CN102286488A - 一种转人类肿瘤抑制基因绿色荧光蛋白载体的培植方法 - Google Patents

Abstract

一种转人类肿瘤抑制基因绿色荧光蛋白载体的培植方法，在GENBANK上参照人抗癌基因序列设计引物，采集肺癌早期病人外周血提取总RNA，采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增P53片段，将该基因片段定向克隆到pMD18-T载体上面，构建出pMD18-P53重组质粒，通过PCR扩增、酶切和测序的方法对重组质粒进行鉴定，对pMD18-P53进行酶切鉴定提取P53目的基因定向的克隆到pEGFP-N1真核表达载体上，构建出pEGFP-N1-P53表达载体。本发明的有益效果是：利用安全稳定、复制力强、表达率高、易于检测的真核表达载体pEGFP-N1作为人类抗癌基因的转运载体，从而构建安全稳定、易于检测、安全可靠的的真核表达载体pEGFP-N1-P53，从而用于预防和治疗癌症。

Description

一种转人类肿瘤抑制基因绿色荧光蛋白载体的培植方法

技术领域

本发明涉及一种载体的培植方法，具体的说是一种转人类肿瘤抑制基因绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53的培植方法。

背景技术

随着人类生活水平的日益提高，大气、水污染严重，农药残留等间接的影响人类的健康，现在癌症是公认的致命杀手之一。根据国际癌症研究中心(IARC)报告,全球2002年癌症新发病例为1090万例，死亡病例为670万例，现患病例为2460万例。癌症发病人数以年均3%-5%的速度递增，发病及死亡人数与10年前相比分别增长了24.7%和19.2%。预计到2020年全球将有2000万新发病例，死亡病例将达1200万例。对于癌症的治疗仍然是世界性难题，单一地手术治疗容易造成病灶的转移，而放化疗带给患者巨大痛苦的同时会抑制骨髓，引起全血细胞减少；红细胞减少引起贫血、白细胞减少造成感染、血小板减少引起出血，任何一项发生都可能危及生命。现代医学尝试采用基因疗法预防和治疗癌症，然而对于转基因仍存在很多难以克服的理论和技术问题，载体在动物体内难以表达、安全性较低、复制力较弱、难于检测等缺点。

发明内容

本发明的目的在于解决上述问题存在的不足，以安全稳定、复制能力强、表达效率高、易于检测的真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1作为人类肿瘤抑制基因的转运载体，从而构建安全稳定、以表达的重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53。

本发明采用的技术方案是：一种转人类肿瘤抑制基因绿色荧光蛋白载体的培植方法，步骤如下：

步骤一、设计引物，按照基因库中人类肿瘤抑制基因序列，用生物学软件primer5.0设计引物；

步骤二、选择肺癌早期病人外周血；

步骤三、提取人外周血总RNA和人类肿瘤抑制基因：

1）从人外周血中提取的总RNA，以总RNA为模板，利用逆转录RCR的方法提取人类肿瘤抑制基因；

逆转录PCR体系：在0.5mL离心管A中加入配制的25ml的逆转录PCR缓冲液，2ml的人外周血总RNA，5μL的5倍聚合酶链式反应缓冲液，浓度为25mM的氯化镁离子2μL，1μL的三磷酸脱氧核糖核苷deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP混合液，1μL的核糖核酸酶抑制剂RNase Inhibitor，1μL的禽骨髓母细胞增多性病毒反转录酶Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase，AMV，1μL的优化的禽骨髓母细胞增多性病毒Avian Myeloblastosis Virus optimized，上游引物、下游引物各2μL，补加RNA 去离子水至总体积为50μL，混匀，表面添加一层石蜡油，形成逆转录RT-PCR反应液，备用；

反应程序为：

（1）互补DNA  complementary DNA，cDNA的合成温度为40℃，合成时间为40分钟；

（2）逆转录PCR扩增：PCR扩增共30个循环，前5个循环，94℃预变性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸90秒；后25个循环， 94℃变性30秒；68℃退火30秒；72℃延伸90秒；

（3）延伸：72℃再次延伸10分钟；

（4）形成逆转录PCR产物；

2）对逆转录PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行结果鉴定，备用；

步骤四、利用常规PCR的方法制备人类肿瘤抑制基因：

利用PCR反应制备出人类肿瘤抑制基因，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳进行结果鉴定，得到人类肿瘤抑制基因时，备用；

步骤五、人类肿瘤抑制基因的回收与纯化：对检测过的人类肿瘤抑制基因利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化，备用；

步骤六、感受态细胞CaCl₂悬液的制备方法；

步骤七、转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53的构建：

1）利用pMD18-T载体试剂盒对人类肿瘤抑制基因与高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体pMD18-T载体的连接，连接反应体系：在0.2mL的离心管A中加入4.5μL的人类肿瘤抑制基因，0.5μL的高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体pMD18-T载体，5μL的T4 DNA连接酶，共10μL体系，将三种溶液混合后，置于离心机内，500转/分钟，离心15秒，后置于16°C干式恒温仪内，连接12小时，形成连接产物Ⅰ；

2）将连接产物Ⅰ置于4°C条件下保存，备用；

3）连接产物转化：

（1）取200μL感受态细胞悬液，放入0.5mL离心管B内，后将0.5mL离心管A置于 0℃的冰水混合物中，时间为10分钟，取出，形成感受态细胞悬液Ⅰ；

（2）在0.5mL离心管B中加入10μL的连接产物Ⅰ，混匀，0℃的冰水混合物中放置30分钟，形成混合液Ⅴ；

（3）将含有混合液Ⅴ的0.5mL离心管B，放入42℃的水浴锅中热激90秒后，0℃的冰水混合物中放置10分钟，形成混合液Ⅵ；

（4）在含有400μL LB液体培养基的1.5ml离心管A中加入混合液Ⅵ，混匀，37℃条件下培养1小时，形成混合菌液Ⅲ；

（5）将含有混合菌液Ⅲ的1.5ml离心管A放入离心机内，2000转/分钟，离心30秒，倒掉澄清液体，形成沉淀物Ⅳ，将其涂抹在含有卡那霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-Gal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG的LB固体培养基中，在37℃条件，培养12个小时，形成抗生素LB固体培养基；

4）转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53质粒提取：

（1）在抗生素LB固体培养基中挑选白色单一菌落接种于50mL的含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，培养16小时，备用，形成含有卡那霉素LB液体培养液A；

（2）取1mL的卡那霉素LB液体培养液A移至1.5mL的离心管B中，放入离心机内，8000转/分钟，离心5分钟，弃去上层澄清液体；

（3）重复步骤（2）一次，形成菌体Ⅰ；

（4）在含有菌体Ⅰ的1.5mL离心管B中加入100μL溶液Ⅰ，悬浮，形成悬浮菌液Ⅰ；

（5）在含有悬浮菌液Ⅰ的1.5mL离心管B中加入200μL新鲜配制的溶液Ⅱ，混匀，0℃的冰水混合物中静置5分钟，形成悬浮菌液Ⅱ；

（6）在含有悬浮菌液Ⅱ的1.5mL离心管B中加入150μL溶液Ⅲ，混匀，0℃的冰水混合物中静置10分钟，12000 转/分钟，离心10分钟，形成悬浮菌液Ⅲ；

（7）取悬浮菌液Ⅲ500ul移至1.5mL的离心管C中，加入等体积的异丙醇，21℃条件下静置10分钟，放入离心机内，12000转/分钟，离心15分钟，弃去澄清液体，形成菌体Ⅱ；

（8）在含有菌体Ⅱ的1.5离心管C中加入200μL的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸，TE使菌体Ⅱ溶解，后加入50μL的7.5mol/L醋酸铵，混匀，0℃的冰水混合物中静置10分钟，12000转/分钟，离心15分钟；

（9）取步骤（8）中的澄清液体250μL的，转移至1.5mL离心管D中，加入250μL异丙醇和500μL的无水乙醇，21℃条件下，静置30分钟，放入离心机内，12000 转/分钟，离心10分钟，形成沉淀物Ⅴ；

（10）用75%乙醇对沉淀物Ⅴ洗涤三次，风干，加入50μL的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸Tris-Hcl-EDTA，TE，pH为8.0溶液使沉淀物Ⅴ溶解，形成混合液Ⅶ；

6）对混合液Ⅶ进行琼脂糖凝胶电泳结果鉴定，备用；

步骤八、转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体pMD18-T-P53的PCR鉴定：

1）PCR体系：在0.5 mL的离心管C中加入5μL的10×PCR缓冲液，1μL的三磷酸脱氧核糖核苷deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP混合液，3μL的氯化镁离子浓度为25mM，2μL的质粒模板，上游、下游引物各1μL，水生栖热菌Thermusaquaticus，Taq DNA聚合酶0.5μL，余量为去离子水，形成PCR反应液Ⅱ，备用；

2）PCR程序：将PCR反应液Ⅱ放入PCR仪内，PCR扩增共30个循环，前5个循环：94℃预变性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸90秒；后25个循环：94℃预变性30秒、68℃退火30秒、72℃延伸90秒；72℃再次延伸10分钟，形成PCR产物Ⅱ；

3）对PCR产物Ⅱ采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53，备用；

步骤九、重组转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53的酶切鉴定：

1）酶切消化体系：在0.2 mL的离心管B加入5μL的转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53，2μL的 2×Buffer K，0.2μL的牛血清白蛋白，BSA，0.5μL的Hind Ⅲ，0.5μL的BamHⅠ，加入无菌的去离子水至总体积20μL，37℃反应4小时，形成酶切产物Ⅰ；

2）对酶切产物Ⅰ进行琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，得到酶切后的转人类肿瘤抑制基因，P53和高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T，备用；

步骤十、人类肿瘤抑制基因，P53和高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T的测序鉴定：将人类肿瘤抑制基因，P53和高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T送至上海生物工程有限公司进行测序；测序完成后利用基因库中的局部相似性基本查询工具Basic Local Alignment Search Tool，BLAST软件进行碱基序列比对、同源性分析；

步骤十一：重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53重组质粒的构建：

1）质粒的酶切：真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的酶切

（1）酶切体系：在0.2mL的离心管C中加入5μL的增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1质粒，2μL的2×Buffer K，0.2μL的牛血清白蛋白，BSA，HindⅢ 0.5μL，BamHⅠ0.5μL，补加灭菌去离子水至总体积为20μL，37℃，消化4小时，形成酶切产物Ⅱ；

（2）对酶切产物Ⅱ进行琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，得到含有两端各酶切位点中3个碱基和1182个碱基载体的共1188个碱基的真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1，备用；

2）对人类肿瘤抑制基因，P53质粒的酶切产物利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化；

3）对真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，对pEGFP-N1的酶切产物Ⅱ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化；

步骤十二、人类肿瘤抑制基因和增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的两种酶切产物Ⅱ的连接，连接反应体系：在新的0.2mL离心管D中加入10μL的人类肿瘤抑制基因，5μL的增强型绿色荧光蛋白载体pEGFP-N1，2μL的T4 DNA连接酶缓冲液，1μL的T4 DNA连接酶，2μL的灭菌去离子水，混匀，于16℃条件下连接12小时，形成重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体；

步骤十三、重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53的质粒转化与提取：

1）质粒转化：

（1）取200μL感受态细胞悬液，放入0.2mL离心管E内，将其置于 0℃的冰水混合物中，时间为10分钟，后将0.2mL离心管E取出，形成感受态细胞悬液A；

（2）在含有感受态细胞悬液A的0.2mL离心管E中加入10μL的重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53溶液，混匀，0℃的冰水混合物中放置30分钟，形成混合液ⅳ；

（3）将0.2mL离心管E放入42℃的水浴锅中热激90秒后，在0℃的冰水混合物中放置10分钟，形成混合液ⅴ；

（4）将混合液ⅴ移至1.5mL的离心管D中，后加入400μL的LB液体培养基，混匀，37℃条件下培养1小时，形成混合菌液Ⅳ；

（5）将含有混合菌液Ⅳ的1.5mL离心管D放入离心机内，2000转/分钟，离心30秒，倒掉澄清液体，形成沉淀物Ⅵ，将沉淀物Ⅵ涂抹在含有卡那霉素的LB固体培养基中，在37℃条件，培养12个小时，形成含有混合菌液Ⅳ的抗生素LB固体培养基；

2）质粒提取

（1）挑取含有混合菌液Ⅳ的抗生素LB固体培养基上的单菌落，接种于50mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，振荡培养12小时，形成卡那霉素LB液体培养液B； 

（2）将1mL卡那霉素LB液体培养液B移入1.5mL的离心管E中，放入离心机内，8000转/分钟，离心5分钟，弃去上层澄清液体；

（3）重复步骤2一次，收集菌体Ⅱ； 

（4）在含有菌体Ⅱ的1.5mL离心管E中加入100μL溶液Ⅰ，悬浮，形成悬浮菌液Ⅴ；

（5）在含有悬浮菌液Ⅴ的1.5mL离心管E中加入200μL新鲜配制的溶液Ⅱ，混匀，0℃的冰水混合物中静置5分钟，形成悬浮菌液Ⅵ；

（6）在含有悬浮菌液Ⅵ的1.5mL离心管E中加入150μL溶液Ⅲ，混匀，0℃的冰水混合物中静置10分钟，放入离心机内，12000 转/分钟，离心10分钟，形成悬浮菌液Ⅶ；

（7）取悬浮菌液Ⅶ500uL移至1.5mL的离心管F中，加入等体积的异丙醇，21℃条件下静置10分钟，放入离心机，12000转/分钟，离心15分钟，弃去澄清液体，形成菌体Ⅲ； 

（8）将含有菌体Ⅲ的1.5mL离心管F中加入200μL的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸（Tris-Hcl-EDTA，TE）使菌体Ⅲ溶解，后加入50μL的7.5mol/L醋酸铵，混匀，0℃的冰水混合物中静置10分钟，放入离心机，12000转/分钟，离心15分钟；

（9）取步骤（8）中的澄清液体250μL，转至1.5mL的离心管G中，加入250μL异丙醇和500μL无水乙醇，21℃条件下静置30分钟，放入离心机，12000 转/分钟，离心10分钟，形成沉淀物Ⅶ；

（10）用75%乙醇对沉淀物Ⅶ洗涤三次，风干加入50μL的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸，Tris-Hcl-EDTA，TE，pH为8.0溶液使沉淀物Ⅶ溶解，备用；

（11）对稀释后的沉淀物Ⅶ溶液进行琼脂糖凝胶电泳结果鉴定，得到含有两个酶切位点6个碱基、上下游引物两端各3个保护碱基和1182个碱基载体共1200个碱基的重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53质粒；

步骤十四、重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53进行酶切鉴定：酶切体系为：在一个新的0.2ml的离心管F中加入10.0μL的转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53，2.0μL的2×Buffer E，0.2μL的牛血清白蛋白，BSA，HindⅢ 0.5μL，BamHⅠ0.5μL，加去离子水至总体积为20μL，37℃,消化4小时，为酶切产物Ⅲ；对酶切产物Ⅲ进行琼脂糖凝胶电泳结果鉴定，得到人类肿瘤抑制基因，P53和增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1。

所述的增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1为真核细胞表达载体，绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)由238个氨基酸组成，分子量约为27Kd。GFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定，用甲醛固定后会持续发出荧光，GFP具有以下优点：在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；检测灵敏，具有极高的检出率；而pEGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。pEGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光；pEGFP-N1载体上携带有EGFP蛋白表达基因，具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；具有多克隆位点，便于目的基因的插入；为市售的一般真核表达载体。

所述的载体pMD18-T为一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体，由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3‵端添加：“T”而成，因而大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3‵末端添加一个“A”的特性，所以使用这两种制品都可以大大可高PCR产物的连接、克隆效率；由于pMD18-T是有pUC18载体的基础上构建而成，所以具有相同的功能，此外pMD18-T载体的高效连接液Ligation Mix可以在极短的时间内完成连接反应，且此连接液可以直接用于细菌转化，方便实验造作；市售的一般T载体。

所述的溶液I的主要成分为25mMTris-Cl、10mM乙二胺四乙EDTA。

所述的溶液II的主要成分为1%十二烷基硫酸钠SDS、2%NaOH。

所述的溶液III的主要成分为3M醋酸钾、2M醋酸。

所述的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸Tris-HCl-EDTA，TE为Tris饱和酚、乙二胺四乙酸EDTA。

所述的牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）为牛血清蛋白，为一般市售牛血清蛋白。

所述的Buffer K的主要成分为Tris-HCl，MgCl2，三磷酸腺苷。

所述的GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司，其中自带有结合缓冲液（Binding Buffer B）、结合缓冲液（Binding Buffer C）。

所述的洗脱缓冲液（Elution Buffer，EB）为Tris-Hcl。

所述的重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53质粒保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。

所述的E．coli JM109菌株为一般市售菌种。

本发明的有益效果是：利用微生物、植物及哺乳动物基因工程来克隆出人类肿瘤抑制基因，P53，利用安全稳定、复制能力强、表达效率高、易于检测的真核表达载体即增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1作为人类肿瘤抑制基因的转运载体，从而构建出安全稳定、易于检测、安全可靠、高效的转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53，易于在动物体内表达，从而用于预防和治疗癌症。

附图说明

图1为转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体（pEGFP-N1-P53）质粒图谱；

图2为转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体（pEGFP-N1-P53 ）PCR琼脂糖凝胶检测电泳图；

图3为转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体（pEGFP-N1-P53）的双酶切琼脂糖凝胶检测电泳图；

图4为鸡胚荧光检测图；

图5为鸡胚组织PCR检测图。

具体实施方式

实施例

步骤一、设计引物，参照基因库（GENBANK）上人类肿瘤抑制基因全基因序列（human tumor suppressor gene p53，P53），利用生物学软件（primer5.0）设计引物；

上游引物：5'-CCCAAGCTTATGGAGGAGCCGCAGTC-3'

下游引物：5'-CGCGGATCCCAGTCTGAATCAGGCCCT-3'；

步骤二、血样的采集：选择肺癌早期病人的外周血，肝素抗凝，-20℃冻存；

步骤三、人外周血总RNA的提取：将所采集的早期肺癌病的人外周血利用手提法提取人外周血总RNA；

步骤四、提取人外周血总RNA和人类肿瘤抑制基因：

1）从人外周血中提取的总RNA，以总RNA为模板，利用逆转录RCR的方法提取人类肿瘤抑制基因；

2）逆转录PCR体系：在0.5mL离心管A中加入配制的25ml的逆转录PCR缓冲液，2ml的人外周血总RNA，5μL的5倍聚合酶链式反应缓冲液，浓度为25mM的氯化镁离子2μL，1μL的三磷酸脱氧核糖核苷deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP混合液，1μL的核糖核酸酶抑制剂RNase Inhibitor，1μL的禽骨髓母细胞增多性病毒反转录酶Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase，AMV，1μL的优化的禽骨髓母细胞增多性病毒Avian Myeloblastosis Virus optimized，上游引物、下游引物各2μL，补加RNA 去离子水至总体积为50μL，混匀，表面添加一层石蜡油，形成逆转录RT-PCR反应液，备用；

3）将逆转录PCR反应液置于PCR仪内进行逆转录PCR反应，反应程序为：

（1）互补DNA (complementary DNA，cDNA)的合成温度为40℃，合成时间为40分钟；

（2）逆转录PCR扩增： PCR扩增共30个循环，前5个循环，94℃预变性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸90秒；后25个循环， 94℃变性30秒；68℃退火30秒；72℃延伸90秒；

（3）延伸：72℃再次延伸10分钟；

（4）形成逆转录PCR产物；

4）对逆转录PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行结果鉴定，得到人类肿瘤抑制基因时，备用；

步骤五、利用常规PCR的方法制备人类肿瘤抑制基因：

1）PCR反应体系：在0.5ml的离心管B中配制50ml的PCR反应液，PCR反应液的组成成份为：5ml的10×PCR缓冲液，浓度为25mM的氯化镁离子3ml，2.5mmol/l的三磷酸脱氧核糖核苷（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）混合液4ul，10μmol/l的上、下游引物各2ml，1ml的逆转录PCR产物，3U/μl的Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase）1ml，余量为去离子水，形成PCR反应液Ⅰ；

2）PCR反应程序：将PCR反应液Ⅰ置于PCR仪内进行PCR反应，PCR反应程序为：94℃预变性30秒、68℃退火30秒、72℃延伸90秒；共33个循环；72℃再次延伸10分钟；形成PCR反应产物Ⅰ；

3）电泳检测：对PCR反应产物Ⅰ进行琼脂糖凝胶电泳进行结果鉴定，得到人类肿瘤抑制基因，备用；

步骤六、人类肿瘤抑制基因的回收与纯化：利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对人类肿瘤抑制基因进行回收与纯化：

1）回收，步骤如下：

（1）取1.5ml的离心管A并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上切下含有人类肿瘤抑制基因的凝胶块，放入1.5ml离心管A中，称其总重计算含有人类肿瘤抑制基因凝胶块的重量；

（2）将凝胶块捣碎，后向1.5ml的离心管A内加入结合缓冲液（Binding Buffer B），后放置在60℃条件下，每隔2分钟摇匀一次，每次30秒，至凝胶完全融化止，形成混合液Ⅰ；

（3）将混合液Ⅰ移至DNA纯化柱a中，DNA纯化柱a位于收集管a中，将含有DNA纯化柱a的收集管a放入离心机内，以3000转/分钟，离心30秒；

（4）将DNA纯化柱a从收集管a内取出，倒掉收集管中a中的废液，将DNA纯化柱a放回收集管a内，加入500μl的洗涤液，放入离心机内，以8000转/分钟，离心30秒，弃去收集管a内的液体；

（5）重复上述步骤（4）两次；

（6）取出DNA纯化柱a，倒掉收集管a中的废液，放入离心机内，10000转/分钟，离心1分钟，去除残留洗脱液；

（7）取出DNA纯化柱a放入1.5ml离心管B中，在DNA纯化柱A的结合柱膜中央加入50μl的洗脱缓冲液，37℃，放置2分钟，形成混合液Ⅱ；

（8）将含有混合液Ⅱ的1.5ml离心管B放入离心机内，10000转/分钟，离心1分钟，得到人类肿瘤抑制基因溶液，备用；

2）纯化，步骤如下：

（1）将回收后的人类肿瘤抑制基因溶液移至新的1.5mL离心管C中，加入5倍体积的结合缓冲液（Binding Buffer C），混匀，形成混合液Ⅲ；

（2）将混合液Ⅲ转移至收集管b内的DNA纯化柱b中，静置2分钟，将含有DNA纯化柱b的收集管b放入离心机内，后以10000转/分钟，离心2分钟；

（3）将DNA纯化柱b从收集管b内取出，倒掉收集管b内的废液，将DNA纯化柱b放入收集管b内，加入500mL 洗涤液（Wash Solution），放入离心机内，10000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱b中的废液；

（4）重复步骤（3）一次；

（5）将DNA纯化柱b从收集管b内取出，倒掉收集管b中的废液，将DNA纯化柱b放回收集管b中，将含有DNA纯化柱b的收集管b放入离心机内，10000转/分钟，离心2分钟，后置于恒温干燥箱中，50℃，放置5分钟；

（6）将DNA纯化柱b放入一个1.5mL离心管D内，在DNA纯化柱b的结合柱膜中央滴加40mL洗脱缓冲液（Elution Buffer），60℃，放置5分钟，形成混合液Ⅳ；

（7）将含有混合液Ⅳ的1.5mL离心管D放入离心机内，10000转/分钟，离心1分钟，得到纯化的人类肿瘤抑制基因，备用；

步骤七、感受态细胞CaCl₂的制备方法：

1）在无菌条件下取一个E．coli JM109单菌落，接种于2ml的LB液体培养基中，37℃条件下培养12小时，形成混合菌液Ⅰ；

2）将混合菌液Ⅰ接种于100mL的 LB液体培养基中，37℃振荡培养3小时，每间隔半小时测OD₆₀₀值，待OD₆₀₀ =0.5时，停止培养，形成混合菌液Ⅱ；

3）取混合菌液Ⅱ1mL移至50mL的离心管中，0℃的冰水混合物中放置30分钟，后放入冷冻离心机内，于4℃条件下，4000转/分钟，离心10分钟，倒掉上面澄清液体，形成沉淀物Ⅰ，备用；

4）取浓度为0.01mol/L的感受态细胞CaCl₂ 溶液10mL加到含有沉淀物Ⅰ的50mL离心管中，0℃的冰水混合物条件下放置25分钟，后置于冷冻离心机内，4℃条件下，转速为3000转/分钟，离心时间为7分钟，倒掉上面澄清液体，形成沉淀物Ⅱ，备用；

5）取10mL浓度为0.01mol/L的CaCl₂溶液加到含有沉淀物Ⅱ的50mL离心管内，0℃的冰水混合物条件下放置25分钟后，后置于冷冻离心机内，4℃条件下，转速为3000转/分钟，离心5分钟，倒掉上面澄清液体，形成沉淀物Ⅲ，备用；

6）在含有沉淀物Ⅲ的50mL离心管中，加入浓度为0.01mol/L 的CaCl₂ 溶液3mL和10%的甘油10mL，混合均匀，形成感受态细胞悬液，备用；

步骤八、转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53的构建：

1）人类肿瘤抑制基因与高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体pMD18-T载体的连接，连接反应体系：在0.2mL的离心管A中加入4.5μL的人类肿瘤抑制基因，0.5μL的高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体pMD18-T载体，5μL的T4 DNA连接酶，共10μL体系，将三种溶液混合后，置于离心机内，500转/分钟，离心15秒，后置于16°C干式恒温仪内，连接12小时，形成连接产物Ⅰ；

2）将连接产物Ⅰ置于4°C条件下保存，备用；

3）连接产物转化：

（1）取200μL感受态细胞悬液Ⅰ，放入0.5mL离心管C内，后将0.5mL离心管C置于 0℃的冰水混合物中，时间为10分钟，取出，备用；

（2）在0.5mL离心管C中加入10μL的连接产物Ⅰ，混匀，0℃的冰水混合物中放置30分钟，形成混合液Ⅴ；

（3）将含有混合液Ⅴ的0.5mL离心管C放入42℃的水浴锅中热激90秒后，0℃的冰水混合物中放置10分钟，形成混合液Ⅵ；

（4）在含有400μL LB液体培养基的1.5mL离心管E中加入混合液Ⅵ，混匀，37℃条件下培养1小时，形成混合菌液Ⅲ；

（5）将含有混合菌液Ⅲ的1.5mL离心管E放入离心机内，2000转/分钟，离心30秒，倒掉澄清液体，形成沉淀物Ⅳ，将其涂抹在含有卡那霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranosi-de，X-Gal）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG的LB固体培养基中，在37℃条件，培养12个小时，形成含有抗生素LB固体培养基；

4）转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T -P53质粒提取：

（1）在含有抗生素LB固体培养基中挑选白色单一菌落接种于50mL的含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，培养16小时，备用，形成含有卡那霉素LB液体培养液A；

（2）取50μL的卡那霉素LB液体培养液A移至1.5mL的离心管F中，放入离心机内，8000转/分钟，离心5分钟，弃去上层澄清液体；

（3）重复步骤（2）一次，形成菌体Ⅰ；

（4）在含有菌体Ⅰ的1.5mL离心管F中加入100μL溶液Ⅰ，悬浮，形成悬浮菌液Ⅰ；

（5）在含有悬浮菌液Ⅰ的1.5mL离心管F中加入200μL新鲜配制的溶液Ⅱ，混匀，0℃的冰水混合物中静置5分钟，形成悬浮菌液Ⅱ；

（6）在含有悬浮菌液Ⅱ的1.5mL离心管F中加入150μL溶液Ⅲ，混匀，0℃的冰水混合物中静置10分钟，12000 转/分钟，离心10分钟，形成悬浮菌液Ⅲ；

（7）取悬浮菌液Ⅲ500ul移至1.5mL的离心管G中，加入等体积的异丙醇，21℃条件下静置10分钟，放入离心机内，12000转/分钟，离心15分钟，弃去澄清液体，形成菌体Ⅱ；

（8）在含有菌体Ⅱ的1.5mL离心管G中加入200μL的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸，TE使菌体Ⅱ溶解，后加入50μL的7.5mol/L醋酸铵，混匀，0℃的冰水混合物中静置10分钟，12000转/分钟，离心15分钟；

（9）取步骤（8）中的澄清液体250μL的，转移至1.5mL离心管H中，加入250μL异丙醇和500μL的无水乙醇，21℃条件下，静置30分钟，放入离心机内，12000 转/分钟，离心10分钟，形成沉淀物Ⅴ；

（10）用75%乙醇对沉淀物Ⅴ洗涤三次，风干，加入50μL的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸（Tris-HCl-EDTA，TE，pH为8.0）溶液使沉淀物Ⅴ溶解，形成混合液Ⅶ；

6）对混合液Ⅶ进行琼脂糖凝胶电泳结果鉴定，得到转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体（pMD18-T-P53），备用；

步骤九、转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体pMD18-T-P53的PCR鉴定：

1）PCR体系：在0.5 mL的离心管D中加入5μL的10×PCR缓冲液，1μL的三磷酸脱氧核糖核苷（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）混合液，3μL的氯化镁离子浓度为25mM，2μL的质粒模板，上游、下游引物各1μL，水生栖热菌（Thermusaquaticus），Taq DNA聚合酶0.5μL，余量为去离子水，形成PCR反应液Ⅱ，备用；

2）PCR程序：将PCR反应液Ⅱ放入PCR仪内，PCR扩增共30个循环，前5个循环：94℃预变性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸90秒；后25个循环：94℃预变性30秒、68℃退火30秒、72℃延伸90秒；72℃再次延伸10分钟，形成PCR产物Ⅱ；

3）对PCR产物Ⅱ采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体（pMD18-T-P53）备用；

步骤十、重组转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53的酶切鉴定：

1）酶切消化体系：在0.2 mL的离心管B加入5μL的重组转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53，2μL的 2×Buffer K，0.2μL的牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），0.5μL的Hind Ⅲ，0.5μL的BamHⅠ，加入无菌的去离子水至总体积20μL，37℃反应4小时，形成酶切产物Ⅰ；

2）对酶切产物Ⅰ进行琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，得到酶切后的人类肿瘤抑制基因，P53和高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T，备用备用；

步骤十一、人类肿瘤抑制基因，P53和高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T的测序鉴定：将得到酶切后的人类肿瘤抑制基因，P53和高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T送至上海生物工程有限公司进行测序，测序完成后利用基因库GenBank中的局部相似性基本查询工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）软件进行碱基序列比对、同源性分析；

步骤十二、重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53重组质粒的构建：

1）质粒的酶切：真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的酶切：

（1）酶切消化体系：在0.2mL的离心管C中加入5μL的增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1质粒，2μL的2×Buffer K，0.2μL的牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），HindⅢ 0.5μL，BamHⅠ0.5μL，补加灭菌去离子水至总体积为20μL，37℃，消化4小时，形成酶切产物Ⅱ；

（2）对酶切产物Ⅱ进行琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，得到含有两端各酶切位点中3个碱基和1182个碱基载体的共1188个碱基的真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体（pEGFP-N1），备用；

2）利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对人类肿瘤抑制基因，P53的酶切产物进行回收，回收步骤：

（1）取1.5ml的离心管I并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上切下含有人类肿瘤抑制基因，P53的酶切产物，放入1.5ml离心管I中，称其总重计算含有人类肿瘤抑制基因，P53的酶切产物凝胶块的重量；

（2）将凝胶块捣碎，后向1.5ml的离心管I内加入结合缓冲液（Binding Buffer B），后放置在60℃条件下，每隔2分钟摇匀一次，每次30秒，至凝胶完全融化止，形成混合液Ⅷ；

（3）将混合液Ⅷ移至DNA纯化柱c中，DNA纯化柱c位于收集管c中，将含有DNA纯化柱c的收集管c放入离心机内，以3000转/分钟，离心30秒；

（4）将DNA纯化柱c从收集管c内取出，倒掉收集管中c中的废液，将DNA纯化柱c放回收集管c内，加入500μl的洗涤液，放入离心机内，以8000转/分钟，离心30秒，弃去收集管c内的液体；

（5）重复上述步骤（4）两次；

（6）取出DNA纯化柱a，倒掉收集管a中的废液，放入离心机内，10000转/分钟，离心1分钟，去除残留洗脱液；

（7）取出DNA纯化柱c放入1.5ml离心管J中，在DNA纯化柱c的结合柱膜中央加入50μl的洗脱缓冲液，37℃，放置2分钟，形成混合液Ⅸ；

（8）将含有混合液Ⅸ的1.5ml离心管J放入离心机内，10000转/分钟，离心1分钟，得到回收后的人类肿瘤抑制基因，P53的酶切产物，备用；

3）利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的酶切产物进行回收，回收步骤：

（1）取1.5ml的离心管K并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上切下含有真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的酶切产物，放入1.5ml离心管K中，称其总重计算含有真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的酶切产物凝胶块的重量；

（2）将凝胶块捣碎，后向1.5ml的离心管K内加入结合缓冲液（Binding Buffer B），后放置在60℃条件下，每隔2分钟摇匀一次，每次30秒，至凝胶完全融化止，形成混合液Ⅹ；

（3）将混合液Ⅹ移至DNA纯化柱d中，DNA纯化柱d位于收集管d中，将含有DNA纯化柱d的收集管d放入离心机内，以3000转/分钟，离心30秒；

（4）将DNA纯化柱d从收集管d内取出，倒掉收集管中d中的废液，将DNA纯化柱d放回收集管d内，加入500μl的洗涤液，放入离心机内，以8000转/分钟，离心30秒，弃去收集管d内的液体；

（5）重复上述步骤（4）两次；

（6）取出DNA纯化柱d，倒掉收集管d中的废液，放入离心机内，10000转/分钟，离心1分钟，去除残留洗脱液；

（7）取出DNA纯化柱d放入1.5ml离心管L中，在DNA纯化柱d的结合柱膜中央加入50μl的洗脱缓冲液，37℃，放置2分钟，形成混合液Ⅺ；

（8）将含有混合液Ⅺ的1.5ml离心管L放入离心机内，10000转/分钟，离心1分钟，得到回收后的真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的酶切产物，备用；

4）利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对人类肿瘤抑制基因，P53的酶切产物进行纯化，步骤如下：

（1）将回收后的人类肿瘤抑制基因，P53的酶切产物移至新的1.5mL离心管M中，加入5倍体积的结合缓冲液（Binding Buffer C），混匀，形成混合液Ⅻ；

（2）将混合液Ⅻ转移至收集管e内的DNA纯化柱e中，静置2分钟，将含有DNA纯化柱e的收集管e放入离心机内，后以10000转/分钟，离心2分钟；

（3）将DNA纯化柱e从收集管e内取出，倒掉收集管e内的废液，将DNA纯化柱e放入收集管e内，加入500mL 洗涤液（Wash Solution），放入离心机内，10000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱e中的废液；

（4）重复步骤（3）一次；

（5）将DNA纯化柱e从收集管e内取出，倒掉收集管e中的废液，将DNA纯化柱e放回收集管e中，将含有DNA纯化柱e的收集管e放入离心机内，10000转/分钟，离心2分钟，后置于恒温干燥箱中，50℃，放置5分钟；

（6）将DNA纯化柱e放入一个1.5mL离心管N内，在DNA纯化柱e的结合柱膜中央滴加40mL洗脱缓冲液（Elution Buffer），60℃，放置5分钟，形成混合液ⅰ；

（7）将含有混合液ⅰ的1.5mL离心管N放入离心机内，10000转/分钟，离心1分钟，得到纯化的转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53质粒的酶切产物，备用；

5）利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的酶切产物进行纯化，步骤如下：

（1）将回收后的真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的酶切产物移至新的1.5mL离心管O中，加入5倍体积的结合缓冲液（Binding Buffer C），混匀，形成混合液ⅱ；

（2）将混合液ⅱ转移至收集管f内的DNA纯化柱f中，静置2分钟，将含有DNA纯化柱f的收集管f放入离心机内，后以10000转/分钟，离心2分钟；

（3）将DNA纯化柱f从收集管f内取出，倒掉收集管f内的废液，将DNA纯化柱f放入收集管f内，加入500mL 洗涤液（Wash Solution），放入离心机内，10000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱f中的废液；

（4）重复步骤（3）一次；

（5）将DNA纯化柱f从收集管f内取出，倒掉收集管f中的废液，将DNA纯化柱f放回收集管f中，将含有DNA纯化柱f的收集管f放入离心机内，10000转/分钟，离心2分钟，后置于恒温干燥箱中，50℃，放置5分钟；

（6）将DNA纯化柱f放入一个1.5mL离心管P内，在DNA纯化柱f的结合柱膜中央滴加40mL洗脱缓冲液（Elution Buffer），60℃，放置5分钟，形成混合液ⅲ；

（7）将含有混合液ⅲ的1.5mL离心管P放入离心机内，10000转/分钟，离心1分钟，得到纯化的真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的酶切产物，备用；

步骤十三、人类肿瘤抑制基因和增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的两种酶切产物的连接，连接反应体系：在新的0.2mL离心管D中加入10μL的人类肿瘤抑制基因，5μL的增强型绿色荧光蛋白载体pEGFP-N1，2μL 的T4 DNA连接酶，1μL的T4 DNA连接酶，2μL的灭菌去离子水，混匀，于16℃条件下连接12小时，形成重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53；

步骤十四、重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53的质粒转化与提取：

1）质粒转化：

（1）取200μL感受态细胞悬液Ⅰ，放入0.2mL离心管E内，将其置于 0℃的冰水混合物中，时间为10分钟，后将0.2mL离心管E取出，形成感受态细胞悬液Ⅲ；

（2）在含有感受态细胞悬液Ⅲ的0.2mL离心管E中加入10μL的重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53溶液，混匀，0℃的冰水混合物中放置30分钟，形成混合液ⅳ；

（3）将0.2mL离心管E放入42℃的水浴锅中热激90秒后，在0℃的冰水混合物中放置10分钟，形成混合液ⅴ；

（4）将混合液ⅴ移至1.5mL的离心管Q中，后加入400μL的LB液体培养基，混匀，37℃条件下培养1小时，形成混合菌液Ⅳ；

（5）将含有混合菌液Ⅳ的1.5mL离心管Q放入离心机内，2000转/分钟，离心30秒，倒掉澄清液体，形成沉淀物Ⅵ，将沉淀物Ⅵ涂抹在含有卡那霉素的LB固体培养基中，在37℃条件，培养12个小时，形成含有混合菌液Ⅳ抗生素LB固体培养基；

2）质粒提取

（1）挑取含有混合菌液Ⅳ的抗生素LB固体培养基上的单菌落，接种于50mL的含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，振荡培养12小时，形成卡那霉素LB液体培养液B； 

（2）将1mL的卡那霉素LB液体培养液B移入1.5mL的离心管R中，放入离心机，8000转/分钟，离心5分钟，弃去上层澄清液体；

（3）重复步骤2一次，收集菌体Ⅱ；

（4）在含有菌体Ⅱ的1.5mL离心管R中加入100μL溶液Ⅰ，悬浮，形成悬浮菌液Ⅴ；

（5）在含有悬浮菌液Ⅴ的1.5mL离心管R中加入200μL新鲜配制的溶液Ⅱ，混匀，0℃的冰水混合物中静置5分钟，形成悬浮菌液Ⅵ；

（6）在含有悬浮菌液Ⅵ的1.5mL离心管R中加入150μL溶液Ⅲ，混匀，0℃的冰水混合物中静置10分钟，放入离心机内，12000 转/分钟，离心10分钟，形成悬浮菌液Ⅶ；

（7）取悬浮菌液Ⅶ500uL移至1.5mL的离心管S中，加入等体积的异丙醇，21℃条件下静置10分钟，放入离心机，12000转/分钟，离心15分钟，弃去澄清液体，形成菌体Ⅲ；

（8）将含有菌体Ⅲ的1.5mL离心管S中加入200μL的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸（Tris-Hcl-EDTA，TE）使菌体Ⅲ溶解，后加入50μL的7.5mol/L醋酸铵，混匀，0℃的冰水混合物中静置10分钟，放入离心机，12000转/分钟，离心15分钟；

（9）取步骤（8）中的澄清液体250μL，转至1.5mL的离心管T中，加入250μL异丙醇和500无水乙醇，21℃条件下静置30分钟，放入离心机，12000 转/分钟，离心10分钟，形成沉淀物Ⅶ；

（10）用75%乙醇对沉淀物Ⅶ洗涤三次，风干，加入50μL的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸（Tris-HCl-EDTA，TE，pH为8.0）溶液使沉淀物Ⅶ溶解；

（11）对稀释后的沉淀物Ⅶ溶液进行琼脂糖凝胶电泳结果鉴定，得到含有两个酶切位点6个碱基、上下游引物两端各3个保护碱基和1182个碱基载体共1200个碱基的重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体（pEGFP-N1-P53）质粒，备用；

步骤十五、重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53的酶切鉴定：酶切体系：在一个新的离心管U中加入10.0μL的重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体（pEGFP-N1-P53）质粒，2.0μL的2×Buffer K，0.2μL的牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）；HindⅢ 0.5μL，BamHⅠ0.5μL，加去离子水至总体积为20μL，37℃,消化4小时，得到酶切产物Ⅲ；对酶切产物Ⅲ进行琼脂糖凝胶电泳结果鉴定，得到人类肿瘤抑制基因，P53和增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1；

步骤十六、鸡胚细胞转染与孵化：

1）制备脂质体和重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53的混合悬液：在0.5mL离心管E中加入取80mL重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体pEGFP-N1-P53和20mL的脂质体混匀制成悬液，分装，A组为对照，B组中加入2mL二月桂酰溶血卵磷脂和硬脂酰胺的混合液；

2）鸡胚注射：在无菌工作条件下，用75%的酒精对蛋壳进行消毒，在蛋壳的小头端打开直经为0.5cm的开口，将转染液注入蛋黄表面的胚盘上，用蛋壳膜对蛋壳开口进行封口；

3.鸡胚的孵化：在温度为38℃，湿度60%的孵化器内进行孵化，每两小时翻蛋一次，直至雏鸡出壳；

步骤十七、结果检测：

1）对死胚组织进行绿色荧光蛋白的检测，将组织装片放在490nm的在荧光显微镜下观察；

2）提取阳性组织基因组进行PCR检测：提取死胚不同部位的基因组和雏鸡血液基因组，进行PCR检测，得到含有1个保护碱基和1182个碱基载体的共1183个碱基的重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体pEGFP-N1-P53；

3）对存活雏鸡进行血液检测：选择三个月龄对照组和实验组的鸡，翅下静脉采血，6000转/分钟，离心2分钟，收集血清，做SDS-PAGE电泳目的蛋白检测。

所述的溶液I的主要成分为25mMTris-Cl、10mM乙二胺四乙EDTA。

所述的溶液II的主要成分为1%十二烷基硫酸钠SDS、2%NaOH。

所述的溶液III的主要成分为3M醋酸钾、2M醋酸。

所述的Buffer K的主要成分为Tris-HCl， MgCl2，三磷酸腺苷。

所述的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸Tris-HCl-EDTA，TE主要成分为Tris饱和酚、乙二胺四乙酸EDTA。

所述的牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）为牛血清蛋白，为一般市售牛血清蛋白。

所述的Buffer K的主要成分为Tris-HCl， MgCl2，三磷酸腺苷。

所述的GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司，其中自带有结合缓冲液（Binding Buffer B）、结合缓冲液（Binding Buffer C）。

所述的洗脱缓冲液（Elution Buffer，EB）主要成分为Tris-Hcl。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  河南科技大学

 

<120>  一种转人类肿瘤抑制基因绿色荧光蛋白载体的培植方法

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  5883

<212>  DNA

<213>  Escherichia coli JM109

 

<400>  1

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg       60

 

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt      120

 

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca      180

 

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc      240

 

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta      300

 

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac      360

 

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg      420

 

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg      480

 

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt      540

 

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta      600

 

ccggactcag atctcgagct caagcttatg gaggagccgc agtcagatcc tagcgtcgag      660

 

ccccctctga gtcaggaaac attttcagac ctatggaaac tacttcctga aaacaacgtt      720

 

ctgtccccct tgccgtccca agcaatggat gatttgatgc tgtccccgga cgatattgaa      780

 

caatggttca ctgaagaccc aggtccagat gaagctccca gaatgccaga ggctgctccc      840

 

cgcgtggccc ctgcaccagc agctcctaca ccggcggccc ctgcaccagc cccctcctgg      900

 

cccctgtcat cttctgtccc ctcccagaaa acctaccagg gcagctacgg tttccgtctg      960

 

ggcttcttgc attctgggac agccaagtct gtgacttgca cgtactcccc tgccctcaac     1020

 

aagatgtttt gccaactggc caagacctgc cctgtgcagc tgtgggttga ttccacaccc     1080

 

ccgcccggca cccgcgtccg cgccatggcc atctacaagc agtcacagca catgacggag     1140

 

gttgtgaggc gctgccccca ccatgagcgc tgctcagata gcgatggtct ggcccctcct     1200

 

cagcatctta tccgagtgga aggaaatttg cgtgtggagt atttggatga cagaaacact     1260

 

tttcgacata gtgtggtggt gccctatgag ccgcctgagg ttggctctga ctgtaccacc     1320

 

atccactaca actacatgtg taacagttcc tgcatgggcg gcatgaaccg gaggcccatc     1380

 

ctcaccatca tcacactgga agactccagt ggtaatctac tggggacgga acagctttga     1440

 

ggtgcgtgtt tgtgcctgtc ctgggagaga ccggcgcaca gaggaggaga atctccgcaa     1500

 

gaaaggggag cctcaccacg agctgccccc agggagcact aagcgagcac tgcccaacaa     1560

 

caccagctcc tctccccagc caaagaagaa accactggat ggagaatatt tcacccttca     1620

 

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ggatgcccag gctgggaagg agccaggggg gagcagggct cactccagcc acctgaagtc     1740

 

caaaaagggt cagtctacct cccgccataa aaaactcatg ttcaagacag aagggcctga     1800

 

ttcagactgg gatccaccgg tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg     1860

 

ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc     1920

 

cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac     1980

 

cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg     2040

 

cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga     2100

 

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cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt     2220

 

caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt     2280

 

ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa     2340

 

catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga     2400

 

cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga     2460

 

ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac     2520

 

tctcggcatg gacgagctgt acaagtaaag cggccgcgac tctagatcat aatcagccat     2580

 

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aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac     2700

 

aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt     2760

 

tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct taaggcgtaa attgtaagcg ttaatatttt     2820

 

gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat     2880

 

cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt     2940

 

ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt     3000

 

ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag     3060

 

gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg     3120

 

aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc     3180

 

gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc     3240

 

gctacagggc gcgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt     3300

 

atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct     3360

 

tcaataatat tgaaaaagga agagtcctga ggcggaaaga accagctgtg gaatgtgtgt     3420

 

cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat     3480

 

ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg     3540

 

caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg     3600

 

cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt     3660

 

tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt     3720

 

tttggaggcc taggcttttg caaagatcga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat     3780

 

gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg     3840

 

ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc     3900

 

gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca     3960

 

agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct     4020

 

cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga     4080

 

tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg     4140

 

gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat     4200

 

cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga     4260

 

gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg     4320

 

cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg     4380

 

ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat     4440

 

agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct     4500

 

cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga     4560

 

cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg     4620

 

ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt     4680

 

ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc     4740

 

caccctaggg ggaggctaac tgaaacacgg aaggagacaa taccggaagg aacccgcgct     4800

 

atgacggcaa taaaaagaca gaataaaacg cacggtgttg ggtcgtttgt tcataaacgc     4860

 

ggggttcggt cccagggctg gcactctgtc gataccccac cgagacccca ttggggccaa     4920

 

tacgcccgcg tttcttcctt ttccccaccc caccccccaa gttcgggtga aggcccaggg     4980

 

ctcgcagcca acgtcggggc ggcaggccct gccatagcct caggttactc atatatactt     5040

 

tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat     5100

 

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta     5160

 

gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa     5220

 

acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt     5280

 

tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag     5340

 

ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta     5400

 

atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca     5460

 

agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag     5520

 

cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa     5580

 

agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga     5640

 

acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc     5700

 

gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc     5760

 

ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt     5820

 

gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccatg     5880

 

cat                                                                   5883

 

 

Claims (1)

1.一种转人类肿瘤抑制基因绿色荧光蛋白载体的培植方法，其特征在于：培植的步骤如下：

步骤一、设计引物，按照基因库中人类肿瘤抑制基因序列，用生物学软件primer5.0设计引物；

步骤二、选择肺癌早期病人外周血；

步骤三、提取人外周血总RNA和人类肿瘤抑制基因：

1）从人外周血中提取的总RNA，以总RNA为模板，利用逆转录RCR的方法提取人类肿瘤抑制基因；

逆转录PCR体系：在0.5mL离心管A中加入配制的25ml的逆转录PCR缓冲液，2ml的人外周血总RNA，5μL的5倍聚合酶链式反应缓冲液，浓度为25mM的氯化镁离子2μL，1μL的三磷酸脱氧核糖核苷deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP混合液，1μL的核糖核酸酶抑制剂RNase Inhibitor，1μL的禽骨髓母细胞增多性病毒反转录酶Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase，AMV，1μL的优化的禽骨髓母细胞增多性病毒Avian Myeloblastosis Virus optimized，上游引物、下游引物各2μL，补加RNA 去离子水至总体积为50μL，混匀，表面添加一层石蜡油，形成逆转录RT-PCR反应液，备用；

反应程序为：

（1）互补DNA  complementary DNA，cDNA的合成温度为40℃，合成时间为40分钟；

（2）逆转录PCR扩增：PCR扩增共30个循环，前5个循环，94℃预变性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸90秒；后25个循环， 94℃变性30秒；68℃退火30秒；72℃延伸90秒；

（3）延伸：72℃再次延伸10分钟；

（4）形成逆转录PCR产物；

2）对逆转录PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行结果鉴定，备用；

步骤四、利用常规PCR的方法制备人类肿瘤抑制基因：

利用PCR反应制备出人类肿瘤抑制基因，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳进行结果鉴定，得到人类肿瘤抑制基因时，备用；

步骤五、人类肿瘤抑制基因的回收与纯化：对检测过的人类肿瘤抑制基因利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化，备用；

步骤六、感受态细胞CaCl₂悬液的制备方法；

步骤七、转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53的构建：

1）利用pMD18-T载体试剂盒对人类肿瘤抑制基因与高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体pMD18-T载体的连接，连接反应体系：在0.2mL的离心管A中加入4.5μL的人类肿瘤抑制基因，0.5μL的高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体pMD18-T载体，5μL的T4 DNA连接酶，共10μL体系，将三种溶液混合后，置于离心机内，500转/分钟，离心15秒，后置于16°C干式恒温仪内，连接12小时，形成连接产物Ⅰ；

2）将连接产物Ⅰ置于4°C条件下保存，备用；

3）连接产物转化：

（1）取200μL感受态细胞悬液，放入0.5mL离心管B内，后将0.5mL离心管A置于 0℃的冰水混合物中，时间为10分钟，取出，形成感受态细胞悬液Ⅰ；

（2）在0.5mL离心管B中加入10μL的连接产物Ⅰ，混匀，0℃的冰水混合物中放置30分钟，形成混合液Ⅴ；

（3）将含有混合液Ⅴ的0.5mL离心管B，放入42℃的水浴锅中热激90秒后，0℃的冰水混合物中放置10分钟，形成混合液Ⅵ；

（4）在含有400μL LB液体培养基的1.5ml离心管A中加入混合液Ⅵ，混匀，37℃条件下培养1小时，形成混合菌液Ⅲ；

（5）将含有混合菌液Ⅲ的1.5ml离心管A放入离心机内，2000转/分钟，离心30秒，倒掉澄清液体，形成沉淀物Ⅳ，将其涂抹在含有卡那霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-Gal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG的LB固体培养基中，在37℃条件，培养12个小时，形成抗生素LB固体培养基；

4）转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53质粒提取：

（1）在抗生素LB固体培养基中挑选白色单一菌落接种于50mL的含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，培养16小时，备用，形成含有卡那霉素LB液体培养液A；

（2）取1mL的卡那霉素LB液体培养液A移至1.5mL的离心管B中，放入离心机内，8000转/分钟，离心5分钟，弃去上层澄清液体；

（3）重复步骤（2）一次，形成菌体Ⅰ；

（4）在含有菌体Ⅰ的1.5mL离心管B中加入100μL溶液Ⅰ，悬浮，形成悬浮菌液Ⅰ；

（5）在含有悬浮菌液Ⅰ的1.5mL离心管B中加入200μL新鲜配制的溶液Ⅱ，混匀，0℃的冰水混合物中静置5分钟，形成悬浮菌液Ⅱ；

（6）在含有悬浮菌液Ⅱ的1.5mL离心管B中加入150μL溶液Ⅲ，混匀，0℃的冰水混合物中静置10分钟，12000 转/分钟，离心10分钟，形成悬浮菌液Ⅲ；

（7）取悬浮菌液Ⅲ500ul移至1.5mL的离心管C中，加入等体积的异丙醇，21℃条件下静置10分钟，放入离心机内，12000转/分钟，离心15分钟，弃去澄清液体，形成菌体Ⅱ；

（8）在含有菌体Ⅱ的1.5离心管C中加入200μL的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸，TE使菌体Ⅱ溶解，后加入50μL的7.5mol/L醋酸铵，混匀，0℃的冰水混合物中静置10分钟，12000转/分钟，离心15分钟；

（9）取步骤（8）中的澄清液体250μL的，转移至1.5mL离心管D中，加入250μL异丙醇和500μL的无水乙醇，21℃条件下，静置30分钟，放入离心机内，12000 转/分钟，离心10分钟，形成沉淀物Ⅴ；

（10）用75%乙醇对沉淀物Ⅴ洗涤三次，风干，加入50μL的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸Tris-Hcl-EDTA，TE，pH为8.0溶液使沉淀物Ⅴ溶解，形成混合液Ⅶ；

6）对混合液Ⅶ进行琼脂糖凝胶电泳结果鉴定，备用；

步骤八、转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体pMD18-T-P53的PCR鉴定：

1）PCR体系：在0.5 mL的离心管C中加入5μL的10×PCR缓冲液，1μL的三磷酸脱氧核糖核苷deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP混合液，3μL的氯化镁离子浓度为25mM，2μL的质粒模板，上游、下游引物各1μL，水生栖热菌Thermusaquaticus，Taq DNA聚合酶0.5μL，余量为去离子水，形成PCR反应液Ⅱ，备用；

2）PCR程序：将PCR反应液Ⅱ放入PCR仪内，PCR扩增共30个循环，前5个循环：94℃预变性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸90秒；后25个循环：94℃预变性30秒、68℃退火30秒、72℃延伸90秒；72℃再次延伸10分钟，形成PCR产物Ⅱ；

3）对PCR产物Ⅱ采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53，备用；

步骤九、重组转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53的酶切鉴定：

1）酶切消化体系：在0.2 mL的离心管B加入5μL的转人类肿瘤抑制基因高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T-P53，2μL的 2×Buffer K，0.2μL的牛血清白蛋白，BSA，0.5μL的Hind Ⅲ，0.5μL的BamHⅠ，加入无菌的去离子水至总体积20μL，37℃反应4小时，形成酶切产物Ⅰ；

2）对酶切产物Ⅰ进行琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，得到酶切后的转人类肿瘤抑制基因，P53和高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T，备用；

步骤十、人类肿瘤抑制基因，P53和高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T的测序鉴定：将人类肿瘤抑制基因，P53和高效克隆聚合酶链式反应产物专用载体，pMD18-T送至上海生物工程有限公司进行测序；测序完成后利用基因库中的局部相似性基本查询工具Basic Local Alignment Search Tool，BLAST软件进行碱基序列比对、同源性分析；

步骤十一：转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53重组质粒的构建：

1）质粒的酶切：真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的酶切

（1）酶切体系：在0.2mL的离心管C中加入5μL的增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1质粒，2μL的2×Buffer K，0.2μL的牛血清白蛋白，BSA，HindⅢ 0.5μL，BamHⅠ0.5μL，补加灭菌去离子水至总体积为20μL，37℃，消化4小时，形成酶切产物Ⅱ；

（2）对酶切产物Ⅱ进行琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，得到含有两端各酶切位点中3个碱基和1182个碱基载体的共1188个碱基的真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1，备用；

2）对人类肿瘤抑制基因，P53质粒的酶切产物利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化；

3）对真核表达载体增强型绿色荧光蛋白载体，对pEGFP-N1的酶切产物Ⅱ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化；

步骤十二、人类肿瘤抑制基因和增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1的两种酶切产物Ⅱ的连接，连接反应体系：在新的0.2mL离心管D中加入10μL的人类肿瘤抑制基因，5μL的增强型绿色荧光蛋白载体pEGFP-N1，2μL的T4 DNA连接酶缓冲液，1μL的T4 DNA连接酶，2μL的灭菌去离子水，混匀，于16℃条件下连接12小时，形成重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体；

步骤十三、重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53的质粒转化与提取：

1）质粒转化：

（1）取200μL感受态细胞悬液，放入0.2mL离心管E内，将其置于 0℃的冰水混合物中，时间为10分钟，后将0.2mL离心管E取出，形成感受态细胞悬液A；

（2）在含有感受态细胞悬液A的0.2mL离心管E中加入10μL的重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53溶液，混匀，0℃的冰水混合物中放置30分钟，形成混合液ⅳ；

（3）将0.2mL离心管E放入42℃的水浴锅中热激90秒后，在0℃的冰水混合物中放置10分钟，形成混合液ⅴ；

（4）将混合液ⅴ移至1.5mL的离心管D中，后加入400μL的LB液体培养基，混匀，37℃条件下培养1小时，形成混合菌液Ⅳ；

（5）将含有混合菌液Ⅳ的1.5mL离心管D放入离心机内，2000转/分钟，离心30秒，倒掉澄清液体，形成沉淀物Ⅵ，将沉淀物Ⅵ涂抹在含有卡那霉素的LB固体培养基中，在37℃条件，培养12个小时，形成含有混合菌液Ⅳ的抗生素LB固体培养基；

2）质粒提取

（1）挑取含有混合菌液Ⅳ的抗生素LB固体培养基上的单菌落，接种于50mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，振荡培养12小时，形成卡那霉素LB液体培养液B； 

（2）将1mL卡那霉素LB液体培养液B移入1.5mL的离心管E中，放入离心机内，8000转/分钟，离心5分钟，弃去上层澄清液体；

（3）重复步骤2一次，收集菌体Ⅱ； 

（4）在含有菌体Ⅱ的1.5mL离心管E中加入100μL溶液Ⅰ，悬浮，形成悬浮菌液Ⅴ；

（5）在含有悬浮菌液Ⅴ的1.5mL离心管E中加入200μL新鲜配制的溶液Ⅱ，混匀，0℃的冰水混合物中静置5分钟，形成悬浮菌液Ⅵ；

（6）在含有悬浮菌液Ⅵ的1.5mL离心管E中加入150μL溶液Ⅲ，混匀，0℃的冰水混合物中静置10分钟，放入离心机内，12000 转/分钟，离心10分钟，形成悬浮菌液Ⅶ；

（7）取悬浮菌液Ⅶ500uL移至1.5mL的离心管F中，加入等体积的异丙醇，21℃条件下静置10分钟，放入离心机，12000转/分钟，离心15分钟，弃去澄清液体，形成菌体Ⅲ； 

（8）将含有菌体Ⅲ的1.5mL离心管F中加入200μL的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸（Tris-Hcl-EDTA，TE）使菌体Ⅲ溶解，后加入50μL的7.5mol/L醋酸铵，混匀，0℃的冰水混合物中静置10分钟，放入离心机，12000转/分钟，离心15分钟；

（9）取步骤（8）中的澄清液体250μL，转至1.5mL的离心管G中，加入250μL异丙醇和500μL无水乙醇，21℃条件下静置30分钟，放入离心机，12000 转/分钟，离心10分钟，形成沉淀物Ⅶ；

（10）用75%乙醇对沉淀物Ⅶ洗涤三次，风干加入50μL的三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸，Tris-Hcl-EDTA，TE，pH为8.0溶液使沉淀物Ⅶ溶解，备用；

（11）对稀释后的沉淀物Ⅶ溶液进行琼脂糖凝胶电泳结果鉴定，得到含有两个酶切位点6个碱基、上下游引物两端各3个保护碱基和1182个碱基载体共1200个碱基的重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53质粒；

步骤十四、重组转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53进行酶切鉴定：酶切体系为：在一个新的0.2ml的离心管F中加入10.0μL的转人类肿瘤抑制基因增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1-P53，2.0μL的2×Buffer E，0.2μL的牛血清白蛋白，BSA，HindⅢ 0.5μL，BamHⅠ0.5μL，加去离子水至总体积为20μL，37℃,消化4小时，为酶切产物Ⅲ；对酶切产物Ⅲ进行琼脂糖凝胶电泳结果鉴定，得到人类肿瘤抑制基因，P53和增强型绿色荧光蛋白载体，pEGFP-N1。

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