CN109136265A

CN109136265A - Gsdmd-n基因重组质粒及在乳腺表达的方法和应用

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Publication number: CN109136265A
Application number: CN201811112277.8A
Authority: CN
Inventors: 杨勇军; 颜世卿; 马超颖; 潘志明; 马轲; 陈巍
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本发明公开一种GSDMD‑N基因重组质粒及在乳腺表达的方法和应用，通过构建GSDMD‑N基因的表达重组质粒，使其在乳腺组织及乳腺细胞内特异性表达，从而达到对金黄色葡萄球菌感染的乳腺炎的防治目的，属于基因工程领域。GSDMD‑N蛋白是近年发现的可以特异性的识别细菌的生物膜成分心磷脂并与之相结合，进而形成大量蜂窝状孔道，使细菌崩解死亡的多肽类化合物。本技术通过乳腺生物反应器，利用乳腺组织的特异性启动子WAP使外源基因GSDMD‑N在动物乳腺中高效表达，并以此杀灭造成奶牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌，从而达到预防和治疗由金黄色葡萄球菌感染造成的奶牛乳腺炎的目的。本发明提供的重组质粒及重组减毒沙门菌具有高效、安全、成本低等优点，为防治金黄色葡萄球菌感染所致奶牛乳腺炎提供新途径，具有良好的应用前景。

Description

GSDMD-N基因重组质粒及在乳腺表达的方法和应用

技术领域：

本发明提供了一种GSDMD-N基因重组质粒，是由鼠GSDMD-N基因构建而成的；本发明进一步提供了GSDMD-N基因重组质粒及其在乳腺表达的方法；利用减毒沙门菌使其在牛乳腺细胞及鼠乳腺组织中表达的方法，从而达到利用GSDMD-N蛋白对金黄色葡萄球菌感染的乳腺炎的防治目的，属于基因工程技术领域。

背景技术：

Gasdermin家族是一种含有DFNA5结构域的但是功能未知的蛋白家族，该家族主要有12个成员，该家族蛋白主要在肠道上皮和胃肠道上皮中表达，该家族蛋白的突变会造成毛囊生长发育异常，同时该家族的蛋白表达异常与肿瘤的发生密切相关，Gasdermin家族的成员N端有介导细胞焦亡的功能。

Gasdmermin D (GSDMD)蛋白是近Gasdermin家族年来发现的天然免疫防御分子，其前体不具有生物活性。当PRRs识别外源性的PAMP，或内源性的DAMP激活炎性体后，募集接头蛋白ASC和激活Caspase-1，4，5，进而剪切GSDMD产生具有生物活性的N末端GSDMD-N蛋白。GSDMD-N蛋白可以特异性的识别细菌的生物膜成分磷脂并与之相结合，进而形成大量蜂窝状孔道，使细菌崩解死亡。目前关于GSDMD-N蛋白序列已成功检测，但其抗菌抑炎功能尚未见报道。

沙门菌是一种可产生局部或全身感染的侵袭性胞内菌，它和宿主之间通过III型分泌机制介导反应，这种机制使细菌的效应蛋白能直接转移到真核细胞发挥作用，使其可以传递表达效应基因并同时表达多种功能性蛋白。近年来通过基因工程技术能将沙门菌的致病基因敲除后得到减毒菌株，为沙门菌作为载体的安全性提供了保证。沙门菌SL7207是aroA基因缺失菌，aroA是合成5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合成酶的重要物质，而该酶参与氨基苯甲酸和二羟基苯甲酸代谢，进而合成芳香族氨基酸。因此，缺失aroA基因时，该菌不能完成上述反应，从而限制该菌的生长进而达到减毒的目的，该菌毒力虽然减弱可是却不影响其胞内侵袭性，所以SL7207减毒沙门菌可以做载体携带外源基因进入到宿主细胞进行表达。

发明内容：

本发明一种GSDMD-N基因重组质粒，使其在乳腺组织及乳腺细胞内特异性表达，从而达到对金黄色葡萄球菌感染的乳腺炎的防治目的。

本发明进一步提供了GSDMD-N基因重组质粒在乳腺表达的方法，通过基因工程扩增GSDMD-N基因，然后将其连接到含有WAP启动子的表达载体上，构成可以表达GSDMD-N蛋白的重组质粒；将其电转至减毒沙门菌SL7207上，由此获得携带GSDMD-N基因、WAP启动子的重组减毒沙门菌GSDMD-N-ORF；随后利用减毒沙门菌侵染牛乳腺上皮细胞以及鼠第四对乳腺，以此评价GSDMD-N重组质粒的表达效果及其在预防和治疗乳腺炎中的初步应用效果。并且该重组表达蛋白无明显的细胞毒性作用，对动物机体也无毒副作用。

本发明提供的一种GSDMD-N基因重组质粒，编码目的蛋白GSDMD-N的核苷酸序列如SEQ no.1所示。

本发明所述的GSDMD-N基因重组质粒构建及其在乳腺表达的方法，包括以下步骤：

1、本发明所述的重组质粒的质粒图谱如图1所示：

2、本发明所述的GSDMD-N重组质粒的构建：

通过已公布的GSDMD-N蛋白序列确定GSDMD-N序列来合成引物以及相关基因引物，随后制备骨髓来源巨噬细胞cDNA进行PCR扩增GSDMD-N片段以及相关基因片段；之后将各片段连接到克隆载体上构成含有pEGFP-GSDMD-N-WAP-His的重组质粒。

PCR及双酶切电泳图证明重组质粒构建成功（参见图2）；

3、本发明所述的GSDMD-N重组质粒在乳腺细胞表达检测：

将重组质粒电转至减毒沙门菌SL7207中，构建重组减毒沙门菌GSDMD-N-ORF，PCR电泳图证明重组减毒沙门菌构建成功（参见图3）。再用减毒沙门菌GSDMD-N-ORF感染牛乳腺上皮细胞，用western blot 检测GSDMD-N蛋白在乳腺上皮细胞内的表达情况；

结果表明减毒沙门菌GSDMD-N-ORF侵染12 h后，GSDMD-N表达量相对升高，而侵染24 hGSDMD-N表达量显著升高，证明GSDMD-N重组质粒成功在乳腺细胞表达（参见图4）；

、本发明所述的GSDMD-N重组质粒对乳腺炎治疗效果检测：

建立鼠金黄色葡萄球菌乳腺炎模型，之后乳腺注射减毒沙门菌GSDMD-N-ORF；

结果表明，GSDMD-N-ORF组的小鼠乳腺内金黄色葡萄球菌荷菌数显著下降，证明GSDMD-N蛋白可以有效地抑制金黄色葡萄球菌在乳腺内的增殖（参见图5）；

5、本发明所述的GSDMD-N重组质粒的安全性检测：

分别将携带有Vector及GSDMD-N-ORF的SL7207侵染牛乳腺上皮细胞24 h后，分别应用CCK8和MTT试剂盒检测乳腺上皮细胞死亡情况；

结果表明，细胞存活无明显差异（参见图8）；

分别将携带Vector、GSDMD-N-ORF的SL7207注射到实验小鼠的乳腺中，48 h后无菌分离小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、乳腺。通过H&E观察各组织器官的的病理变化；

结果表明：相对于NT组，携带Vector、GSDMD-N-ORF的SL7207重组菌注射到小鼠乳腺中，并不能引起肝脏、脾脏、肾脏、乳腺等部位的明显的病理变化，都可以保持细胞正常的形态结构，并未见变性和坏死、炎性细胞浸润（参见图9.1~图9.4）；

以上结果证明GSDMD-N重组质粒在细胞及在体应用中安全性均达标。

本发明的积极效果在于：构建了一个GSDMD-N的重组质粒，通过减毒沙门菌介导其在乳腺内特异性表达，产生的GSDMD-N蛋白明显抑制胞内及乳腺组织内金黄色葡萄球菌增殖，同时减轻金黄色葡萄球菌感染所引起的乳腺炎；使GSDMD-N在乳腺细胞和乳腺组织中均表达，用于防治金黄色葡萄球菌感染引起的乳腺炎。本发明为防治金黄色葡萄球菌感染所致奶牛乳腺炎提供新途径，具有良好的应用前景。

附图说明：

图1：本发明重组质粒质粒图谱（图中“M”2000 bp marker；“1~2”分别表示pEGFP-GSDMD-N-WAP-His、扩增的WAP片段;“3~4”分别表示pEGFP -WAP-His、扩增的WAP片段）；

图2：本发明pEGFP-GSDMD-N-WAP-His、pEGFP-WAP-His重组菌鉴定（图中“M”2000 bpmarker；“1~2”分别表示GSDMD-N-ORF扩增的WAP片段；“3~4”分别表示Vector扩增的WAP片段）；

图3：本发明Vector及GSDMD-N-ORF重组菌鉴定；

图4：本发明重组菌GSDMD-N-ORF感染细胞WB检测GSDMD-N表达；

图5：本发明乳腺组织荷菌数；

图6-图6.1：本发明乳腺组织病理学变化；

图7：本发明乳腺组织细胞细胞因子分泌情况；

图8：本发明细胞存活（图A为MOI=100的沙门菌感染24 h后CKK8检测细胞存活情况；图B为MOI=200的沙门菌感染24 h后CKK8检测细胞存活情况；图C为MOI=100的沙门菌感染24 h后MTT检测细胞存活情况；图D为MOI=200的沙门菌感染24 h后MTT检测细胞存活情况）；

图9.1：本发明肝脏组织病理学变化图片；

图9.2：本发明脾脏组织病理学变化图片；

图9.3：本发明肾脏组织病理学变化图片

图9.4：本发明乳腺组织病理学变化图片。

具体实施方式：

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1：

GSDMD-N重组表达质粒的构建，包括以下工艺步骤及结果：

GSDMD-N基因结构域CDS全长片段引物的设计：

根据GSDMD蛋白全长序列，通过GenBank确定GSDMD-N基因序列，设计GSDMD-N基因结构域CDS全长片段引物，GSDMD-N基因引物（GSDMD-N-F， GSDMD-N-R）分别含有BamH I、EcoRⅠ酶切位点，用于扩增840 bp的GSDMD-N片段。

根据乳清酸蛋白（WAP）基因上游调控序列和含有WAP基因序列的质粒设计引物（WAP-F，WAP-R）分别含有XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点，用于扩增1050 pb的WAP片段，根据pEGFP-1质粒中EGFP序列引物EGFP+HiS-F、EGFP+HiS-R分别含有BamHⅠ和NotⅠ酶切位点，用于扩增大小752 bp EGFP片段和His标签。

表1：各扩增片段的引物序列

Primer name	Sequence ( 5'—3')
		GSDMD-N-F	<u>GAATTC</u>ATGCCATCGGCCTTTGAG
GSDMD-N-R	<u>GGATCC</u>ATCTGACAGGAGACTGAGC
		WAP-F	<u>CTCGAG</u>GGCCACAGTGAAGACCT
WAP-R	<u>GAATTC</u>GGTGTCGGCGGCGG
		EGFP+His-F	<u>GGATCC</u>ATGGTGAGCAAGGGCG
EGFP+His-R	<u>GGCCGC</u>TTAATGATGATGGTGATGATGCTTGTACAGCTCGTCCAT

注：下划线为酶切位点

1、目的片段的获取

1） PCR扩增GSDMD-N片段

以骨髓来源巨噬细胞cDNA为模板，以GSDMD-N-F、GSDMD-N-R为上下游引物扩增大小为840bp的GSDMD-N片段，反应体系表2所示，反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，35个循环，72℃延伸10 min。

表2:PCR反应体系

2） PCR扩增WAP启动子

将带有WAP启动子质粒的细菌在抗性平板上划线，37℃温箱培养16-18 h，挑选阳性单菌落，接种于3 mL无菌的LB培养基过夜培养。以WAP-F、WAP-R为引物，以该菌液为模板扩增大小为1050bp的WAP启动子，反应体系如表3所示，反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，35个循环，72℃延伸10 min。

表3：PCR反应体系

3）PCR扩增EGFP+His片段

将带有pEGFP-1质粒的细菌在抗性平板上划线，37℃温箱培养16-18 h，挑选阳性单菌落，接种于3 mL无菌的LB培养基过夜培养。以EGFP+His-F、EGFP+His-R为引物，以该菌液为模板扩增大小为752bp的EGFP+His片段，反应体系如下表，反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，35个循环，72℃延伸10 min。

2、目的片段连接克隆载体并转化

1）将回收的目的片段按照表6体系混合并连接到pEASY-blunt-zero，室温（37℃）反应5min，后置于冰上。

表 4：连接反应体系

2）将连接产物转化到Trans1-T1

①将连接产物加入刚从﹣80 ℃冰箱取出TransT1感受态，置于冰上，20-30 min;

②42℃热激30 s，置冰上2 min。

③加入500 μL LB培养基，200 r/min 37℃培养1 h；

④在有氨苄抗性的平板上涂300 μL菌液，37℃温箱中培养18 h，命名为pEASY-bluntzero-GSDMD-N、pEASY-blunt zero-EGFP+His、pEASY-blunt zero-WAP。

3、阳性克隆的鉴定

1）挑选阳性菌落进行PCR鉴定

①挑选阳性菌落，加入3 mL LB培养至于37℃摇床，16-18 h培养；

②吸取上述细菌菌液100 μL，7000 r/min离心3 min，吸取90 μL上清，弃掉，余下10 μL重悬用于PCR 鉴定；

③用下列体系做菌液PCR鉴定。

表 5：PCR反应体系

试剂	含量 ( μL)
		10×buffer	2 μL
dNTP	2 μL
		F	1 μL
R	1 μL
		模板	1 μL
rtaq酶	0.2 μL
		RNase-free H<sub>2</sub>O	12.8 μL

2）阳性克隆双酶切鉴定

①取过夜培养的菌液1-4 mL至于无菌离心管中，1 min，弃掉上清；

②加入250 μL Buffer S1，悬浮细菌沉淀，注意悬浮应该充分，不应该留有小的菌块；

③加入250 μL Buffe rS2，翻转4-6次，使菌体充分裂解并且形成透明的液体，注意S2要密封保存，并且避免剧烈摇晃，否则会造成基因组DNA的污染，该步要在5 min之内完成；

④加入350 μL BufferS3，上下翻转混合6-8次12000 r/min 离心10 min。注意避免剧烈摇晃，否则会造成基因组DNA的污染；

⑤将上述离心上清转入至制备管中，12000 r/min离心1 min，弃滤液；

⑥将制备管置回离心管，加入500μL Buffer W1洗涤液，12000 r/min离心1 min，弃滤液；

⑦将制备管置回离心管，加入700μL Buffer W2 去盐液，12000 r/min离心1 min，弃滤液；重复一次；

⑧将制备管置回2 mL离心管中，12000 r/min离心1 min；

⑨自然晾干3-5 min；

⑩将制备管放到新的1.5 mL 离心管中，在制备管膜中央加入60 μL 去离子水，室温静置1 min，12000 r/min离心1 min。注意将去离子水加热至65℃可以提高洗脱效率；

⑪酶切鉴定，37℃，酶切4 h。。

表6 GSDMD-N酶切鉴定反应体系

试剂	含量 ( μL)
		<i>BamH</i> Ⅰ	0.3 μL.
<i>EcoR</i> Ⅰ	0.6 μL
		Buffer3.1	0.6 μL
DNA	2 μL
		RNase-free H<sub>2</sub>O	6.5 μL
Total	10 μL

表7 EGFP+His酶切鉴定反应体系

试剂	含量 ( μL)
		<i>BamH</i>Ⅰ	0.3 μL.
<i>Not</i> Ⅰ	0.3 μL
		Buffer3.1	1 μL
DNA	2 μL
		RNase-free H<sub>2</sub>O	6.4 μL
Total	10 μL

表8 WAP酶切鉴定反应体系

试剂	含量 ( μL)
		<i>Xho</i> Ⅰ	0.3 μL.
<i>EcoR</i>Ⅰ	0.3 μL
		Buffer2.1	1 μL
DNA	2 μL
		RNase-free H<sub>2</sub>O	6.4 μL
Total	10 μL

4、pEASY-blunt zero-GSDMD-N连接pEGFP-His表达载体

1)将鉴定正确的pEGFP-His质粒与pEASY-blunt zero-GSDMD-N按照表9体系在37℃酶切4 h后，配制1.5%琼脂糖凝胶，110V，15 min，胶回收目的片段。

表9 酶切反应体系

试剂	含量 ( μL)
		BamH Ⅰ	1 μL
EcoR Ⅰ	2 μL
		Buffer3.1	4 μL
DNA	30 μL
		RNase-free H2O	3 μL
Total	40 L

2)将pEGFP-His片段和pEASY-blunt zero-GSDMD-N片段，按照表10体系在16℃水浴锅中连接过夜。

表 10 连接反应体系

试剂	含量 ( μL)
		T4 DNA 连接酶	2 μL
Buffer	2 μL
		His-pEGFP 片段	5 μL
GSDMD-N片段	11 μL
		Total	20 μL

3)将连接产物转化到Trans1-T1感受态中，并挑选阳性克隆菌落进行按照表7 PCR反应体系进行鉴定。剩余菌液提取质粒，按照表9酶切体系进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒命名为pEGFP-GSDMD-N-His。

5、pEGFP-GSDMD-N-WAP-His、pEGFP-WAP-His构建

1)将鉴定正确的pEGFP-GSDMD-N-His、pEGFP-His质粒与pEASY-blunt zero-WAP质粒，按照表11 在37℃酶切4 h后，配制1.5%琼脂糖凝胶，110V，15 min，胶回收目的片段。

表11 WAP酶切鉴定反应体系

试剂	含量 ( μL)
		Xho Ⅰ	5 μL
EcoRⅠ	5 μL
		Buffer2.1	5 μL
DNA	30 μL
		RNase-free H2O	5 μL
Total	50 L

2) 将pEGFP-WAP片段、pEGFP-GSDMD-N-His片段和pEASY-blunt zero-WAP片段按照表12、表13体系在16℃水浴锅中连接过夜。

表12 连接反应体系

试剂	含量 ( μL)
		T4 DNA 连接酶	1 μL.
Buffer	1 μL
		pEGFP-GSDMD-N-His片段	6 μL
WAP片段	2 μL
		Total	10 μL

表 13 连接反应体系

试剂	含量 ( μL)
		T4 DNA 连接酶	1 μL.
Buffer	1 μL
		pEGFP-His片段	6 μL
WAP片段	2 μL
		Total	10 μL

3）将连接产物转化到Trans1-T1感受态中，并挑选阳性克隆菌落进行按照表7 PCR反应体系进行鉴定。剩余菌液提取质粒，按照表10酶切体系进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒命名为pEGFP-GSDMD-N-WAP-His、pEGFP-WAP-His。结果如图2所示，证明表明，PCR鉴定目的条带大小正确，酶切鉴定结果正确在，质粒构建成功。

实施例2：

GSDMD-N乳腺细胞表达，具体工艺步骤如下：

1、将pEGFP-GSDMD-N-WAP-His、pEGFP-WAP-His质粒电转至减毒沙门菌中

1）SL7207感受态的制备

①从-80℃取出的减毒沙门菌SL7207，在LB平板上划线，置于37℃培养箱培养约16 h-18 h；

②挑取两个单菌落接种至3 mL LB过夜扩大培养，摇床培养过夜；

③次日，按1:100的体积将1 mL活化的菌液加到100 mL LB液体培养基中，37℃，200 r/min，摇床培养至OD₆₀₀=0.4；

④将摇好的100 mL菌液分装至两个50 mL离心管，冰浴1 h。离心机预冷，3500 r/min，10 min，4℃弃上清；

⑤管底细菌用5 mL灭菌，冰浴的二蒸水重悬，补齐至50 mL。3500 r/min，10 min，弃上清；

⑥重复上述步骤；

⑦沉淀用10 mL灭菌，冰浴的10%甘油重悬，3500 r/min，10 min，弃上清；

⑧按照100倍体积浓缩，在50 mL离心管中加入500 μL灭菌，冰浴的10%甘油重悬，将其分装在1.5 mL无菌预冷的离心管中，每管100 μL，冻存于-80℃保存。

2）电转

①准备电转杯：使用前，先用75%酒精浸泡过夜，并超声清洗2 h，100%酒精浸泡过夜，甩干酒精，超净台直立吹干，电转前20 min冻于-80℃备用；

②电转：50 μL SL7207感受态加入1 ug质粒，2.5 KV，6 ms；

③孵育：电转完成后，吸出电转液，加入到500 μLSOC/LB培养基中，37℃，200 r/min，1.5 h；(SOC=SOB+2% 1M 葡萄糖+0.5% 2M Mgcl2 )

④涂板: 加300 μL菌液于具有卡那霉素抗性的LB平板，置于37℃培养箱中培养过夜（约16 h）；

3）电转鉴定

挑选阳性单克隆，扩大培养，并且做菌液PCR鉴定。将鉴定正确的细菌进行保菌，命名为GSDMD-N-ORF及Vector。结果如图3所示，表明PCR鉴定目的条带大小正确。

2、减毒沙门菌感染牛乳腺上皮细胞

1）细胞复苏

2）将冻存的乳腺上皮细胞从液氮中取出，在37℃的水中迅速解冻，转移到盛有7 mL的DMEM培养基中，4℃，1000 r/min.离心10分钟，然后接种在90 mm²中

3）培养三天，细胞覆盖80%左右时用0.5%胰酶消化三分钟左右，用含有血清的培养基终止，4℃，1000 r/min.离心10分钟；

4）细胞计数，按照1×10⁶细胞/孔接种六孔板，培养基为DMEM+10%FBS+1‰双抗；

5）从-80℃冰箱取出冻存菌，按照1:100接种到LB培养基中，在37℃将200 r/min培养至对数期（OD₆₀₀=0.6）左右，7000 r/min 离心3 min，无菌PBS洗三次，并调整适合的浓度；

6）细胞贴壁后，用无菌PBS洗三次，换成不含血清不含双抗的DMEM培养基，按照不同的要求加入不同的细菌；

7）1 h后，弃去原有培养基，用无菌PBS洗三次，加入DMEM+10%FBS+2‰双抗+2‰庆大霉素；

8）按照要求在不同的时间点进行收样；

3、蛋白免疫印迹分析(WB)

1）先配制12%分离胶，室温静置30-45 min后，再配制4% 浓缩胶，室温30-45 min；

表 18 组份及含量

组份	4% 浓缩胶 (5 mL)	12 %分离胶 (10 mL)
			去离子水	3.655 mL	3.4 mL
30% 丙烯酰胺	0.67 mL	4 mL
			1.5M Tris (pH8.8)	---	2.5 mL
1M Tris (pH6.8)	0.625 mL	---
			10% SDS	50 µl	100 µl
10% APS	60 µl	60 µl
			TEMED	6 µl	6 µl

2）将蛋白 marker、蛋白样品、等量的1×SDS上样缓冲液加入凝胶孔中；

3）电压设置为200 V时间 40－45 min；

4）转膜；

①PVDF膜水化：剪适合大小的PVDF膜，在甲醇中水化30 s；双蒸水洗三次；

②转膜：利用湿转法进行转膜，电压为75 V，时间为60 min；

5）封闭

将转膜后的PVDF膜放在5%牛奶中封闭2 h；

6）结合一抗:4℃结合一抗过夜；

7）结合二抗

①一抗结合过夜后，在1×TBST中洗涤4次，每次15 min；

②二抗孵育：室温结合二抗1 h；

8）显色、曝光及洗片：

①二抗结合后将PVDF膜在1×TBST中洗涤4次，每次15 min；

②ECL显色按照1：1配置显色液，在曝光仪中照相；

结果如图4所示，与对照组相比，携带有GSDMD-N-ORF的SL7207侵染12 h后（MOI=100），GSDMD-N表达量相对升高，而侵染24 h GSDMD-N表达量显著升高。

检验例1：

GSDMD-N乳腺表达及对乳腺炎治疗效果评价，具体工艺步骤如下：

1、小鼠金黄色葡萄球菌乳腺炎模型的建立

1）把从-80℃冰箱冻存的金黄色葡萄球菌按照1：100接种到BHI培养基中，在37℃ 200r/min摇床中培养至对数期（OD₆₀₀≈0.9），7000 r/min 离心3 min，并用无菌PBS洗三次，并调整浓度为3.3×10⁷CFU/mL；

2）随机选取分娩3-7 d的母鼠，并用200 uL戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，然后用纸胶带保定在硬纸板上；

3）将小鼠的第四对乳头用75%的酒精进行消毒，在体式显微镜下用镊子轻轻夹起乳头，并用剪刀剪掉乳头尖端，使其暴露出乳头导管口，然后将持有30号平针头的50 uL 微量进样器的针头插入到暴露的乳腺导管内，然后将事先准备好的30 uL 菌液缓慢的注射到乳腺中；

4）注射完毕后，用镊子轻夹乳头，并适当按摩，使菌液充分进入到乳腺导管内，并平放在鼠笼中，防止菌液漏出；

2、乳腺组织的样品的采集和处理

1）首先将需要采集乳腺样品的小鼠脱颈处死，并用75%的酒精对小鼠的皮肤进行消毒。

2）用无菌的解剖剪剪开小鼠腹部的皮肤，暴露出第四对乳腺组织，并且观察其病理变化，无菌取出第四对乳腺，其中一侧做H&E切片，另一侧组织加入一定的无菌的PBS进行研磨，用于组织荷菌和细胞因子的检测；

3、组织石蜡切片

1）将需要做石蜡切片的新鲜组织浸泡在4%的多聚甲醛中固定24 h，然后转移到70%的酒精中，4℃保存；

2）脱水：70%酒精、80%酒精、90%酒精各2 h，95%酒精2 h，100%酒精、100%酒精各2 h；

3）透明：二甲苯I、二甲苯II各10 min；

4）浸蜡：石蜡、、各30 min；

5）组织包埋：用组织包埋机包埋之后，依次经过切片、展片、贴片、烘片、烤片；

4、石蜡切片的H＆E染色

1）脱蜡：二甲苯I、二甲苯II各15 min；

2）水化：梯度乙醇水化，100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5 min，自来水洗涤3次；

3）苏木精染色3 min，自来水洗涤2次；

4）1%盐酸酒精分化5-10 s，自来水洗涤3次；

5）弱氨水1 min，返蓝，自来水洗涤；

6）伊红染色1-5 min，自来水洗涤；

7）梯度脱水：70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇各5 min；

8）透明：二甲苯I、二甲苯II各15 min；

9）中性树胶封片。

5、组织荷菌数测定

1）将无菌的2 mL组织研磨管称重并做好标记；

2）无菌取实验小鼠的第四对乳腺，称重并且计算组织重，按照1：5（w/v）加入无菌PBS和磁珠，在组织匀浆仪中进行研磨；

3）将研磨后的组织匀浆液稀释一定比例之后，均匀涂布于有甲氧西林抗性的BHI平板上；

4）37℃培养过夜，统计各个平板中细菌的数量；

6、重组菌体内抑菌效果评价

1）将实验小鼠随机分成四组，每组5只，200 uL戊巴比妥钠腹腔注射麻醉；

2）USA300+PBS组：按照3.1.2.1的方法将该组小鼠的第四对乳腺导管内注射30 uL 3.3×10⁷CFU/mL的金黄色葡萄球菌，24 h后乳腺内注射50 uL 无菌PBS；NT组：乳腺导管内注射30 uL 无菌PBS，24 h 后乳腺内注射50 uL 的无菌PBS；USA300+Vector组：乳腺导管注射金黄色葡萄球菌24 h后，将50 uL 2×10⁶ CFU/mL的携带Vector的SL7207重组菌乳腺内注射到乳腺分布区；USA300+GSDMD-N-ORF组：乳腺导管注射金黄色葡萄球菌24 h 后，将50 uL 2×10⁶ CFU/mL的携带GSDMD-N-ORF的SL7207重组菌乳腺内注射到乳腺分布区；

3）48 h后无菌采集乳腺组织，并通过肉眼、组织切片、乳腺组织荷菌量、细胞因子的分泌情况，从而对重组菌在体内对金黄色葡萄球菌的抑菌效果进行评价；

结果如图5、6、6.1、7所示，证明：携带GSDMD-N-ORF的减毒沙门菌能够抑制乳腺组织中金黄色葡萄球菌的增殖；组织切片H＆E染色的NT组乳腺结构完整，没有明显的病理变化；USA300+PBS组和USA300+Vector组乳腺组织细胞大量瓦解、乳腺细胞坏死、变性并有大量的炎性细胞浸润；而USA300+GSDMD-N-ORF组的乳腺组织细胞结构有所好转，腺泡结构也较完整，炎性细胞数量减少；GSDMD-N能够降低USA300所引起的乳腺炎性因子释放。

检验例2：

GSDMD-N重组质粒安全性评价，具体工艺步骤如下：

1、CCK8检测细胞存活

1）实验分组：对照组：未感染实验组；实验组：细胞感染实验孔；

2）按照上述方法接种2×10⁴细胞/孔于96孔板，按照上述细菌感染方法感染细胞，感染1 h后，用无菌PBS洗三次，换成DMEM+10%FBS+2‰双坑+2‰庆大霉素培养22 h后，加入20uLCCK8溶液，2 h后在450 nm处测吸光度；

2、MTT检测细胞存活

2）按照上述方法接种2×10⁴细胞/孔于96孔板，按照上述细菌感染方法感染细胞，感染1 h后，用无菌PBS洗三次，换成DMEM+10%FBS+2‰双坑+2‰庆大霉素培养20 h后，加入20uL MTT溶液，4 h后离心并吸出液体，加入DMSO溶解并在490 nm处测吸光度。

结果如图8所示，与NT组相比，携带GSDMD-N-ORF及携带Vector的重组菌侵染牛乳腺上皮细胞24 h后，细胞存活无明显差异，表明牛乳腺上皮细胞表达的GSDMD-N蛋白及重组菌对正常的牛乳腺上皮细胞存活无明显的影响，暗示了该重组细菌对宿主细胞无明显毒副作用，具有一定的安全性；

3、重组菌体内安全性评价

1）将实验小鼠随机分成三组，每组5只，200 uL戊巴比妥钠腹腔注射麻醉；

2）实验组：将摇到对数期的重组菌调整到细菌密度为2×10⁶ CFU/mL，然后乳腺分布区进行乳腺内注射50 uL。对照组：注射等量的PBS；

3）24 h后将实验小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、乳腺进行样品采集和处理，通过肉眼、组织切片、乳腺组织细胞因子分泌情况与正常组进行对比，从而评价重组菌的安全性；

结果如图9.1~图9.4所示，相对于NT组，携带Vector、GSDMD-N-ORF的SL7207重组菌注射到小鼠乳腺中，并不能引起肝脏、脾脏、肾脏、乳腺等部位的明显的病理变化，都可以保持细胞正常的形态结构，并未见变性和坏死、炎性细胞浸润。

序列表

<110> 吉林大学

<120> GSDMD-N基因重组质粒及在乳腺表达的方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 828

<212> DNA

<213> GSDMD-N蛋白(GSDMD-N蛋白)

<400> 1

atgccatcgg cctttgagaa agtggtcaag aatgtgatca aggaggtaag cggcagcaga 60

ggcgatctca ttccggtgga cagcctgcgg aactccacca gcttcaggcc ctactgcctt 120

ctgaacagga aattttcaag ctcaaggttc tggaaacccc gttattcatg tgtcaacctg 180

tcaatcaagg acatcctgga gcccagtgct ccagaaccag aaccggagtg ttttggctcc 240

ttcaaagtct ctgatgtcgt cgatgggaac attcagggca gagtgatgtt gtcaggcatg 300

ggagaaggga aaatttctgg tggggctgca gtgtctgaca gttccagtgc ctccatgaat 360

gtgtgtatac tgcgtgtgac tcagaagacc tgggagacca tgcagcatga aaggcacctt 420

cagcagcctg agaacaaaat cctgcaacag cttcggagtc gtggggatga cctgtttgtg 480

gtgaccgagg tgctgcagac aaaggaggaa gtgcagatca ctgaggtcca cagccaagag 540

ggctcaggcc agtttacgct gcctggagct ttatgcttga agggtgaagg caagggccac 600

caaagccgga agaagatggt gaccattcct gcaggcagca tcctggcatt ccgagtggcc 660

caactgctta ttggctctaa atgggatatc cttctcgtct cagatgagaa acagaggacc 720

tttgagccct cctcaggtga cagaaaagca gtgggccaga ggcaccatgg cctcaatgtg 780

cttgctgcgc tttgttccat cggaaagcag ctcagtctcc tgtcagat 828

Claims

1.一种GSDMD-N基因重组质粒，其核苷酸序列如SEQ no.1所示。

2.如权利要求1所述的一种GSDMD-N基因重组质粒的制备方法，包括以下步骤：

（1）GSDMD-N及相关基因的引物合成；

引物如下：

GSDMD-N-F GAATTCATGCCATCGGCCTTTGAG GSDMD-N-R GGATCCATCTGACAGGAGACTGAGC WAP-F CTCGAGGGCCACAGTGAAGACCT WAP-R GAATTCGGTGTCGGCGGCGG EGFP+His-F GGATCCATGGTGAGCAAGGGCG EGFP+His-R GGCCGCTTAATGATGATGGTGATGATGCTTGTACAGCTCGTCCAT

（2）GSDMD-N及相关基因片段的Pcr扩增；

（3）将各片段连接到克隆载体上构成含有pEGFP-GSDMD-N-WAP-His的重组质粒，Pcr及双酶切电泳图证明重组质粒构建成功。

3.如权利要求1所述的GSDMD-N基因重组质粒在乳腺细胞表达的方法，包括以下步骤：

（1）通过电转将重组质粒转入减毒沙门菌SL7207中；

（2）利用携带重组质粒的减毒沙门菌SL7207侵染牛乳腺细胞；

（3）western blot检测证明GSDMD-N基因重组质粒在乳腺细胞表达成功。

4.如权利要求1所述的GSDMD-N基因重组质粒在乳腺表达的方法，其特征在于：

获得了携带GSDMD-N重组质粒的重组减毒沙门菌，使得重组质粒通过减毒沙门菌介导从而使得GSDMD-N在乳腺表达。

5.如权利要求1所述的GSDMD-N基因重组质粒在治疗由金黄色葡萄球菌感染的奶牛乳腺炎药物的用途。