KR20230165276A - 타노트랜스미션 폴리펩티드 및 암의 치료에서의 이의 용도 - Google Patents
타노트랜스미션 폴리펩티드 및 암의 치료에서의 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
특정 양태에서, 본 개시내용은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 타노트랜스미션은 표적 세포에서의 세포 턴오버 경로의 활성화에 따른 세포 간의 소통으로서, 반응 세포가 생물학적 반응을 겪도록 신호를 전달한다. 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 및 트랜스포존), 세포 및 약제학적 조성물이 또한 개시된다. 표적 세포에 의한 타노트랜스미션의 촉진 방법, 대상체에서의 면역 반응의 촉진 방법, 및 대상체에서의 암의 치료 방법이 추가로 개시된다.
Description
관련 출원
본 출원은 2021년 3월 31일자 출원된 미국 특허 가출원 제63/169,167호, 2021년 6월 29일자 출원된 미국 특허 가출원 제63/216,499호 및 2021년 12월 22일자 출원된 미국 특허 가출원 제63/292,667호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 각각의 내용은 그들 전문이 본원에 포함된다.
서열 목록의 제출
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후생동물에서, 세포 예정사는 조직 항상성을 유지하고 잠재적으로 유해한 세포를 제거하는 유전학적으로 설정된 필수 과정이다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션(thanotransmission) 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이며, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제(Caspase), FADD, TRADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민(Gasdermin) A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, 종양 괴사 인자 수용체 상과(TNFSF) 단백질 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드는 융합 단백질에 포함된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 TRIF 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 TRIF 또는 이의 변이체 및 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 링커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 단일의 전사물로서 전사된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 둘은 NF-kB를 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 둘은 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 둘은 외인성 아폽토시스(extrinsic apoptosis)를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 둘은 예정 괴사(programmed necrosis)를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 NF-kB를 활성화시키고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 NF-kB를 활성화시키고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 외인성 아폽토시스를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 NF-kB를 활성화시키고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예정 괴사를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 외인성 아폽토시스를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예정 괴사를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 외인성 아폽토시스를 촉진시키고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예정 괴사를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 예정 괴사는 네크롭토시스(necroptosis)를 포함한다. 일부 구현예에서, 예정 괴사는 파이롭토시스(pyroptosis)를 포함한다.
일부 구현예에서, NF-kB를 활성화시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TNFSF 단백질 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, MyD88, MAVS, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 외인성 아폽토시스를 촉진시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, RIPK1, 카스파제, FADD, TRADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 예정 괴사를 촉진시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 688 내지 691 위치에서 RHIM 테트라드(tetrad)의 하나 이상의 아미노산 잔기에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 Q688A, L689A, G690A 및 L691A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 상응하는 야생형 TRIF 단백질과 비교하여 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 541 내지 712 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 546 내지 712 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 하나 이상의 TBK1 인산화 부위의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 S210A, S212A 및 T214A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 434 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 P434H 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 상응하는 야생형 TRIF 단백질과 비교하여 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 311 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 12로 이루어진다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 180 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 217 내지 658 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 217 내지 386 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 180 및 217 내지 658 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 180, 217 내지 386 및 546 내지 712 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 22를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 22로 이루어진다.
일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩한다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 FADD 우성 음성 돌연변이체(FADD-DN), cFLIP, vICA, 카스파제 8 우성 음성 돌연변이체(Casp8-DN), cIAP1, cIAP2, Tak1, IKK 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 FADD-DN이다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 cFLIP이다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 vICA이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 가스더민 또는 이의 변이체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 변이체를 포함하고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스더민은 가스더민 E 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 E 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 이량체화 도메인을 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 이량체화 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 이량체화 도메인은 타노트랜스미션 폴리펩티드에 대하여 이종이다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 리포좀에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 벡터는 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존이다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 분자 중 어느 하나에 의해 인코딩되는 폴리펩티드에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 분자, 벡터 및/또는 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함하는 세포에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 각각이 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 둘 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에 관한 것이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드의 각각은 TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제, FADD, TRADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, 종양 괴사 인자 수용체 상과(TNFSF) 단백질 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 둘 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 동일한 핵산 분자 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드의 각각은 개별 핵산 분자에 포함된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 구현예에서, DNA 분자는 플라스미드 또는 트랜스포존이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자이다.
일부 구현예에서, RNA 분자는 원형 RNA이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 FADD 우성 음성 돌연변이체(FADD-DN), cFLIP, vICA, 카스파제 8 우성 음성 돌연변이체(Casp8-DN), cIAP1, cIAP2, Tak1, IKK 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 FADD-DN이다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 cFLIP이다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 vICA이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스더민은 가스더민 E이다.
일부 구현예에서, 세포는 이량체화 도메인을 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 이량체화 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 이량체화 도메인은 타노트랜스미션 폴리펩티드에 대하여 이종이다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 688 내지 691 위치에서 RHIM 테트라드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 Q688A, L689A, G690A 및 L691A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 상응하는 야생형 TRIF 단백질과 비교하여 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 541 내지 712 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 546 내지 712 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 하나 이상의 TBK1 인산화 부위의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 S210A, S212A 및 T214A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 434 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 P434H 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 상응하는 야생형 TRIF 단백질과 비교하여 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 311 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 12로 이루어진다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 180 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 217 내지 658 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 217 내지 386 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 180 및 217 내지 658 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 180, 217 내지 386 및 546 내지 712 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 22를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 22로 이루어진다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 분자, 리포좀, 벡터 또는 세포 중 어느 하나 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다: (a) 각각이 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드로서, 각각의 타노트랜스미션 폴리펩티드가 TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제, FADD, TRADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, 종양 괴사 인자 수용체 상과(TNFSF) 단백질, 이의 변이체, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 담체.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내의 둘 이상의 폴리뉴클레오티드는 동일한 핵산 분자 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내의 둘 이상의 폴리뉴클레오티드의 각각은 개별 핵산 분자에 포함된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 구현예에서, DNA 분자는 플라스미드 또는 트랜스포존이다. 일부 구현예에서, DNA 분자는 엔지니어링된 바이러스 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 FADD 우성 음성 돌연변이체(FADD-DN), cFLIP, vICA, 카스파제 8 우성 음성 돌연변이체(Casp8-DN), cIAP1, cIAP2, Tak1, IKK, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 FADD-DN이다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 cFLIP이다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 vICA이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스더민은 가스더민 E이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 이량체화 도메인을 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 이량체화 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 이량체화 도메인은 타노트랜스미션 폴리펩티드에 대하여 이종이다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 688 내지 691 위치에서 RHIM 테트라드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 Q688A, L689A, G690A 및 L691A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 상응하는 야생형 TRIF 단백질과 비교하여 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 541 내지 712 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 546 내지 712 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 하나 이상의 TBK1 인산화 부위의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 S210A, S212A 및 T214A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 434 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 P434H 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 상응하는 야생형 TRIF 단백질과 비교하여 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 311 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 12로 이루어진다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 180 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 217 내지 658 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 217 내지 386 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 180 및 217 내지 658 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 180, 217 내지 386 및 546 내지 712 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 22를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 22로 이루어진다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 대상체로의 하나 이상의 핵산 분자의 전달 방법에 관한 것이며, 방법은 전술된 약제학적 조성물 중 어느 하나를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산 분자는 리포펙션을 통해 대상체에게 전달된다. 일부 구현예에서, 리포펙션은 RNA 리포펙션이다. 일부 구현예에서, 리포펙션은 DNA 리포펙션이다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서의 타노트랜스미션의 촉진 방법에 관한 것이며, 방법은 전술된 약제학적 조성물 중 어느 하나를 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 증가를 필요로 하는 대상체에서의 면역 반응의 증가 방법에 관한 것이며, 방법은 전술된 약제학적 조성물 중 어느 하나를 대상체에서 면역 반응을 증가시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에게 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 투여하는 것은, 오직 하나의 타노트랜스미션 폴리펩티드만을 인코딩하는 핵산 분자를 투여한 대상체와 비교하여 면역 반응을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하지만 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하지 않는 핵산 분자를 투여한 대상체와 비교하여 면역 반응을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 면역 반응을 증가시키는 것은 NFkB 활성 및 IRF 활성 중 하나 이상을 증가시키는 것을 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암의 치료 방법에 관한 것이며, 방법은 전술된 약제학적 조성물 중 어느 하나를 암을 치료하기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에게 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 투여하는 것은 오직 하나의 타노트랜스미션 폴리펩티드만을 인코딩하는 핵산 분자를 투여한 대상체와 비교하여 생존 시간을 증가시키고/시키거나 종양 성장을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하지만 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하지 않는 핵산 분자를 투여한 대상체와 비교하여 생존 시간을 증가시키고/시키거나 종양 성장을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내의 둘 이상의 폴리뉴클레오티드는 동일한 핵산 분자 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물 내의 둘 이상의 폴리뉴클레오티드의 각각은 개별 핵산 분자에 포함된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 구현예에서, DNA 분자는 플라스미드 또는 트랜스포존이다. 일부 구현예에서, DNA 분자는 엔지니어링된 바이러스 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체에게 정맥내 투여된다. 일 구현예에서, 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 것은 대상체에서 암 세포의 증식을 감소시킨다. 일 구현예에서, 암 세포의 증식은 대상체가 받은 암 치료법으로부터 초래되는 암 세포의 과다증식이다. 일 구현예에서, 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 것은 대상체에서 암 세포의 전이를 감소시킨다. 일 구현예에서, 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 것은 대상체에서 종양의 혈관신생을 감소시킨다. 일 구현예에서, 암의 치료는 종양 부담의 감소, 종양 크기의 감소, 종양 성장의 저해, 처리 이전에 진행성 암을 갖는 대상체에서의 안정한 암의 달성, 암의 진행까지의 시간 증가 및 생존 시간의 증가 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체에게 종양내 투여된다. 일 구현예에서, 대상체는 면역요법으로 이전에 치료받았다. 일 구현예에서, 암은 면역요법에 대하여 반응성이 아니다. 일 구현예에서, 암은 면역요법에 대하여 반응성인 암이다. 일 구현예에서, 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 것은 면역요법이 실행되지만, 바이러스를 투여하지 않은 대상체와 비교하여 면역요법에 대한 암의 반응을 개선시킨다. 일 구현예에서, 면역요법은 면역 체크포인트 치료법이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 치료법은 면역 체크포인트 저해제 치료법이다.
일 구현예에서, 암은 암종, 육종, 림프종, 흑색종 및 백혈병으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 암은 고형 종양이다. 일 구현예에서, 암은 흑색종, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 전립선암, 고환암, 요로상피 암종, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 육종, 대장 선암종, 위장관 간질 종양, 위식도 암종, 대장암, 췌장암, 신장암, 간세포암, 악성 중피종, 백혈병, 림프종, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 이행 세포 암종, 신경모세포종, 형질 세포 신생물, 빌름스 종양 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 암은 결장암이다. 일 구현예에서, 암은 감소된 RIPK3 발현을 나타낸다.
일 구현예에서, 암은 대장암, 위암, 난소암, 전립선암, 부신피질암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 감소된 RIPK3 발현을 나타내는 암은 대장암, 위암, 난소암, 전립선암, 부신피질암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 방법은 항-신생물제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 항-신생물제는 화학치료제이다. 일 구현예에서, 항-신생물제는 생물학적 작용제이다. 일 구현예에서, 생물학적 작용제는 항원 결합 단백질이다. 일 구현예에서, 항-신생물제는 면역치료제이다. 일 구현예에서, 면역치료제는 톨(Toll)-유사 수용체(TLR) 효능제, 세포-기반의 치료법, 사이토카인, 암 백신 및 면역 체크포인트 분자의 면역 체크포인트 조절제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, TLR 효능제는 콜리(Coley) 독소 및 바실러스 칼메트-게랭(BCG)으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 세포-기반의 치료법은 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포) 치료법이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, GITR, ICOS, 4-1BB, ADORA2A, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG-3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 및 VISTA로부터 선택된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 자극성 면역 체크포인트 분자이며, 면역 체크포인트 조절제는 자극성 면역 체크포인트 분자의 효능제이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 저해성 면역 체크포인트 분자이며, 면역 체크포인트 조절제는 저해성 면역 체크포인트 분자의 길항제이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 소분자, 저해성 RNA, 안티센스 분자 및 면역 체크포인트 분자 결합 단백질로부터 선택된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1이며, 면역 체크포인트 조절제는 PD-1 저해제이다. 일 구현예에서, PD-1 저해제는 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 피딜리주맙(pidilizumab), SHR-1210, MEDI0680R01, BBg-A317, TSR-042, REGN2810 및 PF-06801591로부터 선택된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-L1이며, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L1 저해제이다. 일 구현예에서, PD-L1 저해제는 두발루맙(durvalumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), MDX-1105, AMP-224 및 LY3300054로부터 선택된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 CTLA-4이며, 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4 저해제이다. 일 구현예에서, CTLA-4 저해제는 이필리무맙(ipilimumab), 트레멜리무맙(tremelimumab), JMW-3B3 및 AGEN1884로부터 선택된다. 일 구현예에서, 항-신생물제는 히스톤 데아세틸라제 저해제이다. 일 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 저해제는 하이드록삼산, 벤즈아미드, 사이클릭 테트라펩티드, 뎁시펩티드, 친전자성 케톤 또는 지방족 화합물이다. 일 구현예에서, 하이드록삼산은 보리노스타트(vorinostat)(SAHA), 벨리노스타트(belinostat)(PXD101), LAQ824, 트리코스타틴(trichostatin) A 또는 파노빈 오스타트(panobin ostat)(LBH589)이다. 일 구현예에서, 벤즈아미드는 엔티노스타트(entinostat)(MS-275), 01994 또는 모세티노스타트(mocetinostat)(MGCD0103)이다. 일 구현예에서, 사이클릭 테트라펩티드는 트라폭신(trapoxin) B이다. 일 구현예에서, 지방족 산은 페닐 부티레이트 또는 발프로산이다.
일 구현예에서, 면역-자극성 세포 턴오버 경로가 표적 세포에서 유도된다. 일 구현예에서, 면역-자극성 세포 턴오버 경로는 네크롭토시스, 외인성 아폽토시스, 파이롭토시스 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 표적 세포는 면역-자극성 세포 턴오버 경로가 결핍된다. 일 구현예에서, 표적 세포는 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3(RIPK1)을 인코딩하는 유전자, 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3(RIPK3)을 인코딩하는 유전자, Z-DNA-결합 단백질 1(ZBP1)을 인코딩하는 유전자, 혼합 계통 키나제 도메인 유사 슈도키나제(MLKL)를 인코딩하는 유전자, 가스더민을 인코딩하는 유전자 및 톨/인터류킨-1 수용체(TIR)-도메인-함유 어댑터-유도 인터페론-β(TRIF)를 인코딩하는 유전자 중 하나 이상에서 불활성화 돌연변이를 갖는다. 일 구현예에서, 표적 세포는 RIPK1, RIPK3, ZBP1, TRIF, 가스더민 및 MLKL 중 하나 이상의 발현 또는 활성의 감소를 갖는다. 일 구현예에서, 표적 세포는 RIPK1을 인코딩하는 유전자, RIPK3을 인코딩하는 유전자, ZBP1을 인코딩하는 유전자, TRIF를 인코딩하는 유전자, 가스더민을 인코딩하는 유전자 및 MLKL을 인코딩하는 유전자 중 하나 이상의 카피수 손실을 갖는다. 일 구현예에서, 가스더민은 가스더민 D 및 가스더민 E로부터 선택된다.
일 구현예에서, 표적 세포는 암 세포, 면역 세포, 내피 세포 및 섬유모세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 표적 세포는 암 세포이다. 일 구현예에서, 암은 전이성 암이다.
일부 구현예에서, 엔지니어링된 바이러스는 아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스(AAV)가 아니다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 바이러스는 세포용해성이다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 바이러스는 분열하는 세포를 우선적으로 감염시킨다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 바이러스는 이전에 감염되었던 숙주를 재감염시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 바이러스는 합성 다량체화 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 바이러스는 백시니아(Vaccinia) 바이러스가 아니다. 일부 구현예에서, 엔지니어링된 바이러스는 TRIF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 바이러스는 종양용해성 바이러스이다. 일 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스이다. 일 구현예에서, 바이러스는 레트로바이러스이다. 일 구현예에서, 바이러스는 종양용해성 바이러스이다. 일 구현예에서, 바이러스는 복제 바이러스이다. 일 구현예에서, 바이러스는 비-복제 바이러스이다. 일 구현예에서, 바이러스는 DNA 복제 바이러스이다. 일 구현예에서, 바이러스는 DNA 복제 종양용해성 바이러스이다. 일 구현예에서, 바이러스는 아넬로바이러스이다. 일 구현예에서, 바이러스는 표적 세포를 우선적으로 감염시킨다. 일 구현예에서, 바이러스는 암 세포에 의한 타노트랜스미션을 저해하는 하나 이상의 내인성 바이러스 유전자에 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 바이러스는 적어도 4 kb의 이종 폴리뉴클레오티드를 표적 세포로 수송할 수 있다. 일 구현예에서, 바이러스는 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 폭시바이러스(예를 들어, 백시니아 바이러스), 아데노-연관 바이러스(AAV), 콕사키바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 홍역 바이러스, 점액종증, 폴리오바이러스, 렌티바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 레트로바이러스, 포미(foamy) 바이러스, 파밍턴 바이러스, 파보바이러스 및 인플루엔자 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 바이러스는 아데노바이러스이다. 일 구현예에서, 아데노바이러스는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)이다. 일 구현예에서, 아데노바이러스는 Ad5/F35이다. 일 구현예에서, 아데노바이러스는 Ad5/F3이다. 일 구현예에서, 바이러스는 단순 헤르페스 바이러스(HSV)이다. 일 구현예에서, HSV는 HSV1이다. 일 구현예에서, HSV1은 Kos, F1, MacIntyre, McKrae 및 관련 균주(strain)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, HSV는 ICP34.5, ICP47, UL24, UL55, UL56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 결함이 있다. 일 구현예에서, 각각의 ICP34.5 인코딩 유전자는 즉시 조기(IE) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 US 11 인코딩 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트에 의해 대체된다. 일 구현예에서, HSV는 ΔZα 돌연변이 형태의 백시니아 바이러스 E3L 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, HSV는 ICP6의 하나 이상의 기능에 결함이 있다. 일 구현예에서, ICP6은 수용체-상호작용 단백질 호모타입 상호작용 모티프(RHIM) 도메인의 돌연변이를 갖는다. 일 구현예에서, ICP6은 C-말단에서 카스파제-8 결합을 저해하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일 구현예에서, HSV는 US11 유전자를 즉시 조기 유전자로서 발현한다. 일 구현예에서, US11 유전자가 ICP47 즉시 조기 프로모터의 제어 하에 존재하도록 ICP47 유전자가 결실된다. 일 구현예에서, 엔지니어링된 바이러스는 폭스바이러스 과에 속한다. 일 구현예에서, 폭스바이러스 과에 속하는 엔지니어링된 바이러스는 점액종 바이러스, 야바(Yaba)-유사 질병 바이러스, 라쿤폭스(raccoonpox) 바이러스, orf 바이러스 및 우두 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 엔지니어링된 바이러스는 폭스바이러스 과의 코르도폭스바이러스 아과에 속한다. 일 구현예에서, 엔지니어링된 바이러스는 코르도폭스바이러스 아과의 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus) 속에 속한다. 일 구현예에서, 엔지니어링된 바이러스는 오르토폭스바이러스 속의 백시니아 바이러스 종에 속한다. 일 구현예에서, 백시니아 바이러스는 Dairenl, IHD-J, L-IPV, LC16M8, LC16MO, Lister, LIVP, Tashkent, WR 65-16, Wyeth, Ankara, Copenhagen, Tian Tan 및 WR로 이루어진 군으로부터 선택되는 균주이다. 일 구현예에서, 백시니아 바이러스는 티미딘 키나제(TK) 활성을 결여하도록 엔지니어링된다. 일 구현예에서, 백시니아 바이러스는 TK 활성을 감소시키거나 제거하는 J2R 유전자 내의 불활성화 돌연변이 또는 결실을 갖는다. 일 구현예에서, 백시니아 바이러스는 리보뉴클레오티드 환원효소(RR) 활성을 결여하도록 엔지니어링된다. 일 구현예에서, 백시니아 바이러스는 RR 활성을 감소시키거나 제거하는 I4L 및 F4L 유전자로부터 선택되는 유전자 내의 불활성화 돌연변이 또는 결실을 갖는다. 일 구현예에서, 백시니아 바이러스는 E3L 유전자에 결함이 있다. 일 구현예에서, E3L 유전자는 암 세포에서 네크롭토시스의 유도를 초래하는 돌연변이를 갖는다.
도 1a 및 도 1b는 타노트랜스미션의 유도 후의 CT-26 마우스 결장 암종 세포의 상대적인 생존력을 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 대식구에서의 IFN-관련 유전자 활성화의 자극에 대한, 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현(예를 들어, 단독의, 또는 RIPK3(cR3) 및/또는 가스더민 E(cGE)와 조합된 TRIF 발현)의 유도 후에 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성된 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향을 보여준다. 도 2a에서, Tet-유도 가능한 RIPK3은 "RIPK3"으로 표기되며, 구성성 PGK 프로모터를 함유하는 RIPK3 구축물은 "PGK_RIPK3"으로 표기된다. 도 2b에서, 각각의 타노트랜스미션 모듈에 있어서, 처리군은 좌측에서 우측으로, 대조군(CTL), 독시사이클린(Dox) 및 독시사이클린 + B/B 동종이량체화제(homodimerizer)(Dox + 이량체화제)이다.
도 3은 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에서의 활성화 마커의 발현의 자극에 대한, TRIF, RIPK3 또는 TRIF 및 RIPK3 발현의 유도 후에 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성된 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향을 보여준다. MFI는 평균-형광 세기이다.
도 4a, 도 4b 및 도 4c는 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 이식한 마우스의 생존에 대한 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현의 영향을 보여준다. "CT26-TF"는 TRIF를 단독으로 발현하는 CT-26 세포를 나타내며, "CT26-P_R3"은 RIPK3을 단독으로 발현하는 세포를 나타낸다. 도 4b에서, 모든 마우스를 항-PD1 항체로 처리하였다.
도 5a는 다양한 타노트랜스미션 페이로드를 발현하는 U937 백혈병 세포로부터의 세포 배양물로 처리되고, 단독으로 또는 RIPK3 저해제(GSK872)와 조합하여 카스파제 저해제(Q-VD-Oph)로 처리되는 THP-1 Dual 세포에서의 상대적인 NF-kB 활성을 보여준다. 도 5b 및 도 5c는 다양한 타노트랜스미션 페이로드를 발현하는 U937 백혈병 세포로부터의 세포 배양물로 처리되고, 단독으로 또는 RIPK3 저해제(GSK872)와 조합하여 카스파제 저해제(Q-VD-Oph)로 처리되는 THP-1 Dual 세포에서의 상대적인 IRF 활성을 보여준다. 또한, U937 세포를 단독으로 또는 이량체화를 유도하기 위한 B/B 동종이량체화제와 조합하여 독시사이클린으로 처리하여, 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현을 유도하였다. 도 5a 내지 도 5c에서, +는 독시사이클린으로 처리된 U937 세포를 나타내며, ++는 독시사이클린 및 B/B 동종이량체화제로 처리된 U937 세포를 나타낸다.
도 6a는 단독으로 또는 카스파제 저해제와 조합하여 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포의 생대적인 생존력을 보여준다. 도 6b는 대식구에서의 IFN-관련 유전자 활성화의 자극에 대한, 단독의 또는 카스파제 저해제와 조합된, 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현의 유도 후에 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성된 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향을 보여준다. 도 6c는 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 이식한 마우스의 생존에 대한, 단독의 또는 카스파제 저해제와 조합된, TRIF+RIPK3 발현의 영향을 보여준다.
도 7은 TRIF 변이체 및 대조군의 발현 후의 HT29 세포에서의 세포 생존력을 보여준다.
도 8a는 특정 TRIF 변이체를 발현하는 HT29 세포의 상청액과 함께 배양되는 THP1-Dual 세포에서의 IRF 활성을 보여준다. 도 8b는 특정 TRIF 변이체를 발현하는 HT29 세포의 상청액과 함께 배양되는 THP1-Dual 세포에서의 NFkB 활성을 보여준다.
도 9는 TRIF 변이체 및 대조군을 발현하는 A375 세포에서의 세포 생존력을 보여준다.
도 10은 특정 TRIF 변이체를 발현하는 A375 세포의 상청액과 함께 배양되는 THP1-Dual 세포에서의 IRF 활성(상측 패널) 및 NFkB 활성(하측 패널)을 보여준다.
도 11은 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 이식한 마우스에서의 종양 성장에 대한 미니(mini) TRIF + GSDME 발현의 영향을 보여준다.
도 12는 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 이식한 마우스의 생존에 대한 미니 TRIF + GSDME 발현의 영향을 보여준다.
도 13은 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 이식한 마우스에서의 종양 성장에 대한 미니 TRIF + RIPK3 발현의 영향을 보여준다.
도 14는 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 이식한 마우스의 생존에 대한 미니 TRIF + RIPK3 발현의 영향을 보여준다.
도 15는 암 세포로부터의 배양 배지로 처리된 마우스 유방암 4T1 세포에서의 세포 사멸(좌측 패널) 및 J774-Dual™ 세포에서의 IRF 활성(우측 패널)을 보여준다. 암 세포를 mRIPK3, TRIF-mRIPK3, 또는 TRIF-mRIPK3-vICA를 인코딩하는 복제 부적격 아데노바이러스 5(E1 및 E3 영역이 결실됨), 또는 모의 아데노바이러스 대조군으로 처리하였다.
도 16은 암 세포로부터의 배양 배지로 처리된 마우스 결장암 MC38 세포에서의 세포 사멸(좌측 패널) 및 J774-Dual™ 세포에서의 IRF 활성(우측 패널)을 보여준다. 암 세포를 mRIPK3, TRIF-mRIPK3, 또는 TRIF-mRIPK3-vICA를 인코딩하는 복제 부적격 아데노바이러스 5(E1 및 E3 영역이 결실됨), 또는 모의 아데노바이러스 대조군으로 처리하였다.
도 17은 암 세포로부터의 배양 배지로 처리된 마우스 췌장암 Pan02 세포에서의 세포 사멸(좌측 패널) 및 J774-Dual™ 세포에서의 IRF 활성(우측 패널)을 보여준다. 암 세포를 mRIPK3, TRIF-mRIPK3, 또는 TRIF-mRIPK3-vICA를 인코딩하는 복제 부적격 아데노바이러스 5(E1 및 E3 영역이 결실됨), 또는 모의 아데노바이러스 대조군으로 처리하였다.
도 2a 및 도 2b는 대식구에서의 IFN-관련 유전자 활성화의 자극에 대한, 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현(예를 들어, 단독의, 또는 RIPK3(cR3) 및/또는 가스더민 E(cGE)와 조합된 TRIF 발현)의 유도 후에 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성된 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향을 보여준다. 도 2a에서, Tet-유도 가능한 RIPK3은 "RIPK3"으로 표기되며, 구성성 PGK 프로모터를 함유하는 RIPK3 구축물은 "PGK_RIPK3"으로 표기된다. 도 2b에서, 각각의 타노트랜스미션 모듈에 있어서, 처리군은 좌측에서 우측으로, 대조군(CTL), 독시사이클린(Dox) 및 독시사이클린 + B/B 동종이량체화제(homodimerizer)(Dox + 이량체화제)이다.
도 3은 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에서의 활성화 마커의 발현의 자극에 대한, TRIF, RIPK3 또는 TRIF 및 RIPK3 발현의 유도 후에 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성된 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향을 보여준다. MFI는 평균-형광 세기이다.
도 4a, 도 4b 및 도 4c는 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 이식한 마우스의 생존에 대한 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현의 영향을 보여준다. "CT26-TF"는 TRIF를 단독으로 발현하는 CT-26 세포를 나타내며, "CT26-P_R3"은 RIPK3을 단독으로 발현하는 세포를 나타낸다. 도 4b에서, 모든 마우스를 항-PD1 항체로 처리하였다.
도 5a는 다양한 타노트랜스미션 페이로드를 발현하는 U937 백혈병 세포로부터의 세포 배양물로 처리되고, 단독으로 또는 RIPK3 저해제(GSK872)와 조합하여 카스파제 저해제(Q-VD-Oph)로 처리되는 THP-1 Dual 세포에서의 상대적인 NF-kB 활성을 보여준다. 도 5b 및 도 5c는 다양한 타노트랜스미션 페이로드를 발현하는 U937 백혈병 세포로부터의 세포 배양물로 처리되고, 단독으로 또는 RIPK3 저해제(GSK872)와 조합하여 카스파제 저해제(Q-VD-Oph)로 처리되는 THP-1 Dual 세포에서의 상대적인 IRF 활성을 보여준다. 또한, U937 세포를 단독으로 또는 이량체화를 유도하기 위한 B/B 동종이량체화제와 조합하여 독시사이클린으로 처리하여, 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현을 유도하였다. 도 5a 내지 도 5c에서, +는 독시사이클린으로 처리된 U937 세포를 나타내며, ++는 독시사이클린 및 B/B 동종이량체화제로 처리된 U937 세포를 나타낸다.
도 6a는 단독으로 또는 카스파제 저해제와 조합하여 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포의 생대적인 생존력을 보여준다. 도 6b는 대식구에서의 IFN-관련 유전자 활성화의 자극에 대한, 단독의 또는 카스파제 저해제와 조합된, 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현의 유도 후에 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성된 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향을 보여준다. 도 6c는 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 이식한 마우스의 생존에 대한, 단독의 또는 카스파제 저해제와 조합된, TRIF+RIPK3 발현의 영향을 보여준다.
도 7은 TRIF 변이체 및 대조군의 발현 후의 HT29 세포에서의 세포 생존력을 보여준다.
도 8a는 특정 TRIF 변이체를 발현하는 HT29 세포의 상청액과 함께 배양되는 THP1-Dual 세포에서의 IRF 활성을 보여준다. 도 8b는 특정 TRIF 변이체를 발현하는 HT29 세포의 상청액과 함께 배양되는 THP1-Dual 세포에서의 NFkB 활성을 보여준다.
도 9는 TRIF 변이체 및 대조군을 발현하는 A375 세포에서의 세포 생존력을 보여준다.
도 10은 특정 TRIF 변이체를 발현하는 A375 세포의 상청액과 함께 배양되는 THP1-Dual 세포에서의 IRF 활성(상측 패널) 및 NFkB 활성(하측 패널)을 보여준다.
도 11은 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 이식한 마우스에서의 종양 성장에 대한 미니(mini) TRIF + GSDME 발현의 영향을 보여준다.
도 12는 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 이식한 마우스의 생존에 대한 미니 TRIF + GSDME 발현의 영향을 보여준다.
도 13은 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 이식한 마우스에서의 종양 성장에 대한 미니 TRIF + RIPK3 발현의 영향을 보여준다.
도 14는 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 이식한 마우스의 생존에 대한 미니 TRIF + RIPK3 발현의 영향을 보여준다.
도 15는 암 세포로부터의 배양 배지로 처리된 마우스 유방암 4T1 세포에서의 세포 사멸(좌측 패널) 및 J774-Dual™ 세포에서의 IRF 활성(우측 패널)을 보여준다. 암 세포를 mRIPK3, TRIF-mRIPK3, 또는 TRIF-mRIPK3-vICA를 인코딩하는 복제 부적격 아데노바이러스 5(E1 및 E3 영역이 결실됨), 또는 모의 아데노바이러스 대조군으로 처리하였다.
도 16은 암 세포로부터의 배양 배지로 처리된 마우스 결장암 MC38 세포에서의 세포 사멸(좌측 패널) 및 J774-Dual™ 세포에서의 IRF 활성(우측 패널)을 보여준다. 암 세포를 mRIPK3, TRIF-mRIPK3, 또는 TRIF-mRIPK3-vICA를 인코딩하는 복제 부적격 아데노바이러스 5(E1 및 E3 영역이 결실됨), 또는 모의 아데노바이러스 대조군으로 처리하였다.
도 17은 암 세포로부터의 배양 배지로 처리된 마우스 췌장암 Pan02 세포에서의 세포 사멸(좌측 패널) 및 J774-Dual™ 세포에서의 IRF 활성(우측 패널)을 보여준다. 암 세포를 mRIPK3, TRIF-mRIPK3, 또는 TRIF-mRIPK3-vICA를 인코딩하는 복제 부적격 아데노바이러스 5(E1 및 E3 영역이 결실됨), 또는 모의 아데노바이러스 대조군으로 처리하였다.
본 개시내용은 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 둘 이상의 상이한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 타노트랜스미션은 표적 세포에서의 세포 턴오버 경로의 활성화에 따른, 세포 간의, 예를 들어, 표적 신호전달 세포와 반응 세포 간의 소통의 과정으로서, 반응 세포가 생물학적 반응을 겪도록 신호를 전달한다. 타노트랜스미션은 예를 들어, 표적 세포를 본원에 기재된 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자와 접촉시키는 것을 통한 세포 턴오버 경로 유전자의 조절에 의해 표적 세포에서 유도될 수 있다. 세포 턴오버 경로가 활성화된 표적 세포는 표적 세포에 의해 능동으로 방출되는 인자를 통해, 또는 표적 세포의 턴오버(예를 들어, 세포 사멸) 동안 반응 세포에 노출되는 표적 세포의 세포내 인자를 통해 반응 세포에 신호를 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드는 융합 단백질 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 각각은 개별 폴리펩티드로서 발현된다.
본 개시내용은 또한, 대상체에서의 타노트랜스미션의 촉진 방법에 관한 것이며, 방법은 타노트랜스미션 폴리펩티드 및/또는 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 타노트랜스미션 폴리펩티드 및/또는 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응의 증가 방법 및 암의 치료 방법도 또한 기재된다.
I. 정의
용어 "투여한다", "투여하는" 또는 "투여"는 대상체의 기관계 내로의, 또는 대상체 내의 또는 대상체 상의 특정 영역으로의 약제학적 조성물 또는 작용제의 임의의 운반 방법을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "조합하여 투여하는", "동시-투여" 또는 "조합 요법"은 개별 제형 또는 단일의 약제학적 제형을 사용한 둘 이상의 활성 작용제의 투여, 또는 둘 모두의(또는 모든) 활성 작용제가 동시에 생물학적 활성을 가하는 기간이 존재하게 하는 임의의 순서로의 연속 투여로서 이해된다. 하나의 활성 작용제(예를 들어, 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물)가 제2 치료제(예를 들어, 면역치료제)의 활성을 개선시킬 수 있는, 예를 들어, 표적 세포, 예를 들어, 암 세포를 제2 치료제의 활성에 대하여 감작시킬 수 있는 또는 제2 치료제와 상승적 효과를 가질 수 있는 것이 본원에서 고려된다. "조합하여 투여하는"은 작용제가 동시에, 동일한 빈도로 또는 동일한 투여 경로에 의해 투여되는 것을 필요로 하지 않는다. 본원에 사용되는 바와 같이, "조합하여 투여하는", "동시-투여" 또는 "조합 요법"은 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 면역치료제(예를 들어, 면역 체크포인트 조절제)와 함께 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 바이러스의 투여를 포함한다. 면역치료제의 예가 본원에 제공된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아넬로벡터"는 단백질성 외부(예를 들어, 캡시드) 내로의 패키징을 가능하게 하도록 아넬로바이러스 게놈 서열 또는 이의 연속 부분으로부터 유래되거나 이와 매우 유사한(예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한) 충분한 핵산 서열을 포함하며, 이종 서열을 추가로 포함하는 벡터를 지칭한다. 일부 구현예에서, 아넬로벡터는 바이러스 벡터 또는 네이키드 핵산이다. 일부 구현예에서, 아넬로벡터는 고유 아넬로바이러스 서열의 적어도 약 50, 60, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000 또는 3500개의 연속 뉴클레오티드 또는 이와 매우 유사한(예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 아넬로벡터는 아넬로바이러스 ORF1, ORF2, 또는 ORF3 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 서열은 다중 클로닝 부위를 포함하거나, 이종 프로모터를 포함하거나, 치료적 단백질에 대한 코딩 영역을 포함하거나, 치료적 핵산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 캡시드는 야생형 아넬로바이러스 캡시드이다. 아넬로벡터는 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제11,166,996호에 기재되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "원형 RNA"는 공유적 또는 비-공유적 결합을 통해 원형 구조를 형성하는 폴리리보뉴클레오티드를 지칭한다. 원형 RNA는 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제11,160,822호에 기재되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "증가시키는" 및 "감소시키는"은 조절하여, 각각 참조에 비하여 더 크거나 더 낮은 파라미터의 양, 기능 또는 활성을 초래하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물의 투여 이후에, 파라미터(예를 들어, IRF의 활성화, NF-κB의 활성화, 대식구의 활성화, 종양의 크기 또는 성장)는 대상체에서 투여 이전의 파라미터의 양에 비하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 또는 그 이상 증가하거나 감소할 수 있다. 일반적으로, 측정기준은 투여 이후에 투여가 언급된 효과를 가졌던 시간, 예를 들어, 치료 섭생이 시작된 후 적어도 1일, 1주, 1개월, 3개월, 6개월에 측정된다. 유사하게, 예비-임상 파라미터(예컨대 본원에 기재된 조성물에 의한, 시험관 내에서의 세포의 NF-κB 또는 IRF의 활성화 및/또는 시험 포유동물의 종양 부담의 감소)는 투여 이전의 파라미터의 양에 비하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 또는 그 이상 증가하거나 감소할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항신생물제"는 암의 치료를 위해 사용되는 약물을 지칭한다. 항신생물제는 화학치료제(예를 들어, 알킬화제, 항대사산물, 항종양 항생제, 국소이성질화효소(topoisomerase) 저해제, 유사분열 저해제 코르티코스테로이드 및 효소), 생물학적 항암제 및 면역 체크포인트 조절제를 포함한다.
"암 치료 섭생" 또는 "항신생물 섭생"은 특정 일정에 따른 특정 양의 하나 이상의 항신생물제의 대상체로의 투여를 포함하는 암의 치료를 위해 임상적으로 허용된 투여 프로토콜이다.
본원에 사용된 바와 같이, "융합유도(fusogenic) 단백질"은 바이러스로 감염된 세포와 또 다른 세포의 융합을 촉진시킬 수 있는 임의의 이종 단백질을 지칭한다. 융합유도 단백질의 예에는 VSV-G, (인간 내인성 레트로바이러스-W(HERV-W) 유래의) 신시틴-1 또는 (HERVFRDE1 유래의) 신시틴-2, 파라믹소바이러스 SV5-F, 홍역 바이러스-H, 홍역 바이러스-F, RSV-F, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 예컨대 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV), 쥣과 백혈병 바이러스(MLV), 메이슨-화이자 원숭이 바이러스(MPMV), 및 말 감염성 빈혈증 바이러스(EIAV) 유래의 R 막횡단 펩티드가 제거된(R- 버전) 당단백질이 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "이종"은 자연적으로 조합하여 발생하지 않는 요소의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 바이러스 또는 표적 세포에 대하여 이종인 폴리뉴클레오티드는 바이러스 또는 표적 세포에서 자연적으로 발생하지 않거나, 자연에서 이것이 발생하는 위치와 상이한 바이러스 또는 표적 세포 내의 위치에서 발생하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 표적 세포에 대하여 이종인 폴리펩티드는 표적 세포에서 자연적으로 발생하지 않거나, 표적 세포에 대하여 이종인 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "면역 체크포인트" 또는 "면역 체크포인트 분자"는 신호를 조절하는 면역계 내의 분자이다. 면역 체크포인트 분자는 자극성 체크포인트 분자일 수 있고, 즉, 신호를 증가시킬 수 있거나, 또는 저해성 체크포인트 분자일 수 있고, 즉, 신호를 감소시킬 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 "자극성 체크포인트 분자"는 신호를 증가시키거나, 공동-자극성인 면역계 내의 분자이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "저해성 체크포인트 분자"는 신호를 감소시키거나 공동-저해성인 면역계 내의 분자이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "면역 체크포인트 조절제"는 대상체에서 면역 체크포인트의 활성을 변경시킬 수 있는 작용제이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, GITR, ICOS, 4-1BB, ADORA2A, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG-3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 및 VISTA를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 면역 체크포인트 분자의 기능을 변경시킨다. 면역 체크포인트 조절제는 면역 체크포인트의 효능제 또는 길항제일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 면역 체크포인트 결합 단백질(예를 들어, 항체, 항체 Fab 단편, 이가 항체, 항체 약물 컨쥬게이트, scFv, 융합 단백질, 2가 항체 또는 4가 항체)이다. 다른 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 소분자이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 항-PD1, 항-PD-L1, 또는 항-CTLA-4 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "면역치료제"는 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 약제학적으로 허용 가능한 화합물, 조성물 또는 요법제를 지칭한다. 면역치료제는 면역 체크포인트 조절제, 톨-유사 수용체(TLR) 효능제, 세포-기반 요법제, 사이토카인 및 암 백신을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "종양학적 장애" 또는 "암" 또는 "신생물"은 백혈병, 림프종, 흑색종, 암종 및 육종을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 인간에서 발견되는 모든 유형의 암 또는 신생물을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "종양학적 장애", "암" 및 "신생물"은 상호교환 가능하게 사용되며, 단수 또는 복수 형태로, 그들을 숙주 유기체에 대하여 병원성이게 만드는 악성 변환을 겪은 세포를 지칭한다. 원발성 암 세포(즉, 악성 변환의 부위 근처로부터 수득되는 세포)는 널리 확립된 기법, 특히 조직학적 검사에 의해 비-암성 세포로부터 용이하게 구별될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 암 세포의 정의는 원발성 암 세포뿐만 아니라, 암 줄기 세포, 및 암 전구 세포 또는 암 세포 선조로부터 유래된 임의의 세포를 포함한다. 이는 전이된 암 세포, 및 암 세포로부터 유래된 시험관 내 배양물 및 세포주를 포함한다.
암의 병기결정에 대한 구체적인 기준은 종양 크기, 조직학적 특징, 종양 마커 및 해당 분야의 숙련자에게 공지된 다른 기준에 기초하여 특정 암 유형에 좌우된다. 일반적으로, 암 병기는 하기와 같이 기재될 수 있다: (i) 병기 0, 원 위치에서의 암종; (ii) 병기 I, 병기 II 및 병기 III, 숫자가 더 커질수록, 더 큰 종양 크기 및/또는 인근 림프절 및/또는 원발성 종양의 위치에 인접한 조직 또는 기관으로 처음 발생되는 기관을 넘어선 암의 확산을 포함하는 더욱 광범위한 질병을 나타냄; 및 (iii) 병기 IV, 암이 원위 조직 또는 기관으로 확산됨.
"고형 종양"은 예를 들어, CAT 스캔, MR 영상화, X-선, 초음파 또는 촉진과 같은 절차에 의해; 종양 덩어리에 기초하여 검출 가능하고/하거나 환자로부터 수득 가능한 시료 내의 하나 이상의 암-특이적 항원의 발현 때문에 검출 가능한 종양이다. 종양은 측정 가능한 치수를 가질 필요는 없다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 "대상체"는 인간 또는 비-인간 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일부 구현예에서, 비-인간 포유동물은 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 유인원), 유제류(예를 들어, 소, 버팔로, 양, 염소, 돼지, 낙타, 라마, 알파카, 사슴, 말, 당나귀), 육식 동물(예를 들어, 개, 고양이), 설치류(예를 들어, 랫트, 마우스), 또는 토끼류(예를 들어, 토끼)이다. 특정 구현예에서, 대상체는 본 발명의 방법을 사용한 치료의 개시 이전에, 검출 가능한 또는 진단받은 암을 갖는다. 특정 구현예에서, 대상체는 본 발명의 방법을 사용한 치료의 개시 이전에, 검출 가능한 또는 진단받은 감염, 예를 들어, 만성 감염을 갖는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "자살 유전자"는 약물의 비독성 전구체를 세포독성 화합물로 전환시키는 단백질(예를 들어, 효소)을 인코딩하는 유전자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포 턴오버"는 세포 내에서 물질을 재정렬하고 전파하며, 궁극적으로 세포 사멸을 초래하는 역학적 과정을 나타낸다. 세포 턴오버는 세포 턴오버 인자의 세포로부터의 생산 및 방출을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 턴오버는 세포 사멸을 초래하지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포 턴오버 인자"는 세포 턴오버를 겪고 있는 세포에 의해 생산되고, 궁극적으로 세포로부터 방출되고 다른 세포의 생물학적 활성에 영향을 미치는 분자 및 세포 단편이다. 세포 턴오버 인자는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질, 핵산, 소분자 및 세포 단편(예를 들어, 소낭 및 세포막 단편)을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포 턴오버 경로 유전자"는 세포 턴오버 경로를 촉진하거나, 유도하거나, 다르게는 이에 기여하는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "타노트랜스미션"은 표적 신호전달 세포에서의 세포 턴오버 경로의 활성화에 따른 세포 간의 통신으로, 반응 세포가 생물학적 반응을 겪도록 신호를 전달한다. 타노트랜스미션은 예를 들어, 표적 신호전달 세포로의 세포 턴오버 경로를 촉진시키는 유전자의 바이러스 또는 기타 유전자 치료법 전달을 통해 표적 신호전달 세포에서 세포 턴오버 경로 유전자를 조절함으로써 표적 신호전달 세포에서 유도될 수 있다. 표 1, 2, 3 및 4에는 다양한 세포 턴오버 경로를 촉진시킬 수 있는 예시적인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 기재되어 있다. 이에 따라 세포 턴오버 경로가 활성화된 표적 신호전달 세포는 신호전달 세포에 의해 능동적으로 방출되는 인자를 통해 또는 신호전달 세포의 세포 턴오버(예를 들어, 세포 사멸) 동안 반응 세포에 노출되게 되는 신호전달 세포의 세포내 인자를 통해 반응 세포에 신호를 전달할 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화된 신호전달 세포는 반응 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 면역-자극성 반응(예를 들어, 염증-유발 반응)을 촉진시킨다.
본원에 사용되는 바와 같이, "면역-조절 타노트랜스미션"은 활성화된 신호전달 세포가 반응 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 면역-조절 반응(예를 들어, 염증-유발 반응)을 촉진시키는 타노트랜스미션을 지칭한다.
용어 "타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드" 및 "타노트랜스미션 폴리뉴클레오티드"는 표적 세포에서의 이의 발현이 표적 세포에 의한 면역-조절 타노트랜스미션의 증가를 초래하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하기 위하여 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드는 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리펩티드, 즉, 표적 세포에서의 발현이 표적 세포에 의한 면역-조절 타노트랜스미션을 증가시키는 폴리펩티드를 인코딩한다. 용어 "타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리펩티드" 및 "타노트랜스미션 폴리펩티드"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 핵산 분자"는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드를 조합하여, 자연에서 관찰되지 않는 핵산 분자를 형성함으로써 제조되는 핵산 분자를 지칭한다. 따라서, 재조합 핵산 분자는 이들이 자연에서 공유적으로 결합되지 않는 핵산 서열에 공유적으로 결합된 적어도 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 각각이 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 둘 이상의 폴리뉴클레오티드는 이들이 자연에서 공유 결합되지 않는 핵산 서열에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 자연에서 동일한 핵산 분자 내에서 관찰되지 않는 적어도 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"치료적 유효량"은 질병을 치료하기 위하여 환자에게 투여되는 경우, 이러한 질병에 대한 치료를 달성하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. 질병을 예방하기 위해 투여되는 경우, 양은 질병의 발병을 회피하거나 지연시키기에 충분하다. "치료적 유효량"은 화합물, 질병 및 그의 중증도 및 치료될 환자의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다. 치료적 유효량은 치유적일 필요가 없다. 치료적 유효량은 질병 또는 질환이 발생하는 것을 온전히 예방할 필요는 없다. 대신에, 치료적 유효량은 질병 또는 질환의 발병, 중증도 또는 진행을 적어도 지연시키거나 감소시킬 양이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료", "치료하는" 및 그의 동족어는 질병, 병적 상태 또는 장애를 개선시키거나, 호전시키거나, 안정화시키거나, 예방하거나, 치유하려는 의도를 갖는 대상체의 의료적 관리를 지칭한다. 이 용어는 능동적 치료(질병, 병적 상태 또는 장애를 개선하는 것에 관한 치료), 원인 치료(관련 질병, 병적 상태 또는 장애의 원인에 관한 치료), 완화 치료(증상의 완화를 위해 설계된 치료), 예방적 치료(관련 질병, 병적 상태 또는 장애의 발생을 최소화하거나, 부분적으로 또는 완전히 저해하는 것에 관한 치료); 및 지지적 치료(또 다른 치료법을 보충하기 위해 사용되는 치료)를 포함한다.
폴리펩티드에 관하여 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "변이체"는 상응하는 야생형 폴리펩티드와 적어도 하나의 아미노산 잔기가 상이한 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드는 상응하는 자연 발생 폴리펩티드와 상이한 적어도 하나의 활성을 갖는다. 폴리뉴클레오티드에 관하여 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "변이체"는 상응하는 야생형 폴리뉴클레오티드와 적어도 하나의 뉴클레오티드가 상이한 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 변이체 폴리펩티드 또는 변이체 폴리뉴클레오티드는 상응하는 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지며, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 상이하다. 일부 구현예에서, 변이체는 폴리펩티드의 기능성 단편이다.
폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "기능성 단편"은 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성, 예를 들어, 타노트랜스미션을 촉진시키는 능력을 보유하는 폴리펩티드의 부분을 지칭한다. 일부 구현예에서, 기능적 다편은 폴리펩티드의 도메인, 예를 들어, 폴리펩티드의 사멸 폴드(death fold) 도메인, 사멸 도메인, 피린(pyrin) 도메인, 사멸 이펙터 도메인(Death Effector Domain; DED) 또는 C-말단 카스파제 동원 도메인(CARD)이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 기능성 단편은 도메인의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 도메인의 부분이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "5' 비번역 영역"(5'UTR)은 폴리펩티드를 인코딩하지 않는 출발 코돈(즉, 리보솜에 의해 번역되는 mRNA 전사물의 제1 코돈)으로부터 바로 상류(즉, 5')인 mRNA의 영역을 지칭한다.
"3' 비번역 영역"(3'UTR)은 폴리펩티드를 인코딩하지 않는 정지 코돈(즉, 번역의 종결을 신호전달하는 mRNA 전사물의 코돈)으로부터 바로 하류(즉, 3')인 mRNA의 영역을 지칭한다.
"오픈 리딩 프레임"(ORF)은 출발 코돈(예를 들어, 메티오닌(ATG))으로 시작하고, 정지 코돈(예를 들어, TAA, TAG 또는 TGA)으로 끝나며, 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치이다.
"폴리A 테일"은 다수의 연속 아데노신 모노포스페이트를 함유하는 3' UTR로부터 하류인, 예를 들어, 바로 하류(즉, 3')인 mRNA의 영역이다. 폴리A 테일은 10 내지 300개의 아데노신 모노포스페이트를 함유할 수 있다. 예를 들어, 폴리A 테일은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300개의 아데노신 모노포스페이트를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리A 테일은 50 내지 250개의 아데노신 모노포스페이트를 함유한다. 관련 생물학적 환경에서(예를 들어, 세포에서, 생체내에서), 폴리(A) 테일은 예를 들어, 세포질에서 mRNA를 효소적 분해로부터 보호하는 기능을 하며, 전사 종결, 핵으로부터 mRNA의 유출 및 번역을 보조한다.
II. 세포 턴오버 경로
본원에서 제공되는 바와 같은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 사용하여, 표적 세포에서 세포 턴오버 경로를 조절할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 표적 세포에서의 핵산 분자 및 인코딩된 폴리펩티드의 발현은 표적 세포에서 면역-자극성 세포 턴오버 경로를 유도한다. 면역-자극성 세포 턴오버 경로는 세포에서 활성화되는 경우, 반응 세포, 예컨대 면역 세포에서 면역-자극 반응을 촉진시키는 세포 턴오버 경로이다. 면역-자극성 세포 턴오버 경로에는 예정 괴사(예를 들어, 파이롭토시스 및 네크롭토시스), 외인성 아폽토시스 및 이들의 조합이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
예정 괴사
본원에서 사용되는 바와 같이, "예정 괴사"는 아폽토시스 동안 발생하는 막 온전성의 유지와 대조적으로, 형태학적 특징, 예컨대 세포 팽윤(온코시스(oncosis)), 막 파열 및 세포 내용물의 방출을 갖는 유전학적으로 제어된 세포 사멸을 지칭한다. 일부 구현예에서, 예정 괴사는 파이롭토시스이다. 일부 구현예에서, 예정 괴사는 네크롭토시스이다.
파이롭토시스
본원에서 사용되는 바와 같이, "파이롭토시스"는 카스파제 1-, 카스파제 4-, 또는 카스파제 5-의존적인 예정된 세포 사멸의 선천적인 염증 과정을 지칭한다. 파이롭토시스의 가장 독특한 생화학적 특징은 카스파제-1의 조기의 유도된 근접-매개된 활성화이다. 카스파제-1, 4 또는 5의 파이롭토시스 활성화는 NOD-유사 수용체(NLR) 또는 기타 센서, 예컨대 카스파제-1 활성화를 촉진하는 어댑터 단백질 ASC를 동원하는 시토졸 DNA 센서 흑색종 부재 2(absent in melanoma 2; AIM2)를 수반하는 인플라마좀(inflammasome)으로 알려져 있는 다중단백질 플랫폼의 맥락에서 발생할 수 있다. 카스파제-4/5는 LPS에 의해 직접적으로 활성화될 수 있다. 둘 모두의 경우에, 활성 카스파제-1은 단백질분해 성숙 및 발열성 인터류킨-1β(IL-1β) 및 IL-18의 방출을 촉매한다. 또한, 일부(전부는 아님) 경우에, 카스파제 활성화는 포어 형성 단백질 GSDM-D의 절단 및 활성화를 유도하여, 막 파열 및 세포 사멸을 구동한다. 문헌[Galluzzi et al., 2018, Cell Death Differ. Mar; 25(3): 486-541]을 참조한다. 본 개시내용의 방법에서, 파이롭토시스는 표적 세포에서 파이롭토시스를 유도하는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 바이러스와의 접촉 또는 이로의 감염을 통해 표적 세포에서 유도될 수 있다. 표적 세포에서 파이롭토시스를 유도할 수 있는 폴리펩티드에는 NLR, ASC, GSDM-D, AIM2 및 BIRC1이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
몇몇의 방법이 당업계에 알려져 있으며, 특정 마커의 검출을 통해 파이롭토시스를 겪고 있는 세포를 확인하고, 다른 유형의 세포 디스어셈블리 및/또는 세포 사멸로부터 구별하기 위하여 사용될 수 있다. 파이롭토시스는 카스파제-1, 카스파제-4 또는 카스파제-5 활성을 필요로 하며, 보통 전구-IL-1b 및/또는 전구-IL-18의 가공, 이들 성숙 사이토카인의 방출, 및 GSDM-D의 카스파제-1/4/5 절단 단편에 의한 막 투과성을 동반한다.
네크롭토시스
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "네크롭토시스"는 수용체 상호작용 단백질 키나제 1 및/또는 3(RIPK1- 및/또는 RIPK3)/혼합 계통 키나제-유사(MLKL)-의존적 괴사를 지칭한다. 알킬화 DNA 손상, 흥분독소(excitotoxin) 및 사멸 수용체의 라이게이션을 포함하는 몇몇의 트리거는 네크롭토시스를 유도할 수 있다. 예를 들어, 카스파제(및 특히, 카스파제-8 또는 카스파제-10)가 (예를 들어, 유전자 낙아웃 또는 RNA 간섭, RNAi에 의한) 유전학적 조작에 의해 저해되거나, 약리학적 작용제(예를 들어, 화학적 카스파제 저해제)에 의해 차단되는 경우, RIPK3은 MLKL을 인산화하여, 막 포어 내로의 MLKL 어셈블리를 야기하며, 이는 괴사성 세포 사멸의 실행을 궁극적으로 활성화시킨다. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Galluzzi et al., 2018, Cell Death Differ. Mar; 25(3): 486-541]을 참조한다.
면역원성 아폽토시스를 구동하는 동일한 경로는 RIPK3을 활성화시킬 수 있지만, 보통 카스파제 8(및 잠재적으로 카스파제 10)은 RIPK3 활성화를 억제한다. RIPK3은 전형적으로 카스파제 8 손상의 상황에서만 활성화된다. 바이러스 단백질, 예컨대 vICA 또는 세포 돌연변이체, 예컨대 FADD 우성 음성(DN)은 카스파제 8 경로를 표적화하며, RIPK3이 존재한다면, RIPK3 활성을 촉발시킨다. RIPK3이 존재하지 않는다면, vICA 또는 FADD-DN은 단순히 아폽토시스를 차단한다. (a) 막 파열 및 (b) 염증성 전사 프로그램(예를 들어, NF-kB 및 IRF3)이 동시에 활성화되기 때문에, 네크롭토시스는 면역원성이다.
본 개시내용의 방법에서, 네크롭토시스는 표적 세포에서 네크롭토시스를 유도하는 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 발현을 통해 표적 세포에서 유도될 수 있다. 표적 세포에서 네크롭토시스를 유도할 수 있는 폴리펩티드에는 톨-유사 수용체 3(TLR3), TLR4, TIR 도메인 함유 어댑터 단백질(TIRAP), 톨/인터류킨-1 수용체(TIR)-도메인-함유 어댑터-유도 인터페론-β(TRIF), Z-DNA-결합 단백질 1(ZBP1), 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 1(RIPK1), 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3(RIPK3), 혼합 계통 키나제 도메인 유사 슈도키나제(MLKL), 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), FS-7-관련 표면 항원(FAS), TNF-연관 아폽토시스 유도 리간드 수용체(TRAILR) 및 종양 괴사 인자 수용체 1형-관련 사멸 도메인 단백질(TRADD)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
몇몇의 방법이 당업계에 알려져 있으며, 특정 마커의 검출을 통해 네크롭토시스를 겪고 있는 세포를 확인하고, 다른 유형의 세포 디스어셈블리 및/또는 세포 사멸로부터 구별하기 위하여 사용될 수 있다. 이들은 전형적으로 세포의 면역블롯 또는 면역염색에 의해 이들 번역후 변형을 검출하는 항체에 의한 RIPK1, RIPK3 및 MLKL의 인산화를 포함한다. 네크롭토시스는 카스파제 활성화의 부재, 신속한 막 투과성, 막으로의 MLKL 재국소화, 세제 불용성 분획 내로의 RIPK3 및 MLKL의 축적, RIPK3/MLKL 복합체 형성 및 MLKL 올리고머화에 의해 아폽토시스 및 파이롭토시스로부터 구별될 수 있다. 네크롭토시스는 유전학적으로, 그리고 약리학적으로 RIPK3 및 MLKL 둘 모두 및 이들의 활성화의 요건에 의해 정의될 수 있다.
외인성 아폽토시스
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 '외인성 아폽토시스'는 특정 막횡단 수용체에 의해 감지되고 전파되는 세포외 스트레스 신호에 의해 유도되는 아폽토시스 세포 사멸의 예를 말한다. 외인성 아폽토시스는 다양한 사멸 수용체(즉, 각각 FAS/CD95, TNFα 수용체 1(TNFR1) 및 TRAIL 수용체(TRAILR)1-2)로의 리간드, 예컨대 FAS/CD95 리간드(FASL/CD95L), 종양 괴사 인자 α(TNFα) 및 TNF(리간드) 상과, 구성원 10(TNFSF10, TNF-연관 아폽토시스 유도 리간드, TRAIL로 가장 잘 알려져 있음)의 결합에 의해 개시될 수 있다. 대안적으로, 외인적 아폽토시스-유발 신호는 이들의 특이적인 리간드의 농도가 결정적인 임계치 수준 미만으로 떨어질 때만 치명적인 기능을 발휘하는 네트린 수용체(예를 들어, UNC5A-D 및 대장암종 내 결실, DCC)를 포함하는 소위 '의존성 수용체'에 의해 전송될 수 있다. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Galluzzi et al., 2018, Cell Death Differ. Mar; 25(3): 486-541]을 참조한다.
본 개시내용의 방법에서, 외인성 아폽토시스는 표적 세포에서 외인성 아폽토시스를 유도하는 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 발현을 통해 표적 세포에서 유도될 수 있다. 표적 세포에서 외인성 아폽토시스를 유도할 수 있는 폴리펩티드에는 TNF, Fas 리간드(FasL), TRAIL(및 이의 동족 수용체), TRADD, 사멸 도메인을 갖는 Fas-관련 단백질(FADD), 전환 성장 인자 베타-활성화 키나제 1(Tak1), 카스파제-8, XIAP, BID, 카스파제-9, APAF-1, CytoC, 카스파제-3 및 카스파제-7이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 표적 세포에서 외인성 아폽토시스를 저해할 수 있는 폴리펩티드에는 아폽토시스의 세포 저해제 단백질 1(Cellular Inhibitor of Apoptosis Protein 1; cIAP1), cIAP2, Ikka 및 Ikkb가 포함된다. 몇몇의 방법이 당업계에 알려져 있으며, 특정 마커의 검출을 통해 아폽토시스를 겪고 있는 세포를 확인하고, 다른 유형의 세포 디스어셈블리 및/또는 세포 사멸로부터 구별하기 위해 사용될 수 있다. 아폽토시스는 카스파제 활성화를 필요로 하며, 카스파제 활성화의 저해제 및/또는 카스파제, 예컨대 카스파제-8 또는 카스파제-9의 부재에 의한 사멸의 예방에 의해 억제될 수 있다. 카스파제 활성화는 특이적인 기질, 예컨대 PARP 및 DFF45, 및 600가지 초과의 추가의 단백질의 절단에 의해 세포를 체계적으로 분해한다. 아폽토시스 세포막은 포스포티딜-세린의 외재화 및 동시의 막 수포형성(blebbing)과 함께, 처음에 온전하게 유지된다. 미토콘드리아 외막은 전형적으로 파열되어, 단백질, 예컨대 CytoC 및 HTRA2를 시토졸 내로 방출한다. 핵 DNA는 분리된 단편으로 절단되며, 이는 당업계에 알려져 있는 검정에 의해 검출될 수 있다.
III. 페이로드
특정 양태에서, 본 개시내용은 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 조합, 및 이들 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드는 단일의 핵산 분자에 의해, 또는 둘 이상의 핵산 분자에 의해 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 본 개시내용은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 둘 이상의 재조합 핵산 분자의 조합에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자는 약제학적 조성물, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존) 또는 세포 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존) 또는 세포는 각각이 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 핵산 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 kb 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 kb를 포함한다. 이들 값 중 임의의 것은 재조합 핵산 분자의 크기에 대한 범위를 한정하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 10 내지 100 kb 또는 10 내지 50 kb를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 미만의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩한다. 이들 값 중 임의의 것은 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드의 수에 대한 범위를 한정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 2 내지 3개, 2 내지 4개 또는 2 내지 10개의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 오직 2개의 타노트랜스미션 폴리펩티드만을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 오직 3개의 타노트랜스미션 폴리펩티드만을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제, FADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, 종양 괴사 인자 수용체 상과(TNFSF) 단백질, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적합한 카스파제에는 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-2, 카스파제-3, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-6, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-10, 카스파제-11 및 카스파제-12가 포함된다.
예시적인 TNFSF 단백질은 하기 표 1에 제공되어 있다.
[표 1]
타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오티드 서열은 하기 표 2에 제공되어 있다. 표 2의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는(또는 이와 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는) 임의의 다른 폴리뉴클레오티드 서열은 또한, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드는 야생형 단백질, 또는 이의 기능성 단편이다. 일부 구현예에서, 기능성 단편은 야생형 단백질, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 야생형 타노트랜스미션 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 절단이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 타노트랜스미션 폴리펩티드를 돌연변이시켜, 예를 들어, 타노트랜스미션을 촉진시키는 이들의 능력을 추가로 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 또는 이의 기능성 단편은 야생형 단백질과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
TRIF 변이체
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF 단백질의 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 688 내지 691 위치에서 RHIM 테트라드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 Q688A, L689A, G690A 및 L691A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 치환 Q688A, L689A, G690A 및 L691A를 포함한다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 상응하는 야생형 TRIF 단백질과 비교하여, 예를 들어, 인간 야생형 TRIF 단백질과 비교하여 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 541 내지 712 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 야생형 인간 TRIF 단백질의 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 546 내지 712 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 TBK1에 의해 인산화되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 S210A, S212A 및 T214A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 434 위치에서 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질과 비교하여 P434H 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 상응하는 야생형 TRIF 단백질과 비교하여, 예를 들어, 인간 야생형 TRIF 단백질과 비교하여, N-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 311 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 12, 또는 SEQ ID NO: 12에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 180 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 217 내지 658 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 217 내지 386 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 180 및 217 내지 658 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 1 내지 180, 217 내지 386 및 546 내지 712 위치에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체이다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 22, 또는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 22에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 22로 이루어진다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 22에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 21을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 21에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 21로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, TRIF 변이체는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 22에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
[표 2]
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드는 개별 폴리펩티드로서 발현될 수 있거나, 이들은 융합 단백질 내에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 단일의 전사물로서 전사된다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 이 단일의 전사물은 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 포함하는 단일의 폴리펩티드(예를 들어, 융합 단백질)로서 번역된다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 이 단일의 전사물은 예를 들어, 타노트랜스미션 폴리펩티드를 분리하는 본원에 기재된 바와 같은 2A 펩티드의 포함을 통해 개별 타노트랜스미션 폴리펩티드로서 번역된다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 TRIF 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 TRIF 또는 이의 변이체 및 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 12에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 22에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 링커, 예를 들어, 융합 단백질을 구성하는 타노트랜스미션 폴리펩티드 사이에 위치한 하나 이상의 링커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 SEQ ID NO: 25를 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 기재된 타노트랜스미션 폴리펩티드는 NF-κB의 활성화, IRF3 및/또는 IRF7의 활성화, 아폽토시스의 촉진, 및 예정 괴사(예를 들어, 네크롭토시스 또는 파이롭토시스)의 촉진을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 메커니즘을 통해 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 조합이 사용되는 경우, 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 각각은 유사한 메커니즘을 통해 또는 상이한 메커니즘을 통해 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2가지는 NF-κB를 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2가지는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2가지는 아폽토시스를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 2가지는 예정 괴사(예를 들어, 네크롭토시스 또는 파이롭토시스)를 촉진시킨다.
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드가 상이한 메커니즘을 통해 타노트랜스미션을 촉진시키는 경우, 메커니즘의 다양한 조합이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 NF-κB를 활성화시키며, 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 NF-κB를 활성화시키며, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 아폽토시스를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 NF-κB를 활성화시키며, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예정 괴사(예를 들어, 네크롭토시스 또는 파이롭토시스)를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키며, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 아폽토시스를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키며, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예정 괴사(예를 들어, 네크롭토시스 또는 파이롭토시스)를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 아폽토시스를 촉진시키며, 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예정 괴사(예를 들어, 네크롭토시스 또는 파이롭토시스)를 촉진시킨다.
일부 구현예에서, NF-κB를 활성화시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TNFSF 단백질 및 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, MyD88, MAVS, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3 및 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 아폽토시스를 촉진시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, RIPK1, 카스파제, FADD, TRADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma 및 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 예정 괴사를 촉진시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 및 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드의 조합은 TRADD 및 TRAF2, TRADD 및 TRAF6, TRADD 및 cIAP1, TRADD 및 cIAP2, TRADD 및 XIAP, TRADD 및 NOD2, TRADD 및 MyD88, TRADD 및 TRAM, TRADD 및 HOIL, TRADD 및 HOIP, TRADD 및 Sharpin, TRADD 및 IKKg, TRADD 및 IKKa, TRADD 및 IKKb, TRADD 및 RelA, TRADD 및 MAVS, TRADD 및 RIGI, TRADD 및 MDA5, TRADD 및 Tak1, TRADD 및 TBK1, TRADD 및 IKKe, TRADD 및 IRF3, TRADD 및 IRF7, TRADD 및 IRF1, TRADD 및 TRAF3, TRADD 및 카스파제, TRADD 및 FADD, TRADD 및 TNFR1, TRADD 및 TRAILR1, TRADD 및 TRAILR2, TRADD 및 FAS, TRADD 및 Bax, TRADD 및 Bak, TRADD 및 Bim, TRADD 및 Bid, TRADD 및 Noxa, TRADD 및 Puma, TRADD 및 TRIF, TRADD 및 ZBP1, TRADD 및 RIPK1, TRADD 및 RIPK3, TRADD 및 MLKL, TRADD 및 가스더민 A, TRADD 및 가스더민 B, TRADD 및 가스더민 C, TRADD 및 가스더민 D, TRADD 및 가스더민 E, TRAF2 및 TRAF6, TRAF2 및 cIAP1, TRAF2 및 cIAP2, TRAF2 및 XIAP, TRAF2 및 NOD2, TRAF2 및 MyD88, TRAF2 및 TRAM, TRAF2 및 HOIL, TRAF2 및 HOIP, TRAF2 및 Sharpin, TRAF2 및 IKKg, TRAF2 및 IKKa, TRAF2 및 IKKb, TRAF2 및 RelA, TRAF2 및 MAVS, TRAF2 및 RIGI, TRAF2 및 MDA5, TRAF2 및 Tak1, TRAF2 및 TBK1, TRAF2 및 IKKe, TRAF2 및 IRF3, TRAF2 및 IRF7, TRAF2 및 IRF1, TRAF2 및 TRAF3, TRAF2 및 카스파제, TRAF2 및 FADD, TRAF2 및 TNFR1, TRAF2 및 TRAILR1, TRAF2 및 TRAILR2, TRAF2 및 FAS, TRAF2 및 Bax, TRAF2 및 Bak, TRAF2 및 Bim, TRAF2 및 Bid, TRAF2 및 Noxa, TRAF2 및 Puma, TRAF2 및 TRIF, TRAF2 및 ZBP1, TRAF2 및 RIPK1, TRAF2 및 RIPK3, TRAF2 및 MLKL, TRAF2 및 가스더민 A, TRAF2 및 가스더민 B, TRAF2 및 가스더민 C, TRAF2 및 가스더민 D, TRAF2 및 가스더민 E, TRAF6 및 cIAP1, TRAF6 및 cIAP2, TRAF6 및 XIAP, TRAF6 및 NOD2, TRAF6 및 MyD88, TRAF6 및 TRAM, TRAF6 및 HOIL, TRAF6 및 HOIP, TRAF6 및 Sharpin, TRAF6 및 IKKg, TRAF6 및 IKKa, TRAF6 및 IKKb, TRAF6 및 RelA, TRAF6 및 MAVS, TRAF6 및 RIGI, TRAF6 및 MDA5, TRAF6 및 Tak1, TRAF6 및 TBK1, TRAF6 및 IKKe, TRAF6 및 IRF3, TRAF6 및 IRF7, TRAF6 및 IRF1, TRAF6 및 TRAF3, TRAF6 및 카스파제, TRAF6 및 FADD, TRAF6 및 TNFR1, TRAF6 및 TRAILR1, TRAF6 및 TRAILR2, TRAF6 및 FAS, TRAF6 및 Bax, TRAF6 및 Bak, TRAF6 및 Bim, TRAF6 및 Bid, TRAF6 및 Noxa, TRAF6 및 Puma, TRAF6 및 TRIF, TRAF6 및 ZBP1, TRAF6 및 RIPK1, TRAF6 및 RIPK3, TRAF6 및 MLKL, TRAF6 및 가스더민 A, TRAF6 및 가스더민 B, TRAF6 및 가스더민 C, TRAF6 및 가스더민 D, TRAF6 및 가스더민 E, cIAP1 및 cIAP2, cIAP1 및 XIAP, cIAP1 및 NOD2, cIAP1 및 MyD88, cIAP1 및 TRAM, cIAP1 및 HOIL, cIAP1 및 HOIP, cIAP1 및 Sharpin, cIAP1 및 IKKg, cIAP1 및 IKKa, cIAP1 및 IKKb, cIAP1 및 RelA, cIAP1 및 MAVS, cIAP1 및 RIGI, cIAP1 및 MDA5, cIAP1 및 Tak1, cIAP1 및 TBK1, cIAP1 및 IKKe, cIAP1 및 IRF3, cIAP1 및 IRF7, cIAP1 및 IRF1, cIAP1 및 TRAF3, cIAP1 및 카스파제, cIAP1 및 FADD, cIAP1 및 TNFR1, cIAP1 및 TRAILR1, cIAP1 및 TRAILR2, cIAP1 및 FAS, cIAP1 및 Bax, cIAP1 및 Bak, cIAP1 및 Bim, cIAP1 및 Bid, cIAP1 및 Noxa, cIAP1 및 Puma, cIAP1 및 TRIF, cIAP1 및 ZBP1, cIAP1 및 RIPK1, cIAP1 및 RIPK3, cIAP1 및 MLKL, cIAP1 및 가스더민 A, cIAP1 및 가스더민 B, cIAP1 및 가스더민 C, cIAP1 및 가스더민 D, cIAP1 및 가스더민 E, cIAP2 및 XIAP, cIAP2 및 NOD2, cIAP2 및 MyD88, cIAP2 및 TRAM, cIAP2 및 HOIL, cIAP2 및 HOIP, cIAP2 및 Sharpin, cIAP2 및 IKKg, cIAP2 및 IKKa, cIAP2 및 IKKb, cIAP2 및 RelA, cIAP2 및 MAVS, cIAP2 및 RIGI, cIAP2 및 MDA5, cIAP2 및 Tak1, cIAP2 및 TBK1, cIAP2 및 IKKe, cIAP2 및 IRF3, cIAP2 및 IRF7, cIAP2 및 IRF1, cIAP2 및 TRAF3, cIAP2 및 카스파제, cIAP2 및 FADD, cIAP2 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TRAILR1 및 RIPK3, TRAILR1 및 MLKL, TRAILR1 및 가스더민 A, TRAILR1 및 가스더민 B, TRAILR1 및 가스더민 C, TRAILR1 및 가스더민 D, TRAILR1 및 가스더민 E, TRAILR2 및 FAS, TRAILR2 및 Bax, TRAILR2 및 Bak, TRAILR2 및 Bim, TRAILR2 및 Bid, TRAILR2 및 Noxa, TRAILR2 및 Puma, TRAILR2 및 TRIF, TRAILR2 및 ZBP1, TRAILR2 및 RIPK1, TRAILR2 및 RIPK3, TRAILR2 및 MLKL, TRAILR2 및 가스더민 A, TRAILR2 및 가스더민 B, TRAILR2 및 가스더민 C, TRAILR2 및 가스더민 D, TRAILR2 및 가스더민 E, FAS 및 Bax, FAS 및 Bak, FAS 및 Bim, FAS 및 Bid, FAS 및 Noxa, FAS 및 Puma, FAS 및 TRIF, FAS 및 ZBP1, FAS 및 RIPK1, FAS 및 RIPK3, FAS 및 MLKL, FAS 및 가스더민 A, FAS 및 가스더민 B, FAS 및 가스더민 C, FAS 및 가스더민 D, FAS 및 가스더민 E, Bax 및 Bak, Bax 및 Bim, Bax 및 Bid, Bax 및 Noxa, Bax 및 Puma, Bax 및 TRIF, Bax 및 ZBP1, Bax 및 RIPK1, Bax 및 RIPK3, Bax 및 MLKL, Bax 및 가스더민 A, Bax 및 가스더민 B, Bax 및 가스더민 C, Bax 및 가스더민 D, Bax 및 가스더민 E, Bak 및 Bim, Bak 및 Bid, Bak 및 Noxa, Bak 및 Puma, Bak 및 TRIF, Bak 및 ZBP1, Bak 및 RIPK1, Bak 및 RIPK3, Bak 및 MLKL, Bak 및 가스더민 A, Bak 및 가스더민 B, Bak 및 가스더민 C, Bak 및 가스더민 D, Bak 및 가스더민 E, Bim 및 Bid, Bim 및 Noxa, Bim 및 Puma, Bim 및 TRIF, Bim 및 ZBP1, Bim 및 RIPK1, Bim 및 RIPK3, Bim 및 MLKL, Bim 및 가스더민 A, Bim 및 가스더민 B, Bim 및 가스더민 C, Bim 및 가스더민 D, Bim 및 가스더민 E, Bid 및 Noxa, Bid 및 Puma, Bid 및 TRIF, Bid 및 ZBP1, Bid 및 RIPK1, Bid 및 RIPK3, Bid 및 MLKL, Bid 및 가스더민 A, Bid 및 가스더민 B, Bid 및 가스더민 C, Bid 및 가스더민 D, Bid 및 가스더민 E, Noxa 및 Puma, Noxa 및 TRIF, Noxa 및 ZBP1, Noxa 및 RIPK1, Noxa 및 RIPK3, Noxa 및 MLKL, Noxa 및 가스더민 A, Noxa 및 가스더민 B, Noxa 및 가스더민 C, Noxa 및 가스더민 D, Noxa 및 가스더민 E, Puma 및 TRIF, Puma 및 ZBP1, Puma 및 RIPK1, Puma 및 RIPK3, Puma 및 MLKL, Puma 및 가스더민 A, Puma 및 가스더민 B, Puma 및 가스더민 C, Puma 및 가스더민 D, Puma 및 가스더민 E, TRIF 및 ZBP1, TRIF 및 RIPK1, TRIF 및 RIPK3, TRIF 및 MLKL, TRIF 및 가스더민 A, TRIF 및 가스더민 B, TRIF 및 가스더민 C, TRIF 및 가스더민 D, TRIF 및 가스더민 E, ZBP1 및 RIPK1, ZBP1 및 RIPK3, ZBP1 및 MLKL, ZBP1 및 가스더민 A, ZBP1 및 가스더민 B, ZBP1 및 가스더민 C, ZBP1 및 가스더민 D, ZBP1 및 가스더민 E, RIPK1 및 RIPK3, RIPK1 및 MLKL, RIPK1 및 가스더민 A, RIPK1 및 가스더민 B, RIPK1 및 가스더민 C, RIPK1 및 가스더민 D, RIPK1 및 가스더민 E, RIPK3 및 MLKL, RIPK3 및 가스더민 A, RIPK3 및 가스더민 B, RIPK3 및 가스더민 C, RIPK3 및 가스더민 D, RIPK3 및 가스더민 E, MLKL 및 가스더민 A, MLKL 및 가스더민 B, MLKL 및 가스더민 C, MLKL 및 가스더민 D, MLKL 및 가스더민 E, 가스더민 A 및 가스더민 B, 가스더민 A 및 가스더민 C, 가스더민 A 및 가스더민 D, 가스더민 A 및 가스더민 E, 가스더민 B 및 가스더민 C, 가스더민 B 및 가스더민 D, 가스더민 B 및 가스더민 E, 가스더민 C 및 가스더민 D, 가스더민 C 및 가스더민 E, 가스더민 D 및 가스더민 E, TNFSF 단백질 및 TRADD, TNFSF 단백질 및 TRAF2, TNFSF 단백질 및 TRAF6, TNFSF 단백질 및 cIAP1, TNFSF 단백질 및 cIAP2, TNFSF 단백질 및 XIAP, TNFSF 단백질 및 NOD2, TNFSF 단백질 및 MyD88, TNFSF 단백질 및 TRAM, TNFSF 단백질 및 HOIL, TNFSF 단백질 및 HOIP, TNFSF 단백질 및 Sharpin, TNFSF 단백질 및 IKKg, TNFSF 단백질 및 IKKa, TNFSF 단백질 및 IKKb, TNFSF 단백질 및 RelA, TNFSF 단백질 및 MAVS, TNFSF 단백질 및 RIGI, TNFSF 단백질 및 MDA5, TNFSF 단백질 및 Tak1, TNFSF 단백질 및 TBK1, TNFSF 단백질 및 IKKe, TNFSF 단백질 및 IRF3, TNFSF 단백질 및 IRF7, TNFSF 단백질 및 IRF1, TNFSF 단백질 및 TRAF3, TNFSF 단백질 및 카스파제, TNFSF 단백질 및 FADD, TNFSF 단백질 및 TNFR1, TNFSF 단백질 및 TRAILR1, TNFSF 단백질 및 TRAILR2, TNFSF 단백질 및 FAS, TNFSF 단백질 및 Bax, TNFSF 단백질 및 Bak, TNFSF 단백질 및 Bim, TNFSF 단백질 및 Bid, TNFSF 단백질 및 Noxa, TNFSF 단백질 및 Puma, TNFSF 단백질 및 TRIF, TNFSF 단백질 및 ZBP1, TNFSF 단백질 및 RIPK1, TNFSF 단백질 및 RIPK3, TNFSF 단백질 및 MLKL, TNFSF 단백질 및 가스더민 A, TNFSF 단백질 및 가스더민 B, TNFSF 단백질 및 가스더민 C, TNFSF 단백질 및 가스더민 D, TNFSF 단백질 및 가스더민 E, 및 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
특정 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 30을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 30에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 31을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 31에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
특정 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF, 또는 이의 기능작 단편 또는 변이체이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
특정 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
특정 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MLKL 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
일부 구현예에서, Bid의 기능성 단편은 절단된 Bid(tBID)이다. TNFR1/Fas 결합은 시토졸 BID를 절단된 tBID로 절단시키며, 이는 미토콘드리아로 전위된다. tBID 폴리펩티드는 막-표적화된 사멸 리간드로서 기능한다. Bak-결핍 미토콘드리아 및 차단 항체에 의해, tBID가 이의 미토콘드리아 파트너 BAK에 결합하여, 시토크롬 c를 방출시키는 것이 드러났다. 활성화된 tBID는 BAK의 알로스테릭 활성화를 초래하여, 시토크롬 C 유출을 위해 제안된 포어 내로의 이의 막내 올리고머화를 유도하고, 사멸 수용체로부터 세포 사멸까지 경로를 통합한다. 문헌[Wei et al., 2000, Genes & Dev. 14: 2060-2071]을 참조한다.
특정 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 tBID 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드는 TRIF, 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)가 아니다.
타노트랜스미션을 촉진시키는 융합 단백질
일부 구현예에서, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 융합 단백질은 상기 표 2에 개시된 바와 같은 임의의 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드, 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 기능성 단편은 타노트랜스미션 폴리펩티드의 도메인, 예를 들어, RHIM 도메인, 사멸 도메인(DD), 사멸 이펙터 도메인(DED), 카스파제 동원 도메인(CARD), 대형 서브유닛/소형 서브유닛(L/S) 도메인, RIPK-유래 키나제 도메인, 또는 톨/인터류킨-1 수용체(TIR)-도메인이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 RIPK3 RHIM 도메인 및 카스파제 대형 서브유닛/소형 서브유닛(L/S) 도메인을 포함한다. 이 융합 단백질은 카스파제의 구성성 활성화를 구동하여, 표 3에 나타낸 바와 같이, 선택된 카스파제 L/S 도메인에 따라 상이한 유형의 세포 사멸을 야기할 것이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 TRIF TIR 도메인, TRIF RHIM 도메인 및 FADD 사멸 도메인(FADD-DD)을 포함한다. 이 융합 단백질은 아폽토시스를 차단하지만, 네크롭토시스를 유도할 것으로 예상된다.
[표 3]
카스파제 저해제
둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 또는 벡터(예를 들어, 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물은 표적 세포에서 카스파제 활성을 저해하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 세포에서 카스파제 활성을 저해하는 폴리뉴클레오티드는 표적 세포에 대하여 내인성인 하나 이상의 카스파제의 발현을 감소시킨다. 카스파제의 발현을 감소시키는 폴리뉴클레오티드는 안티센스 DNA 분자, 안티센스 RNA 분자, 이중 가닥 RNA, siRNA, 또는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR)―CRISPR 관련(Cas)(CRISPR-Cas) 시스템 가이드 RNA가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 표적 세포에서 카스파제 활성을 저해하는 폴리뉴클레오티드는 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 바이러스 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다. 예시적인 바이러스 단백질 카스파제 저해제는 하기 표 4에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 인간 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다. 일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9 및 카스파제 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 카스파제를 저해한다. 특정 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 카스파제 8을 저해한다. 특정 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 카스파제 10을 저해한다. 특정 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 카스파제 8 및 카스파제 10을 저해한다.
[표 4]
일부 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 Fas 관련 사멸 도메인 단백질(FADD) 우성 음성 돌연변이체(FADD-DN), 카스파제 8 활성화의 바이러스 저해제(vICA), 세포 FLICE(FADD-유사 IL-1β-전환 효소)-저해성 단백질(cFLIP), 카스파제 8 우성 음성 돌연변이체(Casp8-DN), 아폽토시스의 세포 저해제 단백질-1(cIAP1), 아폽토시스의 세포 저해제 단백질-2(cIAP2), 아폽토시스의 X-연관 저해제(XIAP), TGFβ-활성화된 키나제 1(Tak1), IκB 키나제(IKK), 및 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 FADD-DN이다. 사멸 유도 신호전달 복합체(Death Inducing Signaling Complex; DISC)는 FADD를 포함하는 어댑터 단백질 및 개시제 카스파제, 예컨대 카스파제 8을 동원한다. 문헌[Morgan et al., 2001, Cell Death & Differentiation volume 8, pages 696-705]을 참조한다. DISC에서의 카스파제 8의 응집은 카스파제 캐스케이드 및 아폽토시스의 활성화를 야기한다. FADD는 2개의 단백질 상호작용 도메인으로 이루어진다: 사멸 도메인 및 사멸 이펙터 도메인. FADD가 DISC의 필수 성분이기 때문에, 사멸 도메인을 함유하지만, 사멸 이펙터 도메인을 함유하지 않는 우성 음성 돌연변이체(FADD-DN)가 사멸 수용체-유도된 아폽토시스의 연구에서 광범위하게 사용되어 왔다. FADD-DN은 이것이 수용체에 결합하지만, 카스파제 8을 동원할 수 없기 때문에, 우성 음성 저해제로서 기능한다.
특정 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 vICA이다. vICA 단백질은 UL36 유전자에 의해 인코딩되는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 단백질이다. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Skaletskaya et al., PNAS July 3, 2001 98 (14) 7829-7834]을 참조한다. vICA 단백질은 카스파제-8의 프로-도메인으로의 결합 및 이의 활성화의 방지에 의해 Fas-매개된 아폽토시스를 저해한다. 일부 구현예에서, vICA 단백질은 SEQ ID NO: 32를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, vICA 단백질은 SEQ ID NO: 32에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 핵산 분자는 SEQ ID NO: 32를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 핵산 분자는 SEQ ID NO: 32에 대하여 적어도 85%, 87%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드는 cFLIP이다. cFLIP 단백질은 종양 괴사 인자-α(TNF-α), Fas-L 및 TNF-연관 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL)-유도된 아폽토시스를 억제하는 주요 항-아폽토시스 조절제 및 저항성 인자이다. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Safa, 2012, Exp Oncol Oct;34(3):176-84]을 참조한다. cFLIP 단백질은 인간 세포에서 긴(cFLIP(L)), 짧은(cFLIP(S)) 및 cFLIP(R) 스플라이스 변이체로서 발현된다. cFLIP 단백질은 리간드-의존적인 및 -독립적인 방식으로 FADD 및/또는 카스파제-8 또는 -10 및 TRAIL 수용체 5(DR5)에 결합하며, 아폽토시스 저해성 복합체(AIC)를 형성한다. 이 상호작용은 차례로, 사멸-유도 신호전달 복합체(DISC) 형성 및 카스파제 캐스케이드의 이후의 활성화를 방지한다. c-FLIP(L) 및 c-FLIP(S)는 다양한 신호전달 경로에서 다기능 역할을 갖는 것으로도 알려져 있다. 특정 구현예에서, cFLIP는 cFLIP(L)이다. 특정 구현예에서, cFLIP는 cFLIP(S)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 FADD-DN 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 vICA 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 cFLIP 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 FADD-DN 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
가스더민
가스더민은 막 투과화 및 파이롭토시스를 유발하는 포어-형성 이펙터 단백질의 과이다. 가스더민 단백질에는 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D 및 가스더민 E가 포함된다. 가스더민은 유연성 링커에 의해 연결된 세포독성 N-말단 도메인 및 C-말단 억제 도메인을 함유한다. 이들 2개의 도메인 사이의 단백질분해적 절단은 세포독성 도메인에 대한 분자내 저해를 제거하여, 이것이 세포막 내로 삽입되고, 큰 올리고머 포어를 형성하도록 하며, 이는 이온 항상성을 파괴하고, 세포 사멸을 유도한다. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Broz et al., 2020, Nature Reviews Immunology 20: 143-157]을 참조한다. 예를 들어, 가스더민 E(GSDME, DFNA5로도 알려져 있음)는 카스파제 3에 의해 절단됨으로써, GSDME-발현 세포에서 비염증성 아폽토시스를 파이롭토시스로 전환시킬 수 있다. 유사하게, 카스파제 1, 4 및 5는 가스더민 D를 절단하고, 이를 활성화시킨다.
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 또는 벡터(예를 들어, 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물은 가스더민 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)를 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가스더민의 기능성 단편은 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D 또는 가스더민 E의 N-말단 도메인이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 RIPK3 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 E 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 TRIF 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 E 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 D N-말단 도메인 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 E N-말단 도메인 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 MAVS 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 tBID 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이며, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나는 가스더민 E 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)이다.
면역 자극성 단백질
둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 또는 벡터(예를 들어, 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물은 면역 자극성 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 면역 자극성 단백질은 전환 성장 인자 베타(TGF-β)의 길항제, 콜로니-자극 인자, 사이토카인, 면역 체크포인트 조절제, flt3 리간드 또는 flt3의 항체 효능제이다.
콜로니-자극 인자는 과립구-대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF)일 수 있다. 일 구현예에서, GM-CSF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ICP34.5 유전자 좌 내로 삽입된다.
사이토카인은 인터류킨일 수 있다. 일 구현예에서, 인터류킨은 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-24, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 적합한 사이토카인에는 I형 인터페론, 인터페론 감마, III형 인터페론 및 TNFα가 포함된다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 저해성 면역 체크포인트 단백질의 길항제이다. 저해성 면역 체크포인트 단백질의 예에는 ADORA2A, B7-H3, B7-H4, IDO, KIR, VISTA, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, Tim3, BTLA 및 CTLA4가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 자극성 면역 체크포인트 단백질의 효능제이다. 자극성 면역 체크포인트 단백질의 예에는 CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, GITR, ICOS 및 4-1BB가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 자극성 면역 체크포인트 단백질의 효능제는 CD40 리간드(CD40L), ICOS 리간드, GITR 리간드, 4-1-BB 리간드, OX40 리간드 및 이의 임의의 것의 변형된 버전으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 자극성 면역 체크포인트 단백질의 효능제는 CD40, ICOS, GITR, 4-1-BB 및 0X40으로부터 선택되는 단백질의 항체 효능제이다.
자살 유전자
둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 또는 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물은 자살 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "자살 유전자"는 약물의 비독성 전구체를 세포독성 화합물로 전환시키는 단백질(예를 들어, 효소)을 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 자살 유전자는 FK506 결합 단백질(FKBP)-FAS, FKBP-카스파제-8, FKBP-카스파제-9, 시토신 데아미나제(CDase) 활성을 갖는 폴리펩티드, 티미딘 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제(UPRTase) 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, CDase 활성을 갖는 폴리펩티드는 FCY1, FCA1 또는 CodA이다.
일부 구현예에서, UPRTase 활성을 갖는 폴리펩티드는 FUR1 또는 이의 변이체, 예를 들어, FUR1Δ105이다. FUR1Δ105는 코딩 영역의 5' 영역에서 처음 105개 뉴클레오티드를 결여하는 FUR1 유전자이며, 이는 처음 35개 아미노산 잔기가 N-말단에서 결실된 UPRTase의 합성을 가능하게 한다. FUR1Δ105는 고유 단백질의 위치 36에서 메티오닌으로 시작한다.
자살 유전자는 융합 단백질, 예를 들어, CDase 및 UPRTase 활성을 갖는 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 codA::upp, FCY1::FUR1, FCYl::FUR1Δ105(FCU1) 및 FCU1-8 폴리펩티드로부터 선택된다.
2A 펩티드
둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 또는 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물은 2A 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 2A 펩티드는 단백질의 번역 동안 리보솜 스키핑을 유도하여, 동일한 mRNA 전사물에 의해 인코딩되는 2개의 단백질이 개별 단백질로서 발현될 수 있도록 한다. 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Liu et al., 2017, Scientific Reports. 7 (1): 2193]을 참조한다. 이들 펩티드는 코어 서열 모티프를 공유하며, 약 18 내지 22개 아미노산 잔기 길이이며, 매우 다양한 바이러스에서 관찰된다. 예시적인 2A 펩티드에는 T2A, P2A, E2A 및 F2A가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 2A 펩티드는 P2A 펩티드이다. 2A 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 2개의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 위치하여, 각각의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 개별적인 발현을 가능하게 할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 26의 T2A 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 27의 P2A 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 28의 E2A 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 29의 F2A 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 2A 펩티드는 N-말단에서 GSG 링커를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 TRIF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, RIPK3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 TRIF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 RIPK3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 위치한 2A 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다(예를 들어, TRIF-2A-RIPK3). 일부 구현예에서, 핵산 분자는 TRIF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, RIPK3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, vICA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, TRIF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 RIPK3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 위치한 2A 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 RIPK3을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 vICA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이의 2A 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다(예를 들어, TRIF-2A-RIPK3-2A-vICA). 특정 구현예에서, 2A 펩티드는 P2A이다.
IV. 표적 세포
본원에 기재된 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드의 조합은 다양한 상이한 표적 세포에서 발현되어, 표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시킬 수 있다. 표적 세포의 유형에는 암 세포, 면역 세포, 내피 세포 및 섬유모세포가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 기재된 임의의 암의 세포는 엔지니어링된 바이러스에 대한 표적 세포로서 적합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 전이성 암 세포이다.
일부 구현예에서, 표적 세포는 비만 세포, 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 대식구, 수지상 세포, 림프구(예를 들어, B-세포 및 T 세포) 및 본원에 기재된 임의의 다른 면역 세포로부터 선택되는 면역 세포이다.
일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어, 암 세포)에는 세포 턴오버 경로가 결핍된다. 예를 들어, 표적 세포는 세포 턴오버 경로에 기여하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 불활성화 돌연변이 또는 카피수 손실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포에는 면역-자극성 세포 턴오버 경로, 예를 들어, 네크롭토시스, 외인성 아폽토시스, 페롭토시스, 파이롭토시스 또는 이들의 조합이 결핍된다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3(RIPK1)을 인코딩하는 유전자, 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3(RIPK3)을 인코딩하는 유전자, Z-DNA-결합 단백질 1(ZBP1)을 인코딩하는 유전자, 혼합된 계통 키나제 도메인 유사 슈도키나제(MLKL)를 인코딩하는 유전자, 가스더민(예를 들어, 가스더민 D 및/또는 가스더민 E)을 인코딩하는 유전자, 및 톨/인터류킨-1 수용체(TIR)-도메인-함유 어댑터-유도 인터페론-β(TRIF)를 인코딩하는 유전자 중 하나 이상의 불활성화 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 RIPK1, RIPK3, ZBP1, TRIF, 가스더민(예를 들어, 가스더민 D, 가스더민 E) 및 MLKL 중 하나 이상의 발현 또는 활성의 감소를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 RIPK1을 인코딩하는 유전자, RIPK3을 인코딩하는 유전자, ZBP1을 인코딩하는 유전자, TRIF를 인코딩하는 유전자, 가스더민(예를 들어, 가스더민 D, 가스더민 E)을 인코딩하는 유전자 및 MLKL을 인코딩하는 유전자 중 하나 이상의 카피수 손실을 갖는다.
둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드는 표적 세포에서 세포 턴오버 경로를 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드는 표적 세포의 정상적인 세포 턴오버 경로를 타노트랜스미션, 예컨대, 예를 들어, 네크롭토시스, 외인성 아폽토시스, 페롭토시스 또는 파이롭토시스를 촉진시키는 세포 턴오버 경로로 변경시킬 수 있다.
V. 핵산 분자의 투여 방식
특정 양태에서, 본 개시내용은 대상체로의 하나 이상의 핵산 분자의 전달 방법에 관한 것이며, 방법은 a) 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 및 b) 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, DNA 분자 또는 RNA 분자는 바이러스 내에 포함된다. 일부 구현예에서, DNA 분자는 플라스미드 또는 트랜스포존 내에 포함된다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하도록 엔지니어링된 DNA 분자로서, RNA 분자로서 또는 바이러스(예를 들어, DNA 바이러스 또는 레트로바이러스)로서의 투여 방식을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 투여 방식에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산 분자는 리포펙션을 통해 대상체에게 전달된다. "지질 트랜스펙션" 또는 "리포좀-기반의 트랜스펙션"으로도 알려져 있는 리포펙션은 지질 복합체(예를 들어, 리포좀)를 이용하여, 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA)를 세포에 전달한다. 일부 구현예에서, 리포펙션은 RNA 리포펙션이다. 일부 구현예에서, 리포펙션은 DNA 리포펙션이다.
A. DNA 전달 방법
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자는 DNA로서 대상체에게 전달된다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자는 바이러스, 박테리아 또는 기타 유기체 내에 포함되지 않는다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 분자는 DNA 플라스미드 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 분자는 트랜스포존 내에 포함된다.
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 분자는 각각 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 중합효소 II(Pol II) 프로모터이다. 적합한 Pol II 프로모터에는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 또는 SV40 프로모터(예를 들어, pcDNA3.1, pVAX1, pVIVO2, pCI, pCMV 및 pSV2)가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, EF1a 프로모터 또는 UBC1 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 조직-특이적인 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 합성 프로모터이다. DNA 전달에 적합한 프로모터는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Li, L, et al., 2016, Expert Rev Vaccines 15:313-29]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CMV 프로모터(예를 들어, 미니-CMV 프로모터), EF1α 프로모터(예를 들어, 미니-EF1α 프로모터), SV40 프로모터, PGK1 프로모터, 폴리유비퀴틴 C(UBC) 유전자 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터 및 CMV 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 베타-글로빈(CAG) 하이브리드 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 암-특이적인 프로모터, 예를 들어, 종양-특이적인 프로모터이다. 적합한 종양-특이적인 프로모터에는 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT) 프로모터 및 E2F 프로모터가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. hTERT 프로모터는 텔로머라제의 발현이 증가된 세포(예컨대, 암 세포)에서 유전자 발현을 구동한다. E2F 프로모터는 Rb 경로가 변경된 세포에 특이적인 유전자 발현을 구동한다.
둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 분자는 각각 3' 폴리아데닐화(폴리 A) 신호에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리 A 신호는 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호 또는 소 성장 호르몬 폴리 A 신호이다. 폴리 A 신호는 전사물 mRNA의 핵 유출, 번역 및 안정성에 관여한다. 문헌[Williams, JA, et al.. 2013, Vaccines 1:225-49]을 참조한다.
대상체로의 전달을 위한 DNA의 제형화 방법에는 양이온성 지질 및 콜레스테롤을 함유하는 지질 나노입자 내의 캡슐화, 폴리머, 예컨대 폴리에틸렌이민으로의 흡착 및 생분해성 나노입자, 예컨대 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 또는 키토산 내의 흡착 또는 캡슐화가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 문헌[Donnelly JJ, et al., 2005, J Immunol. 175:633-9]을 참조한다.
둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자의 서열은 예를 들어, GC 함유물의 농축의 사용에 의해(문헌[Thess A, et al., 2015, Mol Ther. 23:1456-64]; 문헌[Petsch B et al., 2012, Nat Biotechnol. 30:1210-6]; 및 문헌[Kudla G et al., 2006, PLoS Biol. 4:e180. doi: 10.1371/journal.pbio.0040180] 참조) 및/또는 희귀 코돈의 대체에 의해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는, 일부 구현예에서, 적절한 폴딩을 보장하기 위해 표적 및 숙주 유기체에서 코돈 빈도를 일치시키거나; mRNA 안정성을 증가시키거나 2차 구조를 감소시키기 위해 GC 함량을 편향시키거나; 유전자 구축 또는 발현을 손상시킬 수 있는 탠덤 반복 코돈 또는 염기 실행을 최소화하거나; 전사 및 번역 제어 영역을 맞춤화시키거나; 단백질 트래픽킹 서열을 삽입하거나 제거하거나; 인코딩된 단백질에서 번역 후 변형 부위(예를 들어, 글리코실화 부위)를 제거/부가하거나; 단백질 도메인을 부가하거나, 제거하거나 또는 셔플링하거나; 제한 부위를 삽입하거나 결실시키거나; 리보솜 결합 부위 및 mRNA 분해 부위를 변경시키거나; 단백질의 다양한 도메인이 적절하게 폴딩되도록 번역 속도를 조정하거나; 폴리뉴클레오티드 내의 문제를 일으키는 2차 구조를 감소시키거나 제거하기 위해 사용될 수 있다. 코돈 최적화 도구, 알고리즘 및 서비스는 당업계에 공지되어 있으며 - 비제한적 예에는 GeneArt(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)), DNA2.0(캘리포니아주 멘로 파크) 및/또는 독점 방법의 서비스가 포함된다. 일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열을 최적화 알고리즘을 사용하여 최적화한다.
일부 구현예에서, 코돈 최적화된 DNA는 예를 들어, G/C의 수준이 향상된 것일 수 있다. 핵산 분자의 G/C-함량은 상응하는 RNA의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 증가된 양의 구아닌(G) 및/또는 시토신(C) 잔기를 갖는 RNA는 다량의 아데닌(A) 및 티민(T) 또는 우라실(U) 뉴클레오티드를 함유하는 핵산보다 기능적으로 더 안정할 수 있다. 제WO02/098443호에는 번역된 영역에서 서열 변형에 의해 안정화된 mRNA를 함유하는 약제학적 조성물이 개시된다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 변형은 생성된 아미노산을 변경하지 않고 기존 코돈을 더 큰 RNA 안정성을 촉진하는 코돈으로 치환함으로써 이루어진다. 접근법은 DNA/RNA의 코딩 영역에 제한된다.
둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 분자는 합성 전달 비히클, 예컨대 지질 나노입자를 사용하여 대상체에게 전달될 수 있다. DNA 분자 전달에 적합한 지질 나노입자는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Reichmuth AM, et al., 2016, Ther Deliv. 7(5):319-334]; 문헌[Geall AJ, et al., 2012, Proc Natl Acad Sci USA. 109:14604-9]; 및 미국 특허 제10,702,600호에 기재되어 있으며, 이의 각각은 전체가 본원에 참조로 포함된다. 지질 나노입자에 사용하기에 적합한 지질 및 지질 복합체에는 DLinDMA: 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판; DOPE: 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민; DOTAP: 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판 클로라이드 염; DSPC: 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린; 히스티딜화된 리포플렉스(Histidylated lipoplex): 히스티딜화된 폴리리신 및 L-히스티딘-(N,N-디-n-헥사데실아민)에틸아미드 리포좀의 PEG화된 유도체; HVJ-리포좀: 일본의 적혈구응집 바이러스(HVJ)로부터 유래된 융합 단백질을 갖는 리포좀; Man11-LPR100: 만노실화된 및 히스티딜화된 리포좀을 mRNA-PEG화된 히스티딜화된 폴리리신 폴리플렉스(polyplex)에 첨가함으로써 수득되는 만노실화된 및 히스티딜화된 리포폴리플렉스(Man11-LPR100); PC: 디팔미토일포스파티딜콜린; 콜레스테롤, PEG DMG 2000: 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]; PS: 포스파티딜세린; Span 85: 소르비탄 트리올레에이트; 유니펙틴(unifectin); 및 스쿠알렌이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 문헌[Martinon F, et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23(7), 1719-1722]; 문헌[Hess PR, et al., 2005, Cancer Immunol. Immunother. 55(6), 672-683], 문헌[Zhou W-Z, et al., 1999. Hum. Gene Ther. 10(16), 2719-2724]; 문헌[Pollard C, et al., 2013, Mol. Ther. 21(1), 251-259]; 문헌[Hoerr I, et al., 2000, Eur. J. Immunol. 30(1), 1-7]; 문헌[Mockey M, et al., 2007, Cancer Gene Ther. 14(9), 802-814]; 문헌[Perche F, et al., 2011, RNA. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 7(4), 445-453]; 문헌[Phua KKL, et al., 2014, Sci. Rep. 4, 5128]; 문헌[Geall AJ, et al., 2012, Proc. Natl Acad. Sci. USA 109(36), 14604-14609]; 및 문헌[Brito LA, et al., 2014, Mol. Ther. 22(12), 2118-2129]을 참조한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, PEG-변형된 지질, 스테롤 및 비-양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 이온화 가능한 양이온성 지질이며, 비-양이온성 지질은 중성 지질이며, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA), 디리놀레일-메틸-4-디메틸아미노부티레이트(DLin-MC3-DMA), 디((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L319), (12Z,15Z)--N,N-디메틸-2-노닐헤니코사-12,15-디엔-1-아민(L608) 및 N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]헵타데칸-8-아민(L530)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 지질은 (L608)이다.
DNA 분자는 또한, 리포좀을 사용하여 제형화될 수 있다. 리포좀은 주로 지질 이중층으로 구성될 수 있는 인공적으로 제조된 소낭이며, 영양소 및 약제학적 제형의 투여를 위한 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 리포좀은 상이한 크기의 것일 수 있으며, 예컨대 비제한적으로, 수백 나노미터의 직경일 수 있고 좁은 수성 구획에 의해 분리된 일련의 동심 이중층을 함유할 수 있는 다층 소낭(MLV), 50 nm 미만의 직경일 수 있는 소형 단층 소낭(SUV) 및 50 내지 500 nm 직경일 수 있는 대형 단층 소낭(LUV)일 수 있다. 리포좀 설계는 건강하지 않은 조직에 대한 리포좀의 부착을 개선시키기 위해 또는 비제한적으로 세포내이입과 같은 사건을 활성화시키기 위해 옵소닌 또는 리간드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 리포좀은 약제학적 제형의 전달을 개선시키기 위해 낮은 또는 높은 pH를 함유할 수 있다.
리포좀의 형성은 물리화학적 특징, 예컨대 비제한적으로, 포획된 약제학적 제형 및 리포좀 성분, 지질 소낭이 분산되어 있는 매질의 성질, 포획된 물질의 유효 농도 및 이의 잠재적인 독성, 소낭의 적용 및/또는 전달 동안 수반되는 임의의 추가의 과정, 의도된 응용을 위한 소낭의 최적화 크기, 다분산도 및 보관-수명, 및 안전하고 효율적인 리포좀 산물의 뱃치(batch)-대-뱃치 재현성 및 대규모 생산 가능성에 좌우될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 제한 없이, 리포좀, 예컨대 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DODMA) 리포좀으로부터 형성된 것들, 마리나 바이오테크(Marina Biotech)(워싱턴주 보셀)로부터의 DiLa2 리포좀, 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA) 및 MC3(제US20100324120호; 전체가 본원에 참조로 포함됨) 및 소분자 약물을 전달할 수 있는 리포좀, 예컨대, 비제한적으로, 얀센 바이오테크, 인코포레이티드(Janssen Biotech, Inc.)(펜실베이니아주 호샴)로부터의 DOXIL®을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 제한 없이, 이전에 설명되고, 시험관내 및 생체내에서 올리고뉴클레오티드 전달에 적합한 것으로 밝혀진 안정화된 플라스미드-지질 입자(SPLP) 또는 안정화된 핵산 지질 입자(SNALP)의 합성으로부터 형성된 것들과 같은 리포좀을 포함할 수 있다(문헌[Wheeler et al. Gene Therapy. 1999 6:271-281]; 문헌[Zhang et al. Gene Therapy. 1999 6:1438-1447]; 문헌[Jeffs et al. Pharm Res. 2005 22:362-372]; 문헌[Morrissey et al., Nat Biotechnol. 2005 2:1002-1007]; 문헌[Zimmermann et al., Nature. 2006 441:111-114]; 문헌[Heyes et al. J Contr Rel. 2005 107:276-287]; 문헌[Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176]; 문헌[Judge et al. J Clin Invest. 2009 119:661-673]; 문헌[deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132]; 미국 특허 공개 제US20130122104호 참조; 이의 전부는 전체가 본원에 포함됨).
일부 구현예에서, DNA 분자는 작용화된 지질 이중층 사이에 가교를 가질 수 있는 지질 소낭에서 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 분자는 지질-다가양이온 복합체에서 제형화될 수 있다. 지질-다가양이온 복합체의 형성은 당업계에 공지된 방법에 의해 및/또는 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 공개 제20120178702호에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 다가양이온은 양이온성 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대, 비제한적으로 폴리리신, 폴리오르니틴 및/또는 폴리아르기닌을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 분자는 비-양이온성 지질, 예컨대, 비제한적으로, 콜레스테롤 또는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)을 추가로 포함할 수 있는 지질-다가양이온 복합체에서 제형화될 수 있다.
다른 구현예에서, 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 분자는 캡시드 및 당단백질 유전자를 트랜스로 제공하는 헬퍼 세포주에 의해 생성되는 바이러스-유사 레플리콘 입자(VRP)에 패키징되고 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 분자는 유리 DNA로서 대상체에게 전달되며, 즉, 이들은 또 다른 분자에 복합체화되지 않는다. 일부 구현예에서, DNA 분자는 프로타민-복합체화된 DNA로서 대상체에게 전달된다. 프로타민은 정소에서 발현되는 천연 양이온성 핵 단백질이다. 이는 정자에서 DNA가 최종 응축되는 동안 히스톤을 대체하는 고도로 특화된 분자이며 핵산을 안정화시키는 것으로 알려져 있다. 이는 아르기닌-풍부 서열을 가지며, 시험관내에서 핵산과 자발적으로 회합한다. 프로타민-복합체화된 DNA는 강력한 유전자 발현 및 면역자극 둘 모두를 제공한다. 문헌[Scheel B et al., 2005, Eur J Immunol. 35:1557-66]; 문헌[Fotin-Mleczek M, 2011, J Immunother. 34:1-15]; 문헌[Fotin-Mleczek M, et al., 2012, J Gene Med. 14:428-39]; 및 문헌[Kowalczyk A, et al., 2016, Vaccine 34:3882-93]을 참조한다.
B. RNA 전달 방법
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자는 RNA로서 대상체에게 전달된다. 일부 구현예에서, RNA는 바이러스, 박테리아 또는 기타 유기체 내에 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, RNA는 정제되며, 예를 들어, HPLC-정제된다. 일부 구현예에서, RNA는 원형 RNA이다.
일부 구현예에서, RNA는 mRNA이다. 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA는 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 진핵 또는 바이러스 기원일 수 있는 UTR은 mRNA의 반감기 및 안정성을 증가시켜, 인코딩된 타노트랜스미션 폴리펩티드의 더 많은 발현을 초래한다(문헌[Ross J, et al., 1985, Blood 66:1149-54]; 문헌[Gallie DR, et al., 1995, Gene 165:233-8]; 문헌[Kariko K, et al., 2012 Mol Ther. 20: 948-53]; 및 문헌[Vivinus S, et al. 2001, Eur J Biochem. 268:1908-17] 참조).
캡 구조는 mRNA의 5' 말단에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 캡 구조는 역의 5'에서 5'의 트리포스페이트 연결기를 통해 mRNA의 제1 뉴클레오티드에 연결된 N7-메틸화된 구아노신이다. 단백질 합성의 캡-의존적 개시에서의 이의 역할에 더하여, mRNA 캡은 또한, 5'에서 3'으로의 엑소뉴클레아제 절단으로부터의 보호기, 및 프레-mRNA 스플라이싱, 폴리아데닐화 및 핵 유출을 위한 단백질 인자를 동원하기 위한 특유한 식별자로서 작용할 수 있다. 문헌[Ramanathan A, et al., 2016, Nucleic Acids Res. 44(16): 7511-7526]을 참조한다. 5' 캡 구조는 안정한 성숙 mRNA의 생성에 중요하며, 진핵 번역 개시 인자 4E로의 결합을 통해 단백질 번역을 증가시킨다. 문헌[Gallie, DR., 1991, Genes Dev. 5:2108-16]을 참조한다. 반응에서의 캡 유사체 또는 항역전 캡(ARCA)의 포함에 의해(문헌[Stepinski J, et al., 2001, RNA 7:1486-95] 참조) 또는 이후에, 백시니아 바이러스 캡핑 복합체를 사용하여(문헌[Venkatesan S, et al. 1980, J Biol Chem. 255, 903-908] 참조), 5' 캡을 전사 동안 부가할 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 말단 캡은 7mG(5')ppp(5')NlmpNp이다.
폴리(A) 테일은 mRNA의 3' 말단에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 폴리 A 테일은 번역을 향상시키는 중요한 조절 요소이며, DNA 주형에 의해 인코딩되거나, 대안적으로, 전사 후에 효소적으로 부가될 수 있다(문헌[Gallie, DR., 1991, Genes Dev. 5:2108-16]).
타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA의 서열은 예를 들어, GC 함유물의 농축의 사용에 의해(문헌[Thess A, et al., 2015, Mol Ther. 23:1456-64]; 문헌[Petsch B et al., 2012, Nat Biotechnol. 30:1210-6]; 및 문헌[Kudla G et al., 2006, PLoS Biol. 4:e180. doi: 10.1371/journal.pbio.0040180] 참조) 또는 희귀 코돈의 대체에 의해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는, 일부 구현예에서, 적절한 폴딩을 보장하기 위해 표적 및 숙주 유기체에서 코돈 빈도를 일치시키거나; mRNA 안정성을 증가시키거나 2차 구조를 감소시키기 위해 GC 함량을 편향시키거나; 유전자 구축 또는 발현을 손상시킬 수 있는 탠덤 반복 코돈 또는 염기 실행을 최소화하거나; 전사 및 번역 제어 영역을 맞춤화시키거나; 단백질 트래픽킹 서열을 삽입하거나 제거하거나; 인코딩된 단백질에서 번역 후 변형 부위(예를 들어, 글리코실화 부위)를 제거/부가하거나; 단백질 도메인을 부가하거나, 제거하거나 또는 셔플링하거나; 제한 부위를 삽입하거나 결실시키거나; 리보솜 결합 부위 및 mRNA 분해 부위를 변경시키거나; 단백질의 다양한 도메인이 적절하게 폴딩되도록 번역 속도를 조정하거나; 폴리뉴클레오티드 내의 문제를 일으키는 2차 구조를 감소시키거나 제거하기 위해 사용될 수 있다. 코돈 최적화 도구, 알고리즘 및 서비스는 당업계에 공지되어 있으며 - 비제한적 예에는 GeneArt(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)), DNA2.0(캘리포니아주 멘로 파크) 및/또는 독점 방법의 서비스가 포함된다. 일부 구현예에서, 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열을 최적화 알고리즘을 사용하여 최적화한다.
일부 구현예에서, 코돈 최적화된 RNA(예를 들어, mRNA)는 예를 들어, G/C의 수준이 향상된 것일 수 있다. 핵산 분자의 G/C-함량은 RNA의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 증가된 양의 구아닌(G) 및/또는 시토신(C) 잔기를 갖는 RNA는 다량의 아데닌(A) 및 티민(T) 또는 우라실(U) 뉴클레오티드를 함유하는 핵산보다 기능적으로 더 안정할 수 있다. 제WO02/098443호에는 번역된 영역에서 서열 변형에 의해 안정화된 mRNA를 함유하는 약제학적 조성물이 개시된다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 변형은 생성된 아미노산을 변경하지 않고 기존 코돈을 더 큰 RNA 안정성을 촉진하는 코돈으로 치환함으로써 이루어진다. 접근법은 RNA의 코딩 영역으로 제한된다.
화학적으로 변형된 뉴클레오시드를 RNA(예를 들어, mRNA)에 부가하여, 예를 들어, 선천 면역 활성화를 감소시키고/시키거나 RNA(예를 들어, mRNA)의 번역을 증가시킬 수 있다. 문헌[Kariko K, et al., 2008, Mol Ther. 16:1833-40]; 및 미국 특허 제10,702,600호를 참조한다. 일부 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA)는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 갖는다.
용어 "화학적 변형" 및 "화학적으로 변형된"은 아데노신(A), 구아노신(G), 우리딘(U), 티미딘(T) 또는 시티딘(C) 리보뉴클레오시드 또는 데옥시리보뉴클레오시드의 위치, 패턴, 백분율 또는 집단 중 적어도 하나에서의 이에 관한 변형을 지칭한다. 일반적으로, 이들 용어는 자연 발생 5'-말단 mRNA 캡 모이어티 내의 리보뉴클레오티드 변형을 지칭하지 않는다. 폴리펩티드에 관하여, 용어 "변형"은 20개 아미노산의 정규 세트에 비한 변형을 지칭한다. 본원에 제공되는 바와 같은 폴리펩티드는 또한 이들이 아미노산 치환, 삽입 또는 삽입 및 치환의 조합을 함유한다면, "변형된" 것으로 간주된다.
폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA 폴리뉴클레오티드, 예컨대 mRNA 폴리뉴클레오티드)는, 일부 구현예에서, 다양한(1가지 초과의) 상이한 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 특정 영역은 1, 2개 이상의(선택적으로 상이한) 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 변형을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 유기체로 도입된, 변형된 RNA 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 변형된 mRNA 폴리뉴클레오티드)는 비변형 폴리뉴클레오티드에 비하여 각각 세포 또는 유기체에서 감소된 분해를 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 또는 유기체 내로 도입된, 변형된 RNA 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 변형된 mRNA 폴리뉴클레오티드)는 각각 세포 또는 유기체에서 감소된 면역원성(예를 들어, 감소된 선천 반응)을 나타낼 수 있다.
폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA 폴리뉴클레오티드, 예컨대 mRNA 폴리뉴클레오티드)는 자연-발생, 비-자연-발생인 변형을 포함할 수 있거나, 폴리뉴클레오티드는 자연-발생 및 비-자연-발생 변형의 조합을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 당, 핵염기 또는 (예를 들어, 연결 포스페이트로의, 포스포디에스테르 연결기로의 또는 포스포디에스테르 백본으로의) 뉴클레오시드간 연결기의 임의의 유용한 변형을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA 폴리뉴클레오티드, 예컨대 mRNA 폴리뉴클레오티드)는, 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 합성 동안 또는 합성 후에 도입되어, 원하는 기능 또는 특성을 달성하기 위한 비-천연 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 변형은 뉴클레오티드간 연결기, 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 당에 존재할 수 있다. 변형은 화학적 합성을 사용하여 또는 중합 효소를 사용하여 쇄의 말단에 또는 쇄 내의 그 밖의 임의의 곳에 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 임의의 영역은 화학적으로 변형될 수 있다.
본 개시내용은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA 폴리뉴클레오티드, 예컨대 mRNA 폴리뉴클레오티드)의 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 제공한다. "뉴클레오시드"는 유기 염기(예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘) 또는 이의 유도체(본원에서 "핵염기"로도 지칭됨)와 조합된 당 분자(예를 들어, 펜토스 또는 리보스) 또는 이의 유도체를 함유하는 화합물을 지칭한다. "뉴클레오티드"는 포스페이트 기를 포함하는 뉴클레오시드를 지칭한다. 변형된 뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 또는 비-천연 뉴클레오시드를 포함하도록 임의의 유용한 방법에 의해, 예컨대 예를 들어 화학적으로, 효소적으로, 또는 재조합적으로 합성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 연결된 뉴클레오시드의 영역 또는 영역들을 포함할 수 있다. 이러한 영역은 다양한 백본 연결기를 가질 수 있다. 연결기는 표준 포스포디에스테르 연결기일 수 있고, 이 경우에 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 영역을 포함할 것이다.
변형된 뉴클레오티드 염기 쌍형성은 표준 아데노신-티민, 아데노신-우라실 또는 구아노신-시토신 염기쌍뿐만 아니라, 뉴클레오티드 및/또는 비-표준 또는 변형된 염기를 포함하는 변형된 뉴클레오티드 간에 형성된 염기쌍도 또한 포함하며, 수소 결합 공여자 및 수소 결합 수여자의 배치는 비-표준 염기와 표준 염기 간의 또는 2개의 상보적인 비-표준 염기 구조 간의 수소 결합을 가능하게 한다. 이러한 비-표준 염기 쌍형성의 일 예는 변형된 뉴클레오티드 이노신과 아데닌, 시토신 또는 우라실 간의 염기 쌍형성이다. 염기/당 또는 링커의 임의의 조합은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있다.
본 개시내용의 RNA 분자에서 유용한 폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA 폴리뉴클레오티드, 예컨대 mRNA 폴리뉴클레오티드)의 변형에는 하기의 것이 포함되지만 이에 한정되지 않는다: 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신; 2-메틸티오-N6-메틸아데노신; 2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신; N6-글리시닐카바모일아데노신; N6-이소펜테닐아데노신; N6-메틸아데노신; N6-트레오닐카바모일아데노신; 1,2'-O-디메틸아데노신; 1-메틸아데노신; 2'-O-메틸아데노신; 2'-O-리보실아데노신 (포스페이트); 2-메틸아데노신; 2-메틸티오-N6 이소펜테닐아데노신; 2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴 카바모일아데노신; 2'-O-메틸아데노신; 2'-O-리보실아데노신 (포스페이트); 이소펜테닐아데노신; N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신; N6,2'-O-디메틸아데노신; N6,2'-O-디메틸아데노신; N6,N6,2'-O-트리메틸아데노신; N6,N6-디메틸아데노신; N6-아세틸아데노신; N6-하이드록시노르발릴카바모일아데노신; N6-메틸-N6-트레오닐카바모일아데노신; 2-메틸아데노신; 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신; 7-데아자-아데노신; N1-메틸-아데노신; N6, N6 (디메틸)아데닌; N6-시스-하이드록시-이소펜테닐-아데노신; α-티오-아데노신; 2 (아미노)아데닌; 2 (아미노프로필)아데닌; 2 (메틸티오) N6 (이소펜테닐)아데닌; 2-(알킬)아데닌; 2-(아미노알킬)아데닌; 2-(아미노프로필)아데닌; 2-(할로)아데닌; 2-(할로)아데닌; 2-(프로필)아데닌; 2'-아미노-2'-데옥시-ATP; 2'-아지도-2'-데옥시-ATP; 2'-데옥시-2'-a-아미노아데노신 TP; 2'-데옥시-2'-a-아지도아데노신 TP; 6 (알킬)아데닌; 6 (메틸)아데닌; 6-(알킬)아데닌; 6-(메틸)아데닌; 7 (데아자)아데닌; 8 (알케닐)아데닌; 8 (알키닐)아데닌; 8 (아미노)아데닌; 8 (티오알킬)아데닌; 8-(알케닐)아데닌; 8-(알킬)아데닌; 8-(알키닐)아데닌; 8-(아미노)아데닌; 8-(할로)아데닌; 8-(하이드록실)아데닌; 8-(티오알킬)아데닌; 8-(티올)아데닌; 8-아지도-아데노신; 아자 아데닌; 데아자 아데닌; N6 (메틸)아데닌; N6-(이소펜틸)아데닌; 7-데아자-8-아자-아데노신; 7-메틸아데닌; 1-데아자아데노신 TP; 2'플루오로-N6-Bz-데옥시아데노신 TP; 2'-OMe-2-아미노-ATP; 2'O-메틸-N6-Bz-데옥시아데노신 TP; 2'-a-에티닐아데노신 TP; 2-아미노아데닌; 2-아미노아데노신 TP; 2-아미노-ATP; 2'-a-트리플루오로메틸아데노신 TP; 2-아지도아데노신 TP; 2'-b-에티닐아데노신 TP; 2-브로모아데노신 TP; 2'-b-트리플루오로메틸아데노신 TP; 2-클로로아데노신 TP; 2'-데옥시-2', 2'-디플루오로아데노신 TP; 2'-데옥시-2'-a-머캅토아데노신 TP; 2'-데옥시-2'-a-티오메톡시아데노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-아미노아데노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-아지도아데노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-브로모아데노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-클로로아데노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-플루오로아데노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-아이오도아데노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-머캅토아데노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-티오메톡시아데노신 TP; 2-플루오로아데노신 TP; 2-아이오도아데노신 TP; 2-머캅토아데노신 TP; 2-메톡시-아데닌; 2-메틸티오-아데닌; 2-트리플루오로메틸아데노신 TP; 3-데아자-3-브로모아데노신 TP; 3-데아자-3-클로로아데노신 TP; 3-데아자-3-플루오로아데노신 TP; 3-데아자-3-아이오도아데노신 TP; 3-데아자아데노신 TP; 4'-아지도아데노신 TP; 4'-카보사이클릭 아데노신 TP; 4'-에티닐아데노신 TP; 5'-호모-아데노신 TP; 8-아자-ATP; 8-브로모-아데노신 TP; 8-트리플루오로메틸아데노신 TP; 9-데아자아데노신 TP; 2-아미노퓨린; 7-데아자-2,6-디아미노퓨린; 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린; 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린; 2,6-디아미노퓨린; 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린; 2-티오시티딘; 3-메틸시티딘; 5-포르밀시티딘; 5-하이드록시메틸시티딘; 5-메틸시티딘; N4-아세틸시티딘; 2'-O-메틸시티딘; 2'-O-메틸시티딘; 5,2'-O-디메틸시티딘; 5-포르밀-2'-O-메틸시티딘; 라이시딘; N4,2'-O-디메틸시티딘; N4-아세틸-2'-O-메틸시티딘; N4-메틸시티딘; N4,N4-디메틸-2'-OMe-시티딘 TP; 4-메틸시티딘; 5-아자-시티딘; 슈도-이소-시티딘; 피롤로-시티딘; α-티오-시티딘; 2-(티오)시토신; 2'-아미노-2'-데옥시-CTP; 2'-아지도-2'-데옥시-CTP; 2'-데옥시-2'-a-아미노시티딘 TP; 2'-데옥시-2'-a-아지도시티딘 TP; 3 (데아자) 5 (아자)시토신; 3 (메틸)시토신; 3-(알킬)시토신; 3-(데아자) 5 (아자)시토신; 3-(메틸)시티딘; 4,2'-O-디메틸시티딘; 5 (할로)시토신; 5 (메틸)시토신; 5 (프로피닐)시토신; 5 (트리플루오로메틸)시토신; 5-(알킬)시토신; 5-(알키닐)시토신; 5-(할로)시토신; 5-(프로피닐)시토신; 5-(트리플루오로메틸)시토신; 5-브로모-시티딘; 5-아이오도-시티딘; 5-프로피닐 시토신; 6-(아조)시토신; 6-아자-시티딘; 아자 시토신; 데아자 시토신; N4 (아세틸)시토신; 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘; 1-메틸-슈도이소시티딘; 2-메톡시-5-메틸-시티딘; 2-메톡시-시티딘; 2-티오-5-메틸-시티딘; 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘; 4-메톡시-슈도이소시티딘; 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘; 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘; 4-티오-슈도이소시티딘; 5-아자-제부라린; 5-메틸-제부라린; 피롤로-슈도이소시티딘; 제부라린; (E)-5-(2-브로모-비닐)시티딘 TP; 2,2'-언하이드로-시티딘 TP 하이드로클로라이드; 2'플루오르-N4-Bz-시티딘 TP; 2'플루오로-N4-아세틸-시티딘 TP; 2'-O-메틸-N4-아세틸-시티딘 TP; 2'O-메틸-N4-Bz-시티딘 TP; 2'-a-에티닐시티딘 TP; 2'-a-트리플루오로메틸시티딘 TP; 2'-b-에티닐시티딘 TP; 2'-b-트리플루오로메틸시티딘 TP; 2'-데옥시-2', 2'-디플루오로시티딘 TP; 2'-데옥시-2'-a-머캅토시티딘 TP; 2'-데옥시-2'-a-티오메톡시시티딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-아미노시티딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-아지도시티딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-브로모시티딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-클로로시티딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-플루오로시티딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-아이오도시티딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-머캅토시티딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-티오메톡시시티딘 TP; 2'-O-메틸-5-(1-프로피닐)시티딘 TP; 3'-에티닐시티딘 TP; 4'-아지도시티딘 TP; 4'-카보사이클릭 시티딘 TP; 4'-에티닐시티딘 TP; 5-(1-프로피닐)아라-시티딘 TP; 5-(2-클로로-페닐)-2-티오시티딘 TP; 5-(4-아미노-페닐)-2-티오시티딘 TP; 5-아미노알릴-CTP; 5-시아노시티딘 TP; 5-에티닐아라-시티딘 TP; 5-에티닐시티딘 TP; 5'-호모-시티딘 TP; 5-메톡시시티딘 TP; 5-트리플루오로메틸-시티딘 TP; N4-아미노-시티딘 TP; N4-벤조일-시티딘 TP; 슈도이소시티딘; 7-메틸구아노신; N2,2'-O-디메틸구아노신; N2-메틸구아노신; 위오신; 1,2'-O-디메틸구아노신; 1-메틸구아노신; 2'-O-메틸구아노신; 2'-O-리보실구아노신 (포스페이트); 2'-O-메틸구아노신; 2'-O-리보실구아노신 (포스페이트); 7-아미노메틸-7-데아자구아노신; 7-시아노-7-데아자구아노신; 아케오신; 메틸위오신; N2,7-디메틸구아노신; N2,N2,2'-O-트리메틸구아노신; N2,N2,7-트리메틸구아노신; N2,N2-디메틸구아노신; N2,7,2'-O-트리메틸구아노신; 6-티오-구아노신; 7-데아자-구아노신; 8-옥소-구아노신; N1-메틸-구아노신; α-티오-구아노신; 2 (프로필)구아닌; 2-(알킬)구아닌; 2'-아미노-2'-데옥시-GTP; 2'-아지도-2'-데옥시-GTP; 2'-데옥시-2'-a-아미노구아노신 TP; 2'-데옥시-2'-a-아지도구아노신 TP; 6 (메틸)구아닌; 6-(알킬)구아닌; 6-(메틸)구아닌; 6-메틸-구아노신; 7 (알킬)구아닌; 7 (데아자)구아닌; 7 (메틸)구아닌; 7-(알킬)구아닌; 7-(데아자)구아닌; 7-(메틸)구아닌; 8 (알킬)구아닌; 8 (알키닐)구아닌; 8 (할로)구아닌; 8 (티오알킬)구아닌; 8-(알케닐)구아닌; 8-(알킬)구아닌; 8-(알키닐)구아닌; 8-(아미노)구아닌; 8-(할로)구아닌; 8-(하이드록실)구아닌; 8-(티오알킬)구아닌; 8-(티올)구아닌; 아자 구아닌; 데아자 구아닌; N (메틸)구아닌; N-(메틸)구아닌; 1-메틸-6-티오-구아노신; 6-메톡시-구아노신; 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신; 6-티오-7-데아자-구아노신; 6-티오-7-메틸-구아노신; 7-데아자-8-아자-구아노신; 7-메틸-8-옥소-구아노신; N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신; N2-메틸-6-티오-구아노신; 1-Me-GTP; 2'플루오로-N2-이소부틸-구아노신 TP; 2'O-메틸-N2-이소부틸-구아노신 TP; 2'-a-에티닐구아노신 TP; 2'-a-트리플루오로메틸구아노신 TP; 2'-b-에티닐구아노신 TP; 2'-b-트리플루오로메틸구아노신 TP; 2'-데옥시-2', 2'-디플루오로구아노신 TP; 2'-데옥시-2'-a-머캅토구아노신 TP; 2'-데옥시-2'-a-티오메톡시구아노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-아미노구아노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-아지도구아노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-브로모구아노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-클로로구아노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-플루오로구아노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-아이오도구아노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-머캅토구아노신 TP; 2'-데옥시-2'-b-티오메톡시구아노신 TP; 4'-아지도구아노신 TP; 4'-카보사이클릭 구아노신 TP; 4'-에티닐구아노신 TP; 5'-호모-구아노신 TP; 8-브로모-구아노신 TP; 9-데아자구아노신 TP; N2-이소부틸-구아노신 TP; 1-메틸이노신; 이노신; 1,2'-O-디메틸이노신; 2'-O-메틸이노신; 7-메틸이노신; 2'-O-메틸이노신; 에폭시케오신; 갈락토실-케오신; 만노실케오신; 케오신; 알릴아미노-티미딘; 아자 티미딘; 데아자 티미딘; 데옥시-티미딘; 2'-O-메틸우리딘; 2-티오우리딘; 3-메틸우리딘; 5-카복시메틸우리딘; 5-하이드록시우리딘; 5-메틸우리딘; 5-타우리노메틸-2-티오우리딘; 5-타우리노메틸우리딘; 디하이드로우리딘; 슈도우리딘; (3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘; 1-메틸-3-(3-아미노-5-카복시프로필)슈도우리딘; 1-메틸슈도우리딘; 1-메틸-슈도우리딘; 2'-O-메틸우리딘; 2'-O-메틸슈도우리딘; 2'-O-메틸우리딘; 2-티오-2'-O-메틸우리딘; 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘; 3,2'-O-디메틸우리딘; 3-메틸-슈도-우리딘 TP; 4-티오우리딘; 5-(카복시하이드록시메틸)우리딘; 5-(카복시하이드록시메틸)우리딘 메틸 에스테르; 5,2'-O-디메틸우리딘; 5,6-디하이드로-우리딘; 5-아미노메틸-2-티오우리딘; 5-카바모일메틸-2'-O-메틸우리딘; 5-카바모일메틸우리딘; 5-카복시하이드록시메틸우리딘; 5-카복시하이드록시메틸우리딘 메틸 에스테르; 5-카복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘; 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘; 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘; 5-카복시메틸아미노메틸우리딘; 5-카복시메틸아미노메틸우리딘; 5-카바모일메틸우리딘 TP; 5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸우리딘; 5-메톡시카보닐메틸-2-티오우리딘; 5-메톡시카보닐메틸우리딘; 5-메톡시우리딘; 5-메틸-2-티오우리딘; 5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘; 5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘; 5-메틸아미노메틸우리딘; 5-메틸디하이드로우리딘; 5-옥시아세트산-우리딘 TP; 5-옥시아세트산-메틸 에스테르-우리딘 TP; N1-메틸-슈도-우리딘; 우리딘 5-옥시아세트산; 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르; 3-(3-아미노-3-카복시프로필)-우리딘 TP; 5-(이소-펜테닐아미노메틸)-2-티오우리딘 TP; 5-(이소-펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸우리딘 TP; 5-(이소-펜테닐아미노메틸)우리딘 TP; 5-프로피닐 우라실; α-티오-우리딘; 1 (아미노알킬아미노-카보닐에틸레닐)-2(티오)-슈도우라실; 1 (아미노알킬아미노카보닐에틸레닐)-2,4-(디티오)슈도우라실; 1 (아미노알킬아미노카보닐에틸레닐)-4 (티오)슈도우라실; 1 (아미노알킬아미노카보닐에틸레닐)-슈도우라실; 1 (아미노카보닐에틸레닐)-2(티오)-슈도우라실; 1 (아미노카보닐에틸레닐)-2,4-(디티오)슈도우라실; 1 (아미노카보닐에틸레닐)-4 (티오)슈도우라실; 1 (아미노카보닐에틸레닐)-슈도우라실; 1 치환된 2(티오)-슈도우라실; 1 치환된 2,4-(디티오)슈도우라실; 1 치환된 4 (티오)슈도우라실; 1 치환된 슈도우라실; 1-(아미노알킬아미노-카보닐에틸레닐)-2-(티오)-슈도우라실; 1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필) 슈도우리딘 TP; 1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필)슈도-UTP; 1-메틸-슈도-UTP; 2 (티오)슈도우라실; 2' 데옥시 우리딘; 2' 플루오로우리딘; 2-(티오)우라실; 2,4-(디티오)슈도우라실; 2' 메틸, 2'아미노, 2' 아지도, 2'플루오로-구아노신; 2'-아미노-2'-데옥시-UTP; 2'-아지도-2'-데옥시-UTP; 2'-아지도-데옥시우리딘 TP; 2'-O-메틸슈도우리딘; 2' 데옥시 우리딘; 2' 플루오로우리딘; 2'-데옥시-2'-a-아미노우리딘 TP; 2'-데옥시-2'-a-아지도우리딘 TP; 2-메틸슈도우리딘; 3 (3 아미노-3 카복시프로필)우라실; 4 (티오)슈도우라실; 4-(티오)슈도우라실; 4-(티오)우라실; 4-티오우라실; 5 (1,3-디아졸-1-알킬)우라실; 5 (2-아미노프로필)우라실; 5 (아미노알킬)우라실; 5 (디메틸아미노알킬)우라실; 5 (구아니디늄알킬)우라실; 5 (메톡시카보닐메틸)-2-(티오)우라실; 5 (메톡시카보닐-메틸)우라실; 5 (메틸) 2 (티오)우라실; 5 (메틸) 2,4 (디티오)우라실; 5 (메틸) 4 (티오)우라실; 5 (메틸아미노메틸)-2 (티오)우라실; 5 (메틸아미노메틸)-2,4 (디티오)우라실; 5 (메틸아미노메틸)-4 (티오)우라실; 5 (프로피닐)우라실; 5 (트리플루오로메틸)우라실; 5-(2-아미노프로필)우라실; 5-(알킬)-2-(티오)슈도우라실; 5-(알킬)-2,4 (디티오)슈도우라실; 5-(알킬)-4 (티오)슈도우라실; 5-(알킬)슈도우라실; 5-(알킬)우라실; 5-(알키닐)우라실; 5-(알릴아미노)우라실; 5-(시아노알킬)우라실; 5-(디알킬아미노알킬)우라실; 5-(디메틸아미노알킬)우라실; 5-(구아니디늄알킬)우라실; 5-(할로)우라실; 5-(1,3-디아졸-1-알킬)우라실; 5-(메톡시)우라실; 5-(메톡시카보닐메틸)-2-(티오)우라실; 5-(메톡시카보닐-메틸)우라실; 5-(메틸) 2(티오)우라실; 5-(메틸) 2,4 (디티오)우라실; 5-(메틸) 4 (티오)우라실; 5-(메틸)-2-(티오)슈도우라실; 5-(메틸)-2,4 (디티오)슈도우라실; 5-(메틸)-4 (티오)슈도우라실; 5-(메틸)슈도우라실; 5-(메틸아미노메틸)-2 (티오)우라실; 5-(메틸아미노메틸)-2,4(디티오)우라실; 5-(메틸아미노메틸)-4-(티오)우라실; 5-(프로피닐)우라실; 5-(트리플루오로메틸)우라실; 5-아미노알릴-우리딘; 5-브로모-우리딘; 5-아이오도-우리딘; 5-우라실; 6 (아조)우라실; 6-(아조)우라실; 6-아자-우리딘; 알릴아미노-우라실; 아자 우라실; 데아자 우라실; N3 (메틸)우라실; 슈도-UTP-1-2-에탄산; 슈도우라실; 4-티오-슈도-UTP; 1-카복시메틸-슈도우리딘; 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘; 1-프로피닐-우리딘; 1-타우리노메틸-1-메틸-우리딘; 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘; 1-타우리노메틸-슈도우리딘; 2-메톡시-4-티오-슈도우리딘; 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘; 2-티오-1-메틸-슈도우리딘; 2-티오-5-아자-우리딘; 2-티오-디하이드로슈도우리딘; 2-티오-디하이드로우리딘; 2-티오-슈도우리딘; 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘; 4-메톡시-슈도우리딘; 4-티오-1-메틸-슈도우리딘; 4-티오-슈도우리딘; 5-아자-우리딘; 디하이드로슈도우리딘; (±) 1-(2-하이드록시프로필)슈도우리딘 TP; (2R)-1-(2-하이드록시프로필)슈도우리딘 TP; (2S)-1-(2-하이드록시프로필)슈도우리딘 TP; (E)-5-(2-브로모-비닐)아라-우리딘 TP; (E)-5-(2-브로모-비닐)우리딘 TP; (Z)-5-(2-브로모-비닐)아라-우리딘 TP; (Z)-5-(2-브로모-비닐)우리딘 TP; 1-(2,2,2-트리플루오로에틸)-슈도-UTP; 1-(2,2,3,3,3-펜타플루오로프로필)슈도우리딘 TP; 1-(2,2-디에톡시에틸)슈도우리딘 TP; 1-(2,4,6-트리메틸벤질)슈도우리딘 TP; 1-(2,4,6-트리메틸-벤질)슈도-UTP; 1-(2,4,6-트리메틸-페닐)슈도-UTP; 1-(2-아미노-2-카복시에틸)슈도-UTP; 1-(2-아미노-에틸)슈도-UTP; 1-(2-하이드록시에틸)슈도우리딘 TP; 1-(2-메톡시에틸)슈도우리딘 TP; 1-(3,4-비스-트리플루오로메톡시벤질)슈도우리딘 TP; 1-(3,4-디메톡시벤질)슈도우리딘 TP; 1-(3-아미노-3-카복시프로필)슈도-UTP; 1-(3-아미노-프로필)슈도-UTP; 1-(3-사이클로프로필-프로프-2-이닐)슈도우리딘 TP; 1-(4-아미노-4-카복시부틸)슈도-UTP; 1-(4-아미노-벤질)슈도-UTP; 1-(4-아미노-부틸)슈도-UTP; 1-(4-아미노-페닐)슈도-UTP; 1-(4-아지도벤질)슈도우리딘 TP; 1-(4-브로모벤질)슈도우리딘 TP; 1-(4-클로로벤질)슈도우리딘 TP; 1-(4-플루오로벤질)슈도우리딘 TP; 1-(4-아이오도벤질)슈도우리딘 TP; 1-(4-메탄술포닐벤질)슈도우리딘 TP; 1-(4-메톡시벤질)슈도우리딘 TP; 1-(4-메톡시-벤질)슈도-UTP; 1-(4-메톡시-페닐)슈도-UTP; 1-(4-메틸벤질)슈도우리딘 TP; 1-(4-메틸-벤질)슈도-UTP; 1-(4-니트로벤질)슈도우리딘 TP; 1-(4-니트로-벤질)슈도-UTP; 1(4-니트로-페닐)슈도-UTP; 1-(4-티오메톡시벤질)슈도우리딘 TP; 1-(4-트리플루오로메톡시벤질)슈도우리딘 TP; 1-(4-트리플루오로메틸벤질)슈도우리딘 TP; 1-(5-아미노-펜틸)슈도-UTP; 1-(6-아미노-헥실)슈도-UTP; 1,6-디메틸-슈도-UTP; 1-[3-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-프로피오닐]슈도우리딘 TP; 1-{3-[2-(2-아미노에톡시)-에톡시]-프로피오닐}슈도우리딘 TP; 1-아세틸슈도우리딘 TP; 1-알킬-6-(1-프로피닐)-슈도-UTP; 1-알킬-6-(2-프로피닐)-슈도-UTP; 1-알킬-6-알릴-슈도-UTP; 1-알킬-6-에티닐-슈도-UTP; 1-알킬-6-호모알릴-슈도-UTP; 1-알킬-6-비닐-슈도-UTP; 1-알릴슈도우리딘 TP; 1-아미노메틸-슈도-UTP; 1-벤조일슈도우리딘 TP; 1-벤질옥시메틸슈도우리딘 TP; 1-벤질-슈도-UTP; 1-비오티닐-PEG2-슈도우리딘 TP; 1-비오티닐슈도우리딘 TP; 1-부틸-슈도-UTP; 1-시아노메틸슈도우리딘 TP; 1-사이클로부틸메틸-슈도-UTP; 1-사이클로부틸-슈도-UTP; 1-사이클로헵틸메틸-슈도-UTP; 1-사이클로헵틸-슈도-UTP; 1-사이클로헥실메틸-슈도-UTP; 1-사이클로헥실-슈도-UTP; 1-사이클로옥틸메틸-슈도-UTP; 1-사이클로옥틸-슈도-UTP; 1-사이클로펜틸메틸-슈도-UTP; 1-사이클로펜틸-슈도-UTP; 1-사이클로프로필메틸-슈도-UTP; 1-사이클로프로필-슈도-UTP; 1-에틸-슈도-UTP; 1-헥실-슈도-UTP; 1-호모알릴슈도우리딘 TP; 1-하이드록시메틸슈도우리딘 TP; 1-이소-프로필-슈도-UTP; 1-Me-2-티오-슈도-UTP; 1-Me-4-티오-슈도-UTP; 1-Me-알파-티오-슈도-UTP; 1-메탄술포닐메틸슈도우리딘 TP; 1-메톡시메틸슈도우리딘 TP; 1-메틸-6-(2,2,2-트리플루오로에틸)슈도-UTP; 1-메틸-6-(4-모르폴리노)-슈도-UTP; 1-메틸-6-(4-티오모르폴리노)-슈도-UTP; 1-메틸-6-(치환된 페닐)슈도-UTP; 1-메틸-6-아미노-슈도-UTP; 1-메틸-6-아지도-슈도-UTP; 1-메틸-6-브로모-슈도-UTP; 1-메틸-6-부틸-슈도-UTP; 1-메틸-6-클로로-슈도-UTP; 1-메틸-6-시아노-슈도-UTP; 1-메틸-6-디메틸아미노-슈도-UTP; 1-메틸-6-에톡시-슈도-UTP; 1-메틸-6-에틸카복실레이트-슈도-UTP; 1-메틸-6-에틸-슈도-UTP; 1-메틸-6-플루오로-슈도-UTP; 1-메틸-6-포르밀-슈도-UTP; 1-메틸-6-하이드록시아미노-슈도-UTP; 1-메틸-6-하이드록시-슈도-UTP; 1-메틸-6-아이오도-슈도-UTP; 1-메틸-6-이소-프로필-슈도-UTP; 1-메틸-6-메톡시-슈도-UTP; 1-메틸-6-메틸아미노-슈도-UTP; 1-메틸-6-페닐-슈도-UTP; 1-메틸-6-프로필-슈도-UTP; 1-메틸-6-tert-부틸-슈도-UTP; 1-메틸-6-트리플루오로메톡시-슈도-UTP; 1-메틸-6-트리플루오로메틸-슈도-UTP; 1-모르폴리노메틸슈도우리딘 TP; 1-펜틸-슈도-UTP; 1-페닐-슈도-UTP; 1-피발로일슈도우리딘 TP; 1-프로파르길슈도우리딘 TP; 1-프로필-슈도-UTP; 1-프로피닐-슈도우리딘; 1-p-톨릴-슈도-UTP; 1-tert-부틸-슈도-UTP; 1-티오메톡시메틸슈도우리딘 TP; 1-티오모르폴리노메틸슈도우리딘 TP; 1-트리플루오로아세틸슈도우리딘 TP; 1-트리플루오로메틸-슈도-UTP; 1-비닐슈도우리딘 TP; 2,2'-언하이드로-우리딘 TP; 2'-브로모-데옥시우리딘 TP; 2'-F-5-메틸-2'-데옥시-UTP; 2'-OMe-5-Me-UTP; 2'-OMe-슈도-UTP; 2'-a-에티닐우리딘 TP; 2'-a-트리플루오로메틸우리딘 TP; 2'-b-에티닐우리딘 TP; 2'-b-트리플루오로메틸우리딘 TP; 2'-데옥시-2',2'-디플루오로우리딘 TP; 2'-데옥시-2'-a-머캅토우리딘 TP; 2'-데옥시-2'-a-티오메톡시우리딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-아미노우리딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-아지도우리딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-브로모우리딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-클로로우리딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-플루오로우리딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-아이오도우리딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-머캅토우리딘 TP; 2'-데옥시-2'-b-티오메톡시우리딘 TP; 2-메톡시-4-티오-우리딘; 2-메톡시우리딘; 2'-O-메틸-5-(1-프로피닐)우리딘 TP; 3-알킬-슈도-UTP; 4'-아지도우리딘 TP; 4'-카보사이클릭 우리딘 TP; 4'-에티닐우리딘 TP; 5-(1-프로피닐)아라-우리딘 TP; 5-(2-푸라닐)우리딘 TP; 5-시아노우리딘 TP; 5-디메틸아미노우리딘 TP; 5'-호모-우리딘 TP; 5-아이오도-2'-플루오로-데옥시우리딘 TP; 5-페닐에티닐우리딘 TP; 5-트리듀테로메틸-6-듀테로우리딘 TP; 5-트리플루오로메틸-우리딘 TP; 5-비닐아라우리딘 TP; 6-(2,2,2-트리플루오로에틸)-슈도-UTP; 6-(4-모르폴리노)-슈도-UTP; 6-(4-티오모르폴리노)-슈도-UTP; 6-(치환된-페닐)-슈도-UTP; 6-아미노-슈도-UTP; 6-아지도-슈도-UTP; 6-브로모-슈도-UTP; 6-부틸-슈도-UTP; 6-클로로-슈도-UTP; 6-시아노-슈도-UTP; 6-디메틸아미노-슈도-UTP; 6-에톡시-슈도-UTP; 6-에틸카복실레이트-슈도-UTP; 6-에틸-슈도-UTP; 6-플루오로-슈도-UTP; 6-포르밀-슈도-UTP; 6-하이드록시아미노-슈도-UTP; 6-하이드록시-슈도-UTP; 6-아이오도-슈도-UTP; 6-이소-프로필-슈도-UTP; 6-메톡시-슈도-UTP; 6-메틸아미노-슈도-UTP; 6-메틸-슈도-UTP; 6-페닐-슈도-UTP; 6-페닐-슈도-UTP; 6-프로필-슈도-UTP; 6-tert-부틸-슈도-UTP; 6-트리플루오로메톡시-슈도-UTP; 6-트리플루오로메틸-슈도-UTP; 알파-티오-슈도-UTP; 슈도우리딘 1-(4-메틸벤젠술폰산) TP; 슈도우리딘 1-(4-메틸벤조산) TP; 슈도우리딘 TP 1-[3-(2-에톡시)]프로피온산; 슈도우리딘 TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-에톡시)-에톡시]-에톡시)-에톡시}]프로피온산; 슈도우리딘 TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-에톡시)-에톡시}-에톡시]-에톡시)-에톡시}]프로피온산; 슈도우리딘 TP 1-[3-{2-(2-[2-에톡시]-에톡시)-에톡시}]프로피온산; 슈도우리딘 TP 1-[3-{2-(2-에톡시)-에톡시}] 프로피온산; 슈도우리딘 TP 1-메틸포스폰산; 슈도우리딘 TP 1-메틸포스폰산 디에틸 에스테르; 슈도-UTP-N1-3-프로피온산; 슈도-UTP-N1-4-부탄산; 슈도-UTP-N1-5-펜탄산; 슈도-UTP-N1-6-헥산산; 슈도-UTP-N1-7-헵탄산; 슈도-UTP-N1-메틸-p-벤조산; 슈도-UTP-N1-p-벤조산; 위부토신; 하이드록시위부토신; 이소위오신; 퍼옥시위부토신; 저변형된(undermodified) 하이드록시위부토신; 4-데메틸위오신; 2,6-(디아미노)퓨린; 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일: 1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일; 1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일; 1,3,5-(트리아자)-2,6-(디옥사)-나프탈렌;2 (아미노)퓨린;2,4,5-(트리메틸)페닐;2' 메틸, 2'아미노, 2'아지도, 2'플루오로-시티딘;2' 메틸, 2' 아미노, 2'아지도, 2'플루오로-아데닌;2'메틸, 2'아미노, 2' 아지도, 2'플루오로-우리딘;2'-아미노-2'-데옥시리보스; 2-아미노-6-클로로-퓨린; 2-아자-이노시닐; 2'-아지도-2'-데옥시리보스; 2'플루오로-2'-데옥시리보스; 2'-플루오로-변형된 염기; 2'-O-메틸-리보스; 2-옥소-7-아미노피리도피리미딘-3-일; 2-옥소-피리도피리미딘-3-일; 2-피리디논; 3 니트로피롤; 3-(메틸)-7-(프로피닐)이소카보스티릴릴; 3-(메틸)이소카보스티릴릴; 4-(플루오로)-6-(메틸)벤즈이미다졸; 4-(메틸)벤즈이미다졸; 4-(메틸)인돌릴; 4,6-(디메틸)인돌릴; 5 니트로인돌; 5 치환된 피리미딘; 5-(메틸)이소카보스티릴릴; 5-니트로인돌; 6-(아자)피리미딘; 6-(아조)티민; 6-(메틸)-7-(아자)인돌릴; 6-클로로-퓨린; 6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일; 7-(아미노알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일; 7-(아미노알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일; 7-(아미노알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일; 7-(아미노알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일; 7-(아미노알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일; 7-(아자)인돌릴; 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진l-일; 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일; 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일; 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일; 7-(구아니디늄알킬-하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일; 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일; 7-(프로피닐)이소카보스티릴릴; 7-(프로피닐)이소카보스티릴릴, 프로피닐-7-(아자)인돌릴; 7-데아자-이노시닐; 7-치환된 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일; 7-치환된 1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일; 9-(메틸)-이미디조피리디닐; 아미노인돌릴; 안트라세닐; 비스-오르토-(아미노알킬하이드록시)-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일; 비스-오르토-치환된-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일; 디플루오로톨릴; 하이포잔틴; 이미디조피리디닐; 이노시닐; 이소카보스티릴릴; 이소구아니신; N2-치환된 퓨린; N6-메틸-2-아미노-퓨린; N6-치환된 퓨린; N-알킬화된 유도체; 나프탈레닐; 니트로벤즈이미다졸릴; 니트로이미다졸릴; 니트로인다졸릴; 니트로피라졸릴; 누부라린(Nubularine); 06-치환된 퓨린; O-알킬화된 유도체; 오르토-(아미노알킬하이드록시)-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일; 오르토-치환된-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일; 옥소포르마이신 TP; 파라-(아미노알킬하이드록시)-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일; 파라-치환된-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일; 펜타세닐(Pentacenyl); 페난트라세닐; 페닐; 프로피닐-7-(아자)인돌릴; 피레닐; 피리도피리미딘-3-일; 피리도피리미딘-3-일, 2-옥소-7-아미노-피리도피리미딘-3-일; 피롤로-피리미딘-2-온-3-일; 피롤로피리미디닐; 피롤로피리지닐; 스틸벤질(Stilbenzyl); 치환된 1,2,4-트리아졸; 테트라세닐; 투베르시딘(Tubercidine); 잔틴; 잔토신-5'-TP; 2-티오-제부라린; 5-아자-2-티오-제부라린; 7-데아자-2-아미노-퓨린; 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드; 2-아미노-리보시드-TP; 포르마이신 A TP; 포르마이신 B TP; 피롤로신 TP; 2'-OH-아라-아데노신 TP; 2'-OH-아라-시티딘 TP; 2'-OH-아라-우리딘 TP; 2'-OH-아라-구아노신 TP; 5-(2-카보메톡시비닐)우리딘 TP; 및 N6-(19-아미노-펜타옥사노나데실)아데노신 TP.
일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 전술된 변형된 핵염기 중 적어도 2개(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자) 내의 변형된 핵염기는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸슈도우리딘(m1ψ), N1-에틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메톡시우리딘 및 2'-O-메틸 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA 폴리뉴클레오티드, 예컨대 mRNA 폴리뉴클레오티드)는 전술된 변형된 핵염기 중 적어도 2개(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자) 내의 변형된 핵염기는 1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 5-메톡시-우리딘(mo5U), 5-메틸-시티딘(m5C), 슈도우리딘(ψ), α-티오-구아노신 및 α-티오-아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 전술된 변형된 핵염기 중 적어도 2개(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 슈도우리딘(v) 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 2-티오우리딘(s2U)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 2-티오우리딘 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 메톡시-우리딘(mo5U)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 5-메톡시-우리딘(mo5U) 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 2'-O-메틸 우리딘을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 2'-O-메틸 우리딘 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 N6-메틸-아데노신(m6A)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 N6-메틸-아데노신(m6A) 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함한다.
일부 구현예에서, RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)는 특정 변형을 위해 균일하게 변형된다(예를 들어, 완전히 변형, 전체 서열에 걸쳐 변형된다). 예를 들어, RNA 분자는 5-메틸-시티딘(m5C)으로 균일하게 변형될 수 있고, 이는 mRNA 서열 내의 모든 시토신 잔기가 5-메틸-시티딘(m5C)으로 대체됨을 의미한다. 유사하게, RNA 분자는 상기 제시된 것들과 같은 변형된 잔기로 대체함으로써 서열에 존재하는 임의의 유형의 뉴클레오시드 잔기에 대해 균일하게 변형될 수 있다.
변형된 시토신을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드에는 N4-아세틸-시티딘(ac4C), 5-메틸-시티딘(m5C), 5-할로-시티딘(예를 들어, 5-아이오도-시티딘), 5-하이드록시메틸-시티딘(hm5C), 1-메틸-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘(s2C) 및 2-티오-5-메틸-시티딘이 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 우리딘이다. 예시적인 핵염기 및 일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 시토신이다. 변형된 우리딘을 갖는 뉴클레오시드에는 5-시아노 우리딘 및 4'-티오 우리딘이 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 아데닌이다. 변형된 아데닌을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드에는 7-데아자-아데닌, 1-메틸-아데노신(m1A), 2-메틸-아데닌(m2A) 및 N6-메틸-아데노신(m6A)이 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 구아닌이다. 변형된 구아닌을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드에는 이노신(I), 1-메틸-이노신(m1I), 위오신(imG), 메틸위오신(mimG), 7-데아자-구아노신, 7-시아노-7-데아자-구아노신(preQO), 7-아미노메틸-7-데아자-구아노신(preQ1), 7-메틸-구아노신(m7G), 1-메틸-구아노신(mlG), 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신이 포함된다.
본원 개시내용의 핵산 분자는 분자의 전체 길이를 따라 부분적으로 또는 완전히 변형될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 또는 모든 또는 주어진 유형의 뉴클레오티드(예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘, 또는 A, G, U, C 중 임의의 하나 이상 또는 모두)는 본 개시내용의 핵산 분자에서 또는 이의 주어진 사전결정된 서열 영역에서(예를 들어, 폴리A 테일을 포함하거나 포함하지 않는 mRNA에서) 균일하게 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 분자에서 (또는 이의 주어진 서열 영역에서) 모든 뉴클레오티드 X는 변형된 뉴클레오티드이고, 여기서, X는 뉴클레오티드 A, G, U, C 중 어느 하나, 또는 A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C 또는 A+G+C 조합 중 어느 하나일 수 있다.
핵산 분자는 (전체 뉴클레오티드 함량과 관련하여 또는 하나 이상의 유형의 뉴클레오티드, 즉 A, G, U 또는 C 중 임의의 하나 이상과 관련하여) 약 1% 내지 약 100%의 변형된 뉴클레오티드 또는 임의의 개재 백분율(예를 들어, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 60%, 1% 내지 70%, 1% 내지 80%, 1% 내지 90%, 1% 내지 95%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 20% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 70%, 20% 내지 80%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100%, 및 95% 내지 100%)을 포함할 수 있다. 임의의 나머지 백분율은 비변형 A, G, U 또는 C의 존재에 의해 설명된다.
따라서, 일부 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA) 분자는 5'UTR 요소 및 선택적으로 코돈 최적화된 오픈 리딩 프레임 및 3'UTR 요소, 폴리(A) 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함하며, RNA는 화학적으로 변형되지 않는다.
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 우라실이다. 변형된 우라실을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드에는 슈도우리딘(ψ), 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘(s2U), 4-티오-우리딘(s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘(ho5U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘(예를 들어, 5-아이오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 3-메틸-우리딘(m3U), 5-메톡시-우리딘(mo5U), 우리딘 5-옥시아세트산(cmo5U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르(mcmo5U), 5-카복시메틸-우리딘(cm5U), 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-카복시하이드록시메틸-우리딘(chm5U), 5-카복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르(mchm5U), 5-메톡시카보닐메틸-우리딘(mcm5U), 5-메톡시카보닐메틸-2-티오-우리딘(mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘(nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우리딘(mnm5U), 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘(mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘(mnm5se2U), 5-카바모일메틸-우리딘(ncm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-우리딘(cmnm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘(cmnm5s2U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘(τm5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘(m5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘, 5-메틸-우리딘(m5U, 즉, 핵염기 데옥시티민을 가짐), 1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸-2-티오-우리딘(m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘(m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘(m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘(D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘(m5D), 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘(acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필)슈도우리딘(acp3ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘(inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘(inm5s2U), α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘(Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘(msUm), 2'-O-메틸-슈도우리딘(Wm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘(s2Um), 5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘(mcm5Um), 5-카바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘(ncm5Um), 5-카복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘(cmnm5Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘(m3Um) 및 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘(inm5Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-아라-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-아라-우리딘, 5-(2-카보메톡시비닐) 우리딘, 및 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)]우리딘이 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 시토신이다. 변형된 시토신을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드에는 5-아자-시티딘, 6-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘(m3C), N4-아세틸-시티딘(ac4C), 5-포르밀-시티딘(f5C), N4-메틸-시티딘(m4C), 5-메틸-시티딘(m5C), 5-할로-시티딘(예를 들어, 5-아이오도-시티딘), 5-하이드록시메틸-시티딘(hm5C), 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘(s2C), 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제부라린, 5-아자-제부라린, 5-메틸-제부라린, 5-아자-2-티오-제부라린, 2-티오-제부라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘, 라이시딘(k2C), α-티오-시티딘, 2'-O-메틸-시티딘(Cm), 5,2'-O-디메틸-시티딘(m5Cm), N4-아세틸-2'-O-메틸-시티딘(ac4Cm), N4,2'-O-디메틸-시티딘(m4Cm), 5-포르밀-2'-O-메틸-시티딘(f5Cm), N4,N4,2'-O-트리메틸-시티딘(m42Cm), 1-티오-시티딘, 2'-F-아라-시티딘, 2'-F-시티딘 및 2'-OH-아라-시티딘이 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 아데닌이다. 변형된 아데닌을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드에는 2-아미노-퓨린, 2, 6-디아미노퓨린, 2-아미노-6-할로-퓨린(예를 들어, 2-아미노-6-클로로-퓨린), 6-할로-퓨린(예를 들어, 6-클로로-퓨린), 2-아미노-6-메틸-퓨린, 8-아지도-아데노신, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-아데노신(m1A), 2-메틸-아데닌(m2A), N6-메틸-아데노신(m6A), 2-메틸티오-N6-메틸-아데노신(ms2m6A), N6-이소펜테닐-아데노신(i6A), 2-메틸티오-N6-이소펜테닐-아데노신(ms2i6A), N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신(io6A), 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신(ms2io6A), N6-글리시닐카바모일-아데노신(g6A), N6-트레오닐카바모일-아데노신(t6A), N6-메틸-N6-트레오닐카바모일-아데노신(m6t6A), 2-메틸티오-N6-트레오닐카바모일-아데노신(ms2g6A), N6,N6-디메틸-아데노신(m62A), N6-하이드록시노르발릴카바모일-아데노신(hn6A), 2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴카바모일-아데노신(ms2hn6A), N6-아세틸-아데노신(ac6A), 7-메틸-아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, α-티오-아데노신, 2'-O-메틸-아데노신(Am), N6,2'-O-디메틸-아데노신(m6Am), N6,N6,2'-O-트리메틸-아데노신(m62Am), 1,2'-O-디메틸-아데노신(m1Am), 2'-O-리보실아데노신 (포스페이트)(Ar(p)), 2-아미노-N6-메틸-퓨린, 1-티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 2'-F-아라-아데노신, 2'-F-아데노신, 2'-OH-아라-아데노신, 및 N6-(19-아미노-펜타옥사노나데실)-아데노신이 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 구아닌이다. 변형된 구아닌을 갖는 예시적인 핵염기 및 뉴클레오시드에는 이노신(I), 1-메틸-이노신(m1I), 위오신(imG), 메틸위오신(mimG), 4-데메틸-위오신(imG-14), 이소위오신(imG2), 위부토신(yW), 퍼옥시위부토신(o2yW), 하이드록시위부토신(OhyW), 저변형된 하이드록시위부토신(OhyW*), 7-데아자-구아노신, 케오신(Q), 에폭시케오신(oQ), 갈락토실-케오신(galQ), 만노실-케오신(manQ), 7-시아노-7-데아자-구아노신(preQ0), 7-아미노메틸-7-데아자-구아노신(preQ1), 아케오신(G+), 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신(m7G), 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸-이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸-구아노신(mG), N2-메틸-구아노신(m2G), N2,N2-디메틸-구아노신(m22G), N2,7-디메틸-구아노신(m2,7G), N2, N2,7-디메틸-구아노신(m2,2,7G), 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, α-티오-구아노신, 2'-O-메틸-구아노신(Gm), N2-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2Gm), N2,N2-디메틸-2'-O-메틸-구아노신(m22Gm), 1-메틸-2'-O-메틸-구아노신(mGm), N2,7-디메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2'7Gm), 2'-O-메틸-이노신(Im), 1,2'-O-디메틸-이노신(m1Im), 2'-O-리보실구아노신 (포스페이트)(Gr(p)), 1-티오-구아노신, 06-메틸-구아노신, 2'-F-아라-구아노신, 및 2'-F-구아노신이 포함된다.
일부 구현예에서, mRNA는 비-복제 mRNA이다. 다른 구현예에서, mRNA는 자가-증폭 mRNA이다. 자가-증폭 mRNA는 알파바이러스 RNA 복제 기구를 인코딩하는 유전자를 함유하지만, 감염성 알파바이러스 입자를 만드는 데 필요한 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 유전자를 결여하는 알파바이러스 게놈에 기반할 수 있다. 문헌[Geall AJ et al., 2012, Proc Natl Acad Sci USA 109(36): 14604-14609]을 참조한다. 알파바이러스의 구조 단백질 유전자는 이들 자가-증폭 RNA로 트랜스펙션된 세포의 세포질에서 하위-게놈 mRNA로부터 풍부하게 발현되는 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자로 대체될 수 있다. T7 RNA 중합효소를 사용하는 선형 pDNA 주형으로부터의 효소적 전사 반응에 의해 자가-증폭 mRNA를 시험관내에서 생성함으로써, 생 바이러스 백신, 재조합 서브유닛 단백질 및 바이러스 벡터의 세포 배양 생성과 관련된 안전성 문제 및 복잡한 제조 문제를 회피할 수 있다. 면역화 후에, mRNA 분자의 복제 및 증폭이 트랜스펙션된 세포의 세포질에서 배타적으로 발생함으로써, 게놈 통합 및 세포 형질전환의 위험이 제거된다. 문헌[Brito LA, et al. 2015, Adv Genet. 89:179-233]; 문헌[Perri S, et al. 2003, J Virol. 77:10394-403]; 및 문헌[Geall AJ, et al., 2012, Proc Natl Acad Sci USA. 109:14604-9]을 참조한다.
자가-증폭 mRNA의 전장 mRNA는 비-복제 mRNA보다 상당히 더 크지만(알파바이러스 시스템에 있어서 대략 9 내지 10 kb), 상기 기재된 바와 같은 동일한 필수 요소, 예컨대 캡, 5' 및 3' UTR 및 폴리 A 테일을 함유한다. 자가-증폭 mRNA를 인코딩하는 DNA는 하위-게놈 프로모터 및 비구조 바이러스 단백질을 인코딩하는 큰 ORF를 포함하며, 이는 시토졸 내로의 DNA의 전달 후에 인코딩된 RNA-의존성 RNA 중합효소(RDRP)에 의해 4가지 기능적 구성성분(nsP1, nsP2, nsP3 및 nsp4)으로 전사된다(문헌[Iavarone C, et al., 2017, Expert Rev Vaccines 16:871-81] 참조). 이어서, RDRP는 2개의 양성 가닥 RNA 분자: 게놈 mRNA 및 더 짧은 하위-게놈 mRNA에 대한 주형으로서 역할을 하는 게놈의 음성-센스 카피를 생성한다. 이 하위-게놈 mRNA는 매우 높은 수준으로 전사되어, 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA의 증폭을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, mRNA는 이들의 안정성을 조절하도록 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 mRNA는 코돈 최적화되지 않은 상응하는 mRNA에 비하여 증가된 안정성을 갖는다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 mRNA는 코돈 최적화되지 않은 상응하는 mRNA에 비해 감소된 안정성을 갖는다. 예를 들어, 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA를 이의 안정성을 증가시키기 위하여 코돈 최적화시킬 수 있다. 안정성을 조절하기 위한 mRNA의 코돈 최적화 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Bicknell AA et al., 2017, Biochem Soc Trans. 45(2):339-351]; 문헌[Radhakrishnan A, et al, 2016, J Mol Biol. 428(18):3558-3564]; 문헌[Chen YH, et al., 2016, Trends Genet. 2016;32(11):687-688]; 및 문헌[Hanson G, et al., 2018, Nat Rev Mol Cell Biol. 19(1):20-30]에 기재되어 있다.
mRNA는 예를 들어, 이의 안정성을 조절하기 위하여 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는 상응하는 mRNA에 비하여 mRNA의 안정성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않는 상응하는 mRNA에 비하여 mRNA의 안정성을 감소시킨다. 적합한 변형된 뉴클레오티드에는 N6-메틸아데노신(m6A), N6,2'-O-디메틸아데노신(m6Am), 5-메틸시티딘(m5C), 이노신(I), 슈도우리딘(Ψ), N1-메틸아데노신(m1A), 5-하이드록실메틸시티딘(hm5C), 2'-O-메틸화(Nm) 및 N4-아세틸시티딘이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 문헌[Roundtree IA, et al., 2017, Cell 169(7):1187-1200]; 및 문헌[Li X, et al., 2019, Biochemistry 58(12):1553-1554]을 참조한다.
mRNA는 mRNA의 3'-UTR 내에 단백질 결합 부위를 포함할 수 있다. 단백질 결합 부위는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 결합 부위는 Staufen1(STAU1)-매개된 결합 부위(SBS)이다. 문헌[Park E, et al., 2013, Wiley Interdiscip Rev RNA. 4(4):423-435]; 및 문헌[Chen YH, et al., 2016, Trends Genet. 32(11):687-688]을 참조한다. Staufen1(STAU1)-매개된 mRNA 분해(SMD)는 표적 mRNA의 3'-비번역 영역(3'-UTR) 내의 STAU1-결합 부위(SBS)로의 STAU1의 결합에 의해 매개되는 포유동물 세포에서의 mRNA 분해 과정이다. SMD 동안, STAU1, 이중-가닥(ds) RNA-결합 단백질은 부분적으로 상보적인 Alu 요소를 통한 긴-비코딩 RNA(lncRNA)와의 3'-UTR 서열의 분자간 염기 쌍형성에 의해 또는 3'-UTR 서열의 분자내 염기 쌍형성에 의해 형성되는 dsRNA 구조를 인식한다. STAU1은 주요 SMD 인자인, ATP-의존성 RNA 헬리카제 UPF1과 직접적으로 상호작용하여, 이의 헬리카제 활성을 향상시켜, 효과적인 STAU1-매개된 mRNA 분해를 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 mRNA를 포함하는 조성물은 마이크로RNA(miRNA) 또는 miRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. miRNA는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA는 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA에 대해 상보적이다. miRNA는 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA와 동시-발현될 수 있다.
타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 분자는 합성 전달 비히클, 예컨대 지질 나노입자를 사용하여 대상체에게 전달될 수 있다. mRNA 분자 전달을 위한 지질 나노입자는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Reichmuth AM, et al., 2016, Ther Deliv. 7(5):319-334]; 문헌[Geall AJ, et al., 2012, Proc Natl Acad Sci USA. 109:14604-9]; 및 미국 특허 제10,702,600호에 기재되어 있으며, 이의 각각은 전체가 본원에 참조로 포함된다. 지질 나노입자에 사용하기에 적합한 지질 및 지질 복합체에는 DLinDMA: 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판; DOPE: 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민; DOTAP: 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판 클로라이드 염; DSPC: 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린; 히스티딜화된 리포플렉스: 히스티딜화된 폴리리신 및 L-히스티딘-(N,N-디-n-헥사데실아민)에틸아미드 리포좀의 PEG화된 유도체; HVJ-리포좀: 일본의 적혈구응집 바이러스(HVJ)로부터 유래된 융합 단백질을 갖는 리포좀; Man11-LPR100: 만노실화된 및 히스티딜화된 리포좀을 mRNA-PEG화된 히스티딜화된 폴리리신 폴리플렉스에 첨가함으로써 수득되는 만노실화된 및 히스티딜화된 리포폴리플렉스(Man11-LPR100); PC: 디팔미토일포스파티딜콜린; 콜레스테롤, PEG DMG 2000: 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]; PS: 포스파티딜세린; Span 85: 소르비탄 트리올레에이트; 유니펙틴; 및 스쿠알렌이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 문헌[Martinon F, et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23(7), 1719-1722]; 문헌[Hess PR, et al., 2005, Cancer Immunol. Immunother. 55(6), 672-683]. 문헌[Zhou W-Z, et al., 1999. Hum. Gene Ther. 10(16), 2719-2724]; 문헌[Pollard C, et al., 2013, Mol. Ther. 21(1), 251-259]; 문헌[Hoerr I, et al., 2000, Eur. J. Immunol. 30(1), 1-7]; 문헌[Mockey M, et al., 2007, Cancer Gene Ther. 14(9), 802-814]; 문헌[Perche F, et al., 2011, RNA. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 7(4), 445-453]; 문헌[Phua KKL, et al., 2014, Sci. Rep. 4, 5128]; 문헌[Geall AJ, et al., 2012, Proc. Natl Acad. Sci. USA 109(36), 14604-14609]; 및 문헌[Brito LA, et al., 2014, Mol. Ther. 22(12), 2118-2129]을 참조한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 양이온성 지질, PEG-변형된 지질, 스테롤 및 비-양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 이온화 가능한 양이온성 지질이며, 비-양이온성 지질은 중성 지질이며, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA), 디리놀레일-메틸-4-디메틸아미노부티레이트(DLin-MC3-DMA), 디((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L319), (12Z,15Z)--N,N-디메틸-2-노닐헤니코사-12,15-디엔-1-아민(L608) 및 N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]헵타데칸-8-아민(L530)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 지질은 (L608)이다.
RNA 분자는 또한, 리포좀을 사용하여 제형화될 수 있다. 리포좀은 주로 지질 이중층으로 구성될 수 있는 인공적으로 제조된 소낭이며, 영양소 및 약제학적 제형의 투여를 위한 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 리포좀은 상이한 크기의 것일 수 있으며, 예컨대 비제한적으로, 수백 나노미터의 직경일 수 있고 좁은 수성 구획에 의해 분리된 일련의 동심 이중층을 함유할 수 있는 다층 소낭(MLV), 50 nm 미만의 직경일 수 있는 소형 단층 소낭(SUV) 및 50 내지 500 nm 직경일 수 있는 대형 단층 소낭(LUV)일 수 있다. 리포좀 설계는 건강하지 않은 조직에 대한 리포좀의 부착을 개선시키기 위해 또는 비제한적으로 세포내이입과 같은 사건을 활성화시키기 위해 옵소닌 또는 리간드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 리포좀은 약제학적 제형의 전달을 개선시키기 위해 낮은 또는 높은 pH를 함유할 수 있다.
리포좀의 형성은 물리화학적 특징, 예컨대 비제한적으로, 포획된 약제학적 제형 및 리포좀 성분, 지질 소낭이 분산되어 있는 매질의 성질, 포획된 물질의 유효 농도 및 이의 잠재적인 독성, 소낭의 적용 및/또는 전달 동안 수반되는 임의의 추가의 과정, 의도된 응용을 위한 소낭의 최적화 크기, 다분산도 및 보관-수명, 및 안전하고 효율적인 리포좀 산물의 뱃치-대-뱃치 재현성 및 대규모 생산 가능성에 좌우될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 제한 없이, 리포좀, 예컨대 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DODMA) 리포좀으로부터 형성된 것들, 마리나 바이오테크(워싱턴주 보셀)로부터의 DiLa2 리포좀, 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA) 및 MC3(제US20100324120호; 전체가 본원에 참조로 포함됨) 및 소분자 약물을 전달할 수 있는 리포좀, 예컨대, 비제한적으로, 얀센 바이오테크, 인코포레이티드(펜실베이니아주 호샴)로부터의 DOXIL®을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 제한 없이, 이전에 설명되고, 시험관내 및 생체내에서 올리고뉴클레오티드 전달에 적합한 것으로 밝혀진 안정화된 플라스미드-지질 입자(SPLP) 또는 안정화된 핵산 지질 입자(SNALP)의 합성으로부터 형성된 것들과 같은 리포좀을 포함할 수 있다(문헌[Wheeler et al. Gene Therapy. 1999 6:271-281]; 문헌[Zhang et al. Gene Therapy. 1999 6:1438-1447]; 문헌[Jeffs et al. Pharm Res. 2005 22:362-372]; 문헌[Morrissey et al., Nat Biotechnol. 2005 2:1002-1007]; 문헌[Zimmermann et al., Nature. 2006 441:111-114]; 문헌[Heyes et al. J Contr Rel. 2005 107:276-287]; 문헌[Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176]; 문헌[Judge et al. J Clin Invest. 2009 119:661-673]; 문헌[deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132]; 미국 특허 공개 제US20130122104호 참조; 이의 전부는 전체가 본원에 포함됨).
일부 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA) 분자는 작용화된 지질 이중층 사이에 가교를 가질 수 있는 지질 소낭에서 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA) 분자는 지질-다가양이온 복합체에서 제형화될 수 있다. 지질-다가양이온 복합체의 형성은 당업계에 공지된 방법에 의해 및/또는 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 공개 제20120178702호에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 다가양이온은 양이온성 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대, 비제한적으로 폴리리신, 폴리오르니틴 및/또는 폴리아르기닌을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA) 분자는 비-양이온성 지질, 예컨대, 비제한적으로, 콜레스테롤 또는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)을 추가로 포함할 수 있는 지질-다가양이온 복합체에서 제형화될 수 있다.
다른 구현예에서, mRNA 분자는 캡시드 및 당단백질 유전자를 트랜스로 제공하는 헬퍼 세포주에 의해 생성되는 바이러스-유사 레플리콘 입자(VRP)에 패키징되고 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 분자는 유리 mRNA로서 대상체에게 전달되며, 즉, 이들은 또 다른 분자에 복합체화되지 않는다. 일부 구현예에서, mRNA 분자는 프로타민-복합체화된 mRNA로서 대상체에게 전달된다. 프로타민은 정소에서 발현되는 천연 양이온성 핵 단백질이다. 이는 정자에서 DNA가 최종 응축되는 동안 히스톤을 대체하는 고도로 특화된 분자이며 핵산을 안정화시키는 것으로 알려져 있다. 이는 아르기닌-풍부 서열을 가지며, 시험관내에서 핵산과 자발적으로 회합한다. 프로타민-복합체화된 mRNA는 강력한 유전자 발현 및 면역자극 둘 모두를 제공한다. 문헌[Scheel B et al., 2005, Eur J Immunol. 35:1557-66]; 문헌[Fotin-Mleczek M, 2011, J Immunother. 34:1-15]; 문헌[Fotin-Mleczek M, et al., 2012, J Gene Med. 14:428-39]; 및 문헌[Kowalczyk A, et al., 2016, Vaccine 34:3882-93]을 참조한다.
C. 바이러스 전달 방법
특정 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드 또는 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하도록 엔지니어링된 바이러스에 관한 것이다. 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 표적 세포 내로 전달하는 능력을 갖는 임의의 바이러스가 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 바이러스는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 kb의 이종 폴리뉴클레오티드를 표적 세포 내로 수송할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 4 내지 12 kb의 이종 폴리뉴클레오티드를 표적 세포 내로 수송할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 세포용해성이며, 즉, 표적 세포를 용해할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 종양용해성이며, 즉, 암 세포를 우선적으로 감염시키고/시키거나 용해시키는 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 표적 세포를 우선적으로 감염시킨다. 일부 구현예에서, 바이러스는 신속하게 분열하는 세포(예를 들어, 암 세포)를 우선적으로 감염시킨다.
바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스)일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 종양용해성 바이러스이다. 일부 구현예에서, 종양용해성 바이러스는 DNA 바이러스이다. 일부 구현예에서, 종양용해성 바이러스는 RNA 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 복제 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 비-복제 바이러스이다. 일부 구현예에서, DNA 바이러스는 DNA 복제 바이러스, 예를 들어, DNA 복제 종양용해성 바이러스이다. 일부 구현예에서, RNA 바이러스는 RNA 복제 바이러스, 예를 들어, RNA 복제 종양용해 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 아넬로바이러스이다.
일부 구현예에서, 바이러스는 이전에 바이러스로 감염되었던 숙주를 재감염시킬 수 있다. 이 특징은 대상체로의 바이러스의 다수의 투여를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 바이러스는 선천적으로 Z-NA 인식을 촉발시킨다. 특정 구현예에서, 바이러스는 아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스(AAV)가 아니다. 추가의 특정 구현예에서, 바이러스는 합성 다량체화 도메인, 즉, 도메인이 서로 근접하게 유지되도록 다른 이러한 도메인과 충분한 친화성으로 물리적으로 회합하는 비-자연 발생 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 바이러스가 하나 이상의 내인성 바이러스 유전자에 불활성화 돌연변이를 포함하는 것이 유리하다. 일부 구현예에서, 불활성화 돌연변이가 발병력을 감소시키도록, 불활성화 돌연변이는 바이러스의 발병력에 기여하는 내인성 바이러스 유전자(예를 들어, ICP34.5) 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 불활성화 돌연변이가 감염 시에 세포의 턴오버를 촉진시키거나 증가시키도록, 불활성화 돌연변이는 감염된 세포의 턴오버를 제한하는 내인성 바이러스 유전자(예를 들어, HSV에서 ICP6; 백시니아 바이러스에서 E3L)에 존재한다. 일부 구현예에서, 바이러스 유전자 내의 불활성화 돌연변이는 발병력 또는 세포 턴오버를 조절하는 추가의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현과 조합될 수 있다. 예를 들어, 델타-Zα1 돌연변이 형태의 백시니아 바이러스 E3L을 ICP34.5의 완전한 결실과 조합하여, 복제 능력을 복구시킬 수 있다.
불활성화를 위해 표적화될 수 있는 적합한 바이러스 및 내인성 바이러스 유전자의 예는 하기 표에 제공되어 있다.
[표 5]
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 바이러스는 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 폭시바이러스(예를 들어, 백시니아 바이러스), 아데노-연관 바이러스(AAV), 콕사키바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 홍역 바이러스, 점액종증, 폴리오바이러스, 렌티바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 레트로바이러스, 포미 바이러스, 파밍턴 바이러스, 파보바이러스 및 인플루엔자 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 바이러스는 아데노바이러스이다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)이다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스는 아데노바이러스 혈청형 19A(Ad19A)이다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스는 아데노바이러스 혈청형 26(Ad26)이다. 하나의 혈청형의 아데노바이러스는 상이한 아데노바이러스 혈청형으로부터의 섬유 단백질을 포함하도록 엔지니어링될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Ad5는 아데노바이러스 혈청형 35(Ad35)로부터의 섬유 단백질을 치환하도록 엔지니어링된다. 이 키메라 바이러스는 Ad5/F35로 지칭된다. (본원에 전체가 참조로 포함되는 문헌[Yotnda et al., 2001, Gene Therapy 8: 930-937] 참조.) 일부 구현예에서, Ad5는 아데노바이러스 혈청형 3(Ad3)으로부터의 섬유 단백질을 치환하도록 엔지니어링된다. 이 키메라 바이러스는 Ad5/F3으로 지칭된다.
일부 구현예에서, 아데노바이러스는 상응하는 야생형 아데노바이러스와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 치환, 부가 또는 결실)를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 아데노바이러스(예를 들어, Ad5 또는 Ad5/F35)는 아데노바이러스 조기 영역 1A(E1A) 내에 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스(예를 들어, Ad5 또는 Ad5/F35)는 E1A 내에 24 bp 결실을 포함한다. 이 결실은 바이러스 복제가 변경된 Rb 경로를 갖는 세포에 특이적이게 만든다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스(예를 들어, Ad5 또는 Ad5/F35)는 아데노바이러스 조기 영역 1B(E1B) 내에 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스(예를 들어, Ad5 또는 Ad5/F35)는 E1B 내에 827 bp 결실을 포함한다. 이 결실은 P53 변경을 갖는 세포에서 바이러스가 복제되도록 한다. 특정 구현예에서, 아데노바이러스(예를 들어, Ad5 또는 Ad5/F35)는 E1A 내의 24 bp 결실 및 E1B 내의 827 bp 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스(예를 들어, Ad5 또는 Ad5/F35)는 섬유-H 루프 내로 엔지니어링된 Arg-Gly-Asp(RGD)-모티프를 갖는다. 이 변형은 아데노바이러스가 세포에 유입하기 위하여 (암 세포에서 발현되는) avβ3 및 avβ5 인테그린을 사용하게 만든다. (본원에 전체가 참조로 포함되는 문헌[Reynolds et al., 1999, Gene Therapy 6: 1336-1339] 참조.)
일부 구현예에서, 아데노바이러스는 변형된 또는 돌연변이된 섬유 영역을 함유한다. 변형된 또는 돌연변이된 섬유 영역은 바이러스 향성 및 수용체 결합을 향상시키거나 변경시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 아데노바이러스의 E1 영역 내로, 예를 들어, E1A 또는 E1B 내에 삽입할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, E1 영역을 제거하고, 폴리뉴클레오티드로 대체한다. 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 프로모터, 예를 들어, 바이러스에 대하여 이종인 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동하기 위하여 내인성 바이러스 프로모터의 하류에 삽입할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드를 아데노바이러스 내로 L5 단백질 발현을 구동하는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 하류에 삽입한다. 아데노바이러스 주요 후기 프로모터는 후기 바이러스 유전자 발현과 동시에 발현을 부여한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드를 L5 단백질을 인코딩하는 내인성 바이러스 유전자의 하류에 삽입한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 발현은 폴리뉴클레오티드와 L5 단백질을 인코딩하는 유전자 사이에 배치된 2A 링커를 사용하여 L5 발현과 연관된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 발현은 아데노바이러스 주요 후기 프로모터의 제어 하에서 아데노바이러스 스플라이스 수여자가 폴리뉴클레오티드의 앞에 존재함으로써 L5 발현과 연관된다.
일부 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 바이러스는 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 예를 들어, HSV1이다. 일부 구현예에서, HSV1은 Kos, F1, MacIntyre, McKrae 및 관련 균주로부터 선택된다. HSV는 ICP6, ICP34.5, ICP47, UL24, UL55 및 UL56으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 결함이 있을 수 있다. 특정 구현예에서, ICP34.5 인코딩 유전자는 즉시 조기(IE) 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 US11 인코딩 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트에 의해 대체된다. 추가의 특정 구현예에서, HSV는 ΔZα 돌연변이 형태의 백시니아 바이러스 E3L 유전자를 포함한다.
일 구현예에서, HSV는 ICP6의 하나 이상의 기능에 결함이 있다. 예를 들어, ICP6 유전자의 돌연변이는 돌연변이에 따라, 상이한 기능의 상실을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, ICP6은 수용체-상호작용 단백질 호모타입 상호작용 모티프(RHIM) 도메인의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, ICP6은 C-말단에서 카스파제-8 결합을 저해하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, ICP6은 리보뉴클레오티드 환원효소(RR) 활성을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, HSV는 즉시 조기 유전자로서 US11 유전자를 발현한다. US11 단백질은 바이러스 라이프 사이클 후기의 단백질 번역 조절에 필요하다. US11의 즉시-조기 발현은 ICP34.5의 기능 상실 돌연변이를 보상할 수 있으므로, ICP34.5의 결실을 갖는 돌연변이 바이러스에서 단백질 합성의 셧오프에 대응하여 덜 약독화된 바이러스를 초래할 수 있다.
다른 구현예에서, 바이러스는 폭스바이러스 과, 예를 들어, 점액종 바이러스, 야바-유사 질병 바이러스, 라쿤폭스 바이러스, orf 바이러스 및 우두 바이러스로로부터 선택되는 바이러스에 속한다. 일부 구현예에서, 바이러스는 폭스바이러스 과의 코르도폭스바이러스 아과에 속한다. 일부 구현예에서, 바이러스는 코르도폭스바이러스 아과의 오르토폭스바이러스 속에 속한다. 일부 구현예에서, 바이러스는 오르토폭스바이러스 속의 백시니아 바이러스 종에 속한다. 일부 구현예에서, 백시니아 바이러스는 Dairenl, IHD-J, L-IPV, LC16M8, LC16MO, Lister, LIVP, Tashkent, WR 65-16, Wyeth, Ankara, Copenhagen, Tian Tan 및 WR로 이루어진 군으로부터 선택되는 균주이다.
일 구현예에서, 백시니아 바이러스는 티미딘 키나제(TK) 활성을 결여하도록 엔지니어링된다. 일 구현예에서, 백시니아 바이러스는 TK 활성을 감소시키거나 제거하는 J2R 유전자 내의 불활성화 돌연변이 또는 결실을 갖는다. J2R 유전자는 피리미딘 데옥시리보뉴클레오티드 합성을 위한 우회 경로의 부분을 형성하는 TK를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 백시니아 바이러스는 리보뉴클레오티드 환원효소(RR) 활성을 결여하도록 엔지니어링된다. 일부 구현예에서, 백시니아 바이러스는 RR 활성을 감소시키거나 제거하는 I4L 및 F4L 유전자로부터 선택되는 유전자 내의 불활성화 돌연변이 또는 결실을 갖는다. TK 활성 또는 RR 활성의 감소는 형질전환된 세포(예를 들어, 암 세포)에서 바이러스의 복제를 증가시킨다.
백시니아 바이러스는 아폽토시스, 네크롭토시스 및 파이롭토시스 신호전달을 방해하는 다수의 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, E3L 유전자에 의해 인코딩된 E3은 또한 백시니아 숙주 범위에 영향을 미치고 발병력에 기여하는 중요한 인터페론 길항제이다. E3은 인터페론-유도된 dsRNA 결합 단백질 PKR의 항-바이러스 활성을 길항시키고, C-말단 dsRNA 결합 도메인을 보유하는 25-kDa dsRNA 결합 단백질로서 처음 특성화되었다. E3의 N-말단 영역은 Z-DNA 결합 단백질과 유사성을 갖는 별개의 도메인을 형성하며, N- 및 C-말단 도메인은 둘 모두 바이러스 발병력에 기여한다. E3L 유전자를 결여한 돌연변이 백시니아로 감염된 HeLa 세포가 신속한 세포 사멸을 초래하였을 때, E3은 또한, 아폽토시스 저해제로서 설명되었다. 문헌[Veyer et al., 2017, Immunology Letters 186: 68-80]을 참조한다. 따라서, 일부 구현예에서, 백시니아 바이러스는 E3L 유전자에 결함이 있다. 일부 구현예에서, E3L 유전자는 암 세포의 감염 시에 네크롭토시스의 유도를 초래하는 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, 바이러스(예를 들어, HSV)는 마이크로RNA(miR) 표적 서열을 포함한다. miR 표적 서열은 종양 세포에서 바이러스 복제의 지연 없이, 정상 세포에서 바이러스 발병을 예방한다. miR 표적 서열은 하나 이상의 바이러스 유전자 좌, 예를 들어, 정상(예를 들어, 비-암) 세포에서 바이러스의 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자 내로 삽입될 수 있다. 바이러스에 포함시키기 위한 예시적인 마이크로RNA 표적 서열은 miR-124이며, 이는 신경 응용을 위해 특별히 적용된다. 다른 마이크로RNA 표적 서열은 대안적으로 다른 유형의 조직을 보호하기 위해 사용될 수 있으며, 원하는 조직 또는 세포 유형을 보호하기 위해 적합한 마이크로RNA 표적 서열을 선택하는 것은 당업계의 통상적인 기술 내에 있다. 예를 들어, miR-122 및 miR-199는 정상적인 간 세포에서 발현되지만, 원발성 간암에서는 발현되지 않으며; 이에 따라, miR-122 및/또는 miR-199 마이크로RNA 표적 서열 중 하나 또는 이의 조합은 간암의 치료를 위한 바이러스의 구현예에서 사용될 수 있다. 유사하게, miR-128 및/또는 miR-137 마이크로RNA에 대한 표적 서열은 정상의 뇌의 보호를 위하여 바이러스에서 사용될 수 있다. 예시적인 마이크로RNA 표적 서열은 마이크로RNA의 역 상보물일 수 있다.
일부 구현예에서, 마이크로RNA 표적 서열을 HSV 유전자의 3' 비번역 영역("UTR)에 포함시켜, 마이크로RNA의 존재 하에서 이 유전자를 침묵화시킨다. 다수의 카피(예를 들어, 2 카피, 3 카피, 4 카피, 5 카피, 6 카피 이상)의 마이크로RNA 표적 서열은 탠덤으로 삽입될 수 있다. 다수의 카피의 마이크로-RNA 표적 서열은 4개 이상의 뉴클레오티드(예를 들어, 8개 이상의 뉴클레오티드)의 스페이서에 의해 분리될 수 있다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 더 큰 간격(예를 들어, 약 8개 초과의 뉴클레오티드)이 증가된 안정성을 제공하는 것으로 여겨진다.
HSV 감염의 용해 효과로부터 비-암 세포를 보호하는 것을 돕기 위하여, 다수의 카피의 마이크로RNA 표적 서열을 당업자에게 알려져 있는 비-암 세포에서의 복제에 필수적인 HSV 유전자의 3' UTR 내에 삽입한다. 부위는 HSV 게놈 내의 이의 정상의(또는 고유의) 유전자좌 내의 마이크로RNA-표적화된 유전자의 3' UTR일 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스는 ICP4 유전자, 예를 들어, 둘 모두의 고유의 카피의 ICP4 유전자를 갖는 바이러스에서 하나 또는 둘 모두의 카피의 ICP4 유전자의 3'UTR 내로 삽입된 다수의 카피의 마이크로RNA 표적 서열을 포함하는 HSV이다.
특정 구현예에서, 바이러스의 게놈은 ICP47 유전자에 대한 프로모터와 함께, 이배체 유전자 ICP0, ICP34.5, LAT 및 ICP4의 각각의 하나의 카피를 포함하는 내부 반복(연결부) 영역의 결실을 함유한다. 다른 구현예에서, 연결부의 결실 대신에, 연결부 영역 내의 유전자, 특히 ICP0 및/또는 ICP47의 발현을 이들 유전자를 결실시키거나, 다르게는 이들의 제한된 돌연변이유발에 의해 침묵화시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스는 표적 세포, 예를 들어, 암 세포의 표면 상에 존재하는 분자(예를 들어, 단백질, 지질 또는 탄수화물)에 특이적인 리간드를 포함한다. 리간드를 바이러스 표면 상에 노출된 당단백질(예를 들어, HSV의 gD 또는 gC) 내로 혼입하여, 리간드를 갖는 원하는 세포의 표적화를 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 리간드를 gD의 잔기 1과 25 사이에에 혼입할 수 있다. GBM 및 다른 암 세포를 표적화하기 위한 예시적인 리간드는 EGFR 및 EGFRVIII, CD133, CXCR4, 암배아 항원(CEA), ClC-3/아넥신(annexin)-2/MMP-2, 인간 트랜스페린 수용체 및 EpCAM을 표적화하는 것들을 포함한다. 리간드는 이러한 수용체 또는 세포-표면 분자를 표적화할 수 있으며, 즉, 리간드는 이러한 수용체 또는 세포-표면 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. EGFR- 및 EGFRVIII-특이적인 리간드, 예컨대 항체(예를 들어, 단일 쇄 항체) 및 VHH(단일 도메인 항체)는 문헌에 기재되어 있다(문헌[Kuan et al. Int. J. Cancer, 88,962-69 (2000)]; 문헌[Wickstrand et al., Cancer Res., 55(14):3140-8 (1995)]; 문헌[Omid far et al., Tumor Biology, 25:296-305 (2004)] 참조; 또한, 문헌[Uchidaetal. Molecular Therapy, 21:561-9 (2013)] 참조; 또한, 문헌[Braidwood et al., Gene Then, 15, 1579-92 (2008)] 참조).
바이러스는 또한, 또는 대안적으로, 반드시 암-관련된 것은 아닌 다른 세포-표면 분자 또는 수용체 내로 리간드를 혼입시킴으로써 표적화될 수 있다. 예를 들어, 리간드는 천연 리간드(예를 들어, 성장 인자(예컨대 EGFR을 표적화할 수 있는 EGF, trkA를 표적화할 수 있는 NGF 등)), 펩티드 또는 비-펩티드 호르몬, 표적 분자에 결합하기 위해 선택한 펩티드(예를 들어, 설계된 안키린(ankyrin) 반복 단백질(DARPin)) 등으로부터의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 바이러스는 또한, 비-정규 수용체를 통한 벡터 유입을 용이하게 하는 돌연변이 형태의 gB 및/또는 gD를 포함할 수 있다(그리고 HSV 게놈 내의 이들 유전자 중 하나 또는 둘 모두에 이러한 돌연변이를 가질 수도 있다).
둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 바이러스는 매트릭스 메탈로프로테이나제, 예를 들어, 교모세포종의 기저막 및 세포외 매트릭스(ECM)의 주요 성분인 콜라겐 IV형을 분해하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 9("MMP9)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다(문헌[Mammato et al., Am. J. Pathol., 183(4): 1293-1305 (2013), doi: 10.1016/j.ajpath.2013.06.026. Epub 2013 Aug. 5]). 엔지니어링된 바이러스에 의한 매트릭스 메탈로프로테이나제의 발현은 측면 전파(lateral spread) 및 종양-사멸 활성의 향상으로 인하여, 바이러스에 의한 종양 세포의 감염을 향상시킨다. 바이러스의 측면 전파를 향상시키는 다른 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드도 또한 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자는 바이러스 유전자에 돌연변이를 포함하는 바이러스 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 바이러스는 ICP34.5 및 ICP47 유전자 내의 불활성화 돌연변이(예를 들어, 결실), ICP6의 RHIM 도메인 내의 불활성화 도메인, ZBP1, RIPK3 및 MLKL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HSV1이다. 추가의 특정 구현예에서, 바이러스는 ICP47의 불활성화 돌연변이(예를 들어, 결실), 델타-Zα1 돌연변이 형태의 백시니아 바이러스 E3L 유전자로의 ICP34.5의 대체, 및 ZBP1, RIPK3 및 MLKL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HSV1이다. 추가의 특정 구현예에서, 바이러스는 E3L 유전자의 Zα1 도메인 내의 돌연변이, 및 ZBP1, RIPK3 및 MLKL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백시니아 바이러스이다.
D. 폴리펩티드 전달 방법
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드의 조합은 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 특정 양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다: 각각의 타노트랜스미션 폴리펩티드가 TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제, FADD, TRADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, TNFSF 단백질, 및 이의 변이체(예를 들어, 기능성 단편)로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체.
특정 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서의 타노트랜스미션의 촉진 방법에 관한 것이며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 증가를 필요로 하는 대상체에서의 면역 반응의 증가 방법에 관한 것이며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에서 면역 반응을 증가시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암의 치료 방법에 관한 것이며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 암을 치료하기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
E. 담체
본 개시내용에 의해 제공되는 조성물, 방법 및 전달 시스템(예를 들어, DNA, RNA, 바이러스 및 폴리펩티드 전달 시스템)은 임의의 적합한 담체를 사용할 수 있다. 담체 및 약제학적 작용제의 전달에 대한 일반적인 고려사항은 예를 들어, 문헌[Delivery Technologies for Biopharmaceuticals: Peptides, Proteins, Nucleic acids and Vaccines (Lene Jorgensen and Hanne Morck Nielson, Eds.) Wiley; 1st edition (December 21, 2009)]; 및 문헌[Vargason et al. 2021. Nat Biomed Eng 5, 951-967]에서 찾을 수 있다.
담체의 비-제한적인 예에는 탄수화물 담체(예를 들어, 무수물-변형된 피토글리코겐 또는 글리코겐-유형 물질, GalNAc), 나노입자(예를 들어, 구축물, 금 나노입자, 실리카 나노입자를 캡슐화하거나 이에 공유 결합된 나노입자), 지질 입자(예를 들어, 리포좀, 지질 나노입자), 양이온성 담체(예를 들어, 양이온성 리포폴리머 또는 트랜스펙션 시약), 푸소좀, 무핵 세포(예를 들어, 생체외 분화된 망상적혈구), 유핵 세포, 엑소좀, 단백질 담체(예를 들어, 구축물에 공유 결합된 단백질), 펩티드(예를 들어, 세포-투과 펩티드), 물질(예를 들어, 그래핀 옥시드), 단일의 순수 지질(예를 들어, 콜레스테롤), DNA 오리가미(origami)(예를 들어, DNA 정사면체(tetrahedron))가 포함된다.
일 구현예에서, 본원에서 기재되는 조성물, 구축물 및 시스템은 리포좀 또는 다른 유사한 소낭으로 제형화될 수 있다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싼 단층 또는 다층 지질 이중층 및 상대적으로 비투과성인 외부 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구형 소낭 구조이다. 리포좀은 음이온성, 중성 또는 양이온성일 수 있다. 리포좀은 생체적합성, 무독성이며, 친수성 및 친지성 약물 분자를 모두 전달하고, 혈장 효소에 의한 분해로부터 이들의 카고를 보호하고, 이들의 로드(load)를 생물학적 막 및 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로질러 수송할 수 있다(예를 들어, 검토를 위해, 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011 doi:101155/2011/469679] 참조).
소낭은 몇몇 상이한 유형의 지질로 제조될 수 있지만; 인지질이 약물 담체로서 리포좀을 생성하기 위해 가장 일반적으로 사용된다. 다층 소낭 지질의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 다층 소낭 지질 제조에 관한 교시가 본원에 참조로 포함되는, 미국 특허 제6,693,086호 참조). 지질막이 수용액과 혼합되는 경우 소낭 형성은 자발적일 수 있지만, 이는 또한 균질화기, 초음파분쇄기, 또는 압출 장치를 사용함으로써 진탕 형태로 힘을 가하여 촉진될 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011 doi:101155/2011/469679] 참조). 압출된 지질은 압출된 지질 제조에 관한 교시가 본원에 참조로 포함되는, 문헌[Templeton et al, Nature Biotech, 15:647-652, 1997]에 기재된 바와 같이, 감소하는 크기의 필터를 통한 압출에 의해 제조될 수 있다.
엑소좀은 또한 본원에서 기재되는 조성물 및 시스템을 위한 약물 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 검토를 위해, 문헌[Ha et al July 2016 Acta Pharmaceutica Sinica B Volume 6, Issue 4, Pages 287-296; https://doiorg/101016/japsb201602001]을 참조한다.
생체외 분화된 적혈구는 또한, 본원에 기재된 작용제를 위한 담체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제WO2015073587호; 제WO2017123646호; 제WO2017123644호; 제WO2018102740호; 제wO2016183482호; 제WO2015153102호; 제WO2018151829호; 제WO2018009838호; 문헌[Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136]; 미국 특허 제9,644,180호; 문헌[Huang et al. 2017. Nature Communications 8: 423]; 문헌[Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136]을 참조한다.
예를 들어, 제WO2018208728호에 기재된 바와 같은 푸소좀 조성물은 또한, 본원에 기재된 조성물 및 구축물을 전달하기 위한 담체로서 사용될 수 있다.
지질 나노입자
특정 구현예에서, 담체는 지질 나노입자(LNP)이다. 지질 나노입자는 일부 구현예에서, 하나 이상의 이온성 지질, 예컨대 비-양이온성 지질(예를 들어, 중성 또는 음이온성 또는 양쪽이온성 지질); 하나 이상의 컨쥬게이트된 지질(예컨대 PEG-컨쥬게이트된 지질 또는 전체가 본원에 참조로 포함되는 제WO2019217941호의 표 5에 기재된 폴리머에 컨쥬게이트된 지질); 하나 이상의 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)을 포함한다.
나노입자 제형(예를 들어, 지질 나노입자)에서 사용될 수 있는 지질은 예를 들어, 참조로 포함되는 제WO2019217941호의 표 4에 기재된 것들을 포함하며-예를 들어, 지질-함유 나노입자는 제WO2019217941호의 표 4의 지질 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 지질 나노입자는 추가의 요소, 예컨대 폴리머, 예컨대 참조로 포함되는 제WO2019217941호의 표 5에 기재된 폴리머를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트된 지질은 존재하는 경우, PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대 l-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), PEG화된 포스파티딜에탄올로아민(PEG-PE), PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대 4-0-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-l-0-(w-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카밤, N-(카보닐-메톡시폴리 에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염, 및 제WO2019051289호(참조로 포함됨)의 표 2에 기재된 것들 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자 내로 혼입될 수 있는 스테롤은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체 중 하나 이상, 예컨대 참조로 포함되는 제W02009/127060호 또는 제US2010/0130588호의 것들을 포함한다. 추가의 예시적인 스테롤은 본원에 참조로 포함되는 문헌[Eygeris et al (2020), dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386]에 기재된 것들을 포함하는 피토스테롤을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 입자는 이온화 가능한 지질, 비-양이온성 지질, 입자의 응집을 저해하는 컨쥬게이트된 지질, 및 스테롤을 포함한다. 이들 구성요소의 양은 독립적으로, 그리고 원하는 특성을 달성하도록 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 90 mol%의 양(다른 구현예에서, 이는 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20 내지 70%(mol), 30 내지 60%(mol) 또는 40 내지 50%(mol); 약 50 mol% 내지 약 90 mol%일 수 있음)의 이온화 가능한 지질, 총 지질의 약 5 mol% 내지 약 30 mol%의 양의 비-양이온성 지질, 총 지질의 약 0.5 mol% 내지 약 20 mol%의 양의 컨쥬게이트된 지질 및 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 50 mol%의 양의 스테롤을 포함한다. 총 지질 대 핵산의 비는 원하는 대로 달라질 수 있다. 예를 들어, 총 지질 대 핵산(질량 또는 중량) 비는 약 10: 1 내지 약 30: 1일 수 있다.
일부 구현예에서, 지질 대 핵산 비(질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 수 있다. 지질 및 핵산의 양은 원하는 N/P 비, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 N/P 비를 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 지질 나노입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL의 범위일 수 있다.
본원에 기재된 조성물, 예를 들어, 본원에 기재된 핵산(예를 들어, RNA 또는 DNA)의 전달을 위한 지질 나노입자를 형성하기 위해 (예를 들어, 다른 지질 구성성분과 조합하여) 사용될 수 있는 지질 화합물의 일부 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
[화학식 i]
일부 구현예에서, 화학식 i을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, RNA 또는 DNA) 조성물을 세포로 전달하는 데 사용된다.
[화학식 ii]
일부 구현예에서, 화학식 ii를 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, RNA 또는 DNA) 조성물을 세포로 전달하는 데 사용된다.
[화학식 iii]
일부 구현예에서, 화학식 iii을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA) 조성물을 세포로 전달하는 데 사용된다.
[화학식 iv]
[화학식 v]
일부 구현예에서, 화학식 v를 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, RNA 또는 DNA) 조성물을 세포로 전달하는 데 사용된다.
[화학식 vi]
일부 구현예에서, 화학식 vi을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA) 조성물을 세포로 전달하는 데 사용된다.
[화학식 vii]
[화학식 viii]
일부 구현예에서, 화학식 viii을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA) 조성물을 세포로 전달하는 데 사용된다.
[화학식 ix]
일부 구현예에서, 화학식 ix를 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA) 조성물을 세포로 전달하는 데 사용된다.
[화학식 x]
상기 식에서,
X1은 O, NR1 또는 직접적인 결합이고, X2는 C2-5 알킬렌이고, X3은 C(=0) 또는 직접적인 결합이고, R1은 H 또는 Me이고, R3은 C1-3알킬이고, R2는 C1-3 알킬이거나, R2는 이것이 부착된 질소 원자 및 X2의 1 내지 3개의 탄소 원자와 함께, 4-, 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, X1은 NR1이고, R1 및 R2는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성하고, Y1은 C2-12 알킬렌이고, Y2는
n은 0 내지 3이고, R4는 C1-15 알킬이고, Z1은 C1-6 알킬렌 또는 직접적인 결합이고,
Z2는 
이거나, 부재하되, 단, Z1이 직접적인 결합이면, Z2는 부재하고;
R5는 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이며, R6은 C5-9 알킬 또는 C6-10 알콕시이며, W는 메틸렌 또는 직접적인 결합이며, R7은 H 또는 Me이되, 단, R3 및 R2가 C2 알킬이고, X1이 O이고, X2가 선형 C3 알킬렌이고, X3이 C(=0)이고, Y1이 선형 Ce 알킬렌이고, (Y2 )n-R4가
R4가 선형 C5 알킬이고, Z1이 C2 알킬렌이고, Z2가 부재하고, W가 메틸렌이고, R7이 H이면, R5 및 R6은 Cx 알콕시가 아니다.
일부 구현예에서, 화학식 xii를 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA) 조성물을 세포로 전달하는 데 사용된다.
[화학식 xi]
일부 구현예에서, 화학식 xi을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA) 조성물을 세포로 전달하는 데 사용된다.
[화학식 xii]
[화학식 xiii]
[화학식 xiv]
일부 구현예에서, LNP는 화학식 xiii의 화합물 및 화학식 xiv의 화합물을 포함한다.
[화학식 xv]
일부 구현예에서, 화학식 xv를 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA) 조성물을 세포로 전달하는 데 사용된다.
[화학식 xvi]
일부 구현예에서, 화학식 xvi을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA) 조성물을 세포로 전달하는 데 사용된다.
[화학식 xvii]
[화학식 xviii(a)]
[화학식 xviii(b)]
[화학식 xix]
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물, 예를 들어, 본원에 기재된 핵산(예를 들어, RNA 또는 DNA)의 전달을 위해 지질 나노입자를 형성하기 위해 사용되는 지질 화합물은 하기 반응 중 하나에 의해 제조된다:
[화학식 xx(a)]
[화학식 xx(b)]
일부 구현예에서, 화학식 xxi을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA) 조성물을 세포로 전달하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 화학식 xxi의 LNP는 제WO2021113777호에 기재된 LNP(예를 들어, 화학식 1의 지질, 예컨대 제WO2021113777호의 표 1의 지질)이다.
[화학식 xxi]
상기 식에서,
각각의 n은 독립적으로 2 내지 15의 정수이며; L1 및 L3은 각각 독립적으로 -OC(O)-* 또는 -C(O)O-*이며, "*"는 R1 또는 R3에 대한 부착점을 나타내며;
R1 및 R3은 각각 독립적으로 옥소, 할로, 하이드록시, 시아노, 알킬, 알케닐, 알데히드, 헤테로사이클릴알킬, 하이드록시알킬, 디하이드록시알킬, 하이드록시알킬아미노알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 디알킬아미노알킬, (헤테로사이클릴)(알킬)아미노알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 알킬헤테로아릴, 알키닐, 알콕시, 아미노, 디알킬아미노, 아미노알킬카보닐아미노, 아미노카보닐알킬아미노, (아미노카보닐알킬)(알킬)아미노, 알케닐카보닐아미노, 하이드록시카보닐, 알킬옥시카보닐, 아미노카보닐, 아미노알킬아미노카보닐, 알킬아미노알킬아미노카보닐, 디알킬아미노알킬아미노카보닐, 헤테로사이클릴알킬아미노카보닐, (알킬아미노알킬)(알킬)아미노카보닐, 알킬아미노알킬카보닐, 디알킬아미노알킬카보닐, 헤테로사이클릴카보닐, 알케닐카보닐, 알키닐카보닐, 알킬술폭시드, 알킬술폭시드알킬, 알킬 술포닐 및 알킬 술폰알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환되는 선형 또는 분지형 C9-C20 알킬 또는 C9-C20 알케닐이며;
R2는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
일부 구현예에서, 화학식 xxii를 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA) 조성물을 세포로 전달하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 화학식 xxii의 LNP는 제WO2021113777호에 기재된 LNP(예를 들어, 화학식 2의 지질, 예컨대 제WO2021113777호의 표 2의 지질)이다.
[화학식 xxii]
상기 식에서,
각각의 n은 독립적으로 1 내지 15의 정수이며;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
R3은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
일부 구현예에서, 화학식 xxiii을 포함하는 LNP는 본원에 기재된 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA) 조성물을 세포로 전달하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 화학식 xxiii의 LNP는 제WO2021113777호에 기재된 LNP(예를 들어, 화학식 3의 지질, 예컨대 제WO2021113777호의 표 3의 지질)이다.
[화학식 xxiii]
상기 식에서,
X는 -O-, -S-, 또는 -OC(O)-*로부터 선택되며, *는 R1에 대한 부착점을 나타내며;
R1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
R2는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 또는 단백질)은 이온화 가능한 지질을 포함하는 LNP에 제공된다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제US9,867,888호(본원에 전체가 참조로 포함됨)의 실시예 1에 기재된 바와 같은; 헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)(6-옥소-6-(운데실옥시)헥실)아미노)옥타노에이트(SM-102)이다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제WO2015/095340호(본원에 전체가 참조로 포함됨)의 실시예 13에서 합성되는 바와 같은; 9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트(LP01)이다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제US2012/0027803호(본원에 전체가 참조로 포함됨)의 실시예 7, 8 또는 9에서 합성되는 바와 같은; 디((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트(L319)이다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제WO2010/053572호(본원에 전체가 참조로 포함됨)의 실시예 14 및 16에서 합성되는 바와 같은; 1,1'-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)(2-하이드록시도데실) 아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸)아잔디일)비스(도데칸-2-올)(C12-200)이다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 이미다졸 콜레스테롤 에스테르(ICE) 지질(3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-lH- 사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로파노에이트, 예를 들어, 제WO2020/106946호(본원에 전체가 참조로 포함됨)로부터의 구조 I이다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 양이온성 지질, 이온화 가능한 양이온성 지질, 예를 들어, pH에 따라 양으로 하전된 또는 중성 형태로 존재할 수 있는 양이온성 지질 또는 용이하게 양성자화될 수 있는 아민-함유 지질일 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 예를 들어, 생리학적 조건 하에서 양으로 하전될 수 있는 지질이다. 예시적인 양이온성 지질은 양전하를 보유하는 하나 이상의 아민기(들)를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 입자는 중성 지질, 이온화 가능한 아민-함유 지질, 생분해성 알킨 지질, 스테롤, 고도불포화된 지질을 포함하는 인지질, 구조적 지질(예를 들어, 스테롤), PEG, 콜레스테롤 및 폴리머 컨쥬게이트된 지질 중 하나 이상을 갖는 제형에서 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 이온화 가능한 양이온성 지질일 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 예시적인 양이온성 지질은 6.0을 초과하는 유효 pKa를 가질 수 있다. 구현예에서, 지질 나노입자는 제1 양이온성 지질과 상이한(예를 들어, 제1 유효 pKa보다 더 큰) 유효 pKa를 갖는 제2 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 지질 나노입자는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 또는 이와 회합된, 40 내지 60 mol 퍼센트의 양이온성 지질, 중성 지질, 스테로이드, 폴리머 컨쥬게이트된 지질 및 치료제, 예를 들어, 본원에 기재된 핵산(예를 들어, RNA(예를 들어, DNA 또는 RNA))을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 양이온성 지질과 동시-제형화된다. 핵산은 LNP, 예를 들어, 양이온성 지질을 포함하는 LNP의 표면에 흡수될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 LNP, 예를 들어, 양이온성 지질을 포함하는 LNP에 캡슐화될 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 예를 들어, 표적화제로 코팅된 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 구현예에서, LNP 제형은 생분해성이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 지질, 예를 들어, 화학식 i, ii, ii, vii 및/또는 ix를 포함하는 지질 나노입자는 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 100%의 RNA 분자를 캡슐화한다.
지질 나노입자 제형에서 사용될 수 있는 예시적인 이온화 가능한 지질은 제한 없이, 본원에 참조로 포함되는 제WO2019051289호의 표 1에 열거된 것들을 포함한다. 추가의 예시적인 지질은 제한 없이, 하기의 화학식 중 하나 이상을 포함한다: 제US2016/0311759호의 X; 제US20150376115호 또는 제US2016/0376224호의 I; 제US20160151284호의 I, II 또는 III; 제US20170210967호의 I, IA, II 또는 IIA; 제US20150140070호의 I-c; 제US2013/0178541호의 A; 제US2013/0303587호 또는 제US2013/0123338호의 I; 제US2015/0141678호의 I; 제US2015/0239926호의 II, III, IV 또는 V; 제US2017/0119904호의 I; 제WO2017/117528호의 I 또는 II; 제US2012/0149894호의 A; 제US2015/0057373호의 A; 제WO2013/116126호의 A; 제US2013/0090372호의 A; 제US2013/0274523호의 A; 제US2013/0274504호의 A; 제US2013/0053572호의 A; 제W02013/016058호의 A; 제W02012/162210호의 A; 제US2008/042973호의 I; 제US2012/01287670호의 I, II, III 또는 IV; 제US2014/0200257호의 I 또는 II; 제US2015/0203446호의 I, II 또는 III; 제US2015/0005363호의 I 또는 III; 제US2014/0308304호의 I, IA, IB, IC, ID, II, IIA, IIB, IIC, IID 또는 III-XXIV; 제US2013/0338210호의; 제W02009/132131호의 I, II, III 또는 IV; 제US2012/01011478호의 A; 제US2012/0027796호의 I 또는 XXXV; 제US2012/0058144호의 XIV 또는 XVII; 제US2013/0323269호의; 제US2011/0117125호의 I; 제US2011/0256175호의 I, II 또는 III; 제US2012/0202871호의 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII; 제US2011/0076335호의 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, X, XII, XIII, XIV, XV 또는 XVI; 제US2006/008378호의 I 또는 II; 제US2013/0123338호의 I; 제US2015/0064242호의 I 또는 X-A-Y-Z; 제US2013/0022649호의 XVI, XVII 또는 XVIII; 제US2013/0116307호의 I, II 또는 III; 제US2013/0116307호의 I, II 또는 III; 제US2010/0062967호의 I 또는 II; 제US2013/0189351호의 I-X; 제US2014/0039032호의 I; 제US2018/0028664호의 V; 제US2016/0317458호의 I; 제US2013/0195920호의 I; 제US10,221,127호의 5, 6 또는 10; 제WO2018/081480호의 III-3; 제WO2020/081938호의 I-5 또는 I-8; 제US9,867,888호의 18 또는 25; 제US2019/0136231호의 A; 제WO2020/219876호의 II; 제US2012/0027803호의 1; 제US2019/0240349호의 OF-02; 제US10,086,013호의 23; 문헌[Miao et al (2020)]의 cKK-E12/A6; 제WO2010/053572호의 C12-200; 문헌[Dahlman et al (2017)]의 7C1; 문헌[Whitehead et al]의 304-O13 또는 503-O13; 제US9,708,628호의 TS-P4C2; 제WO2020/106946호의 I; 제WO2020/106946호의 I; 및 제WO2021/113777호의 (1), (2), (3), 또는 (4). 예시적인 지질은 제WO2021/113777호의 표 1 내지 16 중 어느 하나의 지질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제WO2019051289A9호(전체가 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 9에 기재된 바와 같은 MC3(6Z,9Z,28Z,3 lZ)-헵타트리아콘타-6,9,28,3l-테트라엔-l9-일-4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제WO2019051289A9호(전체가 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 10에 기재된 바와 같은 지질 ATX-002이다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제WO2019051289A9호(전체가 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 11에 기재된 바와 같은 (l3Z,l6Z)-A,A-디메틸-3-노닐도코사-l3,l6-디엔-l-아민(화합물 32)이다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 예를 들어, 제WO2019051289A9호(전체가 본원에 참조로 포함됨)의 실시예 12에 기재된 바와 같은 화합물 6 또는 화합물 22이다.
예시적인 비-양이온성 지질은 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대 16-O-모노메틸 PE), 디메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소화된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 난(egg) 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 라이소레시틴, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 난 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 라이소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린 또는 이의 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 디아실포스파티딜콜린 및 디아실포스파티딜에탄올아민 인지질도 또한 사용될 수 있는 것이 이해된다. 이들 지질 내의 아실기는 바람직하게는 C10-C24 탄소 쇄를 갖는 지방산, 예를 들어, 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 또는 올레오일로부터 유래된 아실기이다. 추가의 예시적인 지질은, 특정 구현예에서, 제한 없이, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Kim et al. (2020) dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386]에 기재된 것들을 포함한다. 이러한 지질은 일부 구현예에서, mRNA(예를 들어, DGTS)로의 간 트랜스펙션을 개선시키는 것으로 관찰된 식물 지질을 포함한다.
지질 나노입자에 사용하기에 적합한 비-양이온성 지질의 다른 예는 제한 없이, 인을 함유하지 않는 지질, 예컨대, 예를 들어, 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤 리시놀레에이트, 헥사데실 스테아레이트, 이소프로필 미리스테이트, 양쪽성 아크릴계 폴리머, 트리에탄올아민-라우릴 술페이트, 알킬-아릴 술페이트 폴리에틸옥실화 지방산 아미드, 디옥타데실 디메틸 암모늄 브로마이드, 세라미드, 스핑고미엘린 등을 포함한다. 다른 비-양이온성 지질은 제WO2017/099823호 또는 미국 특허 공개 제US2018/0028664호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 이들 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 비-양이온성 지질은 전체가 본원에 참조로 포함되는 제US2018/0028664호의 화학식 I, II 또는 IV의 화합물 또는 올레산이다. 비-양이온성 지질은 예를 들어, 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0 내지 30%(mol)를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-양이온성 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 5 내지 20%(mol) 또는 10 내지 15%(mol)이다. 구현예들에서, 이온화 가능한 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1의 범위(예를 들어, 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1 또는 8:1)이다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 임의의 인지질을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 막 온전성을 제공하기 위해 스테롤과 같은 구성성분을 추가로 포함할 수 있다. 지질 나노입자에 사용될 수 있는 하나의 예시적인 스테롤은 콜레스테롤 및 이의 유도체이다. 콜레스테롤 유도체의 비제한적인 예에는, 5a-콜레스탄올, 53-코프로스탄올, 콜레스테릴-(2'-하이드록시)-에틸 에테르, 콜레스테릴-(4'-하이드록시)-부틸 에테르 및 6-케토콜레스탄올과 같은 극성 유사체; 5a-콜레스탄, 콜레스테논, 5a-콜레스타논, 5p-콜레스타논 및 콜레스테릴 데카노에이트와 같은 비극성 유사체; 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 구현예에서, 콜레스테롤 유도체는 극성 유사체, 예를 들어, 콜레스테릴-(4'-하이드록시)-부틸 에테르이다. 예시적인 콜레스테롤 유도체는 PCT 공개 제W02009/127060호 및 미국 특허 공개 제US2010/0130588호에 기재되어 있으며, 이의 각각은 이들 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 스테롤과 같은 막 온전성을 제공하는 구성성분은, 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0 내지 50%(mol)(예를 들어, 0 내지 10%, 10 내지 20%, 20 내지 30%, 30 내지 40% 또는 40 내지 50%)를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 구성성분은 지질 나노입자의 총 지질 함량의 20% 내지 50%(mol) 30 내지 40%(mol)이다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 컨쥬게이트된 지질 분자를 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들은 지질 나노입자의 응집을 저해하고/하거나 입체 안정화를 제공하기 위해 사용된다. 예시적인 컨쥬게이트된 지질에는, 비제한적으로, PEG-지질 컨쥬게이트, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 컨쥬게이트, 폴리아미드-지질 컨쥬게이트(예컨대, ATTA-지질 컨쥬게이트), 양이온성 폴리머-지질(CPL) 컨쥬게이트 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이트된 지질 분자는 PEG-지질 컨쥬게이트, 예를 들어 (메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-컨쥬게이트된 지질이다.
예시적인 PEG-지질 컨쥬게이트에는, 비제한적으로, PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대, 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), PEG화된 포스파티딜에탄올로아민(PEG-PE), PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대, 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(w-메톡시(폴리에톡시)에틸) 부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카르밤, N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 추가의 예시적인 PEG-지질 컨쥬게이트는, 예를 들어 제US5,885,6l3호, 제US6,287,59l호, 제US2003/0077829호, 제US2003/0077829호, 제US2005/0175682호, 제US2008/0020058호, 제US2011/0117125호, 제US2010/0130588호, 제US2016/0376224호, 제US2017/0119904호 및 제US/099823호에 기재되어 있으며, 모든 상기 문헌들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 내용 전체가 본원에 참조로 포함되는 제US2018/0028664호의 화학식 III, III-a-I, III-a-2, III-b-1, III-b-2 또는 V의 화합물이다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 둘 모두의 내용의 전체가 본원에 참조로 포함되는 제US20150376115호 또는 제US2016/0376224호의 화학식 II이다. 일부 구현예에서, PEG-DAA 컨쥬게이트는, 예를 들어 PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필일 수 있다. PEG-지질은 PEG-DMG, PEG-디라우릴글리세롤, PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테릴글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글리카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕시벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르) 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 중 하나 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 PEG-DMG, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]을 포함한다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 하기로부터 선택되는 구조를 포함한다:
일부 구현예에서, PEG 이외의 분자와 컨쥬게이트된 지질이 또한 PEG-지질 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 컨쥬게이트, 폴리아미드-지질 컨쥬게이트(예컨대, ATTA-지질 컨쥬게이트) 및 양이온성 폴리머-지질(GPL) 컨쥬게이트가 PEG-지질 대신에 또는 이에 더하여 사용될 수 있다.
예시적인 컨쥬게이트된 지질, 즉, PEG-지질, (POZ)-지질 컨쥬게이트, ATTA-지질 컨쥬게이트 및 양이온성 폴리머-지질은, 모든 내용의 전체가 본원에 참조로 포함되는 제WO2019051289A9호의 표 2에 열거된 PCT 및 LIS 특허 출원에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, PEG 또는 컨쥬게이트된 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0 내지 20%(mol)를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, PEG 또는 컨쥬게이트된 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0.5 내지 10% 또는 2 내지 5%(mol)이다. 이온화 가능한 지질, 비-양이온성-지질, 스테롤 및 PEG/컨쥬게이트된 지질의 몰비는 필요에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 지질 입자는 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 30 내지 70%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 0 내지 60%의 콜레스테롤, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 0 내지 30%의 비-양이온성-지질 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 1 내지 10%의 컨쥬게이트된 지질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 30 내지 40%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 40 내지 50%의 콜레스테롤 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 10 내지 20%의 비-양이온성-지질을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 조성물은 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 50 내지 75%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 20 내지 40%의 콜레스테롤, 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 5 내지 10%의 비-양이온성-지질 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 1 내지 10%의 컨쥬게이트된 지질이다. 조성물은 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 60 내지 70%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 25 내지 35%의 콜레스테롤, 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 5 내지 10%의 비-양이온성-지질을 함유할 수 있다. 조성물은 또한, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 최대 90%의 이온화 가능한 지질 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 2 내지 15%의 비-양이온성 지질을 함유할 수 있다. 제형은 또한, 예를 들어, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 8 내지 30%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 5 내지 30%의 비-양이온성 지질 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 0 내지 20%의 콜레스테롤; 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 4 내지 25% 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 4 내지 25%의 비-양이온성 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 2 내지 25%의 콜레스테롤, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 10 내지 35%의 컨쥬게이트 지질 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 5%의 콜레스테롤; 또는 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 2 내지 30%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 2 내지 30%의 비-양이온성 지질, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 1 내지 15%의 콜레스테롤, 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 2 내지 35%의 컨쥬게이트 지질 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 1 내지 20%의 콜레스테롤; 또는 심지어 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 최대 90%의 이온화 가능한 지질 및 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 2 내지 10%의 비-양이온성 지질 또는 심지어 조성물의 총 중량 또는 몰 기준으로 100%의 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노입자 제형일 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 입자 제형은 50:10:38.5:1.5의 몰비의 이온화 가능한 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 지질 입자 제형은 60:38.5:1.5의 몰비의 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 입자는 이온화 가능한 지질, 비-양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 PEG화 지질을 포함하며, 지질의 몰비는 이온화 가능한 지질의 경우 20 내지 70 몰%의 범위(목표는 40 내지 60 몰%임)이고, 비양이온성 지질의 몰%는 0 내지 30몰%의 범위(목표는 0 내지 15몰%임)이고, 스테롤의 몰%는 20 내지 70 몰%의 범위(목표는 30 내지 50 몰%임)이고, PEG화된 지질의 몰%는 1 내지 6 몰%의 범위(목표는 2 내지 5 몰%임)이다.
일부 구현예에서, 지질 입자는 이온화 가능한 지질 / 비-양이온성-지질 / 스테롤 / 컨쥬게이트된 지질을 50:10:38.5:1.5의 몰비로 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가의 화합물이 또한 포함될 수 있다. 이들 화합물은 개별적으로 투여될 수 있거나, 추가의 화합물은 본 발명의 지질 나노입자에 포함될 수 있다. 다시 말하면, 지질 나노입자는 핵산에 더하여 다른 화합물 또는 적어도 제1 핵산과 상이한 제2 핵산을 함유할 수 있다. 제한 없이, 다른 추가의 화합물은 소형 또는 대형 유기 또는 무기 분자, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 다당류, 펩티드, 단백질, 펩티드 유사체 및 이의 유도체, 펩티드 모방체, 핵산, 핵산 유사체 및 유도체, 생물학적 물질로 제조된 추출물, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, LNP는 생분해성 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,l2Z)-옥타데카-9,l2-디에노에이트)로도 지칭되는 (9Z,l2Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,l2-디에노에이트 또는 또 다른 이온화 가능한 지질을 포함한다. 예를 들어, 제WO2019/067992호, 제WO/2017/173054호, 제WO2015/095340호 및 제WO2014/136086호 및 그 안에 제공되는 참고문헌의 리간드를 참조한다. 일부 구현예에서, LNP 지질의 맥락에서 용어 양이온성 및 이온화 가능한은 상호교환 가능하며, 예를 들어, 이온화 가능한 지질은 pH에 따라 양이온성이다.
일부 구현예에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 수십 nm 내지 수백 nm일 수 있으며, 예를 들어, 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 약 40 nm 내지 약 150 nm, 예컨대 약 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm 또는 150 nm일 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 90 nm, 약 50 nm 내지 약 80 nm, 약 50 nm 내지 약 70 nm, 약 50 nm 내지 약 60 nm, 약 60 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 90 nm, 약 60 nm 내지 약 80 nm, 약 60 nm 내지 약 70 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 70 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm 또는 약 90 nm 내지 약 100 nm일 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 약 70 nm 내지 약 100 nm일 수 있다. 특정 구현예에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 약 80 nm일 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 약 100 nm일 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 제형의 평균 LNP 직경은 약 1 mm 내지 약 500 mm, 약 5 mm 내지 약 200 mm, 약 10 mm 내지 약 100 mm, 약 20 mm 내지 약 80 mm, 약 25 mm 내지 약 60 mm, 약 30 mm 내지 약 55 mm, 약 35 mm 내지 약 50 mm 또는 약 38 mm 내지 약 42 mm의 범위이다.
LNP는 일부 예에서, 상대적으로 균질할 수 있다. 다분산 지수는 LNP의 균질성, 예를 들어, 지질 나노입자의 입자 크기 분포를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 작은(예를 들어, 0.3 미만) 다분산 지수는 일반적으로 좁은 입자 크기 분포를 나타낸다. LNP는 약 0 내지 약 0.25, 예컨대 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24 또는 0.25의 다분산 지수를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, LNP의 다분산 지수는 약 0.10 내지 약 0.20일 수 있다.
LNP의 제타 전위는 조성물의 계면 동전위를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제타 전위는 LNP의 표면 전하를 설명할 수 있다. 더 고도로 하전된 종은 신체의 세포, 조직, 및 기타 요소와 바람직하지 않게 상호작용할 수 있기 때문에, 상대적으로 낮은 양전하 또는 음전하를 갖는 지질 나노입자가 일반적으로 바람직하다. 일부 구현예에서, LNP의 제타 전위는 약 -10 mV 내지 약 +20 mV, 약 -10 mV 내지 약 +15 mV, 약 -10 mV 내지 약 +10 mV, 약 -10 mV 내지 약 +5 mV, 약 -10 mV 내지 약 0 mV, 약 -10 mV 내지 약 -5 mV, 약 -5 mV 내지 약 +20 mV, 약 -5 mV 내지 약 +15 mV, 약 -5 mV 내지 약 +10 mV, 약 -5 mV 내지 약 +5 mV, 약 -5 mV 내지 약 0 mV, 약 0 mV 내지 약 +20 mV, 약 0 mV 내지 약 +15 mV, 약 0 mV 내지 약 +10 mV, 약 0 mV 내지 약 +5 mV, 약 +5 mV 내지 약 +20 mV, 약 +5 mV 내지 약 +15 mV 또는 약 +5 mV 내지 약 +10 mV일 수 있다.
단백질 및/또는 핵산의 캡슐화의 효율은 제공되는 초기의 양에 비하여, 제조 후에 LNP와 회합되거나 또는 캡슐화된 단백질 및/또는 핵산의 양을 설명한다. 캡슐화 효율은 높은(예를 들어, 100%에 가까운) 것이 바람직하다. 캡슐화 효율은, 예를 들어, 지질 나노입자를 하나 이상의 유기 용매 또는 세제로 분해(breaking up)하기 전과 후에 상기 지질 나노입자를 함유하는 용액에서 단백질 또는 핵산의 양을 비교함으로써 측정될 수 있다. 음이온 교환 수지를 사용하여, 용액 중 유리 단백질 또는 핵산(예를 들어, RNA)의 양을 측정할 수 있다. 형광은 용액 중 유리 단백질 및/또는 핵산(예를 들어, RNA)의 양을 측정하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 지질 나노입자의 경우, 단백질 및/또는 핵산의 캡슐화 효율은 적어도 50%, 예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 캡슐화 효율은 적어도 80%일 수 있다. 일부 구현예에서, 캡슐화 효율은 적어도 90%일 수 있다. 일부 구현예에서, 캡슐화 효율은 적어도 95%일 수 있다.
LNP는 선택적으로 하나 이상의 코팅을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, LNP는 코팅을 갖는 캡슐, 필름 또는 정제로 제형화될 수 있다. 본원에 기재된 조성물을 포함하는 캡슐, 필름 또는 정제는 임의의 유용한 크기, 인장 강도, 경도 또는 밀도를 가질 수 있다.
LNP의 추가의 예시적인 지질, 제형, 방법 및 특성화는 각각의 전체가 본원에 참조로 포함되는 제WO2020/061457호 및 제WO2021/113777호에 교시되어 있다. LNP의 추가의 예시적인 지질, 제형, 방법 및 특성화는 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Hou et al. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater (2021). doi.org/10.1038/s41578-021-00358-0]에 교시되어 있다(예를 들어, 문헌[Hou et al.]의 도 2의 예시적인 지질 및 지질 유도체 참조).
일부 구현예에서, 시험관내 또는 생체외 세포 리포펙션은 리포펙타민 메신저맥스(Lipofectamine MessengerMax)(써모 피셔(Thermo Fisher)) 또는 TransIT-mRNA 트랜스펙션 시약(미루스 바이오(Mirus Bio))을 사용하여 수행된다. 특정 구현예에서, LNP는 GenVoy_ILM 이온화 가능한 지질 믹스(프리시젼 나노시스템즈(Precision NanoSystems))를 사용하여 제형화된다. 특정 구현예에서, LNP는 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA) 또는 디리놀레일메틸-4-디메틸아미노부티레이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)를 사용하여 제형화되며, 이의 제형 및 생체내 이용은 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Jayaraman et al. Angew Chem Int Ed Engl 51(34):8529-8533 (2012)]에 교시되어 있다.
CRISPR-Cas 시스템, 예를 들어, Cas9-gRNA RNP, gRNA, Cas9 mRNA의 전달에 최적화된 LNP 제형은 둘 모두가 참조로 포함되는 제WO2019067992호 및 제WO2019067910호에 기재되어 있으며, 본원에 기재된 DNA 또는 RNA 조성물의 전달에 유용하다.
핵산(예를 들어, RNA, DNA)의 전달에 유용한 추가의 구체적인 LNP 제형은 둘 모두가 참조로 포함되는 제US8158601호 및 제US8168775호에 기재되어 있으며, 이는 명칭 ONPATTRO 하에 시판 중인 파티시란(patisiran)에서 사용되는 제형을 포함한다.
폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA) LNP의 예시적인 투여는 약 0.1, 0.25, 0.3, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 또는 100 mg/kg(RNA)을 포함할 수 있다. 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA)를 포함하는 AAV의 예시적인 투여는 약 1011, 1012, 1013, 및 1014 vg/kg의 MOI를 포함할 수 있다.
VI. 타노트랜스미션의 촉진 방법
특정 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서의 타노트랜스미션의 촉진 방법에 관한 것이며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물을 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드의 발현은 표적 세포가 표적 세포에 의해 능동적으로 방출되거나 표적 세포의 턴오버(예를 들어, 사멸) 동안 노출되게 되는 인자를 생성하도록 유도한다. 이들 인자는 생물학적 반응(예를 들어, 면역 활성의 증가)을 겪도록 반응 세포(예를 들어, 면역 세포)에 신호를 전달한다.
A. 면역 활성의 증가 방법
일부 양태에서, 본원에 기재된 타노트랜스미션 폴리펩티드는 대상체, 예를 들어, 증가된 면역 활성으로부터 이익을 얻을 대상체에서 면역 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 증가를 필요로 하는 대상체에서의 면역 반응의 증가 방법에 관한 것이며, 방법은 본원에 기재된 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물 중 어느 하나를 대상체에서 면역 반응을 증가시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 타노트랜스미션 폴리펩티드의 발현 시에 표적 세포에 의해 생성되는 인자는 반응 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 면역-자극 반응(예를 들어, 염증-유발 반응)을 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 면역 반응은 항-암 반응이다.
본 개시내용의 방법에 따르면, 면역 활성은 표적 세포와, 예를 들어, 비만 세포, 자연 살해(NK) 세포, 호염기구, 호중구, 단핵구, 대식구, 수지상 세포, 호산구, 림프구(예를 들어, B-림프구(B-세포)) 및 T-림프구(T-세포)) 중 임의의 하나 이상을 포함하는 매우 다양한 면역 세포의 상호작용에 의해 조절될 수 있다.
면역 세포의 유형
비만 세포는 히스타민 및 항응고제인 헤파린이 풍부한 과립을 함유하는 과립구의 한 유형이다. 비만 세포는 활성화될 때, 염증성 화합물을 과립으로부터 국소 미세환경 내로 방출한다. 비만 세포는 알러지, 아나필락시스, 상처 치유, 혈관형성, 면역 관용, 병원체에 대한 방어, 및 혈액-뇌 장벽 기능에서 역할을 수행한다.
자연 살해(NK) 세포는 임의의 이전의 자극 또는 면역화 없이 특정 종양 및 바이러스 감염 세포를 용해시키는 세포독성 림프구이다. NK 세포는 또한 다양한 사이토카인, 예를 들어, IFN-감마(IFNγ), TNF-알파(TNFα), GM-CSF 및 IL-3의 강력한 생성자이다. 따라서, NK 세포는 또한 면역계에서 조절 세포로서 기능하여, 다른 세포 및 반응에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 인간에서, NK 세포는 광범위하게 CD56+CD3- 림프구로서 정의된다. NK 세포의 세포독성 활성은 세포 표면 상의 수용체로부터의 활성화 및 저해 신호 간의 균형에 의해 엄격하게 제어된다. NK 세포 활성화를 저해하는 수용체의 주요 그룹은 저해성 살해 면역글로불린-유사 수용체(KIR)이다. 이들 수용체는 표적 세포 상의 자가 MHC 부류 I 분자의 인식 시에, 활성화 신호전달 캐스케이드를 중단시키는 저해성 신호를 운반하여, 정상적인 MHC 부류 I 발현을 갖는 세포를 NK 세포 용해로부터 보호한다. 활성화 수용체는 자연 세포독성 수용체(NCR) 및 NKG2D를 포함하며, 이는 표적 세포 표면 상의 상이한 리간드와의 결합을 통하여 세포용해 작용을 향해 균형을 이루게 한다. 따라서, 표적 세포의 NK 세포 인식은 다수의 활성화 및 저해성 수용체로부터 운반되는 신호의 통합을 포함하는 과정에 의해 엄격하게 조절된다.
단핵구는 조직 내로 동원되기 전에 수시간/수일 동안 혈 중 순환하는 골수-유래 단핵 식세포이다. 문헌[Wacleche et al., 2018, Viruses (10)2: 65]을 참조한다. 그들의 표면에서의 다양한 케모카인 수용체 및 세포 부착 분자의 발현은 그들이 골수에서 혈액 내로 유출된 후에, 혈액으로부터 조직 내로 동원되게 한다. 단핵구는 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생생물 감염에 대한 반응을 제공하는 면역계의 선천적 아암(arm)에 속한다. 그들의 기능은 식세포작용을 통한 병원체의 사멸, 반응성 산소 종(ROS), 산화질소(NO), 마이엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase) 및 염증성 사이토카인의 생성을 포함한다. 단핵구는 특정 조건 하에서, 암 및 감염성 및 자가면역 질병 동안 T-세포 반응을 자극하거나 저해할 수 있다. 그들은 또한 조직 회복 및 혈관신생에 연루된다.
대식구는 식세포작용으로 지칭되는 과정에서 세포 데브리스, 외래 물질, 미생물 및 암 세포와 같은 물질을 포식하고 소화시킨다. 대식구는 식세포작용 외에도, 비특이적인 방어(선천 면역)에서 결정적인 역할을 수행하며, 또한, 림프구와 같은 다른 면역 세포를 동원함으로써 특이적인 방어 메커니즘(획득 면역)의 개시를 돕는다. 예를 들어, 대식구는 T 세포에 대한 항원 제시자로서 중요하다. 염증을 증가시키고 면역계를 자극하는 것 외에도, 대식구는 또한 중요한 항-염증 역할을 수행하며, 사이토카인의 방출을 통해 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 염증을 조장하는 대식구는 M1 대식구로 지칭되는 한편, 염증을 감소시키고 조직 회복을 조장하는 대식구는 M2 대식구로 지칭된다.
수지상 세포(DC)는 병원체에 대한 면역 반응을 자극하고, 무해한 항원에 대하여 면역 항상성을 유지하는 데 결정적인 역할을 수행한다. DC는 면역 반응의 유도 및 조절에 필수적인 특수 항원-감지 및 항원-제시 세포(APC)의 이종 그룹을 나타낸다. 말초 혈액 중에서, 인간 DC는 T-세포(CD3, CD4, CD8), B-세포(CD19, CD20) 및 단핵구 마커(CD14, CD16)가 결여되지만, HLA-DR 및 다른 DC 계통 마커(예를 들어, CD1a, CD1c)를 고도로 발현하는 세포로서 특성화된다. 문헌[Murphy et al., Janeway's Immunobiology. 8th ed. Garland Science; New York, NY, USA: 2012. 868p]을 참조한다.
용어 "림프구"는 신체의 도처의 림프 조직에서 형성되고, 정상 성인에서 질병에 대해 신체를 방어하는 데 큰 역할을 수행하는 순환하는 혈액 중 총 백혈구 수의 약 22 내지 28%를 구성하는 작은 백혈구를 지칭한다. 개별 림프구는 이들이 이들의 유전 물질의 재조합(예를 들어, T 세포 수용체 및 B 세포 수용체를 생성시키기 위함)을 통해 구조적으로 관련된 항원의 제한된 세트에 반응하도록 수임된다는 점에서 특화되어 있다. 면역계와, 주어진 항원의 처음 접촉 전에 존재하는 이러한 수임은 림프구의 표면 막 상의 항원 상의 결정인자(에피토프)에 특이적인 수용체의 존재에 의해 발현된다. 각각의 림프구는 고유한 수용체 집단을 가지며, 이들 모두는 동일한 조합 부위를 갖는다. 림프구의 하나의 세트, 또는 클론은 이의 수용체의 조합 영역의 구조에서 또 다른 클론과 상이하며, 따라서 그것이 인식할 수 있는 에피토프가 상이하다. 림프구는 이들의 수용체의 특이성뿐만 아니라 이들의 기능에 있어서도 서로 상이하다. (문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999), at p. 102]).
림프구는 항체-분비 세포의 전구체인 B-림프구(B-세포), 및 T-림프구(T-세포)를 포함한다.
B-림프구(B-세포)
B-림프구는 골수의 조혈 세포로부터 유래된다. 성숙 B-세포는 그의 세포 표면에 의해 인식되는 에피토프를 발현하는 항원으로 활성화될 수 있다. 활성화 과정은 항원에 의한 막 Ig 분자의 가교 결합(가교 결합 의존성 B-세포 활성화)에 의존하여 직접적일 수 있거나, 동족체 도움으로 언급되는 과정에서 헬퍼 T-세포와의 상호작용을 통해 간접적일 수 있다. 많은 생리학적 상황에서, 수용체 가교 결합 자극 및 동족체 도움은 상승작용하여 더욱 격렬한 B-세포 반응을 제공한다(문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)]).
가교 결합 의존성 B-세포 활성화는 항원이 세포 표면 수용체의 결합 부위에 상보적인 에피토프의 다수의 카피를 발현하는 것을 요구하는데, 이는 각각의 B-세포가 동일한 가변 영역을 갖는 Ig 분자를 발현하기 때문이다. 이러한 요건은 반복 에피토프를 갖는 다른 항원, 예를 들어, 미생물의 캡슐 다당류 또는 바이러스 외피 단백질에 의해 충족된다. 가교 결합 의존성 B-세포 활성화는 이들 미생물에 대해 마운팅되는 주요 보호 면역 반응이다(문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)]).
동족체 도움은 B-세포가 수용체와 가교 결합할 수 없는 항원에 대한 반응을 마운팅시키는 것을 가능하게 하고, 동시에 이들이 약한 가교 결합 사건에 의해 자극되는 경우 불활성화로부터 B 세포를 구제하는 공동자극 신호를 제공한다. 동족체 도움은 B-세포의 막 면역글로불린(Ig)에 의한 항원의 결합, 항원의 세포내이입, 및 세포의 엔도솜/리소좀 구획 내에서의 펩티드로의 그의 단편화에 의존한다. 생성된 펩티드 중 일부는 부류 II 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자로 공지된 세포 표면 단백질의 특화된 세트의 그루브 내로 로딩된다. 생성된 부류 II/펩티드 복합체는 세포 표면 상에서 발현되며, CD4+ T-세포로 지정된 T-세포의 세트의 항원-특이적 수용체에 대한 리간드로서 작용한다. CD4+ T-세포는 이들의 표면 상에 B-세포의 부류 II/펩티드 복합체에 특이적인 수용체를 갖는다. B-세포 활성화는 그의 T 세포 수용체(TCR)를 통한 T 세포의 결합에 의존할 뿐만 아니라 이 상호작용은 또한 T-세포 상의 활성화 리간드(CD40 리간드)가 B-세포 활성화를 신호전달하는 B-세포 상의 그의 수용체(CD40)에 결합하는 것을 가능하게 한다. 또한, T 헬퍼 세포는 B 세포 상의 사이토카인 수용체에 결합함으로써 자극된 B-세포의 성장 및 분화를 조절하는 몇몇의 사이토카인을 분비한다(문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction, "Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)]).
항체 생성을 위한 동족체 도움 동안, CD40 리간드는 활성화된 CD4+ T 헬퍼 세포 상에서 일시적으로 발현되며, 이는 항원-특이적 B 세포 상의 CD40에 결합함으로써 제2 공동자극 신호를 전달한다. 후자의 신호는 B 세포 성장 및 분화, 및 항원과 마주치는 배 중심 B 세포의 아폽토시스의 방지에 의한 기억 B 세포의 생성에 필수적이다. B 및 T 세포 둘 모두에서의 CD40 리간드의 과발현은 인간 SLE 환자에서 병원성 자가항체 생성에 연루된다(문헌[Desai-Mehta, A. et al., "Hyperexpression of CD40 ligand by B and T cells in human lupus and its role in pathogenic autoantibody production," J. Clin. Invest. Vol. 97(9), 2063-2073, (1996)]).
T-림프구(T-세포)
조혈 조직의 전구체로부터 유래된 T-림프구는 흉선에서 분화를 겪으며, 이후 말초 림프 조직 및 림프구의 재순환 풀로 시딩된다. T-림프구 또는 T 세포는 광범위한 면역학적 기능을 매개한다. 이들은 B 세포가 항체-생성 세포로 발달하는 것을 돕는 능력, 단핵구/대식세포의 살균 작용을 증가시키는 능력, 특정 유형의 면역 반응의 억제, 표적 세포의 직접 사멸, 및 염증 반응의 동원을 포함한다. 이들 효과는 특정 세포 표면 분자의 T 세포 발현 및 사이토카인의 분비에 의존한다(문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction", Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)]).
T 세포는 이들의 항원 인식의 메커니즘에 있어서 B 세포와 상이하다. B 세포의 수용체인 면역글로불린은 가용성 분자 또는 미립자 표면 상의 개별적 에피토프에 결합한다. B-세포 수용체는 고유 분자의 표면 상에서 발현된 에피토프를 알아본다. 항체 및 B-세포 수용체는 세포외 유체 내의 미생물에 결합하고 이에 대해 보호하도록 진화한 반면, T 세포는 다른 세포의 표면 상의 항원을 인식하고, 이들 항원 제시 세포(APC)의 거동과 상호작용하고 이를 변경시킴으로써 이들의 기능을 매개한다. T 세포를 활성화시킬 수 있는 말초 림프 기관에는 수지상 세포, 대식구 및 B 세포의 3개의 주요 유형의 APC가 존재한다. 이들 중 가장 강력한 것은 수지상 세포이며, 이의 유일한 기능은 T 세포에 외래 항원을 제시하는 것이다. 미성숙 수지상 세포는 피부, 장, 및 기도를 포함하여 신체의 도처의 조직에 위치한다. 이들이 이들 부위에서 침입 미생물과 마주치는 경우, 이들은 병원체 및 이들의 생성물을 세포내이입하고, 이들을 림프를 통해 국소 림프절 또는 장 관련 림프 기관으로 운반한다. 병원체와의 마주치면, 수지상 세포가 항원-포획 세포에서, T 세포를 활성화시킬 수 있는 APC로 성숙하도록 유도된다. APC는 T 세포를 활성화하여 이펙터 세포가 되도록 하는 역할을 갖는 이들의 표면 상의 3가지 유형의 단백질 분자를 디스플레이한다: (1) 외래 항원을 T 세포 수용체에 제시하는 MHC 단백질; (2) T 세포 표면 상의 상보적인 수용체에 결합하는 공동자극 단백질; 및 (3) T 세포가 활성화되기에 충분히 길게 APC에 결합할 수 있게 하는 세포-세포 부착 분자(문헌["Chapter 24: The adaptive immune system," Molecular Biology of the Cell, Alberts, B. et al., Garland Science, NY, (2002)]).
T-세포는 이들이 발현하는 세포 표면 수용체에 기초하여 2개의 별개의 부류로 세분된다. 대부분의 T 세포는 α 및 β 쇄로 이루어진 T 세포 수용체(TCR)를 발현한다. 작은 그룹의 T 세포는 γ 및 δ 쇄로 구성된 수용체를 발현한다. α/β T 세포 중에서 보조수용체 분자 CD4를 발현하는 것(CD4+ T 세포); 및 CD8을 발현하는 것(CD8+ T 세포)의 2개의 하위-계열이 존재한다. 이들 세포는 이들이 항원을 인식하는 방법 및 이들의 이펙터 및 조절 기능에 있어서 상이하다.
CD4+ T 세포는 면역계의 주요 조절 세포이다. 이들의 조절 기능은 T 세포가 활성화되는 경우에 발현이 유도되는 이들의 세포-표면 분자, 예를 들어, CD40 리간드의 발현, 및 활성화되는 경우 이들이 분비하는 다양한 종류의 사이토카인 둘 모두의 의존한다.
T 세포는 또한 중요한 이펙터 기능을 매개하며, 이중 일부는 이들이 분비하는 사이토카인의 패턴에 의해 결정된다. 사이토카인은 표적 세포에 직접적으로 독성일 수 있고, 강력한 염증 메커니즘을 동원할 수 있다.
또한, T 세포, 특히 CD8+ T 세포는 CTL에 의해 인식되는 항원을 발현하는 표적 세포를 효율적으로 용해시킬 수 있는 세포독성 T-림프구(CTL)로 발생할 수 있다(문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)]).
T 세포 수용체(TCR)는 부류 II 또는 부류 I MHC 단백질의 특화된 그루브에 결합된 항원의 단백질분해에 의해 유래되는 펩티드로 이루어진 복합체를 인식한다. CD4+ T 세포는 펩티드/부류 II 복합체만 인식하는 반면, CD8+ T 세포는 펩티드/부류 I 복합체를 인식한다(문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)]).
TCR의 리간드(즉, 펩티드/MHC 단백질 복합체)는 APC 내에서 생성된다. 일반적으로, 부류 II MHC 분자는 세포내이입 과정을 통해 APC에 의해 흡수된 단백질로부터 유래된 펩티드에 결합한다. 이들 펩티드-로딩된 부류 II 분자는 이후 세포의 표면 상에서 발현되며, 여기서 이들은 발현된 세포 표면 복합체를 인식할 수 있는 TCR을 갖는 CD4+ T 세포에 의해 결합되도록 이용 가능해진다. 따라서, CD4+ T 세포는 세포외 공급원에서 유래된 항원과 반응하도록 특화되어 있다(문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)]).
대조적으로, 부류 I MHC 분자는 주로 바이러스 단백질과 같은 내부적으로 합성된 단백질로부터 유래된 펩티드가 로딩된다. 이들 펩티드는 프로테오솜에 의한 단백질분해에 의해 시토졸 단백질로부터 생성되고, 조면 소포체로 전위된다. 일반적으로 9개 아미노산 길이로 구성된 이러한 펩티드는 부류 I MHC 분자에 결합되고, 세포 표면으로 이동되며, 여기서 이들은 적절한 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포에 의해 인식될 수 있다. 이는 T 세포 시스템, 특히 CD8+ T 세포에, 나머지 유기체의 세포의 것(예를 들어, 바이러스 항원) 또는 돌연변이체 항원(예를 들어, 활성 종양유전자 생성물)과 상이하거나 이보다 훨씬 더 많은 양으로 생성되는 단백질(온전한 형태의 이들 단백질이 세포 표면 상에서 발현되지 않거나 분비되지 않더라도)을 발현하는 세포를 검출하는 능력을 제공한다(문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)]).
T 세포는 또한 이들의 기능에 기초하여 헬퍼 T 세포; 세포 면역을 유도하는 데 관여하는 T 세포; 억제인자 T 세포; 및 세포독성 T 세포로 분류될 수 있다.
헬퍼 T 세포
헬퍼 T 세포는 B 세포를 자극하여 단백질 및 다른 T 세포-의존성 항원에 대한 항체 반응을 일으키는 T 세포이다. T 세포 의존성 항원은 개별 에피토프가 이들이 B 세포의 막 면역글로불린(Ig)을 가교 결합시킬 수 없거나 비효율적으로 가교 결합시킬 수 있도록 단지 1회 또는 제한된 횟수로만 나타나는 면역원이다. B 세포는 이들의 막 Ig를 통해 항원에 결합하고, 복합체는 세포내이입을 겪는다. 엔도솜 및 리소좀 구획 내에서, 항원은 단백질분해 효소에 의해 펩티드로 단편화되고, 생성된 펩티드 중 하나 이상이 부류 II MHC 분자로 로딩되어 이 소포 구획을 통해 수송된다. 이후, 생성된 펩티드/부류 II MHC 복합체는 B-세포 표면 막으로 유출된다. 펩티드/부류 II 분자 복합체에 특이적인 수용체를 갖는 T 세포는 B-세포 표면 상의 이 복합체를 인식한다. (문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999)]).
B-세포 활성화는 T 세포의 TCR을 통한 T 세포의 결합 및 T-세포 CD40 리간드(CD40L)와 B 세포 상의 CD40의 상호작용 둘 모두에 의존한다. T 세포는 CD40L을 구성적으로 발현하지 않는다. 오히려, CD40L 발현은 CD80 또는 CD86 및 T 세포의 TCR에 의해 인식되는 동족 항원 둘 모두를 발현하는 APC와의 상호작용의 결과로서 유도된다. CD80/CD86은 활성화된 B 세포 및 T 세포를 포함하는 헬퍼 상호작용이 효율적인 항체 생성을 야기할 수 있도록 휴지가 아닌 활성화된 B 세포에 의해 일반적으로 발현된다. 그러나, 많은 경우에, T 세포 상에서의 CD40L의 초기 유도는 수지상 세포와 같이 CD80/86을 구성적으로 발현하는 APC의 표면 상에서의 항원의 그들의 인식에 의존한다. 이러한 활성화된 헬퍼 T 세포는 이후 B 세포와 효율적으로 상호작용하고 이를 도울 수 있다. B 세포 상에서의 막 Ig의 가교 결합은 비효율적일지라도 CD40L/CD40 상호작용과 상승작용하여 활발한 B-세포 활성화를 제공할 수 있다. 증식, Ig 분비, 및 발현되는 Ig 부류의 부류 전환을 포함하는 B-세포 반응의 후속 사건은 T 세포-유래 사이토카인의 작용에 의존하거나 이에 의해 향상된다(문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)]).
CD4+ T 세포는 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10을 주로 분비하는 세포(TH2 세포) 또는 IL-2, IFN-γ 및 림프독소를 주로 생성하는 세포(TH1 세포)로 분화하는 경향이 있다. TH2 세포는 B 세포가 항체 생성 세포로 발생하는 것을 돕는 데 매우 효과적인 반면, TH1 세포는 단핵구 및 대식구의 살균 활성의 향상, 및 세포내 소포 구획에서 미생물을 용해시키는 데 있어서의 결과적인 증가된 효율을 포함하는 세포 면역 반응의 효과적인 유도인자이다. TH2 세포의 표현형(즉, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)을 갖는 CD4+ T 세포는 효율적인 헬퍼 세포이나, TH1 세포는 또한 헬퍼가 될 능력을 갖는다(문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction, "Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)]).
세포 면역 유도에서의 T 세포 연루
T 세포는 또한 세포내 미생물을 파괴하는 단핵구 및 대식구의 능력을 향상시키는 작용을 할 수 있다. 특히, 헬퍼 T 세포에 의해 생성된 인터페론-감마(IFN-γ)는 산화질소의 생성 및 종양 괴사 인자(TNF) 생성의 유도를 포함하는, 단핵 포식세포가 세포내 박테리아 및 기생을 파괴하는 몇몇의 메커니즘을 향상시킨다. TH1 세포는 IFN-γ를 생성하므로 살균 작용을 향상시키는 데 효과적이다. 대조적으로, TH2 세포에 의해 생성되는 주요 사이토카인 중 2개인 IL-4 및 IL-10은 이들 활성을 차단한다(문헌[Paul, W. E., "Chapter 1: The immune system: an introduction," Fundamental Immunology, 4th Edition, Ed. Paul, W. E., Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia, (1999)]).
조절성 T(Treg) 세포
면역 항상성은 면역 반응의 개시와 하향조절 사이의 제어된 균형에 의해 유지된다. 아폽토시스 및 T 세포 무반응(T 세포가 항원과 마주친 후에 본질적으로 기능적으로 불활성화되는 내성 메커니즘(문헌[Schwartz, R. H., "T cell anergy", Annu. Rev. Immunol., Vol. 21: 305-334 (2003)]) 둘 모두의 메커니즘이 면역 반응의 하향조절에 기여한다. 제3 메커니즘은 억제인자 또는 조절성 CD4+ T(Treg) 세포에 의한 활성화된 T 세포의 활성 억제에 의해 제공된다(문헌[Kronenberg, M. et al., "Regulation of immunity by self-reactive T cells", Nature, Vol. 435: 598-604 (2005)]에서 개괄됨). IL-2 수용체 알파(IL-2Rα) 쇄를 구성적으로 발현하는 CD4+ Treg(CD4+ CD25+)는 무반응성이고 억제성인 천연 발생 T 세포 하위세트이다(문헌[Taams, L. S. et al., "Human anergic/suppressive CD4+CD25+ T cells: a highly differentiated and apoptosis-prone population", Eur. J. Immunol. Vol. 31: 1122-1131 (2001)]). 이들의 쥣과 대응부와 유사한 인간 CD4+ CD25+ Treg는 흉선에서 생성되며, 세포-세포 접촉 의존성 메커니즘을 통해 반응자 T 세포의 증식을 억제하는 능력, IL-2를 생성할 수 없음, 및 시험관 내에서의 무반응성 표현형을 특징으로 한다. 인간 CD4+ CD25+ T 세포는 CD25 발현의 수준에 따라 억제성(CD25high) 및 비억제성(CD25low) 세포로 나뉠 수 있다. 전사 인자의 포크헤드(forkhead) 계열의 구성원인 FOXP3는 쥣과 및 인간 CD4+ CD25+ Treg에서 발현되는 것으로 밝혀졌고, CD4+ CD25+ Treg 발생을 제어하는 주된 유전자인 것으로 보인다(문헌[Battaglia, M. et al., "Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+Foxp3+ regulator T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients", J. Immunol., Vol. 177: 8338-8347, (2006)]). 따라서, 일부 구현예에서, 면역 반응의 증가는 조절성 T 세포의 활성화 또는 증식의 결여와 연관될 수 있다.
세포독성 T 림프구
표적 세포 내에서 생성된 단백질 유래의 펩티드를 인식하는 CD8+ T 세포는 이들이 표적 세포의 용해를 야기한다는 점에서 세포독성 특성을 갖는다. CTL-유도 용해의 메커니즘은 표적 세포의 막에 삽입하여, 세포의 용해를 촉진할 수 있는 분자인 퍼포린(perforin)의 CTL에 의한 생성을 포함한다. 퍼포린-매개 용해는 활성화된 CTL에 의해 생성된 일련의 효소인 그랜자임(granzyme)에 의해 향상된다. 많은 활성 CTL은 또한 이들의 표면 상에 다량의 fas 리간드를 발현한다. CTL의 표면 상의 fas 리간드와 표적 세포의 표면 상의 fas의 상호작용은 표적 세포에서 아폽토시스를 개시하여, 이들 세포의 사멸을 야기한다. CTL-매개 용해는 바이러스 감염된 세포의 파괴를 위한 주요 메커니즘인 것으로 보인다.
림프구 활성화
용어 "활성화" 또는 "림프구 활성화"는 RNA, 단백질 및 DNA의 합성 및 림포카인의 생성을 초래하는 특정 항원, 비특이적 미토겐 또는 동종이형 세포에 의한 림프구의 자극을 지칭하며; 이는 다양한 이펙터 및 기억 세포의 증식 및 분화로 이어진다. T-세포 활성화는 TCR/CD3 복합체와 부류 I 또는 부류 II MHC 분자의 그루브에 결합된 펩티드인 그의 동족 리간드의 상호작용에 의존적이다. 수용체 결합에 의해 움직이도록 설정된 분자 사건은 복잡하다. 그 중에서 가장 초기 단계는 몇몇의 신호전달 경로를 제어하는 기질 세트의 티로신 인산화를 야기하는 티로신 키나제의 활성화인 것으로 보인다. 이들은 TCR을 ras 경로에 연결시키는 어댑터 단백질의 세트, 포스포리파제 Cγ1을 포함하며, 이의 티로신 인산화는 이의 촉매 활성을 증가시키고, 이노시톨 인지질 대사 경로에 참여시켜, 세포내 유리 칼슘 농도의 상승, 및 단백질 키나제 C 및 세포 성장 및 분화를 제어하는 일련의 다른 효소의 활성화를 야기한다. T 세포의 완전한 반응은 수용체 결합에 더하여 보조 세포-운반 공동자극 활성, 예를 들어, APC 상의 CD80 및/또는 CD86에 의한 T 세포 상의 CD28의 결합을 필요로 한다.
T-기억 세포
적응 면역 반응을 통한 병원체의 인식 및 근절 후, 대다수(90 내지 95%)의 T 세포는 아폽토시스를 겪고, 나머지 세포는 중추 기억 T 세포(TCM), 이펙터 기억 T 세포(TEM), 및 상주 기억 T 세포(TRM)으로 지정된 기억 T 세포 풀을 형성한다(문헌[Clark, R.A., "Resident memory T cells in human health and disease", Sci. Transl. Med., 7, 269rv1, (2015)]).
표준 T 세포와 비교하여, 이들 기억 T 세포는 특정 표면 마커의 발현, 상이한 사이토카인 프로파일의 신속한 생성, 직접적인 이펙터 세포 기능의 능력, 및 독특한 귀소 분포 패턴과 같은 독특한 표현형과 함께 오래 지속된다. 기억 T 세포는 병원체의 재감염을 제거함으로써 면역계의 균형을 신속하게 회복시키기 위해 이들 각각의 항원으로의 재노출 시에 신속한 반응을 나타낸다. 자가면역 기억 T 세포가 자가면역 질병을 치료하거나 치유하려는 대부분의 시도를 방해한다는 것을 입증하는 증거가 증가하고 있다(문헌[Clark, R.A., "Resident memory T cells in human health and disease", Sci. Transl. Med., Vol. 7, 269rv1, (2015)]).
면역 활성의 증가
본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드는 조직 또는 대상체에서 본원에 기재된 면역 세포, 예를 들어, 대식구, 단핵구, 수지상 세포, B-세포, T-세포 및 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포(예를 들어, CD4+, CD8+ 또는 CD3+ T 세포) 중 임의의 하나 이상의 수준 또는 활성을 증가시킴으로써 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자는 조직 또는 대상체에서 하기 중 하나 이상을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다: 대식구의 수준 또는 활성, 단핵구의 수준 또는 활성, 수지상 세포의 수준 또는 활성, T-세포의 수준 또는 활성, B-세포의 수준 또는 활성, 및 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포(예를 들어, CD4+, CD8+ 또는 CD3+ T 세포)의 수준 또는 활성.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물을 조직 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 조직 또는 대상체에서의 대식구, 단핵구, B-세포, T-세포 및/또는 수지상 세포의 수준 또는 활성의 증가 방법에 관한 것이며, 여기서, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물은 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물로 처리되지 않은 조직 또는 대상체에 비하여, 대식구, 단핵구, B-세포, T 세포 및/또는 수지상 세포의 수준 또는 활성을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다.
일 구현예에서, 대상체는 증가된 수준 또는 활성의 대식구, 단핵구, 수지상 세포, B-세포, 및/또는 T-세포를 필요로 한다.
일 구현예에서, 대식구, 단핵구, B-세포, T-세포 또는 수지상 세포의 수준 또는 활성은 엔지니어링된 바이러스로 처리되지 않은 조직 또는 대상체에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%, 또는 적어도 2배, 4배, 6배, 8배 또는 10배 증가된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물을 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물로 처리되지 않은 조직 또는 대상체에 비하여 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포의 수준 또는 활성을 증가시키기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 조직 또는 대상체에서의 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포의 수준 또는 활성의 증가 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 대상체는 증가된 수준 또는 활성의 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포를 필요로 한다.
일 구현예에서, CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포의 수준 또는 활성은 엔지니어링된 바이러스로 처리되지 않은 조직 또는 대상체에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%, 또는 적어도 2배, 4배, 6배, 8배 또는 10배 증가된다.
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드는 또한, 면역 세포에 의해 생성되는 염증-유발 사이토카인의 수준 또는 활성을 증가시킴으로써 세포, 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물은 세포, 조직 또는 대상체에서 면역 세포에 의해 생성되는 염증-유발 사이토카인의 수준 또는 활성을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구현예에서, 염증-유발 사이토카인은 IFN-α, IL-1, IL-12, IL-18, IL-2, IL-15, IL-4, IL-6, TNF-α, IL-17 및 GMCSF로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물을 면역 세포에서 염증-유발 전사 반응, 면역 세포에서 NFkB 경로, 인터페론 IRF 신호전달 및/또는 STAT 신호전달을 유도하기에 충분한 양으로 조직 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 면역 세포에서의 염증-유발 전사 반응의 유도, 예를 들어, 조직 또는 대상체 내의 면역 세포에서의 NFkB 경로, 인터페론 IRF 신호전달 및/또는 STAT 신호전달의 유도 방법에 관한 것이다.
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드는 또한, 핵산의 세포내 센서, 예를 들어, 인터페론 유전자의 자극인자(STING)를 통한 신호전달의 조절에 의해 세포, 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시킬 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물을 핵산의 세포내 센서, 예를 들어, 인터페론 유전자의 자극인자(STING)를 통한 신호전달의 조절에 의해 세포, 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시키기에 충분한 양으로, 조직 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 핵산의 세포내 센서, 예를 들어, 인터페론 유전자의 자극인자(STING)를 통한 신호전달의 조절에 의한 세포, 조직 또는 대상체에서의 면역 활성의 증가 방법에 관한 것이다.
둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드는 또한, 본원에 기재된 면역 세포에서 염증-유발 전사 반응을 유도함으로써, 예를 들어, 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경-쇄-인핸서(NFkB) 경로, 인터페론 조절 인자(IRF) 신호전달 및/또는 STAT 신호전달을 유도함으로써 세포, 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물은 면역 세포에서 NFkB 경로, 인터페론 IRF 신호전달 및/또는 STAT 신호전달을 유도하기에 충분한 양으로 투여된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물을 조직 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 면역 세포에서의 염증-유발 전사 반응의 유도, 예를 들어, 조직 또는 대상체 내의 면역 세포에서의 NFkB 경로, 인터페론 IRF 신호전달 및/또는 STAT 신호전달의 유도 방법에 관한 것이며, 여기서, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물은 면역 세포에서 염증-유발 전사 반응, 면역 세포에서 NFkB 경로, 인터페론 IRF 신호전달 및/또는 STAT 신호전달을 유도하기에 충분한 양으로 투여된다. 특정 구현예에서, 면역 반응을 증가시키는 것은 IRF 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 반응을 증가시키는 것은 NFkB 활성을 증가시키는 것을 포함한다.
둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드는 또한, 항체 반응의 유도 또는 조절에 의해 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물은 조직 또는 대상체에서 항체 반응을 유도하거나 조절하기에 충분한 양으로 투여된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물을 조직 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 조직 또는 대상체 내의 면역 세포에서의 항체 반응의 유도 또는 조절에 의한 조직 또는 대상체에서의 면역 활성의 증가 방법에 관한 것이며, 여기서, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물은 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물로 처리되지 않은 조직 또는 대상체에 비하여 조직 또는 대상체에서 면역 활성을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물을 세포, 조직 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포, 조직 또는 대상체에서의 면역-유발 사이토카인의 수준 또는 활성의 증가 방법에 관한 것이며, 여기서, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물은 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물로 처리되지 않은 세포, 조직 또는 대상체에 비하여 면역-유발 사이토카인의 수준 또는 활성을 증가시키기에 충분한 양으로 투여된다.
일 구현예에서, 대상체는 증가된 수준 또는 활성의 면역-유발 사이토카인을 필요로 한다.
일 구현예에서, 면역-유발 사이토카인의 수준 또는 활성은 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물로 처리되지 않은 세포, 조직 또는 대상체에 비하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%, 또는 적어도 2배, 4배, 6배, 8배, 또는 10배 증가된다.
일 구현예에서, 면역-유발 사이토카인은 IFN-α, IL-1, IL-12, IL-18, IL-2, IL-15, IL-4, IL-6, TNF-α, IL-17 및 GMCSF로부터 선택된다.
본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 조합은 각각의 단독의 타노트랜스미션 폴리펩티드에 비하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 대상체에게 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 투여하는 것은, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 오직 하나만을 인코딩하는 핵산 분자가 투여된 대상체에 비하여, 면역 반응을 증가시킨다(예를 들어, NFkB 활성을 증가시키고/시키거나, IRF 활성을 증가시키고/시키거나, 본원에 기재된 면역 세포, 예를 들어, 대식구, 단핵구, 수지상 세포, B-세포, T-세포 및 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포(예를 들어, CD4+, CD8+ 또는 CD3+ T 세포) 중 임의의 하나 이상의 수준 또는 활성을 증가시킨다). 예를 들어, 일부 구현예에서, TRIF 및 RIPK3을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 투여하는 것은 단지 TRIF만을 인코딩하는 재조합 핵산 분자가 투여된 대상체에 비하여 및/또는 단지 RIPK3만을 인코딩하는 재조합 핵산 분자가 투여된 대상체에 비하여, 면역 반응을 증가시킨다(예를 들어, NFkB 활성을 증가시키고/시키거나, IRF 활성을 증가시키고/시키거나, 본원에 기재된 면역 세포, 예를 들어, 대식구, 단핵구, 수지상 세포, B-세포, T-세포 및 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포(예를 들어, CD4+, CD8+ 또는 CD3+ T 세포) 중 임의의 하나 이상의 수준 또는 활성을 증가시킨다).
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드에 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 부가하는 것은, 단지 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드만에 비하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하고, 본원에 기재된 바와 같은 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 것은, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하지만 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하지 않는 핵산 분자가 투여된 대상체에 비하여 면역 반응을 증가시킨다(예를 들어, NFkB 활성을 증가시키고/시키거나, IRF 활성을 증가시키고/시키거나, 본원에 기재된 면역 세포, 예를 들어, 대식구, 단핵구, 수지상 세포, B-세포, T-세포 및 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포(예를 들어, CD4+, CD8+ 또는 CD3+ T 세포) 중 임의의 하나 이상의 수준 또는 활성을 증가시킨다). 예를 들어, 일부 구현예에서, TRIF, RIPK3, 및 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드(예를 들어, vICA, FADD-DN 또는 cFLIP)를 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는, TRIF 및 RIPK3을 인코딩하지만 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 인코딩하지 않는 핵산 분자가 투여된 대상체에 비하여 면역 반응을 증가시킨다(예를 들어, NFkB 활성을 증가시키고/시키거나, IRF 활성을 증가시키고/시키거나, 본원에 기재된 면역 세포, 예를 들어, 대식구, 단핵구, 수지상 세포, B-세포, T-세포 및 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포(예를 들어, CD4+, CD8+ 또는 CD3+ T 세포) 중 임의의 하나 이상의 수준 또는 활성을 증가시킨다). 일부 구현예에서, TRIF, RIPK3 및 vICA를 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는, TRIF 및 RIPK3을 인코딩하지만 vICA를 인코딩하지 않는 핵산 분자가 투여된 대상체에 비하여 면역 반응을 증가시킨다(예를 들어, IRF 활성을 증가시킨다).
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드에서 하나 이상의 가스더민 폴리펩티드를 포함하는 것은, 가스더민을 포함하지 않는 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드에 비하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 적어도 하나의 가스더민 및 하나 이상의 추가의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는 단지 하나 이상의 추가의 타노트랜스미션 폴리펩티드만을 인코딩하는 핵산 분자에 비하여 면역 반응을 증가시킨다(예를 들어, NFkB 활성을 증가시키고/시키거나, IRF 활성을 증가시키고/시키거나, 본원에 기재된 면역 세포, 예를 들어, 대식구, 단핵구, 수지상 세포, B-세포, T-세포 및 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포(예를 들어, CD4+, CD8+ 또는 CD3+ T 세포) 중 임의의 하나 이상의 수준 또는 활성을 증가시킨다). 일부 구현예에서, TRIF, RIPK3 및 적어도 하나의 가스더민(예를 들어, 가스더민 E)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는 단지 TRIF 및 RIPK3만을 인코딩하는 핵산 분자에 비하여 면역 반응을 증가시킨다(예를 들어, NFkB 활성을 증가시키고/시키거나, IRF 활성을 증가시키고/시키거나, 본원에 기재된 면역 세포, 예를 들어, 대식구, 단핵구, 수지상 세포, B-세포, T-세포 및 CD4+, CD8+ 또는 CD3+ 세포(예를 들어, CD4+, CD8+ 또는 CD3+ T 세포) 중 임의의 하나 이상의 수준 또는 활성을 증가시킨다). 일부 구현예에서, TRIF, RIPK3 및 가스더민 E를 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는 단지 TRIF 및 RIPK3만을 인코딩하는 핵산 분자에 비하여 IRF 활성을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 투여 이전에, 세포, 조직 또는 대상체를 하기 중 하나 이상에 대하여 평가하는 단계를 추가로 포함한다: 대식구의 수준 또는 활성; 단핵구의 수준 또는 활성; 수지상 세포의 수준 또는 활성; CD4+ 세포, CD8+ 세포 또는 CD3+ 세포의 수준 또는 활성; T 세포의 수준 또는 활성; B 세포의 수준 또는 활성 및 면역-유발 사이토카인의 수준 또는 활성.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 투여 이후에, 세포, 조직 또는 대상체를 하기 중 하나 이상에 대하여 평가하는 단계를 추가로 포함한다: NFkB, IRF 또는 STING의 수준 또는 활성; 대식구의 수준 또는 활성; 단핵구의 수준 또는 활성; 수지상 세포의 수준 또는 활성; CD4+ 세포, CD8+ 세포 또는 CD3+ 세포의 수준 또는 활성; T 세포의 수준 또는 활성; 및 면역-유발 사이토카인의 수준 또는 활성.
NFkB, IRF 또는 STING의 수준 또는 활성; 대식구의 수준 또는 활성; 단핵구의 수준 또는 활성; 수지상 세포의 수준 또는 활성; CD4+ 세포, CD8+ 세포 또는 CD3+ 세포의 수준 또는 활성; T 세포의 수준 또는 활성; 및 면역-유발 사이토카인의 수준 또는 활성을 측정하는 방법이 당업계에 알려져 있다.
예를 들어, NFkB, IRF 또는 STING의 단백질 수준 또는 활성은 ELISA, 웨스턴(Western) 블롯 또는 동소 혼성화를 포함하는 해당 분야에 알려져 있는 적합한 기법에 의해 측정될 수 있다. NFkB, IRF 또는 STING를 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA)의 수준은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역전사효소 PCR 분석, 정량적 실시간 PCR, 단일-가닥 입체형태 다형성 분석(SSCP), 미스매치 절단 검출, 헤테로듀플렉스 분석, 노던 블롯 분석, 동소 혼성화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 서열분석, 분해 단편 길이 다형성 분석 및 그의 조합 또는 하위-조합을 포함하는 해당 분야에 알려져 있는 적합한 기법을 사용하여 측정될 수 있다.
대식구의 수준 및 활성을 측정하는 방법은 예를 들어, 문헌[Chitu et al., 2011, Curr Protoc Immunol 14: 1-33]에 기재되어 있다. 단핵구의 수준 및 활성은 예를 들어, 문헌[Henning et al., 2015, Journal of Immunological Methods 423: 78-84]에 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 측정될 수 있다. 수지상 세포의 수준 및 활성은 예를 들어, 문헌[Dixon et al., 2001, Infect Immun. 69(7): 4351-4357]에 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 측정될 수 있다. 이들 참고문헌의 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
T 세포의 수준 또는 활성은 인간 CD4+ T-세포-기반의 증식 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 세포를 형광 염료 5,6-카복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지한다. 증식하는 세포는 CFSE 형광 세기의 감소를 보이며, 이는 유세포분석에 의해 직접적으로 측정된다. 대안적으로, 방사성 티미딘 혼입을 사용하여 T 세포의 성장 속도를 평가할 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 반응의 증가는 조절 T 세포(Treg)의 활성화 감소와 연관될 수 있다. 기능성 활성 T reg는 시험관 내 Treg 억제 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 검정은 문헌[Collinson and Vignali (Methods Mol Biol. 2011; 707: 21-37, 본원에 그의 전문이 참조로 포함됨)]에 기재되어 있다.
면역유발 사이토카인의 수준 또는 활성은 예를 들어, CD8+ T 세포에서 정량화될 수 있다. 구현예들에서, 면역유발 사이토카인은 인터페론 알파(IFN-α), 인터류킨-1(IL-1), IL-12, IL-18, IL-2, IL-15, IL-4, IL-6, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), IL-17 및 과립구-대식구 콜로니-자극 인자(GMCSF)로부터 선택된다. 정량화는 항원 자극에 반응하여 주어진 사이토카인(예를 들어, IFN-α)을 분비하는 T 세포를 검출하는 ELISPOT(효소-연결 면역스폿) 기법을 사용하여 수행될 수 있다. T 세포를 예를 들어, 항-IFN-α 항체로 코팅된 웰 내에서 항원-제시 세포와 배양한다. 분비된 IFN-α는 코팅된 항체에 의해 포획된 다음, 발색 기질에 커플링된 제2 항체를 사용하여 드러난다. 따라서, 국소 분비된 사이토카인 분자는 스폿을 형성하며, 각각의 스폿은 하나의 IFN-α 분비 세포에 상응한다. 스폿의 수는 분석된 시료에서 주어진 항원에 특이적인 IFN-α 분비 세포의 빈도를 결정하게 한다. ELISPOT 검정은 또한, TNF-α, 인터류킨-4(IL-4), IL-6, IL-12 및 GMCSF의 검출에 있어서 기재된 바 있다.
VII. 암의 치료 방법
본원에 제공되는 바와 같이, 예를 들어, 표적 세포에서의 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드의 발현을 통해, 표적 세포를 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드와 접촉시키는 것은 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포 등)를 활성화시킬 수 있으며, 이에 따라, 면역 세포 기능, 예컨대, 예를 들어, 암의 치료를 위한 면역요법에 관여하는 것들을 향상시킬 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 본 개시내용은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암의 치료 방법에 관한 것이며, 방법은 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물을 암을 치료하는 데 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
면역계가 자가를 비-자가로부터 구별하지 못하게 하기 위하여 다양한 복잡한 중첩 메커니즘을 이용하는 암 세포의 능력은 면역감시를 회피하기 위한 암의 기본 메커니즘을 나타낸다. 메커니즘(들)은 항원 제시의 파괴, T 세포 활성화 또는 저해를 제어하는 조절 경로(면역 체크포인트 조절)의 파괴, 면역 억제에 기여하는 세포(Treg, MDSC)의 동원 또는 면역 활성에 영향을 미치는 인자(IDO, PGE2)의 방출을 포함한다. (문헌[Harris et al., 2013, J Immunotherapy Cancer 1:12]; 문헌[Chen et al., 2013, Immunity 39:1]; 문헌[Pardoll, et al., 2012, Nature Reviews: Cancer 12:252]; 및 문헌[Sharma et al., 2015, Cell 161:205] 참조, 이의 각각은 본원에 그의 전문이 참조로 포함됨.)
본원에 기재된 방법을 사용한 치료를 위한 암에는 예를 들어, 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는 포유동물에서 관찰되는 모든 유형의 암 또는 신생물 또는 악성 종양이 포함된다: 육종, 흑색종, 암종, 백혈병 및 림프종.
용어 "육종"은 일반적으로 배아 연결 조직과 같은 물질로 구성되고, 일반적으로 미소섬유 또는 균질한 물질에 매립된 밀접하게 팩킹된 세포로 구성된 종양을 지칭한다. 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 육종의 예는 예를 들어, 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 아베메티 육종(Abemethy's sarcoma), 지방세포 육종(adipose sarcoma), 지방육종, 포상연부육종(alveolar soft part sarcoma), 법랑모세포 육종(ameloblastic sarcoma), 포도상 육종(botryoid sarcoma), 녹색종 육종(chloroma sarcoma), 융모막 암종(chorio carcinoma), 배아육종, 윌름스 종양 육종(Wilms' tumor sarcoma), 자궁내막 육종(endometrial sarcoma), 간질 육종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 근막 육종(fascial sarcoma), 섬유모세포 육종, 거대세포 육종, 과립구성 육종, 호지킨 육종, 특발성 다발성 색소출혈성 육종(idiopathic multiple pigmented hemorrhagic sarcoma), B 세포의 면역모세포성 육종(immunoblastic sarcoma of B cells), 림프종, T-세포의 면역모세포성 육종, 젠센 육종(Jensen's sarcoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 쿠퍼 세포 육종(Kupffer cell sarcoma), 혈관육종, 백혈구육종, 악성 중간엽 육종(malignant mesenchymoma sarcoma), 방골성 육종(parosteal sarcoma), 망상세포 육종(reticulocytic sarcoma), 라우스 육종, 장액낭종 육종(serocystic sarcoma), 활막 육종, 자궁 육종, 점액성 지방육종, 평활근 육종, 방추 세포 육종, 섬유조직형성 육종 및 모세혈관확장성 육종(telangiectaltic sarcoma)을 포함한다.
용어 "흑색종"은 피부 및 다른 기관의 멜라닌세포계에서 발생하는 종양을 의미하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 흑색종은 예를 들어, 선단 흑자성 흑색종, 무색소성 흑색종, 양성 소아 흑색종, 클라우드만 흑색종(Cloudman's melanoma), S91 흑색종, 하딩-파세이(Harding-Passey) 흑색종, 연소성 흑색종, 악성 흑자 흑색종(lentigo maligna melanoma), 악성 흑색종, 결절성 흑색종, 조갑하 흑색종, 및 표재 확장성 흑색종(superficial spreading melanoma)을 포함한다.
용어 "암종"은 주변 조직에 침윤하고 전이를 일으키는 경향이 있는 상피 세포로 이루어진 새로운 악성 성장을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 암종은 예를 들어, 세엽 암종(acinar carcinoma), 소엽 암종(acinous carcinoma), 샘낭 암종(adenocystic carcinoma), 선낭암종(adenoid cystic carcinoma), 선암종, 부신피질 암종, 폐포성 암종, 폐포세포암종, 기저세포 암종, 바닥세포 암종, 기저양 암종, 기저편평세포 암종, 세기관지폐포 암종, 세기관지성 암종, 기관지원성 암종, 대뇌양 암종(cerebriform carcinoma), 담관세포 암종, 융모암종, 콜로이드질 암종, 결장의 결장 선암종, 면포암종, 자궁체부암종, 사상암종(cribriform carcinoma), 경결형 암종(carcinoma en cuirasse), 피부 암종(carcinoma cutaneum), 원주상 암종(cylindrical carcinoma), 원주상 세포암종, 관암종, 듀럼 암종(carcinoma durum), 배아 암종, 뇌양 암종, 에피에모이드 암종(epiemoid carcinoma), 선양 상피 암종(carcinoma epitheliale adenoides), 외장성 암종(exophytic carcinoma), 궤양외 암종(carcinoma ex ulcere), 섬유성 암종(carcinoma fibrosum), 젤라틴형 암종(gelatiniform carcinoma), 젤라틴성 암종(gelatinous carcinoma), 거대 세포 암종, 거대 세포성 암종(carcinoma gigantocellulare), 샘암종(glandular carcinoma), 과립막 세포 암종(granulosa cell carcinoma), 털기질 암종(hair-matrix carcinoma), 간세포양 암종(hepatoid carcinoma), 간세포성 암종(hepatocellular carcinoma), 허슬 세포 암종(Hurthle cell carcinoma), 유리질 암종(hyaline carcinoma), 하이페메프로이드 암종(hypemephroid carcinoma), 초기 배아 암종(infantile embryonal carcinoma), 상피내암종(carcinoma in situ), 표피내 암종(intraepidermal carcinoma), 상피내암종(intraepithelial carcinoma), 크롬페쳐 암종(Krompecher's carcinoma), 컬키츠키 세포 암종(Kulchitzky-cell carcinoma), 거대 세포 암종(large-cell carcinoma), 수정체 암종(lenticular carcinoma), 수정체양 암종(carcinoma lenticulare), 지방성 암종(lipomatous carcinoma), 림프상피 암종(lymphoepithelial carcinoma), 수양 암종(carcinoma medullare), 수질 암종(medullary carcinoma), 멜라닌성 암종(melanotic carcinoma), 피부연성 암종(carcinoma molle), 메르켈 세포 암종, 점액 암종(mucinous carcinoma), 뮤시파룸 암종(carcinoma muciparum), 점액세포 암종(carcinoma mucocellulare), 점액표피양 암종(mucoepidermoid carcinoma), 점막 암종(carcinoma mucosum), 점액 암종(mucous carcinoma), 점액종성 암종(carcinoma myxomatodes), 비인두 암종, 연맥세포 암종(oat cell carcinoma), 화골성 암종(carcinoma ossificans), 유골 암종(osteoid carcinoma), 유두상 암종, 문맥주위 암종(periportal carcinoma), 전침윤 암종(preinvasive carcinoma), 가시 세포 암종(prickle cell carcinoma), 풀모양 암종(pultaceous carcinoma), 신장의 신세포 암종, 예비 세포 암종(reserve cell carcinoma), 육종성 암종(carcinoma sarcomatodes), 슈나이더 암종(schneiderian carcinoma), 경성 암종(scirrhous carcinoma), 음낭 암종, 인환세포암종, 단순 암종(carcinoma simplex), 소세포 암종, 솔라노이드 암종(solanoid carcinoma), 구상 세포 암종(spheroidal cell carcinoma), 방추 세포 암종, 해면질 암종(carcinoma spongiosum), 편평 암종(squamous carcinoma), 편평 세포 암종, 스트링 암종(string carcinoma), 모세혈관확장성 암종(carcinoma telangiectaticum), 모세혈관확장고리 암종(carcinoma telangiectodes), 이행세포 암종(transitional cell carcinoma), 결절성 암종(carcinoma tuberosum), 결절 암종(tuberous carcinoma), 우췌상 암종(verrucous carcinoma), 경부 편평 세포 암종, 편도 편평 세포 암종 및 융모상 암종(carcinoma villosum)을 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 신세포 암종이다.
용어 "백혈병"은 "아구"로 지칭되는 미성숙 백혈구의 비정상적 증가를 특징으로 하는 혈액 또는 골수의 암의 유형을 지칭한다. 백혈병은 광범위한 질병을 포괄하는 광범위한 용어이다. 결국, 이는 혈액, 골수, 및 림프계에 영향을 미치는 훨씬 더 넓은 그룹의 질병의 부분이며, 이는 모두 혈액학적 신생물로서 알려져 있다. 백혈병은 4개의 주요 분류, 급성 림프구성(또는 림프모구) 백혈병(ALL), 급성 골수성(또는 골수 또는 비-림프성) 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 및 만성 골수성 백혈병(CML)으로 나뉠 수 있다. 백혈병의 추가 유형은 모발상 세포 백혈병(HCL), T-세포 전림프구성 백혈병(T-PLL), 거대 과립 림프구성 백혈병, 및 성인 T-세포 백혈병을 포함한다. 특정 구현예에서, 백혈병은 급성 백혈병을 포함한다. 특정 구현예에서, 백혈병은 만성 백혈병을 포함한다.
용어 "림프종"은 림프 세포로부터 발생된 혈구 종양의 그룹을 지칭한다. 림프종의 2가지 주요 범주는 호지킨 림프종(HL) 및 비-호지킨 림프종(NHL)이다. 림프종은 림프 조직의 임의의 신생물을 포함한다. 주요 부류는 림프 및 혈액 둘 모두에 속하고 둘 모두에 만연한 백혈구의 한 유형인 림프구의 암이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 및 약제학적 조성물은 다양한 유형의 고형 종양, 예를 들어, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암), 방광암, 비뇨생식기암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 신장(신장 세포)암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암(예를 들어, 갑상선 유두암), 피부암, 골암, 뇌암, 자궁경부암, 간암, 위암, 구강암, 식도암, 아데노이드 낭성 암, 신경모세포종, 고환암, 자궁암, 갑상선암, 두경부암, 신장암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암), 중피종, 난소암, 육종, 위암, 자궁암, 자궁경부암, 수모세포종 및 외음부암의 치료를 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 피부 암은 흑색종, 편평 세포 암종 및 피부 T-세포 림프종(CTCL)을 포함한다.
특정 구현예에서, 암은 "면역학적으로 차가운(immunologically cold)" 암, 예를 들어, 침윤성 T 세포를 거의 함유하지 않는 종양 또는 면역계에 의해 인식되지 않고 강한 반응을 야기하지 않는 암일 수 있으며, 이는 현재의 면역요법으로 치료하기 어렵게 만든다. 예를 들어, 일 구현예에서, 암은 흑색종, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 전립선암, 고환암, 요로상피암종, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 육종, 대장 선암종, 위장관 간질 종양, 위식도암종, 대장암, 췌장암, 신장암, 악성 중피종, 백혈병, 림프종, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 이행 세포 암종, 신경모세포종, 형질 세포 신생물, 빌름스 종양 및 간세포 암(예를 들어, 간세포 암종)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 암은 면역요법에 대하여 반응성인 암이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 암은 면역 체크포인트 조절제 요법, 예를 들어, 면역 체크포인트 저해제 요법에 대하여 반응성이다. 일부 구현예에서, 면역요법에 대하여 반응성인 암은 편평 세포 두경부암, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 간세포 암종, 진행성 신세포 암종, 전이성 고도-현미부수체 불안정성(MSI-H) 또는 불일치 복구 결함(dMMR) 암(예를 들어, MSI-H 또는 dMMR 대장암), 자궁경부암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 삼중 음성 유방암, 위식도 접합부(GEJ) 암종, 호지킨 림프종, 원발성 종격동 B-세포 림프종(PMBCL) 및 요로상피암(예를 들어, 국부 진행성 또는 전이성 요로상피암)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 암은 감소된 RIPK3 발현을 나타낸다. RIPK3 발현의 감소는 대장암, 위암, 난소암, 전립선암, 부신피질암 및 유방암을 포함하는 몇몇의 암에서 보고된 바 있다. 예를 들어, RIPK3 mRNA 수준은 대장암, 위암 및 난소암 환자에서 종양 성장 동안 점진적으로 감소되었으며, RIPK3 발현의 감소는 또한, 인간 전립선 종양 및 고등급 부신피질암 및 유방암의 전이까지의 진행과 관련이 있었다. 본원에 전체가 참조로 포함되는 문헌[Najafov et al., 2018, PLoS Biol 16(8): e2005756]을 참조한다. 일부 구현예에서, 암은 상응하는 비-암 세포에 비하여 감소된 RIPK3 발현을 나타내며, 예를 들어, 비-암 난소 세포에 비하여 감소된 RIPK3 발현을 나타내는 난소암 세포가 있다. 일부 구현예에서, 암은 예를 들어, 암의 진행으로 인하여, 동일한 유형의 암 세포에 비하여 감소된 RIPK3 발현을 나타낸다. 일 구현예에서, 감소된 RIPK3 발현을 나타내는 암은 대장암, 위암, 난소암, 전립선암, 부신피질암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 치료법은 또 다른 항-신생물(예를 들어, 면역치료) 섭생을 사용한 암에 대한 치료가 이전에 실패한 대상체에게 실행될 수 있다. "항-신생물 섭생이 실패한 대상체"는 RECIST 1.1 기준에 따라 항-신생물 섭생을 사용한 치료에 반응하지 않거나, 그에 대한 반응을 중단한, 즉, 단독으로 또는 가능한 경우 항-신생물 요법과 함께 종종 임상적으로 권고되는 수술 및/또는 방사선 요법과 함께 항-신생물 섭생 동안 또는 그의 완료 후에 표적 병변에서 완전 반응, 부분 반응 또는 안정한 질병을 달성하지 않거나; 또는 비-표적 병변의 완전 반응 또는 비-CR/비-PD를 달성하지 않는 암을 갖는 대상체이다. RECIST 1.1 기준은 예를 들어, 문헌[Eisenhauer et al., 2009, Eur. J. Cancer 45:228-24](이는 본원에 그의 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있으며, 하기에 더욱 상세히 논의된다. 실패한 항-신생물 섭생은 예를 들어, 종양 성장, 증가된 종양 부담 및/또는 종양 전이를 초래한다. 본원에 사용되는 바와 같은 실패한 항-신생물 섭생은 용량 제한 독성, 예를 들어, 독성을 야기하는 항-신생물제 또는 섭생을 사용한 치료의 지속 또는 재개를 허용할 수 없게 하는 III급 또는 IV급 독성으로 인하여 종료된 치료 섭생을 포함한다. 일 구현예에서, 대상체는 하나 이상의 항-혈관신생제의 투여를 포함하는 항-신생물 섭생을 사용한 치료에 실패한 바 있다.
실패한 항-신생물 섭생은 연장된 기간, 예를 들어, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 또는 임상적으로 정의된 치유보다 더 짧은 임의의 기간 동안 모든 표적 및 비-표적 병변에 대하여 적어도 안정한 질병을 초래하지 않는 치료 섭생을 포함한다. 실패한 항-신생물 섭생은 항-신생물제를 사용한 치료 동안 적어도 하나의 표적 병변의 진행성 질병을 초래하거나, 또는 치료 섭생의 종료 후 2주 미만, 1개월 미만, 2개월 미만, 3개월 미만, 4개월 미만, 5개월 미만, 6개월 미만, 12개월 미만, 또는 18개월 미만에 또는 임상적으로 정의된 치유보다 더 짧은 임의의 기간 미만에 진행성 질병을 초래하는 치료 섭생을 포함한다.
실패한 항-신생물 섭생은 암에 대하여 치료되는 대상체가 임상적으로 정의된 치유, 예를 들어, 치료 섭생의 종료 후 5년의 완전 반응을 달성하며, 대상체가 이후에, 예를 들어, 치료 섭생을 종료한지 5년 초과, 6년 초과, 7년 초과, 8년 초과, 9년 초과, 10년 초과, 11년 초과, 12년 초과, 13년 초과, 14년 초과 또는 15년 초과 후에 별개의 암을 갖는 것으로 진단을 받은 치료 섭생을 포함하지 않는다.
RECIST 기준은, 임상 시험에 이용하기 위하여, 고형 종양 측정에 대한 표준 접근법을 제공하고, 종양 크기 변화를 객관적으로 평가하기 위한 정의를 제공하는 데 이용되는 임상적으로 승인된 평가 기준이다. 또한, 이러한 기준은 고형 종양에 대한 치료를 받고 있는 개체의 반응을 모니터링하는 데 이용될 수 있다. RECIST 1.1 기준은 문헌[Eisenhauer et al., 2009, Eur. J. Cancer 45:228-24]에 상세히 논의되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 표적 병변에 대한 반응 기준은 다음을 포함한다:
완전 반응(Complete Response, CR): 모든 표적 병변이 사라짐. 임의의 병적 림프절(표적이든지 비-표적이든지)은 10 ㎜ 미만의 단축의 감소를 가져야 한다.
부분 반응(Partial Response, PR): 기준선 합계 직경을 참조로 하여, 표적 병변의 직경의 합의 적어도 30% 감소.
진행성 질병(Progressive Diseases, PD): 연구에서 최소 합계(이는 연구에서 최소값이면 기준선 합계를 포함한다)를 참조로 하여, 표적 병변 직경 합계의 적어도 20% 증가. 20%의 상대적 증가에 더하여, 합계는 또한 적어도 5 mm의 절대치 증가를 나타내야 한다. (주의: 하나 이상의 새로운 병변의 출현도 진행으로 고려한다.)
안정한 질병(Stable Disease, SD): 연구 중의 최소 합계 직경을 참조로 하여, PR로 확정될 만한 충분한 수축과 PD로 확정될 만한 충분한 증가가 모두 나타나지 않음.
또한, RECIST 1.1 기준은 측정 가능할 수 있는 병변으로 정의되는 비-표적 병변을 고려하나, 측정할 필요는 없으며, 원하는 시점에서 정성적으로 평가해야 할 뿐이다. 비-표적 병변에 대한 반응 기준은 다음을 포함한다:
완전 반응(Complete Response, CR): 모든 비-표적 병변의 소실 및 종양 마커 수준의 정규화. 모든 림프절은 크기가 비-병원성이어야 한다(10 mm 미만의 단축).
비-CR/비-PD: 하나 이상의 비-표적 병변(들)의 지속 및/또는 정상 한계 초과의 종양 마커 수준의 유지.
진행성 질병(Progressive Disease, PD): 기존의 비-표적 병변의 명백한 진행. 하나 이상의 새로운 병변의 출현도 진행으로 고려된다. 비-표적 질병을 기초로 "명백한 진행"을 달성하기 위하여, 비-표적 질병의 전체 수준에서 실질적인 악화가 존재하여, 표적 질병의 SD 또는 PR의 존재 하에서도, 전체 종양 부담이 치료를 중단할 만큼 충분히 증가한다. 하나 이상의 비-표적 병변의 크기의 적당한 "증가"는 보통은 명백한 진행 상태로 확정하기에 충분하지 않다. 그러므로, 표적 질병에서의 SD 또는 PR에 직면한, 비-표적 질병에서의 변화만을 기초로 한 전체 진행의 지정은 극히 드물 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물 및 조합 요법제는 불응성 암을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. "불응성 암"은 처음에 화학- 또는 방사선 요법에 비반응성이거나, 시간이 지나면서 화학- 또는 방사선 요법에 비반응성이 되는, 수술이 비효과적인 악성종양이다.
본 발명은 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물을 투여하여, 종양 세포 성장이 저해되도록 하는 단계를 포함하는 대상체에서의 종양 세포 성장의 저해 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 암을 치료하는 것은 대조군, 예를 들어, 본원에 기재된 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물로 처리되지 않은 대상체에 비하여 생존을 연장시키거나, 종양 진행까지의 시간을 연장시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 제1 용량의 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 투여 이전에 암(예를 들어, 종양)을 갖는 것으로 확인된다. 특정 구현예에서, 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 처음의 투여 시에 암(예를 들어, 종양)을 갖는다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 투여는 암 세포의 증식의 감소, 암 세포의 전이의 감소, 종양의 혈관신생의 감소, 종양 부담의 감소, 종양 크기, 중량 또는 부피의 감소, 종양 성장의 저해, 암의 진행까지의 시간의 증가 및/또는 종양학적 장애를 갖는 대상체의 생존 시간의 연장 중 하나 이상을 초래한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 투여는 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물을 투여하지 않은 상응하는 대조군 대상체에 비하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 만큼, 암 세포의 증식을 감소시키고/시키거나, 암 세포의 전이를 감소시키고/시키거나, 종양의 혈관신생을 감소시키고/시키거나, 종양 부담을 감소시키고/시키거나, 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나, 대상체의 생존 시간을 연장한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 투여는 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물을 투여하지 않은 종양학적 장애에 걸린 상응하는 대조군 대상체의 집단에 비하여, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 만큼, 암 세포의 증식을 감소시키고/시키거나, 암 세포의 전이를 감소시키고/시키거나, 종양의 혈관신생을 감소시키고/시키거나, 종양 부담을 감소시키고/시키거나, 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나, 종양학적 장애에 걸린 대상체의 집단의 생존 시간을 연장한다. 일부 구현예에서, 암 세포의 증식은 대상체가 받은 암 치료법으로부터 초래되는 암 세포의 과다증식이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 투여는 치료 이전에 진행성 종양학적 장애를 갖는 대상체에서 종양학적 장애를 안정화시킨다.
본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 조합은 단독의 각각의 타노트랜스미션 폴리펩티드보다 더 큰 정도로 암 치료를 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 것은, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 오직 하나만을 인코딩하는 핵산 분자를 투여한 대상체에 비하여, 암 치료를 개선시킨다(예를 들어, 암 세포의 증식을 감소시키고/시키거나, 암 세포의 전이를 감소시키고/시키거나, 종양의 혈관신생을 감소시키고/시키거나, 종양 부담을 감소시키고/시키거나, 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나, 암의 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 암을 갖는 대상체의 생존 시간을 연장한다). 예를 들어, 일부 구현예에서, TRIF 및 RIPK3을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 투여하는 것은 단지 TRIF만을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 투여하는 대상체에 비하여 및/또는 단지 RIPK3만을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 투여하는 대상체에 비하여 암 치료를 개선시킨다(예를 들어, 암 세포의 증식을 감소시키고/시키거나, 암 세포의 전이를 감소시키고/시키거나, 종양의 혈관신생을 감소시키고/시키거나, 종양 부담을 감소시키고/시키거나, 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나, 암의 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 암을 갖는 대상체의 생존 시간을 연장한다). 일부 구현예에서, TRIF 및 RIPK3을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 투여하는 것은 단지 TRIF만을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 투여하는 대상체에 비하여 암(예를 들어, 결장암) 치료를 개선시킨다(예를 들어, 생존 시간을 연장한다).
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드에 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 부가하는 것은, 단지 둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드만에 비하여 암 치료를 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하고, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 것은, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하지만 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하지 않는 핵산 분자를 투여한 대상체에 비하여 암 치료를 개선시킨다(예를 들어, 암 세포의 증식을 감소시키고/시키거나, 암 세포의 전이를 감소시키고/시키거나, 종양의 혈관신생을 감소시키고/시키거나, 종양 부담을 감소시키고/시키거나, 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나, 암의 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 암을 갖는 대상체의 생존 시간을 연장한다). 예를 들어, 일부 구현예에서, TRIF, RIPK3, 및 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드(예를 들어, vICA, FADD-DN 또는 cFLIP)를 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는, TRIF 및 RIPK3을 인코딩하지만 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 인코딩하지 않는 핵산 분자를 투여한 대상체에 비하여 암 치료를 개선시킨다(예를 들어, 암 세포의 증식을 감소시키고/시키거나, 암 세포의 전이를 감소시키고/시키거나, 종양의 혈관신생을 감소시키고/시키거나, 종양 부담을 감소시키고/시키거나, 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나, 암의 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 암을 갖는 대상체의 생존 시간을 연장한다). 일부 구현예에서, TRIF, RIPK3 및 vICA를 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는, TRIF 및 RIPK3을 인코딩하지만 vICA를 인코딩하지 않는 핵산 분자를 투여한 대상체에 비하여 암(예를 들어, 결장암) 치료를 개선시킨다(예를 들어, 종양 성장을 감소시킨다). 일부 구현예에서, TRIF, RIPK3 및 FADD-DN을 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는, TRIF 및 RIPK3을 인코딩하지만 FADD-DN을 인코딩하지 않는 핵산 분자를 투여한 대상체에 비하여 암(예를 들어, 결장암) 치료를 개선시킨다(예를 들어, 종양 성장을 감소시킨다).
둘 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드에서의 하나 이상의 가스더민 폴리펩티드의 포함은 가스더민을 포함하지 않는 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드에 비하여 암 치료를 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 적어도 하나의 가스더민(예를 들어, 가스더민 E) 및 하나 이상의 추가의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는, 단지 하나 이상의 추가의 타노트랜스미션 폴리펩티드만을 인코딩하는 핵산 분자에 비하여 암 치료를 개선시킨다(예를 들어, 암 세포의 증식을 감소시키고/시키거나, 암 세포의 전이를 감소시키고/시키거나, 종양의 혈관신생을 감소시키고/시키거나, 종양 부담을 감소시키고/시키거나, 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나, 암의 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 암을 갖는 대상체의 생존 시간을 연장한다). 일부 구현예에서, TRIF 및 가스더민(예를 들어, 가스더민 E)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는 단지 TRIF만을 인코딩하는 핵산 분자에 비하여 암 치료를 개선시킨다(예를 들어, 암 세포의 증식을 감소시키고/시키거나, 암 세포의 전이를 감소시키고/시키거나, 종양의 혈관신생을 감소시키고/시키거나, 종양 부담을 감소시키고/시키거나, 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나, 암의 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 암을 갖는 대상체의 생존 시간을 연장한다). 일부 구현예에서, TRIF, RIPK3 및 적어도 하나의 가스더민(예를 들어, 가스더민 E)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는 단지 TRIF 및 RIPK3만을 인코딩하는 핵산 분자에 비하여 암 치료를 개선시킨다(예를 들어, 암 세포의 증식을 감소시키고/시키거나, 암 세포의 전이를 감소시키고/시키거나, 종양의 혈관신생을 감소시키고/시키거나, 종양 부담을 감소시키고/시키거나, 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나, 암의 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 암을 갖는 대상체의 생존 시간을 연장한다). 일부 구현예에서, TRIF 및 가스더민 E를 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는 단지 TRIF만을 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여에 비하여 암(예를 들어, 결장암) 치료를 개선시킨다(예를 들어, 생존 시간을 연장한다). 일부 구현예에서, TRIF, RIPK3 및 가스더민 E를 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여는 단지 TRIF 및 RIPK3만을 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여에 비하여 암(예를 들어, 결장암) 치료를 개선시킨다(예를 들어, 생존 시간을 연장한다).
본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물 및 추가의 치료제의 조합 요법
용어 "조합하여 투여하는", "조합 요법", "동시-투여하는" 또는 "동시-투여"는 하나 이상의 추가의 치료제와 조합된, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 투여를 지칭할 수 있다. 하나 이상의 추가의 치료제는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 투여 이전에, 이와 동시에 또는 이와 실질적으로 동시에, 이후에 또는 이와 간헐적으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 투여 이전에 투여된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물과 동시에 투여된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 투여 이후에 투여된다.
하나 이상의 추가의 치료제 및 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물은 상가적으로 또는 상승적으로 작용한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제 및 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물은 상승적으로 작용한다. 일부 구현예에서, 종양학적 장애 또는 감염의 치료에 상승적 효과가 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제 및 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 조합은 암에 대한 면역 반응의 지속성을 개선시키며, 즉, 이의 기간을 연장한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제 및 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물은 상가적으로 작용한다.
1. 면역 체크포인트 조절제
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물과 조합하여 투여되는 추가의 치료제는 면역 체크포인트 분자의 면역 체크포인트 조절제이다. 면역 체크포인트 분자의 예에는 LAG-3(문헌[Triebel et al., 1990, J. Exp. Med. 171: 1393-1405]), TIM-3(문헌[Sakuishi et al., 2010, J. Exp. Med. 207: 2187-2194]), VISTA(문헌[Wang et al., 2011, J. Exp. Med. 208: 577-592]), ICOS(문헌[Fan et al., 2014, J. Exp. Med. 211: 715-725]), OX40(문헌[Curti et al., 2013, Cancer Res. 73: 7189-7198]) 및 4-1BB(문헌[Melero et al., 1997, Nat. Med. 3: 682-685])가 포함된다.
면역 체크포인트는 자극성 면역 체크포인트(즉, 면역 반응을 자극하는 분자) 또는 저해성 면역 체크포인트(즉, 면역 반응을 저해하는 분자)일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 저해성 면역 체크포인트의 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 자극성 면역 체크포인트의 효능제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 면역 체크포인트 결합 단백질(예를 들어, 항체, 항체 Fab 단편, 이가 항체, 항체 약물 컨쥬게이트, scFv, 융합 단백질, 2가 항체 또는 4가 항체)이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 1가지 초과의 면역 체크포인트에 결합하거나, 그의 활성을 조절할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 자극성 및 저해성 면역 체크포인트, 및 이들 면역 체크포인트를 조절하는 분자의 예는 하기에 제공되어 있다.
i. 자극성 면역 체크포인트 분자
CD27은 나이브 T 세포의 항원-특이적 증식을 지원하며, T 세포 기억의 생성을 위하여 필수적이다(예를 들어, 문헌[Hendriks et al. (2000) Nat. Immunol. 171 (5): 433-40] 참조). CD27은 또한, B 세포의 기억 마커이다(예를 들어, 문헌[Agematsu et al. (2000) Histol. Histopathol. 15 (2): 573-6] 참조). CD27 활성은 림프구 및 수지상 세포 상의 그의 리간드, CD70의 일시적인 이용 가능성에 의해 결정된다(예를 들어, 문헌[Borst et al. (2005) Curr. Opin. Immunol. 17 (3): 275-81] 참조). CD27에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD27의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD27에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-CD27 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD27 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD27 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD27-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 바를릴루맙(varlilumab)(셀덱스 테라퓨틱스(Celldex Therapeutics))이다. 추가의 CD27-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,248,183호, 제9,102,737호, 제9,169,325호, 제9,023,999호, 제8,481,029호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0185870호, 제2015/0337047호, 제2015/0299330호, 제2014/0112942호, 제2013/0336976호, 제2013/0243795호, 제2013/0183316호, 제2012/0213771호, 제2012/0093805호, 제2011/0274685호, 제2010/0173324호; 및 PCT 공개 제WO 2015/016718호, 제WO 2014/140374호, 제WO 2013/138586호, 제WO 2012/004367호, 제WO 2011/130434호, 제WO 2010/001908호 및 제WO 2008/051424호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
CD28. 분화 클러스터 28(CD28)은 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공동-자극 신호를 제공하는 T 세포 상에서 발현되는 단백질 중 하나이다. T-세포 수용체(TCR)에 더하여 CD28을 통한 T 세포 자극은 다양한 인터류킨(특히 IL-6)의 생성을 위한 강력한 신호를 제공할 수 있다. 수지상 세포 상에서 발현되는 그의 2개의 리간드, CD80 및 CD86과의 결합은 T 세포 증식을 촉진시킨다(예를 들어, 문헌[Prasad et al. (1994) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91(7): 2834-8] 참조). CD28에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD28의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD28에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-CD28 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD28 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD28 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD28-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TAB08(테라맙 엘엘씨(TheraMab LLC)), 룰리주맙(lulizumab)(BMS-931699로도 알려져 있음, 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)) 및 FR104(오에스이 이뮤노테라퓨틱스(OSE Immunotherapeutics))로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 CD28-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,119,840호, 제8,709,414호, 제9,085,629호, 제8,034,585호, 제7,939,638호, 제8,389,016호, 제7,585,960호, 제8,454,959호, 제8,168,759호, 제8,785,604호, 제7,723,482호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0017039호, 제2015/0299321호, 제2015/0150968호, 제2015/0071916호, 제2015/0376278호, 제2013/0078257호, 제2013/0230540호, 제2013/0078236호, 제2013/0109846호, 제2013/0266577호, 제2012/0201814호, 제2012/0082683호, 제2012/0219553호, 제2011/0189735호, 제2011/0097339호, 제2010/0266605호, 제2010/0168400호, 제2009/0246204호, 제2008/0038273호; 및 PCT 공개 제WO 2015198147호, 제WO 2016/05421호, 제WO 2014/1209168호, 제WO 2011/101791호, 제WO 2010/007376호, 제WO 2010/009391호, 제WO 2004/004768호, 제WO 2002/030459호, 제WO 2002/051871호 및 제WO 2002/047721호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
CD40. 분화 클러스터 40(CD40, TNFRSF5로도 알려져 있음)은 항원 제시 세포를 포함하는 다양한 면역계 세포 상에서 관찰된다. 다르게는 CD154로 알려져 있는 CD40L은 CD40의 리간드이며, 활성화된 CD4+ T 세포의 표면 상에서 일시적으로 발현된다. CD40 신호전달은 수지상 세포가 성숙하는 것을 '인가'함으로써 T-세포 활성화 및 분화를 촉발시키는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 문헌[O'Sullivan et al. (2003) Crit. Rev. Immunol. 23 (1): 83-107] 참조). CD40에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD40의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD40에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-CD40 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD40 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD40 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 다세투주맙(dacetuzumab)(제넨테크(Genentech)/시애틀 지네틱스(Seattle Genetics)), CP-870,893(화이자(Pfizer)), 블레셀루맙(bleselumab)(아스텔라스 파마(Astellas Pharma)), 루카투무맙(lucatumumab)(노바티스(Novartis)), CFZ533(노바티스; 예를 들어, 문헌[Cordoba et al. (2015) Am. J. Transplant. 15(11): 2825-36] 참조), RG7876(제넨테크 인코포레이티드(Genentech Inc.)), FFP104(판제네틱스, 비.브이.(PanGenetics, B.V.)), APX005(아펙시젠(Apexigen)), BI 655064(뵈링거 인겔하임(Boehringer Ingelheim)), Chi Lob 7/4(캔서 리서치 유케이(Cancer Research UK); 예를 들어, 문헌[Johnson et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21(6): 1321-8] 참조), ADC-1013(바이오인벤트 인터내셔널(BioInvent International)), SEA-CD40(시애틀 제네틱스), XmAb 5485(젠코르(Xencor)), PG120(판제네틱스 비.브이.), 테넬릭시맙(teneliximab)(브리스톨-마이어스 스큅; 예를 들어, 문헌[Thompson et al. (2011) Am. J. Transplant. 11(5): 947-57] 참조) 및 AKH3(비오겐(Biogen); 예를 들어, 국제 공개 제WO 2016/028810호)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD40-결합 단백질이다. 추가의 CD40-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,234,044호, 제9,266,956호, 제9,109,011호, 제9,090,696호, 제9,023,360, 제9,023,361호, 제9,221,913호, 제8,945,564호, 제8,926,979호, 제8,828,396호, 제8,637,032호, 제8,277,810호, 제8,088,383호, 제7,820,170호, 제7,790,166호, 제7,445,780호, 제7,361,345호, 제8,961,991호, 제8,669,352호, 제8,957,193호, 제8,778,345호, 제8,591,900호, 제8,551,485호, 제8,492,531호, 제8,362,210호, 제8,388,971호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0045597호, 제2016/0152713호, 제2016/0075792호, 제2015/0299329호, 제2015/0057437호 제2015/0315282호, 제2015/0307616호, 제2014/0099317호, 제2014/0179907호, 제2014/0349395호, 제2014/0234344호, 제2014/0348836호, 제2014/0193405호, 제2014/0120103호, 제2014/0105907호, 제2014/0248266호, 제2014/0093497호, 제2014/0010812호, 제2013/0024956호, 제2013/0023047호, 제2013/0315900호, 제2012/0087927호, 제2012/0263732호, 제2012/0301488호, 제2011/0027276호, 제2011/0104182호, 제2010/0234578호, 제2009/0304687호, 제2009/0181015호, 제2009/0130715호, 제2009/0311254호, 제2008/0199471호, 제2008/0085531호, 제2016/0152721호, 제2015/0110783호, 제2015/0086991호, 제2015/0086559호, 제2014/0341898호, 제2014/0205602호, 제2014/0004131호, 제2013/0011405호, 제2012/0121585호, 제2011/0033456호, 제2011/0002934호, 제2010/0172912호, 제2009/0081242호, 제2009/0130095호, 제2008/0254026호, 제2008/0075727호, 제2009/0304706호, 제2009/0202531호, 제2009/0117111호, 제2009/0041773호, 제2008/0274118호, 제2008/0057070호, 제2007/0098717호, 2007/0218060호, 제2007/0098718호, 제2007/0110754호; 및 PCT 공개 제WO 2016/069919호, 제WO 2016/023960호, 제WO 2016/023875호, 제WO 2016/028810호, 제WO 2015/134988호, 제WO 2015/091853호, 제WO 2015/091655호, 제WO 2014/065403호, 제WO 2014/070934호, 제WO 2014/065402호, 제WO 2014/207064호, 제WO 2013/034904호, 제WO 2012/125569호, 제WO 2012/149356호, 제WO 2012/111762호, 제WO 2012/145673호, 제WO 2011/123489호, 제WO 2010/123012호, 제WO 2010/104761호, 제WO 2009/094391호, 제WO 2008/091954호, 제WO 2007/129895호, 제WO 2006/128103호, 제WO 2005/063289호, 제WO 2005/063981호, 제WO 2003/040170호, 제WO 2002/011763호, 제WO 2000/075348호, 제WO 2013/164789호, 제WO 2012/075111호, 제WO 2012/065950호, 제WO 2009/062054호, 제WO 2007/124299호, 제WO 2007/053661호, 제WO 2007/053767호, 제WO 2005/044294호, 제WO 2005/044304호, 제WO 2005/044306호, 제WO 2005/044855호, 제WO 2005/044854호, 제WO 2005/044305호, 제WO 2003/045978호, 제WO 2003/029296호, 제WO 2002/028481호, 제WO 2002/028480호, 제WO 2002/028904호, 제WO 2002/028905호, 제WO 2002/088186호 및 제WO 2001/024823호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
CD122. CD122는 인터류킨-2 수용체 베타 서브-유닛이며, CD8+ 이펙터 T 세포의 증식을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Boyman et al. (2012) Nat. Rev. Immunol. 12 (3): 180-190]을 참조한다. CD122에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD122의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD122에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-CD122 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD122 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CD22 효능제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 인간화된 MiK-Beta-1(로슈(Roche); 예를 들어, 참조로 포함되는 문헌[Morris et al. (2006) Proc Nat'l. Acad. Sci. USA 103(2): 401-6] 참조)이다. 추가의 CD122-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제9,028,830호에 개시되어 있다.
OX40. OX40 수용체(CD134로도 알려져 있음)는 이펙터 및 기억 T 세포의 증식을 촉진시킨다. OX40은 또한, T-조절 세포의 분화 및 활성을 억제하며, 사이토카인 생성을 조절한다(예를 들어, 문헌[Croft et al. (2009) Immunol. Rev. 229(1): 173-91] 참조). OX40에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 OX40의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 OX40에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-OX40 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 OX40 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 OX40 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 MEDI6469(아고녹스(AgonOx)/메드이뮨(Medimmune)), 포갈리주맙(pogalizumab)(MOXR0916 및 RG7888로도 알려져 있음; 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)), 타볼릭시주맙(tavolixizumab)(MEDI0562로도 알려져 있음; 메드이뮨) 및 GSK3174998(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline))로 이루어진 군으로부터 선택되는 OX40-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 추가의 OX-40-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,163,085호, 제9,040,048호, 제9,006,396호, 제8,748,585호, 제8,614,295호, 제8,551,477호, 제8,283,450호, 제7,550,140호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0068604호, 제2016/0031974호, 제2015/0315281호, 제2015/0132288호, 제2014/0308276호, 제2014/0377284호, 제2014/0044703호, 제2014/0294824호, 제2013/0330344호, 제2013/0280275호, 제2013/0243772호, 제2013/0183315호, 제2012/0269825호, 제2012/0244076호, 제2011/0008368호, 제2011/0123552호, 제2010/0254978호, 제2010/0196359호, 제2006/0281072호; 및 PCT 공개 제WO 2014/148895호, 제WO 2013/068563호, 제WO 2013/038191호, 제WO 2013/028231호, 제WO 2010/096418호, 제WO 2007/062245호 및 제WO 2003/106498호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
GITR. 글루코코르티코이드-유도된 TNFR 과 관련 유전자(GITR)는 Treg, CD4 및 CD8 T 세포 상에서 구성적으로 또는 조건적으로 발현되는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 상과의 구성원이다. GITR은 TCR 라이게이션 및 활성화 이후 이펙터 T 세포 상에서 신속하게 상향조절된다. 인간 GITR 리간드(GITRL)는 이차 림프계 기관 및 일부 비림프계 조직 내의 APC 상에서 구성적으로 발현된다. GITR:GITRL 상호작용의 다운스트림 효과는 Treg 활성의 약화를 유도하고, CD4+ T 세포 활성을 향상시켜, Treg-매개의 면역억제의 역전 및 증가된 면역 자극을 초래한다. GITR에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 GITR의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 GITR에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-GITR 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 GITR 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 GITR 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TRX518(리프 테라퓨틱스(Leap Therapeutics)), MK-4166(머크 앤드 컴퍼니(Merck & Co.)), MEDI-1873(메드이뮨), INCAGN1876(아제누스(Agenus)/인사이트(Incyte)) 및 FPA154(파이브 프라임 테라퓨틱스(Five Prime Therapeutics))로 이루어진 군으로부터 선택되는 GITR-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 추가의 GITR-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,309,321호, 제9,255,152호, 제9,255,151호, 제9,228,016호, 제9,028,823호, 제8,709,424호, 제8,388,967호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0145342호, 제2015/0353637호, 제2015/0064204호, 제2014/0348841호, 제2014/0065152호, 제2014/0072566호, 제2014/0072565호, 제2013/0183321호, 제2013/0108641호, 제2012/0189639호; 및 PCT 공개 제WO 2016/054638호, 제WO 2016/057841호, 제WO 2016/057846호, 제WO 2015/187835호, 제WO 2015/184099호, 제WO 2015/031667호, 제WO 2011/028683호 및 제WO 2004/107618호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
ICOS. 유도성 T-세포 공동자극인자(ICOS, CD278로도 알려져 있음)는 활성화된 T 세포 상에서 발현된다. 그의 리간드는 ICOSL이며, 이는 주로 B 세포 및 수지상 세포 상에서 발현된다. ICOS는 T 세포 이펙터 기능에 중요하다. ICOS 발현은 T 세포 활성화 시에 상향-조절된다(예를 들어, 문헌[Fan et al. (2014) J. Exp. Med. 211(4): 715-25] 참조). ICOS에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 ICOS의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 ICOS에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-ICOS 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 ICOS 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 ICOS 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 MEDI-570(JMab-136으로도 알려져 있음, 메드이뮨), GSK3359609(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)/INSERM) 및 JTX-2011(조운스 테라퓨틱스(Jounce Therapeutics))로 이루어진 군으로부터 선택되는 ICOS-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 추가의 ICOS-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,376,493호, 제7,998,478호, 제7,465,445호, 제7,465,444호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0239978호, 제2012/0039874호, 제2008/0199466호, 제2008/0279851호; 및 PCT 공개 제WO 2001/087981호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
4-1BB. 4-1BB(CD137로도 알려져 있음)는 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 상과의 구성원이다. 4-1BB(CD137)는 II형 막횡단 당단백질이며, 이는 프라이밍된 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 활성화된 NK 세포, DC 및 호중구 상에서 유도적으로 발현되며, 활성화된 대식구, B 세포 및 DC 상에서 관찰되는 4-1BB 리간드(4-1BBL)에 결합되는 경우 T 세포 공동자극 분자로서 작용한다. 4-1BB 수용체의 라이게이션은 NF-κB, c-Jun 및 p38 신호전달 경로의 활성화를 야기하며, 구체적으로 항아폽토시스 유전자 BcL-x(L) 및 Bfl-1의 발현을 상향조절함으로써 CD8+ T 세포의 생존을 촉진시키는 것으로 나타난 바 있다. 이 방식으로, 4-1BB는 준최적의 면역 반응을 부스팅하거나, 심지어 구제하는 역할을 한다. 4-1BB에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 4-1BB의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 4-1BB에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-4-1BB 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 4-1BB 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 4-1BB 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 4-1BB-결합 단백질이며, 이는 우렐루맙(urelumab)(BMS-663513으로도 알려져 있음; 브리스톨-마이어스 스큅) 또는 우토밀루맙(utomilumab)(화이자)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 4-1BB-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 4-1BB-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,382,328호, 제8,716,452호, 제8,475,790호, 제8,137,667호, 제7,829,088호, 제7,659,384호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0083474호, 제2016/0152722호, 제2014/0193422호, 제2014/0178368호, 제2013/0149301호, 제2012/0237498호, 제2012/0141494호, 제2012/0076722호, 2011/0177104호, 제2011/0189189호, 제2010/0183621호, 제2009/0068192호, 제2009/0041763호, 2008/0305113호, 제2008/0008716호; 및 PCT 공개 제WO 2016/029073호, 제WO 2015/188047호, 제WO 2015/179236호, 제WO 2015/119923호, 제WO 2012/032433호, 제WO 2012/145183호, 제WO 2011/031063호, 제WO 2010/132389호, 제WO 2010/042433호, 제WO 2006/126835호, 제WO 2005/035584호, 제WO 2004/010947호; 및 문헌[Martinez-Forero et al. (2013) J. Immunol. 190(12): 6694-706] 및 문헌[Dubrot et al. (2010) Cancer Immunol. Immunother. 59(8): 1223-33]에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
ii. 저해성 면역 체크포인트 분자
ADORA2A. 아데노신 A2A 수용체(A2A4)는 7개의 막횡단 알파 나선을 보유하는 G-단백질-커플링된 수용체(GPCR) 과의 구성원이며, 암 치료법에서 중요한 체크포인트로서 간주된다. A2A 수용체는 과반응성 면역 세포를 음성적으로 조절할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ohta et al. (2001) Nature 414(6866): 916-20] 참조). ADORA2A에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 ADORA2A의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 ADORA2A에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-ADORA2A 항체)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 ADORA2A-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 ADORA2A 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 ADORA2A 길항제이다. ADORA2A-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2014/0322236호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
B7-H3. B7-H3(CD276으로도 알려져 있음)은 B7 상과, 즉, T-세포 반응을 공동자극하거나 하향-조절하는 분자의 군에 속한다. B7-H3은 인간 T-세포 반응을 강력하게, 그리고 지속적으로 하향-조절한다(예를 들어, 문헌[Leitner et al. (2009) Eur. J. Immunol. 39(7): 1754-64] 참조). B7-H3에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 B7-H3의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 B7-H3에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-B7-H3 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 B7-H3 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 B7-H3 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 DS-5573(다이치 산교, 인코포레이티드(Daiichi Sankyo, Inc.)), 에노블리투주맙(enoblituzumab)(마크로제닉스, 인코포레이티드(MacroGenics, Inc.)) 및 8H9(슬로안 케터링 인스티튜트 포 캔서 리서치(Sloan Kettering Institute for Cancer Research); 예를 들어, 문헌[Ahmed et al. (2015) J. Biol. Chem. 290(50): 30018-29] 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-B7-H3-결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 B7-H3-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. B7-H3-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,371,395호, 제9,150,656호, 제9,062,110호, 제8,802,091호, 제8,501,471호, 제8,414,892호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0352224호, 제2015/0297748호, 제2015/0259434호, 제2015/0274838호, 제2014/032875호, 제2014/0161814호, 제2013/0287798호, 제2013/0078234호, 제2013/0149236호, 제2012/02947960호, 제2010/0143245호, 제2002/0102264호; PCT 공개 제WO 2016/106004호, 제WO 2016/033225호, 제WO 2015/181267호, 제WO 2014/057687호, 제WO 2012/147713호, 제WO 2011/109400호, 제WO 2008/116219호, 제WO 2003/075846호, 제WO 2002/032375호; 및 문헌[Shi et al. (2016) Mol. Med. Rep. 14(1): 943-8]에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
B7-H4. B7-H4(O8E, OV064 및 V-세트 도메인-함유 T-세포 활성화 저해제(VTCN1)로도 알려져 있음)는 B7 상과에 속한다. T 세포의 B7-H4 라이게이션은 세포 주기를 정지시킴으로써, 성장, 사이토카인 분비 및 세포독성의 발생에 극심한 저해 효과를 갖는다. 마우스 내로의 B7-H4Ig의 투여는 항원-특이적 T 세포 반응을 손상시키는 반면, 특이적인 모노클로널 항체에 의한 내인성 B7-H4의 차단은 T 세포 반응을 촉진시킨다(예를 들어, 문헌[Sica et al. (2003) Immunity 18(6): 849-61] 참조). B7-H4에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 B7-H4의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 B7-H4에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-B7-H4 항체)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 B7-H4-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 B7-H4 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 B7-H4 길항제이다. B7-H4-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,296,822호, 제8,609,816호, 제8,759,490호, 제8,323,645호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0159910호, 제2016/0017040호, 제2016/0168249호, 제2015/0315275호, 제2014/0134180호, 제2014/0322129호, 제2014/0356364호, 제2014/0328751호, 제2014/0294861호, 제2014/0308259호, 제2013/0058864호, 제2011/0085970호, 제2009/0074660호, 제2009/0208489호; 및 PCT 공개 제WO 2016/040724호, 제WO 2016/070001호, 제WO 2014/159835호, 제WO 2014/100483호, 제WO 2014/100439호, 제WO 2013/067492호, 제WO 2013/025779호, 제WO 2009/073533호, 제WO 2007/067991호 및 제WO 2006/104677호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
BTLA. CD272로도 알려져 있는 B 및 T 림프구 약화인자(Attenuator)(BTLA)는 그의 리간드로서 HVEM(헤르페스바이러스 유입 매개체)을 갖는다. BTLA의 표면 발현은 나이브(naive)로부터 이펙터 세포 표현형으로의 인간 CD8+ T 세포의 분화 동안 점차 하향조절되지만, 종양-특이적 인간 CD8+ T 세포는 높은 수준의 BTLA를 발현한다(예를 들어, 문헌[Derre et al. (2010) J. Clin. Invest. 120 (1): 157-67] 참조). BTLA에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 BTLA의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 BTLA에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-BTLA 항체)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 BTLA-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 BTLA 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 BTLA 길항제이다. BTLA-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,346,882호, 제8,580,259호, 제8,563,694호, 제8,247,537호; 미국 특허 출원 공개 제2014/0017255호, 제2012/0288500호, 제2012/0183565호, 제2010/0172900호; 및 PCT 공개 제WO 2011/014438호 및 제WO 2008/076560호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
CTLA-4. 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4)는 면역 조절 CD28-B7 면역글로불린 상과의 구성원이며, B7-의존적 및 B7-독립적 경로 둘 모두를 통하여 면역억제를 촉진시키도록 나이브 및 휴지 T 림프구 상에서 작용한다(예를 들어, 문헌[Kim et al. (2016) J. Immunol. Res., Article ID 4683607, 14 pp.] 참조). CTLA-4는 소위 CD152로도 알려져 있다. CTLA-4는 T 세포 활성화에 대한 임계값을 조절한다. 예를 들어, 문헌[Gajewski et al. (2001) J. Immunol. 166(6): 3900-7]을 참조한다. CTLA-4에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-CTLA-4 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CTLA-4 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 CTLA-4 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 이필리무맙(예르보이(Yervoy); 메다렉스(Medarex)/브리스톨-마이어스 스큅), 트레멜리무맙(이전에 티실리무맙(ticilimumab); 화이자/아스트라제네카(AstraZeneca)), JMW-3B3(유니버시티 오브 아베르딘(University of Aberdeen)) 및 AGEN1884(아제누스)로 이루어진 군으로부터 선택되는 CTLA-4-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 추가의 CTLA-4 결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제8,697,845호; 미국 특허 출원 공개 제2014/0105914호, 제2013/0267688호, 제2012/0107320호, 제2009/0123477호; 및 PCT 공개 제WO 2014/207064호, 제WO 2012/120125호, 제WO 2016/015675호, 제WO 2010/097597호, 제WO 2006/066568호 및 제WO 2001/054732호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
IDO. 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO)는 면역-저해 특성을 갖는 트립토판 이화작용 효소이다. 또 다른 중요한 분자는 TDO, 트립토판 2,3-디옥시게나제이다. IDO는 T 및 NK 세포를 억제하고, Treg 및 골수-유래 억제자 세포를 생성하고 이를 활성화시키고, 종양 혈관형성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 본원에 참조로 포함되는 문헌[Prendergast et al., 2014, Cancer Immunol Immunother. 63 (7): 721-35].
IDO에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 IDO의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 IDO에 결합하는 작용제(예를 들어, IDO 결합 단백질, 예컨대 항-IDO 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 IDO 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 IDO 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 노르하르만(Norharmane), 로즈마린산(Rosmarinic acid), COX-2 저해제, 알파-메틸-트립토판 및 에파카도스타트(Epacadostat)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 조절제는 에파카도스타트이다.
KIR. 살해 면역글로불린-유사 수용체(KIR)는 세포를 NK-매개의 세포 용해로부터 보호하는 자연 살해(NK) 세포 기능을 음성적으로 조절하는 다양한 레퍼토리의 MHCI 결합 분자를 포함한다. KIR은 일반적으로 NK 세포 상에서 발현되지만, 종양 특이적 CTL 상에서도 검출된 바 있다. KIR에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 KIR의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 KIR에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-KIR 항체)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 KIR-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 KIR 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 KIR 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 리릴루맙(lirilumab)(BMS-986015로도 알려져 있음; 브리스톨-마이어스 스큅)이다. 추가의 KIR 결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제8,981,065호, 제9,018,366호, 제9,067,997호, 제8,709,411호, 제8,637,258호, 제8,614,307호, 제8,551,483호, 제8,388,970호, 제8,119,775호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0344576호, 제2015/0376275호, 제2016/0046712호, 제2015/0191547호, 제2015/0290316호, 제2015/0283234호, 제2015/0197569호, 제2014/0193430호, 제2013/0143269호, 제2013/0287770호, 2012/0208237호, 제2011/0293627호, 제2009/0081240호, 제2010/0189723호; 및 PCT 공개 제WO 2016/069589호, 제WO 2015/069785호, 제WO 2014/066532호, 제WO 2014/055648호, 제WO 2012/160448호, 제WO 2012/071411호, 제WO 2010/065939호, 제WO 2008/084106호, 제WO 2006/072625호, 제WO 2006/072626호 및 제WO 2006/003179호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
LAG-3, 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3, CD223으로도 알려져 있음)은 CD4-관련 막횡단 단백질이며, 이는 MHC II에 경쟁적으로 결합하며, T 세포 활성화를 위한 공동-저해성 체크포인트로서 작용한다(예를 들어, 문헌[Goldberg and Drake (2011) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 344: 269-78] 참조). LAG-3에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 LAG-3의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 LAG-3에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-PD-1 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 LAG-3 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 LAG-3 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 펨브롤리주맙(케이트루다(Keytruda); 이전에 람브롤리주맙(lambrolizumab); 머크 앤드 컴퍼니, 인코포레이티드), 니볼루맙(nivolumab)(오프디보(Opdivo); 브리스톨-마이어스 스큅), 피딜리주맙(CT-011, 큐어테크(CureTech)), SHR-1210(인사이트/지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니, 리미티드(Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.)), MEDI0680(AMP-514로도 알려져 있음; 앰플이뮨 인코포레이티드(Amplimmune Inc.)/메드이뮨), PDR001(노바티스), BGB-A317(베이진 리미티드(BeiGene Ltd.)), TSR-042(ANB011로도 알려져 있음; 아납티스바이오(AnaptysBio)/테사로, 인코포레이티드(Tesaro, Inc.)), REGN2810(리제네론 파마슈티컬즈, 인코포레이티드(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)/사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis)) 및 PF-06801591(화이자)로 이루어진 군으로부터 선택되는 LAG-3-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 추가의 PD-1-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,181,342호, 제8,927,697호, 제7,488,802호, 제7,029,674호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0152180호, 제2011/0171215호, 제2011/0171220호; 및 PCT 공개 제WO 2004/056875호, 제WO 2015/036394호, 제WO 2010/029435호, 제WO 2010/029434호, 제WO 2014/194302호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
PD-1. 세포 예정사 단백질 1(PD-1, CD279 및 PDCD1로도 알려져 있음)은 면역계를 음성적으로 조절하는 저해성 수용체이다. 주로 나이브 T 세포에 영향을 미치는 CTLA-4와 대조적으로, PD-1은 면역 세포 상에서 더욱 광범위하게 발현되며, 주변 조직에서, 그리고 종양 미세환경에서, 성숙 T 세포 활성을 조절한다. PD-1은 T 세포 수용체 신호전달을 간섭함으로써 T 세포 반응을 저해한다. PD-1은 2가지 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 갖는다. PD-1에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-1의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-1에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-PD-1 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 PD-1 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 PD-1 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 펨브롤리주맙(케이트루다; 이전에 람브롤리주맙; 머크 앤드 컴퍼니, 인코포레이티드), 니볼루맙(오프디보; 브리스톨-마이어스 스큅), 피딜리주맙(CT-011, 큐어테크), SHR-1210(인사이트/지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니, 리미티드), MEDI0680(AMP-514로도 알려져 있음; 앰플이뮨 인코포레이티드/메드이뮨), PDR001(노바티스), BGB-A317(베이진 리미티드), TSR-042(ANB011로도 알려져 있음; 아납티스바이오/테사로, 인코포레이티드), REGN2810(리제네론 파마슈티컬즈, 인코포레이티드/사노피-아벤티스) 및 PF-06801591(화이자)로 이루어진 군으로부터 선택되는 PD-1-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. 추가의 PD-1-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,181,342호, 제8,927,697호, 제7,488,802호, 제7,029,674호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0152180호, 제2011/0171215호, 제2011/0171220호; 및 PCT 공개 제WO 2004/056875호, 제WO 2015/036394호, 제WO 2010/029435호, 제WO 2010/029434호, 제WO 2014/194302호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
PD-L1/PD-L2. PD 리간드 1(PD-L1, B7-H1로도 알려져 있음) 및 PD 리간드 2(PD-L2, PDCD1LG2, CD273 및 B7-DC로도 알려져 있음)는 PD-1 수용체에 결합한다. 두 리간드 모두는 CD28 및 CTLA-4와 상호작용하는 B7-1 및 B7-2 단백질과 동일한 B7 과에 속한다. PD-L1은 예를 들어, 상피 세포, 내피 세포 및 면역 세포를 포함하는 많은 세포 유형 상에서 발현될 수 있다. PDL-1의 라이게이션은 IFNγ, TNFα 및 IL-2 생성을 감소시키며, 감소된 T 세포 반응성 및 증식뿐 아니라 항원-특이적 T 세포 아네르기와 연관된 항-염증성 사이토카인인 IL10의 생성을 자극한다. PDL-2는 대부분 항원 제시 세포(APC) 상에서 발현된다. PDL2 라이게이션은 또한 T 세포 억제를 초래하지만, PDL-1-PD-1 상호작용이 G1/G2 단계에서 세포 주기 정지를 통하여 증식을 저해하는 경우, PDL2-PD-1 결합은 낮은 항원 농도에서 B7:CD28 신호를 차단하고, 높은 항원 농도에서 사이토카인 생성을 감소시킴으로써 TCR-매개의 신호전달을 저해하는 것으로 나타났다. PD-L1 및 PD-L2에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L1의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L1에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-PD-L1 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 PD-L1 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 PD-L1 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 더발루맙(durvalumab)(MEDI-4736으로도 알려져 있음; 아스트라제네카(AstraZeneca)/셀진 코포레이션(Celgene Corp.)/메드이뮨), 아테졸리주맙(atezolizumab)(티센트릭(Tecentriq); MPDL3280A 및 RG7446으로도 알려져 있음; 제네테크 인코포레이티드(Genetech Inc.)), 아벨루맙(avelumab)(MSB0010718C로도 알려져 있음; 머크 세로노(Merck Serono)/아스트라제네카); MDX-1105(메다렉스(Medarex)/브리스톨-마이어스 스큅), AMP-224(앰플이뮨(Amplimmune), 글락소스미스클라인), LY3300054(일리 릴리 앤드 컴퍼니(Eli Lilly and Co.))로 이루어진 군으로부터 선택되는 PD-L1-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 Fc-융합 단백질)이다. 추가의 PD-L1-결합 단백질은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2016/0084839호, 제2015/0355184호, 제2016/0175397호 및 PCT 공개 제WO 2014/100079호, 제WO 2016/030350호, 제WO2013181634호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L2의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L2에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-PD-L2 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 PD-L2 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 PD-L2 길항제이다. PD-L2-결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,255,147호, 제8,188,238호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0122431호, 제2013/0243752호, 제2010/0278816호, 제2016/0137731호, 제2015/0197571호, 제2013/0291136호, 제2011/0271358호; 및 PCT 공개 제WO 2014/022758호 및 제WO 2010/036959호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
TIM-3. T 세포 면역글로불린 뮤신 3(TIM-3, A형 간염 바이러스 세포 수용체(HAVCR2)로도 알려져 있음)은 S-형 렉틴 갈렉틴-9(Gal-9)에 결합하는 I형 당단백질 수용체이다. TIM-3은, 림프구, 간, 소장, 흉선, 신장, 비장, 폐, 근육, 망상적혈구 및 뇌 조직 상에서 광범위하게 발현되는 리간드이다. Tim-3은 원래 IFN-γ 분비 Th1 및 Tc1 세포 상에서 선택적으로 발현되는 것으로 확인되었다(문헌[Monney et al. (2002) Nature 415: 536-41]). TIM-3 수용체에 의한 Gal-9의 결합은 다운스트림 신호전달을 촉발시켜, T 세포 생존 및 기능을 음성적으로 조절한다. TIM-3에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TIM-3의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TIM-3에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-TIM-3 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 TIM-3 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 TIM-3 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TSR-022(아납티스바이오(AnaptysBio)/테사로, 인코포레이티드(Tesaro, Inc.)) 및 MGB453(노바티스(Novartis))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-TIM-3 항체이다. 추가의 TIM-3 결합 단백질(예를 들어, 항체)은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제9,103,832호, 제8,552,156호, 제8,647,623호, 제8,841,418호; 미국 특허 출원 공개 제2016/0200815호, 제2015/0284468호, 제2014/0134639호, 제2014/0044728호, 제2012/0189617호, 제2015/0086574호, 제2013/0022623호; 및 PCT 공개 제WO 2016/068802호, 제WO 2016/068803호, 제WO 2016/071448호, 제WO 2011/155607호 및 제WO 2013/006490호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
VISTA. T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA, 혈소판 수용체 Gi24로도 알려져 있음)는 T 세포 반응을 음성적으로 조절하는 Ig 상과 리간드이다. 예를 들어, 문헌[Wang et al., 2011, J. Exp. Med. 208: 577-92]을 참조한다. APC 상에서 발현되는 VISTA는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식 및 사이토카인 생성을 직접적으로 억제한다(문헌[Wang et al. (2010) J Exp Med. 208(3): 577-92]). VISTA에 특이적인 다수의 면역 체크포인트 조절제가 개발된 바 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 VISTA의 활성 및/또는 발현을 조절하는 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 VISTA에 결합하는 작용제(예를 들어, 항-VISTA 항체)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 VISTA 효능제이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 VISTA 길항제이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 TSR-022(아납티스바이오/테사로, 인코포레이티드) 및 MGB453(노바티스)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VISTA-결합 단백질(예를 들어, 항체)이다. VISTA-결합 단백질(예를 들어, 항체)이 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2016/0096891호, 제2016/0096891호; 및 PCT 공개 제WO 2014/190356호, 제WO 2014/197849호, 제WO 2014/190356호 및 제WO 2016/094837호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
적어도 하나의 면역 체크포인트 조절제와 조합하여 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여함에 의한 종양학적 장애의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 대상체의 면역 반응을 자극한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 자극성 면역 체크포인트(예를 들어, CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, GITR, ICOS, 또는 4-1BB)의 발현 또는 활성을 자극하거나 증가시킨다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 저해성 면역 체크포인트(예를 들어, A2A4, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 또는 VISTA)의 발현 또는 활성을 저해하거나 감소시킨다.
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, GITR, ICOS, 4-1BB, A2A4, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 및 VISTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 분자를 표적화한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, GITR, ICOS, 4-1BB, A2A4, B7-H3, B7-H4, BTLA, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3 및 VISTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 분자를 표적화한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4, PD-L1 및 PD-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 분자를 표적화한다. 추가의 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-L1 및 PD-1로부터 선택되는 면역 체크포인트 분자를 표적화한다.
일부 구현예에서, 1가지 초과의(예를 들어, 2, 3, 4, 5가지 또는 그 이상의) 면역 체크포인트 조절제가 대상체에게 투여된다. 1가지 초과의 면역 체크포인트 조절제가 투여되는 경우, 조절제는 각각 자극성 면역 체크포인트 분자를 표적화할 수 있거나, 또는 각각 저해성 면역 체크포인트 분자를 표적화할 수 있다. 다른 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 자극성 면역 체크포인트를 표적화하는 적어도 하나의 조절제 및 저해성 면역 체크포인트 분자를 표적화하는 적어도 하나의 면역 체크포인트 조절제를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 결합 단백질, 예를 들어, 항체이다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "결합 단백질"은 표적 분자, 예를 들어, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 항체 또는 그의 항원 결합 부분이며, 표적 분자는 면역 체크포인트 분자이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표적 분자(예를 들어, 면역 체크포인트 분자)에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 리간드이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 수용체이다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 결합 단백질의 예는 인간화 항체, 항체 Fab 단편, 이가 항체, 항체 약물 컨쥬게이트, scFv, 융합 단백질, 2가 항체 및 4가 항체를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 쇄, 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄 또는 그의 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체로 구성된 임의의 면역글로불린(Ig) 분자를 지칭한다. 이러한 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 항체 형식은 해당 분야에 알려져 있다. 전장 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어져 있다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어져 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더욱 보존된 영역 사이에 배치된 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 하기의 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어져 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 쥣과 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이다. 다른 구현예에서, 항체는 키메라 항체이다. 키메라 및 인간화 항체는 CDR 그라프팅 접근법(예를 들어, 미국 특허 제5,843,708호; 제6,180,370호; 제5,693,762호; 제5,585,089호; 및 제5,530,101호 참조), 쇄 셔플링 전략(예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호; 문헌[Rader et al. (1998) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 95: 8910-8915] 참조), 분자 모델링 전략(미국 특허 제5,639,641호) 등을 포함하는 해당 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원 결합 부분"(또는 간단히 "항체 부분")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것이 나타났다. 또한 이러한 항체 구현예는 둘 이상의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는; 이중특이적, 이중 특이적 또는 다중-특이적 형식일 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어져 있는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어져 있는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일의 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어져 있는 Fv 단편, (v) 단일의 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편(내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Ward et al. (1989) NATURE 341: 544-546]; 및 제WO 90/05144 A1호); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 그들은, 재조합 방법을 이용하여, 그들을 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단쇄 Fv(scFv)로 알려져 있음)를 형성하는 단일의 단백질 쇄로 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) SCIENCE 242:423-426]; 및 문헌[Huston et al. (1988) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 85:5879-5883] 참조). 또한, 이러한 단쇄 항체는 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 다른 형태의 단쇄 항체, 예컨대, 디아바디도 또한 포함된다. 항원 결합 부분은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv 내로 혼입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조).
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에 3개의 CDR이 존재하며, 이는 가변 영역의 각각에 대하여 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 표기된다. 본원에 사용되는 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일의 가변 영역에 존재하는 3개의 CDR의 군을 지칭한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의된다. 카바트에 의해 기재된 시스템(문헌[Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)])은 항체의 임의의 가변 영역에 적용 가능한 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐 아니라 3개의 CDR을 정의하는 정밀한 잔기 경계도 또한 제공한다. 이들 CDR은 카바트 CDR로 지칭될 수 있다. 초티아(Chothia) 및 동료는 카바트 CDR 내의 특정한 하위-부분이 아미노산 서열의 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고 거의 동일한 펩티드 백본 입체형태를 채택한다는 것을 발견하였다(문헌[Chothia et al. (1987) J. MOL. BIOL. 196: 901-917] 및 문헌[Chothia et al. (1989) NATURE 342: 877-883]). 이들 하위-부분은 L1, L2, 및 L3 또는 H1, H2, 및 H3으로 표기되었으며, 여기서 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 나타낸다. 이들 영역은 초티아 CDR로 지칭될 수 있으며, 이는 카바트 CDR과 중첩되는 경계를 갖는다. 카바트 CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 경계는 문헌[Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139] 및 문헌[MacCallum et al. (1996) J. MOL. BIOL. 262(5): 732-45]에 의해 기재되어 있다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 시스템 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있으나, 그럼에도 불구하고, 비록 특정 잔기 또는 잔기의 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의적으로 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 견지에서 단축될 수 있거나 길어질 수는 있지만, 카바트 CDR과 중첩될 것이다. 본원에 사용된 방법은, 비록 바람직한 구현예가 카바트 또는 초티아 정의된 CDR을 사용한다고 해도, 이들 시스템 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)인 비-인간(예를 들어, 쥣과) 항체를 지칭한다. 대체적으로, 인간화 항체 및 그의 항체 단편은 수여자의 상보성-결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 요망되는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종, 예컨대 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR(공여자 항체)로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수여자 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화 항체/항체 단편은 수여자 항체, 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열 중 어느 것에서도 관찰되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 추가로 개선하고 최적화시킬 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 그의 항체 단편은 적어도 하나, 전형적으로, 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하며, FR 영역의 모든 또는 상당한 부분은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다. 추가의 상세설명에 대하여, 문헌[Jones et al. (1986) NATURE 321: 522-525]; 문헌[Reichmann et al. (1988) NATURE 332: 323-329]; 및 문헌[Presta (1992) CURR. OP. STRUCT. BIOL. 2: 593-596]을 참조하며, 이의 각각은 본원에 그의 전문이 참조로 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역컨쥬게이트" 또는 "항체 약물 컨쥬게이트"는 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 또 다른 작용제, 예컨대 화학치료제, 독소, 면역치료제, 영상화 프로브 등의 연결을 지칭한다. 연결은 공유 결합 또는 정전기력을 통한 것과 같은 비-공유적 상호작용일 수 있다. 해당 분야에 알려져 있는 다양한 링커를 사용하여, 면역컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 또한, 면역컨쥬게이트는 면역컨쥬게이트를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 융합 단백질의 형태로 제공될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "융합 단백질"은 원래 개별 단백질(펩티드 및 폴리펩티드 포함)를 위해 코딩된 2가지 이상의 유전자 또는 유전자 단편의 연결을 통해 생성된 단백질을 지칭한다. 융합 유전자의 번역은 원래의 단백질의 각각으로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일의 단백질을 초래한다.
"2가 항체"는 2개의 항원-결합 부위를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭한다. 2개의 항원 결합 부위는 동일한 항원에 결합할 수 있거나, 그들은 각각 상이한 항원에 결합할 수 있으며, 이 경우에, 항체 또는 항원-결합 단편은 "이중특이적"으로 특성화된다. "4가 항체"는 4개의 항원-결합 부위를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭한다. 특정 구현예에서, 4가 항체는 이중특이적이다. 특정 구현예에서, 4가 항체는 다중특이적이며, 즉, 2가지 초과의 상이한 항원에 결합한다.
Fab(항원 결합 단편) 항체 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역 1(CH1) 부분으로 이루어진 폴리펩티드 및 경쇄 가변(VL) 및 경쇄 불변(CL) 부분으로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 항체의 1가 항원-결합 도메인을 포함하는 면역반응성 폴리펩티드이며, CL 및 CH1 부분은 바람직하게는 Cys 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 함께 결합된다.
면역 체크포인트 조절자 항체는 적어도 4가지의 주요 범주를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다: i) T 세포 또는 자연 살해(NK) 세포 상에서 직접적으로 저해 경로를 차단하는 항체(예를 들어, PD-1 표적화 항체, 예컨대 니볼루맙 및 펨브롤리주맙, TIM-3을 표적화하는 항체 및 LAG-3, 2B4, CD160, A2aR, BTLA, CGEN-15049 및 KIR을 표적화하는 항체), ii) T 세포 또는 NK 세포 상에서 직접적으로 자극성 경로를 활성화시키는 항체(예를 들어, OX40, GITR 및 4-1BB를 표적화하는 항체), iii) 면역 세포 상에서 억제 경로를 차단하거나, 항체-의존성 세포 세포독성에 의존하여, 면역 세포의 억제 집단을 고갈시키는 항체(예를 들어, CTLA-4 표적화 항체, 예컨대 이필리무맙, VISTA를 표적화하는 항체 및 PD-L2, Gr1 및 Ly6G를 표적화하는 항체) 및 iv) 암 세포 상에서 직접적으로 억제 경로를 차단하거나, 항체-의존성 세포 세포독성에 의존하여, 암 세포에 대한 세포독성을 향상시키는 항체(예를 들어, 리툭시맙(rituximab), PD-L1을 표적화하는 항체 및 B7-H3, B7-H4, Gal-9 및 MUC1을 표적화하는 항체). 체크포인트 저해제의 예는 예를 들어, CTLA-4의 저해제, 예컨대 이필리무맙 또는 트레멜리무맙; PD-1 경로의 저해제, 예컨대 항-PD-1, 항-PD-L1 또는 항-PD-L2 항체를 포함한다. 예시적인 항-PD-1 항체는 제WO 2006/121168호, 제WO 2008/156712호, 제WO 2012/145493호, 제WO 2009/014708호 및 제WO 2009/114335호에 기재되어 있다. 예시적인 항-PD-L1 항체는 제WO 2007/005874호, 제WO 2010/077634호 및 제WO 2011/066389호에 기재되어 있으며, 예시적인 항-PD-L2 항체는 제WO 2004/007679호에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 융합 단백질, 예를 들어, 면역 체크포인트 조절제의 활성을 조절하는 융합 단백질이다.
일 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 치료적 핵산 분자, 예를 들어, 면역 체크포인트 단백질 또는 mRNA의 발현을 조절하는 핵산이다. 핵산 치료제는 해당 분야에 널리 알려져 있다. 핵산 치료제는 세포 내의 표적 서열에 상보성인 단일 가닥 및 이중 가닥(즉, 적어도 15개 뉴클레오티드 길이의 상보성 영역을 갖는 핵산 치료제) 핵산 둘 모두를 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 치료제는 면역 체크포인트 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 대하여 표적화된다.
안티센스 핵산 치료제는 단일 가닥 핵산 치료제, 전형적으로 약 16 내지 30개 뉴클레오티드 길이이며, 배양물 내의 또는 유기체 내의 표적 세포에서의 표적 핵산 서열에 상보성이다.
또 다른 양태에서, 작용제는 단일-가닥 안티센스 RNA 분자이다. 안티센스 RNA 분자는 표적 mRNA 내의 서열에 상보성이다. 안티센스 RNA는 mRNA로의 염기 쌍형성 및 번역 기구의 물리적인 방해에 의해 화학량론적 방식으로 번역을 저해할 수 있으며, 문헌[Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355]을 참조한다. 안티센스 RNA 분자는 표적 mRNA에 상보성인 약 15 내지 30개 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 안티센스 핵산, 화학적 변형 및 치료적 용도에 관한 특허는 예를 들어, 하기를 포함한다: 화학적으로 변형된 RNA-함유 치료적 화합물에 관한 미국 특허 제5,898,031호; 치료제로서의 이들 화합물의 이용 방법에 관한 미국 특허 제6,107,094호; 단일-가닥의 화학적으로 변형된 RNA-유사 화합물의 투여에 의한 환자의 치료 방법에 관한 미국 특허 제7,432,250호; 및 단일-가닥의 화학적으로 변형된 RNA-유사 화합물을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 미국 특허 제7,432,249호. 미국 특허 제7,629,321호는 복수의 RNA 뉴클레오시드 및 적어도 하나의 화학적 변형을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 사용한 표적 mRNA의 절단 방법에 관한 것이다. 이 단락에 열거된 특허의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 핵산 치료제는 또한 이중 가닥 핵산 치료제를 포함한다. 본원에 상호교환 가능하게 사용되는 바와 같이, "dsRNA 작용제", "dsRNA", "siRNA", "iRNA 작용제"로도 지칭되는 "RNAi 작용제", "이중 가닥 RNAi 작용제", 이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자는 하기 정의된 바와 같이 2개의 역-평행하고 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는, 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, RNAi 작용제는 또한 dsiRNA를 포함할 수 있다(예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공개 제20070104688호 참조). 일반적으로, 각각의 가닥의 뉴클레오티드의 대부분은 리보뉴클레오티드이지만, 본원에 기재된 바와 같이, 각각의 또는 둘 모두의 가닥은 하나 이상의 비-리보 뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "RNAi 작용제"는 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있으며; RNAi 작용제는 다수의 뉴클레오티드에서 실질적인 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 본원에 개시되거나 해당 분야에 공지된 모든 유형의 변형을 포함할 수 있다. siRNA 유형 분자에서 사용된 임의의 이러한 변형은 본 명세서 및 청구범위의 목적을 위하여 "RNAi 작용제"에 의해 포함된다. 본 발명의 방법에 사용되는 RNAi 작용제는 예를 들어, 제WO/2012/037254호 및 제WO 2009/073809호에 개시된 바와 같이 화학적 변형을 갖는 작용제를 포함하고, 이들의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
면역 체크포인트 조절제는 예를 들어, 표준 투여량을 사용함으로써 종양학적 장애를 치료하기 위하여 적절한 투여량으로 투여될 수 있다. 해당 분야의 숙련자는 일상적인 실험에 의해 종양학적 장애를 치료하기 위한 면역 체크포인트 조절제의 비-독성 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량은 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있으며, 예를 들어, 면역 체크포인트 조절제의 제조처에 의해 제공되는 제품 인서트(product insert)로부터 수득될 수 있다. 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량의 예는 하기 표 3에 제공되어 있다. 다른 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 특정 종양학적 장애에 대한 치료를 위한 치료 기준 하에서 종양학적 장애를 치료하기 위해 사용되는 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량과 상이한(예를 들어, 더 낮은) 투여량으로 투여된다.
[표 6]
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제의 투여되는 투여량은 특정 종양학적 장애에 대한 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 낮다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제의 투여되는 투여량은 특정 종양학적 장애에 대한 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량의 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%이다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제의 조합이 투여되는 경우, 면역 체크포인트 조절제 중 적어도 하나는 특정 종양학적 장애에 대한 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량보다 더 낮은 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제의 조합이 투여되는 경우, 면역 체크포인트 조절제 중 적어도 2가지는 특정 종양학적 장애에 대한 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량보다 더 낮은 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제의 조합이 투여되는 경우, 면역 체크포인트 조절제 중 적어도 3가지는 특정 종양학적 장애에 대한 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량보다 더 낮은 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제의 조합이 투여되는 경우, 면역 체크포인트 조절제의 전부는 특정 종양학적 장애에 대한 면역 체크포인트 조절제의 표준 투여량보다 더 낮은 용량으로 투여된다.
표적 세포에 의한 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 엔지니어링된 바이러스와 조합하여 투여될 수 있는 추가의 면역치료제에는 톨-유사 수용체(TLR) 효능제, 세포-기반의 요법제, 사이토카인 및 암 백신이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
2.
TLR 효능제
TLR은 미생물로부터 유래된 구조적으로 보존된 분자를 인식하는 단일 막-스패닝 비-촉매적 수용체이다. TLR은 인터류킨-1 수용체와 함께 "인터류킨-1 수용체/톨-유사 수용체 상과"로 알려져 있는 수용체 상과를 형성한다. 이 과의 구성원은 구조적으로, 세포외 류신-풍부 반복(LRR) 도메인, 막근접(juxtamembrane) 시스테인 잔기의 보존된 패턴 및 MyD88, TIR 도메인-함유 어댑터(TRAP) 및 IFNβ를 유도하는 TIR 도메인-함유 어댑터(TRIF)를 포함하는 TIR 도메인-함유 어댑터를 동원함으로써 다운스트림 신호전달을 위한 플랫폼을 형성하는 세포질내 신호전달 도메인을 특징으로 한다(문헌[O'Neill et al., 2007, Nat Rev Immunol 7, 353]).
TLR은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 및 TLR10을 포함한다. TLR2는 펩티도글리칸, 박테리아 리포펩티드, 리포테이코산, 마이코박테리아 리포아라비노만난 및 효모 세포벽 성분을 포함하는 다수의 미생물 산물에 대한 세포 반응을 매개한다. TLR4는 패턴 인식 수용체(PRR) 과에 속하는 막횡단 단백질이다. 그의 활성화는 세포내 신호전달 경로 NF-κB 및 염증성 사이토카인 생성을 야기하며, 이는 선천 면역계의 활성화를 담당한다. TLR5는 침입하는 이동성 박테리아 유래의 박테리아 플라젤린을 인식하는 것으로 알려져 있으며, 염증성 장 질병을 포함하는 많은 질병의 발병에 연루되는 것으로 밝혀졌다.
TLR 효능제가 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 제US2014/0030294호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 그의 전문이 참조로 포함되다. 예시적인 TLR2 효능제는 마이코박테리아 세포벽 당지질, 리포아라비노만난(LAM) 및 만노실화 포스파티딜이노시톨(PIIM), MALP-2 및 Pam3Cys, 및 그의 합성 변이체를 포함한다. 예시적인 TLR4 효능제는 지질다당류 또는 그의 합성 변이체(예를 들어, MPL 및 RC529) 및 지질 A 또는 그의 합성 변이체(예를 들어, 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Cluff et al., 2005, Infection and Immunity, p. 3044-3052:73]; 문헌[Lembo et al., 2008, The Journal of Immunology180, 7574-7581]; 및 문헌[Evans et al., 2003, Expert Rev Vaccines 2:219-29]을 참조한다. 예시적인 TLR5 효능제는 플라젤린 또는 그의 합성 변이체(예를 들어, TLR5 활성화에 비-필수적인 플라젤린의 부분을 결실시킴으로써 제조되는 감소된 면역원성을 갖는 약리학적으로 최적화된 TLR5 효능제(예컨대 CBLB502))를 포함한다.
추가의 TLR 효능제는 콜리 독소 및 바실리 칼메트-게랭(BCG)을 포함한다. 콜리 독소는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 및 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 종의 사멸된 박테리아로 이루어진 혼합물이다. 문헌[Taniguchi et al., 2006, Anticancer Res. 26 (6A): 3997-4002]을 참조한다. BCG는 약독화된 살아 있는 소 결핵 바실러스, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 균주로부터 제조된다. 문헌[Venkataswamy et al., 2012, Vaccine. 30 (6): 1038-1049]을 참조한다.
3.
세포 기반의 치료법
암의 치료를 위한 세포-기반의 치료법은 대상체로의 면역 세포(예를 들어, T 세포, 종양-침윤 림프구(TIL), 자연 살해 세포, 대식구 및 수지상 세포)의 투여를 포함한다. 자가 세포-기반의 치료법에서, 면역 세포는 그들을 투여한 동일한 대상체로부터 유래된다. 동종이계 세포-기반의 치료법에서, 면역 세포는 한 대상체로부터 유래되며, 상이한 대상체로 투여된다. 면역 세포는 대상체로의 투여 이전에, 예를 들어, 사이토카인으로의 처리에 의해 활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 면역요법에서와 같이, 대상체로의 투여 이전에 유전학적으로 변형된다.
일부 구현예에서, 세포-기반의 치료법은 입양 세포 전달(ACT)을 포함한다. ACT는 전형적으로 3가지 부분으로 이루어진다: 림프-고갈(lympho-depletion), 세포 투여 및 고 용량의 IL-2를 사용한 치료법. ACT에서 투여될 수 있는 세포의 유형에는 종양 침윤 림프구(TIL), T 세포 수용체(TCR)-형질도입된 T 세포 및 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포가 포함된다.
종양-침윤 림프구는 유방암을 포함하는 많은 고형 종양에서 관찰되는 면역 세포이다. 그들은 세포독성 T 세포 및 헬퍼 T 세포, 및 B 세포, 대식구, 자연 살해 세포 및 수지상 세포의 혼합물을 포함하는 세포의 집단이다. 자가 TIL 치료법을 위한 일반적인 절차는 하기와 같다: (1) 절제된 종양을 단편으로 분해하고; (2) 각각의 단편을 IL-2에서 성장시키고, 림프구를 증식시켜 종양을 파괴하고; (3) 순수한 림프구의 집단이 존재한 후에, 이들 림프구를 증량시키고; (4) 최대 1011개의 세포로 증량시킨 후에, 림프구를 환자 내로 주입한다. 문헌[Rosenberg et al., 2015, Science 348(6230):62-68]을 참조하며, 이는 본원에 그의 전문이 참조로 포함된다.
TCR-형질도입된 T 세포는 종양-특이적 TCR의 유전학적 유도를 통해 생성된다. 이것은 종종 특정 항원-특이적 TCR을 레트로바이러스 백본 내로 클로닝시킴으로써 행해진다. 혈액을 환자로부터 채혈하고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 추출한다. PBMC를 IL-2의 존재 하에 CD3으로 자극한 다음, 항원-특이적 TCR을 인코딩하는 레트로바이러스로 형질도입한다. 이들 형질도입된 PBMC를 시험관 내에서 추가로 증량시키고, 다시 환자 내로 주입한다. 문헌[Robbins et al., 2015, Clinical Cancer Research 21(5):1019-1027]을 참조하며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함된다.
키메라 항원 수용체(CAR)는 세포외 항원 인식 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 신호전달 도메인(예컨대 CD3ζ, CD28 및 4-1BB)을 함유하는 재조합 수용체이다. CAR은 항원-결합 및 T-세포-활성화 기능 둘 모두를 갖는다. 따라서, CAR을 발현하는 T 세포는 당지질, 탄수화물 및 단백질을 포함하는 매우 다양한 세포 표면 항원을 인식할 수 있으며, 세포질 동시자극의 활성화를 통하여 이들 항원을 발현하는 악성 세포를 공격할 수 있다. 문헌[Pang et al., 2018, Mol Cancer 17: 91]을 참조하며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 세포-기반의 치료법은 자연 살해(NK) 세포-기반의 치료법이다. NK 세포는 임의의 이전의 감작 또는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자 발현의 제한 없이, 종양 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 큰 과립 림프구이다. 문헌[Uppendahl et al., 2017, Frontiers in Immunology 8: 1825]을 참조한다. 고-용량 IL-2 치료법을 사용한 자가 림포카인-활성화된 살해(LAK) 세포의 입양 전달은 인간 임상 시험에서 평가된 바 있다. LAK 면역요법과 유사하게, 사이토카인-유도된 살해(CIK) 세포는 항-CD3 mAb, IFN-γ 및 IL-2의 자극과 함께 말초 혈액 단핵 세포 배양물로부터 발생한다. CIK 세포는 혼합된 T-NK 표현형을 특징으로 하며(CD3+CD56+), 난소 및 자궁경부암에 대하여 LAK 세포에 비하여 향상된 세포독성 활성을 나타낸다. 일차 감량 수술 및 애쥬번트(adjuvant) 카보플라틴/파클리탁셀 화학요법 이후 자가 CIK 세포의 입양 전달을 조사하는 인간 임상 시험도 또한 행한 바 있다. 문헌[Liu et al., 2014, J Immunother 37(2): 116-122]을 참조한다.
일부 구현예에서, 세포-기반의 치료법은 수지상 세포-기반의 면역요법이다. 종양 용해물로 처리된 수지상 세포(DC)를 사용한 백신접종은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 치료적 항종양 면역 반응을 증가시키는 것으로 나타났다. 문헌[Jung et al., 2018, Translational Oncology 11(3): 686-690]을 참조한다. DC는 항원을 포획하고 처리하며, 림프 기관 내로 이동하며, 림프구 동시자극 분자를 발현하며, 면역 반응을 개시하는 사이토카인을 분비한다. 그들은 또한 종양-관련 항원에 특이적인 수용체를 발현하는 면역학적 이펙터 세포(T 세포)를 자극하며, 면역 억제인자, 예컨대 CD4+CD25+Foxp3+ 조절 T(Treg) 세포의 수를 감소시킨다. 예를 들어, 종양 세포 용해물-DC 혼성물에 기초한 신장 세포 암종(RCC)을 위한 DC 백신접종 전략은 예비임상 및 임상 시험에서 치료적 능력을 보여주었다. 문헌[Lim et al., 2007, Cancer Immunol Immunother 56: 1817-1829]을 참조한다.
일부 구현예에서, 세포-기반의 치료법은 중간엽 줄기 세포(MSC)를 포함한다. 중간엽 줄기 세포(MSC)는 자가-재생 및 다계통 분화가 가능한 성체 줄기 세포이다. MSC의 치료적 이익은 암을 포함하는 상이한 질병을 치료하기 위한 세포-기반의 전략에서 이들의 이용을 유도하였다. 종양은 종양 부위로의 MSC의 동원에 영향을 미치도록 MSC에 화학유인 효과를 가한다. MSC는 일단 종양 환경에 도달하면, 종양 발달에 영향을 미치는 직접적인 및 간접적인 메커니즘을 통해 암 세포와 상호작용한다. MSC의 주변분비 기능은 암 조절에 관여하는 주요 메커니즘 중 하나이며, 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 다수의 인자에 의해 매개된다. 이들 주변분비 인자는 세포 사이클(즉, 세포 증식), 세포 생존, 혈관형성 및 면역억제/면역조절을 포함하는 세포 과정에 영향을 미쳐, MSC가 암을 조절하도록 한다. MSC와 종양 세포 사이클의 상호작용은 MSC가 이들의 치료 효과를 가하는 방법 중 하나이다. 증식-관련 신호전달 경로, 예컨대 포스파티딜이노시톨 3-키나제/단백질 키나제 B(PI3K/AKT)를 저해함으로써, MSC는 세포 사이클 정지를 유도하고 암 성장을 감소시킬 수 있다. 또한, MSC는 다른 세포 유형, 예컨대 암-관련 섬유모세포(CAF)로의 분화를 겪어, 암 진행에 직접적으로 기여할 수 있다. 문헌[Hmadcha et al., 2020, Front. Bioeng. Biotechnol 8(43): 1-13; doi.org/10.3389/fbioe.2020.00043]을 참조한다.
일부 구현예에서, 세포-기반의 치료법은 섬유모세포, 예를 들어, 암-관련 섬유모세포(CAF)를 포함한다. 이들 세포는 세포외 매트릭스(ECM)의 합성 및 리모델링 및 성장 인자의 생성을 통해 암 전이를 조절하고, 혈관형성, 종양 역학, 약물 접근 및 치료법 반응에 영향을 미친다. CAF는 또한, 면역계를 조절할 수 있다. CAF의 수, 하위유형 또는 기능을 변경시킴에 의한 이들의 표적화는 암 치료법의 개선 방법을 제공한다. 문헌[Sahai et al., 2020, Nature Reviews Cancer 20: 174-186]을 참조한다.
4.
사이토카인
IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21을 포함하는 몇몇의 사이토카인은 면역 세포, 예컨대 NK 세포 및 T 세포의 활성화를 위하여 암의 치료에 사용되었다. IL-2는 항종양 면역성의 유도를 희망하여, 임상적으로 처음 사용된 사이토카인 중 하나이다. 고 용량에서 단일의 작용제로서 IL-2는 신장 세포 암종(RCC) 및 전이성 흑색종을 갖는 일부 환자에서 관해를 유도한다. 저 용량 IL-2를 또한 조사하였으며, 생물학적 활성을 유지하면서 독성을 감소시키기 위한 노력으로 IL-2 αβγ 수용체(IL-2Rαβγ)를 선택적으로 라이게이션시키는 것이 목적이었다. 문헌[Romee et al., 2014, Scientifica, Volume 2014, Article ID 205796, 18 pages]을 참조하며, 이는 본원에 전체가 참조로 포함된다.
인터류킨-15(IL-15)는 인터류킨-2(IL-2)와 구조적 유사성을 갖는 사이토카인이다. IL-2와 같이, IL-15는 IL-2/IL-15 수용체 베타 쇄(CD122) 및 공통 감마 쇄(감마-C, CD132)로 구성된 복합체에 결합하며, 이를 통해 신호를 전달한다. 재조합 IL-15를 고형 종양(예를 들어, 흑색종, 신장 세포 암종)의 치료에 대하여 그리고 암 환자에서 입양 전달 이후 NK 세포의 지원에 대하여 평가하였다. 상기 언급된 문헌[Romee et al.]을 참조한다.
IL-12는 NK 세포 세포독성을 향상시키는 그의 능력에 기초하여, 원래 "NK 세포 자극 인자(NKSF)"로서 확인된, p35 및 p40 서브유닛(IL-12α 및 β 쇄)으로 구성된 이종이량체 사이토카인이다. 병원체와 마주칠 때, IL-12는 활성화된 수지상 세포 및 대식구에 의해 방출되며, 활성화된 T 및 NK 세포 상에서 주로 발현되는 그의 동족 수용체에 결합한다. 수많은 예비임상 연구에 의해, IL-12가 항종양 능력을 갖는 것이 뒷받침되었다. 상기 언급된 문헌[Romee et al.]을 참조한다.
IL-18은 염증유발 IL-1 과의 구성원이며, IL-12와 같이, 활성화된 식세포에 의해 분비된다. IL-18은 예비임상 동물 모델에서 유의미한 항종양 활성이 입증되고, 인간 임상 시험에서 평가된 바 있다. 문헌[Robertson et al., 2006, Clinical Cancer Research 12: 4265-4273]을 참조한다.
IL-21은 NK 세포 및 CD8+ T 세포를 자극하는 그의 능력으로 인하여 항종양 면역요법을 위해 사용되었다. 생체외 NK 세포 증식을 위하여, 막 결합된 IL-21는 유효한 결과와 함께 K562 자극인자 세포에서 발현되었다. 문헌[Denman et al., 2012, PLoS One 7(1)e30264]을 참조한다. 재조합 인간 IL-21은 또한, 용해성 CD25를 증가시키고, CD8+ 세포 상의 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현을 유도하는 것으로 나타났다. IL-21를 고형 종양의 치료를 위한 몇몇의 임상 시험에서 평가하였다. 상기 언급된 문헌[Romee et al.]을 참조한다.
5.
암 백신
치료적 암 백신은 적합한 애쥬번트의 보조와 함께, 암에 대한 환자 자신의 면역 반응, 특히 CD8+ T 세포 매개된 반응을 강화시킴으로써 암 세포를 제거한다. 암 백신의 치료적 효능은 정상 세포에 비하여 종양 세포에 의한 종양 관련 항원(TAA)의 차등적인 발현에 좌우된다. TAA는 세포 단백질로부터 유래하며, 면역 관용 또는 자가면역 효과를 회피하기 위하여, 암 세포 상에서 주로 또는 선택적으로 발현되어야 한다. 문헌[Circelli et al., 2015, Vaccines 3(3): 544-555]을 참조한다. 암 백신은 예를 들어, 수지상 세포(DC) 기반의 백신, 펩티드/단백질 백신, 유전학적 백신 및 종양 세포 백신을 포함한다. 문헌[Ye et al., 2018, J Cancer 9(2): 263-268]을 참조한다.
본 발명의 조합 요법은 종양학적 장애의 치료를 위하여 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물 및 추가의 치료제의 조합 요법은 종양 세포 성장을 저해한다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물 및 적어도 하나의 추가의 치료제를 대상체에게 투여하여, 종양 세포 성장이 저해되게 하는 단계를 포함하는 대상체에서의 종양 세포 성장의 저해 방법을 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 암을 치료하는 것은 대조군에 비하여 생존을 연장시키거나, 종양 진행까지의 시간을 연장시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군은 추가의 치료제로 처리되지만, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물로 처리되지 않은 대상체이다. 일부 구현예에서, 대조군은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물로 처리되지만, 추가의 치료제로 처리되지 않은 대상체이다. 일부 구현예에서, 대조군은 추가의 치료제 또는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물로 처리되지 않은 대상체이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 제1 용량의 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물 또는 제1 용량의 추가의 치료제의 투여 이전에 종양을 갖는 것으로 확인된다. 특정 구현예에서, 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물의 처음의 투여 시에 또는 추가의 치료제의 처음의 투여 시에 종양을 갖는다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물 및 하나 이상의 추가의 치료제를 포함하는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 사이클의 조합 요법제를 대상체에게 투여한다. 대상체를 각 사이클의 마지막에 반응 기준에 대하여 평가한다. 대상체를 또한 치료 섭생이 충분히 용인되는 것을 보장하기 위하여, 각 사이클 내내 유해 사건(예를 들어, 응고, 빈혈, 간 및 신장 기능 등)에 대하여 모니터링한다.
1가지 초과의 추가의 치료제, 예를 들어, 2, 3, 4, 5가지 또는 그 이상의 추가의 치료제가 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물과 조합하여 투여될 수 있다는 것을 주의해야 한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물 및 본원에 기재된 바와 같은 추가의 치료제의 투여는 종양 크기, 중량 또는 부피의 감소, 진행까지의 시간 증가, 종양 성장의 저해 및/또는 종양학적 장애를 갖는 대상체의 생존 시간의 연장 중 하나 이상을 초래한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물 및 추가의 치료제의 투여는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물이 투여되지만, 추가의 치료제가 투여되지 않은 상응하는 대조군 대상체에 비하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 만큼 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나 대상체의 생존 시간을 연장시킨다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물 및 추가의 치료제의 투여는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물이 투여되지만, 추가의 치료제가 투여되지 않은 종양학적 장애에 걸린 상응하는 대조군 대상체의 집단에 비하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 만큼 종양 크기, 중량 또는 부피를 감소시키고/시키거나, 진행까지의 시간을 증가시키고/시키거나, 종양 성장을 저해하고/하거나 종양학적 장애에 걸린 대상체 집단의 생존 시간을 연장시킨다. 다른 구현예에서, 타노트랜스미션을 촉진시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 추가의 치료제를 포함하도록 엔지니어링된 바이러스의 투여는 처리 이전에 진행성 종양학적 장애를 갖는 대상체에서 종양학적 장애를 안정화시킨다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물 및 추가의 치료제(예를 들어, 면역치료제)로의 치료는 예를 들어, 표준 투여량의 하나 이상의 항신생물(예를 들어, 화학치료)제를 투여함으로써 추가의 항-신생물제, 예컨대 치료할 특정 암의 치료를 위한 치료 기준과 조합된다. 특정 암 유형에 대한 치료 기준은 예를 들어, 암의 유형 및 중증도, 대상체의 연령, 체중, 성별 및/또는 병력 및 이전의 치료의 성공 또는 실패에 기초하여, 해당 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 치료 기준은 외과술, 방사선, 호르몬 요법, 항체 요법, 성장 인자, 사이토카인을 사용한 치료법 및 화학요법 중 어느 하나 또는 그의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, 추가의 항-신생물제는 철-의존성 세포 디스어셈블리를 유도하는 작용제 및/또는 면역 체크포인트 조절제가 아니다.
본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 추가의 항-신생물제는 화학치료제(예를 들어, 알킬화제, 예컨대 알트레타민(Altretamine), 부술판(Busulfan), 카보플라틴(Carboplatin), 카무스틴(Carmustine), 클로람부실(Chlorambucil), 시스플라틴(Cisplatin), 사이클로포스파미드, 다카르바진(Dacarbazine), 로무스틴(Lomustine), 멜팔란(Melphalan), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 테모졸로미드(Temozolomide), 티오테파(Thiotepa); 항대사물질, 예컨대, 5-플루오로우라실(5-FU), 6-머캅토퓨린(6-MP); 카페시타빈(Capecitabine)(젤로다(Xeloda)®), 시타라빈(Cytarabine)(아라(Ara)-C®), 플록수리딘(Floxuridine), 플루다라빈(Fludarabine), 젬시타빈(Gemcitabine)(젬자르(Gemzar)®), 하이드록시우레아, 메토트렉세이트(Methotrexate), 페메트렉시드(Pemetrexed)(알림타(Alimta)®); 항종양 항생제, 예컨대 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(Daunorubicin), 독소루비신(Doxorubicin)(아드리아마이신(Adriamycin)®), 에피루비신(Epirubicin), 이다루비신(Idarubicin)), 악티노마이신(Actinomycin)-D, 블레오마이신(Bleomycin), 미토마이신(Mitomycin)-C, 미톡산트론(Mitoxantrone)(국소이성질화효소 II 저해제로서도 작용함); 국소이성질화효소 저해제, 예컨대 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan)(CPT-11), 에토포시드(Etoposide)(VP-16), 테니포시드(Teniposide), 미톡산트론(Mitoxantrone)(항종양 항생제로서도 작용함); 유사분열 저해제, 예컨대 도세탁셀(Docetaxel), 에스트라무스틴(Estramustine), 익사베필론(Ixabepilone), 파클리탁셀(Paclitaxel), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 비노렐빈(Vinorelbine); 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손(Prednisone), 메틸프레드니솔론(Methylprednisolone)(솔루메드롤(Solumedrol)®), 덱사메타손(Dexamethasone)(데카드론(Decadron)®); 효소, 예컨대 L-아스파라기나제 및 보르테조밉(bortezomib)(벨케이드(Velcade)®))를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 항-신생물제는 또한, 생물학적 항암제, 예를 들어, 항-TNF 항체, 예를 들어, 아달리무맙(adalimumab) 또는 인플릭시맙(infliximab); 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙(rituximab), 항-VEGF 항체, 예컨대 베바시주맙(bevacizumab); 항-HER2 항체, 예컨대 트라스투주맙(trastuzumab); 항-RSV, 예컨대 팔리비주맙(palivizumab)을 포함한다.
VIII. 약제학적 조성물 및 투여 방식
특정 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 벡터(예를 들어, 엔지니어링된 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존), 세포 또는 약제학적 조성물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본원에 기재된 약제학적 조성물은 임의의 적합한 제형으로 대상체에게 투여될 수 있다. 이들은 예를 들어, 액체, 반-고체 및 고체 투여형을 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 응용에 좌우된다.
특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 경구 투여에 적합하다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 국소 투여 및 정맥내, 복강내, 근육내 및 피하 주사를 포함하는 비경구 투여에 적합하다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여에 적합하다. 추가의 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 종양내 투여에 적합하다.
비경구 투여용 약제학적 조성물은 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 정맥내 투여를 위하여, 제형은 수용액일 수 있다. 수용액은 행크스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution), 인산염 완충 염수(PBS), 생리학적 염수 완충액 또는 기타 적합한 염 또는 조합을 포함하여, 비경구적으로 운반된 제형에 적절한 pH 및 오스몰농도를 달성할 수 있다. 수용액을 사용하여 투여용 제형을 원하는 농도로 희석할 수 있다. 수용액은 용액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 제2인산나트륨, 제1인산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨 및 주사용수를 함유하는 인산염 완충 염수 용액을 포함한다.
국부 투여에 적합한 제형은 피부를 통한 침투에 적합한 액상 또는 반액상 제제, 예컨대 도찰제, 로션, 크림, 연고 또는 페이스트, 및 눈, 귀 또는 코로의 투여에 적합한 액적을 포함한다. 경구 투여에 적합한 제형은 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체를 함유하는 제제를 포함한다. 경구 투여용 제형은 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입될 수 있거나, 또는 정제로 압축될 수 있거나, 또는 식이 식품에 직접 혼입될 수 있다. 단위 투여형이 캡슐일 때, 그것은 상기 유형의 물질에 더하여, 액상 담체를 함유할 수 있다. 코팅으로서 또는 다르게는 물리적 단위 투여형을 변형시키기 위하여 다양한 다른 물질이 존재할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 활성 성분(즉, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 재조합 핵산 분자)이 그의 의도된 목적, 예를 들어, 타노트랜스미션의 촉진, 면역 반응의 증가 또는 암의 치료를 달성하기 위한 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 본원에 기재된 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 포함한다. 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용의 견지에서 해당 분야의 숙련자의 능력 내에 있다. 활성 성분에 더하여, 이들 약제학적 조성물은 활성 화합물을 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 처리하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 수 있다.
해당 분야의 숙련자에게 용이하게 명백할 것처럼, 투여될 유용한 생체 내 투여량 및 특정 투여 방식은 연령, 체중, 고통의 중증도 및 치료되는 포유동물 종, 사용되는 특정 화합물 및 이들 화합물이 사용되는 특정 용도에 따라 달라질 것이다. 원하는 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 수준인 유효한 투여량 수준의 결정은 일상적인 방법, 예를 들어, 인간 임상 시험, 동물 모델 및 시험관 내 연구를 사용하여 해당 분야의 숙련자에 의해 달성될 수 있다.
특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 경구로 운반된다. 특정 구현예에서, 조성물은 비경구로 투여된다. 특정 구현예에서, 조성물은 주사 또는 주입에 의해 운반된다. 특정 구현예에서, 조성물은 경점막을 포함하여, 국부로 운반된다. 특정 구현예에서, 조성물은 흡입에 의해 운반된다. 일 구현예에서, 본원에 제공되는 조성물은 종양에 직접 주사함으로써 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 정맥내 주사 또는 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 투여는 전신이다. 특정 구현예에서, 투여는 국소이다.
실시예
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 출원 내내 언급된 모든 참고문헌, GenBank 수탁번호 및 유전자 번호, 및 공개된 특허 및 특허 출원의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 당업자는 본 발명이 개시된 구조, 물질, 조성물 및 방법에 대한 변동과 함께 실시될 수 있는 것을 인식할 것이며, 이러한 변동은 본 발명의 범위 내인 것으로 간주된다.
실시예 1. 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포에서의 세포 사멸의 유도
CT-26 마우스 결장 암종 세포(ATCC; CRL-2638)를 pLVX-Tet3G 벡터(다카라(Takara); 631358)로부터 유래된 렌티바이러스로 형질도입하여, 인간 PGK 프로모터에 의한 안정한 Tet-On 트랜스활성화제(transactivator) 발현을 확립하였다. Tet-On 시스템에서, 유전자 발현은 독시사이클린에 의해 유도 가능하다. 모든 렌티바이러스 형질도입을 293T 세포(ATCC; CRL-3216) 및 렌티바이러스 패키징 믹스(Lentivirus Packaging Mix)(바이오세티아(Biosettia); pLV-PACK)를 사용하는 표준 생성 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 이어서, CT-26-Tet3G 세포를 pLVX-TRE3G(다카라; 631193)에서 인간 TRIF ORF를 발현하는 렌티바이러스로 형질도입하였다(수탁 번호: NM_182919). CT-26-Tet3G 세포를 대안적으로 또는 부가적으로 마우스 RIPK3 ORF를 발현하는 벡터로 형질도입하였으며(수탁 번호: NM_019955.2); RIPK3 발현을 pLV-EF1a-MCS-IRES-Hyg(바이오세티아; cDNA-pLV02)의 구성성 PGK 프로모터 유도체에 의해 구동하였다. 둘 모두의 ORF를 B-B 리간드(다카라; 635059)로의 결합 시에 올리고머화하는 2개의 탠덤 DmrB 도메인의 부가에 의해 변형시켜, 올리고머화를 촉진시키기 위한 B/B 동종이량체화제(1μM)를 사용한 단백질 활성화를 가능하게 하였다. 초기 시험 후에, B/B를 사용한 이량체화는 TRIF 구축물의 활성에 실질적인 영향을 갖지 않았지만, RIPK3 발현 구축물의 활성을 촉진시켰다. 따라서, 모든 이후의 실험에서, B/B-유도된 이량체화는 TRIF를 포함하는 임의의 구축물을 활성화시키기 위하여 사용하지 않았고, 오직 RIPK3을 발현하는 단일의 구축물을 활성하기 위해서만 사용하였다. 이와 같이, B/B 이량체화제가 TRIF-유도된 활성에 영향을 갖지 않았지만, 이를 실험 환경에 포함시켜, 실험 조건이 모든 군 간에 비슷하였음을 보장하였다. 예를 들어, 도 2b에 나타나 있고, 실시예 2에 기재된 바와 같이, 이량체화제의 부가는 상기 기재된 엔지니어링된 CT-26 세포로부터의 세포 배양물로 처리되는 대식구에서 IRF 활성에 영향을 거의 갖지 않았다.
표기된 타노트랜스미션 모듈을 발현하는 CT26 마우스 결장 암종 세포를 씨딩한 후에, 독시사이클린(1mg/mL; 시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 0219895525) 및 B/B 동종이량체화제(1μM)로 24시간 동안 처리하여, 올리고머화를 통해 발현 및 단백질 활성화를 촉진시켰다. 상대적인 세포 생존력을 제조처의 설명에 따라 처리 후 제24시간에 리얼타임-글로(RealTime-Glo) MT 세포 생존력 검정 키트(프로메가(Promega), 카탈로그 번호 G9712)를 사용하여 결정하고, 그래프로 작성하여, 상대 발광 단위(RLU)에 의해 측정되는 상대적인 생존력을 보여주였다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, TRIF, RIPK3, 또는 TRIF+RIPK3의 유도된 발현 및 올리고머화는 CT-26-Tet3G(Tet3G) 부모 세포주에 비하여 세포 생존력의 감소를 유도하였다. 이들 결과는 암 세포에서의 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 발현이 암 세포의 생존력을 감소시키는 것을 보여준다.
개별 실험에서, TRIF, RIPK3, 또는 TRIF 및 RIPK3을 발현하는 암 세포에서의 가스더민 E(GSDME)의 발현의 영향을 시험하였다. CT-26-Tet3G 세포를 pLV-EF1a-MCS-IRES-Puro 벡터(바이오세티아) 내로 클로닝된 인간 GSDME(NM_004403.3)로 형질도입하였다. GSDME를 또한, 상기 기재된 CT-26-Tet3G-TRIF 및 CT26-Tet3G-TRIF-RIPK3 세포 내로 형질도입하였다. 이들 세포를 씨딩한 후에, 24시간 동안 독시사이클린(1 mg/mL; 시그마 알드리치, 0219895525)으로 처리하여, 발현을 촉진시켰다. 상대적인 세포 생존력을 제조처의 설명에 따라 처리 후 제24시간에 리얼타임-글로 MT 세포 생존력 검정 키트(프로메가, 카탈로그 번호 G9712)를 사용하여 결정하고, 그래프로 작성하여, 상대 발광 단위(RLU)에 의해 측정되는 상대적인 생존력을 보여주였다. B/B 이량체화제는 이들 실험을 위해 사용하지 않았다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, TRIF 및 TRIF+RIPK3의 발현은 CT-26-Tet3G 부모 세포주에 비하여 세포 생존력을 감소시켰으며, 이에 의해, 도 1a에 제시된 결과가 확인된다. 또한, GSDME-발현 세포에서의 TRIF 또는 TRIF+RIPK3 단백질 발현의 유도는 또한 CT-26-Tet3G 부모 세포에 비하여 세포 생존력을 감소시켰다. 종합하여, 이들 결과는 암 세포에서의 TRIF, RIPK3 및 GSDME를 포함하는 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 발현이 암 세포의 생존력을 감소시키는 것을 보여준다.
실시예 2. 대식구 내의 인터페론 자극된 유전자(ISG) 리포터에 대한 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터의 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향
J774-Dual™ 세포(인비보겐(Invivogen), J774-NFIS)를 96-웰 배양 플레이트에 100,000개 세포/웰로 씨딩하였다. J774-Dual™ 세포를 2개의 유도 가능한 리포터 구축물의 안정한 통합에 의해 마우스 J774.1 대식구-유사 세포주로부터 유도하였다. 이들 세포는 5 카피의 NF-κB 전사 반응 요소 및 3 카피의 c-Rel 결합 부위에 융합된 IFN-β 최소 프로모터의 제어 하에 분비형 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 발현한다. J774-Dual™ 세포는 또한, 5개의 인터페론-자극된 반응 요소(ISRE)와 함께 ISG54 최소 프로모터의 제어 하에 분비형 루시퍼라제를 인코딩하는 루시아(Lucia) 루시퍼라제 유전자를 발현할 수 있다. 결과적으로, J774-Dual™ 세포는 SEAP의 활성을 평가함에 의한 NF-κB 경로, 및 루시아 루시퍼라제의 활성을 모니터링함에 의한 인터페론 조절 인자(IRF) 경로의 동시의 연구를 가능하게 한다.
세포 턴오버 인자(CTF)를 함유하는 배양 배지를 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성하였다. 실시예 1에 기재된 타노트랜스미션 모듈에 더하여, 완전히 Tet-유도 가능한 프로모터를 함유하는 추가의 RIPK3 구축물도 또한 평가하였다. 이 Tet-유도 가능한 RIPK3은 도 2a에서 "RIPK3"으로 표기되어 있으며, (실시예 1에 기재된) PGK 프로모터를 함유하는 RIPK3 구축물은 도 2a에서 "PGK_RIPK3"으로 표기되어 있다.
대조군도 또한 포함시켰으며, 이는 면역자극성 타노트랜스미션 없이 세포 사멸을 유도하는 것으로 예측될 것이다. 이들 대조군 구축물은 i) 인간 Bid의 C-말단 카스파제 절단물(NM_197966.3), ii) 인간 GSDMD의 N-말단 카스파제 절단물(NM_001166237.1), iii) 합성적으로 이량체화 가능한 형태의 인간 카스파제-8(DmrB-카스파제-8), 또는 iv) 둘 모두의 DmrB-카스파제-8 및 인간 GSDME(NM_004403.3)를 발현한다. 이어서, J774-Dual™ 세포를 표기된 CTF로 24시간 동안 자극하였다. 세포 배양 배지를 수집하고, 루시퍼라제 활성을 QUANTI-Luc(인비보겐; rep-qlc1) 검정을 사용하여 측정하였다. 인터페론-자극된 반응 요소(ISRE) 프로모터 활성화를 대조군 세포주, CT-26-Tet3G와 비교하여 그래프로 작성하였다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, 시험된 CT-26 세포주 중에, (단독으로 또는 RIPK3과 조합하여) TRIF를 발현하는 세포로부터 수집된 배양 배지만이 J774-Dual™ 세포에서 ISRE/IRF 리포터 유전자 활성화를 유도하였다.
개별 실험에서, 가스더민 E(GSDME)와 TRIF 또는 TRIF+RIPK3의 조합된 발현의 영향을 시험하였다. CTF를 함유하는 배양 배지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 TRIF 또는 TRIF+RIPK3을 발현하는 CT-26 세포로부터 및 또한 TRIF+가스더민-E 또는 TRIF+RIPK3+가스더민-E를 발현하는 CT-26 세포로부터 생성하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, TRIF(iTRIF), TRIF+RIPK3(iTRIF_cR3), TRIF+가스더민-E(iTRIF_cGE), 또는 TRIF+RIPK3+가스더민-E(iTRIF_cR3_cGE)를 발현하는 CT-26 세포로부터의 배양 배지는 각각 J774-Dual™ 세포에서 ISRE/IRF 리포터 유전자 활성화를 유도하였다. 실시예 1에서 논의된 바와 같이, 이량체화제의 첨가는 ISRE/IRF 리포터 유전자 활성화에 영향을 거의 갖지 않았다.
종합하여, 이들 결과는 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 암 세포로부터 생성되는 CTF가 면역 세포에서 면역-자극 경로(즉, IRF 경로)를 활성화시키는 것을 보여준다.
실시예 3. 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에 대한 하나 이상의 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터의 세포 턴오버 인자(CTF)의 영향
골수 세포를 GM-CSF 충분한 RPMI 배양 배지를 사용하여 8일 동안 수지상 세포로 분화시켰다. 2 mL당 400,000개 세포를 6-웰 플레이트에 씨딩하였다. 제8일에, 골수 유래 수지상 세포(BMDC)를 수거하고, 100,000개 세포/웰을 96-웰 플레이트에 씨딩하였다. 이어서, BMDC를 실시예 1에 기재된 엔지니어링된 CT-26 세포로부터 유래된 CTF를 함유하는 배지로 자극하였다. 제24시간에, 자극된 세포를 수거하고, 세포 표면 마커 CD86, CD40 및 PD-L1의 발현을 유세포분석에 의해 측정하고, 평균-형광 세기(MFI)를 Tet3G 대조군과 비교하여 그래프로 작성하였다. 항체의 공급처는 하기와 같았다: CD86(바이오레전드(Biolegend), 카탈로그 번호 105042); CD40(바이오레전드, 카탈로그 번호 102910); PD-L1(바이오레전드, 카탈로그 번호 124312). 세포 표면 마커 CD86, CD40 및 PD-L1의 발현은 수지상 세포 성숙을 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 시험된 CT-26 세포주 중에, (단독으로 또는 RIPK3과 조합하여) TRIF를 발현하도록 엔지니어링된 세포로부터 수집된 배양 배지만이 CD86, CD40 또는 PD-L1의 세포 표면 발현을 상승시켰다. 이들 결과는 TRIF 또는 TRIF 및 RIPK3 둘 모두를 발현하도록 엔지니어링된 CT-26 세포로부터의 CTF가 수지상 세포의 성숙을 유도하였음을 나타낸다. 수지상 세포에서의 CD86 및 CD40의 상향조절은 T 세포를 활성화시키는 능력의 증가를 나타낸다. 따라서, 결과는 TRIF, 또는 TRIF 및 RIPK3을 발현하도록 엔지니어링된 암 세포로부터의 CTF가 수지상 세포의 성숙을 유도하고, T 세포를 활성화시키는 이들의 능력을 증가시킬 것을 나타낸다.
실시예 4. 결장 암종의 마우스 모델에서 종양 성장 및 생존에 대한 단독의 또는 항-PD1 항체와 조합된 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현의 영향
실시예 1에 기재된 바와 같은 TRIF 또는 TRIF+RIPK3 타노트랜스미션 모듈을 보유하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 트립신 처리하고, 무혈청 배지 중에 1x106개 세포/mL로 재현탁화시켰다. 세포를 BALB/c 마우스의 우측 피하 옆구리 내로 주사하였다(100 mL). CT-26 세포 주사 후 제11일 내지 제18일에, 보통의 식수에 독시사이클린(시그마 알드리치, 카탈로그 번호 D9891)을 2 mg/ml로 보충하여, 타노트랜스미션 폴리펩티드 발현을 유도하였으며, 제11일 내지 제18일에, B/B 동종이량체화제(다카라, 카탈로그 번호 632622) 2 mg/kg을 매일 복강내 주사에 의해 투여하였다. 항-PD1 항체(바이오엑스셀(BioXcell), 카탈로그 번호 BP0273) 및 아이소타입 대조군을 제14일, 제17일 및 제21일에 투여하였다. IACUC 지침에 따라 종양이 2000 mm3에 도달한 때 또는 실험 종점에 마우스를 안락사시켰다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 단독의 TRIF(CT26-TF)의 발현은 CT-26-Tet3G 대조군(Tet3G-아이소타입 대조군) 및 CT26-RIPK3 세포(CT26-P_R3)에 비하여 생존을 증가시켰으며, TRIF 및 RIPK3의 조합(Trif_RIPK3-아이소타입 대조군)을 사용하여 훨씬 더 큰 이익이 관찰되었다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, TRIF를 보유하는 CT-26 세포(CT26-TF) 또는 TRIF+RIPK3을 보유하는 CT-26 세포(TRIF_RIPK3)를 주사한 마우스의 생존은 항-PD-1 항체로의 처리에 의해 향상되었으며, 이들 처리군 둘 모두는 100% 생존을 나타낸다(선 중첩).
개별 실험에서, 실시예 2에 기재된 TRIF+GSDME 및 TRIF+RIPK3+GSDME 타노트랜스미션 모듈을 보유하는 CT-26 마우스 결장 암종 세포를 트립신 처리하고, 무혈청 배지 중에 1x106개 세포/mL로 재현탁화시켰다. 이 실험을 위하여 B/B 동종이량체화제를 사용하지 않았다. 세포를 BALB/c 마우스의 우측 피하 옆구리 내로 주사하였다(100 mL). CT-26 세포 주사 후 제15일 내지 제21일에, 마우스에 625 mg/kg의 독시사이클린 하이클레이트(엔비고(Envigo) TD.01306)를 보충한 Teklad 기본 식이를 공급하였다. IACUC 지침에 따라 종양이 2000 mm3에 도달한 때 또는 실험 종점에 마우스를 안락사시켰다.
도 4c에 나타낸 바와 같이, TRIF 또는 TRIF+RIPK3과 조합된 GSDME의 발현은 단지 TRIF만을 또는 단지 TRIF+RIPK3만을 발현하는 종양을 이식한 마우스에 비하여 생존을 추가로 향상시켰다.
실시예 5. 타노트랜스미션 폴리펩티드를 발현하는 U937 인간 골수성 백혈병 세포에 대한 화학적 카스파제 저해제의 영향
U937 인간 골수성 백혈병 세포 및 THP1-Dual 세포를 각각 ATCC 및 인비보겐으로부터 획득하였다. U937은 골수성 백혈병 세포주이다. 인간 타노트랜스미션 폴리펩티드(tBid, 카스파제 8, RIPK3 또는 TRIF)를 발현하는 U937 세포를 실시예 1 및 2에 기재된 방법 및 실시예 1에 기재된 독시사이클린-유도 가능한 발현 시스템을 사용하여 생성하였다.
THP1-Dual 세포는 NF-kB 또는 IRF 경로의 활성화 시에 리포터 단백질을 유도하는 인간 단핵 세포주이다. 이는 5 카피의 NF-κB 컨센서스 전사 반응 요소 및 3 카피의 c-Rel 결합 부위에 융합된 IFN-β 최소 프로모터에 의해 구동되는 분비형 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 발현한다. THP1-Dual 세포는 또한, 5개의 IFN-자극된 반응 요소와 함께 ISG54 최소 프로모터의 제어 하의 루시아 유전자, 즉, 분비형 루시퍼라제 리포터 유전자를 특징으로 한다. 결과적으로, THP1-Dual 세포는 SEAP의 활성의 모니터링에 의한 NF-kB 경로 및 분비형 루시퍼라제(루시아)의 활성의 평가에 의한 IRF 경로의 동시의 연구를 가능하게 한다.
조정 배지를 생성하기 위하여, 500만개의 U937-tet3G, U937-tBid, U937-카스파제8, U937-RIPK3 또는 U937-TRIF 세포를 RPMI 중에 10 cm 디쉬(dish)에 씨딩한 후에, 독시사이클린(1 μg/mL)으로 24시간 동안 처리하여, 발현을 유도하였다. B/B 동종이량체화제(100 nM)를 U937-카스파제8, U937-RIPK3 및 U937-TRIF 세포 배양물에 첨가하여, 올리고머화를 통해 발현 및 단백질 활성화를 촉진시켰다. 또한, U937-TRIF 세포를 또한, 4 μM Q-VD-Oph(범-카스파제 저해제), 10 μM GSK872(RIPK3 저해제) 또는 둘 모두의 조합으로 처리하였다. 세포를 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 조정 배지를 수거하고, 멸균 여과하였다.
NF-kB 또는 IRF 리포터 발현에 대한 타노트랜스미션 폴리펩티드 영향을 측정하기 위하여, 100,000개의 THP1-Dual 세포/웰을 100 μl 부피 중에 96-웰 편평-바닥 플레이트에 씨딩하였다. 타노트랜스미션 모듈을 발현하는 U937 세포로부터 생성되는 조정 배지 100 μl를 각각의 웰에 첨가하였다. 24시간 인큐베이션 기간 후에, 20 μl의 THP1-Dual 세포 배양 상청액을 편평-바닥 96-웰 백색(불투명) 검정 플레이트에 전달하고, 50 μl의 QUANTI-Luc 검정 용액을 각각의 웰에 첨가한 직후에, 플레이트 판독기에 의해 발광을 판독하였다. NF-kB 활성을 측정하기 위하여, 20 μl의 THP1-Dual 배양 상청액을 편평-바닥 96-웰 투명 검정 플레이트에 전달하고, 180 μl의 재현탁화된 QUANTI-Blue 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 655 nm에서 플레이트 판독기를 사용하여 SEAP 수준을 측정하였다.
도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 단독의 또는 RIPK3 저해제(Q-VD-Oph+GSK872)와 조합된 카스파제 저해제(Q-VD-Oph)로 처리된 U937-TRIF 세포로부터의 세포 배양물로의 THP-1 Dual 세포의 처리는, NF-kB 활성화 및 IRF 활성을 크게 증가시켰다. (도 5a 내지 도 5c에서, +는 독시사이클린으로 처리되는 U937 세포를 나타내고, ++는 독시사이클린 및 B/B 동종이량체화제로 처리되는 U937 세포를 나타낸다). 단독의 RIPK3 저해제로 처리되는 U937-TRIF 세포로부터의 세포 배양 배지는 THP-1 Dual 세포의 NF-kB 활성화에 영향을 거의 갖지 않았으며, 이는 증가된 NF-kB 활성화가 카스파제 저해로 인한 것이었음을 나타낸다. 도 5b 및 도 5c에 나타낸 바와 같이, 카스파제 저해제로 처리하지 않은 U937-TRIF 세포로부터의 세포 배양 배지로의 THP-1 Dual 세포의 처리는 또한 IRF 활성을 증가시켰지만, 카스파제 저해제로 처리한 U937-TRIF 세포보다는 더 적은 정도였다.
종합하여, 이들 결과는 TRIF를 발현하는 인간 암 세포로부터 생성된 CTF가 면역 세포에서 면역-자극 경로(즉, NF-kB 및 IRF 경로)를 활성화시키며, 카스파제 저해가 이의 효과를 향상시키는 것을 보여준다.
실시예 6. 카스파제 저해제 단백질을 포함하는 조합 타노트랜스미션 폴리펩티드의 발현에 의한 CT-26 마우스 결장 암종 세포에서의 타노트랜스미션의 조절
본 실시예에 기재된 실험은 TRIF 및 RIPK3을 발현하는 암 세포에서의 타노트랜스미션에 대한 카스파제 저해제 단백질의 발현의 영향을 시험하였다.
실시예 1에 기재된 바와 같은, 타노트랜스미션 폴리펩티드 TRIF 및 RIPK3을 발현하는 CT26 마우스 결장 암종 세포를 하기: (i) 우성 음성 버전의 사멸 도메인을 갖는 인간 Fas-관련 단백질(FADD; 수탁 번호 NM_003824); (ii) 짧은 버전의 인간 세포 FLICE-유사 저해성 단백질(cFLIP; 수탁 번호 NM_001127184.4); 또는 (iii) 카스파제의 바이러스 저해제(vICA, HCMV 유전자 UL36; 수탁 번호 NC_006273.2)를 인코딩하는 유전자로 형질도입하여, 카스파제 활성을 저해함으로써 타노트랜스미션을 조절하였다. FADD-DN, cFLIP 및 vICA를 각각 pLV-EF1a-MCS-IRES-Puro 벡터(바이오세티아) 내로 클로닝하고, CT26-TRIF-RIPK3 발현 세포를 형질도입하기 위하여 사용하였다.
이들 세포를 씨딩한 후에, 독시사이클린(1 mg/mL; 시그마 알드리치, 0219895525)으로 24시간 동안 처리하여, 발현을 촉진시켰다. 이 실험에서 B/B 동종이량체화제를 사용하지 않았다. 상대적인 세포 생존력을 제조처의 설명에 따라 리얼타임-글로 MT 세포 생존력 검정 키트(프로메가, 카탈로그 번호 G9712)를 사용하여 처리 후 제24시간에 결정하고, 그래프로 작성하여, 상대 발광 단위(RLU)에 의해 측정되는 상대적인 생존력을 보여주었다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, CT26-TRIF+RIPK3 세포에서의 FADD-DN, cFLIP 또는 vICA 중 어느 하나의 발현은 TRIF+RIPK3 발현에 의해 유도되는 암 세포 생존력의 감소를 약화시켰다. 그러나, CT26 세포에서의 cFLIP+TRIF+RIPK3 또는 vICA+TRIF+RIPK3의 발현은 부모 CT26-Tet3G 세포주에 비하여 암 세포 생존력을 단독의 TRIF-RIPK3보다 더 적은 정도로만 여전히 감소시켰다. 도 6a를 참조한다.
다음으로, CTF를 함유하는 배양 배지를 실시예 5에서 상기 기재된 바와 같이 CT-26 마우스 결장 암종 세포로부터 생성하였다. 이어서, J774-Dual™ 세포를 표기된 CTF로 24시간 동안 자극하였다. 세포 배양 배지를 수집하고, 루시퍼라제 활성을 QUANTI-Luc(인비보겐; rep-qlc1) 검정을 사용하여 측정하였다. 인터페론-자극 반응 요소(ISRE) 프로모터 활성화를 대조군 세포주, Tet3G에 비하여 그래프로 작성하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, TRIF 또는 TRIF+RIPK3을 발현하는 CT26 세포주로부터 수집된 배지는 J774-Dual 세포에서 IRF 리포터 발현을 유도하였다. 또한, TRIF+RIPK3에 더하여 FADD-DN, cFLIP 또는 vICA를 발현하는 CT26 세포로부터의 배지는 또한, J774-Dual 세포에서 IRF 리포터 활성화를 유도하였다.
상기 기재된 FADD-DN, cFLIP 또는 vICA 타노트랜스미션 모듈을 보유하는 CT-26-TRIF+RIPK3 마우스 결장 암종 세포를 트립신 처리하고, 무혈청 배지 중에 1x106개 세포/mL로 재현탁화시켰다. 이 실험에는 B/B 동종이량체화제를 사용하지 않았다. 세포를 면역-적격 BALB/c 마우스의 우측 피하 옆구리 내로 주사하였다(100 μL). CT-26 세포 주사 후 제15일 내지 제21일에, 마우스에 625 mg/kg의 독시사이클린 하이클레이트(엔비고 TD.01306)가 보충된 Teklad 기본 식이를 제공하였다. IACUC 지침에 따라 종양이 2000 mm3에 도달한 때 또는 실험 종점에 마우스를 안락사시켰다.
도 6c에 나타낸 바와 같이, 타노트랜스미션 모듈(즉, TRIF+RIPK3, TRIF+RIPK3+FADD-DN, TRIF+RIPK3+cFLIPS, 또는 TRIF+RIPK3+vICA)을 발현하는 모든 종양의 성장은 대조군 CT26-Tet3G 세포에 비하여 감소되었다. 특히, TRIF+RIPK3과 조합된 FADD-DN 또는 vICA의 발현은 부모 CT26-TRIF+RIPK3 세포에 비하여 종양 성장을 추가로 감소시켰다. 흥미로운 점은, TRIF+RIPK3에 더하여 FADD-DN 또는 vICA를 포함하는 타노트랜스미션 모듈이 생체내에서 종양 성장을 감소시키는 데 가장 효과적이었지만, 시험관내에서 FADD-DN+TRIF+RIPK3은 TRIF+RIPK3 세포에 비하여 CT26 암 세포 생존력에 대하여 영향을 거의 갖지 않은 한편, vICA+TRIF+RIPK3 동시발현은 시험관내에서 TRIF+RIPK3에 비하여 세포 사멸을 향상시켰다. 이들 결과는 타노트랜스미션 모듈에 의한 암 세포 사멸의 세기에 더하여, 이들 모듈의 발현으로 인한 암 세포에 의해 생성되는 정밀한 세포 턴오버 인자(CTF) 프로필이 또한 생체내에서 종양 세포에 대한 면역 반응에 기여할 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 7. 시험관내에서 암 세포 생존력, 및 IRF 및 NFkB 활성에 대한 인간 TRIF 변이체의 영향
본 연구의 목적은 인간 암 세포주의 생존력 및 인간 단핵 세포주에서의 IRF 및 NFkB 경로의 유도에 대한 인간 TRIF 단백질의 상이한 변이체의 영향을 결정하는 것이었다.
구축물을 시험하기 위하여, 인간 TRIF 변이체에 대한 서열을 설계하고, 코돈-최적화시키고, 합성하고, 상용의 렌티바이러스 벡터(pLVX-TetONE-Puro, 다카라) 내로 클로닝하였다. 2개의 대조군 세포주를 또한 제조하였다, TETON3G 및 tBID. TetON3G 세포주는 세포 사멸 유도인자 유전자의 이종 발현 없이 독시사이클린 유도를 위한 트랜스활성화제를 발현하는 음성 대조군이다. tBID 세포주는 세포독성에 대한 양성 대조군이며, 여기서, tBID는 독시사이클린-독립적인 방식으로 발현된다. TRIF 구축물은 또한, 단백질 발현의 모니터링을 위하여 C-말단에 FLAG-태그를 함유하였다. TRIF 구축물을 인간 대장 선암종 HT29 세포 및 인간 흑색종 A375 세포 내로 형질도입하였다. TRIF 구축물의 발현을 독시사이클린-유도 가능한 시스템(TetON 시스템, 다카라)을 통해 유도하였다. 독시사이클린 처리 1일 후에, 세포 생존력을 CellTiterGlo2.0 검정("CTG", 프로메가)을 사용하여 평가하고, 상청액을 THP1-Dual 단핵구(인비보겐) 상으로 전달하였다. THP1-Dual 단핵구는 각각 분비된 루시퍼라제 및 분비된 알칼리성 포스파타제를 사용하는 IRF 및 NFkB 활성에 대한 2가지 리포터를 함유하였다. 이 연구에서 평가된 TRIF 구축물은 하기 표 7에 기재되어 있다.
[표 7]
결과:
도 7 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 단독의 TIR 도메인("TIR 도메인" 구축물)의 발현은 일부 세포용해 활성을 가졌으며, TRIF 단편 aa181 내지 aa216을 TIR 도메인에 부가함으로써("TRIR" 구축물), 이 세포용해 활성은 향상되었다. 예상치 않게, RHIM 테트라드의 결실("TRIF_mutRHIM" 구축물) 또는 RHIM 도메인을 함유하는 TRIF의 C-말단 영역의 절단("TRIF_Trunc" 구축물)에 의해 나타난 바와 같이, RHIM 도메인은 세포용해 활성에 필수적이지 않았다. TBK1에 의해 인산화된 3개의 아미노산 잔기의 돌연변이를 갖는 TRIF 변이체("TRIF_PhosphoM" 구축물)의 발현은 HT29 세포에서 세포독성 활성을 거의 보이지 않았으며, A375 세포에서 세포독성 활성을 보이지 않았다. 예상치 않게, 이 TRIF 변이체는 이의 IRF 및 NFkB 활성을 유지하며, 이는 세포 사멸과 이들 경로의 활성화의 잠재적인 분리를 시사한다. 이 결과는 세포 사멸 및 IRF 활성화가 저 용량의 독시사이클린에서 변이체에 따라 분리될 수 있는 HT29 세포에서의 IRF 검정에 의해 보강된다(도 8 참조). 미니TRIF 변이체의 발현은 세포 사멸에 있어서 매우 강력하지만(도 7 및 도 9 참조), THP1-Dual 검정에서 NFkB 및 IRF 경로의 낮은 유도를 야기한다(도 8 및 도 10 참조). 미니TRIF로의 단편 aa181 내지 aa310의 부가("TRIF_d1-180" 구축물)는 NFkB 및 IRF 경로를 강력하게 활성화시키는 한편, 세포 사멸에 대하여 높은 효력을 여전히 유지한다. TRIR과 인간 RIPK3 간의 융합으로 이루어진 TRIF 변이체("TRIR3" 구축물)의 발현은 THP1-Dual 세포에서 단독의 TRIF 또는 TRIR보다 더 낮은 수준으로 세포 사멸을 유도하고 IRF 및 NFkB 경로를 활성화시킬 수 있다. 이전에 공개된 관찰(문헌[Han et al., JBC 285:12543-12550 (2010)])과 반대로, RHIM 도메인과 함께 단편 aa181 내지 aa216을 함유하는 TRIS 변이체의 발현은 THP1-Dual 세포의 세포 사멸 또는 활성화를 야기하지 않았다.
종합하여, 이들 결과는 i) TIR 도메인이 세포 사멸을 유도하기 위한 최소의 단편인 것으로 보이지만, 단백질의 다른 도메인(예를 들어, RHIM 도메인)은 세포 사멸의 방식 및 세기를 달라지게 할 수 있고; ii) TRIF의 TBK1 인산화 부위(S210A, S212A 및 T214A)가 특히 A375 세포에서 세포 사멸에 대한 중요한 기여자이고; iii) aa181 내지 aa216 단편 및 TIR 도메인의 조합이 THP1-Dual 검정에서 높은 수준의 IRF 유도를 초래하고; iv) TRIF 단백질의 TIR 도메인 및 RIPK3 단백질을 함유하는 융합 구축물("TRIR3")이 높은 세포독성, 중등도의 IRF 유도 및 낮은 NFkB 유도/NFkB 유도 부재의 예상치 않은 특징을 보유함을 나타낸다.
실시예 8. 결장암의 마우스 모델에서의 미니TRIF를 포함하는 조합 타노트랜스미션 폴리펩티드의 평가
실시예 1에 기재된 바와 같은 독시사이클린-유도 가능한 발현을 위한 Tet-On 3G 트랜스활성화제를 발현하는 CT26 마우스 결장 암종 세포를 하기를 인코딩하는 유전자로 형질도입하였다: (i) 미니TRIF(표 7 참조) + 마우스 RIPK3(실시예 1, 수탁 번호: NM_019955.2); 또는 ii) 미니TRIF + GSDME(수탁 번호: NM_001127453.2). 상기 기재된 바와 같은 단독의 Tet-On 3G 활성화자, 미니TRIF+RIPK3(+ Tet-On 3G 활성화자), 또는 미니TRIF+GSDME(+ Tet-On 3G 활성화자) 모듈을 발현하는 CT26 세포를 트립신 처리하고, 무혈청 배지 중에 1x106개 세포/mL로 재현탁화시켰다. 이 실험에서 B/B 동종이량체화제를 사용하지 않았다. 세포를 면역-적격 BALB/c 마우스의 우측 피하 옆구리 내로 주사하였다(100 μL). CT-26 세포 주사 후 제13일 내지 제19일에, 마우스에 625 mg/kg의 독시사이클린 하이클레이트(엔비고 TD.01306)를 보충한 Teklad 기본 식이를 공급하였다. IACUC 지침에 따라 종양이 2000 mm3에 도달한 때 또는 실험 종점에 마우스를 안락사시켰다.
결과
도 11에 나타낸 바와 같이, 미니TRIF 및 GSDME의 조합은 대조군에 비하여 종양 크기를 크게 감소시켰다. 미니TRIF 및 GSDME의 조합은 또한, 도 12에 나타낸 바와 같이 대조군에 비하여 생존을 크게 증가시켰다. 예를 들어, 미니TRIF 및 GSDME의 조합을 발현하는 CT26 세포를 함유하는 모든 마우스는 제34일에 여전히 생존하였지만, 모든 대조군 동물은 사망하였다. 미니TRIF 및 RIPK3의 조합은 또한, 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 종양 크기를 크게 감소시키고, 생존을 크게 증가시켰다.
종합하여, 이들 결과는 암 세포에서의 타노트랜스미션 폴리펩티드의 발현이 종양 성장을 감소시키고, 생존을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 9. 시험관내에서 암 세포 생존력 및 IRF 활성에 대한 아데노바이러스로부터 발현되는 RIPK3, TRIF 및 vICA의 영향
본 연구의 목적은 J774-Dual™ 세포(인비보겐, J774-NFIS)에서 인간 암 세포주의 생존력 및 IRF 경로의 유도에 대한 복제 비적격 아데노바이러스 5로부터 발현되는 단독의 또는 TRIF 또는 TRIF+vICA와 조합된 RIPK3의 영향을 결정하는 것이었다.
J774-Dual™ 세포를 유도 가능한 리포터 구축물의 안정한 통합에 의해 마우스 J774.1 대식구-유사 세포주로부터 유도하였다. 예를 들어, 이들 세포는 5개의 인터페론-자극 반응 요소(ISRE)와 함께 ISG54 최소 프로모터의 제어 하에 분비형 루시퍼라제를 인코딩하는 루시아 루시퍼라제 유전자를 발현한다. 결과적으로, J774-Dual™ 세포는 루시아 루시퍼라제의 활성을 모니터링함으로써 인터페론 조절 인자(IRF) 경로의 연구를 가능하게 한다.
이 실험은 야생형 마우스 암 세포주 4T1(유방암), MC38(결장암) 및 Pan02(췌장암)에서 타노트랜스미션에 대한 마우스 RIPK3(mRIPK3), 인간 TRIF-P2A-mRIPK3, 또는 인간 TRIF-P2A-mRIPK3-P2A-vICA를 발현하는 복제 비적격 아데노바이러스 5(E1 및 E3 영역 결실)의 영향을 시험하였다. 마우스 RIPK3을 마우스 모델에서 사용하였는데, 그 이유는 RIPK3이 종 특이성을 갖기 때문이다. TRIF가 종 특이성을 갖지 않기 때문에, 인간 TRIF를 사용하였다. P2A 펩티드는 번역 동안 리보솜 스키핑을 유도하여, TRIF, mRIPK3 및 vICA가 개별 단백질로서 발현되도록 하였다.
암 세포주 4T1, MC38 및 Pan02를 씨딩한 후에, 50의 감염 다중도(MOI)(즉, 암 세포당 50개의 아데노바이러스)로, 모의 대조군, mRIPK3, TRIF-P2A-mRIPK3, 또는 TRIF-P2A-mRIPK3-P2A-vICA를 발현하는 아데노바이러스 5로 72시간 동안 처리하였다. 세포 사멸을 SYTOX 그린(green)(라이프 테크놀로지즈(Life technologies); S7020)을 사용하여 측정하고, 총 세포 수를 훼이스트(Hoechst)(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific); H1399)를 사용한 핵 염색에 의해 측정하였다.
세포를 아데노바이러스로의 처리 후 48시간 동안 배양함으로써, 세포 턴오버 인자(CTF)를 함유하는 조정 배양 배지를 본질적으로 실시예 5에 기재된 바와 같이 상기 재조합 아데노바이러스로 처리한 세포로부터 생성하였다. 48시간 인큐베이션 후에, 조정 배지를 수거하고, 멸균 여과하였다. IRF 활성의 측정을 위하여, J774-Dual™ 세포를 이어서, 표기된 CTF를 사용하여 24시간 동안 자극하였다. 구체적으로, 100,000개의 J774-Dual 세포/웰을 96-웰 편평-바닥 플레이트에 100 μl 부피 중에 씨딩하였다. 타노트랜스미션 모듈을 발현하는 다양한 암 세포로부터 생성되었던 조정 배지 100 μl를 각각의 웰에 첨가하였다. J774-Dual™ 세포로부터의 세포 배양 배지를 수집하고, 루시퍼라제 활성을 QUANTI-Luc(인비보겐; rep-qlc1) 검정을 사용하여 측정하였다. IRF 활성을 보여주기 위하여 인터페론-자극 반응 요소(ISRE) 프로모터 활성화를 대조군 세포주, Tet3G와 비교하여 그래프로 작성하였다.
결과
도 15 내지 도 17은 72시간에 걸쳐 생존 가능한 세포에 비한 세포 사멸을 보여준다. 도 15 좌측 패널에 나타낸 바와 같이, TRIF+mRIPK3+vICA의 조합은 4T1 마우스 유방암 세포에서 세포 사멸을 크게 증가시킨 한편, 단독의 mRIPK3, TRIF+mRIPK3 및 모의 대조군은 세포 사멸을 거의 나타내지 않거나, 전혀 나타내지 않았다. 도 16 및 도 17에 나타낸 바와 같이, TRIF+mRIPK3+vICA 및 TRIF+mRIPK3은 둘 모두 단독의 mRIPK3 및 모의 대조군에 비하여 MC38 결장암 세포(도 16, 좌측 패널) 및 Pan02 췌장암 세포(도 17, 좌측 패널)에서 세포 사멸을 크게 증가시켰으며, TRIF+mRIPK3+vICA 발현은 더 높고 더 신속한 세포 사멸을 초래하였다.
도 15 내지 도 17, 우측 패널에 나타낸 바와 같이, TRIF+mRIPK3+vICA를 발현하는 4T1, MC38 및 Pan02 세포로부터 수집된 배지는 J774-Dual™ 세포에서 IRF 리포터 발현을 강력하게 유도하는 한편, 단독의 mRIPK3 및 mRIPK3+TRIF의 발현은 IRF 활성에 영향을 거의 갖지 않았다.
Ad5-hTRIF-P2A-mRIPK3으로 처리한 MC38, 4T1 및 Pan02 세포로부터 수집된 배지에 대한 이 후자의 결과는 hTRIF 및 mRIPK3을 발현하는 CT26 세포로부터 수집된 배지가 J774 세포에서 IRF 활성을 유도하였던 상기 기재된 dox 유도 가능한 타노스위치(thanoswitch) 결과와 상이하다. 이 차이에 대한 이유는 특성화되어야 하지만, 아데노바이러스 발현 시스템에서의 IRF 활성의 결여는 dox 유도 가능한 시스템에 비하여 더 낮은 RIPK3 및 TRIF 발현 수준으로 인한 것일 수 있다. 대안적으로, 이 실험에서 감염성 아데노바이러스 입자의 용량은 mRIPK3+TRIF가 IRF 활성을 유도하는 데 충분하지 않았을 가능성이 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Schmidt, Darby Rye
Nagarajan, Niranjana Aditi
Kaiser, William Joseph
Gough, Peter Joseph
Dhakal, Sabin
Hubaud, Alexis Benoit
<120> THANOTRANSMISSION POLYPEPTIDES AND THEIR USE IN TREATING CANCER
<130> 129983-01220
<150> US 63/169,167
<151> 2021-03-31
<150> US 63/216,499
<151> 2021-06-29
<150> US 63/292,667
<151> 2021-12-22
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2139
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggcttgca caggaccttc tctgcccagc gcctttgata tcctgggagc cgctggacag 60
gacaagctgc tgtacctgaa gcacaagctg aaaacccctc ggcctggctg ccagggacaa 120
gatctgctgc atgctatggt gctgctgaag ctgggccaag agacagaggc cagaatcagc 180
ctggaagccc tgaaggctga tgccgtggct agactggttg ccagacaatg ggctggcgtg 240
gacagcacag aggaccctga agaacctcct gacgtgtcct gggccgtcgc cagactgtat 300
catctgctgg ccgaagagaa gctgtgcccc gcctctctga gagatgtggc ctatcaagaa 360
gccgtgcgga ccctgagcag cagggatgat catagactgg gcgagctgca ggacgaggcc 420
cggaatagat gtggctggga tattgctggc gaccccggca gcattagaac cctgcagtct 480
aacctgggct gcctgcctcc atcttctgcc ctgccatctg gcacaagaag cctgcctaga 540
cctatcgacg gcgtgtccga ttggagccag ggctgttctc tgagaagcac aggatctcca 600
gccagcctgg ccagcaacct ggaaatcagc cagtctccta caatgccctt cctgagcctg 660
cacagaagcc ctcacggacc tagcaagctg tgcgacgatc ctcaggcttc tctggtgcct 720
gaacctgttc ctggcggctg ccaagagcct gaagagatgt cttggcctcc tagcggcgag 780
atcgcctctc cacctgaact gccatctagc cctccaccag gactgcctga agtggcccct 840
gatgccactt ctacaggcct gcctgataca cccgccgctc cagagacaag cacaaactac 900
cctgtggaat gcaccgaggg ctctgccgga cctcaatctc tgcctctgcc tatcctggaa 960
cctgtgaaga acccttgcag cgtgaaggat cagacccctc tgcagctgag cgtggaagat 1020
accacctctc ctaacaccaa gccttgtcct ccaacaccta ccacacctga gacaagccca 1080
cctcctccgc ctccaccacc aagctctaca ccttgtagcg cccacctgac accaagcagc 1140
ctgtttccaa gctctctgga aagcagcagc gagcagaaat tctacaactt cgtgatcctg 1200
cacgccagag ccgacgagca cattgccctg agagtgcgcg aaaagctgga agctctggga 1260
gtgcctgatg gcgccacctt ctgcgaggat tttcaggttc ccggaagagg cgagctgagc 1320
tgtctgcagg atgccatcga tcacagcgcc ttcatcattc tgctgctgac cagcaacttc 1380
gactgccggc tgtctctgca ccaagtgaac caggccatga tgagcaacct gaccagacag 1440
ggcagccccg attgcgtgat cccattcctg ccactggaaa gctccccagc acagctgtct 1500
agcgatactg cctctctgct gtctggactc gtgcggctgg atgagcacag ccagatcttc 1560
gccagaaagg tggccaacac cttcaagccc catcggctgc aggccagaaa agccatgtgg 1620
cggaaagagc aggacacacg ggcactgaga gagcagtctc agcacctgga tggcgagaga 1680
atgcaggccg ctgctctgaa tgccgcctac agcgcttacc tgcagagcta cctgagctat 1740
caggcccaga tggaacagct gcaggtcgcc tttggcagcc acatgtcctt tggaacaggc 1800
gccccttacg gcgccagaat gccttttggt ggacaggtgc cactgggagc ccctccacct 1860
tttccaacat ggccaggatg tccccagcct cctccactgc atgcttggca agctggaaca 1920
cctccgccac catctccaca gccagctgcc tttccacagt ctctcccatt tccacagagc 1980
cccgcctttc caacagctag ccctgctcct ccacaaagcc ctggactgca gcccctgatc 2040
attcaccacg cacagatggt gcagctggga ctgaacaatc acatgtggaa ccagagaggc 2100
tctcaggccc ctgaggacaa gacacaagag gccgaatga 2139
<210> 2
<211> 712
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Cys Thr Gly Pro Ser Leu Pro Ser Ala Phe Asp Ile Leu Gly
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gln Asp Lys Leu Leu Tyr Leu Lys His Lys Leu Lys Thr
20 25 30
Pro Arg Pro Gly Cys Gln Gly Gln Asp Leu Leu His Ala Met Val Leu
35 40 45
Leu Lys Leu Gly Gln Glu Thr Glu Ala Arg Ile Ser Leu Glu Ala Leu
50 55 60
Lys Ala Asp Ala Val Ala Arg Leu Val Ala Arg Gln Trp Ala Gly Val
65 70 75 80
Asp Ser Thr Glu Asp Pro Glu Glu Pro Pro Asp Val Ser Trp Ala Val
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr His Leu Leu Ala Glu Glu Lys Leu Cys Pro Ala Ser
100 105 110
Leu Arg Asp Val Ala Tyr Gln Glu Ala Val Arg Thr Leu Ser Ser Arg
115 120 125
Asp Asp His Arg Leu Gly Glu Leu Gln Asp Glu Ala Arg Asn Arg Cys
130 135 140
Gly Trp Asp Ile Ala Gly Asp Pro Gly Ser Ile Arg Thr Leu Gln Ser
145 150 155 160
Asn Leu Gly Cys Leu Pro Pro Ser Ser Ala Leu Pro Ser Gly Thr Arg
165 170 175
Ser Leu Pro Arg Pro Ile Asp Gly Val Ser Asp Trp Ser Gln Gly Cys
180 185 190
Ser Leu Arg Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ser Asn Leu Glu
195 200 205
Ile Ser Gln Ser Pro Thr Met Pro Phe Leu Ser Leu His Arg Ser Pro
210 215 220
His Gly Pro Ser Lys Leu Cys Asp Asp Pro Gln Ala Ser Leu Val Pro
225 230 235 240
Glu Pro Val Pro Gly Gly Cys Gln Glu Pro Glu Glu Met Ser Trp Pro
245 250 255
Pro Ser Gly Glu Ile Ala Ser Pro Pro Glu Leu Pro Ser Ser Pro Pro
260 265 270
Pro Gly Leu Pro Glu Val Ala Pro Asp Ala Thr Ser Thr Gly Leu Pro
275 280 285
Asp Thr Pro Ala Ala Pro Glu Thr Ser Thr Asn Tyr Pro Val Glu Cys
290 295 300
Thr Glu Gly Ser Ala Gly Pro Gln Ser Leu Pro Leu Pro Ile Leu Glu
305 310 315 320
Pro Val Lys Asn Pro Cys Ser Val Lys Asp Gln Thr Pro Leu Gln Leu
325 330 335
Ser Val Glu Asp Thr Thr Ser Pro Asn Thr Lys Pro Cys Pro Pro Thr
340 345 350
Pro Thr Thr Pro Glu Thr Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser
355 360 365
Ser Thr Pro Cys Ser Ala His Leu Thr Pro Ser Ser Leu Phe Pro Ser
370 375 380
Ser Leu Glu Ser Ser Ser Glu Gln Lys Phe Tyr Asn Phe Val Ile Leu
385 390 395 400
His Ala Arg Ala Asp Glu His Ile Ala Leu Arg Val Arg Glu Lys Leu
405 410 415
Glu Ala Leu Gly Val Pro Asp Gly Ala Thr Phe Cys Glu Asp Phe Gln
420 425 430
Val Pro Gly Arg Gly Glu Leu Ser Cys Leu Gln Asp Ala Ile Asp His
435 440 445
Ser Ala Phe Ile Ile Leu Leu Leu Thr Ser Asn Phe Asp Cys Arg Leu
450 455 460
Ser Leu His Gln Val Asn Gln Ala Met Met Ser Asn Leu Thr Arg Gln
465 470 475 480
Gly Ser Pro Asp Cys Val Ile Pro Phe Leu Pro Leu Glu Ser Ser Pro
485 490 495
Ala Gln Leu Ser Ser Asp Thr Ala Ser Leu Leu Ser Gly Leu Val Arg
500 505 510
Leu Asp Glu His Ser Gln Ile Phe Ala Arg Lys Val Ala Asn Thr Phe
515 520 525
Lys Pro His Arg Leu Gln Ala Arg Lys Ala Met Trp Arg Lys Glu Gln
530 535 540
Asp Thr Arg Ala Leu Arg Glu Gln Ser Gln His Leu Asp Gly Glu Arg
545 550 555 560
Met Gln Ala Ala Ala Leu Asn Ala Ala Tyr Ser Ala Tyr Leu Gln Ser
565 570 575
Tyr Leu Ser Tyr Gln Ala Gln Met Glu Gln Leu Gln Val Ala Phe Gly
580 585 590
Ser His Met Ser Phe Gly Thr Gly Ala Pro Tyr Gly Ala Arg Met Pro
595 600 605
Phe Gly Gly Gln Val Pro Leu Gly Ala Pro Pro Pro Phe Pro Thr Trp
610 615 620
Pro Gly Cys Pro Gln Pro Pro Pro Leu His Ala Trp Gln Ala Gly Thr
625 630 635 640
Pro Pro Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Ala Phe Pro Gln Ser Leu Pro
645 650 655
Phe Pro Gln Ser Pro Ala Phe Pro Thr Ala Ser Pro Ala Pro Pro Gln
660 665 670
Ser Pro Gly Leu Gln Pro Leu Ile Ile His His Ala Gln Met Val Gln
675 680 685
Leu Gly Leu Asn Asn His Met Trp Asn Gln Arg Gly Ser Gln Ala Pro
690 695 700
Glu Asp Lys Thr Gln Glu Ala Glu
705 710
<210> 3
<211> 2139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutation of the RHIM tetrad of TRIF into AAAA
<400> 3
atggcttgca caggaccttc tctgcccagc gcctttgata tcctgggagc cgctggacag 60
gacaagctgc tgtacctgaa gcacaagctg aaaacccctc ggcctggctg ccagggacaa 120
gatctgctgc atgctatggt gctgctgaag ctgggccaag agacagaggc cagaatcagc 180
ctggaagccc tgaaggctga tgccgtggct agactggttg ccagacaatg ggctggcgtg 240
gacagcacag aggaccctga agaacctcct gacgtgtcct gggccgtcgc cagactgtat 300
catctgctgg ccgaagagaa gctgtgcccc gcctctctga gagatgtggc ctatcaagaa 360
gccgtgcgga ccctgagcag cagggatgat catagactgg gcgagctgca ggacgaggcc 420
cggaatagat gtggctggga tattgctggc gaccccggca gcattagaac cctgcagtct 480
aacctgggct gcctgcctcc atcttctgcc ctgccatctg gcacaagaag cctgcctaga 540
cctatcgacg gcgtgtccga ttggagccag ggctgttctc tgagaagcac aggatctcca 600
gccagcctgg ccagcaacct ggaaatcagc cagtctccta caatgccctt cctgagcctg 660
cacagaagcc ctcacggacc tagcaagctg tgcgacgatc ctcaggcttc tctggtgcct 720
gaacctgttc ctggcggctg ccaagagcct gaagagatgt cttggcctcc tagcggcgag 780
atcgcctctc cacctgaact gccatctagc cctccaccag gactgcctga agtggcccct 840
gatgccactt ctacaggcct gcctgataca cccgccgctc cagagacaag cacaaactac 900
cctgtggaat gcaccgaggg ctctgccgga cctcaatctc tgcctctgcc tatcctggaa 960
cctgtgaaga acccttgcag cgtgaaggat cagacccctc tgcagctgag cgtggaagat 1020
accacctctc ctaacaccaa gccttgtcct ccaacaccta ccacacctga gacaagccca 1080
cctcctccgc ctccaccacc aagctctaca ccttgtagcg cccacctgac accaagcagc 1140
ctgtttccaa gctctctgga aagcagcagc gagcagaaat tctacaactt cgtgatcctg 1200
cacgccagag ccgacgagca cattgccctg agagtgcgcg aaaagctgga agctctggga 1260
gtgcctgatg gcgccacctt ctgcgaggat tttcaggttc ccggaagagg cgagctgagc 1320
tgtctgcagg atgccatcga tcacagcgcc ttcatcattc tgctgctgac cagcaacttc 1380
gactgccggc tgtctctgca ccaagtgaac caggccatga tgagcaacct gaccagacag 1440
ggcagccccg attgcgtgat cccattcctg ccactggaaa gctccccagc acagctgtct 1500
agcgatactg cctctctgct gtctggactc gtgcggctgg atgagcacag ccagatcttc 1560
gccagaaagg tggccaacac cttcaagccc catcggctgc aggccagaaa agccatgtgg 1620
cggaaagagc aggacacacg ggcactgaga gagcagtctc agcacctgga tggcgagaga 1680
atgcaggccg ctgctctgaa tgccgcctac agcgcttacc tgcagagcta cctgagctat 1740
caggcccaga tggaacagct gcaggtcgcc tttggcagcc acatgtcctt tggaacaggc 1800
gccccttacg gcgccagaat gccttttggt ggacaggtgc cactgggagc ccctccacct 1860
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cctccgccac catctccaca gccagctgcc tttccacagt ctctcccatt tccacagagc 1980
cccgcctttc caacagctag ccctgctcct ccacaaagcc ctggactgca gcccctgatc 2040
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tctcaggccc ctgaggacaa gacacaagag gccgaatga 2139
<210> 4
<211> 712
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutation of the RHIM tetrad of TRIF into AAAA
<400> 4
Met Ala Cys Thr Gly Pro Ser Leu Pro Ser Ala Phe Asp Ile Leu Gly
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gln Asp Lys Leu Leu Tyr Leu Lys His Lys Leu Lys Thr
20 25 30
Pro Arg Pro Gly Cys Gln Gly Gln Asp Leu Leu His Ala Met Val Leu
35 40 45
Leu Lys Leu Gly Gln Glu Thr Glu Ala Arg Ile Ser Leu Glu Ala Leu
50 55 60
Lys Ala Asp Ala Val Ala Arg Leu Val Ala Arg Gln Trp Ala Gly Val
65 70 75 80
Asp Ser Thr Glu Asp Pro Glu Glu Pro Pro Asp Val Ser Trp Ala Val
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr His Leu Leu Ala Glu Glu Lys Leu Cys Pro Ala Ser
100 105 110
Leu Arg Asp Val Ala Tyr Gln Glu Ala Val Arg Thr Leu Ser Ser Arg
115 120 125
Asp Asp His Arg Leu Gly Glu Leu Gln Asp Glu Ala Arg Asn Arg Cys
130 135 140
Gly Trp Asp Ile Ala Gly Asp Pro Gly Ser Ile Arg Thr Leu Gln Ser
145 150 155 160
Asn Leu Gly Cys Leu Pro Pro Ser Ser Ala Leu Pro Ser Gly Thr Arg
165 170 175
Ser Leu Pro Arg Pro Ile Asp Gly Val Ser Asp Trp Ser Gln Gly Cys
180 185 190
Ser Leu Arg Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ser Asn Leu Glu
195 200 205
Ile Ser Gln Ser Pro Thr Met Pro Phe Leu Ser Leu His Arg Ser Pro
210 215 220
His Gly Pro Ser Lys Leu Cys Asp Asp Pro Gln Ala Ser Leu Val Pro
225 230 235 240
Glu Pro Val Pro Gly Gly Cys Gln Glu Pro Glu Glu Met Ser Trp Pro
245 250 255
Pro Ser Gly Glu Ile Ala Ser Pro Pro Glu Leu Pro Ser Ser Pro Pro
260 265 270
Pro Gly Leu Pro Glu Val Ala Pro Asp Ala Thr Ser Thr Gly Leu Pro
275 280 285
Asp Thr Pro Ala Ala Pro Glu Thr Ser Thr Asn Tyr Pro Val Glu Cys
290 295 300
Thr Glu Gly Ser Ala Gly Pro Gln Ser Leu Pro Leu Pro Ile Leu Glu
305 310 315 320
Pro Val Lys Asn Pro Cys Ser Val Lys Asp Gln Thr Pro Leu Gln Leu
325 330 335
Ser Val Glu Asp Thr Thr Ser Pro Asn Thr Lys Pro Cys Pro Pro Thr
340 345 350
Pro Thr Thr Pro Glu Thr Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser
355 360 365
Ser Thr Pro Cys Ser Ala His Leu Thr Pro Ser Ser Leu Phe Pro Ser
370 375 380
Ser Leu Glu Ser Ser Ser Glu Gln Lys Phe Tyr Asn Phe Val Ile Leu
385 390 395 400
His Ala Arg Ala Asp Glu His Ile Ala Leu Arg Val Arg Glu Lys Leu
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Glu Ala Leu Gly Val Pro Asp Gly Ala Thr Phe Cys Glu Asp Phe Gln
420 425 430
Val Pro Gly Arg Gly Glu Leu Ser Cys Leu Gln Asp Ala Ile Asp His
435 440 445
Ser Ala Phe Ile Ile Leu Leu Leu Thr Ser Asn Phe Asp Cys Arg Leu
450 455 460
Ser Leu His Gln Val Asn Gln Ala Met Met Ser Asn Leu Thr Arg Gln
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Gly Ser Pro Asp Cys Val Ile Pro Phe Leu Pro Leu Glu Ser Ser Pro
485 490 495
Ala Gln Leu Ser Ser Asp Thr Ala Ser Leu Leu Ser Gly Leu Val Arg
500 505 510
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515 520 525
Lys Pro His Arg Leu Gln Ala Arg Lys Ala Met Trp Arg Lys Glu Gln
530 535 540
Asp Thr Arg Ala Leu Arg Glu Gln Ser Gln His Leu Asp Gly Glu Arg
545 550 555 560
Met Gln Ala Ala Ala Leu Asn Ala Ala Tyr Ser Ala Tyr Leu Gln Ser
565 570 575
Tyr Leu Ser Tyr Gln Ala Gln Met Glu Gln Leu Gln Val Ala Phe Gly
580 585 590
Ser His Met Ser Phe Gly Thr Gly Ala Pro Tyr Gly Ala Arg Met Pro
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Phe Pro Gln Ser Pro Ala Phe Pro Thr Ala Ser Pro Ala Pro Pro Gln
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Ser Pro Gly Leu Gln Pro Leu Ile Ile His His Ala Gln Met Val Ala
675 680 685
Ala Ala Ala Asn Asn His Met Trp Asn Gln Arg Gly Ser Gln Ala Pro
690 695 700
Glu Asp Lys Thr Gln Glu Ala Glu
705 710
<210> 5
<211> 1623
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Truncation of the C-ter fragment (541-712) of TRIF containing the RHIM
domain
<400> 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Truncation of the C-ter fragment (541-712) of TRIF containing the RHIM
domain
<400> 6
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515 520 525
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530 535 540
<210> 7
<211> 2139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutations for TBK1 phosphorylation sites (S210A,S212A,T214A) of TRIF
<400> 7
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cggaaagagc aggacacacg ggcactgaga gagcagtctc agcacctgga tggcgagaga 1680
atgcaggccg ctgctctgaa tgccgcctac agcgcttacc tgcagagcta cctgagctat 1740
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<210> 8
<211> 712
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutations for TBK1 phosphorylation sites (S210A,S212A,T214A) of TRIF
<400> 8
Met Ala Cys Thr Gly Pro Ser Leu Pro Ser Ala Phe Asp Ile Leu Gly
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gln Asp Lys Leu Leu Tyr Leu Lys His Lys Leu Lys Thr
20 25 30
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565 570 575
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580 585 590
Ser His Met Ser Phe Gly Thr Gly Ala Pro Tyr Gly Ala Arg Met Pro
595 600 605
Phe Gly Gly Gln Val Pro Leu Gly Ala Pro Pro Pro Phe Pro Thr Trp
610 615 620
Pro Gly Cys Pro Gln Pro Pro Pro Leu His Ala Trp Gln Ala Gly Thr
625 630 635 640
Pro Pro Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Ala Phe Pro Gln Ser Leu Pro
645 650 655
Phe Pro Gln Ser Pro Ala Phe Pro Thr Ala Ser Pro Ala Pro Pro Gln
660 665 670
Ser Pro Gly Leu Gln Pro Leu Ile Ile His His Ala Gln Met Val Gln
675 680 685
Leu Gly Leu Asn Asn His Met Trp Asn Gln Arg Gly Ser Gln Ala Pro
690 695 700
Glu Asp Lys Thr Gln Glu Ala Glu
705 710
<210> 9
<211> 2139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutation for dimerization site P434 in the TIR domain of TRIF
<400> 9
atggcttgca caggaccttc tctgcccagc gcctttgata tcctgggagc cgctggacag 60
gacaagctgc tgtacctgaa gcacaagctg aaaacccctc ggcctggctg ccagggacaa 120
gatctgctgc atgctatggt gctgctgaag ctgggccaag agacagaggc cagaatcagc 180
ctggaagccc tgaaggctga tgccgtggct agactggttg ccagacaatg ggctggcgtg 240
gacagcacag aggaccctga agaacctcct gacgtgtcct gggccgtcgc cagactgtat 300
catctgctgg ccgaagagaa gctgtgcccc gcctctctga gagatgtggc ctatcaagaa 360
gccgtgcgga ccctgagcag cagggatgat catagactgg gcgagctgca ggacgaggcc 420
cggaatagat gtggctggga tattgctggc gaccccggca gcattagaac cctgcagtct 480
aacctgggct gcctgcctcc atcttctgcc ctgccatctg gcacaagaag cctgcctaga 540
cctatcgacg gcgtgtccga ttggagccag ggctgttctc tgagaagcac aggatctcca 600
gccagcctgg ccagcaacct ggaaatcagc cagtctccta caatgccctt cctgagcctg 660
cacagaagcc ctcacggacc tagcaagctg tgcgacgatc ctcaggcttc tctggtgcct 720
gaacctgttc ctggcggctg ccaagagcct gaagagatgt cttggcctcc tagcggcgag 780
atcgcctctc cacctgaact gccatctagc cctccaccag gactgcctga agtggcccct 840
gatgccactt ctacaggcct gcctgataca cccgccgctc cagagacaag cacaaactac 900
cctgtggaat gcaccgaggg ctctgccgga cctcaatctc tgcctctgcc tatcctggaa 960
cctgtgaaga acccttgcag cgtgaaggat cagacccctc tgcagctgag cgtggaagat 1020
accacctctc ctaacaccaa gccttgtcct ccaacaccta ccacacctga gacaagccca 1080
cctcctccgc ctccaccacc aagctctaca ccttgtagcg cccacctgac accaagcagc 1140
ctgtttccaa gctctctgga aagcagcagc gagcagaaat tctacaactt cgtgatcctg 1200
cacgccagag ccgacgagca cattgccctg agagtgcgcg aaaagctgga agctctggga 1260
gtgcctgatg gcgccacctt ctgcgaggat tttcaggttc atggaagagg cgagctgagc 1320
tgtctgcagg atgccatcga tcacagcgcc ttcatcattc tgctgctgac cagcaacttc 1380
gactgccggc tgtctctgca ccaagtgaac caggccatga tgagcaacct gaccagacag 1440
ggcagccccg attgcgtgat cccattcctg ccactggaaa gctccccagc acagctgtct 1500
agcgatactg cctctctgct gtctggactc gtgcggctgg atgagcacag ccagatcttc 1560
gccagaaagg tggccaacac cttcaagccc catcggctgc aggccagaaa agccatgtgg 1620
cggaaagagc aggacacacg ggcactgaga gagcagtctc agcacctgga tggcgagaga 1680
atgcaggccg ctgctctgaa tgccgcctac agcgcttacc tgcagagcta cctgagctat 1740
caggcccaga tggaacagct gcaggtcgcc tttggcagcc acatgtcctt tggaacaggc 1800
gccccttacg gcgccagaat gccttttggt ggacaggtgc cactgggagc ccctccacct 1860
tttccaacat ggccaggatg tccccagcct cctccactgc atgcttggca agctggaaca 1920
cctccgccac catctccaca gccagctgcc tttccacagt ctctcccatt tccacagagc 1980
cccgcctttc caacagctag ccctgctcct ccacaaagcc ctggactgca gcccctgatc 2040
attcaccacg cacagatggt gcagctggga ctgaacaatc acatgtggaa ccagagaggc 2100
tctcaggccc ctgaggacaa gacacaagag gccgaatga 2139
<210> 10
<211> 712
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutation for dimerization site P434 in the TIR domain of TRIF
<400> 10
Met Ala Cys Thr Gly Pro Ser Leu Pro Ser Ala Phe Asp Ile Leu Gly
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gln Asp Lys Leu Leu Tyr Leu Lys His Lys Leu Lys Thr
20 25 30
Pro Arg Pro Gly Cys Gln Gly Gln Asp Leu Leu His Ala Met Val Leu
35 40 45
Leu Lys Leu Gly Gln Glu Thr Glu Ala Arg Ile Ser Leu Glu Ala Leu
50 55 60
Lys Ala Asp Ala Val Ala Arg Leu Val Ala Arg Gln Trp Ala Gly Val
65 70 75 80
Asp Ser Thr Glu Asp Pro Glu Glu Pro Pro Asp Val Ser Trp Ala Val
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr His Leu Leu Ala Glu Glu Lys Leu Cys Pro Ala Ser
100 105 110
Leu Arg Asp Val Ala Tyr Gln Glu Ala Val Arg Thr Leu Ser Ser Arg
115 120 125
Asp Asp His Arg Leu Gly Glu Leu Gln Asp Glu Ala Arg Asn Arg Cys
130 135 140
Gly Trp Asp Ile Ala Gly Asp Pro Gly Ser Ile Arg Thr Leu Gln Ser
145 150 155 160
Asn Leu Gly Cys Leu Pro Pro Ser Ser Ala Leu Pro Ser Gly Thr Arg
165 170 175
Ser Leu Pro Arg Pro Ile Asp Gly Val Ser Asp Trp Ser Gln Gly Cys
180 185 190
Ser Leu Arg Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ser Asn Leu Glu
195 200 205
Ile Ser Gln Ser Pro Thr Met Pro Phe Leu Ser Leu His Arg Ser Pro
210 215 220
His Gly Pro Ser Lys Leu Cys Asp Asp Pro Gln Ala Ser Leu Val Pro
225 230 235 240
Glu Pro Val Pro Gly Gly Cys Gln Glu Pro Glu Glu Met Ser Trp Pro
245 250 255
Pro Ser Gly Glu Ile Ala Ser Pro Pro Glu Leu Pro Ser Ser Pro Pro
260 265 270
Pro Gly Leu Pro Glu Val Ala Pro Asp Ala Thr Ser Thr Gly Leu Pro
275 280 285
Asp Thr Pro Ala Ala Pro Glu Thr Ser Thr Asn Tyr Pro Val Glu Cys
290 295 300
Thr Glu Gly Ser Ala Gly Pro Gln Ser Leu Pro Leu Pro Ile Leu Glu
305 310 315 320
Pro Val Lys Asn Pro Cys Ser Val Lys Asp Gln Thr Pro Leu Gln Leu
325 330 335
Ser Val Glu Asp Thr Thr Ser Pro Asn Thr Lys Pro Cys Pro Pro Thr
340 345 350
Pro Thr Thr Pro Glu Thr Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser
355 360 365
Ser Thr Pro Cys Ser Ala His Leu Thr Pro Ser Ser Leu Phe Pro Ser
370 375 380
Ser Leu Glu Ser Ser Ser Glu Gln Lys Phe Tyr Asn Phe Val Ile Leu
385 390 395 400
His Ala Arg Ala Asp Glu His Ile Ala Leu Arg Val Arg Glu Lys Leu
405 410 415
Glu Ala Leu Gly Val Pro Asp Gly Ala Thr Phe Cys Glu Asp Phe Gln
420 425 430
Val His Gly Arg Gly Glu Leu Ser Cys Leu Gln Asp Ala Ile Asp His
435 440 445
Ser Ala Phe Ile Ile Leu Leu Leu Thr Ser Asn Phe Asp Cys Arg Leu
450 455 460
Ser Leu His Gln Val Asn Gln Ala Met Met Ser Asn Leu Thr Arg Gln
465 470 475 480
Gly Ser Pro Asp Cys Val Ile Pro Phe Leu Pro Leu Glu Ser Ser Pro
485 490 495
Ala Gln Leu Ser Ser Asp Thr Ala Ser Leu Leu Ser Gly Leu Val Arg
500 505 510
Leu Asp Glu His Ser Gln Ile Phe Ala Arg Lys Val Ala Asn Thr Phe
515 520 525
Lys Pro His Arg Leu Gln Ala Arg Lys Ala Met Trp Arg Lys Glu Gln
530 535 540
Asp Thr Arg Ala Leu Arg Glu Gln Ser Gln His Leu Asp Gly Glu Arg
545 550 555 560
Met Gln Ala Ala Ala Leu Asn Ala Ala Tyr Ser Ala Tyr Leu Gln Ser
565 570 575
Tyr Leu Ser Tyr Gln Ala Gln Met Glu Gln Leu Gln Val Ala Phe Gly
580 585 590
Ser His Met Ser Phe Gly Thr Gly Ala Pro Tyr Gly Ala Arg Met Pro
595 600 605
Phe Gly Gly Gln Val Pro Leu Gly Ala Pro Pro Pro Phe Pro Thr Trp
610 615 620
Pro Gly Cys Pro Gln Pro Pro Pro Leu His Ala Trp Gln Ala Gly Thr
625 630 635 640
Pro Pro Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Ala Phe Pro Gln Ser Leu Pro
645 650 655
Phe Pro Gln Ser Pro Ala Phe Pro Thr Ala Ser Pro Ala Pro Pro Gln
660 665 670
Ser Pro Gly Leu Gln Pro Leu Ile Ile His His Ala Gln Met Val Gln
675 680 685
Leu Gly Leu Asn Asn His Met Trp Asn Gln Arg Gly Ser Gln Ala Pro
690 695 700
Glu Asp Lys Thr Gln Glu Ala Glu
705 710
<210> 11
<211> 1209
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miniTRIF
<400> 11
atgcagtctc tgcccctgcc tatcctggaa cctgtgaaga acccctgcag cgtgaaggat 60
cagacccctc tgcagctgag cgtggaagat accacctctc ctaacaccaa gccttgtcct 120
ccaacaccta ccacacctga gacaagccct ccacctccgc ctccaccacc aagctctaca 180
ccttgtagcg cccacctgac accaagcagc ctgtttccat ccagcctgga aagcagcagc 240
gagcagaaat tctacaactt cgtgatcctg cacgccagag ccgacgagca cattgccctg 300
agagtgcgcg aaaagctgga agccctggga gttcctgatg gcgccacctt ctgcgaggat 360
ttccaagtgc ctggaagagg cgagctgagc tgtctgcagg atgccatcga tcacagcgcc 420
ttcatcatcc tgctgctgac cagcaacttc gactgcagac tgagcctgca ccaagtgaac 480
caggccatga tgagcaacct gaccagacag ggcagccccg attgcgtgat cccattcctg 540
cctctggaaa gctcccctgc tcagctgtct agcgatacag cctctctgct gtctggactc 600
gtgcggctgg atgagcacag ccagatcttc gccagaaagg tggccaacac cttcaagccc 660
catcggctgc aggccagaaa agccatgtgg cggaaagagc aggacacacg ggctctgaga 720
gagcagtctc agcacctgga tggcgagaga atgcaggccg ctgctctgaa tgccgcctac 780
tctgcctacc tgcagagcta cctgagctat caggcccaga tggaacagct gcaggtcgcc 840
tttggcagcc acatgtcctt tggaacaggc gccccttacg gcgccagaat gccttttggt 900
ggacaggtgc cactgggagc ccctccacca tttcctacat ggccaggatg tccccagcct 960
cctccactgc atgcttggca agctggaaca ccacctcctc catctccaca gcctgccgcc 1020
tttccacaga gcctgccttt tccacagtct cccgcttttc ccaccgcctc tccagctcca 1080
ccacaatctc caggactgca gcccctgatc atccaccacg ctcaaatggt gcagctggga 1140
ctgaacaatc acatgtggaa ccagcggggc tctcaggccc ctgaggataa gacacaagag 1200
gccgagtga 1209
<210> 12
<211> 402
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miniTRIF
<400> 12
Met Gln Ser Leu Pro Leu Pro Ile Leu Glu Pro Val Lys Asn Pro Cys
1 5 10 15
Ser Val Lys Asp Gln Thr Pro Leu Gln Leu Ser Val Glu Asp Thr Thr
20 25 30
Ser Pro Asn Thr Lys Pro Cys Pro Pro Thr Pro Thr Thr Pro Glu Thr
35 40 45
Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ser Thr Pro Cys Ser Ala
50 55 60
His Leu Thr Pro Ser Ser Leu Phe Pro Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ser
65 70 75 80
Glu Gln Lys Phe Tyr Asn Phe Val Ile Leu His Ala Arg Ala Asp Glu
85 90 95
His Ile Ala Leu Arg Val Arg Glu Lys Leu Glu Ala Leu Gly Val Pro
100 105 110
Asp Gly Ala Thr Phe Cys Glu Asp Phe Gln Val Pro Gly Arg Gly Glu
115 120 125
Leu Ser Cys Leu Gln Asp Ala Ile Asp His Ser Ala Phe Ile Ile Leu
130 135 140
Leu Leu Thr Ser Asn Phe Asp Cys Arg Leu Ser Leu His Gln Val Asn
145 150 155 160
Gln Ala Met Met Ser Asn Leu Thr Arg Gln Gly Ser Pro Asp Cys Val
165 170 175
Ile Pro Phe Leu Pro Leu Glu Ser Ser Pro Ala Gln Leu Ser Ser Asp
180 185 190
Thr Ala Ser Leu Leu Ser Gly Leu Val Arg Leu Asp Glu His Ser Gln
195 200 205
Ile Phe Ala Arg Lys Val Ala Asn Thr Phe Lys Pro His Arg Leu Gln
210 215 220
Ala Arg Lys Ala Met Trp Arg Lys Glu Gln Asp Thr Arg Ala Leu Arg
225 230 235 240
Glu Gln Ser Gln His Leu Asp Gly Glu Arg Met Gln Ala Ala Ala Leu
245 250 255
Asn Ala Ala Tyr Ser Ala Tyr Leu Gln Ser Tyr Leu Ser Tyr Gln Ala
260 265 270
Gln Met Glu Gln Leu Gln Val Ala Phe Gly Ser His Met Ser Phe Gly
275 280 285
Thr Gly Ala Pro Tyr Gly Ala Arg Met Pro Phe Gly Gly Gln Val Pro
290 295 300
Leu Gly Ala Pro Pro Pro Phe Pro Thr Trp Pro Gly Cys Pro Gln Pro
305 310 315 320
Pro Pro Leu His Ala Trp Gln Ala Gly Thr Pro Pro Pro Pro Ser Pro
325 330 335
Gln Pro Ala Ala Phe Pro Gln Ser Leu Pro Phe Pro Gln Ser Pro Ala
340 345 350
Phe Pro Thr Ala Ser Pro Ala Pro Pro Gln Ser Pro Gly Leu Gln Pro
355 360 365
Leu Ile Ile His His Ala Gln Met Val Gln Leu Gly Leu Asn Asn His
370 375 380
Met Trp Asn Gln Arg Gly Ser Gln Ala Pro Glu Asp Lys Thr Gln Glu
385 390 395 400
Ala Glu
<210> 13
<211> 1602
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-ter deletion (1-180) of TRIF
<400> 13
atgcccatcg acggcgtgtc cgattggagc cagggctgtt ctctgcggag caccggcagc 60
cctgccagcc tggcctctaa cctggaaatc agccaaagcc ccaccatgcc attcctgtct 120
cttcacagaa gtccgcacgg ccctagcaag ctgtgcgacg acccccaggc tagcctggtg 180
ccagaacctg tgcctggcgg ctgccaggag cctgaggaaa tgagctggcc tccttctggc 240
gagatcgcct ccccgcccga gctgcctagc tctcctcctc ccggcctgcc tgaagtggct 300
cctgatgcca cttctacagg actgcctgat acacccgccg cacccgaaac cagcaccaac 360
taccccgtgg aatgcaccga gggctcagcc ggcccccaat ctctccctct gcctatcctg 420
gagcccgtga aaaacccttg cagcgtgaag gaccagaccc ctctgcagct gagcgtggag 480
gataccacaa gccccaacac aaagccctgt ccccctaccc ccacaacacc tgagacaagc 540
ccaccacctc ctcctccacc tcctagcagt accccttgta gcgcccatct gaccccatca 600
agcctgttcc ctagctctct agagagcagc agtgaacaaa agttctacaa cttcgtgatc 660
ctgcacgcca gagccgacga gcacatcgcc ctgagagtgc gggaaaagct ggaggccctg 720
ggtgtgcctg acggcgccac cttctgcgag gacttccagg tccctggcag aggcgagctg 780
tcctgtctgc aagacgccat cgaccactct gccttcatca tcctgctgct gacctccaat 840
ttcgactgcc ggctgagcct ccaccaggtt aatcaggcca tgatgagcaa cctgacaaga 900
cagggcagcc ccgactgcgt gatccctttc ctgcctctgg aaagcagccc tgcccaactg 960
tcgtctgata cagccagcct gctgagcggc ctggtcagac tggacgagca cagccagatt 1020
ttcgccagaa aagtggccaa caccttcaag cctcaccggc tgcaggcccg gaaagccatg 1080
tggcggaagg aacaggacac cagagccctg agagagcaga gccagcacct ggatggcgaa 1140
agaatgcagg ccgctgccct gaatgccgcc tacagcgcct acctgcagag ctacctgtct 1200
tatcaggccc agatggaaca gctgcaggtg gcttttggca gccacatgtc cttcggcacc 1260
ggcgctcctt acggtgccag gatgcccttc ggaggccagg tgccactggg agcccctcct 1320
ccttttccta cctggcccgg ctgcccccaa cctccacctc tgcatgcttg gcaagctgga 1380
acacctccac caccttctcc aaagcctgcc gcatttcccc agtccctgcc ttttcctcag 1440
agccctgctt tcccaaccgc cagcccagct cctccccaga gccctggact gcagcctctg 1500
atcatccacc acgcccagat ggtgcagctc ggactgaaca accacatgtg gaaccagaga 1560
ggctctcagg ctcctgagga caagacacag gaggccgagt ga 1602
<210> 14
<211> 533
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-ter deletion (1-180) of TRIF
<400> 14
Met Pro Ile Asp Gly Val Ser Asp Trp Ser Gln Gly Cys Ser Leu Arg
1 5 10 15
Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ile Ser Gln
20 25 30
Ser Pro Thr Met Pro Phe Leu Ser Leu His Arg Ser Pro His Gly Pro
35 40 45
Ser Lys Leu Cys Asp Asp Pro Gln Ala Ser Leu Val Pro Glu Pro Val
50 55 60
Pro Gly Gly Cys Gln Glu Pro Glu Glu Met Ser Trp Pro Pro Ser Gly
65 70 75 80
Glu Ile Ala Ser Pro Pro Glu Leu Pro Ser Ser Pro Pro Pro Gly Leu
85 90 95
Pro Glu Val Ala Pro Asp Ala Thr Ser Thr Gly Leu Pro Asp Thr Pro
100 105 110
Ala Ala Pro Glu Thr Ser Thr Asn Tyr Pro Val Glu Cys Thr Glu Gly
115 120 125
Ser Ala Gly Pro Gln Ser Leu Pro Leu Pro Ile Leu Glu Pro Val Lys
130 135 140
Asn Pro Cys Ser Val Lys Asp Gln Thr Pro Leu Gln Leu Ser Val Glu
145 150 155 160
Asp Thr Thr Ser Pro Asn Thr Lys Pro Cys Pro Pro Thr Pro Thr Thr
165 170 175
Pro Glu Thr Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ser Thr Pro
180 185 190
Cys Ser Ala His Leu Thr Pro Ser Ser Leu Phe Pro Ser Ser Leu Glu
195 200 205
Ser Ser Ser Glu Gln Lys Phe Tyr Asn Phe Val Ile Leu His Ala Arg
210 215 220
Ala Asp Glu His Ile Ala Leu Arg Val Arg Glu Lys Leu Glu Ala Leu
225 230 235 240
Gly Val Pro Asp Gly Ala Thr Phe Cys Glu Asp Phe Gln Val Pro Gly
245 250 255
Arg Gly Glu Leu Ser Cys Leu Gln Asp Ala Ile Asp His Ser Ala Phe
260 265 270
Ile Ile Leu Leu Leu Thr Ser Asn Phe Asp Cys Arg Leu Ser Leu His
275 280 285
Gln Val Asn Gln Ala Met Met Ser Asn Leu Thr Arg Gln Gly Ser Pro
290 295 300
Asp Cys Val Ile Pro Phe Leu Pro Leu Glu Ser Ser Pro Ala Gln Leu
305 310 315 320
Ser Ser Asp Thr Ala Ser Leu Leu Ser Gly Leu Val Arg Leu Asp Glu
325 330 335
His Ser Gln Ile Phe Ala Arg Lys Val Ala Asn Thr Phe Lys Pro His
340 345 350
Arg Leu Gln Ala Arg Lys Ala Met Trp Arg Lys Glu Gln Asp Thr Arg
355 360 365
Ala Leu Arg Glu Gln Ser Gln His Leu Asp Gly Glu Arg Met Gln Ala
370 375 380
Ala Ala Leu Asn Ala Ala Tyr Ser Ala Tyr Leu Gln Ser Tyr Leu Ser
385 390 395 400
Tyr Gln Ala Gln Met Glu Gln Leu Gln Val Ala Phe Gly Ser His Met
405 410 415
Ser Phe Gly Thr Gly Ala Pro Tyr Gly Ala Arg Met Pro Phe Gly Gly
420 425 430
Gln Val Pro Leu Gly Ala Pro Pro Pro Phe Pro Thr Trp Pro Gly Cys
435 440 445
Pro Gln Pro Pro Pro Leu His Ala Trp Gln Ala Gly Thr Pro Pro Pro
450 455 460
Pro Ser Pro Lys Pro Ala Ala Phe Pro Gln Ser Leu Pro Phe Pro Gln
465 470 475 480
Ser Pro Ala Phe Pro Thr Ala Ser Pro Ala Pro Pro Gln Ser Pro Gly
485 490 495
Leu Gln Pro Leu Ile Ile His His Ala Gln Met Val Gln Leu Gly Leu
500 505 510
Asn Asn His Met Trp Asn Gln Arg Gly Ser Gln Ala Pro Glu Asp Lys
515 520 525
Thr Gln Glu Ala Glu
530
<210> 15
<211> 483
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fragment 387-544 of TRIF
<400> 15
atggagtcta gcagcgagca gaaattctac aacttcgtga tcctgcacgc cagagccgac 60
gagcacattg ccctgagagt gcgcgaaaag ctggaagccc tgggagttcc tgatggcgcc 120
accttctgcg aggatttcca agtgcctgga agaggcgagc tgagctgtct gcaggatgcc 180
atcgatcaca gcgccttcat catcctgctg ctgaccagca acttcgactg cagactgagc 240
ctgcaccaag tgaaccaggc catgatgagc aacctgacca gacagggcag ccccgattgc 300
gtgatcccat tcctgcctct ggaaagcagc cctgctcagc tgtctagcga tacagcctct 360
ctgctgtctg gactcgtgcg gctggatgag cacagccaga tcttcgccag aaaggtggcc 420
aacaccttca agccccatcg gctgcaggcc agaaaagcca tgtggcggaa agagcaggac 480
tga 483
<210> 16
<211> 159
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fragment 387-544 of TRIF
<400> 16
Met Glu Ser Ser Ser Glu Gln Lys Phe Tyr Asn Phe Val Ile Leu His
1 5 10 15
Ala Arg Ala Asp Glu His Ile Ala Leu Arg Val Arg Glu Lys Leu Glu
20 25 30
Ala Leu Gly Val Pro Asp Gly Ala Thr Phe Cys Glu Asp Phe Gln Val
35 40 45
Pro Gly Arg Gly Glu Leu Ser Cys Leu Gln Asp Ala Ile Asp His Ser
50 55 60
Ala Phe Ile Ile Leu Leu Leu Thr Ser Asn Phe Asp Cys Arg Leu Ser
65 70 75 80
Leu His Gln Val Asn Gln Ala Met Met Ser Asn Leu Thr Arg Gln Gly
85 90 95
Ser Pro Asp Cys Val Ile Pro Phe Leu Pro Leu Glu Ser Ser Pro Ala
100 105 110
Gln Leu Ser Ser Asp Thr Ala Ser Leu Leu Ser Gly Leu Val Arg Leu
115 120 125
Asp Glu His Ser Gln Ile Phe Ala Arg Lys Val Ala Asn Thr Phe Lys
130 135 140
Pro His Arg Leu Gln Ala Arg Lys Ala Met Trp Arg Lys Glu Gln
145 150 155
<210> 17
<211> 276
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Deletion of N-ter fragment 1-180 and fragment 217-658 of TRIF
<400> 17
atgcctatcg acggcgtgtc cgactggtcc caaggctgca gcctgagaag caccggcagc 60
cctgctagcc tggcctctaa tctggaaatc agccaatctc caacaatgcc ccagagccct 120
gccttcccca ccgccagccc agctcctcct cagtctcccg gcctgcagcc tctgatcatc 180
caccacgccc agatggtgca gctgggcctg aacaaccaca tgtggaacca gcggggaagc 240
caggcccctg aggacaaaac ccaggaggcc gaatga 276
<210> 18
<211> 91
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Deletion of N-ter fragment 1-180 and fragment 217-658 of TRIF
<400> 18
Met Pro Ile Asp Gly Val Ser Asp Trp Ser Gln Gly Cys Ser Leu Arg
1 5 10 15
Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ile Ser Gln
20 25 30
Ser Pro Thr Met Pro Gln Ser Pro Ala Phe Pro Thr Ala Ser Pro Ala
35 40 45
Pro Pro Gln Ser Pro Gly Leu Gln Pro Leu Ile Ile His His Ala Gln
50 55 60
Met Val Gln Leu Gly Leu Asn Asn His Met Trp Asn Gln Arg Gly Ser
65 70 75 80
Gln Ala Pro Glu Asp Lys Thr Gln Glu Ala Glu
85 90
<210> 19
<211> 591
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Deletion of N-ter fragment 1-180, fragment 217-386 and fragment
546-712 of TRIF
<400> 19
atgcctatcg acggagtgtc cgactggtcc cagggatgta gccttagaag caccggcagc 60
cctgctagcc tggcctctaa cctggaaatc agccagagcc ctacaatgcc agagagcagc 120
agcgagcaga aattctacaa cttcgtgatt ctgcacgcca gagccgacga gcacatcgcc 180
ctgagagtgc gggaaaagct ggaggccctg ggcgtgcctg atggcgccac cttctgcgaa 240
gattttcagg tccccggcag aggcgagctg agctgcctgc aggacgctat cgaccacagc 300
gccttcatca tcctgctgct gacaagcaac ttcgactgca ggctgagcct gcaccaggtg 360
aaccaggcca tgatgagcaa tctgaccaga cagggctccc cagattgcgt gatccccttc 420
ctgcctctgg agagctctcc tgcacagctg tcttctgaca ccgccagcct gctctccggc 480
ctggtgcggc tggacgagca ttctcaaatc ttcgccagaa aagtggccaa cacctttaag 540
ccccacagac tgcaagctcg gaaggccatg tggcggaagg aacaggattg a 591
<210> 20
<211> 195
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Deletion of N-ter fragment 1-180, fragment 217-386 and fragment
546-712 of TRIF
<400> 20
Met Pro Ile Asp Gly Val Ser Asp Trp Ser Gln Gly Cys Ser Leu Arg
1 5 10 15
Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ile Ser Gln
20 25 30
Ser Pro Thr Met Pro Glu Ser Ser Ser Glu Gln Lys Phe Tyr Asn Phe
35 40 45
Val Ile Leu His Ala Arg Ala Asp Glu His Ile Ala Leu Arg Val Arg
50 55 60
Glu Lys Leu Glu Ala Leu Gly Val Pro Asp Gly Ala Thr Phe Cys Glu
65 70 75 80
Asp Phe Gln Val Pro Gly Arg Gly Glu Leu Ser Cys Leu Gln Asp Ala
85 90 95
Ile Asp His Ser Ala Phe Ile Ile Leu Leu Leu Thr Ser Asn Phe Asp
100 105 110
Cys Arg Leu Ser Leu His Gln Val Asn Gln Ala Met Met Ser Asn Leu
115 120 125
Thr Arg Gln Gly Ser Pro Asp Cys Val Ile Pro Phe Leu Pro Leu Glu
130 135 140
Ser Ser Pro Ala Gln Leu Ser Ser Asp Thr Ala Ser Leu Leu Ser Gly
145 150 155 160
Leu Val Arg Leu Asp Glu His Ser Gln Ile Phe Ala Arg Lys Val Ala
165 170 175
Asn Thr Phe Lys Pro His Arg Leu Gln Ala Arg Lys Ala Met Trp Arg
180 185 190
Lys Glu Gln
195
<210> 21
<211> 2166
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRIR RIPK3
<400> 21
atgcctatcg acggcgtgtc cgattggagc cagggatgtt ctctgcggag cacaggctct 60
cccgcctctc tggccagcaa cctggaaatc agccaatctc ctaccatgcc cgaaagctct 120
tctgagcaga agttctacaa ctttgtgatc ctgcacgccc gggccgacga gcacatcgcc 180
ctgagagtgc gggaaaagct ggaagccctg ggcgtgcccg acggcgcaac attttgtgaa 240
gatttccagg ttcctggtag aggagagctt tcctgtctgc aagacgccat tgaccacagc 300
gccttcatca tcctgctgct gacatctaac ttcgactgca gactgtccct gcaccaggtg 360
aatcaggcca tgatgagcaa tctgaccaga cagggcagcc ctgactgcgt gatccccttc 420
ctgccactgg aaagcagccc tgctcagctg agtagcgaca ccgccagcct gctcagcggc 480
ctggtcagac tggacgaaca ctctcaaatc ttcgccagaa aagtggctaa taccttcaag 540
ccccaccggc tgcaggccag aaaggctatg tggcggaaag aacaggatgg ccccggcgga 600
tccagcggca gcagctgcgt caaactgtgg cctagcggcg cccctgcccc tctggtgtcc 660
atcgaggaac tggaaaacca agagcttgtc ggcaagggcg gcttcggcac tgttttcaga 720
gctcaacaca gaaagtgggg ctacgacgtg gccgtgaaga tcgtgaacag caaggccatc 780
agcagagaag tgaaggccat ggccagcctg gacaacgagt tcgtgctgag actggaggga 840
gtgatcgaga aggtgaactg ggaccaggat cctaaacccg ccctggtgac aaagttcatg 900
gaaaacggca gcctgagcgg actgctgcag agccaatgtc ctagaccttg gcccctgctg 960
tgccggctcc tgaaggaagt ggtgctcggc atgttctacc tgcatgatca gaatcccgtg 1020
ctgctgcaca gagatctgaa accctccaac gtgctgctgg atcctgagct gcacgtgaag 1080
ctggccgatt tcggcctgag cacctttcag ggcggcagtc agagcggcac aggcagcggc 1140
gagcctggcg gcaccctggg ctacctggct cctgagctgt tcgtgaatgt gaatcggaag 1200
gccagcacag cttctgacgt gtatagcttt ggcatcctga tgtgggccgt gctggctgga 1260
agggaagttg agctgcccac cgagcccagc ctggtgtacg aggccgtgtg caaccggcag 1320
aaccggccaa gcctggccga gctgcctcag gctggccctg agacacctgg ccttgagggc 1380
ctgaaggagc tcatgcagct gtgctggagc tccgagccaa aggacagacc atctttccag 1440
gagtgcctgc ctaagaccga cgaggtgttc cagatggtgg aaaacaacat gaacgccgcc 1500
gtcagcaccg tgaaggactt tctgagccag ctgagatctt ccaatagacg cttcagcatc 1560
cctgagtctg gacagggagg aacagagatg gacggattcc ggagaaccat cgagaaccag 1620
cactcccgga acgacgtgat ggtcagcgag tggctgaaca agctgaacct ggaagagcct 1680
ccaagctcag tgcccaagaa gtgcccctct ctgaccaaaa gaagcagagc ccaggaggaa 1740
caggtgcctc aggcctggac cgccggaaca agcagcgaca gcatggccca gcctccgcaa 1800
acacctgaaa ccagcacctt cagaaaccag atgcctagcc ccaccagcac cggcacccct 1860
tcccctggcc ccagaggcaa ccagggcgca gagcggcagg gcatgaactg gtcctgccgc 1920
acccccgagc ccaaccctgt gaccggccgg cctctggtga acatctacaa ctgcagcggt 1980
gtgcaggtgg gtgataacaa ttacctgacc atgcagcaga ccaccgctct gccaacatgg 2040
ggcctcgccc cttctggcaa gggcagaggc ctgcagcatc ctcctcctgt gggctctcag 2100
gaaggaccta aggaccccga ggcctggagc aggcctcagg gctggtacaa ccactcaggc 2160
aaatga 2166
<210> 22
<211> 721
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRIR RIPK3
<400> 22
Met Pro Ile Asp Gly Val Ser Asp Trp Ser Gln Gly Cys Ser Leu Arg
1 5 10 15
Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ile Ser Gln
20 25 30
Ser Pro Thr Met Pro Glu Ser Ser Ser Glu Gln Lys Phe Tyr Asn Phe
35 40 45
Val Ile Leu His Ala Arg Ala Asp Glu His Ile Ala Leu Arg Val Arg
50 55 60
Glu Lys Leu Glu Ala Leu Gly Val Pro Asp Gly Ala Thr Phe Cys Glu
65 70 75 80
Asp Phe Gln Val Pro Gly Arg Gly Glu Leu Ser Cys Leu Gln Asp Ala
85 90 95
Ile Asp His Ser Ala Phe Ile Ile Leu Leu Leu Thr Ser Asn Phe Asp
100 105 110
Cys Arg Leu Ser Leu His Gln Val Asn Gln Ala Met Met Ser Asn Leu
115 120 125
Thr Arg Gln Gly Ser Pro Asp Cys Val Ile Pro Phe Leu Pro Leu Glu
130 135 140
Ser Ser Pro Ala Gln Leu Ser Ser Asp Thr Ala Ser Leu Leu Ser Gly
145 150 155 160
Leu Val Arg Leu Asp Glu His Ser Gln Ile Phe Ala Arg Lys Val Ala
165 170 175
Asn Thr Phe Lys Pro His Arg Leu Gln Ala Arg Lys Ala Met Trp Arg
180 185 190
Lys Glu Gln Asp Gly Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ser Cys Val Lys
195 200 205
Leu Trp Pro Ser Gly Ala Pro Ala Pro Leu Val Ser Ile Glu Glu Leu
210 215 220
Glu Asn Gln Glu Leu Val Gly Lys Gly Gly Phe Gly Thr Val Phe Arg
225 230 235 240
Ala Gln His Arg Lys Trp Gly Tyr Asp Val Ala Val Lys Ile Val Asn
245 250 255
Ser Lys Ala Ile Ser Arg Glu Val Lys Ala Met Ala Ser Leu Asp Asn
260 265 270
Glu Phe Val Leu Arg Leu Glu Gly Val Ile Glu Lys Val Asn Trp Asp
275 280 285
Gln Asp Pro Lys Pro Ala Leu Val Thr Lys Phe Met Glu Asn Gly Ser
290 295 300
Leu Ser Gly Leu Leu Gln Ser Gln Cys Pro Arg Pro Trp Pro Leu Leu
305 310 315 320
Cys Arg Leu Leu Lys Glu Val Val Leu Gly Met Phe Tyr Leu His Asp
325 330 335
Gln Asn Pro Val Leu Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Val Leu
340 345 350
Leu Asp Pro Glu Leu His Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ser Thr
355 360 365
Phe Gln Gly Gly Ser Gln Ser Gly Thr Gly Ser Gly Glu Pro Gly Gly
370 375 380
Thr Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Leu Phe Val Asn Val Asn Arg Lys
385 390 395 400
Ala Ser Thr Ala Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Ile Leu Met Trp Ala
405 410 415
Val Leu Ala Gly Arg Glu Val Glu Leu Pro Thr Glu Pro Ser Leu Val
420 425 430
Tyr Glu Ala Val Cys Asn Arg Gln Asn Arg Pro Ser Leu Ala Glu Leu
435 440 445
Pro Gln Ala Gly Pro Glu Thr Pro Gly Leu Glu Gly Leu Lys Glu Leu
450 455 460
Met Gln Leu Cys Trp Ser Ser Glu Pro Lys Asp Arg Pro Ser Phe Gln
465 470 475 480
Glu Cys Leu Pro Lys Thr Asp Glu Val Phe Gln Met Val Glu Asn Asn
485 490 495
Met Asn Ala Ala Val Ser Thr Val Lys Asp Phe Leu Ser Gln Leu Arg
500 505 510
Ser Ser Asn Arg Arg Phe Ser Ile Pro Glu Ser Gly Gln Gly Gly Thr
515 520 525
Glu Met Asp Gly Phe Arg Arg Thr Ile Glu Asn Gln His Ser Arg Asn
530 535 540
Asp Val Met Val Ser Glu Trp Leu Asn Lys Leu Asn Leu Glu Glu Pro
545 550 555 560
Pro Ser Ser Val Pro Lys Lys Cys Pro Ser Leu Thr Lys Arg Ser Arg
565 570 575
Ala Gln Glu Glu Gln Val Pro Gln Ala Trp Thr Ala Gly Thr Ser Ser
580 585 590
Asp Ser Met Ala Gln Pro Pro Gln Thr Pro Glu Thr Ser Thr Phe Arg
595 600 605
Asn Gln Met Pro Ser Pro Thr Ser Thr Gly Thr Pro Ser Pro Gly Pro
610 615 620
Arg Gly Asn Gln Gly Ala Glu Arg Gln Gly Met Asn Trp Ser Cys Arg
625 630 635 640
Thr Pro Glu Pro Asn Pro Val Thr Gly Arg Pro Leu Val Asn Ile Tyr
645 650 655
Asn Cys Ser Gly Val Gln Val Gly Asp Asn Asn Tyr Leu Thr Met Gln
660 665 670
Gln Thr Thr Ala Leu Pro Thr Trp Gly Leu Ala Pro Ser Gly Lys Gly
675 680 685
Arg Gly Leu Gln His Pro Pro Pro Val Gly Ser Gln Glu Gly Pro Lys
690 695 700
Asp Pro Glu Ala Trp Ser Arg Pro Gln Gly Trp Tyr Asn His Ser Gly
705 710 715 720
Lys
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLAG tag
<400> 23
gactacaagg acgacgacga caag 24
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLAG tag
<400> 24
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 25
Gly Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ser
1 5
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A peptide
<400> 26
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A peptide
<400> 27
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 28
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2A peptide
<400> 28
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 29
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F2A peptide
<400> 29
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 30
<211> 518
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Met Ser Cys Val Lys Leu Trp Pro Ser Gly Ala Pro Ala Pro Leu Val
1 5 10 15
Ser Ile Glu Glu Leu Glu Asn Gln Glu Leu Val Gly Lys Gly Gly Phe
20 25 30
Gly Thr Val Phe Arg Ala Gln His Arg Lys Trp Gly Tyr Asp Val Ala
35 40 45
Val Lys Ile Val Asn Ser Lys Ala Ile Ser Arg Glu Val Lys Ala Met
50 55 60
Ala Ser Leu Asp Asn Glu Phe Val Leu Arg Leu Glu Gly Val Ile Glu
65 70 75 80
Lys Val Asn Trp Asp Gln Asp Pro Lys Pro Ala Leu Val Thr Lys Phe
85 90 95
Met Glu Asn Gly Ser Leu Ser Gly Leu Leu Gln Ser Gln Cys Pro Arg
100 105 110
Pro Trp Pro Leu Leu Cys Arg Leu Leu Lys Glu Val Val Leu Gly Met
115 120 125
Phe Tyr Leu His Asp Gln Asn Pro Val Leu Leu His Arg Asp Leu Lys
130 135 140
Pro Ser Asn Val Leu Leu Asp Pro Glu Leu His Val Lys Leu Ala Asp
145 150 155 160
Phe Gly Leu Ser Thr Phe Gln Gly Gly Ser Gln Ser Gly Thr Gly Ser
165 170 175
Gly Glu Pro Gly Gly Thr Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Leu Phe Val
180 185 190
Asn Val Asn Arg Lys Ala Ser Thr Ala Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly
195 200 205
Ile Leu Met Trp Ala Val Leu Ala Gly Arg Glu Val Glu Leu Pro Thr
210 215 220
Glu Pro Ser Leu Val Tyr Glu Ala Val Cys Asn Arg Gln Asn Arg Pro
225 230 235 240
Ser Leu Ala Glu Leu Pro Gln Ala Gly Pro Glu Thr Pro Gly Leu Glu
245 250 255
Gly Leu Lys Glu Leu Met Gln Leu Cys Trp Ser Ser Glu Pro Lys Asp
260 265 270
Arg Pro Ser Phe Gln Glu Cys Leu Pro Lys Thr Asp Glu Val Phe Gln
275 280 285
Met Val Glu Asn Asn Met Asn Ala Ala Val Ser Thr Val Lys Asp Phe
290 295 300
Leu Ser Gln Leu Arg Ser Ser Asn Arg Arg Phe Ser Ile Pro Glu Ser
305 310 315 320
Gly Gln Gly Gly Thr Glu Met Asp Gly Phe Arg Arg Thr Ile Glu Asn
325 330 335
Gln His Ser Arg Asn Asp Val Met Val Ser Glu Trp Leu Asn Lys Leu
340 345 350
Asn Leu Glu Glu Pro Pro Ser Ser Val Pro Lys Lys Cys Pro Ser Leu
355 360 365
Thr Lys Arg Ser Arg Ala Gln Glu Glu Gln Val Pro Gln Ala Trp Thr
370 375 380
Ala Gly Thr Ser Ser Asp Ser Met Ala Gln Pro Pro Gln Thr Pro Glu
385 390 395 400
Thr Ser Thr Phe Arg Asn Gln Met Pro Ser Pro Thr Ser Thr Gly Thr
405 410 415
Pro Ser Pro Gly Pro Arg Gly Asn Gln Gly Ala Glu Arg Gln Gly Met
420 425 430
Asn Trp Ser Cys Arg Thr Pro Glu Pro Asn Pro Val Thr Gly Arg Pro
435 440 445
Leu Val Asn Ile Tyr Asn Cys Ser Gly Val Gln Val Gly Asp Asn Asn
450 455 460
Tyr Leu Thr Met Gln Gln Thr Thr Ala Leu Pro Thr Trp Gly Leu Ala
465 470 475 480
Pro Ser Gly Lys Gly Arg Gly Leu Gln His Pro Pro Pro Val Gly Ser
485 490 495
Gln Glu Gly Pro Lys Asp Pro Glu Ala Trp Ser Arg Pro Gln Gly Trp
500 505 510
Tyr Asn His Ser Gly Lys
515
<210> 31
<211> 1557
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
atgtcgtgcg tcaagttatg gcccagcggt gcccccgccc ccttggtgtc catcgaggaa 60
ctggagaacc aggagctcgt cggcaaaggc gggttcggca cagtgttccg ggcgcaacat 120
aggaagtggg gctacgatgt ggcggtcaag atcgtaaact cgaaggcgat atccagggag 180
gtcaaggcca tggcaagtct ggataacgaa ttcgtgctgc gcctagaagg ggttatcgag 240
aaggtgaact gggaccaaga tcccaagccg gctctggtga ctaaattcat ggagaacggc 300
tccttgtcgg ggctgctgca gtcccagtgc cctcggccct ggccgctcct ttgccgcctg 360
ctgaaagaag tggtgcttgg gatgttttac ctgcacgacc agaacccggt gctcctgcac 420
cgggacctca agccatccaa cgtcctgctg gacccagagc tgcacgtcaa gctggcagat 480
tttggcctgt ccacatttca gggaggctca cagtcaggga cagggtccgg ggagccaggg 540
ggcaccctgg gctacttggc cccagaactg tttgttaacg taaaccggaa ggcctccaca 600
gccagtgacg tctacagctt cgggatccta atgtgggcag tgcttgctgg aagagaagtt 660
gagttgccaa ccgaaccatc actcgtgtac gaagcagtgt gcaacaggca gaaccggcct 720
tcattggctg agctgcccca agccgggcct gagactcccg gcttagaagg actgaaggag 780
ctaatgcagc tctgctggag cagtgagccc aaggacagac cctccttcca ggaatgccta 840
ccaaaaactg atgaagtctt ccagatggtg gagaacaata tgaatgctgc tgtctccacg 900
gtaaaggatt tcctgtctca gctcaggagc agcaatagga gattttctat cccagagtca 960
ggccaaggag ggacagaaat ggatggcttt aggagaacca tagaaaacca gcactctcgt 1020
aatgatgtca tggtttctga gtggctaaac aaactgaatc tagaggagcc tcccagctct 1080
gttcctaaaa aatgcccgag ccttaccaag aggagcaggg cacaagagga gcaggttcca 1140
caagcctgga cagcaggcac atcttcagat tcgatggccc aacctcccca gactccagag 1200
acctcaactt tcagaaacca gatgcccagc cctacctcaa ctggaacacc aagtcctgga 1260
ccccgaggga atcagggggc tgagagacaa ggcatgaact ggtcctgcag gaccccggag 1320
ccaaatccag taacagggcg accgctcgtt aacatataca actgctctgg ggtgcaagtt 1380
ggagacaaca actacttgac tatgcaacag acaactgcct tgcccacatg gggcttggca 1440
ccttcgggca aggggagggg cttgcagcac cccccaccag taggttcgca agaaggccct 1500
aaagatcctg aagcctggag caggccacag ggttggtata atcatagcgg gaaataa 1557
<210> 32
<211> 476
<212> PRT
<213> Herpes virus
<400> 32
Met Asp Asp Leu Arg Asp Thr Leu Met Ala Tyr Gly Cys Ile Ala Ile
1 5 10 15
Arg Ala Gly Asp Phe Asn Gly Leu Asn Asp Phe Leu Glu Gln Glu Cys
20 25 30
Gly Thr Arg Leu His Val Ala Trp Pro Glu Arg Cys Phe Ile Gln Leu
35 40 45
Arg Ser Arg Ser Ala Leu Gly Pro Phe Val Gly Lys Met Gly Thr Val
50 55 60
Cys Ser Gln Gly Ala Tyr Val Cys Cys Gln Glu Tyr Leu His Pro Phe
65 70 75 80
Gly Phe Val Glu Gly Pro Gly Phe Met Arg Tyr Gln Leu Ile Val Leu
85 90 95
Ile Gly Gln Arg Gly Gly Ile Tyr Cys Tyr Asp Asp Leu Arg Asp Cys
100 105 110
Ile Tyr Glu Leu Ala Pro Thr Met Lys Asp Phe Leu Arg His Gly Phe
115 120 125
Arg His Cys Asp His Phe His Thr Met Arg Asp Tyr Gln Arg Pro Met
130 135 140
Val Gln Tyr Asp Asp Tyr Trp Asn Ala Val Met Leu Tyr Arg Gly Asp
145 150 155 160
Val Glu Ser Leu Ser Ala Glu Val Thr Lys Arg Gly Tyr Ala Ser Tyr
165 170 175
Ser Ile Asp Asp Pro Phe Asp Glu Cys Pro Asp Thr His Phe Ala Phe
180 185 190
Trp Thr His Asn Thr Glu Val Met Lys Phe Lys Glu Thr Ser Phe Ser
195 200 205
Val Val Arg Ala Gly Gly Ser Ile Gln Thr Met Glu Leu Met Ile Arg
210 215 220
Thr Val Pro Arg Ile Thr Cys Tyr His Gln Leu Leu Gly Ala Leu Gly
225 230 235 240
His Glu Val Pro Glu Arg Lys Glu Phe Leu Val Arg Gln Tyr Val Leu
245 250 255
Val Asp Thr Phe Gly Val Val Tyr Gly Tyr Asp Pro Ala Met Asp Ala
260 265 270
Val Tyr Arg Leu Ala Glu Asp Val Val Met Phe Thr Cys Val Met Gly
275 280 285
Lys Lys Gly His Arg Asn His Arg Phe Ser Gly Arg Arg Glu Ala Ile
290 295 300
Val Arg Leu Glu Lys Thr Pro Thr Cys Gln His Pro Lys Lys Thr Pro
305 310 315 320
Asp Pro Met Ile Met Phe Asp Glu Asp Asp Asp Asp Glu Leu Ser Leu
325 330 335
Pro Arg Asn Val Met Thr His Glu Glu Ala Glu Ser Arg Leu Tyr Asp
340 345 350
Ala Ile Thr Glu Asn Leu Met His Cys Val Lys Leu Val Thr Thr Asp
355 360 365
Ser Pro Leu Ala Thr His Leu Trp Pro Gln Glu Leu Gln Ala Leu Cys
370 375 380
Asp Ser Pro Ala Leu Ser Leu Cys Thr Asp Asp Val Glu Gly Val Arg
385 390 395 400
Gln Lys Leu Arg Ala Arg Thr Gly Ser Leu His His Phe Glu Leu Ser
405 410 415
Tyr Arg Phe His Asp Glu Asp Pro Glu Thr Tyr Met Gly Phe Leu Trp
420 425 430
Asp Ile Pro Ser Cys Asp Arg Cys Val Arg Arg Arg Arg Phe Lys Val
435 440 445
Cys Asp Val Gly Arg Arg His Ile Ile Pro Gly Ala Ala Asn Gly Met
450 455 460
Pro Pro Leu Thr Pro Pro His Ala Tyr Met Asn Asn
465 470 475
Claims (115)
- 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션(thanotransmission) 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자로서, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드가 TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제(Caspase), FADD, TRADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민(Gasdermin) A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, 종양 괴사 인자 수용체 상과(TNFSF) 단백질 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 MAVS 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하는 재조합 핵산 분자.
- 제6항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 FADD 우성 음성 돌연변이체(FADD-DN), cFLIP, vICA, 카스파제 8 우성 음성 돌연변이체(Casp8-DN), cIAP1, cIAP2, Tak1, IKK 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 핵산 분자.
- 제6항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 FADD-DN인 재조합 핵산 분자.
- 제6항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 cFLIP인 재조합 핵산 분자.
- 제6항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 vICA인 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 핵산 분자가 적어도 하나의 가스더민 또는 이의 변이체를 인코딩하는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 가스더민 또는 이의 변이체를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 MAVS 또는 이의 변이체를 포함하고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 가스더민 또는 이의 변이체를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 가스더민이 가스더민 E 또는 이의 변이체인 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 가스더민 E 또는 이의 변이체를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 단일의 전사물로서 전사되는 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 분자인 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 RNA 분자인 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 둘이 NF-kB를 활성화시키는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 둘이 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 둘이 외인성 아폽토시스(extrinsic apoptosis)를 촉진시키는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 둘이 예정 괴사를 촉진시키는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 NF-kB를 활성화시키고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 NF-kB를 활성화시키고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 외인성 아폽토시스를 촉진시키는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 NF-kB를 활성화시키고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 예정 괴사를 촉진시키는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 외인성 아폽토시스를 촉진시키는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 예정 괴사를 촉진시키는 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 외인성 아폽토시스를 촉진시키고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 예정 괴사를 촉진시키는 재조합 핵산 분자.
- 제22항, 제25항, 제27항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 예정 괴사가 네크롭토시스(necroptosis)를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제22항, 제25항, 제27항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 예정 괴사가 파이롭토시스(pyroptosis)를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제19항 및 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, NF-kB를 활성화시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드가 TRIF, TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TNFSF 단백질 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 핵산 분자.
- 제20항, 제23항, 제26항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, IRF3 및/또는 IRF7을 활성화시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드가 TRIF, MyD88, MAVS, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 핵산 분자.
- 제21항, 제24항, 제26항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 아폽토시스를 촉진시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드가 TRIF, RIPK1, 카스파제, FADD, TRADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 핵산 분자.
- 제22항, 제25항, 제27항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 예정 괴사를 촉진시키는 타노트랜스미션 폴리펩티드가 TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩된 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드가 융합 단백질에 포함되는 재조합 핵산 분자.
- 제35항에 있어서, 융합 단백질이 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제35항에 있어서, 융합 단백질이 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제35항에 있어서, 융합 단백질이 TRIF 또는 이의 변이체, 및 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 하나 이상의 링커를 추가로 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제35항에 있어서, 융합 단백질이 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 이량체화 도메인을 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 이량체화 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질 내에 포함되는 재조합 핵산 분자.
- 제41항 또는 제42항에 있어서, 이량체화 도메인이 타노트랜스미션 폴리펩티드에 대하여 이종인 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 리포좀.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 벡터.
- 제45항에 있어서, 벡터가 엔지니어링된(engineered) 바이러스, 플라스미드 또는 트랜스포존인 벡터.
- 제46항에 있어서, 바이러스가 아데노바이러스인 벡터.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자 중 어느 하나에 의해 인코딩된 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 벡터 및/또는 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함하는 세포.
- 각각이 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 둘 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포로서, 타노트랜스미션 폴리펩티드의 각각이 TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제, FADD, TRADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, 종양 괴사 인자 수용체 상과(TNFSF) 단백질 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포.
- 제50항에 있어서, 둘 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드가 동일한 핵산 분자 내에 포함되는 세포.
- 제50항에 있어서, 둘 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드의 각각이 개별 핵산 분자에 포함되는 세포.
- 제51항 또는 제52항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 분자인 세포.
- 제53항에 있어서, DNA 분자가 플라스미드 또는 트랜스포존인 세포.
- 제51항 또는 제52항에 있어서, 핵산 분자가 RNA 분자인 세포.
- 제55항에 있어서, RNA 분자가 원형 RNA인 세포.
- 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하는 세포.
- 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하는 세포.
- 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하는 세포.
- 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 가스더민 또는 이의 변이체를 포함하는 세포.
- 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 가스더민 또는 이의 변이체를 포함하는 세포.
- 제61항에 있어서, 가스더민이 가스더민 E인 세포.
- 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 세포.
- 제63항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 FADD 우성 음성 돌연변이체(FADD-DN), cFLIP, vICA, 카스파제 8 우성 음성 돌연변이체(Casp8-DN), cIAP1, cIAP2, Tak1, IKK 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포.
- 제63항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 FADD-DN인 세포.
- 제63항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 cFLIP인 세포.
- 제63항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 vICA인 세포.
- a) 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 리포좀, 벡터 또는 세포 중 어느 하나, 및 b) 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 하기를 포함하는 약제학적 조성물:
(a) 각각이 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드로서, 타노트랜스미션 폴리펩티드의 각각이 TRADD, TRAF2, TRAF6, cIAP1, cIAP2, XIAP, NOD2, MyD88, TRAM, HOIL, HOIP, Sharpin, IKKg, IKKa, IKKb, RelA, MAVS, RIGI, MDA5, Tak1, TBK1, IKKe, IRF3, IRF7, IRF1, TRAF3, 카스파제, FADD, TRADD, TNFR1, TRAILR1, TRAILR2, FAS, Bax, Bak, Bim, Bid, Noxa, Puma, TRIF, ZBP1, RIPK1, RIPK3, MLKL, 가스더민 A, 가스더민 B, 가스더민 C, 가스더민 D, 가스더민 E, 종양 괴사 인자 수용체 상과(TNFSF) 단백질, 이의 변이체 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드; 및
(b) 약제학적으로 허용 가능한 담체. - 제69항에 있어서, 약제학적 조성물 내의 둘 이상의 폴리뉴클레오티드가 동일한 핵산 분자 내에 포함되는 약제학적 조성물.
- 제69항에 있어서, 약제학적 조성물 내의 둘 이상의 폴리뉴클레오티드의 각각이 개별 핵산 분자에 포함되는 약제학적 조성물.
- 제70항 또는 제71항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 분자인 약제학적 조성물.
- 제72항에 있어서, DNA 분자가 플라스미드 또는 트랜스포존인 약제학적 조성물.
- 제72항에 있어서, DNA 분자가 엔지니어링된 바이러스 내에 포함되는 약제학적 조성물.
- 제74항에 있어서, 바이러스가 아데노바이러스인 약제학적 조성물.
- 제70항 또는 제71항에 있어서, 핵산 분자가 RNA 분자인 약제학적 조성물.
- 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 가스더민 또는 이의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 TRIF 또는 이의 변이체를 포함하고, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 RIPK3 또는 이의 변이체를 포함하며, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 가스더민 또는 이의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제81항에 있어서, 가스더민이 가스더민 E인 약제학적 조성물.
- 제69항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물이 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
- 제83항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 FADD 우성 음성 돌연변이체(FADD-DN), cFLIP, vICA, 카스파제 8 우성 음성 돌연변이체(Casp8-DN), cIAP1, cIAP2, Tak1, IKK, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
- 제83항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 FADD-DN인 약제학적 조성물.
- 제83항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 cFLIP인 약제학적 조성물.
- 제83항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드가 vICA인 약제학적 조성물.
- 제69항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물이 이량체화 도메인을 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
- 제69항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 적어도 하나가 이량체화 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질 내에 포함되는 약제학적 조성물.
- 제89항에 있어서, 이량체화 도메인이 타노트랜스미션 폴리펩티드에 대하여 이종인 약제학적 조성물.
- 제69항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, TRIF 변이체가 SEQ ID NO: 2의 야생형 인간 TRIF 단백질의 위치 1 내지 311에서 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 인간 TRIF 변이체인 약제학적 조성물.
- 제69항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, TRIF 변이체가 SEQ ID NO: 12로 이루어진 약제학적 조성물.
- 대상체로의 하나 이상의 핵산 분자의 전달 방법으로서, 제68항 내지 제92항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 대상체에서의 타노트랜스미션의 촉진 방법으로서, 제68항 내지 제92항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 타노트랜스미션을 촉진시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 면역 반응의 증가를 필요로 하는 대상체에서의 면역 반응의 증가 방법으로서, 제68항 내지 제92항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 대상체에서 면역 반응을 증가시키기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제95항에 있어서, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 대상체로의 투여가 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 오직 하나만을 인코딩하는 핵산 분자가 투여되는 대상체에 비하여 면역 반응을 증가시키는 방법.
- 제95항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여가, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하지만 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하지 않는 핵산 분자가 투여되는 대상체에 비하여 면역 반응을 증가시키는 방법.
- 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응을 증가시키는 것이 NFkB 활성 및 IRF 활성 중 하나 이상을 증가시키는 것을 포함하는 방법.
- 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 암의 치료 방법으로서, 제68항 내지 제92항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 암을 치료하기에 충분한 양으로 및 그러한 시간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물이 대상체에게 정맥내 투여되는 방법.
- 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 핵산 분자가 리포펙션을 통해 대상체에게 전달되는 방법.
- 제101항에 있어서, 리포펙션이 RNA 리포펙션인 방법.
- 제101항에 있어서, 리포펙션이 DNA 리포펙션인 방법.
- 제99항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계가 대상체에서 암 세포의 증식을 감소시키는 방법.
- 제104항에 있어서, 암 세포의 증식이 대상체가 받은 암 치료법으로부터 초래되는 암 세포의 과다증식인 방법.
- 제99항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계가 대상체에서 암 세포의 전이를 감소시키는 방법.
- 제99항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계가 대상체에서 종양의 혈관신생을 감소시키는 방법.
- 제99항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료가 종양 부담의 감소, 종양 크기의 감소, 종양 성장의 저해, 치료 이전에 진행성 암을 갖는 대상체에서의 안정한 암의 달성, 암의 진행까지의 시간 증가 및 생존 시간 증가 중 임의의 하나 이상을 포함하는 방법.
- 제99항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 감소된 RIPK3 발현을 나타내는 방법.
- 제99항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 고형 종양인 방법.
- 제99항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 대장암, 위암, 난소암, 전립선암, 부신피질암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제99항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 결장암인 방법.
- 제99항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 항-신생물제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제99항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 대상체로의 투여가 타노트랜스미션 폴리펩티드 중 오직 하나만을 인코딩하는 핵산 분자가 투여되는 대상체에 비하여 생존 시간을 증가시키고/시키거나 종양 성장을 감소시키는 방법.
- 제99항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 투여가, 둘 이상의 상이한 타노트랜스미션 폴리펩티드를 인코딩하지만 카스파제 활성을 저해하는 폴리펩티드를 추가로 인코딩하지 않는 핵산 분자가 투여되는 대상체에 비하여 생존 시간을 증가시키고/시키거나 종양 성장을 감소시키는 방법.
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