KR101093806B1 - 유전자 전달을 위한 나노 구조체 및 그의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 전달을 위한 나노 구조체, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 키트 또는 의약 조성물, 이를 이용한 유전자 전달 방법 및 창상 치료 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 (i) 나노섬유, (ii) 효소 기질 펩티드, 및 (iii) 양이온성 고분자와 유전자의 복합체를 포함하는 유전자 전달을 위한 나노 구조체로서, 상기 나노섬유와 상기 복합체가 상기 효소 기질 펩티드에 의해 연결되어 있는 나노 구조체, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 키트 또는 의약 조성물, 이를 이용한 유전자 전달 방법 및 창상 치료 방법에 관한 것이다.

효소 절단, 나노 구조체, 유전자 전달, 창상 치료

Description

유전자 전달을 위한 나노 구조체 및 그의 제조 방법{Nano scaffold for gene delivery and a method for preparing the same}

본 발명은 유전자 전달을 위한 나노 구조체, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 키트, 이를 이용한 유전자 전달 방법 및 창상 치료 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 (i) 나노섬유, (ii) 효소 기질 펩티드, 및 (iii) 양이온성 고분자와 유전자의 복합체를 포함하는 유전자 전달을 위한 나노 구조체로서, 상기 나노섬유와 상기 복합체가 상기 효소 기질 펩티드에 의해 연결되어 있는 나노 구조체, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 키트, 이를 이용한 유전자 전달 방법 및 창상 치료 방법에 관한 것이다.

유전자 치료는 유전자를 특정 세포에 전달하여 질병을 치료하거나 예방하는 새로운 치료 방법이다. 구체적으로, 유전자 치료는 세포 안에 결손된 유전자를 정상 유전자로 치료하거나, 새로운 유전자를 집어 넣어 몸 안에 새로운 기능을 부여하거나, 과잉 또는 과소 작용을 하는 유전자의 기능을 조절하는 방법이다. 유전자 치료에서 치료 유전자를 대상 세포에 도입하기 위하여 필요한 매개체가 유전자 전달체이다.

이러한 유전자 전달체는 바이러스성 전달체와 비 바이러스성 전달체가 있다. 그러나, 바이러스는 강력한 면역 반응을 일으켜 독성을 나타낼 뿐만 아니라, 다시 투여하는 것도 어렵다는 단점 때문에 바이러스를 쓰지 않는 방법이 많이 연구되고 있다.

한편, 최근 나노섬유를 유전자 전달체로 이용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다(M Hadjiargyrou et al., Journal of Controlled Release, 89, "Development of a nanostructured DNA delivery scaffold via electrospinning of PLGA and PLA-PEG block copolymers", 2003, 341-353). 나노섬유는 전기 방사 방법을 이용하여 얻을 수 있는데, 이것은 경제적이고, 원하는 원료 물질을 이용하여 손쉽게 얻을 수 있는 장점이 있다. 특히, 상처 치유 측면에서 볼 때, 전기 방사를 통하여 얻어진 나노 구조체, 즉 나노 섬유는 표면적이 넓어 원하는 약물 또는 유전자를 효과적으로 수식할 수 있고, 형태적으로는 세포외 기질(ECM, extracellular matrix)과 유사하여, 세포의 분화 또는 성장을 촉진시킬 수 있는 역할을 한다. 또한, 무작위적으로 배열되어 있는 나노섬유의 성질로 인하여 외부에서 박테리아의 침입을 막아줄 수 있다. 이러한 특징으로 인하여 나노섬유는 조직 공학 분야에서 많이 응용되고 있다. 나노섬유 표면에 창상 치료를 촉진하는 약물(또는 성장 인자)을 수식할 수도 있다(Hyuk Sang Yoo et al., Biomaterials, "In vivo wound healing of diabetic ulcers using electrospun nanofibers immobilized with human epidermal growth factor", 29, 2008, 587-596).

한국공개특허 10-2006-0097806호는 고분자 수지가 휘발성 용매에 용해되어 있는 방사 용액을 고 전압하에서 노즐을 통해 컬렉터 상에 전기 방사하여 굵기가 60-4000nm인 나노섬유를 제조함에 있어서, 방사 용액을 구성하는 휘발성 용매의 비등점 이상이며 고분자 수지의 2차 유리 전이 온도(Tg) 이하인 온도 범위까지 상기 컬렉터를 가열해 주는 것을 특징으로 하는 다공성 나노 섬유의 제조 방법을 개시하고 있다. 이렇게 하여 제조된 나노 섬유는 나노 섬유를 관통하지 않는 슬릿(slit) 형태의 미세 공극(pore)들이 다수 형성되어 있어서 유전자 전달체로 사용될 수 있음을 기재하고 있다.

미국공개특허 2008/0149561호는 나노섬유를 포함하는 섬유형 지지체; 및 상기 섬유형 지지체 표면 위에 배치된 계면 중합된 중합체 층을 포함하는 물품을 기재하고 있다. 상기 계면 중합된 중합체 층은 기능성 분자로서 DNA, RNA 등을 포함할 수 있어서, 생물학적인 기판(예를 들면, 조직 재생을 위한 스캐폴드, 고정된 효소 및 촉매 시스템, 창상 드레싱, 인공 혈관, 수술 후 유도된 협착의 예방을 위한 물질)으로 사용될 수 있음을 기재하고 있다.

그러나, 나노섬유를 이용하여 유전자를 전달하는 방법은 여러 가지 문제점을 갖고 있다. 대부분의 유전자 전달 시스템이 갖고 있는 문제점으로서, 전달된 유전자가 실제로 단백질로 발현되기까지의 시간이 너무 길다는 문제점이 있다.

한편, 상처가 생기게 되면 상처 부위에 상처 치유를 위한 여러 가지 성장 인자나 효소와 같은 생체 활성 물질이 생성된다. 그 중 하나가 매트릭스 메탈로프로테인아제(matrix metalloproteinase, MMP)이다. MMP는 세포 외 기질을 녹여 상처 부위로의 세포 이동을 도와 상처 치유를 촉진시키는 역할을 하는 효소이다. 암세포 에서 과 발현된다고 알려져 있는 이 효소는 보통 세포에서도 적정 수준이 발현되나, 상처 발생 시 상처 부위에서 과 발현된다고도 알려져 있다. 따라서, 이 효소의 기질을 링커로 이용하여 유전자 전달체를 만들어 암세포나 상처 부위에서만 특정하게 유전자가 방출되도록 설계하여 유전자의 손실을 줄이고, 정확하게 부작용이 없이 원하는 유전자를 전달할 수 있는 연구가 진행되고 있다(Youngro Byun et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 67, 2007, 646-654).

본 발명은 유전자 전달을 위한 나노 구조체, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 키트 또는 의약 조성물, 이를 이용한 유전자 전달 방법 및 창상 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 유전자 전달을 위한 나노 구조체, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 키트, 이를 이용한 유전자 전달 방법 및 창상 치료 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 유전자 전달을 위한 나노 구조체는 (i) 나노섬유, (ii) 효소 기질 펩티드, 및 (iii) 양이온성 고분자와 유전자의 복합체를 포함하는 유전자 전달을 위한 나노 구조체로서, 상기 나노섬유와 상기 복합체가 상기 효소 기질 펩티드에 의해 연결되어 있을 수 있다.

상기 나노 구조체에서 효소 기질 펩티드의 한쪽 말단에는 나노섬유가 결합되어 있고, 또 다른 쪽 말단에는 양이온성 고분자와 유전자의 복합체가 결합될 수 있다.

상기 나노섬유는 폴리카프로락톤 또는 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록 공중합체, 폴리락트글리콜산(PLGA), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 또는 폴리락트글리콜산-폴리에틸렌글리콜 공중합체(PLGA-PEG)를 포함하는 폴리에스테르 계 고분자 또는 콜라겐을 포함하는 생분해성 고분자를 포함할 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 나노섬유는 나노섬유의 표면에 아민기가 노출된 것일 수 있다. 나노섬유의 직경은 560-860 nm으로 할 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 나노섬유의 제조 방법은 전기방사를 이용하여 고분자로부터 나노섬유를 제조하는 분야에서 알려져 있는 통상적인 방법을 사용할 수 있다.

상기 효소 기질 펩티드는 매트릭스 메탈로프로테인아제(matrix metalloproteinase, MMP) 계열(family)을 포함하는 가수분해 효소 특이적 펩티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 효소 기질 펩티드는 MMP-2 또는 MMP-9를 포함할 수 있다. 더 바람직하게는 효소 기질 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열(DGPLGVC)을 포함할 수 있다. 상기 효소 기질 펩티드는 나노섬유 및 양이온성 고분자와의 결합을 위하여 이용가능한 작용기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 효소 기질 펩티드는 카르복시기, 티올기 등을 포함할 수 있다.

상기 나노섬유와 효소 기질 펩티드는 다양한 방법으로 결합될 수 있다. 예를 들면, 나노섬유의 작용기와 효소 기질 펩티드의 작용기를 반응시킴으로써, 나노섬유와 효소 기질 펩티드를 결합시킬 수 있다. 상기 작용기로는 아미노기, 카르복시기, 수산기, 티올기 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 나노섬유의 표면에 노출된 아민기와 효소 기질 펩티드의 카르복시기를 반응시킴으로써, 나노섬유와 효소 기질 펩티드를 결합시킬 수 있다.

상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민, 키토산, 프로타민(protamine) 및 그 유도체들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 양이온성 고분자는 효소 기질 펩티드와의 결합을 위하여, 활성화된 양이온성 고분자일 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 25000 달톤의 분자량을 보유하는 선형 또는 분지형의 형태일 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

상기 양이온성 고분자는 나노섬유가 결합된 효소 기질 펩티드의 다른 쪽 말단에 결합될 수 있다. 예를 들면, 양이온성 고분자는 이황화 결합에 의해 효소 기질 펩티드에 결합될 수 있다. 예를 들면, 양이온성 고분자는 활성화되어 효소 기질 펩티드에 결합될 수 있다.

상기 유전자는 gDNA, cDNA, 플라스미드 DNA, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 뉴클레오티드, 미스센스 뉴클레오티드 및 단백질 생산 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 유전자는 상처 치유를 촉진하는 성장인자를 발현시키는 유전자일 수 있다. 예를 들면, 유전자는 EGF(epidermal growth factor), 섬유아세포 성장인자 FGF(fibroblast growth factor), 혈소판유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 종양성장인자-b(transforming growth factor-b, TGF-b), 혈관세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, vEGF) 또는 인슐린(insulin)을 발현하는 유전자일 수 있다. 예를 들면, 유전자는 서열번호 2의 DNA 서열을 갖는 EGF와 서열번호 3의 DNA 서열을 갖는 FGF가 될 수 있다. 또는 상기 유전자는 항종양 유전자일 수 있다. 예를 들어 항종양 유전자는 종양억제유전자, 아폽토시스 유발인자 유전자, 세포 주기 조절 유전자 또는 혈관신생 억제 유전자일 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자는 양이온성 고분자에 결합되어 양이온성 고분자와 유전자의 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들면, 유전자의 음전하와 양이온성 고분자의 양전하가 이온 결합에 의해 복합체를 형성할 수 있다.

본 발명에 따른 나노 구조체에서 N/P 비(나노 구조체의 질소 원자/핵산의 인산염 원자의 개수의 비율)는 0.1 - 100 범위 내일 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 나노 구조체의 일 실시예, 및 이러한 나노 구조체가 MMP에 의해 효소 절단된 후 상처 부위의 표피 세포에서 성장 인자를 방출시키는 것을 나타낸 것이다.

도 1에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 나노 구조체는 일 실시예로, 나노섬유의 아미노기에 MMP 특이적 펩티드가 결합되어 있고, 추가로 폴리에틸렌이민과 유전자의 복합체가 MMP 특이적 펩티드와 이황화 결합을 형성하면서 결합된 구조를 갖고 있다. 본 발명에 따른 나노 구조체가 상처 부위에 있는 세포와 접촉할 경우, 상처 부위에서 과량으로 형성되는 MMP에 의해 MMP 특이적 펩티드가 분해되고, 이로부터 폴리에틸렌이민과 유전자의 입자가 방출된다. 방출된 폴리에틸렌이민과 유전자 입자는 상처 부위가 있는 표피 세포에 주입되어 특정 유전자를 발현시킴으로써 상처 치유를 도와주게 된다. 이를 통해, 무작위적으로 유전자를 방출시키는 것이 아니라, 상처 부위에서 과량으로 발현되는 MMP를 이용하여, 상처 부위에서만 특이적으로 유전자를 방출시킴으로써 상처 치유를 촉진시키는 것이 가능할 수 있다. 또한, 본 발명의 나노 구조체는 유전자 방출 속도를 제어할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 나노 구조체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 나노 구조체의 제조 방법은 (i) 나노섬유를 제조하는 단계; (ii) 상기 나노섬유에 효소 기질 펩티드를 결합시켜, 나노섬유가 결합된 효소 기질 펩티드를 제조하는 단계; (iii) 상기 나노섬유가 결합된 효소 기질 펩티드에 양이온성 고분자를 결합시키는 단계; 및 (iv) 상기 양이온성 고분자에 유전자를 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.

나노섬유, 효소 기질 펩티드, 양이온성 고분자 및 유전자에 대한 상세한 내용은 상기 나노 구조체에서 서술된 부분과 동일하게 적용된다.

나노섬유는 전기방사를 이용하여 고분자로부터 나노섬유를 제조하는 분야에서 알려져 있는 통상적인 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 나노섬유 제조용 고분자를 위한 유기 용매뿐만 아니라, 노즐의 직경, 방출 속도, 전압, 노즐과 그라운드(ground)의 거리, 전기 방사시 온도와 습도 등을 포함하는 방출 조건은 적절하게 변형시킬 수 있다. 유기 용매는 휘발성이 높고 고분자를 용해시킬 수 있는 유기용매를 포함할 수 있고, 예를 들면 디클로로메탄, 클로로포름 또는 디옥세인, 디메틸설폭시드를 사용할 수 있고, 노즐의 직경은 27 G, 방출 속도는 1ml/h, 전압은 15kV, 노즐과 그라운드의 거리는 15cm, 전기 방사 시 온도와 습도는 각각 25℃와 30~50%로 조절할 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

나노섬유에 효소 기질 펩티드를 결합시켜, 나노섬유가 결합된 효소 기질 펩티드를 제조할 수 있다. 나노섬유와 효소 기질 펩티드는 다양한 방법을 사용하여 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 나노섬유의 작용기와 효소 기질 펩티드의 작용기를 반응시킴으로써, 나노섬유와 효소 기질 펩티드를 결합시킬 수 있다. 상기 작용기로는 아미노기, 카르복시기, 수산기, 티올기 등을 포함할 수 있다. 상기 결합에서는 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드), NHS(N-히드록시숙신이미드) 또는 HOBt(히드록시벤조트리아졸)를 포함하는 커플링 제를 추가로 사용할 수 있다. 도 2는 본 발명의 일 실시예인 PCL-PEG 블록 공중합체와 MMP-특이적 펩티드가 결합된 것을 나타낸 것이다.

상기 나노섬유가 결합된 효소 기질 펩티드에 양이온성 고분자를 결합시킬 수 있다. 상기 양이온성 고분자는 나노섬유가 결합된 효소 기질 펩티드의 다른 쪽 말단에 결합될 수 있다. 상기 결합은 화학적 결합을 포함하는 다양한 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 효소 기질 펩티드의 티올기와, 양이온성 고분자가 결합될 수 있다. 또한, 상기 양이온성 고분자는 효소 기질 펩티드와의 결합을 위하여, 활성화될 수 있다. 양이온성 고분자는 SPDP(N-숙시니미딜 3-(2-(피리딜티오)-프로피오네이트) 또는 LC-SPDP(숙시니미딜 6-(3-[2-피리딜티오]-프로피온아미도)헥소네이트)로 활성화될 수 있다. 양이온성 고분자의 티올기를 활성화시키고, 활성화된 양이온성 고분자를 효소 기질 펩티드에 결합시킬 수 있다. 도 2는 본 발명의 일 실시예인 MMP-특이적 펩티드의 티올기와, SPDP로 활성화된 폴리에틸렌이민이 이황화 결합을 통하여 결합된 것을 나타낸 것이다.

상기 양이온성 고분자에 유전자를 결합시킬 수 있다. 상기 결합은 이온결합, 소수성 결합, 배위결합을 포함하는 다양한 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 양이온성 고분자의 양전하와 유전자의 음전하의 이온 결합에 의해서, 양이온 성 고분자와 유전자는 결합하여 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들면, 나노섬유와 효소 기질 펩티드가 결합된 양이온성 고분자에 유전자를 포함하는 용액을 첨가하고 반응시킴으로써 결합시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 나노 구조체를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 본 발명에 따른 나노 구조체, 또는 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 나노 구조체를 포함할 수 있다. 또한 본 발명은 본 발명의 나노 구조체를 포함하는 의약조성물 또는 유전자치료제를 제공한다. 본 발명에 의한 키트, 의약조성물 또는 유전자 치료제는 일 실시예로 창상 치료 또는 종양치료에 사용될 수 있으며, 이때 효소 기질 펩티드로써 창상 부위 또는 종양부위에서 과발현되는 MMP의 기질펩티드를 사용할 수 있다.

본 발명의 의약조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 경구 또는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 국소투여용 제제, 상처치료용 드레싱 등이 바람직하다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약제학적으로 허용할 수 있는 용매를 사용한 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체 혹은 매체, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형체, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당히 조합하여, 일반적으로 인정되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량 및 투여시기는 투여대상의 나이, 성별, 상태, 체중, 투여경로, 투여 횟수, 약의 형태에 따라서 달라진다. 일일 투여량은 약 0.01 ug/kg 내지 10g/kg이고, 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 100mg/kg 이다.

또한, 본 발명은 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 세포에 유전자를 전달하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 세포를 본 발명의 나노 구조체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 접촉시키는 방법은 예를 들면, 나노 구조체의 국소 투여, 전신 투여, 정맥내 투여, 비경구 투여를 이용할 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 인 비트로 또는 인 비보의 세포에서 창상 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 나노 구조체를 인 비트로 또는 인 비보의 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 접촉시키는 방법은 예를 들면, 나노 구조체의 국소 투여, 전신 투여, 정맥내 투여, 비경구 투여를 이용할 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 무작위적으로 유전자를 방출시키는 것이 아니라, 특정 부위에서 과량으로 발현되는 효소를 이용하여, 그 부위에만 특이적으로 유전자를 전달할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<시약 및 시료>

폴리카프로록탄[poly(ε-caprolactone), Mw 70,000-100,000]은 와코사(Wako)에서 구입하였다. 아민기가 결합된 PEG[polyethyleneglycol, Mw 2,000]은 선 바이오(SunBio, 한국)에서 구입하였다. 선형 PEI[polyethyleneimine, Mw 25,000]는 폴리사이언스사(Polyscience, Inc.)에서 구입하였다. MMP에 의해 절단되는 MMP 기질 펩티드는 애니젠(Anygen, 한국)에서 제작하였다. 플루오레스카민(Fluorescamine)은 시그마사(Sigma)에서 구입하였다. PEI정량을 위한 Advanced Protein Assay (APA) 시약은 사이토스켈레톤사(Cytoskeleton)에서 구입하였다. 말단에 아민기를 갖는 퀀텀닷(QD-NH₂)은 이바이오사이언스사(ebioscience)에서 구입하였다. NIH 3T3세포는 한국세포주은행에서 분양받았다.

실시예 1: 나노 구조체의 제조

(1) 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록 공중합체의 제조

폴리카프로락톤(PCL)(Mw 70,000-10,000) 3g을 디클로메탄 30ml에 녹인 후 0℃에서 교반하였다. 얻은 용액에 피리딘 9.7㎕와 p-니트로 페닐 클로로포르메이트 12mg을 첨가하였다(PCL, p-니트로 페닐 클로로포르메이트, 및 피리딘의 몰 비는 1:2:4임). 얻은 혼합물을 실온에서 3시간 동안 더 반응시킨 후, 얼음으로 냉각시킨 디에틸 에테르에 침전시키고 진공 상태에서 하루 밤 동안 건조시켰다. 상기 침전 반응을 두 번 반복한 후 건조시켜, 활성화된 폴리카프로락톤 2g을 얻었다. 얻은 활 성화된 폴리카프로락톤 2g과 폴리에틸렌글리콜 0.2g을 각각 디클로로메탄 20㎖에 용해시켰다(폴리카프로락톤과 폴리에틸렌글리콜의 몰 비는 5:1임). 얻은 폴리카프로락톤 디클로로메탄 용액을 폴리에틸렌글리콜 디클로로메탄 용액에 천천히 적가하였고, 이때 교반을 빠르게 하여 균일한 반응이 일어나도록 하였다. 적가한 후에, 실온에서 24시간 동안 반응시킨 후, 얼음으로 냉각시킨 에탄올에 부어 침전시켰다. 침전된 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록 공중합체를 진공 상태에서 하루 밤 동안 건조시켰다. 얻은 블록 공중합체의 합성 수율을 400 Hz ¹H NMR로 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 나타난 바와 같이, 폴리카프로락톤과 폴리에틸렌글리콜이 1:1의 비율로 합성되고, 디블록 공중합체를 형성하였음을 확인하였다. 제조한 공중합체는 밀폐시켜 냉동 보관하였다.

(2) 나노섬유 제조

상기 합성된 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 블록 공중합체를 클로로포름과 메탄올을 1:3으로 혼합한 유기 용매에 10중량%의 농도로 녹였다. 전기 방사용 기계에 상기 얻은 용액을 방출 속도 1m/h, 전압은 15kV, 노즐과 그라운드의 거리는 15cm, 직경 27G의 노즐을 통해 흘려 주었다. 방사 시 온도와 습도는 각각 25℃, 습도는 30-50%를 유지하였다. 전기 방사 후 얻은 섬유의 모양을 FE-SEM(Field Emission Scanning Electron Microscope)을 통해 관찰하였고, 이미지 분석을 통하여 직경을 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 나타난 바와 같이, 비드가 생성되지 않은 나노섬유가 제조되었음을 확인하였다. 또한 제조된 나노 섬유의 굵기는 약 500 nm 내지 1 ㎛가 되었다.

(3) 나노섬유에 MMP 기질 펩티드 및 폴리에틸렌이민을 결합

(i) 표면에 노출된 아민의 정량

상기 제조된 나노섬유를 30% 에탄올로 적신 후, PBS(pH 7.5)로 수화시켰다. 플루오레스카민(0.3 mg/ml)을 아세톤에 녹여 나노섬유에 분주한 후, 상온에서 30분 동안 반응시켰다. PBS를 제거하고 메탄올로 30분 동안 세척하였고, 세척 과정을 3회 반복하였다. 얻은 나노섬유를 건조시킨 후, 1,4-디옥산에 완전히 녹여 형광을 측정하였다. 이를 통해 나노섬유의 표면에 노출된 아민을 정량한 결과 0.387 nmol/mg의 아민이 노출되었음을 확인하였다. 이는 나노섬유의 전체 아민 중 3-4%가 노출된 정도로, 한정된 넓이에 나노섬유를 받는 전기 방사 과정에서 많은 양의 아민이 겹겹이 쌓이면서 아민이 내부로 들어가게 되어 실질적으로 나노섬유의 표면에 노출되는 아민의 함량은 적은 것으로 판단된다.

(ii) 나노섬유에 MMP 기질 펩티드와 폴리에틸렌이민을 결합

폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 나노섬유를 30% 에탄올로 적신 후, PBS-EDTA(pH 7.5) 버퍼로 수화시켰다. 얻은 용액에 MMP 기질 펩티드를 동일한 버퍼에 녹인 것을 첨가하였다(이때 나노섬유의 표면에 노출된 아민과 펩티드의 몰비는 1:1이 되도록 하였음). 얻은 혼합 용액에 EDC와 NHS를 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다(EDC와 NHS의 몰수는 펩티드 몰수의 10배 가량으로 첨가하였음). 폴리에틸렌이민은 PBS-EDTA에 녹이고, 20mM SPDP와 혼합하고 실온에서 30분 동안 반응시 켜, 폴리에틸렌이민을 활성화시켰다. 활성화된 폴리에틸렌이민과 펩티드가 결합된 나노섬유를 혼합하고, 실온에서 하루 밤 동안 반응시킨 후, 건조시켰다.

폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 나노섬유의 표면에 폴리에틸렌이민이 결합된 정도를 X-레이 광전자 스펙트로스코피(photoelectron spectroscopy, XPS, ESCA-2000(Thermo Scientific))를 이용하여 측정하였다. XPS는 X-레이 급원으로 비-단색형 색각된(non-monochromated) Al 조사를 사용하였다. XPS의 결과 C1s, O1s, N1s를 포함하는 스펙트럼을 얻게 되고, 폴리에틸렌이민이 결합된 정도는 C1s 피크와 O1s 피크의 세기를 N1s의 피크의 세기와 비교하여 측정한다. 비교를 위하여 폴리에틸렌이민을 결합시키지 않은 폴리카프로락톤-폴리에틸렌이민 나노섬유에 대해서도 XPS를 실시하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 나타난 바와 같이, 폴리에틸렌이민이 결합된 나노섬유는 0.384 nmol/mg의 질소가 있음을 확인하였다. 이는 나노섬유의 표면에 노출된 폴리에틸렌글리콜의 99.2%(0.384/0.387=0.99)에 해당하는 아민이 폴리에틸렌이민과 결합하였음을 나타낸다.

(4) 폴리에틸렌이민에 유전자를 결합

실리콘 코팅 처리된 마이크로 튜브에 상기 제조한 나노섬유를 넣고 30% 에탄올로 적신 후, 1ml PBS로 수화시켰다. 여기에, GFP를 발현하는 플라스미드 DNA(GenBank Accession #U55762)(서열번호 4)를 하기 표 1에 따른 N/P 비율로 첨가하였다. 유전자가 결합하는 나노섬유는 고정되어 있고 따라서 폴리에틸렌이민의 함량도 고정되어 있으므로, DNA의 함량을 다르게 첨가함으로써 N/P 비율을 조절하였 다. 결국 N/P 비율이 낮아질수록 첨가되는 DNA의 양을 늘였다. DNA를 첨가한 후 37℃에서 교반시키면서 하루 밤 동안 반응시켰다. 나노섬유를 건져내고 남아있는 상층액의 흡광도를 측정함으로써 나노섬유와 결합하지 않은 DNA의 함량을 측정하였다. 이러한 방법으로 나노섬유에 유전자가 결합하였는지 여부 및 N/P 비율에 따라 유전자가 결합하는 정도를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

<표 1>

N/P 비율에 따른 나노섬유 NF	첨가해준 DNA의 양 (㎍/device)	나노섬유에 결합된 DNA의 양(㎍/device)	나노섬유-DNA 결합율(％)
NF 2	36.7	6.4±0.5	17.4±1.4
NF 4	18.3	5.7±0.8	30.9±4.5
NF 8	9.2	4.4±0.7	47.8±7.7
NF 16	4.6	3.9±0.2	79.5±3.3

표 1에서 살핀 바와 같이, 나노섬유에 유전자가 결합하였음을 확인할 수 있고, 결합율에 있어서는 N/P 비율이 16이었을 때 나노섬유에 유전자가 효과적으로 결합하였음을 알 수 있다.

실시예 2: 나노구조체로부터 폴리에틸렌이민-플라스미드 DNA 의 방출(1)

상기 실시예 1에 따라 제조된 N/P 비율(2, 4, 8, 16)을 갖는 나노 구조체를 실리콘 코팅 처리된 50 ml 코니칼 튜브에 넣고 30% 에탄올로 적신 후, PBS 5 ml(pH 7.5)를 첨가하여 나노 구조체를 수화시켰다. 여기에 MMP-2를 MMP 기질 펩티드와 동일한 몰수로 첨가한 후, 37℃에서 250rpm으로 교반하였다. 교반 시간은 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 및 72시간으로 하였다. 상기 교반 시간 별로 용액을 분취하였고, 분취한 용액으로부터 폴리에틸렌이민과 DNA를 정량하였다.

각각의 교반 시간별로 용액 50㎕를 분취하였고, 분취한 용액에 1 x APA 시약을 1.5ml 첨가하여 섞어준 후, 상온에서 30분 동안 반응시켰다고, 590nm에서 흡광값을 측정하여, 방출된 폴리에틸렌이민을 정량하였다. 동일한 방법으로 260nm에서 흡광도를 측정하여, 방출된 DNA를 정량하였다. 그 결과를 도 6(a와 c)에 나타내었다.

또한, MMP를 처리하지 않은 대조군도 상기와 동일한 방법으로 폴리에틸렌이민과 DNA의 방출량을 정량하였고, 그 결과를 도 6(b와 d)에 나타내었다.

도 6에서 살핀 바와 같이, 시간 경과에 따라 NF 2의 DNA 방출이 가장 크게 증가하였다. 이는 N/P 비율이 낮을수록 PEI-DNA간 결합력이 낮아지기 때문이다. 반면 PEI의 방출에서는 NF 16이 가장 많이 방출되었다. 표 1을 참고했을 때 본 나노섬유는 N/P 비율이 낮아질 수록 결합된 DNA의 양이 많았다. 때문에 MMP가 링커(MMP 특이적 펩티드)를 끊는 작용을 방해하여 NF 2의 PEI가 가장 적게 방출된 것으로 보인다. 낮은 대조군의 방출 정도를 확인함으로써 MMP 특이적 펩티드가 효과적으로 PEI/DNA 복합체의 방출을 조절함을 확인하였다.

실시예 3: 나노구조체로부터 폴리에틸렌이민-플라스미드 DNA 의 방출(2)

0.5mg/ml DNA에 0.5M NaHCO₃(pH 9.6) 3ml를 첨가한 후, NBS를 DNA의 10배(몰비)로 첨가하고 얼음에서 10분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 말단에 아민 작용기를 갖는 Quantum dot을 1/10(몰비)으로 첨가하여 50℃에서 1시간 동안 반응시시켰고 상온에서 하루밤 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 QD-DNA를 투석막(cut off=10kDa)을 이용해 투석시켜, QD-DNA를 얻었다.

얻은 QD-DNA를 실시예 1에 따라 N/P 비율을 달리하여 나노섬유에 결합시켰다. 그런 다음, 실시예 2에 따라 MMP를 처리하기 전(0시간)과 MMP 처리한 후 72시간 째에 나노섬유를 공초점 현미경(Confocal laser scanning microscopy, CLSM)을 이용해 방출차이를 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 나타난 바와 같이 MMP 처리 전과 후의 변화를 통해, 나노섬유로부터 PEI/DNA 복합체가 방출되었음을 시각적으로 확인할 수 있다.

또한, DLS(dynamic laser scattering)을 이용하여 방출된 PEI/DNA 복합체의 크기를 확인하였다. 그 결과는 표2에 나타내었다.

<표 2>

	평균 입자 크기(nm)
NF 2	505.1±19.3
NF 4	471.9±9.5
NF 8	379.9±15.7
NF 16	248.5±21.1

표 2에서 나타난 바와 같이, N/P 비율이 증가할수록 입자의 크기가 작아지는 경향을 보였다. 이는 N/P 비율이 증가할수록 PEI-DNA간 결합력이 증가하기 때문이다.

또한, DLS로 측정한 복합체가 제대로 형성되었는지 확인하기 위해 겔 지연 분석법(gel retardation assay)을 실시하였다. 0.32g 아가로스를 39.68 ml 1 x TBE 버퍼에 녹인 후, 2㎕ EtBr(Ethidium bromide)을 첨가하여 섞어준 뒤, 틀에 붓고 콤(comb)dmf 끼워 30분 굳혔다. 72시간까지 방출이 끝나고 남은 용액을 동결 건조하여 100㎕ 3차 증류수로 녹여 샘플을 준비하였다. 2.5㎕ 5 x 로딩 버퍼(loading buffer)와 10㎕ 샘플을 섞어 각 웰에 분주한 후, 100V에서 20분 동안 전기영동을 하였다. 20분 경과 후, UV 트랜스일루미네이터(transilluminator)로 입자의 이동을 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 나타난 바와 같이 겔 지연 분석 결과 모든 그룹의 웰 안에 입자가 남아있음을 보였다. 이로써 PEI/DNA 복합체가 확실하게 형성되었음을 확인할 수 있었다.

이렇게 방출된 복합체를 이용하여 트랜스펙션(transfection)(유전자 전달효율측정을 위한 실험)을 진행하였다. 72시간 방출이 끝난 용액을 동결건조 시켜 얻은 파우더를 100㎕ 3차 증류수에 녹여 준비하였다. 12 웰에 NIH 3T3를 5x10⁵ 세포수/웰로 계대 배양을 하고, 24시간 동안 안정화 시킨 후, 900㎕의 무혈청 DMEM배지와 100㎕ 샘플을 처리하여 5시간 동안 트랜스펙션을 진행하였다. NF는 2, 4, 8, 16으로 진행하였다. 이때, DNA양에 따른 트랜스펙션 결과 차이를 알아보기 위해 부피를 동일(100㎕)하게 하여 녹인 그룹과 PEI의 영향을 알기 위해 DNA의 양을 동일(5㎍)하게 한 그룹의 실험을 진행하였다(즉, NF 2에서 PEI/DNA 복합체가 가장 많이 방출되었기 때문에 모든 그룹을 같은 부피로 녹여서 처리하게 되면 NF 2의 방출된 분획을 처리한 웰에 가장 많은 양의 PEI/DNA 복합체가 들어가게 되고, 모든 그룹의 DNA의 양을 동일하게 되도록 계산하여 처리하게 되면 NF 16의 방출된 분획을 처리한 웰이 가장 많은 PEI가 들어가게 되므로 둘의 차이를 비교하기 위해 각각 실험을 진행하였다.) 5시간 경과 후, 혈청 포함 DMEM 배지로 갈아주었다. 43시간 후, 2ml 용해 버퍼(lysis buffer)를 처리하여 세포를 용해시켜 BCA 분석(Bicinchoninic acid assay)으로 총 발현된 단백질의 양을 측정하고, 발현된 GFP의 형광을 형광광도계(spectrofluorometer)를 이용하여 측정하였다. 이는 도 9에 나타냈다. 도 9에서 용적(volume)은 방출된 분획을 동결건조시켜 얻은 분말을 100㎕의 증류수에 녹여 처리한 것이다. 도 9에서 나타난 바와 같이, N/P 비율이 높아질수록 트랜스펙션 효율이 증가함을 보였다.

도 1은 본 발명에 따른 나노 구조체, 및 나노 구조체가 MMP에 의해 효소 절단된 후 상처 부위의 표피 세포에서 성장 인자를 방출시키는 것을 나타낸 것이다.

도 2는 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록 공중합체에 MMP 특이적 펩티드, 및 폴리에틸렌이민이 결합되는 과정의 일 실시예를 나타낸 것이다.

도 3은 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 블록 공중합체의 ¹H-NMR 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록 공중합체를 전기 방사하여 제조된 나노섬유의 표면을 2000배(a), 및 5000배(b)의 배율로 확대한 것이다.

도 5는 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록 공중합체를 전기 방사하여 제조된 나노섬유에 MMP 기질 펩티드를 결합시킨 후, 폴리에틸렌이민을 결합하지 않은 경우(a)와 폴리에틸렌이민을 결합한 경우(b)의 XPS 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 나노섬유로부터 PEI/DNA 복합체의 방출실험으로 DNA와 PEI를 각각 정량한 결과이다. MMP를 처리한 그룹(A, C)과 MMP를 처리하지 않은 그룹(B, D)을 나태낸 것이다.

도 7은 퀀텀닷으로 염색한 유전자를 나노섬유에 결합시켜 MMP를 처리하기 전과 후를 비교하기 위해 공 초점 레이저 현미경으로 관찰한 것이다.

도 8은 PEI/DNA 복합체를 확인하기 위해 전기영동을 한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 방출된 PEI/DNA 복합체를 NIH 3T3로 트랜스펙션을 한 결과를 나타낸 것이다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> NANO SCAFFOLD FOR GENE DELIVERY AND A METHOD FOR PREPARING THE SAME <130> PN084215 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> MMP Peptide <400> 1 Asp Gly Pro Leu Gly Val Cys 1 5 <210> 2 <211> 165 <212> DNA <213> EGF <400> 2 atgaactcag atagtgaatg ccctttgagc cacgatggat attgcctaca tgacggtgtt 60 tgtatgtata tcgaggcttt agacaaatac gcatgcaact gcgttgttgg ttacatcgga 120 gaaagatgtc aataccgtga cttaaaatgg tgggaattac gttaa 165 <210> 3 <211> 570 <212> DNA <213> FGF <400> 3 atggcgagca aagaacccca gctcaaaggg attgtgacaa ggttattcag ccagcaggga 60 tacttcctgc agatgcaccc agatggtacc attgatggga ccaaggacga aaacagcgac 120 tacactctct tcaatctaat tcccgtgggc ctgcgtgtag tggccatcca aggagtgaag 180 gctagcctct atgtggccat gaatggtgaa ggctatctct acagttcaga tgttttcact 240 ccagaatgca aattcaagga atctgtgttt gaaaactact atgtgatcta ttcttccaca 300 ctgtaccgcc agcaagaatc aggccgagct tggtttctgg gactcaataa agaaggtcaa 360 attatgaagg ggaacagagt agagaaaacc aagccctcat cacattttgt accgaaacct 420 attgaagtgt gtatgtacag agaaccatcg ctacatgaaa ttggagaaaa acaagggcgt 480 tcaaggaaaa gttctggaca ccaccatgat ggaggcaagt tgtgatcagt tcacatgctg 540 agactcccct tcttccctct ctcatccctt 570 <210> 4 <211> 4733 <212> DNA <213> plasmid DNA <400> 4 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540 acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600 ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg 660 gatccaccgg tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 720 atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 780 gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 840 cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 900 taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 960 caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 1020 ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 1080 ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 1140 gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 1200 ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 1260 ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 1320 aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 1380 gacgagctgt acaagtaaag cggccgcgac tctagatcat aatcagccat accacatttg 1440 tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa 1500 tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 1560 atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 1620 ccaaactcat caatgtatct taaggcgtaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc 1680 gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 1740 ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 1800 agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 1860 gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 1920 gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 1980 aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 2040 gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 2100 gcgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 2160 atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 2220 tgaaaaagga agagtcctga ggcggaaaga accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt 2280 gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt 2340 cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc 2400 atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc 2460 cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg 2520 ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc 2580 taggcttttg caaagatcga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa 2640 gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 2700 gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 2760 ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca agacgaggca 2820 gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 2880 actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 2940 tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 3000 acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 3060 cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 3120 ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc 3180 gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 3240 ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 3300 acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 3360 ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 3420 tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag 3480 atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 3540 ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccctaggg 3600 ggaggctaac tgaaacacgg aaggagacaa taccggaagg aacccgcgct atgacggcaa 3660 taaaaagaca gaataaaacg cacggtgttg ggtcgtttgt tcataaacgc ggggttcggt 3720 cccagggctg gcactctgtc gataccccac cgagacccca ttggggccaa tacgcccgcg 3780 tttcttcctt ttccccaccc caccccccaa gttcgggtga aggcccaggg ctcgcagcca 3840 acgtcggggc ggcaggccct gccatagcct caggttactc atatatactt tagattgatt 3900 taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 3960 ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 4020 aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 4080 caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 4140 taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 4200 gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 4260 cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 4320 taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 4380 agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 4440 ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 4500 gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 4560 acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 4620 acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 4680 tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccatg cat 4733

Claims (19)

1. (i) 나노섬유, (ii) 효소 기질 펩티드, 및 (iii) 양이온성 고분자와 유전자의 복합체를 포함하는 유전자 전달을 위한 나노 구조체로서, 상기 나노섬유와 상기 복합체가 상기 효소 기질 펩티드에 의해 연결되어 있는 것인 나노 구조체.
2. 제1항에 있어서, 상기 나노섬유의 아미노기와 상기 효소 기질 펩티드의 카르복시기가 결합되어 연결되고, 상기 효소 기질 펩티드의 티올기와 상기 복합체를 구성하는 양이온성 고분자가 결합되어 연결된 것인 나노 구조체.
3. 제1항에 있어서, 상기 나노섬유는 폴리카프로락톤 또는 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블록 공중합체, 폴리락트글리콜산(PLGA), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 또는 폴리락트글리콜산-폴리에틸렌글리콜 공중합체(PLGA-PEG)를 포함하는 폴리에스테르계 고분자 또는 콜라겐을 포함하는 생분해성 고분자를 포함하는 것인 나노 구조체.
4. 제1항에 있어서, 상기 효소 기질 펩티드는 매트릭스 메탈로프로테인아제(matrix metalloproteinase, MMP)를 포함하는 가수분해효소 특이적 펩티드를 포함하는 것인 나노 구조체.
5. 제4항에 있어서, 상기 효소 기질 펩티드는 서열번호 1의 서열을 포함하는 것인 나노 구조체.
6. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 키토산, 프로타민 또는 그의 유도체들을 포함하는 것인 나노 구조체.
7. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 gDNA, cDNA, 플라스미드 DNA, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 뉴클레오티드, 미스센스 뉴클레오티드 및 단백질 생산 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 나노 구조체.
8. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 상피세포 성장인자 EGF(epidermal growth factor), 섬유아세포 성장인자 FGF(fibroblast growth factor), 혈소판유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 종양성장인자-b(transforming growth factor-b, TGF- b), 혈관세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, vEGF) 또는 인슐린(insulin)을 발현하는 유전자를 포함하는 것인 나노 구조체.
9. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 항종양 유전자를 발현하는 유전자를 포함하는 것인 나노 구조체.
10. 제1항에 있어서, 나노 구조체의 N/P(나노 구조체의 질소 원자/핵산의 인산염 원자의 비율)는 0.1 - 100의 범위인 것인 나노 구조체.
11. (i) 나노섬유를 제조하는 단계; (ii) 상기 나노섬유에 효소 기질 펩티드를 결합시켜, 나노섬유가 결합된 효소 기질 펩티드를 제조하는 단계; (iii) 상기 나노섬유가 결합된 효소 기질 펩티드에 양이온성 고분자를 결합시키는 단계; 및 (iv) 상기 양이온성 고분자에 유전자를 결합시키는 단계를 포함하는, 유전자 전달을 위한 나노 구조제를 제조하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 나노섬유의 작용기와 상기 효소 기질 펩티드의 작용기가 결합되는 것인 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 효소 기질 펩티드와 상기 양이온성 고분자는 화학적 결합에 의해 결합되는 것인 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 양이온성 고분자와 유전자는 이온 결합, 소수성 결합, 또는 배위 결합에 의해 결합되는 것인 방법.
15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 방법에 의해 제조된 유전자 전달을 위한 나노 구조체.
16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 나노 구조체를 포함하는 키트.
17. 삭제
18. 삭제
19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 나노 구조체를 포함하는 창상 또는 종양 치료용 의약 조성물.

Images