KR20230039669A - eEF1A2용 유전자 요법 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

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라즈빈더 카르다
크리스토퍼 딘 헤르조그
조앤 응
체스터 사크라멘토
스테파니 쇼르지
데이비드 릭스
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Abstract

eEF1A2 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 발현하는 벡터로서 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온을 사용하는, 신경 질환에 대한 유전자 요법이 본원에 제공된다. 상기 rAAV 비리온은 뉴런-특이적 프로모터, 예를 들어, 인간 시냅신 1(hSYN) 프로모터를 사용할 수 있다. 캡시드는 AAV9 캡시드 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 다른 프로모터 또는 캡시드가 사용될 수 있다. 추가로, 예컨대 rAAV 비리온의 강내 및/또는 정맥내 치료 방법, 및 다른 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

eEF1A2용 유전자 요법 벡터 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 7월 23일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/055,775호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 참조로서 본 명세서에 통합된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 ROPA_019_02WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일의 크기는 2021년 7월 20일에 생성된 약 101 KB이며, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출 중이다.
EEF1A2 유전자는 단백질 합성, 세포자멸사의 억제, 및 액틴 기능 및 세포골격 구조의 조절에 관여하는 단백질인, 진핵 신장 인자 1, 알파-2(eEF1A2)를 암호화한다. 마우스와 인간 오르소로그는 463개 아미노산 위치에서의 462개에서 동일성을 공유한다. EEF1A2는 난소암에서 과발현되기 때문에 잠재적인 종양유전자이다. 난소암에 대한 연구에서는, EEF1A2를 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 실험적으로 사용하여 불멸화 난소 표면 상피(IOSE) 세포를 형질도입함으로써, eEF1A2가 비-종양형성 전구체 세포에서 종양형성을 촉진한다는 것을 입증하였다. Sun 등, Int J Cancer. 123(8):1761-176 (2008).
EEF1A2는 심장 및 근육뿐만 아니라 중추 신경계(CNS)에서 고도로 발현된다. 마우스에서의 Eef1a2의 완전한 손실은, 그 표현형을 "폐기"로 지칭하며, 그의 유전자형을 wst로 지칭하는, 운동 신경 변성을 야기한다. Davies 등, Sci Rep. 7:46019 (2017). 최근, 인간 EEF1A2 유전자의 점 돌연변이는 간질, 지적 장애 및/또는 자폐증을 다양한 방식으로 유발하는 것으로 입증되었다. Cao 등, Human Molecular Genetics. 26(18):3545-3552 (2017); Lam 등, Mol Genet Genomic Med. 4(4):465-74 (2016); Nakajima 등, Clin Genet. 87(4):356-61 (2015).
박테리아 인공 염색체(BAC) 상에 야생형 Eef1a2를 갖는 유전자 이식 마우스를 사용한 실험은, 야생형 Eefl1a2가 발생 중에 존재할 때, wst 유전자형을 보완한다는 것을 확인하였다. Newbury 등, J. Bio. Chem. 282:2891-50 (2007).
EEF1A2-관련 질환은 드물다. 전 세계적으로 단지 약 100명의 개체만이 EEF1A2에서 돌연변이를 갖는 것으로 확인되었다. 질병의 병인은 여전히 잘 이해되지 않고 있다. 결과적으로, 야생형 EEF1A2의 출생 후 발현에 의한 질환 표현형의 구제가 달성될 수 있는지의 여부는 명확하지 않다. 또한, CNS에 대한 유전자 요법의 전달은 어렵고 예측할 수 없다.
EEF1A2-관련 질환에 대한 요법에 대한 충족되지 않은 필요성이 존재한다. 본원에 제공된 유전자 요법은 이러한 요구를 해결한다.
본 발명은 대체적으로 eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 아데노-연관 바이러스(AAV)-기반 전달을 사용하는, 신경 질환 또는 장애에 대한 유전자 요법에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 개시는 캡시드 및 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온을 제공하며, 여기에서 벡터 게놈은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, eEF1A2 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 프로모터는 뉴런-특이적 프로모터, 예를 들어, 인간 시냅신 1(hSYN) 프로모터일 수 있다. 캡시드는 AAV9 캡시드 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 다른 프로모터 또는 캡시드가 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서의 신경 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하며, 방법은 본 개시의 rAAV 비리온 또는 이의 약학적 조성물을 해당 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. rAAV 비리온은 강내 및/또는 정맥내 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체의 뇌에서 eEF1A2를 발현시키는 방법을 제공하며, 방법은 본 개시의 rAAV 비리온 또는 이의 약학적 조성물을 해당 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. rAAV 비리온은 강내 및/또는 정맥내 투여될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 개시는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 벡터 게놈), 약학적 조성물, 키트, 및 다른 조성물 및 방법을 제공한다.
다양한 다른 양태 및 구현예가 다음의 상세한 설명에 개시된다. 본 발명은 단지 첨부된 청구범위로 한정된다.
도 1은 질환과 연관된 점 돌연변이를 나타내는 eEF1A2의 도메인 다이어그램을 도시한다.
도 2는 벡터 게놈의 비제한적인 예의 벡터 다이어그램을 도시한다.
도 3은 벡터 게놈의 비제한적인 예의 벡터 다이어그램을 도시한다.
도 4는 벡터 게놈의 비제한적인 예의 벡터 다이어그램을 도시한다.
도 5는 벡터 게놈의 비제한적인 예의 벡터 다이어그램을 도시한다.
도 6은 벡터 게놈의 비제한적인 예의 벡터 다이어그램을 도시한다.
도 7은 AAV9-hSyn-eEF1A2-2A-eGFP 또는 대조군의 신생아 주사, 뇌내(IC) 또는 정맥내(IV) 후 마우스의 면역형광 현미경 영상을 도시한다. 스케일 바, 300 mm.
도 8a는 AAV9-hSyn-eEF1A2-2A-eGFP 또는 대조군의 신생아 주사, 뇌내(IC) 또는 정맥내(IV) 후 마우스의 면역조직화학 분석을 도시한다. 도 8b는 동일한 슬라이드의 확대도를 도시한다. 스케일 바, 300 mm.
도 9a는, 미치료 wst/wst(널(null)) 마우스에서의 생존율을, 뇌내(IC), 정맥 내(IV) 또는 둘 모두(IC+IV)의 조합으로 치료한 마우스와 비교하여 도시한다.
도 9b는, 미치료 wst/wst(널(null)) 마우스에서의 체중 감소를, 뇌내(IC), 정맥 내(IV) 또는 둘 모두(IC+IV)의 조합으로 치료한 마우스와 비교하여 도시한다.
도 9c는, 미치료 wst/wst(널(null)) 마우스에서의 로타로드 시험을, 뇌내(IC), 정맥 내(IV) 또는 둘 모두(IC+IV)의 조합으로 치료한 마우스와 비교하여 도시한다.
도 9d는, 미치료 wst/wst(널(null)) 마우스에서의 반전 그리드 시험을, 뇌내(IC), 정맥 내(IV) 또는 둘 모두(IC+IV)의 조합으로 치료한 마우스와 비교하여 도시한다.
도 9e는, 미치료 wst/wst(널(null)) 마우스에서의 eEF1A2 발현을, 뇌내(IC), 정맥 내(IV) 또는 둘 모두(IC+IV)의 조합으로 치료한 마우스와 비교하여 도시한다. 스케일 바, 125 mm.
도 9f는, 미치료 wst/wst(널(null)) 마우스에서의 eEF1A2 발현을, 뇌내(IC), 정맥 내(IV) 또는 둘 모두(IC+IV)의 조합으로 치료한 마우스와 비교하여 도시한다.
도 10a 내지 도 10k는, 2e1011 vg/동물로 투여된, 도 2("V1"), 도 3("V2"), 도 4("V3") 및 도 6("V4")에 나타낸 벡터 게놈을 포함하는 AAV9 벡터의 비교를 도시한다.
도 10a는 FBS 치료 야생형, wst/wst, V1, V2,V3, 및 V4 유전자 요법으로 치료한 뇌실내 치료 wst/wst 동물의 케플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 도표를 도시한다.
도 10b는 마우스의 중량을 도시한다(데이터 평균 ± S.E.M.). 동물을 출생 후 35일까지 매일 칭량하고, 그 후 시기적절한 희생 시점인 P60 또는 인도 종말점 15% 체중 감소 시까지 매주 칭량하였다.
도 10c는 P15일차의 반전 그리드에 의한 근력 평가를 도시한다.
도 10d는 P15일차의 로타 로드에 의한 근력 평가를 도시한다.
도 10e는 P23일차의 반전 그리드에 의한 근력 평가를 도시한다.
도 10f는 P23일차의 로타 로드에 의한 근력 평가를 도시한다.
도 10g는 야생형 FBS(제형화 완충액)를 생리학적 기준으로 사용하는, 유리 유동 면역조직화학을 사용한 뇌 전체에 걸친 eEF1A2에 대한 대표적인 면역염색을 도시한다(군 당 n = 4 또는 5, 스케일 바 250 μm).
도 10h는 eEF1A2를 공발현하는 뉴런(NeuN 마커)에 대한 대뇌피질 뇌 영역에서의 대표적인 면역조직형광을 도시한다(n = 군 당 4.5, 200 μm).
도 10i는, V4 벡터와 비교하여 중뇌, 소뇌 및 후뇌 영역에서 보다 높은 발현을 갖는 모든 유전자 요법 벡터를 사용하여 달성된 뇌 전체에 걸친 eEF1A2 발현을 나타내는 정량화와 함께, 뇌에서의 eEF1A2에 대한 대표적인 면역블롯을 도시한다(데이터 평균 ± S.E.M, 양방향 ANOVA).
도 10j는 V1 벡터로 가장 높은 mRNA 발현을 나타내는, 전뇌에서의 인간 eEF1A2 전사체 발현에 대한 qPCR을 도시한다(데이터 평균 ± S.E.M, 양방향 ANOVA).
도 10k는 V1 벡터로 가장 높은 mRNA 발현을 나타내는, 피질에서의 인간 eEF1A2 피질 발현에 대한 qPCR을 도시한다(데이터 평균 ± S.E.M, 양방향 ANOVA).
도 11a 내지 도 11c
도 11a는 FBS 치료 야생형, FBS 치료 D252H/+, 녹-아웃(knock-out)(D252H-/-), 뇌실내 V3 유전자 요법 치료 D252H-/-의 케플란-마이어 생존 도표를 도시한다(야생형 FBS n = 12, D252H/+ FBS n = 5, D252H-/- FBS n = 4 및 2 x1011 vg/pup, V3 치료 n = 5).
도 11b는 시간 경과에 따른 체중을 도시한다(데이터 평균 ± S.E.M., 일방향 ANOVA, 및 더넷(Dunnett) 다중 비교).
도 11c는 로타 로드에 의한 운동 평가를 도시한다(데이터 평균 ± S.E.M., 양방향 ANOVA, 및 더넷 다중 비교).
도 12a는 V3 고 투여량(2 x 1011 vg/pup, n = 5)을 투여받은 Del22ex3, V3 저 투여량(2 x 1010 vg/pup, n = 5)을 투여받은 Del22ex3, 제형 완충액을 투여받은 Del22ex3 대조군(n = 3) 및 제형 완충액을 투여받은 야생형 대조군(n = 6)의 케플란-마이어 생존 도표를 도시한다.
도 12b는 시간 경과에 따른 체중을 도시한다(데이터 평균 ± S.E.M.).
도 12c는 악력 압력측정계에 의한 PP22 내지 25일차의 운동 평가를 도시한다(데이터 평균 ± S.E.M).
도 12d는 P23일차의 악력 압력측정을 도시한다(데이터 평균 ± S.E.M., 양방향 ANOVA, 및 투키(Tukey) 다중 비교).
도 12e는 로타로드에 의한 P22 내지 25일차의 운동 평가를 도시한다(데이터 평균 ± S.E.M).
도 12f는 P24일차의 로타로드 데이터를 도시한다(데이터 평균 ± S.E.M., 양방향 ANOVA, 및 투키 다중 비교).
도 12g는 P21 내지 25일차의 신경학적 스코어를 도시한다.
정의
섹션의 제목은 단지 구성적인 목적을 위해 제공되는 것이며, 기술된 주제를 특정 양태 또는 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질이 아래에 기술된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참조 문헌은 그 전체가 참조로서 명시적으로 포함된다. 상충하는 경우, 해당 정의를 포함하는 본 명세서가 우선시된다. 또한, 본원에 기술된 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하고자 하는 것은 아니다.
본원에 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로서 통합되도록 표시되는 것과 같이 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 상충하는 경우, 본원의 정의 중 어느 하나를 포함하는 본 출원이 우선시된다. 그러나, 본원에 인용된 임의의 참조문헌, 논문, 간행물, 특허, 특허 공개, 및 특허 출원에 대한 언급을, 그들이 유효한 선행기술을 구성하거나 세계 어느 나라에서든 공통된 일반 지식의 일부를 구성한다는 인정, 또는 임의의 형태의 제안으로 간주하여서는 안 된다.
본 기술에서, 달리 명시되지 않는 한, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값, 및 적절한 경우, 이의 분획(예를 들어, 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 숫자 또는 숫자 표현 바로 앞에 있는 "약"이라는 용어는 해당 숫자 또는 해당 숫자 표현의 ±10% 범위임을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어, "일" 및 "하나"는 달리 명시되지 않는 한, 열거된 구성 요소의 "하나 이상"을 지칭함을 이해해야 한다. 대안적인 것(예를 들어, "또는")의 사용은 해당 대안적인 것 중 하나, 둘 모두, 또는 이의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 용어 "및/또는"은 대안적인 것 중 하나 또는 둘 모두를 의미하는 것으로 이해해야 한다. 본원에서 사용되는 용어, "포함하다" 및 "포함한다"는 동의어로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어, "동일성" 및 "동일한"은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해, "쿼리" 서열의 "대상" 서열에 대한 정렬, 예컨대 BLAST 알고리즘에 의해 생성된 정렬의 정확한 일치 잔기의 백분율을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 동일성은 대상 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산된다. 따라서, 쿼리 서열이 대상 서열에 대해 정렬될 때, 해당 대상 서열에서의 잔기의 적어도 x%(반내림됨)가 해당 쿼리 서열에서의 상응하는 잔기와 정확히 일치하여 정렬되는 경우, 해당 쿼리 서열은 해당 대상 서열에 "적어도 x%의 동일성을 공유한다". 대상 서열이 가변 위치(예를 들어, X로 표시된 잔기)를 갖는 경우, 쿼리 서열 내의 임의의 잔기에 대한 정렬은 일치하는 것으로 계수된다.
본원에서 사용되는, "AAV 벡터" 또는 "rAAV 벡터"는 AAV 말단 반복 서열(ITR)이 측면에 위치하는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(또는 이식유전자)를 포함하는 재조합 벡터를 지칭한다. 이러한 AAV 벡터는, rep 및 cap 유전자 산물을 암호화하고 발현하는 플라스미드로 형질감염된 숙주 세포에 존재할 경우, 복제되고 감염성 바이러스 입자로 포장될 수 있다. 대안적으로, AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자를 발현하도록 안정적으로 조작된 숙주 세포를 사용하여 감염성 입자 내로 포장될 수 있다.
본원에서 사용되는, "AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 AAV 벡터로 이루어진 바이러스 입자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 입자가 이종 폴리뉴클레오티드(즉, 포유류 세포에 전달될 이식유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 이는 일반적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 단순히 "AAV 벡터"로서 지칭된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생산은 AAV 벡터의 생산을 반드시 포함해야 하는데, 이는 이러한 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 포함되기 때문이다.
본원에서 사용되는, "프로모터"는 진핵 세포 중 폴리뉴클레오티드로부터 RNA 전사의 개시를 촉진할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "벡터 게놈"은 측부 서열(AAV 중, 역위 말단 반복)을 포함하는, 벡터(예를 들어, rAAV 비리온)에 의해 포장된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "발현 카세트" 및 "폴리뉴클레오티드 카세트"는 측부 ITR 서열 사이의 벡터 게놈의 부분을 지칭한다. "발현 카세트"는 해당 벡터 게놈이 발현을 유도하는 요소(예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 포함한다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어, "~를 필요로 하는 환자" 또는 "~를 필요로 하는 대상체"는 본원에 개시된 재조합 유전자 요법 벡터 또는 유전자 편집 시스템으로 치료 또는 완화될 수 있는 질환, 장애 또는 병태의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자 또는 대상체를 지칭한다. 예를 들어, 이를 필요로 하는 환자 또는 대상체는 중추 신경계와 연관된 장애로 진단된 환자 또는 대상체일 수 있다. 대상체는 EEF1A2 유전자에서의 돌연변이 또는 EEF1A2 유전자의 전부 또는 일부의 결실, 또는 eEF1A2 단백질의 비정상적인 발현을 유발하는 유전자 조절 서열의 결실을 가질 수 있다. "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 본원에 기술된 방법에 의해 치료되는 대상체는 성인 또는 아동일 수 있다. 대상체의 연령은 다양할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어, "변이체" 또는 "기능적 변이체"는 부모 단백질의 하나 이상의 원하는 활성을 보유하는, 부모 단백질과 비교 시 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 단백질을 상호 교환적으로 지칭한다.
본원에서 사용되는, "유전자 파괴"는 유전자에서의 기능 또는 비정상적인 활성의 부분적이거나 완전한 상실을 지칭한다. 예를 들어, 대상체는 해당 대상체의 적어도 일부 세포(예를 들어, 뉴런)에서 발현을 감소시키거나 EEF1A2 단백질의 손실 또는 비정상적인 기능을 초래하는 eEF1A2 유전자에서의 발현 또는 기능의 유전적 파괴를 겪을 수 있다.
본원에서 사용되는, "치료"는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 개선하는 것을 지칭한다. 용어 "예방"은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 개시를 지연 또는 방해하거나 eEF1A2 관련 신경 질환 또는 장애의 진행을 늦추는 것을 지칭한다.
eEF1A2 단백질 또는 폴리뉴클레오티드
본 개시는 신장 인자 1-알파 2(eEF1A2) 단백질과 관련된 조성물 및 이의 사용 방법을 고려한다. 도 1에 도시된 EEF1A2에서의 다양한 돌연변이는 간질, 지적 장애 및/또는 자폐증을 포함하는 신경 장애와 연관된 것으로 알려져 있다. 유전적 돌연변이 및 신규(de novo) 돌연변이 모두가 관찰되었다. 일부 경우에, 이형접합성 미스센스 돌연변이는 질환을 유발하기에 충분하다.
eEF1A2의 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:
MGKEKTHINIVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMGKGSFKYAWVLDKLKAERERGITIDISLWKFETTKYYITIIDAPGHRDFIKNMITGTSQADCAVLIVAAGVGEFEAGISKNGQTREHALLAYTLGVKQLIVGVNKMDSTEPAYSEKRYDEIVKEVSAYIKKIGYNPATVPFVPISGWHGDNMLEPSPNMPWFKGWKVERKEGNASGVSLLEALDTILPPTRPTDKPLRLPLQDVYKIGGIGTVPVGRVETGILRPGMVVTFAPVNITTEVKSVEMHHEALSEALPGDNVGFNVKNVSVKDIRRGNVCGDSKSDPPQEAAQFTSQVIILNHPGQISAGYSPVIDCHTAHIACKFAELKEKIDRRSGKKLEDNPKSLKSGDAAIVEMVPGKPMCVESFSQYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKNVEKKSGGAGKVTKSAQKAQKAGK
(서열번호 1)
일부 구현예에서, eEF1A2 단백질은 서열번호 1과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 캡시드 및 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온을 제공하며, 여기에서 벡터 게놈은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, eEF1A2 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 캡시드 및 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온을 제공하며, 여기에서 벡터 게놈은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, eEF1A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. eEF1A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다:
ATGGGCAAGGAGAAGACCCACATCAACATCGTGGTCATCGGCCACGTGGACTCCGGAAAGTCCACCACCACGGGCCACCTCATCTACAAATGCGGAGGTATTGACAAAAGGACCATTGAGAAGTTCGAGAAGGAGGCGGCTGAGATGGGGAAGGGATCCTTCAAGTATGCCTGGGTGCTGGACAAGCTGAAGGCGGAGCGTGAGCGCGGCATCACCATCGACATCTCCCTCTGGAAGTTCGAGACCACCAAGTACTACATCACCATCATCGATGCCCCCGGCCACCGCGACTTCATCAAGAACATGATCACGGGTACATCCCAGGCGGACTGCGCAGTGCTGATCGTGGCGGCGGGCGTGGGCGAGTTCGAGGCGGGCATCTCCAAGAATGGGCAGACGCGGGAGCATGCCCTGCTGGCCTACACGCTGGGTGTGAAGCAGCTCATCGTGGGCGTGAACAAAATGGACTCCACAGAGCCGGCCTACAGCGAGAAGCGCTACGACGAGATCGTCAAGGAAGTCAGCGCCTACATCAAGAAGATCGGCTACAACCCGGCCACCGTGCCCTTTGTGCCCATCTCCGGCTGGCACGGTGACAACATGCTGGAGCCCTCCCCCAACATGCCGTGGTTCAAGGGCTGGAAGGTGGAGCGTAAGGAGGGCAACGCAAGCGGCGTGTCCCTGCTGGAGGCCCTGGACACCATCCTGCCCCCCACGCGCCCCACGGACAAGCCCCTGCGCCTGCCGCTGCAGGACGTGTACAAGATTGGCGGCATTGGCACGGTGCCCGTGGGCCGGGTGGAGACCGGCATCCTGCGGCCGGGCATGGTGGTGACCTTTGCGCCAGTGAACATCACCACTGAGGTGAAGTCAGTGGAGATGCACCACGAGGCTCTGAGCGAAGCTCTGCCCGGCGACAACGTCGGCTTCAATGTGAAGAACGTGTCGGTGAAGGACATCCGGCGGGGCAACGTGTGTGGGGACAGCAAGTCTGACCCGCCGCAGGAGGCTGCTCAGTTCACCTCCCAGGTCATCATCCTGAACCACCCGGGGCAGATTAGCGCCGGCTACTCCCCGGTCATCGACTGCCACACAGCCCACATCGCCTGCAAGTTTGCGGAGCTGAAGGAGAAGATTGACCGGCGCTCTGGCAAGAAGCTGGAGGACAACCCCAAGTCCCTGAAGTCTGGAGACGCGGCCATCGTGGAGATGGTGCCGGGAAAGCCCATGTGTGTGGAGAGCTTCTCCCAGTACCCGCCTCTCGGCCGCTTCGCCGTGCGCGACATGAGGCAGACGGTGGCCGTAGGCGTCATCAAGAACGTGGAGAAGAAGAGCGGCGGCGCCGGCAAGGTCACCAAGTCGGCGCAGAAGGCGCAGAAGGCGGGCAAG
(서열번호 2).
eEF1A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화될 수 있다.
eEF1A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다:
ATGGGTAAAGAAAAAACACATATTAATATAGTAGTAATCGGTCATGTTGACTCTGGAAAATCTACTACTACAGGACATTTGATTTATAAATGTGGAGGAATTGATAAAAGAACAATAGAAAAATTTGAAAAAGAAGCTGCTGAAATGGGTAAAGGTAGTTTTAAATATGCTTGGGTTTTGGATAAATTGAAAGCTGAAAGAGAAAGAGGAATTACAATTGATATTTCTTTGTGGAAATTTGAAACTACAAAATATTATATAACAATAATAGATGCTCCTGGACATAGAGATTTTATTAAAAATATGATTACAGGAACTTCTCAAGCAGATTGTGCTGTTTTGATAGTAGCAGCAGGAGTTGGTGAATTCGAAGCAGGCATTTCTAAAAATGGACAAACTAGAGAACATGCTTTGTTGGCTTATACATTGGGCGTAAAACAATTGATTGTAGGAGTTAATAAAATGGATTCTACTGAACCTGCATATTCTGAAAAAAGATATGATGAAATAGTAAAAGAAGTTTCTGCTTATATTAAAAAAATTGGTTATAATCCTGCTACAGTTCCATTTGTTCCTATTTCTGGATGGCATGGAGATAATATGTTGGAACCTAGTCCTAATATGCCTTGGTTTAAAGGATGGAAAGTTGAAAGGAAAGAAGGAAATGCATCAGGAGTCTCCTTGTTGGAAGCTTTGGATACAATCTTGCCTCCAACAAGACCTACAGATAAACCTTTGAGATTGCCTCTTCAAGATGTATATAAAATAGGAGGAATAGGAACAGTGCCAGTTGGAAGAGTAGAAACAGGTATATTGAGACCTGGAATGGTTGTAACATTTGCACCAGTTAATATAACTACTGAAGTAAAATCTGTTGAAATGCATCATGAAGCTTTGTCTGAAGCTCTTCCTGGAGATAATGTAGGATTTAATGTTAAAAATGTAAGTGTAAAAGATATAAGAAGAGGAAATGTATGTGGTGATAGTAAATCAGATCCACCTCAAGAAGCAGCTCAATTTACATCACAAGTAATAATATTGAATCATCCTGGACAAATTTCTGCAGGATATTCACCAGTAATAGATTGTCATACAGCACATATAGCTTGTAAATTTGCTGAATTGAAAGAAAAAATTGATAGAAGAAGTGGAAAAAAACTTGAAGATAATCCTAAATCATTGAAATCAGGAGATGCAGCTATTGTAGAAATGGTACCTGGAAAACCAATGTGTGTAGAATCTTTTTCTCAATATCCACCTCTCGGAAGATTTGCTGTTAGAGATATGAGACAAACAGTTGCAGTAGGAGTTATTAAAAATGTAGAAAAAAAAAGCGGAGGTGCAGGAAAGGTTACAAAATCCGCACAAAAAGCTCAAAAAGCTGGTAAATAA
(서열번호 4).
eEF1A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다:
ATGGGCAAAGAAAAAACACATATAAACATTGTCGTTATCGGACACGTTGATTCTGGTAAAAGTACAACAACCGGTCACTTGATATACAAATGCGGGGGTATAGACAAACGCACTATTGAAAAGTTCGAGAAAGAAGCTGCGGAGATGGGCAAAGGCTCATTCAAGTACGCGTGGGTACTCGATAAGTTGAAAGCTGAACGCGAGAGGGGAATCACCATAGACATCTCACTTTGGAAATTCGAGACAACCAAGTATTACATAACTATTATAGATGCCCCAGGCCACAGGGATTTCATTAAAAATATGATAACCGGCACATCTCAAGCCGATTGCGCCGTACTCATCGTCGCCGCTGGTGTGGGTGAGTTCGAGGCAGGTATTTCTAAAAATGGCCAGACACGCGAACATGCTCTTCTGGCTTATACACTCGGGGTTAAACAGCTCATAGTAGGAGTGAATAAGATGGACTCCACTGAACCCGCCTATTCAGAGAAGCGCTATGACGAAATTGTAAAGGAGGTCTCAGCATATATTAAAAAAATTGGCTATAACCCAGCCACGGTGCCATTCGTCCCGATTAGTGGATGGCATGGTGACAATATGCTGGAACCAAGTCCCAATATGCCTTGGTTTAAGGGTTGGAAAGTAGAGCGGAAAGAGGGTAATGCTTCCGGCGTGTCATTGCTGGAGGCGCTTGACACGATACTCCCACCCACAAGGCCAACTGATAAGCCACTCCGATTGCCCTTGCAGGACGTGTACAAGATTGGGGGAATTGGGACTGTGCCCGTCGGGCGCGTGGAGACGGGCATCCTCAGACCTGGGATGGTAGTCACTTTTGCCCCCGTCAACATAACGACTGAAGTTAAATCAGTGGAAATGCATCACGAAGCTTTGAGTGAGGCGCTTCCCGGAGATAACGTTGGATTTAATGTCAAAAATGTCTCCGTTAAAGATATAAGAAGAGGAAACGTCTGCGGTGACTCAAAGTCAGACCCACCACAGGAGGCTGCTCAATTTACGAGTCAAGTAATAATTCTGAATCACCCTGGGCAAATAAGTGCGGGATACTCTCCAGTCATCGATTGTCACACCGCCCATATTGCATGTAAGTTCGCAGAACTTAAGGAAAAGATCGACCGAAGAAGCGGAAAAAAATTGGAAGATAATCCGAAAAGTTTGAAAAGCGGTGACGCGGCGATTGTAGAGATGGTCCCTGGCAAACCGATGTGTGTGGAGTCTTTCAGTCAATATCCACCACTCGGTCGCTTTGCCGTGCGGGATATGCGACAGACCGTTGCTGTCGGCGTAATAAAAAACGTCGAAAAAAAGAGCGGTGGGGCTGGAAAAGTTACAAAATCCGCTCAAAAGGCACAGAAGGCGGGCAAGTGA
(서열번호 5).
eEF1A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다:
ATGGGTAAAGAAAAGACCCACATTAACATAGTAGTAATCGGTCATGTTGACTCTGGGAAAAGCACTACTACCGGACATTTGATCTATAAATGTGGGGGCATCGACAAAAGAACGATAGAGAAGTTTGAGAAGGAGGCGGCGGAGATGGGTAAAGGTAGTTTTAAGTACGCTTGGGTTTTGGACAAATTGAAAGCCGAGCGCGAGCGCGGCATTACCATTGACATTTCTCTCTGGAAATTCGAAACTACGAAGTATTATATAACAATAATAGACGCCCCCGGCCATCGGGACTTTATTAAAAACATGATTACAGGAACTAGCCAAGCAGATTGTGCTGTGCTGATAGTAGCGGCAGGGGTCGGGGAGTTCGAAGCAGGCATCTCTAAAAATGGACAAACTCGAGAGCACGCCTTGTTGGCTTATACCTTGGGCGTAAAGCAGCTGATCGTAGGAGTTAATAAAATGGATTCCACTGAACCCGCATATAGCGAAAAGCGATATGACGAAATAGTAAAGGAAGTCTCAGCTTATATCAAGAAAATCGGTTACAATCCTGCGACGGTTCCATTCGTTCCTATCTCCGGGTGGCACGGCGATAATATGCTTGAGCCCAGTCCCAATATGCCCTGGTTCAAGGGGTGGAAGGTTGAGAGGAAGGAAGGCAATGCATCAGGCGTCAGCTTGTTGGAAGCTCTCGACACCATCCTGCCGCCCACGAGGCCCACAGACAAACCGTTGCGACTGCCTCTTCAAGATGTATACAAAATAGGCGGGATAGGAACCGTGCCGGTTGGACGAGTAGAGACGGGTATACTGCGGCCCGGAATGGTCGTGACGTTTGCACCCGTGAATATAACTACTGAGGTGAAGAGCGTCGAGATGCACCATGAAGCGCTGAGTGAAGCTCTCCCTGGCGATAACGTAGGGTTCAACGTGAAAAACGTAAGTGTAAAGGATATAAGGCGCGGAAATGTATGTGGTGACAGTAAAAGCGACCCGCCGCAAGAGGCGGCGCAATTCACATCACAGGTAATAATATTGAATCACCCCGGCCAAATTTCCGCAGGCTACTCACCAGTCATAGATTGCCACACCGCCCACATAGCTTGTAAGTTCGCTGAGTTGAAAGAGAAGATTGATAGACGAAGTGGGAAGAAACTTGAAGACAATCCGAAGTCCCTGAAGTCCGGTGACGCAGCGATTGTAGAAATGGTACCGGGCAAGCCAATGTGTGTAGAGTCTTTCAGCCAGTACCCACCACTGGGGCGGTTCGCGGTGCGAGACATGAGGCAAACGGTTGCGGTCGGCGTCATTAAAAATGTCGAAAAAAAGAGTGGCGGTGCAGGTAAGGTCACAAAAAGCGCACAAAAGGCCCAGAAAGCCGGTAAGTGA
(서열번호 6).
eEF1A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다:
ATGGGAAAGGAAAAAACTCACATAAACATTGTCGTCATCGGTCACGTAGACAGTGGCAAATCAACGACCACTGGACATCTCATCTATAAGTGTGGCGGTATTGACAAACGCACTATCGAGAAATTCGAAAAGGAGGCTGCTGAGATGGGCAAAGGCTCTTTCAAGTACGCATGGGTCCTGGATAAGCTGAAAGCGGAGCGAGAGAGAGGGATCACCATCGATATATCTCTGTGGAAATTTGAAACCACCAAGTACTACATCACAATTATTGATGCCCCAGGTCATAGGGATTTTATCAAGAACATGATCACCGGGACAAGCCAAGCCGACTGCGCAGTTCTCATAGTGGCGGCTGGAGTAGGGGAGTTTGAAGCAGGGATATCTAAGAATGGACAGACCCGCGAGCACGCCTTGCTGGCCTACACCCTGGGAGTGAAGCAGCTCATAGTTGGCGTCAATAAGATGGACAGCACCGAACCCGCCTACAGTGAGAAGAGGTATGACGAGATTGTGAAGGAGGTTTCTGCTTACATTAAAAAGATTGGCTATAACCCAGCTACTGTCCCATTCGTTCCAATCAGCGGCTGGCACGGTGATAACATGCTGGAGCCTAGTCCCAACATGCCGTGGTTCAAGGGGTGGAAGGTTGAACGCAAGGAGGGGAATGCCTCAGGCGTTTCCCTGCTGGAGGCCCTCGATACAATACTCCCCCCGACCCGGCCTACAGATAAACCGCTGCGACTGCCTCTTCAGGACGTGTATAAAATCGGGGGAATCGGCACAGTGCCCGTGGGCAGGGTAGAGACTGGCATCTTGCGGCCTGGAATGGTAGTCACCTTTGCCCCGGTTAATATCACAACGGAGGTGAAATCTGTGGAGATGCATCACGAAGCACTGAGCGAGGCTCTGCCTGGTGACAACGTGGGATTTAACGTCAAAAACGTGTCAGTCAAGGACATCCGCCGCGGTAACGTTTGCGGAGATTCTAAGTCCGATCCCCCCCAGGAGGCAGCCCAATTTACCTCCCAAGTGATCATTCTGAATCACCCAGGCCAAATTTCCGCCGGGTATTCCCCTGTGATTGACTGTCACACAGCACACATCGCATGCAAATTCGCCGAACTCAAGGAGAAAATTGATCGGAGAAGCGGTAAAAAACTGGAGGACAACCCAAAGTCCCTCAAGTCTGGGGATGCCGCCATCGTGGAGATGGTACCAGGCAAACCTATGTGCGTGGAAAGTTTTAGCCAGTACCCTCCACTGGGTCGCTTTGCTGTTCGGGATATGCGGCAGACAGTAGCGGTTGGGGTCATAAAAAACGTCGAGAAAAAGAGCGGAGGAGCTGGGAAAGTTACCAAATCCGCACAGAAGGCACAAAAAGCCGGAAAATGA
(서열번호 7).
eEF1A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다:
ATGGGCAAAGAGAAAACACATATTAACATTGTTGTTATCGGGCACGTTGATAGCGGCAAGTCCACTACCACTGGCCATCTGATTTACAAGTGCGGCGGAATCGATAAACGAACTATTGAAAAGTTCGAAAAAGAAGCCGCCGAGATGGGAAAGGGCTCCTTTAAATACGCTTGGGTCCTCGATAAACTCAAAGCAGAACGGGAGAGAGGAATCACCATCGATATATCCTTGTGGAAGTTCGAAACTACAAAATATTACATTACCATCATTGATGCGCCTGGGCACCGCGACTTCATTAAGAACATGATTACTGGCACCTCTCAAGCCGACTGCGCAGTGTTGATCGTAGCCGCAGGCGTCGGGGAGTTCGAAGCTGGGATCAGCAAGAACGGGCAGACTAGGGAACACGCTCTGCTCGCATATACTCTTGGCGTGAAACAGTTGATCGTTGGCGTGAACAAGATGGATTCAACTGAGCCTGCCTATTCTGAGAAACGATACGACGAGATTGTGAAAGAGGTTTCAGCTTACATCAAGAAAATTGGGTATAATCCCGCAACAGTTCCCTTCGTGCCCATCTCTGGGTGGCACGGCGACAACATGCTCGAACCATCCCCAAATATGCCATGGTTCAAGGGATGGAAGGTGGAGCGCAAAGAAGGCAACGCCTCCGGAGTGTCTCTGCTCGAGGCCCTGGACACCATTCTGCCCCCAACACGACCCACTGATAAGCCTCTGAGACTGCCACTGCAAGACGTTTACAAAATTGGGGGAATTGGAACCGTGCCTGTGGGTCGGGTGGAAACCGGAATCCTCAGACCCGGCATGGTGGTCACCTTCGCACCAGTGAATATAACGACAGAGGTCAAATCTGTGGAGATGCACCATGAGGCATTGAGCGAGGCACTCCCAGGAGACAACGTGGGTTTCAACGTGAAAAATGTCTCAGTTAAGGACATCCGACGCGGCAACGTGTGCGGAGATAGCAAATCTGACCCCCCCCAGGAGGCCGCTCAATTCACAAGTCAGGTTATCATCCTTAATCACCCTGGCCAAATATCTGCAGGCTACAGCCCCGTGATCGATTGTCACACAGCTCATATCGCCTGTAAATTTGCTGAACTCAAAGAAAAGATTGACCGCAGATCAGGAAAAAAGCTGGAGGACAACCCTAAAAGTCTGAAGTCCGGCGACGCTGCCATCGTGGAGATGGTCCCTGGGAAACCCATGTGCGTGGAGTCCTTTTCTCAGTACCCCCCTCTGGGACGATTCGCCGTGCGCGACATGAGACAGACTGTCGCCGTGGGCGTCATTAAAAATGTGGAAAAAAAATCAGGAGGTGCAGGGAAAGTGACAAAGAGTGCCCAGAAAGCACAGAAGGCTGGCAAGTGA
(서열번호: 8).
선택적으로, 벡터 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 GCCACCATGG(서열번호 10)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 코작 서열을 포함할 수 있다. 코작 서열은 eEF1A2 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 중첩될 수 있다. 예를 들어, 벡터 게놈은 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다(코작에는 밑줄이 그어져 있음):
gccaccATGGGCAAGGAGAAGACCCACATCAACATCGTGGTCATCGGCCACGTGGACTCCGGAAAGTCCACCACCACGGGCCACCTCATCTACAAATGCGGAGGTATTGACAAAAGGACCATTGAGAAGTTCGAGAAGGAGGCGGCTGAGATGGGGAAGGGATCCTTCAAGTATGCCTGGGTGCTGGACAAGCTGAAGGCGGAGCGTGAGCGCGGCATCACCATCGACATCTCCCTCTGGAAGTTCGAGACCACCAAGTACTACATCACCATCATCGATGCCCCCGGCCACCGCGACTTCATCAAGAACATGATCACGGGTACATCCCAGGCGGACTGCGCAGTGCTGATCGTGGCGGCGGGCGTGGGCGAGTTCGAGGCGGGCATCTCCAAGAATGGGCAGACGCGGGAGCATGCCCTGCTGGCCTACACGCTGGGTGTGAAGCAGCTCATCGTGGGCGTGAACAAAATGGACTCCACAGAGCCGGCCTACAGCGAGAAGCGCTACGACGAGATCGTCAAGGAAGTCAGCGCCTACATCAAGAAGATCGGCTACAACCCGGCCACCGTGCCCTTTGTGCCCATCTCCGGCTGGCACGGTGACAACATGCTGGAGCCCTCCCCCAACATGCCGTGGTTCAAGGGCTGGAAGGTGGAGCGTAAGGAGGGCAACGCAAGCGGCGTGTCCCTGCTGGAGGCCCTGGACACCATCCTGCCCCCCACGCGCCCCACGGACAAGCCCCTGCGCCTGCCGCTGCAGGACGTGTACAAGATTGGCGGCATTGGCACGGTGCCCGTGGGCCGGGTGGAGACCGGCATCCTGCGGCCGGGCATGGTGGTGACCTTTGCGCCAGTGAACATCACCACTGAGGTGAAGTCAGTGGAGATGCACCACGAGGCTCTGAGCGAAGCTCTGCCCGGCGACAACGTCGGCTTCAATGTGAAGAACGTGTCGGTGAAGGACATCCGGCGGGGCAACGTGTGTGGGGACAGCAAGTCTGACCCGCCGCAGGAGGCTGCTCAGTTCACCTCCCAGGTCATCATCCTGAACCACCCGGGGCAGATTAGCGCCGGCTACTCCCCGGTCATCGACTGCCACACAGCCCACATCGCCTGCAAGTTTGCGGAGCTGAAGGAGAAGATTGACCGGCGCTCTGGCAAGAAGCTGGAGGACAACCCCAAGTCCCTGAAGTCTGGAGACGCGGCCATCGTGGAGATGGTGCCGGGAAAGCCCATGTGTGTGGAGAGCTTCTCCCAGTACCCGCCTCTCGGCCGCTTCGCCGTGCGCGACATGAGGCAGACGGTGGCCGTAGGCGTCATCAAGAACGTGGAGAAGAAGAGCGGCGGCGCCGGCAAGGTCACCAAGTCGGCGCAGAAGGCGCAGAAGGCGGGCAAG
(서열번호: 9).
일 구현예에서, 코작 서열은 다음 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어지는 대안적인 코작 서열이다:
(gcc)gccRccAUGG (서열번호 11);
AGNNAUGN;
ANNAUGG;
ACCAUGG;
GACACCAUGG (서열번호 12).
일부 구현예에서, 벡터 게놈은 코작 서열을 포함하지 않는다.
벡터 게놈
본 개시의 AAV 비리온은 벡터 게놈을 포함한다. 벡터 게놈은 발현 카세트(또는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 필요로 하지 않는 유전자-편집 용도를 위한 폴리뉴클레오티드 카세트)를 포함할 수 있다. 임의의 적절한 역위 말단 반복(ITR)이 사용될 수 있다. ITR은 캡시드와 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있다(예를 들어, AAV2 ITR이 사용될 수 있음).
일부 구현예에서, 5' ITR은 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
(서열번호 18).
일부 구현예에서, 5' ITR은 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:
GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTA
(서열번호 19).
일부 구현예에서, 5' ITR은 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTA
(서열번호 20).
일부 구현예에서, 3' ITR은 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
(서열번호 21).
일부 구현예에서, 3' ITR은 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:
TACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC
(서열번호 63).
일부 구현예에서, 벡터 게놈은 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 하나 이상의 필러 서열을 포함한다:
GCGGCAATTCAGTCGATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGATTTAAATACGCGCTCTCTTAAGGTAGCCCCGGGACGCGTCAATTGACTACAAACCGAGTATCTGCAGAGGGCCCTGCGTATG (서열번호 22);
CTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGATCCTCTCTTAAGGTAGCATCGAGATTTAAATTAGGGATAACAGGGTAATGGCGCGGGCCGC (서열번호 23); 또는
GTTACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACATTTCTGCTCACTGCAACCTCCTCCTCCCTGGGTTC (서열번호 24).
프로모터
일부 구현예에서, eEF1A2 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
본 개시는 다양한 프로모터의 사용을 고려한다. 본 개시의 구현예에 유용한 프로모터는, 제한 없이, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 또는 CMV 인핸서 및 닭 베타-액틴 프로모터 및 토끼 베타-글로빈 유전자(CAG)의 부분으로 이루어진 프로모터 서열을 포함한다. 일부 경우, 프로모터는 합성 프로모터일 수 있다. 예시적인 합성 프로모터는, Schlabach 등, PNAS USA. 107(6):2538-43 (2010)에 제공된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 다음의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:
ACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGG
(서열번호 14).
일부 구현예에서, eEF1A2 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 유도성 프로모터는 폴리뉴클레오티드 서열이 제제의 첨가 또는 축적에 반응하거나 제제의 제거, 분해 또는 희석에 반응하여 전사적으로 발현되거나 전사적으로 발현되지 않게 하도록 구성될 수 있다. 제제는 약물일 수 있다. 제제는 테트라시클린 또는 독시시클린을 포함하나 이에 한정되지 않는 이의 유도체 중 하나일 수 있다. 일부 경우, 유도성 프로모터는 tet-on 프로모터, tet-off 프로모터, 화학적으로 조절되는 프로모터, 물리적으로 조절되는 프로모터(즉, 광의 존재 또는 부재, 또는 저온 또는 고온에 반응하는 프로모터)이다. 유도성 프로모터는 중금속 이온 유도성 프로모터(예컨대, 마우스 유방 종양 바이러스(mMTV) 프로모터 또는 다양한 성장 호르몬 프로모터), 및 T7 RNA 중합효소의 존재 하에 활성인 T7 파지로부터의 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 이러한 목록은 비제한적이다.
일부 경우, 프로모터는 비-신경 세포에서보다 더 큰 정도로 뉴런에서 발현을 유도할 수 있는 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 조직 특이적 프로모터는, hSYN1(인간 시냅신), INA(알파-인터넥신), NES(네스틴), TH(티로신 히드록실라아제), FOXA2(Forkhead box A2), CaMKII(칼모둘린-의존성 단백질 II 키나아제), 및 NSE(뉴런-특이적 엔올라아제)를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 다양한 뉴런 특이적 프로모터로부터 선택된다. 일부 경우, 프로모터는 유비쿼터스 프로모터이다. "유비쿼터스 프로모터"는 실험 또는 임상 조건 하에서 조직 특이적이지 않은 프로모터를 지칭한다. 일부 경우, 유비쿼터스 프로모터는 CMV, CAG, UBC, PGK, EF1-알파, GAPDH, SV40, HBV, 닭 베타-액틴, 및 인간 베타-액틴 프로모터 중 어느 하나이다.
일부 구현예에서, 프로모터 서열은 표 3으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 3, 14, 16, 17, 및 25 내지 30 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00001
바람직한 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호 3과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
프로모터의 추가 예시적인 예는 시미안 바이러스 40 유래 SV40 후기 프로모터, 바쿨로바이러스 폴리헤드론 인핸서/프로모터 요소, 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나아제(HSV tk), 시토메갈로바이러스(CMV) 유래의 즉각적 초기 프로모터, 및 LTR 요소를 포함하는 다양한 레트로바이러스 프로모터이다. 다양한 다른 프로모터가 당업계에 공지되어 있고 일반적으로 이용 가능하며, 많은 이러한 프로모터의 서열은 GenBank 데이터베이스와 같은 서열 데이터베이스에서 이용 가능하다.
다른 조절 요소
일부 경우, 본 개시의 벡터는, 인핸서, 인트론, poly-A 신호, 2A 펩티드 암호화 서열, WPRE(마멋(Woodchuck) 간염 바이러스 전사후 조절 요소), 및 HPRE(간염 B 전사후 조절 요소)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조절 요소를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 CMV 인핸서를 포함한다.
특정 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 인핸서를 포함한다. 특정 구현예에서, 인핸서는 CMV 인핸서 서열, GAPDH 인핸서 서열, β-액틴 인핸서 서열, 또는 EF1-α 인핸서 서열이다. 전술한 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, CMV 즉각적 초기(IE) 인핸서의 서열은 다음과 같다:
ACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA
(서열번호 31).
특정 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 인트론을 포함한다. 특정 구현예에서, 인트론은 토끼 글로빈 인트론 서열, 닭 β-액틴 인트론 서열, 합성 인트론 서열, 또는 EF1-α 인트론 서열이다.
특정 구현예에서, 벡터는 polyA 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, polyA 서열은 토끼 글로빈 polyA 서열, 인간 성장 호르몬 polyA 서열, 소 성장 호르몬 polyA 서열, PGK polyA 서열, SV40 polyA 서열, 또는 TK polyA 서열이다. 일부 구현예에서, ploy-A 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(bGHpA)일 수 있다.
특정 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 전사체 안정화 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 전사체 안정화 요소는 WPRE 서열, HPRE 서열, 스캐폴드-부착 영역, 3' UTR, 또는 5' UTR이다. 특정 구현예에서, 벡터는 5' UTR 및 3' UTR 둘 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 표 4로부터 선택되는 5' 미번역 영역(UTR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호 32 내지 40 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00002
일부 구현예에서, 벡터는 표 5로부터 선택되는 3' 미번역 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호 41 내지 49 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00003
일부 구현예에서, 벡터는 표 6으로부터 선택되는 폴리아데닐화(polyA) 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, polyA 신호는 서열번호 50 내지 54 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
Figure pct00004
예시적인 벡터 게놈은 도 2 내지 도 5에 도시되어 있고 서열번호 55 내지 58 또는 65 내지 68로서 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터 게놈은, 선택적으로 소문자인 ITR 서열을 포함하거나 포함하지 않는 서열번호 55 내지 58 또는 65 내지 68 중 어느 하나와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 코딩 서열에는 밑줄이 그어져 있다. 대안적인 벡터 게놈 서열은 서열번호 65 내지 68로서 제공된다.
V1 - 벡터 게놈 - 3,144 bp (도 2) (서열번호 55)
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctGCGGCAATTCAGTCGATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGATTTAAATACGCGCTCTCTTAAGGTAGCCCCGGGACGCGTCAATTGACTACAAACCGAGTATCTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGATGGGCAAGGAGAAGACCCACATCAACATCGTGGTCATCGGCCACGTGGACTCCGGAAAGTCCACCACCACGGGCCACCTCATCTACAAATGCGGAGGTATTGACAAAAGGACCATTGAGAAGTTCGAGAAGGAGGCGGCTGAGATGGGGAAGGGATCCTTCAAGTATGCCTGGGTGCTGGACAAGCTGAAGGCGGAGCGTGAGCGCGGCATCACCATCGACATCTCCCTCTGGAAGTTCGAGACCACCAAGTACTACATCACCATCATCGATGCCCCCGGCCACCGCGACTTCATCAAGAACATGATCACGGGTACATCCCAGGCGGACTGCGCAGTGCTGATCGTGGCGGCGGGCGTGGGCGAGTTCGAGGCGGGCATCTCCAAGAATGGGCAGACGCGGGAGCATGCCCTGCTGGCCTACACGCTGGGTGTGAAGCAGCTCATCGTGGGCGTGAACAAAATGGACTCCACAGAGCCGGCCTACAGCGAGAAGCGCTACGACGAGATCGTCAAGGAAGTCAGCGCCTACATCAAGAAGATCGGCTACAACCCGGCCACCGTGCCCTTTGTGCCCATCTCCGGCTGGCACGGTGACAACATGCTGGAGCCCTCCCCCAACATGCCGTGGTTCAAGGGCTGGAAGGTGGAGCGTAAGGAGGGCAACGCAAGCGGCGTGTCCCTGCTGGAGGCCCTGGACACCATCCTGCCCCCCACGCGCCCCACGGACAAGCCCCTGCGCCTGCCGCTGCAGGACGTGTACAAGATTGGCGGCATTGGCACGGTGCCCGTGGGCCGGGTGGAGACCGGCATCCTGCGGCCGGGCATGGTGGTGACCTTTGCGCCAGTGAACATCACCACTGAGGTGAAGTCAGTGGAGATGCACCACGAGGCTCTGAGCGAAGCTCTGCCCGGCGACAACGTCGGCTTCAATGTGAAGAACGTGTCGGTGAAGGACATCCGGCGGGGCAACGTGTGTGGGGACAGCAAGTCTGACCCGCCGCAGGAGGCTGCTCAGTTCACCTCCCAGGTCATCATCCTGAACCACCCGGGGCAGATTAGCGCCGGCTACTCCCCGGTCATCGACTGCCACACAGCCCACATCGCCTGCAAGTTTGCGGAGCTGAAGGAGAAGATTGACCGGCGCTCTGGCAAGAAGCTGGAGGACAACCCCAAGTCCCTGAAGTCTGGAGACGCGGCCATCGTGGAGATGGTGCCGGGAAAGCCCATGTGTGTGGAGAGCTTCTCCCAGTACCCGCCTCTCGGCCGCTTCGCCGTGCGCGACATGAGGCAGACGGTGGCCGTAGGCGTCATCAAGAACGTGGAGAAGAAGAGCGGCGGCGCCGGCAAGGTCACCAAGTCGGCGCAGAAGGCGCAGAAGGCGGGCAAGTGAAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGATCCTCTCTTAAGGTAGCATCGAGATTTAAATTAGGGATAACAGGGTAATGGCGCGGGCCGCaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg
V2 - 벡터 게놈 - 3,035 bp (도 3) (서열번호 56)
gcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtaAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGCCACCATGGGCAAGGAGAAGACCCACATCAACATCGTGGTCATCGGCCACGTGGACTCCGGAAAGTCCACCACCACGGGCCACCTCATCTACAAATGCGGAGGTATTGACAAAAGGACCATTGAGAAGTTCGAGAAGGAGGCGGCTGAGATGGGGAAGGGATCCTTCAAGTATGCCTGGGTGCTGGACAAGCTGAAGGCGGAGCGTGAGCGCGGCATCACCATCGACATCTCCCTCTGGAAGTTCGAGACCACCAAGTACTACATCACCATCATCGATGCCCCCGGCCACCGCGACTTCATCAAGAACATGATCACGGGTACATCCCAGGCGGACTGCGCAGTGCTGATCGTGGCGGCGGGCGTGGGCGAGTTCGAGGCGGGCATCTCCAAGAATGGGCAGACGCGGGAGCATGCCCTGCTGGCCTACACGCTGGGTGTGAAGCAGCTCATCGTGGGCGTGAACAAAATGGACTCCACAGAGCCGGCCTACAGCGAGAAGCGCTACGACGAGATCGTCAAGGAAGTCAGCGCCTACATCAAGAAGATCGGCTACAACCCGGCCACCGTGCCCTTTGTGCCCATCTCCGGCTGGCACGGTGACAACATGCTGGAGCCCTCCCCCAACATGCCGTGGTTCAAGGGCTGGAAGGTGGAGCGTAAGGAGGGCAACGCAAGCGGCGTGTCCCTGCTGGAGGCCCTGGACACCATCCTGCCCCCCACGCGCCCCACGGACAAGCCCCTGCGCCTGCCGCTGCAGGACGTGTACAAGATTGGCGGCATTGGCACGGTGCCCGTGGGCCGGGTGGAGACCGGCATCCTGCGGCCGGGCATGGTGGTGACCTTTGCGCCAGTGAACATCACCACTGAGGTGAAGTCAGTGGAGATGCACCACGAGGCTCTGAGCGAAGCTCTGCCCGGCGACAACGTCGGCTTCAATGTGAAGAACGTGTCGGTGAAGGACATCCGGCGGGGCAACGTGTGTGGGGACAGCAAGTCTGACCCGCCGCAGGAGGCTGCTCAGTTCACCTCCCAGGTCATCATCCTGAACCACCCGGGGCAGATTAGCGCCGGCTACTCCCCGGTCATCGACTGCCACACAGCCCACATCGCCTGCAAGTTTGCGGAGCTGAAGGAGAAGATTGACCGGCGCTCTGGCAAGAAGCTGGAGGACAACCCCAAGTCCCTGAAGTCTGGAGACGCGGCCATCGTGGAGATGGTGCCGGGAAAGCCCATGTGTGTGGAGAGCTTCTCCCAGTACCCGCCTCTCGGCCGCTTCGCCGTGCGCGACATGAGGCAGACGGTGGCCGTAGGCGTCATCAAGAACGTGGAGAAGAAGAGCGGCGGCGCCGGCAAGGTCACCAAGTCGGCGCAGAAGGCGCAGAAGGCGGGCAAGTGATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCACTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCCCAAGTTGGGAAGAAACCTGTAGGGCCTGCGTTACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACATTTCTGCTCACTGCAACCTCCTCCTCCCTGGGTTCtacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgc
V3 - 벡터 게놈 - 3,263 bp (도 4) (서열번호 57)
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일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, HuBA 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGlobin-Oc를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CMV 프로모터, TPL-eMLP 인핸서, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(r), 및 pAGlobin-Oc를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, Syn 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(r), 3'UTR(글로빈), 및 pAGH-Bt를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CBA 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, pAGH-Bt를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, EF1α 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGlobin-Oc를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, HuBA 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 및 pAGH-Bt를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, Syn 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 3'UTR(글로빈), 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CaMKIIa 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(r), 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CMV 프로모터, TPL-eMLP 인핸서, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(r), 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, HuBA 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CMV 프로모터, TPL/eMLP 인핸서, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 3'UTR(글로빈), 및 pAGH-Bt를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, EF1α 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(r), 및 pAGH-Bt를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, Syn 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 및 pAGlobin-Oc를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CaMKIIa 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 및 pAGlobin-Oc를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CBA 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 3'UTR(글로빈), 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CBA 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 3'UTR(글로빈), 및 pAGlobin-Oc를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CaMKIIa 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 및 pAGH-Bt를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, EF1α 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 3'UTR(글로빈), 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CMV 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 3'UTR(글로빈), 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CMV 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, hSYN 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGH-Bt를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, hSYN 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, hSYN 프로모터, 코작, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CAG 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CAG 프로모터, 코작, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, hSYN 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGH-Bt를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, hSYN 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, hSYN 프로모터, 코작, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CAG 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Hs를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로, CAG 프로모터, 코작, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Hs를 포함한다.
아데노-연관 바이러스 벡터
아데노-연관 바이러스(AAV)는 복제-결핍 파보바이러스이며, 이의 단일-가닥 DNA 게놈은 2 내지 145개-뉴클레오티드 역위 말단 반복(ITR)을 포함하는 약 4.7 kb 길이이다. 항원 에피토프에 의해 분류될 경우, 때때로 혈청형으로도 지칭되는, AAV의 다수의 공지된 변이체가 존재한다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, AAV-1의 전체 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_002077에 제공되고; AAV-2의 전체 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001401 및 Srivastava 등, J. Virol., 45: 555-564 (1983)에 제공되고; AAV-3의 전체 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_1829에 제공되고; AAV-4의 전체 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001829에 제공되고; AAV-5 게놈은 GenBank 수탁 번호 AF085716에 제공되고; AAV-6의 전체 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_00 1862에 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 GenBank 수탁 번호 AX753246 및 AX753249에 각각 제공되고; AAV-9 게놈은 Gao 등, J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)에 제공되고; AAV-10 게놈은 Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)에 제공되며; AAV-11 게놈은 Virology, 330(2): 375-383 (2004)에 제공된다. AAVrh.74 게놈의 서열은 본원에 참조로서 통합되는 미국 특허 제9,434,928호에 제공된다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡슐화/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 유도하는 cis-작용 서열은 AAV ITR 내에 포함된다. 3개의 AAV 프로모터(상대적인 맵 위치에 대해 p5, p19 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 2개의 AAV 내부 개방 해독 프레임의 발현을 유도한다. (뉴클레오티드 2107 및 2227에서의) 단일 AAV 인트론의 차등 스플라이싱과 커플링된 2개의 rep 프로모터(p5 및 p19)는 rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질(rep78, rep68, rep52 및 rep40)을 생산한다. Rep 단백질은 바이러스 게놈의 복제를 궁극적으로 담당하는 다수의 효소적 특성을 갖는다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고, 이는 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. 대체 스플라이싱 및 비-컨센서스 번역 시작 부위는 3개의 관련 캡시드 단백질의 생산을 담당한다. 단일 컨센서스 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치한다. AAV의 수명 주기 및 유전자는 Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)에서 검토되어 있다.
AAV는, 예를 들어 유전자 요법에서 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 이를 주목하게 하는 고유 특징을 갖는다. 배양물 중 세포의 AAV 감염은 비세포병성이며, 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 침묵적이고 무증상이다. 또한, AAV는 많은 포유류 세포를 감염시켜 생체 내 많은 상이한 조직을 표적화할 가능성을 허용한다. 또한, AAV는 서서히 분화하는 세포 및 비분열 세포를 형질도입하며, 전사 활성 핵 에피솜(염색체 외 요소)으로서 이들 세포의 수명 동안 본질적으로 연명할 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은 플라스미드 내에 클로닝된 DNA로서 삽입되며, 이는 재조합 게놈의 작제를 가능하게 한다. 또한, AAV 복제 및 게놈 캡슐화를 유도하는 신호는 AAV 게놈의 ITR 내에 포함되기 때문에, (복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap을 암호화하는) 게놈 내부의 약 4.3 kb의 일부 또는 전부가 외래 DNA로 대체될 수 있다. AAV 벡터를 생성하기 위해, rep 및 cap 단백질은 trans로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 AAV가 매우 안정적이고 왕성한 바이러스라는 것이다. 이는 아데노바이러스를 불활성화하는 데 사용되는 조건(56° 내지 65°C에서 수시간 동안)을 쉽게 견뎌내며, AAV의 저온 보존에 대한 필요성을 덜어준다. AAV는 심지어 동결 건조될 수 있다. 마지막으로, AAV-감염 세포는 중복감염에 내성이 없다.
rAAV 게놈 내의 AAV DNA는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는, 재조합 바이러스가 유도될 수 있는 임의의 AAV 변이체 또는 혈청형으로부터 유래될 수 있다: AAV 변이체 또는 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV- 10, AAV-11, AAV- 12, AAV-13 및 AAVrh10. 위형화된 rAAV의 생산은, 예를 들어 WO 01/83692에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV가 또한 고려된다. 예를 들어, Marsic 등, Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)를 참조한다. 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다.
일부 경우, rAAV는 자기-상보성 게놈을 포함한다. 본원에서 정의되는, "자기-상보성" 또는 "이중 가닥" 게놈을 포함하는 rAAV는, McCarty 등의 문헌에 기술된 바와 같이, rAAV의 코딩 영역이 분자 내 이중 가닥 DNA 템플릿을 형성하게 구성되도록 조작된 rAAV를 지칭한다. 자기-상보성 재조합 아데노-연관 바이러스(scAAV) 벡터는 DNA 합성에 대해 독립적으로 효율적인 형질도입을 촉진한다. Gene Therapy. 8 (16): 1248-54 (2001). 본 개시는, 일부 경우, 자기-상보성 게놈을 포함하는 rAAV의 사용을 고려하는데, 그 이유는, 감염(예컨대 형질도입) 시, rAAV 게놈의 제2 가닥의 세포 매개 합성을 기다리기보다는, scAAV의 상보성인 2개의 절반체는 결합하여 즉각적인 복제 및 전사를 위한 준비가 된 하나의 이중 가닥 DNA(dsDNA) 유닛을 형성할 것이기 때문이다. rAAV(4.7 내지 6 kb)에서 발견되는 전체 코딩 용량 대신, 자기-상보성 게놈을 포함하는 rAAV는 그 양의 대략 절반(
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2.4 kb)만을 보유할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
다른 경우, rAAV 벡터는 단일 가닥 게놈을 포함한다. 본원에서 정의되는, "단일 가닥" 게놈은 자기-상보성이 아닌 게놈을 지칭한다. 대부분의 경우, 비-재조합 AAV는 단일 가닥 DNA 게놈을 갖는다. 세포의 효율적인 형질도입을 달성하기 위해 rAAV는 scAAV여야만 한다는 몇몇 징표가 있었다. 그러나, 본 개시는, rAAV 벡터의 다른 유전적 변형이 표적 세포에서 최적의 유전자 전사를 수득하는 데 유리할 수 있다는 것을 이해하면서, 자기-상보성 게놈보다는 단일 가닥 게놈을 가질 수 있는 rAAV 벡터를 고려한다. 일부 경우, 본 개시는 마우스 눈의 전안부로의 효율적인 유전자 전달을 달성할 수 있는 단일 가닥 rAAV 벡터에 관한 것이다. Wang 등의 문헌을 참조한다. 단일 가닥 아데노-연관 바이러스는 마우스 눈의 전안부로 효율적인 유전자 전달을 달성한다. PLoS ONE 12(8): e0182473 (2017).
일부 경우, rAAV 벡터는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, 또는 AAVrh74이다. 위형화된 rAAV의 생산은, 예를 들어 WO 01/83692에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV가 또한 고려된다. 예를 들어, Marsic 등, Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)를 참조한다. 일부 경우, rAAV 벡터는 혈청형 AAV9이다. 일부 구현예에서, 전술한 rAAV 벡터는 혈청형 AAV9이고 단일 가닥 게놈을 포함한다. 일부 구현예에서, 전술한 rAAV 벡터는 혈청형 AAV9이고 자기-상보성 게놈을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV2의 역위 말단 반복(ITR) 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV2 게놈을 포함하며, 여기에서 rAAV 벡터는 AAV-2/9 벡터, AAV-2/6 벡터, 또는 AAV-2/8 벡터이다.
대부분의 공지된 AAV에 대한 캡시드 유전자를 위한 전장 서열 및 서열은 미국 특허 제8,524,446호에 제공되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 통합된다.
AAV 벡터는 야생형 AAV 서열을 포함할 수 있거나, 야생형 AAV 서열에 대한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 캡시드 단백질, 예를 들어, VP1, VP2 및/또는 VP3 내에 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형은 AAV 벡터가 대상체에게 제공될 때 감소된 면역원성을 제공한다.
rAAV의 캡시드 단백질은, rAAV가 뉴런 또는 보다 구체적으로 도파민성 뉴런과 같은 특정 관심 표적 조직에 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Albert 등, AAV Vector-Mediated Gene Delivery to Substantia Nigra Dopamine Neurons: Implications for Gene Therapy and Disease Models. Genes. 2017년 2월 8일; 또한, 미국 특허 제6,180,613호 및 미국 특허 공개 US20120082650A1호(이들 특허 둘 모두의 개시는 본원에 참조로서 통합됨)를 참조한다. 일부 구현예에서, rAAV는 대상체의 흑색질 내로 직접 주사된다.
일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV2 rAAV 비리온이다. 캡시드는 AAV2 캡시드 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, AAV2 캡시드는 다음의 기준 AAV2 캡시드(예를 들어, 다음의 서열)와 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 공유한다:
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(서열번호 59).
일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV9 rAAV 비리온이다. 캡시드는 AAV9 캡시드 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, AAV9 캡시드는 기준 AAV9 캡시드(예를 들어, 다음의 서열)와 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 공유한다:
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(서열번호 15).
일부 구현예에서, rAAV 비리온은, 제한 없이, 국제 특허 공개 번호 WO 2015/038958A1 및 WO 2017/100671A1에 기술된 것과 같은 AAV-PHP.B rAAV 비리온 또는 이의 호중구 변이체이다. 예를 들어, AAV 캡시드는 서열 TLAVPFK(서열번호 61) 또는 KFPVALT(서열번호 62)로부터의 적어도 4개의 연속적인 아미노산을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 이는 AAV9의 아미노산 588 및 589를 암호화하는 서열 사이에 삽입된다.
캡시드는 AAV-PHP.B 캡시드 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, AAV-PHP.B 캡시드는 기준 AAV-PHP.B 캡시드(예를 들어, 다음의 서열)와 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 공유한다:
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(서열번호 60).
본 개시의 rAAV 비리온에 사용된 추가적인 AAV 캡시드는 특허 공개 번호 WO 2009/012176A2 및 WO 2015/168666A2에 기술된 것들을 포함한다.
약학적 조성물 및 키트
일 양태에서, 본 개시는 본 개시의 rAAV 비리온 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
투여 목적을 위해, 예를 들어, 주사에 의해, 멸균 수용액과 같은 다양한 용액이 사용될 수 있다. 이러한 수용액은 원하는 경우 완충화될 수 있고, 액체 희석제는 우선적으로 식염수 또는 글루코스를 사용하여 등장성으로 제조될 수 있다. 유리산(DNA는 산성 인산염기를 함유함) 또는 약리학적으로 허용 가능한 염으로서의 rAAV의 용액은 PluronicTM F-68과 같은 계면활성제와 0.001% 또는 0.01%로 적절히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. rAAV의 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다. 이와 관련하여, 사용된 멸균 수성 매질은 모두 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해 용이하게 수득될 수 있다.
주사용으로 적합한 약학적 형태는, 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 모든 경우, 형태는 멸균 상태이고, 용이하게 주사할 수 있는 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우, 당류 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 지연 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 이루어질 수 있다.
멸균 주사용 용액은, rAAV를 필요에 따라 위에 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에 필요한 양으로 혼입한 후, 멸균 여과하여 제조할 수 있다. 대체적으로, 분산액은, 염기성 분산액 매질 및 위에 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 멸균된 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균 여과된 그의 용액으로부터의 활성 성분의 분말과 추가의 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 rAAV 비리온을 포함하는 키트 및 이의 사용 지침을 포함한다.
사용 방법
일 양태에서, 본 개시는 세포에서 eEF1A2 활성을 증가시키는 방법을 제공하며, 이는 해당 세포를 본 개시의 rAAV와 접촉시키는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 eEF1A2 활성을 증가시키는 방법을 제공하며, 이는 본 개시의 rAAV를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 및/또는 대상체는 eEF1A2 발현 수준 및/또는 활성이 결핍되어 있고/있거나 eEF1A2에 기능 상실 돌연변이를 포함한다. 세포는 뉴런, 예를 들어 도파민성 뉴런일 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 세포 배양물 및/또는 생체 내에서의 뉴런의 생존을 촉진한다.
치료 방법
또 다른 양태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체에서의 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 이는 본 개시의 rAAV 비리온의 유효량을 해당 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 신경 질환 또는 장애이다. 일부 구현예에서, 대상체는 eEF1A2 발현 또는 기능의 유전적 파괴를 겪는다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 eEF1A2 결핍증 및/또는 eEF1A2-관련 신경 질환(OMIM #617309, 616393, 616409) 표현형 스펙트럼, 예컨대 지적 장애, 정신 지체, 간질 뇌병증 및 자폐성 스펙트럼 장애이다.
eEF1A2 단백질의 CNS로의 AAV-매개 전달은 수명을 연장시키고, 신경 변성을 예방하고, 신경행동 결핍, 퇴행성 간질-운동이상 뇌병증, 간질 및 근긴장이상을 예방하거나 경감시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 병용 요법을 고려한다. 신규 요법과의 조합과 마찬가지로, 표준 의학적 치료(예를 들어, 코르티코스테로이드 또는 국소 감압 약물)와 본 발명의 방법의 조합이 구체적으로 고려된다. 일부 경우, 대상체는 본원에 기술된 rAAV의 투여에 대한 면역 반응을 예방하거나 감소시키기 위해 스테로이드로 치료될 수 있다.
예를 들어, 뇌실내(ICV) 또는 대뇌수조내(intra-cisterna magna)(ICM) 주사를 위한 rAAV 벡터의 치료적 유효량은, 뇌 중량 기준, 1e12 vg/kg 내지 약 5e12 vg/kg, 또는 약 1e13 vg/kg 내지 약 5e13 vg/kg, 또는 약 1e14 vg/kg 내지 약 5e14 vg/kg, 또는 약 1e15 vg/kg 내지 약 5e15 vg/kg 범위의 rAAV의 투여량이다. 또는 체중 기준으로, 1213-1e14 vg/kg의 정맥내 전달 투여량 범위이다. 본 발명은 또한 이들 범위의 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다.
예를 들어, 특정 구현예에서, rAAV 벡터의 치료적 유효량은, 1e10 vg, 약 2e10 vg, 약 3e10 vg, 약 4e10 vg, 약 5e10 vg, 약 6e10 vg, 약 7e10 vg, 약 8e10 vg, 약 9e10 vg, 약 1e12 vg, 약 2e12 vg, 약 3e12 vg, 약 4e12 vg, 또는 약 5e12 vg의 투여량이다. 본 발명은 또한 이들 투여량의 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, ICV 주사가 수행되는 경우, rAAV 벡터의 치료적 유효량은 1e10 vg/반구 내지 1e13 vg/반구, 또는 약 1e10 vg/반구, 약 1e11 vg/반구, 약 1e12 vg/반구, 또는 약 1e13 vg/반구 범위의 투여량이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, ICM 주사가 수행되는 경우, rAAV 벡터의 치료적 유효량은 총 1e10 vg 내지 총 1e14 vg, 또는 총 약 1e10 vg, 총 약 1e11 vg, 총 약 1e12 vg, 총 약 1e13 vg, 또는 총 약 1e14 vg 범위의 투여량이다.
일부 구현예에서, 치료 조성물은 주사된 치료 조성물의 부피 당 약 1e9, 1e10, 또는 1e11 초과의 rAAV 벡터의 게놈을 포함한다. 구현예에서, 치료 조성물은 mL당 대략 1e10, 1e11, 1e12, 또는 1e13 초과의 rAAV 벡터의 게놈을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료 조성물은 mL당 약 1e14, 1e13 또는 1e12 미만의 rAAV 벡터의 게놈을 포함한다.
환자에서의 기능적 개선, 임상적 이익 또는 효능의 징표는 영국-WHO 소아의 머리 둘레, 신장 및 체중 백분위 차트를 사용하여 발작 빈도(근경련성 및 전신성 긴장성 간대성 발작), 뇌 성장 및 신체 성장의 감소에 대한 대리 마커 분석에 의해 평가될 수 있다. 소아기 발작 목록 및 투약 일지와 같은 표준 질병 등급 척도, 아동의 장애 수준에 따라 적절하게 적용되는 소아 발달 운동 척도(Peabody Developmental Motor Scales) 제2판(PDMS-2) 및 베일리 영아 발달 척도(Bayley Scales of Infant Development) 제3판을 포함하는 인지 및 발달 평가, 총 운동 기능 측정(Gross motor function measure, GFMF-88), 소아 장애 평가 목록(Pediatric Evaluation of Disability Inventory, PEDI)을 사용하여 인지, 운동, 발성 및 언어 기능을 측정한다. 이러한 척도 또는 유사한 척도뿐만 아니라, 3점 척도(평균 지속 기간의 감소, 변화 없음, 또는 증가)의 전반적인 발작 지속 기간의 변화에 대한 간병인의 평가(Caregiver Global Impression of Change in Seizure Duration, CGICSD), 소아 삶의 질 평가 척도(Pediatric Quality of Life Inventory, PedsQLTM) 및 비네란트 적응 행동 척도(Vineland Adaptive Behavior Scales)-제2판은 질환 구성 요소의 개선을 입증할 수 있다. 베이스라인 및 치료 후 뇌 자기 공명 영상은 수초화 및 뇌 부피의 개선을 나타낼 수 있다. 심장 결함은 심근병증, 대동맥 결함 및 심실 중격 결손을 포함하는 상염색체 우성 EEF1A2-관련 신경발달 장애를 갖는 환자에서 관찰된다(Kaneko 등, 2021, Carvill 등, 2020; McLachlan 등, 2019). EEF1A2에서의 동형접합성 변이체는 전반적 발달 지연, 간질, 성장 장애, 확장성 심근병증 및 조기 사망을 갖는 단일 혈연에서 확인되었다(Cao 등, 2017). 심장 상태의 측정은 베이스라인 심전도 및 심초음파를 통해 모니터링될 수 있다.
임상적 이익은 수명 연장, 정상적인 신경발달 이정표 충족, 간질 발작 활성(근간대성, 간대성, 전신 강직성 간대성 및/또는 간질 연축 포함)의 빈도 또는 정도 감소, 근긴장 저하증 또는 운동 장애, 예컨대 무도무정위운동증, 근긴장 이상증 및/또는 운동 실조의 개선 또는 이의 발생의 감퇴로서 관찰될 수 있다. 신경보호 효과 및/또는 신경원복 효과의 징표는 발달에 걸친 수초화 정도, 뇌량의 두께, 및 피질 및/또는 소뇌 위축의 정도를 특성화함으로써 자기 공명 영상화(MRI)로부터 확인할 수 있다. 뇌파도(EEG) 활성의 유익한 변화는 다초점 방출의 감소 및/또는 전신 스파이크 활성의 감소로 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 정맥내 투여가 수행되는 경우, rAAV 벡터의 치료적으로 효과적인 투여량은 대상체의 총 체중 기준 약 1e12 vg/kg 내지 1e14 vg/kg 범위의 투여량이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, rAAV 벡터의 치료적으로 효과적인 투여량은 약 1e12 vg/kg, 약 2e12 vg/kg, 약 3e12 vg/kg, 약 4e12 vg/kg, 약 5e12 vg/kg, 약 6e12 vg/kg, 약 7e12 vg/kg, 약 8e12 vg/kg, 약 9e12 vg/kg, 약 1e13 vg/kg, 약 2e13 vg/kg, 약 3e13 vg/kg, 약 4e13 vg/kg, 약 5e13 vg/kg, 약 6e13 vg/kg, 약 7e13 vg/kg, 약 8e13 vg/kg, 약 9e13 vg/kg, 또는 약 1e14 vg의 투여량이다. 심장에 대한 이점의 징표는 심장 초음파 상의 안정적인 심장 기능을 포함할 수 있다.
조성물의 투여
조성물의 유효 투여량의 투여는, 전신, 국소, 직접 주사, 정맥내, 뇌, 뇌척수, 경막내, 흉골내, 객담내, 해마내, 심방내(푸타민 및/또는 카우다테), 피질내, 또는 뇌실내 투여를 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업계에서 표준인 경로로 투여될 수 있다. 일부 경우, 투여는 정맥내, 뇌, 뇌척수, 경막내, 수조내, 경피내, 해마내, 선조체내(푸타민 및/또는 카우다테), 또는 뇌실내 주사를 포함한다. 투여는 트렌델렌버그 틸팅(Trendelenberg tilting)을 사용하거나 사용하지 않고 경막내 주사에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본 발명의 rAAV 및 조성물의 유효 투여량의 국소 투여 및 전신 투여를 제공한다. 예를 들어, 전신 투여는 전체 신체가 영향을 받도록 순환계 내로 투여될 수 있다. 전신 투여는 주사, 주입 또는 이식을 통한 부모 투여를 포함한다.
특히, 본 발명의 rAAV의 투여는 rAAV 재조합 벡터를 동물의 표적 조직 내로 수송할 임의의 물리적 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다. 투여는 중추 신경계(CNS) 또는 뇌척수액(CSF) 내로의 주사 및/또는 뇌로의 직접 주사를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 뇌실내, 대뇌수조내, 경막내, 또는 뇌실질내 전달을 포함한다. 주입은 주입 펌프를 사용하여, 특수 캐뉼라, 카테터, 주사기/바늘로 수행될 수 있다. 선택적으로, 주사 부위의 표적화는 MRI 유도 영상화를 통해 이루어질 수 있다. 투여는 rAAV 비리온의 유효량, 또는 해당 rAAV 비리온을 포함하는 약학적 조성물의 CNS로의 전달을 포함할 수 있다. 이는, 예를 들어, 일측성 뇌실내 주사, 양측성 뇌실내 주사, 트렌델렌부르크 틸팅 시술을 사용하는 대뇌수조내 주입, 또는 트렌델렌부르크 틸팅 시술을 사용하지 않는 대뇌수조내 주입, 트렌델렌부르크 틸팅 시술을 사용하는 경막내 주입, 또는 트렌델렌부르크 틸팅 시술을 사용하지 않는 경막내 주입을 통해 달성될 수 있다. 본 개시의 조성물은 추가적으로 정맥내 투여될 수 있다.
CNS로의 직접 전달은 뇌실내 공간, 일측성 또는 양측성 중 하나, 특이적 신경 영역 또는 신경 표적을 함유하는 보다 일반적인 뇌 영역을 표적화하는 단계를 포함할 수 있다. 개별 환자의 뇌실내 공간, 뇌 영역 및/또는 신경 표적(들) 선택 및 후속적인 AAV의 수술 중 전달은, 다수의 영상화 기술(MRI, CT, MRI 병합과 조합된 CT)을 사용하고, 다수의 소프트웨어 플래닝 프로그램(예를 들어, Stealth 시스템, Clearpoint Neuronavigation System, Brainlab, Neuroinsspire 등)을 사용함으로써 달성될 수 있다. 뇌실내 공간 또는 뇌 영역 표적화 및 전달은 표준 정위 프레임(Leksell, CRW)의 사용, 또는 수술 중 MRI를 사용하거나 사용하지 않는 프레임 없는 접근법의 사용을 포함할 수 있다. AAV의 실제적인 전달은 AAV 벡터의 흡착을 방지하기 위한 물질로 라이닝된 내부 루멘을 갖거나 갖지 않는 바늘 또는 캐뉼라(예를 들어, Smartflow 캐뉼라, MRI 관여 캐뉼라)를 통한 주사에 의해 이루어질 수 있다. 전달 장치는 주사기 및 사전 프로그래밍된 주입 속도 및 용량을 갖는 자동 주입 또는 미세주입 펌프와 인터페이싱한다. 주사기/바늘 조합 또는 단지 바늘이 위상 프레임과 직접 인터페이싱될 수 있다. 주입은 일정한 유속 또는 대류 강화 전달을 사용하는 다양한 유속을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: 프로모터 선택
야생형 신생아 마우스에서의 생체분포 연구를 수행하여 뉴런에서의 eEF1A2의 발현을 복원하기 위한 프로모터를 선택하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 인간 시냅신(hSYN) 프로모터는 모든 다른 후보 프로모터와 비교하여 신경계에 대해 우월한 선택성 및 강력한 뉴런 발현을 나타냈다. 놀랍게도, hSYN 프로모터는 시험된 eSYN 및 다른 프로모터보다 더 큰 뉴런 선택성을 나타냈다.
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실시예 2: EEF1A2 녹아웃 마우스 모델의 AAV9 유전자 요법 치료
EEF1A2 유전자의 돌연변이에 의해 영향을 받는 대상체(예를 들어, 아동)를 위한 새로운 치료 접근법을 개발하였다. 진핵 번역 신장 인자 1 알파 2(eEF1A2)는 단백질 합성을 위해 아미노아실 전달 RNA를 리보솜으로 전달하는 데 필수적이다. EEF1A2 유전자의 돌연변이는 중증 지적 장애, 자폐증 및 간질과 관련이 있다. 현재 이에 대한 효과적인 치료제는 없다. EEF1A2 녹아웃 마우스 모델(폐기된 마우스)를 양호하게 특성화하였다. 폐기된(wst/wst) 마우스는 젖을 뗀 후 보행 장애 및 떨림을 나타냈고, 이어서 23일령까지 마비 및 운동 뉴런 변성이 이어졌다. 이러한 마우스 모델을 사용하여, 본 발명자는 단백질의 기능이 유전자 요법으로 복원될 수 있는지의 여부를 시험하였다. 인간 EEF1A2 cDNA(hSyn-eEF1A2)의 발현을 유도하기 위해, 팬 뉴런 프로모터인 인간 시냅신을 사용하여 아데노-연관 바이러스 9(AAV9)를 설계하였다. 생체 내 작제물의 발현을 추적하기 위해 eGFP 마커 유전자를 포함시켰다. 면역형광(도 7)은 AAV9-hSyn-eEF1A2-T2A-eGFP의 신생아 IC 또는 IV 주사 후 뉴런 표적화를 입증하였다. (eEF1A2-2A-eGFP 또는 eGFP 마커 단독 둘 모두에 대한) rAAV의 1회 주사로부터의 두 가지 경로의 투여 후, 면역조직화학 염색(도 8)은 CNS에서의 광범위한 이식유전자 발현을 확인하였다.
유전자 요법 벡터는 폐기된 (wst/wst) 마우스의 치료에 효과적인 것으로 입증되었다. Eef1a2-/- 녹아웃 마우스(wst/wst)는 IC 주사 시 대부분 생존하였고(3/4), IC 및 IV 주사 시 모두 생존하였다(도 9a). 미치료 마우스는 P23일차에 사망하였다. WT 마우스와 비교하여, IC 또는 IC/IV 마우스는 서로 유사하게 체중 감소를 나타내지 않은 반면, 미치료 대조군 마우스는 P23일차에 사망으로 이어지는 체중 감소를 나타냈다(도 9b). 로타로드 및 반전 그리드 분석은 치료군에서 기능의 저하를 나타내지 않았다(도 9c 및 도 9d). 이 결과는 양방향 ANOVA 및 더넷 다중 비교 시험 둘 모두에서 유의미하였다.
eEF1A2 발현은 야생형, IC 및 병용 치료에서 뇌 전체에 걸쳐 관찰되었다(도 9e 및 도 9f). eEF1A2 발현은 야생형, IC 및 병용 치료군의 척수 조직에서 존재하였다. 그러나, 미치료 폐기군 및 IV 치료군(F)에서는 발현이 없었다.
실시예 3: EEF1A2 D252H 또는 EEF1A2 G70S 또는 EEF1A2 E122K 마우스 모델의 AAV9 유전자 요법 치료
다양한 코돈 최적화뿐만 아니라 도 2 내지 도 5 및 도 6에 도시된 벡터 설계의 효능을 비교하여 우수한 효능을 갖는 벡터를 식별하였다. 실험은 인간에서 발견되는 3개의 돌연변이(D252H, G70S 및/또는 E122K)를 반복하는 마우스 모델 및/또는 중증 신경퇴행성 표현형(Del.22.ex3)을 갖는 마우스 모델에서 수행되었다. eEF1A2를 암호화하는 AAV 벡터가 생존, 체중 감소, 및 행동 표현형을 구제할 수 있는지를 확인하기 위해, 신생아 마우스 및 성체까지의 후기 발달 단계 모두에서 실험을 수행하였다. 신경행동 시험에 대한 유익한 효과의 평가는, 회전 실린더(로타로드) 상에서의 수행 능력, 매달린 와이어 표면에 매달리는 능력(와이어 행 시험), 풋 폴트(foot fault) 시험, 반전 그리드 거동, 악력, 및 정상적인 탐색적 활동 또는 비정상적인 거동(예를 들어, "경련성 거동")의 관찰을 포함하는 개방 필드에서의 거동을 포함한다. 뒷다리 클래스핑, 보행, 척추후만증 및 렛지를 따라 걷는 능력에 대한 분석을 포함하는 일련의 시험에 대한 집합적 신경스코어를 수득하여, 미치료 대조군에 비한 AAV9-eEF1A2가 주사된 마우스의 신경행동 기능을 평가할 수 있다. 수명이 연장된 Del.22.ex3(또는 EEG 이상이 있는 다른 마우스 계통) 마우스에서 발작 및 뇌파검사(EEG) 빈도의 변화는, CNS에서 비정상적인 전기적 활성을 완화시키는 데 유익한 효과를 나타냈다. 생화학적 및 조직학적 분석은 eEF1A2 발현 수준 및 CNS 내 분포에 대한 벡터 설계의 우월한 효능을 입증한다. 조직 분석은 웨스턴 블롯 및 ELISA에 의한 신선 조직 및 면역 표지에 의한 CNS의 고정된 섹션에서의 mRNA, DNA, 벡터 카피 수, 및 이식유전자 단백질 발현의 검출을 포함한다.
실시예 4: eEF1A2 부전의 wst/wst 마우스 모델에서의 인간 eEF1A2 단백질의 중앙 신경 계통으로의 AAV9-매개 전달의 효과
eEF1A2 관련 장애에 대한 선도 모델은 폐기된 마우스 모델이며, 여기에서 EEf1A2 유전자의 제1 엑손 및 모든 프로모터 요소의 자발적 결실은 eEF1A2 널(wst/wst)로 이어진다. 미치료 동물에서, 31%의 wst/wst 마우스는 P20 내지 22일차에 사망하였고, 생존 wst/wst 마우스는 체중 감소, 경련에 이어지는 체중 감소를 나타내며 이들 나머지는 24일차까지 모두 사망하였다. 미치료 동물은 또한 경련, 진행성 마비 및 체중 감소가 가장 오래 지속된 생존한 동물과 함께 손상된 악력 및 손상된 로타 로드 수행 능력을 나타낼 수 있다. 본 wst/wst 콜로니의 동물은 보다 중증인 것으로 보였으며, 보다 급성으로 악화되었고 보다 일찍 사망하였다. P23일차에서의 반전 그리드 추락 대기를 통해 손상된 악력을 관찰하였다. wst/wst 동물이 P24일차까지만 생존한 경우, 야생형 동물과 wst/wst를 유의미하게 구별하기 위한 로타 로드 수행 능력의 저하는 관찰되지 않았다.
물질 및 방법
동물 복지
모든 동물 실험은 영국 본사(UK Home Office) 및 1986년 동물(과학적 절차) 법(Animal (Scientific Procedures) Act)을 준수하여, University College London 윤리 검토 위원회(ethical review committee)의 지침에 따라 수행하였다. 본 연구에 사용된 wst/wst eEF1A2 널 마우스 모델은 이전에 기술되었다(Chambers D 외, PNAS 95:4463-8 (1998)). 이형접합성 마우스를 시간 교배시켜 혼합 유전자형 한배새끼를 생성하였다. 프라이머(Primers EEF1A2 Mut F 5' ACCAGTGGTTTCACCTGCTC 3', EEF1A2 Common R 5' CACTGTGGGGGCTCTGGTTT 3', EEF1A2 WT F 5' CAGAGCTTCACTCAGTCTG 3')를 사용하여 P0일차에 새끼(pup)의 유전자형을 분석하였다.
AAV9-eEF1A2 벡터 또는 대조군 물품의 투여는 P0일차에 신생아 동형접합성 wst/wst 또는 야생형 한배새끼에게 양측 뇌실내 주사로 수행되었고, 인간 종말점(체중 감소 ≥ 15%) 또는 희생 시점 P60일차까지 동물을 추적하였다. 뇌실내 주사는 전술한 바와 같이 P0-1 마우스의 외측 심실에 주사되었다(Newbery HJ 등, J Neuropathol Exp Neurol 64:295-303 (2005)). 33-게이지 바늘(Hamilton)을 3 mm의 깊이로 주사 부위에 수직으로 삽입하고 5 μl의 벡터를 5초에 걸쳐 외측 심실에 투여하였다. 새끼를 즉시 어미에게 돌려주었다. 유전자 요법 치료 wst/wst 마우스의 경우 군의 크기는 6마리였고, 7회의 출산에 걸친 14 내지 16마리의 대조군 한배새끼가 있었다.
거동 연구
마우스를 정기적으로 칭량하고, 일반적인 웰빙의 변화에 대해 평가하였으며, 인도적 종말점을 충족시켰다. 거동 시험인 로타로드, 및 반전 그리드 시험을 P23일차에 수행하였다. 모든 거동 시험은 동물 치료군에 대해 맹검인 연구원에 의해 수행되었다. 4 내지 40 r.p.m.에서 최대 5분 동안의 연속 가속 하 로타로드(Harvard Devices®) 위에 마우스를 놓았다. 마우스가 로드에서 추락하는 시간을 각 시험일마다 각 동물에 대해 3회의 시험으로 기록하였다(추락 대시 시간). 반전 그리드 시험은 30 cm 높이의 플라스틱 투명 박스 위에 놓이는 스테인리스 스틸 그리드(41 x 25 cm) 상에 마우스를 놓는 방식으로 진행되었다. 반전 그리드에서 추락하기까지의 대기 시간을 최장 5분으로 기록하였다. 각 시험일에 반전 그리드 시험을 마우스당 3회 반복하였다.
마우스 조직의 조직학 및 면역조직화학 분석
PBS를 사용하여 말단 경심 관류로 마우스를 도태시켰다. 상이한 처리 기술을 적용하기 위해 채취된 조직(뇌 및 내장 기관)을 반으로 나누었다. 면역조직화학에 사용된 뇌를 48시간 동안 4% PFA에 사후 고정시키고, 30% 수크로오스 용액으로 옮기고 동결 보호를 위해 절단 시까지 4°C로 유지하였다. 뇌는 양쪽 관상면에서 40 mm 두께의 냉동 마이크로톰(ThermoFisher® HM430)에 장착되었다. 전뇌 면역조직화학을 위해 240 mm 간격으로 선택된 뇌 절편을 사용하여 유리-유동 면역조직화학-기반 분석을 수행하였다. 요약하면, 유리 유동 절편을 0.1% 트리톤-X(TBS-T)(Sigma®)를 포함하는 15% 정상 염소 혈청(Vector Laboratories®)-트리스 완충 식염수에 넣어 실온에서 1시간 동안 차단시키고, 10% 정상 염소 혈청-TBS-T 중 일차 항체인 토끼 eEF1A2(Proteintech®) 중 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 절편을 각각 종 특이적 이차 항체(Vector Laboratories®)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, TBS에서 세척한 다음, 벡타스테인 아비딘-비오틴 용액(Vector Laboratories®)과 함께 인큐베이션한다. 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)(Sigma®)로 반응을 시각화하였다. 얼음 냉각 1 x TBS를 사용하여 DAB 반응을 중단시키고, 절편을 세척하고 이중 코팅된 젤라틴화 유리 슬라이드에 장착하였다. 장착된 절편을 공기 건조시키고, 커버슬립을 위한 장착물(DPX, VWR International®)로 덮기 전에 100% 에탄올 중에서 10분 동안 탈수시키고, 탈수 용액(Histoclear??, National Diagnostics®) 중에서 30분 동안 탈수시켰다.
면역형광의 경우, 뇌 절편을 15% 염소 혈청 중에서 30분 동안 차단시킨 다음, 10% 정상 염소 혈청 TBS-T 0.3%로 희석된 일차 항체(토끼 eEF1A2 1:1000 Proteintech® 및 마우스 NeuN 1:1000 Milipore)와 함께 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 절편을 1 x TBS 중에서 세척하고, 10% 정상 염소 혈청 중 희석된 Alexa 488 및 Alexa 594(모두 Invitrogen®으로부터 수득함)로 표지된 각각의 종-특이적 이차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. NV4ei를 DAPI(Sigma Aldrich®)로 2분 동안 염색하였다. 뇌 절편을 이중 코팅된 슬라이드 상에 장착하고, Fluromount GTM(Thermofisher Scientific®)을 사용하여 커버슬립하였다.
Leica DFC420 카메라 시스템에 연결된 Leica DM 4000을 사용하여 광 현미경 및 형광 이미징을 수행하였다. Leica TCS SP5 AOBS 공초점 현미경을 사용하여 공초점 이미지를 캡쳐하였다. Image J 소프트웨어(National Institutes of Health)로 이미지를 분석하였다.
면역블로팅
프로테아제 억제제(Roche®)가 보충된 얼음 냉각 0.32 M 수크로오스 중 마우스 뇌 조직으로부터 Qiagen® 조직 용해기를 사용하여 단백질을 추출하고, 4도에서 15분 동안 원심분리하였다. Pierce BCA Protein Assay kit(Thermo Scientific®)로 단백질 농도를 측정하였다: 10 μg의 단백질을 디티오트레이톨(DTT)을 사용하여 Laemmli 완충액(Bio-Rad Laboratories®)으로 변성시켰다. 단백질을 Mini-PROTEAN TGXTM Stain Free Gels(Bio-Rad Laboratories®)로 분리하고, Trans-Blot Turbo Transfer 멤브레인(Bio-Rad Laboratories®)으로 옮겼다. Biorad® 차단 완충액 중 실온에서 1시간 동안 차단시킨 후, 멤브레인을 일차 항체 토끼 eEF1A2(Proteintech®, 1:1000) 및 마우스 GAPDH(Ab Cam®, 1:10,000)와 함께 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 이에 이어서, 멤브레인을 이차 StarBrightTM Blue 520 염소 항-토끼 IgG(1:3000) 및 StarBrightTM Blue 700 염소 항-마우스 IgG(1:3000)와 함께 인큐베이션하였다. Chemidoc MP(Bio-Rad Laboratories®)로 면역 반응성 단백질을 가시화하였다. 샘플은 n = 4 또는 5의 생물학적 복제물로 로딩되었다.
qRT-PCR mRNA 전사물 발현 분석
RNA를 RNeasyTM 미니 키트(Qiagen®)로 추출된 뇌 균질물(전뇌, 군 당 피질 n = 4 또는 5의 생물학적 복제물)로부터 제조업체의 지침에 따라 추출하고 Omega FluostarTM 상에서 정량화하였다. High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Bioscience®)로 역전사를 수행하기 전, DNAse I 정제 키트(NEB®)를 사용하여 전체 RNA(1 μg)로부터 오염 DNA를 제거하였다. 이에 이어서, 10 ng의 DNA 또는 합성된 cDNA를 사용하여, Quantstudio?? Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems®)에서 Luna Taqman?? 마스터믹스(NEB®)로 멀티플렉스 hEEF1A2 및 mGAPDH RT-qPCR(eEF1A2__Fwd1: ATCGTGGGCGTGAACAAA, eEF1A2 _Rev1:GGTTGTAGCCGATCTTCTTGAT, eEF1A2 _Probe: ATCGTCAAGGAAGTCAGCGCCTAC 및 ACGGCAAATTCAACGGCAC, Rev: TAGTGGGGTCTCGCTCCTGG, Probe: TTGTCATCAACGGGAAGCCCATCA의 경우 마우스 GAPDH)을 수행하였다. GAPDH를 내인성 대조군으로서 사용하였고, 상대적 배수 변화를 계산하였다.
통계 분석
GraphPad PrismTM 버전 8을 사용하여 각 실험에 맞춰진 통계적 분석을 수행하였다. NC3Rs 가이드 및 검정력 계산을 사용하여 생체 내 실험 설계 및 샘플 크기를 설계하였다. 동물 실험의 대부분의 분석에 대해, 본페로니(Bonferroni) 또는 투키 다중 비교 중 하나를 사용하여 일방향 또는 양방향 ANOVA를 수행하였다.
결과
도 10a 내지 도 10k는, 2e1011 vg/동물로 투여된, 도 2("V1"; 서열번호 55), 도 3("V2"; 서열번호 56), 도 4("V3"; 서열번호 57) 및 도 6("V4"; 서열번호 58)에 나타낸 벡터 게놈을 포함하는 AAV9 벡터의 비교를 나타낸다.
도 10a FBS 치료 야생형, wst/wst, V1, V2,V3, 및 V4 유전자 요법으로 치료한 뇌실내 치료 wst/wst 동물의 케플란-마이어 생존 도표(2 x 1011 vg/pup, 모든 유전자 요법 치료군 n = 6, 야생형 FBS n = 14, wst/wst FBS = 17). 모든 유전자 요법 치료 동물은 유의미한 수명 연장을 나타냈다(평균 연장 V1 = 4.4일, p = 0.001, V2 = 3.8일 p = 0.0014, V3 10.7일 p < 0.0001, V4 = 4.4일 p = 0.001, Logrank Mantel-Cox 시험). 도 10b 마우스 체중(데이터 평균 ± S.E.M.). 동물을 출생 후 35일까지 매일 칭량하고, 그 후 시기적절한 희생 시점인 P60 또는 인도 종말점 15% 체중 감소 시까지 매주 칭량하였다. 도 10c, 도 10d, 도 10e, 및 도 10f 반전 그리드 시험 및 로타 로드를 사용한 근력 평가(군 당 n = 4 내지 7, 각 동물은 15일령차 및 23일령차에서 3회 시험됨). 이들 시험에서, 로타 로드 상에서의 wst/wst 및 야생형 FBS 대조군 간에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. WT와 비교하여 P23일차에 wst/wst FBS 동물에서 유의미한 악력 감소가 관찰되었으며, 이러한 거동 결과에 대해 유전자 요법 벡터의 효과는 관찰되지 않았다(데이터 평균 ± S.E.M., 양방향 ANOVA). 도 10g 야생형 FBS를 생리학적 기준으로 사용하는, 유리 유동 면역조직화학을 사용한 뇌 전체에 걸친 eEF1A2에 대한 대표적인 면역염색(군 당 n = 4 또는 5, 스케일 바 250 μm). V1 내지 4가 주사된 모든 wst/wst 동물은 뇌 전체에 걸쳐 eEF1A2를 발현하였으며, V3에서 가장 짙은 염색 및 가장 높은 발현이 관찰되었다. 도 10h eEF1A2를 공발현하는 뉴런(NeuN 마커)에 대한 대뇌피질 뇌 영역에서의 대표적인 면역조직형광(n = 군 당 4.5, 200 μm). 모두 야생형에 비해 보다 높은 발현을 갖는 뉴런 발현 프로파일을 나타낸다. V3에서는 모든 피질층에 걸친 발현을 나타내며 가장 높은 발현이 관찰되었다. 모든 이미지를 일정한 이미징 설정으로 캡처하였다. V2 및 V4에서는 피질층 4 및 5에서의 보다 개별적인 발현이 관찰되었다. 도 10i V4 벡터와 비교하여 중뇌, 소뇌 및 후뇌 영역에서 보다 높은 발현을 갖는 모든 유전자 요법 벡터를 사용하여 달성된 뇌 전체에 걸친 eEF1A2 발현을 나타내는 정량화를 포함하는, 뇌에서의 eEF1A2에 대한 대표적인 면역블롯(데이터 평균 ± S.E.M, 양방향 ANOVA). 도 10j V1 벡터로 가장 높은 mRNA 발현을 나타내는, 전뇌에서의 인간 eEF1A2 전사체 발현에 대한 qPCR(데이터 평균 ± S.E.M, 양방향 ANOVA). 도 10k V1 벡터로 가장 높은 mRNA 발현을 나타내는, 전뇌에서의 인간 eEF1A2 피질 발현에 대한 qPCR(데이터 평균 ± S.E.M, 양방향 ANOVA).
결론
이들 실험은 4개의 벡터 모두가 EEF1A2 유전자에 동형접합성 널 돌연변이를 갖는 마우스(마우스에서 wst로 지칭됨) 모델에서 eEF1A2의 발현을 복원할 수 있음을 입증한다. 놀랍게도, 벡터 V1, V2, 및 V3은 wst/wst 마우스에서의 생존을 효과적이고 유의미하게 P23일을 초과하여 연장할 수 있다. (도 10a). 또한, 이 실험은 뇌, 구체적으로는 전뇌(도 10j) 및 피질(도 10k)에서의 eEF1A2 이식유전자의 발현이 V1, V2 또는 V4에서보다 V3에서 더 크다는 것을 입증한다. 이론에 얽매이지 않고, 이는 기대치와는 대조적으로, 5' UTR(서열번호 34) 및/또는 3' UTR(서열번호 48)을 포함하여, 유전자 발현을 치료적으로 증가시켜 생존을 연장시키는 것으로 보인다.
실시예 5: eEF1A2 질환의 D252H 마우스 모델에서의 인간 eEF1A2 단백질의 중앙 신경 계통으로의 AAV9-매개 전달의 효과
조직-특이적 번역 신장 인자 eEF1A2를 암호화하는 EEF1A2에서의 이형접합성 신규 돌연변이는 종종 중증 간질 및 지적 장애를 포함하는 신경발달 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다. 큰 이형접합 결실이 생명과 호환되는 것으로 알려져 있을지라도, 약 50개의 상이한 미스센스 돌연변이가 확인되었지만 기능 돌연변이의 명백한 손실은 확인되지 않았다. 미스센스 D252H 돌연변이를 유발하는 질환을 보유하는 녹-인(knock-in) eEF1A2 마우스 모델은 동일한 유전적 백그라운드에 대해 널 동형접합체에 비해 보다 심각하게 영향을 받았으며, 이는 P23일차까지 체중 감소, 신경스코어 증가 및 사망을 나타냈다. 미스센스 돌연변이에 대해 이형접합성인 마우스는 거동 이상을 나타내지 않았지만, 체중 및 일시적인 악력 손상을 동반하는 운동 기능에 있어서 성별 특이적 결함을 가졌다. 이러한 D252H 신규 마우스의 표현형 분석은 del22ex3 널 마우스 모델과 함께 D252H 돌연변이의 기능 획득을 뒷받침한다(Davies, Faith CJ 등, Human Molecular Genetics (2020)). 본 실시예는 이형접합성 및 동형접합성 D252H 마우스 모두에서의 유전자 요법 연구를 기술한다.
물질 및 방법
치료 마우스 및 미치료 마우스의 생존 및 체중을 발달 과정에 걸쳐 모니터링하였다. 또한, 행동 검사를 P18 내지 24일령 사이에 수행하였다.
동물 복지
모든 동물 실험은 영국 본사(UK Home Office) 및 1986년 동물(과학적 절차) 법(Animal (Scientific Procedures) Act)을 준수하여, University College London 윤리 검토 위원회(ethical review committee)의 지침에 따라 수행하였다. 이형접합성 D252H eEF1A2 녹-인 마우스를 시간 교배시켜 혼합 유전자형 한배새끼를 생성하였다. P0일차에 프라이머 5"-3" AGGCTACCCCTTAGGCAGGT, TGAACAAATGGTAGGTGGGAGG를 사용하여 새끼의 유전자형을 분석하였다. PCR 증폭 후, 샘플을 Hin1II(Thermo Fisher)로 제한 분해하였다.
시험 및 대조군 물품의 투여
신생아 동형접합성 녹-인 마우스(D252H-/-)에 대해, 1.8 x 1011 vg/pup 투여량의 일측성 뇌실내 주사로 5 μL의 V3 벡터 또는 제형화 완충액(FB) 물품을 투여하였다. Kim 등이 기술한 주사 부위 좌표를 사용하여, 33-게이지 Hamilton 바늘(Fisher Scientific®, Loughborough, UK)을 통해 시험 또는 FB 대조군 물품을 야생형 및 이형접합성 D252H에 투여하였다. Kim, J. Y. 등, J Vis Exp 91:51863 (2014). 람도이드 봉합사는 신생아 새끼에서 식별 가능하며, 의도된 주사 부위는 람도이드 봉합사로부터 눈까지의 2/5 지점, 즉 대략적으로 람다와 브레그마 간의 중간 지점인, 시상 봉합사로부터 측면으로 0.8 mm 내지 1 mm의 지점이다. 주사 후 새끼를 어미에게 돌려주었다.
체중
개별 동물 체중을 P1일차에서 P32일차까지 칭량하고, 그 후 매주 칭량하였다. ≥ 15%의 체중 감소는 안락사에 대한 인간 종말점 기준에 도달하는 것이다.
거동 시험
모든 거동 시험 검정은 동물 치료군에 대해 맹검인 연구원에 의해 수행되었다. 로타 로드 시험: P18일차 내지 P24일차에 로타로드 훈련/시험을 수행하였다. 4 내지 40 r.p.m.에서 최대 2분 동안의 연속 가속 하 로타로드(Harvard Apparatus) 위에 마우스를 놓았다. 마우스가 로드에서 추락하는 시간을 각 시험일마다 각 동물에 대해 3회의 시험으로 기록하였다(추락 대시 시간). 반전 그리드 시험: 반전 그리드 시험은 30 cm 높이의 플라스틱 투명 박스 위에 놓인 스테인리스 스틸 그리드(41 x 25 cm) 상에 마우스를 놓는 방식으로 진행되었다. 반전 그리드에서 추락하기까지의 대기 시간을 최장 2분으로 기록하였다. 각 시험일에 반전 그리드 시험을 마우스당 3회 반복한다.
결과
도 11a 내지 도 11c는 미치료 D252H-/- 마우스의 표현형을 나타낸다. 도 11a: FBS 치료 야생형, 녹-아웃(D252H-/-), 뇌실내 V3 유전자 요법 치료 D252H-/-의 케플란-마이어 생존 도표(2 x 1011 vg/pup, V3 치료 = 2, V4 치료 = 1, 야생형 FBS n = 5, D252H-/- FBS = 3). 도 11b 마우스의 중량(데이터 평균 ± S.E.M.). 도 11c 로타로드에 의한 운동 평가(데이터 평균 ± S.E.M., 양방향 ANOVA, 및 더넷 다중 비교).
결론
이들 실험은 V3을 사용한 D252H-/- 마우스에서의 eEF1A2의 AAV9-매개 발현이 미치료 D252H-/- 대조군과 비교하여 생존율을 증가시킬 수 있음을 입증한다. 또한, D252H -/- 동형접합성 마우스에서는 로타 로드 수행 능력이 지속적으로 불량하지만, D252H-/- V3 치료 마우스에서는 시간 경과에 따른 개선 추세가 지속적으로 관찰되었다. 선험적으로 정의된 장기적 안전성/내약성 연구에서, D252H/+ 이형접합성 마우스에서의 V3의 뇌실내 투여 후 eEF1A2의 과발현은 생존 또는 기능적 결과 측정에 유해한 효과를 갖는 것으로 보이지 않는다. 동형접합성 및 이형접합성 D252H 마우스 둘 모두에서 진행 중인 분석은 이러한 eEF1A2 결핍 모델에서 AAV9-매개 eEF1A2 과발현의 장기적인 효과를 추가로 특성화할 것이다.
실시예 6: eEF1A2 질환의 Del22ex3 마우스 모델에서의 인간 eEF1A2 단백질의 중앙 신경 계통으로의 AAV9-매개 전달의 효과
CRISPR/Cas9 생성 Del.22.ex.3 eEF1A2 마우스 모델을 생성하여 eEF1A2 발현을 녹-아웃하였다(Davies, Faith CJ 등, Human Molecular Genetics 2020). CRISPR/Cas9 돌연변이 유발으로부터 생성된 Eef1a2의 엑손 3 내의 22개의 염기쌍 결실은 널 돌연변이를 초래하였다. 이들 Del22ex3 마우스는 중증 표현형을 나타내며, 이는 치명적인 간질 발작의 추가적인 임상적으로 상대적인 증상을 동반하는 조기 발병 운동 뉴런 변성으로 고통받는 질환의 발병 후에 마우스가 더 이상(약 21 내지 25일) 생존하지 못하게 한다. 본 실시예는 동형접합성 Del22ex3 eEF1A2 널 마우스에서의 유전자 요법 연구를 기술한다.
물질 및 방법
치료 마우스 및 미치료 마우스의 생존 및 체중을 발달 과정에 걸쳐 모니터링하였다. 또한, 행동 검사를 P21 내지 25일령의 임상 윈도우 사이에 수행하였다.
동물 복지
모든 동물 실험은 영국 본사(UK Home Office) 및 1986년 동물(과학적 절차) 법(Animal (Scientific Procedures) Act)을 준수하여, University College London 윤리 검토 위원회(ethical review committee)의 지침에 따라 수행하였다. 이형접합성 Del22ex3 마우스를 시간 교배시켜 혼합 유전자형 한배새끼를 생성하였다. P0일차에 프라이머 5"-3" 5'-TGAGTTGTGCCTCTACCCTT-3' 및 5'-TACAGGCACATCCCAGGTGT-3'를 사용하여 새끼의 유전자형을 분석하였다.
시험 및 대조군 물품의 투여
신생아 동형접합성 Del22ex3 마우스(Del22ex3) 새끼에게 2 x 1011 vg/pup(V3 고 투여량) 또는 2 x 1010 vg/pup(V3 저 투여량)의 투여량으로 V3 벡터의 10 μL(각 반구 내 5 μL, 양측) 또는 제형 완충액(FBS)을 뇌실내 주사로 투여하였다. 야생형 및 동형접합성 Del22ex3 마우스에게, Kim 등이 기술한 주사 부위 좌표를 사용하여, 33-게이지 Hamilton 바늘(Fisher Scientific®, Loughborough, UK)을 통해 대조군으로서의 제형 완충액(FBS, 5 μL 양측)을 투여하였다. Kim, J. Y. 등, J Vis Exp 91:51863 (2014). 람도이드 봉합사는 신생아 새끼에서 식별 가능하며, 의도된 주사 부위는 람도이드 봉합사로부터 눈까지의 2/5 지점, 즉 대략적으로 람다와 브레그마 간의 중간 지점인, 시상 봉합사로부터 측면으로 0.8 mm 내지 1 mm의 지점이다. 주사 후 새끼를 어미에게 돌려주었다.
체중
개별 동물 체중을 P1일차에서 P30일차까지 매일 칭량하고, 그 후 매주 칭량하였다. ≥ 15%의 체중 감소를 안락사에 대한 인간 종말점 기준으로서 사용하였다.
거동 시험
로타로드 훈련 및 시험은 P21일차 내지 25일차(P21일차는 훈련일로 간주됨)에 이루어졌다. 모든 거동 검정은 동물 치료군에 대해 맹검인 연구원에 의해 수행되었다. 4 내지 40 r.p.m.에서 최대 2분 동안의 연속 가속 하 로타로드(Harvard Apparatus) 위에 마우스를 놓았다. 마우스가 로드에서 추락하는 시간을 각 시험일마다 각 동물에 대해 3회의 시험으로 기록하였다(추락 대시 시간).
사지 근력을 악력 측정기(Bioseb®)를 사용하여 P21일차 내자 25일차(P21일차는 훈련일로 간주됨) 사이에 측정하였다. 사지 또는 앞다리 모두의 악력을 3회 측정하였으며, 각 시험 사이에 마우스가 휴식을 취할 수 있도록 1분의 휴식 시간을 두었다. 각각의 시험에 대해, 마우스를 꼬리 밑부분으로 잡고 앞발 또는 네 발 모두로 그리드를 잡을 때까지 그리드 위로 하강시켰다.
신경스코어
렛지 시험: 각각의 마우스를 비어있는 케이지의 렛지 상에 놓고 자유롭게 탐색할 수 있게 하였다. 케이지의 가장자리를 따라 걷고 그 가장자리로 내려가는 마우스를 관찰하고, 그에 따라 다음과 같이 채점하였다: 0 = 자신감 있는 보행 및 착지, 1 = 보행 중 혼선 및 동요, 2 = 혼선 및 동요, 렛지에서 미끄러지지만 복귀함, 3 = 렛지를 따라 보행할 수 없음.
뒷다리 클래스핑 시험: 마우스를 꼬리 밑부분으로 잡고 10초 동안 대기 중에 매달아 놓았다. 뒷다리의 위치를 관찰하고 다음과 같이 채점하였다: 0 = 뒷다리가 지속적으로 복부로부터 바깥쪽을 향함, 1 = 매달린 시간의 50% 이상 동안 뒷다리가 몸쪽으로 약간 당겨짐, 2 = 매달린 시간의 50% 이상 동안 뒷다리가 복부를 향해 아래쪽을 향함, 3 = 매달린 시간의 50% 이상 동안 뒷다리가 완전히 오므려져 복부에 닿음.
보행 시험: 동물을 평평한 평면에 놓고 연구원의 반대 방향으로 머리를 향하게 한 다음, 보행 시 뒤에서 관찰하고, 다음과 같이 거동을 채점하였다: 0 = 마우스가 정상적으로 움직임, 모든 사지가 체중을 지지함, 복부는 지면에 닿지 않음, 뒷다리 둘 모두가 동일하게 움직임, 1 = 약간의 경련이 관찰됨, 골반이 약간 솟아오르거나 약간 뒤뚱거림, 2 = 심한 경련, 골반이 솟아오르거나 현저하게 뒤뚱거림, 3 = 움직임이 연결되지 않음, 골반이 솟아오르고 더듬거리며 심하게 뒤뚱거림. 마우스가 전혀 움직이지 않을 수 있다.
척추후만증 시험: 마우스를 평평한 평면에 놓고, 보행 시 측면에서 관찰하고, 다음과 같이 채점하였다: 0 = 걸을 때 척추를 쉽게 펼 수 있음, 1 = 경미한 척추후만증(척추 만곡)이지만 대부분 걷는 동안 스스로 척추를 펼 수 있음, 2 = 척추를 완전히 펼 수 없고 경미하지만 지속적인 척추후만증을 유지함, 3 = 걷거나 앉는 동안 현저한 척추후만증을 유지함.
악력 압력측정: 사지 근력을 P21일차 내지 25일차에 측정하였고, P30일차 및 P60일차에는 압력 압력측정계(Bioseb®)를 사용하여 다시 측정할 것이다. 앞다리의 악력을 3회 측정하며, 각 시험 사이에 마우스가 휴식을 취할 수 있도록 1분의 휴식 시간을 둔다. 각각의 시험에 대해, 마우스를 꼬리 밑부분으로 잡고 앞발로 그리드를 잡을 때까지 그리드 위로 하강시킨다.
결과
도 12a V3 고 투여량(2 x 1011 vg/pup, n = 5)을 투여받은 Del22ex3 마우스, V3 저 투여량(2 x 1010 vg/pup, n = 5)을 투여받은 Del22ex3 마우스, 제형 완충액을 투여받은 Del22ex3 대조군(n = 3) 및 제형 완충액을 투여받은 야생형 대조군(n = 6)의 케플란-마이어 생존 도표. 도 12b 시간 경과에 따른 체중(데이터 평균 ± S.E.M.). 도 12c 악력 압력측정에 의한 PP22 내지 25일차의 운동 평가(데이터 평균 ± S.E.M).
도 12d P23일차의 악력 압력측정치(데이터 평균 ± S.E.M., 양방향 ANOVA, 및 투키 다중 비교). 도 12e 로타로드에 의한 P22 내지 25일차의 운동 평가(데이터 평균 ± S.E.M).
도 12f P24일차의 로타로드(데이터 평균 ± S.E.M., 양방향 ANOVA, 및 투키 다중 비교).
도 12g P21 내지 25일차의 신경학적 스코어.
결론
본 실험은 V3을 사용한 동형접합성 Del22ex3 마우스에서의 eEF1A2의 AAV9-매개 발현의 투여량 관련 이점을 입증한다. 치료 효능은 출생 후 36일차(최근까지 평가된 마지막 시점)까지의 생존 연령의 증가, 체중 증가 및 악력과 로타로드에 의해 측정된 근력 및 운동 거동, 및 신경스코어에서의 정상적인 퇴행의 개선에 의해 입증된다. 출생 후 25일차까지만 최대로 생존하는 미치료 동형접합성 Del22ex3 대조군과 비교하여, V3 고 투여량 치료 동물에서 출생 후 36일차까지의 보다 긴 생존이 관찰된다. 생존 기간은 또한, 대조군과 비교하여, V3 저 투여량 군에서 출생 후 28일까지 증가된다. V3 고 투여량 군에서는 야생형 한배새끼 대조군과 유사한 체중 증가가 관찰된다. 악력 압력측정에 있어서, 미치료 대조군에서는 근력의 감소를 나타내는 반면, 야생형 동물에서는 연령이 증가함에 따라 악력이 증가한다. 미치료 대조군에 비해, V3 고 투여량 치료 동물에서는 P22 내지 25일차로부터 유지되는 악력의 증가가 관찰된다. 출생 후 23일차에, V3 고 투여량 치료 마우스는 야생형 한배새끼에 대해 구별되는, 유의미하게 보다 강한 악력 압력치(p = 0.0046)를 나타낸다. V3 저 투여량에서는 효과가 관찰되지 않는다. 로타로드의 추락 대기 시간 수행 능력은, 출생 후 22 내지 25일차 사이에, 모두 연령에 따라 감소하는 경향을 나타내는 미치료 및 V3 저 투여량과 비교하여, V3 고 투여량에서는 지속적인 수행 능력을 나타낸다. 출생 후 24일차에, V3 고 투여량 치료 동물은 미치료 동물(p = 0.0016)에 비해 유의미하게 보다 높은 로타로드 수행 능력을 나타내고, 야생형 한배새끼와 유사하다. V3 저 투여량 군에서는 효과가 관찰되지 않는다. AAV9-eEF1A2의 이점에 대한 추가적인 징표는 V3-치료 동물의 신경학적 스코어에서 확인할 수 있다. Del22.ex3 미치료 대조군의 신경스코어는 P21 내지 25일차에서 연령에 따라 증가하며, 이는 신경행동 감퇴와 일치한다. 이는 V3 고 투여량 치료 동물에서는 관찰되지 않는데, 이는 이들이 출생 후 21 내지 25일차 사이에는 야생형 한배새끼와 유사하기 때문이다. 적어도 P24일차까지, Del22ex3V3 미치료 동물과 비교 시, V3 저 투여량 군에서는 지속적으로 더 낮은 신경스코어가 또한 관찰된다.
SEQUENCE LISTING <110> UCL Business, Ltd <120> GENE THERAPY VECTOR FOR eEF1A2 AND USES THEREOF <130> ROPA-019/02WO 329592-2245 <150> 63/055,775 <151> 2020-07-23 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Lys Glu Lys Thr His Ile Asn Ile Val Val Ile Gly His Val 1 5 10 15 Asp Ser Gly Lys Ser Thr Thr Thr Gly His Leu Ile Tyr Lys Cys Gly 20 25 30 Gly Ile Asp Lys Arg Thr Ile Glu Lys Phe Glu Lys Glu Ala Ala Glu 35 40 45 Met Gly Lys Gly Ser Phe Lys Tyr Ala Trp Val Leu Asp Lys Leu Lys 50 55 60 Ala Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Asp Ile Ser Leu Trp Lys Phe 65 70 75 80 Glu Thr Thr Lys Tyr Tyr Ile Thr Ile Ile Asp Ala Pro Gly His Arg 85 90 95 Asp Phe Ile Lys Asn Met Ile Thr Gly Thr Ser Gln Ala Asp Cys Ala 100 105 110 Val Leu Ile Val Ala Ala Gly Val Gly Glu Phe Glu Ala Gly Ile Ser 115 120 125 Lys Asn Gly Gln Thr Arg Glu His Ala Leu Leu Ala Tyr Thr Leu Gly 130 135 140 Val Lys Gln Leu Ile Val Gly Val Asn Lys Met Asp Ser Thr Glu Pro 145 150 155 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<223> Made in Lab - mutated woodchuck hepatitis regulatory element <400> 42 tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 60 ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat 120 ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 180 gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 240 ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 300 tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 360 gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc 420 ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 480 tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 540 ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgca 588 <210> 43 <211> 755 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Made in Lab - mutated woodchuck hepatitis regulatory element <400> 43 ttcctgttaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact 60 atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg 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gtatttacgg 300 taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 360 gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt acatgacctt atgggacttt 420 cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga ggtgagcccc 480 acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 540 attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg cgcgccaggc 600 ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat 660 cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat 720 aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgcgct gccttcgccc cgtgccccgc 780 tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg 840 agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc tgagcaagag gtaagggttt 900 aagggatggt tggttggtgg ggtattaatg tttaattacc tggagcacct gcctgaaatc 960 actttttttc aggttgggcc accatgggca aggagaagac ccacatcaac atcgtggtca 1020 tcggccacgt ggactccgga aagtccacca ccacgggcca cctcatctac aaatgcggag 1080 gtattgacaa aaggaccatt gagaagttcg agaaggaggc ggctgagatg gggaagggat 1140 ccttcaagta tgcctgggtg ctggacaagc tgaaggcgga gcgtgagcgc ggcatcacca 1200 tcgacatctc cctctggaag ttcgagacca ccaagtacta catcaccatc atcgatgccc 1260 ccggccaccg cgacttcatc aagaacatga tcacgggtac atcccaggcg gactgcgcag 1320 tgctgatcgt ggcggcgggc gtgggcgagt tcgaggcggg catctccaag aatgggcaga 1380 cgcgggagca tgccctgctg gcctacacgc tgggtgtgaa gcagctcatc gtgggcgtga 1440 acaaaatgga ctccacagag ccggcctaca gcgagaagcg ctacgacgag atcgtcaagg 1500 aagtcagcgc ctacatcaag aagatcggct acaacccggc caccgtgccc tttgtgccca 1560 tctccggctg gcacggtgac aacatgctgg agccctcccc caacatgccg tggttcaagg 1620 gctggaaggt ggagcgtaag gagggcaacg caagcggcgt gtccctgctg gaggccctgg 1680 acaccatcct gccccccacg cgccccacgg acaagcccct gcgcctgccg ctgcaggacg 1740 tgtacaagat tggcggcatt ggcacggtgc ccgtgggccg ggtggagacc ggcatcctgc 1800 ggccgggcat ggtggtgacc tttgcgccag tgaacatcac cactgaggtg aagtcagtgg 1860 agatgcacca cgaggctctg agcgaagctc tgcccggcga caacgtcggc ttcaatgtga 1920 agaacgtgtc ggtgaaggac atccggcggg gcaacgtgtg tggggacagc aagtctgacc 1980 cgccgcagga ggctgctcag ttcacctccc aggtcatcat cctgaaccac ccggggcaga 2040 ttagcgccgg ctactccccg gtcatcgact gccacacagc ccacatcgcc tgcaagtttg 2100 cggagctgaa ggagaagatt gaccggcgct ctggcaagaa gctggaggac aaccccaagt 2160 ccctgaagtc tggagacgcg gccatcgtgg agatggtgcc gggaaagccc atgtgtgtgg 2220 agagcttctc ccagtacccg cctctcggcc gcttcgccgt gcgcgacatg aggcagacgg 2280 tggccgtagg cgtcatcaag aacgtggaga agaagagcgg cggcgccggc aaggtcacca 2340 agtcggcgca gaaggcgcag aaggcgggca agtgatcaac ctctggatta caaaatttgt 2400 gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct 2460 ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat 2520 aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg 2580 gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag 2640 ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc 2700 tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg 2760 tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc 2820 gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc 2880 ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc 2940 tccctttggg ccgcctcccc gcagctggag cctcggtagc cgttcctcct gcccgctggg 3000 cctcccaacg ggccctcctc ccctccttgc accggccctt cctggtcttt gaataaattc 3060 attgcctgcc cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gccctggaag 3120 ttgccactcc agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc attttgtctg 3180 actaggtgtc cttctataat attatggggt ggaggggggt ggtatggagc aaggggccca 3240 agttgggaag aaacctgtag ggcctgcgtt acccaggctg gagtgcagtg gcacatttct 3300 gctcactgca acctcctcct ccctgggttc tacgtagata agtagcatgg cgggttaatc 3360 attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 3420 ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 3480 gtgagcgagc gagcgcgc 3498

Claims (71)

  1. 캡시드 및 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온으로서, 상기 벡터 게놈은 프로모터에 작동 가능하게 연결된, eEF1A2 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 비리온.
  2. 제1항에 있어서, 프로모터는 뉴런-특이적 프로모터인, rAAV 비리온.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터는 범신경 프로모터인, rAAV 비리온.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 시냅신 1 프로모터인, rAAV 비리온.
  5. 제4항에 있어서, 시냅신 1 프로모터는 인간 시냅신 1(hSYN) 프로모터인, rAAV 비리온.
  6. 제5항에 있어서, hSYN 프로모터는 서열번호 3과 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, rAAV 비리온.
  7. 제6항에 있어서, hSYN 프로모터는 서열번호 3과 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, rAAV 비리온.
  8. 제7항에 있어서, hSYN 프로모터는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, rAAV 비리온.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 eSYN 프로모터인, rAAV 비리온.
  10. 제9항에 있어서, eSYN 프로모터는 서열번호 64와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, rAAV 비리온.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, eEF1A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2와 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 동일성을 공유하는, rAAV 비리온.
  12. 제11항에 있어서, eEF1A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2와 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 동일성을 공유하는, rAAV 비리온.
  13. 제12항에 있어서, eEF1A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, rAAV 비리온.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, eEF1A2 단백질은 서열번호 1과 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 동일성을 공유하는, rAAV 비리온.
  15. 제14항에 있어서, eEF1A2 단백질은 서열번호 1과 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 동일성을 공유하는, rAAV 비리온.
  16. 제15항에 있어서, eEF1A2 단백질은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, rAAV 비리온.
  17. 제15항에 있어서, 프로모터는 시냅신 1 프로모터인, rAAV 비리온.
  18. 제17항에 있어서, 시냅신 1 프로모터는 인간 시냅신 1(hSYN) 프로모터인, rAAV 비리온.
  19. 제18항에 있어서, hSYN 프로모터는 서열번호 3과 적어도 95%의 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, rAAV 비리온.
  20. 제1항 또는 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 구성 프로모터인, rAAV 비리온.
  21. 제1항, 제11항 내지 제15항, 또는 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 CAG 프로모터이되, 선택적으로 상기 CAG 프로모터는 서열번호 14와 적어도 95%의 동일성을 공유하는, rAAV 비리온.
  22. 제1항, 제11항 내지 제15항, 또는 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 CMV 프로모터이되, 선택적으로 상기 CMV 프로모터는 서열번호 16 또는 서열번호 17과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, rAAV 비리온.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈은 폴리아데닐화(polyA) 부위를 포함하는, rAAV 비리온.
  24. 제23항에 있어서, polyA 서열은 bGH 폴리아데닐화 부위인, rAAV 비리온.
  25. 제24항에 있어서, bGH 폴리아데닐화 부위는 서열번호 53과 적어도 95%의 동일성을 공유하는, rAAV 비리온.
  26. 제23항에 있어서, polyA 서열은 hGH 폴리아데닐화 부위인, rAAV 비리온.
  27. 제26항에 있어서, hGH 폴리아데닐화 부위는 서열번호 54와 적어도 95%의 동일성을 공유하는, rAAV 비리온.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈은 WPRE(x) 요소를 포함하는, rAAV 비리온.
  29. 제28항에 있어서, WPRE(x) 요소는 서열번호 42와 적어도 95%의 동일성을 공유하는, rAAV 비리온.
  30. 제28항에 있어서, WPRE(x) 요소는 서열번호 41 또는 서열번호 43과 적어도 95%의 동일성을 공유하는, rAAV 비리온.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈은 코작 서열을 포함하는, rAAV 비리온.
  32. 제31항에 있어서, 코작 서열은 서열번호 10인, rAAV 비리온.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈은 서열번호 32 내지 40 중 하나 이상과 적어도 95%의 동일성을 공유하는 5' 미번역 영역(UTR)을 포함하는, rAAV 비리온.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈은 서열번호 41 내지 49 중 하나 이상과 적어도 95%의 동일성을 공유하는 3' 미번역 영역(UTR)을 포함하는, rAAV 비리온.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈은 서열번호 19 또는 서열번호 20과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 5' 역위 말단 반복(ITR)을 포함하는, rAAV 비리온.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈은 서열번호 21 또는 서열번호 63과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 3' 역위 말단 반복(ITR)을 포함하는, rAAV 비리온.
  37. 제21항에 있어서, CAG 프로모터는 서열번호 14와 적어도 95%의 동일성을 공유하는, rAAV 비리온.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드는 AAV9 캡시드 또는 이의 기능적 변이체인, rAAV 비리온.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드는 서열번호 15와 적어도 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 공유하는, rAAV 비리온.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈은 발현 카세트를 포함하되, 상기 발현 카세트는, 5'에서 3'으로의 순서로:
    a. HuBA 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGlobin-Oc;
    b. CMV 프로모터, TPL-eMLP 인핸서, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(r), 및 pAGlobin-Oc;
    c. Syn 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(r), 3'UTR(글로빈), 및 pAGH-Bt;
    d. CBA 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Bt;
    e. EF1α 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGlobin-Oc;
    f. HuBA 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 및 pAGH-Bt;
    g. Syn 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 3'UTR(글로빈), 및 pAGH-Hs;
    h. CaMKIIa 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(r), 및 pAGH-Hs;
    i. CMV 프로모터, TPL-eMLP 인핸서, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(r), 및 pAGH-Hs;
    j. HuBA 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Hs;
    k. CMV 프로모터, TPL/eMLP 인핸서, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 3'UTR(글로빈), 및 pAGH-Bt;
    l. EF1α 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(r), 및 pAGH-Bt;
    m. Syn 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 및 pAGlobin-Oc;
    n. CaMKIIa 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 및 pAGlobin-Oc;
    o. CBA 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 3'UTR(글로빈), 및 pAGH-Hs;
    p. CBA 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 3'UTR(글로빈), 및 pAGlobin-Oc;
    q. CaMKIIa 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 및 pAGH-Bt;
    r. EF1α 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 3'UTR(글로빈), 및 pAGH-Hs;
    s. CMV 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, R2V17, 3'UTR(글로빈), 및 pAGH-Hs;
    t. CMV 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Hs;
    u. hSYN 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGH-Bt;
    v. hSYN 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGH-Hs;
    w. hSYN 프로모터, 코작, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGH-Hs;
    x. CAG 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGH-Hs;
    y. CAG 프로모터, 코작, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGH-Hs;
    z. hSYN 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, WPRE(x), 및 pAGH-Bt;
    aa. hSYN 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Hs;
    bb. hSYN 프로모터, 코작, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Hs;
    cc. CAG 프로모터, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Hs; 또는
    dd. CAG 프로모터, 코작, eEF1A2 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 pAGH-Hs를 포함하는, rAAV 비리온.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈은 서열번호 55 내지 58 또는 65 내지 68 중 어느 하나와 적어도 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지는, rAAV 비리온.
  42. 신경 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 것을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 rAAV 비리온을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 대상체는 EEF1A2 유전자 중 하나 이상의 돌연변이를 가지고 있거나 갖는 것으로 의심되는, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 신경 질환 또는 장애는 간질을 포함하는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 질환 또는 장애는 지적 장애를 포함하는, 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 질환 또는 장애는 자폐증을 포함하는, 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계는 뇌실내 투여를 포함하는, 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계는 정맥내 투여를 포함하는, 방법.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계는 동시 또는 순차적인 뇌실내 투여 및 정맥내 투여 둘 모두를 포함하는, 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 포유동물인, 방법.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 미치료 대조군 대상체와 비교하여 대상체에서의 신경 성능의 감퇴를 예방하는, 방법.
  52. 제24항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 근력 및/또는 운동 능력을 개선시키되, 선택적으로 근력 및/또는 운동 능력은 반전 그리드 시험 또는 로타 로드 시험을 사용하여 평가되는, 방법.
  53. 뇌에서의 eEF1A2 발현을 필요로 하는 대상체의 뇌에서 eEF1A2를 발현시키는 방법으로서, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 rAAV 비리온을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 방법은, 선택적으로 hSYN 프로모터, 코작 서열, eEF1A2 이식유전자, 및/또는 인간 글로불린 폴리아데닐화 서열(hGH)을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 기준 벡터와 비교 시, 전뇌에서 보다 높은 발현을 야기하는, 방법.
  55. 제53항에 있어서, 방법은, 선택적으로 hSYN 프로모터, 코작 서열, eEF1A2 이식유전자, 및/또는 인간 글로불린 폴리아데닐화 서열(hGH)을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 기준 벡터와 비교 시, 피질에서 보다 높은 발현을 야기하는, 방법.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온의 벡터 게놈은 코작 서열을 포함하지 않는, 방법.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온의 벡터 게놈은 인간 글로불린 폴리아데닐화 서열(hGH)을 포함하지 않는, 방법.
  58. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 비리온의 벡터 게놈은 소 글로불린 폴리아데닐화 서열(bGH)을 포함하는, 방법.
  59. 제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 EEF1A2 유전자 중 하나 이상의 돌연변이를 가지고 있거나 갖는 것으로 의심되는, 방법.
  60. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 신경 질환 또는 장애를 앓고 있거나 이에 대한 위험이 있는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 신경 질환 또는 장애는 간질을 포함하는, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 신경 질환 또는 장애는 지적 장애를 포함하는, 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 질환 또는 장애는 자폐증을 포함하는, 방법.
  64. 제53항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계는 뇌실내 투여를 포함하는, 방법.
  65. 제53항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계는 정맥내 투여를 포함하는, 방법.
  66. 제53항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계는 동시 또는 순차적인 뇌실내 투여 및 정맥내 투여 둘 모두를 포함하는, 방법.
  67. 제53항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 포유동물인, 방법.
  68. 제53항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 미치료 대조군 대상체와 비교하여 대상체에서의 신경 성능의 감퇴를 예방하는, 방법.
  69. 제53항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 근력 및/또는 운동 능력을 개선시키되, 선택적으로 근력 및/또는 운동 능력은 반전 그리드 시험 또는 로타 로드 시험을 사용하여 평가되는, 방법.
  70. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 rAAV 비리온을 포함하는, 약학적 조성물.
  71. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 rAAV 비리온 및 이의 사용 지침을 포함하는, 키트.
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