CN1529754A - 一种针对hbv s-表面抗原的单克隆抗体可变区及编码它的基因 - Google Patents

一种针对hbv s-表面抗原的单克隆抗体可变区及编码它的基因 Download PDF

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Abstract

提供了一种针对乙型肝炎病毒S－表面抗原的单克隆抗体的可变区和编码它的基因，包含该基因的重组载体，和获自该重组载体的转化子。

Description

一种针对HBV S-表面抗原的单克隆抗体可变区及编码它的基因
技术领域
该发明涉及一种针对乙型肝炎病毒S-表面抗原的单克隆抗体可变区和编码它的基因，一种包含该基因的重组载体，和一种获自该重组载体的转化子。
背景技术
乙型肝炎病毒(自此以后，称为“HBV”)，也称为丹氏粒，具有42nm直径的球形特征。外包被包含大量的乙型肝炎表面抗原，并将由180种乙型肝炎核心蛋白组成的核壳包裹在内。核壳包含HBV基因组，聚合酶等(Summers等.，Proc.Nat.Acad.Sci，72，4579，1975；Pierre Tiollais等.，Science，213，406-411，1981)。
在HBV基因组内，HBV表面抗原的编码区包含三个开放阅读框起始位点，其共用一个产生同样的S结构域的终止密码子。因此，HBV表面抗原可分为三种类型：即，(1)小HBV表面抗原(自此以后，称为“S-表面抗原”)，其仅包含S结构域，(2)中等HBV表面抗原(自此以后，称为“M-表面抗原”)，其包含S结构域和附加的已知为Pre-S2的55个氨基酸的结构域，和(3)大HBV表面抗原(自此以后，称为“L-表面抗原”)，其包含Pre-S1结构域以及Pre-S2和S结构域。在表达的表面抗原中，S-表面抗原约占80％，或者更多。
根据其抗体识别特性，S表面抗原被分成亚类。在所有表面抗原中表达的抗原性结构域被分为决定簇a。四种其它亚类为d或y和w或r。决定簇d的122位残基是赖氨酸，而y是精氨酸。类似地，决定簇w的160位残基是赖氨酸，而r是精氨酸(Kennedy R.C.等.，J.Immunol.130，385，1983)。因此，血清型可被分为四种亚型，如adr，adw，ayr和ayw(Peterson等.，J.Biol.Chem.257，10414，1982；Lars O.Marnius等.，intervirology，38，24-34，1995)。
S-表面抗原特异结合于肝细胞(Leenders等.，Hepatology，12，141，1990；Irina Ionescu-Matiu等.，J.Med.Virology，6，175-178，1980；Swan N.T.等.，Gastroenterolgy 80，260-264，1981；Swan N.T.等.，Gastroenterolgy 85，466-468，1983；Marie L.M.等.，Proc.Nat.Acad.Sci.81，7708-7712，1984)。并且，已经鉴定了人肝质膜含有与S-表面抗原特异结合的靶蛋白，如载脂蛋白H和内联蛋白II(Mehdi H.等.，J.Viro.，68，2415，1994；HertogsK.等.，Virology，197，265，1993)。
同时，在开发有用的治疗性单克隆抗体时，由于在将来源于小鼠的单克隆抗体应用于人体时，能够引起免疫反应，所以优选人源化的抗体。
最近，韩国专利出版物第1999-8650公开了一种针对Pre-S1表位的单克隆抗体的可变区，所述表位仅存在于三种HBV表面抗原(S-，M-，和L-表面抗原)中的L-表面抗原，编码它的基因，和一种使用它的人源化抗体。然而，由于L-表面抗原仅占表达的表面抗原的1-2％，所以L-表面抗原不适合作为用于诊断和治疗目的的抗HBV抗体开发的靶目标。
发明内容
因此，本发明的主要目的是提供一种编码单克隆抗体可变区的基因，所述单克隆抗体特异识别S-表面抗原，尤其是决定簇a，该决定簇通常存在于所有的HBV表面抗原中。
本发明的另一个目的是提供一种含有上述基因的重组载体。
本发明的另一个目的是提供一种使用上述重组载体获得的转化子。
本发明的另一个目的是提供一种上述单克隆抗体的可变区。
与本发明的一个方面一致，提供了一种编码特异识别HBV S-表面抗原的单克隆抗体可变区的基因。
本发明人使用在韩国HBV患者中最为流行的决定簇adr的S-表面抗原(International Ezymes Inc.，USA)免疫小鼠。从免疫小鼠获得的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2O-Ag14，ATCC CRL-1581)融合产生了大量杂交瘤细胞，接着随后的克隆和筛选程序，最终产生了许多单克隆抗体。本发明人从许多的单克隆抗体中筛选了特异结合于决定簇a的单克隆抗体；结果，获得一株产生独特单克隆抗体的杂交瘤细胞系(mC6-9-1)，所述单克隆抗体以高的结合亲和力特异结合于决定簇a。
本发明人从所述杂交瘤细胞系分离了的总RNA，用以合成轻链和重链的cDNA，最后，分别获得了包含SEQ ID NO.5的约440bp轻链cDNA基因和包含SEQ ID NO.6的约480bp重链cDNA基因。
从所述单克隆抗体轻链和重链，检测了CDR(互补决定区)残基。结果，鉴定了轻链CDR残基在分别代表SEQ ID Nos.9，10和11的肽的24-40，56-62，和95-102位置存在。而且，发现重链CDR残基在分别代表SEQ ID Nos.12，13和14的肽的31-35，50-66和99-111的位置存在。
因此，在本发明的范围内，包括一段cDNA，其编码抗HBV S-表面抗原的单克隆抗体的轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID Nos.9，10和11的肽。此外，本发明包含一段cDNA，其中轻链可变区具有SEQ IDNO.7的氨基酸序列，优选地，包含SEQ ID NO.5的核苷酸序列的cDNA。
在本发明的范围内，还包括一段cDNA，其编码抗HBV S-表面抗原的单克隆抗体的重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID Nos.12，13和14的肽。此外，本发明包含一段cDNA，其中所述重链可变区具有SEQ IDNO.8的氨基酸序列，优选地，包含SEQ ID NO.6的核苷酸序列的cDNA。
上述编码单克隆抗体轻链或重链可变区的cDNA基因可以被插入到质粒载体中，例如pCRII(Invitrogen Co.USA)，以制备重组载体。因此，在本发明的范围内，还包括一种重组载体pCRC6Lv，其包含上述编码轻链可变区的cDNA，和包含上述编码重链可变区的cDNA的重组载体pCRC6Hv。
此外，用上述重组载体，pCRC6Lv和/或pCRC6Hv转化微生物，如大肠杆菌，以获得转化子。因此，本发明包含转化子大肠杆菌DH5α/pCRC6Lv(KCTC，10239BP)，和转化子大肠杆菌DH5α/pCRC6Hv(KCTC，10238BP)，它们分别用重组载体pCRC6Lv和pCRC6Hv转化。
利用已知的方法(J.Sambrook等.，Molecular Cloning，卷1，1.25-1.28)从上述转化子中重新获得重组载体。例如，用溶液1(50mM葡萄糖，25mMTris·HCl，和10mM EDTA)将转化子细胞膜弱化。用溶液2(0.2N NaOH和1％SDS)破坏细胞膜，并使蛋白和染色体变性。用溶液3(5M醋酸钾和醋酸)聚集除重组载体以外的成分，然后离心。可用乙醇沉淀获得的重组载体层以重新获得重组载体。
在本发明的范围内，包括一种单克隆抗体可变区，其由含有SEQ IDNos.9，10和11的肽的轻链和含有SEQ ID Nos.12，13和14的肽的重链组成。而且，优选的是单克隆抗体可变区，其中轻链可变区具有SEQ IDNO.7的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列。
从依照本发明编码单克隆抗体可变区的上述cDNA基因，通过将直接结合S-表面抗原的CDR区(即对于轻链而言，编码SEQ ID Nos.9，10和11的肽的基因；对重链而言，编码SEQ ID Nos.12，13和14的肽的基因)与一种人抗体基因融合，或者通过用依照本发明的编码单克隆抗体可变区的基因替换人抗体可变区，可以获得针对HBV的人源化单克隆抗体。
如上所述，依照本发明编码单克隆抗体可变区的基因在识别HBV S-表面抗原，特别是决定簇a时特别有效，所述决定簇a在HBV表面抗原中表达比例最高。因此，依照本发明的基因可以用于制备可广泛用于各种类型HBV表面抗原如adr，adw， ayr和ayw的单克隆抗体，以中和和/或去除HBV。
实施本发明的最佳方式
现在，通过下述实施例，但决不限于下述实施例，将进一步详细举例说明本发明。
实施例1.从细胞系(mC6-9-1)分离RNA和合成它的cDNA
将1×108个mC6-9-1细胞加入到10ml 4M硫氰酸胍中以破裂细胞后，向其中加入8ml酸性酚溶液。将混合物离心(10,000rpm，10分钟)以提取RNA。向5μg提取的RNA中添加0.5ng寡d(T)，0.5单位的RNA酶抑制剂和100单位莫洛尼鼠类白血病病毒逆转录酶(M-MLV)。将获得的混合物在37℃反应1小时以合成cDNA。
以2μg合成的cDNA作为模板；在轻链的情形中，以SEQ ID Nos.1和2的DNA寡聚体作为引物；在重链的情形中，以SEQ ID Nos.3和4的DNA寡聚体作为引物，使用AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer Biosystem Co.，USA)进行聚合酶链反应(PCR)。在PCR的第一步中，采用以下反应条件重复反应30个循环：94℃1.5分钟，55℃2分钟，72℃3分钟。在第二步中，采用以下条件将反应进行1个循环：94℃1.5分钟，55℃2分钟，72℃10分钟。
用扩增的PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。用100ml 0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色20分钟以后，与100bp的标准DNA梯度(LifetechnologyCo.USA)相比较，扩增的基因产物显现：在重链的情形中约480bp，在轻链的情形中约440bp。
实施例2.cDNA克隆
通过向440bp基因片段(轻链基因片段)中加入200μl苯酚和200μl氯仿去除杂质后，所述基因片段通过进行在实施例1中1.5％琼脂糖凝胶电泳后使用透析膜(Spectrum Co.USA)回收，加入2.5ml乙醇以纯化基因片段。将纯化的基因片段亚克隆到pCRII载体(InvitrogenCo.USA)，以此转化大肠杆菌DH5α(Lifetechnology Co.USA)以提供转化子(Cohen S.N.等.，Proc.Nat.Acad.Sci.69，2110，1972)。将获得的转化子在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，随后，处理以提供质粒。然后，用限制性酶EcoRI(Biolab Co.，USA)切割质粒，以提供插入了上述440bp基因片段的克隆，CS-2，CS-4和CS-5。
用480bp基因片段(重链基因片段)进行相同的程序以提供重组载体，用其转化大肠杆菌DH5α(Lifetechnology Co.USA)以获得转化子。在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，随后处理以提供质粒。然后，用限制性酶EcoRI(Biolab Co.，USA)切割质粒，以提供插入了上述480bp基因片段的克隆，CS-6，CS-7和CS-8。
向100μg/ml获自上述克隆的每种质粒溶液中加入60μl聚乙二醇溶液(20％聚乙二醇和2.5M NaCl)，然后离心。在产生的沉淀中加入100μ1蒸馏水后，用50μl苯酚溶液萃取两次，用200μl乙醇以纯化质粒。
向50μl含有2μg纯化质粒的溶液中加入5μl 2N NaOH和10μl10mM EDTA。然后，将混合物在37℃反应30分钟。向该反应混合物中，分别加入1pmol的M13和T7引物。将整个混合物在65℃反应2分钟，然后静止至室温。采用DNA Sequenase版本II试剂盒(United StatesBiochemical Co.USA)分析每个克隆的核苷酸序列。
结果，三个轻链克隆(CS-2，CS-4和CS-5)的核苷酸序列一致。将从这些克隆获得的质粒载体命名为pCRC6Lv。含有pCRC6Lv质粒载体的转化子被命名为大肠杆菌DH5α/pCRC6Lv，并按照布达佩斯条约于2001年5月3日保藏在韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物中心(KCTC)(KCTC 10239BP)。
此外，三个重链克隆(CS-6，CS-7和CS-8)的核苷酸序列一致。将从这些克隆获得的质粒载体命名为pCRC6Hv。含有pCRC6Hv质粒载体的转化子被命名为大肠杆菌DH5α/pCRC6Hv，并按照布达佩斯条约于2001年5月3日保藏在韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物中心(KCTC)(KCTC 10238BP)。
实施例3.cDNA的核苷酸序列分析
作为对来源于细胞系mC6-9-1的单克隆抗体可变区氨基酸序列(Harris.L.等.，Protein Sci.4，306-310，1995；Kabat E.A.等.，Sequence ofProteins of immunological interest.第5版.，1991；Williams A.F.等.，Annu.Rev.Immunol.6，381-406，1988)的分析结果，鉴定了重链属于II(B)亚类，轻链属于k1系列。
在可变区中，重链的抗原识别CDR残基位于31-35(CDR1)，50-66(CDR2)，和99-111(CDR3)的位置，轻链的抗原识别CDR残基位于24-40(CDR1)，56-62(CDR2)，和95-102(CDR3)的位置。
实施例4.来源于杂交瘤细胞系mC6-9-1的单克隆抗体的结合亲和力
将2.0×10-11M来源于细胞系mC6-9-1的单克隆抗体加入到不同浓度(1.0×10-6-1.0×10-12M)HBV S-表面抗原(International Enzymes Inc.，USA)的溶液中，然后在室温反应混合物3小时。
将100μl每种混合物加入到已经预先包被有0.1μg上述S-表面抗原的96孔免疫板(immulon plates)(Dinatech Co.USA)中。继续在37℃孵育混合物2小时，去除上清液。每孔加入200μl 0.5％酪蛋白-磷酸缓冲的盐水，继续37℃孵育1小时。加入100μl稀释的(×1,000)羊抗鼠多克隆抗体，该抗体偶联了辣根过氧化物酶(Sigma Co.USA)，并用ELISA读出器(Dinatech Co.USA)测量它的光密度。
来源于细胞系mC6-9-1的单克隆抗体具有0.24×10-9M-1的高结合亲和力。结合亲和力的术语表示50％的单克隆抗体的结合被抑制时抗原的浓度的倒数(Friguet B.等.，J.of Immunological Method，77，305-319，1985)。
 微生物国际保藏和存活证明(译文)
保藏人 金善镇
地址 韩国汉城
保藏日 2001年5月3日
保藏号 KCTC 10239BP
微生物分类命名 大肠杆菌DH5α/pCRC6Lv
国际保藏单位名称 韩国典型培养物保藏中心
存活状态 □存活 □不存活
代理机构盖章
微生物国际保藏和存活证明(译文)
保藏人 金善镇
地址 韩国汉城
保藏日 2001年5月3日
保藏号 KCTC 10238BP
微生物分类命名 大肠杆菌DH5α/pCRC6Hv
国际保藏单位名称 韩国典型培养物保藏中心
存活状态 □存活 □不存活
代理机构盖章
                             序列表
<110>株式会社柳韩洋行
<120>一种针对HBV S-表面抗原的单克隆抗体可变区及编码它的基因
<130>OV17440
<150>KR 10-2001-26634
<151>2001-05-16
<160>14
<170>KopatentIn 1.71
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<213>大肠杆菌
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<213>大肠杆菌
<400>7
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<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Met Val Arg Pro Gly Thr
  1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn His
             20                  25                  30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Ile
         35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
     50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                 85                  90                  95
Ala Ile Met Thr Thr Phe Leu Gly Glu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro
        115                 120                 125
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Leu
    130                 135
<210>9
<211>17
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>9
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Ala
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>10
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
  1               5
<210>11
<211>8
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>11
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr
  1               5
<210>12
<211>5
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>12
Asn His Leu Ile Glu
  1               5
<210>13
<211>17
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>13
Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
  1               5                  10                  15
Gly
<210>14
<211>13
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>14
Met Thr Thr Phe Leu Gly Glu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
  1               5                  10

Claims (12)

1.一种编码针对乙型肝炎病毒S-表面抗原的单克隆抗体轻链可变区的cDNA，所述轻链可变区包含SEQ ID Nos.9，10和11的肽。
2.权利要求1的cDNA，其中所述轻链可变区具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列。
3.权利要求2的cDNA含有SEQ ID NO.5的核苷酸序列。
4.一种编码针对乙型肝炎病毒S-表面抗原的单克隆抗体重链可变区的cDNA，所述重链可变区包含SEQ ID Nos.12，13和14的肽。
5.权利要求4的cDNA，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列。
6.权利要求5的cDNA，其包含SEQ ID NO.6的核苷酸序列。
7.一种重组载体pCRC6Lv，其包含权利要求1的cDNA。
8.一种重组载体pCRC6Hv，其包含权利要求4的cDNA。
9.一种转化子大肠杆菌DH5α/pCRC6Lv(KCTC 10239BP)，其是用重组载体pCRC6Lv转化的。
10.一种转化子大肠杆菌DH5α/pCRC6Hv(KCTC 10238BP)，其是用重组载体pCRC6Hv转化的。
11.一种单克隆抗体可变区，其是由包含SEQ ID Nos.9，10和11的肽
12.权利要求11的单克隆抗体可变区，其中所述轻链可变区具有SEQ IDNO.7的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列。
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