CN112639107A - 治疗clrn1相关的听力损失和/或视力损失的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包括单一核酸载体或两种不同核酸载体的组合物，以及这些组合物用以治疗受试者的听力损失和/或视力损失的用途。

Description

治疗CLRN1相关的听力损失和/或视力损失的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年6月25日提交的序列号为62/689,660的美国临时专利申请的优先权；所述美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及核酸用以治疗人受试者的听力损失、视力损失或两者的用途。
背景技术
当前对于听力损失的治疗主要由针对轻度至重度听力损失的听力放大以及针对重度至深度听力损失的耳蜗植入物组成；然而，对于用于预防或逆转综合征性耳聋的药剂和方法，仍有长期以来感到的需要。
听力损失可为传导性的(由耳道或中耳引起)，感觉神经性的(由内耳或听神经引起)，或混合性的。大多数形式的综合征性耳聋与由对内耳中的结构的损害引起的永久听力损失(感觉神经性耳聋)相关，但一些形式可涉及中耳中的变化(传导性听力损失)。绝大多数的人感觉神经性听力损失由耳蜗中的柯蒂氏器(organ of Corti)的毛细胞的异常(不良毛细胞功能)引起。毛细胞可在出生时是异常的，或可在个体的生存时间期间受到损害(例如由于噪声创伤或感染)。
发明内容
本发明涉及一种包括至少两种不同核酸载体的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，可用于在哺乳动物细胞中产生编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)的序列，并且由此治疗有需要的受试者的CLRN1相关的听力损失和/或视力损失。本发明还涉及包括单一核酸载体的组合物，所述单一核酸载体包括CLRN1蛋白的第一亚型和/或第二亚型的编码序列。
本文提供了包括至少两种不同核酸载体的组合物，其中：所述至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基，其中所编码部分中的每一者的氨基酸序列可任选地与所编码部分中的不同者的氨基酸序列部分重叠；所述至少两种不同载体中没有单一载体编码全长CLRN1蛋白；所述编码序列中的至少一者包括跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子，并且缺乏所述两个连续外显子之间的内含子序列的核苷酸序列；并且当引入哺乳动物细胞中时，所述至少两种不同载体经受彼此同源性重组，由此形成编码全长CLRN1蛋白的重组核酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的第一亚型的不同部分的编码序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括与SEQ ID NO：3具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括SEQ ID NO：3。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型由SEQ ID NO：3组成。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，至少两种不同核酸载体中的一者还包括编码CLRN1蛋白的第二亚型的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括与SEQ IDNO：5具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括SEQ ID NO：5。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型由SEQ ID NO：5组成。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的第二亚型的不同部分的编码序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括与SEQ ID NO：5具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括SEQ IDNO：5。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型由SEQ ID NO：5组成。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，至少两种不同核酸载体中的一者还包括编码CLRN1蛋白的第一亚型的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括与SEQ ID NO：3具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括SEQ ID NO：3。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，至少两种不同载体中的至少一者包括5’非翻译区(UTR)、3’UTR或两者。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少10个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少20个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少50个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少80个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性的序列。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少10个连续核苷酸。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少20个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少50个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少80个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的序列。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者是质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者是人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或P1源性人工染色体(PAC)。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者是选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者是AAV载体。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，所编码部分中没有一者的氨基酸序列与所编码部分中的不同者的氨基酸序列重叠。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，所编码部分中的每一者的氨基酸序列与所编码部分中的不同者的氨基酸序列部分重叠。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，重叠氨基酸序列的长度在约30个氨基酸残基至约202个氨基酸残基之间。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，载体包括两种不同载体，其中每一者包括内含子的不同区段，其中所述内含子包括存在于CLRN1基因组DNA中的内含子的核苷酸序列，并且其中两个不同内含子区段在序列方面重叠至少100个核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，两个不同内含子区段在序列方面重叠100个核苷酸至约800个核苷酸。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者的全部核苷酸序列的长度在约500个核苷酸至约10,000个核苷酸之间。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者的全部核苷酸序列的长度在500个核苷酸至5,000个核苷酸之间。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，组合物中不同载体的种数是两种。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，两种不同载体中的第一载体包括编码CLRN1蛋白的N末端部分的编码序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的N末端部分的长度在30个氨基酸至202个氨基酸之间。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的N末端部分的长度在60个氨基酸至170个氨基酸之间。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一载体还包括5’UTR序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少10个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少20个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少50个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少80个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一载体还包括启动子和Kozak序列中的一者或两者。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一载体包括是诱导型启动子、组成型启动子、或组织特异性启动子的启动子。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，两种不同载体中的第二者包括编码CLRN1蛋白的C末端部分的编码序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的C末端部分的长度在30个氨基酸至202个氨基酸之间。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的C末端部分的长度在60个氨基酸至170个氨基酸之间。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第二载体还包括多腺苷酸化信号序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第二载体还包括3’UTR序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少10个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少20个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少50个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少80个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的序列。
本文还提供了包括单一核酸载体的组合物，其中所述载体包括(i)编码CLRN1蛋白的第一亚型的第一编码序列，和(ii)编码CLRN1蛋白的第二亚型的第二编码序列中的一者或两者，其中所述第一编码序列和所述第二编码序列中的一者或两者包括跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子，并且缺乏两个连续内含子之间的内含子序列的核苷酸序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，单一核酸载体含有第一编码序列，而不含有第二编码序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，单一核酸载体含有第二编码序列，而不含有第一编码序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，单一核酸载体含有第一编码序列与第二编码序列两者。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括与SEQ ID NO：3具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括SEQ ID NO：3。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型由SEQ ID NO：3组成。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括与SEQ ID NO：5至少95％同一的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括SEQ ID NO：5。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型由SEQ ID NO：5组成。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，单一核酸载体还包括5’非翻译区(UTR)、3’UTR或两者。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ IDNO：12内的任何地方的至少10个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少20个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少50个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少80个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括与SEQID NO：12具有至少80％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少10个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少20个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少50个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ IDNO：15内的任何地方的至少80个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的序列。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，单一核酸载体是质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，单一核酸载体是人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或P1源性人工染色体(PAC)。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，单一核酸载体是选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，单一核酸载体是AAV载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，单一核酸载体还包括启动子和Kozak序列中的一者或两者。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一载体包括是诱导型启动子、组成型启动子、或组织特异性启动子的启动子。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，单一核酸载体还包括多腺苷酸化信号序列。本文提供的任何组合物的一些实施方案还包括药学上可接受的赋形剂。
本文还提供了包括本文提供的任何组合物的药盒。本文提供的任何药盒的一些实施方案还包括预装载注射器，所述预装载注射器包括或含有本文所述的任何组合物。
本文还提供了包括向哺乳动物的耳蜗中引入治疗有效量的本文提供的任何组合物的方法。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物是人。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物先前已被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因。
本文还提供了使哺乳动物细胞中全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括将本文提供的任何组合物引入所述哺乳动物细胞中。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是耳蜗内毛细胞或耳蜗外毛细胞。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是视网膜细胞。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞先前已被确定为具有缺陷性CLRN1基因。
本文还提供了使哺乳动物的耳蜗中的内毛细胞、外毛细胞或两者中的全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：向所述哺乳动物的所述耳蜗中引入治疗有效量的本文提供的任何组合物。本文还提供了使哺乳动物的眼中的全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：以眼内方式向所述哺乳动物的所述眼施用治疗有效量的本文提供的任何组合物。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物先前已被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物是人。
本文还提供了治疗被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因的受试者的听力损失的方法，所述方法包括：向所述受试者的耳蜗中施用治疗有效量的本文提供的任何组合物。本文还提供了治疗被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因的受试者的视力损失的方法，所述方法包括：向所述受试者的眼中施用治疗有效量的本文提供的任何组合物。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，受试者患有III型尤塞氏综合征(Usher syndrome)。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，受试者是人。本文提供的任何方法的一些实施方案还包括在施用步骤之前确定受试者具有缺陷性CLRN1基因。
本文还提供了包括两种不同核酸载体的组合物，其中：所述两种不同核酸载体中的第一核酸载体包括启动子、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分的第一编码序列、以及位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列；并且所述两种不同核酸载体中的第二核酸载体包括剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分的第二编码序列、以及在所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化信号序列；其中所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基，其中两个所编码部分的氨基酸序列不彼此重叠；其中所述两种不同载体中没有单一载体编码全长CLRN1蛋白；并且当引入哺乳动物细胞中时，在所述剪接供体序列与所述剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码全长CLRN1蛋白的重组核酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一编码序列编码CLRN1蛋白的第一亚型的N末端部分，并且第二编码序列编码CLRN1蛋白的第一亚型的C末端部分。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括与SEQ ID NO：3具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括SEQ ID NO：3。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型由SEQ ID NO：3组成。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第二核酸载体的第一核酸载体还包括编码CLRN1蛋白的第二亚型的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括与SEQ ID NO：5具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括SEQ ID NO：5。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型由SEQID NO：5组成。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一编码序列编码CLRN1蛋白的第二亚型的N末端部分，并且第二编码序列编码CLRN1蛋白的第二亚型的C末端部分。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括与SEQ ID NO：5具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括SEQ ID NO：5。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型由SEQID NO：5组成。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体或第二核酸载体还包括编码CLRN1蛋白的第一亚型的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括与SEQ ID NO：3具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括SEQ ID NO：3。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的一者或两者包括5’非翻译区(UTR)、3’UTR或两者。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少10个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少20个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少50个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少80个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少10个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少20个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQID NO：15内的任何地方的至少50个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少80个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的序列。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的每一者是质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的每一者是人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或P1源性人工染色体(PAC)。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的每一者是选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的每一者是AAV载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，编码序列中的至少一者包括跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子，并且缺乏所述两个连续外显子之间的内含子序列的核苷酸序列。
本文还提供了包括两种不同核酸载体的组合物，其中：所述两种不同核酸载体中的第一核酸载体包括启动子、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列、以及位于所述剪接供体序列的3’的第一可检测标记基因；并且所述两种不同核酸载体中的第二核酸载体包括第二可检测标记基因、位于所述第二可检测标记基因的3’的剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分的第二编码序列、以及位于所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化信号序列；其中所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基，其中所编码部分的氨基酸序列不彼此重叠；其中所述两种不同载体中没有单一载体编码全长CLRN1蛋白；并且当引入哺乳动物细胞中时，在所述剪接供体序列与所述剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码全长CLRN1蛋白的重组核酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一编码序列编码CLRN1蛋白的第一亚型的N末端部分，并且第二编码序列编码CLRN1蛋白的第一亚型的C末端部分。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括与SEQ ID NO：3具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括SEQ ID NO：3。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型由SEQ ID NO：3组成。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第二核酸载体的第一核酸载体还包括编码CLRN1蛋白的第二亚型的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括与SEQ IDNO：5具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括SEQ ID NO：5。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型由SEQ ID NO：5组成。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一编码序列编码CLRN1蛋白的第二亚型的N末端部分，并且第二编码序列编码CLRN1蛋白的第二亚型的C末端部分。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括与SEQID NO：5具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括SEQ ID NO：5。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型由SEQ ID NO：5组成。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体或第二核酸载体还包括编码CLRN1蛋白的第一亚型的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括与SEQ ID NO：3具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括SEQ ID NO：3。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的一者或两者包括5’非翻译区(UTR)、3’UTR或两者。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少10个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少20个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少80个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少10个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少20个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少50个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少80个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的序列。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的每一者是质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的每一者是人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或P1源性人工染色体(PAC)。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的每一者是选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的每一者是AAV载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，编码序列中的至少一者包含跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子，并且缺乏所述两个连续外显子之间的内含子序列的核苷酸序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一或第二可检测标记基因是碱性磷酸酶。
本文还提供了包括两种不同核酸载体的组合物，其中：所述两种不同核酸载体中的第一核酸载体包括启动子、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列、以及位于所述剪接供体序列的3’的F1噬菌体致重组区域；并且所述两种不同核酸载体中的第二核酸载体包括F1噬菌体致重组区域、位于所述F1噬菌体致重组区域的3’的剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分的第二编码序列、以及位于所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化信号序列；其中两个所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基，其中两个所编码部分的氨基酸序列不彼此重叠；其中所述两种不同载体中没有单一载体编码全长CLRN1蛋白；并且当引入哺乳动物细胞中时，在所述剪接供体序列与所述剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码全长CLRN1蛋白的重组核酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一编码序列编码CLRN1蛋白的第一亚型的N末端部分，并且第二编码序列编码CLRN1蛋白的第一亚型的C末端部分。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括与SEQ ID NO：3具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括SEQ ID NO：3。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型由SEQ ID NO：3组成。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第二核酸载体的第一核酸载体还包括编码CLRN1蛋白的第二亚型的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括与SEQ ID NO：5具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括SEQ ID NO：5。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型由SEQ ID NO：5组成。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一编码序列编码CLRN1蛋白的第二亚型的N末端部分，并且第二编码序列编码CLRN1蛋白的第二亚型的C末端部分。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括与SEQ ID NO：5具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型包括SEQ ID NO：5。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第二亚型由SEQID NO：5组成。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体或第二核酸载体还包括编码CLRN1蛋白的第一亚型的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括与SEQ ID NO：3具有至少95％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型包括SEQ ID NO：3。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白的第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的一者或两者包含5’非翻译区(UTR)、3’UTR或两者。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少10个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少20个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少50个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少80个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包括与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性的序列。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少10个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少20个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQID NO：15内的任何地方的至少50个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少80个连续核苷酸。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包括与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的序列。
在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的每一者是质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的每一者是人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或P1源性人工染色体(PAC)。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的每一者是选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，第一核酸载体和第二核酸载体中的每一者是AAV载体。在本文提供的任何组合物的一些实施方案中，编码序列中的至少一者包括跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子，并且缺乏所述两个连续外显子之间的内含子序列的核苷酸序列。
本文还提供了包括本文提供的任何组合物的药盒。本文提供的任何药盒的一些实施方案还包括预装载注射器，所述预装载注射器包括组合物。
本文还提供了包括向哺乳动物的耳蜗中引入治疗有效量的本文提供的任何组合物的方法。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物是人。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物先前已被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因。
本文还提供了使哺乳动物细胞中全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括将本文提供的任何组合物引入所述哺乳动物细胞中。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是耳蜗内毛细胞或耳蜗外毛细胞。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是视网膜细胞。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞先前已被确定为具有缺陷性CLRN1基因。
本文还提供了使哺乳动物的耳蜗中的内毛细胞、外毛细胞或两者中的全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：向所述哺乳动物的所述耳蜗中引入治疗有效量的本文所述的任何组合物。本文还提供了使哺乳动物的眼中的全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：以眼内方式向所述哺乳动物的所述眼施用治疗有效量的本文提供的任何组合物。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物先前已被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物是人。
本文还提供了治疗被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因的受试者的听力损失的方法，所述方法包括：向所述受试者的耳蜗中施用治疗有效量的本文提供的任何组合物。本文还提供了治疗被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因的受试者的视力损失的方法，所述方法包括：向所述受试者的眼中施用治疗有效量的本文提供的任何组合物。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，受试者患有III型尤塞氏综合征(Usher syndrome)。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，受试者是人。本文提供的任何方法的一些实施方案还包括在施用步骤之前确定受试者具有缺陷性CLRN1基因。
术语“一个(种)(a/an)”是指所述冠词的一个(种)或超过一个(种)(即至少一个(种))语法对象。举例来说，“一个(种)要素”涵盖一个(种)要素以及超过一个(种)要素。
术语“CLRN1基因中的突变”是指野生型CLRN1基因中的修饰，所述修饰导致产生相较于野生型CLRN1蛋白，具有以下中的一者或多者的CLRN1蛋白：一个或多个氨基酸的缺失、一个或多个氨基酸取代、以及一个或多个氨基酸插入，和/或导致相较于不具有突变的哺乳动物细胞中所编码CLRN1蛋白的表达水平，哺乳动物细胞中所编码CLRN1蛋白的表达水平降低。在一些实施方案中，突变可导致产生具有一个或多个氨基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 16、17、18、19或20个氨基酸)的缺失的CLRN1蛋白。在一些实施方案中，突变可导致CLRN1基因中的移码。本领域中已知术语“移码”涵盖编码序列中的导致所述编码序列的阅读框的移动的任何突变。在一些实施方案中，移码可导致非功能性蛋白质。在一些实施方案中，点突变可为无义突变(即在基因的外显子中产生过早终止密码子)。无义突变可导致产生可或可不具有功能性的截短蛋白质(相较于相应野生型蛋白质)。在一些实施方案中，突变可导致CLRN1 mRNA、或CLRN1蛋白、或mRNA与蛋白质两者的表达的丧失(或水平降低)。在一些实施方案中，突变可导致产生相较于野生型CLRN1蛋白，一种或多种生物活性(功能)丧失或降低的经改变CLRN1蛋白。
在一些实施方案中，突变是一个或多个核苷酸向CLRN1基因中的插入。在一些实施方案中，突变在CLRN1基因的调控序列中，即基因的不是编码序列的部分。在一些实施方案中，调控序列中的突变可在启动子或增强子区域中，并且阻止或降低CLRN1基因的适当转录。术语“保守性突变”是指不改变在突变位点处编码的氨基酸的突变(归因于密码子简并性)。
修饰可通过本领域中已知的标准技术诸如定点诱变和PCR介导的诱变来引入核苷酸序列中。保守性氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。本领域中已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)、以及具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。
除非另外规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的简并形式，因此编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
术语“内源性”是指任何物质来源于生物体、细胞或组织内。
术语“外源性”是指从生物体、细胞或组织的外部引入或来源于生物体、细胞或组织的外部的任何物质不由它被引入其中的前述生物体、细胞或组织产生或不来源于它被引入其中的前述生物体、细胞或组织。
术语“经分离”意指从天然状态改变或移除。举例来说，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“经分离的”，但部分地或完全地与它的天然状态的共存物质分离的前述核酸或肽是“经分离的”。经分离核酸或蛋白质可以大致上纯化形式存在，或可存在于非天然环境诸如像宿主细胞中。
术语“转染”、“转化”或“转导”是指外源性核酸被转移至或引入细胞中所采用的过程。“经转染”、“经转化”或“经转导”哺乳动物细胞是已用外源性核酸转染、转化或转导的哺乳动物细胞。
术语“表达”是指编码蛋白质的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“短暂表达”是指非整合编码序列持续短暂时期(例如数小时或数天)的表达。在细胞(例如哺乳动物细胞)中短暂表达的编码序列在多轮细胞分裂后丢失。
术语“受试者”意图包括任何哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是啮齿动物(例如大鼠或小鼠)、兔、绵羊、山羊、猪、犬、猫、非人灵长类动物或人。在一些实施方案中，受试者患有听力损失和/或视力损失，或处于听力损失和/或视力损失的风险下。在一些实施方案中，受试者先前已被鉴定为在CLRN1基因中具有突变。在一些实施方案中，受试者已被鉴定为在CLRN1基因中具有突变，并且已被诊断有听力损失和/或视力损失。在一些实施方案中，受试者已被鉴定为患有听力损失和/或视力损失。
当治疗导致受试者(例如人)的疾病状态(例如听力损失或视力损失)的一种或多种症状的数目、严重性和频率中的一者或多者降低时，所述治疗是“治疗有效的”。在一些实施方案中，治疗有效量的组合物可导致活性CLRN1蛋白(例如野生型全长CLRN1蛋白或CLRN1蛋白的具有所需活性的变体)的表达水平增加(例如相较于在用所述组合物治疗之前的表达水平)。在一些实施方案中，治疗有效量的组合物可导致靶细胞(例如耳蜗内毛细胞)中活性CLRN1蛋白(例如野生型全长CLRN1蛋白或活性变体)的表达水平增加。在一些实施方案中，治疗有效量的组合物可导致靶细胞中活性CLRN1蛋白(例如野生型全长CLRN1蛋白或活性变体)的表达水平增加，和/或CLRN1蛋白的一种或多种活性的增加(例如相较于参考水平，诸如在治疗之前受试者中的一种或多种水平，在CLRN1基因中具有突变的受试者中的一种或多种水平，或患有听力损失和/或视力损失的受试者或受试者群体中的一种或多种水平)。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或它们的组合。除非明确限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸与参考核苷酸具有类似结合性质。除非另外指示，否则特定核酸序列还隐含地涵盖互补序列以及明确指示的序列。在本文所述的任何核酸的一些实施方案中，核酸是DNA。在本文所述的任何核酸的一些实施方案中，核酸是RNA。
术语“活性CLRN1蛋白”意指由以下DNA编码的蛋白质，如果所述DNA替代在其他方面是野生型哺乳动物的哺乳动物的听觉毛细胞或眼部细胞中编码全长CLRN1蛋白的两个野生型等位基因，并且如果在那个哺乳动物的所述听觉毛细胞或眼部细胞中表达，那么所述DNA导致那个哺乳动物具有接近完全是野生型的类似哺乳动物的正常听力或视力水平的听力或视力水平。活性CLRN1蛋白的非限制性实例是全长CLRN1蛋白(例如本文所述的任何全长CLRN1蛋白)。
举例来说，活性CLRN1蛋白可包括野生型全长CLRN1蛋白(例如野生型人全长CLRN1蛋白)的包括1个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约8个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约7个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约6个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约5个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约4个氨基酸取代、1个氨基酸取代至约3个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约8个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约7个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约6个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约5个氨基酸取代、约2个氨基酸取代至约4个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约8个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约7个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约6个氨基酸取代、约3个氨基酸取代至约5个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约8个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约7个氨基酸取代、约4个氨基酸取代至约6个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约8个氨基酸取代、约5个氨基酸取代至约7个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、约6个氨基酸取代至约8个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约7个氨基酸取代至约9个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约8个氨基酸取代至约10个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约10个氨基酸取代至约15个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约15个氨基酸取代至约20个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约20个氨基酸取代至约25个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约25个氨基酸取代至约30个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约30个氨基酸取代至约35个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约35个氨基酸取代至约40个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约40个氨基酸取代至约45个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约45个氨基酸取代至约50个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约60个氨基酸取代、约50个氨基酸取代至约55个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约70个氨基酸取代、约60个氨基酸取代至约65个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约80个氨基酸取代、约70个氨基酸取代至约75个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约90个氨基酸取代、约80个氨基酸取代至约85个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约100个氨基酸取代、约90个氨基酸取代至约95个氨基酸取代、或约95个氨基酸至约100个氨基酸的序列。
本领域技术人员将了解可使在来自不同物种的野生型CLRN1蛋白之间不保守的氨基酸突变而不丧失活性，而不应使在来自不同物种的野生型CLRN1蛋白之间保守的那些氨基酸突变，因为它们(相比于在不同物种之间不保守的氨基酸)更可能涉及于活性中。
活性CLRN1蛋白可包括例如野生型全长CLRN1蛋白(例如野生型人全长CLRN1蛋白)的缺失约1个氨基酸至约100个氨基酸、约1个氨基酸至约95个氨基酸、约1个氨基酸至约90个氨基酸、约1个氨基酸至约85个氨基酸、约1个氨基酸至约80个氨基酸、约1个氨基酸至约75个氨基酸、约1个氨基酸至约70个氨基酸、约1个氨基酸至约65个氨基酸、约1个氨基酸至约60个氨基酸、约1个氨基酸至约55个氨基酸、约1个氨基酸至约50个氨基酸、约1个氨基酸至约45个氨基酸、约1个氨基酸至约40个氨基酸、约1个氨基酸至约35个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约1个氨基酸至约25个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约15个氨基酸、约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约9个氨基酸、约1个氨基酸至约8个氨基酸、约1个氨基酸至约7个氨基酸、约1个氨基酸至约6个氨基酸、约1个氨基酸至约5个氨基酸、约1个氨基酸至约4个氨基酸、约1个氨基酸至约3个氨基酸、约2个氨基酸至约100个氨基酸、约2个氨基酸至约95个氨基酸、约2个氨基酸至约90个氨基酸、约2个氨基酸至约85个氨基酸、约2个氨基酸至约80个氨基酸、约2个氨基酸至约75个氨基酸、约2个氨基酸至约70个氨基酸、约2个氨基酸至约65个氨基酸、约2个氨基酸至约60个氨基酸、约2个氨基酸至约55个氨基酸、约2个氨基酸至约50个氨基酸、约2个氨基酸至约45个氨基酸、约2个氨基酸至约40个氨基酸、约2个氨基酸至约35个氨基酸、约2个氨基酸至约30个氨基酸、约2个氨基酸至约25个氨基酸、约2个氨基酸至约20个氨基酸、约2个氨基酸至约15个氨基酸、约2个氨基酸至约10个氨基酸、约2个氨基酸至约9个氨基酸、约2个氨基酸至约8个氨基酸、约2个氨基酸至约7个氨基酸、约2个氨基酸至约6个氨基酸、约2个氨基酸至约5个氨基酸、约2个氨基酸至约4个氨基酸、约3个氨基酸至约100个氨基酸、约3个氨基酸至约95个氨基酸、约3个氨基酸至约90个氨基酸、约3个氨基酸至约85个氨基酸、约3个氨基酸至约80个氨基酸、约3个氨基酸至约75个氨基酸、约3个氨基酸至约70个氨基酸、约3个氨基酸至约65个氨基酸、约3个氨基酸至约60个氨基酸、约3个氨基酸至约55个氨基酸、约3个氨基酸至约50个氨基酸、约3个氨基酸至约45个氨基酸、约3个氨基酸至约40个氨基酸、约3个氨基酸至约35个氨基酸、约3个氨基酸至约30个氨基酸、约3个氨基酸至约25个氨基酸、约3个氨基酸至约20个氨基酸、约3个氨基酸至约15个氨基酸、约3个氨基酸至约10个氨基酸、约3个氨基酸至约9个氨基酸、约3个氨基酸至约8个氨基酸、约3个氨基酸至约7个氨基酸、约3个氨基酸至约6个氨基酸、约3个氨基酸至约5个氨基酸、约4个氨基酸至约100个氨基酸、约4个氨基酸至约95个氨基酸、约4个氨基酸至约90个氨基酸、约4个氨基酸至约85个氨基酸、约4个氨基酸至约80个氨基酸、约4个氨基酸至约75个氨基酸、约4个氨基酸至约70个氨基酸、约4个氨基酸至约65个氨基酸、约4个氨基酸至约60个氨基酸、约4个氨基酸至约55个氨基酸、约4个氨基酸至约50个氨基酸、约4个氨基酸至约45个氨基酸、约4个氨基酸至约40个氨基酸、约4个氨基酸至约35个氨基酸、约4个氨基酸至约30个氨基酸、约4个氨基酸至约25个氨基酸、约4个氨基酸至约20个氨基酸、约4个氨基酸至约15个氨基酸、约4个氨基酸至约10个氨基酸、约4个氨基酸至约9个氨基酸、约4个氨基酸至约8个氨基酸、约4个氨基酸至约7个氨基酸、约4个氨基酸至约6个氨基酸、约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约95个氨基酸、约5个氨基酸至约90个氨基酸、约5个氨基酸至约85个氨基酸、约5个氨基酸至约80个氨基酸、约5个氨基酸至约75个氨基酸、约5个氨基酸至约70个氨基酸、约5个氨基酸至约65个氨基酸、约5个氨基酸至约60个氨基酸、约5个氨基酸至约55个氨基酸、约5个氨基酸至约50个氨基酸、约5个氨基酸至约45个氨基酸、约5个氨基酸至约40个氨基酸、约5个氨基酸至约35个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约9个氨基酸、约5个氨基酸至约8个氨基酸、约5个氨基酸至约7个氨基酸、约6个氨基酸至约100个氨基酸、约6个氨基酸至约95个氨基酸、约6个氨基酸至约90个氨基酸、约6个氨基酸至约85个氨基酸、约6个氨基酸至约80个氨基酸、约6个氨基酸至约75个氨基酸、约6个氨基酸至约70个氨基酸、约6个氨基酸至约65个氨基酸、约6个氨基酸至约60个氨基酸、约6个氨基酸至约55个氨基酸、约6个氨基酸至约50个氨基酸、约6个氨基酸至约45个氨基酸、约6个氨基酸至约40个氨基酸、约6个氨基酸至约35个氨基酸、约6个氨基酸至约30个氨基酸、约6个氨基酸至约25个氨基酸、约6个氨基酸至约20个氨基酸、约6个氨基酸至约15个氨基酸、约6个氨基酸至约10个氨基酸、约6个氨基酸至约9个氨基酸、约6个氨基酸至约8个氨基酸、约7个氨基酸至约100个氨基酸、约7个氨基酸至约95个氨基酸、约7个氨基酸至约90个氨基酸、约7个氨基酸至约85个氨基酸、约7个氨基酸至约80个氨基酸、约7个氨基酸至约75个氨基酸、约7个氨基酸至约70个氨基酸、约7个氨基酸至约65个氨基酸、约7个氨基酸至约60个氨基酸、约7个氨基酸至约55个氨基酸、约7个氨基酸至约50个氨基酸、约7个氨基酸至约45个氨基酸、约7个氨基酸至约40个氨基酸、约7个氨基酸至约35个氨基酸、约7个氨基酸至约30个氨基酸、约7个氨基酸至约25个氨基酸、约7个氨基酸至约20个氨基酸、约7个氨基酸至约15个氨基酸、约7个氨基酸至约10个氨基酸、约7个氨基酸至约9个氨基酸、约8个氨基酸至约100个氨基酸、约8个氨基酸至约95个氨基酸、约8个氨基酸至约90个氨基酸、约8个氨基酸至约85个氨基酸、约8个氨基酸至约80个氨基酸、约8个氨基酸至约75个氨基酸、约8个氨基酸至约70个氨基酸、约8个氨基酸至约65个氨基酸、约8个氨基酸至约60个氨基酸、约8个氨基酸至约55个氨基酸、约8个氨基酸至约50个氨基酸、约8个氨基酸至约45个氨基酸、约8个氨基酸至约40个氨基酸、约8个氨基酸至约35个氨基酸、约8个氨基酸至约30个氨基酸、约8个氨基酸至约25个氨基酸、约8个氨基酸至约20个氨基酸、约8个氨基酸至约15个氨基酸、约8个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约100个氨基酸、约10个氨基酸至约95个氨基酸、约10个氨基酸至约90个氨基酸、约10个氨基酸至约85个氨基酸、约10个氨基酸至约80个氨基酸、约10个氨基酸至约75个氨基酸、约10个氨基酸至约70个氨基酸、约10个氨基酸至约65个氨基酸、约10个氨基酸至约60个氨基酸、约10个氨基酸至约55个氨基酸、约10个氨基酸至约50个氨基酸、约10个氨基酸至约45个氨基酸、约10个氨基酸至约40个氨基酸、约10个氨基酸至约35个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约100个氨基酸、约15个氨基酸至约95个氨基酸、约15个氨基酸至约90个氨基酸、约15个氨基酸至约85个氨基酸、约15个氨基酸至约80个氨基酸、约15个氨基酸至约75个氨基酸、约15个氨基酸至约70个氨基酸、约15个氨基酸至约65个氨基酸、约15个氨基酸至约60个氨基酸、约15个氨基酸至约55个氨基酸、约15个氨基酸至约50个氨基酸、约15个氨基酸至约45个氨基酸、约15个氨基酸至约40个氨基酸、约15个氨基酸至约35个氨基酸、约15个氨基酸至约30个氨基酸、约15个氨基酸至约25个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约95个氨基酸、约20个氨基酸至约90个氨基酸、约20个氨基酸至约85个氨基酸、约20个氨基酸至约80个氨基酸、约20个氨基酸至约75个氨基酸、约20个氨基酸至约70个氨基酸、约20个氨基酸至约65个氨基酸、约20个氨基酸至约60个氨基酸、约20个氨基酸至约55个氨基酸、约20个氨基酸至约50个氨基酸、约20个氨基酸至约45个氨基酸、约20个氨基酸至约40个氨基酸、约20个氨基酸至约35个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约25个氨基酸至约100个氨基酸、约25个氨基酸至约95个氨基酸、约25个氨基酸至约90个氨基酸、约25个氨基酸至约85个氨基酸、约25个氨基酸至约80个氨基酸、约25个氨基酸至约75个氨基酸、约25个氨基酸至约70个氨基酸、约25个氨基酸至约65个氨基酸、约25个氨基酸至约60个氨基酸、约25个氨基酸至约55个氨基酸、约25个氨基酸至约50个氨基酸、约25个氨基酸至约45个氨基酸、约25个氨基酸至约40个氨基酸、约25个氨基酸至约35个氨基酸、约25个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约100个氨基酸、约30个氨基酸至约95个氨基酸、约30个氨基酸至约90个氨基酸、约30个氨基酸至约85个氨基酸、约30个氨基酸至约80个氨基酸、约30个氨基酸至约75个氨基酸、约30个氨基酸至约70个氨基酸、约30个氨基酸至约65个氨基酸、约30个氨基酸至约60个氨基酸、约30个氨基酸至约55个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约30个氨基酸至约45个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸、约30个氨基酸至约35个氨基酸、约35个氨基酸至约50个氨基酸、约35个氨基酸至约45个氨基酸、约35个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约100个氨基酸、约40个氨基酸至约95个氨基酸、约40个氨基酸至约90个氨基酸、约40个氨基酸至约85个氨基酸、约40个氨基酸至约80个氨基酸、约40个氨基酸至约75个氨基酸、约40个氨基酸至约70个氨基酸、约40个氨基酸至约65个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约40个氨基酸至约55个氨基酸、约40个氨基酸至约50个氨基酸、约40个氨基酸至约45个氨基酸、约45个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、约50个氨基酸至约95个氨基酸、约50个氨基酸至约90个氨基酸、约50个氨基酸至约85个氨基酸、约50个氨基酸至约80个氨基酸、约50个氨基酸至约75个氨基酸、约50个氨基酸至约70个氨基酸、约50个氨基酸至约65个氨基酸、约50个氨基酸至约60个氨基酸、或约50个氨基酸至约55个氨基酸的序列。在其中两个或更多个氨基酸从野生型全长CLRN1蛋白的序列缺失的一些实施方案中，所述两个或更多个缺失氨基酸中的至少两者在野生型全长蛋白的序列中可为连续的。在其中两个或更多个氨基酸从野生型全长CLRN1蛋白的序列缺失的其他实例中，所述两个或更多个缺失氨基酸中的一些或全部在野生型全长蛋白的序列中不是连续的。本领域技术人员将了解可使在来自不同物种的野生型全长CLRN1蛋白之间不保守的氨基酸缺失而不丧失活性，而不应使在来自不同物种的野生型全长CLNRN1蛋白之间保守的那些氨基酸缺失，因为它们(相比于在不同物种之间不保守的氨基酸)更可能涉及于活性中。
在一些实例中，活性CLRN1蛋白可例如包括野生型全长CLRN1蛋白的从它的N末端移除1个氨基酸至约100个氨基酸、1个氨基酸至约95个氨基酸、1个氨基酸至约90个氨基酸、1个氨基酸至约85个氨基酸、1个氨基酸至约80个氨基酸、1个氨基酸至约75个氨基酸、1个氨基酸至约70个氨基酸、1个氨基酸至约65个氨基酸、1个氨基酸至约60个氨基酸、1个氨基酸至约55个氨基酸、1个氨基酸至约50个氨基酸、1个氨基酸至约45个氨基酸、1个氨基酸至约40个氨基酸、1个氨基酸至约35个氨基酸、1个氨基酸至约30个氨基酸、1个氨基酸至约25个氨基酸、1个氨基酸至约20个氨基酸、1个氨基酸至约15个氨基酸、1个氨基酸至约10个氨基酸、1个氨基酸至约9个氨基酸、1个氨基酸至约8个氨基酸、1个氨基酸至约7个氨基酸、1个氨基酸至约6个氨基酸、1个氨基酸至约5个氨基酸、1个氨基酸至约4个氨基酸、1个氨基酸至约3个氨基酸、约2个氨基酸至约100个氨基酸、约2个氨基酸至约95个氨基酸、约2个氨基酸至约90个氨基酸、约2个氨基酸至约85个氨基酸、约2个氨基酸至约80个氨基酸、约2个氨基酸至约75个氨基酸、约2个氨基酸至约70个氨基酸、约2个氨基酸至约65个氨基酸、约2个氨基酸至约60个氨基酸、约2个氨基酸至约55个氨基酸、约2个氨基酸至约50个氨基酸、约2个氨基酸至约45个氨基酸、约2个氨基酸至约40个氨基酸、约2个氨基酸至约35个氨基酸、约2个氨基酸至约30个氨基酸、约2个氨基酸至约25个氨基酸、约2个氨基酸至约20个氨基酸、约2个氨基酸至约15个氨基酸、约2个氨基酸至约10个氨基酸、约2个氨基酸至约9个氨基酸、约2个氨基酸至约8个氨基酸、约2个氨基酸至约7个氨基酸、约2个氨基酸至约6个氨基酸、约2个氨基酸至约5个氨基酸、约2个氨基酸至约4个氨基酸、约3个氨基酸至约100个氨基酸、约3个氨基酸至约95个氨基酸、约3个氨基酸至约90个氨基酸、约3个氨基酸至约85个氨基酸、约3个氨基酸至约80个氨基酸、约3个氨基酸至约75个氨基酸、约3个氨基酸至约70个氨基酸、约3个氨基酸至约65个氨基酸、约3个氨基酸至约60个氨基酸、约3个氨基酸至约55个氨基酸、约3个氨基酸至约50个氨基酸、约3个氨基酸至约45个氨基酸、约3个氨基酸至约40个氨基酸、约3个氨基酸至约35个氨基酸、约3个氨基酸至约30个氨基酸、约3个氨基酸至约25个氨基酸、约3个氨基酸至约20个氨基酸、约3个氨基酸至约15个氨基酸、约3个氨基酸至约10个氨基酸、约3个氨基酸至约9个氨基酸、约3个氨基酸至约8个氨基酸、约3个氨基酸至约7个氨基酸、约3个氨基酸至约6个氨基酸、约3个氨基酸至约5个氨基酸、约4个氨基酸至约100个氨基酸、约4个氨基酸至约95个氨基酸、约4个氨基酸至约90个氨基酸、约4个氨基酸至约85个氨基酸、约4个氨基酸至约80个氨基酸、约4个氨基酸至约75个氨基酸、约4个氨基酸至约70个氨基酸、约4个氨基酸至约65个氨基酸、约4个氨基酸至约60个氨基酸、约4个氨基酸至约55个氨基酸、约4个氨基酸至约50个氨基酸、约4个氨基酸至约45个氨基酸、约4个氨基酸至约40个氨基酸、约4个氨基酸至约35个氨基酸、约4个氨基酸至约30个氨基酸、约4个氨基酸至约25个氨基酸、约4个氨基酸至约20个氨基酸、约4个氨基酸至约15个氨基酸、约4个氨基酸至约10个氨基酸、约4个氨基酸至约9个氨基酸、约4个氨基酸至约8个氨基酸、约4个氨基酸至约7个氨基酸、约4个氨基酸至约6个氨基酸、约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约95个氨基酸、约5个氨基酸至约90个氨基酸、约5个氨基酸至约85个氨基酸、约5个氨基酸至约80个氨基酸、约5个氨基酸至约75个氨基酸、约5个氨基酸至约70个氨基酸、约5个氨基酸至约65个氨基酸、约5个氨基酸至约60个氨基酸、约5个氨基酸至约55个氨基酸、约5个氨基酸至约50个氨基酸、约5个氨基酸至约45个氨基酸、约5个氨基酸至约40个氨基酸、约5个氨基酸至约35个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约9个氨基酸、约5个氨基酸至约8个氨基酸、约5个氨基酸至约7个氨基酸、约6个氨基酸至约100个氨基酸、约6个氨基酸至约95个氨基酸、约6个氨基酸至约90个氨基酸、约6个氨基酸至约85个氨基酸、约6个氨基酸至约80个氨基酸、约6个氨基酸至约75个氨基酸、约6个氨基酸至约70个氨基酸、约6个氨基酸至约65个氨基酸、约6个氨基酸至约60个氨基酸、约6个氨基酸至约55个氨基酸、约6个氨基酸至约50个氨基酸、约6个氨基酸至约45个氨基酸、约6个氨基酸至约40个氨基酸、约6个氨基酸至约35个氨基酸、约6个氨基酸至约30个氨基酸、约6个氨基酸至约25个氨基酸、约6个氨基酸至约20个氨基酸、约6个氨基酸至约15个氨基酸、约6个氨基酸至约10个氨基酸、约6个氨基酸至约9个氨基酸、约6个氨基酸至约8个氨基酸、约7个氨基酸至约100个氨基酸、约7个氨基酸至约95个氨基酸、约7个氨基酸至约90个氨基酸、约7个氨基酸至约85个氨基酸、约7个氨基酸至约80个氨基酸、约7个氨基酸至约75个氨基酸、约7个氨基酸至约70个氨基酸、约7个氨基酸至约65个氨基酸、约7个氨基酸至约60个氨基酸、约7个氨基酸至约55个氨基酸、约7个氨基酸至约50个氨基酸、约7个氨基酸至约45个氨基酸、约7个氨基酸至约40个氨基酸、约7个氨基酸至约35个氨基酸、约7个氨基酸至约30个氨基酸、约7个氨基酸至约25个氨基酸、约7个氨基酸至约20个氨基酸、约7个氨基酸至约15个氨基酸、约7个氨基酸至约10个氨基酸、约7个氨基酸至约9个氨基酸、约8个氨基酸至约100个氨基酸、约8个氨基酸至约95个氨基酸、约8个氨基酸至约90个氨基酸、约8个氨基酸至约85个氨基酸、约8个氨基酸至约80个氨基酸、约8个氨基酸至约75个氨基酸、约8个氨基酸至约70个氨基酸、约8个氨基酸至约65个氨基酸、约8个氨基酸至约60个氨基酸、约8个氨基酸至约55个氨基酸、约8个氨基酸至约50个氨基酸、约8个氨基酸至约45个氨基酸、约8个氨基酸至约40个氨基酸、约8个氨基酸至约35个氨基酸、约8个氨基酸至约30个氨基酸、约8个氨基酸至约25个氨基酸、约8个氨基酸至约20个氨基酸、约8个氨基酸至约15个氨基酸、约8个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约100个氨基酸、约10个氨基酸至约95个氨基酸、约10个氨基酸至约90个氨基酸、约10个氨基酸至约85个氨基酸、约10个氨基酸至约80个氨基酸、约10个氨基酸至约75个氨基酸、约10个氨基酸至约70个氨基酸、约10个氨基酸至约65个氨基酸、约10个氨基酸至约60个氨基酸、约10个氨基酸至约55个氨基酸、约10个氨基酸至约50个氨基酸、约10个氨基酸至约45个氨基酸、约10个氨基酸至约40个氨基酸、约10个氨基酸至约35个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约10个氨基酸至约20个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约95个氨基酸、约20个氨基酸至约90个氨基酸、约20个氨基酸至约85个氨基酸、约20个氨基酸至约80个氨基酸、约20个氨基酸至约75个氨基酸、约20个氨基酸至约70个氨基酸、约20个氨基酸至约65个氨基酸、约20个氨基酸至约60个氨基酸、约20个氨基酸至约55个氨基酸、约20个氨基酸至约50个氨基酸、约20个氨基酸至约45个氨基酸、约20个氨基酸至约40个氨基酸、约20个氨基酸至约35个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约30个氨基酸至约100个氨基酸、约30个氨基酸至约95个氨基酸、约30个氨基酸至约90个氨基酸、约30个氨基酸至约85个氨基酸、约30个氨基酸至约80个氨基酸、约30个氨基酸至约75个氨基酸、约30个氨基酸至约70个氨基酸、约30个氨基酸至约65个氨基酸、约30个氨基酸至约60个氨基酸、约30个氨基酸至约55个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约30个氨基酸至约45个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸、约30个氨基酸至约35个氨基酸、约40个氨基酸至约100个氨基酸、约40个氨基酸至约95个氨基酸、约40个氨基酸至约90个氨基酸、约40个氨基酸至约85个氨基酸、约40个氨基酸至约80个氨基酸、约40个氨基酸至约75个氨基酸、约40个氨基酸至约70个氨基酸、约40个氨基酸至约65个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约40个氨基酸至约55个氨基酸、约40个氨基酸至约50个氨基酸、约40个氨基酸至约45个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、约50个氨基酸至约95个氨基酸、约50个氨基酸至约90个氨基酸、约50个氨基酸至约85个氨基酸、约50个氨基酸至约80个氨基酸、约50个氨基酸至约75个氨基酸、约50个氨基酸至约70个氨基酸、约50个氨基酸至约65个氨基酸、约50个氨基酸至约60个氨基酸、约50个氨基酸至约55个氨基酸、约60个氨基酸至约100个氨基酸、约60个氨基酸至约95个氨基酸、约60个氨基酸至约90个氨基酸、约60个氨基酸至约85个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约60个氨基酸至约75个氨基酸、约60个氨基酸至约70个氨基酸、约60个氨基酸至约65个氨基酸、约70个氨基酸至约100个氨基酸、约70个氨基酸至约95个氨基酸、约70个氨基酸至约90个氨基酸、约70个氨基酸至约85个氨基酸、约70个氨基酸至约80个氨基酸、约70个氨基酸至约75个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约80个氨基酸至约95个氨基酸、约80个氨基酸至约90个氨基酸、约80个氨基酸至约85个氨基酸、约90个氨基酸至约100个氨基酸、约90个氨基酸至约95个氨基酸、或约95个氨基酸至约100个氨基酸，和/或从它的C末端移除1个氨基酸至100个氨基酸(或本文所述的这个范围的任何子范围)的序列。
在一些实施方案中，活性CLRN1蛋白可例如包括野生型全长CLRN1蛋白的其中插入1个氨基酸至50个氨基酸、1个氨基酸至45个氨基酸、1个氨基酸至40个氨基酸、1个氨基酸至35个氨基酸、1个氨基酸至30个氨基酸、1个氨基酸至25个氨基酸、1个氨基酸至20个氨基酸、1个氨基酸至15个氨基酸、1个氨基酸至10个氨基酸、1个氨基酸至9个氨基酸、1个氨基酸至8个氨基酸、1个氨基酸至7个氨基酸、1个氨基酸至6个氨基酸、1个氨基酸至5个氨基酸、1个氨基酸至4个氨基酸、1个氨基酸至3个氨基酸、约2个氨基酸至50个氨基酸、约2个氨基酸至45个氨基酸、约2个氨基酸至40个氨基酸、约2个氨基酸至35个氨基酸、约2个氨基酸至30个氨基酸、约2个氨基酸至25个氨基酸、约2个氨基酸至20个氨基酸、约2个氨基酸至15个氨基酸、约2个氨基酸至10个氨基酸、约2个氨基酸至9个氨基酸、约2个氨基酸至8个氨基酸、约2个氨基酸至7个氨基酸、约2个氨基酸至6个氨基酸、约2个氨基酸至5个氨基酸、约2个氨基酸至4个氨基酸、约3个氨基酸至50个氨基酸、约3个氨基酸至45个氨基酸、约3个氨基酸至40个氨基酸、约3个氨基酸至35个氨基酸、约3个氨基酸至30个氨基酸、约3个氨基酸至25个氨基酸、约3个氨基酸至20个氨基酸、约3个氨基酸至15个氨基酸、约3个氨基酸至10个氨基酸、约3个氨基酸至9个氨基酸、约3个氨基酸至8个氨基酸、约3个氨基酸至7个氨基酸、约3个氨基酸至6个氨基酸、约3个氨基酸至5个氨基酸、约4个氨基酸至50个氨基酸、约4个氨基酸至45个氨基酸、约4个氨基酸至40个氨基酸、约4个氨基酸至35个氨基酸、约4个氨基酸至30个氨基酸、约4个氨基酸至25个氨基酸、约4个氨基酸至20个氨基酸、约4个氨基酸至15个氨基酸、约4个氨基酸至10个氨基酸、约4个氨基酸至9个氨基酸、约4个氨基酸至8个氨基酸、约4个氨基酸至7个氨基酸、约4个氨基酸至6个氨基酸、约5个氨基酸至50个氨基酸、约5个氨基酸至45个氨基酸、约5个氨基酸至40个氨基酸、约5个氨基酸至35个氨基酸、约5个氨基酸至30个氨基酸、约5个氨基酸至25个氨基酸、约5个氨基酸至20个氨基酸、约5个氨基酸至15个氨基酸、约5个氨基酸至10个氨基酸、约5个氨基酸至9个氨基酸、约5个氨基酸至8个氨基酸、约5个氨基酸至7个氨基酸、约6个氨基酸至50个氨基酸、约6个氨基酸至45个氨基酸、约6个氨基酸至40个氨基酸、约6个氨基酸至35个氨基酸、约6个氨基酸至30个氨基酸、约6个氨基酸至25个氨基酸、约6个氨基酸至20个氨基酸、约6个氨基酸至15个氨基酸、约6个氨基酸至10个氨基酸、约6个氨基酸至9个氨基酸、约6个氨基酸至8个氨基酸、约7个氨基酸至50个氨基酸、约7个氨基酸至45个氨基酸、约7个氨基酸至40个氨基酸、约7个氨基酸至35个氨基酸、约7个氨基酸至30个氨基酸、约7个氨基酸至25个氨基酸、约7个氨基酸至20个氨基酸、约7个氨基酸至15个氨基酸、约7个氨基酸至10个氨基酸、约7个氨基酸至9个氨基酸、约8个氨基酸至50个氨基酸、约8个氨基酸至45个氨基酸、约8个氨基酸至40个氨基酸、约8个氨基酸至35个氨基酸、约8个氨基酸至30个氨基酸、约8个氨基酸至25个氨基酸、约8个氨基酸至20个氨基酸、约8个氨基酸至15个氨基酸、约8个氨基酸至10个氨基酸、约10个氨基酸至50个氨基酸、约10个氨基酸至45个氨基酸、约10个氨基酸至40个氨基酸、约10个氨基酸至35个氨基酸、约10个氨基酸至30个氨基酸、约10个氨基酸至25个氨基酸、约10个氨基酸至20个氨基酸、约10个氨基酸至15个氨基酸、约15个氨基酸至50个氨基酸、约15个氨基酸至45个氨基酸、约15个氨基酸至40个氨基酸、约15个氨基酸至35个氨基酸、约15个氨基酸至30个氨基酸、约15个氨基酸至25个氨基酸、约15个氨基酸至20个氨基酸、约20个氨基酸至50个氨基酸、约20个氨基酸至45个氨基酸、约20个氨基酸至40个氨基酸、约20个氨基酸至35个氨基酸、约20个氨基酸至30个氨基酸、约20个氨基酸至25个氨基酸、约25个氨基酸至50个氨基酸、约25个氨基酸至45个氨基酸、约25个氨基酸至40个氨基酸、约25个氨基酸至35个氨基酸、约25个氨基酸至30个氨基酸、约30个氨基酸至50个氨基酸、约30个氨基酸至45个氨基酸、约30个氨基酸至40个氨基酸、约30个氨基酸至35个氨基酸、约35个氨基酸至50个氨基酸、约35个氨基酸至45个氨基酸、约35个氨基酸至40个氨基酸、约40个氨基酸至50个氨基酸、约40个氨基酸至45个氨基酸、或约45个氨基酸至约50个氨基酸的序列。在一些实例中，1个氨基酸至50个氨基酸(或其任何子范围)可以连续序列形式插入野生型全长蛋白的序列中。在一些实例中，1个氨基酸至50个氨基酸(或其任何子范围)插入野生型全长蛋白的序列中的多个非连续位置中。如本领域中可了解，1个氨基酸至50个氨基酸可插入野生型全长蛋白的序列的在物种之间不是充分保守的部分中。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。本文描述了用于本发明中的方法和材料；还可使用本领域中已知的其他适合方法和材料。材料、方法和实例仅具有说明性而非意图具有限制性。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目以及其他参考文献都通过引用以它们的整体并入本文。在有冲突的情况下，将以包括定义的本说明书为准。
本发明的其他特征和优势将根据以下具体实施方式和附图以及根据权利要求而显而易知。
附图说明
图1是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-1载体(SEQ ID NO：40；3397个碱基对(bp))的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、T2A序列(SEQ ID NO：31)、CLRN1亚型2(SEQ ID NO：6)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2ITR。
图2是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-2GFP载体(SEQ ID NO：41；4177bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、T2A序列(SEQID NO：31)、CLRN1亚型2(SEQ ID NO：6)、T2A序列(SEQ ID NO：31)、eGFP(SEQ ID NO：32)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图3是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-3载体(SEQ ID NO：42；4607bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、5’UTR-291、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、3’UTR-1357(SEQ ID NO：36)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图4是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-4载体(SEQ ID NO：43；4796bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、T2A序列(SEQID NO：31)、CLRN1亚型2(SEQ ID NO：6)、3’UTR-1406(SEQ ID NO：37)、bGH多聚(A)信号(SEQID NO：20)和AAV2 ITR。
图5是可用于本文所述的任何本发明方法中的pITR-CBA-5’UTR-tGFP-3’UTR载体(5026bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、5’UTR-291、tGFP(SEQ ID NO：19)、3’UTR-1595、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图6是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-6eGFP载体(SEQ ID NO：44；4756bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、eGFP(SEQ ID NO：32)、3’UTR-1406(SEQID NO：37)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图7是可用于本文所述的任何本发明方法中的pITR-CBA-3’UTR-600A载体(3982bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：4)、T2A序列(SEQ ID NO：31)、CLRN1亚型2(SEQ ID NO：6)、3’UTR-600(SEQ ID NO：27)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图8是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-8载体(SEQ ID NO：46；3982bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、T2A序列(SEQID NO：31)、CLRN1亚型2(SEQ ID NO：6)、3’UTR-600B(SEQ ID NO：28)、bGH多聚(A)信号(SEQID NO：20)和AAV2 ITR。
图9是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-9载体(SEQ ID NO：47；3982bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、T2A序列(SEQID NO：31)、CLRN1亚型2(SEQ ID NO：6)、3’UTR-600C(SEQ ID NO：29)、bGH多聚(A)信号(SEQID NO：20)和AAV2 ITR。
图10是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-0载体(SEQ ID NO：39；4732bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、3’UTR 1773(SEQ ID NO：15)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图11是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-7eGFP载体(SEQ ID NO：45；3580bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、eGFP序列(SEQ ID NO：32)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图12是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-10(SEQ ID NO：48；3511bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：4)、HA序列(SEQ ID NO：34)、FP序列(SEQ ID NO：30)、T2A序列(SEQ ID NO：31)、CLRN1亚型2(SEQ ID NO：5)、3xFLAG标签序列(SEQ ID NO：35)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图13是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-10myc载体(SEQ ID NO：49；3574bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、myc序列(SEQID NO：33)、FP序列(SEQ ID NO：30)、T2A序列(SEQ ID NO：31)、3x FLAG标签序列(SEQ IDNO：35)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图14是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-10NF载体(SEQ ID NO：50；3499bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、T2A序列(SEQID NO：31)、HA序列(SEQ ID NO：34)、CLRN-1亚型2(SEQ ID NO：5)、3x FLAG标签序列(SEQID NO：35)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图15是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-11载体(SEQ ID NO：51；4908bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、HA序列(SEQID NO：34)、FP序列(SEQ ID NO：30)、T2A序列(SEQ ID NO：31)、CLRN-1亚型2(SEQ ID NO：5)、3x FLAG标签序列(SEQ ID NO：35)、3’UTR-1406(SEQ ID NO：37)、bGH多聚(A)信号(SEQID NO：20)和AAV2 ITR。
图16是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-11myc载体(SEQ ID NO：52；4971bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、myc序列(SEQID NO：33)、FP序列(SEQ ID NO：30)、T2A序列(SEQ ID NO：31)、CLRN1亚型2(SEQ ID NO：5)、3x FLAG标签序列(SEQ ID NO：35)、3’UTR-1406(SEQ ID NO：37)、bGH多聚(A)信号(SEQ IDNO：20)和AAV2 ITR。
图17是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-11NF载体(SEQ ID NO：53；4896bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、HA序列(SEQID NO：34)、T2A序列(SEQ ID NO：31)、CLRN1亚型2(SEQ ID NO：5)、3x FLAG序列(SEQ IDNO：33)、3’UTR-1406(SEQ ID NO：37)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图18是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-12载体(SEQ ID NO：54；4640bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、5’UTR-291序列(SEQ ID NO：12)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、HA序列(SEQ ID NO：34)、3’UTR-1357(SEQ ID NO：36)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图19是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-13载体(SEQ ID NO：55；4291bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型4(SEQ ID NO：7)、3x FLAG标签序列(SEQ ID NO：35)、T2A序列(SEQ ID NO：31)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、HA序列(SEQID NO：34)、3’UTR-600(SEQ ID NO：27)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图20是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-14载体(SEQ ID NO：56；4192bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型4(SEQ ID NO：7)、T2A序列(SEQID NO：31)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、3’UTR-600(SEQ ID NO：27)、bGH多聚(A)信号(SEQID NO：20)和AAV2 ITR。
图21是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-15载体(SEQ ID NO：57；3505bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型4(SEQ ID NO：7)、3x FLAG标签序列(SEQ ID NO：35)、3’UTR-600(SEQ ID NO：27)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2ITR。
图22是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-16载体(SEQ ID NO：58；3439bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子(SEQ ID NO：16)、CLRN1亚型4(SEQ ID NO：7)、3’UTR-600(SEQ ID NO：27)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图23是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-17载体(SEQ ID NO：59；130bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、sh嵌合内含子(SEQ ID NO：26)、5’UTR-291(SEQ ID NO：12)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、HA序列(SEQ ID NO：34)、3’UTR-1773(SEQ ID NO：15)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图24是可用于本文所述的任何本发明方法中的CLRN-18载体(SEQ ID NO：60；4277bp)的遗传图谱的示例性图示。所述载体包括AAV2 ITR、CMV增强子(SEQ ID NO：17)、鸡β-肌动蛋白启动子、sh嵌合内含子(SEQ ID NO：26)、CLRN1亚型1(SEQ ID NO：1)、3’UTR-1773(SEQ ID NO：15)、bGH多聚(A)信号(SEQ ID NO：20)和AAV2 ITR。
图25是使用抗HA抗体和抗FLAG抗体获得的来自经转染HEK293FT细胞的在转染后48小时的CLRN1蛋白水平的免疫印迹的图像。泳道1–PageRuler Plus预染物；泳道2–CLRN-10(37℃变性)；泳道3–CLRN-11(37℃变性)；泳道4–CLRN-12(37℃变性)；泳道5–阴性对照；泳道6–CLRN-10(56℃变性)；泳道7–CLRN-11(56℃变性)；泳道8–CLRN-12(56℃变性)；泳道9–阴性对照。CLRN-1亚型蛋白是一种糖基化蛋白，并且经常以拖尾条带形式迁移。
图26是使用抗FLAG抗体获得的来自经转染HEK293FT细胞的在转染后48小时的CLRN1蛋白水平的免疫印迹的图像。泳道1–PageRuler Plus预染物；泳道2–CLRN-10；泳道3–CLRN-11；泳道4–CLRN-12；泳道5–CLRN-13；泳道6–CLRN-15；泳道7–阴性对照
图27是使用抗FLAG抗体获得的来自经转染HEK293FT细胞的在转染后48小时的CLRN1蛋白水平的免疫印迹的图像。泳道1–PageRuler Plus预染物；泳道2–CLRN-10；泳道3–CLRN-10NF；泳道4–CLRN-10myc；泳道5–CLRN-11NF；泳道6–CLRN-11myc；泳道7–阴性对照。所有样品都保持在室温下。
图28是使用抗myc抗体获得的来自经转染HEK293FT细胞的在转染后48小时的CLRN1蛋白水平的免疫印迹的图像。泳道1–PageRuler Plus预染物；泳道2–CLRN-10；泳道3–CLRN-10NF；泳道4–CLRN-10myc；泳道5–CLRN-11NF；泳道6–CLRN-11myc；泳道7–阴性对照。
图29是使用抗HA抗体和抗FLAG抗体获得的从经转染HEK293FT细胞收集的在转染后48小时的CLRN1蛋白水平的免疫印迹的图像。泳道1–PageRuler Plus预染物；泳道2–CLRN-13；泳道3–CLRN-10；泳道4–CLRN-10NF；泳道5–CLRN-10myc；泳道6–CLRN-11NF；泳道7–CLRN-11myc；泳道8–阴性对照。
图30是从用本文所述的质粒转染的HEK239FT细胞收集的在转染后48小时的CLRN1亚型1蛋白质水平的使用抗CLRN(EKIANYKEGTYVYKTQSEKY；SEQ ID NO：38)兔多克隆抗体获得的免疫印迹的图像。泳道1–PageRuler Plus预染物；泳道2–CLRN-10；泳道3–CLRN-1；泳道4-CLRN-2；泳道5–CLRN-3；泳道6–CLRN-4；泳道7–CLRN-8；泳道8–CLRN-9；泳道9–CLRN-10；泳道10–CLRN-11；泳道11–CLRN-12；泳道12–CLRN-13，泳道13–CLRN-14；泳道14–CLRN-15；泳道15–CLRN-16；泳道16–阴性对照；泳道17–阴性对照。
图31是使用抗CLRN兔多克隆抗体获得的从经转染HEK293FT细胞收集的在转染后48小时的CLRN1蛋白水平的免疫印迹的图像。泳道1–PageRuler Plus预染物；泳道2–Anc80-CLRN-0；泳道3–Anc80-CLRN-0+PNG酶F；泳道4-Anc80-CLRN-3；泳道5–Anc80-CLRN-3+PNG酶F；泳道6–Anc80-CLRN-6eGFP；泳道7–Anc80-CLRN-6eGFP+PNG酶F；泳道8–Anc80-CLRN-13；泳道9–Anc80-CLRN-13+PNG酶F；泳道10–无载体；泳道11–无载体+PNG酶F。CLRN-1亚型蛋白是一种糖基化蛋白，并且经常以拖尾条带形式(泳道2、4和8)迁移。在用PNG酶F处理之后，拖尾条带消失，并且转变成清晰条带(泳道3、5和8)。
图32是经AAVanc80-CLRN6eGFP转导的HEK293FT细胞的在分别在MOI 8.41E+04和MOI 2.53E+05下转染后24小时和48小时获取的一组免疫荧光图像。
图33是显示分别用AAVanc80-CLRN-6eGFP(在MOI 1.05E+05和MOI 3.15E+05下)、AAVanc80-CLRN-0(在MOI 8.23E+04和MOI 2.47E+05下)、AAVanc80-CLRN-3(在MOI 8.41E+04和MOI 2.53E+04下)、以及AAVanc80-CLRN-13(在MOI 8.33E+04和MOI 2.50E+05下)转导的HEK293FT细胞中的相对CLRN1和GFP表达的条形图。
图34是显示来自野生型小鼠的分别用AAVanc80-CLRN-6eGFP(在MOI 2.0E+05下)、AAVanc80-CLRN-0(在MOI 2.5E+05和MOI 7.6E+0.5下)、AAVanc80-CLRN-3(在MOI 2.0E+05和6.03E+05下)以及AAVanc80-CLRN-13(在MOI 2.0E+05和MOI 6.0E+05下)感染16小时的P2耳蜗外植体中的相对CLRN1和GFP表达的条形图。
图35是来自野生型小鼠的用1.3E10 AAVanc80-CLRN-0 VG/耳蜗、9.9E9AAVanc80-CLRN-3 VG/耳蜗和1.0E10 AAVanc80-CLRN-13 VG/耳蜗感染72小时的P2耳蜗外植体的显示Myo7a和DAPI染色的一组荧光图像。
图36是来自野生型小鼠的用1E09 VG/耳蜗的AAV Anc80.CAG.eGFP.3’UTR感染72小时的P2耳蜗外植体的显示eGFP、Myo7a和DAPI染色的一组荧光图像。
具体实施方式
由CLRN1基因编码的蛋白“clarin 1”的缺乏或突变导致听力损失和视力损失。举例来说，CLRN1中的突变导致III型尤塞氏综合征和视网膜色素病变。
本文提供了包括至少两种不同核酸载体的组合物，其中：所述至少两种不同载体中的每一者包含编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基，其中所编码部分中的每一者的氨基酸序列可任选地与所编码部分中的不同者的氨基酸序列部分重叠；所述至少两种不同载体中没有单一载体编码全长CLRN1蛋白；所述编码序列中的至少一者包含跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子，并且缺乏所述两个连续外显子之间的内含子序列的核苷酸序列；并且当引入哺乳动物细胞中时，所述至少两种不同载体经受彼此同源性重组，由此形成编码全长CLRN1蛋白的重组核酸。
本文提供了包括单一核酸载体的组合物，其中所述载体包含(i)编码CLRN1蛋白的第一亚型的第一编码序列；和(ii)编码CLRN1蛋白的第二亚型的第二编码序列中的一者或两者，其中所述第一编码序列和所述第二编码序列中的一者或两者包含跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子，并且缺乏两个连续内含子之间的内含子序列的核苷酸序列。
本文提供了包括两种不同核酸载体的组合物，其中：所述两种不同核酸载体中的第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分的第一编码序列、以及位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列；并且所述两种不同核酸载体中的第二核酸载体包含剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分的第二编码序列、以及在所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化信号序列；其中所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基，其中两个所编码部分的氨基酸序列不彼此重叠；其中所述两种不同载体中没有单一载体编码全长CLRN1蛋白；并且当引入哺乳动物细胞中时，在所述剪接供体序列与所述剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码全长CLRN1蛋白的重组核酸。
本文提供了包括两种不同核酸载体的组合物，其中：所述两种不同核酸载体中的第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列、以及位于所述剪接供体序列的3’的第一可检测标记基因；并且所述两种不同核酸载体中的第二核酸载体包含第二可检测标记基因、位于所述第二可检测标记基因的3’的剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分的第二编码序列、以及位于所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化信号序列；其中所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基，其中所编码部分的氨基酸序列不彼此重叠；其中所述两种不同载体中没有单一载体编码全长CLRN1蛋白；并且当引入哺乳动物细胞中时，在所述剪接供体序列与所述剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码全长CLRN1蛋白的重组核酸。
本文还提供了包括两种不同核酸载体的组合物，其中：所述两种不同核酸载体中的第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列、以及位于所述剪接供体序列的3’的F1噬菌体致重组区域；并且所述两种不同核酸载体中的第二核酸载体包含F1噬菌体致重组区域、位于所述F1噬菌体致重组区域的3’的剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分的第二编码序列、以及位于所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化信号序列；其中两个所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基，其中两个所编码部分的氨基酸序列不彼此重叠；其中所述两种不同载体中没有单一载体编码全长CLRN1蛋白；并且当引入哺乳动物细胞中时，在所述剪接供体序列与所述剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码全长CLRN1蛋白的重组核酸。
本文提供了包括：向哺乳动物的耳蜗中引入治疗有效量的本文所述的任何组合物的方法。
本文提供了使哺乳动物细胞中全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：将本文所述的任何组合物引入所述哺乳动物细胞中。
本文提供了使哺乳动物的耳蜗中的内毛细胞、外毛细胞或两者中的全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：向所述哺乳动物的所述耳蜗中引入治疗有效量的本文所述的任何组合物。
本文提供了使哺乳动物的眼中的全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：以眼内方式向所述哺乳动物的所述眼施用治疗有效量的本文所述的任何组合物。
本文提供了治疗被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因的受试者的听力损失的方法，所述方法包括：向所述受试者的耳蜗中施用治疗有效量的本文所述的任何组合物。
本文还提供了治疗被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因的受试者的视力损失的方法，所述方法包括：向所述受试者的眼中施用治疗有效量的本文所述的任何组合物。
组合物、药盒和方法的额外非限制性方面在本文中加以描述，并且可不加限制地以任何组合加以使用。
CLRN1
CLRN1基因编码作为一种在内耳的毛细胞(例如内耳毛细胞、外耳毛细胞)中以及在视网膜中表达的蛋白质的“clarin 1”(CLRN1)。
人CLRN1基因位于染色体3q25.1上。它含有涵盖约47千碱基(kb)的7个外显子(Vastinsalo等人(2011)Eur J Hum Genet 19(1):30-35；NCBI登录号NG_009168.1)。
CLRN1基因中的各种突变已与III型尤塞氏综合征(例如IIIA型尤塞氏综合征(MIM#606397)(参见例如Fields等人(2002)Am J Hum Genet 71:607-617，以及Joensuu等人(2001)Am J Hum Genet 69：673-684)和视网膜色素病变(参见例如Khan等人(2011)Ophthalmology 118:1444-1448)相关联。导致III型尤塞氏综合征的突变已主要见于CLRN1的外显子3中。III型尤塞氏综合征-耳聋可通过产生CLRN1缺陷性小鼠来模型化(参见例如Geng等人(2017)Sci Rep 7(1):13480)。与III型尤塞氏综合征相关的示例性CLRN1突变包括：T528G、M120K、M44K、N48K和C40G。
与视网膜色素病变相关的示例性CLRN1突变包括L154W和P31L(参见例如Khan等人(2011)Ophthalmology 118:1444-1448)。
CLRN1基因中的已在患有听力损失的受试者中检测到的额外示例性突变以及对编码CLRN1的核酸进行测序的方法描述于例如Fields等人(2002)Am J Hum Genet 71:607-617，Joensuu等人(2001)Am J Hum Genet 69:673-684，Adato等人(2002)Europ J HumGenet 10:339-350，Aller等人(2004),Clin Genet 66:525-529中。检测基因中的突变的方法在本领域中是熟知的。这类技术的非限制性实例包括：实时聚合酶链式反应(RT-PCR)、PCR、测序、Southern印迹和Northern印迹。
示例性人野生型CLRN1蛋白是或包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的序列。编码野生型CLRN1蛋白的核苷酸序列的非限制性实例是或包括SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白包含与SEQ ID NO：1具有至少75％(例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白包含与SEQ ID NO：3具有至少75％(例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白包含与SEQ ID NO：5具有至少75％(例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，CLRN1蛋白包含与SEQ ID NO：7具有至少75％(例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的序列。
人全长野生型CLRN1蛋白亚型D(SEQ ID NO：1)
Figure BDA0002946755900000531
人野生型CLRN1亚型D cDNA(SEQ ID NO：2)
Figure BDA0002946755900000532
人全长野生型CLRN1蛋白亚型A(SEQ ID NO：3)
Figure BDA0002946755900000533
人野生型CLRN1亚型A cDNA(SEQ ID NO：4)
Figure BDA0002946755900000541
人全长野生型CLRN1蛋白亚型C(SEQ ID NO：5)
Figure BDA0002946755900000542
人野生型CLRN1亚型C cDNA(SEQ ID NO：6)
Figure BDA0002946755900000543
人全长野生型CLRN1蛋白亚型E(SEQ ID NO：7)
Figure BDA0002946755900000544
人野生型CLRN1亚型E cDNA(SEQ ID NO：8)
Figure BDA0002946755900000551
人野生型CLRN1基因组序列(SEQ ID NO：9)
Figure BDA0002946755900000552
Figure BDA0002946755900000561
Figure BDA0002946755900000571
Figure BDA0002946755900000581
Figure BDA0002946755900000591
Figure BDA0002946755900000601
Figure BDA0002946755900000611
Figure BDA0002946755900000621
Figure BDA0002946755900000631
Figure BDA0002946755900000641
Figure BDA0002946755900000651
Figure BDA0002946755900000661
Figure BDA0002946755900000671
Figure BDA0002946755900000681
Figure BDA0002946755900000691
Figure BDA0002946755900000701
Figure BDA0002946755900000711
Figure BDA0002946755900000721
Figure BDA0002946755900000731
Figure BDA0002946755900000741
Figure BDA0002946755900000751
人野生型CLRN1基因组DNA序列的一非限制性实例是SEQ ID NO：9。SEQ ID NO：9中的外显子是：核苷酸位置1-544(外显子1)、核苷酸位置28764-29180(外显子2)、核苷酸位置31239-31418(外显子3)、核苷酸位置32481-32519(外显子4)、核苷酸位置44799-46433(外显子5)、核苷酸位置44799-44935(外显子6)以及核苷酸位置46128-46837(外显子7)。内含子位于SEQ ID NO：9中这些外显子的每一对之间，即在核苷酸位置545-28763(内含子1)、核苷酸位置29181-31238(内含子2)、核苷酸位置31419-32480(内含子3)、核苷酸位置32520-44798(内含子4)以及核苷酸位置44936-46127(内含子7)处。
小鼠CLRN1蛋白亚型1(SEQ ID NO：10)
Figure BDA0002946755900000761
犬CLRN1蛋白(SEQ ID NO：11)
Figure BDA0002946755900000762
载体
本文提供的组合物包括至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)核酸载体，其中：所述至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸(例如在约30个氨基酸至约202个氨基酸、约30个氨基酸至约200个氨基酸、约30个氨基酸至约180个氨基酸、约30个氨基酸至约170个氨基酸、约30个氨基酸至约160个氨基酸、约30个氨基酸至约150个氨基酸、约30个氨基酸至约140个氨基酸、约30个氨基酸至约130个氨基酸、约30个氨基酸至约120个氨基酸、约30个氨基酸至约110个氨基酸、约30个氨基酸至约100个氨基酸、约30个氨基酸至约90个氨基酸、约30个氨基酸至约80个氨基酸、约30个氨基酸至约70个氨基酸、约30个氨基酸至约60个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸、约60个氨基酸至约202个氨基酸、约60个氨基酸至约200个氨基酸、约60个氨基酸至约180个氨基酸、约60个氨基酸至约170个氨基酸、约60个氨基酸至约160个氨基酸、约60个氨基酸至约150个氨基酸、约60个氨基酸至约140个氨基酸、约60个氨基酸至约130个氨基酸、约60个氨基酸至约120个氨基酸、约60个氨基酸至约110个氨基酸、约60个氨基酸至约100个氨基酸、约60个氨基酸至约90个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约60个氨基酸至约70个氨基酸、约90个氨基酸至约202个氨基酸、约90个氨基酸至约200个氨基酸、约90个氨基酸至约180个氨基酸、约90个氨基酸至约170个氨基酸、约90个氨基酸至约160个氨基酸、约90个氨基酸至约150个氨基酸、约90个氨基酸至约140个氨基酸、约90个氨基酸至约130个氨基酸、约90个氨基酸至约120个氨基酸、约90个氨基酸至约110个氨基酸、约90个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约202个氨基酸、约100个氨基酸至约200个氨基酸、约100个氨基酸至约180个氨基酸、约100个氨基酸至约170个氨基酸、约100个氨基酸至约160个氨基酸、约100个氨基酸至约150个氨基酸、约100个氨基酸至约140个氨基酸、约100个氨基酸至约130个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约90个氨基酸至约110个氨基酸、约120个氨基酸至约202个氨基酸、约120个氨基酸至约200个氨基酸、约120个氨基酸至约180个氨基酸、约120个氨基酸至约170个氨基酸、约120个氨基酸至约160个氨基酸、约120个氨基酸至约150个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约120个氨基酸至约130个氨基酸、约150个氨基酸至约202个氨基酸、约150个氨基酸至约200个氨基酸、约150个氨基酸至约180个氨基酸、约150个氨基酸至约170个氨基酸、约150个氨基酸至约160个氨基酸、约170个氨基酸至约202个氨基酸、约170个氨基酸至约200个氨基酸、约170个氨基酸至约180个氨基酸、约190个氨基酸至约202个氨基酸、或约190个氨基酸至约200个氨基酸之间)。
在这些组合物的一些实施方案中，编码序列中的至少一者包括跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子(例如外显子1和2、或外显子5和6)，并且缺乏天然存在于所述两个连续外显子之间的内含子序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所编码部分中没有一者的氨基酸序列与所编码部分中的不同者的氨基酸序列即使部分地重叠。在一些实施方案中，所编码部分中的一者或多者的氨基酸序列与所编码部分中的不同者的氨基酸序列部分重叠。在一些实施方案中，所编码部分中的每一者的氨基酸序列与所编码部分中的不同者的氨基酸序列部分重叠。
在一些实施方案中，重叠氨基酸序列的长度在约30个氨基酸残基至约202个氨基酸之间(例如或本文所述的这个范围的任何子范围)。
在一些实例中，载体包括两种不同载体，其中每一者包含内含子的不同区段，其中所述内含子包括存在于CLRN1基因组DNA中的内含子(例如本文所述的SEQ ID NO：9中的任何示例性内含子)的核苷酸序列，并且其中两个不同区段在序列方面就长度而言重叠至少100个核苷酸(例如约100个核苷酸至约10,000个核苷酸、约100个核苷酸至约5,000个核苷酸、约100个核苷酸至约4,500个核苷酸、约100个核苷酸至约4,000个核苷酸、约100个核苷酸至约3,500个核苷酸、约100个核苷酸至约3,000个核苷酸、约100个核苷酸至约2,500个核苷酸、约100个核苷酸至约2,000个核苷酸、约100个核苷酸至约1,500个核苷酸、约100个核苷酸至约1,000个核苷酸、约100个核苷酸至约800个核苷酸、约100个核苷酸至约600个核苷酸、约100个核苷酸至约400个核苷酸、约100个核苷酸至约200个核苷酸、约200个核苷酸至约10,000个核苷酸、约200个核苷酸至约5,000个核苷酸、约200个核苷酸至约4,500个核苷酸、约200个核苷酸至约4,000个核苷酸、约200个核苷酸至约3,500个核苷酸、约200个核苷酸至约3,000个核苷酸、约200个核苷酸至约2,500个核苷酸、约200个核苷酸至约2,000个核苷酸、约200个核苷酸至约1,500个核苷酸、约200个核苷酸至约1,000个核苷酸、约200个核苷酸至约800个核苷酸、约200个核苷酸至约600个核苷酸、约200个核苷酸至约400个核苷酸、约400个核苷酸至约10,000个核苷酸、约400个核苷酸至约5,000个核苷酸、约400个核苷酸至约4,500个核苷酸、约400个核苷酸至约4,000个核苷酸、约400个核苷酸至约3,500个核苷酸、约400个核苷酸至约3,000个核苷酸、约400个核苷酸至约2,500个核苷酸、约400个核苷酸至约2,000个核苷酸、约400个核苷酸至约1,500个核苷酸、约400个核苷酸至约1,000个核苷酸、约400个核苷酸至约800个核苷酸、约400个核苷酸至约600个核苷酸、约600个核苷酸至约10,000个核苷酸、约600个核苷酸至约5,000个核苷酸、约600个核苷酸至约4,500个核苷酸、约600个核苷酸至约4,000个核苷酸、约600个核苷酸至约3,500个核苷酸、约600个核苷酸至约3,000个核苷酸、约600个核苷酸至约2,500个核苷酸、约600个核苷酸至约2,000个核苷酸、约600个核苷酸至约1,500个核苷酸、约600个核苷酸至约1,000个核苷酸、约600个核苷酸至约800个核苷酸、约800个核苷酸至约10,000个核苷酸、约800个核苷酸至约5,000个核苷酸、约800个核苷酸至约4,500个核苷酸、约800个核苷酸至约4,000个核苷酸、约800个核苷酸至约3,500个核苷酸、约800个核苷酸至约3,000个核苷酸、约800个核苷酸至约2,500个核苷酸、约800个核苷酸至约2,000个核苷酸、约800个核苷酸至约1,500个核苷酸、约800个核苷酸至约1,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约5,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约2,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约2,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约1,500个核苷酸、约1,500个核苷酸至约10,000个核苷酸、约1,500个核苷酸至约5,000个核苷酸、约1,500个核苷酸至约4,500个核苷酸、约1,500个核苷酸至约4,000个核苷酸、约1,500个核苷酸至约3,500个核苷酸、约1,500个核苷酸至约3,000个核苷酸、约1,500个核苷酸至约2,500个核苷酸、约1,500个核苷酸至约2,000个核苷酸、约2,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约2,000个核苷酸至约5,000个核苷酸、约2,000个核苷酸至约4,500个核苷酸、约2,000个核苷酸至约4,000个核苷酸、约2,000个核苷酸至约3,500个核苷酸、约2,000个核苷酸至约3,000个核苷酸、约2,000个核苷酸至约2,500个核苷酸、约2,500个核苷酸至约10,000个核苷酸、约2,500个核苷酸至约5,000个核苷酸、约2,500个核苷酸至约4,500个核苷酸、约2,500个核苷酸至约4,000个核苷酸、约2,500个核苷酸至约3,500个核苷酸、约2,500个核苷酸至约3,000个核苷酸、约3,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约3,000个核苷酸至约5,000个核苷酸、约3,000个核苷酸至约4,500个核苷酸、约3,000个核苷酸至约4,000个核苷酸、约3,000个核苷酸至约3,500个核苷酸、约3,500个核苷酸至约10,000个核苷酸、约3,500个核苷酸至约5,000个核苷酸、约3,500个核苷酸至约4,500个核苷酸、约3,500个核苷酸至约4,000个核苷酸、约4,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约4,000个核苷酸至约5,000个核苷酸、约4,000个核苷酸至约4,500个核苷酸、约4,500个核苷酸至约10,000个核苷酸约4,500个核苷酸至约5,000个核苷酸、或约5,000个核苷酸至约10,000个核苷酸)。
不同载体中的任何两者中的重叠核苷酸序列可包括CLRN1基因的一个或多个外显子(例如本文所述的SEQ ID NO：9中的示例性外显子中的任何一者或多者)的一部分或全部。
在一些实施方案中，组合物中不同载体的种数是两种、三种、四种或五种。在其中组合物中不同载体的种数是两种的组合物中，两种不同载体中的第一载体可包括编码CLRN1蛋白的N末端部分的编码序列。在一些实例中，CLRN1基因的N末端部分的长度在约30个氨基酸至约202个氨基酸之间(或以上所述的这个范围的任何子范围)。在一些实例中，第一载体还包括启动子(例如本文所述或本领域中已知的任何启动子)和Kozak序列(例如本文所述或本领域中已知的任何示例性Kozak序列)中的一者或两者。在一些实例中，第一载体包括是诱导型启动子、组成型启动子、或组织特异性启动子的启动子。在一些实例中，两种不同载体中的第二者包括编码CLRN1蛋白的C末端部分的编码序列。在一些实例中，CLRN1蛋白的C末端部分的长度在30个氨基酸至约202个氨基酸之间(或以上所述的这个范围的任何子范围)。在一些实例中，第二载体还包括多腺苷酸化信号序列。
在其中组合物中不同载体的种数是两种的一些实例中，由两种载体中的一者编码的N末端部分可包括包含野生型CLRN1蛋白(例如SEQ ID NO：1、3、5或7)的氨基酸位置1至以下中的任一者的部分：约氨基酸位置202、约氨基酸位置200、约氨基酸190、约氨基酸位置180、约氨基酸位置170、约氨基酸位置160、约氨基酸位置150、约氨基酸位置140、约氨基酸位置130、约氨基酸位置120、约氨基酸位置110、约氨基酸位置100、约氨基酸位置90、约氨基酸位置80、约氨基酸位置70、约氨基酸位置60、约氨基酸位置50、或约氨基酸位置40。
在其中组合物中不同载体的种数是两种的一些实例中，前体CLRN1蛋白的N末端部分可包括包含野生型CLRN1蛋白(例如SEQ ID NO：1、3、5或7)的氨基酸位置1至氨基酸位置202、氨基酸位置1至约氨基酸位置200、氨基酸位置1至约氨基酸位置190、氨基酸位置1至约氨基酸位置180、氨基酸位置1至约氨基酸位置170、氨基酸位置1至约氨基酸位置160、氨基酸位置1至约氨基酸位置150、氨基酸位置1至约氨基酸位置140、氨基酸位置1至约氨基酸位置130、氨基酸位置1至约氨基酸位置120、氨基酸位置1至约氨基酸位置110、氨基酸位置1至约氨基酸位置100、氨基酸位置1至约氨基酸位置90、氨基酸位置1至约氨基酸位置80、氨基酸位置1至约氨基酸位置70、氨基酸位置1至约氨基酸位置60、氨基酸位置1至约氨基酸位置50、氨基酸位置1至约氨基酸位置40、氨基酸位置1至约氨基酸位置30的部分。
如本文所用，术语“载体”意指包括能够携带至少一种外源性核酸片段的多核苷酸的组合物，例如质粒载体、转座子、粘粒、人工染色体(例如人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1源性人工染色体(PAC))、病毒载体(例如如本文所述的任何腺病毒载体(例如pSV或pCMV载体)或任何逆转录病毒载体)、以及任何
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载体。载体可例如包括足以达成表达的顺式作用性元件；用于表达的其他元件可由宿主哺乳动物细胞或在体外表达系统中提供。术语“载体”包括当与适当控制元件相关联时能够复制的任何遗传元件(例如质粒、转座子、粘粒、人工染色体、病毒载体等)。因此，所述术语包括克隆载体和表达载体以及病毒载体(例如腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体)。
载体包括本领域中已知的所有那些，包括并有重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸质粒或含于脂质体中的质粒)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。熟练从业者将能够选择适于制备本文所述的任何核酸的载体和哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，载体是质粒(即可在细胞内部自主复制的环状DNA分子)。在一些实施方案中，载体可为粘粒(例如pWE和sCos系列(Wahl等人(1987)，Evans等人(1989))。
在一些实施方案中，一种或多种载体是人工染色体。人工染色体是可作为载体用于携带大型DNA插入物的经遗传工程改造染色体。在一些实施方案中，人工染色体是人类人工染色体(HAC)(参见例如Kouprina等人,Expert Opin.Drug Deliv 11(4):517-535,2014；Basu等人,Pediatr.Clin.North Am.53:843-853,2006；Ren等人,Stem.Cell Rev.2(1):43-50,2006；Kazuki等人,Mol.Ther.19(9):1591-1601,2011；Kazuki等人,Gen.Ther.18:384-393,2011；以及Katoh等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.321:280-290,2004)。
在一些实施方案中，一种或多种载体是酵母人工染色体(YAC)(参见例如Murray等人,Nature 305:189-193,1983；Ikeno等人(1998)Nat.Biotech.16:431-439,1998)。在一些实施方案中，一种或多种载体是细菌人工染色体(BAC)(例如pBeloBAC11、pECBAC1和pBAC108L)。在一些实施方案中，一种或多种载体是P1源性人工染色体(PAC)。人工染色体的实例在本领域中是已知的。
在一些实施方案中，一种或多种载体是病毒载体(例如腺相关病毒、腺病毒、慢病毒和逆转录病毒)。病毒载体的非限制性实例在本文中加以描述。在一些实施方案中，一种或多种载体是腺相关病毒载体(AAV)(参见例如Asokan等人,Mol.Ther.20:699-7080,2012)。重组AAV载体或“rAAV”通常由至少转基因或其一部分和调控序列，以及任选的5'和3'AAV反向末端重复序列(ITR)组成。这种重组AAV载体被包装至衣壳中，并且递送至所选靶细胞(例如耳蜗毛细胞)。
载体的AAV序列通常包含顺式作用性5'和3'ITR序列(参见例如B.J.Carter,"Handbook of Parvoviruses",P.Tijsser编,CRC Press,第155 168页,1990)。典型AAV ITR序列的长度是约145个核苷酸。在一些实施方案中，典型ITR序列的至少75％(例如至少80％、至少85％、至少90％或至少95％)并入AAV载体中。修改这些ITR序列的能力属于本领域的技能。(参见例如教科书诸如Sambrook等人,"Molecular Cloning.A LaboratoryManual",第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989；以及K.Fisher等人,JVirol.70:520 532,1996)。在一些实施方案中，本文所述的任何编码序列在AAV载体中都由5'和3'AAV ITR序列侧接。AAV ITR序列可从包括当前鉴定的AAV类型的任何已知AAV获得。
如本文所述的AAV载体可包括本文所述的任何调控元件(例如启动子、多腺苷酸化(多聚(A))信号序列和IRES中的一者或多者)。
在一些实施方案中，AAV载体选自由以下组成的组：AAV1载体、AAV2载体、AAV3载体、AAV4载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV7载体、AAV8载体、AAV9载体、AAV2.7m8载体、AAV8BP2载体和AAV293载体。可在本文中使用的额外示例性AAV载体在本领域中是已知的。参见例如Kanaan等人,Mol.Ther.Nucleic Acids8:184-197,2017；Li等人,Mol.Ther.16(7)：1252-1260；Adachi等人,Nat.Commun.5:3075,2014；Isgrig等人,Nat.Commun.10(1)：427,2019；以及Gao等人,J.Virol.78(12):6381-6388。
在一些实施方案中，本文提供的AAV载体包括以下或由以下组成：与SEQ ID NO：40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60至少80％同一(例如至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％、至少99％或100％同一)的序列。在一些实施方案中，一种或多种载体是腺病毒(参见例如Dmitriev等人(1998)J.Virol.72：9706-9713；以及Poulin等人,J.Virol 8:10074-10086,2010)。在一些实施方案中，一种或多种载体是逆转录病毒(参见例如Maier等人(2010)Future Microbiol 5:1507-23)。
在一些实施方案中，一种或多种载体是慢病毒(参见例如Matrai等人(2010)MolTher.18:477-490；Banasik等人(2010)Gene Ther.17:150-7；以及Wanisch等人(2009)Mol.Ther.17:1316-32)。慢病毒载体是指源于慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)中所述的自失活性慢病毒载体。可在临床中使用的非限制性慢病毒载体包括来自Oxford BioMedica的
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基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。其他类型的慢病毒载体也是可用的，并且将为本领域技术人员所知。
本文提供的载体可具有不同大小。对用于本文所述的任何组合物、药盒和方法中的载体的选择可取决于载体的大小。
在一些实施方案中，一种或多种载体是质粒，并且可包括多达约1kb、多达约2kb、多达约3kb、多达约4kb、多达约5kb、多达约6kb、多达约7kb、多达约8kb、多达约9kb、多达约10kb、多达约11kb、多达约12kb、多达约13kb、多达约14kb、或多达约15kb的总长度。在一些实施方案中，一种或多种载体是质粒，并且可具有在约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约1kb至约9kb、约1kb至约10kb、约1kb至约11kb、约1kb至约12kb、约1kb至约13kb、约1kb至约14kb、或约1kb至约15kb的范围内的总长度。
在一些实施方案中，一种或多种载体是转座子(例如PiggyBacTM转座子)，并且可包括大于200kb。在一些实例中，一种或多种载体是具有在约1kb至约10kb、约1kb至约20kb、约1kb至约30kb、约1kb至约40kb、约1kb至约50kb、约1kb至约60kb、约1kb至约70kb、约1kb至约80kb、约1kb至约90kb、约10kb至约20kb、约10kb至约30kb、约10kb至约40kb、约10kb至约50kb、约10kb至约60kb、约10kb至约70kb、约10kb至约90kb、约10kb至约100kb、约20kb至约30kb、约20kb至约40kb、约20kb至约50kb、约20kb至约60kb、约20kb至约70kb、约20kb至约80kb、约20kb至约90kb、约20kb至约100kb、约30kb至约40kb、约30kb至约50kb、约30kb至约60kb、约30kb至约70kb、约30kb至约80kb、约30kb至约90kb、约30kb至约100kb、约40kb至约50kb、约40kb至约60kb、约40kb至约70kb、约40kb至约80kb、约40kb至约90kb、约40kb至约100kb、约50kb至约60kb、约50kb至约70kb、约50kb至约80kb、约50kb至约90kb、约50kb至约100kb、约60kb至约70kb、约60kb至约80kb、约60kb至约90kb、约60kb至约100kb、约70kb至约80kb、约70kb至约90kb、约70kb至约100kb、约80kb至约90kb、约80kb至约100kb、约90kb至约100kb、约1kb至约100kb、约100kb至约200kb、约100kb至约300kb、约100kb至约400kb、或约100kb至约500kb的范围内的总长度的转座子。
在一些实施方案中，载体是粘粒，并且可具有多达55kb的总长度。在一些实例中，载体是粘粒，并且具有约1kb至约10kb、约1kb至约20kb、约1kb至约30kb、约1kb至约40kb、约1kb至约50kb、约1kb至约55kb、约10kb至约20kb、约10kb至约30kb、约10kb至约40kb、约10kb至约50kb、约10kb至约55kb、约15kb至约55kb、约15kb至约50kb、约15kb至约40kb、约15kb至约30kb、约15kb至约20kb、约20kb至约55kb、约20kb至约50kb、约20kb至约40kb、约20kb至约30kb、约25kb至约55kb、约25kb至约50kb、约25kb至约40kb、约25kb至约30kb、约30kb至约55kb、约30kb至约50kb、约30kb至约40kb、约35kb至约55kb、约40kb至约55kb、约40kb至约50kb、或约45kb至约55kb的核苷酸总数。
在一些实施方案中，一种或多种载体是人工染色体，并且可具有约100kb至约2000kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，一种或多种人工染色体是人类人工染色体(HAC)，并且可具有在约1kb至约10kb、1kb至约20kb、约1kb至约30kb、约1kb至约40kb、约1kb至约50kb、约1kb至约60kb、约10kb至约20kb、约10kb至约30kb、约10kb至约40kb、约10kb至约50kb、约10kb至约60kb、约20kb至约30kb、约20kb至约40kb、约20kb至约50kb、约20kb至约60kb、约30kb至约40kb、约30kb至约50kb、约30kb至约60kb、约40kb至约50kb、约40kb至约60kb、或约50kb至约60kb的范围内的核苷酸总数。
在一些实施方案中，一种或多种人工染色体是酵母人工染色体(YAC)，并且可具有多达1000kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，一种或多种人工染色体是具有在约100kb至约1,000kb、约100kb至约900kb、约100kb至约800kb、约100kb至约700kb、约100kb至约600kb、约100kb至约500kb、约100kb至约400kb、约100kb至约300kb、约100kb至约200kb、约200kb至约1,000kb、约200kb至约900kb、约200kb至约800kb、约200kb至约700kb、约200kb至约600kb、约200kb至约500kb、约200kb至约400kb、约200kb至约300kb、约300kb至约1,000kb、约300kb至约900kb、约300kb至约800kb、约300kb至约700kb、约300kb至约600kb、约300kb至约500kb、约300kb至约400kb、约400kb至约1,000kb、约400kb至约900kb、约400kb至约800kb、约400kb至约700kb、约400kb至约600kb、约400kb至约500kb、约500kb至约1,000kb、约500kb至约900kb、约500kb至约800kb、约500kb至约700kb、约500kb至约600kb、约600kb至约1,000kb、约600kb至约900kb、约600kb至约800kb、约600kb至约700kb、约700kb至约1,000kb、约700kb至约900kb、约700kb至约800kb、约800kb至约1,000kb、约800kb至约900kb、或约900kb至约1,000kb的范围内的核苷酸总数的YAC。
在一些实施方案中，一种或多种人工染色体是细菌人工染色体(BAC)，并且可具有多达750kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，一种或多种人工染色体是BAC，并且可具有在约100kb至约750kb、约100kb至约700kb、约100kb至约600kb、约100kb至约500kb、约100kb至约400kb、约100kb至约300kb、约100kb至约200kb、约150kb至约750kb、约150kb至约700kb、约150kb至约600kb、约150kb至约500kb、约150kb至约400kb、约150kb至约300kb、约150kb至约200kb、约200kb至约750kb、约200kb至约700kb、约200kb至约600kb、约200kb至约500kb、约200kb至约400kb、约200kb至约300kb、约250kb至约750kb、约250kb至约700kb、约250kb至约600kb、约250kb至约500kb、约250kb至约400kb、约250kb至约300kb、约300kb至约750kb、约300kb至约700kb、约300kb至约600kb、约300kb至约500kb、约300kb至约400kb、约350kb至约750kb、约350kb至约700kb、约350kb至约600kb、约350kb至约500kb、约350kb至约400kb、约400kb至约750kb、约400kb至约700kb、约450kb至约600kb、约450kb至约500kb、约500kb至约750kb、约500kb至约700kb、约500kb至约600kb、约550kb至约750kb、约550kb至约700kb、约550kb至约600kb、约600kb至约750kb、约600kb至约700kb、或约650kb至约750kb的范围内的核苷酸总数。
在一些实施方案中，一种或多种人工染色体是P1源性人工染色体(PAC)，并且可具有多达300kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，一种或多种P1源性人工染色体可具有在约100kb至约300kb、约100kb至约200kb、或约200kb至约300kb的范围内的核苷酸总数。
在一些实施方案中，一种或多种载体是病毒载体，并且可具有多达10kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，一种或多种病毒载体可具有在约1kb至约2kb、1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约1kb至约9kb、约1kb至约10kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约2kb至约9kb、约2kb至约10kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约3kb至约9kb、约3kb至约10kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约4kb至约9kb、约4kb至约10kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约5kb至约9kb、约5kb至约10kb、约6kb至约7kb、约6kb至约8kb、约6kb至约9kb、约6kb至约10kb、约7kb至约8kb、约7kb至约9kb、约7kb至约10kb、约8kb至约9kb、约8kb至约10kb、或约9kb至约10kb的范围内的核苷酸总数。
在一些实施方案中，一种或多种载体是慢病毒，并且可具有多达8kb的核苷酸总数。在一些实例中，一种或多种慢病毒可具有约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约6kb至约8kb、约6kb至约7kb、或约7kb至约8kb的核苷酸总数。
在一些实施方案中，一种或多种载体是腺病毒，并且可具有多达8kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，一种或多种腺病毒可具有在约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约1kb至约6kb、约1kb至约7kb、约1kb至约8kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约2kb至约6kb、约2kb至约7kb、约2kb至约8kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、约3kb至约6kb、约3kb至约7kb、约3kb至约8kb、约4kb至约5kb、约4kb至约6kb、约4kb至约7kb、约4kb至约8kb、约5kb至约6kb、约5kb至约7kb、约5kb至约8kb、约6kb至约7kh、约6kb至约8kb、或约7kb至约8kb的范围内的核苷酸总数。
在一些实施方案中，一种或多种载体是腺相关病毒(AAV载体)，并且可包括多达5kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，一种或多种AAV载体可包括在约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、或约4kb至约5kb的范围内的核苷酸总数。
在一些实施方案中，一种或多种载体是
Figure BDA0002946755900000891
载体，并且可包括多达5kb的核苷酸总数。在一些实施方案中，每种
Figure BDA0002946755900000892
载体包括在约1kb至约2kb、约1kb至约3kb、约1kb至约4kb、约1kb至约5kb、约2kb至约3kb、约2kb至约4kb、约2kb至约5kb、约3kb至约4kb、约3kb至约5kb、或约4kb至约5kb的范围内的核苷酸总数。
在本文提供的任何组合物、药盒和方法的一些实施方案中，至少两种不同载体可为大致上相同类型的载体，并且在大小方面可不同。在一些实施方案中，至少两种不同载体可为不同类型的载体，并且可具有大致上相同的大小或具有不同大小。
在一些实施方案中，至少两种载体中的任一者可具有在以下范围内的核苷酸总数：约500个核苷酸至约15,000个核苷酸、约500个核苷酸至约14,500个核苷酸、约500个核苷酸至约14,000个核苷酸、约500个核苷酸至约13,500个核苷酸、约500个核苷酸至约13,000个核苷酸、约500个核苷酸至约12,500个核苷酸、约500个核苷酸至约12,000个核苷酸、约500个核苷酸至约11,500个核苷酸、约500个核苷酸至约11,000个核苷酸、约500个核苷酸至约10,500个核苷酸、约500个核苷酸至约10,000个核苷酸、约500个核苷酸至约9,500个核苷酸、约500个核苷酸至约9,000个核苷酸、约500个核苷酸至约8,500个核苷酸、约500个核苷酸至约8,000个核苷酸、约500个核苷酸至约7,800个核苷酸、约500个核苷酸至约7,600个核苷酸、约500个核苷酸至约7,400个核苷酸、约500个核苷酸至约7,200个核苷酸、约500个核苷酸至约7,000个核苷酸、约500个核苷酸至约6,800个核苷酸、约500个核苷酸至约6,600个核苷酸、约500个核苷酸至约6,400个核苷酸、约500个核苷酸至约6,200个核苷酸、约500个核苷酸至约6,000个核苷酸、约500个核苷酸至约5,800个核苷酸、约500个核苷酸至约5,600个核苷酸、约500个核苷酸至约5,400个核苷酸、约500个核苷酸至约5,200个核苷酸、约500个核苷酸至约5,000个核苷酸、约500个核苷酸至约4,800个核苷酸、约4,600个核苷酸、约500个核苷酸至约4,400个核苷酸、约500个核苷酸至约4,200个核苷酸、约500个核苷酸至约4,000个核苷酸、约500个核苷酸至约3,800个核苷酸、约500个核苷酸至约3,600个核苷酸、约500个核苷酸至约3,400个核苷酸、约500个核苷酸至约3,200个核苷酸、约500个核苷酸至约3,000个核苷酸、约500个核苷酸至约2,800个核苷酸、约500个核苷酸至约2,600个核苷酸、约500个核苷酸至约2,400个核苷酸、约500个核苷酸至约2,200个核苷酸、约500个核苷酸至约2,000个核苷酸、约500个核苷酸至约1,800个核苷酸、约500个核苷酸至约1,600个核苷酸、约500个核苷酸至约1,400个核苷酸、约500个核苷酸至约1,200个核苷酸、约500个核苷酸至约1,000个核苷酸、约500个核苷酸至约800个核苷酸、约800个核苷酸至约15,000个核苷酸、约800个核苷酸至约14,500个核苷酸、约800个核苷酸至约14,000个核苷酸、约800个核苷酸至约13,500个核苷酸、约800个核苷酸至约13,000个核苷酸、约800个核苷酸至约12,500个核苷酸、约800个核苷酸至约12,000个核苷酸、约800个核苷酸至约11,500个核苷酸、约800个核苷酸至约11,000个核苷酸、约800个核苷酸至约10,500个核苷酸、约800个核苷酸至约10,000个核苷酸、约800个核苷酸至约9,500个核苷酸、约800个核苷酸至约9,000个核苷酸,约800个核苷酸至约8,500个核苷酸、约800个核苷酸至约8,000个核苷酸、约800个核苷酸至约7,800个核苷酸、约800个核苷酸至约7,600个核苷酸、约800个核苷酸至约7,400个核苷酸、约800个核苷酸至约7,200个核苷酸、约800个核苷酸至约7,000个核苷酸、约800个核苷酸至约6,800个核苷酸、约800个核苷酸至约6,600个核苷酸、约800个核苷酸至约6,400个核苷酸、约800个核苷酸至约6,200个核苷酸、约800个核苷酸至约6,000个核苷酸、约800个核苷酸至约5,800个核苷酸、约800个核苷酸至约5,600个核苷酸、约800个核苷酸至约5,400个核苷酸、约800个核苷酸至约5,200个核苷酸、约800个核苷酸至约5,000个核苷酸、约800个核苷酸至约4,800个核苷酸、约800个核苷酸至约4,600个核苷酸、约800个核苷酸至约4,400个核苷酸、约800个核苷酸至约4,200个核苷酸、约800个核苷酸至约4,000个核苷酸、约800个核苷酸至约3,800个核苷酸、约800个核苷酸至约3,600个核苷酸、约800个核苷酸至约3,400个核苷酸、约800个核苷酸至约3,200个核苷酸、约800个核苷酸至约3,000个核苷酸、约800个核苷酸至约2,800个核苷酸、约800个核苷酸至约2,600个核苷酸、约800个核苷酸至约2,400个核苷酸、约800个核苷酸至约2,200个核苷酸、约800个核苷酸至约2,000个核苷酸、约800个核苷酸至约1,800个核苷酸、约800个核苷酸至约1,600个核苷酸、约800个核苷酸至约1,400个核苷酸、约800个核苷酸至约1,200个核苷酸、约800个核苷酸至约1,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约15,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约14,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约14,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约13,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约13,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约12,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约12,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约11,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约11,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约10,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约9,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约8,500个核苷酸、约1,000个核苷酸至约8,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约7,800个核苷酸、约1,000个核苷酸至约7,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约7,400个核苷酸、约1,000个核苷酸至约7,200个核苷酸、约1,000个核苷酸至约7,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约6,800个核苷酸、约1,000个核苷酸至约6,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约6,400个核苷酸、约1,000个核苷酸至约6,200个核苷酸、约1,000个核苷酸至约6,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约5,800个核苷酸、约1,000个核苷酸至约5,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约5,400个核苷酸、约1,000个核苷酸至约5,200个核苷酸、约1,000个核苷酸至约5,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,800个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,400个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,200个核苷酸、约1,000个核苷酸至约4,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,800个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,400个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,200个核苷酸、约1,000个核苷酸至约3,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约2,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约2,400个核苷酸,约1,000个核苷酸至约2,200个核苷酸、约1,000个核苷酸至约2,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约1,800个核苷酸、约1,000个核苷酸至约1,600个核苷酸、约1,000个核苷酸至约1,400个核苷酸、约1,000个核苷酸至约1,200个核苷酸、约1,200个核苷酸至约15,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约14,500个核苷酸、约1,200个核苷酸至约14,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约13,500个核苷酸、约1,200个核苷酸至约13,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约12,500个核苷酸、约1,200个核苷酸至约12,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约11,500个核苷酸、约1,200个核苷酸至约11,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约10,500个核苷酸、约1,200个核苷酸至约10,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约9,500个核苷酸、约1,200个核苷酸至约9,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约8,500个核苷酸、约1,200个核苷酸至约8,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约7,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约7,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约7,400个核苷酸、约1,200个核苷酸至约7,200个核苷酸、约1,200个核苷酸至约7,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约6,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约6,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约6,400个核苷酸、约1,200个核苷酸至约6,200个核苷酸、约1,200个核苷酸至约6,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约5,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约5,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约5,400个核苷酸、约1,200个核苷酸至约5,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约4,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约4,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约4,400个核苷酸、约1,200个核苷酸至约4,200个核苷酸、约1,200个核苷酸至约4,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约3,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约3,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约3,400个核苷酸、约1,200个核苷酸至约3,200个核苷酸、约1,200个核苷酸至约3,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约2,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约2,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约2,400个核苷酸、约1,200个核苷酸至约2,200个核苷酸、约1,200个核苷酸至约2,000个核苷酸、约1,200个核苷酸至约1,800个核苷酸、约1,200个核苷酸至约1,600个核苷酸、约1,200个核苷酸至约1,400个核苷酸、约1,400个核苷酸至约15,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约14,500个核苷酸、约1,400个核苷酸至约14,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约13,500个核苷酸、约1,400个核苷酸至约13,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约12,500个核苷酸、约1,400个核苷酸至约12,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约11,500个核苷酸、约1,400个核苷酸至约11,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约10,500个核苷酸、约1,400个核苷酸至约10,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约9,500个核苷酸、约1,400个核苷酸至约9,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约8,500个核苷酸、约1,400个核苷酸至约8,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约7,800个核苷酸、约1,400个核苷酸至约7,600个核苷酸、约1,400个核苷酸至约7,400个核苷酸、约1,400个核苷酸至约7,200个核苷酸、约1,400个核苷酸至约7,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约6,800个核苷酸、约1,400个核苷酸至约6,600个核苷酸、约1,400个核苷酸至约6,400个核苷酸、约1,400个核苷酸至约6,200个核苷酸、约1,400个核苷酸至约6,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约5,800个核苷酸、约1,400个核苷酸至约5,600个核苷酸、约1,400个核苷酸至约5,400个核苷酸,约1,400个核苷酸至约5,200个核苷酸、约1,400个核苷酸至约5,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约4,800个核苷酸、约1,400个核苷酸至约4,600个核苷酸、约1,400个核苷酸至约4,400个核苷酸、约1,400个核苷酸至约4,200个核苷酸、约1,400个核苷酸至约4,000个核苷酸、约1,400个核苷酸至约3,800个核苷酸、约1,400个核苷酸至约3,600个核苷酸、约1,400个核苷酸至约3,400个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酸、约7,000个核苷酸至约7,800个核苷酸、约7,000个核苷酸至约7,600个核苷酸、约7,000个核苷酸至约7,400个核苷酸、约7,000个核苷酸至约7,200个核苷酸、约7,200个核苷酸至约15,000个核苷酸、约7,200个核苷酸至约14,500个核苷酸、约7,200个核苷酸至约14,000个核苷酸、约7,200个核苷酸至约13,500个核苷酸、约7,200个核苷酸至约13,000个核苷酸、约7,200个核苷酸至约12,500个核苷酸、约7,200个核苷酸至约12,000个核苷酸、约7,200个核苷酸至约11,500个核苷酸、约7,200个核苷酸至约11,000个核苷酸、约7,200个核苷酸至约10,500个核苷酸、约7,200个核苷酸至约10,000个核苷酸、约7,200个核苷酸至约9,500个核苷酸、约7,200个核苷酸至约9,000个核苷酸、约7,200个核苷酸至约8,500个核苷酸、约7,200个核苷酸至约8,000个核苷酸、约7,200个核苷酸至约7,800个核苷酸、约7,200个核苷酸至约7,600个核苷酸、约7,200个核苷酸至约7,400个核苷酸、约7,400个核苷酸至约15,000个核苷酸、约7,400个核苷酸至约14,500个核苷酸、约7,400个核苷酸至约14,000个核苷酸、约7,400个核苷酸至约13,500个核苷酸、约7,400个核苷酸至约13,000个核苷酸、约7,400个核苷酸至约12,500个核苷酸、约7,400个核苷酸至约12,000个核苷酸、约7,400个核苷酸至约11,500个核苷酸、约7,400个核苷酸至约11,000个核苷酸、约7,400个核苷酸至约10,500个核苷酸、约7,400个核苷酸至约10,000个核苷酸、约7,400个核苷酸至约9,500个核苷酸、约7,400个核苷酸至约9,000个核苷酸、约7,400个核苷酸至约8,500个核苷酸、约7,400个核苷酸至约8,000个核苷酸、约7,400个核苷酸至约7,800个核苷酸、约7,400个核苷酸至约7,600个核苷酸、约7,600个核苷酸至约15,000个核苷酸、约7,600个核苷酸至约14,500个核苷酸、约7,600个核苷酸至约14,000个核苷酸、约7,600个核苷酸至约13,500个核苷酸、约7,600个核苷酸至约13,000个核苷酸、约7,600个核苷酸至约12,500个核苷酸、约7,600个核苷酸至约12,000个核苷酸、约7,600个核苷酸至约11,500个核苷酸、约7,600个核苷酸至约11,000个核苷酸、约7,600个核苷酸至约10,500个核苷酸、约7,600个核苷酸至约10,000个核苷酸、约7,600个核苷酸至约9,500个核苷酸、约7,600个核苷酸至约9,000个核苷酸、约7,600个核苷酸至约8,500个核苷酸、约7,600个核苷酸至约8,000个核苷酸、约7,600个核苷酸至约7,800个核苷酸、约7,800个核苷酸至约15,000个核苷酸、约7,800个核苷酸至约14,500个核苷酸、约7,800个核苷酸至约14,000个核苷酸、约7,800个核苷酸至约13,500个核苷酸、约7,800个核苷酸至约13,000个核苷酸、约7,800个核苷酸至约12,500个核苷酸、约7,800个核苷酸至约12,000个核苷酸、约7,800个核苷酸至约11,500个核苷酸、约7,800个核苷酸至约11,000个核苷酸、约7,800个核苷酸至约10,500个核苷酸、约7,800个核苷酸至约10,000个核苷酸、约7,800个核苷酸至约9,500个核苷酸、约7,800个核苷酸至约9,000个核苷酸、约7,800个核苷酸至约8,500个核苷酸、约7,800个核苷酸至约8,000个核苷酸、约8,000个核苷酸至约15,000个核苷酸、约8,000个核苷酸至约14,500个核苷酸、约8,000个核苷酸至约14,000个核苷酸、约8,000个核苷酸至约13,500个核苷酸、约8,000个核苷酸至约13,000个核苷酸、约8,000个核苷酸至约12,500个核苷酸、约8,000个核苷酸至约12,000个核苷酸、约8,000个核苷酸至约11,500个核苷酸、约8,000个核苷酸至约11,000个核苷酸、约8,000个核苷酸至约10,500个核苷酸、约8,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约8,000个核苷酸至约9,500个核苷酸、约8,000个核苷酸至约9,000个核苷酸、约8,000个核苷酸至约8,500个核苷酸、约8,500个核苷酸至约15,000个核苷酸、约8,500个核苷酸至约14,500个核苷酸、约8,500个核苷酸至约14,000个核苷酸、约8,500个核苷酸至约13,500个核苷酸、约8,500个核苷酸至约13,000个核苷酸、约8,500个核苷酸至约12,500个核苷酸、约8,500个核苷酸至约12,000个核苷酸、约8,500个核苷酸至约11,500个核苷酸、约8,500个核苷酸至约11,000个核苷酸、约8,500个核苷酸至约10,500个核苷酸、约8,500个核苷酸至约10,000个核苷酸、约8,500个核苷酸至约9,500个核苷酸、约8,500个核苷酸至约9,000个核苷酸、约9,000个核苷酸至约15,000个核苷酸、约9,000个核苷酸至约14,500个核苷酸、约9,000个核苷酸至约14,000个核苷酸、约9,000个核苷酸至约13,500个核苷酸、约9,000个核苷酸至约13,000个核苷酸、约9,000个核苷酸至约12,500个核苷酸、约9,000个核苷酸至约12,000个核苷酸、约9,000个核苷酸至约11,500个核苷酸、约9,000个核苷酸至约11,000个核苷酸、约9,000个核苷酸至约10,500个核苷酸、约9,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约9,000个核苷酸至约9,500个核苷酸、约9,500个核苷酸至约10,000个核苷酸、约10,000个核苷酸至约15,000个核苷酸、约10,000个核苷酸至约14,500个核苷酸、约10,000个核苷酸至约14,000个核苷酸、约10,000个核苷酸至约13,500个核苷酸、约10,000个核苷酸至约13,000个核苷酸、约10,000个核苷酸至约12,500个核苷酸、约10,000个核苷酸至约12,000个核苷酸、约10,000个核苷酸至约11,500个核苷酸、约10,000个核苷酸至约11,000个核苷酸、约10,000个核苷酸至约10,500个核苷酸、约10,500个核苷酸至约15,000个核苷酸、约10,500个核苷酸至约14,500个核苷酸、约10,500个核苷酸至约14,000个核苷酸、约10,500个核苷酸至约13,500个核苷酸、约10,500个核苷酸至约13,000个核苷酸、约10,500个核苷酸至约12,500个核苷酸、约10,500个核苷酸至约12,000个核苷酸、约10,500个核苷酸至约11,500个核苷酸、约10,500个核苷酸至约11,000个核苷酸、约11,000个核苷酸至约15,000个核苷酸、约11,000个核苷酸至约14,500个核苷酸、约11,000个核苷酸至约14,000个核苷酸、约11,000个核苷酸至约13,500个核苷酸、约11,000个核苷酸至约13,000个核苷酸、约11,000个核苷酸至约12,500个核苷酸、约11,000个核苷酸至约12,000个核苷酸、约11,000个核苷酸至约11,500个核苷酸、约11,500个核苷酸至约15,000个核苷酸、约11,500个核苷酸至约14,500个核苷酸、约11,500个核苷酸至约14,000个核苷酸、约11,500个核苷酸至约13,500个核苷酸、约11,500个核苷酸至约13,000个核苷酸、约11,500个核苷酸至约12,500个核苷酸、约11,500个核苷酸至约12,000个核苷酸、约12,000个核苷酸至约15,000个核苷酸、约12,000个核苷酸至约14,500个核苷酸、约12,000个核苷酸至约14,000个核苷酸、约12,000个核苷酸至约13,500个核苷酸、约12,000个核苷酸至约13,000个核苷酸、约12,000个核苷酸至约12,500个核苷酸、约12,500个核苷酸至约15,000个核苷酸、约12,500个核苷酸至约14,500个核苷酸、约12,500个核苷酸至约14,000个核苷酸、约12,500个核苷酸至约13,500个核苷酸、约12,500个核苷酸至约13,000个核苷酸、约13,000个核苷酸至约15,000个核苷酸、约13,000个核苷酸至约14,500个核苷酸、约13,000个核苷酸至约14,000个核苷酸、约13,000个核苷酸至约13,500个核苷酸、约13,500个核苷酸至约15,000个核苷酸、约13,500个核苷酸至约14,500个核苷酸、约13,500个核苷酸至约14,000个核苷酸、约14,000个核苷酸至约15,000个核苷酸、约14,000个核苷酸至约14,500个核苷酸、或约14,500个核苷酸至约15,000个核苷酸(包括端值)。
本文提供了可用于本文所述的任何组合物和方法中的示例性载体。参见例如图1至图24。
本领域中已知的多种不同方法可用于将本文公开的任何载体引入哺乳动物细胞(例如耳蜗内毛细胞、耳蜗外毛细胞、视网膜细胞)中。用于将核酸引入哺乳动物细胞中的方法的非限制性实例包括：脂质体转染、转染(例如磷酸钙转染、使用高度分支有机化合物进行的转染、使用阳离子聚合物进行的转染、基于树状体的转染、光学转染、基于颗粒的转染(例如纳米颗粒转染)、或使用脂质体(例如阳离子脂质体)进行的转染)、显微注射、电穿孔、细胞挤压、声致穿孔、原生质体融合、刺穿转染、流体动力学递送、基因枪、磁性转染、病毒转染和核转染。
熟练从业者将了解，本文所述的任何载体都可通过例如脂质体转染来引入哺乳动物细胞中，并且可稳定整合至内源性基因座(例如CLRN1基因座)中。在一些实施方案中，本文提供的载体稳定整合至内源性缺陷性CLRN1基因座中，并且由此用编码功能性(例如野生型)CLRN1蛋白的核酸替换缺陷性CLRN1基因。
可用于将一个或多个突变和/或一个或多个缺失引入内源性基因中的各种分子生物学技术在本领域中也是已知的。这类技术的非限制性实例包括定点诱变、CRISPR(例如CRISPR/Cas9诱导的敲入突变和CRISPR/Cas9诱导的敲除突变)和TALEN。这些方法可用于纠正存在于靶细胞的染色体中的缺陷性内源性基因的序列。
本文所述的任何载体都可还包括控制序列，例如选自转录起始序列、转录终止序列、启动子序列、增强子序列、RNA剪接序列、多腺苷酸化(多腺苷酸)信号和Kozak共有序列的组的控制序列。这些控制序列的非限制性实例在本文中加以描述。在一些实施方案中，启动子可为天然启动子、组成型启动子、诱导型启动子和/或组织特异性启动子。
启动子
术语“启动子”意指由哺乳动物细胞中的为使特定基因(例如CLRN1基因)的转录起始所需的酶/蛋白质识别的DNA序列。启动子通常是指例如RNA聚合酶和/或任何相关因子与其结合，并且转录得以起始所处的核苷酸序列。启动子的非限制性实例在本文中加以描述。启动子的额外实例在本领域中是已知的。
在一些实施方案中，编码CLRN1蛋白(例如人CLRN1蛋白)的N末端部分的载体可包括启动子和/或增强子。编码CLRN1蛋白的N末端部分的载体可包括本文所述或本领域中已知的任何启动子和/或增强子。
在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子、组成型启动子、哺乳动物细胞启动子、病毒启动子、嵌合启动子、经工程改造启动子、组织特异性启动子、或本领域中已知的任何其他类型的启动子。在一些实施方案中，启动子是RNA聚合酶II启动子，诸如哺乳动物RNA聚合酶II启动子。在一些实施方案中，启动子是RNA聚合酶III启动子，包括但不限于H1启动子、人U6启动子、小鼠U6启动子或猪U6启动子。启动子将通常是能够促进在内毛细胞中的转录的启动子。在一些实例中，启动子是耳蜗特异性启动子或耳蜗定向启动子。
可在本文中使用的多种启动子在本领域中是已知的。可在本文中使用的启动子的非限制性实例包括：人EF1a、人巨细胞病毒(CMV)(美国专利第5,168,062号)、人泛素C(UBC)、小鼠磷酸甘油酸激酶1、多瘤腺病毒、猿猴病毒40(SV40)、β-球蛋白、β-肌动蛋白、α-胎蛋白、γ-球蛋白、β-干扰素、γ-谷氨酰基转移酶、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、大鼠胰岛素、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、金属硫蛋白II(MT II)、淀粉酶、组织蛋白酶、MI蕈毒碱受体、逆转录病毒LTR(例如人T细胞白血病病毒HTLV)、AAVITR、白介素-2、胶原酶、血小板源性生长因子、腺病毒5E2、基质溶解素(stromelysin)、鼠MX基因、葡萄糖调控蛋白(GRP78和GRP94)、α-2-巨球蛋白、波形蛋白(vimentin)、I类MHC基因H-2κb、HSP70、增殖蛋白(proliferin)、肿瘤坏死因子、甲状腺刺激激素α基因、免疫球蛋白轻链、T细胞受体、HLA DQα和DQβ、白介素-2受体、II类MHC、II类MHC HLA-DRα、肌肉肌酸激酶、前白蛋白(转甲状腺素蛋白)、弹性蛋白酶I、白蛋白基因、c-fos、c-HA-ras、神经细胞粘附分子(NCAM)、H2B(TH2B)组蛋白、大鼠生长激素、人血清淀粉样蛋白(SAA)、肌钙蛋白I(troponin I，TN I)、杜兴肌营养不良(duchenne muscular dystrophy)蛋白、人免疫缺陷病毒以及长臂猿白血病病毒(GALV)启动子。启动子的额外实例在本领域中是已知的。参见例如Lodish,Molecular Cell Biology,Freeman and Company,New York 2007。在一些实施方案中，启动子是CMV立即早期启动子。在一些实施方案中，启动子是CAG启动子或CAG/CBA启动子。在一些实施方案中，启动子是CBA启动子，例如包含SEQ ID NO：18或由SEQ IDNO：18组成的CBA启动子。
术语“组成型”启动子是指当与编码蛋白质(例如CLRN1蛋白)的核酸可操作地连接时导致在哺乳动物细胞中在大多数或所有生理条件下从所述核酸转录RNA的核苷酸序列。
组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(参见例如Boshart等人,Cell 41:521-530,1985)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1-α启动子(Invitrogen)。
诱导型启动子允许调控基因表达，并且可通过外源提供的化合物；环境因素诸如温度；或存在特定生理状态，例如急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中，来调控。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad获得。诱导型启动子的额外实例在本领域中是已知的。
通过外源提供的化合物来调控的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素(ecdysone)昆虫启动子(No等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:3346-3351,1996)、四环素阻遏型系统(Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:5547-5551,1992)、四环素诱导型系统(Gossen等人,Science 268:1766-1769,1995，也参见Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol.2:512-518,1998)、RU486诱导型系统(Wang等人,Nat.Biotech.15:239-243,1997)以及Wang等人,GeneTher.4:432-441,1997)和雷帕霉素(rapamycin)诱导型系统(Magari等人J.Clin.Invest.100:2865-2872,1997)。
术语“组织特异性”启动子是指仅在某些特定细胞类型和/或组织中具有活性的启动子(例如特定基因的转录仅在表达结合组织特异性启动子的转录调控蛋白的细胞内发生)。
在一些实施方案中，调控序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调控序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。
示例性组织特异性启动子包括但不限于以下：肝特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、胰岛素启动子、升糖素启动子、生长激素抑制素启动子、胰多肽(PPY)启动子、突触蛋白-1(Syn)启动子、肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物肌间线蛋白(desmin，DES)启动子、α-肌球蛋白重链(a-MHC)启动子、以及心脏肌钙蛋白T(cTnT)启动子。额外示例性启动子包括β-肌动蛋白启动子、乙型肝炎病毒核心启动子(Sandig等人,Gene Ther.3:1002-1009,1996)、α-胎蛋白(AFP)启动子(Arbuthnot等人,Hum.Gene Ther.7:1503-1514,1996)、骨骨钙蛋白(osteocalcin)启动子(Stein等人,Mol.Biol.Rep.24:185-196,1997)；骨唾液蛋白(sialoprotein)启动子(Chen等人,J.Bone Miner.Res.11:654-664,1996)、CD2启动子(Hansal等人,J.Immunol.161:1063-1068,1998)；免疫球蛋白重链启动子；T细胞受体α链启动子、神经元性诸如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等人,Cell.Mol.Neurobiol.13:503-515,1993)、神经丝轻链基因启动子(Piccioli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:5611-5615,1991)、以及神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等人,Neuron 15:373-384,1995)。
在一些实施方案中，组织特异性启动子是耳蜗特异性启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子是耳蜗毛细胞特异性启动子。耳蜗毛细胞特异性启动子的非限制性实例包括但不限于：ATOH1启动子、POU4F3启动子、LHX3启动子、MYO7A启动子、MYO6启动子、α9ACHR启动子和α10ACHR启动子。在一些实施方案中，启动子是耳蜗毛细胞特异性启动子，诸如快蛋白(PRESTIN)启动子或癌调蛋白(ONCOMOD)启动子。参见例如Zheng等人,Nature405:149-155,2000；Tian等人Dev.Dyn.231:199-203,2004；以及Ryan等人,Adv.Otorhinolaryngol.66：99-115,2009。
增强子
在一些情况下，载体可包括增强子序列。术语“增强子”是指可使编码目标蛋白质(例如CLRN1蛋白)的核酸的转录水平增加的核苷酸序列。增强子序列(长度是50-1500个碱基对)通常通过提供为转录相关蛋白(例如转录因子)所用的额外结合位点来使转录水平增加。在一些实施方案中，增强子序列见于内含子序列内。不同于启动子序列，增强子序列可在相距转录起始位点大得多的距离处起作用(例如相较于启动子)。增强子的非限制性实例包括RSV增强子、CMV增强子和SV40增强子。在一些实施方案中，CMV增强子序列包含SEQ IDNO：17或由SEQ ID NO：17组成。
多聚(A)信号
在一些实施方案中，本文提供的任何载体都可包括多腺苷酸化(多聚(A))信号序列。大多数新生的真核mRNA在它们的3’末端具有在复杂过程期间添加的多聚(A)尾部，所述复杂过程包括对初级转录物的裂解，以及由多聚(A)信号序列驱动的偶联多腺苷酸化反应(参见例如Proudfoot等人,Cell 108:501-512,2002)。多聚(A)尾部赋予mRNA稳定性和可转移性(Molecular Biology of the Cell,第三版,B.Alberts等人,Garland Publishing,1994)。在一些实施方案中，多聚(A)信号序列位于编码CLRN1蛋白的C末端的核酸序列的3’。
如本文所用，“多腺苷酸化”是指多腺苷酰基部分或它的经修饰变体共价连接于信使RNA分子。在真核生物体中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'末端是多腺苷酸化的。3'多聚(A)尾部是通过酶即多腺苷酸聚合酶的作用来添加至前mRNA中的腺嘌呤核苷酸(例如50、60、70、100、200、500、1000、2000、3000、4000或5000个)的长序列。在高等真核生物中，多聚(A)尾部添加于含有特定序列即多腺苷酸化(或多聚(A))信号的转录物上。多聚(A)尾部和结合于它的蛋白质有助于保护mRNA免遭由核酸外切酶达成的降解。多腺苷酸化对于转录终止、mRNA从核输出、以及翻译也是重要的。多腺苷酸化紧接在DNA转录成RNA之后在核中发生，但还可稍后在细胞质中发生。在转录已被终止之后，mRNA链通过与RNA聚合酶缔合的核酸内切酶复合物的作用来裂解。裂解位点的特征通常在于在裂解位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA已被裂解之后，腺苷残基在裂解位点处被添加至游离3'末端。
如本文所用，“多聚(A)信号序列”或“多腺苷酸化信号序列”是触发核酸内切酶对mRNA的裂解以及一系列腺苷向经裂解mRNA的3’末端的添加的序列。
存在可使用的若干多聚(A)信号序列，包括源于牛生长激素(bgh)(Woychik等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81(13):3944-3948,1984；美国专利第5,122,458号)、小鼠β-球蛋白、小鼠α-球蛋白(Orkin等人,EMBO J.4(2):453-456,1985；Thein等人,Blood 71(2):313-319,1988)、人胶原、多瘤病毒(Batt等人,Mol.Cell Biol.15(9):4783-4790,1995)、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV TK)、IgG重链基因多腺苷酸化信号(US 2006/0040354)、人生长激素(hGH)(Szymanski等人,Mol.Therapy 15(7):1340-1347,2007)、由SV40多聚(A)位点诸如SV40晚期和早期多聚(A)位点(Schek等人,Mol.Cell Biol.12(12):5386-5393,1992)组成的组的那些。
多聚(A)信号序列可为AATAAA。AATAAA序列可用与AATAAA具有同源性，并且能够传导多腺苷酸化信号的其他六核苷酸序列替代，所述其他六核苷酸序列包括ATTAAA、AGTAAA、CATAAA、TATAAA、GATAAA、ACTAAA、AATATA、AAGAAA、AATAAT、AAAAAA、AATGAA、AATCAA、AACAAA、AATCAA、AATAAC、AATAGA、AATTAA或AATAAG(参见例如WO 06/12414)。
在一些实施方案中，多聚(A)信号序列可为合成多腺苷酸化位点(参见例如Promega的基于Levitt等人,Genes Dev.3(7):1019-1025,1989的pCl-neo表达载体)。在一些实施方案中，多聚(A)信号序列是牛生长激素的多腺苷酸化信号(CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG(SEQ ID NO：20))。在一些实施方案中，多聚(A)信号序列是可溶性神经纤毛蛋白-1(sNRP)的多腺苷酸化信号(AAATAAAATACGAAATG(SEQ ID NO：21))(参见例如WO 05/073384)。多聚(A)信号序列的额外实例在本领域中是已知的。
内部核糖体进入位点(IRES)
在一些实施方案中，编码CLRN1蛋白的C末端部分的载体可包括多核苷酸内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列用于从单一基因转录物产生超过一个多肽。IRES形成允许从mRNA的紧靠在所述IRES所定位处的下游的任何位置发生翻译起始的复杂二级结构(参见例如Pelletier和Sonenberg,Mol.Cell.Biol.8(3):1103-1112,1988)。
存在为本领域技术人员所知的若干IRES序列，包括来自例如口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、人鼻病毒(HRV)、蟋蟀麻痹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)和脊髓灰质炎病毒(PV)的那些。参见例如Alberts,MolecularBiology of the Cell,Garland Science,2002；以及Hellen等人,Genes Dev.15(13):1593-612,2001。
在一些实施方案中，并入编码CLRN1蛋白的C末端部分的载体中的IRES序列是口蹄疫病毒(FMDV)2A序列。口蹄疫病毒2A序列是一种已被显示会介导对多聚蛋白的裂解的小肽(长度是约18个氨基酸)(Ryan,M D等人,EMBO 4:928-933,1994；Mattion等人,J.Virology70:8124-8127,1996；Furler等人,Gene Therapy 8:864-873,2001；以及Halpin等人,PlantJournal 4:453-459,1999)。2A序列的裂解活性先前已在包括质粒和基因疗法载体(AAV和逆转录病毒)的人工系统中证明(Ryan等人,EMBO 4:928-933,1994；Mattion等人,J.Virology70:8124-8127,1996；Furler等人,Gene Therapy 8:864-873,2001；以及Halpin等人,Plant Journal 4:453-459,1999；de Felipe等人,Gene Therapy 6:198-208,1999；de Felipe等人,Human Gene Therapy 11:1921-1931,2000；以及Klump等人,Gene Therapy8:811-817,2001)。
报告序列
本文提供的任何载体都可任选地包括编码报告蛋白的序列(“报告序列”)。报告序列的非限制性实例包括编码以下的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白、mCherry荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)和荧光素酶。报告序列的额外实例在本领域中是已知的。当与驱动它们的表达的调控元件相关联时，报告序列可提供可通过常规手段检测的信号，所述常规手段包括酶法测定、放射摄影测定、比色测定、荧光测定或其他光谱测定；荧光激活细胞分选(FACS)测定；免疫测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学分析)。
在一些实施方案中，报告序列是tGFP(SEQ ID NO：19)。在一些实施方案中，报告序列是LacZ基因，并且携带所述LacZ基因的载体在哺乳动物细胞(例如耳蜗毛细胞、眼部细胞诸如视网膜细胞)中的存在性通过针对β-半乳糖苷酶活性的测定来检测。当报告体是荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白)或荧光素酶时，携带所述荧光蛋白或荧光素酶的载体在哺乳动物细胞(例如耳蜗毛细胞、眼部细胞诸如视网膜细胞)中的存在性可通过荧光技术(例如荧光显微术或FACS)，或光度计(例如分光光度计或IVIS成像仪器)中的光产生来测量。在一些实施方案中，报告序列可用于验证本文所述的任何载体的组织特异性靶向能力和组织特异性启动子调控活性。
侧翼区非翻译区(UTR)
在一些实施方案中，本文所述的任何载体(例如至少两种不同载体中的任一者)都可包括非翻译区，诸如5’UTR或3’UTR。
基因的非翻译区(UTR)被转录，但不被翻译。5'UTR起始于转录起始位点，并且延续至起始密码子，但不包括起始密码子。3'UTR紧接在终止密码子之后起始，并且延续直至转录终止信号。关于由UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面所起的调控作用，存在处于增长中的一堆证据。可将UTR的调控特征并入如本文所述的任何载体、组合物、药盒或方法中以使CLRN1蛋白的表达增强。
天然5'UTR包括在翻译起始中起作用的序列。它们具有如Kozak序列的特征，通常已知的是，所述Kozak序列涉及于核糖体使许多基因的翻译起始所采用的过程中。Kozak序列具有共有序列CCR(A/G)CCAUGG，其中R是在起始密码子(AUG)的上游三个碱基处的嘌呤(A或G)，并且起始密码子继之以另一“G”。还已知5'UTR形成涉及于延伸因子结合中的二级结构。
在一些实施方案中，5’UTR被包括在本文所述的任何载体中。5’UTR的非限制性实例，包括来自以下基因的那些：白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、α胎蛋白、红血球生成素和因子VIII，可用于使核酸分子诸如mRNA的表达增强。
在一些实施方案中，来自由耳蜗或视网膜中的细胞转录的mRNA的5’UTR可被包括在本文所述的任何载体、组合物、药盒和方法中。
已知的是，3'UTR具有腺苷和嵌入它们之中的尿苷(在RNA形式中)或胸苷(在DNA形式中)的链段。这些富含AU的特征在具有高转换速率的基因中是特别普遍的。基于它们的序列特征和功能性质，富含AU的元件(ARE)可被分成三个类别(Chen等人,Mol.Cell.Biol.15:5777-5788,1995；Chen等人,Mol.Cell Biol.15:2010-2018,1995)：I类ARE在富含U的区域内含有AUUUA基序的若干分散拷贝。举例来说，c-Myc和MyoD mRNA含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。GM-CSF和TNF-αmRNA是含有II类ARE的实例。III类ARE的定义不太明确。这些富含U的区域不含有AUUUA基序。这个类别的两个充分研究的实例是c-Jun和肌细胞生成素(myogenin)mRNA。
已知的是，大多数结合ARE的蛋白质使信使去稳定，而ELAV家族的成员，最特别是HuR，已有文件记载使mRNA的稳定性增加。HuR结合所有三个类别的ARE。将HuR特异性结合位点工程改造至核酸分子的3'UTR中将导致HuR结合，因此，导致体内信息的稳定化。
一示例性人野生型5’UTR是或包括SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的序列。一示例性人野生型5’UTR是或包括SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的序列。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，5’非翻译区(UTR)、3’UTR或两者被包括在载体(例如本文所述的任何载体)中。举例来说，本文所述的任何5’-UTR都可操作性地连接于本文所述的任何编码序列中的起始密码子。举例来说，任何3’-UTR都可操作性地连接于本文所述的任何编码序列中的3’-终末密码子(末个密码子)。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包含来自SEQ ID NO：12或SEQID NO：13内的任何地方的至少10个连续(例如至少15个连续、至少20个连续、至少25个连续、至少30个连续、至少35个连续、至少40个连续、至少45个连续、至少50个连续、至少55个连续、至少60个连续、至少65个连续、至少70个连续、至少75个连续、至少80个连续、至少85个连续、至少90个连续、至少100个连续、至少105个连续、至少110个连续、至少115个连续、至少120个连续、至少125个连续、至少130个连续、至少135个连续、至少140个连续、至少145个连续、至少150个连续、至少155个连续、至少160个连续、至少165个连续、至少170个连续、至少175个连续、至少180个连续、至少185个连续、至少190个连续、至少195个连续、至少200个连续、至少205个连续、至少210个连续、至少215个连续、至少220个连续、至少225个连续、至少230个连续、至少235个连续、至少240个连续、至少245个连续、至少250个连续、至少255个连续或至少260个连续)核苷酸。
举例来说，5’UTR可包括以下中的一者或多者或由以下中的一者或多者组成：SEQID NO:12或13的核苷酸位置1至291、核苷酸位置1至290、核苷酸位置1至280、核苷酸位置1至270、核苷酸位置1至260、核苷酸位置1至250、核苷酸位置1至240、核苷酸位置1至230、核苷酸位置1至220、核苷酸位置1至210、核苷酸位置1至200、核苷酸位置1至190、核苷酸位置1至180、核苷酸位置1至170、核苷酸位置1至160、核苷酸位置1至150、核苷酸位置1至140、核苷酸位置1至130、核苷酸位置1至120、核苷酸位置1至110、核苷酸位置1至100、核苷酸位置1至90、核苷酸位置1至80、核苷酸位置1至70、核苷酸位置1至60、核苷酸位置1至50、核苷酸位置1至40、核苷酸位置1至30、核苷酸位置1至20、核苷酸位置1至10、核苷酸位置10至291、核苷酸位置10至290、核苷酸位置10至280、核苷酸位置10至270、核苷酸位置10至260、核苷酸位置10至250、核苷酸位置10至240、核苷酸位置10至230、核苷酸位置10至220、核苷酸位置10至210、核苷酸位置10至200、核苷酸位置10至190、核苷酸位置10至180、核苷酸位置10至170、核苷酸位置10至160、核苷酸位置10至150、核苷酸位置10至140、核苷酸位置10至130、核苷酸位置10至120、核苷酸位置10至110、核苷酸位置10至100、核苷酸位置10至90、核苷酸位置10至80、核苷酸位置10至70、核苷酸位置10至60、核苷酸位置10至50、核苷酸位置10至40、核苷酸位置10至30、核苷酸位置10至20、核苷酸位置20至291、核苷酸位置20至290、核苷酸位置20至280、核苷酸位置20至270、核苷酸位置20至260、核苷酸位置20至250、核苷酸位置20至240、核苷酸位置20至230、核苷酸位置20至220、核苷酸位置20至210、核苷酸位置20至200、核苷酸位置20至190、核苷酸位置20至180、核苷酸位置20至170、核苷酸位置20至160、核苷酸位置20至150、核苷酸位置20至140、核苷酸位置20至130、核苷酸位置20至120、核苷酸位置20至110、核苷酸位置20至100、核苷酸位置20至90、核苷酸位置20至80、核苷酸位置20至70、核苷酸位置20至60、核苷酸位置20至50、核苷酸位置20至40、核苷酸位置20至30、核苷酸位置30至291、核苷酸位置30至290、核苷酸位置30至280、核苷酸位置30至270、核苷酸位置30至260、核苷酸位置30至250、核苷酸位置30至240、核苷酸位置30至230、核苷酸位置30至220、核苷酸位置30至210、核苷酸位置30至200、核苷酸位置30至190、核苷酸位置30至180、核苷酸位置30至170、核苷酸位置30至160、核苷酸位置30至150、核苷酸位置30至140、核苷酸位置30至130、核苷酸位置30至120、核苷酸位置30至110、核苷酸位置30至100、核苷酸位置30至90、核苷酸位置30至80、核苷酸位置30至70、核苷酸位置30至60、核苷酸位置30至50、核苷酸位置30至40、核苷酸位置40至291、核苷酸位置40至290、核苷酸位置40至280、核苷酸位置40至270、核苷酸位置40至260、核苷酸位置40至250、核苷酸位置40至240、核苷酸位置40至230、核苷酸位置40至220、核苷酸位置40至210、核苷酸位置40至200、核苷酸位置40至190、核苷酸位置40至180、核苷酸位置40至170、核苷酸位置40至160、核苷酸位置40至150、核苷酸位置40至140、核苷酸位置40至130、核苷酸位置40至120、核苷酸位置40至110、核苷酸位置40至100、核苷酸位置40至90、核苷酸位置40至80、核苷酸位置40至70、核苷酸位置40至60、核苷酸位置40至50、核苷酸位置50至291、核苷酸位置50至290、核苷酸位置50至280、核苷酸位置50至270、核苷酸位置50至260、核苷酸位置50至250、核苷酸位置50至240、核苷酸位置50至230、核苷酸位置50至220、核苷酸位置50至210、核苷酸位置50至200、核苷酸位置50至190、核苷酸位置50至180、核苷酸位置50至170、核苷酸位置50至160、核苷酸位置50至150、核苷酸位置50至140、核苷酸位置50至130、核苷酸位置50至120、核苷酸位置50至110、核苷酸位置50至100、核苷酸位置50至90、核苷酸位置50至80、核苷酸位置50至70、核苷酸位置50至60、核苷酸位置60至291、核苷酸位置60至290、核苷酸位置60至280、核苷酸位置60至270、核苷酸位置60至260、核苷酸位置60至250、核苷酸位置60至240、核苷酸位置60至230、核苷酸位置60至220、核苷酸位置60至210、核苷酸位置60至200、核苷酸位置60至190、核苷酸位置60至180、核苷酸位置60至170、核苷酸位置60至160、核苷酸位置60至150、核苷酸位置60至140、核苷酸位置60至130、核苷酸位置60至120、核苷酸位置60至110、核苷酸位置60至100、核苷酸位置60至90、核苷酸位置60至80、核苷酸位置60至70、核苷酸位置70至291、核苷酸位置70至290、核苷酸位置70至280、核苷酸位置70至270、核苷酸位置70至260、核苷酸位置70至250、核苷酸位置70至240、核苷酸位置70至230、核苷酸位置70至220、核苷酸位置70至210、核苷酸位置70至200、核苷酸位置70至190、核苷酸位置70至180、核苷酸位置70至170、核苷酸位置70至160、核苷酸位置70至150、核苷酸位置70至140、核苷酸位置70至130、核苷酸位置70至120、核苷酸位置70至110、核苷酸位置70至100、核苷酸位置70至90、核苷酸位置70至80、核苷酸位置80至291、核苷酸位置80至290、核苷酸位置80至280、核苷酸位置80至270、核苷酸位置80至260、核苷酸位置80至250、核苷酸位置80至240、核苷酸位置80至230、核苷酸位置80至220、核苷酸位置80至210、核苷酸位置80至200、核苷酸位置80至190、核苷酸位置80至180、核苷酸位置80至170、核苷酸位置80至160、核苷酸位置80至150、核苷酸位置80至140、核苷酸位置80至130、核苷酸位置80至120、核苷酸位置80至110、核苷酸位置80至100、核苷酸位置80至90、核苷酸位置90至291、核苷酸位置90至290、核苷酸位置90至280、核苷酸位置90至270、核苷酸位置90至260、核苷酸位置90至250、核苷酸位置90至240、核苷酸位置90至230、核苷酸位置90至220、核苷酸位置90至210、核苷酸位置90至200、核苷酸位置90至190、核苷酸位置90至180、核苷酸位置90至170、核苷酸位置90至160、核苷酸位置90至150、核苷酸位置90至140、核苷酸位置90至130、核苷酸位置90至120、核苷酸位置90至110、核苷酸位置90至100、核苷酸位置100至291、核苷酸位置100至290、核苷酸位置100至280、核苷酸位置100至270、核苷酸位置100至260、核苷酸位置100至250、核苷酸位置100至240、核苷酸位置100至230、核苷酸位置100至220、核苷酸位置100至210、核苷酸位置100至200、核苷酸位置100至190、核苷酸位置100至180、核苷酸位置100至170、核苷酸位置100至160、核苷酸位置100至150、核苷酸位置100至140、核苷酸位置100至130、核苷酸位置100至120、核苷酸位置100至110、核苷酸位置110至291、核苷酸位置110至290、核苷酸位置110至280、核苷酸位置110至270、核苷酸位置110至260、核苷酸位置110至250、核苷酸位置110至240、核苷酸位置110至230、核苷酸位置110至220、核苷酸位置110至210、核苷酸位置110至200、核苷酸位置110至190、核苷酸位置110至180、核苷酸位置110至170、核苷酸位置110至160、核苷酸位置110至150、核苷酸位置110至140、核苷酸位置110至130、核苷酸位置110至120、核苷酸位置120至291、核苷酸位置120至290、核苷酸位置120至280、核苷酸位置120至270、核苷酸位置120至260、核苷酸位置120至250、核苷酸位置120至240、核苷酸位置120至230、核苷酸位置120至220、核苷酸位置120至210、核苷酸位置120至200、核苷酸位置120至190、核苷酸位置120至180、核苷酸位置120至170、核苷酸位置120至160、核苷酸位置120至150、核苷酸位置120至140、核苷酸位置120至130、核苷酸位置130至291、核苷酸位置130至290、核苷酸位置130至280、核苷酸位置130至270、核苷酸位置130至260、核苷酸位置130至250、核苷酸位置130至240、核苷酸位置130至230、核苷酸位置130至220、核苷酸位置130至210、核苷酸位置130至200、核苷酸位置130至190、核苷酸位置130至180、核苷酸位置130至170、核苷酸位置130至160、核苷酸位置130至150、核苷酸位置130至140、核苷酸位置140至291、核苷酸位置140至290、核苷酸位置140至280、核苷酸位置140至270、核苷酸位置140至260、核苷酸位置140至250、核苷酸位置140至240、核苷酸位置140至230、核苷酸位置140至220、核苷酸位置140至210、核苷酸位置140至200、核苷酸位置140至190、核苷酸位置140至180、核苷酸位置140至170、核苷酸位置140至160、核苷酸位置140至150、核苷酸位置150至291、核苷酸位置150至290、核苷酸位置150至280、核苷酸位置150至270、核苷酸位置150至260、核苷酸位置150至250、核苷酸位置150至240、核苷酸位置150至230、核苷酸位置150至220、核苷酸位置150至210、核苷酸位置150至200、核苷酸位置150至190、核苷酸位置150至180、核苷酸位置150至170、核苷酸位置150至160、核苷酸位置160至291、核苷酸位置160至290、核苷酸位置160至280、核苷酸位置160至270、核苷酸位置160至260、核苷酸位置160至250、核苷酸位置160至240、核苷酸位置160至230、核苷酸位置160至220、核苷酸位置160至210、核苷酸位置160至200、核苷酸位置160至190、核苷酸位置160至180、核苷酸位置160至170、核苷酸位置170至291、核苷酸位置170至290、核苷酸位置170至280、核苷酸位置170至270、核苷酸位置170至260、核苷酸位置170至250、核苷酸位置170至240、核苷酸位置170至230、核苷酸位置170至220、核苷酸位置170至210、核苷酸位置170至200、核苷酸位置170至190、核苷酸位置170至180、核苷酸位置180至291、核苷酸位置180至290、核苷酸位置180至280、核苷酸位置180至270、核苷酸位置180至260、核苷酸位置180至250、核苷酸位置180至240、核苷酸位置180至230、核苷酸位置180至220、核苷酸位置180至210、核苷酸位置180至200、核苷酸位置180至190、核苷酸位置190至291、核苷酸位置190至290、核苷酸位置190至280、核苷酸位置190至270、核苷酸位置190至260、核苷酸位置190至250、核苷酸位置190至240、核苷酸位置190至230、核苷酸位置190至220、核苷酸位置190至210、核苷酸位置190至200、核苷酸位置200至291、核苷酸位置200至290、核苷酸位置200至280、核苷酸位置200至270、核苷酸位置200至260、核苷酸位置200至250、核苷酸位置200至240、核苷酸位置200至230、核苷酸位置200至220、核苷酸位置200至210、核苷酸位置210至291、核苷酸位置210至290、核苷酸位置210至280、核苷酸位置210至270、核苷酸位置210至260、核苷酸位置210至250、核苷酸位置210至240、核苷酸位置210至230、核苷酸位置210至220、核苷酸位置220至291、核苷酸位置220至290、核苷酸位置220至280、核苷酸位置220至270、核苷酸位置220至260、核苷酸位置220至250、核苷酸位置220至240、核苷酸位置220至230、核苷酸位置230至291、核苷酸位置230至290、核苷酸位置230至280、核苷酸位置230至270、核苷酸位置230至260、核苷酸位置230至250、核苷酸位置230至240、核苷酸位置240至291、核苷酸位置240至290、核苷酸位置240至280、核苷酸位置240至270、核苷酸位置240至260、核苷酸位置240至250、核苷酸位置250至291、核苷酸位置250至290、核苷酸位置250至280、核苷酸位置250至270、核苷酸位置250至260、核苷酸位置260至291、核苷酸位置260至290、核苷酸位置260至280、核苷酸位置260至270、核苷酸位置270至291、核苷酸位置270至290、核苷酸位置270至280、核苷酸位置280至291、或核苷酸位置280至290。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，5’UTR包含与SEQ ID NO：12或13具有至少70％(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包含来自SEQ ID NO：14或15内的任何地方的至少10个连续(例如至少15个连续、至少20个连续、至少25个连续、至少30个连续、至少35个连续、至少40个连续、至少45个连续、至少50个连续、至少55个连续、至少60个连续、至少65个连续、至少70个连续、至少75个连续、至少80个连续、至少85个连续、至少90个连续、至少100个连续、至少105个连续、至少110个连续、至少115个连续、至少120个连续、至少125个连续、至少130个连续、至少135个连续、至少140个连续、至少145个连续、至少150个连续、至少155个连续、至少160个连续、至少165个连续、至少170个连续、至少175个连续、至少180个连续、至少185个连续、至少190个连续、至少195个连续、至少200个连续、至少205个连续、至少210个连续、至少215个连续、至少220个连续、至少225个连续、至少230个连续、至少235个连续、至少240个连续、至少245个连续、至少250个连续、至少255个连续、至少260个连续、至少265个连续、至少270个连续、至少275个连续、至少280个连续、至少285个连续、至少290个连续、至少295个连续、至少300个连续、至少305个连续、至少310个连续、至少315个连续、至少320个连续、至少325个连续、至少330个连续、至少335个连续、至少340个连续、至少345个连续、至少350个连续、至少355个连续、至少360个连续、至少365个连续、至少370个连续、至少375个连续、至少380个连续、至少385个连续、至少390个连续、至少395个连续、至少400个连续、至少450个连续、至少500个连续、至少550个连续、至少600个连续、至少650个连续、至少700个连续、至少750个连续、至少800个连续、至少850个连续、至少900个连续、至少950个连续、至少1000个连续、至少1050个连续、至少1100个连续、至少1150个连续、至少1200个连续、至少1250个连续、至少1300个连续、至少1350个连续、至少1400个连续、至少1450个连续、至少1500个连续、至少1550个连续、至少1600个连续、至少1650个连续、至少1700个连续或至少1750个连续)核苷酸。
举例来说，5’UTR可包括以下中的一者或多者或由以下中的一者或多者组成：SEQID NO:14或15的核苷酸位置1至1773、核苷酸位置1至1770、核苷酸位置1至1750、核苷酸位置1至1700、核苷酸位置1至1650、核苷酸位置1至1600、核苷酸位置1至1550、核苷酸位置1至1500、核苷酸位置1至1450、核苷酸位置1至1400、核苷酸位置1至1350、核苷酸位置1至1300、核苷酸位置1至1250、核苷酸位置1至1200、核苷酸位置1至1150、核苷酸位置1至1100、核苷酸位置1至1050、核苷酸位置1至1000、核苷酸位置1至950、核苷酸位置1至900、核苷酸位置1至850、核苷酸位置1至800、核苷酸位置1至750、核苷酸位置1至700、核苷酸位置1至650、核苷酸位置1至600、核苷酸位置1至550、核苷酸位置1至500、核苷酸位置1至450、核苷酸位置1至400、核苷酸位置1至350、核苷酸位置1至300、核苷酸位置1至250、核苷酸位置1至200、核苷酸位置1至150、核苷酸位置1至100、核苷酸位置1至50、核苷酸位置1至25、核苷酸位置25至1773、核苷酸位置25至1770、核苷酸位置25至1750、核苷酸位置25至1700、核苷酸位置25至1650、核苷酸位置25至1600、核苷酸位置25至1550、核苷酸位置25至1500、核苷酸位置25至1450、核苷酸位置25至1400、核苷酸位置25至1350、核苷酸位置25至1300、核苷酸位置25至1250、核苷酸位置25至1200、核苷酸位置25至1150、核苷酸位置25至1100、核苷酸位置25至1050、核苷酸位置25至1000、核苷酸位置25至950、核苷酸位置25至900、核苷酸位置25至850、核苷酸位置25至800、核苷酸位置25至750、核苷酸位置25至700、核苷酸位置25至650、核苷酸位置25至600、核苷酸位置25至550、核苷酸位置25至500、核苷酸位置25至450、核苷酸位置25至400、核苷酸位置25至350、核苷酸位置25至300、核苷酸位置25至250、核苷酸位置25至200、核苷酸位置25至150、核苷酸位置25至100、核苷酸位置25至50、核苷酸位置50至1773、核苷酸位置50至1770、核苷酸位置50至1750、核苷酸位置50至1700、核苷酸位置50至1650、核苷酸位置50至1600、核苷酸位置50至1550、核苷酸位置50至1500、核苷酸位置50至1450、核苷酸位置50至1400、核苷酸位置50至1350、核苷酸位置50至1300、核苷酸位置50至1250、核苷酸位置50至1200、核苷酸位置50至1150、核苷酸位置50至1100、核苷酸位置50至1050、核苷酸位置50至1000、核苷酸位置50至950、核苷酸位置50至900、核苷酸位置50至850、核苷酸位置50至800、核苷酸位置50至750、核苷酸位置50至700、核苷酸位置50至650、核苷酸位置50至600、核苷酸位置50至550、核苷酸位置50至500、核苷酸位置50至450、核苷酸位置50至400、核苷酸位置50至350、核苷酸位置50至300、核苷酸位置50至250、核苷酸位置50至200、核苷酸位置50至150、核苷酸位置50至100、核苷酸位置100至1773、核苷酸位置100至1770、核苷酸位置100至1750、核苷酸位置100至1700、核苷酸位置100至1650、核苷酸位置100至1600、核苷酸位置100至1550、核苷酸位置100至1500、核苷酸位置100至1450、核苷酸位置100至1400、核苷酸位置100至1350、核苷酸位置100至1300、核苷酸位置100至1250、核苷酸位置100至1200、核苷酸位置100至1150、核苷酸位置100至1100、核苷酸位置100至1050、核苷酸位置100至1000、核苷酸位置100至950、核苷酸位置100至900、核苷酸位置100至850、核苷酸位置100至800、核苷酸位置100至750、核苷酸位置100至700、核苷酸位置100至650、核苷酸位置100至600、核苷酸位置100至550、核苷酸位置100至500、核苷酸位置100至450、核苷酸位置100至400、核苷酸位置100至350、核苷酸位置100至300、核苷酸位置100至250、核苷酸位置100至200、核苷酸位置100至150、核苷酸位置150至1773、核苷酸位置150至1770、核苷酸位置150至1750、核苷酸位置150至1700、核苷酸位置150至1650、核苷酸位置150至1600、核苷酸位置150至1550、核苷酸位置150至1500、核苷酸位置150至1450、核苷酸位置150至1400、核苷酸位置150至1350、核苷酸位置150至1300、核苷酸位置150至1250、核苷酸位置150至1200、核苷酸位置150至1150、核苷酸位置150至1100、核苷酸位置150至1050、核苷酸位置150至1000、核苷酸位置150至950、核苷酸位置150至900、核苷酸位置150至850、核苷酸位置150至800、核苷酸位置150至750、核苷酸位置150至700、核苷酸位置150至650、核苷酸位置150至600、核苷酸位置150至550、核苷酸位置150至500、核苷酸位置150至450、核苷酸位置150至400、核苷酸位置150至350、核苷酸位置150至300、核苷酸位置150至250、核苷酸位置150至200、核苷酸位置200至1773、核苷酸位置200至1770、核苷酸位置200至1750、核苷酸位置200至1700、核苷酸位置200至1650、核苷酸位置200至1600、核苷酸位置200至1550、核苷酸位置200至1500、核苷酸位置200至1450、核苷酸位置200至1400、核苷酸位置200至1350、核苷酸位置200至1300、核苷酸位置200至1250、核苷酸位置200至1200、核苷酸位置200至1150、核苷酸位置200至1100、核苷酸位置200至1050、核苷酸位置200至1000、核苷酸位置200至950、核苷酸位置200至900、核苷酸位置200至850、核苷酸位置200至800、核苷酸位置200至750、核苷酸位置200至700、核苷酸位置200至650、核苷酸位置200至600、核苷酸位置200至550、核苷酸位置200至500、核苷酸位置200至450、核苷酸位置200至400、核苷酸位置200至350、核苷酸位置200至300、核苷酸位置200至250、核苷酸位置250至1773、核苷酸位置250至1770、核苷酸位置250至1750、核苷酸位置250至1700、核苷酸位置250至1650、核苷酸位置250至1600、核苷酸位置250至1550、核苷酸位置250至1500、核苷酸位置250至1450、核苷酸位置250至1400、核苷酸位置250至1350、核苷酸位置250至1300、核苷酸位置250至1250、核苷酸位置250至1200、核苷酸位置250至1150、核苷酸位置250至1100、核苷酸位置250至1050、核苷酸位置250至1000、核苷酸位置250至950、核苷酸位置250至900、核苷酸位置250至850、核苷酸位置250至800、核苷酸位置250至750、核苷酸位置250至700、核苷酸位置250至650、核苷酸位置250至600、核苷酸位置250至550、核苷酸位置250至500、核苷酸位置250至450、核苷酸位置250至400、核苷酸位置250至350、核苷酸位置250至300、核苷酸位置300至1773、核苷酸位置300至1770、核苷酸位置300至1750、核苷酸位置300至1700、核苷酸位置300至1650、核苷酸位置300至1600、核苷酸位置300至1550、核苷酸位置300至1500、核苷酸位置300至1450、核苷酸位置300至1400、核苷酸位置300至1350、核苷酸位置300至1300、核苷酸位置300至1250、核苷酸位置300至1200、核苷酸位置300至1150、核苷酸位置300至1100、核苷酸位置300至1050、核苷酸位置300至1000、核苷酸位置300至950、核苷酸位置300至900、核苷酸位置300至850、核苷酸位置300至800、核苷酸位置300至750、核苷酸位置300至700、核苷酸位置300至650、核苷酸位置300至600、核苷酸位置300至550、核苷酸位置300至500、核苷酸位置300至450、核苷酸位置300至400、核苷酸位置300至350、核苷酸位置350至1773、核苷酸位置350至1770、核苷酸位置350至1750、核苷酸位置350至1700、核苷酸位置350至1650、核苷酸位置350至1600、核苷酸位置350至1550、核苷酸位置350至1500、核苷酸位置350至1450、核苷酸位置350至1400、核苷酸位置350至1350、核苷酸位置350至1300、核苷酸位置350至1250、核苷酸位置350至1200、核苷酸位置350至1150、核苷酸位置350至1100、核苷酸位置350至1050、核苷酸位置350至1000、核苷酸位置350至950、核苷酸位置350至900、核苷酸位置350至850、核苷酸位置350至800、核苷酸位置350至750、核苷酸位置350至700、核苷酸位置350至650、核苷酸位置350至600、核苷酸位置350至550、核苷酸位置350至500、核苷酸位置350至450、核苷酸位置350至400、核苷酸位置400至1773、核苷酸位置400至1770、核苷酸位置400至1750、核苷酸位置400至1700、核苷酸位置400至1650、核苷酸位置400至1600、核苷酸位置400至1550、核苷酸位置400至1500、核苷酸位置400至1450、核苷酸位置400至1400、核苷酸位置400至1350、核苷酸位置400至1300、核苷酸位置400至1250、核苷酸位置400至1200、核苷酸位置400至1150、核苷酸位置400至1100、核苷酸位置400至1050、核苷酸位置400至1000、核苷酸位置400至950、核苷酸位置400至900、核苷酸位置400至850、核苷酸位置400至800、核苷酸位置400至750、核苷酸位置400至700、核苷酸位置400至650、核苷酸位置400至600、核苷酸位置400至550、核苷酸位置400至500、核苷酸位置400至450、核苷酸位置450至1773、核苷酸位置450至1770、核苷酸位置450至1750、核苷酸位置450至1700、核苷酸位置450至1650、核苷酸位置450至1600、核苷酸位置450至1550、核苷酸位置450至1500、核苷酸位置450至1450、核苷酸位置450至1400、核苷酸位置450至1350、核苷酸位置450至1300、核苷酸位置450至1250、核苷酸位置450至1200、核苷酸位置450至1150、核苷酸位置450至1100、核苷酸位置450至1050、核苷酸位置450至1000、核苷酸位置450至950、核苷酸位置450至900、核苷酸位置450至850、核苷酸位置450至800、核苷酸位置450至750、核苷酸位置450至700、核苷酸位置450至650、核苷酸位置450至600、核苷酸位置450至550、核苷酸位置450至500、核苷酸位置500至1773、核苷酸位置500至1770、核苷酸位置500至1750、核苷酸位置500至1700、核苷酸位置500至1650、核苷酸位置500至1600、核苷酸位置500至1550、核苷酸位置500至1500、核苷酸位置500至1450、核苷酸位置500至1400、核苷酸位置500至1350、核苷酸位置500至1300、核苷酸位置500至1250、核苷酸位置500至1200、核苷酸位置500至1150、核苷酸位置500至1100、核苷酸位置500至1050、核苷酸位置500至1000、核苷酸位置500至950、核苷酸位置500至900、核苷酸位置500至850、核苷酸位置500至800、核苷酸位置500至750、核苷酸位置500至700、核苷酸位置500至650、核苷酸位置500至600、核苷酸位置500至550、核苷酸位置550至1773、核苷酸位置550至1770、核苷酸位置550至1750、核苷酸位置550至1700、核苷酸位置550至1650、核苷酸位置550至1600、核苷酸位置550至1550、核苷酸位置550至1500、核苷酸位置550至1450、核苷酸位置550至1400、核苷酸位置550至1350、核苷酸位置550至1300、核苷酸位置550至1250、核苷酸位置550至1200、核苷酸位置550至1150、核苷酸位置550至1100、核苷酸位置550至1050、核苷酸位置550至1000、核苷酸位置550至950、核苷酸位置550至900、核苷酸位置550至850、核苷酸位置550至800、核苷酸位置550至750、核苷酸位置550至700、核苷酸位置550至650、核苷酸位置550至600、核苷酸位置600至1773、核苷酸位置600至1770、核苷酸位置600至1750、核苷酸位置600至1700、核苷酸位置600至1650、核苷酸位置600至1600、核苷酸位置600至1550、核苷酸位置600至1500、核苷酸位置600至1450、核苷酸位置600至1400、核苷酸位置600至1350、核苷酸位置600至1300、核苷酸位置600至1250、核苷酸位置600至1200、核苷酸位置600至1150、核苷酸位置600至1100、核苷酸位置600至1050、核苷酸位置600至1000、核苷酸位置600至950、核苷酸位置600至900、核苷酸位置600至850、核苷酸位置600至800、核苷酸位置600至750、核苷酸位置600至700、核苷酸位置600至650、核苷酸位置650至1773、核苷酸位置650至1770、核苷酸位置650至1750、核苷酸位置650至1700、核苷酸位置650至1650、核苷酸位置650至1600、核苷酸位置650至1550、核苷酸位置650至1500、核苷酸位置650至1450、核苷酸位置650至1400、核苷酸位置650至1350、核苷酸位置650至1300、核苷酸位置650至1250、核苷酸位置650至1200、核苷酸位置650至1150、核苷酸位置650至1100、核苷酸位置650至1050、核苷酸位置650至1000、核苷酸位置650至950、核苷酸位置650至900、核苷酸位置650至850、核苷酸位置650至800、核苷酸位置650至750、核苷酸位置650至700、核苷酸位置700至1773、核苷酸位置700至1770、核苷酸位置700至1750、核苷酸位置700至1700、核苷酸位置700至1650、核苷酸位置700至1600、核苷酸位置700至1550、核苷酸位置700至1500、核苷酸位置700至1450、核苷酸位置700至1400、核苷酸位置700至1350、核苷酸位置700至1300、核苷酸位置700至1250、核苷酸位置700至1200、核苷酸位置700至1150、核苷酸位置700至1100、核苷酸位置700至1050、核苷酸位置700至1000、核苷酸位置700至950、核苷酸位置700至900、核苷酸位置700至850、核苷酸位置700至800、核苷酸位置700至750、核苷酸位置750至1773、核苷酸位置750至1770、核苷酸位置750至1750、核苷酸位置750至1700、核苷酸位置750至1650、核苷酸位置750至1600、核苷酸位置750至1550、核苷酸位置750至1500、核苷酸位置750至1450、核苷酸位置750至1400、核苷酸位置750至1350、核苷酸位置750至1300、核苷酸位置750至1250、核苷酸位置750至1200、核苷酸位置750至1150、核苷酸位置750至1100、核苷酸位置750至1050、核苷酸位置750至1000、核苷酸位置750至950、核苷酸位置750至900、核苷酸位置750至850、核苷酸位置750至800、核苷酸位置800至1773、核苷酸位置800至1770、核苷酸位置800至1750、核苷酸位置800至1700、核苷酸位置800至1650、核苷酸位置800至1600、核苷酸位置800至1550、核苷酸位置800至1500、核苷酸位置800至1450、核苷酸位置800至1400、核苷酸位置800至1350、核苷酸位置800至1300、核苷酸位置800至1250、核苷酸位置800至1200、核苷酸位置800至1150、核苷酸位置800至1100、核苷酸位置800至1050、核苷酸位置800至1000、核苷酸位置800至950、核苷酸位置800至900、核苷酸位置800至850、核苷酸位置850至1773、核苷酸位置850至1770、核苷酸位置850至1750、核苷酸位置850至1700、核苷酸位置850至1650、核苷酸位置850至1600、核苷酸位置850至1550、核苷酸位置850至1500、核苷酸位置850至1450、核苷酸位置850至1400、核苷酸位置850至1350、核苷酸位置850至1300、核苷酸位置850至1250、核苷酸位置850至1200、核苷酸位置850至1150、核苷酸位置850至1100、核苷酸位置850至1050、核苷酸位置850至1000、核苷酸位置850至950、核苷酸位置850至900、核苷酸位置900至1773、核苷酸位置900至1770、核苷酸位置900至1750、核苷酸位置900至1700、核苷酸位置900至1650、核苷酸位置900至1600、核苷酸位置900至1550、核苷酸位置900至1500、核苷酸位置900至1450、核苷酸位置900至1400、核苷酸位置900至1350、核苷酸位置900至1300、核苷酸位置900至1250、核苷酸位置900至1200、核苷酸位置900至1150、核苷酸位置900至1100、核苷酸位置900至1050、核苷酸位置900至1000、核苷酸位置900至950、核苷酸位置950至1773、核苷酸位置950至1770、核苷酸位置950至1750、核苷酸位置950至1700、核苷酸位置950至1650、核苷酸位置950至1600、核苷酸位置950至1550、核苷酸位置950至1500、核苷酸位置950至1450、核苷酸位置950至1400、核苷酸位置950至1350、核苷酸位置950至1300、核苷酸位置950至1250、核苷酸位置950至1200、核苷酸位置950至1150、核苷酸位置950至1100、核苷酸位置950至1050、核苷酸位置950至1000、核苷酸位置1000至1773、核苷酸位置1000至1770、核苷酸位置1000至1750、核苷酸位置1000至1700、核苷酸位置1000至1650、核苷酸位置1000至1600、核苷酸位置1000至1550、核苷酸位置1000至1500、核苷酸位置1000至1450、核苷酸位置1000至1400、核苷酸位置1000至1350、核苷酸位置1000至1300、核苷酸位置1000至1250、核苷酸位置1000至1200、核苷酸位置1000至1150、核苷酸位置1000至1100、核苷酸位置1000至1050、核苷酸位置1050至1773、核苷酸位置1050至1770、核苷酸位置1050至1750、核苷酸位置1050至1700、核苷酸位置1050至1650、核苷酸位置1050至1600、核苷酸位置1050至1550、核苷酸位置1050至1500、核苷酸位置1050至1450、核苷酸位置1050至1400、核苷酸位置1050至1350、核苷酸位置1050至1300、核苷酸位置1050至1250、核苷酸位置1050至1200、核苷酸位置1050至1150、核苷酸位置1050至1100、核苷酸位置1100至1773、核苷酸位置1100至1770、核苷酸位置1100至1750、核苷酸位置1100至1700、核苷酸位置1100至1650、核苷酸位置1100至1600、核苷酸位置1100至1550、核苷酸位置1100至1500、核苷酸位置1100至1450、核苷酸位置1100至1400、核苷酸位置1100至1350、核苷酸位置1100至1300、核苷酸位置1100至1250、核苷酸位置1100至1200、核苷酸位置1100至1150、核苷酸位置1150至1773、核苷酸位置1150至1770、核苷酸位置1150至1750、核苷酸位置1150至1700、核苷酸位置1150至1650、核苷酸位置1150至1600、核苷酸位置1150至1550、核苷酸位置1150至1500、核苷酸位置1150至1450、核苷酸位置1150至1400、核苷酸位置1150至1350、核苷酸位置1150至1300、核苷酸位置1150至1250、核苷酸位置1150至1200、核苷酸位置1200至1773、核苷酸位置1200至1770、核苷酸位置1200至1750、核苷酸位置1200至1700、核苷酸位置1200至1650、核苷酸位置1200至1600、核苷酸位置1200至1550、核苷酸位置1200至1500、核苷酸位置1200至1450、核苷酸位置1200至1400、核苷酸位置1200至1350、核苷酸位置1200至1300、核苷酸位置1200至1250、核苷酸位置1250至1773、核苷酸位置1250至1770、核苷酸位置1250至1750、核苷酸位置1250至1700、核苷酸位置1250至1650、核苷酸位置1250至1600、核苷酸位置1250至1550、核苷酸位置1250至1500、核苷酸位置1250至1450、核苷酸位置1250至1400、核苷酸位置1250至1350、核苷酸位置1250至1300、核苷酸位置1300至1773、核苷酸位置1300至1770、核苷酸位置1300至1750、核苷酸位置1300至1700、核苷酸位置1300至1650、核苷酸位置1300至1600、核苷酸位置1300至1550、核苷酸位置1300至1500、核苷酸位置1300至1450、核苷酸位置1300至1400、核苷酸位置1300至1350、核苷酸位置1350至1773、核苷酸位置1350至1770、核苷酸位置1350至1750、核苷酸位置1350至1700、核苷酸位置1350至1650、核苷酸位置1350至1600、核苷酸位置1350至1550、核苷酸位置1350至1500、核苷酸位置1350至1450、核苷酸位置1350至1400、核苷酸位置1400至1773、核苷酸位置1400至1770、核苷酸位置1400至1750、核苷酸位置1400至1700、核苷酸位置1400至1650、核苷酸位置1400至1600、核苷酸位置1400至1550、核苷酸位置1400至1500、核苷酸位置1400至1450、核苷酸位置1450至1773、核苷酸位置1450至1770、核苷酸位置1450至1750、核苷酸位置1450至1700、核苷酸位置1450至1650、核苷酸位置1450至1600、核苷酸位置1450至1550、核苷酸位置1450至1500、核苷酸位置1500至1773、核苷酸位置1500至1770、核苷酸位置1500至1750、核苷酸位置1500至1700、核苷酸位置1500至1650、核苷酸位置1500至1600、核苷酸位置1500至1550、核苷酸位置1550至1773、核苷酸位置1550至1770、核苷酸位置1550至1750、核苷酸位置1550至1700、核苷酸位置1550至1650、核苷酸位置1550至1600、核苷酸位置1600至1773、核苷酸位置1600至1770、核苷酸位置1600至1750、核苷酸位置1600至1700、核苷酸位置1600至1650、核苷酸位置1650至1773、核苷酸位置1650至1770、核苷酸位置1650至1750、核苷酸位置1650至1700、核苷酸位置1700至1773、核苷酸位置1700至1770、核苷酸位置1700至1750、核苷酸位置1750至1773、或核苷酸位置1750至1770。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，3’UTR包含与SEQ ID NO：14或15具有至少70％(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。
CLRN1的人5’UTR(SEQ ID NO：12)
Figure BDA0002946755900001421
CLRN1的人5’UTR(SEQ ID NO：13)
Figure BDA0002946755900001422
CLRN1的人3’UTR(SEQ ID NO：14)
Figure BDA0002946755900001423
CLRN1的人3’UTR(SEQ ID NO：15)
Figure BDA0002946755900001431
在一些实施方案中，引入、移除或修饰3'UTR ARE可用于调节编码CLRN1蛋白的mRNA的稳定性。在其他实施方案中，ARE可被移除或突变以使细胞内稳定性增加，因此使CLRN1蛋白的翻译和产生增加。
在其他实施方案中，非ARE序列可并入5'或3'UTR中。在一些实施方案中，内含子或内含子序列的部分可并入本文提供的任何载体、组合物、药盒和方法中的多核苷酸的侧翼区中。内含子序列的并入可使蛋白质产生以及mRNA水平增加。
在本文所述的任何载体的一些实施方案中，载体包括嵌合内含子序列(SEQ IDNO：16)。
哺乳动物细胞
本文还提供了一种包括本文所述的任何核酸、载体(例如本文所述的至少两种不同载体)或组合物的细胞(例如哺乳动物细胞)。熟练从业者将了解，本文所述的核酸和载体可被引入任何哺乳动物细胞中。载体以及用于将载体引入哺乳动物细胞中的方法的非限制性实例在本文中加以描述。
在一些实施方案中，细胞是人细胞、小鼠细胞、猪细胞、兔细胞、犬细胞、猫细胞、大鼠细胞或非人灵长类动物细胞。在一些实施方案中，细胞是耳蜗的特化细胞。在一些实施方案中，细胞是耳蜗毛细胞，诸如耳蜗内毛细胞或耳蜗外毛细胞。在一些实施方案中，细胞是眼部细胞(例如视网膜细胞、视网膜神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、双极细胞、感光细胞)。
在一些实施方案中，哺乳动物细胞在体外。在一些实施方案中，哺乳动物细胞存在于哺乳动物中。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是从受试者获得，并且加以离体培养的自体细胞。
方法
本文还提供了包括：向哺乳动物(例如人)的耳蜗中引入治疗有效量的本文所述的任何组合物的方法。
本文还提供了使哺乳动物细胞中全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：将本文所述的任何组合物引入所述哺乳动物细胞中。
本文还提供了使哺乳动物(例如人)的耳蜗中的内毛细胞、外毛细胞或两者中的全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：向所述哺乳动物的所述耳蜗中引入治疗有效量的本文所述的任何组合物。
本文还提供了使哺乳动物(例如人)的眼中的全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：以眼内方式向所述哺乳动物的所述眼施用治疗有效量的本文所述的任何组合物。
本文还提供了治疗被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因的受试者的听力损失的方法，所述方法包括：向所述受试者的耳蜗中施用治疗有效量的本文所述的任何组合物。
本文还提供了治疗被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因的受试者的视力损失的方法，所述方法包括：向所述受试者的眼中施用治疗有效量的本文所述的任何组合物。
在这些方法中的任一者的一些实施方案中，哺乳动物先前已被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因(例如具有导致由CLRN1基因编码的CLRN1蛋白的表达和/或活性降低的突变的所述CLRN1基因)。这些方法中的任一者的一些实施方案还包括在引入或施用步骤之前确定受试者具有缺陷性CLRN1基因。这些方法中的任一者的一些实施方案可还包括检测受试者中CLRN1基因中的突变。任何方法的一些实施方案可还包括将受试者鉴定或诊断为患有听力损失和/或视力损失。
在这些方法中的任一者的一些实施方案中，向哺乳动物或受试者的耳蜗中引入或施用两剂或更多剂本文所述的任何组合物。在这些方法中的任一者的一些实施方案中，向哺乳动物或受试者的耳蜗中引入或施用两剂或更多剂本文所述的任何组合物。这些方法中的任一者的一些实施方案可包括向哺乳动物或受试者的耳蜗中引入或施用第一剂组合物，在引入或施用所述第一剂之后评估所述哺乳动物或受试者的听力功能，以及向被发现不具有在正常范围内的听力功能(例如如使用本领域中已知的任何听力测试所测定)的哺乳动物或受试者的耳蜗中施用额外剂量的组合物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，组合物可被配制用于耳蜗内施用。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，本文所述的组合物可通过耳蜗内施用或局部施用来施用。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，组合物通过使用医学装置(例如本文所述的任何示例性医学装置)来施用。
在一些实施方案中，耳蜗内施用可使用本文所述或本领域中已知的任何方法进行。举例来说，组合物可使用以下手术技术来向耳蜗中施用或引入：首先在使用以0度、2.5mm刚性内窥镜进行显像的情况下，对外耳道进行清洁，并且使用圆刀来清晰勾划约5mm鼓室耳道皮瓣。接着将鼓室耳道皮瓣提升，并且在后面进入中耳。识别并分开鼓索神经，并且使用刮器来移除盾骨，从而暴露圆窗膜。为使所施用或引入的组合物的顶端分布增强，可使用手术激光来在卵圆窗中产生小型2mm开窗以允许在跨圆窗膜输注组合物期间达成外淋巴位移。接着启动微量输注装置，并且带入手术区中。装置向圆窗进行运用，并且使顶端坐落在骨性圆窗悬突内以允许一个或多个微针对膜的穿透。用脚踏板进行接合以允许计量化稳定输注组合物。接着取出装置，并且用明胶海绵贴片密封圆窗和镫骨底板。
在这些方法中的任一者的一些实施方案中，向哺乳动物或受试者的眼中引入或施用两剂或更多剂本文所述的任何组合物。这些方法中的任一者的一些实施方案可包括向哺乳动物或受试者的眼(例如眼内间隙)中引入或施用第一剂组合物，在引入或施用所述第一剂之后评估所述哺乳动物或受试者的听力功能，以及向被发现不具有在正常范围内的视力(例如如使用本领域中已知的任何视力测试所测定)的哺乳动物或受试者的眼中施用额外剂量的组合物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，组合物可被配制用于眼内施用。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，本文所述的组合物可通过眼内施用或局部施用来施用。
在一些实施方案中，眼内施用可使用本文所述或本领域中已知的任何方法进行。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物是啮齿动物、非人灵长类动物或人。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物是成人、少年、青少年、儿童、学步儿、婴儿或新生儿。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物处于1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、2-5、2-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100、10-110、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-110、30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、50-70、50-80、50-90、50-100、60-80、60-90、60-100、70-90、70-100、70-110、80-100、80-110、或90-110岁。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物处于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11月龄。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物患有听力损失和/或视力损失(例如III型尤塞氏综合征、视网膜色素病变)，或处于显现听力损失和/或视力损失(例如III型尤塞氏综合征、视网膜色素病变)的风险下。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物先前已被鉴定为在CLRN1基因中具有突变。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物在CLRN1基因中具有本文描述或本领域中已知为与听力损失和/或视力损失相关的任何突变。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者或哺乳动物已被鉴定为是CLRN1基因中的突变的携带者(例如通过遗传测试)。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者或人已被鉴定为在CLRN1基因中具有突变，并且已被诊断有听力损失和/或视力损失(例如III型尤塞氏综合征、视网膜色素病变)。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者或人已被鉴定为患有听力损失和/或视力损失(例如III型尤塞氏综合征、视网膜色素病变)。
在一些实施方案中，对听力损失(例如III型尤塞氏综合征)的成功治疗可在受试者中使用本领域中已知的任何常规功能性听力测试来确定。功能性听力测试的非限制性实例是各种类型的测听测定(例如纯音测试、言语测试、中耳测试、听性脑干响应以及耳声发射)。
在一些实施方案中，对视力损失的成功治疗可在受试者中使用本领域中已知的任何常规功能性视力测试来确定。功能性视网膜和视力测试的非限制性实例是敏锐度测试、眼内压(IOP)测试以及视网膜电图(ERG)。
本文还提供了使哺乳动物细胞中活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)的表达增加的方法，所述方法包括将本文所述的任何组合物引入所述哺乳动物细胞中。在这些方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是耳蜗毛细胞(例如内毛细胞、外毛细胞)或眼部细胞(例如视网膜细胞)。在这些方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞(例如人耳蜗毛细胞)。在这些方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞在体外。在这些方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞在哺乳动物中。在这些方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞最初从哺乳动物获得，并且加以离体培养。在一些实施方案中，哺乳动物细胞先前已被确定为具有缺陷性CLRN1基因。
用于将本文所述的任何组合物引入哺乳动物细胞中的方法在本领域中是已知的(例如通过脂质体转染或通过使用病毒载体，例如本文所述的任何病毒载体)。
如本文所述的活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)的表达增加是例如相较于对照或相较于在引入一种或多种载体之前的活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)表达水平来说的。
检测CLRN1的表达和/或活性的方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中，可直接检测CLRN1蛋白的表达水平(例如检测CLRN1蛋白或检测CLRN1 mRNA)。可用于直接检测CLRN1的表达和/或活性的技术的非限制性实例包括：实时PCR、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学分析或免疫荧光。在一些实施方案中，可间接检测CLRN1蛋白的表达(例如通过功能性听力测试、功能性视网膜和视力测试)。
药物组合物和药盒
在一些实施方案中，本文所述的任何组合物都可还包括促进本文所述的核酸或任何载体进入哺乳动物细胞中的一种或多种剂(例如脂质体或阳离子脂质)。
在一些实施方案中，本文所述的任何载体都可使用天然和/或合成聚合物来配制。可被包括在本文所述的任何组合物中的聚合物的非限制性实例可包括但不限于DYNAMIC
Figure BDA0002946755900001491
(Arrowhead Research Corp.,Pasadena,Calif.)、来自MirusBio(Madison,Wis.)和Roche Madison(Madison,Wis.)的制剂、PhaseRX聚合物制剂诸如但不限于SMARTT POLYMER
Figure BDA0002946755900001492
(PhaseRX,Seattle,Wash.)、DMRI/DOPE、泊洛沙姆(poloxamer)、来自Vical(San Diego,Calif.)的
Figure BDA0002946755900001493
佐剂、壳聚糖、来自Calando Pharmaceuticals(Pasadena,Calif.)的环糊精、树状体和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)聚合物、RONDELTM(RNAi/寡核苷酸纳米颗粒递送)聚合物(Arrowhead ResearchCorporation,Pasadena,Calif.)、以及pH响应性共嵌段聚合物，诸如但不限于由PhaseRX(Seattle,Wash.)生产的那些。这些聚合物中的许多已在将寡核苷酸在体内递送至哺乳动物细胞中这个方面显示功效(参见例如deFougerolles,Human Gene Ther.19:125-132,2008；Rozema等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:12982-12887,2007；Rozema等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:12982-12887,2007；Hu-Lieskovan等人,Cancer Res.65:8984-8982,2005；Heidel等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:5715-5721,2007)。
本文所述的任何组合物都可为例如药物组合物。药物组合物可包括本文所述的任何组合物以及一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这类组合物可包含一种或多种缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；一种或多种碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖和右旋糖酐；甘露糖醇；一种或多种蛋白质、多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；一种或多种抗氧化剂；一种或多种螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；和/或一种或多种防腐剂。
在一些实施方案中，组合物包括药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲盐水、盐水、或抑菌水)。在配制后，溶液将以可与剂量制剂相容的方式，并且以诸如治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型诸如可注射溶液、可注射凝胶剂、药物释放胶囊等施用。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括可与药物施用相容的溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂、抗真菌剂等。还可将补充性活性化合物并入本文所述的任何组合物中。
在一些实施方案中，单剂本文所述的任何组合物可包括例如处于缓冲溶液中的至少两种不同载体的以下总量：至少1ng、至少2ng、至少4ng、约6ng、约8ng、至少10ng、至少20ng、至少30ng、至少40ng、至少50ng、至少60ng、至少70ng、至少80ng、至少90ng、至少100ng、至少200ng、至少300ng、至少400ng、至少500ng、至少1μg、至少2μg、至少4μg、至少6μg、至少8μg、至少10μg、至少12μg、至少14μg、至少16μg、至少18μg、至少20μg、至少22μg、至少24μg、至少26μg、至少28μg、至少30μg至少32μg、至少34μg、至少36μg、至少38μg、至少40μg、至少42μg、至少44μg、至少46μg、至少48μg、至少50μg、至少52μg、至少54μg、至少56μg、至少58μg、至少60μg、至少62μg、至少64μg、至少66μg、至少68μg、至少70μg、至少72μg、至少74μg、至少76μg、至少78μg、至少80μg、至少82μg、至少84μg、至少86μg、至少88μg、至少90μg、至少92μg、至少94μg、至少96μg、至少98μg、至少100μg、至少102μg、至少104μg、至少106μg、至少108μg、至少110μg、至少112μg、至少114μg、至少116μg、至少118μg、至少120μg、至少122μg、至少124μg、至少126μg、至少128μg、至少130μg至少132μg、至少134μg、至少136μg、至少138μg、至少140μg、至少142μg、至少144μg、至少146μg、至少148μg、至少150μg、至少152μg、至少154μg、至少156μg、至少158μg、至少160μg、至少162μg、至少164μg、至少166μg、至少168μg、至少170μg、至少172μg、至少174μg、至少176μg、至少178μg、至少180μg、至少182μg、至少184μg、至少186μg、至少188μg、至少190μg、至少192μg、至少194μg、至少196μg、至少198μg或至少200μg。
本文提供的组合物可例如被配制以可与它们的预定施用途径相容。预定施用途径的一非限制性实例是局部施用(例如耳蜗内施用)。
在一些实施方案中，治疗性组合物被配制以包括脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，治疗性组合物被配制以包括聚合纳米颗粒。在一些实施方案中，治疗性组合物被配制以包含小环DNA。在一些实施方案中，治疗性组合物被配制以包含CELiD DNA。在一些实施方案中，治疗性组合物被配制以包含合成外淋巴溶液。一示例性合成外淋巴溶液包括20-200mMNaCl；1-5mM KCl；0.1-10mM CaCl2；1-10mM葡萄糖；2-50mM HEPES，具有在约6与约9之间的pH。
还提供了包括本文所述的任何组合物的药盒。在一些实施方案中，药盒可包括固体组合物(例如包括本文所述的至少两种不同载体的冻干组合物)和用于使冻干组合物溶解的液体。在一些实施方案中，药盒可包括预装载注射器，所述预装载注射器包括本文所述的任何组合物。
在一些实施方案中，药盒包括包含本文所述的任何组合物(例如配制成水性组合物，例如水性药物组合物)的小瓶。
在一些实施方案中，药盒可包括关于进行本文所述的任何方法的说明书。
装置和手术方法
本文提供了用于治疗听力损失和/或视力损失(例如III型尤塞氏综合征、视网膜色素病变)的治疗性递送系统。在一个方面，治疗性递送系统包括i)能够在有需要的人受试者的内耳的圆窗膜中创建一个或多个切口的医学装置，和ii)有效剂量的组合物(例如本文所述的任何组合物)。在一些实施方案中，医学装置包括多个微针。
本文还提供了用于治疗听力损失(例如III型尤塞氏综合征)的手术方法。在一些实施方案中，方法包括以下步骤：向人受试者的耳蜗中在第一切开点处引入第一切口；以及在耳蜗内施用治疗有效量的本文提供的任何组合物。在一些实施方案中，在第一切开点处向受试者施用组合物。在一些实施方案中，向第一切口中或穿过第一切口向受试者施用组合物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，向耳蜗卵圆窗膜中或穿过耳蜗卵圆窗膜向受试者施用本文所述的任何组合物。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，向耳蜗圆窗膜中或穿过耳蜗圆窗膜向受试者施用本文所述的任何组合物。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，使用能够在圆窗膜中创建多个切口的医学装置来施用组合物。在一些实施方案中，医学装置包括多个微针。在一些实施方案中，医学装置包括多个微针，所述微针包括大体上是环状的第一外观，其中每个微针具有至少约10微米的直径。在一些实施方案中，医学装置包括能够容纳组合物的基底和/或储库。在一些实施方案中，医学装置包括多个中空微针，所述微针单个地包括能够转移组合物的内腔。在一些实施方案中，医学装置包括用于产生至少部分真空的部件。
本文还提供了用于治疗视力损失(例如视网膜色素病变)的手术方法。在一些实施方案中，方法包括以下步骤：在眼内施用治疗有效量的本文提供的任何组合物。
通过参考以下实验性实施例来进一步详细描述本发明。除非另外规定，否则这些实施例仅出于说明的目的而提供，并且不意图具有限制性。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而是应解释为涵盖由于本文提供的教示内容而变得明显的任何和所有变化形式。
在不进一步描述的情况下，据信本领域普通技术人员可使用先前描述和以下说明性实施例制备和利用本发明化合物以及实施所要求保护的方法。以下工作实施例明确指出本发明的各个方面，并且不应解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例
实施例1：病毒载体的构建
重组AAV通过用如由Xiao等人J.Virol.73(5):3994-4003,1999使用的无腺病毒方法进行的转染来产生。将具有AAV ITR的顺式质粒、具有AAV Rep和Cap基因的反式质粒以及具有来自腺病毒基因组的必需区域的辅助质粒以1:1:2的比率共转染于293细胞中。此处使用的AAV载体在使用以下描述的构建体进行的多种双载体策略下表达人CLRN1或小鼠CLRN1。AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43和Anc80各自被制备来囊封三组CLRN1构建体以测试(i)多联化-反式剪接策略，(ii)杂合内含子同源性重组-反式剪接策略，和(iii)外显子同源性重组策略，如由Pryadkina等人,Meth.Clin.Devel.2:15009,2015所概述。
实施例2：产生和纯化病毒颗粒
重组AAV-1使用三重转染方案来产生，并且通过两个连续氯化铯(CsCl)密度梯度来纯化，如由Pryadkina等人,Mol.Ther.2:15009,2015所描述。在第二离心结束时，从CsCl密度梯度管回收11个500μl级分，并且通过在1×PBS中透析来纯化。级分通过斑点印迹来分析以确定含有rAAV基因组的那些级分。每个制剂的病毒基因组数目(vg)通过使用对应于AAV载体基因组的ITR区域的引物和探针进行的基于定量实时PCR的滴定方法来测定(Bartoli等人Gene.Ther.13:20-28,2006)。
实施例3：病毒颗粒的配制
在人工外淋巴中在3.2e13、1.0e13、3.2e12、1.0e12 vg/mL的稀释度下制备在1e14vg/mL的效价下产生的AAV。人工外淋巴通过将以下试剂组合来制备：NaCl，120mM；KCl，3.5mM；CaCl2，1.5mM；葡萄糖，5.5mM；HEPES，20mM。人工外淋巴用NaOH滴定以将它的pH调整至7.5(130mM的总Na+浓度)(Chen等人,J.Controlled Rel.110:1-19,2005)。
实施例4：装置描述
使用被设计用于持续和安全穿透圆窗膜(RWM)的专门化微型导管将AAV-CLRN1制剂递送至耳蜗。对微型导管进行塑造以使进行递送程序的外科医师可通过外耳道进入中耳腔，并且使微型导管的末端与RWM接触。微型导管的远端包含至少一个具有在10与1,000微米之间的直径的微针，所述微针在RWM中产生足以允许AAV-CLRN1在约1uL/min的速率下进入鼓阶的耳蜗外淋巴，但足够小以致在不进行手术修复下可愈合的穿孔。微型导管的在一个或多个微针的近侧的其余部分装载有在约1e13 vg/mL的效价下的AAV-CLRN1/人工外淋巴制剂。微型导管的近端连接于允许以约1μL/min进行精确低体积输注的显微操纵器。
实施例5：动物模型1A：在老龄小鼠中进行的手术方法
向小鼠中的鼓阶施用在人工外淋巴中制备的AAV-CLRN1，如由Shu等人(HumanGene Therapy,doi:10.1089/hum.2016.053,2016年6月,)所描述。使用腹膜内注射甲苯噻嗪(20mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)来使六周龄雄性小鼠麻醉。使用电加热垫使体温维持在37℃下。从右侧耳后区域产生切口，并且使鼓泡暴露。用手术针对泡进行穿孔，并且使小孔扩展以提供到达耳蜗的通路。用牙钻使鼓阶的耳蜗侧壁的骨变薄，因此使膜性侧壁完整。与玻璃微量吸移器联合的纳升显微注射系统用于在2nL/秒的速率下将总计约300nL的处于人工外淋巴中的AAV-CLRN1递送至鼓阶。在注射后，将玻璃微量吸移器在原地留置5分钟。在耳蜗造口术和注射之后，用牙科粘固剂密封鼓泡中的开口，并且将肌肉和皮肤进行缝合。使小鼠从麻醉中醒来，并且持续3天用0.15mg/kg盐酸丁丙诺啡控制它们的疼痛。
实施例6：动物模型2：在豚鼠中采用的往复式微量泵
手术程序
向豚鼠施用在人工外淋巴中制备的AAV-CLRN1以评估在用如由Tandon等人,LabChip,DOI:10.1039/c5lc01396h,2015所述的往复式微量泵进行耳蜗内递送之后的分布和毒性。用戊巴比妥钠(耐波他(Nembutal)；25mg kg-1，腹膜内注射)、芬太尼(0.2mg kg-1，肌肉内)和氟哌啶醇(10mg kg-1，肌肉内)的组合使各自称重为约350g的雄性豚鼠(n＝16)麻醉。含肾上腺素的利多卡因作为表面麻醉剂在切开部位处加以皮下给与。使用背侧方法，在泡中产生5mm直径的孔，并且在圆窗膜的远侧约0.5mm处创建耳蜗造口。将微量泵(以下描述)的导管插入耳蜗造口中，向顶端穿行至耳蜗中3mm，并且用常用氰基丙烯酸酯胶水胶粘于泡。对于复合动作电位(CAP)测量，将全氟烷氧基-烷烃绝缘银线电极(203μm未涂布直径)插入在圆窗小生境附近，并且胶粘于泡。
用于测量畸变产物耳声发射(DPOAE)和CAP的程序如先前于Tandon等人BiomedMicrodevices 17:3-21,2015中所述加以进行。在耳蜗造口术程序之前和之后在特征频率：32、24、16、12、8、5.6、4和2.78kHz下测量DPOAE以监测由于手术而发生的任何损害。
使用如由Tandon等人Lab Chip,DOI：10.1039/c5lc01396h,2015所述的微量泵，向豚鼠施用在1e14 vg/mL的最大效价下的AAV-CLRN1。微量泵系统具有4个可选择端口。这些端口连接于：(i)用于人工外淋巴储存的大型流体电容器；(ii)连接于耳蜗的出口；(iii)来自集成AAV-CLRN1储库的出口；(iv)向集成AAV-CLRN1储库的进口。每个端口与中心泵室成流体连通，并且各自用阀加以单独定址。往复式AAV-CLRN1递送的事件顺序如下：(i)运行内部AAV-CLRN1更新环路，从而将AAV-CLRN1从AAV-CLRN1储库转移至主要输注–抽取管线中；(ii)将AAV-CLRN1输注至耳蜗中，并且从人工外淋巴储存电容器排放一些人工外淋巴；(iii)前两个步骤可重复数次以达成额外剂量；(iv)在已使AAV-CLRN1扩散一定时间之后，从耳蜗抽取与步骤(i)–(iii)中输注的体积相等的体积的外淋巴，从而再填充人工外淋巴储存电容器。这个过程导致药物的净递送，其中添加至耳蜗中的净流体体积是零。
微量泵中的流体电容器是圆柱形腔室，其顶板是薄的(25.4μm)柔性聚酰亚胺膜。泵室具有3.5mm的直径，流体储存电容器具有14mm的直径，并且所有其余电容器都具有4mm的直径。将相同的膜偏转以阻断在每个阀处的流动。阀室具有3.1mm的直径。包含药物储库的蛇形通道具有宽度762μm的方形截面和410mm的长度，总体积是238μL。泵中的所有其他微通道都具有400μm的宽度和254μm的高度。
在豚鼠中进行的急性药物递送
将微量泵装载以AAV-CLRN1和人工外淋巴，并且将导管插入在耳蜗的处于具有24和32kHz的特征频率敏感性的位置之间的区域中产生的耳蜗造口中，并且向顶端穿行3mm，从而终止于12–16kHz区域中。在开始AAV-CLRN1/人工外淋巴输注之前进行基线DPOAE和CAP听力测试。接着使泵启动，并且每5分钟输注约1μL的人工外淋巴直至将总计约10μL的人工外淋巴递送至耳蜗。在20分钟等待时间之后，从耳蜗抽取约10μL的外淋巴。接着在每5分钟约1μL的速率下起始AAV-CLRN1递送直至递送总计约10μL的液体。
在处理后1周、1个月、3个月和6个月时将动物处死(n＝4/组)，并且提取它们的耳蜗。通过用抗CLRN1抗体进行免疫染色来评估沿柯蒂氏器的AAV转导和CLRN1表达的程度。针对毛细胞标志物(Myo7a)和支持细胞标志物(Sox2)的抗体用于定量IHC、OHC、支持细胞和硬纤毛形态。膜联蛋白V染色用于评估沿耳蜗感觉上皮的细胞中的凋亡的迹象。
实施例7：动物模型3：绵羊
向幼年绵羊施用在人工外淋巴中制备的AAV-CLRN1以评估在通过跨RWM输注递送至耳蜗之后的分布和毒性。在处于3月龄下的雌性绵羊(n＝40)中在双侧测量基线听性脑干响应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)，以评估处理前内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)功能。在基线ABR和DPOAE测量之后，将20uL的在1.0e14、3.2e13、1.0e13和3.2e12 vg/mL的效价下的AAV1-CLRN1注射至绵羊的左侧鼓阶中(n＝10/组)。每个动物的右耳留作未处理对照。在手术程序之后1、5和10天，在双侧再次获取ABR和DPOAE测量结果。在程序后6个月时，从所有动物获取额外双侧ABR和DPOAE测量结果，并且随后将动物处死，并且移除它们的耳蜗。
在半数处死动物(n＝5，来自每个剂量群组)中，进行免疫染色以鉴定毛细胞结构，以及评估沿耳蜗感觉上皮的CLRN1蛋白表达。针对毛细胞标志物(Myo7a)、支持细胞标志物(Sox2)和CLRN1的抗体如先前所述加以使用(Duncker等人2013,J Neurosci 33(22):9508-9519)。在柯蒂氏器的底转、中转和顶转处，对在200um区域内的毛细胞和表达CLRN1的那些毛细胞的总数进行计数。
在其余半数处死动物(来自每个剂量群组的其余5个动物)中，从与以上所述相同的基底、中间和顶端区域收集耳蜗组织样品，并且测定CLRN1 mRNA转录物。
实施例8：人临床实例(儿科治疗)
将患者置于全身麻醉下。外科医师从外耳道接近鼓膜，在外耳道的与鼓膜交会所处的下边缘处产生小切口，并且将鼓膜以皮瓣形式提升以暴露中耳间隙。手术激光用于在镫骨底板中产生小开口(约2mm)。外科医师接着用装载有在1e13 vg/mL的效价下的在人工外淋巴中制备的AAV-CLRN1溶液的微型导管穿透圆窗膜。微型导管连接于在约1uL/min的速率下输注约20uL的AAV-CLRN1溶液的显微操纵器。在AAV-CLRN1输注结束时，外科医师抽出微型导管，并且用明胶海绵贴片修补镫骨底板和RWM中的孔。程序以将鼓膜皮瓣复位来结束。
实施例9：用以检测CLRN1突变的对母体血液的非侵袭性产前测试
将母体血液样品(20-40mL)收集至无细胞DNA管中。通过2,000g持续20分钟继之以3,220g持续30分钟，其中在第一次旋转之后进行上清液转移的双重离心方案来从每个样品分离至少7mL的血浆。使用QIAGEN
Figure BDA0002946755900001581
循环核酸试剂盒从7-20mL血浆分离cfDNA，并且洗脱于45μL TE缓冲液中。从在第一次离心之后获得的血沉棕黄层分离纯净母体基因组DNA。
通过将用以选择探针-探针相互作用的可能性最小的探针的对测定进行的热力学建模与先前描述的扩增方法(Stiller等人,Genome Res.19(10):1843-1848,2009)组合，可实现11,000个测定的多路化。使用11,000个靶标特异性测定，对母体cfDNA和母体基因组DNA样品进行15个循环的预扩增，并且将等分试样转移至使用巢式引物进行15个循环的第二PCR反应中。通过在第三轮12循环PCR中添加条形码化标签来制备用于测序的样品。接着使用Illumina HiSeq测序仪对扩增子进行测序。使用可商购获得的软件进行基因组序列比对。
实施例10：腺病毒(AAV)反式剪接策略
至少两种不同核酸载体(例如AAV载体)可用于在分子间多联化和反式剪接之后在细胞内重构活性CLRN1基因(例如全长CLRN1基因)。参见例如Yan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:12；6716-6721,2000，其以它的整体并入本文。
在一些实例中，将使用两种不同核酸载体。第一核酸载体可包括启动子(例如本文所述的任何启动子)、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分(例如本文所述的CLRN1蛋白的任何大小的一部分和/或本文所述的CLRN1蛋白的任何N末端部分)的第一编码序列、以及位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列。第二核酸载体可包括剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分(即CLRN1蛋白的不包括在N末端部分中的整个部分)(例如本文所述的CLRN1蛋白的任何大小的一部分和/或本文所述的CLRN1蛋白的任何C末端部分)的第二编码序列、以及在所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化序列(例如本文所述的任何多腺苷酸化序列)。在一些实施方案中，所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基(例如的长度是至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、或至少100个氨基酸)，所编码部分中的每一者的氨基酸序列不与其他所编码部分的序列重叠，并且两种不同载体中没有单一载体编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)。当引入哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)中时，在剪接供体序列与剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)的重组核酸。
在另一实例中，可使用三种不同核酸载体。第一核酸载体可包括启动子序列(例如本文所述的任何启动子序列)的一部分；CLRN1基因的编码CLRN1蛋白的第一部分，位于所述启动子的3’的第一编码序列(例如本文所述的任何CLRN1编码序列)；以及位于所述第一编码序列的3’末端的第一剪接供体序列。第二核酸载体可包括第一剪接接受体序列；CLRN1基因的编码CLRN1蛋白的第二部分，位于所述第一剪接接受体序列的3’末端的第二编码序列；以及位于所述第二编码序列的3’末端的第二剪接供体序列(例如本文所述的任何剪接供体序列)。第二核酸载体的特征将是不能发生自剪接(即剪接将不在第二核酸载体的第二剪接供体序列与第一剪接接受体序列之间发生)。在一些实施方案中，第一核酸载体的剪接供体序列和第二核酸载体的第二剪接供体序列是相同的(例如本文所述或本领域中已知的任何剪接供体序列)。在一些实施方案中，第一核酸载体的第一剪接供体序列和第二核酸载体的第二剪接供体序列是不同的(例如本文所述或本领域中已知的任何剪接供体序列)。第三核酸载体将包括第二剪接接受体序列；CLRN1基因的编码CLRN1蛋白的第三部分，位于所述第二剪接接受体序列的3’末端的第三编码序列；以及位于所述第三编码序列的3’末端的多腺苷酸化序列(例如本文所述的任何多腺苷酸化序列)。在其中使用三种核酸载体的这类方法中，第一剪接供体序列和第一剪接接受体序列可组装在一起(重组)，并且第二剪接供体序列和第二剪接接受体序列可组装在一起(重组)，并且CLRN1蛋白的由第一、第二和第三编码序列编码的部分不重叠，并且当引入哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)中时，在第一剪接供体序列与第一剪接接受体序列之间，以及在第二剪接供体序列与第二剪接接受体序列之间发生剪接，以形成编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)的重组核酸。基于以上提供的策略，本领域技术人员将了解如何开发使用四种、五种或六种不同核酸载体进行的策略。
在这些方法的任何实例中，所编码部分的氨基酸序列都不与任何其他所编码部分重叠，并且没有单一载体编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)。
至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，并且所编码部分中的每一者可为至少30个氨基酸(例如在约30个氨基酸至约1200个氨基酸之间，或本文所述的这个范围的任何其他子范围)。
在一些实施方案中，编码序列中的每一者可包括SEQ ID NO：9的至少一个外显子和至少一个内含子(例如至少两个外显子和至少一个内含子、至少两个外显子和至少两个内含子、至少三个外显子和至少一个内含子、至少三个外显子和至少两个内含子、或至少三个外显子和至少三个内含子)。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，并且所编码部分中的每一者可编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多达80％(例如SEQ ID NO：1的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％或多达70％)，以致所编码部分中的每一者是非重叠的。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多达80％(例如SEQ ID NO：3的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％或多达70％)，前提是所编码部分中的每一者与任何其他所编码部分是非重叠的。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多达80％(例如SEQ ID NO：5的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％或多达70％)，前提是所编码部分中的每一者与任何其他所编码部分是非重叠的。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：7的氨基酸序列的多达80％(例如SEQ IDNO：7的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％或多达70％)，前提是所编码部分中的每一者与任何其他所编码部分是非重叠的。
至少两种核酸载体中的每一者可还包括反向末端重复序列(ITR)以允许头-尾重组。ITR将随后通过剪接而移除。举例来说，ITR可为如以它的整体并入本文的Yan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12):6716-6721,2000中所述的回文双D ITR，或如Gosh等人,Mol.Ther.16:124-130,2008以及Gosh等人,Human Gene Ther.22：77-83,2011中所述的AAV血清型-2ITR。剪接接受体和/或供体序列的非限制性实例在本领域中是已知的。参见例如Reich等人,Human Gene Ther.14(1):37-44,2003以及Lai等人(2005)Nat.Biotechnol.23(11):1435-1439,2005,2005。剪接供体和接受体序列可为基因(例如CLRN1基因)的任何内源性内含子剪接供体/接受体序列。举例来说，剪接供体序列可为：5’-GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT-3’(SEQ ID NO：22)，并且剪接接受体序列可为5’-GATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG-3’(SEQ ID NO：23)(参见例如Trapani等人,EMBO Mol.Med.6(2):194-211,2014)。评估剪接和剪接效率的方法在本领域中是已知的(参见例如Lai等人,Nat.Biotechnol.23(11)：1435-1439,2005)。
实施例11：使用碱性磷酸酶(AP)高度致重组外源性基因区域进行的杂合载体反式剪接策略
至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)不同核酸载体(例如AAV载体)还可在本文所述的任何方法中用于在分子间多联化、标记基因介导的重组以及反式剪接之后在细胞内重构活性CLRN1基因(例如全长CLRN1基因)。这个策略是一种杂合策略，因为它将包括同源性重组和/或反式剪接。参见例如Gosh等人,Mol.Ther.16：124-130,2008；Gosh等人,Human Gene Ther.22：77-83,2011；以及Duan等人,Mol.Ther.4：383-391,2001，其各自以它的整体并入本文。如本文所用，可检测标记基因可为将允许进行编码序列非依赖性重组的高度致重组DNA序列。可检测标记基因的一非限制性实例是碱性磷酸酶(AP)基因。举例来说，可检测标记基因可为人胎盘AP互补性DNA的中间三分之一，长度是872bp(参见例如Gosh等人,2008)。至少两种不同核酸载体将含有可检测标记基因(例如本文所述的任何可检测标记基因)。因为杂合载体将基于如实施例10中所述的反式剪接载体构建，所以活性CLRN1基因(例如全长CLRN1基因)可使用ITR介导的重组和反式剪接或可检测标记基因介导(例如AP基因介导)的重组和反式剪接加以重构。在反式剪接之后，活性CLRN1基因(例如全长CLRN1基因)将在哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)的基因组DNA中加以重构。
在一个实例中，将使用两种不同核酸载体。第一核酸载体可包括启动子(例如本文所述的任何启动子)、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分(例如本文所述的CLRN1蛋白的任何大小的一部分和/或本文所述的CLRN1蛋白的任何N末端部分)的第一编码序列、位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列、以及位于所述剪接供体序列的3’的第一可检测标记基因。第二核酸载体可包括第二可检测标记基因、位于所述第二可检测标记基因的3’的剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分(例如本文所述的CLRN1蛋白的任何大小的一部分和/或本文所述的CLRN1蛋白的任何C末端部分)的第二编码序列、以及在所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化序列(例如本文所述的任何多腺苷酸化序列)。在一些实施方案中，所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基(例如的长度是至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、或至少100个氨基酸)，所编码部分的氨基酸序列不重叠，并且两种不同载体中没有单一载体编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)。当引入哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)中时，在剪接供体序列与剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)的重组核酸。
在另一实例中，可使用三种不同核酸载体。第一核酸载体可包括启动子序列(例如本文所述的任何启动子序列)的一部分；CLRN1基因的编码CLRN1蛋白的第一部分，位于所述启动子的3’的第一编码序列(例如本文所述的任何CLRN1编码序列)；位于所述第一编码序列的3’末端的第一剪接供体序列；以及第一可检测标记基因。第二核酸载体可包括第二可检测标记基因；位于所述第二可检测标记基因的3’的第一剪接接受体序列；CLRN1基因的编码CLRN1蛋白的第二部分，位于所述第一剪接接受体序列的3’末端的第二编码序列；位于所述第二编码序列的3’末端的第二剪接供体序列(例如本文所述的任何剪接供体序列)；以及第三可检测标记基因。第二核酸载体的特征将是不能发生自剪接(即剪接将不在第二核酸载体的第二剪接供体序列与第一剪接接受体序列之间发生)。在一些实施方案中，第一核酸载体的剪接供体序列和第二核酸载体的第二剪接供体序列是相同的(例如本文所述或本领域中已知的任何剪接供体序列)。在一些实施方案中，第一核酸载体的第一剪接供体序列和第二核酸载体的第二剪接供体序列是不同的(例如本文所述或本领域中已知的任何剪接供体序列)。第三核酸载体可包括第四可检测标记基因；位于所述第四可检测标记基因的3’的第二剪接接受体序列；CLRN1基因的编码CLRN1蛋白的第三部分，位于所述第二剪接接受体序列的3’末端的第三编码序列；以及位于所述第三编码序列的3’末端的多腺苷酸化序列(例如本文所述的任何多腺苷酸化序列)。在其中使用三种核酸载体的这类方法中，第一剪接供体序列和第一剪接接受体序列可组装在一起(重组)，并且第二剪接供体序列和第二剪接接受体序列可组装在一起(重组)，并且CLRN1蛋白的由第一、第二和第三编码序列编码的部分不彼此重叠，并且当引入哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)中时，在第一剪接供体序列与第一剪接接受体序列之间，以及在第二剪接供体序列与第二剪接接受体序列之间发生剪接，以形成编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)的重组核酸。如本领域中可了解，当使用三种核酸载体时，至少两种不同核酸载体中的两者可包括可检测标记基因(例如AP标记基因)，并且至少两种不同核酸载体中的一者可包括互补于包括可检测标记基因的核酸载体中的剪接供体序列的剪接接受体序列。举例来说，在一些实施方案中，第一和第二核酸载体可包括可检测标记基因(例如AP标记基因)，并且第三核酸载体将包括互补于第二核酸载体中的剪接供体序列的剪接接受体序列，并且第三核酸载体将不包括可检测标记基因(例如AP标记基因)。在其他实例中，第二和第三核酸载体可包括可检测标记基因(例如AP标记基因)，并且第一核酸载体将包括互补于第二核酸载体中的剪接接受体序列的剪接供体序列，并且第一核酸载体将不包括可检测标记基因(例如AP标记基因)。
基于以上提供的策略，本领域技术人员将了解如何开发使用四种、五种或六种载体进行的策略。
至少两种核酸载体(例如两种、三种、四种、五种或六种)中提供的CLRN1编码序列将不是重叠的。至少两种不同载体中的每一者可包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者是例如至少30个氨基酸(例如约30个氨基酸至约1600个氨基酸，或本文所述的这个范围的任何其他子范围)。
在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：9的至少一个外显子和至少一个内含子(例如至少两个外显子和至少一个内含子、至少两个外显子和至少两个内含子、至少三个外显子至少一个内含子、至少三个外显子和至少两个内含子、或至少三个外显子和至少三个内含子)。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：1的多达80％(例如SEQ ID NO：1的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％、多达70％)，前提是所编码部分中的每一者与任何其他所编码部分是非重叠的。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：3的多达80％(例如SEQ ID NO：3的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％、多达70％)，前提是所编码部分中的每一者与任何其他所编码部分是非重叠的。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：5的多达80％(例如SEQ ID NO：5的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％、多达70％)，前提是所编码部分中的每一者与任何其他所编码部分是非重叠的。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQID NO：7的多达80％(例如SEQ ID NO：7的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％、多达70％)，前提是所编码部分中的每一者与任何其他所编码部分是非重叠的。
如实施例10中所述，至少两种核酸载体中的每一者可还包括反向末端重复序列(ITR)以允许头-尾重组。ITR将随后通过剪接而移除。ITR和剪接接受体序列和/或剪接供体序列的实例在本领域中是已知的，并且已在实施例10中描述。
实施例12：使用F1噬菌体高度致重组外源性基因区域(AK)进行的杂合载体反式剪接策略
至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)不同核酸载体(例如AAV载体)还可在本文所述的任何方法中用于在分子间多联化、标记基因介导的重组以及反式剪接之后在细胞内重构活性CLRN1基因(例如全长CLRN1基因)。这个策略是一种杂合策略，因为它将包括同源性重组和/或反式剪接。参见例如Trapani等人,EMBO Mol.Med.6(2):194-211,2014，其以它的整体并入本文。如本文所用，F1噬菌体致重组区域(AK)将用于允许进行编码序列非依赖性重组。F1噬菌体致重组区域可为如Trapani等人(2014)中所述的来自F1噬菌体基因组的77bp致重组区域。至少两种不同核酸载体将含有F1噬菌体致重组区域。因为杂合载体将基于如实施例10中所述的反式剪接载体构建，所以编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)的核酸可使用F1噬菌体致重组区域诱导的重组和反式剪接来产生。在反式剪接之后，编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)的核酸将在哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)中产生。
在一个实例中，将使用两种不同核酸载体。第一核酸载体可包括启动子(例如本文所述的任何启动子)、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分(例如本文所述的CLRN1蛋白的任何大小的一部分和/或本文所述的CLRN1蛋白的任何N末端部分)的第一编码序列、位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列、以及位于所述剪接供体序列的3’的F1噬菌体致重组区域。第二核酸载体可包括F1噬菌体致重组区域、位于所述F1噬菌体致重组区域的3’的剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分(例如本文所述的CLRN1蛋白的任何大小的一部分和/或本文所述的CLRN1蛋白的任何C末端部分)的第二编码序列、以及在所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化序列(例如本文所述的任何多腺苷酸化序列)。在一些实施方案中，所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基(例如的长度是至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、或至少100个氨基酸)，所编码部分中的每一者的氨基酸序列不重叠，并且两种不同载体中没有单一载体编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)。当引入哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)中时，在剪接供体序列与剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)的重组核酸。
在另一实例中，将使用三种不同核酸载体。第一核酸载体可包括启动子序列(例如本文所述的任何启动子序列)、位于所述启动子的5’的编码CLRN1蛋白的第一部分的第一编码序列(例如本文所述的任何CLRN1编码序列)、位于所述第一编码序列的3’末端的第一剪接供体序列、以及F1噬菌体致重组区域。第二核酸载体可包括F1噬菌体致重组区域、位于所述F1噬菌体致重组区域的3’的第一剪接接受体序列、位于所述第一剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的第二部分的第二编码序列、位于所述第二编码序列的3’末端的第二剪接供体序列(例如本文所述的任何剪接供体序列)、以及F1噬菌体致重组区域。第二核酸载体的特征将是不能发生自剪接(即剪接将不在第二核酸载体的第二剪接供体序列与第一剪接接受体序列之间发生)。在一些实施方案中，第一核酸载体的剪接供体序列和第二核酸载体的第二剪接供体序列是相同的(例如本文所述或本领域中已知的任何剪接供体序列)。在一些实施方案中，第一核酸载体的第一剪接供体序列和第二核酸载体的第二剪接供体序列是不同的(例如本文所述或本领域中已知的任何剪接供体序列)。第三核酸载体可包括F1噬菌体致重组区域、位于所述F1噬菌体致重组区域的3’的第二剪接接受体序列、位于所述第二剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的第三部分的第三编码序列、以及位于所述第三编码序列的3’末端的多腺苷酸化序列(例如本文所述的任何多腺苷酸化序列)。在其中使用三种核酸载体的这类方法中，第一剪接供体序列和第一剪接接受体序列可组装在一起(重组)，并且第二剪接供体序列和第二剪接接受体序列可组装在一起(重组)，并且CLRN1蛋白的由第一、第二和第三编码序列编码的部分不重叠，并且当引入哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)中时，在第一剪接供体序列与第一剪接接受体序列之间，以及在第二剪接供体序列与第二剪接接受体序列之间发生剪接，以形成编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)的重组核酸。如本领域中可了解，当使用三种核酸载体时，不同核酸载体中的两者可包括F1噬菌体致重组区域，并且不同核酸载体中的一者可包括互补于包括F1噬菌体致重组区域的核酸载体中的剪接供体序列的剪接接受体序列。举例来说，在一些实施方案中，第一和第二核酸载体可包括F1噬菌体致重组区域，并且第三核酸载体将包括互补于第二核酸载体中的剪接供体序列的剪接接受体序列，并且第三核酸载体将不包括F1噬菌体致重组区域(例如AP标记基因)。在其他实例中，第二和第三核酸载体可包括F1噬菌体致重组区域，并且第一核酸载体将包括互补于第二核酸载体中的剪接接受体序列的剪接供体序列，并且第一核酸载体将不包括F1噬菌体致重组区域。基于以上提供的策略，本领域技术人员将了解如何开发使用四种、五种或六种载体进行的策略。
至少两种核酸载体(例如两种、三种、四种、五种或六种)中的每一者中提供的CLRN1编码序列将不是重叠的。至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者是至少30个氨基酸(例如约30个氨基酸至约1600个氨基酸，或本文所述的这个范围的任何子范围)。
在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：9的至少一个外显子和至少一个内含子(例如至少两个外显子和至少一个内含子、至少两个外显子和至少两个内含子、至少三个外显子和至少一个内含子、至少三个外显子和至少两个内含子、或至少三个外显子和至少三个内含子)。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：1的多达80％(例如SEQ IDNO：1的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％或多达70％)，前提是所编码部分中的每一者是非重叠的。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：3的多达80％(例如SEQ ID NO：3的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％或多达70％)，前提是所编码部分中的每一者是非重叠的。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：5的多达80％(例如SEQ ID NO：5的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％或多达70％)，前提是所编码部分中的每一者是非重叠的。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：7的多达80％(例如SEQ ID NO：7的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％或多达70％)，前提是所编码部分中的每一者是非重叠的。
如实施例10中所述，至少两种核酸载体中的每一者可还包括反向末端重复序列(ITR)以允许头-尾重组。ITR将随后通过剪接而移除。ITR和剪接接受体序列和/或剪接供体序列的实例在本领域中是已知的，并且已在实施例10中描述。
实施例13.使用两种CLRN1亚型进行的杂合载体反式剪接策略
至少两种不同核酸载体(例如AAV载体)可用于在分子间多联化和反式剪接之后在细胞内重构活性CLRN1基因(例如全长CLRN1基因)。参见例如Yan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:12；6716-6721,2000，其以它的整体并入本文。
在一些实例中，将使用两种不同核酸载体。第一核酸载体可包括启动子(例如本文所述的任何启动子)、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分(例如本文所述的CLRN1蛋白的任何大小的一部分和/或本文所述的CLRN1蛋白的任何N末端部分)的第一编码序列、以及位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列。
第二核酸载体可包括剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分(即CLRN1蛋白的不包括在N末端部分中的整个部分)(例如本文所述的CLRN1蛋白的任何大小的一部分和/或本文所述的CLRN1蛋白的任何C末端部分)的第二编码序列、以及在所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化信号序列(例如本文所述的任何多腺苷酸化序列)。
在一些实施方案中，所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基(例如的长度是至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、或至少100个氨基酸)，两个所编码部分的氨基酸序列不彼此重叠；并且两种不同载体中没有单一载体编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)。
在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的第一亚型(例如SEQ ID NO：3)的不同部分的编码序列。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ IDNO：3的氨基酸序列的多达80％(例如SEQ ID NO：3的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％或多达70％)，前提是所编码部分中的每一者与任何其他所编码部分是非重叠的。
在一些实施方案中，至少两种不同核酸载体中的一者还包括编码CLRN1蛋白的第二亚型(例如SEQ ID NO：5)的序列。在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者编码SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多达80％(例如SEQ ID NO：5的多达10％、多达20％、多达30％、多达40％、多达50％、多达60％或多达70％)，前提是所编码部分中的每一者与任何其他所编码部分是非重叠的。
在一些实施方案中，至少两种不同载体中的每一者包括编码CLRN1蛋白的第二亚型的不同部分的编码序列。在一些实施方案中，至少两种不同核酸载体中的一者还包括编码CLRN1蛋白的第一亚型的序列。
当引入哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)中时，在剪接供体序列与剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码活性CLRN1蛋白(例如全长CLRN1蛋白)的重组核酸。
这类载体的非限制性实例显示于图1、图2、图4、图7至图10、以及图12至图24中。
实施例14.CLRN1在HEK293FT细胞中的表达
用示例性CLRN载体转染HEK293FT细胞。在转染后48小时，制备HEK293FT细胞溶解产物，并且通过蛋白质印迹来测定CLRN1蛋白表达。如图25至图31中所示，在所有测试样品中都检测到CLRN1蛋白。这个结果确认CLRN1蛋白可通过本文所述的示例性CLRN1载体来表达。
图32显示用CLRN1-6eGFP载体转染的HEK293FT细胞在转染后快至72小时即表达高水平的GFP。在用CLRN1-e6GFP载体在MOI 8.41E+04和2.53E+05下转染之后，在转染后24小时，少许HEK293FT细胞表达GFP。在转染后72小时，用CLRN1-e6GFP载体在MOI 2.53E+05下转染的大多数HEK293FT细胞表达GFP，同时，用CLRN1-e6GFP载体在MOI 8.41E+04下转染的一些HEK293FT细胞表达GFP。如图33中所示，在用CLRN-0载体、CLRN-3载体和CLRN-13载体转染的HEK293FT细胞中，CLRN1在高水平下表达。
实施例15.CLRN1表达P2耳蜗小鼠外植体
在涂铺之后16小时，对来自野生型小鼠的P2耳蜗外植体进行感染，并且在感染之后72小时进行收集以测定RNA和免疫荧光。如图34中所示，CLRN1在耳蜗外植体中高效表达。如图35中所示，当用CLRN-0载体(1.3E10 VG/耳蜗)、CLRN-3(9.9E09 VG/耳蜗)和CLRN-13(1.0E10 VG/耳蜗)转染时，P2耳蜗外植体的外毛细胞(OHC)和内毛细胞(IHC)表达Myo7a。用任一载体转染都不破坏耳蜗的OHC或IHC的结构完整性。因此，图35以有活力和组织化的外毛细胞(OHC)、内毛细胞(IHC)和硬纤毛束显示CLRN1构建体没有毒性。如图36中所示，相较于单独CAG启动子，采用CLRN1-3’UTR达成的eGFP表达似乎明确说明了转导。用1E09 AAV/Anc80.CAG.eGFP感染的耳蜗外植体在内毛细胞中表达Myo7a。用1E09AAV/Anc80.CAG.eGFP.CLRN-3’UTR感染的耳蜗外植体在OHC与IHC两者中均表达My07a。在用AAV/Anc80.CAG.eGFP.CLRN-3’UTR感染的耳蜗外植体的OHC中观察到CLRN1的较高转导和共表达。用AAV/Anc80.CAG.eGFP.CLRN-3’UTR感染的耳蜗外植体中的GFP表达限于OHC。
其他实施方案
应了解尽管本发明已与其具体实施方式联合加以描述，但先前描述意图说明而非限制由随附权利要求的范围限定的本发明的范围。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用以它们的整体并入本文。在有冲突的情况下，将以包括定义的本说明书为准。章节标题以及对材料、方法和实例的任何描述仅具有说明性，而非意图具有限制性。
序列表
SEQ ID NO：1-人全长野生型CLRN1蛋白亚型D
Figure BDA0002946755900001731
SEQ ID NO：2-人野生型CLRN1亚型D cDNA
Figure BDA0002946755900001732
SEQ ID NO：3-人全长野生型CLRN1蛋白亚型A
Figure BDA0002946755900001741
SEQ ID NO：4-人野生型CLRN1亚型A cDNA
Figure BDA0002946755900001742
SEQ ID NO：5-人全长野生型CLRN1蛋白亚型C
Figure BDA0002946755900001743
SEQ ID NO：6-人野生型CLRN1亚型C cDNA
Figure BDA0002946755900001744
SEQ ID NO：7-人全长野生型CLRN1蛋白亚型E
Figure BDA0002946755900001745
SEQ ID NO：8-人野生型CLRN1亚型E cDNA
Figure BDA0002946755900001751
SEQ ID NO：9-人野生型CLRN1基因组序列
Figure BDA0002946755900001761
Figure BDA0002946755900001771
Figure BDA0002946755900001781
Figure BDA0002946755900001791
Figure BDA0002946755900001801
Figure BDA0002946755900001811
Figure BDA0002946755900001821
Figure BDA0002946755900001831
Figure BDA0002946755900001841
Figure BDA0002946755900001851
Figure BDA0002946755900001861
Figure BDA0002946755900001871
Figure BDA0002946755900001881
Figure BDA0002946755900001891
Figure BDA0002946755900001901
Figure BDA0002946755900001911
Figure BDA0002946755900001921
Figure BDA0002946755900001931
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SEQ ID NO：10-小鼠CLRN1蛋白亚型1
Figure BDA0002946755900001962
SEQ ID NO：11-犬CLRN1蛋白
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SEQ ID NO：12-5’UTR
Figure BDA0002946755900001964
SEQ ID NO：13-5’ITR
Figure BDA0002946755900001971
SEQ ID NO：14–3’ITR
Figure BDA0002946755900001972
SEQ ID NO：15–3’UTR
Figure BDA0002946755900001973
SEQ ID NO：16–嵌合内含子
Figure BDA0002946755900001981
SEQ ID NO：17–CMV增强子
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SEQ ID NO：18–CBA启动子
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SEQ ID NO：20–牛生长激素多腺苷酸
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SEQ ID NO：21–可溶性神经纤毛蛋白-1的多腺苷酸化信号
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SEQ ID NO：22–剪接供体序列
Figure BDA0002946755900001994
SEQ ID NO：23-剪接接受体序列
Figure BDA0002946755900001995
SEQ ID NO：24–3’ITR
Figure BDA0002946755900001996
SEQ ID NO：25–ITR
Figure BDA0002946755900001997
SEQ ID NO：26–sh嵌合内含子
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SEQ ID NO：27–3’UTR 600A
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KRKRRG
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EGRGSLLTCGDVEENPGP
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EQKLISEEDLEQKLISEEDLEQKLISEEDL
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YPYDVPDYA
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DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK
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EKIANYKEGTYVYKTQSEKY
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Figure BDA0002946755900002262
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SEQ ID NO：53–CLRN-11NF
Figure BDA0002946755900002282
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Figure BDA0002946755900002302
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SEQ ID NO：55–CLRN-13
Figure BDA0002946755900002322
Figure BDA0002946755900002331
Figure BDA0002946755900002341
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Figure BDA0002946755900002342
Figure BDA0002946755900002351
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SEQ ID NO：57–CLRN-15
Figure BDA0002946755900002362
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SEQ ID NO：58-CLRN-16
Figure BDA0002946755900002381
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Figure BDA0002946755900002392
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Figure BDA0002946755900002393
Figure BDA0002946755900002401
Figure BDA0002946755900002402
序列表
<110> 阿库斯股份有限公司(Akouos Inc.)
<120> 治疗CLRN1相关的听力损失和/或视力损失的方法
<130> 44628-0026WO1
<150> 62/689,660
<151> 2018-06-25
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 245
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Pro Ser Gln Gln Lys Lys Ile Ile Phe Cys Met Ala Gly Val Phe
1 5 10 15
Ser Phe Ala Cys Ala Leu Gly Val Val Thr Ala Leu Gly Thr Pro Leu
20 25 30
Trp Ile Lys Ala Thr Val Leu Cys Lys Thr Gly Ala Leu Leu Val Asn
35 40 45
Ala Ser Gly Gln Glu Leu Asp Lys Phe Met Gly Glu Met Gln Tyr Gly
50 55 60
Leu Phe His Gly Glu Gly Val Arg Gln Cys Gly Leu Gly Ala Arg Pro
65 70 75 80
Phe Arg Phe Ser Phe Phe Pro Asp Leu Leu Lys Ala Ile Pro Val Ser
85 90 95
Ile His Val Asn Val Ile Leu Phe Ser Ala Ile Leu Ile Val Leu Thr
100 105 110
Met Val Gly Thr Ala Phe Phe Met Tyr Asn Ala Phe Gly Lys Pro Phe
115 120 125
Glu Thr Leu His Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Phe Ile Ser
130 135 140
Val Ala Leu Trp Leu Pro Ala Thr Arg His Gln Ala Gln Gly Ser Cys
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Met Ile Leu Phe Ala Ser Glu Val Lys Ile His His
165 170 175
Leu Ser Glu Lys Ile Ala Asn Tyr Lys Glu Gly Thr Tyr Val Tyr Lys
180 185 190
Thr Gln Ser Glu Lys Tyr Thr Thr Ser Phe Trp Val Ile Phe Phe Cys
195 200 205
Phe Phe Val His Phe Leu Asn Gly Leu Leu Ile Arg Leu Ala Gly Phe
210 215 220
Gln Phe Pro Phe Ala Lys Ser Lys Asp Ala Glu Thr Thr Asn Val Ala
225 230 235 240
Ala Asp Leu Met Tyr
245
<210> 2
<211> 738
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
atgccaagcc aacagaagaa aatcattttt tgcatggccg gagtgttcag ttttgcatgt 60
gccctcggag ttgtgacagc cttggggaca ccgttgtgga tcaaagccac tgtcctctgc 120
aaaacgggag ctctgctcgt caatgcctca gggcaggagc tggacaagtt tatgggtgaa 180
atgcagtacg ggcttttcca cggagagggt gtgaggcagt gtgggttggg agcaaggccc 240
tttcggttct cattttttcc agatttgctc aaagcaatcc cagtgagcat ccacgtcaat 300
gtcattctct tctctgccat ccttattgtg ttaaccatgg tggggacagc cttcttcatg 360
tacaatgctt ttggaaaacc ttttgaaact ctgcatggtc ccctagggct gtaccttttg 420
agcttcattt cagttgccct ttggctgcca gctaccaggc accaggctca aggctcctgt 480
ggctgtcttg tcatgatatt gtttgcctct gaagtgaaaa tccatcacct ctcagaaaaa 540
attgcaaatt ataaagaagg gacttatgtc tacaaaacgc aaagtgaaaa atataccacc 600
tcattctggg tcattttctt ttgctttttt gttcattttc tgaatgggct cctaatacga 660
cttgctggat ttcagttccc ttttgcaaaa tctaaagacg cagaaacaac taatgtagct 720
gcagatctaa tgtactga 738
<210> 3
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Met Pro Ser Gln Gln Lys Lys Ile Ile Phe Cys Met Ala Gly Val Phe
1 5 10 15
Ser Phe Ala Cys Ala Leu Gly Val Val Thr Ala Leu Gly Thr Pro Leu
20 25 30
Trp Ile Lys Ala Thr Val Leu Cys Lys Thr Gly Ala Leu Leu Val Asn
35 40 45
Ala Ser Gly Gln Glu Leu Asp Lys Phe Met Gly Glu Met Gln Tyr Gly
50 55 60
Leu Phe His Gly Glu Gly Val Arg Gln Cys Gly Leu Gly Ala Arg Pro
65 70 75 80
Phe Arg Phe Ser Phe Phe Pro Asp Leu Leu Lys Ala Ile Pro Val Ser
85 90 95
Ile His Val Asn Val Ile Leu Phe Ser Ala Ile Leu Ile Val Leu Thr
100 105 110
Met Val Gly Thr Ala Phe Phe Met Tyr Asn Ala Phe Gly Lys Pro Phe
115 120 125
Glu Thr Leu His Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Phe Ile Ser
130 135 140
Gly Ser Cys Gly Cys Leu Val Met Ile Leu Phe Ala Ser Glu Val Lys
145 150 155 160
Ile His His Leu Ser Glu Lys Ile Ala Asn Tyr Lys Glu Gly Thr Tyr
165 170 175
Val Tyr Lys Thr Gln Ser Glu Lys Tyr Thr Thr Ser Phe Trp Val Ile
180 185 190
Phe Phe Cys Phe Phe Val His Phe Leu Asn Gly Leu Leu Ile Arg Leu
195 200 205
Ala Gly Phe Gln Phe Pro Phe Ala Lys Ser Lys Asp Ala Glu Thr Thr
210 215 220
Asn Val Ala Ala Asp Leu Met Tyr
225 230
<210> 4
<211> 699
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
atgccaagcc aacagaagaa aatcattttt tgcatggccg gagtgttcag ttttgcatgt 60
gccctcggag ttgtgacagc cttggggaca ccgttgtgga tcaaagccac tgtcctctgc 120
aaaacgggag ctctgctcgt caatgcctca gggcaggagc tggacaagtt tatgggtgaa 180
atgcagtacg ggcttttcca cggagagggt gtgaggcagt gtgggttggg agcaaggccc 240
tttcggttct cattttttcc agatttgctc aaagcaatcc cagtgagcat ccacgtcaat 300
gtcattctct tctctgccat ccttattgtg ttaaccatgg tggggacagc cttcttcatg 360
tacaatgctt ttggaaaacc ttttgaaact ctgcatggtc ccctagggct gtaccttttg 420
agcttcattt caggctcctg tggctgtctt gtcatgatat tgtttgcctc tgaagtgaaa 480
atccatcacc tctcagaaaa aattgcaaat tataaagaag ggacttatgt ctacaaaacg 540
caaagtgaaa aatataccac ctcattctgg gtcattttct tttgcttttt tgttcatttt 600
ctgaatgggc tcctaatacg acttgctgga tttcagttcc cttttgcaaa atctaaagac 660
gcagaaacaa ctaatgtagc tgcagatcta atgtactga 699
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Met Gln Ala Leu Gln Gln Gln Pro Val Phe Pro Asp Leu Leu Lys Ala
1 5 10 15
Ile Pro Val Ser Ile His Val Asn Val Ile Leu Phe Ser Ala Ile Leu
20 25 30
Ile Val Leu Thr Met Val Gly Thr Ala Phe Phe Met Tyr Asn Ala Phe
35 40 45
Gly Lys Pro Phe Glu Thr Leu His Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Leu Leu
50 55 60
Ser Phe Ile Ser Gly Ser Cys Gly Cys Leu Val Met Ile Leu Phe Ala
65 70 75 80
Ser Glu Val Lys Ile His His Leu Ser Glu Lys Ile Ala Asn Tyr Lys
85 90 95
Glu Gly Thr Tyr Val Tyr Lys Thr Gln Ser Glu Lys Tyr Thr Thr Ser
100 105 110
Phe Trp Leu Thr Lys Gly His Ser
115 120
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
atgcaggccc tgcagcagca accagttttt ccagatttgc tcaaagcaat cccagtgagc 60
atccacgtca atgtcattct cttctctgcc atccttattg tgttaaccat ggtggggaca 120
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tga 363
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Met Pro Ser Gln Gln Lys Lys Ile Ile Phe Cys Met Ala Gly Val Phe
1 5 10 15
Ser Phe Ala Cys Ala Leu Gly Val Val Thr Ala Leu Gly Thr Pro Leu
20 25 30
Trp Ile Lys Ala Thr Val Leu Cys Lys Thr Gly Ala Leu Leu Val Asn
35 40 45
Ala Ser Gly Gln Glu Leu Asp Lys Phe Met Gly Glu Met Gln Tyr Gly
50 55 60
Leu Phe His Gly Glu Gly Val Arg Gln Cys Gly Leu Gly Ala Arg Pro
65 70 75 80
Phe Arg Phe Ser Cys Tyr Phe Leu Asp Pro Phe Met Gly Leu Pro Thr
85 90 95
Gly Val Pro His Leu Leu Ser Leu Pro Cys Ser Thr Ser Cys Arg Arg
100 105 110
Glu His Thr Ser Glu Arg Val Gln Glu Pro Ala Gly Cys Phe Ser Ala
115 120 125
Val Arg Ser Lys Leu His Ala Gly Pro Ala Ala Ala Thr Ser Phe Ser
130 135 140
Arg Phe Ala Gln Ser Asn Pro Ser Glu His Pro Arg Gln Cys His Ser
145 150 155 160
Leu Leu Cys His Pro Tyr Cys Val Asn His Gly Gly Asp Ser Leu Leu
165 170 175
His Val Gln Cys Phe Trp Lys Thr Phe
180 185
<210> 8
<211> 558
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
atgccaagcc aacagaagaa aatcattttt tgcatggccg gagtgttcag ttttgcatgt 60
gccctcggag ttgtgacagc cttggggaca ccgttgtgga tcaaagccac tgtcctctgc 120
aaaacgggag ctctgctcgt caatgcctca gggcaggagc tggacaagtt tatgggtgaa 180
atgcagtacg ggcttttcca cggagagggt gtgaggcagt gtgggttggg agcaaggccc 240
tttcggttct catgctattt tcttgacccc ttcatgggac tcccaacagg ggtaccccat 300
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<210> 9
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<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
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caattaggga gaagaagcag cagaaaagga gaaaagccaa gtatgagtga tgatgaggcc 120
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tcacaaaggt cttgtttttg aacctcgccc tcacagaagc cgtttctcat catgccaagc 300
caacagaaga aaatcatttt ttgcatggcc ggagtgttca gttttgcatg tgccctcgga 360
gttgtgacag ccttggggac accgttgtgg atcaaagcca ctgtcctctg caaaacggga 420
gctctgctcg tcaatgcctc agggcaggag ctggacaagt ttatgggtga aatgcagtac 480
gggcttttcc acggagaggg tgtgaggcag tgtgggttgg gagcaaggcc ctttcggttc 540
tcatgtaagt agcaattgca tttgagttat ttaatgcttt aggcagactc ttcccagtgt 600
tgcgaggaat tatatttgag aattttgccg tgtttactgc aggacttttt aaatcggtgt 660
gaaccatatg aaaaacctat gactctgagc aatttcttct tcctagtttt tattatttta 720
tacttgcttt ttattataat atagagttaa ttcattgtta cataattaag gtttttggaa 780
atattggcaa ttaagatgct taagtattaa tatttatgta aaaaattatg gagtcttttt 840
aaaaaagtaa acttggggaa ataggaaagc tgtaaagaat gatctttatg ctttttgttc 900
tttataaaaa gaaccaaggt catgggctcc gtatttaacc aggttgccac ctttctcatg 960
attttgtttc ctgctcccca ctccctccca ttattcctgc taagaccttt cctgctgcta 1020
aatattcagt tttcattttt aactaatttg gaatcatttg gctatagaaa tttaaaatga 1080
tctgctgtgc taactgggaa agaaatggat gcctatttag tatagaacat tttaaactga 1140
ttgacctgca aatcatgtag agaatatgag agagattttc ttgttgtgat ttttgtgaaa 1200
tggaagtgta atccacagta tttataacct gtttatctta agaagagaat ttttaaaaat 1260
taccatgtga ataggcaact cattaaatga aaattaatag gaagtcattt gttatatctc 1320
ttacaacaca cattcagaag ttattattat ttcagaaggg ctggtttgga acaaccttat 1380
gaagacacag tcagtaaatt actgcataaa tcactcttca ggaaaggagg ttaccaactg 1440
aagcatttaa aatgaattat tattttgccc aggttttttt tttctttcta gtataggtag 1500
aaggctaaat taattgaatt tattattaac atatgcagtg cctaattaaa tttcagtgct 1560
ggtctattta tatttctgca acattcctta tatcttctta gcagtcattg gacaccaacc 1620
ttcagctcac ataggttact aagtgatatg aattttcata gggctccaga aaatttccaa 1680
gaattggttg ttagcttttt aattgatgaa gtggatacca gttcttttca ctgaatggct 1740
tttattcatt aaggtaatgg ggctgttaga gttgcttagt tttcctgggg aaggggaagg 1800
aagaaaacaa agcagaatgt catgtgatat gcaactgtat taaaaaaccg aaaaggaaaa 1860
aagttgagag agatgattta accgtgagtc accggcagcc aaagcgtgag taaagcttct 1920
cacagatgaa tttagacaaa agcggagaag gtactggtga attttctgga gcctttacat 1980
tttctacagt gaaatggaga taaactttac tcatgccata ggacatgttt caaaacaata 2040
ataagatgtt ttctgaacac ttactacata ctaagcactt tatatgcttt gtctcattta 2100
atccttacac agccacattc ttctggggtt tagcgaatga tttttgtggt tgtgtcctat 2160
gcttgtcctg tctaaggatg aagttgttct aattgggtgc ccctcctttt gctttctgtg 2220
aggacttgca gaactggtgg ggtttaaaca gtaccctcac ttatctcaca gaatttcatt 2280
agctcccaga tacccctgac attctccccc tagcctagtg aagaaaatct tccatttact 2340
tgttcattct gcagtgacag ctccatcaat atacaataga ctatacatat taagtgtact 2400
gtatatacta tacatgttaa aaatctcatt cattttggtg aggcccagct aagaatactt 2460
acagtagagc tttttttttt ttcctaagca taaaagtatc tttttcaatg cagcatgaga 2520
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tttaaataaa cacccctctc agtgttaaaa ctttctaatc aacatgcctt tgggacacat 2640
tgcaccctca aagtttacac tcccattgca acgcagcttt gtggttcacg ttttttccat 2700
tcagaatgtc attaccctgt caatgatgtt tcatcaacgt ttgcttggat gagaatcctc 2760
tgatattctt cctgatagaa atgtataagc cctgttcata taaatgaata aaagatctaa 2820
ccttactttc tcagtagtgg cttccttgga gcaaaaagca gggacctcca gagagctcag 2880
gtggatgact cttttctgtt tcttccagag ctcaacttac aattagtgca caattcattt 2940
cccagaatgt cttctttctt attgtgcctt tagaaagtta ttaagcaaac atttgaattc 3000
acagaatctt accagtgtaa gaggaatgga aaaggtaact tatcaaggta acaatcactt 3060
cgtggccagt tttttcggct cactgcaact acccctcctg ggttcaagcg attctcctgc 3120
ctcagcctcc caagtagctg ggactacagg cgtgcaccac catgcccagc taattttttt 3180
tttgtatttt tagtaaagac agggtttcac catgtgggcc aggctggtct catggcaagt 3240
tttctttgtg ttgtcatgtt attatcaatt aataggaatt tatatttcag ttctgttagg 3300
tggataaaca ctattttgca tacctaaatg tttcatttat atcagcactg gccaataaaa 3360
atatactata agcaggccgg gtgcagtggc tcacgcctgt aatcccaact tttgggaggc 3420
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatata tatatatata tatatattac aagccacaag 3720
ccacatatgt acttttaaat gtcctagtag ccatattaga aaacaaaagt aaaaaggaat 3780
agatgaaatt aattttaatg atttttttaa acccaagata tccaaaatat tatcatttta 3840
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ttggaaatct agagtgtatt ttacatttac attacatcta attcagtcta gccacatttc 3960
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ttttttaatg aggagatttg aaattccatt tcaattgcca acctgcctct ttcaacttct 17460
aaaaacaaag taaaacaaaa caaaaacaca ctgggtccta tcaccccctc ttgctactac 17520
tattttatct ccattgccct gaattctttc caaacttctt tccacccagc tttgatttgt 17580
tttcagtcgg gtttattgag gcataattta cgtacagtaa aattcatcct tcttagattt 17640
agaggtctat gcattttgac taatgcatat tggcttataa tgactaccac aacaaagata 17700
tagaacacac ccatcactcc cgggttctcc ctgtcccttt tttggtccat ctcctctcct 17760
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cttctttctg cctttgtttc aatttggtaa caaccctcaa ttttaggaca ggctaaacct 20280
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cgtacagcct ggagaactgt gagccaatta aacctcatct ctttttaaat tacccagtct 21360
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aggttgtctg cttactcttt tgattgtttc ttttaccatg cagaagctcc taagtttaat 22680
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aaaaacaaat aatatctcta atatatccac acatttgttg ccagatttca gaaaactgag 45480
ctgcaatcgc tttcctaaaa cagtagtgta ttaaatgaac atctataaaa tgtatcaaca 45540
cacattttaa aaaatttgtt taaagtatac tcttaggcca ggcgtggtga ctcacacctg 45600
taattccagc acttcaggag gccaaggtgg gaagatcatt tgagttcagg agttcgagtt 45660
acagcctggg caataaagtg agaccctgtc actaacaaaa ttaaaaaata aaataaatat 45720
aaaatatagg ctttaaaaaa gcatagtctt attaaccatg tctgttggtc aaaatctgca 45780
aactctaaaa gaagaaaaga agaaaaaacc aagcttaggg tatttttcct cccgtgcctg 45840
agtcccaatt acattcacga cagtactttc aatgaacata attgttagga ccactgagga 45900
atcatgaaaa atgatctctg cttagtacat ttgatgcaaa atgacttatt aggggctgtt 45960
tttctagcta tagtgtctcg agtactaata tgcaattatg aaaattatat taaatctggg 46020
attatgacgg tatcactgta tcatcttggt cttgttctgg ctgtcaccaa gcatgaccca 46080
ggtcaacttt ttttttcccc tgaattaccc atcaaattga tctgcagctg actaaaggcc 46140
acagctgagc ctggaactga cccttccttc atcctcaacc tgctgtcctc cagaaagcac 46200
caaggaaaaa gcagagaatg acagcaaaca gatcactagg cctctgacca caggtgctga 46260
gtactcagca gccctcatat aataggtttg aaagtactcc ttaaaataaa acactgtttc 46320
cctttggaac tatttacaag gatgaaacaa ccgtatacct gagaaataac ttgctctggt 46380
gtcaattcgc tattcgccag cagacatcag aacacaccga gtttccagat gctggttttt 46440
ccccttaaat caggaaatac acctggacaa tttctagaag actacaattc agtctagcca 46500
caaaggggat tttttttttt tggtaacagg ctagagcccg gttctgtaag tctttagctg 46560
aaatggtcca gtacaaaagc actggaaatg agtgggctag gaggacaagg accgtctcct 46620
gcgtgaggag ttggttggag gtccccaagg ccaggtaccc cctgcactct tattggattc 46680
ctctctgtct tcttggagtt ttgaaaaact ccttcgaaca ccaggctttt ttctttagaa 46740
aacaagtctc caatcgttct ctgttccgta gaaagagaaa gaaaacctgg agcagctgct 46800
gaaaaatcta atgaggaact aagaggcaaa cccacca 46837
<210> 10
<211> 250
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 10
Met Pro Ser Gln Gln Lys Lys Ile Ile Phe Cys Met Ala Gly Val Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Cys Ala Leu Gly Val Val Thr Ala Val Gly Thr Pro Leu
20 25 30
Trp Val Lys Ala Thr Ile Leu Cys Lys Thr Gly Ala Leu Leu Val Asn
35 40 45
Ala Ser Gly Lys Glu Leu Asp Lys Phe Met Gly Glu Met Gln Tyr Gly
50 55 60
Leu Phe His Gly Glu Gly Val Arg Gln Cys Gly Leu Gly Ala Arg Pro
65 70 75 80
Phe Arg Phe Ser Ser Arg Ser Met Lys Glu Arg Tyr Ser Leu Tyr Glu
85 90 95
Asp Lys Gly Glu Thr Ala Val Phe Pro Asp Leu Val Gln Ala Ile Pro
100 105 110
Val Ser Ile His Ile Asn Ile Ile Leu Phe Ser Met Ile Leu Val Val
115 120 125
Leu Thr Met Val Gly Thr Ala Phe Phe Met Tyr Asn Ala Phe Gly Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Thr Leu His Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Leu Val Ser Phe
145 150 155 160
Ile Ser Gly Ser Cys Gly Cys Leu Val Met Ile Leu Phe Ala Ser Glu
165 170 175
Val Lys Val His Arg Leu Ser Glu Lys Ile Ala Asn Phe Lys Glu Gly
180 185 190
Thr Tyr Ala Tyr Arg Thr Gln Asn Glu Asn Tyr Thr Thr Ser Phe Trp
195 200 205
Val Val Phe Ile Cys Phe Phe Val His Phe Leu Asn Gly Leu Leu Ile
210 215 220
Arg Leu Ala Gly Phe Gln Phe Pro Phe Thr Lys Ser Lys Glu Thr Glu
225 230 235 240
Thr Thr Asn Val Ala Ser Asp Leu Met Tyr
245 250
<210> 11
<211> 232
<212> PRT
<213> 灰狼(Canis lupus)
<400> 11
Met Pro Asn Gln Gln Lys Lys Val Val Phe Cys Thr Ala Gly Val Leu
1 5 10 15
Ser Phe Val Cys Ala Leu Gly Val Val Thr Ala Leu Gly Thr Pro Leu
20 25 30
Trp Ile Lys Ala Thr Phe Leu Cys Lys Thr Gly Ala Leu Leu Val Asn
35 40 45
Ala Ser Gly Gln Glu Leu Asp Lys Phe Met Gly Glu Met Gln Tyr Gly
50 55 60
Leu Phe His Gly Glu Gly Ile Arg Gln Cys Gly Leu Gly Ala Arg Pro
65 70 75 80
Phe Arg Phe Ser Leu Phe Pro Asp Leu Leu Lys Val Ile Pro Val Ser
85 90 95
Ile His Val Asn Val Ile Leu Phe Ser Thr Ile Leu Val Val Leu Thr
100 105 110
Met Val Gly Thr Ala Phe Phe Met Tyr Asn Ala Phe Gly Lys Pro Phe
115 120 125
Glu Thr Leu His Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Phe Ile Ser
130 135 140
Gly Ser Cys Gly Cys Leu Val Met Ile Leu Phe Ala Ser Glu Val Lys
145 150 155 160
Ile His His Leu Ser Glu Lys Ile Ala Asn Tyr Lys Glu Gly Thr Tyr
165 170 175
Ala Tyr Lys Thr Gln Ser Glu Lys Tyr Thr Thr Ser Phe Trp Val Val
180 185 190
Phe Ile Cys Phe Leu Val His Leu Leu Asn Gly Leu Leu Ile Arg Leu
195 200 205
Ala Gly Phe Gln Phe Pro Phe Ala Lys Ser Lys Asp Thr Glu Thr Thr
210 215 220
Asn Val Ala Ala Asp Leu Met Tyr
225 230
<210> 12
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 5'非翻译区
<400> 12
aggagatact tgaaggcagt ttgaaagact tgttttacag attcttagtc caaagatttc 60
caattaggga gaagaagcag cagaaaagga gaaaagccaa gtatgagtga tgatgaggcc 120
ttcatctact gacatttaac ctggcgagaa ccgtcgatgg tgaagttgcc ttttcagctg 180
ggagctgtcc gttcagcttc cgtaataaat gcagtcaaag aggcagtccc ttcccattgc 240
tcacaaaggt cttgtttttg aacctcgccc tcacagaagc cgtttctcat c 291
<210> 13
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 5'反向末端重复序列
<400> 13
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 14
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 3'反向末端重复序列
<400> 14
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgcag g 141
<210> 15
<211> 1773
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 5'非翻译区
<400> 15
aaggcaaacc tttctataat tttacaaggg agtagacttg ctttggtcac ttttagatgt 60
ggttaatttt gcatatcctt ttagtctgca tatattaaag catcaggacc cttcgtgaca 120
atgtttacaa attacgtact aaggatacag gctggaaagt aagggaagca gaaggaaggc 180
tttgaaaagt tgttttatct ggtgggaaat tgcttgaccc aggtagtcaa aggcagttga 240
ctagaatcga caaattgtta ctccatatat atatatgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 300
gtgtaagatg tcttcctatc aaaaagatat caaaggcaca tggaatatat tttaataaaa 360
acaaataata tctctaatat atccacacat ttgttgccag atttcagaaa actgagctgc 420
aatcgctttc ctaaaacagt agtgtattaa atgaacatct ataaaatgta tcaacacaca 480
ttttaaaaaa tttgtttaaa gtatactctt aggccaggcg tggtgactca cacctgtaat 540
tccagcactt caggaggcca aggtgggaag atcatttgag ttcaggagtt cgagttacag 600
cctgggcaat aaagtgagac cctgtcacta acaaaattaa aaaataaaat aaatataaaa 660
tataggcttt aaaaaagcat agtcttatta accatgtctg ttggtcaaaa tctgcaaact 720
ctaaaagaag aaaagaagaa aaaaccaagc ttagggtatt tttcctcccg tgcctgagtc 780
ccaattacat tcacgacagt actttcaatg aacataattg ttaggaccac tgaggaatca 840
tgaaaaatga tctctgctta gtacatttga tgcaaaatga cttattaggg gctgtttttc 900
tagctatagt gtctcgagta ctaatatgca attatgaaaa ttatattaaa tctgggatta 960
tgacggtatc actgtatcat cttggtcttg ttctggctgt caccaagcat gacccaggtc 1020
aacttttttt ttcccctgaa ttacccatca aattgatctg cagctgacta aaggccacag 1080
ctgagcctgg aactgaccct tccttcatcc tcaacctgct gtcctccaga aagcaccaag 1140
gaaaaagcag agaatgacag caaacagatc actaggcctc tgaccacagg tgctgagtac 1200
tcagcagccc tcatataata ggtttgaaag tactccttaa aataaaacac tgtttccctt 1260
tggaactatt tacaaggatg aaacaaccgt atacctgaga aataacttgc tctggtgtca 1320
attcgctatt cgccagcaga catcagaaca caccgagttt ccagatgctg gtttttcccc 1380
ttaaatcagg aaatacacct ggacaatttc tagaagacta caattcagtc tagccacaaa 1440
ggggattttt tttttttggt aacaggctag agcccggttc tgtaagtctt tagctgaaat 1500
ggtccagtac aaaagcactg gaaatgagtg ggctaggagg acaaggaccg tctcctgcgt 1560
gaggagttgg ttggaggtcc ccaaggccag gtaccccctg cactcttatt ggattcctct 1620
ctgtcttctt ggagttttga aaaactcctt cgaacaccag gcttttttct ttagaaaaca 1680
agtctccaat cgttctctgt tccgtagaaa gagaaagaaa acctggagca gctgctgaaa 1740
aatctaatga ggaactaaga ggcaaaccca cca 1773
<210> 16
<211> 1013
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 嵌合内含子
<400> 16
ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc 60
cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 120
ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 180
cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 240
gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc 300
gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 360
gtgccccgcg gtgcgggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt 420
gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc 480
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg gggcgtggcg 540
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 600
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 660
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 720
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 780
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 840
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 900
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 960
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cag 1013
<210> 17
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> CMV增强子
<400> 17
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg 380
<210> 18
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> CBA启动子
<400> 18
tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60
ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120
cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg 180
gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg 240
cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcg 276
<210> 19
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> tGFP
<400> 19
Met Glu Ser Asp Glu Ser Gly Leu Pro Ala Met Glu Ile Glu Cys Arg
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Leu Asn Gly Val Glu Phe Glu Leu Val Gly Gly Gly
20 25 30
Glu Gly Thr Pro Glu Gln Gly Arg Met Thr Asn Lys Met Lys Ser Thr
35 40 45
Lys Gly Ala Leu Thr Phe Ser Pro Tyr Leu Leu Ser His Val Met Gly
50 55 60
Tyr Gly Phe Tyr His Phe Gly Thr Tyr Pro Ser Gly Tyr Glu Asn Pro
65 70 75 80
Phe Leu His Ala Ile Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Asn Thr Arg Ile Glu
85 90 95
Lys Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu His Val Ser Phe Ser Tyr Arg Tyr
100 105 110
Glu Ala Gly Arg Val Ile Gly Asp Phe Lys Val Met Gly Thr Gly Phe
115 120 125
Pro Glu Asp Ser Val Ile Phe Thr Asp Lys Ile Ile Arg Ser Asn Ala
130 135 140
Thr Val Glu His Leu His Pro Met Gly Asp Asn Asp Leu Asp Gly Ser
145 150 155 160
Phe Thr Arg Thr Phe Ser Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Val
165 170 175
Val Asp Ser His Met His Phe Lys Ser Ala Ile His Pro Ser Ile Leu
180 185 190
Gln Asn Gly Gly Pro Met Phe Ala Phe Arg Arg Val Glu Glu Asp His
195 200 205
Ser Asn Thr Glu Leu Gly Ile Val Glu Tyr Gln His Ala Phe Lys Thr
210 215 220
Pro Asp Ala Asp Ala Gly Glu Glu
225 230
<210> 20
<211> 225
<212> DNA
<213> 黄牛(Bos taurus)
<400> 20
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
aaataaaata cgaaatg 17
<210> 22
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 剪接供体
<400> 22
gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60
cagagaagac tcttgcgttt ct 82
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 剪接接受体
<400> 23
gataggcacc tattggtctt actgacatcc actttgcctt tctctccaca g 51
<210> 24
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 3'反向末端重复序列
<400> 24
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc t 141
<210> 25
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> ITR
<400> 25
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60
cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 26
<211> 245
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> sh嵌合内含子
<400> 26
ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc 60
cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 120
ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 180
cttgaggggc tccgggagct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc 240
tacag 245
<210> 27
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 3'UTR 600A
<400> 27
aaggcaaacc tttctataat tttacaaggg agtagacttg ctttggtcac ttttagatgt 60
ggttaatttt gcatatcctt ttagtctgca tatattaaag catcaggacc cttcgtgaca 120
atgtttacaa attacgtact aaggatacag gctggaaagt aagggaagca gaaggaaggc 180
tttgaaaagt tgttttatct ggtgggaaat tgcttgaccc aggtagtcaa aggcagttga 240
ctagaatcga caaattgtta ctccatatat atatatgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 300
gtgtaagatg tcttcctatc aaaaagatat caaaggcaca tggaatatat tttaataaaa 360
acaaataata tctctaatat atccacacat ttgttgccag atttcagaaa actgagctgc 420
aatcgctttc ctaaaacagt agtgtattaa atgaacatct ataaaatgta tcaacacaca 480
ttttaaaaaa tttgtttaaa gtatactctt aggccaggcg tggtgactca cacctgtaat 540
tccagcactt caggaggcca aggtgggaag atcatttgag ttcaggagtt cgagttacag 600
<210> 28
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 3'UTR 600B
<400> 28
gaagatcatt tgagttcagg agttcgagtt acagcctggg caataaagtg agaccctgtc 60
actaacaaaa ttaaaaaata aaataaatat aaaatatagg ctttaaaaaa gcatagtctt 120
attaaccatg tctgttggtc aaaatctgca aactctaaaa gaagaaaaga agaaaaaacc 180
aacgttaggg tatttttcct cccgtgcctg agtcccaatt acattcacga cagtactttc 240
aatgaacata attgttagga ccactgagga atcatgaaaa atgatctctg cttagtacat 300
ttgatgcaaa atgacttatt aggggctgtt tttctagcta tagtgtctcg agtactaata 360
tgcaattatg aaaattatat taaatctggg attatgacgg tatcactgta tcatcttggt 420
cttgttctgg ctgtcaccaa gcatgaccca ggtcaacttt ttttttcccc tgaattaccc 480
atcaaattga tctgcagctg actaaaggcc acagctgagc ctggaactga cccttccttc 540
atcctcaacc tgctgtcctc cagaaagcac caaggaaaaa gcagagaatg acagcaaaca 600
<210> 29
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 3'UTR 600C
<400> 29
aggcctctga ccacaggtgc tgagtactca gcagccctca tataataggt ttgaaagtac 60
tccttaaaat aaaacactgt ttccctttgg aactatttac aaggatgaaa caaccgtata 120
cctgagaaat aacttgctct ggtgtcaatt cgctattcgc cagcagacat cagaacacac 180
cgagtttcca gatgctggtt tttcccctta aatcaggaaa tacacctgga caatttctag 240
aagactacaa ttcagtctag ccacaaaggg gatttttttt ttttggtaac aggctagagc 300
ccggttctgt aagtctttag ctgaaatggt ccagtacaaa agcactggaa atgagtgggc 360
taggaggaca aggaccgtct cctgcgtgag gagttggttg gaggtcccca aggccaggta 420
ccccctgcac tcttattgga ttcctctctg tcttcttgga gttttgaaaa actccttcga 480
acaccaggct tttttcttta gaaaacaagt ctccaatcgt tctctgttcc gtagaaagag 540
aaagaaaacc tggagcagct gctgaaaaat ctaatgagga actaagaggc aaacccacca 600
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> FP
<400> 30
Lys Arg Lys Arg Arg Gly
1 5
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> T2A
<400> 31
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 32
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 增强型GFP
<400> 32
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> Myc标签序列
<400> 33
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Asp Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
20 25 30
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> HA标签序列
<400> 34
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 35
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> FLAG标签序列
<400> 35
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
<210> 36
<211> 1357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 3'UTR 1357
<400> 36
aaggcaaacc tttctataat tttacaaggg agtagacttg ctttggtcac ttttagatgt 60
ggttaatttt gcatatcctt ttagtctgca tatattaaag catcaggacc cttcgtgaca 120
atgtttacaa attacgtact aaggatacag gctggaaagt aagggaagca gaaggaaggc 180
tttgaaaagt tgttttatct ggtgggaaat tgcttgaccc aggtagtcaa aggcagttga 240
ctagaatcga caaattgtta ctccatatat atatatgtgt gtgtgtgtgt gtaagatgtc 300
ttcctatcaa aaagatatca aaggcacatg gaatatattt taataaaaac aaataatatc 360
tctaatatat ccacacattt gttgccagat ttcagaaaac tgagctgcaa tcgctttcct 420
aaaacagtag tgtattaaat gaacatctat aaaatgtatc aacacacatt ttaaaaaatt 480
tgtttaaagt atactcttag gccaggcgtg gtgactcaca cctgtaattc cagcacttca 540
ggaggccaag gtgggaagat catttgagtt caggagttcg agttacagtc tgggcaataa 600
agtgagaccc tgtcactaac aaaattaaaa aataaaataa atataaaata taggctttaa 660
aaaagcatag tcttattaac catgtctgtt ggtcaaaatc tgcaaactct aaaagaagaa 720
aagaagaaaa aaccaacgtt agggtatttt tcctcccgtg cctgagtccc aattacattc 780
acgacagtac tttcaatgaa cataattgtt aggaccactg aggaatcatg aaaaatgatc 840
tctgcttagt acatttgatg caaaatgact tattaggggc tgtttttcta gctatagtgt 900
ctcgagtact aatatgcaat tatgaaaatt atattaaatc tgggattatg acggtatcac 960
tgtatcatct tggtcttgtt ctggctgtca ccaagcatga cccaggtcaa cttttttttt 1020
cccctgaatt acccatcaaa ttgatctgca gctgactaaa ggccacagct gagcctggaa 1080
ctgacccttc cttcatcctc aacctgctgt cctccagaaa gcaccaagga aaaagcagag 1140
aatgacagca aacagatcac taggcctctg accacaggtg ctgagtactc agcagccctc 1200
atataatagg tttgaaagta ctccttaaaa taaaacactg tttccctttg gaactattta 1260
caaggatgaa acaaccgtat acctgagaaa taacttgctc tggtgtcaat tcgctattcg 1320
ccagcagaca tcagaacaca ccgagtttcc agatgct 1357
<210> 37
<211> 1406
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> 3'UTR 1406
<400> 37
aaggcaaacc tttctataat tttacaaggg agtagacttg ctttggtcac ttttagatgt 60
ggttaatttt gcatatcctt ttagtctgca tatattaaag catcaggacc cttcgtgaca 120
atgtttacaa attacgtact aaggatacag gctggaaagt aagggaagca gaaggaaggc 180
tttgaaaagt tgttttatct ggtgggaaat tgcttgaccc aggtagtcaa aggcagttga 240
ctagaatcga caaattgtta ctccatatat atatatatgt gtgtgtgtgt gtaagatgtc 300
ttcctatcaa aaagatatca aaggcacatg gaatatattt taataaaaac aaataatatc 360
tctaatatat ccacacattt gttgccagat ttcagaaaac tgagctgcaa tcgctttcct 420
aaaacagtag tgtattaaat gaacatctat aaaatgtatc aacacacatt ttaaaaaatt 480
tgtttaaagt atactcttag gccaggcgtg gtgactcaca cctgtaattc cagcacttca 540
ggaggccaag gtgggaagat catttgagtt caggagttcg agttacagcc tgggcaataa 600
agtgagaccc tgtcactaac aaaattaaaa aataaaataa atataaaata taggctttaa 660
aaaagcatag tcttattaac catgtctgtt ggtcaaaatc tgcaaactct aaaagaagaa 720
aagaagaaaa aaccaacgtt agggtatttt tcctcccgtg cctgagtccc aattacattc 780
acgacagtac tttcaatgaa cataattgtt aggaccactg aggaatcatg aaaaatgatc 840
tctgcttagt acatttgatg caaaatgact tattaggggc tgtttttcta gctatagtgt 900
ctcgagtact aatatgcaat tatgaaaatt atattaaatc tgggattatg acggtatcac 960
tgtatcatct tggtcttgtt ctggctgtca ccaagcatga cccaggtcaa cttttttttt 1020
cccctgaatt acccatcaaa ttgatctgca gctgactaaa ggccacagct gagcctggaa 1080
ctgacccttc cttcatcctc aacctgctgt cctccagaaa gcaccaagga aaaagcagag 1140
aatgacagca aacagatcac taggcctctg accacaggtg ctgagtactc agcagccctc 1200
atataatagg tttgaaagta ctccttaaaa taaaacactg tttccctttg gaactattta 1260
caaggatgaa acaaccgtat acctgagaaa taacttgctc tggtgtcaat tcgctattcg 1320
ccagcagaca tcagaacaca ccgagtttcc agatgctggt ttttcccctt aaatcaggaa 1380
atacacctgg acaatttcta gaagac 1406
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> CLRN1抗体表位
<400> 38
Glu Lys Ile Ala Asn Tyr Lys Glu Gly Thr Tyr Val Tyr Lys Thr Gln
1 5 10 15
Ser Glu Lys Tyr
20
<210> 39
<211> 4732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> CLRN-0载体
<400> 39
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgtgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 180
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggac tatttacggt 360
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catgggtcga ggtgagcccc 540
acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 600
attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 660
ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 720
gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 780
aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgttgcct tcgccccgtg ccccgctccg 840
cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg 900
gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggctcgtttc 960
ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttaaagg gctccgggag ggccctttgt gcggggggga 1020
gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggcccgcgct 1080
gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcgtgtgcgc 1140
gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg gggctgcgag gggaacaaag 1200
gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc 1260
tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg 1320
gggctccgtg cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg 1380
ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc 1440
ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg 1500
taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct 1560
gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg 1620
aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc 1680
cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg 1740
ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc 1800
ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgaccggtgc caccatgcct 1860
agccagcaga agaaaatcat cttctgcatg gccggcgtgt tcagcttcgc ctgtgctctg 1920
ggagttgtga cagccctggg aacccctctg tggatcaaag ccacagtgct gtgcaagaca 1980
ggcgccctgc tggttaatgc ctctggccaa gagctggaca agttcatggg cgagatgcag 2040
tacggcctgt tccatggcga aggcgtcaga cagtgtggcc tgggagccag acctttcaga 2100
ttcagcttct tcccagacct gctgaaggct atccccgtgt ccatccacgt gaacgtgatc 2160
ctgttcagcg ccatcctgat cgtgctgaca atggtcggaa ccgccttctt catgtacaac 2220
gccttcggca agcccttcga gacactgcat ggacctctgg gcctgtacct gctgagcttt 2280
atcagcggca gctgtggctg cctggtcatg attctgttcg ccagcgaagt gaagatccac 2340
cacctgagcg agaagatcgc caactacaaa gagggcacct acgtctacaa gacccagtcc 2400
gagaagtaca ccaccagctt ttgggttatc ttcttctgtt tcttcgtgca cttcctgaac 2460
ggcctgctga tcagactggc cggcttccag tttccattcg ccaagagcaa ggacgccgaa 2520
accacaaacg tggccgccga tctgatgtac taagagctca aggcaaacct ttctataatt 2580
ttacaaggga gtagacttgc tttggtcact tttagatgtg gttaattttg catatccttt 2640
tagtctgcat atattaaagc atcaggaccc ttcgtgacaa tgtttacaaa ttacgtacta 2700
aggatacagg ctggaaagta agggaagcag aaggaaggct ttgaaaagtt gttttatctg 2760
gtgggaaatt gcttgaccca ggtagtcaaa ggcagttgac tagaatcgac aaattgttac 2820
tccatatata tatatgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtaagatgt cttcctatca 2880
aaaagatatc aaaggcacat ggaatatatt ttaataaaaa caaataatat ctctaatata 2940
tccacacatt tgttgccaga tttcagaaaa ctgagctgca atcgctttcc taaaacagta 3000
gtgtattaaa tgaacatcta taaaatgtat caacacacat tttaaaaaat ttgtttaaag 3060
tatactctta ggccaggcgt ggtgactcac acctgtaatt ccagcacttc aggaggccaa 3120
ggtgggaaga tcatttgagt tcaggagttc gagttacagc ctgggcaata aagtgagacc 3180
ctgtcactaa caaaattaaa aaataaaata aatataaaat ataggcttta aaaaagcata 3240
gtcttattaa ccatgtctgt tggtcaaaat ctgcaaactc taaaagaaga aaagaagaaa 3300
aaaccaacgt tagggtattt ttcctcccgt gcctgagtcc caattacatt cacgacagta 3360
ctttcaatga acataattgt taggaccact gaggaatcat gaaaaatgat ctctgcttag 3420
tacatttgat gcaaaatgac ttattagggg ctgtttttct agctatagtg tctcgagtac 3480
taatatgcaa ttatgaaaat tatattaaat ctgggattat gacggtatca ctgtatcatc 3540
ttggtcttgt tctggctgtc accaagcatg acccaggtca actttttttt tcccctgaat 3600
tacccatcaa attgatctgc agctgactaa aggccacagc tgagcctgga actgaccctt 3660
ccttcatcct caacctgctg tcctccagaa agcaccaagg aaaaagcaga gaatgacagc 3720
aaacagatca ctaggcctct gaccacaggt gctgagtact cagcagccct catataatag 3780
gtttgaaagt actccttaaa ataaaacact gtttcccttt ggaactattt acaaggatga 3840
aacaaccgta tacctgagaa ataacttgct ctggtgtcaa ttcgctattc gccagcagac 3900
atcagaacac accgagtttc cagatgctgg tttttcccct taaatcagga aatacacctg 3960
gacaatttct agaagactac aattcagtct agccacaaag gggatttttt ttttttggta 4020
acaggctaga gcccggttct gtaagtcttt agctgaaatg gtccagtaca aaagcactgg 4080
aaatgagtgg gctaggagga caaggaccgt ctcctgcgtg aggagttggt tggaggtccc 4140
caaggccagg taccccctgc actcttattg gattcctctc tgtcttcttg gagttttgaa 4200
aaactccttc gaacaccagg cttttttctt tagaaaacaa gtctccaatc gttctctgtt 4260
ccgtagaaag agaaagaaaa cctggagcag ctgctgaaaa atctaatgag gaactaagag 4320
gcaaacccac cactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc 4380
cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg 4440
catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca 4500
agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggaag 4560
cttgaattca gctgacgtgc ctcggaccgc taggaacccc tagtgatgga gttggccact 4620
ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg 4680
ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca gg 4732
<210> 40
<211> 3397
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> CLRN-1载体
<400> 40
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgtgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 180
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggac tatttacggt 360
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catgggtcga ggtgagcccc 540
acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 600
attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 660
ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 720
gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 780
aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgttgcct tcgccccgtg ccccgctccg 840
cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg 900
gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggctcgtttc 960
ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttaaagg gctccgggag ggccctttgt gcggggggga 1020
gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggcccgcgct 1080
gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcgtgtgcgc 1140
gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg gggctgcgag gggaacaaag 1200
gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc 1260
tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg 1320
gggctccgtg cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg 1380
ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc 1440
ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg 1500
taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct 1560
gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg 1620
aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc 1680
cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg 1740
ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc 1800
ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgaccggtgc caccatgcct 1860
agccagcaga agaaaatcat cttctgcatg gccggcgtgt tcagcttcgc ctgtgctctg 1920
ggagttgtga cagccctggg aacccctctg tggatcaaag ccacagtgct gtgcaagaca 1980
ggcgccctgc tggttaatgc ctctggccaa gagctggaca agttcatggg cgagatgcag 2040
tacggcctgt tccatggcga aggcgtcaga cagtgtggcc tgggagccag acctttcaga 2100
ttcagcttct tcccagacct gctgaaggct atccccgtgt ccatccacgt gaacgtgatc 2160
ctgttcagcg ccatcctgat cgtgctgaca atggtcggaa ccgccttctt catgtacaac 2220
gccttcggca agcccttcga gacactgcat ggacctctgg gcctgtacct gctgagcttt 2280
atcagcggca gctgtggctg cctggtcatg attctgttcg ccagcgaagt gaagatccac 2340
cacctgagcg agaagatcgc caactacaaa gagggcacct acgtctacaa gacccagtcc 2400
gagaagtaca ccaccagctt ttgggttatc ttcttctgtt tcttcgtgca cttcctgaac 2460
ggcctgctga tcagactggc cggcttccag tttccattcg ccaagagcaa ggacgccgaa 2520
accacaaacg tggccgccga tctgatgtac ggcagcggag aaggcagagg cagcctgctt 2580
acatgtggcg acgtggaaga gaaccccgga cctatgcagg ctctgcagca gcagccagtg 2640
ttccccgatc tgctgaaagc cattcctgtc agcatccatg tcaacgtcat cctcttctct 2700
gccatcctca ttgtcctcac tatggttgga acggcctttt ttatgtataa tgcctttggg 2760
aagccgtttg aaaccctgca cggacccctg ggactctatc tcctgagctt catctccggc 2820
tcttgcggct gcctcgtgat gatcctcttt gcctctgaag tcaaaattca ccacctgtct 2880
gagaaaattg ctaattacaa agaagggaca tacgtttaca aaacgcagag cgaaaagtat 2940
acgaccagct tctggctgac caagggccac tcttaagagc tcgctgatca gcctcgactg 3000
tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 3060
aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 3120
gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 3180
aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggaagcttga attcagctga 3240
cgtgcctcgg accgctagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct 3300
cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg 3360
gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcagg 3397
<210> 41
<211> 4177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> CLRN-2eGFP载体
<400> 41
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgtgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 180
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggac tatttacggt 360
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catgggtcga ggtgagcccc 540
acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 600
attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 660
ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 720
gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 780
aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgttgcct tcgccccgtg ccccgctccg 840
cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg 900
gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggctcgtttc 960
ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttaaagg gctccgggag ggccctttgt gcggggggga 1020
gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggcccgcgct 1080
gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcgtgtgcgc 1140
gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg gggctgcgag gggaacaaag 1200
gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc 1260
tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg 1320
gggctccgtg cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg 1380
ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc 1440
ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg 1500
taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct 1560
gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg 1620
aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc 1680
cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg 1740
ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc 1800
ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgaccggtgc caccatgcct 1860
agccagcaga agaaaatcat cttctgcatg gccggcgtgt tcagcttcgc ctgtgctctg 1920
ggagttgtga cagccctggg aacccctctg tggatcaaag ccacagtgct gtgcaagaca 1980
ggcgccctgc tggttaatgc ctctggccaa gagctggaca agttcatggg cgagatgcag 2040
tacggcctgt tccatggcga aggcgtcaga cagtgtggcc tgggagccag acctttcaga 2100
ttcagcttct tcccagacct gctgaaggct atccccgtgt ccatccacgt gaacgtgatc 2160
ctgttcagcg ccatcctgat cgtgctgaca atggtcggaa ccgccttctt catgtacaac 2220
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<210> 42
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<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> CLRN-3
<400> 42
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tcctcccgtg cctgagtccc aattacattc acgacagtac tttcaatgaa cataattgtt 3660
aggaccactg aggaatcatg aaaaatgatc tctgcttagt acatttgatg caaaatgact 3720
tattaggggc tgtttttcta gctatagtgt ctcgagtact aatatgcaat tatgaaaatt 3780
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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<223> CLRN-6eGFP载体
<400> 44
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<220>
<223> CLRN-8载体
<400> 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> CLRN-13载体
<400> 55
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<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> CLRN-14载体
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<212> DNA
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<220>
<223> CLRN-15载体
<400> 57
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aaaaccttcg gcagcgacta caaggaccac gacggcgatt ataaggatca cgatatcgat 2460
tacaaggacg atgacgacaa gtaagagctc aaggcaaacc tttctataat tttacaaggg 2520
agtagacttg ctttggtcac ttttagatgt ggttaatttt gcatatcctt ttagtctgca 2580
tatattaaag catcaggacc cttcgtgaca atgtttacaa attacgtact aaggatacag 2640
gctggaaagt aagggaagca gaaggaaggc tttgaaaagt tgttttatct ggtgggaaat 2700
tgcttgaccc aggtagtcaa aggcagttga ctagaatcga caaattgtta ctccatatat 2760
atatatgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtaagatg tcttcctatc aaaaagatat 2820
caaaggcaca tggaatatat tttaataaaa acaaataata tctctaatat atccacacat 2880
ttgttgccag atttcagaaa actgagctgc aatcgctttc ctaaaacagt agtgtattaa 2940
atgaacatct ataaaatgta tcaacacaca ttttaaaaaa tttgtttaaa gtatactctt 3000
aggccaggcg tggtgactca cacctgtaat tccagcactt caggaggcca aggtgggaag 3060
atcatttgag ttcaggagtt cgagttacag gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt 3120
gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 3180
ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 3240
ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 3300
ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg aagcttgaat tcagctgacg tgcctcggac 3360
cgctaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact 3420
gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 3480
gagcgagcgc gcagctgcct gcagg 3505
<210> 58
<211> 3439
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> CLRN-16载体
<400> 58
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgtgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 180
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggac tatttacggt 360
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catgggtcga ggtgagcccc 540
acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 600
attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 660
ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 720
gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 780
aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgttgcct tcgccccgtg ccccgctccg 840
cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg 900
gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggctcgtttc 960
ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttaaagg gctccgggag ggccctttgt gcggggggga 1020
gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggcccgcgct 1080
gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcgtgtgcgc 1140
gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg gggctgcgag gggaacaaag 1200
gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc 1260
tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg 1320
gggctccgtg cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg 1380
ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc 1440
ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg 1500
taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct 1560
gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg 1620
aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc 1680
cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg 1740
ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc 1800
ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgaccggtgc caccatgcct 1860
agccagcaga agaaaatcat cttctgcatg gccggcgtgt tcagcttcgc ctgtgctctg 1920
ggagttgtga cagccctggg aacccctctg tggatcaaag ccacagtgct gtgcaagaca 1980
ggcgccctgc tggttaatgc ctctggccaa gagctggaca agttcatggg cgagatgcag 2040
tacggcctgt tccatggcga aggcgtcaga cagtgtggcc tgggagccag acctttccgg 2100
ttcagctgct actttctgga ccccttcatg ggcctgccta ccggcgttcc acatctgctg 2160
tctctgcctt gcagcaccag ctgcagaaga gagcacacca gcgagagagt gcaagagcct 2220
gccggctgtt tttctgccgt gcggtctaaa ctgcacgccg gacctgctgc cgccaccagc 2280
ttttctagat tcgcccagag caaccccagc gagcacccta gacagtgtca cagcctgctg 2340
tgtcacccct actgtgtgaa tcacggcggc gattctctgc tgcatgtgca gtgcttttgg 2400
aaaaccttcg gcagctaaga gctcaaggca aacctttcta taattttaca agggagtaga 2460
cttgctttgg tcacttttag atgtggttaa ttttgcatat ccttttagtc tgcatatatt 2520
aaagcatcag gacccttcgt gacaatgttt acaaattacg tactaaggat acaggctgga 2580
aagtaaggga agcagaagga aggctttgaa aagttgtttt atctggtggg aaattgcttg 2640
acccaggtag tcaaaggcag ttgactagaa tcgacaaatt gttactccat atatatatat 2700
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtaa gatgtcttcc tatcaaaaag atatcaaagg 2760
cacatggaat atattttaat aaaaacaaat aatatctcta atatatccac acatttgttg 2820
ccagatttca gaaaactgag ctgcaatcgc tttcctaaaa cagtagtgta ttaaatgaac 2880
atctataaaa tgtatcaaca cacattttaa aaaatttgtt taaagtatac tcttaggcca 2940
ggcgtggtga ctcacacctg taattccagc acttcaggag gccaaggtgg gaagatcatt 3000
tgagttcagg agttcgagtt acaggctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc 3060
catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 3120
tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 3180
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gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc 3360
gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 3420
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<210> 59
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> CLRN-17载体
<400> 59
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct 130
<210> 60
<211> 4277
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> CLRN-18载体
<400> 60
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgtgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 180
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggac tatttacggt 360
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catgggtcga ggtgagcccc 540
acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 600
attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 660
ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 720
gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 780
aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgttgcct tcgccccgtg ccccgctccg 840
cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg 900
gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc 960
ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttgaggg gctccgggag ctagagcctc tgctaaccat 1020
gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct 1080
catcattttg gcaaagagga gatacttgaa ggcagtttga aagacttgtt ttacagattc 1140
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gagtgatgat gaggccttca tctactgaca tttaacctgg cgagaaccgt cgatggtgaa 1260
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tctcatcacc ggtgccacca tgcctagcca gcagaagaaa atcatcttct gcatggccgg 1440
cgtgttcagc ttcgcctgtg ctctgggagt tgtgacagcc ctgggaaccc ctctgtggat 1500
caaagccaca gtgctgtgca agacaggcgc cctgctggtt aatgcctctg gccaagagct 1560
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ttgactagaa tcgacaaatt gttactccat atatatatat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 2400
gtgtgtgtaa gatgtcttcc tatcaaaaag atatcaaagg cacatggaat atattttaat 2460
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cacattttaa aaaatttgtt taaagtatac tcttaggcca ggcgtggtga ctcacacctg 2640
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aaaatatagg ctttaaaaaa gcatagtctt attaaccatg tctgttggtc aaaatctgca 2820
aactctaaaa gaagaaaaga agaaaaaacc aacgttaggg tatttttcct cccgtgcctg 2880
agtcccaatt acattcacga cagtactttc aatgaacata attgttagga ccactgagga 2940
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caaggaaaaa gcagagaatg acagcaaaca gatcactagg cctctgacca caggtgctga 3300
gtactcagca gccctcatat aataggtttg aaagtactcc ttaaaataaa acactgtttc 3360
cctttggaac tatttacaag gatgaaacaa ccgtatacct gagaaataac ttgctctggt 3420
gtcaattcgc tattcgccag cagacatcag aacacaccga gtttccagat gctggttttt 3480
ccccttaaat caggaaatac acctggacaa tttctagaag actacaattc agtctagcca 3540
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gcgtgaggag ttggttggag gtccccaagg ccaggtaccc cctgcactct tattggattc 3720
ctctctgtct tcttggagtt ttgaaaaact ccttcgaaca ccaggctttt ttctttagaa 3780
aacaagtctc caatcgttct ctgttccgta gaaagagaaa gaaaacctgg agcagctgct 3840
gaaaaatcta atgaggaact aagaggcaaa cccaccactg tgccttctag ttgccagcca 3900
tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc 3960
ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 4020
gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct 4080
ggggatgcgg tgggctctat ggaagcttga attcagctga cgtgcctcgg accgctagga 4140
acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 4200
gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 4260
gcgcagctgc ctgcagg 4277

Claims (228)

1.一种组合物，所述组合物包含至少两种不同核酸载体，其中：
所述至少两种不同载体中的每一者包含编码CLRN1蛋白的不同部分的编码序列，所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基，其中所编码部分中的每一者的氨基酸序列可任选地与所编码部分中的不同者的氨基酸序列部分重叠；
所述至少两种不同载体中没有单一载体编码全长CLRN1蛋白；
所述编码序列中的至少一者包含跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子，并且缺乏所述两个连续外显子之间的内含子序列的核苷酸序列；并且
当引入哺乳动物细胞中时，所述至少两种不同载体经受彼此同源性重组，由此形成编码全长CLRN1蛋白的重组核酸。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每一者包括编码所述CLRN1蛋白的第一亚型的不同部分的编码序列。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含与SEQ ID NO：3具有至少95％同一性的序列。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含SEQ ID NO：3。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
6.如权利要求2所述的组合物，其中所述至少两种不同核酸载体中的一者还包含编码所述CLRN1蛋白的第二亚型的序列。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含与SEQ ID NO：5具有至少95％同一性的序列。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含SEQ ID NO：5。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型由SEQ ID NO：5组成。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每一者包括编码所述CLRN1蛋白的第二亚型的不同部分的编码序列。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含与SEQ IDNO：5具有至少95％同一性的序列。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含SEQ ID NO：5。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型由SEQ ID NO：5组成。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述至少两种不同核酸载体中的一者还包含编码所述CLRN1蛋白的第一亚型的序列。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含与SEQ IDNO：3具有至少95％同一性的序列。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含SEQ ID NO：3。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的至少一者包含5’非翻译区(UTR)、3’UTR或两者。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少10个连续核苷酸。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少20个连续核苷酸。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少80个连续核苷酸。
23.如权利要求18所述的组合物，其中所述5’UTR包含与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性的序列。
24.如权利要求18所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少10个连续核苷酸。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少20个连续核苷酸。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少80个连续核苷酸。
28.如权利要求18所述的组合物，其中所述3’UTR包含与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的序列。
29.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每一者是质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒载体。
30.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每一者是人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或P1源性人工染色体(PAC)。
31.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每一者是选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每一者是AAV载体。
33.如权利要求1-32中任一项所述的组合物，其中所编码部分中没有一者的氨基酸序列与所编码部分中的不同者的氨基酸序列重叠。
34.如权利要求1-32中任一项所述的组合物，其中所编码部分中的每一者的氨基酸序列与所编码部分中的不同者的氨基酸序列部分重叠。
35.如权利要求34所述的组合物，其中重叠氨基酸序列的长度在约30个氨基酸残基至约202个氨基酸残基之间。
36.如权利要求1-32中任一项所述的组合物，其中所述载体包括两种不同载体，其中每一者包含内含子的不同区段，其中所述内含子包含存在于CLRN1基因组DNA中的内含子的核苷酸序列，并且其中两个不同内含子区段在序列方面重叠至少100个核苷酸。
37.如权利要求36所述的组合物，其中两个不同内含子区段在序列方面重叠100个核苷酸至约800个核苷酸。
38.如权利要求1-37中任一项所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每一者的全部核苷酸序列的长度在约500个核苷酸至约10,000个核苷酸之间。
39.如权利要求38所述的组合物，其中所述至少两种不同载体中的每一者的全部核苷酸序列的长度在500个核苷酸至5,000个核苷酸之间。
40.如权利要求1-39中任一项所述的组合物，其中所述组合物中不同载体的种数是两种。
41.如权利要求40所述的组合物，其中所述两种不同载体中的第一载体包含编码所述CLRN1蛋白的N末端部分的编码序列。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述N末端部分的长度在30个氨基酸至202个氨基酸之间。
43.如权利要求41所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述N末端部分的长度在60个氨基酸至170个氨基酸之间。
44.如权利要求41所述的组合物，其中所述第一载体还包含5’UTR序列。
45.如权利要求44所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少10个连续核苷酸。
46.如权利要求45所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少20个连续核苷酸。
47.如权利要求46所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
48.如权利要求47所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少80个连续核苷酸。
49.如权利要求44所述的组合物，其中所述5’UTR包含与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性的序列。
50.如权利要求41-49中任一项所述的组合物，其中所述第一载体还包含启动子和Kozak序列中的一者或两者。
51.如权利要求50所述的组合物，其中所述第一载体包含是诱导型启动子、组成型启动子、或组织特异性启动子的启动子。
52.如权利要求40-51中任一项所述的组合物，其中所述两种不同载体中的第二者包含编码所述CLRN1蛋白的C末端部分的编码序列。
53.如权利要求52所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述C末端部分的长度在30个氨基酸至202个氨基酸之间。
54.如权利要求53所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述C末端部分的长度在60个氨基酸至170个氨基酸之间。
55.如权利要求52-54中任一项所述的组合物，其中所述第二载体还包含多腺苷酸化信号序列。
56.如权利要求52-55中任一项所述的组合物，其中所述第二载体还包含3’UTR序列。
57.如权利要求56所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少10个连续核苷酸。
58.如权利要求57所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少20个连续核苷酸。
59.如权利要求58所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
60.如权利要求59所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少80个连续核苷酸。
61.如权利要求56所述的组合物，其中所述3’UTR包含与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的序列。
62.一种组合物，所述组合物包含单一核酸载体，其中所述载体包含(i)编码CLRN1蛋白的第一亚型的第一编码序列，和(ii)编码CLRN1蛋白的第二亚型的第二编码序列中的一者或两者，
其中所述第一编码序列和所述第二编码序列中的一者或两者包含跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子，并且缺乏两个连续内含子之间的内含子序列的核苷酸序列。
63.如权利要求62所述的组合物，其中所述单一核酸载体含有所述第一编码序列，而不含有所述第二编码序列。
64.如权利要求62所述的组合物，其中所述单一核酸载体含有所述第二编码序列，而不含有所述第一编码序列。
65.如权利要求62所述的组合物，其中所述单一核酸载体含有所述第一编码序列与所述第二编码序列两者。
66.如权利要求62、63和65中任一项所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含与SEQ ID NO：3具有至少95％同一性的序列。
67.如权利要求66所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含SEQ ID NO：3。
68.如权利要求67所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
69.如权利要求62、64和65中任一项所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含与SEQ ID NO：5具有至少95％同一性的序列。
70.如权利要求69所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含SEQ ID NO：5。
71.如权利要求70所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型由SEQ ID NO：5组成。
72.如权利要求62-71中任一项所述的组合物，其中所述单一核酸载体还包含5’非翻译区(UTR)、3’UTR或两者。
73.如权利要求72所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少10个连续核苷酸。
74.如权利要求73所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少20个连续核苷酸。
75.如权利要求74所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
76.如权利要求75所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少80个连续核苷酸。
77.如权利要求72所述的组合物，其中所述5’UTR包含与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性的序列。
78.如权利要求72所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少10个连续核苷酸。
79.如权利要求78所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少20个连续核苷酸。
80.如权利要求79所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
81.如权利要求80所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少80个连续核苷酸。
82.如权利要求72所述的组合物，其中所述3’UTR包含与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的序列。
83.如权利要求62所述的组合物，其中所述单一核酸载体是质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒载体。
84.如权利要求62所述的组合物，其中所述单一核酸载体是人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或P1源性人工染色体(PAC)。
85.如权利要求62所述的组合物，其中所述单一核酸载体是选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。
86.如权利要求85所述的组合物，其中所述单一核酸载体是AAV载体。
87.如权利要求62所述的组合物，其中所述单一核酸载体还包含启动子和Kozak序列中的一者或两者。
88.如权利要求87所述的组合物，其中所述第一载体包含是诱导型启动子、组成型启动子、或组织特异性启动子的启动子。
89.如权利要求87所述的组合物，其中所述单一核酸载体还包含多腺苷酸化信号序列。
90.如权利要求1-89中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
91.一种药盒，所述药盒包括权利要求1-90中任一项所述的组合物。
92.如权利要求91所述的药盒，所述药盒还包括包含所述组合物的预装载注射器。
93.一种方法，所述方法包括：
向哺乳动物的耳蜗中引入治疗有效量的权利要求1-90中任一项所述的组合物。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
95.如权利要求93或94所述的方法，其中所述哺乳动物先前已被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因。
96.一种使哺乳动物细胞中全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括将权利要求1-90中任一项所述的组合物引入所述哺乳动物细胞中。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是耳蜗内毛细胞或耳蜗外毛细胞。
98.如权利要求96所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是视网膜细胞。
99.如权利要求96-98中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
100.如权利要求96-99中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞先前已被确定为具有缺陷性CLRN1基因。
101.一种使哺乳动物的耳蜗中的内毛细胞、外毛细胞或两者中的全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：
向所述哺乳动物的所述耳蜗中引入治疗有效量的权利要求1-90中任一项所述的组合物。
102.一种使哺乳动物的眼中的全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：
以眼内方式向所述哺乳动物的所述眼施用治疗有效量的权利要求1-90中任一项所述的组合物。
103.如权利要求101或102所述的方法，其中所述哺乳动物先前已被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因。
104.如权利要求101-104中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
105.一种治疗被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因的受试者的听力损失的方法，所述方法包括：
向所述受试者的耳蜗中施用治疗有效量的权利要求1-90中任一项所述的组合物。
106.一种治疗被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因的受试者的视力损失的方法，所述方法包括：
向所述受试者的眼中施用治疗有效量的权利要求1-90中任一项所述的组合物。
107.如权利要求105或106所述的方法，其中所述受试者患有III型尤塞氏综合征。
108.如权利要求105-107中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
109.如权利要求105-108中任一项所述的方法，所述方法还包括在施用步骤之前确定所述受试者具有缺陷性CLRN1基因。
110.一种组合物，所述组合物包含两种不同核酸载体，其中：
所述两种不同核酸载体中的第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分的第一编码序列、以及位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列；并且
所述两种不同核酸载体中的第二核酸载体包含剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分的第二编码序列、以及在所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化信号序列；
其中所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基，其中两个所编码部分的氨基酸序列不彼此重叠；其中所述两种不同载体中没有单一载体编码全长CLRN1蛋白；并且
当引入哺乳动物细胞中时，在所述剪接供体序列与所述剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码全长CLRN1蛋白的重组核酸。
111.如权利要求110所述的组合物，其中所述第一编码序列编码CLRN1蛋白的第一亚型的N末端部分，并且所述第二编码序列编码CLRN1蛋白的所述第一亚型的C末端部分。
112.如权利要求111所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含与SEQ IDNO：3具有至少95％同一性的序列。
113.如权利要求112所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含SEQ IDNO：3。
114.如权利要求113所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
115.如权利要求111所述的组合物，其中所述第二核酸载体的所述第一核酸载体还包含编码所述CLRN1蛋白的第二亚型的序列。
116.如权利要求115所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含与SEQ IDNO：5具有至少95％同一性的序列。
117.如权利要求116所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含SEQ IDNO：5。
118.如权利要求117所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型由SEQ ID NO：5组成。
119.如权利要求110所述的组合物，其中所述第一编码序列编码CLRN1蛋白的第二亚型的N末端部分，并且所述第二编码序列编码CLRN1蛋白的所述第二亚型的C末端部分。
120.如权利要求119所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含与SEQ IDNO：5具有至少95％同一性的序列。
121.如权利要求120所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含SEQ IDNO：5。
122.如权利要求121所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型由SEQ ID NO：5组成。
123.如权利要求119所述的组合物，其中所述第一核酸载体或所述第二核酸载体还包含编码所述CLRN1蛋白的第一亚型的序列。
124.如权利要求123所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含与SEQ IDNO：3具有至少95％同一性的序列。
125.如权利要求124所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含SEQ IDNO：3。
126.如权利要求125所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
127.如权利要求110-126中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的一者或两者包含5’非翻译区(UTR)、3’UTR或两者。
128.如权利要求127所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少10个连续核苷酸。
129.如权利要求128所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少20个连续核苷酸。
130.如权利要求129所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
131.如权利要求130所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少80个连续核苷酸。
132.如权利要求127所述的组合物，其中所述5’UTR包含与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性的序列。
133.如权利要求127所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少10个连续核苷酸。
134.如权利要求133所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少20个连续核苷酸。
135.如权利要求134所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
136.如权利要求135所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少80个连续核苷酸。
137.如权利要求127所述的组合物，其中所述3’UTR包含与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的序列。
138.如权利要求110-137中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的每一者是质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒载体。
139.如权利要求110-137中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的每一者是人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或P1源性人工染色体(PAC)。
140.如权利要求110-137中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的每一者是选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。
141.如权利要求140所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的每一者是AAV载体。
142.如权利要求110-141中任一项所述的组合物，其中所述编码序列中的至少一者包含跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子，并且缺乏所述两个连续外显子之间的内含子序列的核苷酸序列。
143.一种组合物，所述组合物包含两种不同核酸载体，其中：
所述两种不同核酸载体中的第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列、以及位于所述剪接供体序列的3’的第一可检测标记基因；并且
所述两种不同核酸载体中的第二核酸载体包含第二可检测标记基因、位于所述第二可检测标记基因的3’的剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分的第二编码序列、以及位于所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化信号序列；
其中所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基，其中所编码部分的氨基酸序列不彼此重叠；其中所述两种不同载体中没有单一载体编码全长CLRN1蛋白；并且
当引入哺乳动物细胞中时，在所述剪接供体序列与所述剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码全长CLRN1蛋白的重组核酸。
144.如权利要求143所述的组合物，其中所述第一编码序列编码CLRN1蛋白的第一亚型的N末端部分，并且所述第二编码序列编码CLRN1蛋白的所述第一亚型的C末端部分。
145.如权利要求144所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含与SEQ IDNO：3具有至少95％同一性的序列。
146.如权利要求145所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含SEQ IDNO：3。
147.如权利要求146所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
148.如权利要求144所述的组合物，其中所述第二核酸载体的所述第一核酸载体还包含编码所述CLRN1蛋白的第二亚型的序列。
149.如权利要求148所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含与SEQ IDNO：5具有至少95％同一性的序列。
150.如权利要求149所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含SEQ IDNO：5。
151.如权利要求150所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型由SEQ ID NO：5组成。
152.如权利要求143所述的组合物，其中所述第一编码序列编码CLRN1蛋白的第二亚型的N末端部分，并且所述第二编码序列编码CLRN1蛋白的所述第二亚型的C末端部分。
153.如权利要求152所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含与SEQ IDNO：5具有至少95％同一性的序列。
154.如权利要求153所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含SEQ IDNO：5。
155.如权利要求154所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型由SEQ ID NO：5组成。
156.如权利要求152所述的组合物，其中所述第一核酸载体或所述第二核酸载体还包含编码所述CLRN1蛋白的第一亚型的序列。
157.如权利要求156所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含与SEQ IDNO：3具有至少95％同一性的序列。
158.如权利要求157所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含SEQ IDNO：3。
159.如权利要求158所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
160.如权利要求143-159中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的一者或两者包含5’非翻译区(UTR)、3’UTR或两者。
161.如权利要求160所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少10个连续核苷酸。
162.如权利要求161所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少20个连续核苷酸。
163.如权利要求162所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
164.如权利要求163所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少80个连续核苷酸。
165.如权利要求160所述的组合物，其中所述5’UTR包含与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性的序列。
166.如权利要求160所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少10个连续核苷酸。
167.如权利要求166所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少20个连续核苷酸。
168.如权利要求167所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
169.如权利要求168所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少80个连续核苷酸。
170.如权利要求160所述的组合物，其中所述3’UTR包含与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的序列。
171.如权利要求143-170中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的每一者是质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒载体。
172.如权利要求143-170中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的每一者是人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或P1源性人工染色体(PAC)。
173.如权利要求143-170中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的每一者是选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。
174.如权利要求173所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的每一者是AAV载体。
175.如权利要求143-174中任一项所述的组合物，其中所述编码序列中的至少一者包含跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子，并且缺乏所述两个连续外显子之间的内含子序列的核苷酸序列。
176.如权利要求143-175中任一项所述的组合物，其中所述第一可检测标记基因或所述第二可检测标记基因是碱性磷酸酶。
177.一种组合物，所述组合物包含两种不同核酸载体，其中：
所述两种不同核酸载体中的第一核酸载体包含启动子、位于所述启动子的3’的编码CLRN1蛋白的N末端部分的第一编码序列、位于所述第一编码序列的3’末端的剪接供体序列、以及位于所述剪接供体序列的3’的F1噬菌体致重组区域；并且
所述两种不同核酸载体中的第二核酸载体包含F1噬菌体致重组区域、位于所述F1噬菌体致重组区域的3’的剪接接受体序列、位于所述剪接接受体序列的3’末端的编码CLRN1蛋白的C末端部分的第二编码序列、以及位于所述第二编码序列的3’末端的多腺苷酸化信号序列；
其中两个所编码部分中的每一者的长度是至少30个氨基酸残基，其中两个所编码部分的氨基酸序列不彼此重叠；其中所述两种不同载体中没有单一载体编码全长CLRN1蛋白；并且
当引入哺乳动物细胞中时，在所述剪接供体序列与所述剪接接受体序列之间发生剪接，由此形成编码全长CLRN1蛋白的重组核酸。
178.如权利要求177所述的组合物，其中所述第一编码序列编码CLRN1蛋白的第一亚型的N末端部分，并且所述第二编码序列编码CLRN1蛋白的所述第一亚型的C末端部分。
179.如权利要求178所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含与SEQ IDNO：3具有至少95％同一性的序列。
180.如权利要求179所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含SEQ IDNO：3。
181.如权利要求180所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
182.如权利要求178所述的组合物，其中所述第二核酸载体的所述第一核酸载体还包含编码所述CLRN1蛋白的第二亚型的序列。
183.如权利要求182所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含与SEQ IDNO：5具有至少95％同一性的序列。
184.如权利要求183所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含SEQ IDNO：5。
185.如权利要求184所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型由SEQ ID NO：5组成。
186.如权利要求177所述的组合物，其中所述第一编码序列编码CLRN1蛋白的第二亚型的N末端部分，并且所述第二编码序列编码CLRN1蛋白的所述第二亚型的C末端部分。
187.如权利要求186所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含与SEQ IDNO：5具有至少95％同一性的序列。
188.如权利要求187所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型包含SEQ IDNO：5。
189.如权利要求188所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第二亚型由SEQ ID NO：5组成。
190.如权利要求186所述的组合物，其中所述第一核酸载体或所述第二核酸载体还包含编码所述CLRN1蛋白的第一亚型的序列。
191.如权利要求190所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含与SEQ IDNO：3具有至少95％同一性的序列。
192.如权利要求191所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型包含SEQ IDNO：3。
193.如权利要求192所述的组合物，其中所述CLRN1蛋白的所述第一亚型由SEQ ID NO：3组成。
194.如权利要求177-193中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的一者或两者包含5’非翻译区(UTR)、3’UTR或两者。
195.如权利要求194所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少10个连续核苷酸。
196.如权利要求195所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少20个连续核苷酸。
197.如权利要求196所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
198.如权利要求197所述的组合物，其中所述5’UTR包含来自SEQ ID NO：12内的任何地方的至少80个连续核苷酸。
199.如权利要求194所述的组合物，其中所述5’UTR包含与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性的序列。
200.如权利要求194所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少10个连续核苷酸。
201.如权利要求200所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少20个连续核苷酸。
202.如权利要求201所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少50个连续核苷酸。
203.如权利要求202所述的组合物，其中所述3’UTR包含来自SEQ ID NO：15内的任何地方的至少80个连续核苷酸。
204.如权利要求194所述的组合物，其中所述3’UTR包含与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的序列。
205.如权利要求177-204中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的每一者是质粒、转座子、粘粒、人工染色体或病毒载体。
206.如权利要求177-204中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的每一者是人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或P1源性人工染色体(PAC)。
207.如权利要求177-204中任一项所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的每一者是选自腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体的病毒载体。
208.如权利要求207所述的组合物，其中所述第一核酸载体和所述第二核酸载体中的每一者是AAV载体。
209.如权利要求177-204中任一项所述的组合物，其中所述编码序列中的至少一者包含跨越CLRN1基因组DNA的两个连续外显子，并且缺乏所述两个连续外显子之间的内含子序列的核苷酸序列。
210.一种药盒，所述药盒包括权利要求110-209中任一项所述的组合物。
211.如权利要求210所述的药盒，所述药盒还包括包含所述组合物的预装载注射器。
212.一种方法，所述方法包括：
向哺乳动物的耳蜗中引入治疗有效量的权利要求110-209中任一项所述的组合物。
213.如权利要求212所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
214.如权利要求212或213所述的方法，其中所述哺乳动物先前已被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因。
215.一种使哺乳动物细胞中全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括将权利要求110-209中任一项所述的组合物引入所述哺乳动物细胞中。
216.如权利要求215所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是耳蜗内毛细胞或耳蜗外毛细胞。
217.如权利要求215所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是视网膜细胞。
218.如权利要求215-217中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
219.如权利要求215-218中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞先前已被确定为具有缺陷性CLRN1基因。
220.一种使哺乳动物的耳蜗中的内毛细胞、外毛细胞或两者中的全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：
向所述哺乳动物的所述耳蜗中引入治疗有效量的权利要求110-209中任一项所述的组合物。
221.一种使哺乳动物的眼中的全长CLRN1蛋白的表达增加的方法，所述方法包括：
以眼内方式向所述哺乳动物的所述眼施用治疗有效量的权利要求110-209中任一项所述的组合物。
222.如权利要求220或221所述的方法，其中所述哺乳动物先前已被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因。
223.如权利要求220-222中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
224.一种治疗被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因的受试者的听力损失的方法，所述方法包括：
向所述受试者的耳蜗中施用治疗有效量的权利要求110-209中任一项所述的组合物。
225.一种治疗被鉴定为具有缺陷性CLRN1基因的受试者的视力损失的方法，所述方法包括：
向所述受试者的眼中施用治疗有效量的权利要求110-209中任一项所述的组合物。
226.如权利要求224或225所述的方法，其中所述受试者患有III型尤塞氏综合征。
227.如权利要求224-226中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
228.如权利要求224-227中任一项所述的方法，所述方法还包括在施用步骤之前确定所述受试者具有缺陷性CLRN1基因。
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