液形式。溶液或悬浮液可以包含在所用剂量和浓度下对接受者无毒的药剂,诸如1,3-丁二醇、林格氏溶液、汉克氏溶液、等渗氯化钠溶液、油剂、脂肪酸、局部麻醉剂、防腐剂、缓冲剂、粘度或溶解度增加剂、水溶性抗氧化剂、油溶性抗氧化剂以及金属螯合剂。
在另一个方面,本发明的结合分子(诸如人类单克隆抗体(其功能片段和变异体))、免疫偶联物、组合物或药物组合物可以用作一种药剂或诊断剂。因此,使用本发明的结合分子、免疫偶联物、组合物或药物组合物对一种B型肝炎病毒感染进行诊断、治疗和/或预防的方法是本发明的另一个方面。上文提及的分子尤其可以用于对由一种B型肝炎病毒引起的一种感染进行诊断、预防、治疗或其组合。它们适用于治疗罹患一种B型肝炎病毒感染的尚未被治疗的患者和已经或正针对一种B型肝炎病毒感染进行治疗的患者。在一个具体实施例中,它们适用于预防一个新的肝在移植之后的B型肝炎病毒再感染。
上文提及的分子或组合物可以与可用于诊断、预防和/或治疗的其他分子结合使用。它们可以体外、离体或体内使用。举例来说,本发明的结合分子(诸如人类单克隆抗体(或其功能变异体))、免疫偶联物、组合物或药物组合物可以与一种针对B型肝炎病毒的疫苗(如果可用的话)共同给予。可替代地,疫苗还可以在给予本发明的分子之前或之后给予。代替一种疫苗,抗病毒剂也可以与本发明的结合分子结合使用。适合的抗病毒剂如上文所提及。
这些分子典型地以治疗或诊断上有效量配制于本发明的组合物和药物组合物中。可替代地,它们可以分别地进行配制和给予。举例来说,其他分子(诸如抗病毒剂)可以全身性地应用,而本发明的结合分子可以静脉内应用。
治疗可以靶向暴露于B型肝炎病毒的患者群组。此类患者群组包括但不限于例如由于HBV而经历肝移植的患者;HBsAg阳性母亲所生的婴儿;暴露于含有HBsAg的血液的医疗工作者;由于性和/或家庭接触HBsAg阳性个体而暴露于HBV的人员;以及已经用一种抗病毒化合物治疗但已经显示出一种不充分的抗病毒反应的慢性感染患者。
可以调节剂量方案以提供最优的所希望的反应(例如一种治疗反应)。一种适合的剂量范围可以是例如0.01-100mg/kg体重,优选地是0.1-50mg/kg体重,优选地是0.01-15mg/kg体重。此外,举例来说,可以给予一种单一大丸剂,可以随时间给予数次分次剂量,或可以如治疗情况的紧急状态所指示而按比例减少或增加剂量。根据本发明的分子和组合物优选地是无菌的。使这些分子和组合物无菌的方法在本领域中是熟知的。可用于诊断、预防和/或治疗的其他分子可以按如关于本发明的结合分子所提议的一种类似给药方案给予。如果其他分子分开地给予,那么它们可以在给予本发明的人类结合分子或药物组合物中的一者或多者之前(例如之前2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周)、与该给药同时、或在该给药之后(例如之后2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周)给予一个患者。确切给药方案通常在人类患者的临床试验期间分选出。
人类结合分子和包含人类结合分子的药物组合物当待给予人类作为体内治疗剂时特别适用并且通常是优选的,因为接受者对所给予抗体的免疫反应通常将实质上小于由给予一种单克隆鼠类、嵌合或人类化结合分子引起的反应。
在另一个方面,本发明涉及根据本发明的结合分子(诸如中和人类单克隆抗体(其功能片段和变异体))、免疫偶联物、核酸分子、组合物或药物组合物的用途,用于制备用于对一种B型肝炎病毒感染进行诊断、预防、治疗或其组合的一种药剂。
除此以外,包含以下的试剂盒也是本发明的一个方面:根据本发明的至少一种结合分子,诸如一种中和人类单克隆抗体(其功能片段和变异体);至少一种免疫偶联物;至少一种核酸分子;至少一种组合物;至少一种药物组合物;至少一种载体;至少一种宿主,或其组合。任选地,本发明的试剂盒的上述组分被包装在适合容器中并且被标记用于诊断、预防和/或治疗指定的病状。上文提及的组分可以按一种水性、优选地无菌溶液形式或按一种用于复水的冻干、优选地无菌配制品形式储存在单位或多剂量容器中。容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成,并且可以具有一个无菌接入端口(例如容器可以是一个静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针可刺穿的一个塞子的一个小瓶)。试剂盒可以进一步包含更多个包含一种药学上可接受的缓冲剂的容器。它可以进一步包括从一种商业和用户立场出发令人希望的其他物质,包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器、用于一种或多种适合宿主的培养基以及可能地甚至至少一种其他治疗剂、预防剂或诊断剂。与试剂盒相关的说明书习惯上可以包括在治疗、预防或诊断产品的商业包装中,这些说明书含有关于例如适应症、用法、剂量、制造商、给药、禁忌症的信息和/或关于此类治疗、预防或诊断产品的用途的警告。
根据本发明的结合分子还可以有利地用作一种用于检测B型肝炎病毒的体外方法中的一种诊断剂。本发明因此进一步涉及一种检测一种样品中B型肝炎亚型病毒的方法,其中该方法包括以下步骤
(a)使用一种根据本发明的结合分子和/或一种根据本发明的免疫偶联物来分析一种生物样品中B型肝炎病毒抗原的水平;并且
(b)将B型肝炎病毒抗原的该分析的水平与一个对照水平比较,由此B型肝炎病毒抗原的该分析的水平与该B型肝炎病毒抗原的该对照水平相比的一个增加指示一种B型肝炎病毒感染。
生物样品可以是一种生物样品,包括但不限于来自(可能)感染的受试者的血液、血清、大便、痰液、鼻咽抽出液、支气管灌洗液、尿液、组织或其他生物物质;或一种非生物样品,诸如水、饮料等。(可能)感染的受试者可以是人类受试者,而且可以使用本发明的人类结合分子或免疫偶联物测试疑似B型肝炎病毒携带者的动物中的病毒存在。该样品可以首先被操纵以使其更适用于检测方法。操纵尤其意指以一种使得病毒将分解为抗原组分(诸如蛋白质、(多)肽或其他抗原片段)的方式处理疑似含有和/或包含病毒的样品。优选地,本发明的人类结合分子或免疫偶联物在使得可在人类结合分子与可能存在于样品中的病毒或其抗原组分之间形成一种免疫复合物的条件下与样品接触。指示样品中的病毒存在的一种免疫复合物的形成(如果存在的话)然后通过适合手段来检测和测量。此类方法尤其包括均质和异质结合免疫分析,诸如放射免疫分析(RIA)、ELISA、免疫荧光、免疫组织化学、FACS、SPR、BLI以及蛋白质印迹分析。
尤其用于大规模临床筛检患者血清和血液和血液来源的产物的优选分析技术是ELISA和蛋白质印迹技术。ELISA测试是尤其优选的。为了用作这些分析中的试剂,本发明的结合分子或免疫偶联物宜结合到微量滴定孔的内表面。本发明的结合分子或免疫偶联物可以直接结合到微量滴定孔。然而,本发明的结合分子或免疫偶联物与孔的最大结合可以通过在添加本发明的结合分子或免疫偶联物之前用聚赖氨酸预处理这些孔而实现。此外,本发明的结合分子或免疫偶联物可以通过已知手段共价连接到这些孔。一般来说,结合分子或免疫偶联物以0.01到100μg/ml之间的一个浓度用于涂层,但也可以使用更高以及更低的量。然后将样品添加到涂布有本发明的结合分子或免疫偶联物的孔中。
本发明进一步提供了治疗或预防一个受试者中一种B型肝炎病毒感染的方法,包括向该受试者给予治疗或预防有效量的本发明的结合分子、免疫偶联物和/或药物组合物。在某些实施例中,受试者是一个哺乳动物,优选地是一个人类。
此外,本发明的结合分子可以用以确定B型肝炎病毒的特异性结合结构。结合结构可以是蛋白质和/或多肽上的表位。它们可以是线性的,而且还是构造和/或构象的。在一个实施例中,结合结构可以借助于PEPSCAN分析来分析(尤其参看WO 84/03564、WO 93/09872、斯洛特斯特拉(Slootstra)等人,1996)。可替代地,可以从包含来自B型肝炎病毒的一种蛋白质的肽的一个随机肽库中筛选能够结合到本发明的结合分子的肽。
在以下实例和图式中进一步展示本发明。这些实例并不意在以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1
CR8097抗体的稳定构象
已经对一组数种抗体测试了其结合并且中和HBV的不同血清/基因型的能力。一种抗体出人意料地胜过该组中的其余抗体。然而,此抗体由SEC-MALS(尺寸排阻色谱-基质辅助光散射)分析所显示呈现一种异质构象。图1示出了所述抗体以两个分开的峰从一个g3000SWXL柱洗脱,这两个峰对应于具有类似分子量的两种单体物质(粗线)。为了解决此问题,使抗体突变。如图1中所显示,这导致产生一种稳定单体抗体制剂,该制剂以一个单一均质峰(细线)从SEC柱洗脱,该峰具有如通过MALS直接测量的关于一种IgG1所预期的MW。
因此,根据本发明的针对HBV的结合分子(CR8097)已经证实了被高效制造,这使其适于大规模工业生产。
实例2
如通过FACS测量的CR8097的结合广度
对各自用表达一种特异性HBsAg血清型的一种构建体转染的HEK293F细胞进行FACS染色,以评估多少HBV血清型由mAb CR8097识别。这项研究中所用的HBsAg序列选自日本NIG HBV大数据库,它含有多于6000个HBV序列(关于链接,参看http://s2as02.genes.nig.ac.jp/)。通过以下方式进行病毒株选择:对数据库中的所有HBsAg序列进行血清型分类,并且随后基于HBsAg的从残基100延伸到207的细胞外环序列计算每种血清型(当前已经定义了11种血清型)的最中心病毒株。然后,对于每种血清型,选择最接近最中心病毒株的一种病毒株(参看表1)。以此方式,可以选择最具代表性的HBV血清型。另外,测定每种选择的血清型的基因型(当可能时),并且对于两种主要血清型(ayw1和adw2),选择额外基因型以包括尽可能多的基因型(参看表1)。选择总计15个不同HBsAg序列,将其合成并且克隆到表达载体中。
在转染之后48小时通过以下方式进行细胞内FACS染色:固定细胞(在室温下用3%多聚甲醛在PBS中孵育15分钟),渗透细胞(在室温下用0.1%曲拉通(triton)在PBS加1%BSA中孵育30分钟),随后在室温下用4μg/mlCR8097或一种无关IgG在阻断缓冲液(PBS,具有0.1%Tween-20和1%BSA)中孵育细胞1小时。通过在室温下用Alexafluor 647标记的山羊抗人类抗体(1000倍稀释于阻断缓冲液中)孵育1小时进行CR8097或无关IgG的检测。使用仅用二级抗体孵育作为一种阴性对照的被转染的细胞在来自BD生物科学公司(BD Biosciences)的Canto II上进行FACS分析。
表1.来自其的HBsAg序列用于表达并且结合CR8097的所选择HBV病毒株的概述
图2中的结合数据示出,与现有技术中、例如PCT/IL97/00183和PCT/IL97/00184中所披露的并不识别HBsAg adw2亚型(C基因型)的结合分子截然相反,CR8097识别HBV的所有主要亚型(埃伦等人,2000,《肝脏病学》32,588)。
实例3
CR8097与HBsAg逃逸突变体的结合
数种选择可用于治疗或预防HBV感染,这些选择尤其是使用重组HBsAg的疫苗接种、用HBIg的免疫疗法或用聚合酶抑制剂的治疗。这些治疗中的每一者可以诱导HBsAg蛋白质的突变,并且或者为HBV逃逸机制必需或者这些突变由于重叠聚合酶基因的突变而被引入(关于综述,参看谢尔登(Sheldon)等人JAC(2008)第766-768页)。为了评估此类逃逸突变体是否将影响CR8097的结合,使一组HBsAg突变体重组表达于HEK293F细胞中,随后进行细胞内FACS分析。对于此分析,选择最常观察到的HBsAg逃逸突变(参看表2),并且将其引入HBsAg的两种不同野生型序列(是ayw和adr)中。野生型序列示出于图3中。
在转染之后48小时通过以下方式进行细胞内FACS染色:固定细胞(在室温下用3%多聚甲醛在PBS中孵育15分钟),渗透细胞(在室温下用0.1%曲拉通在PBS加1%BSA中孵育30分钟),随后在室温下用4μg/ml CR8097或一种无关IgG在阻断缓冲液(PBS,具有0.1%Tween-20和1%BSA)中孵育细胞1小时。通过在室温下用Alexafluor 647标记的山羊抗人类抗体(1000倍稀释于阻断缓冲液中)孵育1小时进行CR8097或无关IgG的检测。使用仅用二级抗体孵育作为一种阴性对照的被转染的细胞在来自BD生物科学公司(BDBiosciences)的Canto II上进行FACS分析(图4)。
数据示出了所有产生的HBsAg突变体都由CR8097识别(图4)。
表2.引入HBsAg野生型序列中的突变的清单
实例4
如通过体外中和分析测量的HBV特异性IgG的中和效能
在一种体外中和分析中使用来自小鼠的血清评估抗HBV单克隆抗体的体外中和效能,这些小鼠已经移植了一个人肝并且接着感染了adr血清型(C基因型)的一种B型肝炎病毒和ayw3血清型(D基因型)的一种B型肝炎病毒。在此分析中,首先将抗体稀释液用固定量的含有HBV的血清孵育,在此之后,使病毒侵染培养于一个24孔板中的分化的HepaRG细胞(易受HBV感染影响的人类肝肿瘤细胞系)。在感染之后十一天,通过使用一种商业ELISA测量HBsAg表达水平来检测感染性。使用一个4参数拟合来拟合测量的OD值,从该拟合计算IC50值(注意,一个IC50值表示观察到50%中和的浓度)。
从这些数据(参看图5和图6)显而易见,CR8097的效能比测试的HBIg批次高至少100倍。
实例5
使用PXB评估抗HBV特异性IgG的体内功效。这些小鼠通过以下方式产生:在白蛋白增强子/启动子驱动的尿激酶纤维蛋白溶酶原活化子转基因/重度联合免疫缺陷疾病(uPA/SCID)接受者小鼠中移植人肝细胞,随后用B型肝炎病毒(C基因型,adr血清型)感染。在HBV接种之前一天,向每组小鼠静脉内给予IgG。在第零天,用1×105个HBV复本对小鼠进行静脉内接种。对照小鼠仅用HBV进行接种,但并不接受IgG。来自Nabi的Nabi-HB用作HBIg来源,因为此HBIg对HBV(C基因型,adr血清型)示出了最高体外中和效能。
每周通过测量小鼠血清中的HBV滴度(HBV基因组当量/毫升,通过Q-PCR进行)监测HBV感染。将IgG剂量的保护性效应表示为由卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meijer curve)计算的感染所花费的时间。如果一组中有50%的HBV滴度高于检测极限(4000个HBV复本/毫升),那么小鼠不再受到保护。在对照组中,仅得到持续2周的保护。当给定CR8097的最高剂量(0.2和0.02mg/kg)时,得到持续超过10周的保护。0.2mg/kg HBIg的保护与0.002mg/kgCR8097的保护相当,是3周(参看图7),这表明CR8097的保护性功效比HBIg高约100倍。
序列
>CR8097VH CDR1(SEQ ID NO:1)
GFTFSNNW
>CR8097VH CDR2(SEQ ID NO:2)
ISTDGMST
>CR8097VH CDR3(SEQ ID NO:3)
VRGSTYYFGSGSLNF
>CR8097VL CDR1(SEQ ID NO:4)
NSDIGNYDY
>CR8097VL CDR2(SEQ ID NO:5)
DVS
>(SEQ ID NO:6)
SSYAGTFTYVV
>CR8097VH(SEQ ID NO:7)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRVSCEVSGFTFSNNWMHWVRQAPGKGPVWVSRISTDGMSTSYAEFVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCVRGSTYYFGSGSLNFWGQGTTVIVSS
>CR8097VL(SEQ ID NO:8)
QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTNSDIGNYDYVSWYQQHPGKAPRLIIYDVSERPSGVPNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDESDYFCSSYAGTFTYVVFGGGTKLTVL
>CR8097 HC(SEQ ID NO:9)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRVSCEVSGFTFSNNWMHWVRQAPGKGPVWVSRISTDGMSTSYAEFVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCVRGSTYYFGSGSLNFWGQGTTVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>CR8097 LC(SEQ ID NO:10)
QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTNSDIGNYDYVSWYQQHPGKAPRLIIYDVSERPSGVPNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDESDYFCSSYAGTFTYVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Claims (13)
1.一种结合分子,包含:
一个重链CDR1,包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列,
一个重链CDR2,包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列,
一个重链CDR3,包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列,
一个轻链CDR1,包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列,
一个轻链CDR2,包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列,以及
一个轻链CDR3,包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的结合分子,其中该结合分子包含:一个重链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列;和一个轻链可变区,该轻链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的结合分子,其中该结合分子包含:一条重链,该重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列;和一条轻链,该轻链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
4.一种结合分子,该结合分子与一种根据权利要求1到3中任何一项所述的结合分子为结合到一种B型肝炎病毒蛋白质上的一个表位而免疫特异性竞争。
5.根据权利要求1到4中任何一项所述的结合分子,其中该结合分子在一个体外分析中中和一种B型肝炎病毒。
6.根据权利要求1到5中任何一项所述的结合分子,其中该结合分子是一种人类单克隆抗体或其一种抗原结合片段。
7.一种免疫偶联物,包含至少一种根据权利要求1到6中任何一项所述的结合分子并且进一步包含至少一种标签。
8.一种核酸分子,编码一种根据权利要求1到6中任何一项所述的结合分子。
9.根据权利要求1到6中任何一项所述的结合分子、根据权利要求7所述的免疫偶联物和/或根据权利要求8所述的核酸分子,用作一种药剂,优选地用于对由一种B型肝炎病毒引起的一种B型肝炎感染进行诊断、预防和/或治疗。
10.一种根据权利要求1到7中任何一项所述的结合分子的功能变异体。
11.一种药物组合物,包含一种根据权利要求1到6中任何一项所述的结合分子和/或一种根据权利要求7所述的免疫偶联物;和一种药学上可接受的载剂或赋形剂。
12.根据权利要求11所述的药物组合物,包含一种根据权利要求1到6中任何一项所述的结合分子;和一种额外B型肝炎中和结合分子。
13.一种检测B型肝炎病毒感染的方法,包括:
(a)使用一种根据权利要求1到6所述的结合分子和/或一种根据权利要求7所述的免疫偶联物来分析一种生物样品中B型肝炎病毒抗原的水平;并且
(b)将B型肝炎病毒抗原的该分析的水平与一个对照水平比较,由此B型肝炎病毒抗原的该分析的水平与该B型肝炎病毒抗原的该对照水平相比的一个增加指示一种B型肝炎病毒感染。
Applications Claiming Priority (5)
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