CN114657210A - 一种基于负载gsdmd蛋白n端肽段的纳米材料及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种基于负载GSDMD蛋白N端肽段的纳米材料及其应用。本发明提供一种载有GSDMD‑N端核苷酸序列的质粒，所述GSDMD‑N端核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明同时提供一种GSDMD‑N‑PDPA纳米材料，所述GSDMD‑N‑PDPA纳米材料的核心是GSDMD‑N质粒，包载材料是纳米载体PDPA。本发明的GSDMD‑N‑PDPA纳米材料兼顾肿瘤杀伤和局部免疫功能增强的作用，制备成本经济，该纳米材料核心是GSDMD‑N质粒，制作后质粒扩增操作简便，制备成本低；包载材料是纳米材料PDPA，制备成本不高。

Description

一种基于负载GSDMD蛋白N端肽段的纳米材料及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种基于负载GSDMD蛋白N端肽段的纳米材料及其应用。
背景技术
肿瘤是21世纪人类最主要的杀手，它是一种由环境因素与遗传因素相互作用的复杂性疾病。恶性肿瘤有很多种，其性质类型各异、累及的组织和器官不同、病期不同、对各种治疗的反应也不同，因此大部分患者需要进行综合治疗。所谓综合治疗就是根据患者的身体状况、肿瘤的病理类型、侵犯范围等情况，综合采用手术、化疗、放疗、免疫治疗、中医中药治疗、介入治疗、微波治疗等手段，以期较大幅度地提高治愈率，并改善患者的生活质量。
免疫治疗是目前的热门疗法之一，它是利用人体内的免疫机制来对抗肿瘤细胞。已经有许多对抗癌症的免疫疗法在研究中。目前较有进展的就是癌症疫苗疗法和单克隆抗体疗法，而免疫细胞疗法则是最近这几年最新发展的治疗技术。此外，由于肿瘤细胞原来也是体内细胞的一种，但因为机体免疫功能低下，导致肿瘤细胞不受免疫防线的杀伤，进而无限增殖。因此，通过免疫增强剂重塑机体免疫屏障，杀伤肿瘤也是一种备受期待的免疫疗法，我们常称之为“固有免疫疗法”。
固有免疫细胞是机体固有免疫(非特异性免疫)的一个重要组成部分，是生物体在长期种系进化过程中形成的一系列免疫效应细胞。其在个体出生时就已具备，可对侵入的病原体迅速应答，产生非特异抗感染免疫作用；亦可参与对体内损伤、衰老或畸变细胞的清除，并参与适应性免疫应答。固有免疫细胞主要有以下几种：1.吞噬细胞：包括单核吞噬细胞、中性粒细胞；2.树突状细胞；3.NK细胞；4.NKT细胞；5.γδT细胞；6.B-1细胞；7.肥大细胞；8.嗜酸性粒细胞；9.嗜碱性粒细胞。目前研究认为，NK细胞增多有利于肿瘤杀伤，树突状细胞的增多可以促进获得性免疫的发生。鉴于固有免疫反应在免疫中的关键作用，利用这些反应为长期、多层次的肿瘤控制开辟了新的可能性。
免疫增强剂是一个新的药物类别，曾用名为免疫促进剂及免疫刺激剂。本类药物能使低下的免疫功能提高，加速诱导免疫应答反应，大多是以肿瘤的非特异性免疫(固有免疫)疗法为目的而开发的。临床上常用的药物依其来源分为五类：1、微生物来源的药物，如卡介苗；2、人或动物免疫系统产物，如胸腺素、转移因子、干扰素、白介素等；3、化学合成药物，如左旋咪唑、聚肌胞苷酸等；4、真菌多糖类，如香菇多糖等；5、中药及其他，如人参、黄芪等中药有效成分；植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A及胎盘多糖等。
免疫增强剂的概念从1980年开始就有，但是随着生物疗法的发展，目前因为他的短板也比较明显，临床上普及率不及化学疗法、放射疗法以及更具有应用潜能的免疫疗法上的T细胞疗法和分子靶向药疗法。对此，主要原因可能在于：1、传统免疫增强剂缺乏靶向性，容易引起全身的免疫促进反应，导致在发挥抗肿瘤作用的同时引起副作用较多；2、传统免疫增强剂作用单一，作用于固有免疫细胞的肿瘤部位趋化外，对肿瘤细胞的作用较少，常需要联合其他抗肿瘤药物进行。对此，一种新的联合固有免疫和肿瘤杀伤的治疗策略及新材料技术是目前的迫切需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于负载GSDMD蛋白N端肽段的纳米材料及其应用。
细胞焦亡(Pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应，在抗击感染中发挥重要作用。细胞焦亡是由gasdermin介导的细胞程序性坏死。当细胞焦亡程序启动后，NOD样受体3(NLRP3)和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的结合体形成炎症小体(Inflammasome)活化具有切割功能的Caspases家族蛋白，对消皮素蛋白(Gasdermins)进行切割。
消皮素蛋白D(GSDMD)是细胞焦亡的主要功能效应蛋白，具有自抑制(Auto-inhibit)作用，当Caspases-1对Gasdermins进行切割，将GSDMD蛋白N-端暴露后，它将与细胞膜上卵磷脂结合，打孔产生焦亡效应，使细胞死亡；同时对IL-1β前体(pro-IL-1β)进行切割，从Gasdermins造成的穿孔上释放成熟的IL-1β，引起局部固有免疫细胞的趋化，增强局部巨噬细胞、树突状细胞以及T细胞等固有免疫细胞浸润。这为肿瘤的固有免疫疗法改进提供了很好的理论基础。
本发明通过直接构建GSDMD-N端质粒，将GSDMD-N直接转染到肿瘤细胞内，成功转染的细胞发生细胞焦亡的死亡方式。但是临床上应用直接质粒递送效果并不好，很多质粒将被肝、肾代谢，无法到达肿瘤区发挥作用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种载有GSDMD-N端核苷酸序列的质粒，所述GSDMD-N端核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明同时提供一种GSDMD-N-PDPA纳米材料，所述GSDMD-N-PDPA纳米材料的核心是GSDMD-N质粒，包载材料是纳米载体PDPA。
纳米高分子材料其具有相容性好、低免疫原性、易于大规模制备等优点，被广泛运用于医学及生物学领域。纳米材料具有增强渗透与滞留(Enhanced permeation andretention，EPR)特性，粒径在10–100nm之间的纳米材料，难以通过健康组织的血管或者被肾脏清除，但是对于功能失调、管壁间隙较大，结构完整性较差的实体肿瘤内血管，纳米材料可以从中释放至肿瘤组织中。因此，使用高分子材料构建新型纳米载体并用于肿瘤局部的递送是纳米医学的基础，也是实体肿瘤生物靶向治疗的前沿技术。进一步发挥纳米递送系统高效、靶向递送，体内清除速率低的优势提高质粒在肿瘤细胞中的递送效果，对于未来肿瘤的精准靶向治疗具有重要的应用前景。
由于肿瘤生长迅速，肿瘤血管往往无法提供充足的必需营养物质来供应肿瘤细胞增殖，肿瘤内部缺氧状态使肿瘤细胞无氧糖酵解产生乳酸，肿瘤细胞内的质子泵促进了酸性分泌物释放至细胞外从而维持酸性环境。并且肿瘤细胞中内涵体(pH 5.0～6.0)和溶酶体(pH 4.0～5.0)均处于酸性环境。
基于肿瘤特殊的微环境及质粒递送的问题，本发明开发弱酸响应的纳米材料包载GSDMD-N质粒用于肿瘤治疗。结果显示，纳米材料递送GSDMD-N质粒，肿瘤明显缩小。同时，使用流式细胞术检测免疫细胞趋化，NK细胞明显增多。
作为本发明所述纳米材料的优选实施方式，所述PDPA为Meo-PEG-b-PDPA。
作为本发明所述纳米材料的优选实施方式，所述Meo-PEG-b-PDPA的制备包括以下步骤：
S1.合成溴代聚乙二醇Meo-PEG-Br；
S2.原子转移自由基聚合法合成Meo-PEG-b-PDPA。
作为本发明所述纳米材料的优选实施方式，所述纳米材料的制备包括以下步骤：
(1)将G0-C14溶液与GSDMD-N质粒溶液混合，再与Meo-PEG-b-PDPA溶液混合；
(2)在搅拌下，将混合物滴加到去离子水中，随后超滤并离心以去除有机溶剂和游离化合物，用去离子水洗涤后得到。
本发明同时提供一种药物组合物，所述药物组合物中含有所述的质粒或所述的纳米材料。
本发明同时提供所述的质粒或所述的纳米材料在制备治疗癌症的药物中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述治疗癌症为肿瘤杀伤和/或增强固有免疫细胞浸润。
本发明还提供所述的质粒或所述的纳米材料在制备固有免疫增强剂中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的GSDMD-N-PDPA纳米材料兼顾肿瘤杀伤和局部免疫功能增强的作用，制备成本经济，该纳米材料核心是GSDMD-N质粒，制作后质粒扩增操作简便，制备成本低；包载材料是纳米材料PDPA，制备成本不高。
附图说明
图1A.GSDMD-N的质粒设计，GSDMD-N端肽段包含在质粒内；B.质粒功能验证，GSDMD-N端转染后细胞死亡，呈圆形，而对照组及GSDMD-全长组细胞未见死亡。
图2A.细胞转染明确，GSDMD-N端表达；B.LDH细胞毒性试验(死亡率验证)，明确GSDMD-N端转染后，细胞死亡率显著升高；C.流式细胞术检测发现转染GSDMD-N后，肿瘤细胞死亡率显著升高。
图3：GSDMD-N促进肿瘤中趋化因子表达。
图4：Meo-PEG-Br的化学结构和核磁共振氢谱。
图5：Meo-PEG-b-PDPA的化学结构和核磁共振氢谱。
图6A.GSDMD-N-PDPA纳米材料直径约79.51nm，符合那里材料大小；B.GSDMD-N-PDPA纳米材料电势为-6.11，具有良好的肿瘤表面吸附效应。
图7：显微电镜观测纳米粒子微观形貌图，比例尺，200nm。
图8：通过Cy-5含量检测纳米材料的体外GSDMD-N质粒的释放效率。
图9：纳米材料转染24小时后，GSDMD-N端成功令转染细胞死亡。
图10：纳米材料在小鼠模型中的生物分布。
图11：药代动力学研究，核靶向纳米材料在体内驻留时间更久。
图12：纳米材料递送GSDMD-N质粒进行肿瘤治疗，肿瘤大小明显缩小。
图13：对各组小鼠进行心，肝，脾，肺，肾进行HE染色，发现各治疗组的重要器官均无损伤。
图14：GSDMD-N-PDPA纳米材料组中天然杀伤细胞(NK)浸润显著增加。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1GSDMD-N端质粒载体设计
针对GSDMD的特征，本发明设计了载有GSDMD-N端序列的质粒载体(图1)，并在载体中加入mcherry的红色荧光标记。通过该载体转染入肿瘤细胞(MDA-231)中，发现带有红色荧光的细胞(转染成功的)全部死亡，证明了该质粒具有细胞毒性，可杀伤肿瘤细胞。其中，GSDMD全长核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，GSDMD-N端核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，GSDMD-N端质粒核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
我们认为GSDMD-N具有肿瘤普遍的杀伤作用，对此我们在口腔肿瘤细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、恶性成纤维细胞等细胞中进行验证(图2)。结果再次证明GSDMD-N端载体转染成功后可以大量杀伤肿瘤细胞。
实施例2GSDMD-N端质粒载体具有免疫细胞趋化潜能
GSDMD诱发的细胞焦亡可以引起肿瘤中免疫细胞的趋化。因此，我们有理由推测GSDMD-N端质粒可以促进肿瘤中的免疫浸润。对口腔癌细胞株(CAL-27，HSC-6)和乳腺癌细胞(MDA-231和MCF-7)进行质粒转染和细胞内趋化因子的PCR检测(图3)。结果明确转染GSDMD-N端质粒后，肿瘤细胞内的大量固有免疫细胞趋化因子显著升高。
上述问题的阐明我们确认GSDMD-N具有肿瘤杀伤功能及潜在的固有免疫趋化功能。通过GSDMD-N质粒构建新的免疫增强剂和肿瘤药物，我们利用纳米材料进行包装。对此，我们设计Meo-PEG-b-PDPA的弱酸响应的纳米材料。
实施例3纳米载体Meo-PEG-b-PDPA的合成
①合成溴代聚乙二醇(Meo-PEG-Br)。
将聚乙二醇(Meo-PEG-OH)和三乙胺溶于二氯甲烷中。在冰盐浴中，滴加溶于α-溴异丁酰溴。在室温下搅拌反应24小时后，分别用浓度为1mol/L的氢氧化钠和盐酸水溶液洗涤反应液，最后用去离子洗涤。收集有机相，用无水硫酸镁干燥后，浓缩溶液，加入冷乙醚沉淀出产物。反复沉淀3次后，真空干燥后收集白色粉末状产物。图4是Meo-PEG-Br的化学结构和核磁共振氢谱。
②原子转移自由基聚合法合成Meo-PEG-b-PDPA。
将2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(DPA-MA，2.6g，12mmol)、Meo-PEG-Br(0.75g，0.15mmol)和N,N,N',N',N'-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA，31.5μL，0.15mmol)加入到聚合管中。然后加入3mL二甲基甲酰胺和3mL 2-异丙醇溶解单体和引发剂。冷冻-解冻三次除去氧气后，在氮气氛下加入CuBr(21.6mg，0.15mmol)，并将聚合管真空密封。在40℃聚合24小时后，加入四氢呋喃稀释产物，然后使用中性三氧化二铝柱除去催化剂CuBr。收集滤液，将滤液转移至透析管中(截留分子量为5000～8000)，在去离子水继续透析3天，在真空中冷冻干燥产品。图5是Meo-PEG-b-PDPA的化学结构和核磁共振氢谱。
实施例4GSDMD-N-PDPA纳米药物的制备
按照上述方法合成的两亲性聚合物Meo-PEG-b-PDPA，并将其溶解在N,N'-二甲基甲酰胺(N,N′-dimethylformamide DMF)中制备浓度为20mg/mL的溶液。
GSDMD-N质粒提取，制备成1000ug/uL浓度的质粒水溶液。
G0-C14溶解在DMF中，形成浓度为5mg/mL的溶液。
制备开始，取50μL的G0-C14与10μL的质粒溶液进行混合，再与100μLMeo-PEG-b-PDPA溶液混合，形成纳米粒子。
在搅拌器(1000rpm)下，将混合物缓慢滴加到6mL的去离子水(ddH2O)中，随后将纳米材料分散体转移到超滤装置(EMD Millipore，MWCO 100kDa)并离心以去除有机溶剂和游离化合物。用6mL体积的去离子水洗涤两次后，将所得纳米颗粒用去离子水定容到200μL，纳米材料制备完成。
实施例5GSDMD-N的纳米材料的性能检测
制备完成后，首先通过一系列检测，以明确纳米材料符合设计预期，其中包括：通过动态光散射(DLS，Malvern Zetasizer)确定纳米粒子的尺寸和电势；通过透射电子显微镜(TEM)上观察纳米材料的形态；通过多功能酶标仪(TECAN SPARK 10M)测量荧光强度，计算载体对GSDMD-N质粒的封装效率(EE％＝EE％＝(FINP/FIStandard)×100)，选取EE％大于80％的NPs进行进一步实验。
①粒径、电势与形貌
通过动态光散射(DLS，Malvern Zetasizer)确定纳米粒子的尺寸和电势。载有GSDMD-N的Meo-PEG-b-PDPA的纳米粒子的尺寸分布(图6A)和电势(图6B)。79.51nm的大小和-6.11mV的电势，表明合成的GSDMD-N-PDPA材料具有良好的纳米材料特性。
使用Tecnai G20 S-TWIN型显微电镜(TEM)观测纳米粒子的形貌(图7)，显示纳米材料圆球状，大小在70-90nm之间，与DLS测量得到的纳米材料粒径相符。
②体外GSDMD-N质粒的释放检测
GSDMD-N是质粒，PDPA材料是弱酸响应的纳米材料。因此，需要检测PDPA在弱酸环境下对GSDMD质粒的释放，以明确纳米材料在进入细胞内后，在胞内弱酸环境下能够释放GSDMD-N质粒，完成质粒的递送与转染。
将Cy5标记的GSDMD-N质粒按照上述步骤制备好纳米材料。随后将纳米颗粒分散在1mL PBS(pH 7.4)中，然后转移到Float-a-lyzer G2透析装置(MWCO100kDa，Spectrum)中，将该装置在37℃、pH 7.4或6.0的PBS缓冲液中。并在不同的时间间隔内，取出10μL纳米材料溶液并与20倍DMSO混合。使用酶标仪测定Cy5的荧光强度，通过荧光强度检测纳米材料中质粒的释放情况(图8)。结果显示在弱酸环境下，GSDMD-N可以很好的释放。
③激光共聚焦显微镜观察纳米材料载GSMD-N功效
将乳腺癌细胞(MDA-231)接种在共聚焦皿中，加入2mL含有10％FBS的DMEM培养基(pH 7.4)中培养24小时，待细胞贴壁后，用2mL新鲜无血清DMEM培养基替换原培养基后，以1.7ug的GSDMD-N质粒浓度加入PDPA纳米材料包载的纳米材料，细胞孵育24小时后进行激光共聚焦显微镜观测。发现MDA-231细胞带有红色荧光，对于质粒空载对照组，红色荧光和细胞共存，标志空载组也成功转染，无细胞毒性；而GSMD-N-PDPA组细胞红色荧光与死亡细胞共定位，说明通过纳米材料递送GSDMD-N质粒并完成转染后，肿瘤细胞死亡(图9，从两个层面明确GSDMD转染成功的MDA-231细胞死亡，而未转染的细胞存活)。说明纳米材料递送GSDMD-N质粒是可行的。
④生物分布与药代动力学
为更进一步明确GSDMD-N-PDPA纳米材料在体内的分布，我们构建裸鼠荷瘤模型。通过鼠尾静脉注射CY5标记的GSDMD-N-PDPA材料，在注射后24小时，使用IVIS体内成像系统对小鼠进行CY5的成像观察。结果(图10)发现纳米材料在小鼠瘤体中显著富集。然后进行小鼠解剖，取小鼠脏器(心、肝、脾、肺、肾)、肌肉和肿瘤进行CY5的成像观察，同样发现纳米材料组的瘤体中存在较强的CY5的荧光，证明GSDMD-N质粒成功导入到肿瘤中。
同时，进行小鼠血样中GSDMD-N-CY5纳米材料的药代动力学研究。使用健康雌性裸鼠，随机分为两组，每组5只，并以每只小鼠10ug GSDMD-N质粒的剂量静脉注射未被包载纳米材料的裸cy5-GSDMD-N质粒(Naked组)或已包载cy5-GSDMD-N的纳米材料(Nano组)。在预定的时间间隔，使用含有肝素的管抽取眼眶静脉血(20μL)，按压伤口几秒钟以止血。20μL血样与200μL的DMSO混合，通过酶标仪测定血液中CY5的荧光强度，以反映材料的药代动力学特性。结果如图10所示，纳米材料在小鼠体内驻留时间更长，缓慢代谢，有利于材料在肿瘤中的靶向调控。
上述检测证明了本发明的核靶向纳米粒子具有长循环特征，可以在体内递送GSDMD-N质粒到肿瘤中进行转染，并发挥抗肿瘤与局部免疫刺激的作用，有希望在临床中使用。
实施例6GSDMD-N的纳米材料的肿瘤杀伤与免疫功能检测
本发明的关键之处在于设计并构建的GSDMD-N-PDPA纳米材料兼顾肿瘤杀伤和局部免疫功能增强的作用。
为了验证我们的设计，通过SCC-7细胞在C57小鼠中构建口腔癌的小鼠荷瘤模型，在瘤体达到100mm3时，通过尾静脉给予GSDMD-N-PDPA纳米材料，并设计对照组。隔天进行尾静脉注射200uL纳米材料，在注射4次后继续观察18天，发现GSDMD-N-PDPA纳米材料组的治疗效果好，肿瘤增殖显著受到抑制。并对各组小鼠进行心，肝，脾，肺，肾进行HE染色，发现各治疗组的重要器官均无损伤。
随后，我们提取小部分肿瘤组织，分离成单细胞悬液后进行流式细胞术检测肿瘤组织中免疫细胞浸润情况。结果发现GSDMD-N-PDPA纳米材料组中天然杀伤细胞(NK)浸润显著增加，证明GSDMD-N-PDPA纳米材料的固有免疫增强作用。
综上所述，我们的数据表明使用GSDMD-N-PDPA纳米材料进行肿瘤治疗，具有肿瘤杀伤和免疫增强剂作用，具有良好的肿瘤治疗应用前景。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学孙逸仙纪念医院
<120> 一种基于负载GSDMD蛋白N端肽段的纳米材料及其应用
<130> 2022.03.03
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggggtcgg cctttgagcg ggtagtccgg agagtggtcc aggagctgga ccatggtggg 60
gagttcatcc ctgtgaccag cctgcagagc tccactggct tccagcccta ctgcctggtg 120
gttaggaagc cctcaagctc atggttctgg aaaccccgtt ataagtgtgt caacctgtct 180
atcaaggaca tcctggagcc ggatgccgcg gaaccagacg tgcagcgtgg caggagcttc 240
cacttctacg atgccatgga tgggcagata cagggcagcg tggagctggc agccccagga 300
caggcaaaga tcgcaggcgg ggccgctgtg tctgacagct ccagcacctc aatgaatgtg 360
tactcgctga gtgtggaccc taacacctgg cagactctgc tccatgagag gcacctgcgg 420
cagccagaac acaaagtcct gcagcagctg cgcagccgcg gggacaacgt gtacgtggtg 480
actgaggtgc tgcagacaca gaaggaggtg gaagtcacgc gcacccacaa gcgggagggc 540
tcgggccggt tttccctgcc cggagccacg tgcttgcagg gtgagggcca gggccatctg 600
agccagaaga agacggtcac catcccctca ggcagcaccc tcgcattccg ggtggcccag 660
ctggttattg actctgactt ggacgtcctt ctcttcccgg ataagaagca gaggaccttc 720
cagccacccg cgacaggcca caagcgttcc acgagcgaag gcgcctggcc acagctgccc 780
tctggcctct ccatgatgag gtgcctccac aacttcctga cagatggggt ccctgcggag 840
ggggcgttca ctgaagactt ccagggccta cgggcagagg tggagaccat ctccaaggaa 900
ctggagcttt tggacagaga gctgtgtcag ctgctgctgg agggcctgga gggggtgctg 960
cgggaccagc tggccctgcg agccttggag gaggcgctgg agcagggcca gagccttggg 1020
ccagtggagc ccctggacgg tccagcaggt gctgtcctgg agtgcctggt gttgtcctcc 1080
ggaatgctgg tgccggaact cgctatccct gttgtctacc tgctgggggc actgaccatg 1140
ctgagtgaaa cgcagcacaa gctgctggcg gaggcgctgg agtcgcagac cctgttgggg 1200
ccgctcgagc tggtgggcag cctcttggag cagagtgccc cgtggcagga gcgcagcacc 1260
atgtccctgc cccccgggct cctggggaac agctggggcg aaggagcacc ggcctgggtc 1320
ttgctggacg agtgtggcct agagctgggg gaggacactc cccacgtgtg ctgggagccg 1380
caggcccagg gccgcatgtg tgcactctac gcctccctgg cactgctatc aggactgagc 1440
caggagcccc acacg 1455
<210> 2
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggggtcgg cctttgagcg ggtagtccgg agagtggtcc aggagctgga ccatggtggg 60
gagttcatcc ctgtgaccag cctgcagagc tccactggct tccagcccta ctgcctggtg 120
gttaggaagc cctcaagctc atggttctgg aaaccccgtt ataagtgtgt caacctgtct 180
atcaaggaca tcctggagcc ggatgccgcg gaaccagacg tgcagcgtgg caggagcttc 240
cacttctacg atgccatgga tgggcagata cagggcagcg tggagctggc agccccagga 300
caggcaaaga tcgcaggcgg ggccgctgtg tctgacagct ccagcacctc aatgaatgtg 360
tactcgctga gtgtggaccc taacacctgg cagactctgc tccatgagag gcacctgcgg 420
cagccagaac acaaagtcct gcagcagctg cgcagccgcg gggacaacgt gtacgtggtg 480
actgaggtgc tgcagacaca gaaggaggtg gaagtcacgc gcacccacaa gcgggagggc 540
tcgggccggt tttccctgcc cggagccacg tgcttgcagg gtgagggcca gggccatctg 600
agccagaaga agacggtcac catcccctca ggcagcaccc tcgcattccg ggtggcccag 660
ctggttattg actctgactt ggacgtcctt ctcttcccgg ataagaagca gaggaccttc 720
cagccacccg cgacaggcca caagcgttcc acgagcgaag gcgcctggcc acagctgccc 780
tctggcctct ccatgatgag gtgcctccac aacttcctga cagat 825
<210> 3
<211> 6153
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 540
ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gaggataaca tggccatcat caaggagttc 600
atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc acgagttcga gatcgagggc 660
gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt gaccaagggt 720
ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt tcatgtacgg ctccaaggcc 780
tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc tgtccttccc cgagggcttc 840
aattgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac ccaggactcc 900
tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc gcggcaccaa cttcccctcc 960
gacggccccg taatgcagtg tcgtaccatg ggctgggagg cctccactga gcggatgtac 1020
cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc tgaagctgaa ggacggcggc 1080
cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca gctgcccggc 1140
gcctacaacg tcgacatcaa gttggacatc ctttcccaca acgaggacta caccatcgtg 1200
gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg gcatggacga gctgtacaag 1260
tccggactca gatctcgagc tcaagcttcg aattcgatgg ggtcggcctt tgagcgggta 1320
gtccggagag tggtccagga gctggaccat ggtggggagt tcatccctgt gaccagcctg 1380
cagagctcca ctggcttcca gccctactgc ctggtggtta ggaagccctc aagctcatgg 1440
ttctggaaac cccgttataa gtgtgtcaac ctgtctatca aggacatcct ggagccggat 1500
gccgcggaac cagacgtgca gcgtggcagg agcttccact tctacgatgc catggatggg 1560
cagatacagg gcagcgtgga gctggcagcc ccaggacagg caaagatcgc aggcggggcc 1620
gctgtgtctg acagctccag cacctcaatg aatgtgtact cgctgagtgt ggaccctaac 1680
acctggcaga ctctgctcca tgagaggcac ctgcggcagc cagaacacaa agtcctgcag 1740
cagctgcgca gccgcgggga caacgtgtac gtggtgactg aggtgctgca gacacagaag 1800
gaggtggaag tcacgcgcac ccacaagcgg gagggctcgg gccggttttc cctgcccgga 1860
gccacgtgct tgcagggtga gggccagggc catctgagcc agaagaagac ggtcaccatc 1920
ccctcaggca gcaccctcgc attccgggtg gcccagctgg ttattgactc tgacttggac 1980
gtccttctct tcccggataa gaagcagagg accttccagc cacccgcgac aggccacaag 2040
cgttccacga gcgaaggcgc ctggccacag ctgccctctg gcctctccat gatgaggtgc 2100
ctccacaact tcctgacaga tggggtccct gcggaggggg cgttcactga agacttccag 2160
ggcctacggg cagaggtgga gaccatctcc aaggaactgg agcttttgga cagagagctg 2220
tgtcagctgc tgctggaggg cctggagggg gtgctgcggg accagctggc cctgcgagcc 2280
ttggaggagg cgctggagca gggccagagc cttgggccag tggagcccct ggacggtcca 2340
gcaggtgctg tcctggagtg cctggtgttg tcctccggaa tgctggtgcc ggaactcgct 2400
atccctgttg tctacctgct gggggcactg accatgctga gtgaaacgca gcacaagctg 2460
ctggcggagg cgctggagtc gcagaccctg ttggggccgc tcgagctggt gggcagcctc 2520
ttggagcaga gtgccccgtg gcaggagcgc agcaccatgt ccctgccccc cgggctcctg 2580
gggaacagct ggggcgaagg agcaccggcc tgggtcttgc tggacgagtg tggcctagag 2640
ctgggggagg acactcccca cgtgtgctgg gagccgcagg cccagggccg catgtgtgca 2700
ctctacgcct ccctggcact gctatcagga ctgagccagg agccccacac gggatccacc 2760
ggatctagat aactgatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta 2820
aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt 2880
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 2940
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 3000
taacgcgtaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat 3060
cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata 3120
gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt 3180
ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc 3240
atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa 3300
agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg 3360
gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt 3420
aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcaggtg gcacttttcg 3480
gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 3540
gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtcctga 3600
ggcggaaaga accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc 3660
ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag 3720
tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 3780
atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct 3840
ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct 3900
gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaagatcga 3960
tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 4020
tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 4080
ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 4140
cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 4200
cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 4260
gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 4320
gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 4380
cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 4440
tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 4500
cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 4560
ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 4620
gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 4680
gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 4740
gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc 4800
gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc 4860
ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat gatcctccag 4920
cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccctaggg ggaggctaac tgaaacacgg 4980
aaggagacaa taccggaagg aacccgcgct atgacggcaa taaaaagaca gaataaaacg 5040
cacggtgttg ggtcgtttgt tcataaacgc ggggttcggt cccagggctg gcactctgtc 5100
gataccccac cgagacccca ttggggccaa tacgcccgcg tttcttcctt ttccccaccc 5160
caccccccaa gttcgggtga aggcccaggg ctcgcagcca acgtcggggc ggcaggccct 5220
gccatagcct caggttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 5280
aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 5340
ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 5400
ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 5460
tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 5520
cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 5580
gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 5640
gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 5700
tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 5760
ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 5820
gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 5880
ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 5940
tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 6000
ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 6060
gattctgtgg ataaccgtat taccgccatg cattagttat taatagtaat caattacggg 6120
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccg 6153

Claims (9)

1.一种载有GSDMD-N端核苷酸序列的质粒，其特征在于，所述GSDMD-N端核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种GSDMD-N-PDPA纳米材料，其特征在于，所述GSDMD-N-PDPA纳米材料的核心是GSDMD-N质粒，包载材料是纳米载体PDPA。
3.根据权利要求2所述的纳米材料，其特征在于，所述PDPA为Meo-PEG-b-PDPA。
4.根据权利要求3所述的纳米材料，其特征在于，所述Meo-PEG-b-PDPA的制备包括以下步骤：
S1.合成溴代聚乙二醇Meo-PEG-Br；
S2.原子转移自由基聚合法合成Meo-PEG-b-PDPA。
5.根据权利要求3所述的纳米材料，其特征在于，所述纳米材料的制备包括以下步骤：
(1)将G0-C14溶液与GSDMD-N质粒溶液混合，再与Meo-PEG-b-PDPA溶液混合；
(2)在搅拌下，将混合物滴加到去离子水中，随后超滤并离心以去除有机溶剂和游离化合物，用去离子水洗涤后得到。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有权利要求1所述的质粒或权利要求1-5任一所述的纳米材料。
7.权利要求1所述的质粒或权利要求1-5任一所述的纳米材料在制备治疗癌症的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述治疗癌症为肿瘤杀伤和/或增强固有免疫细胞浸润。
9.权利要求1所述的质粒或权利要求1-5任一所述的纳米材料在制备固有免疫增强剂中的应用。
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