CN116368228A

CN116368228A - 用于治疗眼部疾病的组合物和方法

Info

Publication number: CN116368228A
Application number: CN202180064406.4A
Authority: CN
Inventors: 赵巍; 施中东; 塞巴斯蒂安·阿吉雷
Original assignee: Fangtuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Fangtuo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2023-06-30
Also published as: EP4185335A1; CA3186818A1; AU2021314400A1; JP2023535232A; US20230321280A1; WO2022017363A1

Abstract

提供了一种用于治疗Leber先天性黑朦的药物组合物和用于使用所述药物组合物治疗Leber先天性黑朦的方法。

Description

用于治疗眼部疾病的组合物和方法

相关申请

本申请要求2020年7月21日提交的中国专利申请202010704946.1和2021年4月8日提交的中国专利申请202110378979.6的优先权权益，其中的每一个申请均通过引用以其全文并入本文。

序列表

本申请含有按ASCII格式以电子方式递交并特此通过引用以其全文并入的序列表。所述ASCII副本创建于2021年7月14日，名称为57837-706_601_SL.txt并且大小为47,087字节。

背景技术

Leber先天性黑朦(LCA)是一种罕见的遗传性眼部疾病，其表现为出生时或生命早期的严重视力障碍并且通常在前20年内完全丧失视力。LCA的表现形式因受影响的部位和相关联的基因突变而异。

视网膜色素上皮细胞特异性65kDa蛋白(RPE65)，也被称为类视黄醇异构水解酶，大小为65kDa，并且在人类中由RPE65基因编码。RPE65是脊椎动物视觉周期中的一种酶，在视网膜色素上皮细胞(RPE)中表达，并且也存在于视杆细胞和视锥细胞中。RPE65的缺陷可能导致LCA，占LCA病例的约6％至16％。

发明内容

目前，本领域需要开发可以有效治疗LCA的药物和方法。本公开提供了可以有效治疗遗传性眼病诸如LCA的组合物、药物组合物和方法。

在一方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含含有RPE65多肽的编码序列的表达盒多核苷酸序列，其中所述编码序列是密码子优化的，并且与野生型RPE65核苷酸序列(SEQ ID NO:1)相比含有改变数量的CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含减少数量的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约50％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过20个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过10个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列不包含CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含增加数量的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约600％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含约100至200个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中的一个或多个具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中的一个或多个具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10中的一个或多个具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中的一个或多个具有至少98％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中的一个或多个具有至少99％同一性。

在一些实施方案中，所述rAAV颗粒还包含AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述AAV蛋白来自血清型AAV2或其变体、血清型AAV5或其变体、或血清型AAV8或其变体。

在一些实施方案中，所述表达盒多核苷酸序列还包含启动子，并且所述启动子可操作地连接至所述编码序列。在一些实施方案中，所述启动子是CMV、CAG、MNDU3、PGK、EF1a、Ubc启动子或眼部组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述眼部组织特异性启动子选自RPE 65基因启动子、人视网膜结合蛋白(CRALBP)基因启动子、鼠11-顺式视黄醇脱氢酶(RDH)基因启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、金属蛋白酶组织抑制因子3(Timp3)启动子、光感受器视黄醇结合蛋白启动子和卵黄状黄斑营养不良2启动子或光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)启动子。

在一些实施方案中，所述表达盒序列还包含在3'末端处的WPRE序列。在一些实施方案中，所述编码序列还包含在3'末端处的poly(A)序列。在一些实施方案中，所述poly(A)序列是SV40晚期poly(A)(SV40pA)、人生长激素poly(A)(hGHpA)和牛生长激素poly(A)(bGHpA)中的一种。在一些实施方案中，所述多核苷酸还包含填充序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸还包含反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述反向末端重复(ITR)序列是变体反向末端重复(ITR)序列。

在一些实施方案中，所述多核苷酸包含不超过300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含不超过250个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含约200至500个CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述多核苷酸还包含编码其它治疗性蛋白的序列。在一些实施方案中，所述其它治疗性蛋白选自ABCA4、RDH12、RDH8、RBP3、RBP1、LRAT、RLBP1、RDH10或RDH11。在一些实施方案中，所述编码序列通过编码接头的序列与编码其它治疗性蛋白的序列连接。在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些实施方案中，所述接头包含2A肽的序列。

在另一方面，本公开提供了一种组合物，其包含：(i)编码腺相关病毒(AAV)蛋白的第一多核苷酸，和(ii)包含编码RPE65多肽的序列的第二多核苷酸，其中所述序列是密码子优化的，并且与野生型RPE65核苷酸序列相比含有改变数量的CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述RPE65编码序列包含减少数量的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约50％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过20个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过10个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列不包含CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述AAV衣壳蛋白来自血清型AAV2或其变体、血清型AAV5或其变体、或血清型AAV8或其变体。

在一些实施方案中，所述第一多核苷酸是密码子优化的。

在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含启动子，并且所述启动子可操作地连接至所述序列。在一些实施方案中，所述启动子是CMV、CAG、MNDU3、PGK、EF1a、Ubc启动子或眼部组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述眼部组织特异性启动子选自RPE 65基因启动子、人视网膜结合蛋白(CRALBP)基因启动子、鼠11-顺式视黄醇脱氢酶(RDH)基因启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、金属蛋白酶组织抑制因子3(Timp3)启动子、光感受器视黄醇结合蛋白启动子和卵黄状黄斑营养不良2启动子或光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)启动子。

在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含不超过300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含不超过250个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含约200至500个CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述序列还包含在3'末端处的WPRE序列。在一些实施方案中，所述序列还包含在3'末端处的poly(A)序列。在一些实施方案中，所述poly(A)序列是SV40pA、hGHpA和bGHpA中的一种。

在一些实施方案中，所述第二多核苷酸还包含填充序列。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸还包含反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述反向末端重复(ITR)序列是变体反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸还包含编码其它治疗性蛋白的序列。在一些实施方案中，所述其它治疗性蛋白选自ABCA4、RDH12、RDH8、RBP3、RBP1、LRAT、RLBP1、RDH10或RDH11。在一些实施方案中，所述序列通过编码接头的序列与编码其它治疗性蛋白的序列连接。所述接头是可切割接头。在一些实施方案中，所述接头包含2A肽的序列。

在另一方面，本公开提供了一种用于制备重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，所述方法包括在宿主细胞中引入本文所述的表达盒多核苷酸序列。在另一方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其通过包括在宿主细胞中引入本文所述的表达盒多核苷酸序列的方法制备。在一些实施方案中，所述方法包括在所述宿主细胞中表达本文所述的表达盒多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述宿主细胞是人细胞、动物细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是Sf9细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是HEK293细胞或其衍生物。在一些实施方案中，所述宿主细胞是HEK293T细胞。在一些实施方案中，所述方法包括生成杆状病毒质粒(bacmid)DNA和/或杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法包括生成RPE65表达序列杆状病毒质粒DNA。在一些实施方案中，所述方法包括生成rAAV cap表达序列杆状病毒质粒DNA。在一些实施方案中，所述方法包括用所述杆状病毒质粒DNA转染宿主细胞以产生杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法包括用所述RPE65表达序列杆状病毒质粒DNA转染宿主细胞以产生杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法包括用所述rAAV cap表达序列杆状病毒质粒DNA转染宿主细胞以产生杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述两种杆状病毒混合来感染宿主细胞(诸如Sf9细胞)，以获得本公开的包装的rAAV/RPE65优化病毒颗粒。

在另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的对象的Leber先天性黑朦(LCA)的药物组合物，所述药物组合物包含本公开的rAAV颗粒和药学上可接受的载剂。

在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包括用于治疗LCA的本公开的药物组合物和说明书。

在另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的对象的Leber先天性黑朦(LCA)的药物组合物，其包括向所述对象施用治疗有效量的本公开的rAAV颗粒或药物组合物。在一些实施方案中，所述治疗有效量的rAAV颗粒或药物组合物通过玻璃体内注射、视网膜下注射或脉络膜上腔注射来施用。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10⁹-1×10¹³个rAAV颗粒。在一些实施方案中，对于每只眼睛，所述治疗有效量是1×10⁹-1×10¹³个载体基因组(vg)。在另一方面，本公开提供了如本文所述的rAAV颗粒在制备用于治疗与RPE65突变相关联的眼病的药物中的用途。在另一方面，本公开提供了如本文所述的rAAV颗粒在制备用于治疗对象的遗传性视网膜疾病(IRD)的药物中的用途。在一些实施方案中，所述IRD与RPE65突变相关联。在一些实施方案中，所述IRD是由于对象的RPE65基因的两个拷贝的突变引起。在一些实施方案中，所述IRD是由于对象的RPE65基因的一个拷贝的一个或多个突变引起。在一些实施方案中，所述IRD是LCA。

附图说明

图1是含有优化的RPE65编码序列的多核苷酸表达盒结构的一部分的示意图。

具体实施方式

尽管本文已经示出和描述了本公开的各种实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替代。应理解，可以采用针对本文所述的本公开实施方案的各种可替代方案。

除非另外指示，否则本文所公开的一些实施方案的实施采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术。参见例如，Sambrook和Green,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版(2012)；the seriesCurrent Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编)；the series MethodsIn Enzymology(Academic Press,Inc.),PC 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995)),Harlow和Lane编(1988)Antibodies,A LaboratoryManual，以及Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique andSpecialized Applications,第6版(R.I.Freshney编(2010))。

定义

除非上下文另外明确指示，否则如说明书和权利要求中所用，单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数个指示物。例如，术语“rAAV颗粒”包括一个或多个rAAV颗粒。

术语“约”或“大约”意指如由本领域普通技术人员确定的具体值处于可接受的误差范围内，这将部分取决于所述值的测量或确定方式，即，测量系统的限制性。例如，根据本领域中的实践，“约”可以意指在1个或超过1个标准偏差内。可替代地，“约”可以意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指在值的一个数量级以内、优选在值的5倍以内及更优选在值的2倍以内。在本申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另外说明，否则应假设术语“约”意指所述特定值在可接受的误差范围内。

如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直链、环状或支链的，它可以含有经修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。所述术语还包括进行修饰的氨基酸聚合物，诸如通过硫酸化、糖基化、乙酰化、乙酰化、磷酸化、碘化、甲基化、氧化、蛋白水解、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(例如，精氨酰化)、泛素化或任何其它操作，诸如与标记组分缀合。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。“衍生”自给定蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。优选地，多肽具有与序列中编码的多肽的氨基酸序列或其一部分基本上相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少10-20个氨基酸或至少20-30个氨基酸或至少30-50个氨基酸组成，或者可以用序列中编码的多肽进行免疫鉴定。所述术语还包括从给定核酸序列表达的多肽。如本文所用，术语“结构域”是指在物理上或功能上与蛋白质或肽的其它部分区分开来的蛋白质的一部分。物理上定义的结构域包括极其疏水或亲水的氨基酸序列，诸如膜结合或细胞质结合的那些氨基酸序列。结构域也可以例如通过由基因复制引起的内部同源性来定义。功能上定义的结构域具有不同的生物学功能。例如，抗原结合结构域是指抗原结合单元或与抗原结合的抗体的一部分。功能上定义的结构域不需要由连续氨基酸序列编码，并且功能上定义的结构域可以含有一个或多个物理上定义的结构域。

如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括但不限于D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。标准的单字母或三字母代码用于指定氨基酸。氨基酸在本文中通常用本领域熟知的单字母和三字母缩写来代表。例如，丙氨酸可以用A或Ala表示。

如本文所用，在多肽的情况下，“序列”是多肽中氨基酸在从氨基末端至羧基末端的方向上的序列，其中序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。所述序列也可以是已知在一个或两个方向上含有额外残基的多肽的一部分的直链序列。

如本文所用，“同一性”、“同源性”或“序列同一性”是指两个或更多个多核苷酸序列之间或者两个或更多个多肽序列之间的序列相似性或可互换性。当使用程序诸如EmbossNeedle或BestFit确定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用默认设置，或者可以选择适当的评分矩阵，诸如blosum45或blosum80，以优化同一性、相似性或同源性的得分。优选地，同源多核苷酸是在如本文定义的严格条件下杂交，并且与这些序列相比具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％、更优选97％、更优选98％并且甚至更优选99％的序列同一性的那些多核苷酸。当具有相当长度的序列最佳比对时，同源多肽优选具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％的序列同一性，或者具有至少99％的序列同一性。

如本文所用，“序列同一性百分比(％)”被定义为：在比对序列并引入空位(如果需要以获得最大序列同一性百分比)之后，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分，查询序列中与第二参考多肽序列或其一部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。旨在确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，通过使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括为了在被比较的序列的全长上获得最大比对所需要的任何算法。同一性百分比可以在整个定义的多肽序列的长度上测量，或者可以在较短的长度上测量，例如，从较大的定义的多肽序列中获取的片段的长度，诸如至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少50个、至少100个或至少200个连续残基的片段。这些长度只是示例性的，并且应理解，本文中的表、附图或序列表中所示的序列支持的任何片段长度都可以用于描述可以测量同一性百分比的长度。

本文所述的蛋白质相对于参考序列可以具有一个或多个修饰。修饰可以是氨基酸残基的缺失、插入或添加，或取代或替换。“缺失”是指由于缺少一个或多个氨基酸残基而导致的氨基酸序列变化。“插入”或“添加”是指与参考序列相比，由于添加一个或多个氨基酸残基而导致的氨基酸序列变化。“取代”或“替换”是指用不同的氨基酸取代一个或多个氨基酸。在本文中，抗原结合单元相对于参考序列的突变可以通过将抗原结合单元与参考序列进行比较来确定。用于比较的序列的最佳比对可以根据本领域的任何已知方法来进行。

如本文所用，术语“分离的”是指从在自然界中在正常情况下与多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段缔合的细胞和其它组分中分离。本领域技术人员知道，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要被“分离”以与其天然存在的对应物区分开来。另外，“浓缩”、“分离”或“稀释”的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在的对应物区分开来，因为每单位体积的分子浓度或数量大于(“浓缩”)或小于(“分离”)其天然存在的对应物。富集可以基于绝对量，诸如每单位体积的溶液重量来测量，或者可以相对于源混合物中存在的第二种潜在干扰物种进行测量。

术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指核苷酸(无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸)或其任何长度的类似物的聚合物形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、通过连锁分析确定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针、引物、寡核苷酸或合成DNA。多核苷酸可以含有经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。对核苷酸结构的修饰(如果存在)可以在聚合物组装之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合之后进一步被修饰，例如通过与标记组分缀合。

当应用于多核苷酸时，“重组”意指多核苷酸是克隆、限制性消化和/或连接步骤的各种组合以及产生与自然界中发现的多核苷酸不同的构建体的其它程序的产物。

术语“基因”或“基因片段”在本文中可互换使用。它们是指包含至少一个开放阅读框的多核苷酸，所述开放阅读框可以在转录和翻译之后编码特定蛋白质。所述基因或基因片段可以是基因组的、cDNA的或合成的，只要所述多核苷酸包含至少一个开放阅读框即可，所述开放阅读框可以覆盖整个编码区或其区段。

术语“可操作地连接”或“有效地连接”是指并列，其中如此描述的组分处于允许它们以预期方式发挥功能的关系中。例如，如果启动子序列促进编码序列的转录，则所述启动子序列可操作地连接至编码序列。

如本文所用，“表达”是指将多核苷酸转录为mRNA的过程，和/或转录的mRNA(也被称为“转录物”)随后被翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽统称为基因产物。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中剪接mRNA。

如本文所用，术语“载体”是指用于核酸递送的工具，其中可以插入多核苷酸。当载体可以表达由插入的多核苷酸编码的蛋白质时，所述载体被称为表达载体。载体可以通过转化、转导或转染来引入宿主细胞中，使得其携带的遗传物质元件可以在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员熟知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；人工染色体，诸如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体，诸如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒等。可以用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳头多瘤空泡病毒(例如，SV40)。载体可以含有控制表达的各种元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。另外，载体还可以含有复制起点位点。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以用于引入载体的细胞，其包括但不限于原核细胞，诸如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；真菌细胞，诸如酵母细胞或曲霉属；昆虫细胞，诸如S2果蝇细胞或Sf9；或动物和人细胞，诸如成纤维细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK293细胞或其衍生物。

如本文所用，“治疗有效量”是指实现特定病状的可测量改善或预防所需的至少最小浓度。本文中的有效量可以随患者的疾病状态、年龄、性别、体重和其它因素而变化。有效量也是治疗益处超过治疗中的任何毒性或不良作用的量。在癌症或肿瘤的治疗中，药物的有效量可以具有以下作用：减少癌细胞的数量，降低肿瘤大小，抑制癌细胞浸润到外周器官中，抑制肿瘤转移，在一定程度上抑制肿瘤生长，和/或在一定程度上缓解与疾病相关的一种或多种症状。有效量可以在一个或多个剂量中施用。

如本文所用，术语“接受者”、“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指需要对其进行诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物对象，特别是人类。

如本文所用，术语“疗法”和“治疗”是指获得所需的药理学和/或生理学作用。作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，并且/或者就部分或完全稳定或治愈疾病和/或归因于疾病的不良反应而言可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物的疾病的任何治疗，所述哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、猪、灵长类动物，包括人类和其它类人猿，尤其是人类，并且所述术语包括：(a)防止疾病或症状在可能易患疾病或症状但尚未被诊断的对象中发生；(b)抑制疾病症状；(c)预防疾病发展；(d)缓解疾病症状；(e)导致疾病或症状消退；或其任何组合。如本文所用，术语“试剂盒”是指包装在一起使用或可商购获得的组合。例如，本公开的试剂盒可以包括本公开的组合物，以及使用所述组合物或试剂盒的说明书。术语“说明书”是指通常包含在治疗产品的商业包装中的解释性插页，其含有关于此类治疗性产品的适应症、用途、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或使用警告的信息。

“密码子优化”是指改变构成核酸序列的密码子，使得密码子最适合在特定系统(例如，特定物种或一组物种)中表达。例如，优化核酸序列以在哺乳动物细胞中更有效地表达。由于存在同义密码子，密码子优化不会改变编码蛋白质的氨基酸序列。各种密码子优化方法是本领域已知的，诸如美国专利号5,786,464和6,114,148中公开的那些。“同义密码子”是指编码相同氨基酸的密码子。

Leber先天性黑朦和其它疾病

在一方面，本文提供了用于治疗对象的疾病或病状的组合物和方法。所述疾病或病状可以是遗传性视网膜疾病(IRD)。在一些实施方案中，所述IRD由RPE65基因的突变导致。在一些实施方案中，所述IRD由对象的RPE65基因的两个拷贝的突变导致。在一些实施方案中，足够的活细胞保留在对象的视网膜中。在一些实施方案中，所述疾病或病状是Leber先天性黑朦(LCA)。

Leber先天性黑朦(LCA)是一种罕见的遗传性眼部疾病，占所有遗传性视网膜疾病的约6％，并且是遗传性视网膜病变的最严重的形式。LCA是儿童先天性失明的最常见病因，其通常表现为出生时或生命早期的严重视力障碍并且在前20年内完全丧失视力。在LCA的发展过程中，患者疾病的症状包括视网膜功能障碍、眼球运动(眼球震颤)、视力障碍、瞳孔无反应以及最终失明。

LCA通常是一种常染色体隐性遗传病。迄今为止，已经鉴定出18种与LCA相关的基因，并且这些基因的突变通常是LCA的病因。根据这18种基因，在线人类孟德尔遗传(OMIM)进一步将LCA分为18种不同的类型。不同类型的LCA及其相关联的遗传信息在以下表1中示出。

表1.LCA和相关基因的分类

类型	基因	基因座
			LCA1	GUCY2D	17p13.1
LCA2	RPE65	1p31.3-p31.2
			LCA3	SPATA7	14q31.3
LCA4	AIPL1	17p13.2
			LCA5	LCA5	6q14.1
LCA6	RPGRIP1	14q11.2
			LCA7	CRX	19q13.3
LCA8	CRB1	1q31-q32.1
			LCA9	NMNAT1	1p36.22
LCA10	CEP290	12q21.32
			LCA11	IMPDH1	7q32.1
LCA12	RD3	7q32.1
			LCA13	RDH12	1q32.3
LCA14	LRAT	14q24.1
			LCA15	TULP1	4q31
LCA16	KCNJ13	2q37
			LCA17	GDF6	8q22
LCA18	PRPH2	6p21

视网膜色素上皮细胞特异性65kDa蛋白(RPE65)，也被称为类视黄醇异构水解酶，属于类胡萝卜素加氧酶家族，是脊椎动物视觉周期中的一种酶，并且在人类中由RPE65基因编码。

RPE65主要在视网膜色素上皮(RPE)中表达，并且也存在于视杆细胞和视锥细胞中。它负责在光转导过程中将全反式视黄酯转化为11-顺式视黄醇。然后在其它酶的作用下，11-顺式视黄醇被氧化成11-顺式视黄醛，其进而与视蛋白配混形成活性视觉色素，从而激活大脑检测光的光转导途径。

RPE65的功能性缺陷可能导致LCA2，占所有LCA病例的约6％至16％。研究显示，用具有正常功能的RPE65补充具有RPE65功能性缺陷的眼细胞可以改善LCA。

重组AAV载体

腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科，并且是一种单链DNA(ssDNA)病毒。AAV基因组的长度为大约4.7千碱基，并且可以包含在DNA链两个末端处的反向末端重复序列(ITR)和被称为rep和cap的两个开放阅读框(ORF)。

“AAV反向末端重复(ITR)”序列可以是存在于天然单链AAV基因组的两个末端处的约145个核苷酸的序列。ITR是用于在腺相关病毒基因组中高效复制的对称核酸序列，其可以用作病毒DNA合成的复制起点，并且可以是重组AAV载体的必需结构组分。

“rep”可以包含编码AAV生命周期所需的四种rep蛋白rep78、rep68、rep52和rep40的多核苷酸序列。“cap”可以包含编码AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的多核苷酸序列，其中AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3可以相互作用以形成三八面体对称的AAV衣壳。

AAV可以有效地感染分裂和/或未分裂的人细胞，并且其基因组可以整合到宿主细胞基因组中的单个染色体位点中。最重要的是，虽然AAV存在于许多人的体内，但当前的研究认为AAV与任何疾病无关。基于其高安全性、低免疫原性、宽宿主范围以及介导外源基因在动物中的长期稳定表达的能力，AAV已成为基因疗法中最有前景的载体系统。

迄今为止，根据AAV血清型或感染组织或细胞的差异，已经鉴定出13种不同的AAV，即AAV1-AAV13。而且，如以下表2所示，已经开发了不同的AAV作为转染特定细胞类型的有利载体系统。在许多AAV血清型中，血清型2(AAV2)是研究和应用最广泛的一种，它可以感染视网膜上皮细胞、光感受器细胞、骨骼肌、中枢神经系统和肝细胞等，并且已被用作许多正在进行的临床研究的载体。

表2.AAV血清型及其在基因疗法中用作递送载体的组织

如本文所用，术语“重组AAV载体(rAAV载体)”是指含有一个或多个侧接两个AAV反向末端重复序列(ITR)的异源序列(即，非AAV衍生的核酸序列)的多核苷酸载体。当存在于表达AAV rep和cap蛋白的宿主细胞中时，rAAV载体可以被复制并包装到AAV病毒颗粒中。

“重组AAV(rAAV)病毒”或“rAAV病毒颗粒”是指由被至少一种AAV衣壳蛋白包封的rAAV载体构成的AAV病毒颗粒。当前用于产生rAAV病毒颗粒的宿主细胞可以是衍生自哺乳动物的细胞类型，诸如293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞和其它哺乳动物细胞系，以及昆虫细胞。rAAV病毒颗粒可以通过提供rAAV质粒在哺乳动物细胞培养系统中产生。然而，大多数以上哺乳动物细胞培养系统的输出难以满足临床试验和商业规模生产的要求。最近还开发了使用昆虫细胞(诸如Sf9细胞)的rAAV病毒颗粒产生系统。然而，为了在昆虫细胞中产生AAV，必须进行一些修改以获得AAV衣壳蛋白的正确化学计量比。

杆状病毒属于杆状病毒科，并且是一种双链环状DNA病毒，基因组大小在90kb与230kb之间。杆状病毒仅寄生在节肢动物中，并且已知感染超过600种昆虫。在1983年，Smith等人使用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)在草地贪夜蛾细胞系Sf9中成功表达了人β-干扰素，并首次创建了杆状病毒表达系统(Mol Cell Biol,1983,3:2156-2165)。此后，杆状病毒表达系统不断完善和发展，并且已经成为应用非常广泛的真核表达系统。在2002年，Urabe等人确认了感染杆状病毒的Sf9昆虫细胞可以支持AAV复制。他们使用分别携带AAV的rep基因、Cap基因和ITR核心表达元件的3种重组杆状病毒共感染Sf9细胞，并成功制备了rAAV病毒颗粒。在此基础上，研究人员相继开发了更适合大规模制备rAAV病毒颗粒的系统。

目前，使用杆状病毒表达系统大规模制备rAAV病毒颗粒的方法主要有两种：两杆状病毒系统(Two Bac system)和依赖包装细胞系的一杆状病毒系统(One Bac system)。使用两杆状病毒系统制备rAAV病毒颗粒的主要过程是将AAV rep基因和cap基因整合到一个杆状病毒基因组中，将ITR核心表达元件和目的靶基因整合到另一个杆状病毒基因组中，并且然后使用以上所述的两个重组杆状病毒共感染宿主细胞，以产生携带靶基因的rAAV病毒颗粒。使用依赖包装细胞系的一杆状病毒系统来制备rAAV病毒颗粒的主要过程是首先建立诱导rep基因和cap基因表达的包装细胞系。此包装细胞系整合了rep基因和cap基因的表达元件，其中rep基因和cap基因分别置于杆状病毒晚期基因表达强启动子多角体蛋白(polh)和/或p10的调控下，并且除rep和cap之外，还添加了hr2增强子序列和/或AAV的rep蛋白结合序列。在感染含有AAV ITR和靶基因的重组杆状病毒之后，诱导包装细胞系中的rep基因和cap基因表达，从而产生与靶基因整合的rAAV病毒颗粒。

在一些实施方案中，rAAV病毒颗粒中用于携带靶基因的rAAV载体还可以包含一种或多种“表达调控元件”。如本文所用，术语“表达调控元件”是指影响可操作连接的多核苷酸表达的核酸序列，包括促进异源多核苷酸的转录和翻译的多核苷酸序列。可以用于本公开的表达调控元件包括但不限于启动子、增强子、内含子剪接信号、poly(A)、反向末端重复序列(ITR)等。

“启动子”是与编码靶产物的异源多核苷酸序列相邻定位的DNA序列，并且通常可操作地连接至相邻序列，诸如异源多核苷酸。与没有启动子的异源多核苷酸相比，启动子通常增加表达的异源多核苷酸的量。

“增强子”是增强启动子的活性的序列。与启动子不同，增强子不具有启动子活性，并且通常可以独立于其相对于启动子的位置(即，启动子的上游或下游)来发挥作用。可以用于本公开的增强子元件(或其部分)的非限制性实例包括在昆虫细胞中发现的杆状病毒增强子和增强子元件。

“填充序列”是指包含在较大核酸分子(诸如载体)中的核苷酸序列，并且通常用于在两个核酸特征之间(诸如在启动子与编码序列之间)产生所需的间距，或将核酸分子延伸至所需长度。填充序列不含蛋白质编码信息，并且可能具有未知/合成来源和/或与较大核酸分子内的其它核酸序列无关。

密码子优化

构成蛋白质的氨基酸有20种，并且编码氨基酸的密码子有64种。每个氨基酸对应于至少一个密码子，并且一个氨基酸可以对应于最多达6个密码子(简并密码子)。不同的生物体，甚至同一生物体的不同蛋白质编码基因，对简并密码子的使用频率不同，并且有一定的偏好。其中，高频率密码子被称为偏爱密码子，并且很少使用的密码子被称为稀有或低频率密码子。基因密码子的优化可以通过利用偏爱密码子、避免使用利用率低的稀有或低频率密码子、简化基因转录之后mRNA的二级结构、并入有益于高效表达的基序和减少不利于表达的基序、以及调整GC含量等来增加蛋白表达水平。虽然通用密码子优化原理有很多，但这些通用优化原理不能统一地应用于单个基因疗法载体。不同的通用优化原理可能相互矛盾。例如，改变CpG岛的组成或编码区的GC含量可能影响密码子使用偏好的选择。另外，不同的密码子优化可能导致不同的翻译后修饰和不同的生物活性。

本公开提供了一种编码RPE65多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列是密码子优化的。在密码子优化之后，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述核苷酸序列含有改变数量的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约95％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约90％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约80％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约70％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约60％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约50％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约40％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约30％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约20％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约10％或更少的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含至多约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含至多约60％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含至多约50％的CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过20个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过19个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过18个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过17个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过16个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过15个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过14个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过13个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过12个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过11个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过10个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过9个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过8个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过7个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过6个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过5个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过4个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过3个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过2个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不超过1个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列不包含CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含5至20个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含5至15个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含12至20个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含2至10个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含0至5个CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含增加数量的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约200％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约300％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约400％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约500％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约600％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码本文所述的RPE65的序列包含约700％的CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不少于50个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不少于100个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不少于150个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不少于200个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不少于250个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含不少于300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含约50至300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含约100至250个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含约150至200个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含约150个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含约100个CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，编码本文所述的RPE65的序列包含选自SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列。在一些实施方案中，所述编码序列包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:2具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:2具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:2具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:3具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:3具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:3具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:3具有至少98％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:4具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:4具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:4具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:5具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:5具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:5具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:6具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:6具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:6具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:6具有至少98％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:7具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:7具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:7具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:8具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:8具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:8具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:9具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:9具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:9具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:10具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:10具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:10具有至少95％同一性。

在一些实施方案中，编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列是密码子优化的。在密码子优化之后，与野生型AAV衣壳蛋白核苷酸序列相比，所述核苷酸序列含有改变数量的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，编码腺相关病毒(AAV)rep蛋白的核苷酸序列是密码子优化的。在密码子优化之后，与野生型AAV rep蛋白核苷酸序列相比，所述核苷酸序列含有改变数量的CpG二核苷酸。

组合物

在一方面，本公开提供了一种组合物，其包含：(i)编码腺相关病毒(AAV)蛋白的第一多核苷酸，和(ii)包含编码RPE65多肽的序列的第二多核苷酸。在一方面，本公开提供了一种组合物，其包含：(i)编码腺相关病毒(AAV)蛋白的第一多核苷酸，和(ii)包含编码RPE65多肽的序列的第二多核苷酸，其中所述序列是密码子优化的，并且与野生型RPE65核苷酸序列相比含有改变数量的CpG二核苷酸。

本文所述的RPE65多肽可以是衍生自任何哺乳动物的RPE65及其变体。在一些实施方案中，哺乳动物包括但不限于灵长类动物(例如，人类)、牛、犬科动物、猫科动物和啮齿类动物(例如，豚鼠、大鼠或小鼠)。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽是人衍生的RPE65或其变体。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与人RPE65具有至少75％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与人RPE65具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与人RPE65具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与人RPE65具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与人RPE65具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与人RPE65具有至少96％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与人RPE65具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与人RPE65具有至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与人RPE65具有至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与人RPE65相比具有一个或多个氨基酸突变、取代、缺失或添加的序列。

本文所述的组合物可以包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码RPE65多肽的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含SEQ ID No:1的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与SEQ ID No:1具有至少75％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与SEQ ID No:1具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与SEQ IDNo:1具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与SEQ ID No:1具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与SEQ ID No:1具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与SEQ ID No:1具有至少96％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与SEQ ID No:1具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与SEQ ID No:1具有至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与SEQ ID No:1具有至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，本文所述的RPE65多肽包含与SEQ ID No:1相比具有一个或多个氨基酸突变、取代、缺失或添加的序列。

在一些实施方案中，本文提供了一种多核苷酸，其包含编码RPE65多肽的序列，其中与对应野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含减少数量的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，编码RPE65多肽的序列包含约90％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约80％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约70％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约60％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约50％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约40％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约30％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约20％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约10％的CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述序列包含不超过20个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过19个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过18个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过17个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过16个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过15个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过14个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过13个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过12个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过11个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过10个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过9个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过8个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过7个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过6个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过5个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过4个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过3个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过2个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不超过1个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列不包含CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含增加数量的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约200％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约300％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约400％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约500％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约600％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约700％的CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述序列包含不少于50个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不少于100个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不少于150个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不少于200个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不少于250个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含不少于300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含约50至300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含约100至250个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含约150至200个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含约150个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述序列包含约100个CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，所述编码序列包含或是SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQID No:2具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:2具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:2具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含或是SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:3具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:3具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:3具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含或是SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:4具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:4具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:4具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含或是SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:5具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:5具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:5具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含或是SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:6具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ IDNo:6具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:6具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含或是SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:7具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ IDNo:7具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:7具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含或是SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:8具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ IDNo:8具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:8具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含或是SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:9具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ IDNo:9具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:9具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列包含或是SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:10具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQID No:10具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:10具有至少95％同一性。

在一些实施方案中，所述腺相关病毒(AAV)蛋白可以来自任何AAV血清型。在一些实施方案中，所述AAV蛋白可以来自AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV血清型3(AAV3，包括血清型3A和3B)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)、AAV血清型12(AAV12)、AAV血清型13(AAV13)、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，所述AAV蛋白与衍生自以下的野生型AAV蛋白具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大的同一性：AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。在一些实施方案中，与衍生自以下的野生型AAV蛋白相比，所述AAV蛋白具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加：AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。在一些实施方案中，所述AAV蛋白来自血清型AAV2或其变体、血清型AAV5或其变体、或血清型AAV8或其变体。

在一些实施方案中，所述AAV蛋白包含cap蛋白。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸包含编码cap蛋白的序列。在一些实施方案中，所述cap蛋白可以是本领域已知的任何结构蛋白，其能够形成功能性AAV衣壳(即，能够包装DNA并感染靶细胞)。在一些实施方案中，所述cap蛋白包含VP1、VP2和VP3。在一些实施方案中，所述cap蛋白不需要包含VP1、VP2和VP3的全部，只要它可以产生功能性AAV衣壳即可。在一些实施方案中，所述cap蛋白包含VP1和VP2。在一些实施方案中，所述cap蛋白包含VP1和VP3。在一些实施方案中，所述cap蛋白包含VP2和VP3。在一些实施方案中，所述cap蛋白包含VP1。在一些实施方案中，所述cap蛋白包含VP2。在一些实施方案中，所述cap蛋白包含VP3。

VP1、VP2和VP3可以衍生自任何AAV血清型。在一些实施方案中，VP1可以衍生自AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV血清型3(AAV3，包括血清型3A和3B)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)、AAV血清型12(AAV12)、AAV血清型13(AAV13)、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，所述VP1与衍生自以下的野生型VP1具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大的同一性：AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。在一些实施方案中，与衍生自以下的野生型VP1相比，VP1具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加：AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。

在一些实施方案中，VP2可以衍生自AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，VP2与衍生自以下的野生型VP2具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大的同一性：AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。在一些实施方案中，与衍生自以下的野生型VP2相比，所述VP2具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加：AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。

在一些实施方案中，VP3可以衍生自AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，所述VP3与衍生自以下的野生型VP3具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大的同一性：AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。在一些实施方案中，与衍生自以下的野生型VP3相比，所述VP3具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加：AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。

在一些实施方案中，所述cap包含衍生自相同AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3，例如，所述cap可以包含衍生自AAV2的VP1、VP2和/或VP3。在一些实施方案中，所述cap包含衍生自不同AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3，例如，所述cap可以包含衍生自以下中的任一种或多种的VP1、VP2和/或VP3：AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74和AAV-2i8。

在一些实施方案中，编码cap蛋白的序列可操作地连接至启动子。所述启动子可以是本领域已知的任何合适的启动子，其可以驱动cap的表达。在一些实施方案中，所述启动子可以是组织特异性启动子、组成型启动子或调控型启动子。在一些实施方案中，所述启动子可以选自不同的来源，例如，所述启动子可以是病毒启动子、植物启动子和哺乳动物启动子。

所述启动子的实例包括但不限于人巨细胞病毒(CMV)即时早期增强子/启动子、SV40早期增强子/启动子、JC多瘤病毒启动子、髓磷脂碱性蛋白(MBP)或胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、单纯疱疹病毒(HSV-1)潜伏期相关启动子(LAP)、劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)启动子、神经元特异性启动子(NSE)、血小板源性生长因子(PDGF)启动子、hSYN、黑色素聚集激素(MCH)启动子、CBA、基质金属蛋白启动子(MPP)、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG、MNDU3、PGK和EF1a启动子。

在一些实施方案中，所述启动子是适于在昆虫细胞中表达的启动子。在一些实施方案中，适于在昆虫细胞中表达的启动子包括但不限于polh启动子、p10启动子、基本启动子、诱导型启动子、E1启动子或ΔE1启动子。在一些实施方案中，所述启动子是polh启动子。在一些实施方案中，所述启动子是p10启动子。

在一些实施方案中，编码cap蛋白的核苷酸序列的3'末端还包含多腺苷酸化序列或“poly(A)序列”。在一些实施方案中，多腺苷酸化序列或“poly(A)序列”的长度范围可以是约1-500bp。在一些实施方案中，多腺苷酸化序列或“poly(A)序列”的长度可以是但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、100、200或500个核苷酸。

在一些实施方案中，本公开的组合物中所含的AAV蛋白还包含腺相关病毒(AAV)rep蛋白。在一些实施方案中，第一多核苷酸包含编码AAV rep蛋白的序列，其中所述rep蛋白可以是任何rAAV载体复制和包装到rAAV病毒颗粒中所必需的复制蛋白。在一些实施方案中，所述rep蛋白包含rep78、rep68、rep52和rep40。在一些实施方案中，所述rep蛋白不需要包含rep78、rep68、rep52和rep40的全部，只要它可以允许rAAV载体复制并包装到rAAV病毒颗粒中即可。在一些实施方案中，所述rep蛋白包含rep78、rep68、rep52和rep40中的任意三种。在一些实施方案中，所述rep蛋白包含rep78、rep68、rep52和rep40中的任意两种。在一些实施方案中，所述rep蛋白包含rep78、rep68、rep52和rep40中的任一种。在一些实施方案中，所述rep蛋白包含rep78和rep52。在一些实施方案中，所述rep蛋白包含rep78和rep40。在一些实施方案中，所述rep蛋白包含rep68和rep52。在一些实施方案中，所述rep蛋白包含rep68和rep40。

所述rep78、rep68、rep52和rep40可以衍生自任何AAV血清型。在一些实施方案中，所述rep78可以衍生自AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，所述rep78与衍生自以下的野生型rep78具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大的同一性：AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。在一些实施方案中，与衍生自以下的野生型rep78相比，所述rep78具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加：AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。

在一些实施方案中，所述rep68可以衍生自AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，所述rep68与衍生自以下的野生型rep68具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大的同一性：AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。在一些实施方案中，与衍生自以下的野生型rep68相比，所述rep68具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加：AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。

在一些实施方案中，所述rep52可以衍生自AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，所述rep52与衍生自以下的野生型rep52具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大的同一性：AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。在一些实施方案中，与衍生自以下的野生型rep52相比，所述rep52具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加：AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。

在一些实施方案中，所述rep40可以衍生自AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，所述rep40与衍生自以下的野生型rep40具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大的同一性：AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。在一些实施方案中，与衍生自以下的野生型rep40相比，所述rep40具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加：AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。

在一些实施方案中，所述rep包含衍生自相同AAV血清型的rep78、rep68、rep52和/或rep40，例如，所述rep可以包含衍生自AAV2的rep78、rep68、rep52和/或rep40。在一些实施方案中，所述rep包含衍生自不同AAV血清型的rep78、rep68、rep52和/或rep40，例如，所述rep可以包含衍生自以下中的任一种或多种的rep78、rep68、rep52和/或rep40：AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。

在一些实施方案中，编码rep蛋白的序列可操作地连接至启动子。所述启动子可以是本领域已知的任何合适的启动子，其可以驱动rep的表达。在一些实施方案中，所述启动子可以是组织特异性启动子、组成型启动子或调控型启动子。在一些实施方案中，所述启动子可以选自不同的来源，例如，所述启动子可以是病毒启动子、植物启动子和哺乳动物启动子。

在一些实施方案中，编码rep蛋白的核苷酸序列的3'末端还包含多腺苷酸化序列或“poly(A)序列”。在一些实施方案中，多腺苷酸化序列或“poly(A)序列”的长度范围可以是约1-500bp。在一些实施方案中，多腺苷酸化序列或“poly(A)序列”的长度可以是但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、100、200或500个核苷酸。

在一些实施方案中，所述cap和rep可以衍生自相同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述cap和rep可以衍生自相同的AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8或任何其它已知的AAV和变体。

在一些实施方案中，所述cap和rep可以衍生自不同的AAV血清型，例如，所述cap和rep可以分别衍生自AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8或任何其它已知的AAV。例如，在一些实施方案中，所述cap可以衍生自AAV2，并且所述rep衍生自AAV5。

在一些实施方案中，所述第一多核苷酸是密码子优化的。在一些实施方案中，AAV蛋白的编码序列是密码子优化的。在一些实施方案中，AAV cap蛋白的编码序列是密码子优化的。在一些实施方案中，AAV rep蛋白的编码序列是密码子优化的。在一些实施方案中，启动子的编码序列是密码子优化的。

在一些实施方案中，所述序列还包含在3'末端处的WPRE序列。

在一些实施方案中，所述序列还包含在3'末端处的多腺苷酸化序列或“poly(A)序列”。在一些实施方案中，多腺苷酸化序列或“poly(A)序列”的长度范围可以是约1-500bp。在一些实施方案中，多腺苷酸化序列或“poly(A)序列”的长度可以是但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、100、200或500个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列的长度是5至100、5至50、10至50、10至25、25至50或25-75个核苷酸。在一些实施方案中，所述poly(A)序列是SV40pA、hGHpA和bGHpA中的一种。

在一些实施方案中，所述第二多核苷酸还包含一个或多个其它调控序列。所述调控序列包括但不限于反向末端重复序列(ITR)、增强子、剪接信号、多腺苷酸化信号、填充序列、终止子、蛋白质降解信号、内部核糖体进入元件(IRES)、2A序列等。

在一些实施方案中，所述第二多核苷酸还包含增强子区。在一些实施方案中，所述增强子区包含SV40增强子、即时早期巨细胞病毒增强子、IRBP增强子和衍生自免疫球蛋白基因的增强子。在一些实施方案中，所述增强子区位于CMV、CAG、MNDU3、PGK和EF1a启动子的上游。在一些实施方案中，所述增强子位于眼部组织特异性启动子的上游。在一些实施方案中，所述增强子区位于CMV、CAG、MNDU3、PGK和EF1a启动子的下游。在一些实施方案中，所述增强子位于眼部组织特异性启动子的下游。

在一些实施方案中，所述第二多核苷酸还包含反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含至少一个反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含两个反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，所述两个ITR是相同的。在一些实施方案中，所述两个ITR彼此是不同的。在一些实施方案中，所述反向末端重复序列(ITR)是衍生自AAV的ITR。在一些实施方案中，所述ITR可以衍生自AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV的ITR。在一些实施方案中，与衍生自以下的野生型ITR相比，所述ITR具有一个或多个碱基突变、插入或缺失：AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV的ITR，只要它保留作为末端重复序列的所需功能，诸如靶基因的复制、病毒颗粒的包装和/或整合等即可。

在一些实施方案中，所述第二多核苷酸还包含一个或多个填充序列。在一些实施方案中，所述填充序列位于CMV、CAG、MNDU3、PGK和EF1a启动子序列的上游。在一些实施方案中，所述填充序列位于CMV、CAG、MNDU3、PGK和EF1a启动子序列的下游。在一些实施方案中，所述填充序列位于眼部组织特异性启动子的上游。在一些实施方案中，所述填充序列位于眼部组织特异性启动子的下游。在一些实施方案中，所述填充序列位于5'ITR序列的5'末端处。在一些实施方案中，所述填充序列位于5'ITR序列的3'末端处。在一些实施方案中，所述填充序列位于5'ITR序列的5'末端处。在一些实施方案中，所述填充序列位于3'ITR序列的5'末端处。在一些实施方案中，所述填充序列位于3'ITR序列的3'末端处。

在一些实施方案中，所述填充序列的长度可以是约0.1kb-5kb，诸如但不限于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4.0kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb或5.0kb。

在一些实施方案中，所述第二多核苷酸还包含编码一个或多个其它治疗性蛋白的序列。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白选自：ATP结合盒亚家族A成员4(ABCA4)、视黄醇脱氢酶12(RDH12)、视黄醇脱氢酶8(RDH8)、视黄醇结合蛋白3(RBP 3)、视黄醇结合蛋白1(RBP 1)、卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)、视黄醛结合蛋白1(Rlbp1)、视黄醇脱氢酶10(RDH10)和视黄醇脱氢酶氢化酶11(RDH11)。

在一些实施方案中，编码其它治疗性蛋白的序列通过编码接头的序列连接至所述序列。在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些实施方案中，所述可切割接头包含2A肽的序列。在一些实施方案中，所述2A肽可以选自衍生自口蹄疫病毒或心脏病毒的2A肽，诸如衍生自口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻炎A病毒(ERAV)、明脉扁刺蛾病毒(TaV)或猪捷申病毒(PTV-1)的2A肽。

在一些实施方案中，所述第二多核苷酸是密码子优化的。在一些实施方案中，所述启动子是密码子优化的。在一些实施方案中，所述填充序列是密码子优化的。在一些实施方案中，所述其它治疗性蛋白是密码子优化的。在一些实施方案中，所述接头序列是密码子优化的。

在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含不超过500个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含不超过450个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含不超过400个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含不超过350个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含不超过300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含不超过250个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含不超过200个CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含约200至500个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含约250至450个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含约300至400个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含约200至400个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含约200至300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含约210至290个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含约220至280个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含约230至270个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含约240至260个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含约250个CpG二核苷酸。

重组AAV病毒颗粒

在一方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含含有RPE65多肽的编码序列的表达盒多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述编码序列是密码子优化的，并且与野生型RPE65核苷酸序列相比含有改变数量的CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含减少数量的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约90％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约80％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约70％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约60％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约50％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约40％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约30％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约20％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约10％的CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过25个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过20个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过19个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过18个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过17个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过16个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过15个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过14个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过13个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过12个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过11个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过10个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过9个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过8个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过7个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过6个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过5个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过4个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过3个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过2个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不超过1个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列不包含CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含至少1、2、3、4、5或10个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含5至15个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含7至12个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含0至10个CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含增加数量的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约200％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约300％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约400％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约500％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约600％的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，与野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约700％的CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述编码序列包含不少于50个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不少于100个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不少于150个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不少于200个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不少于250个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含不少于300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含约50至300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含约100至250个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含约150至200个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含约150个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述编码序列包含约100个CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述编码序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，所述编码序列是SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQID No:2具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:2具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:2具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列是SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ IDNo:3具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:3具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:3具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列是SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:4具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:4具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:4具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列是SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:5具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:5具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:5具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列是SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:6具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:6具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:6具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列是SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:7具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:7具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:7具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列是SEQ ID NO:8。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:8具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:8具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:8具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列是SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:9具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:9具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:9具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列是SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:10具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:10具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述编码序列与SEQ ID No:10具有至少95％同一性。

在一些实施方案中，所述RPE65多肽在rAAV颗粒感染宿主细胞之后在宿主细胞中表达。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平高于含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约1.1倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约1.2倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约1.3倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约1.4倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约1.5倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约2倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约2.5倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约3倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约3.5倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约4倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约4.5倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约5倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约5.5倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约6倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约6.5倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约7倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约7.5倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约8倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约8.5倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约9倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约9.5倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约10倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约11倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约12倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约13倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约14倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约15倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约20倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约25倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约30倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约35倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约40倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约45倍。在一些实施方案中，rAAV颗粒的RPE65多肽在宿主细胞中的表达水平是含有野生型RPE65编码序列的rAAV颗粒在宿主细胞中的表达水平的大约50倍。

在一些实施方案中，由rAAV颗粒表达的RPE65信使核糖核酸(mRNA)在宿主细胞中的稳定性高于由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA的稳定性。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA相比，由rAAV颗粒表达的RPE65 mRNA在宿主细胞中具有更长的半衰期。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA相比，由rAAV颗粒表达的RPE65 mRNA的半衰期增加约10％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA相比，由rAAV颗粒表达的RPE65 mRNA的半衰期增加约20％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA相比，由rAAV颗粒表达的RPE65 mRNA的半衰期增加约30％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA相比，由rAAV颗粒表达的RPE65 mRNA的半衰期增加约40％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA相比，由rAAV颗粒表达的RPE65 mRNA的半衰期增加约50％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA相比，由rAAV颗粒表达的RPE65 mRNA的半衰期增加约60％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA相比，由rAAV颗粒表达的RPE65 mRNA的半衰期增加约70％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA相比，由rAAV颗粒表达的RPE65 mRNA的半衰期增加约80％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA相比，由rAAV颗粒表达的RPE65 mRNA的半衰期增加约90％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA相比，由rAAV颗粒表达的RPE65 mRNA的半衰期增加约100％。

在一些实施方案中，由rAAV颗粒表达的RPE65多肽在宿主细胞中的稳定性高于由野生型RPE65编码序列表达的RPE65多肽的稳定性。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65多肽相比，由rAAV颗粒表达的RPE65多肽在宿主细胞中具有更长的半衰期。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65多肽相比，由rAAV颗粒表达的RPE65多肽的半衰期增加约10％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65多肽相比，由rAAV颗粒表达的RPE65多肽的半衰期增加约20％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65多肽相比，由rAAV颗粒表达的RPE65多肽的半衰期增加约30％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65多肽相比，由rAAV颗粒表达的RPE65多肽的半衰期增加约40％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65多肽相比，由rAAV颗粒表达的RPE65多肽的半衰期增加约50％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65多肽相比，由rAAV颗粒表达的RPE65多肽的半衰期增加约60％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65多肽相比，由rAAV颗粒表达的RPE65多肽的半衰期增加约70％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65多肽相比，由rAAV颗粒表达的RPE65多肽的半衰期增加约80％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65多肽相比，由rAAV颗粒表达的RPE65多肽的半衰期增加约90％。在一些实施方案中，与由野生型RPE65编码序列表达的RPE65多肽相比，由rAAV颗粒表达的RPE65多肽的半衰期增加约100％。

在一些实施方案中，rAAV颗粒中所含的RPE65 DNA在对象中具有比野生型RPE65DNA更低的免疫原性。在一些实施方案中，由rAAV颗粒表达的RPE65 mRNA在对象中具有比由野生型RPE65编码序列表达的RPE65 mRNA更低的免疫原性。

在一些实施方案中，所述rAAV颗粒还包含AAV蛋白。在一些实施方案中，所述AAV蛋白可以来自任何AAV血清型。在一些实施方案中，所述AAV蛋白可以来自AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV血清型3(AAV3，包括血清型3A和3B)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)、AAV血清型12(AAV12)、AAV血清型13(AAV13)、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，所述AAV蛋白与衍生自以下的野生型AAV蛋白具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大的同一性：AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。在一些实施方案中，与衍生自以下的野生型AAV蛋白相比，所述AAV蛋白具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加：AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8。在一些实施方案中，所述AAV蛋白来自血清型AAV2或其变体、血清型AAV5或其变体、或血清型AAV8或其变体。

在一些实施方案中，所述核苷酸序列还包含启动子，并且所述启动子可操作地连接至所述编码序列。在一些实施方案中，所述启动子是CMV、CAG、MNDU3、PGK、EF1a、Ubc启动子或眼部组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述眼部组织特异性启动子选自RPE 65基因启动子、人视网膜结合蛋白(CRALBP)基因启动子、鼠11-顺式视黄醇脱氢酶(RDH)基因启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、金属蛋白酶组织抑制因子3(Timp3)启动子、光感受器视黄醇结合蛋白启动子和卵黄状黄斑营养不良2启动子或光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)启动子。

在一些实施方案中，所述表达盒多核苷酸序列还包含在3'末端处的WPRE序列。

在一些实施方案中，所述表达盒多核苷酸序列还包含在3'末端处的多腺苷酸化序列或“poly(A)序列”。在一些实施方案中，多腺苷酸化序列或“poly(A)序列”的长度范围可以是约1-500bp。在一些实施方案中，多腺苷酸化序列或“poly(A)序列”的长度可以是但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、100、200或500个核苷酸。在一些实施方案中，所述poly(A)序列是SV40pA、hGHpA和bGHpA中的一种。

在一些实施方案中，所述多核苷酸还包含其它调控序列。所述调控序列包括但不限于反向末端重复序列(ITR)、增强子、剪接信号、多腺苷酸化信号、填充序列、终止子、蛋白质降解信号、内部核糖体进入元件(IRES)、2A序列等。

在一些实施方案中，所述多核苷酸还包含增强子区。在一些实施方案中，所述增强子区包含SV40增强子、即时早期巨细胞病毒增强子、IRBP增强子和衍生自免疫球蛋白基因的增强子。在一些实施方案中，所述增强子区位于CMV、CAG、MNDU3、PGK和EF1a启动子的上游。在一些实施方案中，所述增强子位于眼部组织特异性启动子的上游。在一些实施方案中，所述增强子区位于CMV、CAG、MNDU3、PGK和EF1a启动子的下游。在一些实施方案中，所述增强子位于眼部组织特异性启动子的下游。

在一些实施方案中，所述多核苷酸还包含反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含至少一个反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含两个反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，所述两个ITR是相同的。在一些实施方案中，所述两个ITR彼此是不同的。在一些实施方案中，所述反向末端重复序列(ITR)是衍生自AAV的ITR。在一些实施方案中，所述ITR可以衍生自AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV的ITR。在一些实施方案中，与衍生自以下的野生型ITR相比，所述ITR具有一个或多个碱基突变、插入或缺失：AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV的ITR，只要它保留作为末端重复序列的所需功能，诸如靶基因的复制、病毒颗粒的包装和/或整合等即可。

在一些实施方案中，所述多核苷酸还包含一个或多个填充序列。在一些实施方案中，所述填充序列位于CMV、CAG、MNDU3、PGK和EF1a启动子序列的上游。在一些实施方案中，所述填充序列位于CMV、CAG、MNDU3、PGK和EF1a启动子序列的下游。在一些实施方案中，所述填充序列位于眼部组织特异性启动子的上游。在一些实施方案中，所述填充序列位于眼部组织特异性启动子的下游。在一些实施方案中，所述填充序列位于5'ITR序列的5'末端处。在一些实施方案中，所述填充序列位于5'ITR序列的3'末端处。在一些实施方案中，所述填充序列位于3'ITR序列的5'末端处。在一些实施方案中，所述填充序列位于3'ITR序列的3'末端处。

在一些实施方案中，所述多核苷酸还包含编码一种其它治疗性蛋白的序列。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白选自：ATP结合盒亚家族A成员4(ABCA4)、视黄醇脱氢酶12(RDH12)、视黄醇脱氢酶8(RDH8)、视黄醇结合蛋白3(RBP 3)、视黄醇结合蛋白1(RBP 1)、卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)、视黄醛结合蛋白1(Rlbp1)、视黄醇脱氢酶10(RDH10)和视黄醇脱氢酶氢化酶11(RDH11)。

在一些实施方案中，编码其它治疗性蛋白的序列通过编码接头的序列连接至所述编码序列。在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些实施方案中，所述可切割接头包含2A肽的序列。在一些实施方案中，所述2A肽可以选自衍生自口蹄疫病毒或心脏病毒的2A肽，诸如衍生自口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻炎A病毒(ERAV)、明脉扁刺蛾病毒(TaV)或猪捷申病毒(PTV-1)的2A肽。

在一些实施方案中，所述多核苷酸是密码子优化的。在一些实施方案中，所述启动子是优化的。在一些实施方案中，所述填充序列是优化的。在一些实施方案中，所述其它治疗性蛋白是优化的。在一些实施方案中，所述接头序列是优化的。

在一些实施方案中，所述多核苷酸包含不超过500个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含不超过450个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含不超过400个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含不超过350个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含不超过300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含不超过250个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含不超过200个CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，所述多核苷酸包含约200至500个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含约250至450个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含约300至400个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含约200至400个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含约200至300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含约210至290个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含约220至280个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含约230至270个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含约240至260个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含约250个CpG二核苷酸。在另一方面，本公开提供了一种用于制备重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，所述方法包括在宿主细胞中引入本文所述的表达盒多核苷酸序列。在另一方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其通过包括在宿主细胞中引入本文所述的表达盒多核苷酸序列的方法制备。在一些实施方案中，所述方法包括在所述宿主细胞中表达本文所述的表达盒多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述宿主细胞是人细胞、动物细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是Sf9细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是HEK293细胞或其衍生物。在一些实施方案中，所述宿主细胞是HEK293T细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是HEK293FT细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是昆虫细胞。在一些实施方案中，所述方法包括生成杆状病毒质粒DNA和/或杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法包括生成RPE65表达序列杆状病毒质粒DNA。在一些实施方案中，所述方法包括生成rAAV cap表达序列杆状病毒质粒DNA。在一些实施方案中，所述方法包括用所述杆状病毒质粒DNA转染宿主细胞以产生杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法包括用所述RPE65表达序列杆状病毒质粒DNA转染宿主细胞以产生杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法包括用所述rAAV cap表达序列杆状病毒质粒DNA转染宿主细胞以产生杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述两种杆状病毒混合来感染宿主细胞(诸如Sf9细胞)，以获得本公开的包装的rAAV/RPE65优化病毒颗粒。

在一些实施方案中，本公开的组合物可以通过本领域已知的任何方法递送到宿主细胞中。在一些实施方案中，所述方法包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体介导等。在一些实施方案中，所述组合物稳定地转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，所述组合物瞬时转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，所述宿主细胞用于产生rAAV病毒颗粒。

如果需要，可以根据本领域技术人员已知的常规方法从宿主细胞中分离和纯化rAAV病毒颗粒。例如，rAAV病毒颗粒可以使用离心、HPLC、疏水相互作用色谱法(HIC)、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、超滤、凝胶电泳、亲和色谱法和/或其它纯化技术进行纯化。

药物组合物

在一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含所述的rAAV颗粒或所述的组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含本公开的rAAV颗粒和药学上可接受的载剂或赋形剂。

如本文所用，“药学上或治疗上可接受的载剂或赋形剂”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性并且对宿主或患者无毒的载剂介质。药物配制品中使用的载剂类型将取决于治疗化合物的施用方法。制备用于多种施用途径的药物组合物的许多方法是本领域熟知的。“药学上可接受的眼用载剂”是指可以用于直接或间接地将本公开的rAAV病毒颗粒递送到眼睛、眼睛上或眼睛附近的药学上可接受的载剂或赋形剂。

在本公开的一些实施方案中，所述药物组合物通过将本公开的rAAV病毒颗粒溶解在合适的溶剂中来制备。合适的溶剂包括但不限于水、盐溶液(例如，NaCl)、缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))或其它溶剂。在某些实施方案中，所述病毒颗粒药物组合物可以包含表面活性剂(例如，泊洛沙姆、普朗尼克酸F68(pluronic acid F68))。在某些实施方案中，所述溶剂是无菌的。在某些实施方案中，所述病毒颗粒药物组合物包含氯化钠、磷酸钠和泊洛沙姆。在一些实施方案中，所述药物组合物不包含任何防腐剂。

在一些实施方案中，所述药物组合物是悬浮液。在一些实施方案中，所述药物组合物是溶液。

本文所述的药物组合物可以包含任何合适量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述药物组合物包含1x10⁹至1x10¹⁴个载体基因组(vg)/mL。在一些实施方案中，所述药物组合物包含1x10¹⁰至1x10¹³个vg/mL。在一些实施方案中，所述药物组合物包含5x10¹⁰至5x10¹²个vg/mL。在一些实施方案中，所述药物组合物包含1x10¹¹至1x10¹²个vg/mL。在一些实施方案中，所述药物组合物具有0.1至5mL的体积。在一些实施方案中，所述药物组合物具有0.2至0.5mL的体积。在一些实施方案中，所述药物组合物具有0.1至1mL的体积。

治疗方法

在一方面，本申请提供了一种用于治疗遗传性视网膜疾病，诸如由RPE65基因的一个或两个拷贝的突变引起的疾病的方法。在一方面，本申请提供了一种用于治疗Leber先天性黑朦(LCA)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文所述的rAAV病毒颗粒和/或本公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述对象患有由RPE65基因的两个拷贝的突变引起的遗传性视网膜疾病。在一些实施方案中，所述对象患有LCA。

在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒和/或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法施用于对象。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒和/或药物组合物可以诸如通过结膜下、眼球后、眼周、玻璃体内、视网膜下、脉络膜上腔或眼内施用局部施用于眼睛。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒和/或药物组合物经由视网膜下注射施用。

在一些实施方案中，包含rAAV病毒颗粒的药物组合物以在医学上可接受的毒性水平下实现所需生物学作用的治疗有效量提供。剂量可以根据施用途径和疾病的严重程度而变化。剂量也可以根据每个待治疗患者的体重、年龄、性别和/或症状程度进行调整。准确剂量和施用途径最终将由主治医生或兽医决定。可以理解的是，根据患者的年龄和体重以及待治疗的病状的严重程度，可能需要常规剂量变化。

在一些实施方案中，所述治疗有效量通常是约1×10⁵至1×10¹³个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10⁶至1×10¹³个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10⁷至1×10¹³个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10⁸至1×10¹³个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10⁹至1×10¹³个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10¹⁰至1×10¹³个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10¹¹至1×10¹³个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10¹²至1×10¹³个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量通常是约1×10⁶至1×10¹²个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量通常是约1×10⁷至1×10¹²个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量通常是约1×10⁸至1×10¹²个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量通常是约1×10⁹至1×10¹²个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量通常是约1×10¹⁰至1×10¹²个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10⁹至1×10¹⁰个rAAV病毒颗粒。

在一些实施方案中，所述治疗有效量是约1×10⁵至1×10²⁰个载体基因组(vg)/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10⁶至1×10¹⁶个vg/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10⁷至1×10¹⁴个vg/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10⁸至1×10¹³个vg/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10⁹至1×10¹³个vg/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10¹⁰至1×10¹³个vg/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10¹¹至1×10¹³个vg/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10¹²至1×10¹³个vg/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量通常是约1×10⁶至1×10¹²个vg/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量通常是约1×10⁷至1×10¹²个vg/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量通常是约1×10⁸至1×10¹²个vg/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量通常是约1×10⁹至1×10¹²个vg/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量通常是约1×10¹⁰至1×10¹²个vg/剂量。在一些实施方案中，所述治疗有效量是1×10⁹至1×10¹⁰个vg/剂量。

在一些实施方案中，递送体积是约0.01mL-1mL。在一些实施方案中，递送体积是约0.05mL-1mL。在一些实施方案中，递送体积是约0.1mL-1mL。在一些实施方案中，递送体积是约0.5mL-1mL。在一些实施方案中，递送体积是约0.1mL-0.5mL。在一些实施方案中，递送体积是约0.01mL-0.5mL。在一些实施方案中，递送体积是约0.05mL-0.5mL。在一些实施方案中，递送体积是约0.05mL-1mL。

在一些实施方案中，施用频率可以是每天至少一次，包括每天2、3、4或5次。在一些实施方案中，治疗可以持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、150天、200天、250天、300天、400天、500天、750天、1000天或超过1000天。

在一些实施方案中，所述施用包括稀释药物组合物。例如，药物组合物可以在施用之前以1:1至1:100比例稀释。在一些实施方案中，药物组合物在施用之前以1:10稀释。

在一些实施方案中，所述施用包括每只眼睛单个剂量。对于对象的每只眼睛的施用可以是相同或不同的一天。在一些实施方案中，对于对象的每只眼睛的施用在单独的一天进行，例如，间隔至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或10天。在一些实施方案中，对于对象的每只眼睛的施用间隔至多45天、30天、20天、15天、10天、7天或3天进行。在一些实施方案中，对于对象的每只眼睛的施用间隔不少于6天进行。

在一些实施方案中，第二治疗剂可以与所述药物组合物同时或顺序施用。在一些实施方案中，第二治疗剂是全身口服皮质类固醇。例如，口服皮质类固醇可以0.1至40mg/kg/天施用，持续总计1至30天。在一些实施方案中，口服皮质类固醇以1mg/kg/天施用，持续总计7天。在一些实施方案中，口服皮质类固醇在施用药物组合物之前1、2、3、4、5、6或7天开始施用。在一些实施方案中，口服皮质类固醇在施用药物组合物之后接下来的5、6、7、8、9、10、11、12、15或更多天期间以递减剂量施用。

在一些实施方案中，所述对象是至少12个月的年龄。在一些实施方案中，所述对象是成年人。在一些实施方案中，所述对象是二酮。在一些实施方案中，所述对象是老年人。在一些实施方案中，所述对象是1至18岁。在一些实施方案中，所述对象是4至12岁。在一些实施方案中，所述对象是至少18岁。

试剂盒

在另一方面，本公开提供了一种用于治疗LCA的试剂盒，所述试剂盒包括本公开的药物组合物和说明书。在一些实施方案中，所述说明书用于指示施用药物组合物以治疗LCA的方法。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括容器。在一些实施方案中，所述容器被配置来递送本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述容器包括小瓶、滴管、瓶子、管和注射器。在一些实施方案中，所述容器是用于施用药物组合物的滴管。在一些实施方案中，所述容器是用于施用药物组合物的注射器。

本公开的一些实施方案通过以下实施例进一步说明，其不应被解释为限制性的。本领域技术人员将理解，以下实施例中公开的技术代表了实施本文所述的本公开实施方案的操作良好的技术，并且因此可以被认为构成用于实现这些实施方案的优选手段。然而，本领域技术人员将理解，根据本公开，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本文公开的具体实施方案做出许多改变，并且仍然实现相同或类似的结果。

实施例

以下实施例进一步说明了本公开。这些实施例仅用于说明本公开，并且不应被解释为限制本公开。

实施例1重组AAV载体的设计和克隆

将衍生自rAAV的cap和rep编码序列及其对应的启动子一起分别克隆到pFastBac1载体中，以获得编码AAV蛋白的多核苷酸。rAAV的衣壳蛋白VP1的编码序列是SEQ ID NO:17；衣壳蛋白VP2的编码序列是SEQ ID NO:18；并且衣壳蛋白VP3的编码序列是SEQ ID NO:19。优化了SEQ ID No:1中所示的编码RPE65多肽的野生型核苷酸序列的密码子。具体地，同义替换RPE65基因中较少使用的密码子，同时确保RPE65的优化核苷酸序列含有改变数量的CpG二核苷酸。密码子优化的RPE65核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID No:1中所示的RPE65多肽的氨基酸序列一致。换言之，由密码子优化的RPE65核苷酸序列编码的氨基酸序列是SEQ ID NO:11。优化的RPE65核苷酸序列是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

将本申请的优化的RPE65核苷酸序列与CAG启动子(例如，SEQ ID NO:12)和两个末端处的ITR序列一起克隆到pFastBac1载体中，以获得含有优化的RPE65序列的多核苷酸。其中，如图1所示，优化的RPE65核苷酸序列的3'末端后面还可以是poly(A)序列hGHpA(例如，SEQ ID NO:13)、SV40pA(例如，SEQ ID NO:15)或bGHpA(例如，SEQ ID NO:14)。优化的RPE65核苷酸序列的3'末端后面还可以是WPRE序列(例如，SEQ ID NO:16)。两个末端处的ITR序列在启动子前面并且在poly(A)后面。

实施例2重组AAV病毒颗粒的制备

将编码AAV蛋白的多核苷酸和含有实施例1获得的优化的RPE65序列的多核苷酸转化到DH10Bac中，以分别产生Rep-Cap和RPE65表达序列杆状病毒质粒DNA，并且然后单独转染Sf9昆虫细胞产生杆状病毒，接着将两种杆状病毒混合以感染Sf9细胞，获得本申请的包装的rAAV/RPE65优化病毒颗粒。另外，编码AAV蛋白的多核苷酸和含有优化的RPE65序列的多核苷酸也可以与辅助质粒载体一起共转染到HEK293细胞中，以获得本申请的包装的rAAV/RPE65优化病毒颗粒。最后，通过梯度超速离心纯化rAAV/RPE65优化病毒颗粒。

实施例3RPE65在宿主细胞中的体外表达

用RPE65优化表达质粒转染的宿主细胞可以高效地表达RPE65多肽。与野生型RPE65表达质粒相比，本申请的RPE65优化质粒的RPE65多肽表达效率显著更高。在分别用本公开的RPE65优化多核苷酸或对照质粒的野生型RPE65多核苷酸转染HEK293细胞之后，收集HEK293细胞并使用蛋白质印迹法测量RPE65的表达水平。结果显示，以对照中野生型RPE65的表达水平作为参考，其它组的归一化表达水平如下(在3个独立实验中测量)：RPE001的表达水平为0.36、0.58和0.20；RPE002的表达水平为0.76、0.93和0.61；RPE003的表达水平为2.43、2.42和1.05；RPE004的表达水平为8.00、2.60和3.70；RPE005的表达水平为5.48、1.19和3.52；并且RPE006的表达水平为2.60、1.31和3.02。

在MOI＝1E5的剂量下，用含有本公开的优化RPE65和对照的野生型RPE65的rAAV颗粒感染HEK293细胞之后，使用流式细胞术测量表达RPE65蛋白的阳性细胞。结果如下(在2-3个独立实验中测量)：野生型AAV颗粒的RPE65阳性细胞率为9.84％和4.5％，RPE001的RPE65阳性细胞率为4.71％、3.5％和5.02％；RPE002的RPE65阳性细胞率为3.95％、6.08％和4.74％；RPE003的RPE65阳性细胞率为3.04％、5.22％和4.36％；RPE004的RPE65阳性细胞率为28.8％、31％和27.4％；RPE005的RPE65阳性细胞率为6.66％、9.65％和11％；RPE006的RPE65阳性细胞率为9.25％、13.6％和14.1％；并且RPE007的RPE65阳性细胞率为18.9％、27％和22.6％。

在MOI＝5E5的剂量下，用含有本公开的优化RPE65和对照的野生型RPE65的rAAV颗粒感染HEK293细胞之后，使用流式细胞术测量表达RPE65蛋白的阳性细胞。结果如下(在2-3个独立实验中测量)：野生型AAV颗粒的RPE65阳性细胞率为13.3％和9.27％，RPE001的RPE65阳性细胞率为7.88％、9.11％和2.94％；RPE002的RPE65阳性细胞率为9.61％、9.13％和6.84％；RPE003的RPE65阳性细胞率为7.73％、11.5％和7.39％；RPE004的RPE65阳性细胞率为34.7％、41％和34.3％；RPE005的RPE65阳性细胞率为22.9％、20.9％和12.4％；RPE006的RPE65阳性细胞率为19.4％、24.2％和15.5％；并且RPE007的RPE65阳性细胞率为38.8％、32.7％和25.5％。

在MOI＝1E5的剂量下，用含有本公开的优化RPE65和对照的野生型RPE65的AAV颗粒感染HEK293细胞之后，使用蛋白质印迹法测量表达水平。结果显示，以用RPE001 AAV颗粒感染的HEK293T细胞中RPE65蛋白的表达水平作为参考，其它组的归一化表达水平如下(在2-3个独立实验中测量)：野生型的表达水平为1.46和2.20；RPE002的表达水平为1.17、0.63和0.91；RPE003的表达水平为1.61、1.34和1.34；RPE004的表达水平为11.63、5.13和7.47；RPE005的表达水平为2.60、2.03和2.09；RPE006的表达水平为2.70、2.94和3.10；并且RPE007的表达水平为4.70、8.24和7.20。

在MOI＝5E5的剂量下，用含有本公开的优化RPE65和对照的野生型RPE65的AAV颗粒感染HEK293细胞之后，使用蛋白质印迹法测量RPE65的表达水平。结果显示，以用RPE001AAV颗粒感染的HEK293T细胞中RPE65蛋白的表达水平作为参考，其它组的归一化表达水平如下(在2-3个独立实验中测量)：野生型的表达水平为2.93和3.18；RPE002的表达水平为0.91、0.68和1.45；RPE003的表达水平为2.10、1.75和2.19；RPE004的表达水平为17.44、3.94和11.56；RPE005的表达水平为3.95、1.65和0.64；RPE006的表达水平为3.73、2.94和0.71；并且RPE007的表达水平为8.35、4.51和10.15。以上结果显示，本公开的RPE65优化rAAV颗粒中RPE65的感染率和表达水平均显著高于对照的野生型RPE65 AAV颗粒的感染率和表达水平。

实施例4rAAV/优化RPE65在B6(A)-Rpe65^rd12小鼠中的治疗作用

使用B6(A)-Rpe65^rd12小鼠来确定rAAV/优化RPE65的体内治疗作用。其中，对照使用不含rAAV的空白媒介物缓冲液，并且实验组使用由实施例2生成的纯化的rAAV/RPE65优化病毒颗粒RPE003、RPE004、RPE006、RPE007和WT进行视网膜下注射。具体地，在出生之后14天对Rpe65^rd12小鼠进行视网膜下注射。在整个程序中使用手术显微镜，并且将针头切向插入巩膜，从而产生具有自密封巩膜通道的伤口。将约1μl的病毒悬浮液注射到视网膜下间隙中，并且两者都导致检眼镜检查可见的大疱性视网膜脱离。向小鼠的一只或两只眼睛注射不含rAAV的空白媒介物缓冲液或rAAV/RPE65优化病毒颗粒。用于注射的病毒颗粒剂量是每只眼睛5×10⁹个vg。

在注射之后，使用本领域技术人员熟知的视网膜电图(ERG)观察小鼠的眼睛。ERG是一种非侵入性工具，通过测量视网膜细胞对光刺激的电应答来测试视网膜功能。ERG测试经常用于评估眼部疾病和视网膜变性，并且其可以用于人类或小鼠的眼睛。有两种类型的ERG测试：暗视ERG和明视ERG。其中，暗视ERG包括暗视A波和暗视B波。暗视ERG使用低强度闪光在过夜的黑暗适应之后诱导视杆细胞的激活，以实现最大的视杆细胞激活和灵敏性。A波测量视杆细胞光感受器的功能，并且B波测量视网膜细胞对于光感受器刺激的下游应答。任一波的振幅读数的降低和增加分别可以指示疾病进展和视网膜功能的恢复。明视ERG使用高强度闪光来诱导视锥细胞的激活，并在一段时间的光刺激之后抑制视杆细胞的应答。

使用ERG来评估视网膜功能的恢复是本领域技术人员熟知的一种技术手段。参见例如，ERG协议，包括实验设置、研究材料、小鼠准备、ERG设置和数据处理的详细信息，其在Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography(G.Benchorin等人,Bio Protoc.2017)中描述。

所有小鼠在实验日之前进行至少12小时的过夜黑暗适应，并且在准备期间通过仅使用红色过滤光源保持黑暗适应。将小鼠置于加热至37℃的平台上，并且用含有硫酸阿托品、盐酸去氧肾上腺素和盐酸丙美卡因的滴眼液处理。然后去除滴眼液，并且然后用药膏将它们的眼睛保持润湿。对于A波和B波两者，脉冲强度为1cd sec/m²。使用Microsoft Excel和GraphPad Prism来分析数据。

在注射治疗之后一个月，通过暗视ERG A波和B波评价视网膜功能的恢复。此后每个月进行暗视ERG，直至注射之后3个月(进行评价的最后时间点)。结果在表3和表4中总结。

表3.暗视ERG A波结果

*10uV≤A<50uV；并且0<B<10uV。

表4.暗视ERG B波结果

*30uV≤A<100uV；15uV<B<30uV；并且0<C≤15uV。

另外，此研究还使用视网膜眼底成像和光学相干断层扫描(OCT)技术来评价对照组和实验组中视网膜结构的变化。在研究结束时，收集小鼠眼睛组织样品进行免疫荧光染色和免疫组织化学，以评价视网膜的结构和人RPE65蛋白的表达水平。

序列表

SEQ ID NO:1

ATGTCTATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACT

GTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATG

TAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGA

TGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCA

CCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAG

AAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCT

TACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAAT

TTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCC

AGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATGC

CCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCA

CAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGA

GACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTATGTCTCTGTCAATG

GGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTAC

AATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAA

CATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCA

ATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCG

ATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTA

TATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGT

TCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGT

TTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGA

CAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCT

CCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGG

GTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTG

TTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAA

GAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTA

GGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGC

AAGAATTTAGTCACGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCT

GTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTT

CAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAG

AAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTT

GAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAA

CTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCA

GAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGA

TGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAA

AAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGA

AGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTC

ATGGACTGTTCAAAAAATCTTGA

SEQ ID NO:2

ATGTCTATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACT

GTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATG

TAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGA

TGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCA

CCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAG

AAGGACACGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGC

TTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAA

TTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCC

AGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAACGC

CCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCA

CAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGA

GACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTATGTCTCTGTCAATG

GGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTAC

AATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAA

CATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCA

ATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCG

ATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTA

TATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGT

TCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGT

TTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGA

CAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCT

CCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGG

GTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTG

TTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAA

GAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTA

GGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGC

AAGAATTTAGTCACGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCT

GTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTT

CAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAG

AAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTT

GAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAA

CTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCA

GAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGA

TGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAA

AAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGA

AGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTC

ACGGACTGTTCAAAAAATCTTGA

SEQ ID NO:3

ATGTCCATCCAGGTGGAGCACCCAGCTGGAGGCTACAAGAAGC

TGTTTGAAACTGTGGAAGAACTGAGCAGCCCCCTGACAGCCCAT

GTGACAGGCAGAATCCCTCTGTGGCTGACAGGCAGCCTGCTGA

GATGTGGCCCAGGCCTGTTTGAGGTGGGCTCTGAGCCTTTCTAC

CACCTGTTTGATGGCCAAGCCCTGCTCCACAAGTTTGATTTCAA

GGAGGGCCATGTGACCTACCACAGAAGATTCATCAGAACAGAT

GCCTATGTGAGGGCCATGACAGAGAAGAGGATAGTTATCACAG

AGTTTGGCACCTGTGCCTTCCCTGACCCCTGCAAGAACATCTTC

AGCAGATTCTTCAGCTACTTCAGAGGAGTGGAAGTGACAGACA

ATGCCCTGGTCAATGTGTACCCTGTGGGAGAGGACTACTATGCC

TGTACTGAGACCAACTTCATCACCAAGATCAACCCTGAAACCCT

GGAAACCATCAAGCAGGTGGACCTGTGCAACTATGTGTCAGTC

AATGGAGCCACAGCCCACCCTCACATTGAGAATGATGGCACAG

TTTACAACATAGGCAACTGCTTTGGCAAAAACTTCAGCATTGCC

TACAACATTGTGAAGATCCCCCCTCTGCAGGCTGACAAGGAGG

ACCCCATCAGCAAGTCTGAGATAGTGGTGCAGTTCCCATGCTCT

GACAGATTCAAGCCCAGCTATGTGCACAGCTTTGGCCTGACCCC

AAACTACATTGTGTTTGTGGAAACCCCTGTGAAGATCAACCTGT

TCAAGTTCCTGAGCTCCTGGAGCCTGTGGGGAGCCAACTACATG

GACTGCTTTGAAAGCAATGAGACCATGGGAGTGTGGCTGCACA

TTGCTGACAAGAAAAGAAAGAAGTACCTGAACAACAAATACAG

AACCAGCCCTTTCAACCTGTTCCACCACATCAACACCTATGAGG

ACAATGGCTTCCTGATTGTGGACCTGTGCTGCTGGAAGGGCTTT

GAGTTTGTGTACAACTACCTGTACCTGGCCAACCTGAGAGAAAA

CTGGGAGGAAGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCCCCCCAGCCT

GAGGTGAGGAGATATGTGCTGCCTCTGAACATAGACAAGGCTG

ACACAGGCAAGAACCTGGTGACCCTCCCCAACACCACAGCCAC

AGCCATCCTGTGCTCTGATGAGACCATCTGGCTGGAGCCTGAAG

TGCTGTTCTCTGGCCCCAGACAGGCCTTTGAGTTCCCTCAAATC

AACTACCAGAAATACTGTGGCAAACCCTACACCTATGCCTATGG

CCTGGGCCTGAACCACTTTGTCCCTGACAGACTGTGCAAGCTGA

ATGTGAAAACCAAGGAGACCTGGGTCTGGCAGGAGCCTGACTC

CTACCCTTCTGAACCCATCTTTGTGAGCCACCCTGATGCCCTGG

AGGAGGATGATGGAGTGGTGCTGAGTGTGGTGGTCAGCCCTGG

TGCTGGCCAGAAGCCTGCATACCTGCTAATCCTGAATGCCAAGG

ACCTGTCTGAAGTTGCCAGGGCTGAGGTGGAAATCAACATCCCT

GTGACCTTCCATGGCCTTTTCAAGAAGAGCTGA

SEQ ID NO:4

ATGAGCATCCAGGTGGAACATCCTGCTGGTGGCTACAAGAAAC

TGTTTGAGACAGTGGAAGAACTGAGCAGCCCTCTGACAGCCCA

TGTGACAGGCAGAATCCCTCTGTGGCTGACAGGCTCCCTGCTGA

GATGTGGCCCTGGCCTGTTTGAAGTGGGCTCTGAGCCTTTCTAC

CACCTGTTTGATGGACAGGCCCTGCTGCACAAGTTTGACTTCAA

AGAGGGCCATGTGACCTACCACAGAAGATTCATCAGGACAGAT

GCCTATGTCAGAGCCATGACAGAGAAGAGGATTGTGATCACTG

AGTTTGGCACCTGTGCCTTTCCAGATCCTTGCAAGAACATCTTC

AGCAGATTCTTCAGCTACTTCAGAGGGGTTGAAGTGACAGACA

ATGCCCTGGTCAATGTGTACCCTGTGGGAGAAGATTACTATGCC

TGCACAGAGACAAACTTCATCACCAAGATCAACCCTGAGACAC

TGGAAACCATCAAGCAGGTTGACCTGTGCAACTATGTGTCTGTG

AATGGGGCCACAGCTCACCCTCACATTGAGAATGATGGCACAG

TGTACAACATTGGCAACTGCTTTGGCAAGAACTTCAGCATTGCC

TACAACATAGTGAAGATCCCACCTCTGCAGGCTGACAAAGAGG

ACCCCATCAGCAAGTCTGAGATTGTGGTGCAGTTCCCCTGCTCT

GACAGATTCAAGCCCAGCTATGTGCACAGCTTTGGCCTGACACC

TAACTACATTGTGTTTGTGGAAACCCCTGTGAAGATCAATCTGT

TCAAGTTCCTGAGCAGCTGGTCCCTGTGGGGAGCCAACTACATG

GACTGCTTTGAGAGCAATGAGACAATGGGAGTGTGGCTGCACA

TTGCAGACAAGAAGAGAAAGAAGTACCTGAACAACAAGTACAG

GACAAGCCCCTTCAACCTGTTCCACCACATCAACACCTATGAGG

ACAATGGCTTCCTGATTGTGGACCTGTGCTGCTGGAAGGGCTTT

GAGTTTGTGTACAACTACCTGTACCTGGCCAACCTGAGGGAAAA

CTGGGAAGAAGTGAAGAAGAATGCCAGAAAGGCCCCTCAGCCT

GAAGTTAGAAGATATGTGCTGCCCCTGAACATTGACAAGGCTG

ACACAGGCAAGAACCTGGTCACCCTGCCTAACACCACAGCCAC

AGCCATCCTGTGCTCTGATGAGACTATCTGGCTGGAACCTGAGG

TGCTGTTCTCTGGCCCCAGACAGGCCTTTGAGTTCCCTCAGATC

AACTACCAGAAATACTGTGGCAAGCCCTACACCTATGCCTATGG

CCTGGGCCTGAACCACTTTGTGCCAGACAGACTGTGCAAGCTGA

ATGTCAAGACCAAAGAGACATGGGTCTGGCAAGAGCCTGACAG

CTACCCTTCTGAGCCCATCTTTGTGTCTCACCCTGATGCTCTGGA

AGAGGATGATGGGGTTGTGCTGTCTGTGGTGGTGTCCCCTGGTG

CTGGACAGAAGCCTGCCTATCTGCTGATCCTGAATGCCAAGGAC

CTGTCTGAGGTGGCCAGAGCTGAGGTGGAAATCAACATCCCTGT

GACCTTCCATGGCCTGTTCAAGAAGTCCTGA

SEQ ID NO:5

ATGAGCATCCAGGTGGAACATCCTGCTGGTGGCTACAAGAAAC

TGTTTGAGACAGTGGAAGAACTGAGCAGCCCTCTGACAGCCCA

TGTGACAGGCAGAATCCCTCTGTGGCTGACAGGCTCCCTGCTGA

GATGTGGCCCTGGCCTGTTTGAAGTGGGCTCTGAGCCTTTCTAC

CACCTGTTTGATGGACAGGCCCTGCTGCACAAGTTTGACTTCAA

AGAGGGCCATGTGACCTACCACAGAAGATTCATCAGGACAGAT

GCCTATGTCAGAGCCATGACAGAGAAGAGGATTGTGATCACTG

AGTTTGGCACCTGTGCCTTTCCAGATCCTTGCAAGAACATCTTC

AGCAGATTCTTCAGCTACTTCAGAGGGGTTGAAGTGACAGACA

ATGCCCTGGTCAATGTGTACCCTGTGGGAGAAGATTACTATGCC

TGCACAGAGACAAACTTCATCACCAAGATCAACCCTGAGACAC

TGGAAACCATCAAGCAGGTTGACCTGTGCAACTATGTGTCTGTG

AATGGGGCCACAGCTCACCCTCACATTGAGAATGATGGCACAG

TGTACAACATTGGCAACTGCTTTGGCAAGAACTTCAGCATTGCC

TACAACATAGTGAAGATCCCACCTCTGCAGGCTGACAAAGAGG

ACCCCATCAGCAAGTCTGAGATTGTGGTGCAGTTCCCCTGCTCT

GACAGATTCAAGCCCAGCTATGTGCACAGCTTTGGCCTGACACC

TAACTACATTGTGTTTGTGGAAACCCCTGTGAAGATCAATCTGT

TCAAGTTCCTGAGCAGCTGGTCCCTGTGGGGAGCCAACTACATG

GACTGCTTTGAGAGCAATGAGACAATGGGAGTGTGGCTGCACA

TTGCAGACAAGAAGAGAAAGAAGTACCTGAACAACAAGTACCG

GACAAGCCCCTTCAACCTGTTCCACCACATCAACACCTATGAGG

ACAATGGCTTCCTGATTGTGGACCTGTGCTGCTGGAAGGGCTTT

GAGTTCGTGTACAACTACCTGTACCTGGCCAACCTGAGGGAAA

ACTGGGAAGAAGTGAAGAAGAATGCCAGAAAGGCCCCTCAGCC

TGAAGTTAGAAGATATGTGCTGCCCCTGAACATTGACAAGGCTG

ACACAGGCAAGAACCTGGTCACCCTGCCTAACACCACAGCCAC

AGCCATCCTGTGCTCTGATGAGACTATCTGGCTGGAACCTGAGG

TGCTGTTCTCTGGCCCCAGACAGGCCTTCGAGTTCCCTCAGATC

AACTACCAGAAATACTGCGGCAAGCCCTACACCTATGCCTATGG

CCTGGGCCTGAACCACTTCGTGCCAGACAGACTGTGCAAGCTGA

ATGTCAAGACCAAAGAGACATGGGTCTGGCAAGAGCCTGACAG

CTACCCTTCTGAGCCCATCTTTGTGTCTCACCCTGATGCTCTGGA

AGAGGATGATGGGGTTGTGCTGTCTGTGGTGGTGTCCCCTGGTG

CTGGACAGAAGCCTGCCTATCTGCTGATCCTGAATGCCAAGGAC

CTGTCTGAGGTGGCCAGAGCTGAGGTGGAAATCAACATCCCTGT

GACCTTCCATGGCCTGTTCAAGAAGTCCTGA

SEQ ID NO:6

ATGTCCATCCAGGTGGAGCACCCAGCTGGAGGCTACAAGAAGC

TGTTTGAGACTGTGGAAGAACTGAGCAGCCCCCTGACAGCCCAT

GTGACAGGCAGGATCCCCCTGTGGCTGACAGGCAGCCTGCTGA

GATGTGGCCCAGGCCTGTTTGAGGTGGGCTCTGAGCCTTTCTAC

CACCTGTTTGATGGCCAAGCCCTGCTCCACAAGTTCGATTTCAA

AGAGGGCCATGTGACCTACCACAGACGGTTCATCAGAACAGAT

GCCTATGTGAGAGCCATGACAGAGAAGAGAATTGTGATCACAG

AATTTGGCACCTGTGCCTTCCCTGACCCCTGCAAGAACATCTTC

AGCAGATTCTTCAGCTACTTCAGAGGAGTGGAAGTGACAGACA

ATGCCCTGGTGAATGTGTACCCTGTGGGAGAAGACTACTATGCC

TGTACTGAGACCAACTTCATCACCAAGATCAACCCTGAAACCCT

GGAAACCATCAAGCAGGTGGACCTGTGCAACTATGTGTCAGTC

AATGGAGCCACAGCCCACCCTCACATCGAGAATGATGGCACAG

TTTACAACATTGGCAACTGCTTTGGCAAAAACTTCAGCATCGCC

TACAACATTGTGAAGATCCCCCCTCTGCAGGCTGACAAAGAGG

ACCCCATCAGCAAGTCTGAGATAGTGGTGCAGTTCCCATGCTCT

GACCGGTTCAAGCCCAGCTATGTGCACAGCTTTGGCCTGACCCC

AAACTACATTGTGTTTGTGGAAACCCCTGTCAAAATCAACCTGT

TCAAATTCCTGAGCTCCTGGAGCCTGTGGGGAGCCAACTACATG

GACTGCTTTGAAAGCAATGAGACCATGGGAGTGTGGCTGCACA

TTGCTGACAAGAAACGGAAGAAGTACCTGAACAACAAGTACCG

GACCAGCCCTTTCAACCTGTTCCACCACATCAACACCTATGAGG

ACAATGGCTTCCTGATCGTGGACCTGTGCTGCTGGAAGGGCTTT

GAGTTCGTGTACAACTACCTGTACCTGGCCAACCTGAGAGAAA

ACTGGGAGGAGGTGAAGAAGAATGCCAGAAAGGCCCCCCAGCC

TGAAGTGAGGAGATATGTGCTGCCTCTGAACATAGACAAGGCT

GACACAGGCAAGAACCTGGTGACCCTCCCTAACACCACAGCCA

CAGCCATCCTCTGCTCTGATGAGACCATCTGGCTGGAACCTGAA

GTGCTGTTCTCTGGCCCCAGACAGGCCTTTGAGTTCCCACAAAT

CAACTACCAGAAATACTGTGGCAAGCCCTACACCTACGCCTATG

GCCTGGGCCTGAACCACTTTGTGCCTGACAGACTGTGCAAGCTG

AATGTGAAGACCAAGGAGACCTGGGTCTGGCAGGAGCCTGACT

CCTACCCTTCTGAACCCATCTTTGTCAGCCACCCTGATGCCCTG

GAGGAGGATGATGGAGTGGTGCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCTG

GTGCTGGCCAGAAGCCTGCATACCTGCTGATCCTGAATGCCAAG

GACCTGTCTGAGGTTGCCAGAGCTGAGGTGGAAATCAACATCC

CTGTCACCTTCCATGGCTTATTCAAGAAAAGCTGA

SEQ ID NO:7

ATGAGCATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACT

GTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATG

TAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGA

TGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCA

CCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAG

AAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCT

TACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAAT

TTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCC

AGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAACGC

CCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCA

CAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGA

GACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTATGTCTCTGTCAATG

GGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTAC

AATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAA

CATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCA

ATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCG

ATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTA

TATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGT

TCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGT

TTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGA

CAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCT

CCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGG

GTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTG

TTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAA

GAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTA

GGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGC

AAGAATTTAGTCACGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCT

GTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTT

CAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAG

AAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTT

GAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAA

CTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCA

GAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGA

TGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAA

AAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGA

AGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTC

ATGGACTGTTCAAAAAATCTTAATAA

SEQ ID NO:8

ATGTCTATTCAAGTCGAGCACCCAGCGGGGGGATATAAAAAGC

TTTTCGAAACGGTGGAGGAGCTGAGCTCCCCCCTTACGGCGCAT

GTTACGGGGCGCATACCTCTGTGGCTCACGGGATCATTGCTTCG

CTGCGGACCCGGATTGTTCGAGGTTGGCAGTGAACCATTCTACC

ATCTCTTCGATGGTCAGGCATTGCTTCATAAATTTGATTTCAAA

GAAGGACACGTCACATATCATCGCAGGTTCATCCGGACAGATG

CGTACGTTCGCGCCATGACAGAAAAGCGCATTGTAATAACTGA

GTTTGGGACATGTGCATTTCCTGACCCTTGTAAGAATATATTCA

GCCGCTTTTTCAGCTATTTTAGAGGCGTTGAGGTTACTGACAAT

GCGCTCGTGAACGTCTATCCAGTAGGTGAAGATTATTACGCCTG

TACTGAGACTAATTTCATCACTAAAATTAATCCAGAAACTTTGG

AGACCATAAAGCAGGTTGATCTCTGTAACTATGTCTCAGTGAAT

GGCGCTACAGCGCACCCGCACATAGAAAACGATGGAACGGTTT

ACAATATAGGCAACTGTTTTGGTAAGAATTTTAGCATTGCTTAC

AACATAGTCAAGATACCTCCTCTCCAAGCCGATAAAGAGGACC

CGATATCCAAATCAGAGATTGTTGTCCAATTCCCGTGCAGTGAT

AGATTCAAACCGTCTTACGTCCACAGTTTTGGCCTGACACCCAA

TTACATTGTTTTTGTTGAAACACCTGTTAAGATAAATCTCTTTAA

ATTTCTGTCTTCTTGGAGTCTGTGGGGGGCAAATTACATGGATT

GTTTCGAGTCTAACGAGACGATGGGAGTCTGGCTTCATATAGCA

GATAAAAAGCGCAAAAAGTATTTGAATAACAAGTACCGGACGA

GCCCGTTCAATTTGTTCCACCATATCAACACTTACGAGGATAAC

GGGTTTCTGATCGTCGACCTTTGCTGTTGGAAAGGGTTCGAGTT

CGTGTATAACTACCTCTACTTGGCGAACCTTCGGGAAAATTGGG

AGGAAGTTAAGAAGAACGCAAGAAAGGCCCCGCAGCCAGAAG

TCCGAAGGTATGTTCTGCCGTTGAATATCGACAAAGCCGACACT

GGAAAGAACCTCGTTACGCTTCCCAATACCACGGCTACCGCGAT

CTTGTGCAGTGACGAAACAATTTGGCTGGAGCCCGAGGTGTTGT

TTTCTGGCCCAAGGCAAGCCTTTGAATTCCCACAGATAAATTAT

CAAAAATATTGTGGAAAGCCCTACACCTACGCTTATGGACTCGG

TCTCAACCATTTTGTTCCAGATCGACTTTGCAAGCTGAATGTAA

AGACCAAAGAAACCTGGGTTTGGCAAGAACCCGATTCCTACCC

CAGTGAACCGATCTTTGTTTCCCATCCCGACGCCCTCGAAGAAG

ACGACGGAGTTGTCTTGTCCGTTGTGGTGAGCCCCGGTGCAGGA

CAGAAGCCCGCTTATCTTTTGATTCTTAATGCCAAAGATTTGTC

AGAAGTAGCGCGGGCCGAGGTAGAGATCAACATACCTGTTACT

TTCCATGGGTTGTTCAAAAAGAGTTGA

SEQ ID NO:9

ATGAGCATCCAGGTGGAACATCCTGCCGGCGGATACAAGAAAC

TGTTCGAGACAGTGGAAGAACTGAGCAGCCCTCTGACAGCCCA

CGTGACAGGCAGAATCCCTCTGTGGCTGACCGGCAGCCTGCTGA

GATGTGGACCTGGCCTGTTTGAAGTGGGCAGCGAGCCTTTCTAC

CACCTGTTCGATGGACAGGCCCTGCTGCACAAGTTCGACTTCAA

AGAGGGCCACGTCACCTACCACCGGCGGTTCATTAGAACCGAT

GCCTACGTGCGGGCCATGACCGAGAAGAGAATCGTGATCACCG

AGTTCGGCACCTGTGCCTTTCCAGATCCTTGCAAGAACATCTTC

AGCCGGTTCTTCAGCTACTTCAGAGGCGTGGAAGTGACCGACA

ACGCCCTGGTCAATGTGTACCCCGTGGGCGAAGATTACTACGCC

TGCACCGAGACAAACTTCATCACCAAGATCAACCCCGAGACAC

TGGAAACCATCAAGCAGGTTGACCTGTGCAACTACGTGTCCGTG

AACGGCGCCACAGCTCACCCTCACATCGAGAATGATGGCACCG

TGTACAACATCGGCAACTGCTTCGGCAAGAACTTCTCTATCGCC

TACAATATCGTGAAGATCCCACCTCTGCAGGCCGACAAAGAGG

ACCCCATCAGCAAGAGCGAGATCGTGGTGCAGTTCCCCTGCAG

CGACAGATTCAAGCCCAGCTACGTGCACAGCTTCGGCCTGACAC

CTAACTACATCGTGTTCGTGGAAACCCCTGTGAAGATCAATCTG

TTCAAGTTCCTGAGCAGCTGGTCCCTGTGGGGCGCCAACTACAT

GGATTGCTTCGAGAGCAACGAGACAATGGGCGTGTGGCTGCAC

ATTGCCGACAAGAAGCGGAAGAAGTACCTGAACAACAAGTACC

GGACAAGCCCCTTCAACCTGTTCCACCACATCAACACCTACGAG

GACAACGGCTTCCTGATCGTGGACCTGTGTTGCTGGAAGGGCTT

CGAGTTCGTGTACAATTACCTGTACCTGGCCAACCTGCGCGAGA

ACTGGGAAGAAGTGAAGAAGAACGCCCGGAAGGCCCCTCAGCC

TGAAGTGCGAAGATATGTGCTGCCCCTGAACATCGACAAGGCC

GACACCGGCAAGAATCTGGTCACCCTGCCTAATACCACCGCCAC

CGCCATCCTGTGTAGCGACGAAACCATCTGGCTGGAACCCGAG

GTGCTGTTCTCTGGACCTAGACAGGCCTTCGAGTTTCCCCAGAT

CAACTACCAGAAGTACTGCGGCAAGCCCTACACCTACGCCTATG

GCCTGGGCCTGAATCACTTCGTGCCCGACAGACTGTGCAAGCTG

AACGTCAAGACCAAAGAGACATGGGTCTGGCAAGAGCCCGACA

GCTACCCTAGCGAGCCCATCTTTGTGTCTCACCCCGACGCTCTG

GAAGAGGACGATGGCGTTGTGCTGAGCGTGGTGGTTTCTCCTGG

CGCCGGACAGAAACCTGCCTACCTGCTGATCCTGAACGCCAAG

GACCTGAGCGAAGTGGCCAGAGCCGAGGTGGAAATCAACATCC

CCGTGACCTTCCACGGCCTGTTCAAGAAGTCCTAATAA

SEQ ID NO:10

ATGAGCATCCAGGTGGAGCACCCCGCCGGCGGCTACAAGAAGC

TGTTCGAGACCGTGGAGGAGCTGAGCAGCCCCCTGACCGCCCA

CGTGACCGGCCGCATCCCCCTGTGGCTGACCGGCAGCCTGCTGC

GCTGCGGCCCCGGCCTGTTCGAGGTGGGCAGCGAGCCCTTCTAC

CACCTGTTCGACGGCCAGGCCCTGCTGCACAAGTTCGACTTCAA

GGAGGGCCACGTGACCTACCACCGCCGCTTCATCCGCACCGAC

GCCTACGTGCGCGCCATGACCGAGAAGCGCATCGTGATCACCG

AGTTCGGCACCTGCGCCTTCCCCGACCCCTGCAAGAACATCTTC

AGCCGCTTCTTCAGCTACTTCCGCGGCGTGGAGGTGACCGACAA

CGCCCTGGTGAACGTGTACCCCGTGGGCGAGGACTACTACGCCT

GCACCGAGACCAACTTCATCACCAAGATCAACCCCGAGACCCT

GGAGACCATCAAGCAGGTGGACCTGTGCAACTACGTGAGCGTG

AACGGCGCCACCGCCCACCCCCACATCGAGAACGACGGCACCG

TGTACAACATCGGCAACTGCTTCGGCAAGAACTTCAGCATCGCC

TACAACATCGTGAAGATCCCCCCCCTGCAGGCCGACAAGGAGG

ACCCCATCAGCAAGAGCGAGATCGTGGTGCAGTTCCCCTGCAG

CGACCGCTTCAAGCCCAGCTACGTGCACAGCTTCGGCCTGACCC

CCAACTACATCGTGTTCGTGGAGACCCCCGTGAAGATCAACCTG

TTCAAGTTCCTGAGCAGCTGGAGCCTGTGGGGCGCCAACTACAT

GGACTGCTTCGAGAGCAACGAGACCATGGGCGTGTGGCTGCAC

ATCGCCGACAAGAAGCGCAAGAAGTACCTGAACAACAAGTACC

GCACCAGCCCCTTCAACCTGTTCCACCACATCAACACCTACGAG

GACAACGGCTTCCTGATCGTGGACCTGTGCTGCTGGAAGGGCTT

CGAGTTCGTGTACAACTACCTGTACCTGGCCAACCTGCGCGAGA

ACTGGGAGGAGGTGAAGAAGAACGCCCGCAAGGCCCCCCAGCC

CGAGGTGCGCCGCTACGTGCTGCCCCTGAACATCGACAAGGCC

GACACCGGCAAGAACCTGGTGACCCTGCCCAACACCACCGCCA

CCGCCATCCTGTGCAGCGACGAGACCATCTGGCTGGAGCCCGA

GGTGCTGTTCAGCGGCCCCCGCCAGGCCTTCGAGTTCCCCCAGA

TCAACTACCAGAAGTACTGCGGCAAGCCCTACACCTACGCCTAC

GGCCTGGGCCTGAACCACTTCGTGCCCGACCGCCTGTGCAAGCT

GAACGTGAAGACCAAGGAGACCTGGGTGTGGCAGGAGCCCGAC

AGCTACCCCAGCGAGCCCATCTTCGTGAGCCACCCCGACGCCCT

GGAGGAGGACGACGGCGTGGTGCTGAGCGTGGTGGTGAGCCCC

GGCGCCGGCCAGAAGCCCGCCTACCTGCTGATCCTGAACGCCA

AGGACCTGAGCGAGGTGGCCCGCGCCGAGGTGGAGATCAACAT

CCCCGTGACCTTCCACGGCCTGTTCAAGAAGAGCTAA

SEQ ID NO:11

MSIQVEHPAGGYKKLFETVEELSSPLTAHVTGRIPLWLTGSLLRCG

PGLFEVGSEPFYHLFDGQALLHKFDFKEGHVTYHRRFIRTDAYVR

AMTEKRIVITEFGTCAFPDPCKNIFSRFFSYFRGVEVTDNALVNVYP

VGEDYYACTETNFITKINPETLETIKQVDLCNYVSVNGATAHPHIE

NDGTVYNIGNCFGKNFSIAYNIVKIPPLQADKEDPISKSEIVVQFPCS

DRFKPSYVHSFGLTPNYIVFVETPVKINLFKFLSSWSLWGANYMDC

FESNETMGVWLHIADKKRKKYLNNKYRTSPFNLFHHINTYEDNGF

LIVDLCCWKGFEFVYNYLYLANLRENWEEVKKNARKAPQPEVRR

YVLPLNIDKADTGKNLVTLPNTTATAILCSDETIWLEPEVLFSGPRQ

AFEFPQINYQKYCGKPYTYAYGLGLNHFVPDRLCKLNVKTKETW

VWQEPDSYPSEPIFVSHPDALEEDDGVVLSVVVSPGAGQKPAYLLI

LNAKDLSEVARAEVEINIPVTFHGLFKKS

SEQ ID NO:12

CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCA

ACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATA

GTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTA

TTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATA

TGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCC

GCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTAC

TTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGTCGA

GGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTC

CCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCA

GCGATTGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGG

GGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGG

TGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTT

TTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAG

CGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGT

GCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGAC

TGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCT

CCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCT

TTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCC

TTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGT

GTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCT

GTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAG

TGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGC

GGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGT

GCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCT

GTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGC

CCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGC

TCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGG

CGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGG

GCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCG

AGCCGCAGCCAATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGC

AGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGG

AGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGT

GCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATCGGGCGGGGAGGGCCTTCGTG

CGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGC

TGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGG

CGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCT

GCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG

SEQ ID NO:13

GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCT

GGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAAT

TAAGTTGCAATCCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATAT

TATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGG

AAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCT

GGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCC

TGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGG

ATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTG

GTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACT

CCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTG

GGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTT

SEQ ID NO:14

CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCG

TGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCT

AATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCAT

TCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGG

ATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTC

TATGG

SEQ ID NO:15

AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAG

CATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTA

GTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGA

TC

SEQ ID NO:16

AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTAT

TCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTT

AATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTT

CTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTT

GTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTG

CTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAG

CTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCG

GAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCG

GCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGA

CGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGC

GCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCG

GACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCC

GCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGG

CCGCCTCCCCGC

SEQ ID NO:17

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRG

LVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDN

PYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVE

EPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGD

ADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVG

NSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGAS

NDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRL

NFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSA

HQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQM

LRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRT

NTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSA

DNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQS

GVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNL

QRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDG

HFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYS

TGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGV

YSEPRPIGTRYLTRNL

SEQ ID NO:18

TAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSV

PDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSG

NWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDN

HYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKL

FNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGC

LPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG

NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPS

GTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNN

SEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIF

GKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNR

QAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSP

LMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVS

VEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPR

PIGTRYLTRNL

SEQ ID NO:19

MATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTR

TWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCH

FSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANN

LTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTL

NNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAH

SQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRD

QSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSL

VNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE

EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVW

QDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTP

VPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQ

YTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL。

序列表

<110> 英斯培瑞有限公司

<120> 用于治疗眼部疾病的组合物和方法

<130> 57837-706.601

<140>

<141>

<150> CN 202110378979.6

<151> 2021-04-08

<150> CN 202010704946.1

<151> 2020-07-21

<160> 19

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 1602

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

atgtctatcc aggttgagca tcctgctggt ggttacaaga aactgtttga aactgtggag 60

gaactgtcct cgccgctcac agctcatgta acaggcagga tccccctctg gctcaccggc 120

agtctccttc gatgtgggcc aggactcttt gaagttggat ctgagccatt ttaccacctg 180

tttgatgggc aagccctcct gcacaagttt gactttaaag aaggacatgt cacataccac 240

agaaggttca tccgcactga tgcttacgta cgggcaatga ctgagaaaag gatcgtcata 300

acagaatttg gcacctgtgc tttcccagat ccctgcaaga atatattttc caggtttttt 360

tcttactttc gaggagtaga ggttactgac aatgcccttg ttaatgtcta cccagtgggg 420

gaagattact acgcttgcac agagaccaac tttattacaa agattaatcc agagaccttg 480

gagacaatta agcaggttga tctttgcaac tatgtctctg tcaatggggc cactgctcac 540

ccccacattg aaaatgatgg aaccgtttac aatattggta attgctttgg aaaaaatttt 600

tcaattgcct acaacattgt aaagatccca ccactgcaag cagacaagga agatccaata 660

agcaagtcag agatcgttgt acaattcccc tgcagtgacc gattcaagcc atcttacgtt 720

catagttttg gtctgactcc caactatatc gtttttgtgg agacaccagt caaaattaac 780

ctgttcaagt tcctttcttc atggagtctt tggggagcca actacatgga ttgttttgag 840

tccaatgaaa ccatgggggt ttggcttcat attgctgaca aaaaaaggaa aaagtacctc 900

aataataaat acagaacttc tcctttcaac ctcttccatc acatcaacac ctatgaagac 960

aatgggtttc tgattgtgga tctctgctgc tggaaaggat ttgagtttgt ttataattac 1020

ttatatttag ccaatttacg tgagaactgg gaagaggtga aaaaaaatgc cagaaaggct 1080

ccccaacctg aagttaggag atatgtactt cctttgaata ttgacaaggc tgacacaggc 1140

aagaatttag tcacgctccc caatacaact gccactgcaa ttctgtgcag tgacgagact 1200

atctggctgg agcctgaagt tctcttttca gggcctcgtc aagcatttga gtttcctcaa 1260

atcaattacc agaagtattg tgggaaacct tacacatatg cgtatggact tggcttgaat 1320

cactttgttc cagataggct ctgtaagctg aatgtcaaaa ctaaagaaac ttgggtttgg 1380

caagagcctg attcataccc atcagaaccc atctttgttt ctcacccaga tgccttggaa 1440

gaagatgatg gtgtagttct gagtgtggtg gtgagcccag gagcaggaca aaagcctgct 1500

tatctcctga ttctgaatgc caaggactta agtgaagttg cccgggctga agtggagatt 1560

aacatccctg tcacctttca tggactgttc aaaaaatctt ga 1602

<210> 2

<211> 1602

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

atgtctatcc aggttgagca tcctgctggt ggttacaaga aactgtttga aactgtggag 60

gaactgtcct cgccgctcac agctcatgta acaggcagga tccccctctg gctcaccggc 120

agtctccttc gatgtgggcc aggactcttt gaagttggat ctgagccatt ttaccacctg 180

tttgatgggc aagccctcct gcacaagttt gactttaaag aaggacacgt cacataccac 240

agaaggttca tccgcactga tgcttacgta cgggcaatga ctgagaaaag gatcgtcata 300

acagaatttg gcacctgtgc tttcccagat ccctgcaaga atatattttc caggtttttt 360

tcttactttc gaggagtaga ggttactgac aacgcccttg ttaatgtcta cccagtgggg 420

gaagattact acgcttgcac agagaccaac tttattacaa agattaatcc agagaccttg 480

gagacaatta agcaggttga tctttgcaac tatgtctctg tcaatggggc cactgctcac 540

ccccacattg aaaatgatgg aaccgtttac aatattggta attgctttgg aaaaaatttt 600

tcaattgcct acaacattgt aaagatccca ccactgcaag cagacaagga agatccaata 660

agcaagtcag agatcgttgt acaattcccc tgcagtgacc gattcaagcc atcttacgtt 720

catagttttg gtctgactcc caactatatc gtttttgtgg agacaccagt caaaattaac 780

ctgttcaagt tcctttcttc atggagtctt tggggagcca actacatgga ttgttttgag 840

tccaatgaaa ccatgggggt ttggcttcat attgctgaca aaaaaaggaa aaagtacctc 900

aataataaat acagaacttc tcctttcaac ctcttccatc acatcaacac ctatgaagac 960

aatgggtttc tgattgtgga tctctgctgc tggaaaggat ttgagtttgt ttataattac 1020

ttatatttag ccaatttacg tgagaactgg gaagaggtga aaaaaaatgc cagaaaggct 1080

ccccaacctg aagttaggag atatgtactt cctttgaata ttgacaaggc tgacacaggc 1140

aagaatttag tcacgctccc caatacaact gccactgcaa ttctgtgcag tgacgagact 1200

atctggctgg agcctgaagt tctcttttca gggcctcgtc aagcatttga gtttcctcaa 1260

atcaattacc agaagtattg tgggaaacct tacacatatg cgtatggact tggcttgaat 1320

cactttgttc cagataggct ctgtaagctg aatgtcaaaa ctaaagaaac ttgggtttgg 1380

caagagcctg attcataccc atcagaaccc atctttgttt ctcacccaga tgccttggaa 1440

gaagatgatg gtgtagttct gagtgtggtg gtgagcccag gagcaggaca aaagcctgct 1500

tatctcctga ttctgaatgc caaggactta agtgaagttg cccgggctga agtggagatt 1560

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<210> 3

<211> 1602

<212> DNA

<213> 智人

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atgtccatcc aggtggagca cccagctgga ggctacaaga agctgtttga aactgtggaa 60

gaactgagca gccccctgac agcccatgtg acaggcagaa tccctctgtg gctgacaggc 120

agcctgctga gatgtggccc aggcctgttt gaggtgggct ctgagccttt ctaccacctg 180

tttgatggcc aagccctgct ccacaagttt gatttcaagg agggccatgt gacctaccac 240

agaagattca tcagaacaga tgcctatgtg agggccatga cagagaagag gatagttatc 300

acagagtttg gcacctgtgc cttccctgac ccctgcaaga acatcttcag cagattcttc 360

agctacttca gaggagtgga agtgacagac aatgccctgg tcaatgtgta ccctgtggga 420

gaggactact atgcctgtac tgagaccaac ttcatcacca agatcaaccc tgaaaccctg 480

gaaaccatca agcaggtgga cctgtgcaac tatgtgtcag tcaatggagc cacagcccac 540

cctcacattg agaatgatgg cacagtttac aacataggca actgctttgg caaaaacttc 600

agcattgcct acaacattgt gaagatcccc cctctgcagg ctgacaagga ggaccccatc 660

agcaagtctg agatagtggt gcagttccca tgctctgaca gattcaagcc cagctatgtg 720

cacagctttg gcctgacccc aaactacatt gtgtttgtgg aaacccctgt gaagatcaac 780

ctgttcaagt tcctgagctc ctggagcctg tggggagcca actacatgga ctgctttgaa 840

agcaatgaga ccatgggagt gtggctgcac attgctgaca agaaaagaaa gaagtacctg 900

aacaacaaat acagaaccag ccctttcaac ctgttccacc acatcaacac ctatgaggac 960

aatggcttcc tgattgtgga cctgtgctgc tggaagggct ttgagtttgt gtacaactac 1020

ctgtacctgg ccaacctgag agaaaactgg gaggaagtga aaaaaaatgc cagaaaggcc 1080

ccccagcctg aggtgaggag atatgtgctg cctctgaaca tagacaaggc tgacacaggc 1140

aagaacctgg tgaccctccc caacaccaca gccacagcca tcctgtgctc tgatgagacc 1200

atctggctgg agcctgaagt gctgttctct ggccccagac aggcctttga gttccctcaa 1260

atcaactacc agaaatactg tggcaaaccc tacacctatg cctatggcct gggcctgaac 1320

cactttgtcc ctgacagact gtgcaagctg aatgtgaaaa ccaaggagac ctgggtctgg 1380

caggagcctg actcctaccc ttctgaaccc atctttgtga gccaccctga tgccctggag 1440

gaggatgatg gagtggtgct gagtgtggtg gtcagccctg gtgctggcca gaagcctgca 1500

tacctgctaa tcctgaatgc caaggacctg tctgaagttg ccagggctga ggtggaaatc 1560

aacatccctg tgaccttcca tggccttttc aagaagagct ga 1602

<210> 4

<211> 1602

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

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gaactgagca gccctctgac agcccatgtg acaggcagaa tccctctgtg gctgacaggc 120

tccctgctga gatgtggccc tggcctgttt gaagtgggct ctgagccttt ctaccacctg 180

tttgatggac aggccctgct gcacaagttt gacttcaaag agggccatgt gacctaccac 240

agaagattca tcaggacaga tgcctatgtc agagccatga cagagaagag gattgtgatc 300

actgagtttg gcacctgtgc ctttccagat ccttgcaaga acatcttcag cagattcttc 360

agctacttca gaggggttga agtgacagac aatgccctgg tcaatgtgta ccctgtggga 420

gaagattact atgcctgcac agagacaaac ttcatcacca agatcaaccc tgagacactg 480

gaaaccatca agcaggttga cctgtgcaac tatgtgtctg tgaatggggc cacagctcac 540

cctcacattg agaatgatgg cacagtgtac aacattggca actgctttgg caagaacttc 600

agcattgcct acaacatagt gaagatccca cctctgcagg ctgacaaaga ggaccccatc 660

agcaagtctg agattgtggt gcagttcccc tgctctgaca gattcaagcc cagctatgtg 720

cacagctttg gcctgacacc taactacatt gtgtttgtgg aaacccctgt gaagatcaat 780

ctgttcaagt tcctgagcag ctggtccctg tggggagcca actacatgga ctgctttgag 840

agcaatgaga caatgggagt gtggctgcac attgcagaca agaagagaaa gaagtacctg 900

aacaacaagt acaggacaag ccccttcaac ctgttccacc acatcaacac ctatgaggac 960

aatggcttcc tgattgtgga cctgtgctgc tggaagggct ttgagtttgt gtacaactac 1020

ctgtacctgg ccaacctgag ggaaaactgg gaagaagtga agaagaatgc cagaaaggcc 1080

cctcagcctg aagttagaag atatgtgctg cccctgaaca ttgacaaggc tgacacaggc 1140

aagaacctgg tcaccctgcc taacaccaca gccacagcca tcctgtgctc tgatgagact 1200

atctggctgg aacctgaggt gctgttctct ggccccagac aggcctttga gttccctcag 1260

atcaactacc agaaatactg tggcaagccc tacacctatg cctatggcct gggcctgaac 1320

cactttgtgc cagacagact gtgcaagctg aatgtcaaga ccaaagagac atgggtctgg 1380

caagagcctg acagctaccc ttctgagccc atctttgtgt ctcaccctga tgctctggaa 1440

gaggatgatg gggttgtgct gtctgtggtg gtgtcccctg gtgctggaca gaagcctgcc 1500

tatctgctga tcctgaatgc caaggacctg tctgaggtgg ccagagctga ggtggaaatc 1560

aacatccctg tgaccttcca tggcctgttc aagaagtcct ga 1602

<210> 5

<211> 1602

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

atgagcatcc aggtggaaca tcctgctggt ggctacaaga aactgtttga gacagtggaa 60

gaactgagca gccctctgac agcccatgtg acaggcagaa tccctctgtg gctgacaggc 120

tccctgctga gatgtggccc tggcctgttt gaagtgggct ctgagccttt ctaccacctg 180

tttgatggac aggccctgct gcacaagttt gacttcaaag agggccatgt gacctaccac 240

agaagattca tcaggacaga tgcctatgtc agagccatga cagagaagag gattgtgatc 300

actgagtttg gcacctgtgc ctttccagat ccttgcaaga acatcttcag cagattcttc 360

agctacttca gaggggttga agtgacagac aatgccctgg tcaatgtgta ccctgtggga 420

gaagattact atgcctgcac agagacaaac ttcatcacca agatcaaccc tgagacactg 480

gaaaccatca agcaggttga cctgtgcaac tatgtgtctg tgaatggggc cacagctcac 540

cctcacattg agaatgatgg cacagtgtac aacattggca actgctttgg caagaacttc 600

agcattgcct acaacatagt gaagatccca cctctgcagg ctgacaaaga ggaccccatc 660

agcaagtctg agattgtggt gcagttcccc tgctctgaca gattcaagcc cagctatgtg 720

cacagctttg gcctgacacc taactacatt gtgtttgtgg aaacccctgt gaagatcaat 780

ctgttcaagt tcctgagcag ctggtccctg tggggagcca actacatgga ctgctttgag 840

agcaatgaga caatgggagt gtggctgcac attgcagaca agaagagaaa gaagtacctg 900

aacaacaagt accggacaag ccccttcaac ctgttccacc acatcaacac ctatgaggac 960

aatggcttcc tgattgtgga cctgtgctgc tggaagggct ttgagttcgt gtacaactac 1020

ctgtacctgg ccaacctgag ggaaaactgg gaagaagtga agaagaatgc cagaaaggcc 1080

cctcagcctg aagttagaag atatgtgctg cccctgaaca ttgacaaggc tgacacaggc 1140

aagaacctgg tcaccctgcc taacaccaca gccacagcca tcctgtgctc tgatgagact 1200

atctggctgg aacctgaggt gctgttctct ggccccagac aggccttcga gttccctcag 1260

atcaactacc agaaatactg cggcaagccc tacacctatg cctatggcct gggcctgaac 1320

cacttcgtgc cagacagact gtgcaagctg aatgtcaaga ccaaagagac atgggtctgg 1380

caagagcctg acagctaccc ttctgagccc atctttgtgt ctcaccctga tgctctggaa 1440

gaggatgatg gggttgtgct gtctgtggtg gtgtcccctg gtgctggaca gaagcctgcc 1500

tatctgctga tcctgaatgc caaggacctg tctgaggtgg ccagagctga ggtggaaatc 1560

aacatccctg tgaccttcca tggcctgttc aagaagtcct ga 1602

<210> 6

<211> 1602

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

atgtccatcc aggtggagca cccagctgga ggctacaaga agctgtttga gactgtggaa 60

gaactgagca gccccctgac agcccatgtg acaggcagga tccccctgtg gctgacaggc 120

agcctgctga gatgtggccc aggcctgttt gaggtgggct ctgagccttt ctaccacctg 180

tttgatggcc aagccctgct ccacaagttc gatttcaaag agggccatgt gacctaccac 240

agacggttca tcagaacaga tgcctatgtg agagccatga cagagaagag aattgtgatc 300

acagaatttg gcacctgtgc cttccctgac ccctgcaaga acatcttcag cagattcttc 360

agctacttca gaggagtgga agtgacagac aatgccctgg tgaatgtgta ccctgtggga 420

gaagactact atgcctgtac tgagaccaac ttcatcacca agatcaaccc tgaaaccctg 480

gaaaccatca agcaggtgga cctgtgcaac tatgtgtcag tcaatggagc cacagcccac 540

cctcacatcg agaatgatgg cacagtttac aacattggca actgctttgg caaaaacttc 600

agcatcgcct acaacattgt gaagatcccc cctctgcagg ctgacaaaga ggaccccatc 660

agcaagtctg agatagtggt gcagttccca tgctctgacc ggttcaagcc cagctatgtg 720

cacagctttg gcctgacccc aaactacatt gtgtttgtgg aaacccctgt caaaatcaac 780

ctgttcaaat tcctgagctc ctggagcctg tggggagcca actacatgga ctgctttgaa 840

agcaatgaga ccatgggagt gtggctgcac attgctgaca agaaacggaa gaagtacctg 900

aacaacaagt accggaccag ccctttcaac ctgttccacc acatcaacac ctatgaggac 960

aatggcttcc tgatcgtgga cctgtgctgc tggaagggct ttgagttcgt gtacaactac 1020

ctgtacctgg ccaacctgag agaaaactgg gaggaggtga agaagaatgc cagaaaggcc 1080

ccccagcctg aagtgaggag atatgtgctg cctctgaaca tagacaaggc tgacacaggc 1140

aagaacctgg tgaccctccc taacaccaca gccacagcca tcctctgctc tgatgagacc 1200

atctggctgg aacctgaagt gctgttctct ggccccagac aggcctttga gttcccacaa 1260

atcaactacc agaaatactg tggcaagccc tacacctacg cctatggcct gggcctgaac 1320

cactttgtgc ctgacagact gtgcaagctg aatgtgaaga ccaaggagac ctgggtctgg 1380

caggagcctg actcctaccc ttctgaaccc atctttgtca gccaccctga tgccctggag 1440

gaggatgatg gagtggtgct gagtgtggtg gtgagccctg gtgctggcca gaagcctgca 1500

tacctgctga tcctgaatgc caaggacctg tctgaggttg ccagagctga ggtggaaatc 1560

aacatccctg tcaccttcca tggcttattc aagaaaagct ga 1602

<210> 7

<211> 1605

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

atgagcatcc aggttgagca tcctgctggt ggttacaaga aactgtttga aactgtggag 60

gaactgtcct cgccgctcac agctcatgta acaggcagga tccccctctg gctcaccggc 120

agtctccttc gatgtgggcc aggactcttt gaagttggat ctgagccatt ttaccacctg 180

tttgatgggc aagccctcct gcacaagttt gactttaaag aaggacatgt cacataccac 240

agaaggttca tccgcactga tgcttacgta cgggcaatga ctgagaaaag gatcgtcata 300

acagaatttg gcacctgtgc tttcccagat ccctgcaaga atatattttc caggtttttt 360

tcttactttc gaggagtaga ggttactgac aacgcccttg ttaatgtcta cccagtgggg 420

gaagattact acgcttgcac agagaccaac tttattacaa agattaatcc agagaccttg 480

gagacaatta agcaggttga tctttgcaac tatgtctctg tcaatggggc cactgctcac 540

ccccacattg aaaatgatgg aaccgtttac aatattggta attgctttgg aaaaaatttt 600

tcaattgcct acaacattgt aaagatccca ccactgcaag cagacaagga agatccaata 660

agcaagtcag agatcgttgt acaattcccc tgcagtgacc gattcaagcc atcttacgtt 720

catagttttg gtctgactcc caactatatc gtttttgtgg agacaccagt caaaattaac 780

ctgttcaagt tcctttcttc atggagtctt tggggagcca actacatgga ttgttttgag 840

tccaatgaaa ccatgggggt ttggcttcat attgctgaca aaaaaaggaa aaagtacctc 900

aataataaat acagaacttc tcctttcaac ctcttccatc acatcaacac ctatgaagac 960

aatgggtttc tgattgtgga tctctgctgc tggaaaggat ttgagtttgt ttataattac 1020

ttatatttag ccaatttacg tgagaactgg gaagaggtga aaaaaaatgc cagaaaggct 1080

ccccaacctg aagttaggag atatgtactt cctttgaata ttgacaaggc tgacacaggc 1140

aagaatttag tcacgctccc caatacaact gccactgcaa ttctgtgcag tgacgagact 1200

atctggctgg agcctgaagt tctcttttca gggcctcgtc aagcatttga gtttcctcaa 1260

atcaattacc agaagtattg tgggaaacct tacacatatg cgtatggact tggcttgaat 1320

cactttgttc cagataggct ctgtaagctg aatgtcaaaa ctaaagaaac ttgggtttgg 1380

caagagcctg attcataccc atcagaaccc atctttgttt ctcacccaga tgccttggaa 1440

gaagatgatg gtgtagttct gagtgtggtg gtgagcccag gagcaggaca aaagcctgct 1500

tatctcctga ttctgaatgc caaggactta agtgaagttg cccgggctga agtggagatt 1560

aacatccctg tcacctttca tggactgttc aaaaaatctt aataa 1605

<210> 8

<211> 1602

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

atgtctattc aagtcgagca cccagcgggg ggatataaaa agcttttcga aacggtggag 60

gagctgagct ccccccttac ggcgcatgtt acggggcgca tacctctgtg gctcacggga 120

tcattgcttc gctgcggacc cggattgttc gaggttggca gtgaaccatt ctaccatctc 180

ttcgatggtc aggcattgct tcataaattt gatttcaaag aaggacacgt cacatatcat 240

cgcaggttca tccggacaga tgcgtacgtt cgcgccatga cagaaaagcg cattgtaata 300

actgagtttg ggacatgtgc atttcctgac ccttgtaaga atatattcag ccgctttttc 360

agctatttta gaggcgttga ggttactgac aatgcgctcg tgaacgtcta tccagtaggt 420

gaagattatt acgcctgtac tgagactaat ttcatcacta aaattaatcc agaaactttg 480

gagaccataa agcaggttga tctctgtaac tatgtctcag tgaatggcgc tacagcgcac 540

ccgcacatag aaaacgatgg aacggtttac aatataggca actgttttgg taagaatttt 600

agcattgctt acaacatagt caagatacct cctctccaag ccgataaaga ggacccgata 660

tccaaatcag agattgttgt ccaattcccg tgcagtgata gattcaaacc gtcttacgtc 720

cacagttttg gcctgacacc caattacatt gtttttgttg aaacacctgt taagataaat 780

ctctttaaat ttctgtcttc ttggagtctg tggggggcaa attacatgga ttgtttcgag 840

tctaacgaga cgatgggagt ctggcttcat atagcagata aaaagcgcaa aaagtatttg 900

aataacaagt accggacgag cccgttcaat ttgttccacc atatcaacac ttacgaggat 960

aacgggtttc tgatcgtcga cctttgctgt tggaaagggt tcgagttcgt gtataactac 1020

ctctacttgg cgaaccttcg ggaaaattgg gaggaagtta agaagaacgc aagaaaggcc 1080

ccgcagccag aagtccgaag gtatgttctg ccgttgaata tcgacaaagc cgacactgga 1140

aagaacctcg ttacgcttcc caataccacg gctaccgcga tcttgtgcag tgacgaaaca 1200

atttggctgg agcccgaggt gttgttttct ggcccaaggc aagcctttga attcccacag 1260

ataaattatc aaaaatattg tggaaagccc tacacctacg cttatggact cggtctcaac 1320

cattttgttc cagatcgact ttgcaagctg aatgtaaaga ccaaagaaac ctgggtttgg 1380

caagaacccg attcctaccc cagtgaaccg atctttgttt cccatcccga cgccctcgaa 1440

gaagacgacg gagttgtctt gtccgttgtg gtgagccccg gtgcaggaca gaagcccgct 1500

tatcttttga ttcttaatgc caaagatttg tcagaagtag cgcgggccga ggtagagatc 1560

aacatacctg ttactttcca tgggttgttc aaaaagagtt ga 1602

<210> 9

<211> 1605

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

atgagcatcc aggtggaaca tcctgccggc ggatacaaga aactgttcga gacagtggaa 60

gaactgagca gccctctgac agcccacgtg acaggcagaa tccctctgtg gctgaccggc 120

agcctgctga gatgtggacc tggcctgttt gaagtgggca gcgagccttt ctaccacctg 180

ttcgatggac aggccctgct gcacaagttc gacttcaaag agggccacgt cacctaccac 240

cggcggttca ttagaaccga tgcctacgtg cgggccatga ccgagaagag aatcgtgatc 300

accgagttcg gcacctgtgc ctttccagat ccttgcaaga acatcttcag ccggttcttc 360

agctacttca gaggcgtgga agtgaccgac aacgccctgg tcaatgtgta ccccgtgggc 420

gaagattact acgcctgcac cgagacaaac ttcatcacca agatcaaccc cgagacactg 480

gaaaccatca agcaggttga cctgtgcaac tacgtgtccg tgaacggcgc cacagctcac 540

cctcacatcg agaatgatgg caccgtgtac aacatcggca actgcttcgg caagaacttc 600

tctatcgcct acaatatcgt gaagatccca cctctgcagg ccgacaaaga ggaccccatc 660

agcaagagcg agatcgtggt gcagttcccc tgcagcgaca gattcaagcc cagctacgtg 720

cacagcttcg gcctgacacc taactacatc gtgttcgtgg aaacccctgt gaagatcaat 780

ctgttcaagt tcctgagcag ctggtccctg tggggcgcca actacatgga ttgcttcgag 840

agcaacgaga caatgggcgt gtggctgcac attgccgaca agaagcggaa gaagtacctg 900

aacaacaagt accggacaag ccccttcaac ctgttccacc acatcaacac ctacgaggac 960

aacggcttcc tgatcgtgga cctgtgttgc tggaagggct tcgagttcgt gtacaattac 1020

ctgtacctgg ccaacctgcg cgagaactgg gaagaagtga agaagaacgc ccggaaggcc 1080

cctcagcctg aagtgcgaag atatgtgctg cccctgaaca tcgacaaggc cgacaccggc 1140

aagaatctgg tcaccctgcc taataccacc gccaccgcca tcctgtgtag cgacgaaacc 1200

atctggctgg aacccgaggt gctgttctct ggacctagac aggccttcga gtttccccag 1260

atcaactacc agaagtactg cggcaagccc tacacctacg cctatggcct gggcctgaat 1320

cacttcgtgc ccgacagact gtgcaagctg aacgtcaaga ccaaagagac atgggtctgg 1380

caagagcccg acagctaccc tagcgagccc atctttgtgt ctcaccccga cgctctggaa 1440

gaggacgatg gcgttgtgct gagcgtggtg gtttctcctg gcgccggaca gaaacctgcc 1500

tacctgctga tcctgaacgc caaggacctg agcgaagtgg ccagagccga ggtggaaatc 1560

aacatccccg tgaccttcca cggcctgttc aagaagtcct aataa 1605

<210> 10

<211> 1602

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

atgagcatcc aggtggagca ccccgccggc ggctacaaga agctgttcga gaccgtggag 60

gagctgagca gccccctgac cgcccacgtg accggccgca tccccctgtg gctgaccggc 120

agcctgctgc gctgcggccc cggcctgttc gaggtgggca gcgagccctt ctaccacctg 180

ttcgacggcc aggccctgct gcacaagttc gacttcaagg agggccacgt gacctaccac 240

cgccgcttca tccgcaccga cgcctacgtg cgcgccatga ccgagaagcg catcgtgatc 300

accgagttcg gcacctgcgc cttccccgac ccctgcaaga acatcttcag ccgcttcttc 360

agctacttcc gcggcgtgga ggtgaccgac aacgccctgg tgaacgtgta ccccgtgggc 420

gaggactact acgcctgcac cgagaccaac ttcatcacca agatcaaccc cgagaccctg 480

gagaccatca agcaggtgga cctgtgcaac tacgtgagcg tgaacggcgc caccgcccac 540

ccccacatcg agaacgacgg caccgtgtac aacatcggca actgcttcgg caagaacttc 600

agcatcgcct acaacatcgt gaagatcccc cccctgcagg ccgacaagga ggaccccatc 660

agcaagagcg agatcgtggt gcagttcccc tgcagcgacc gcttcaagcc cagctacgtg 720

cacagcttcg gcctgacccc caactacatc gtgttcgtgg agacccccgt gaagatcaac 780

ctgttcaagt tcctgagcag ctggagcctg tggggcgcca actacatgga ctgcttcgag 840

agcaacgaga ccatgggcgt gtggctgcac atcgccgaca agaagcgcaa gaagtacctg 900

aacaacaagt accgcaccag ccccttcaac ctgttccacc acatcaacac ctacgaggac 960

aacggcttcc tgatcgtgga cctgtgctgc tggaagggct tcgagttcgt gtacaactac 1020

ctgtacctgg ccaacctgcg cgagaactgg gaggaggtga agaagaacgc ccgcaaggcc 1080

ccccagcccg aggtgcgccg ctacgtgctg cccctgaaca tcgacaaggc cgacaccggc 1140

aagaacctgg tgaccctgcc caacaccacc gccaccgcca tcctgtgcag cgacgagacc 1200

atctggctgg agcccgaggt gctgttcagc ggcccccgcc aggccttcga gttcccccag 1260

atcaactacc agaagtactg cggcaagccc tacacctacg cctacggcct gggcctgaac 1320

cacttcgtgc ccgaccgcct gtgcaagctg aacgtgaaga ccaaggagac ctgggtgtgg 1380

caggagcccg acagctaccc cagcgagccc atcttcgtga gccaccccga cgccctggag 1440

gaggacgacg gcgtggtgct gagcgtggtg gtgagccccg gcgccggcca gaagcccgcc 1500

tacctgctga tcctgaacgc caaggacctg agcgaggtgg cccgcgccga ggtggagatc 1560

aacatccccg tgaccttcca cggcctgttc aagaagagct aa 1602

<210> 11

<211> 533

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Met Ser Ile Gln Val Glu His Pro Ala Gly Gly Tyr Lys Lys Leu Phe

1 5 10 15

Glu Thr Val Glu Glu Leu Ser Ser Pro Leu Thr Ala His Val Thr Gly

20 25 30

Arg Ile Pro Leu Trp Leu Thr Gly Ser Leu Leu Arg Cys Gly Pro Gly

35 40 45

Leu Phe Glu Val Gly Ser Glu Pro Phe Tyr His Leu Phe Asp Gly Gln

50 55 60

Ala Leu Leu His Lys Phe Asp Phe Lys Glu Gly His Val Thr Tyr His

65 70 75 80

Arg Arg Phe Ile Arg Thr Asp Ala Tyr Val Arg Ala Met Thr Glu Lys

85 90 95

Arg Ile Val Ile Thr Glu Phe Gly Thr Cys Ala Phe Pro Asp Pro Cys

100 105 110

Lys Asn Ile Phe Ser Arg Phe Phe Ser Tyr Phe Arg Gly Val Glu Val

115 120 125

Thr Asp Asn Ala Leu Val Asn Val Tyr Pro Val Gly Glu Asp Tyr Tyr

130 135 140

Ala Cys Thr Glu Thr Asn Phe Ile Thr Lys Ile Asn Pro Glu Thr Leu

145 150 155 160

Glu Thr Ile Lys Gln Val Asp Leu Cys Asn Tyr Val Ser Val Asn Gly

165 170 175

Ala Thr Ala His Pro His Ile Glu Asn Asp Gly Thr Val Tyr Asn Ile

180 185 190

Gly Asn Cys Phe Gly Lys Asn Phe Ser Ile Ala Tyr Asn Ile Val Lys

195 200 205

Ile Pro Pro Leu Gln Ala Asp Lys Glu Asp Pro Ile Ser Lys Ser Glu

210 215 220

Ile Val Val Gln Phe Pro Cys Ser Asp Arg Phe Lys Pro Ser Tyr Val

225 230 235 240

His Ser Phe Gly Leu Thr Pro Asn Tyr Ile Val Phe Val Glu Thr Pro

245 250 255

Val Lys Ile Asn Leu Phe Lys Phe Leu Ser Ser Trp Ser Leu Trp Gly

260 265 270

Ala Asn Tyr Met Asp Cys Phe Glu Ser Asn Glu Thr Met Gly Val Trp

275 280 285

Leu His Ile Ala Asp Lys Lys Arg Lys Lys Tyr Leu Asn Asn Lys Tyr

290 295 300

Arg Thr Ser Pro Phe Asn Leu Phe His His Ile Asn Thr Tyr Glu Asp

305 310 315 320

Asn Gly Phe Leu Ile Val Asp Leu Cys Cys Trp Lys Gly Phe Glu Phe

325 330 335

Val Tyr Asn Tyr Leu Tyr Leu Ala Asn Leu Arg Glu Asn Trp Glu Glu

340 345 350

Val Lys Lys Asn Ala Arg Lys Ala Pro Gln Pro Glu Val Arg Arg Tyr

355 360 365

Val Leu Pro Leu Asn Ile Asp Lys Ala Asp Thr Gly Lys Asn Leu Val

370 375 380

Thr Leu Pro Asn Thr Thr Ala Thr Ala Ile Leu Cys Ser Asp Glu Thr

385 390 395 400

Ile Trp Leu Glu Pro Glu Val Leu Phe Ser Gly Pro Arg Gln Ala Phe

405 410 415

Glu Phe Pro Gln Ile Asn Tyr Gln Lys Tyr Cys Gly Lys Pro Tyr Thr

420 425 430

Tyr Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Asn His Phe Val Pro Asp Arg Leu Cys

435 440 445

Lys Leu Asn Val Lys Thr Lys Glu Thr Trp Val Trp Gln Glu Pro Asp

450 455 460

Ser Tyr Pro Ser Glu Pro Ile Phe Val Ser His Pro Asp Ala Leu Glu

465 470 475 480

Glu Asp Asp Gly Val Val Leu Ser Val Val Val Ser Pro Gly Ala Gly

485 490 495

Gln Lys Pro Ala Tyr Leu Leu Ile Leu Asn Ala Lys Asp Leu Ser Glu

500 505 510

Val Ala Arg Ala Glu Val Glu Ile Asn Ile Pro Val Thr Phe His Gly

515 520 525

Leu Phe Lys Lys Ser

530

<210> 12

<211> 1604

<212> DNA

<213> 智人

<400> 12

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120

atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300

catgtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc 360

ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgattggggg cggggggggg 420

gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag 480

aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg 540

gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgacgct 600

gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga 660

ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc 720

gcttggttta atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc 780

gggagggccc tttgtgcggg ggggagcggc tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg 840

gggagcgccg cgtgcggccc gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg 900

ggctttgtgc gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt 960

gcgggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1020

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1080

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1140

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1200

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg 1260

gcgagccgca gccaattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg gacttccttt 1320

gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct ctagcgggcg 1380

cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatcggg cggggagggc cttcgtgcgt 1440

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1500

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1560

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acag 1604

<210> 13

<211> 479

<212> DNA

<213> 智人

<400> 13

gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60

gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcaatc cattttgtct gactaggtgt 120

ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 180

caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 240

ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 300

tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 360

ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 420

cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtcctt 479

<210> 14

<211> 225

<212> DNA

<213> 智人

<400> 14

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225

<210> 15

<211> 135

<212> DNA

<213> 智人

<400> 15

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120

tatcatgtct ggatc 135

<210> 16

<211> 589

<212> DNA

<213> 智人

<400> 16

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180

tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240

ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300

attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360

ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420

gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480

aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540

cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589

<210> 17

<211> 735

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly

145 150 155 160

Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

355 360 365

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

385 390 395 400

Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr

435 440 445

Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln

450 455 460

Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly

465 470 475 480

Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn

485 490 495

Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly

500 505 510

Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp

515 520 525

Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys

530 535 540

Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr

545 550 555 560

Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr

565 570 575

Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr

580 585 590

Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp

595 600 605

Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr

610 615 620

Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys

625 630 635 640

His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn

645 650 655

Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln

660 665 670

Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys

675 680 685

Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr

690 695 700

Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr

705 710 715 720

Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 18

<211> 598

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro

1 5 10 15

Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys

20 25 30

Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro

35 40 45

Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn

50 55 60

Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly

65 70 75 80

Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr

85 90 95

Trp Met Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu

100 105 110

Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly

115 120 125

Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr

130 135 140

Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln

145 150 155 160

Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe

165 170 175

Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr

180 185 190

Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp

195 200 205

Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys

210 215 220

Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr

225 230 235 240

Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr

245 250 255

Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe

260 265 270

Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala

275 280 285

His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr

290 295 300

Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln

305 310 315 320

Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln

325 330 335

Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser

340 345 350

Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala

355 360 365

Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro

370 375 380

Ala Met Ala Ser His Lys Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser

385 390 395 400

Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp

405 410 415

Ile Glu Lys Val Met Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn

420 425 430

Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg

435 440 445

Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu

450 455 460

Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile

465 470 475 480

Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu

485 490 495

Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys

500 505 510

Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys

515 520 525

Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu

530 535 540

Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu

545 550 555 560

Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr

565 570 575

Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg

580 585 590

Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

595

<210> 19

<211> 533

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

Met Ala Thr Gly Ser Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala

1 5 10 15

Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp

20 25 30

Met Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro

35 40 45

Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala

50 55 60

Ser Asn Asp Asn His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe

65 70 75 80

Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg

85 90 95

Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys

100 105 110

Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr

115 120 125

Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser

130 135 140

Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu

145 150 155 160

Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu

165 170 175

Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys

180 185 190

Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr

195 200 205

Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His

210 215 220

Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu

225 230 235 240

Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser

245 250 255

Arg Leu Gln Phe Ser Gln Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser

260 265 270

Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys

275 280 285

Thr Ser Ala Asp Asn Asn Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr

290 295 300

Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala

305 310 315 320

Met Ala Ser His Lys Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly

325 330 335

Val Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile

340 345 350

Glu Lys Val Met Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro

355 360 365

Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly

370 375 380

Asn Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro

385 390 395 400

Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp

405 410 415

Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met

420 425 430

Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn

435 440 445

Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe

450 455 460

Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile

465 470 475 480

Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile

485 490 495

Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val

500 505 510

Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr

515 520 525

Leu Thr Arg Asn Leu

530

Claims

1.一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含含有RPE65多肽的编码序列的多核苷酸序列，其中所述编码序列是密码子优化的，并且与野生型RPE65核苷酸序列相比含有改变数量的CpG二核苷酸。

2.根据权利要求1所述的rAAV颗粒，其中与所述野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含减少数量的CpG二核苷酸。

3.根据权利要求2所述的rAAV颗粒，其中与所述野生型RPE65核苷酸序列相比，所述编码序列包含约50％的CpG二核苷酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的rAAV颗粒，其中所述编码序列包含少于20个CpG二核苷酸。

5.根据权利要求4所述的rAAV颗粒，其中所述编码序列包含少于10个CpG二核苷酸。

6.根据权利要求5所述的rAAV颗粒，其中所述编码序列不包含CpG二核苷酸。

7.根据权利要求1所述的rAAV颗粒，其中所述编码序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQID NO:10。

8.根据权利要求1所述的rAAV颗粒，其中所述编码序列与选自SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列具有至少95％序列同一性。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的rAAV颗粒，其还包含AAV衣壳蛋白。

10.根据权利要求9所述的rAAV颗粒，其中所述AAV衣壳蛋白是血清型2AAV蛋白、血清型5AAV蛋白、血清型8AAV蛋白或其片段或变体。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的rAAV颗粒，其中所述多核苷酸序列还包含启动子，并且所述启动子可操作地连接至所述编码序列。

12.根据权利要求11所述的rAAV颗粒，其中所述启动子是CMV、CAG、MNDU3、PGK、EF1a、Ubc启动子或眼部组织特异性启动子。

13.根据权利要求12所述的rAAV颗粒，其中所述眼部组织特异性启动子选自RPE 65基因启动子、人视网膜结合蛋白(CRALBP)基因启动子、鼠11-顺式视黄醇脱氢酶(RDH)基因启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、金属蛋白酶组织抑制因子3(Timp3)启动子、光感受器视黄醇结合蛋白启动子、卵黄状黄斑营养不良2启动子或光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)启动子。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的rAAV颗粒，其中所述多核苷酸序列还包含在3'末端处的WPRE序列。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的rAAV颗粒，其中所述多核苷酸序列还包含在3'末端处的poly(A)序列。

16.根据权利要求15所述的rAAV颗粒，其中所述poly(A)序列是SV40pA、hGHpA或bGHpA。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的rAAV颗粒，其中所述多核苷酸还包含填充序列。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的rAAV颗粒，其中所述多核苷酸序列还包含反向末端重复(ITR)序列。

19.根据权利要求18所述的rAAV颗粒，其中所述反向末端重复(ITR)序列是变体反向末端重复(ITR)序列。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的rAAV颗粒，其中所述多核苷酸包含不超过300个CpG二核苷酸。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的rAAV颗粒，其中所述多核苷酸包含不超过250个CpG二核苷酸。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的rAAV颗粒，其中所述多核苷酸包含约200至500个CpG二核苷酸。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的rAAV颗粒，其中所述多核苷酸还包含编码一种其它治疗性蛋白的序列。

24.根据权利要求23所述的rAAV颗粒，其中所述其它治疗性蛋白选自ABCA4、RDH12、RDH8、RBP3、RBP1、LRAT、RLBP1、RDH10和RDH11。

25.根据权利要求23或24所述的rAAV颗粒，其中所述编码序列通过接头序列与所述其它治疗性蛋白的序列连接。

26.根据权利要求25所述的rAAV颗粒，其中所述接头是可切割接头。

27.根据权利要求25或26所述的rAAV颗粒，其中所述接头包含2A肽。

28.一种组合物，其包含：

(i)编码腺相关病毒(AAV)蛋白的第一多核苷酸，和

(ii)包含编码RPE65多肽的序列的第二多核苷酸，其中所述序列是密码子优化的，并且与野生型RPE65核苷酸序列相比含有改变数量的CpG二核苷酸。

29.根据权利要求28所述的组合物，其中与所述野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含减少数量的CpG二核苷酸。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中与所述野生型RPE65核苷酸序列相比，所述序列包含约50％的CpG二核苷酸。

31.根据权利要求28至30所述的组合物，其中所述序列包含少于20个CpG二核苷酸。

32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述序列包含少于10个CpG二核苷酸。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述序列不包含CpG二核苷酸。

34.根据权利要求28所述的组合物，其中所述序列选自SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10。

35.根据权利要求28所述的组合物，其中所述序列与选自SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQID NO:10的序列具有至少95％序列同一性。

36.根据权利要求28至35所述的组合物，其中所述AAV蛋白是血清型2AAV蛋白、血清型5AAV蛋白、血清型8AAV蛋白或其片段或变体。

37.根据权利要求28至36所述的组合物，其中所述第一多核苷酸是密码子优化的。

38.根据权利要求28至37所述的组合物，其中所述第二多核苷酸包含启动子，所述启动子可操作地连接至所述序列。

39.根据权利要求38所述的组合物，所述启动子是CMV、CAG、MNDU3、PGK、EF1a、Ubc启动子或眼部组织特异性启动子。

40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述眼部组织特异性启动子选自RPE 65基因启动子、人视网膜结合蛋白(CRALBP)基因启动子、鼠11-顺式视黄醇脱氢酶(RDH)基因启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、金属蛋白酶组织抑制因子3(Timp3)启动子、光感受器视黄醇结合蛋白启动子、卵黄状黄斑营养不良2启动子或光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)启动子。

41.根据权利要求28至40所述的组合物，其中所述第二多核苷酸包含少于300个CpG二核苷酸。

42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述第二多核苷酸包含少于250个CpG二核苷酸。

43.根据权利要求28至42所述的组合物，其中所述第二多核苷酸包含约200-500个CpG二核苷酸。

44.根据权利要求28至43所述的组合物，其中所述第二多核苷酸序列还包含在3'末端处的WPRE序列。

45.根据权利要求28至44所述的组合物，其中所述第二多核苷酸序列还包含在3'末端处的poly A序列。

46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述poly(A)序列是SV40晚期poly(A)(SV40pA)、人生长激素poly(A)(hGHpA)或牛生长激素poly(A)(bGHpA)。

47.根据权利要求28至46所述的组合物，其中所述第二多核苷酸还包含填充序列。

48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述第二多核苷酸还包含反向末端重复(ITR)序列。

49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述反向末端重复(ITR)序列是变体反向末端重复(ITR)序列。

50.根据权利要求28至49所述的组合物，其中所述第二多核苷酸还包含编码一种其它治疗性蛋白的序列。

51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述其它治疗性蛋白是ABCA4、RDH12、RDH8、RBP3、RBP1、LRAT、RLBP1、RDH10或RDH11。

52.根据权利要求49所述的组合物，其中所述序列和所述其它治疗性蛋白的序列通过接头连接。

53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述接头是可切割接头。

54.根据权利要求52或53所述的组合物，其中所述接头包含2A肽。

55.一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其通过将根据权利要求28至54中任一项所述的组合物引入宿主细胞中来制备。

56.根据权利要求55所述的rAAV颗粒，其中所述宿主细胞是人细胞、动物细胞或昆虫细胞。

57.根据权利要求56所述的rAAV颗粒，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞。

58.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1至27中任一项所述的rAAV颗粒或根据权利要求28至54中任一项所述的组合物。

59.一种用于制备rAAV颗粒的方法，所述方法包括在宿主细胞中引入根据权利要求27-52中任一项所述的组合物。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述宿主细胞是人细胞、动物细胞或昆虫细胞。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述宿主细胞是Sf9细胞。

62.根据权利要求60所述的方法，其中所述宿主细胞是HEK293细胞或其衍生物。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述宿主细胞是HEK293T细胞。

64.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其还包括生成杆状病毒质粒DNA和/或杆状病毒。

65.一种用于治疗Leber先天性黑朦(LCA)的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至27或55至57中任一项所述的rAAV颗粒和药学上可接受的载剂。

66.一种试剂盒，其包括根据权利要求65所述的药物组合物和说明书。

67.根据权利要求1至27或55至57中任一项所述的rAAV颗粒在制备用于治疗对象的遗传性视网膜疾病(IRD)的药物中的用途。

68.根据权利要求67所述的rAAV颗粒的用途，其中所述IRD是由于所述对象的RPE65基因的两个拷贝的突变引起。

69.一种用于治疗有需要的对象的Leber先天性黑朦(LCA)的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的根据权利要求1至27或55至57中任一项所述的rAAV颗粒或根据权利要求65所述的药物组合物。

70.根据权利要求69所述的方法，其中根据权利要求1至27中任一项所述的rAAV颗粒或根据权利要求65所述的药物组合物通过玻璃体内注射、视网膜下注射或脉络膜上腔注射来施用。

71.根据权利要求69或70所述的方法，其中所述治疗有效量是1×10⁹-1×10¹³个rAAV颗粒。

72.根据权利要求69或70所述的方法，其中对于每只眼睛，所述治疗有效量是1×10⁹-1×10¹³个载体基因组(vg)。