CN1489473A - 沉默型抗cd-28抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供：缺乏促有丝分裂活性的抗CD28抗体(沉默型抗CD28抗体)、生产方法、包含所述抗体的组合物以及免疫抑制、诱发T细胞耐受及治疗器官和/或组织移植排斥的方法。

Description

沉默型抗CD-28抗体及其应用
发明领域
本发明涉及缺乏促有丝分裂活性的抗CD-28抗体及其应用。
发明背景
免疫反应，尤其是器官的移植排斥，主要起因于T淋巴细胞的活化。T细胞的这种活化由一种来自抗原呈递细胞(APC)的信号诱导。来自APC的该信号通过T细胞受体(TCR)而涉及第一信号，通过共同刺激分子而涉及第二信号(共同刺激信号)。当APC通过TCR来呈递T细胞抗原时，所述第一信号来自肽抗原的主要组织相容性抗原(MHC)复合体。所述第二信号由几种共同刺激分子介导；所述共同刺激分子的实例包括：在APC一侧称为配体的B7(B7-1(CD80)和B7-2(CD86))以及在T细胞一侧作为受体的CD28、CTLA-4等等。配体B7是一种属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白，而且在属于抗原呈递细胞类群的B细胞等中表达。识别作为共同配体之B7的CD28和CTLA-4都是属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白。因此，通过同时转导经由TCR的第一信号和来自例如B7和CD28/CTLA-4的第二信号，来调节T细胞的活化。已经知道，从B7到CD28的信号促进T细胞的活化，而从B7到CTLA-4的信号则抑制T细胞的活化[Waterhouse等，Science，270：985-988(1995)]。
到现在为止，为了诱导免疫抑制或耐受，已尝试通过给予CTLA-4Ig、抗B7-1抗体/抗B7-2抗体、抗CD28抗体等来阻断B7-CD28信号。例如，CTLA-4Ig结合B7，从而干扰B7与CD28之间的反应，且因此阻断来自CD28的信号，显示出免疫抑制活性。但是，由于B7与CTLA-4之间的反应同时也被抑制，因而也抑制对T细胞活化起负调节作用的CTLA-4信号，以致于无法诱发所需的耐受(Kirk等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：8789-8794(1997))。此外还制备了抗B7抗体，据报道抗B7抗体仅仅在CTLA-4Ig情况下抑制T细胞活化，该抗体也抑制CTLA-4信号。在体外实验中，发现抗CD28抗体对T细胞产生促有丝分裂效应，而且用这种抗体和抗CD3抗体的联合刺激则促进T细胞的生长与活化，并增加细胞因子的产量[WO 90/05541，Eur.J.Immunology，16，1289-1296(1986)等等]。此外，在体内激发出抗CD28抗体对T细胞CD28受体的促有丝分裂刺激，导致类似于从B7到CD28之第二信号的T细胞活化信号的产生[Yin等，J.Immunology，163：4328-4334(1999)]。这些T细胞活化功能则暗示：可以在癌症和艾滋病(AIDS)治疗中将抗CD28抗体用作免疫增强剂(WO 90/05541)。
                     发明概述
用常规技术制备的抗CD28抗体对T细胞产生促有丝分裂的作用。虽然并不完全了解这种促有丝分裂活性的原因，但据信抗CD28的Fc区与抗原呈递细胞Fc受体的结合是可能的原因(Cole等，J.Immunology，36：159(1997))。因此，我们通过使用基因工程技术，将突变引入到抗CD28抗体的Fc受体的结合位点中，从而修饰该抗体，使得它不再会具有促有丝分裂活性。本发明人已制备出一种这样的抗体-TN228 IgG2M3，在该抗体中，IgG2M3在IgG基因中有两个氨基酸的取代。而且，我们证实了所产生的沉默型抗CD28抗体没有促有丝分裂的活性，这对于诱导T细胞耐受是非常有用的。
因此，本发明提供没有促有丝分裂活性的抗CD28抗体(在下文中称之为沉默型抗CD28抗体)，并提供通过用所述抗体来抑制免疫反应(尤其是移植排斥)且诱发免疫耐受的方法。
本发明的一个目标是沉默型抗CD28抗体，其中所述抗CD28抗体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。所述抗CD28抗体的可变区可包括用SEQ ID NO：2、4、6和8中所示的氨基酸序列以及编码这样氨基酸序列的多核苷酸。例如，这样的多核苷酸包括SEQ ID NO：1、3、5和7。
本发明的另一个目标是：包含编码所述抗CD28抗体的多核苷酸的载体与细胞宿主。
本发明的又一个目标是：通过在允许所述多核苷酸表达的条件下，培养包含编码抗CD28抗体的多核苷酸的细胞宿主并且收集所产生的该基因产物，来生产沉默型抗CD28抗体的方法。
本发明的再一个目标是包含一种或更多种沉默型抗CD28抗体的药用组合物，最好是与一种或更多种药学上可接受成分混合的所述药用组合物。
所述沉默型抗CD28抗体可用于诱发T细胞耐受、免疫抑制，且可用作器官或组织移植排斥的一种预防/治疗药。因此，本发明提供：通过给予哺乳动物一种或更多种沉默型抗CD28抗体来诱发T细胞耐受、免疫抑制的方法，以及在器官或组织移植排斥期间通过给予哺乳动物一种或更多种沉默型抗CD28抗体来达到预防性或治疗性治疗的方法。最好是以本文描述的药用组合物形式来给予这样的沉默型抗CD28抗体，且可以包含合适的附加药/药物。
                     附图简述
图1：表达ChTN228抗体用的质粒构建体。将鼠TN228的VL和VH构建成邻接XbaI位点的小外显子。把所述VL序列插入到表达载体pVk中，而将所述VH序列插入到表达载体pVg2M3中。
图2：小外显子中ChTN228轻链的核苷酸序列以及推定的氨基酸序列。信号肽序列用斜体表示。CDR以下划线标注。成熟的轻链以天冬氨酸残基(粗体字母)开始。非翻译序列和内含子序列用小写字母表示。(SEQ ID NO：1和2)。
图3：小外显子中ChTN228重链可变区的核苷酸序列以及推定的氨基酸序列。信号肽序列用斜体表示。CDR以下划线标注。成熟的重链以谷氨酰胺残基(粗体字母)开始。非翻译序列和内含子序列用小写字母表示。(SEQ ID NO：3和4)。
图4：竞争实验。将P815/CD28+细胞与25ng MuTN228-FITC和所描述的或者ChTN228、或者MuTN228的2倍连续稀释液一起温育P815/CD28+。同样，将P815/CD28’细胞与单独的MuTN228-FITC一起温育，不加入任何竞争剂。将每个样品的通道荧光平均量对竞争剂的浓度作图。
图5：TN228-IgG2m3对人初次MLR(1)的抑制作用。分别显示了来自四个个体的初次MLR的百分抑制率。
图6：TN228-IgG2m3对人初次MLR(2)的抑制作用。分别显示了来自四个个体的初次MLR的百分抑制率。
图7：TN228-IgG2m3对二次MLR的作用。分别显示了来自两个志愿者的数据。以初次MLR中单独的Raji刺激作为100，以单独Raji刺激的dpm百分数的形式，来表示二次MLR中的[3H]-胸苷的摄入。TN228-IgG2m3：0.1mg/ml。
图8：表达HuTN228抗体用的质粒构建体。将人源化TN228的VL和VH构建成邻接XbaI位点的小外显子。把所述VL序列插入到表达载体pVk中，而将所述VH序列插入到表达载体pVg2M3中。
图9：小外显子中HuTN228重链可变区的核苷酸序列以及推定的氨基酸序列。信号肽序列用斜体表示。CDR以下划线标注。成熟的重链以谷氨酰胺残基(粗体字母)开始。(SEQ ID NO：5和6)。
图10：小外显子中HuTN228轻链可变区的核苷酸序列以及推定的氨基酸序列。信号肽序列用斜体表示。CDR以下划线标注。成熟的轻链以天冬氨酸残基(粗体字母)开始。(SEQ ID NO：7和8)。
图11：FACS竞争实验。用在实施例中描述的流式细胞仪竞争实验，分析了FITC标记的MuTN228在存在不同量竞争剂MuTN228抗体或HuTN228抗体的情况下与P815/CD28’细胞的结合。
图12：ELISA竞争实验。用在实施例中描述的ELISA竞争实验，分析了生物素化的MuTN228在存在不同量竞争剂MuTN228抗体或HuTN228抗体的情况下与sCD28-Fc的结合。
图13：I-125竞争实验。用在实施例中描述的125I标记抗体竞争实验，分析了125I标记的MuTN228在存在不同量竞争剂MuTN228抗体或HuTN228抗体的情况下与P815/CD28+细胞的结合。
图14：表达PV1-IgG3抗体用的质粒构建体。将PV1的VL和VH构建成邻接XbaI位点的小外显子。把所述VL序列插入到表达载体pMVk.rg.dE中，而将所述VH序列插入到表达载体pMVg3.D.Tt中。然后，重组所述两种质粒，产生共表达PV1-IgG3重链和PV1-IgG3轻链的单一质粒。
图15A：小外显子中所述轻链和重链的cDNA序列以及推定的氨基酸序列。CDR以下划线标注。成熟的轻链以位于位置20的天冬氨酸残基(双下划线标注的)开始。(SEQ ID NO：9和10)。
图15B：小外显子中的PV1可变区的cDNA序列以及推定的氨基酸序列。CDR以下划线标注。成熟的重链以位于位置20的谷氨酰胺(双下划线标注的)开始。(SEQ ID NO：11和12)。
图16：按照方法中描述的，运用HPLC，通过大小排阻层析而进行的PV-1-IgG3分析。根据蛋白在280nM的吸光度来监测蛋白。
图17：小鼠IgG3同种型对照(泳道1)、PV1(泳道2)以及PV1-IgG3(泳道3)的SDS-PAGE分析。A板中的蛋白在非还原条件下电泳，并B板中的蛋白在还原条件下电泳。MW表示分子量标记。所列数字是以kD为单位的MW标准。
图18：用PV1(A)、37.51(B)或PV1-IgG3(C)染色的且用流式细胞仪分析的EL4细胞。所用的第二抗体是：用于PV1的缀合FITC的驴抗亚美尼亚仓鼠IgG(H+L)，用于37.51的缀合FITC的驴抗金黄仓鼠IgG，以及用于PV1-IgG3的缀合FITC的山羊抗小鼠κ。实线的分布图表示仅被第二抗体染色的细胞。虚线分布图表示被方法中描述的第一抗体和第二抗体两者染色的细胞。小鼠IgG3同种型对照不使EL4细胞染色(数据未显示)。
图19：(A)过量的PV1或PV1-IgG3与缀合R-PE的PV1竞争与EL4细胞的结合。在流式细胞术频率分布图中的细实线(黑色)表示没有染任何色的细胞，粗实线(深蓝色)表示仅被R-PE-PV1染色的细胞，细虚线(洋红色)表示被R-PE-PV1和过量未缀合的PV1染色的细胞，而细的双虚线(淡蓝色)表示被R-PE-PV1和过量未缀合的PV1-IgG3染色的细胞。过量的小鼠IgG3同种型对照对R-PE-PV1与EL4细胞的结合没有影响(数据未显示)。(B)过量的145.2C11或145.2C11-IgG3与缀合R-PE的145.2C11竞争结合到EL4细胞上。细实线(黑色)表示无任何染色的细胞，粗实线(深蓝色)表示仅被R-PE-145.2C11染色的细胞，细虚线(洋红色)表示被R-PE-145.2C11和过量未缀合的145.2C11染色的细胞，而细的双虚线(淡蓝色)表示被R-PE-145.2C11和过量未缀合的145.2C11-IgG3染色的细胞。(C)过量的PV1与PV1-IgG3竞争结合EL4细胞。用PV1-IgG3和过量的PV1将EL4细胞染色，或在没有过量PV1的情况下用PV1-IgG3将EL4细胞染色。洗涤细胞，并用小鼠IgG3特异性的、缀合FITC的驴抗小鼠IgG(H+L)将其染色。细实线(黑色)表示仅被第二抗体染色的细胞，粗实线(深蓝色)表示被PV1-IgG3和第二抗体染色的细胞，而细虚线(洋红色)表示被PV1-IgG3和过量的PV1以及第二抗体染色的细胞。
图20：用PV1-IgG3和145.2C11染色的鼠脾细胞。用小鼠IgG3同种型对照(A)或PV1-IgG3(B)将细胞染色，用缀合R-PE的山羊抗小鼠IgG和缀合FITC的145.2C11复染细胞，并用材料与方法中描述的双色流式细胞术分析细胞。仅分析淋巴细胞闸门中的细胞。PV1-IgG3阳性细胞在上面的“象限”中，而CD-3阳性细胞在右边的“象限”中。每个“象限”中的数字表示在那特定“象限”中的细胞的百分数。
                     发明详述
在本发明范围内，术语“沉默型抗CD28抗体”意指缺乏促有丝分裂活性的任何抗CD28抗体。更准确地说，它是特异性结合T细胞表面上的抗原CD28受体并且不会通过与抗CD3抗体联合刺激而促进T细胞生长或活化的抗体。
可以在抗CD28抗体的基础上或在产生抗CD28抗体的杂交瘤的基础上，通过用基因工程技术或通过化学修饰，使具有激动性的抗CD28抗体突变或将其修饰，来构建沉默型抗CD28抗体。以基因工程技术的运用为例，通过将突变引入到所述抗体Fc区的氨基酸序列中，可降低或消除抗CD28抗体对Fc受体的结合亲和性。例如，通过从能够产生抗CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离cDNA，且将突变引入到与在结合Fc受体过程中起重要作用的Fc区域相对应的序列区中，则可获得沉默型抗CD28抗体(WO 88/07089)。对于突变的位点并无特别的限制，因为都可以抑制与Fc受体的结合。因此，在IgG类抗体的情况下，例如H-链氨基酸残基234、235、236、237、318、320和322是优选的，且可通过用不同的氨基酸来取代这些氨基酸中的至少一种而构建沉默型抗CD28抗体。
可根据应用所述抗体的靶动物，来审慎地选择这样的沉默型抗CD28抗体之来源。例如，非人类的单克隆抗体含有在人类中在相当宽泛的范围内显示抗原性的氨基酸序列。许多研究已显示：在注射抗体之后，患者对外来抗体的免疫应答非常强烈；且只给予该抗体，可能使患者进入危险状态之中或可使该抗体失去治疗效用。因此，值得推荐的是：取代Fc区以便使所述抗体与治疗靶动物相对更同源，取代可变区的构架部分，或使用从已经引入了所述抗体基因的转基因动物获得的所述抗体。例如，当要把所述抗体给予人时，则可用以下抗体：通过取代Fc区可获得的嵌合抗体(EP125023)、构架部分被取代的人源化抗体(EP0239400，EP045126)、或从已经引入了所述人抗体基因的转基因动物获得的人抗体(EP546073，WO 97/07671)。通过用基因工程技术例如上述那些技术在这些抗体中引入突变，或通过化学修饰而在这些抗体中引入突变，可降低或消除所述抗体的促有丝分裂活性。
作为具有沉默型Fc区的抗CD28抗体的具体实例，不仅可提到下文实施例部分中描述的抗体，而且可提到用所治疗靶动物的恒定区基因与基于SEQ ID NO：2和4或SEQ ID NO：6和8所示可变区氨基酸序列的可变区多核苷酸合成制备的抗体。这样的多核苷酸的实例是SEQ ID NO：1、3、5和7。
本发明的更具体的实例是HuTN228和MuTN228以及其Fab片段、其F(ab)’2片段、其衍生物等等。
正如本领域技术熟练人员所想到的，由于第3个碱基的简并性，几乎每种氨基酸在核苷酸编码序列中，都可以由不止一个三联体密码子来表示。而且，较小的碱基对变化可能导致所编码氨基酸序列的变异(保守取代)；但预计不会显著改变所述基因产物的生物学活性。因此，在序列上，可略微修饰编码本文所公开的蛋白或肽的核酸序列(例如取代三联体密码子中的一个核苷酸)，但该序列仍编码其相应的、同样氨基酸序列的基因产物。
术语“表达载体”是指编码本发明之肽且提供在所选宿主细胞中表达该肽所必需之序列的多核苷酸。表达载体通常会包含转录启动子和终止子，或者将为邻近内源启动子掺入创造条件。表达载体通常会是进一步包含一个复制起点以及一个或更多个选择标记的质粒。然而另一方面，表达载体可以是被设计来感染宿主的病毒重组子，或是设计用于在宿主基因组内的一个优选位点整合的整合型载体。在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook，Fritsch和Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中，公开了表达载体的实例。
用于表达沉默型抗CD28抗体的合适宿主细胞包括：原核生物、酵母、古细菌(archae)和其它真核细胞。供细菌、真菌、酵母以及哺乳动物细胞宿主使用的合适的克隆载体与表达载体是本技术领域众所周知的，例如，Pouwels等，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，New York(1985)。所述细胞最好是哺乳动物细胞。所述载体可以是质粒载体、单链或双链噬菌体载体、或者单链或双链RNA或DNA病毒载体。可以用众所周知的把DNA和RNA导入到细胞中的技术，以多核苷酸的形式，且最好是以DNA的形式，将这样的载体引入到细胞中。在噬菌体和病毒载体的情况下，用众所周知的感染和转导技术，也可以且优选以包装病毒或有包膜病毒的形式，将所述载体引入到细胞中。病毒载体可以是具有复制能力的或是复制缺陷型的。在后一种情况下，病毒繁殖通常将仅仅发生于互补的宿主细胞中。也能使用来源于本发明DNA构建体的RNA，用无细胞翻译系统来生产所述蛋白。
可以按蛋白质化学领域中通常已知的蛋白分离/纯化的方法，来纯化沉默型抗CD28抗体/蛋白。更详细地讲，可以提到例如：提取，重结晶，用硫酸铵、硫酸钠等等的盐析，离心，透析，超滤，吸附色谱，离子交换层析，疏水层析，正相层析，反相层析，凝胶过滤法，凝胶渗透层析，亲和层析，电泳，逆流分配等等以及这些方法的组合。
按照本发明，可以用上面描述的重组表达系统来生产纯化的抗体。该方法包括：在足以促进所述蛋白表达的条件下，培养用含有编码该蛋白之DNA序列的表达载体转化的宿主细胞。然后，依所用的表达系统而定，从培养基或细胞抽提物中回收该蛋白。正如技术人员所知道的，纯化重组蛋白的步骤，将根据诸如所用宿主细胞的类型以及该重组蛋白是否被分泌到培养基中的因素而变化。
如果把沉默型抗CD28抗体配制成一种药用组合物，则可以将其用于：(a)器官或组织移植后的移植排斥，所述器官或组织例如心、肾、肝、骨髓、皮肤、角膜、肺、胰、小肠、肌肉、神经等等；(b)骨髓移植时的移植物抗宿主反应；(c)例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、I型糖尿病等等的自身免疫疾病；以及(d)例如哮喘、特应性皮炎等等的免疫疾病。
虽然可以预计沉默型抗CD28抗体本身抑制免疫反应和移植排斥并诱发免疫耐受，但也可以与其它药物联合使用。在这样的可用于与沉默型抗CD28抗体联合的其它药物之中，有各种各样的免疫抑制药，例如雷帕霉素、脱氧精胍菌素、抗CD40抗体、抗CD40L抗体、普乐可复、环孢菌素A、抗IL-2抗体、抗IL-2受体的抗体以及MMF。特别是雷帕霉素，抑制来自IL-2受体的信号中的涉及T细胞生长信号的转导，而不抑制凋亡相关信号的转导；因此预期它与CD28信号的特异性抑制剂的联用将是有用的。
可以口服或非肠道给予本发明的沉默型抗CD28抗体，优选通过静脉内途径、肌内途径或皮下途径给予。
可以以溶液或冻干粉的形式，制备本发明的沉默型抗CD28抗体；且必要时，可以用药学上可接受的各种添加剂例如赋形剂、稀释剂、稳定剂、等渗剂以及缓冲剂，来配制本发明的沉默型抗CD28抗体。优选的添加剂包括：糖例如麦芽糖、表面活性剂例如聚山梨酸酯、氨基酸例如甘氨酸、蛋白质例如人血清白蛋白、以及盐例如氯化钠。
同样，可依据给药方式而适当地选择剂型，所述剂型例如注射剂(溶液系、混悬剂、乳剂、在使用时溶解的固体等等)、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、脂质体包含物、油膏、凝胶剂、外用散剂、喷雾剂、吸入粉剂、滴眼剂、眼膏剂、栓剂、阴道栓剂等等；且可以相应地配制本发明的肽。在Comprehensive Medicinal Chemistry，第5卷，Hansch等编辑，Pergamon Press 1990的25.2章节中，全面描述了制剂。
本发明药用组合物的剂量尤其取决于具体的组合物、作为治疗或预防目标的疾病的类型、给药方式、患者的年龄和健康状况以及治疗的持续时间。然而，在静脉内给予、肌内给予或皮下给予的情况下，每天可给予每个成人0.01-100mg/kg，优选给予0.1-10mg/kg。
当使用本发明的沉默型抗CD28抗体抑制移植排斥或诱发免疫耐受时，在器官或组织移植后，可通过静脉注射、肌内注射或皮下注射，以大约1mg/kg/天的剂量，在临移植前、刚移植之后，以及在移植后3天、7天、12天、18天、25天、35天、45天和60天，给予所述组合物。在监测移植后的排斥反应过程的同时，可以审慎地增加或减少给药的频率和剂量。
虽然给药的间隔尤其取决于所用给药方式与患者的病症；但不仅连续给药、而且间歇给药，都是可行的。如此，由于本发明的沉默型抗CD28抗体是一种抗体，因而它提供一种持续的作用，以致于间歇给药可以获得所期望的功效。至于治疗期，一旦建立了耐受状态，则即使停止使用沉默型抗CD28抗体，也可以保持这种耐受性。在这方面，这种沉默型抗CD28抗体无疑优于停用后免疫抑制作用下降的其它免疫抑制药。
                        实施例
已经概括地描述了本发明，通过参考本文提供的某些具体实施例，可进一步理解本发明，提供所述实施例仅为了说明，而非限制性的，除非另有说明。除非另有详细描述，用本领域技术人员众所周知的且常规的标准技术，来实施下面的实施例。
实施例1  小鼠抗人CD28抗体的氨基酸序列测定
产生抗人CD28抗体的杂交瘤(克隆：TN228，小鼠IgG1κ)由Yagita博士(Juntendo University School of Medicine，Japan))慷慨提供。让大约0.2mg纯化的抗人CD28抗体(TN228)在0.64M盐酸胍、pH8.5的0.28M Tris-HCl、0.055M DTT中，于60℃(在氩中)还原达90分钟，在室温(于黑暗中)通过添加碘乙酸至0.13M而进行羧甲基化达45分钟，继之以添加DTT至0.32M(终止羧甲基化反应)，并立即用一根PD-10柱(目录号17-0851-01，Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweeden)使其在0.1M磷酸钠、pH8.0的0.002M EDTA中进行缓冲液交换。将洗脱物调至0.005M DTT、0.02％的甘油；且把该溶液的三分之一(大约0.35ml)转移至一根单独的管中，供重链N末端的去封闭。用1800μU焦谷氨酸氨肽酶(目录号7334，Takara Shuzo Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)于45℃消化该样品达24小时。通过20个循环的自动Edman降解以及用241型蛋白序列测定仪(Model 241 Protein Sequencer)(HewlettPackard，Palo Alto，CA)的PTH分析，测定来自去封闭样品的轻链和重链的N末端序列。用一根Hypersil ODS C18柱来分析PTH衍生物。按照制造商的说明书，用得自Hewlett Packard的试剂、溶剂及柱，操作所述序列测定仪和HPLC。
用焦谷氨酸氨肽酶去封闭的TN228的N末端测序的结果如下：
 残基号  氨基酸  残基号  氨基酸  残基号  氨基酸  残基号  氨基酸
 1  D，Q  6  Q，E  11  L  16  G，Q
 2  I，v  7  s  12  A，V  17  Q，S
 3  V，Q  8  P，G  13  V，A  18  R，L
 4  L  9  A，P  14  S，P  19  A，S
 5  T，K  10  S，G  15  L，S  20  T，I
实施例2  可变区cDNA的克隆
用Co等描述的锚式聚合酶链式反应(PCR)法(Co，M.S.，N.M.Avadalovic，P.C.Caron，M.V.Avadalovic，D.A.Scheinberg和C.Queen.1992.对CD33抗原具有特异性的嵌合抗体和人源化抗体.J.Immunol.148：1149-1154)，从所述杂交瘤细胞克隆TN228的轻链和重链V区cDNA。运用分别退火到小鼠κ链C区和γ链C区上的3’引物以及退火到添加的cDNA之G尾上的5’引物，在cDNA上进行扩增。对于VLPCR，所述3’引物具有以下序列(SEQ ID NO：13)：5′TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC 3′其残基17-46与小鼠Cκ区杂交。对于VH PCR，所述3’引物具有以下简并序列(SEQ ID NO：14、15和16)：
                            A        G   T5′TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTTTGGC 3′
                              T其残基17-50与小鼠IgG CH1杂交。两个引物组中的非杂交序列包含供克隆用的限制性酶切位点。将VL cDNA和VH cDNA亚克隆到TOPOII Blunt载体(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)中供序列测定。
从两个独立的聚合酶链式反应，对几个轻链与重链克隆进行序列测定。至于所述轻链，鉴定出两种与小鼠轻链可变区同源的独特序列。一种VL序列由于移码突变，是无功能的，被鉴定为非生产性等位基因。另一种VL序列是一种功能性小鼠κ链可变区的典型。对于所述重链，鉴定出一种与典型的小鼠重链可变区同源的独特序列。在图2和图3中，描绘了其可变区的核苷酸序列及其推定的氨基酸序列。
实施例3  嵌合TN228-IgG2M3的构建与表达
(方法)
按照He等(He，X.Y.，Z.Xu，J.Melrose，A.Mullowney，M.Vasquez，C.Queen，V.Vexler，C.Klingbeil，M.S.Co和E.L.Berg.1998.对E-选择蛋白和P-选择蛋白都有特异性的单克隆抗体的人源化及药物代谢动力学.J.Immunol.160：1029-1035)所描述的，通过PCR，将TN228的VL和VH转变成邻接XbaI位点的小外显子区段；并将其亚克隆到所述轻链和重链表达质粒(图1)中。每个小外显子包含一段信号肽序列、一段成熟可变区序列和一段来源于同源性最高的小鼠J链基因的剪接供体序列。用这样的剪接供体序列，将所述V区外显子剪接到人抗体的恒定区上。在把小外显子克隆到表达载体中之后，测定每个小外显子的序列，以确保得到正确的序列且没产生PCR差错。同样，通过序列测定，来确认轻链和重链表达质粒的所述恒定区外显子。
在本说明书中，ChTN228是指一种包含小鼠TN228 VL和VH可变区、人IgG2M3的重链恒定区以及人轻链κ恒定区的嵌合抗体。来自人种系2基因组片段的该重链恒定区是修饰过的(Cole，M.S.，C.Anasetti和J.Y.Tso.1997.嵌合抗CD33的人IgG2变异体对T细胞无促有丝分裂性.J.Immunol.159：3613-3621)，且该轻链来源于人种系K基因组片段。所述重链基因和轻链基因都由人巨细胞病毒的主要立即早期启动子和增强子驱动。所述重链基因后接来源于人补体基因C2的转录终止子(Ashfield，R.，P.Enriquez-Harris和N.J.Proudfoot.1991.紧密连锁的人补体基因C2与B因子之间的转录终止：C2和c-myc的共同终止因子？EMBO J.10：4197-4207)。轻链选择标记gpt基因(Mulligan，R.C.和P.Berg.1981.表达大肠杆菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶编码基因的动物细胞的选择.Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：2072-2076)和重链选择标记dhfr基因(Simonsen，C.C.和A.D.Levinson.1983.一种改建的小鼠二氢叶酸还原酶cDNA的分离与表达.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2495-2499)都由SV40早期启动子驱动。为了表达嵌合TN228，用脂质转染胺(目录号10964-013，GIBCO BRL)完成转染到COS-7细胞(猴肾细胞系)中的瞬时转染。用山羊抗人IgGγ链的特异性抗体作为捕获试剂，且用缀合HRP的山羊抗人κ链抗体作为显色试剂，通过ELISA，对瞬时转染子用过的培养基分析人IgG2M3抗体的产生。此外，还通过间接免疫荧光染色，对所述用过的培养基测试ChTN228结合到P815/CD28+细胞(用CD28转染P815(小鼠肥大细胞瘤)所得的稳定转染细胞)上的能力；并用流式细胞仪进行分析。至于稳定细胞系的产生，则通过电穿孔，使嵌合表达质粒转染到鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0中；且根据gpt的表达而挑选出转染子。关于瞬时转染，通过ELISA，分析稳定转染子用过的培养基。
结果
通过PCR，将克隆的VL基因和VH基因转变成小外显子(图2和图3)，并将其亚克隆到上面描述的和图1所示的轻链和重链表达载体中。
COS-7细胞的瞬时转染：使所述嵌合表达载体瞬时转染到猴肾细胞系COS-7中，以产生嵌合TN228+抗体。而通过ELISA来检验所述转染细胞用过的培养基的嵌合IgG2M3抗体的产生情况；且P815/CD28+用流式细胞仪检验所述转染细胞用过的培养基与P815/CD28+细胞结合的情况。在两种分析中，用过的培养基都是阳性的。来自瞬时转染的嵌合抗体的产量大约是0.9μg/ml。来自瞬时上清液的ChTN228抗体以依赖浓度的方式结合到P815/CD28+细胞上(数据未显示)。
Sp2/0细胞的稳定转染：为了产生稳定的细胞系，而将所述嵌合表达载体转染到Sp2/0细胞中。检验几种转染子用过的培养基中TN228嵌合抗体产生的情况；且如同所述瞬时转染子一样，检验与P815/CD28+细胞结合的情况。对于两种分析，大多数转染子是阳性的。一种转染子由于其抗体生产率较高而被挑选出，且将其培养扩大而使其在5升的无血清培养基中生长。通过亲和层析，从5升用过的培养基中纯化出ChTN228。纯化的抗体产量大约是25mg。
实施例4  嵌合抗体ChTN228的蛋白纯化
在5升的GIBCO杂交瘤无血清培养基(目录号12045-076，GIBCOBRL)中，培养来自稳定转染的ChTN228表达高的转染子中的一种(克隆7H)。当细胞生存力达到10％或更低时，收获用过的培养上清液；并将其浓缩至500ml，且用一台Pharmacia P1泵(2-3ml/分钟)，将其加样到一根5ml的蛋白-A Sepharose柱上。用PBS洗涤该柱，然后用0.1M甘氨酸、0.1M NaCl pH2.7洗脱所述抗体。对2升PBS透析所洗脱的蛋白，且更换PBS达3次；然后，将其加到一根用含有额外0.1M NaCl的PBS平衡的PD-10柱上，使其脱盐。在贮存于4℃之前，通过一张0.2mm的滤纸，过滤脱过盐的蛋白溶液。
实施例5  通过大小排阻HPLC和SDS-PAGE进行纯度测定
用由一台PE ISS 200 Advanced LC Sample Processor(样品处理器)、一台PE Series 410 Bio LC Pump(泵)、一台PE 235C Diode ArrayDetector(二极管阵列检测器)以及PE Nelson 600 Series LINK组成的Perkin Elmer HPLC系统，来进行大小排阻HPLC。使用Perkin ElmerTurbochrom Navigator Version 4.1软件，来控制自动进样器、泵与检测器；且用该软件来获得、储存及处理数据。用两根串联连接的TosoHaasTSK-GEL G3000SWXL大小排阻HPLC柱，来完成分离；所述柱的数据为：7.8mm×300mm，5mm的粒度，250的孔隙大小(目录号08541，TosoHaas，Montgomeryville，MD)。流动相是pH6.9的200mM磷酸钾/150mM氯化钾，且流速为1.00ml/分钟。用分光光度计在220nm波长和280nm波长下监测该柱的洗脱液。ChTN228样品的注射体积为50μl(50μg)。
按照标准步骤，用4-20％的梯度凝胶(目录号EC6025，Novex，SanDiego，CA)进行SDS-PAGE。
通过大小排阻HPLC和SDS-PAGE，来分析所分离的ChTN228的纯度。根据这一分析，该蛋白是96.5％的单体，且具有相当于分子量约160kD蛋白的迁移率。MuTN228、同种型对照MuFd79(小鼠IgG1)、ChTN228以及同种型对照HuEP5C7(人IgG2M3)在非还原条件下的SDS-PAGE分析也表明：所有四种抗体都有大约150-160kD的分子量。在还原条件下分析同样的四种蛋白则表明：所有四种抗体都是由一条分子量约50kD的重链和一条分子量约25kD的轻链组成的。
实施例6  竞争实验
方法
使用MuTN228-FITC抗体的从250ng/试验开始的二倍连续稀释液，来完成滴定实验。在冰上将P815/CD28+细胞(5×105个细胞/试验)与FITC标记的抗体一起孵育达1小时，然后用PBS洗涤且用流式细胞仪分析。至于竞争实验，将25ng MuTN228-FITC以及竞争性ChTN228或MuTN228抗体从800ng/试验开始的二倍连续稀释液，加到P815/CD28+细胞(5×105个细胞/试验)中。作为对照，将25ng单独的MuTN228-FITC与P815/CD28+细胞(5×105个细胞/试验)一起孵育(即没有任何竞争剂)。同样，测试作为竞争剂的HuEP5C7同种型对照抗体(800ng/试验)和MuFd79同种型对照抗体(800ng/试验)。在冰上(于黑暗中)，将细胞与抗体混合物一起以150ml的终体积孵育达1小时，然后洗涤，并用流式细胞仪分析。
结果
如在方法中所描述的，用流式细胞计量术竞争实验，比较MuTN228抗体和ChTN228抗体的结合特异性。将不同量未标记的MuTN228或ChTN228与25 ng FITC标记的MuTN228抗体相混合，并使其与P815/CD28’细胞温育。MuTN228和ChTN228都以依赖浓度的方式与MuTN228-FITC竞争，这表明这两种抗体与CD28抗原的结合是特异性的(图4)。同种型对照抗体MuFd79和HuEP5C7不与MuTN228-FITC竞争，表明MuTN228抗体和ChTN228抗体通过V区的特异性相互作用而识别CD28抗原。
实施例7  对人FR亲和性降低的嵌合抗人CD28抗体抑制初次混合淋巴细胞反应
细胞的制备
通过用Ficoll-Paque plus(Amersham Pharmacia Biotech，Tokyo，Japan)进行密度梯度离心，制备来自健康正常自愿者的人外周血单核细胞(PBMC)。用等体积的RPMI1640稀释人血，然后铺在Ficoll-Paque plus的上面。在室温离心30分钟后，收集外周血细胞单核细胞并用RPMI1640洗涤。此后，用培养基(含有2.5％的人AB型血清、2-巯基乙醇以及抗生素的RPMI1640)悬浮外周血细胞单核细胞，并将其加到一根尼龙纤维柱(Wako junyaku，Osaka，Japan)上。在5％CO2中于37℃孵育1小时后，用温热的培养基洗脱T细胞。
在混合淋巴细胞反应中，将人B细胞系(Raji和JY)用作刺激素细胞。这些细胞在使用之前经过X射线照射(2000R)。
初次混合淋巴细胞反应(初次MLR)
把纯化的人T细胞(1×105个细胞/孔)和照射过的Raji(1×105个细胞/孔)接种到96孔平底小平板中。向培养基中添加抗生素，并培养细胞7天。在最后的6小时培养中，用10kBq/孔的[3H]胸苷(AmershamPharmacia biotech)标记所有的培养物。收获细胞，并用液体闪烁计数器测量掺入的放射性。
在图5和图6中显示了TN228-IgG2m3(ChTN228)对初次MLR的影响。原始的抗人CD28抗体TN228(MuTN228)不抑制初次MLR，然而，嵌合抗体TN228-IgG2m3则以依赖剂量的方式抑制初次MLR。因此，将抗人CD28抗体的Fc区转变成对人Fc R亲和性降低的Fc区，则使得该抗体成为对T细胞增殖有拮抗性。
对人Fc R亲和性降低的抗人CD28嵌合抗体在二次混合淋巴细胞反应中减弱了T细胞的低应答性。
二次混合淋巴细胞反应(二次MLR)
把纯化的人T细胞(1×105个细胞/孔)和照射过的Raji细胞(1×105个细胞/孔)接种到96孔平底小平板中。向培养基中添加抗生素并孵育细胞。5天之后，收集细胞，用新鲜的培养基洗涤。用新鲜的培养基悬浮细胞，并培养所述细胞8天。用照射过的Raji细胞或JY细胞再刺激所述细胞。再培养7天之后，将10kBq/孔的[3H]胸苷与细胞一起孵育6小时。收获细胞，并用液体闪烁计数器测量放射性。
TN228-IgG2m3抑制初次MLR(图5和图6)。接着，我们分析这种抗体对二次MLR的影响。把所述抗体加到初次MLR培养物中，然后，从培养上清液中除去该抗体。在没有抗体的培养基中培养细胞之后，用同样的刺激细胞(Raji)或第三方刺激物(JY)再刺激细胞。与没有处理过的细胞的增殖相比，用TN228-IgG2m3通过初次MLR处理过的细胞的增殖减少。但是，用第三方刺激物(JY)，两种细胞增殖到几乎同样的程度(图7)。这个结果表明了对人Fc R亲和性降低的抗人CD28抗体可通过异源(alo-)抗原刺激而诱导T细胞的活力(energy)。
实施例8  人源化TN228可变区的设计
通过计算机建模，来分析MuTN228的V区序列。基于对Kabat抗体序列数据库(8.Johnson，G.和T.T.Wu.2000.Kabat数据库及其应用：在第一幅变异性图后的30年.Nucleic Acids Res.28：214-218)的序列同源性搜寻，挑选出IC4(Manheimmer-Lory，A.，J.B.Katz，M.Pillinger，C.Ghossein，A.Smith，B.Diamond.1991.带有抗DNA相关独特型的抗体的分子特征.J.Exp.Med.174：1639-1652)，来为人源化TN228的重链可变区和轻链可变区两者提供构架。人源化的TN228重链可变区在85个构架残基中有65个残基与小鼠TN228重链构架的残基相同，即有76％的序列同一性。人源化的TN228轻链可变区在80个构架残基中有56个残基与小鼠TN228轻链构架的残基相同，即有70％的序列同一性。
使用计算机程序ABMOD和ENCAD(Levitt，M.1983.天然蛋白的分子动力学.I.轨道的计算机模拟.J.Mol.Biol.168：595-620)，来构建TN228可变区的分子模型；用该模型来确定小鼠TN228构架中足够靠近CDR从而可能与它们相互作用的氨基酸的位置。为了设计人源化TN228的重链可变区与轻链可变区，将来自小鼠TN228重链的CDR移植到人IC4重链构架区中，且把来自小鼠TN228轻链的CDR移植到人IC4轻链的构架区中。在计算机模型提示值得注意的与所述CDR接触的构架位置，来自小鼠抗体的氨基酸取代了原始人构架的氨基酸。对于人源化的TN228，在重链残基27、29、30、48、67、71和78之处完成这种取代。对于轻链，不进行取代(即将MuTN228 CDR直接移植到IC4构架区中)。此外，至于在人抗体数据库中在相应位置上只是罕见的构架残基，则用那些残基位置上的人共有序列氨基酸来取代。对于人源化的TN228，在重链残基23、40、73、83和85之处以及在轻链残基69和77之处，进行这种取代。图9和图10显示了人源化TN228抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
实施例9  人源化TN228-IgG2M3的的构建与表达
方法
一旦如上所述设计了所述人源化可变区的氨基酸序列，则构建基因来编码它们，包括信号肽、剪接供体信号以及合适的限制酶位点(图8)。构建重链可变区基因和轻链可变区基因，并用长度为大约65-80个碱基的8种重叠合成寡核苷酸来扩增它们(He，X.Y.，Z.Xu，J.Melrose，A.Mullowney，M.Vasquez，C.Queen，V.Vexler，C.Klingbeil，M.S.Co和E.L.Berg.1998.对E-选择蛋白和P-选择蛋白都有特异性的单克隆抗体的人源化与药物代谢动力学.J.Immunol.160：1029-1035)。使所述寡核苷酸成对退火，并用DNA聚合酶I的Klenow片段将其延伸，产生四种双链片段。将所产生的片段变性，成对退火，且用Klenow片段将其延伸，产生两种片段。把这些片段变性，成对退火，且再一次将其延伸，而产生全长的基因。所产生的产物通过聚合酶链式反应(PCR)用Taq聚合酶将扩增，用凝胶纯化，并用XbaI消化；再次用凝胶纯化，然后亚克隆到用于表达重链的pVg2M3以及用于表达轻链的pVk的XbaI位点中。先前已描述了用于人γ2重链表达的pVg2M3载体(Cole，M.S.，C.Anasetti和J.Y.Tso.1997.嵌合抗CD33的人IgG2变异体对T细胞无促有丝分裂性.J.Immunol.159：3613-3621)以及用于人κ轻链表达的pVk载体(Co，M.S.，N.M.Avadalovic，P.C.Caron，M.V.Avadalovic，D.A.Scheinberg和C.Queen.1992.对CD33抗原具有特异性的嵌合抗体和人源化抗体.J.Immunol.148：1149-1154)。
通过核苷酸序列测定，来验证最终的重链质粒和轻链质粒的V区与恒定区外显子的序列。通过限制酶作图，来验证最终质粒的整个结构。按标准方法进行DNA的所有操作。
在本说明书中，HuTN228是指包含人源化TN228VH和VL可变区、人IgG2M3的重链恒定区以及人的轻链κ恒定区的人源化抗体。来自人种系2基因组片段的该重链恒定区是修饰过的(Cole，M.S.，C.Anasetti和J.Y.Tso.1997.嵌合抗CD33的人IgG2变异体对T细胞无促有丝分裂性.J.Immunol.159：3613-3621)，且该轻链来源于人种系K基因组片段。人巨细胞病毒的主要立即早期启动子和增强子既驱动重链基因、又驱动轻链基因。所述重链基因后面是来源于人补体基因C2的转录终止子(Ashfield，R.，P.Enriquez-Harris和N.J.Proudfoot.1991.紧密连锁的人补体基因C2与B因子之间的转录终止：C2和c-myc的共同终止因子？EMBO J.10：4197-4207)。轻链选择标记gpt基因(Mulligan，R.C.和P.Berg.1981.表达大肠杆菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶编码基因的动物细胞的选择.Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：2072-2076)和重链选择标记dhfr基因(Simonsen，C.C.和AD.Levinson.1983.一种改建的小鼠二氢叶酸还原酶cDNA的分离与表达.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2495-2499)两者都由SV40早期启动子驱动。
为了表达HuTN228，用脂质转染胺2000(目录号11668-027，LifeTechnologies)来完成到COS-7细胞(猴肾细胞系)中的瞬时转染。用山羊抗人IgGγ链的特异性抗体作为捕获试剂，且用缀合HRP的山羊抗人κ链抗体作为显色试剂，通过ELISA，来对瞬时转染子用过的培养基进行人IgG2M3抗体产生方面的分析。此外还通过间接免疫荧光染色，对所述用过的培养基检验HuTN228与P815/CD28+细胞结合的能力；并用流式细胞仪，对所述用过的培养基进行分析(数据未显示)。至于稳定细胞系的产生，通过电穿孔使人源化的表达质粒转染到鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0中；且根据gpt的表达而选择出转染子。在瞬时转染方面，通过ELISA，分析稳定转染子用过的培养基。
结果
基于人源化V区氨基酸序列的设计，如方法中所描述的，构建重链的V区基因和轻链的V区基因(图9和图10)。正如图8中所显示的，将重链的V区基因和轻链的V区基因分别克隆到pVg2M3载体和pVk载体中。通过核苷酸序列测定来分析几个克隆，且将重链表达载体和轻链表达载体的正确克隆都用于转染。同样，通过序列测定，进一步证实重链表达载体和轻链表达载体两者的恒定区。
实施例10  HuTN228的表达
COS-7细胞的瞬时转染：使所述表达载体瞬时转染到猴肾细胞系COS-7中，以产生HuTN228抗体。用所转染细胞用过的培养基，通过ELISA检验人源化IgG2M3抗体的产生来，且用流式细胞仪检验与P815/CD28+细胞的结合(数据未显示)。在两种分析中，用过的培养基是阳性的。由瞬时转染而来的人源化抗体的产量大约是3.7g/ml。来自瞬时上清液的HuTN228抗体以依赖浓度的方式结合到P815/CD28+细胞上(数据未显示)。
Sp2/0细胞的稳定转染：为了产生稳定的细胞系，将所述人源化表达载体转染到Sp2/0细胞中。如同所述瞬时转染子一样，对几种转染子用过的几份培养基检验HuTN228抗体的产生。一种转染子(克隆4)由于抗体生产率较高而被挑选出，且在GIBCO杂交瘤无血清培养基中将其扩大培养。通过亲和层析，从570毫升用过的培养基中纯化出HuTN228抗体。纯化的抗体产量大约是7mg。
实施例11  蛋白的纯化
在570ml GIBCO杂交瘤无血清培养基(目录号12045076，LifeTechnologies)中，培养来自稳定转染(克隆4)的、HuTN228表达高的转染子中的一种。当细胞生存力达到10％或更低时，收获用过的培养上清液；并将其加样到一根2ml的蛋白-A Sepharose柱上。用PBS洗涤该柱，然后用0.1M甘氨酸、0.1M NaCl pH2.5洗脱所述抗体。对2升PBS透析所洗脱的蛋白，且更换PBS达3次；然后，在一根用含有额外0.1M NaCl的PBS平衡的PD-10柱上，使其脱盐。在贮存于4℃之前，通过一张0.2mm的滤纸，过滤脱过盐的蛋白溶液。
实施例11  通过大小排阻HPLC和SDS-PAGE进行纯度测定
方法
用由一台PE ISS 200 Advanced LC Sample Processor(样品处理器)、一台PE Series 410 Bio LC Pump(泵)、一台PE 235C Diode ArrayDetector(二极管阵列检测器)以及PE Nelson 600 Series LINK组成的Perkin Elmer HPLC系统，来进行大小排阻HPLC。使用Perkin ElmerTurbochrom Navigator Version 4.1软件，来控制自动进样器、泵与检测器；且用该软件来获得、储存及处理数据。用两根串联连接的TosoHaasTSK-GEL G3000SWXL大小排阻HPLC柱(7.8mm×300mm，5mm的粒度，250的孔隙大小，目录号08541，TosoHaas，Montgomeryville，MD)，来完成分离。流动相是pH6.9的200mM磷酸钾/150mM氯化钾，且流速为1.00ml/分钟。用分光光度计在220nm波长和280nm波长下监测该柱的洗脱液。HuTN228样品的注射体积为60l(60g)。
按照标准步骤，在4-20％的梯度凝胶(目录号EC6025，Novex，SanDiego，CA)上进行SDS-PAGE。
按照制造商的建议，用Human IgG Subclass Profile ELISA Kit(人IgG亚类分布型ELISA试剂盒)(目录号99-1000，Zymed Laboratories，South San Francisco，CA)，来证实所纯化抗体的同种型。
结果
通过大小排阻HPLC和SDS-PAGE，来分析所分离的HuTN228抗体的纯度。未显示HuTN228的HPLC洗脱分布图。根据这一分析，该蛋白是约98％的单体，且具有相当于分子量约160kD蛋白的迁移率。
MuTN228、同种型对照MuFd79(小鼠IgG1)、HuTN228以及同种型对照HuEP5C7(人IgG2M3)在非还原条件下的SDS-PAGE分析也表明：所有四种抗体都有大约150-160kD的分子量。在还原条件下分析同样的四种蛋白则表明：所有四种抗体都是由一条分子量约50kD的重链和一条分子量约25kD的轻链组成的。
同种型试验表明：HuTN228抗体的同种型和所预期的IgG2同种型一致(数据未显示)。
实施例12  FACS竞争实验
方法
使用MuTN228-FITC抗体的从250ng/试验开始的二倍连续稀释液，来完成滴定实验。在冰上在100l FACS染色缓冲液(FSB＝PBS，2％FBS，3％正常小鼠血清，0.1％NaN3)中，将FITC标记的抗体与P815/CD28+细胞(3×105个细胞/试验)一起孵育达1小时，然后用2ml的FBS洗涤，并用流式细胞仪分析(数据未显示)。
至于竞争实验，把25l FSB中的MuTN228-FITC(50ng/试验)与、25l FSB中的竞争性HuTN228抗体或MuTN228抗体的三倍连续稀释液的(从200g/ml的抗体开始)混合，并添加到50l FSB里的P815/CD28+细胞(3×105个细胞/试验)中。作为对照，单独用MuTN228-FITC孵育P815/CD28+细胞(50ng/试验，于50l的FSB中)。同样，测试作为非特异性竞争剂的、在25l FSB中的HuEP5C7(人IgG2M3)同种型对照抗体(200g/ml)和MuFd79(小鼠IgG1)同种型对照抗体(200g/ml)。在冰上(于黑暗中)，在终体积100l中将抗体混合物与细胞一起孵育达1小时，然后用2ml FSB洗涤，并用流式细胞仪分析。重复这一实验三次。
结果
正如在方法中所描述的，用一个流式细胞计量术竞争实验，比较了MuTN228抗体和HuTN228抗体与P815/CD28+细胞上的CD28分子的结合特异性。在图5中显示了有代表性的结果。MuTN228和HuTN228两者都以依赖浓度的方式与MuTN228-FITC竞争，这表明这两种抗体与CD28抗原的结合是特异性的。HuTN228的相对结合是MuTN228的相对结合的几分之一。同种型对照抗体MuFd79和HuEP5C7不与MuTN228-FITC竞争，表明MuTN228抗体和HuTN228抗体通过V区的特异性相互作用而识别CD28抗原。
实施例13  ELISA竞争实验
方法
用100l/孔的sCD28-Fc(于PBS中，0.5g/ml)(sCD28-Fc是其中CD28的胞外域与IgG1的CH2结构域及CH3结构域结合的指融合蛋白)在4℃包被96孔ELISA板(Nunc-Immuno板，目录号439454，NalgeNunc，Naperville，IL)过夜。用300l/孔的、于TBS中的SuperblockBlocking Buffer(封闭缓冲液)(目录号37535，Pierce，Rockford，IL)封闭该平板达30分钟，并用300l/孔的ELISA ELISA Wash Buffer(洗涤缓冲液)(EWB＝PBS，0.1％Tween-20)洗涤所述平板。按终体积200l/孔，每种三份地添加100l ELISA Buffer(ELISA缓冲液)(EB＝PBS，1％BSA，0.1％Tween-20)中的MuTN228-生物素(0.5g/ml)与竞争剂HuTN228抗体或MuTN228抗体在100l EB中的三倍连续稀释液(从100g/ml开始)的混合物。同样试验在100l EB中的、作为非特异性竞争剂的同种型对照抗体HuEP5C7和MuFd79(100g/ml)。将100l的EB加到100l的MuTN228-生物素(0.5g/ml)中，作为‘无竞争剂’对照。将200l的EB加到剩余的孔中(不包含MuTN228-生物素)，作为空白(对照)。在室温振荡保温该平板达1.5小时。在用300l/孔的EWB洗涤所述孔4次后，向所有的孔中添加100l/孔的链霉亲和素-HRP(1g/ml，目录号21124，Pierce)。在室温振荡保温该平板达1小时。如上所述洗涤所述孔之后，向所有的孔中添加100l/孔的ABTS底物(目录号507602和506502，KPL，Gaithersburg，MD)。在室温下温育该平板达5至7分钟，然后读出415nm的光密度。重复这一实验三次。
结果
正如在方法中所描述的，用一种ELISA竞争实验，比较了HuTN228抗体和MuTN228抗体与sCD28-Fc的结合特异性。在图12中显示了有代表性的结果。MuTN228和HuTN228两者都以依赖浓度的方式与MuTN228-生物素竞争。同种型对照抗体MuFd79和HuEP5C7不与MuTN228-生物素竞争，表明MuTN228抗体和HuTN228抗体通过V区的特异性相互作用而识别CD28抗原。在表2中显示了所有三次实验的MuTN228和HuTN228的IC50值。HuTN228的相对结合平均是MuTN228结合的2.6分之一。
表2  ELISA竞争的总结
                          IC50(g/ml)
竞争剂  实验1  实验2  实验3  平均值  标准偏差
MuTN228  0.21  0.20  0.15  0.19  0.03
HuTN228  0.37  0.64  0.48  0.50  0.14
实施例14  125I标记抗体的竞争实验
方法
按照Queen等的方法(Queen，C.，W.P.Schneider，H.E.Selick，P.W.Payne，N.F.Landolfi，J.F.Duncan，N.M.Avdalovic，M.Levitt，R.P.Junghans，T.A.Waldmann.1989.一种与白介素2受体结合的人源化抗体.Proc.Natl.Acad.Sci.86：10029-10033)，测定了MuTN228抗体和HuTN228抗体的相对结合亲和性。简短地说，使50l结合缓冲液(Binding Buffer)(BB＝PBS，2％FBS，1g/ml小鼠IgG，0.1％NaN3)中的约10ng 125I标记的MuTN228与竞争剂MuTN228抗体或HuTN228抗体在50l BB中的三倍连续稀释液(从400g/ml开始)相混合，且每种混合做三份；然后，将其加到孵育管(Skatron Macrowell Tube Strips，目录号15773，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)里的100l P815/CD28+细胞(2.5×105个细胞/试验)中；并于4℃温和振荡孵育达90分钟。同样试验在50l BB中的、作为非特异性竞争剂的同种型对照抗体HuEP5C7和MuFd79(400g/ml)。在孵育之后，将细胞-抗体混合物转移到含有0.1ml 80％邻苯二甲酸二丁酯-20％橄榄油的离心管(Sarstedt MicroTubes，目录号72.702，Sarstedt，Newton，NC)中，用50l的BB洗涤所述孵育管一次，并通过已描述的方法离心来分离结合的计数和游离的计数(Kuziel，W.A.，S.J.Morgan，T.C.Dawson，S.Griffin，O.Smithies，K.Ley，N.Maeda.1997.在CC趋化因子受体2缺乏的小鼠中白细胞粘附与单核细胞外渗的严重减少.Proc.Natl.Acad.Sci.94：12053-12058)。重复这一实验三次。
结果
正如在方法中所描述的，用125I标记抗体竞争实验，比较了MuTN228抗体和HuTN228抗体的相对结合亲和性。在图13中显示了有代表性的结果。MuTN228和HuTN228两者都以依赖浓度的方式与125I标记的MuTN228竞争。同种型对照抗体MuFd79在高浓度时显示出弱而可重复的竞争，但同种型对照抗体HuEP5C7不与125I标记的MuTN228竞争；这表明HuTN228抗体通过V区的特异性相互作用而识别CD28抗原。在表3中显示了所有三次实验的MuTN228和HuTN228的IC50值。HuTN228的表观结合亲和性是MuTN228抗体的表观结合亲和性的大约2.4倍。
表3  125I竞争的总结
                        IC50(nM)
竞争剂  实验1  实验2  实验3  平均  标准偏差
MuTN228  0.93  1.05  1.02  1.00  0.06
HuTN228  2.65  2.43  2.13  2.40  0.26
实施例15  仓鼠抗鼠CD28抗体的氨基酸序列测定
方法
杂交瘤和抗体：从ATCC(ATCC HB-12352)获得亚美尼亚仓鼠抗鼠CD28的杂交瘤PV1。从Southern Biotechnology(Birmingham，AL)购买纯化的PV1、缀合R-藻红蛋白(R-PE)的PV1。叙利亚仓鼠抗CD28抗体37.51来自PharMingen(San Diego，CA)。第二抗体缀合荧光素(FITC)的驴抗亚美尼亚仓鼠IgG(H+L)、缀合FITC的驴抗叙利亚仓鼠IgG(H+L)、缀合FITC的驴抗小鼠IgG(H+L)、R-PE-F(ab’)2驴抗小鼠IgG(H+L)，则来自Jackson ImmunoResearch(West Grove，PA)；而缀合FITC的山羊抗小鼠κ、缀合R-PE的山羊抗小鼠IgG3、以及缀合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠κ则来自Southern Biotechnology。山羊抗小鼠IgG3以及小鼠IgG3同种型对照FLOPC 22，则来自SigmaChemicals(St.Louis，MO)。在我们实验室中，制备出亚美尼亚仓鼠抗鼠CD3抗体145.2C11及其仓鼠/小鼠嵌合体145.2C11-IgG3。缀合FITC的145.2C11来自Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。
可变区cDNA的克隆：用Co等描述的锚式聚合酶链式反应(PCR)法(Co，M.S.，N.M.Avadalovic，P.C.Caron，M.V.Avadalovic，D.A.Scheinberg和C.Queen.1992.J.Immunol.148：1149-1154)，从所述杂交瘤细胞克隆PV1之轻链和重链V区的cDNA。运用分别退火到仓鼠κ链C区和γ链C区上的3’引物以及退火到添加的cDNA之G尾上的5’引物，在cDNA上进行扩增。对于VLPCR，所述3’引物具有序列5’TATAGAGCTCCACTTCCAGTGCCC 3’(20SEQ ID NO：)，其残基11-24与仓鼠Cκ区杂交。对于VHPCR，所述3’引物具有以下的简并序列(SEQ ID NO：17、18和19)：
                          A         G   T5′TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTTTGGC，
                          T其残基19-50与大多数啮齿类动物的IgG CH1杂交。两种引物组中的非杂交序列包含供克隆用的限制酶切位点。将VL和VH的cDNA亚克隆到pUC19载体中供序列测定。为了避免PCR产生的差错，每种cDNA测定了5个独立克隆的序列；且仅仅选择克隆之序列与共有序列一致的克隆，来表达嵌合的PV1。
结果
PV1V区cDNA的克隆：正如在方法中所描述的，从杂交瘤细胞中克隆了PV1轻链可变区的cDNA和重链可变区的cDNA。对于VLPCR，仅仅对应于仓鼠Cγ区的3’引物能够从PV1产生VL cDNA产物。另一方面，来自仓鼠Cγ区的一种3’引物不产生任何PCR的产物。这些结果表明：杂交瘤PV1的轻链使用κ。测定了轻链和重链的几个克隆的序列，发现它们分别含有相同的VL和VH。CH1和Cγ的有限序列数据表明：所克隆的重链和轻链不是起源于鼠的。
实施例16  嵌合PV1-IgG3的构建与表达
方法
按照已描述的方法(He，X.Y.，Z.Xu，J.Melrose，A.Mullowney，M.Vasquez，C.Queen，V.Vexler，C.Klingbeil，M.S.Co和E.L.Berg.1998.J.Immunol.160：1029-1035)，通过PCR，将PV1的VL和VH制备成邻接XbaI位点的小外显子区段；并将它们分别引入到轻链表达质粒和重链表达质粒中(图14)。每个小外显子包含一段信号肽序列、一段成熟可变区序列和一段来源于同源性最高的小鼠J链基因的5’剪接供体序列。用这样的剪接供体，将所述可变区外显子剪接到小鼠抗体的恒定区上。在把小外显子克隆到表达载体中之后，再一次测定每个小外显子的序列，从而确保引入正确的剪接信号，且不产生PCR的差错。
构建一种载体，来由一种单一质粒表达嵌合PV1-IgG3的重链基因和轻链基因两者。在本报告中，PV1-IgG3表示一种包含仓鼠PV1 VL和VH可变区、小鼠IgG3的重链恒定区以及小鼠轻链的κ恒定区的嵌合抗体。通过类似于Cole等所述方法(Cole，M.S.，C.Anasetti和J.Y.Tso.1997.J.Immunol.159：3613-3621)的两步克隆法，获得表达载体pV1.g3.rg.dE(图14)。重链恒定区来源于小鼠γ3基因组片段，轻链来自κ片段。所述重链基因和轻链基因都由人巨细胞病毒的主要立即早期启动子和增强子驱动，且它们被来源于人补体基因C2的转录终止子(Ashfield，R.，P.Enriquez-Harris和N.J.Proudfoot.1991.EMBO J.10：4197-4207)隔开。选择标记的gpt基因(Mulligan，R.C.和P.Berg.1981.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072-2076)由经修饰的SV40早期启动子来驱动。为了表达嵌合PV1-IgG3，将所述单一质粒载体转染到鼠骨髓瘤细胞系NS0中；且根据gpt的表达而选择出转染子。用山羊抗小鼠IgG3作为捕获试剂，且用缀合HRP的山羊抗小鼠κ链作为显色试剂，通过ELISA，对转染子用过的培养基进行小鼠IgG3抗体产生方面的分析。这一分析对小鼠IgG3是特异性的，在该分析中，其它小鼠IgG同种型是阴性的。
结果
嵌合PV1-IgG3的表达：按照材料和方法以及图15中所描述的，把克隆的VL和VH制备成小外显子(图15)，并使其结合到一种表达载体中。然后，将该表达载体转染到鼠骨髓瘤细胞系NS0中，以产生嵌合PV1-IgG3。用几种转染子用过的培养基通过ELISA分析了小鼠IgG3抗体的产生，并且用FACScan分析了与EL4细胞的结合。在两种分析中，大多数转染子是阳性的。一种转染子由于抗体生产率高而被挑选出，在1升无血清培养基中将其扩大培养。通过亲和层析，从1升用过的培养基中纯化出PV1-IgG3。产率＞10mg/l。
实施例17  通过HPLC和SDS-PAGE表征纯化的嵌合PV1-IgG3
方法
蛋白的纯化：在1升Gibco无血清杂交瘤培养基中，培养IgG3表达高的转染子中的一种(克隆1号)。当细胞生存力达到30％或更低时，收获用过的培养上清液；并将其浓缩至200ml，且用一台PharmaciaP1泵(2-3ml/分钟)，将其加样到一根5ml的蛋白-A Sepharose柱上。接着，用含有额外0.1M NaCl(NaCl的终浓度为0.25M)的PBS洗涤该柱，然后用3.5M的MgClμ洗脱所述抗体。接着，在一根用含有额外0.1M NaCl的PBS平衡的PD-10柱上，使洗脱的蛋白脱盐。在贮存于4℃之前，通过一张0.2mm的滤纸，过滤脱过盐的蛋白溶液。和所有的小鼠IgG3一样，高浓度(＞1mg/ml)下PV1-IgG3在低温时沉淀，而通过在37℃温热则溶解回溶液中。在室温，该抗体则保持在溶液里。冷沉淀的反复循环似乎不影响该抗体的结合抗原的活性。
通过大小排阻HPLC和SDS-PAGE进行纯度测定：用由一台PEISS 200 Advanced LC Sample Processor(样品处理器)、一台PE Series410 Bio LC Pump(泵)、一台PE 235C Diode Array Detector(二极管阵列检测器)以及PE Nelson 600 Series LINK组成的Perkin Elmer HPLC系统，来进行大小排阻HPLC。使用Perkin Elmer Turbochrom NavigatorVersion 4.1软件，来控制自动进样器、泵与检测器；且用该软件来获得、储存及处理数据。用两根串联连接的TosoHaas TSK-GELG3000SWXL大小排阻HPLC柱(TosoHaas，目录号08541，7.8mm×300mm，5mm的粒度，250的孔隙大小)，来完成分离。流动相是pH6.9的200mM磷酸钾/150mM氯化钾，且流速为1.00ml/分钟。用分光光度计在220nm波长和280nm波长下监测该柱的洗脱液。未稀释的PV1-IgG3样品的注射体积为50μl(63.5μg)。按照标准方法，进行SDS-PAGE。
结果
通过大小排阻HPLC和SDS-PAGE，来分析所分离的PV1-IgG3的纯度。在图16中显示了PV1-IgG3的HPLC洗脱分布图。根据这一分析，该蛋白是99％的单体，且具有相当于分子量150kD的迁移率。PV1、PV1-IgG3以及同种型对照在非还原条件下的SDS-PAGE分析也表明：所有三种抗体都有大约150kD的分子量(图17A)。在图17A中看到的较弱的带，是由于所述样品在没有还原作用的SDS中沸腾而形成的人工产物。它们反映了所述抗体中未完成的链间二硫键的数目。但是在还原条件下(图17B)分析同样的三种蛋白则表明：PV1，而不是PV1-IgG3或同种型对照，具有分子量比通常所见的IgG的50kD分子量略高的重链。因此，或者仓鼠抗体PV1在CH3中的Asn297得到重链糖基化，或者它在重链中的其它位置有一个额外的糖基化位点。正如以后所讨论的，这种罕见的糖基化模式可能促使PV1与EL4细胞的非特异性结合，或许是通过凝集素/碳水化合物的相互作用来结合。
实施例18
方法
流式细胞术：在4℃用1μg/ml的PV1、37.51或PV1-IgG3染色鼠T细胞系EL4细胞(2.5×105个细胞/0.2ml)达30分钟，然后用2ml冷PBS洗涤它们，并用20μl缀合荧光染料的特异性第二抗体(10μg/ml)将其染色。在黑暗中于4℃孵育20分钟后，用PBS洗涤所述细胞，并用FACScan(Becton Dickenson，Milpitas，CA)分析。
在所述竞争实验中，于4℃用1μg/ml的R-PE-PV1和25μg/ml的PV1、PV1-IgG3或IgG3同种型对照在黑暗中染色EL4细胞(2.5×105个细胞/0.2ml)达30分钟；用PBS洗涤所述细胞，并用FACScan分析。也用不同形式的145.2C11进行类似的竞争实验。在可逆竞争实验中，于4℃用1μg/ml的PV1-IgG3和25μg/ml的PV1染色EL4细胞(2.5×105个细胞/0.2ml)达30分钟；用PBS洗涤两次，且用缀合FITC的驴抗小鼠IgG(H+L)将其染色，然后洗涤，并用FACScan分析。为了控制第二抗体与PV1的非特异性结合，在没有PV1-IgG3的情况下用过量的PV1对EL4细胞进行染色，并分析所述细胞。
至于小鼠T细胞染色，在4℃用1μg/ml的小鼠IgG3同种型对照(FLOPC 21)或PV1-IgG3对BALB/c小鼠的脾细胞(2.5×105个细胞/0.2ml)染色达30分钟；然后用2ml冷的PBS洗涤，并用20μl缀合FITC的145.2C11(10μg/ml)与20μl缀合R-PE的山羊抗小鼠IgG3(10μg/ml)染色。在4℃于黑暗中孵育20分钟后，用PBS洗涤所述细胞，并用FACScan分析。
结果
通过流式细胞术表征PV1和PV1-IgG3：用PV1使CD28阳性T细胞系EL4染色，并用FACScan进行分析。着色的方式表明：PV1在两个不同的位点结合EL4细胞(图17A)。另外，PV1以及几种亚美尼亚仓鼠抗鼠T细胞抗体(145.2C11，抗-CD3；H57-597，抗-TCR；以及UC10-4F10-11，抗-CTLA4)，也与CD28阴性骨髓瘤细胞系NS0非特异性地结合(数据未显示)。相反，叙利亚仓鼠抗-CD28抗体37.51仅仅与EL4细胞上的一个位点特异性地结合(图17B)。看来PV1除了结合CD28之外，也非特异性地结合到其它位点上；可能是通过碳水化合物/凝集素型的相互作用。正如在图17C中所显示的，嵌合PV1-IgG3不包含这种非特异性结合的活性。这种抗体以类似于37.51之结合方式的方式与EL4细胞结合，且它不结合CD28阴性的NS0细胞(数据未显示)。因此，PV1的非特异性结合特性取决于这种特殊抗体的重链恒定区，且通过嵌合作用而消除这种特性。
为了证实PV1-IgG3包含CD28特异性结合活性，我们采用了FACScan竞争分析。在这些实验中，使缀合R-PE的PV1与过量(25倍)的未标记的PV1、PV1-IgG3或小鼠IgG3对照混合，并用该混合物使EL4细胞染色。正如在图18A中所显示的，PV1和PV1-IgG3两者，而不是同种型对照，阻止缀合R-PE的PV1结合到EL4细胞上。由PV1-IgG3造成的抑制小于由PV1造成的抑制，我们把这些数据理解为：PV1-IgG3与缀合R-PE的PV1竞争CD28位点，而不是竞争非特异性位点。类似地是，145.2C11(亚美尼亚仓鼠抗鼠CD3)和嵌合145.2C11-IgG3两者都阻止缀合R-PE的145.2C11结合到EL4细胞上(图18B)；但由于该嵌合抗体不能消除R-PE-145.2C11与细胞的非特异性结合，因而该抗体效率较低。
我们也用过量(25倍)的PV1与PV1-IgG3竞争同EL4细胞的结合，做了可逆竞争实验。虽然在这种情况下没有标记PV-1-IgG3，但用缀合FITC的驴抗小鼠抗体来特异性地识别它。图18C中的结果显示：由过量PV1造成的对PV1-IgG3与EL4细胞结合的抑制，几乎是完全的；从而证实了PV1与PV1-IgG3结合同一表位。
最后，用PV1-IgG3对小鼠脾细胞进行染色。包有PV1-IgG3的脾细胞为第二抗体缀合R-PE的山羊抗小鼠IgG3特异性地识别。同时，也将缀合FITC的145.2C11添加到脾细胞之中，从而标记CD3阳性细胞。在双色流式细胞术分析中，PV1-IgG3特异性地使CD3阳性细胞染色，而不使CD3阴性细胞染色(图19B)。相反，小鼠IgG3同种型对照不使CD3阳性细胞着色(图19A)。因此，嵌合PV1-IgG3识别在鼠T细胞上表达的一种抗原，这是与抗CD28抗体相符合的结合抗原活性。
实施例19  胶原蛋白诱发性关节炎的诱导
方法
用以等体积的CFA(Wako，Japan)乳化的125μg牛CII(CollagenGijutsu Kenkyukai，Japan)，在小鼠尾的基底真皮内免疫小鼠。在第21天，用125μg的、CFA中的牛CII，通过真皮内注射，来加强免疫小鼠。在初次免疫之后，以1mg/kg/天的剂量，借助于等渗泵连续输注抗CD28抗体(PV1-IgG3)达7天，来治疗小鼠。在第二次免疫后的第11天，通过观察四只爪，来检查关节炎的发生；并按照先前所描述的(Tada，Y.，A.Ho，D.-R.Koh，T.W.Mak.1996.J.Immunol.156：4520，.Tada，Y.，A.Ho，T.Matsuyama，T.W.Mak.1997.J.Exp.Med.185：231)，将四只爪的炎症按0至3级评等级。评定每只爪的等级，并将四个得分相加；因此每只小鼠的最高得分为12。通过用小鼠总数除实验小鼠的总得分，来计算关节炎指数。
结果
用牛CII免疫了小鼠，观察小鼠关节炎发生的情况。在第二次免疫后的第11天，在用抗CD28抗体治疗的小鼠中，关节炎指数(0.63±0.50)(P＜0.01)与对照(7.50±0.66)相比较显著降低。
实施例20
方法
小鼠：动物
从Charles River Japan，Inc.(Yokohama，Japan)，得到雌性BALB/c小鼠和C3H小鼠。动物全部关养在无病原体设施中的具有过滤空气的小隔离笼里，且能自由获得食物和水。当开始实验时，所有小鼠为6至8周龄。
抗体：
沉默型抗小鼠CD28(PV1-IgG3)具有与PV-1克隆相同的特异性，但它在体外不具有强激动活性(Fc→IgG3)。抗小鼠CD154(TRAP1，IgG1)购自BD PharMingen(San Diego，CA)。CTLA4-Ig(CTLA-4/Fc嵌合体)购自Genzyme(Cambridge，MA)。
尾皮移植：
将来自供体小鼠(BALB/c：H-2d)尾部的全厚度皮肤移植物(0.5cm2)移植到受体小鼠(C3H：H-2b)的背侧胸部，并用急救绷带将其固定7天。然后，通过每日目视观察，来跟踪移植物的存活。排斥定义为丧失＞80％的活的表皮移植物组织。用Dunnett的多重比较检验进行统计学分析。p＜0.05的数值被认为是显著性的。
治疗方案：
用10μg、50μg、250μg的沉默型抗小鼠CD28，来治疗皮肤移植物的受体。在移植当天(0天)以及在手后第3天和第6天，腹膜内给予250μg抗小鼠CD154和100μgCTLA4-Ig。
结果：
通过给予沉默型抗小鼠CD28和抗小鼠CD154而同时阻断CD40和CD28的T细胞共同刺激途径，则有效地促进C3H小鼠中的皮肤同种移植物的存活。对照动物在第9天排斥其移植物。单独的抗CD40L单克隆抗体适中地延长同种移植物的存活(MST为10天)，但当与CD28联合时，则观察到显著地改善存活，而使半数存活时间(MST)延长到超过第33天。这种策略在给予CTLA4-Ig和抗小鼠CD40L单克隆抗体时明显是不太有效的，MST为12天。
实施例21  抗CD28抗体的Fab和F(ab’)2片段的制备
抗CD28抗体的Fab片段的制备
用固定化的无花果蛋白酶(Pierce，USA)消化抗人CD28抗体(HuTN228)。用含有5mM EDTA和11.5mM半胱氨酸盐酸的50mMTris-HCl pH6.8缓冲液，来活化固定化的无花果蛋白酶；并将其填充到一根柱里。将抗体溶液添加到该柱上，并在37℃保温达2或3天。用PBS洗涤该柱，并通过超滤，浓缩所述消化液。将浓缩的消化液加到凝胶过滤柱(TSKgel-3000SWxl，Tosoh，Japan)上，并收集适当的级分，且通过超滤进行浓缩。根据在280nm的吸光度(对于1mg/ml，Abs280＝1.4)而确定蛋白的浓度；并通过SDS-PAGE来确认片段的大小。
抗CD28抗体的F(ab’)2片段的制备
用与Fab片段制备方法一样的方法(除了半胱氨酸的浓度(1.15mM)和保温时间(过夜一次)之外)，来制备抗人CD28抗体。
显然，根据上述内容，可能存在本发明的许多改进与变化。因此必须明白：在所附的权利要求书的范围内，可以以除本文具体所描述的之外的其它方式，来实施本发明。
本文提到的所有出版物、专利申请、专利以及其它参考文献通过引用全部结合到本文中。
                    序列表<110>VASQUEZ，Maximiliano
 HINTON，Paul
 TAMURA，Kouichi
 HIGASHI，Yauyuki
 SEKI，Nobuo
 UEDA，Hirotsugu
 TSO，J.Yun<120>沉默型抗CD28抗体及其应用<130>200071USOPROV<150>US 60/255,155<151>2000-12-14<160>21<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>427<212>DNA<213>杂合<220><221>CDS<222>(12)..(404)<223><400>1tctagaccac c atg gag tca gac aca ctc ctg cta tgg gtg ctg ctg ctc      50
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95                  100                 105tat tac tgt cag caa agt agg aag gtt cca ttc acg ttc ggc ggg ggg       386Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly110                 115                 120                 125aca aag gtg gaa ata aaa cgtaagtaga cttttgctct aga                     427Thr Lys Val Glu Ile Lys
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130<210>10<211>445<212>DNA<213>杂合<220><221>CDS<222>(21)..(419)<223><400>10tctagacagt ggggaacaat atg gat tca cag atc cag gtc ctc atg tcc ctg    53
                  Met Asp Ser Gln Ile Gln Val Leu Met Ser Leu
                  1               5                   10ctc ctc tgg atg tct ggt gcc tgt gga gat att gtg atg acc cag tct      101Leu Leu Trp Met Ser Gly Ala Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser
        15                  20                  25cca tat tcc ctg gct gtg tca gca gga gag aag gtc acc atg agt tgc      149Pro Tyr Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
    30                  35                  40agg tcc agt cag agc ctc tat tac agt gga atc aaa aag aac ctc ttg      197Arg Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Tyr Ser Gly Ile Lys Lys Asn Leu Leu
45                  50                  55gcc tgg tac cag cag aaa cca ggc cag tct ccg aaa ctg ctg atc tac      245Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr60                  65                  70                  75ttt aca tct act cgg tta cct ggg gta ccg gat cgc ttc aca ggc agt      293Phe Thr Ser Thr Arg Leu Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
            80                  85                  90gga tct ggg aca gat tac act ctc acc atc acc agt gtc cag gct gaa      341Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val Gln Ala Glu
        95                  100                 105gac atg ggg cat tat ttc tgt cag cag ggt ata agc act ccg ctc acg      389Asp Met Gly His Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Ser Thr Pro Leu Thr
    110                 115                 120ttc ggt gat ggc acc aag ctg gag ata aga cgtaagtaga atccaaagtc        439Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
125                 130tctaga                                                               445<210>11<211>133<212>PRT<213>杂合<400>11Met Asp Ser Gln Ile Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Leu Trp Met Ser1               5                   10                  15Gly Ala Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Tyr Ser Leu Ala
        20                  25                  30Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
    35                  40                  45Leu Tyr Tyr Ser Gly Ile Lys Lys Asn Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50                  55                  60Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Thr Arg65                  70                  75                  80Leu Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
            85                  90                  95Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val Gln Ala Glu Asp Met Gly His Tyr
        100                 105                 110Phe Cys Gln Gln Gly Ile Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr
    115                 120                 125Lys Leu Glu Ile Arg
130<210>12<211>467<212>DNA<213>杂合<220><221>CDS<222>(16)..(444)<223><400>12tctagagtct tcacc atg gta tgg ggc ttg atc atc atc ttc ctg gtc aca      5l
             Met Val Trp Gly Leu Ile Ile Ile Phe Leu Val Thr
             1               5                   10gca gct aca ggt gtc cac tcc cag gtc cag ttg aag cag tct ggg gct       99Ala Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala
    15                  20                  25gag ctt gtg aag cct gga gcc tca gtg aag ata tcc tgc aaa act tca       147Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser
30                  35                  40ggc tat acc ttc act gat ggc tac atg aac tgg gtt gag cag aag cct       195Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Gly Tyr Met Asn Trp Val Glu Gln Lys Pro45                  50                  55                  60ggg cag ggc ctt gag tgg att gga aga att gat cct gat agt ggt aat       243Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Asp Ser Gly Asn
            65                  70                  75act cgg tac aat cag aaa ttc cag ggc aag gcc aca ctg act aga gac       291Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Arg Asp
        80                  85                  90aaa tcc tcc agc aca gtc tac atg gac ctc agg agc ctg aca tct gag       339Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu
    95                  100                 105gac tct gct gtc tat tac tgt gcg aga gat ggg acc ttc tac ggt acc       387Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Thr Phe Tyr Gly Thr
110                 115                 120tac ggc tac tgg tac ttc gat ttc tgg ggc cag ggg acc cag gtc acc       435Tyr Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr125                 130                 135                 140gtc tcc tca ggtgagtcct taaaacctct aga                                 467Val Ser Ser<210>13<211>143<212>PRT<213>杂合<400>13Met Val Trp Gly Leu Ile Ile Ile Phe Leu Val Thr Ala Ala Thr Gly1               5                   10                  15Val His Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
        20                  25                  30Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
    35                  40                  45Thr Asp Gly Tyr Met Asn Trp Val Glu Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50                  55                  60Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Asp Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Asn65                  70                  75                  80Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser
            85                  90                  95Thr Val Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
        100                 105                 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Thr Phe Tyr Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp
    115                 120                 125Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
130                 135                 140<210>14<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400>14tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc                    46<210>15<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400>15tatagagctc aagcttccag tggatagacc gatggggctg tcgttttggc               50<210>16<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400>16tatagagctc aagcttccag tggatagaca gatgggggtg ttgttttggc                50<210>17<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400>17tatagagctc aagcttccag tggatagacc gttggggctg tcgttttggc                50<210>18<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400>18tatagagctc aagcttccag tggatagacc gatggggctg tcgttttggc                50<210>19<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400>19tatagagctc aagcttccag tggatagacc gatgggggtg ttgttttggc                50<210>20<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400>20tatagagctc aagcttccag tggatagtcc gatggggctg tcgttttggc                50<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成DNA<400>21tatagagctc cacttccagt gccc                                         24

Claims (25)

1.一种沉默型抗CD28抗体。
2.权利要求1的抗体，所述抗体为一种嵌合抗体。
3.权利要求1的抗体，所述抗体为一种人源化抗体。
4.权利要求1的抗体，所述抗体具有包含SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4中的氨基酸序列的可变区。
5.权利要求1的抗体，所述抗体具有包含SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：4中的氨基酸序列的可变区。
6.权利要求1的抗体，所述抗体具有包含SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：8中的氨基酸序列的可变区。
7.权利要求1的抗体，所述抗体具有包含SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：8中的氨基酸序列的可变区。
8.一种编码权利要求1的抗体的多核苷酸。
9.权利要求8的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的至少一种多核苷酸。
10.一种包含权利要求8的多核苷酸的表达载体。
11.一种包含权利要求8的多核苷酸的宿主细胞。
12.一种包含权利要求10的表达载体的宿主细胞。
13.一种生产沉默型抗CD28抗体的方法，所述方法包括：
在适合于所述抗体表达的条件下，培养权利要求11的宿主细胞；并从所述培养物中回收所表达的抗体。
14.一种生产沉默型抗CD28抗体的方法，所述方法包括：
在适合于所述抗体表达的条件下，培养权利要求12的宿主细胞；并从所述培养物中回收所表达的抗体。
15.一种生产沉默型抗CD28抗体的方法，所述方法包括：
将权利要求8的多核苷酸引入到宿主细胞中；
在适合于所述抗体表达的条件下，培养所述宿主细胞；并从所述培养物中回收所表达的抗体。
16.权利要求15的方法，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的至少一种多核苷酸。
17.一种生产沉默型抗CD28抗体的方法，所述方法包括：
将权利要求10的表达载体引入到宿主细胞中；
在适合于所述抗体表达的条件下，培养所述宿主细胞；并从所述培养物中回收所表达的抗体。
18.一种药用组合物，所述组合物包括权利要求1的沉默型抗CD28抗体以及药学上可接受成分。
19.一种在患者体内诱发T细胞耐受的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求1的抗体，来诱发所述患者的T细胞耐受。
20.权利要求19的方法，其中所述给予还包括给予另一种免疫抑制药。
21.一种在患者体内提供免疫抑制的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求1的抗体，来为所述患者提供免疫抑制。
22.权利要求21的方法，其中所述给予还包括给予另一种免疫抑制药。
23.一种治疗患者体内器官或组织移植排斥的方法，所述方法包括给予有效量的所述抗体，来治疗所述患者体内的器官或组织的移植排斥。
24.权利要求23的方法，其中所述给予还包括给予另一种免疫抑制药。
25.一种抗体，所述抗体选自HuTN228与MuTN228及其Fab片段以及其F(ab)’2片段。
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