CN1176106C - 抗人胃癌单链抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的抗人胃癌单链抗体是一种采用噬菌体抗体库技术，直接从胃癌细胞抗原免疫的小鼠脾细胞出发，构建的抗人胃癌全套单链抗体基因噬菌体抗体库中筛选出的具有抗胃癌活性的单链抗体，并可在大肠杆菌中进行可溶性表达。该单链抗体为今后在此基础上筛选高亲和力、高表达的抗胃癌单链抗体，构建其他类型的基因工程抗体积累了资料。对胃癌临床诊断和治疗的研究及应用具有重要意义。

Description

抗人胃癌单链抗体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程抗体，具体地说涉及一种抗人胃癌单链抗体及其应用。

背景技术

胃癌是当今严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，多年来人们一直在寻找诊断和治疗胃癌的各种途径。随着肿瘤免疫学和分子生物学技术的不断发展。已有许多抗胃癌单克隆抗体及其单抗免疫偶联物应用于胃癌的显像、寻向治疗等研究方面的报道。但是，由于鼠源性单克隆抗体具有较强的免疫原性，给其临床应用带来困难。基因工程抗体的问世，特别是被誉为抗体技术革命性进展的噬菌体抗体库技术的出现，为克服单克隆抗体的缺陷提供了新途径。目前，抗胃癌基因工程抗体的研究还处于初始阶段，因此，获得多种抗胃癌抗体可变区基因及其抗体分子片段，对于抗胃癌基因工程抗体的研制和应用具有重要意义。

噬菌体抗体库技术无需经过杂交瘤技术，甚至无需经过免疫过程即可直接获得特异性的各种抗体基因及其抗体分子片段。单链抗体具有分子量小，能在保持其与抗体亲和活性的同时，降低免疫原性，对肿瘤有很强的穿透力等优势，是具有很好应用前景的一种基因工程抗体。因此，利用噬菌体抗体库技术，进一步研制更多、更好的抗胃癌基因工程抗体，无疑在胃癌的诊断和治疗中有重要价值。

发明内容

本发明的目的在于利用噬菌体抗体库技术提供一种抗人胃癌单链抗体。

本发明的另一个目的是上述抗人胃癌单链抗体的应用。

本发明的抗人胃癌单链抗体是一种采用噬菌体抗体库技术，直接从胃癌细胞抗原免疫的小鼠脾细胞出发，构建的抗人胃癌全套单链抗体基因噬菌体抗体库中筛选出的具有抗胃癌活性的单链抗体，并可在大肠杆菌中进行可溶性表达，该单链抗体的氨基酸序列如下：

Q  V  Q  L  Q  Q  S  R  A  E  L  V  K  P  G  A  S  V  K  L  S  C  K  A

S  G  Y  T  F  T  S  Y  W  M  H  W  V  K  Q  R  P  G  Q  G  L  E  W  I

G  E  I  N  P  S  N  G  R  T  N  Y  N  E  N  F  K  S  K  A  T  L  T  V

D  K  S  S  S  S  A  Y  M  Q  L  S  S  L  T  S  E  D  S  A  V  Y  Y  C

A  R  Y  E  D  Y  D  L  H  D  Y  W  G  Q  G  T  S  V  T  V  S  S  G  G

G  G  S  G  G  G  G  S  G  G  G  G  S  D  I  K  L  T  Q  S  P  T  A  M

A  A  S  P  G  E  K  I  T  I  T  C  S  A  S  Q  T  Y  N  L  V  M  W  Y

Q  Q  K  S  G  T  S  P  K  P  W  I  Y  R  T  S  N  L  A  S  G  V  P  A

R  F  S  G  S  G  S  G  T  S  Y  S  L  T  I  G  T  M  E  A  E  D  V  A

T  Y  Y  C  Q  Q  S  S  T  L  P  F  T  F  G  S  G  T  K  L  E  I  K  P，并将该氨基酸序列命名为SEQ ID NO：1。

本发明的抗人胃癌单链抗体，其中重链可变区基因VHCI编码118个氨基酸，该氨基酸序列如下：

Q  V  Q  L  Q  Q  S  R  A  E  L  V  K  P  G  A  S  V  K  L  S  C  K  A

S  G  Y  T  F  T  S  Y  W  M  H  W  V  K  Q  R  P  G  Q  G  L  E  W  I

G  E  I  N  P  S  N  G  R  T  N  Y  N  E  N  F  K  S  K  A  T  L  T  V

D  K  S  S  S  S  A  Y  M  Q  L  S  S  L  T  S  E  D  S  A  V  Y  Y  C

A  R  Y  E  D  Y  D  L  H  D  Y  W  G  Q  G  T  S  V  T  V  S  S，并将该氨基酸序列命名为SEQ ID NO：2。

本发明的抗人胃癌单链钪体，其中轻链可变区基因VLCI编码107个氨基酸，该氨基酸序列如下：

D  I  K  L  T  Q  S  P  T  A  M  A  A  S  P  G  E  K  I  T  I  T  C  S

A  S  Q  T  Y  N  L  V  M  W  Y  Q  Q  K  S  G  T  S  P  K  P  W  I  Y

R  T  S  N  L  A  S  G  V  P  A  R  F  S  G  S  G  S  G  T  S  Y  S  L

T  I  G  T  M  E  A  E  D  V  A  T  Y  Y  C  Q  Q  S  S  T  L  P  F  T

F  G  S  G  T  K  L  E  I  K  P，并将该氨基酸序列命名为SEQ ID NO：3。

本发明的抗人胃癌单链抗体，它由720个核苷酸组成，其核苷酸序列如下：

CAG GTC CAA CTG CAG CAG TCT AGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTG

AAA CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAT TGG ATG CAC TGG

GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCT AGC

AAC GGT CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAC TTC AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTT

GAC AAA TCC TCC AGC TCA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC

TCT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA TAT GAG GAC TAC GAT CTC CAT GAC TAC TGG

GGC CAA GGG ACC TCG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT

GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC AAG CTC ACT CAG TCT CCA ACC GCC ATG

GCT GCA TCT CCC GGG GAG AAG ATC ACT ATC ACC TGC AGT GCC AGT CAG ACA TAC

AAC TTA GTA ATG TGG TAC CAA CAG AAG TCA GGG ACC TCT CCT AAA CCC TGG ATT

TAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT TCT GGA GTC CCA GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG

TCT GGG ACT TCT TAC TCT CTC ACA ATT GGC ACC ATG GAA GCT GAA GAT GTT GCC

ACT TAC TAC TGC CAG CAG AGT AGT ACT TTA CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA

AAG TTG GAA ATA AAA CCG

本发明的抗人胃癌单链抗体，其中重链可变区基因VHCI由354个核苷酸组成，其核苷酸序列如下：

CAG GTC CAA CTG CAG CAG TCT AGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTG

AAA CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAT TGG ATG CAC TGG

GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCT AGC

AAC GGT CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAC TTC AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTT

GAC AAA TCC TCC AGC TCA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC

TCT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA TAT GAG GAC TAC GAT CTC CAT GAC TAC TGG

GGC CAA GGG ACC TCG GTC ACC GTC TCC TCA

本发明的抗人胃癌单链抗体，其中轻链可变区基因VLCI由321个核苷酸组成，其核苷酸序列如下：

GAC ATC AAG CTC ACT CAG TCT CCA ACC GCC ATG GCT GCA TCT CCC GGG GAG AAG ATC ACT

ATC ACC TGC AGT GCC AGT CAG ACA TAC AAC TTA GTA ATG TGG TAC CAA CAG AAG TCA GGG

ACC TCT CCT AAA CCC TGG ATT TAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT TCT GGA GTC CCA GCT

CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACT TCT TAC TCT CTC ACA ATT GGC ACC ATG GAA GCT

GAA GAT GTT GCC ACT TAC TAC TGC CAG CAG AGT AGT ACT TTA CCA TTC ACG TTC GGC TCG

GGG ACA AAG TTG GAA ATA AAA CCG

本发明的抗人胃癌单链抗体，其中VHCI基因与鼠免疫球蛋白重链可变区基因MM2F2A同源性最高，分数为1464；且为单一开放读框，它系重排后的功能性鼠抗体可变区基因。

本发明的抗人胃癌单链抗体，其中VLCI基因与鼠免疫球蛋白轻链可变区基因S61341同源性最高，分数为1074，且为单一开放读框，它系重排后的功能性鼠抗体可变区基因。

本发明的抗人胃癌单链抗体，利用其与抗原保持亲和活性的同时，降低免疫原性，对肿瘤具有的强大穿透力优势，在诊断和治疗胃癌上的应用，以及在此基础上筛选高亲和力、高表达的抗胃癌单链抗体，为构建其他类型的基因工程抗体及临床应用奠定基础。

本发明的抗人胃癌单链抗体其应用的积极效果在于：利用噬菌体抗体库技术，绕过杂交瘤技术，构建了抗人胃癌全套ScFv基因的噬菌体抗体库，从中获得了一个新的VH基因和一个新的VL基因。经基因序列同源分析，表明VHCI基因与鼠免疫球蛋白重链可变区基因MM2F2A同源性最高，分数为1464；VLCI基因与鼠免疫球蛋白轻链可变区基因S61341同源性最高，分数为1074。经氨基酸序列推导分析，表明二者均为单一开放读框。它们均系重排后的功能性鼠抗体中可变区基因。除此之外还建立了ScFvCI的表达载体，在大肠杆菌中表达出噬菌体表面呈现和可溶性ScFv两类抗体分子片段。经免疫印迹证实，IPTG诱导后可表达一分子量约30KDa的可溶性蛋白。经ELISA和间接免疫荧光染色流式细胞仪分析表明：表达出的ScFvCI片段与胃癌细胞系SGC-7901有良好的亲和活性，而与正常胃粘膜细胞系无亲和活性。为今后在此基础上筛选高亲和力、高表达的抗胃癌ScFv，构建其他类型的基因工程抗体积累了资料。对胃癌临床诊断和治疗的研究及应用具有重要意义。

下面对本发明抗人胃癌单链抗体的实施例进行详细说明。

实施例

(一)胃癌细胞膜抗原粗提物的制备

取新鲜胃癌手术切除标本，病理诊断为低分化胃癌。用高浓度裂化钾的方法，提取细胞膜抗原，制备膜抗原粗提物。用4℃灭菌生理盐水洗净血迹，冰浴下仔细剪切并研磨，边研磨边加入3MKCL溶液，研磨至匀浆，过筛网，置4℃过夜，不时用玻棒搅动，次晨4℃10000rpm离心20min，吸取上清液，加等体积饱和硫酸铵沉淀，4℃10000rpm离心20min。将沉淀用10mMPBS完全溶解后，对10mMPBS透析，透析毕，真空冷冻干燥，-20℃保存备用。

(二)免疫动物：

初次免疫以胃癌膜抗原(22μg/只)，加福氏完全佐剂行皮下多点注射；第4周行第二次免疫，同样剂量抗原(22μg/只)加福氏不完全佐剂行皮下多点注射；第6周行第3次免疫，以同样剂量抗原(22μg/只)腹腔注射，第7周，取鼠尾血清，ELISA法检测抗体浓度，测得滴度为1∶10，行第4次免疫，以同样抗原(44μg/只)腹腔注射，第8周行加强免疫，以同样抗原(22μg/只)腹腔注射，连续免疫3天。

(三)总RNA的提取及cDNA第一链的合成

待免疫结束后，取小鼠脾脏，采用异硫氰酸胍一步法，提取总RNA，经分光光度计定量后备用。取10μg总RNA，按反转录系统使用说明书加入各成分，42℃水浴1h。反应产物-20℃保存备用。

(四)全套VH、VL基因的扩增：

将反转录产物分为两份，分别加入轻、重链可变区引物各2μl，10×缓冲液5μl，四种dNTP至终浓度2.5mmol/L，用去离子水补至50μl，95℃变性5min后，加入TaqDNA聚合酶5U，进入PCR循环，反应条件为：94℃1min，55℃2min，72℃2min，30个循环。最后72℃保温10min。取PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳，用PEAE-纤维素膜电泳回收法纯化、回收。

(五)VH、VL的随机拼接

将近等摩尔浓度的VH、VL、Linker-Priner Mix混合，加dNTP至终浓度：2.5mmol/L、TaqDNA聚合酶5U，去离子水补至25μl。进行随机拼接反应，反应条件：94℃1min，63℃4min，7次循环。

(六)全套ScFv基因的扩增

上述7次循环结束后，再加入RS Primer Mix，进行PCR反应。反应条件：94℃1min，55℃2min，72℃2min，30个循环后，72℃保温10min。PCR产物用DEAE-纤维素膜电泳纯化、回收。

(七)全套ScFv基因的克隆

1、氯化钙法制备感受态细胞

取低营养琼脂平皿上生长的TG1单菌落，接种于2ml不含Amp的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，次日1∶100转种于100mlLB培养液中，37℃继续培养2-4hr，生长至对数期。冰浴10min，4℃5000rpm离心5min，弃上清。菌体重悬于1/2原体积的冰冷氯化钙溶液(75mM CaCl₂；10mM Tris Cl pH8.0)，冰浴15min。4℃，4000rpm离心5min，弃上清。菌体重悬于1/15原体积的冰冷氯化钙溶液中，4℃放置12-24hr后应用。

2、SfiI、NotI双酶切反应及与载体PCANTAB5E的连接

取纯化的全套ScFv 20μl，先后加SfiI，NotI酶切，然后，与同种酶切开的pCANTAB5E载体在ATP的作用下用T4DNA连接酶进行连接，16℃保温6小时。

3、宿主菌的转化

取上述制备的感受态细胞200μl，冰浴下加入连接产物5μl，轻混匀后冰浴30min，42℃热休克90s，迅速置冰浴中1-2min。加入不含氨苄青霉素的LB培养液800μl，37℃保温复苏45min。取适量转化菌液涂布于SOBAG(含100μg/ml Amp和2％葡萄糖的SOB培养基)营养琼脂板上。待水份吸收后，倒置平皿于37℃温箱中培养过夜。

(八)重组克隆的酶切鉴定

在SOBAG培养板上随机挑选6个转化菌落，小量制备噬菌粒DNA，以EcoRI、HindIII进行双酶切，酶切产物在1％琼脂糖凝胶中电泳。

(九)构建全套ScFv基因噬菌体表面呈现文库

从SOBAG琼脂板上收集全部转化菌，用2×YTAG(含100μg/ml Amp和2％葡萄糖)稀释细菌悬液至OD600＝0.2，取其中15ml培养至对数生长期，加入3×10pfu M13KO7辅助噬菌体，37℃振荡培养1h，离心后，用10ml 2×YTAK(含100μg Amp和50μl/ml Kan)悬浮沉淀，37℃振荡培养过夜，离心后的上清即为全套ScFv噬菌体表面呈现文库。上清4℃保存，并测定重组噬菌体滴度。取1μl上清，进行103倍系列稀释，再将稀释后上清，取400μl，加对数生长期TGI 200μl，摇30min，取100μl涂布于SOBAG板，计算cfu。

(十)Panning筛选

用胃癌细胞膜抗原包被塑料培养皿后，将重组噬菌体上清倾至其上，37℃培养2h，先后用PBS和PBST各洗板20次。然后将培养至对数生长期的TG1倾至免疫吸附后的培养皿上，37℃培养1小时。如此“吸附—洗脱—繁殖”的过程即为Panning筛选，再以M13KO7超感染，就可生成富集克隆的噬菌体表面呈现文库。以后按上述方法进行第2轮筛选。

(十一)单个重组噬菌体克隆的抗原结合活性的鉴定

1.制备单克隆重组噬菌体

Panning筛选后，将TG1菌液按原液、1∶10、1∶100、1∶1000 4个稀释度稀释，铺于SOBAG琼脂板上，30℃倒置培养过夜。挑选94个单菌落，分别接种于100μl的2×YTAG中，30℃培养过夜，取20μl培养物，加入200μl含5×10pfu/ml M13KO7的2×YTAG中，37℃振荡培养2h，离心，用2×YTAK 200μl重悬沉淀，30℃培养过夜。离心后的上清即为单个重组噬菌体。

2.ELISA检测抗原结合活性

设1个阴性对照孔，1个阳性对照孔，94个待测孔。100μl0.5％BSA包被阴性对照孔，100μl羊抗M13噬菌体抗体包被阳性对照孔，100μl/孔(10μg/ml)胃癌细胞膜抗原包被待测孔。1％BSA 37℃封闭1小时。对照孔加M13噬菌体，待测孔加50μl待测上清与50μl封闭液的混合物，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，各孔加100μl工作浓度的HRP/羊抗M13噬菌体抗体，37℃反应1h。PBST洗板4次，加新鲜配制的H2O2-ABTS，在410nm测每孔OD值。

(十二)ScFv基因序列的测定

1、双链DNA模板的制备

从4℃贮存的阳性克隆菌种取100μl接种于25μl含氨苄青霉素(100μg/ml)的SOC培养液中，30℃振荡培养过夜，碱裂解法大量制备噬菌粒DNA，经FPLC Hi Trap Q柱纯化，紫外分光光度计定量。

2、灌制聚丙烯酰胺凝胶

将丙烯酰胺和N、N’-亚甲叉双丙烯酰胺按19∶1配制成40％的储存液；变性工作胶浓度为6％，内含尿素46g/100ml。

3、测序引物5’端放射性标记反应

反应液成份：10×T4 Kinase Buffer 1.0μl

T4多核苷酸激酶              5.0μl

r-³²p-ATP                  10.0pmol

测序引物                    10.0pmol

无菌双蒸水至终体积          10.0μl

标记过程：先37℃30分钟，然后于90℃2分钟灭活残留的多核苷酸激酶，-20℃备用。

4、测序反应

(1)每套的反应各准备G、A、T、C4个管，分别加入相应d/ddNTP混合液2μl。

(2)针对每套反应准备1个管，加入下列试剂：

5×测序缓冲液             5.0μl

标记引物                  1.5μl

测序模板                  2-3μl

无菌双蒸水至              16.0μl

测序级Taq酶               5.0μl

(3)将第(2)步的反应液混匀，分别取4.0μl加至第(1)步中的G、A、T、C4个管中，再各加石蜡油25μl。

(4)延伸/终止反应：于热循环仪中进行，循环参数为96℃预变性2分钟，然后按95℃45秒、50℃45秒、70℃90秒，共30个循环。

(5)每管加测序终止液3.0μl，-20℃储存，准备上样前取出。

5、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1)预电泳：1800V，30-60分钟

(2)先将样品90℃变性2分钟，立即置冰中

(3)按G、A、T、C顺序，每个加样孔中上样2.5-3.0μl

(4)电泳条件：第1次上样，电泳1800V 2-3小时。

然后进行第2次上样，电泳1800V 6-10小时。

6、干胶与压片

用滤纸小心将凝胶揭下，于干胶仪内80℃真空干燥40分钟，-20℃压片12小时至7天不等。

7、将测序模板纯化好后，同时在DNA序列分析仪上进行序列测定。

(十三)ScFv基因的表达

1.ScFv的噬菌体表面呈现表达

将pC1噬菌粒DNA转化TG1感受态细胞，小量制备噬菌粒DNA，以EcoRl-HindHI酶切鉴定，筛选出重组噬菌粒克隆，再按上述制备单个重组噬菌粒克隆的方法制备。

2.可溶性ScFv C1在大肠杆菌中的诱导表达

将pC1噬菌粒DNA转化HB2151感受态细胞，小量制备噬菌粒DNA，筛选出含有ScFv插段的重组噬菌粒克隆。取5ml过夜培养物，接种于50ml SBAG(含100μg/ml Amp和2％葡萄糖的SB培养液)中，30℃培养1小时，离心，用50ml SBAI(含100μg/ml Amp和1mmol/L IPTG的SB培养液)重悬沉淀，37℃诱导3小时，离心，收集细菌培养上清，并收集菌体，接灌胶方法制备细菌外周质，将上清和外周质4℃下对10mMPBS透析12h，真空冷冻干燥，-20℃贮存。

(十四)可溶性ScFv C1的鉴定：

1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

配制6％浓缩胶和12％分离胶，常规处理各样品，上样后进行恒压电脉，120V电泳使样品进入分离胶后，调至160V继续在分离胶中电泳，电泳结束后，考马斯亮蓝R-250染色，或Western Blot检测。

2.Western Blot

SDS-PAGE结束后，将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜上。滤膜在TBS缓冲液中漂洗15min，然后用1％脱脂奶封闭30min，TBST洗涤2次，每次洗涤5min，然后将NC膜置于含鼠抗E-tag抗体的平皿中，室温作用30min，TBST洗膜3次后(每次10min)，将膜置于含碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG的平皿中，室温反应30min，洗膜后(同前)放入10ml显色液中(10ml显色缓冲液加66μl NBT和33μ BCIP)避光反应，待膜充分显色后立即将膜置入三蒸水中终止反应。

(十五)ScFvC1生物学活性的鉴定：间接免疫荧光染色和流式细胞仪分析

1.细胞培养

将正常胃粘膜细胞系、SGC-7901、SMMC-7721培养至对数生长期。用10％FCS RPMI 1640调整细胞浓度为1×10⁷/ml。取40μl细胞悬液分别加入预先有特异性McAB的离心管，再加50μl 1∶20稀释的正常灭活兔血清，4℃反应30min，用洗涤液洗2次，1000rpm离心5min，弃上清，加入2μl鼠抗E-tag抗体4℃反应30min，用洗涤液洗2次，1000rpm离心5min，弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠IgG荧光抗体，充分振摇，4℃反应30min，用洗涤液洗2次，加适量固定液用流式细胞仪进行分析。

2、ScFv的活性测定

采用间接免疫荧光染色，并用流式细胞仪进行分析。采用三种细胞系：正常胃粘膜细胞系，胃癌细胞系SGC-7901，肝细胞癌SMMC-7721。每个细胞系内均设阴性抗体对照组(抗出血热IgGMcAb)，ScFvC1组以及未诱导组三组，另外，胃癌细胞系还设阳性对照组(抗胃癌McAb)，见表1。

                表1  ScFv的活性测定

                                     所加抗体

细胞系

               未诱导细菌外周质  ScFvC1    抗出血热McAb   抗胃癌McAb

GES-1                  a            b           c

SMMC-7721              d            e           f

SGC-7901               g            h           i               j

附图说明

下面结合附图进行相关的说明。

图1是本发明全套VH、VL基因的PCR扩增图。

图2是本发明全套ScFv基因的PCR扩增图。

图3是本发明ScFv-CI表达产物考马斯亮兰染色结果图。

图4是本发明ScFv-CI表达产物Western 6 lot的结果图。

具体实施方式

一、抗人胃癌细胞膜抗原全套ScFv基因噬菌体表面呈现文库的构建与筛选

(一)抗人胃癌细胞膜抗原全套VH、VL基因的扩增及鉴定

用Heavy primer 1.2和ligh primer Mix分别扩增抗人胃癌细胞全套VH、VL基因，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析，分别见一条PCR扩增带，VH片段约为350左右，VL片段约为340左右，与预期大小相符，见图1。图1是本发明全套VH、VL基因的PCR扩增图，其中H:VH PCR产物；M：pGEM-7zf/HaeIII；L:VL PCR产物。

(二)全套ScFv基因的随机拼接和扩增

经过重叠延伸反应，将VH，VL随机拼接为ScFv，再将此ScFv扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析，见一条PCR扩增带，大小约为720bp，与预期结果相符，见图2。图2是本发明全套ScFv基因的PCR扩增图，其中M：pEGM-7zf/HaeIII；ScFv：ScFv基因扩增产物。

(三)全套ScFv基因的克隆和重组克隆的酶切鉴定

随机挑选6个菌落小量制备噬菌粒DNA，以EcoRI，HindIII酶切鉴定，含有外源插段者应切出约2.0kb的片段。6个克隆均切出2.0Kb片段。与预期结果一致。

(四)ScFv重组噬菌体的表达和Panning筛选富集

噬菌粒文库经M13KO7辅助噬菌体超感染后，产生重组噬菌体颗粒释放于细菌培养上清中，经测定ScFv噬菌体表面呈现文库的滴度为3.2×10¹²cfu。对两轮Panning后的菌液进行适度稀释，铺于SOBAG琼脂板上，经培养后，1∶1000，1∶100、1∶10和原液等四个稀释度的平皿上分别长出11、205、302和1000以上菌落，分隔良好的菌落用于下一步单个克隆重组噬菌体的ELISA鉴定。

(五)单个重组噬菌体克隆的抗原结合活性鉴定

ABTS显色后，94个克隆中，共有18个克隆呈现阳性反应，其OD值见表2，阳性克隆检出率约为19％。

表2  胃癌细胞膜抗原结合反应阳性噬菌体克隆ELISA显色的光吸收值

clone    B7     C1    C2    C3    C5    C7    C8    C9    F6       F7

OD410    0.26   0.42  0.38  0.41  0.40  0.37  0.49  0.30  0.38     0.24

clone    F8     G1    G8    G9    H2    H3    H7    H9    阳性对照 阴性对照

CD410    0.40   0.37  0.30  0.28  0.18  0.38  0.32 0.31   1.71     0.01

二、ScFv基因的序列测定和分析

(一)ScFv-C1基因序列测定

分别用fmol DNA Sequencing system和全自动荧光测序仪对ScFv-C1进行核苷酸序列测定，结果表明，基因全长720bp，VH基因长度为354bp，VL为321bp，linker序列为45bp。VH、VL符合小鼠Ig可变区结构。Linker序列正确。基因核苷酸序列如下。

CAG GTC CAA CTG CAG CAG TCT AGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTG

AAA CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAT TGG ATG CAC TGG

GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT AAT CCT AGC

AAC GGT CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAC TTC AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTT

GAC AAA TCC TCC AGC TCA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC

TCT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA TAT GAG GAC TAC GAT CTC CAT GAC TAC TGG

GGC CAA GGG ACC TCG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT

GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC AAG CTC ACT CAG TCT CCA ACC GCC ATG

GCT GCA TCT CCC GGG GAG AAG ATC ACT ATC ACC TGC AGT GCC AGT CAG ACA TAC

AAC TTA GTA ATG TGG TAC CAA CAG AAG TCA GGG ACC TCT CCT AAA CCC TGG ATT

TAT AGG ACA TCC AAT CTG GCT TCT GGA GTC CCA GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG

TCT GGG ACT TCT TAC TCT CTC ACA ATT GGC ACC ATG GAA GCT GAA GAT GTT GCC

ACT TAC TAC TGC CAG CAG AGT AGT ACT TTA CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA

AAG TTG GAA ATA AAA CCG

(二)ScFv-C1基因序列的计算机分析

1、VHC1基因序列计算机分析

1)基因同源性分析

将VHC1基因序列输入计算机与Internet网中的所有基因数据库中的已知基因进行同源性比较，其同源序列均为鼠Ig重链可变区基因，与之同源性最高的为MM2F2A(分数1464)，该基因为记忆B淋巴细胞体细胞突变产生M.Musc□lusm RNA。

2)氨基酸序列的推导分析

VHCI基因长度为354bp，系一开放读框，基因内无终止码，可编码118个氨基酸，氨基酸序列见图4。VHCI有明确的4个FR区和3个CDR区，CDR1区：第31位-35位，CDR2区：第50位-66位，CDR3区，第99位-107位，其中第22位和第96位为抗体可变区特征性的恒定半胱氨酸残基，表明该序列符合小鼠Ig重链可变区的氨基酸序列特征。VHCI氨基酸序列推导为：

Q  V  Q  L  Q  Q  S  R  A  E  L  V  K  P  G  A  S  V  K  L  S  C  K  A

CAGGTCCAACTGCAGCAGTCTAGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAACTGTCCTGCAAGGCT

          12          24          36          48          60          72

S  G  Y  T  F  T  S  Y  W  M  H  W  V  K  Q  R  P  G  Q  G  L  E  W  I

TCTGGCTACACCTTCACCAGCTATTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATT

          84          96         108         120         132         144

                         CDR1

G  E  I  N  P  S  N  G  R  T  N  Y  N  E  N  F  K  S  K  A  T  L  T  V

GGAGAGATTAATCCTAGCAACGGTCGTACTAACTACAATGAGAACTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTT

         156         168         180         192         204         216

                         CDR2

D  K  S  S  S  S  A  Y  M  Q  L  S  S  L  T  S  E  D  S  A  V  Y  Y  C

GACAAATCCTCCAGCTCAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGT

        228         240         252         264         276         288

A  R  Y  E  D  Y  D  L  H  D  Y  W  G  Q  G  T  S  V  T  V  S  S

GCAAGATATGAGGACTACGATCTCCATGACTACTGGGGCCAAGGGACCTCGGTCACCGTCTCCTCA

           300         312         324         336         348

               CDR3

2、VIC1基因在序列的计算机分析

1)基因同源性分析

将VLC1基因在序列输入计算机与Internet网中的所有基因数据库中的已知基因进行同源性比较，其同源序列均为鼠Ig Vk基因，与之同源性最高的为S61341(分数1074)，该基因为小鼠F10杂交瘤IgK轻链mRNA。

2)氨基酸序列的推导分析

VLCI基因长度为321bp，系一开放读框，可编码107个氨基酸，序列中有明确的4个FR区和3个CDR区。CDR1区：第24位-33位，CDR2区：第49位-55位，CDR3区，第88位-96位，在第23位和第87位为特低性的恒定半胱氨酸残基，表明其结构符合鼠Ig轻链可变区的氨基酸序列特征。VLCI氨基酸序列推导为：

 D  I  K  L  T  Q  S  P  T  A  M  A  A  S  P  G  E  K  I  T  I  T  C  S

GACATCAAGCTCACTCAGTCTCCAACCGCCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGT

          12          24          36          48          60          72

A  S  Q  T  Y  N  L  V  M  W  Y  Q  Q  K  S  G  T  S  P  K  P  W  I  Y

GCCAGTCAGACATACAACTTAGTAATGTGGTACCAACAGAAGTCAGGGACCTCTCCTAAACCCTGGATTTAT

          84          96         108         120         132         144

     CDR1

 R  T  S  N  L  A  S  G  V  P  A  R  F  S  G  S  G  S  G  T  S  Y  S  L

AGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACTTCTTACTCTCTC

      156         168         180         192         204         216

      CDR2

 T  I  G  T  M  E  A  E  D  V  A  T  Y  Y  C  Q  Q  S  S  T  L  P  F  T

ACAATTGGCACCATGGAAGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGAGTAGTACTTTACCATTCACG

         228         240         252         264         276         288

                                                            CDR3

 F  G  S  G  T  K  L  E  I  K  P

TTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACCG

         300         312

三、ScFv-C1在大肠杆菌中的表达和活性检测

(一)ScFv-C1在大肠杆菌中的表达

含重组噬菌体的阳性克隆经IPTG诱导可表达ScFv-E-tag融合蛋白，预期分子量约为30KDa，将表达产物经PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，诱导组和未诱导组的蛋白带未见明显差异，见图3。图3是本发明ScFv-CI表达产物考马斯亮兰染色结果图。，其中M：标准蛋白；U：未诱导细菌外周质；T：IPTG诱导后的细菌外周质。以抗E-tag抗体进行WesternBlot，可见诱导组的细菌外周质和上清有大小为30KD的表达蛋白，而未诱导组未见有蛋白的表达，见图4。图4是本发明ScFv-CI表达产物Western Blot的结果图。其中M：标准蛋白；U：未诱导；I：IPTG诱导。

(二)ScFv C1的活性测定

采用间接免疫荧光染色，并用流式细胞仪分析ScFvC1与三种不同细胞系的亲和活性，结果提示：ScFvC1与正常胃粘膜细胞无亲和活性，ScFvC1与胃癌细胞系SGC-7901有较强的亲和活性，而与肝癌细胞系SMMC-7701亦有一定的交叉反应。

Claims (4)

1、一种抗人胃癌单链抗体，其特征在于：该单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

2、根据权利要求1所述的抗人胃癌单链抗体，其特征在于：该抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

3、根据权利要求1所述的抗人胃癌单链抗体，其特征在于：该抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

4、权利要求1所述的抗人胃癌单链抗体在制备治疗胃癌药物中的应用。

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