CN115838435B

CN115838435B - 细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白及其制备方法和应用

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Publication number: CN115838435B
Application number: CN202211335686.0A
Authority: CN
Inventors: 杨安钢; 邢玉琪; 赵晶; 阎博
Original assignee: Air Force Medical University of PLA
Current assignee: Air Force Medical University of PLA
Priority date: 2022-10-28
Filing date: 2022-10-28
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2042-10-28
Also published as: CN115838435A

Abstract

本发明重组免疫偶联蛋白制备方法领域，具体公开了细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白及其制备方法和应用，所述重组免疫偶联蛋白的基因从3’端至5’端依次包括靶向区域、组织蛋白酶B识别肽段B2基因片段、用于内吞体膜上打孔的膜融合序列、用于在细胞膜上直接打孔并杀伤细胞的基因片段和蛋白标签。本发明制备的免疫偶联蛋白具有更强的杀伤功能鉴定，能够有效延长半衰期，从而解决给药频率高的问题。

Description

细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及重组免疫偶联蛋白制备方法领域，具体涉及细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

HER2在多种类型肿瘤中高表达，是公认的抗肿瘤靶位。目前，靶向HER2的抗肿瘤治疗已取得重要进展：①单克隆抗体及其化学药物偶联物已经用于临床，但单药疗效有限，易出现心脏毒性、耐药等问题；②免疫毒素仍停留在临床试验阶段，尚未有效解决中和抗体产生、肝毒性等问题；③免疫偶联蛋白(与细胞因子、核酸酶、促凋亡蛋白等偶联)正处于临床前研究。但其仍存在治疗剂量大、给药频率高等问题，给进一步转化带来不便。因此选用杀上效率较高、并且半衰期较长的肿瘤免疫偶联蛋白对肿瘤靶向治疗的发展具有重要意义。

细胞焦亡是介于细胞凋亡和细胞坏死的细胞死亡方式，其主要特征为细胞膜表面气泡凸起、细胞溶胀崩解、伴有炎症反应等。

尽管细胞焦亡原本是固有免疫的防御机制，但将其应用于抗肿瘤研究具有理论和技术的可行性。已报道在不同哺乳动物细胞系中，通过3种给药方式相互印证，利用GSDMD主动杀伤细胞的思路具有有效性，分别是：转染活性型基因的方式；转染无活性基因、同时控制活化开关的方式；纯化蛋白给药的方式。目前的给药方式存在给药剂量大、给药频率高的问题。至今，还并未报道GSDMD相关的重组免疫偶联蛋白，利用其来主动杀伤肿瘤细胞。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白及其制备方法和应用，本发明获得的细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白包括ABD035相关的长效化GSDMD-N偶联蛋白，dAb7h8相关的长效化GSDMD-N偶联蛋白和短效的GSDMD-N相关的偶联蛋白，显著的增加了对肿瘤细胞的杀伤效果和靶向性。

本发明的第一个目的提供细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白，表达所述重组免疫偶联蛋白的基因从3’端至5’端依次包括靶向区域、组织蛋白酶B识别肽段B2基因片段、用于内吞体膜上打孔的膜融合序列、用于在细胞膜上直接打孔并杀伤细胞的基因片段和蛋白标签。

本发明还提供了一种细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白，表达所述重组免疫偶联蛋白的基因从3’端至5’端依次包括靶向区域、增长蛋白半衰期相关肽段的基因片段、组织蛋白酶B识别肽段B2基因片段、用于内吞体膜上打孔的膜融合序列E5C3、用于在细胞膜上直接打孔并杀伤细胞的GSDM-N基因片段和蛋白标签。

靶向区域可以起到识别疾病相关抗原的作用；增长蛋白半衰期相关肽段的基因片段(如白蛋白肽)能够蛋白半衰期；组织蛋白酶B在蛋白进入细胞内体后，在低PH的作用下，会在B2处识别并被切割，释放包括E5C3的剩余片段；E5C3可在内吞体膜上打孔促进功能GSDM-N基因片段的释放；GSDM-N基因片段可在细胞膜上直接打孔从而杀伤细胞；蛋白标签有利于蛋白纯化。

进一步地，所述增长蛋白半衰期相关肽段的基因片段为白蛋白肽基因片段。

进一步地，所述靶向区域为抗体与识别肽中的一种。

进一步地，所述抗体为HER2人源化单链抗体P1h3片段。

进一步地，所述GSDM-N基因为GSDMA-N、GSDMB-N、GSDMC-N、GSDMD-N和GADME-N中的一种。

进一步地，所述蛋白标签为His标签或Flag标签。

本发明的第二个目的提供上述细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白的制备方法，包括如下步骤：

S1，获得目的片段：分别设计用于扩增目的片段的引物对并扩增获得相应的目的片段，所述目的片段包括靶向区域的基因片段和用于在细胞膜上直接打孔并杀伤细胞的基因片段；

S2，重组表达质粒构建：将S1中获得的目的片段连接到pcDNA3.1(+)质粒，转化进入DH5α感受态细胞，经氨苄霉素筛选出阳性菌落，经PCR验证并测序鉴定正确后，提取并得到重组质粒；

S3，真核表达及纯化：将S2获得的重组质粒转染进入到293F细胞中，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养5天，收集细胞培养上清液，与Ni-NTA纯化树脂结合，在含有10mmol/L咪唑的洗脱缓冲液中洗脱并收集目的蛋白。

进一步地，S1中，所述目的片段还包括增长蛋白半衰期相关肽段的基因片段。

本发明的第三个目的提供上述细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白在制备杀伤肿瘤细胞药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明首次在体外表达并获得了具有活性的焦亡分子相关的长效化免疫偶联蛋白，并且实验证实，其具有更强的杀伤功能鉴定，为肿瘤免疫治疗提供了一种新的途径。

2、本发明构建的细胞焦亡相关免疫偶联蛋白直接以细胞焦亡方式杀伤肿瘤细胞，利用焦亡效应分子(GSDM-N)可以在细胞膜上进行打孔杀伤，对于其他细胞死亡方式更具有动力学优势，解决给药剂量大、给药频率高的问题。

3、本发明将分子量小的白蛋白肽与药物蛋白直接融合，该融合蛋白能够与白蛋白形成非共价复合物，间接借助白蛋白长效化机制延长血清半衰期。拟将ABD035和dAb7h8插入靶向区域与组织蛋白酶B2之间，来进一步延长细胞焦亡相关偶联蛋白的半衰期。

4、本发明获得的细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白包括ABD035相关的长效化GSDMD-N偶联蛋白，dAb7h8相关的长效化GSDMD-N偶联蛋白和短效的GSDMD-N相关的偶联蛋白，均显著的增加了对肿瘤细胞的杀伤效果，并表现出显著地靶向性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中PCR扩增GSDMD-N基因的电泳图谱，其中1：Marker，2：扩增产物；

图2为本发明实施例1中PCR扩增Fc基因的电泳图谱，其中1：Marker，2：扩增产物；

图3为本发明实施例1中PCR鉴定阳性转化子的电泳图谱，1：Marker，2：阳性菌落PCR扩增；

图4为本发明实施例1中Western-blotting鉴定目的蛋白分离纯化结果；1：流穿液，2：洗涤液；3-12:浓度依次为：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mmol/L；

图5为本发明实施例1中SDS-PAGE鉴定目的蛋白分离纯化结果；1：流穿液，2：洗涤液；3-12:浓度依次为：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mmol/L；

图6为本发明实施例1中获得的体外免疫偶联蛋白对肿瘤细胞杀伤结果，其中SKBR3是HER2高表达，NCl-H1975是中表达，PC9^-是完全不表达HER2的；

图7为本发明实施例2中PCR扩增GSDMD-N基因的电泳图谱，其中1：Marker，2：扩增产物；

图8本发明实施例2中PCR鉴定阳性转化子的电泳图谱，1：Marker，2：阳性菌落PCR扩增；

图9本发明实施例2中Western-blotting鉴定目的蛋白分离纯化结果；1：流穿液，2：洗涤液；3-13:浓度依次为：10、20、30、40、60、80、100、200、400、600、800、1000mmol/L；

图10本发明实施例2中SDS-PAGE鉴定目的蛋白分离纯化结果；1：流穿液，2：洗涤液；3-13:浓度依次为：10、20、30、40、60、80、100、200、400、600、800、1000mmol/L；

图11本发明实施例2中获得的体外免疫偶联蛋白对肿瘤细胞杀伤结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一、一种ABD035相关的长效化细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白及制备方法

1、一种ABD035相关的长效化细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白

所述ABD035相关的长效化细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，从3’端至5’端依次包括HER2人源化单链抗体P1h3片段(基因序列如SEQID NO.2)，ABD035基因片段(基因序列如SEQ ID NO.3)，组织蛋白酶B识别肽段B2基因片段(基因序列如SEQ ID NO.4)，优化的膜融合序列E5C3(基因序列如SEQ ID NO.5)，GSDMD-N基因片段(基因序列如SEQ ID NO.6)和His标签(基因序列如SEQ ID NO.7所示)。

2、所述重组免疫偶联蛋白的制备方法

S1，目的片段的获得：分别设计用于扩增GSDMD-N蛋白的基因和ABD035基因片段的引物对，具体引物信息见表1；

以商品化GSDMD-N质粒的cDNA为模板、利用GSDMD-N-F和GSDMD-N-R引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖电泳，回收753bp左右DNA片段，获得SEQ ID NO.6所示的GSDMD-N基因片段；

以ABD035基因的cDNA为模板(参见文献：Guo,Rui et al.“Fusion of analbumin-binding domain extends the half-life of immu notoxins.”)、利用ABD035-F和ABD035-R引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖电泳，回收180bp左右DNA片段，获得SEQID NO.3所示的ABD035基因片段；

PCR扩增条件：95℃预变性5min，98℃变性10sec，59℃退火5sec，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃充分延伸5min，4℃保存；

表1引物对信息

S2，重组表达质粒构建：将S1中扩增得到的GSDMD-N基因片段和ABD035基因片段连接到pcDNA3.1(+)质粒，转化进入DH5α感受态细胞，经氨苄霉素筛选出阳性菌落，经PCR验证并测序鉴定正确后，提取并得到重组质粒；

上述步骤具体为：将S1的反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳(见图1)，用Takara的胶回收试剂盒回收长度为753bp的DNA片段后，进行EcoRI和BamHI双酶切；回收长度为183bp的DNA片段后，进行SmaI和NcoI双酶切，经DNA片段纯化后，与EcoRI和BamHI、SmaI和NcoI酶切处理后的pcDNA3.1(+)质粒(Takara公司)连接过夜，转化到DH5α感受态细胞，挑取白色单菌落进行PCR验证(见图2)及DNA测序鉴定，得到阳性转化子(见图3)；提取阳性转化子的质粒，即得到重组质粒，保存于-20℃备用；

S3，真核表达及纯化：将S2制备得到的重组质粒转染进入到293F细胞中，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养5天，收集细胞培养上清液，上清即含有带有His标签的特异性诱导肿瘤细胞的长效化免疫偶联蛋白，上清液与Ni-NTA纯化树脂结合，冰上孵育2h后，用缓冲液充分清洗Ni柱，在含有10mmol/L咪唑的洗脱缓冲液中洗脱目的蛋白，分装收集，即得到ABD035相关的长效化细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白。

二、鉴定方法和结果：

1、western-blotting鉴定：按《分子克隆手册》所述方法，取蛋白上清进行Western-blotting鉴定。

一抗为抗His-tag小鼠单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，显色剂为米鼠公司的超敏ECL化学发光试剂盒。结果如图4所示，在68KD处出现单一条带，与SDS-PAGE电泳分析结果一致，从图4中看出，在68KD处出现特异的、大量表达的蛋白条带。

SDS-PAGE电泳结束后，取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗30min，将甲醇浸泡过的与胶同样大小的NC膜和滤纸，按纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫的结构，装入转印夹。转膜时凝胶侧接负极，NC膜侧接正极，电泳槽冰浴，100mA横流转膜1.5h。转膜结束后，用TBST漂洗膜3次，每次5min，然后置于3％BSA中封闭2h；取出NC膜置于稀释好的His-tag一抗中，4℃孵育过夜；TBST洗涤3次，每次5min；再用稀释好的二抗溶液室温孵育2h；TBST洗涤3次，每次5min；最后将NC膜用ECL化学发光曝光X-光片，显影，定影。

2、重组截断蛋白的分离纯化

取10ml细胞上清液用Ni-NTA树脂结合，用12倍柱床体积的过柱平衡液(50mmol/LNaH₂PO₄；300mmol/L NaCl；pH 8.0)洗去非特异结合的杂蛋白，含150mmol/L咪唑的洗脱缓冲液(50mmol/LNaH₂PO₄；300mmol/L NaCl；150mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱带有His标签的融合蛋白，收集蛋白洗脱液，得到了纯化的融合蛋白即本发明的重组截断蛋白目的蛋白，经SDS-PAGE电泳鉴定其纯度，从图5中可以看出，在咪唑浓度为10mmol/L时的纯化结果较好。

3、免疫偶联蛋白的保存备用

按照实施例1的方法大量转染293F细胞表达目的蛋白，收集上清，并过柱纯化，将收集的蛋白洗脱液在4℃对蒸馏水透析48h，每8h换一次液。透析后的蛋白样品进行冷冻干燥，-80℃保存备用。

4、免疫偶联蛋白体外杀伤实验

在96孔板中接种SKBR-3、NCI-H1975和PC9^-细胞，每孔细胞数约为1×10⁴，待肿瘤细胞贴壁后，吸弃上清，使用无菌1×PBS洗涤一次，分别加入100μL免疫促焦亡蛋白，对照组加入相应体积的pcDNA3.1(+)空载体的293F细胞上清液，每组设置6个复孔；孵育24h后，弃去上清，以无菌1×PBS洗涤一次后，加入CCK8试剂与培养液1:1的混合液100μL。避光共孵育1h。酶标仪检测CCK8结果，用GraphPad统计软件分析结果。结果如图6所示，本实施例制备的ABD035相关的长效化细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白可有效杀伤HER2阳性肿瘤细胞，并随着细胞HER2阳性率的升高，其杀伤效果增强，表现了其显著地靶向性(SKBR3是HER2高表达，NCl-H1975是中表达，PC9^-是完全不表达HER2的)。

实施例2

一、一种GSDMD-N相关的短效重组免疫偶联蛋白及其制备方法

1、一种GSDMD-N相关的短效重组免疫偶联蛋白

所述GSDMD-N相关的短效重组免疫偶联蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，从3’端至5’端依次包括HER2人源化单链抗体P1h3片段(基因序列如SEQ ID NO.2)，组织蛋白酶B识别肽段B2基因片段(基因序列如SEQ ID NO.4)，优化的膜融合序列E5C3(基因序列如SEQ ID NO.5)，GSDMD-N基因片段(基因序列如SEQ ID NO.6)和His标签(基因序列如SEQID NO.7所示)。

2、所述重组免疫偶联蛋白的制备方法和应用

S1，目的片段的获得：设计用于扩增GSDMD-N蛋白的基因的引物对，具体引物信息见表1；

按照实施例1的方法扩增得到SEQ ID NO.6所示的GSDMD-N基因片段；

S2，重组表达质粒构建：将GSDMD-N基因片段连接到pcDNA3.1(+)质粒，转化进入DH5α感受态细胞，经氨苄霉素筛选出阳性菌落，经PCR验证并测序鉴定正确后，提取并得到重组质粒；

上述步骤具体为：将S1的反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳(见图7)，用Takara的胶回收试剂盒回收长度为753bpDNA片段后，进行EcoRI和BamHI双酶切，经DNA片段纯化后，与EcoRI和BamHI酶切处理后的pcDNA3.1(+)质粒(Takara公司)连接过夜，转化到DH5α感受态细胞，挑取白色单菌落进行PCR验证(见图8)及DNA测序鉴定，得到阳性转化子；提取阳性转化子的质粒，即得到重组质粒，保存于-20℃备用；

S3，真核表达及纯化：将重组质粒转染进入到293F细胞中，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养5天，收集细胞培养上清液，上清即含有带有His标签的特异性诱导肿瘤细胞的短效免疫偶联蛋白，上清液与Ni-NTA纯化树脂结合，冰上孵育2h后，用缓冲液充分清洗Ni柱，在含有10mmol/L咪唑的洗脱缓冲液中洗脱目的蛋白，分装收集，即得到GSDMD-N相关的短效免疫偶联蛋白。

二、鉴定方法和结果：

1、western-blotting鉴定：按《分子克隆手册》所述方法，取蛋白上清进行Western-blotting鉴定，具体实验步骤与实施例1相同。

结果如图9所示，在68KD处出现单一条带，与SDS-PAGE电泳分析结果一致，从图9中看出，在68KD处出现特异的、大量表达的蛋白条带。

2、免疫偶联蛋白的分离纯化

具体步骤与实施例1相同，实验结果如图10所示，在咪唑浓度为10mmol/L时的纯化结果较好。

3、免疫偶联蛋白的保存备用

4、免疫偶联蛋白体外杀伤实验

具体操作步骤与实施例1相同，结果如图11所示，本实施例制备得到的GSDMD-N相关的短效重组免疫偶联蛋白可有效杀伤HER2阳性肿瘤细胞，并随着细胞HER2阳性率的升高，其杀伤效果增强，表现了其显著地靶向性(SKBR3是HER2高表达，1975是中表达，PC9^-是完全不表达HER2的)。

实施例3

一、一种dAb7h8相关的长效化细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白及其制备方法

1、一种dAb7h8相关的长效化细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白

所述dAb7h8相关的长效化细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，从3’端至5’端依次包括HER2人源化单链抗体P1h3片段(基因序列如SEQID NO.2)，dAb7h8基因片段(基因序列如SEQ ID NO.14所示)，组织蛋白酶B识别肽段B2基因片段(基因序列如SEQ ID NO.4)，优化的膜融合序列E5C3(基因序列如SEQ ID NO.5)，GSDMD-N基因片段(基因序列如SEQ ID NO.6)和His标签(基因序列如SEQ ID NO.7所示)。

2、所述重组免疫偶联蛋白的制备方法和应用

S1，目的片段的获得：分别设计用于扩增GSDMD-N基因片段和dAb7h8基因片段的引物对，具体引物信息见表1和表2；

按照实施例1的步骤扩增得到GSDMD-N基因片段；

以dAb7h8基因的cDNA为模板为模板(参见文献：O&apos；Connor-Semmes,R L etal.“GSK2374697,a novel albumin-binding domai n antibody(AlbudAb),extendssystemic exposure of exendin-4:first study in huma ns--PK/PD and safety.”)，利用dAb7h8-F和dAb7h8-R为引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖电泳，回收222bp左右DNA片段，获得SEQ ID NO.14所示的dAb7h8基因片段；

表2引物对信息(不同酶切位点用单线和双线分开标记)

S2，重组表达质粒构建：将S1中扩增得到的GSDMD-N基因片段和dAb7h8基因片段连接到pcDNA3.1(+)质粒，转化进入DH5α感受态细胞，经氨苄霉素筛选出阳性菌落，经PCR验证并测序鉴定正确后，提取并得到重组质粒；

上述步骤具体为：将S1的反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳，用Takara的胶回收试剂盒回收长度为753bp的DNA片段后，进行EcoRI和BamHI双酶切；回收长度为222bp的DNA片段后，进行HindIII和NcoI双酶切，经DNA片段纯化后，与EcoRI和BamHI、HindIII和NcoI酶切处理后的pcDNA3.1(+)质粒(Takara公司)连接过夜，转化到DH5α感受态细胞，挑取白色单菌落进行PCR验证及DNA测序鉴定，得到阳性转化子；提取阳性转化子的质粒，即得到重组质粒，保存于-20℃备用；

S3，真核表达及纯化：将重组质粒转染进入到293F细胞中，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养5天，收集细胞培养上清液，上清即含有带有His标签的特异性诱导肿瘤细胞的长效化免疫偶联蛋白，上清液与Ni-NTA纯化树脂结合，冰上孵育2h后，用缓冲液充分清洗Ni柱，在含有10mmol/L咪唑的洗脱缓冲液中洗脱目的蛋白，分装收集，即得到dAb7h8相关的长效化细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白，其特征在于，表达所述重组免疫偶联蛋白的基因从5’端至3’端依次包括靶向区域、增长蛋白半衰期相关肽段的基因片段、组织蛋白酶B识别肽段B2基因片段、用于内吞体膜上打孔的膜融合序列E5C3、用于在细胞膜上打孔并杀伤细胞的GSDM-N基因片段和蛋白标签，所述细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的细胞焦亡相关分子重组免疫偶联蛋白在制备杀伤肿瘤细胞药物中的应用。