KR20210057720A - Clrn1 관련된 청력 손실 및/또는 시력 손실의 치료 방법 - Google Patents

Clrn1 관련된 청력 손실 및/또는 시력 손실의 치료 방법 Download PDF

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KR20210057720A
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KR1020217002300A
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엠마누엘 제이. 시몬스
로버트 엔쥐
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아카우오스, 인크.
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Abstract

단일 핵산 벡터 또는 2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물, 및 대상체의 청력 손실 및/또는 시력 손실을 치료하기 위한 이들 조성물의 용도가 본원에 제공된다.

Description

CLRN1 관련된 청력 손실 및/또는 시력 손실의 치료 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2018년 6월 25일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/689,660을 우선권 주장하며; 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시 내용은 일반적으로 인간 대상체에서 청력 손실, 시력 손실 또는 둘 다를 치료하기 위한 핵산의 용도에 관한 것이다.
현재의 청력 손실 치료는 주로 경증에서 중증의 청력 손실을 위한 청력 증폭과 중증에서 심도의 청력 손실을 위한 인공 와우로 구성된다; 그러나, 증후군성 난청을 예방하거나 되돌릴 수 있는 제제와 방법에 대한 오랜 필요성이 남아 있다.
청력 손실은 전음성(외이도 또는 중이에서 발생), 감각신경성(내이 또는 청신경에서 발생) 또는 혼합형일 수 있다. 대부분 형태의 증후군성 난청은 내이의 구조 손상(감각신경성 난청)으로 인한 영구 청력 손실과 관련이 있지만, 일부 형태는 중이의 변화(전음성 청력 손실)를 수반할 수 있다. 인간의 감각신경성 청력 손실의 대부분은 달팽이관에 있는 코르티(Corti) 기관의 유모세포(hair cells)의 이상으로 인해 발생한다(유모세포 기능 불량). 유모세포는 출생시 비정상이거나 개인의 일생 동안 손상될 수 있다(예를 들어, 소음 외상 또는 감염의 결과).
개요
본 발명은 적어도 2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 포유동물 세포에서 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하는 서열을 생성하는데 사용될 수 있고, 이에 의해 CLRN1 관련된 청력 손실 및/또는 시력 손실 치료가 필요한 대상체에서 CLRN1 관련된 청력 손실 및/또는 시력 손실을 치료하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CLRN1 단백질의 제1 및/또는 제2 아이소폼에 대한 코딩 서열을 포함하는 단일 핵산 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
적어도 2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이이고, 상기 암호화된 부분 각각의 아미노산 서열은 선택적으로 암호화된 부분 중 상이한 부분의 아미노산 서열과 부분적으로 중첩될 수 있고; 상기 적어도 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 전장 CLRN1 단백질을 암호화하지 않으며; 상기 코딩 서열 중 적어도 하나는 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손(exon)에 걸쳐 있고 상기 2개의 연속 엑손 사이에 인트론 서열(intronic sequence)이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 포유동물 세포에 도입되면, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터는 서로 상동성 재조합을 거쳐 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 형성하는 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼(isoform)의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3으로 구성된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 핵산 벡터 중 하나는 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5를 포함한다, 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5로 구성된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5로 구성된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 핵산 벡터 중 하나는 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3으로 구성된다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 중 적어도 하나는 5' 비번역 영역(untranslated region, UTR), 3' UTR 또는 둘 다를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 기술된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 기술된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 플라스미드, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체(artificial chromosome) 또는 바이러스 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 AAV 벡터이다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 암호화된 부분 중 어느 것의 아미노산 서열도 상기 암호화된 부분의 상이한 부분의 아미노산 서열과 중첩되지 않는다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 암호화된 부분 각각의 아미노산 서열은 상기 암호화된 부분 중 상이한 부분의 아미노산 서열과 부분적으로 중첩된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 중첩되는 아미노산 서열은 약 30개의 아미노산 잔기 내지 약 202개의 아미노산 잔기 길이이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 2개의 상이한 벡터를 포함하고, 이들 각각은 상이한 인트론 세그먼트를 포함하고, 상기 인트론은 CLRN1 게놈 DNA에 존재하는 인트론의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 2개의 상이한 인트론 세그먼트는 적어도 100개의 뉴클레오타이드에 의해 순차적으로 중첩된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 2개의 상이한 인트론 세그먼트는 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 800개의 뉴클레오타이드에 의해 순차적으로 중첩된다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각의 전체 뉴클레오타이드 서열은 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드 길이이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각의 전체 뉴클레오타이드 서열은 500개의 뉴클레오타이드 내지 5,000개의 뉴클레오타이드 길이이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 조성물 내의 상이한 벡터의 수는 2개이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 2개의 상이한 벡터 중 제1 벡터는 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 N-말단 부분은 30개의 아미노산 내지 202개의 아미노산 길이이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 N-말단 부분은 60개의 아미노산 내지 170개의 아미노산 길이이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 벡터는 5'UTR 서열을 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 벡터는 프로모터 및 코작 서열(Kozak sequence) 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 벡터는 유도성 프로모터(inducible promoter), 항시성 프로모터(constitutive promoter) 또는 조직 특이적 프로모터인 프로모터를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 2개의 상이한 벡터 중 제2 벡터는 CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 C-말단 부분은 30개의 아미노산 내지 202개의 아미노산 길이이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 C-말단 부분은 60개의 아미노산 내지 170개의 아미노산 길이이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제2 벡터는 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제2 벡터는 3' UTR 서열을 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.
단일 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 벡터는 (i) CLRN1 단백질의 제1 아이소폼을 암호화하는 제1 코딩 서열 및 (ii) CLRN1 단백질의 제2 아이소폼을 암호화하는 제2 코딩 서열 중 하나 또는 둘 다를 포함하고, 상기 제1 및 제2 코딩 서열 중 하나 또는 둘 다는 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손에 걸쳐 있고 2개의 연속 인트론 사이에 인트론 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 단일 핵산 벡터는 상기 제1 코딩 서열을 함유하고 상기 제2 코딩 서열은 함유하지 않는다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 단일 핵산 벡터는 상기 제2 코딩 서열을 함유하고 상기 제1 코딩 서열은 함유하지 않는다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 단일 핵산 벡터가 상기 제1 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열 둘 다를 함유한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3으로 구성된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5로 구성된다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 단일 핵산 벡터는 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 단일 핵산 벡터는 플라스미드, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 단일 핵산 벡터는 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 단일 핵산 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 단일 핵산 벡터는 AAV 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 단일 핵산 벡터는 프로모터 및 코작 서열 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 벡터는 유도성 프로모터, 항시성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터인 프로모터를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 단일 핵산 벡터는 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태는 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물을 포함하는 키트가 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 키트의 일부 실시양태는 본원에 기술된 임의의 조성물을 포함하거나 함유하는 사전 로딩된 주사기를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 달팽이관에 도입하는 것을 포함하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간이다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물은 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 확인되었다.
본원에 제공된 임의의 조성물을 포유동물 세포에 도입하는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 달팽이관 내유모세포(cochlear inner hair cell) 또는 달팽이관 외유모세포(cochlear outer hair cell)이다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 망막 세포이다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 인간 세포이다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 결정되었다.
본원에 기술된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 달팽이관에 도입하는 것을 포함하는, 포유동물의 달팽이관에서 내유모세포, 외유모세포 또는 둘 다에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 눈에 안내 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 눈에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물은 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 확인되었다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간이다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 대상체의 달팽이관에 투여하는 것을 포함하는, 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 확인된 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 확인된 대상체의 시력 손실을 치료하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 어셔 증후군(Usher syndrome) III형을 갖는다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 인간이다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태는 투여 단계 전에 상기 대상체가 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는지 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제1 핵산 벡터는 프로모터, 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 제1 코딩 서열 및 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열을 포함하고; 상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제2 핵산 벡터는 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며; 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이이고, 2개의 암호화된 부분의 아미노산 서열은 서로 중첩되지 않고; 상기 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 전장 CLRN1 단백질을 암호화하지 않으며; 포유동물 세포에 도입되면, 상기 스플라이스 공여체 서열과 상기 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 형성하는 조성물이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 코딩 서열은 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼의 N-말단 부분을 암호화하고, 상기 제2 코딩 서열은 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼의 C-말단 부분을 암호화한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3으로 구성된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제2 핵산 벡터의 상기 제1 핵산 벡터는 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5로 구성된다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 코딩 서열은 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 N-말단 부분을 암호화하고, 상기 제2 코딩 서열은 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 C-말단 부분을 암호화한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5로 구성된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 또는 상기 제2 핵산 벡터는 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3으로 구성된다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 중 하나 또는 둘 다는 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR 또는 둘 다를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 플라스미드, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 AAV 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 코딩 서열 중 적어도 하나는 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손에 걸쳐 있고 상기 2개의 연속 엑손 사이에 인트론 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제1 핵산 벡터는 프로모터, 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 제1 코딩 서열, 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열 및 상기 스플라이스 공여체 서열의 3'에 위치한 제1 검출 가능한 마커 유전자를 포함하고; 상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제2 핵산 벡터는 제2 검출 가능한 마커 유전자, 상기 제2 검출 가능한 마커 유전자의 3'에 위치한 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며; 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이이고, 상기 암호화된 부분의 아미노산 서열은 서로 중첩되지 않고; 상기 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 전장 CLRN1 단백질을 암호화하지 않으며; 포유동물 세포에 도입되면, 상기 스플라이스 공여체 서열과 상기 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 형성하는 조성물이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 코딩 서열은 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼의 N-말단 부분을 암호화하고, 상기 제2 코딩 서열은 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼의 C-말단 부분을 암호화한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3으로 구성된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제2 핵산 벡터의 상기 제1 핵산 벡터는 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5로 구성된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 코딩 서열은 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 N-말단 부분을 암호화하고, 상기 제2 코딩 서열은 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 C-말단 부분을 암호화한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5로 구성된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 또는 상기 제2 핵산 벡터는 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3으로 구성된다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 중 하나 또는 둘 다는 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR 또는 둘 다를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 플라스미드, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 AAV 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 코딩 서열 중 적어도 하나가 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손에 걸쳐 있고 상기 2개의 연속 엑손 사이에 인트론 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 또는 상기 제2 검출 가능한 마커 유전자는 알칼리성 포스파타제이다.
2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제1 핵산 벡터는 프로모터, 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 제1 코딩, 상기 제1 코딩의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열 및 상기 스플라이스 공여체 서열에 대해 3'에 위치한 F1 파지 재조합 생성 영역을 포함하고; 상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제2 핵산 벡터는 F1 파지 재조합 생성 영역, 상기 F1 파지 재조합 생성 영역의 3'에 위치한 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며; 2개의 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이이고, 상기 2개의 암호화된 부분의 아미노산 서열은 서로 중첩되지 않고; 상기 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 전장 CLRN1 단백질을 암호화하지 않으며; 포유동물 세포에 도입되면, 상기 스플라이스 공여체 서열과 상기 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 형성하는 조성물이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 코딩 서열은 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼의 N-말단 부분을 암호화하고, 상기 제2 코딩 서열은 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼의 C-말단 부분을 암호화한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3으로 구성된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제2 핵산 벡터의 상기 제1 핵산 벡터는 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5로 구성된다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 코딩 서열은 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 N-말단 부분을 암호화하고, 상기 제2 코딩 서열은 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 C-말단 부분을 암호화한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼은 서열 번호 5로 구성된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 또는 상기 제2 핵산 벡터는 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼은 서열 번호 3으로 구성된다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 중 하나 또는 둘 다는 5' 비번역 영역(UTR), 3'UTR 또는 둘 다를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 5' UTR은 서열 번호 12와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 3' UTR은 서열 번호 15와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 플라스미드, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 AAV 벡터이다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 코딩 서열 중 적어도 하나는 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손에 걸쳐 있고 상기 2개의 연속 엑손 사이에 인트론 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물을 포함하는 키트가 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 키트의 일부 실시양태는 상기 조성물을 포함하는 사전 로딩된 주사기를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 달팽이관에 도입하는 것을 포함하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간이다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물은 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 확인되었다.
본원에 제공된 임의의 조성물을 포유동물 세포에 도입하는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 달팽이관 내유모세포 또는 달팽이관 외유모세포이다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 망막 세포이다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 인간 세포이다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 결정되었다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 달팽이관에 도입하는 것을 포함하는, 포유동물의 달팽이관 내유모세포, 외유모세포 또는 둘 다에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 눈에 안구 내 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 눈에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물은 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 확인되었다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간이다.
본원에 제공된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 대상체의 달팽이관에 투여하는 것을 포함하는, 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 확인된 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 확인된 대상체의 시력 손실을 치료하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 어셔 증후군 III형을 갖는다, 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 인간이다. 본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태는 투여 단계 전에 상기 대상체가 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는지 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
용어 "a" 및 "an"은 물품의 문법적 대상 중 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭한다. 예를 들어, "요소(element)"는 하나의 요소와 1개 초과의 요소를 포함한다.
용어 "CLRN1 유전자의 돌연변이"는 야생형 CLRN1 단백질과 비교하여 하나 이상의 아미노산 결실, 하나 이상의 아미노산 치환 및 하나 이상의 아미노산 삽입 중 하나 이상을 갖는 CLRN1 단백질의 생성을 초래하고/거나 돌연변이가 없는 포유동물 세포에서 암호화된 CLRN1 단백질의 발현 수준과 비교하여 포유동물 세포에서 암호화된 CLRN1 단백질의 발현 수준의 감소를 초래하는 야생형 CLRN1 유전자의 변형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산)이 결실된 CLRN1 단백질의 생성을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 CLRN1 유전자에서 프레임 시프트(frameshift)를 초래할 수 있다. 용어 "프레임 시프트"는 코딩 서열에 임의의 돌연변이를 포함하여 코딩 서열의 판독 프레임에서 시프트를 초래하는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 프레임 시프트는 비기능적 단백질을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 점 돌연변이는 넌센스 돌연변이(nonsense mutation)일 수 있다(즉, 유전자의 엑손에서 조기 정지 코돈을 초래함). 넌센스 돌연변이는 기능적일 수도 있고 아닐 수도 있는 (해당하는 야생형 단백질과 비교하여) 절단된 단백질의 생성을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 CLRN1 mRNA 또는 CLRN1 단백질, 또는 이러한 mRNA 및 단백질 둘 다의 발현의 손실(또는 수준의 감소)을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 야생형 CLRN1 단백질과 비교하여 하나 이상의 생물학적 활성(기능)이 손실되거나 감소한 변경된 CLRN1 단백질의 생성을 초래할 수 있다.
일부 실시양태에서, 돌연변이는 CLRN1 유전자로의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 CLRN1 유전자의 조절 서열에, 즉 코딩 서열이 아닌 유전자의 일부에 있다. 일부 실시양태에서, 조절 서열의 돌연변이는 프로모터 또는 인핸서 영역에 있을 수 있고 CLRN1 유전자의 적절한 전사를 방지하거나 감소시킬 수 있다. 용어 "보존적 돌연변이"는 (코돈 축퇴로 인해) 돌연변이 부위에서 암호화된 아미노산을 변경하지 않는 돌연변이를 지칭한다.
변형은 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발과 같은 당해 분야에 공지된 표준 기술에 의해 뉴클레오타이드 서열에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당해 분야에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄가 있는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄가 있는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄가 있는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인 및 트립토판), 비극성 측쇄가 있는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌 및 메티오닌), 베타-분지형 측쇄가 있는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린 및 이소류신) 및 방향족 측쇄가 있는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 히스티딘)을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로 축퇴된 버전(degenerate version)이고, 따라서 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
용어 "내인성(endogenous)"은 유기체, 세포 또는 조직 내에서 유래하는 모든 물질을 의미한다.
용어 "외인성(exogenous)"은 도입되는 동일한 유기체, 세포 또는 조직으로부터 생성되지 않거나 유래하지 않는, 유기체, 세포 또는 조직 외부로부터 도입되거나 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "분리된(isolated)"은 자연 상태에서 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "분리"되지 않지만, 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "분리"된다. 분리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어, 숙주 세포와 같은 비천연 환경에 존재할 수 있다.
용어 "형질감염된", "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된", "형질전환된" 또는 "형질도입된" 포유동물 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다.
용어 "발현"은 단백질을 암호화하는 특정 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
용어 "일과성 발현(transient expression)"은 단기간(예를 들어, 몇 시간 또는 며칠) 동안 비통합 코딩 서열의 발현을 지칭한다. 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에서 일시적으로 발현되는 코딩 서열은 여러 라운드의 세포 분열시 손실된다.
용어 "대상체"는 임의의 포유동물을 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 설치류(예를 들어, 쥐 또는 마우스), 토끼, 양, 염소, 돼지, 개, 고양이, 비인간 영장류 또는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 청력 손실 및/또는 시력 손실이 있거나 있을 위험이 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 CLRN1 유전자에 돌연변이가 있는 것으로 사전에 확인되었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 CLRN1 유전자에 돌연변이가 있는 것으로 확인되었고 청력 손실 및/또는 시력 손실로 진단되었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 청력 손실 및/또는 시력 손실이 있는 것으로 확인되었다.
치료는 대상체(예를 들어, 인간)에서 질환 상태(예를 들어, 청력 손실 또는 시력 손실)의 하나 이상의 증상의 수, 중증도 및 빈도 중 하나 이상을 감소시킬 때 "치료적으로 유효"하다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효량의 조성물은 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 야생형, 전장 CLRN1 단백질 또는 원하는 활성을 갖는 CLRN1 단백질의 변이체)의 발현 수준을 향상시킬 수 있다(예를 들어, 조성물로 처리하기 전의 발현 수준과 비교하여). 일부 실시양태에서, 치료적 유효량의 조성물은 표적 세포(예를 들어, 달팽이관 내유모세포)에서 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 야생형, 전장 CLRN1 단백질 또는 활성 변이체)의 발현 수준을 향상시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효량의 조성물은 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 야생형, 전장 CLRN1 단백질 또는 활성 변이체)의 발현 수준의 향상 및/또는 표적 세포에서 CLRN1 단백질의 하나 이상의 활성을 증가시킬 수 있다(예를 들어, 치료 전 대상체의 수준(들), CLRN1 유전자에 돌연변이가 있는 대상체의 수준(들), 또는 청력 손실 및/또는 시력 손실이 있는 대상체 또는 대상체 집단의 수준(들)과 같은 기준 수준과 비교하여).
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 또는 이들의 조합을 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 이 용어는 기준 뉴클레오타이드와 결합 특성이 유사한 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명시적으로 표시된 서열뿐만 아니라 상보적 서열을 암시적으로 포함한다. 본원에 기술된 임의의 핵산의 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA이다. 본원에 기술된 임의의 핵산의 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA이다.
용어 "활성 CLRN1 단백질"은 달리는 야생형 포유동물의 청각 유모세포 또는 안구 세포에서 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 야생형 대립 유전자 둘 모두를 대체하는 경우 및 포유동물의 청각 유모세포 또는 안구 세포에서 발현되는 경우, 포유동물이 완전히 야생형인 유사한 포유동물의 정상적인 청각 또는 시각 수준에 가까운 청각 또는 시각 수준을 갖게 되는 DNA에 의해 암호화된 단백질을 의미한다. 활성 CLRN1 단백질의 비제한적 예는 전장 CLRN1 단백질(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 전장 CLRN1 단백질)이다.
예를 들어, 활성 CLRN1 단백질은 1개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 50개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 45개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 40개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 35개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 30개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 25개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 20개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 15개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 10개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 9개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 8개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 7개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 6개의 아미노산, 1개의 아미노산 치환에서 약 5개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 4개의 아미노산 치환, 1개의 아미노산 치환 내지 약 3개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 50개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 45개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 40개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 35개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 30개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 25개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 20개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 15개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 10개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 9개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 8개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 7개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 6개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 5개의 아미노산 치환, 약 2개의 아미노산 치환 내지 약 4개의 아미노산 치환, 약 3개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 3개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 3개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 3개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 3개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 3개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 3개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 3개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 3개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 약 3개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 약 3개의 아미노산 치환 내지 약 50개의 아미노산 치환, 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치환 내지 약 40개의 아미노산 치환, 약 7개의 아미노산 치환 내지 약 35개의 아미노산 치환, 약 7개의 아미노산 치환 내지 약 30개의 아미노산 치환, 약 7개의 아미노산 치환 내지 약 25개의 아미노산 치환, 약 7개의 아미노산 치환 내지 약 20개의 아미노산 치환, 약 7개의 아미노산 치환 내지 약 15개의 아미노산 치환, 약 7개의 아미노산 치환 내지 약 10개의 아미노산 치환, 약 7개의 아미노산 치환 내지 약 9개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 50개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 45개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 40개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 35개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 30개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 25개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 20개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 15개의 아미노산 치환, 약 8개의 아미노산 치환 내지 약 10개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 50개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 45개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 40개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 35개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 30개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 25개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 20개의 아미노산 치환, 약 10개의 아미노산 치환 내지 약 15개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 50개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 45개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 40개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 35개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 30개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 25개의 아미노산 치환, 약 15개의 아미노산 치환 내지 약 20개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 50개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 45개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 40개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 35개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 30개의 아미노산 치환, 약 20개의 아미노산 치환 내지 약 25개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 50개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 45개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 40개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 35개의 아미노산 치환, 약 25개의 아미노산 치환 내지 약 30개의 아미노산으로의 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 50개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 45개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 40개의 아미노산 치환, 약 30개의 아미노산 치환 내지 약 35개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 50개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 45개의 아미노산 치환, 약 35개의 아미노산 치환 내지 약 40개의 아미노산 치환, 약 40개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 40개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 40개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 40개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 40개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 40개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 40개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 40개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 40개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 약 40개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 약 40개의 아미노산 치환 내지 약 50개의 아미노산 치환으로, 약 40개의 아미노산 치환 내지 약 45개의 아미노산 치환, 약 45개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 45개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 45개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 45개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 45개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 45개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 45개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 45개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 45개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 약 45개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 약 45개의 아미노산 치환 내지 약 50개의 아미노산 치환, 약 50개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 50개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 50개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 50개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 50개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 50개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 50개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 50개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 50개의 아미노산 치환 내지 약 60개의 아미노산 치환, 약 50개의 아미노산 치환 내지 약 55개의 아미노산 치환, 약 60개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 60개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 60개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 60개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 60개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 60개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 60개의 아미노산 치환 내지 약 70개의 아미노산 치환, 약 60개의 아미노산 치환 내지 약 65개의 아미노산 치환, 약 70개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 70개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 70개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 70개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 70개의 아미노산 치환 내지 약 80개의 아미노산 치환, 약 70개의 아미노산 치환 내지 약 75개의 아미노산 치환, 약 80개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 80개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 약 80개의 아미노산 치환 내지 약 90개의 아미노산 치환, 약 80개의 아미노산 치환 내지 약 85개의 아미노산 치환, 약 90개의 아미노산 치환 내지 약 100개의 아미노산 치환, 약 90개의 아미노산 치환 내지 약 95개의 아미노산 치환, 또는 약 95개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산을 포함한 야생형 전장 CLRN1 단백질(예를 들어, 야생형 인간 전장 CLRN1 단백질)의 서열을 포함할 수 있다.
당해 분야의 숙련가는 상이한 종으로부터의 야생형 CLRN1 단백질 사이에 보존되지 않은 아미노산은 활성을 잃지 않고 돌연변이될 수 있는 반면, 상이한 종으로부터의 야생형 CLRN1 단백질 사이에 보존된 아미노산은 (다른 종간에 보존되지 않은 아미노산보다) 활성에 관여할 가능성이 더 크기 때문에 돌연변이되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
활성 CLRN1 단백질은, 예를 들어, 약 1개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 약 45개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 7개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 6개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 5개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 4개의 아미노산, 약 1개의 아미노산 내지 약 3개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 7개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 6개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 5개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 4개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 7개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 6개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 5개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 7개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 6개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 7개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 7개의 아미노산에서 약 25개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 35개의 아미노산에서 약 50개의 아미노산, 약 35개의 아미노산에서 약 45개의 아미노산, 약 35개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 45개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산 또는 약 50개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산이 결실된 야생형 전장 CLRN1 단백질(예를 들어, 야생형 인간 전장 CLRN1 단백질)의 서열을 포함할 수 있다. 2개 이상의 아미노산이 야생형 전장 CLRN1 단백질의 서열로부터 결실되는 일부 실시양태에서, 2개 이상의 결실된 아미노산 중 적어도 2개는 야생형 전장 단백질의 서열에서 인접할 수 있다. 2개 이상의 아미노산이 야생형 전장 CLRN1 단백질의 서열로부터 결실된 다른 예에서, 2개 이상의 결실된 아미노산 중 일부 또는 전부는 야생형 전장 단백질의 서열에서 인접하지 않을 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 상이한 종으로부터의 야생형 전장 CLRN1 단백질 사이에 보존되지 않은 아미노산이 활성을 잃지 않고 결실될 수 있는 반면, 상이한 종으로부터의 야생형 전장 CLNRN1 단백질 사이에 보존된 아미노산은 (다른 종간에 보존되지 않은 아미노산보다) 활성에 관여할 가능성이 더 크기 때문에 결실되지 않는다는 것을 인식할 것이다.
일부 예에서, 활성 CLRN1 단백질은, 예를 들어, 이의 N-말단에서 제거된 1개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 7개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 6개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 5개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 4개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 약 3개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산 산, 약 2개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 7개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 6개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 5개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 약 4개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 7개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 6개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 5개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 4개의 아미노산에서 약 55개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 7개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 6개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 약 35개의 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아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 35개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 45개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 65개의 아미노산, 약 70개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 70개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 70개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 70개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 70개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 70개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산, 약 80개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 80개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 약 80개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 80개의 아미노산 내지 약 85개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 95개의 아미노산, 또는 약 95개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산 및/또는 이의 C-말단에서 제거된 1개의 아미노산 내지 100개의 아미노산 (또는 본 명세서에 기술된 이 범위의 하위 범위)을 갖는 야생형 전장 CLRN1 단백질의 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 활성 CLRN1 단백질은, 예를 들어, 1개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 25개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 9개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 8개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 7개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 6개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 5개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 4개의 아미노산, 1개의 아미노산 내지 3개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 25개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 9개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 8개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 7개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 6개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 5개의 아미노산, 약 2개의 아미노산 내지 4개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 25개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 9개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 8개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 7개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 6개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 5개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 25개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 9개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 8개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 7개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 6개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 25개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 9개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 8개의 아미노산, 약 5개의 아미노산 내지 7개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 25개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 9개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 8개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 25개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 약 7개의 아미노산 내지 9개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 25개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 약 8개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 25개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 25개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 25개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 약 25개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 35개의 아미노산, 약 35개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 35개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 약 35개의 아미노산 내지 40개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 45개의 아미노산, 또는 약 45개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산이 삽입된 야생형 전장 CLRN1 단백질의 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 1개의 아미노산 내지 50개의 아미노산(또는 이의 임의의 하위 범위)은 야생형 전장 단백질의 서열에 인접한 서열로서 삽입될 수 있다. 일부 예에서, 1개의 아미노산 내지 50개의 아미노산(또는 이의 임의의 하위 범위)은 야생형 전장 단백질의 서열에서 다수의 인접하지 않은 위치에 삽입된다. 당해 분야에서 인지할 수 있는 바와 같이, 1개의 아미노산 내지 50개의 아미노산은 종간에 잘 보존되지 않은 야생형 전장 단백질 서열의 일부에 삽입될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 재료가 본원에 기술되어 있다; 당해 분야에 공지된 다른 적절한 방법 및 재료도 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충되는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명 및 도면, 그리고 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 본원에 기술된 임의의 본 방법에 사용될 수 있는 CLRN-1 벡터(서열 번호 40; 3397개의 염기쌍(bp))의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter), 키메릭 인트론(chimeric intron)(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), T2A 서열(서열 번호 31), CLRN1 아이소폼 2(서열 번호 6), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 2는 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-2GFP 벡터(서열 번호 41; 4177개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), T2A 서열(서열 번호 31), CLRN1 아이소폼 2(서열 번호 6), T2A 서열(서열 번호 31), eGFP(서열 번호 32), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 3은 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-3 벡터(서열 번호 42; 4607개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), 5'UTR-291, CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), 3'UTR-1357(서열 번호 36), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 4는 본원에 기술된 임의의 본 방법에 사용될 수 있는 CLRN-4 벡터(서열 번호 43; 4796개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), T2A 서열(서열 번호 31), CLRN1 아이소폼 2(서열 번호 6), 3'UTR-1406(서열 번호 37), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 5는 본원에 기술된 임의의 본 방법에 사용될 수 있는 pITR-CBA-5'UTR-tGFP-3'UTR 벡터(5026개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), 5'UTR-291, tGFP(서열 번호 19), 3'UTR-1595, bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 6은 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-6eGFP 벡터(서열 번호 44; 4756개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), eGFP(서열 번호 32), 3'UTR-1406(서열 번호 37), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 7은 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 pITR-CBA-3'UTR-600A 벡터(3982개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 4), T2A 서열(서열 번호 31), CLRN1 아이소폼 2(서열 번호 6), 3'UTR-600(서열 번호 27), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 8은 본원에 기술된 임의의 본 방법에 사용될 수 있는 CLRN-8 벡터(서열 번호 46; 3982개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), T2A 서열(서열 번호 31), CLRN1 아이소폼 2(서열 번호 6), 3'UTR-600B(서열 번호 28), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 9는 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-9 벡터(서열 번호 47; 3982개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), T2A 서열(서열 번호 31), CLRN1 아이소폼 2(서열 번호 6), 3'UTR-600C(서열 번호 29), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 10은 본원에 기술된 임의의 본 방법에 사용될 수 있는 CLRN-0 벡터(서열 번호 39; 4732개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), 3'UTR 1773(서열 번호 15), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 11은 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-7eGFP 벡터(서열 번호 45; 3580개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), eGFP 서열(서열 번호 32), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 12는 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-10(서열 번호 48; 3511개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 4), HA 서열(서열 번호 34), FP 서열(서열 번호 30), T2A 서열(서열 번호 31), CLRN1 아이소폼 2(서열 번호 5), 3x FLAG 태그 서열(서열 번호 35), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 13은 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-10myc 벡터(서열 번호 49; 3574개의 bp)의 유전지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), myc 서열(서열 번호 33), FP 서열(서열 번호 30), T2A 서열(서열 번호 31), 3x FLAG 태그 서열(서열 번호 35), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 14는 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-10NF 벡터(서열 번호 50; 3499개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), T2A 서열(서열 번호 31), HA 서열(서열 번호 34), CLRN-1 아이소폼 2(서열 번호 5), 3x FLAG 태그 서열(서열 번호 35), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 15는 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-11 벡터(서열 번호 51; 4908개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), HA 서열(서열 번호 34), FP 서열(서열 번호 30), T2A 서열(서열 번호 31), CLRN-1 아이소폼 2(서열 번호 5), 3x FLAG 태그 서열(서열 번호 35), 3'UTR-1406(서열 번호 37), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 16은 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-11myc 벡터(서열 번호 52; 4971개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), myc 서열(서열 번호 33), FP 서열(서열 번호 30), T2A 서열(서열 번호 31), CLRN1 아이소폼 2(서열 번호 5), 3x FLAG 태그 서열(서열 번호 35), 3'UTR-1406(서열 번호 37), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 17은 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-11NF 벡터(서열 번호 53; 4896개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), HA 서열(서열 번호 34), T2A 서열(서열 번호 31), CLRN1 아이소폼 2(서열 번호 5), 3x FLAG 서열(서열 번호 33), 3'UTR-1406(서열 번호 37), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 18은 본원에 기술된 임의의 본 방법에 사용될 수 있는 CLRN-12 벡터(서열 번호 54; 4640개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), 5'UTR-291 서열(서열 번호 12), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), HA 서열(서열 번호 34), 3'UTR-1357(서열 번호 36), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 19는 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-13 벡터(서열 번호 55; 4291개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 4(서열 번호 7), 3x FLAG 태그 서열(서열 번호 35), T2A 서열(서열 번호 31), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), HA 서열(서열 번호 34), 3'UTR-600(서열 번호 27), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 20은 본원에 기술된 임의의 본 방법에 사용될 수 있는 CLRN-14 벡터(서열 번호 56; 4192개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 4(서열 번호 7), T2A 서열(서열 번호 31), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), 3'UTR-600(서열 번호 27), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 21은 본원에 기술된 임의의 본 방법에 사용될 수 있는 CLRN-15 벡터(서열 번호 57; 3505개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 4(서열 번호 7), 3x FLAG 태그 서열(서열 번호 35), 3'UTR-600(서열 번호 27), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 22는 본원에 기술된 임의의 본 방법에 사용될 수 있는 CLRN-16 벡터(서열 번호 58; 3439개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, 키메릭 인트론(서열 번호 16), CLRN1 아이소폼 4(서열 번호 7), 3'UTR-600(서열 번호 27), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 23은 본원에 기술된 임의의 본 방법에 사용될 수 있는 CLRN-17 벡터(서열 번호 59; 130개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, sh-키메릭 인트론(서열 번호 26), 5'UTR-291(서열 번호 12), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), HA 서열(서열 번호 34), 3'UTR-1773(서열 번호 15), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 24는 본원에 기술된 임의의 본 방법에서 사용될 수 있는 CLRN-18 벡터(서열 번호 60; 4277개의 bp)의 유전자지도의 예시적인 개략도이다. 상기 벡터는 AAV2 ITR, CMV 인핸서(서열 번호 17), 닭 β-액틴 프로모터, sh-키메릭 인트론(서열 번호 26), CLRN1 아이소폼 1(서열 번호 1), 3'UTR-1773(서열 번호 15), bGH 폴리(A) 신호(서열 번호 20) 및 AAV2 ITR을 포함한다.
도 25는 항-HA 및 항-FLAG 항체를 사용한 형질감염 48시간 후 형질감염된 HEK293FT 세포로부터의 CLRN1 단백질 수준의 면역 블롯 이미지이다. 레인 1 - PageRuler Plus Prestained; 레인 2 - CLRN-10(37℃ 변성(denaturing)); 레인 3 - CLRN-11(37℃ 변성); 레인 4 - CLRN-12(37℃ 변성); 레인 5 - 음성 대조군; 레인 6 - CLRN-10(56℃ 변성); 레인 7 - CLRN-11(56℃ 변성); 레인 8 - CLRN-12(56℃ 변성); 레인 9 - 음성 대조군. CLRN-1 아이소폼 단백질은 글리코실화 단백질이며 종종 얼룩진 밴드(smear bands)로서 이동한다.
도 26은 항-FLAG 항체를 사용한 형질감염 48시간 후 형질감염된 HEK293FT 세포로부터의 CLRN1 단백질 수준의 면역 블롯 이미지이다. 레인 1 - PageRuler Plus Prestained; 레인 2 - CLRN-10; 레인 3 - CLRN-11; 레인 4 - CLRN-12; 레인 5 - CLRN-13; 레인 6 - CLRN-15; 레인 7 - 음성 대조군
도 27은 항-FLAG 항체를 사용한 형질감염 48시간 후 형질감염된 HEK293FT 세포로부터의 CLRN1 단백질 수준의 면역 블롯 이미지이다. 레인 1 - PageRuler Plus Prestained; 레인 2 - CLRN-10; 레인 3 - CLRN-10NF; 레인 4 - CLRN-10myc; 레인 5 - CLRN-11NF; 레인 6 - CLRN-11myc; 레인 7 - 음성 대조군. 모든 샘플은 실온에서 보관되었다.
도 28은 항-myc 항체를 사용한 형질감염 48시간 후 형질감염된 HEK293FT 세포로부터의 CLRN1 단백질 수준의 면역 블롯 이미지이다. 레인 1 - PageRuler Plus Prestained; 레인 2 - CLRN-10; 레인 3 - CLRN-10NF; 레인 4 - CLRN-10myc; 레인 5 - CLRN-11NF; 레인 6 - CLRN-11myc; 레인 7 - 음성 대조군.
도 29는 항-HA 및 항-FLAG 항체를 사용하여 형질감염 48시간 후 형질감염된 HEK293FT 세포로부터 수확된 CLRN1 단백질 수준의 면역 블롯 이미지이다. 레인 1 - PageRuler Plus Prestained; 레인 2 - CLRN-13; 레인 3 - CLRN-10; 레인 4 - CLRN-10NF; 레인 5 - CLRN-10myc; 레인 6 - CLRN-11NF; 레인 7 - CLRN-11myc; 레인 8 - 음성 대조군.
도 30은 형질감염 후 48시간에 본원에 기술된 플라스미드로 형질감염된 HEK239FT 세포로부터 수확된 CLRN1 아이소폼 1 단백질 수준의 항-CLRN(EKIANYKEGTYVYKTQSEKY; 서열 번호 38) 토끼 다클론 항체를 사용한 면역 블롯의 이미지이다. 레인 1 - PageRuler Plus Prestained; 레인 2 - CLRN-10; 레인 3 - CLRN-1; 레인 4 - CLRN-2; 레인 5 - CLRN-3; 레인 6 - CLRN-4; 레인 7 - CLRN-8; 레인 8 - CLRN-9; 레인 9 - CLRN-10; 레인 10 - CLRN-11; 레인 11 - CLRN-12; 레인 12 - CLRN-13, 레인 13 - CLRN-14; 레인 14 - CLRN-15; 레인 15 - CLRN-16; 레인 16 - 음성 대조군; 레인 17 - 음성 대조군.
도 31은 항-CLRN 토끼 다클론 항체를 사용한 형질감염 48시간 후 형질감염된 HEK293FT 세포로부터 수확된 면역 블롯 CLRN1 단백질 수준의 이미지이다. 레인 1 - PageRuler Plus Prestained; 레인 2 - Anc80-CLRN-0; 레인 3 - Anc80-CLRN-0 + PNGase F; 레인 4 - Anc80-CLRN-3; 레인 5 - Anc80-CLRN-3 + PNGase F; 레인 6 - Anc80-CLRN-6eGFP; 레인 7 - Anc80-CLRN-6eGFP + PNGase F; 레인 8 - Anc80-CLRN-13; 레인 9 - Anc80-CLRN-13 + PNGase F; 레인 10 - 벡터 없음; 레인 11 - 벡터 없음 + PNGase F. CLRN-1 아이소폼 단백질은 글리코실화 단백질이며 종종 얼룩진 밴드(레인 2, 4 및 8)로 이동한다. PNGase F로 처리한 후 얼룩진 밴드가 사라지고 별개의 밴드(alnes 3, 5 및 8)로 이동하였다.
도 32는 MOI 8.41E+04 및 MOI 2.53E+05에서 형질감염 24시간 및 48시간 후에 취한 AAVanc80-CLRN6eGFP 형질도입된 HEK293FT 세포의 면역 형광 이미지 세트이다.
도 33은 각각 AAVanc80-CLRN-6eGFP(MOI 1.05E+05 및 MOI 3.15E+05에서), AAVanc80-CLRN-0(MOI 8.23E+04 및 MOI 2.47E+05에서), AAVanc80-CLRN-3(MOI 8.41E+04 및 MOI 2.53E+04에서) 및 AAVanc80-CLRN-13(MOI 8.33E+04 및 MOI 2.50E+05에서)로 형질도입된 HEK293FT 세포에서 상대적인 CLRN1 및 GFP 발현을 보여주는 막대 그래프이다.
도 34는 각각 AAVanc80-CLRN-6eGFP(MOI 2.0E+05에서), AAVanc80-CLRN-0(MOI 2.5E+05 및 MOI 7.6E+0.5에서), AAVanc80-CLRN-3(MOI 2.0E+05 및 6.03E+05) 및 AAVanc80-CLRN-13(MOI 2.0E+05 및 MOI 6.0E+05)로 16시간 감염된 WT 마우스로부터의 P2 달팽이관 외식편에서 상대적인 CLRN1 및 GFP 발현을 보여주는 막대그래프이다.
도 35는 Myo7a 및 DAPI 염색을 보여주는 1.3E10 AAVanc80-CLRN-0 VG/달팽이관, 9.9E9 AAVanc80-CLRN-3 VG/달팽이관 및 1.0E10 AAVanc80-CLRN-13 VG/달팽이관으로 72시간 감염된 WT 마우스로부터의 P2 달팽이관 외식편의 형광 이미지 세트이다.
도 36은 eGFP, Myo7a 및 DAPI 염색을 보여주는 1E09 VG/달팽이관 AAV Anc80.CAG.eGFP.3'UTR로 72시간 감염된 WT 마우스로부터의 P2 달팽이관 외식편의 형광 이미지 세트이다.
CLRN1 유전자에 의해 암호화된 단백질인 "클라린(clarin) 1"의 결핍 또는 돌연변이는 청력 손실 및 시력 손실을 유발한다. 예를 들어, CLRN1의 돌연변이는 어셔 증후군 III형 및 망막색소변성증(retinitis pigmentosa)으로 이어진다.
적어도 2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이이고, 상기 암호화된 부분 각각의 아미노산 서열은 선택적으로 암호화된 부분 중 상이한 부분의 아미노산 서열과 부분적으로 중첩될 수 있고; 상기 적어도 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 전장 CLRN1 단백질을 암호화하지 않으며; 상기 코딩 서열 중 적어도 하나는 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손에 걸쳐 있고 상기 2개의 연속 엑손 사이에 인트론 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 포유동물 세포에 도입되면, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터는 서로 상동성 재조합을 거쳐 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 형성하는 조성물이 본원에 제공된다.
단일 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 벡터는 (i) CLRN1 단백질의 제1 아이소폼을 암호화하는 제1 코딩 서열; 및 (ii) CLRN1 단백질의 제2 아이소폼을 암호화하는 제2 코딩 서열 중 하나 또는 둘 다를 포함하고, 상기 제1 및 제2 코딩 서열 중 하나 또는 둘 다는 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손에 걸쳐 있고 상기 2개의 연속 인트론 사이에 인트론 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제1 핵산 벡터는 프로모터, 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 제1 코딩 서열 및 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열을 포함하고; 상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제2 핵산 벡터는 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며; 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이이고, 2개의 암호화된 부분의 아미노산 서열은 서로 중첩되지 않고; 상기 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 전장 CLRN1 단백질을 암호화하지 않으며; 포유동물 세포에 도입되면, 상기 스플라이스 공여체 서열과 상기 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 형성하는 조성물이 본원에 제공된다.
2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제1 핵산 벡터는 프로모터, 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 제1 코딩 서열, 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열 및 상기 스플라이스 공여체 서열의 3'에 위치한 제1 검출 가능한 마커 유전자를 포함하고; 상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제2 핵산 벡터는 제2 검출 가능한 마커 유전자, 상기 제2 검출 가능한 마커 유전자의 3'에 위치한 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며; 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이이고, 상기 암호화된 부분의 아미노산 서열은 서로 중첩되지 않고; 상기 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 전장 CLRN1 단백질을 암호화하지 않으며; 포유동물 세포에 도입되면, 상기 스플라이스 공여체 서열과 상기 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 형성하는 조성물이 본원에 제공된다.
2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제1 핵산 벡터는 프로모터, 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 제1 코딩, 상기 제1 코딩의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열 및 상기 스플라이스 공여체 서열에 대해 3'에 위치한 F1 파지 재조합 생성 영역을 포함하고; 상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제2 핵산 벡터는 F1 파지 재조합 생성 영역, 상기 F1 파지 재조합 생성 영역의 3'에 위치한 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며; 2개의 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이이고, 상기 2개의 암호화된 부분의 아미노산 서열은 서로 중첩되지 않고; 상기 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 전장 CLRN1 단백질을 암호화하지 않으며; 포유동물 세포에 도입되면, 스플라이스 공여체 서열과 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 형성하는 조성물이 또한 본원에 제공된다.
본원에 기술된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 달팽이관에 도입하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기술된 임의의 조성물을 포유동물 세포에 도입하는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기술된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 달팽이관에 도입하는 것을 포함하는, 포유동물의 달팽이관의 내유모세포, 외유모세포 또는 둘 다에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법이 본원에서 제공된다
본원에 기술된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 눈에 안내 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 눈에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기술된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 대상체의 달팽이관에 투여하는 것을 포함하는, 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 확인된 대상체에서 청력 손실을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기술된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 확인된 대상체에서 시력 손실을 치료하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
조성물, 키트 및 방법의 추가의 비제한적 측면이 본원에 기술되고 제한 없이 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
CLRN1
CLRN1 유전자는 내이의 유모세포(예를 들어, 내이 유모세포, 외이 유모세포) 및 망막에서 발현되는 단백질인 "클라린 1"(CLRN1)을 암호화한다.
인간 CLRN1 유전자는 염색체 3q25.1에 있다. 그것은 ~ 47킬로베이스(kb)를 포함하는 7개의 엑손을 포함한다(Vastinsalo 등, (2011) Eur J Hum Genet 19(1):30-35; NCBI 수탁번호 NG_009168.1).
CLRN1 유전자의 다양한 돌연변이는 어셔 증후군 III형(예를 들어, 어셔 증후군 IIIA형(MIM#606397)(예를 들어, Fields 등, (2002) Am J Hum Genet 71:607-617, 및 Joensuu 등, (2001) Am J Hum Genet 69:673-684 참조) 및 망막색소변성증(예를 들어, Khan 등, (2011) Ophthalmology 118:1444-1448 참조)과 연관되어 있다. 어셔 증후군 III형 유발 돌연변이가 주로 CLRN1의 엑손 3에서 발견되었다. 어셔 증후군 III형-난청은 CLRN1 결핍 마우스를 생성하여 모델링할 수 있다(예를 들어, Geng 등, (2017) Sci Rep 7(1):13480 참조). 어셔 증후군 III형과 관련된 예시적인 돌연변이 CLRN1은 T528G, M120K, M44K, N48K 및 C40G를 포함한다.
망막색소변성증과 관련된 예시적인 돌연변이 CLRN1은 L154W 및 P31L을 포함한다(예를 들어, Khan 등, (2011) Ophthalmology 118:1444-1448 참조).
청력 손실이 있는 대상체에서 검출된 CLRN1 유전자의 추가 예시적인 돌연변이 및 CLRN1을 암호화하는 핵산을 시퀀싱하는 방법은, 예를 들어, Fields 등, (2002) Am J Hum Genet 71:607-617, Joensuu 등, (2001) Am J Hum Genet 69:673-684, Adato 등, (2002) Europ J Hum Genet 10:339-350, Aller 등, (2004), Clin Genet 66:525-529에 기술되어 있다. 유전자 돌연변이를 검출하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 이러한 기술의 비제한적인 예는 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), PCR, 시퀀싱, 서던 블로팅(Southern blotting) 및 노던 블로팅(Northern blotting)을 포함한다.
예시적인 인간 야생형 CLRN1 단백질은 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5 및 서열 번호 7의 서열이거나 이를 포함한다. 야생형 CLRN1 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 비제한적인 예는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 서열 번호 8이거나 이를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, CLRN1 단백질은 서열 번호 1과 적어도 75%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%) 동일한 서열을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, CLRN1 단백질은 서열 번호 3과 적어도 75%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%) 동일한 서열을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, CLRN1 단백질은 서열 번호 5와 적어도 75%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%) 동일한 서열을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, CLRN1 단백질은 서열 번호 7과 적어도 75%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%) 동일한 서열을 포함한다.
인간 전장 야생형 CLRN1 단백질 아이소폼 D(서열 번호 1)
Figure pct00001
인간 야생형 CLRN1 아이소폼 D cDNA (서열 번호 2)
Figure pct00002
인간 전장 야생형 CLRN1 단백질 아이소폼 A (서열 번호 3)
Figure pct00003
인간 야생형 CLRN1 아이소폼 A cDNA (서열 번호 4)
Figure pct00004
인간 전장 야생형 CLRN1 단백질 아이소폼 C(서열 번호 5)
Figure pct00005
인간 야생형 CLRN1 아이소폼 C cDNA(서열 번호 6)
Figure pct00006
인간 전장 야생형 CLRN1 단백질 아이소폼 E(서열 번호 7)
Figure pct00007
인간 야생형 CLRN1 아이소폼 E cDNA(서열 번호 8)
Figure pct00008
인간 야생형 CLRN1 게놈 서열(서열 번호 9)
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
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Figure pct00013
Figure pct00014
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Figure pct00028
Figure pct00029
인간 야생형 CLRN1 게놈 DNA 서열의 비제한적인 예는 서열 번호 9이다. 서열 번호 9의 엑손은 다음과 같다: 뉴클레오타이드 위치 1-544(엑손 1), 뉴클레오타이드 위치 28764-29180(엑손 2), 뉴클레오타이드 위치 31239-31418(엑손 3), 뉴클레오타이드 위치 32481-32519(엑손 4), 뉴클레오타이드 위치 44799-46433(엑손 5), 뉴클레오타이드 위치 44799-44935(엑손 6) 및 뉴클레오타이드 위치 46128-46837(엑손 7). 인트론은 서열 번호 9에서 이들 엑손의 각 쌍 사이, 즉 뉴클레오타이드 위치 545-28763(인트론 1), 뉴클레오타이드 위치 29181-31238(인트론 2), 뉴클레오타이드 위치 31419-32480(인트론 3), 뉴클레오타이드 위치 32520-44798(인트론 4) 및 뉴클레오타이드 위치 44936-46127(인트론 7)에 위치한다.
마우스 CLRN1 단백질 아이소폼 1(서열 번호 10)
Figure pct00030
개 CLRN1 단백질(서열 번호 11)
Figure pct00031
벡터
본원에 제공된 조성물은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 핵산 벡터를 포함하며, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 상기 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산(예를 들어, 약 30개의 아미노산 내지 약 202개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 200개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 180개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 170개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 160개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 150개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 140개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 130개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 120개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 202개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 200개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 180개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 170개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 160개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 150개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 140개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 130개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 120개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 90개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 80개의 아미노산, 약 60개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 202개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 200개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 180개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 170개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 160개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 150개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 140개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 130개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 120개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 100개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 내지 약 202개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 내지 약 200개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 내지 약 180개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 내지 약 170개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 내지 약 160개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 내지 약 150개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 내지 약 140개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 내지 약 130개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 내지 약 120개의 아미노산, 약 90개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산, 약 120개의 아미노산 내지 약 202개의 아미노산, 약 120개의 아미노산 내지 약 200개의 아미노산, 약 120개의 아미노산 내지 약 180개의 아미노산, 약 120개의 아미노산 내지 약 170개의 아미노산, 약 120개의 아미노산 내지 약 160개의 아미노산, 약 120개의 아미노산 내지 약 150개의 아미노산, 약 120개의 아미노산 내지 약 140개의 아미노산, 약 120개의 아미노산 내지 약 130개의 아미노산, 약 150개의 아미노산 내지 약 202개의 아미노산, 약 150개의 아미노산 내지 약 200개의 아미노산, 약 150개의 아미노산 내지 약 180개의 아미노산, 약 150개의 아미노산 내지 약 170개의 아미노산, 약 150개의 아미노산 내지 약 160개의 아미노산, 약 170개의 아미노산 내지 약 202개의 아미노산, 약 170개의 아미노산 내지 약 200개의 아미노산, 약 170개의 아미노산 내지 약 180개의 아미노산, 약 190개의 아미노산 내지 약 202개의 아미노산, 또는 약 190개의 아미노산 내지 약 200개의 아미노산) 길이이다.
이들 조성물의 일부 실시양태에서, 상기 코딩 서열 중 적어도 하나는 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손(예를 들어, 엑손 1 및 2, 또는 엑손 5 및 6)에 걸쳐 있고 상기 2개의 연속 엑손 사이에 자연적으로 발생하는 인트론 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 암호화된 부분 중 어느 것의 아미노산 서열도 암호화된 부분 중 상이한 부분의 아미노산 서열과 부분적으로도 중첩되지 않는다. 일부 실시양태에서, 암호화된 부분 중 하나 이상의 아미노산 서열은 암호화된 부분 중 상이한 부분의 아미노산 서열과 부분적으로 중첩된다. 일부 실시양태에서, 암호화된 부분 각각의 아미노산 서열은 암호화된 부분 중 상이한 부분의 아미노산 서열과 부분적으로 중첩된다.
일부 실시양태에서, 중첩된 아미노산 서열은 약 30개의 아미노산 잔기 내지 약 202개의 아미노산(예를 들어, 또는 본원에 기술된 이 범위의 임의의 하위 범위) 길이이다.
일부 예에서, 상기 벡터는 각각 상이한 인트론 세그먼트를 포함하는 2개의 상이한 벡터를 포함하고, 상기 인트론은 CLRN1 게놈 DNA에 존재하는 인트론(예를 들어, 본원에 기술된 서열 번호 9의 임의의 예시적 인트론)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 2개의 상이한 세그먼트는 적어도 100개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,500개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,500개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,500개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,500개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 800개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 600개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 400개의 뉴클레오타이드, 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,500개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,500개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,500개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,500개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 800개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 600개의 뉴클레오타이드, 약 200개의 뉴클레오타이드 내지 약 400개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,500개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,500개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,500개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,500개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드 내지 약 800개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드 약 600개의 뉴클레오타이드, 약 600개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,500개의 뉴클레오타이드, 약 600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 600개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,500개의 뉴클레오타이드, 약 600개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 600개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,500개의 뉴클레오타이드, 약 600개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드, 약 600개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,500개의 뉴클레오타이드, 약 600개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드, 약 600개의 뉴클레오타이드 내지 약 800개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,500개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,500개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,500개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,500개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,500개의 뉴클레오타이드, 약 4,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드 약 4,500개의 뉴클레오타이드 5,000개의 뉴클레오타이드, 또는 약 5,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드) 길이에 의해 서열 상 중첩된다.
임의의 2개의 상이한 벡터에서의 중첩 뉴클레오타이드 서열은 CLRN1 유전자의 하나 이상의 엑손의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다(예를 들어, 본원에 기술된 서열 번호 9의 예시적인 엑손 중 임의의 하나 이상).
일부 실시양태에서, 조성물 내의 상이한 벡터의 수는 2개, 3개, 4개 또는 5개이다. 조성물 내의 상이한 벡터의 수가 2개인 조성물에서, 2개의 상이한 벡터 중 첫 번째는 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, CLRN1 유전자의 N-말단 부분은 약 30개의 아미노산 내지 약 202개의 아미노산(또는 위에 기술된 이 범위의 임의의 하위 범위) 길이이다. 일부 예에서, 제1 벡터는 프로모터(예를 들어, 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 프로모터) 및 코작 서열(예를 들어, 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 예시적인 코작 서열) 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 제1 벡터는 유도성 프로모터, 항시성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터인 프로모터를 포함한다. 일부 예에서, 2개의 상이한 벡터 중 두 번째는 CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함한다. 일부 예에서, CLRN1 단백질의 C-말단 부분은 30개의 아미노산 내지 약 202개의 아미노산(또는 위에 기술된 이 범위의 임의의 하위 범위) 길이이다. 일부 예에서, 제2 벡터는 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함한다.
조성물 내의 상이한 벡터의 수가 2개인 일부 예에서, 2개의 벡터 중 하나에 의해 암호화되는 N-말단 부분은 야생형 CLRN1 단백질(예를 들어, 서열 번호 1, 3, 5 또는 7)의 아미노산 위치 1 내지 다음 중 임의의 것을 포함하는 부분을 포함할 수 있다: 약 아미노산 위치 202, 약 아미노산 위치 200, 약 아미노산 190, 약 아미노산 위치 180, 약 아미노산 위치 170, 약 아미노산 위치 160, 약 아미노산 위치 150, 약 아미노산 위치 140, 약 아미노산 위치 130, 약 아미노산 위치 120, 약 아미노산 위치 110, 약 아미노산 위치 100, 약 아미노산 위치 90, 약 아미노산 위치 80, 약 아미노산 위치 70, 약 아미노산 위치 60, 약 아미노산 위치 50 또는 약 아미노산 위치 40.
조성물 내의 상이한 벡터의 수가 2개인 일부 예에서, 전구체 CLRN1 단백질의 N-말단 부분은 야생형 CLRN1 단백질(예를 들어, 서열 번호 1, 3, 5 또는 7)의 아미노산 위치 1 내지 아미노산 위치 202, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 200, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 190, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 180, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 170, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 160, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 150, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 140, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 130, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 120, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 110, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 100, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 90, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 80, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 70, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 60, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 50, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 40, 아미노산 위치 1 내지 약 아미노산 위치 30을 포함하는 부분을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 하나 이상의 외인성 핵산 단편, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체(예를 들어, 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)), 바이러스 벡터(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 아데노바이러스 벡터(예를 들어, pSV 또는 pCMV 벡터) 또는 임의의 레트로바이러스 벡터) 및 임의의 Gateway® 벡터를 운반할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 의미한다. 벡터는, 예를 들어, 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함할 수 있으며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 포유동물 세포에 의해 또는 시험관 내 발현 시스템에 공급될 수 있다. 용어 "벡터"는 적절한 대조군 요소와 연관될 때 복제할 수 있는 임의의 유전 요소(예를 들어, 플라스미드, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체, 바이러스 벡터 등)를 포함한다. 따라서, 이 용어는 클로닝 및 발현 벡터뿐만 아니라 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터)를 포함한다.
벡터는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드이거나 리포솜에 포함됨) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)를 포함하여 당해 분야에 공지된 모든 것을 포함한다. 숙련가는 본원에 기술된 임의의 핵산을 제조하기 위해 적합한 벡터 및 포유동물 세포를 선택할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드(즉, 세포 내부에서 자율적으로 복제할 수 있는 원형 DNA 분자)이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 코스미드(예를 들어, pWE 및 sCos 시리즈(Wahl 등, (1987), Evans 등, (1989)))일 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 인공 염색체이다. 인공 염색체는 큰 DNA 삽입물을 운반하는 벡터로 사용할 수 있는 유전적으로 조작된 염색체이다. 일부 실시양태에서, 인공 염색체는 인간 인공 염색체(HAC)이다(예를 들어, Kouprina 등, Expert Opin. Drug Deliv 11(4):517-535, 2014; Basu 등, Pediatr. Clin. North Am. 53:843-853, 2006; Ren 등, Stem. Cell Rev. 2(1):43-50, 2006; Kazuki 등, Mol. Ther. 19(9):1591-1601, 2011; Kazuki 등, Gen. Ther. 18:384-393, 2011; 및 Katoh 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 321:280-290, 2004 참조).
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 효모 인공 염색체(YAC)이다(예를 들어, Murray 등, Nature 305:189-193, 1983; Ikeno 등, (1998) Nat. Biotech. 16:431-439, 1998 참조). 일부 실시양태에서, 벡터(들)는 박테리아 인공 염색체(BAC)(예를 들어, pBeloBAC11, pECBAC1 및 pBAC108L)이다. 일부 실시양태에서, 벡터(들)는 P1 유래 인공 염색체(PAC)이다. 인공 염색체의 예는 당해 분야에 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노 관련 바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 레트로바이러스)이다. 바이러스 벡터의 비제한적인 예가 본원에 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, 벡터(들)는 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)이다(예를 들어, Asokan 등, Mol. Ther. 20:699-7080, 2012 참조). 재조합 AAV 벡터 또는 "rAAV"는 전형적으로 최소한 전이유전자(transgene) 또는 이의 일부와 조절 서열, 및 선택적으로 5' 및 3' AAV 역말단 반복서열(inverted terminal repeats, ITR)로 구성된다. 이러한 재조합 AAV 벡터는 캡시드(capsid)로 포장되고 선택된 표적 세포(예를 들어, 달팽이관 유모세포)로 전달된다.
벡터의 AAV 서열은 전형적으로 시스-작용 5' 및 3' ITR 서열을 포함한다(예를 들어, B. J. Carter, "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168, 1990 참조). 전형적인 AAV ITR 서열은 약 145개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시양태에서, 전형적인 ITR 서열의 적어도 75%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%)가 AAV 벡터에 포함된다. 이러한 ITR 서열을 수정하는 능력은 당해 분야의 기술 내에 있다(예를 들어, Sambrook 등, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989; 및 K. Fisher 등, J Virol. 70:520 532, 1996과 같은 텍스트 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 코딩 서열은 AAV 벡터에서 5' 및 3' AAV ITR 서열에 의해 플랭크된다. AAV ITR 서열은 현재 확인된 AAV 유형을 포함하는 임의의 알려진 AAV로부터 수득할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 AAV 벡터는 본원에 기술된 임의의 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 폴리아데닐화 (폴리(A)) 신호 서열 및 IRES 중 하나 이상)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV1 벡터, AAV2 벡터, AAV3 벡터, AAV4 벡터, AAV5 벡터, AAV6 벡터, AAV7 벡터, AAV8 벡터, AAV9, AAV2.7m8 벡터, AAV8BP2 벡터 및 AAV293 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에서 사용될 수 있는 추가의 예시적인 AAV 벡터는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Kanaan 등, Mol. Ther. Nucleic Acids 8:184-197, 2017; Li 등, Mol. Ther. 16(7):1252-1260; Adachi 등, Nat. Commun. 5:3075, 2014; Isgrig 등, Nat. Commun. 10(1):427, 2019; 및 Gao 등, J. Virol. 78(12):6381-6388 참조.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 AAV 벡터는 서열 번호 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60과 적어도 80% 동일한(예를 들어, 적어도 82%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한) 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시양태에서, 벡터(들)는 아데노바이러스이다(예를 들어, Dmitriev 등, (1998) J. Virol. 72:9706-9713; 및 Poulin 등, J. Virol 8:10074-10086, 2010 참조). 일부 실시양태에서, 벡터(들)는 레트로바이러스이다(예를 들어, Maier 등, (2010) Future Microbiol 5:1507-23 참조).
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 렌티바이러스이다(예를 들어, Matrai 등, (2010) Mol Ther. 18:477-490; Banasik 등, (2010) Gene Ther. 17:150-7; 및 Wanisch 등, (2009) Mol. Ther. 17:1316-32 참조). 렌티바이러스 벡터는 특히 Milone 등, Mol. Ther. 17(8):1453-1464 (2009)에 기술된 바와 같은 자가 불활성 렌티바이러스 벡터를 포함하는 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 사용될 수 있는 비제한적인 렌티바이러스 벡터는 Oxford BioMedica의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술, Lentigen의 LENTIMAX™ 벡터 시스템 등을 포함한다. 다른 유형의 렌티바이러스 벡터도 이용 가능하며 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있을 것이다.
본원에 제공된 벡터는 크기가 다를 수 있다. 본원에 기술된 임의의 조성물, 키트 및 방법에서 사용되는 벡터의 선택은 벡터의 크기에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 플라스미드이고 최대 약 1kb, 최대 약 2kb, 최대 약 3kb, 최대 약 4kb, 최대 약 5kb, 최대 약 6kb, 최대 약 7kb, 최대 약 8kb, 최대 약 9kb, 최대 약 10kb, 최대 약 11kb, 최대 약 12kb, 최대 약 13kb, 최대 약 14kb 또는 최대 약 15kb의 총 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터(들)는 플라스미드이고 총 길이가 약 1kb 내지 약 2kb, 약 1kb 내지 약 3kb, 약 1kb 내지 약 4kb, 약 1kb 내지 약 5kb, 약 1kb 내지 약 6kb, 약 1kb 내지 약 7kb, 약 1kb 내지 약 8kb, 약 1kb 내지 약 9kb, 약 1kb 내지 약 10kb, 약 1kb 내지 약 11kb, 약 1kb 내지 약 12kb, 약 1kb 내지 약 13kb, 약 1kb 내지 약 14kb, 또는 약 1kb 내지 약 15kb 범위일 수 있다
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 트랜스포존(예를 들어, PiggyBac™ 트랜스포존)이고 200kb 초과를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 벡터(들)는 총 길이가 약 1kb 내지 약 10kb, 약 1kb 내지 약 20kb, 약 1kb 내지 약 30kb, 약 1kb 내지 약 40kb, 약 1kb 내지 약 50kb, 약 1kb 내지 약 60kb, 약 1kb 내지 약 70kb, 약 1kb 내지 약 80kb, 약 1kb 내지 약 90kb, 약 10kb 내지 약 20kb, 약 10kb 내지 약 30kb, 약 10kb 내지 약 40kb, 약 10kb 내지 약 50kb, 약 10kb 내지 약 60kb, 약 10kb 내지 약 70kb, 약 10kb 내지 약 90kb, 약 10kb 내지 약 100kb, 약 20kb 내지 약 30kb, 약 20kb 내지 약 40kb, 약 20kb 내지 약 50kb, 약 20kb 내지 약 60kb, 약 20kb 내지 약 70kb, 약 20kb 내지 약 80kb, 약 20kb 내지 약 90kb, 약 20kb 내지 약 100kb, 약 30kb 내지 약 40kb, 약 30kb 내지 약 50kb, 약 30kb 내지 약 60kb, 약 30kb 내지 약 70kb, 약 30kb 내지 약 80kb, 약 30kb 내지 약 90kb, 약 30kb 내지 약 100kb, 약 40kb 내지 약 50kb, 약 40kb 내지 약 60kb, 약 40kb 내지 약 70kb, 약 40kb 내지 약 80kb, 약 40kb 내지 약 90kb, 약 40kb 내지 약 100kb, 약 50kb 내지 약 60kb, 약 50kb 내지 약 70kb, 약 50kb 내지 약 80kb, 약 50kb 내지 약 90kb, 약 50kb 내지 약 100kb, 약 60kb 내지 약 70kb, 약 60kb 내지 약 80kb, 약 60kb 내지 약 90kb, 약 60kb 내지 약 100kb, 약 70kb 내지 약 80kb, 약 70kb 내지 약 90kb, 약 70kb 내지 약 100kb, 약 80kb 내지 약 90kb, 약 80kb 내지 약 100kb, 약 90kb 내지 약 100kb, 약 1kb 내지 약 100kb, 약 100kb 내지 약 200kb, 약 100kb 내지 약 300kb, 약 100kb 내지 약 400kb, 또는 약 100kb 내지 약 500kb 범위인 트랜스포존이다.
일부 실시양태에서, 벡터는 코스미드이고 총 길이가 최대 55kb일 수 있다. 일부 예에서, 벡터는 코스미드이고 뉴클레오타이드 총 수가 약 1kb 내지 약 10kb, 약 1kb 내지 약 20kb, 약 1kb 내지 약 30kb, 약 1kb 내지 약 40kb, 약 1kb 내지 약 50kb, 약 1kb 내지 약 55kb, 약 10kb 내지 약 20kb, 약 10kb 내지 약 30kb, 약 10kb 내지 약 40kb, 약 10kb 내지 약 50kb, 약 10kb 내지 약 55kb, 약 15kb 내지 약 55kb, 약 15kb 내지 약 50kb, 약 15kb 내지 약 40kb, 약 15kb 내지 약 30kb, 약 15kb 내지 약 20kb, 약 20kb 내지 약 55kb, 약 20kb 내지 약 50kb, 약 20kb 내지 약 40kb, 약 20kb 내지 약 30kb, 약 25kb 내지 약 55kb, 약 25kb 내지 약 50kb, 약 25kb 내지 약 40kb, 약 25kb 내지 약 30kb, 약 30kb 내지 약 55kb, 약 30kb 내지 약 50kb, 약 30kb 내지 약 40kb, 약 35kb 내지 약 55kb, 약 40kb 내지 약 55kb, 약 40kb 내지 약 50kb, 또는 약 45kb 내지 약 55kb이다.
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 인공 염색체이고 뉴클레오타이드 총 수가 약 100kb 내지 약 2000kb일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인공 염색체(들)는 인간 인공 염색체(HAC)이고 뉴클레오타이드 총 수가 약 1kb 내지 약 10kb, 1kb 내지 약 20kb, 약 1kb 내지 약 30kb, 약 1kb 내지 약 40kb, 약 1kb 내지 약 50kb, 약 1kb 내지 약 60kb, 약 10kb 내지 약 20kb, 약 10kb 내지 약 30kb, 약 10kb 내지 약 40kb, 약 10kb 내지 약 50kb, 약 10kb 내지 약 60kb, 약 20kb 내지 약 30kb, 약 20kb 내지 약 40kb, 약 20kb 내지 약 50kb, 약 20kb 내지 약 60kb, 약 30kb 내지 약 40kb, 약 30kb 내지 약 50kb, 약 30kb 내지 약 60kb, 약 40kb 내지 약 50kb, 약 40kb 내지 약 60kb, 또는 약 50kb 내지 약 60kb 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 인공 염색체(들)는 효모 인공 염색체(YAC)이고 뉴클레오타이드 총 수가 최대 1000kb일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인공 염색체(들)는 뉴클레오타이드 총 수가 약 100kb 내지 약 1,000kb, 약 100kb 내지 약 900kb, 약 100kb 내지 약 800kb, 약 100kb 내지 약 700kb, 약 100kb 내지 약 600kb, 약 100kb 내지 약 500kb, 약 100kb 내지 약 400kb, 약 100kb 내지 약 300kb, 약 100kb 내지 약 200kb, 약 200kb 내지 약 1,000kb, 약 200kb 내지 약 900kb, 약 200kb 내지 약 800kb, 약 200kb 내지 약 700kb, 약 200kb 내지 약 600kb, 약 200kb 내지 약 500kb, 약 200kb 내지 약 400kb, 약 200kb 내지 약 300kb, 약 300kb 내지 약 1,000kb, 약 300kb 내지 약 900kb, 약 300kb 내지 약 800kb, 약 300kb 내지 약 700kb, 약 300kb 내지 약 600kb, 약 300kb 내지 약 500kb, 약 300kb 내지 약 400kb, 약 400kb 내지 약 1,000kb, 약 400kb 내지 약 900kb, 약 400kb 내지 약 800kb, 약 400kb 내지 약 700kb, 약 400kb 내지 약 600kb, 약 400kb 내지 약 500kb, 약 500kb 내지 약 1,000kb, 약 500kb 내지 약 900kb, 약 500kb 내지 약 800kb, 약 500kb 내지 약 700kb, 약 500kb 내지 약 600kb, 약 600kb 내지 약 1,000kb, 약 600kb 내지 약 900kb, 약 600kb 내지 약 800kb, 약 600kb 내지 약 700kb, 약 700kb 내지 약 1,000kb, 약 700kb 내지 약 900kb, 약 700kb 내지 약 800kb, 약 800kb 내지 약 1,000kb, 약 800kb 내지 약 900kb, 또는 약 900kb 내지 약 1,000kb 범위인 YAC이다.
일부 실시양태에서, 인공 염색체(들)는 박테리아 인공 염색체(BAC)이고 뉴클레오타이드 총 수가 최대 750kb일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인공 염색체(들)는 BAC이고 뉴클레오타이드 총 수가 약 100kb 내지 약 750kb, 약 100kb 내지 약 700kb, 약 100kb 내지 약 600kb, 약 100kb 내지 약 500kb, 약 100kb 내지 약 400kb, 약 100kb 내지 약 300kb, 약 100kb 내지 약 200kb, 약 150kb 내지 약 750kb, 약 150kb 내지 약 700kb, 약 150kb 내지 약 600kb, 약 150kb 내지 약 500kb, 약 150kb 내지 약 400kb, 약 150kb 내지 약 300kb, 약 150kb 내지 약 200kb, 약 200kb 내지 약 750kb, 약 200kb 내지 약 700kb, 약 200kb 내지 약 600kb, 약 200kb 내지 약 500kb, 약 200kb 내지 약 400kb, 약 200kb 내지 약 300kb, 약 250kb 내지 약 750kb, 약 250kb 내지 약 700kb, 약 250kb 내지 약 600kb, 약 250kb 내지 약 500kb, 약 250kb 내지 약 400kb, 약 250kb 내지 약 300kb, 약 300kb 내지 약 750kb, 약 300kb 내지 약 700kb, 약 300kb 내지 약 600kb, 약 300kb 내지 약 500kb, 약 300kb 내지 약 400kb, 약 350kb 내지 약 750kb, 약 350kb 내지 약 700kb, 약 350kb 내지 약 600kb, 약 350kb 내지 약 500kb, 약 350kb 내지 약 400kb, 약 400kb 내지 약 750kb, 약 400kb 내지 약 700kb, 약 450kb 내지 약 600kb, 약 450kb 내지 약 500kb, 약 500kb 내지 약 750kb, 약 500kb 내지 약 700kb, 약 500kb 내지 약 600kb, 약 550kb 내지 약 750kb, 약 550kb 내지 약 700kb, 약 550kb 내지 약 600kb, 약 600kb 내지 약 750kb, 약 600kb 내지 약 700kb, 또는 약 650kb 내지 약 750kb 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 인공 염색체(들)는 P1 유래 인공 염색체(PAC)이고 뉴클레오타이드 총 수가 최대 300kb일 수 있다. 일부 실시양태에서, P1 유래 인공 염색체(들)는 뉴클레오타이드 총 수가 약 100kb 내지 약 300kb, 약 100kb 내지 약 200kb, 또는 약 200kb 내지 약 300kb 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 바이러스 벡터이고 뉴클레오타이드 총 수가 최대 10kb일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터(들)는 뉴클레오타이드 총 수가 약 1kb 내지 약 2kb, 1kb 내지 약 3kb, 약 1kb 내지 약 4kb, 약 1kb 내지 약 5kb, 약 1kb 내지 약 6kb, 약 1kb 내지 약 7kb, 약 1kb 내지 약 8kb, 약 1kb 내지 약 9kb, 약 1kb 내지 약 10kb, 약 2kb 내지 약 3kb, 약 2kb 내지 약 4kb, 약 2kb 내지 약 5kb, 약 2kb 내지 약 6kb, 약 2kb 내지 약 7kb, 약 2kb 내지 약 8kb, 약 2kb 내지 약 9kb, 약 2kb 내지 약 10kb, 약 3kb 내지 약 4kb, 약 3kb 내지 약 5kb, 약 3kb 내지 약 6kb, 약 3kb 내지 약 7kb, 약 3kb 내지 약 8kb, 약 3kb 내지 약 9kb, 약 3kb 내지 약 10kb, 약 4kb 내지 약 5kb, 약 4kb 내지 약 6kb, 약 4kb 내지 약 7kb, 약 4kb 내지 약 8kb, 약 4kb 내지 약 9kb, 약 4kb 내지 약 10　kb, 약 5kb 내지 약 6kb, 약 5kb 내지 약 7kb, 약 5kb 내지 약 8kb, 약 5kb 내지 약 9kb, 약 5kb 내지 약 10kb, 약 6kb 내지 약 7kb, 약 6kb 내지 약 8kb, 약 6kb 내지 약 9kb, 약 6kb 내지 약 10kb, 약 7kb 내지 약 8kb, 약 7kb 내지 약 9kb, 약 7kb 내지 약 10kb, 약 8kb 내지 약 9kb, 약 8kb 내지 약 10kb, 또는 약 9kb 내지 약 10kb 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 렌티바이러스이고 뉴클레오타이드 총 수가 최대 8kb일 수 있다. 일부 예에서, 렌티바이러스(들)는 뉴클레오타이드 총 수가 약 1kb 내지 약 2kb, 약 1kb 내지 약 3kb, 약 1kb 내지 약 4kb, 약 1kb 내지 약 5kb, 약 1kb 내지 약 6kb, 약 1kb 내지 약 7kb, 약 1kb 내지 약 8kb, 약 2kb 내지 약 3kb, 약 2kb 내지 약 4kb, 약 2kb 내지 약 5kb, 약 2kb 내지 약 6kb, 약 2kb 내지 약 7kb, 약 2kb 내지 약 8kb, 약 3kb 내지 약 4kb, 약 3kb 내지 약 5kb, 약 3kb 내지 약 6kb, 약 3kb 내지 약 7kb, 약 3kb 내지 약 8kb, 약 4kb 내지 약 5kb, 약 4kb 내지 약 6kb, 약 4kb 내지 약 7kb, 약 4kb 내지 약 8kb, 약 5kb 내지 약 6kb, 약 5kb 내지 약 7kb, 약 5kb 내지 약 8kb, 약 6kb 내지 약 8kb, 약 6kb 내지 약 7kb, 또는 약 7kb 내지 약 8kb일 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 아데노바이러스이고 뉴클레오타이드 총 수가 최대 8kb일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스(들)는 뉴클레오타이드 총 수가 약 1kb 내지 약 2kb, 약 1kb 내지 약 3kb, 약 1kb 내지 약 4kb, 약 1kb 내지 약 5kb, 약 1kb 내지 약 6kb, 약 1kb 내지 약 7kb, 약 1kb 내지 약 8kb, 약 2kb 내지 약 3kb, 약 2kb 내지 약 4kb, 약 2kb 내지 약 5kb, 약 2kb 내지 약 6kb, 약 2kb 내지 약 7kb, 약 2kb 내지 약 8kb, 약 3kb 내지 약 4kb, 약 3kb 내지 약 5kb, 약 3kb 내지 약 6kb, 약 3kb 내지 약 7kb, 약 3kb 내지 약 8kb, 약 4kb 내지 약 5kb, 약 4kb 내지 약 6kb, 약 4kb 내지 약 7kb, 약 4kb 내지 약 8kb, 약 5kb 내지 약 6kb, 약 5kb 내지 약 7kb, 약 5kb 내지 약 8kb, 약 6kb 내지 약 7kh, 약 6kb 내지 약 8kb, 또는 약 7kb 내지 약 8kb 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 아데노 관련 바이러스(AAV 벡터)이고 최대 5kb의 뉴클레오타이드 총 수를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터(들)는 약 1kb 내지 약 2kb, 약 1kb 내지 약 3kb, 약 1kb 내지 약 4kb, 약 1kb 내지 약 5kb, 약 2kb 내지 약 3kb, 약 2kb 내지 약 4kb, 약 2kb 내지 약 5kb, 약 3kb 내지 약 4kb, 약 3kb 내지 약 5kb, 또는 약 4kb 내지 약 5kb 범위의 뉴클레오타이드 총 수를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 Gateway® 벡터이고 최대 5kb의 뉴클레오타이드 총 수를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 Gateway® 벡터(들)는 약 1kb 내지 약 2kb, 약 1kb 내지 약 3kb, 약 1kb 내지 약 4kb, 약 1kb 내지 약 5kb, 약 2kb 내지 약 3kb, 약 2kb 내지 약 4kb, 약 2kb 내지 약 5kb, 약 3kb 내지 약 4kb, 약 3kb 내지 약 5kb, 또는 약 4kb 내지 약 5kb 범위의 뉴클레오타이드 총 수를 포함한다.
본원에 제공된 임의의 조성물, 키트 및 방법의 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 상이한 벡터는 실질적으로 동일한 유형의 벡터일 수 있고 크기가 다를 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 상이한 벡터는 상이한 유형의 벡터일 수 있고, 실질적으로 동일한 크기를 갖거나 상이한 크기를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 2개의 벡터 중 임의의 것은 뉴클레오타이드 총 수가 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,400개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,200개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,800개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,600개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,400개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,200개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,800개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,600개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,400개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,200개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 800개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,400개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,200개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,800개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,600개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,400개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,200개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,800개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,600개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,400개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,200개의 뉴클레오타이드, 약 800개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,400개의 뉴클레오타이드 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1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 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뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,800개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,600개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,400개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,200개의 뉴클레오타이드, 약 1,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드, 약 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뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 2,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,400개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,200개의 뉴클레오타이드, 약 2,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,400개의 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약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 3,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 3,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 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뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,600개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,400개의 뉴클레오타이드, 약 4,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,200개의 뉴클레오타이드, 약 4,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 4,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 4,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 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뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 4,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,200개의 뉴클레오타이드, 약 4,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 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뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 5,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 5,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,400개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 5,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,600개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 5,800개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 5,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,400개의 뉴클레오타이드, 약 6,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,200개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 6,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 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뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 6,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,600개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,800개의 뉴클레오타이드, 약 6,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 6,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 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뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 7,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,200개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 7,200개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,400개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 7,400개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,600개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,600개의 뉴클레오타이드 내지 약 7,800개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 7,800개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 8,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,000개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 9,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 9,500개의 뉴클레오타이드, 약 9,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 약 10,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 10,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 10,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 10,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 10,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 10,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 10,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 10,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 10,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 10,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,500개의 뉴클레오타이드, 약 10,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 10,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 10,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 10,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 10,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 10,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 10,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 10,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 10,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,000개의 뉴클레오타이드, 약 11,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 11,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 11,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 11,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 11,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 11,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 11,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 11,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 11,500개의 뉴클레오타이드, 약 11,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 11,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 11,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 11,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 11,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 11,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 11,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드, 약 12,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 12,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 12,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 12,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 12,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 12,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,500개의 뉴클레오타이드, 약 12,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 12,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 12,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 12,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 12,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,000개의 뉴클레오타이드, 약 13,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 13,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 13,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 13,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 13,500개의 뉴클레오타이드, 약 13,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 13,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 약 13,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,000개의 뉴클레오타이드, 약 14,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드, 약 14,000개의 뉴클레오타이드 내지 약 14,500개의 뉴클레오타이드, 또는 약 14,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 15,000개의 뉴클레오타이드(포함됨) 범위일 수 있다.
본원에 기술된 임의의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 벡터가 본원에 제공된다. 예를 들어, 도 1-24 참조.
당해 분야에 공지된 다양한 상이한 방법을 사용하여 본원에 개시된 임의의 벡터를 포유동물 세포(예를 들어, 달팽이관 내유모세포, 달팽이관 외유모세포, 망막 세포)에 도입할 수 있다. 포유동물 세포에 핵산을 도입하는 방법의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 리포펙션, 형질감염(예를 들어, 인산칼슘 형질감염, 고분지형 유기 화합물을 사용한 형질감염, 양이온성 중합체를 사용한 형질감염, 덴드리머 기반 형질감염, 광학 형질감염, 입자 기반 형질감염)(예를 들어, 나노입자 형질감염), 또는 리포솜(예를 들어, 양이온성 리포솜)을 사용한 형질감염), 미세주입, 전기천공, 세포 스퀴징(cell squeezing), 초음파천공(sonoporation), 원형질체 융합(protoplast fusion), 임페일펙션(impalefection), 유체 역학적 전달(hydrodynamic delivery), 유전자 총, 마그네토펙션(magnetofection), 바이러스 형질감염 및 뉴클레오펙션(nucleofection).
숙련가는 본원에 기술된 임의의 벡터가, 예를 들어, 리포펙션에 의해 포유동물 세포로 도입될 수 있고, 내인성 유전자 자리(예를 들어, CLRN1 유전자 자리)에 안정적으로 통합될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터는 내인성의 결함이 있는 CLRN1 유전자 자리로 안정적으로 통합되고, 이에 따라 결함이 있는 CLRN1 유전자를 기능(예를 들어, 야생형) CLRN1 단백질을 암호화하는 핵산으로 대체한다.
내인성 유전자에 돌연변이(들) 및/또는 결실(들)을 도입하기 위해 사용할 수 있는 다양한 분자 생물학 기술이 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 기술의 비제한적인 예는 부위 특이적 돌연변이 유도, CRISPR(예를 들어, CRISPR/Cas9 유도된 녹인(knock-in) 돌연변이 및 CRISPR/Cas9 유도된 녹아웃(knock-out) 돌연변이) 및 TALEN을 포함한다. 이러한 방법은 표적 세포의 염색체에 존재하는 결함이 있는 내인성 유전자의 서열을 수정하는 데 사용할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 벡터는 제어 서열, 예를 들어, 전사 개시 서열, 전사 종결 서열, 프로모터 서열, 인핸서 서열, RNA 스플라이싱 서열, 폴리아데닐화 (polyA) 신호 및 코작 컨센서스 서열의 군으로부터 선택된 제어 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이들 제어 서열의 비제한적인 예가 본원에 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 천연 프로모터, 항시성 프로모터, 유도성 프로모터 및/또는 조직 특이적 프로모터일 수 있다.
프로모터
용어 "프로모터"는 특정 유전자(예를 들어, CLRN1 유전자)의 전사를 개시하는 데 필요한 포유동물 세포에서 효소/단백질에 의해 인식되는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터는 전형적으로, 예를 들어, RNA 중합효소 및/또는 임의의 관련 인자가 결합하고 전사가 개시되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 프로모터의 비제한적인 예가 본원에 기술되어 있다. 프로모터의 추가 예는 당해 분야에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, CLRN1 단백질(예를 들어, 인간 CLRN1 단백질)의 N-말단 부분을 암호화하는 벡터는 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 수 있다. CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 벡터는 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터, 항시성 프로모터, 포유동물 세포 프로모터, 바이러스 프로모터, 키메릭 프로모터, 조작된 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 유형의 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II 프로모터, 예컨대 포유동물 RNA 중합효소 II 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 H1 프로모터, 인간 U6 프로모터, 마우스 U6 프로모터 또는 돼지 U6 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는 RNA 중합효소 III 프로모터이다. 프로모터는 일반적으로 내유모세포에서 전사를 촉진할 수 있는 것일 것이다. 일부 예에서, 프로모터는 달팽이관 특이적 프로모터 또는 달팽이관 지향 프로모터이다.
본원에서 사용될 수 있는 다양한 프로모터가 당해 분야에 공지되어 있다. 본원에서 사용될 수 있는 프로모터의 비제한적인 예는 인간 EF1a, 인간 거대세포바이러스(cytomegalovirus)(CMV)(미국 특허 제5,168,062호), 인간 유비퀴틴(human ubiquitin) C(UBC), 마우스 포스포글리세레이트 키나제 1, 폴리오마 아데노바이러스(polyoma adenovirus), 유인원 바이러스(simian virus) 40(SV40), β-글로빈, β-액틴, α-태아 단백질, γ-글로빈, β-인터페론, γ-글루타밀 전이효소, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스, 래트 인슐린, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 메탈로티오네인(metallothionein) II(MT II), 아밀라제, 카텝신, MI 무스카린 수용체, 레트로바이러스 LTR(예를 들어, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 HTLV), AAV ITR, 인터루킨-2, 콜라게나제, 혈소판 유래 성장 인자, 아데노바이러스 5 E2, 스트로멜리신(stromelysin), 뮤린 MX 유전자, 포도당 조절 단백질(GRP78 및 GRP94), α-2-마크로글로불린, 비멘틴(vimentin), MHC 클래스 I 유전자 H-2κ b, HSP70, 프롤리페린(proliferin), 종양 괴사 인자, 갑상선 자극 호르몬 α 유전자, 면역 글로불린 경쇄, T-세포 수용체, HLA DQα 및 DQβ, 인터루킨-2 수용체, MHC 클래스 II, MHC 클래스 II HLA-DRα, 근육 크레아틴 키나제, 프리알부민(prealbumin)(트랜스티레틴(transthyretin)), 엘라스타제 I, 알부민 유전자, c-fos, c-HA-ras, 신경 세포 부착 분자(neural cell adhesion molecule)(NCAM), H2B(TH2B) 히스톤, 래트 성장 호르몬, 인간 혈청 아밀로이드(human serum amyloid)(SAA), 트로포닌(troponin) I(TN I), 뒤쉔 근디스트로피(duchenne muscular dystrophy), 인간 면역결핍 바이러스 및 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(Gibbon Ape Leukemia Virus)(GALV) 프로모터를 포함한다. 프로모터의 추가 예는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Lodish, Molecular Cell Biology, Freeman and Company, New York 2007 참조. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CMV 즉시 초기 프로모터(immediate early promoter)이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CAG 프로모터 또는 CAG/CBA 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CBA 프로모터, 예를 들어, 서열 번호 18을 포함하거나 이로 구성된 CBA 프로모터이다.
용어 "항시성" 프로모터는 단백질(예를 들어, CLRN1 단백질)을 암호화하는 핵산과 작동 가능하게 연결될 때 대부분의 또는 모든 생리적 조건 하에서 포유동물 세포의 핵산으로부터 RNA가 전사되도록 하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
항시성 프로모터의 예는 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 거대 세포 바이러스(CMV) 프로모터(예를 들어, Boshart 등, Cell 41:521-530, 1985 참조), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1-알파 프로모터(Invitrogen)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고 외인성으로 공급되는 화합물, 온도와 같은 환경 요인, 또는 특정 생리학적 상태의 존재에 의해, 예를 들어, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해 또는 세포 복제에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 상업적 공급처에서 입수할 수 있다. 유도성 프로모터의 추가 예는 당해 분야에 공지되어 있다.
외인성으로 공급되는 화합물에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연 유도성 양 메탈로티오닌(metallothionine)(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex) 유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터(ecdysone insect promoter)(No 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3346-3351, 1996), 테트라사이클린 억제 시스템(tetracycline-repressible system)(Gossen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992), 테트라사이클린 유도성 시스템(Gossen 등, Science 268:1766-1769, 1995, 또한 Harvey 등, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518, 1998 참조), RU486 유도성 시스템(Wang 등, Nat. Biotech. 15:239-243, 1997) 및 Wang 등, Gene Ther. 4:432-441, 1997) 및 라파마이신 유도성 시스템(Magari 등, J. Clin. Invest. 100:2865-2872, 1997)을 포함한다.
용어 "조직 특이적" 프로모터는 일부 특이적 세포 유형 및/또는 조직에서만 활성인 프로모터를 지칭한다(예를 들어, 특이적 유전자의 전사는 조직 특이적 프로모터에 결합하는 전사 조절 단백질을 발현하는 세포 내에서만 발생함).
일부 실시양태에서, 조절 서열은 조직 특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직 특이적 조절 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직 특이적 전사 인자에 결합한다.
예시적인 조직 특이적 프로모터는 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 간 특이적 티록신 결합 글로불린(thyroxin binding globulin)(TBG) 프로모터, 인슐린 프로모터, 글루카곤 프로모터(glucagon promoter), 소마토스타틴 프로모터(somatostatin promoter), 췌장 폴리펩타이드(PPY) 프로모터, 시냅신(synapsin)-1(Syn) 프로모터, 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, 포유동물 데스민(desmin)(DES) 프로모터, 알파-미오신 중쇄(a-MHC) 프로모터 및 심장 트로포닌(Troponin) T(cTnT) 프로모터. 추가의 예시적인 프로모터는 베타-액틴 프로모터, B형 간염 바이러스 코어 프로모터(Sandig 등, Gene Ther. 3:1002-1009, 1996), 알파-태아 단백질(AFP) 프로모터(Arbuthnot 등, Hum. Gene Ther. 7:1503-1514, 1996), 뼈 오스테오칼신 프로모터(bone osteocalcin promoter)(Stein 등, Mol. Biol. Rep. 24:185-196, 1997); 뼈 시알로단백질 프로모터(bone sialoprotein promoter)(Chen 등, J. Bone Miner. Res. 11:654-664, 1996), CD2 프로모터(Hansal 등, J. Immunol. 161:1063-1068, 1998); 면역 글로불린 중쇄 프로모터; T 세포 수용체 알파-쇄 프로모터, 신경원(neuronal), 예컨대 뉴런 특이적 에놀라제(neuron-specific enolase)(NSE) 프로모터(Andersen 등, Cell. Mol. Neurobiol. 13:503-515, 1993), 신경필라멘트(neurofilament) 경쇄 유전자 프로모터(Piccioli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5611-5615, 1991) 및 뉴런 특이적 vgf 유전자 프로모터(Piccioli 등, Neuron 15:373-384, 1995)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조직 특이적 프로모터는 달팽이관 특이적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 조직 특이적 프로모터는 달팽이관 유모세포 특이적 프로모터이다. 달팽이관 유모세포 특이적 프로모터의 비제한적인 예는 ATOH1 프로모터, POU4F3 프로모터, LHX3 프로모터, MYO7A 프로모터, MYO6 프로모터, α9ACHR 프로모터 및 α10ACHR 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 프로모터는 PRESTIN 프로모터 또는 ONCOMOD 프로모터와 같은 달팽이관 유모세포 특이적 프로모터이다. 예를 들어, Zheng 등, Nature 405:149-155, 2000; Tian 등, Dev. Dyn. 231:199-203, 2004; 및 Ryan 등, Adv. Otorhinolaryngol. 66:99-115, 2009 참조.
인핸서
일부 예에서 벡터는 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 용어 "인핸서"는 관심 단백질(예를 들어, CLRN1 단백질)을 암호화하는 핵산의 전사 수준을 향상시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 인핸서 서열(길이가 50-1500개인 염기쌍)은 일반적으로 전사 관련 단백질(예를 들어, 전사 인자)에 대한 추가 결합 부위를 제공함으로써 전사 수준을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 인트론 서열 내에서 인핸서 서열이 발견된다. 프로모터 서열과 달리, 인핸서 서열은 (예를 들어, 프로모터에 비해) 전사 시작 부위로부터 훨씬 더 먼 거리에서 작용할 수 있다. 인핸서의 비제한적인 예는 RSV 인핸서, CMV 인핸서 및 SV40 인핸서를 포함한다. 일부 실시양태에서, CMV 인핸서 서열은 서열 번호 17을 포함하거나 이로 구성된다.
폴리(A) 신호
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 벡터는 폴리아데닐화(폴리(A)) 신호 서열을 포함할 수 있다. 대부분의 초기 진핵생물 mRNA는 3' 말단에 폴리(A) 테일이 있으며, 이는 1차 전사체의 절단과 폴리(A) 신호 서열에 의해 구동되는 커플링된 폴리아데닐화 반응을 포함하는 복잡한 과정 중에 추가된다(예를 들어, Proudfoot 등, Cell 108:501-512, 2002 참조). 폴리(A) 테일은 mRNA 안정성 및 이동성을 부여한다(Molecular Biology of the Cell, Third Edition by B. Alberts 등, Garland Publishing, 1994). 일부 실시양태에서, 폴리(A) 신호 서열은 CLRN1 단백질의 C-말단을 암호화하는 핵산 서열에 대해 3'에 위치한다.
본원에 사용된 "폴리아데닐화"는 폴리아데닐릴 모이어티 또는 이의 변형된 변이체의 메신저 RNA 분자로의 공유 연결을 의미한다. 진핵생물에서 대부분의 메신저 RNA(mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 3' 폴리(A) 테일은 효소인 폴리아데닐레이트 중합효소의 작용을 통해 pre-mRNA에 추가된 긴 서열의 아데닌 뉴클레오타이드(예를 들어, 50개, 60개, 70개, 100개, 200개, 500개, 1000개, 2000개, 3000개, 4000개 또는 5000개)이다. 고등 진핵생물에서 폴리(A) 테일은 특정 서열, 폴리아데닐화(또는 폴리(A)) 신호를 함유하는 전사체에 추가된다. 폴리(A) 테일과 이에 결합된 단백질은 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하는 데 도움이 된다. 폴리아데닐화는 전사 종결, 핵으로부터 mRNA의 엑스포트(export) 및 번역에도 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA가 RNA로 전사된 직후 핵에서 발생하지만, 나중에 세포질에서도 발생할 수 있다. 전사가 종료된 후, mRNA 쇄는 RNA 중합효소와 관련된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통해 절단된다. 절단 부위는 일반적으로 절단 부위 근처에 염기 서열 AAUAAA의 존재를 특징으로 한다. mRNA가 절단된 후, 절단 부위의 자유 3' 말단에 아데노신 잔기가 추가된다.
본원에 사용된 "폴리(A) 신호 서열" 또는 "폴리아데닐화 신호 서열"은 mRNA의 엔도뉴클레아제 절단 및 절단된 mRNA의 3' 말단에 일련의 아데노신의 첨가를 유발하는 서열이다.
소 성장 호르몬(bovine growth hormone)(bgh)(Woychik 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(13):3944-3948, 1984; 미국 특허 제5,122,458호), 마우스-β-글로빈, 마우스-α-글로빈(Orkin 등, EMBO J. 4(2):453-456, 1985; Thein 등, Blood 71(2):313-319, 1988), 인간 콜라겐, 폴리오마 바이러스(Batt 등, Mol. Cell Biol. 15(9):4783-4790, 1995), 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 유전자(Herpes simplex virus thymidine kinase gene)(HSV TK), IgG 중쇄 유전자 폴리아데닐화 신호(US 2006/0040354), 인간 성장 호르몬(hGH)(Szymanski 등, Mol. Therapy 15(7):1340-1347, 2007), SV40 폴리(A) 부위로 구성된 그룹, 예컨대 SV40 후기 및 초기 폴리(A) 부위(Schek 등, Mol. Cell Biol. 12(12):5386-5393, 1992)에서 유래한 것을 포함하여 사용할 수 있는 여러 폴리(A) 신호 서열이 있다.
폴리(A) 신호 서열은 AATAAA일 수 있다. AATAAA 서열은 AATAAA와 상동성이 있고 ATTAAA, AGTAAA, CATAAA, TATAAA, GATAAA, ACTAAA, AATATA, AAGAAA, AATAAT, AAAAAA, AATGAA, AATCAA, AACAAA, AATCAA, AATAAC, AATAGA, AATTAA 또는 AATAAG를 포함하여 폴리아데닐화 신호를 보낼 수 있는 다른 헥사뉴클레오타이드 서열로 치환될 수 있다(예를 들어, WO 06/12414 참조).
일부 실시양태에서, 폴리(A) 신호 서열은 합성 폴리아데닐화 부위일 수 있다(예를 들어, Levitt 등, Genes Dev. 3(7):1019-1025, 1989에 기초한 Promega의 pCl-neo 발현 벡터). 일부 실시양태에서, 폴리(A) 신호 서열은 소 성장 호르몬의 폴리아데닐화 신호이다 (CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG(서열 번호 20)). 일부 실시양태에서, 폴리(A) 신호 서열은 가용성 뉴로필린-1(sNRP)의 폴리아데닐화 신호이다(AAATAAAATACGAAATG(서열 번호 21))(예를 들어, WO 05/073384 참조). 폴리(A) 신호 서열의 추가 예는 당해 분야에 공지되어 있다.
내부 리보솜 유입 부위(IRES)
일부 실시양태에서, CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 벡터는 폴리뉴클레오타이드 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함할 수 있다. IRES 서열은 단일 유전자 전사체로부터 하나 초과의 폴리펩타이드를 생산하는 데 사용된다. IRES는 IRES가 위치한 곳으로부터 바로 하류에 있는 mRNA로 임의의 위치로부터 번역이 개시될 수 있도록 하는 복잡한 2차 구조를 형성한다(예를 들어, Pelletier 및 Sonenberg, Mol. Cell. Biol. 8(3):1103-1112, 1988 참조).
예를 들어, 구제역 바이러스(FMDV), 뇌심근염 바이러스(EMCV), 인간 라이노바이러스(HRV), 귀뚜라미 마비 바이러스(cricket paralysis virus), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), A형 간염 바이러스(HAV), C형 간염 바이러스(HCV) 및 소아마비 바이러스(PV)로부터의 것들을 포함하여 당해 분야의 숙련가에게 알려진 여러 IRES 서열이 있다. 예를 들어, Alberts, Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 2002; 및 Hellen 등, Genes Dev. 15(13):1593-612, 2001 참조.
일부 실시양태에서, CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 벡터에 도입된 IRES 서열은 구제역 바이러스(FMDV) 2A 서열이다. 구제역 바이러스 2A 서열은 폴리단백질의 절단을 매개하는 것으로 밝혀진 작은 펩타이드(약 18개의 아미노산 길이)이다(Ryan, M D 등, EMBO 4:928-933, 1994; Mattion 등, J. Virology 70:8124-8127, 1996; Furler 등, Gene Therapy 8:864-873, 2001; 및 Halpin 등, Plant Journal 4:453-459, 1999). 상기 2A 서열의 절단 활성은 플라스미드 및 유전자 치료 벡터(AAV 및 레트로바이러스)를 포함한 인공 시스템에서 이전에 입증되었다(Ryan 등, EMBO 4:928-933, 1994; Mattion 등, J. Virology 70:8124-8127, 1996; Furler 등, Gene Therapy 8:864-873, 2001; 및 Halpin 등, Plant Journal 4:453-459, 1999; de Felipe 등, Gene Therapy 6:198-208, 1999; de Felipe 등, Human Gene Therapy 11:1921-1931, 2000; 및 Klump 등, Gene Therapy 8:811-817, 2001).
리포터 서열
본원에 제공된 임의의 벡터는 선택적으로 리포터 단백질을 암호화하는 서열("리포터 서열")을 포함할 수 있다. 리포터 서열의 비제한적인 예는 다음을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다: 베타-락타마제, 베타-갈락토시다제(LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질, mCherry 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase)(CAT) 및 루시퍼라제. 리포터 서열의 추가 예는 당해 분야에 공지되어 있다. 발현을 유도하는 조절 요소와 연관될 때, 리포터 서열은 효소, 방사선, 비색, 형광 또는 기타 분광 분석; 형광 활성화 세포 분류(fluorescent activating cell sorting)(FACS) 분석; 면역학적 분석(예를 들어, 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 면역조직화학)을 포함한 기존의 수단으로 검출 가능한 신호를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 리포터 서열은 tGFP(서열 번호 19)이다. 일부 실시양태에서, 리포터 서열은 LacZ 유전자이고, 포유동물 세포(예를 들어, 달팽이관 유모세포, 망막 세포와 같은 안구 세포)에서 LacZ 유전자를 운반하는 벡터의 존재는 베타-갈락토시다아제 활성에 대한 분석에 의해 검출된다. 리포터가 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질) 또는 루시퍼라제이면, 포유동물 세포(예를 들어, 달팽이관 유모세포, 망막 세포와 같은 안구 세포)에서 형광 단백질 또는 루시퍼라제를 운반하는 벡터의 존재는 형광 기술(예를 들어, 형광 현미경 또는 FACS) 또는 발광계(예를 들어, 분광광도계 또는 IVIS 이미징 기기)의 광 생성에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포터 서열은 본원에 기술된 임의의 벡터의 조직 특이적 표적화 능력 및 조직 특이적 프로모터 조절 활성을 확인하는데 사용될 수 있다.
플랭킹(flanking) 영역 비번역 영역(UTR)
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 벡터(예를 들어, 2개 이상의 상이한 벡터 중 임의의 것)는 5' UTR 또는 3' UTR과 같은 비번역 영역을 포함할 수 있다.
유전자의 비번역 영역(UTR)은 전사되지만 번역되지는 않는다. 5' UTR은 전사 시작 부위에서 시작하여 시작 코돈까지 계속되지만 시작 코돈은 포함하지 않는다. 3' UTR은 중지 코돈 바로 뒤에서 시작하여 전사 종료 신호까지 계속된다. 핵산 분자의 안정성 및 번역 측면에서 UTR이 수행하는 조절 역할에 대한 증거가 늘어나고 있다. UTR의 조절 특징은 CLRN1 단백질의 발현을 향상시키기 위해 본원에 기술된 임의의 벡터, 조성물, 키트 또는 방법에 도입될 수 있다.
천연 5' UTR은 번역 개시 역할을 하는 서열을 포함한다. 이들은 리보솜이 많은 유전자의 번역을 개시하는 과정에 관여하는 것으로 일반적으로 알려진 코작 서열과 같은 시그니처를 가지고 있다. 코작 서열은 컨센서스 서열 CCR(A/G)CCAUGG를 가지며, 여기서 R은 시작 코돈(AUG)의 상류에 있는 3개의 퓨린 염기(A 또는 G)이고 시작 코돈 다음에 또 다른 "G"가 온다. 5' UTR은 또한 신장 인자 결합(elongation factor binding)에 관여하는 2차 구조를 형성하는 것으로 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 5' UTR은 본원에 기술된 임의의 벡터에 포함된다. 알부민, 혈청 아밀로이드 A, 아포지질단백질 A/B/E, 트랜스페린, 알파 태아 단백질, 에리트로포이에틴 및 인자 VIII의 유전자로부터의 것들을 포함하는 5' UTR의 비제한적 예를 mRNA와 같은 핵산 분자의 발현을 향상시키는 데 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 달팽이관 또는 망막의 세포에 의해 전사되는 mRNA로부터의 5' UTR은 본원에 기술된 임의의 벡터, 조성물, 키트 및 방법에 포함될 수 있다.
3' UTR은 아데노신과 우리딘(RNA 형태) 또는 티미딘(DNA 형태) 스트레치(stretche)가 내장되어 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 AU 풍부 시그니처는 특히 회전율(turnover)이 높은 유전자에 널리 퍼져 있다. 서열 특징 및 기능적 특성에 따라 AU 풍부 요소(ARE)는 세 가지 유형으로 분리될 수 있다(Chen 등, Mol. Cell. Biol. 15:5777-5788, 1995; Chen 등, Mol. Cell Biol. 15:2010-2018, 1995): 유형 I ARE는 U 풍부 영역 내에 AUUUA 모티프의 여러 분산 복제물을 포함한다. 예를 들어, c-Myc 및 MyoD mRNA는 유형 I ARE를 함유한다. 유형 II ARE는 2개 이상의 중첩 UUAUUUA(U/A)(U/A) 노나머(nonamer)를 보유한다. GM-CSF 및 TNF-알파 mRNA는 유형 II ARE를 함유하는 예이다. 유형 III ARE는 잘 정의되어 있지 않다. 이러한 U 풍부 영역은 AUUUA 모티프를 함유하지 않는다. 이 유형의 두 가지 잘 연구된 예는 c-Jun 및 미오게닌(myogenin) mRNA이다.
ARE에 결합하는 대부분의 단백질은 메신저를 불안정하게 하는 것으로 알려진 반면, ELAV 계열의 구성원, 특히 HuR은 mRNA의 안정성을 증가시키는 것으로 문서화되어 있다. HuR은 세 가지 유형 모두의 ARE에 결합한다. HuR 특이적 결합 부위를 핵산 분자의 3' UTR 안으로 조작하면 HuR 결합이 발생하여 생체 내에서 메시지가 안정화된다.
예시적인 인간 야생형 5' UTR은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13의 서열이거나 이를 포함한다. 예시적인 인간 야생형 5' UTR은 서열 번호 14 또는 서열 번호 15의 서열이거나 이를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR, 또는 둘 다가 벡터(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 벡터)에 포함된다. 예를 들어, 본원에 기술된 임의의 5'-UTR은 본원에 기술된 임의의 코딩 서열에서 시작 코돈에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 임의의 3'-UTR은 본원에 기술된 임의의 코딩 서열에서 3'-말단 코돈(마지막 코돈)에 작동적으로 연결될 수 있다.
본원에 기술된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 5' UTR은 서열 번호 12 또는 서열 번호 13 내의 어느 곳에서나 적어도 10개의 인접(예를 들어, 적어도 15개의 인접, 적어도 20개의 인접, 적어도 25개의 인접, 적어도 30개의 인접, 적어도 35개의 인접, 적어도 40개의 인접, 적어도 45개의 인접, 적어도 50개의 인접, 적어도 55개의 인접, 적어도 60개의 인접, 적어도 65개의 인접, 적어도 70개의 인접, 적어도 75개의 인접, 적어도 80개의 인접, 적어도 85개의 인접, 적어도 90개의 인접, 적어도 100개의 인접, 적어도 105개의 인접, 적어도 110개의 인접, 적어도 115개의 인접, 적어도 120개의 인접, 적어도 125개의 인접, 적어도 130개의 인접, 적어도 135개의 인접, 적어도 140개의 인접, 적어도 145개의 인접, 적어도 150개의 인접, 적어도 155개의 인접, 적어도 160개의 인접, 적어도 165개의 인접, 적어도 170개의 인접, 적어도 175개의 인접, 적어도 180개의 인접, 적어도 185개의 인접, 적어도 190개의 인접, 적어도 195개의 인접, 적어도 200개의 인접, 적어도 205개의 인접, 적어도 210개의 인접, 적어도 215개의 인접, 적어도 220개의 인접, 적어도 225개의 인접, 적어도 230개의 인접, 적어도 235개의 인접, 적어도 240개의 인접, 적어도 245개의 인접, 적어도 250개의 인접, 적어도 255개의 인접 또는 적어도 260개의 인접)한 뉴클레오타이드를 포함한다.
예를 들어, 5' UTR은 다음 중 하나 이상을 포함하거나 이로 구성될 수 있다: 서열 번호 12 또는 13의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 160, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 140, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 130, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 120, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 110, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 100, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 90, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 80, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 70, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 60, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 50, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 40, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 30, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 20, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 10, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 160, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 140, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 130, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 120, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 110, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 100, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 90, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 80, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 70, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 60, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 50, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 40, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 30, 뉴클레오타이드 위치 10 내지 20, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 160, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 140, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 130, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 120, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 110, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 100, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 90, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 80, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 70, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 60, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 50, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 40, 뉴클레오타이드 위치 20 내지 30, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 160, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 140, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 130, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 120, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 110, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 100, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 90, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 80, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 70, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 60, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 50, 뉴클레오타이드 위치 30 내지 40, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 160, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 140, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 130, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 120, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 110, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 100, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 90, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 80, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 70, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 60, 뉴클레오타이드 위치 40 내지 50, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 160, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 140, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 130, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 120, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 110, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 100, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 90, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 80, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 70, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 60, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 160, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 60 내지 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80 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 80 내지 140, 뉴클레오타이드 위치 80 내지 130, 뉴클레오타이드 위치 80 내지 120, 뉴클레오타이드 위치 80 내지 110, 뉴클레오타이드 위치 80 내지 100, 뉴클레오타이드 위치 80 내지 90, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 160, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 140, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 130, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 120, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 110, 뉴클레오타이드 위치 90 내지 100, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 160, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 140, 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130 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 160, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 130 내지 140, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 160, 뉴클레오타이드 위치 140 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 160, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 160 내지 170, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 170 내지 180, 뉴클레오타이드 위치 180 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 180 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 180 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 180 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 180 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 180 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 180 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 180 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 180 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 180 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 180 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 180 내지 190, 뉴클레오타이드 위치 190 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 190 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 190 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 190 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 190 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 190 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 190 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 190 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 190 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 190 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 190 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 210, 뉴클레오타이드 위치 210 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 210 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 210 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 210 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 210 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 210 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 210 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 210 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 210 내지 220, 뉴클레오타이드 위치 220 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 220 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 220 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 220 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 220 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 220 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 220 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 220 내지 230, 뉴클레오타이드 위치 230 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 230 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 230 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 230 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 230 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 230 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 230 내지 240, 뉴클레오타이드 위치 240 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 240 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 240 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 240 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 240 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 240 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 260, 뉴클레오타이드 위치 260 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 260 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 260 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 260 내지 270, 뉴클레오타이드 위치 270 내지 291, 뉴클레오타이드 위치 270 내지 290, 뉴클레오타이드 위치 270 내지 280, 뉴클레오타이드 위치 280 내지 291, 또는 뉴클레오타이드 위치 280 내지 290.
본원에 기술된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 5' UTR은 서열 번호 12 또는 13과 적어도 70%(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 서열을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 3' UTR은 서열 번호 14 또는 15 내의 어느 곳에서나 적어도 10개의 인접(예를 들어, 적어도 15개의 인접, 적어도 20개의 인접, 적어도 25개의 인접, 적어도 30개의 인접, 적어도 35개의 인접, 적어도 40개의 인접, 적어도 45개의 인접, 적어도 50개의 인접, 적어도 55개의 인접, 적어도 60개의 인접, 적어도 65개의 인접, 적어도 70개의 인접, 적어도 75개의 인접, 적어도 80개의 인접, 적어도 85개의 인접, 적어도 90개의 인접, 적어도 100개의 인접, 적어도 105개의 인접, 적어도 110개의 인접, 적어도 115개의 인접, 적어도 120개의 인접, 적어도 125개의 인접, 적어도 130개의 인접, 적어도 135개의 인접, 적어도 140개의 인접, 적어도 145개의 인접, 적어도 150개의 인접, 적어도 155개의 인접, 적어도 160개의 인접, 적어도 165개의 인접, 적어도 170개의 인접, 적어도 175개의 인접, 적어도 180개의 인접, 적어도 185개의 인접, 적어도 190개의 인접, 적어도 195개의 인접, 적어도 200개의 인접, 적어도 205개의 인접, 적어도 210개의 인접, 적어도 215개의 인접, 적어도 220개의 인접, 적어도 225개의 인접, 적어도 230개의 인접, 적어도 235개의 인접, 적어도 240개의 인접, 적어도 245개의 인접, 적어도 250개의 인접, 적어도 255개의 인접, 적어도 260개의 인접, 적어도 265개의 인접, 적어도 270개의 인접, 적어도 275개의 인접, 적어도 280개의 인접, 적어도 285개의 인접, 적어도 290개의 인접, 적어도 295개의 인접, 적어도 300개의 인접, 적어도 305개의 인접, 적어도 310개의 인접, 적어도 315개의 인접, 적어도 320개의 인접, 적어도 325개의 인접, 적어도 330개의 인접, 적어도 335개의 인접, 적어도 340개의 인접, 적어도 345개의 인접, 적어도 350개의 인접, 적어도 355개의 인접, 적어도 360개의 인접, 적어도 365개의 인접, 적어도 370개의 인접, 적어도 375개의 인접, 적어도 380개의 인접, 적어도 385개의 인접, 적어도 390개의 인접, 적어도 395개의 인접, 적어도 400개의 인접, 적어도 450개의 인접, 적어도 500개의 인접, 적어도 550개의 인접, 적어도 600개의 인접, 적어도 650개의 인접, 적어도 700개의 인접, 적어도 750개의 인접, 적어도 800개의 인접, 적어도 850개의 인접, 적어도 900개의 인접, 적어도 950개의 인접, 적어도 1000개의 인접, 적어도 1050개의 인접, 적어도 1100개의 인접, 적어도 1150개의 인접, 적어도 1200개의 인접, 적어도 1250개의 인접, 적어도 1300개의 인접, 적어도 1350개의 인접, 적어도 1400개의 인접, 적어도 1450개의 인접, 적어도 1500개의 인접, 적어도 1550개의 인접, 적어도 1600개의 인접, 적어도 1650개의 인접, 적어도 1700개의 인접, 또는 적어도 1750개의 인접)한 뉴클레오타이드를 포함한다.
예를 들어, 5' UTR은 다음 중 하나 이상을 포함하거나 이로 구성될 수 있다: 서열 번호 14 또는 15의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1500, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1450, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1400, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1350, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1300, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1250, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1200, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1150, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1100, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1050, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 1000, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 950, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 900, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 850, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 800, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 750, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 700, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 650, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 600, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 550, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 500, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 450, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 400, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 350, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 300, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 100, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 50, 뉴클레오타이드 위치 1 내지 25, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1500, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1450, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1400, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1350, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1300, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1250, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1200, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1150, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1100, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1050, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 1000, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 950, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 900, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 850, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 800, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 750, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 700, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 650, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 600, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 550, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 500, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 450, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 400, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 350, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 300, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 100, 뉴클레오타이드 위치 25 내지 50, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1500, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1450, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1400, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1350, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1300, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1250, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1200, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1150, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1100, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1050, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 1000, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 950, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 900, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 850, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 800, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 750, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 700, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 650, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 600, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 550, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 500, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 450, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 400, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 350, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 300, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 50 내지 100, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1500, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1450, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1400, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1350, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1300, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1250, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1200, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1150, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1100, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1050, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 1000, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 950, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 900, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 850, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 800, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 750, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 700, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 650, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 600, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 550, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 500, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 450, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 400, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 350, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 300, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 100 내지 150, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1500, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1450, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1400, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1350, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1300, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1250, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1200, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1150, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1100, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1050, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 1000, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 950, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 900, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 850, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 800, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 750, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 700, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 650, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 600, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 550, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 500, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 450, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 400, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 350, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 300, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 150 내지 200, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1500, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1450, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1400, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1350, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1300, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1250, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1200, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1150, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1100, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1050, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 1000, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 950, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 900, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 850, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 800, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 750, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 700, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 650, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 600, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 550, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 500, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 450, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 400, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 350, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 300, 뉴클레오타이드 위치 200 내지 250, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1500, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1450, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1400, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1350, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1300, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1250, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1200, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1150, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1100, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1050, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 1000, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 950, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 900, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 850, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 800, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 750, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 700, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 650, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 600, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 550, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 500, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 450, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 400, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 350, 뉴클레오타이드 위치 250 내지 300, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1500, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1450, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1400, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1350, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1300, 뉴클레오타이드 위치 300 내지 1250, 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뉴클레오타이드 위치 1250 내지 1300, 뉴클레오타이드 위치 1300 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 1300 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 1300 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 1300 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 1300 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 1300 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 1300 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 1300 내지 1500, 뉴클레오타이드 위치 1300 내지 1450, 뉴클레오타이드 위치 1300 내지 1400, 뉴클레오타이드 위치 1300 내지 1350, 뉴클레오타이드 위치 1350 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 1350 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 1350 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 1350 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 1350 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 1350 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 1350 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 1350 내지 1500, 뉴클레오타이드 위치 1350 내지 1450, 뉴클레오타이드 위치 1350 내지 1400, 뉴클레오타이드 위치 1400 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 1400 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 1400 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 1400 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 1400 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 1400 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 1400 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 1400 내지 1500, 뉴클레오타이드 위치 1400 내지 1450, 뉴클레오타이드 위치 1450 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 1450 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 1450 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 1450 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 1450 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 1450 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 1450 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 1450 내지 1500, 뉴클레오타이드 위치 1500 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 1500 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 1500 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 1500 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 1500 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 1500 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 1500 내지 1550, 뉴클레오타이드 위치 1550 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 1550 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 1550 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 1550 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 1550 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 1550 내지 1600, 뉴클레오타이드 위치 1600 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 1600 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 1600 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 1600 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 1600 내지 1650, 뉴클레오타이드 위치 1650 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 1650 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 1650 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 1650 내지 1700, 뉴클레오타이드 위치 1700 내지 1773, 뉴클레오타이드 위치 1700 내지 1770, 뉴클레오타이드 위치 1700 내지 1750, 뉴클레오타이드 위치 1750 내지 1773, 또는 뉴클레오타이드 위치 1750 내지 1770.
본원에 기술된 임의의 조성물의 일부 실시양태에서, 3' UTR은 서열 번호 14 또는 15와 적어도 70%(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 서열을 포함한다.
CLRN1의 인간 5' UTR(서열 번호 12)
Figure pct00032
CLRN1의 인간 5' UTR(서열 번호 13)
Figure pct00033
CLRN1의 인간 3' UTR(서열 번호 14)
Figure pct00034
CLRN1의 인간 3' UTR(서열 번호 15)
Figure pct00035
일부 실시양태에서, 3' UTR ARE의 도입, 제거 또는 변형은 CLRN1 단백질을 암호화하는 mRNA의 안정성을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, ARE는 제거되거나 돌연변이되어 세포 내 안정성을 증가시키고, 따라서 CLRN1 단백질의 번역 및 생산을 증가시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 비-ARE 서열은 5' 또는 3' UTR에 통합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인트론 또는 인트론 서열의 일부는 본원에 제공된 임의의 벡터, 조성물, 키트 및 방법에서 폴리뉴클레오타이드의 플랭킹 영역으로 통합될 수 있다. 인트론 서열의 통합은 mRNA 수준 뿐만 아니라 단백질 생산을 증가시킬 수 있다.
본원에 기술된 임의의 벡터의 일부 실시양태에서, 벡터는 키메릭 인트론 서열(서열 번호 16)을 포함한다.
포유동물 세포
본원에 기술된 임의의 핵산, 벡터(예를 들어, 본원에 기술된 적어도 2개의 상이한 벡터) 또는 조성물을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)가 또한 본원에 제공된다. 숙련가는 본원에 기술된 핵산 및 벡터가 임의의 포유동물 세포에 도입될 수 있음을 인식할 것이다. 벡터 및 포유동물 세포에 벡터를 도입하기 위한 방법의 비제한적인 예가 본원에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 상기 세포는 인간 세포, 마우스 세포, 돼지 세포, 토끼 세포, 개 세포, 고양이 세포, 래트 세포 또는 비인간 영장류 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 달팽이관의 특화된 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 달팽이관 내유모세포 또는 달팽이관 외유모세포와 같은 달팽이관 유모세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 안구 세포(예를 들어, 망막 세포, 망막신경절 세포, 무축색 세포, 수평 세포, 양극 세포, 광수용체 세포)이다.
일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 시험관 내에 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 포유동물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 대상체로부터 수득되고 생체 외에서 배양된 자가 세포이다.
방법
본원에 기술된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물(예를 들어, 인간)의 달팽이관에 도입하는 것을 포함하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
포유동물 세포에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법으로서, 본원에 기술된 임의의 조성물을 포유동물 세포에 도입하는 것을 포함하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
포유동물(예를 들어, 인간)의 내유모세포, 외유모세포 또는 둘 다에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법으로서, 본원에 기술된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 달팽이관에 도입하는 것을 포함하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
포유동물(예를 들어, 인간)의 눈에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법으로서, 본원에 기술된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 눈에 안내 투여하는 것을 포함하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 확인된 대상체에서 청력 손실을 치료하는 방법으로서, 본원에 기술된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 대상체의 달팽이관에 투여하는 것을 포함하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 확인된 대상체에서 시력 손실을 치료하는 방법으로서, 본원에 기술된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
임의의 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 포유동물은 결함이 있는 CLRN1 유전자(예를 들어, CLRN1 유전자에 의해 암호화되는 CLRN1 단백질의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 돌연변이가 있는 CLRN1 유전자)를 갖는 것으로 사전에 확인되었다. 임의의 이들 방법의 일부 실시양태는, 상기 도입 또는 투여 단계 전에, 대상체가 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는지 결정하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 이러한 방법의 일부 실시양태는 대상체에서 CLRN1 유전자의 돌연변이를 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 상기 방법의 일부 실시양태는 대상체가 청력 손실 및/또는 시력 손실이 있는 것으로 확인하거나 진단하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 조성물의 2회 이상의 용량이 포유동물 또는 대상체의 달팽이관에 도입되거나 투여된다. 임의의 이러한 방법의 일부 실시양태는 포유동물 또는 대상체의 달팽이관에 상기 조성물의 제1 용량을 도입 또는 투여하고, 제1 용량의 도입 또는 투여 후 포유동물 또는 대상체의 청력 기능을 평가하고, (예를 들어, 당해 분야에 공지된 임의의 청력 검사를 사용하여 결정된 바와 같이) 청각 기능이 정상 범위 내가 아닌 것으로 밝혀진 포유동물 또는 대상체의 달팽이관에 상기 조성물의 추가 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 달팽이관 내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 달팽이관 내 투여 또는 국소 투여를 통해 투여될 수 있다. 본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 의료 장치(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 예시적인 의료 장치)의 사용을 통해 투여된다.
일부 실시양태에서, 달팽이관 내 투여는 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 다음의 수술 기법을 사용하여 상기 조성물을 달팽이관으로 투여하거나 도입할 수 있다: 먼저 0도, 2.5mm 강성 내시경을 이용한 시각화를 사용하여, 외이도를 청소하고 원형 나이프를 사용하여 대략 5mm 고실 플랩(tympanomeatal flap)을 예리하게 그린다. 이어서, 고실 플랩을 들어 올리고 중이를 뒤쪽으로 진입시킨다. 고삭신경을 확인하고 분할하고, 큐렛을 사용하여 갑상연골을 제거하여 원창 막(round window membrane)을 노출시킨다. 투여되거나 도입된 조성물의 첨단 분포를 향상시키기 위해, 외과용 레이저를 사용하여 난원창(oval window)에 작은 2mm 천공을 만들어 조성물의 원창 막 주입 동안 외림프가 이동되도록 할 수 있다. 이어서, 미세주입 장치를 프라이밍하고 수술 부위로 가져간다. 상기 장치를 원창으로 이동시키고, 팁을 골 원창 돌출부 내에 안착시켜 미세니들(들)이 막을 침투하도록 한다. 측량된 상기 조성물이 꾸준히 주입되도록 풋 페달을 사용한다. 이어서, 상기 장치를 회수하고 원창과 등골근족판을 젤 폼 패치로 밀봉한다.
임의의 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 조성물의 2회 이상의 용량이 포유동물 또는 대상체의 눈에 도입되거나 투여된다. 임의의 이러한 방법의 일부 실시양태는 포유동물 또는 대상체의 눈(예를 들어, 안구 공간)에 상기 조성물의 제1 용량을 도입하거나 투여하고, 포유동물 또는 대상체의 청력 기능을 평가한 후 제1 용량을 도입하거나 투여하고, (예를 들어, 당해 분야에 공지된 임의의 시력 검사를 사용하여 결정된 바와 같이) 시력이 정상 범위 내가 아닌 것으로 밝혀진 포유동물 또는 대상체의 눈에 상기 조성물의 추가 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 안구 내 투여용으로 제형화될 수 있다. 본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물은 안구 내 투여 또는 국소 투여를 통해 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 안구 내 투여는 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체 또는 포유동물은 설치류, 비인간 영장류 또는 인간이다. 본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체 또는 포유동물은 성인, 십대, 청소년, 아동, 유아(toddle), 영아(infant) 또는 신생아이다. 본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체 또는 포유동물은 1-5, 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1-70, 1-80, 1-90, 1-100, 1-110, 2-5, 2-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 10-90, 10-100, 10-110, 20-40, 20-50, 20-60, 20-70, 20-80, 20-90, 20-100, 20-110, 30-50, 30-60, 30-70, 30-80, 30-90, 30-100, 40-60, 40-70, 40-80, 40-90, 40-100, 50-70, 50-80, 50-90, 50-100, 60-80, 60-90, 60-100, 70-90, 70-100, 70-110, 80-100, 80-110 또는 90-110세이다. 본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체 또는 포유동물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개월령이다.
본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체 또는 포유동물은 청력 손실 및/또는 시력 손실(예를 들어, 어셔 증후군 III형, 망막색소변성증)이 있거나 발병할 위험이 있다. 본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체 또는 포유동물은 CLRN1 유전자에 돌연변이가 있는 것으로 사전에 확인되었다. 본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체 또는 포유동물에는 본원에 기술되거나 청력 손실 및/또는 시력 손실과 관련되는 것으로 당해 분야에 공지된 CLRN1 유전자의 임의의 돌연변이가 있다.
본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체 또는 포유동물은 (예를 들어, 유전자 검사를 통해) CLRN1 유전자에서 돌연변이의 운반자인 것으로 확인되었다. 본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체 또는 인간은 CLRN1 유전자에 돌연변이가 있는 것으로 확인되었고 청력 손실 및/또는 시력 손실(예를 들어, 어셔 증후군 III형, 망막색소변성증)로 진단되었다. 본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체 또는 인간은 청력 손실 및/또는 시력 손실(예를 들어, 어셔 증후군 III형, 망막색소변성증)이 있는 것으로 확인되었다.
일부 실시양태에서, 청력 손실(예를 들어, 어셔 증후군 III형)의 성공적인 치료는 당해 분야에 공지된 임의의 통상적인 기능적 청력 검사를 사용하여 대상체에서 결정될 수 있다. 기능적 청력 검사의 비제한적인 예는 다양한 유형의 청력 측정 분석(예를 들어, 순음 검사(pure-tone testing), 음성 검사(speech testing), 중이 검사, 청성 뇌간 반응(auditory brainstem response) 및 이 음향방사(otoacoustic emissions))이다.
일부 실시양태에서, 시력 손실의 성공적인 치료는 당해 분야에 공지된 임의의 통상적인 기능적 시력 검사를 사용하여 대상체에서 결정될 수 있다. 망막 및 시력의 기능적 검사의 비제한적인 예는 시력 검사(acuity testing), 안압(IOP) 검사 및 망막전도(electroretinogram)(ERG)이다.
본원에 기술된 임의의 조성물을 포유동물 세포에 도입하는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)의 발현을 증가시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 달팽이관 유모세포(예를 들어, 내유모세포, 외유모세포) 또는 안구 세포(예를 들어, 망막 세포)이다. 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 인간 세포(예를 들어, 인간 달팽이관 유모세포)이다. 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 시험관 내에 있다. 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 포유동물에 있다. 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 원래 포유동물로부터 수득되고 생체 외에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 결정되었다.
본원에 기술된 임의의 조성물을 포유동물 세포로 도입하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 리포펙션을 통해 또는 바이러스 벡터, 예를 들어, 본원에 기술된 임의의 바이러스 벡터의 사용을 통해).
본원에 기술된 바와 같은 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)의 발현 증가는, 예를 들어, 대조군과 또는 벡터(들)의 도입 이전의 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)의 발현 수준과 비교한다.
CLRN1의 발현 및/또는 활성을 검출하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, CLRN1 단백질의 발현 수준은 직접 검출할 수 있다(예를 들어, CLRN1 단백질 검출 또는 CLRN1 mRNA 검출). CLRN1의 발현 및/또는 활성을 직접 검출하는 데 사용할 수 있는 기술의 비제한적인 예는 실시간 PCR, 웨스턴 블로팅, 면역침강법, 면역조직화학 또는 면역형광법을 포함한다. 일부 실시양태에서, CLRN1 단백질의 발현은 간접적으로 검출할 수 있다(예를 들어, 기능적 청력 검사, 기능적 망막 및 시력 검사를 통해).
약제학적 조성물 및 키트
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 조성물은 포유동물 세포로의 본원에 기술된 핵산 또는 임의의 벡터의 진입을 촉진하는 하나 이상의 제제(예를 들어, 리포솜 또는 양이온성 지질)를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 벡터는 천연 및/또는 합성 중합체를 사용하여 제형화할 수 있다. 본원에 기술된 임의의 조성물에 포함될 수 있는 중합체의 비제한적인 예는 DYNAMIC POLYCONJUGATE®(Arrowhead Research Corp., Pasadena, CA), Mirus Bio(Madison, Wis.) 및 Roche Madison(Madison, Wis.)으로부터의 제형, PhaseRX 중합체 제형, 예컨대 비제한적으로 SMARTT POLYMER TECHNOLOGY®(PhaseRX, Seattle, Wash.), DMRI/DOPE, 폴록사머, Vical(San Diego, Calif.)로부터의 VAXFECTIN® 보조제, 키토산, Calando Pharmaceuticals(Pasadena, Calif.)로부터의 사이클로덱스트린, 덴드리머 및 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 중합체, RONDEL™(RNAi/올리고뉴클레오타이드 나노입자 전달) 중합체(Arrowhead Research Corporation, Pasadena, CA) 및 pH 반응성 공블록(co-block) 중합체, 예컨대 비제한적으로 PhaseRX(Seattle, Wash.)에 의해 생산된 것들을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 이들 중합체 중 다수는 생체 내에서 포유동물 세포로 올리고뉴클레오타이드를 전달하는 효능을 입증하였다(예를 들어, deFougerolles, Human Gene Ther. 19:125-132, 2008; Rozema 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887, 2007; Rozema 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887, 2007; Hu-Lieskovan 등, Cancer Res. 65:8984-8982, 2005; Heidel 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:5715-5721, 2007 참조).
본원에 기술된 임의의 조성물은, 예를 들어, 약제학적 조성물일 수 있다. 약제학적 조성물은 본원에 기술된 임의의 조성물 및 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 하나 이상의 완충액; 포도당, 만노스, 수크로스 및 덱스트란과 같은 하나 이상의 탄수화물; 만니톨; 글리신과 같은 하나 이상의 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산; 하나 이상의 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 하나 이상의 킬레이트제; 및/또는 하나 이상의 방부제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체(예를 들어, 인산염 완충 식염수, 식염수, 또는 정균수)를 포함한다. 제형화시, 용액이 투여 제형과 양립할 수 있는 방식으로 치료적 유효량으로 투여될 것이다. 제형은 주사 가능한 용액, 주사 가능한 겔, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여 형태로 쉽게 투여된다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 약제학적 투여와 양립할 수 있는 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제, 항진균제 등을 포함한다. 보충 활성 화합물이 또한 본원에 기술된 임의의 조성물에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 조성물의 단일 용량은, 예를 들어, 완충 용액 중의 적어도 1ng, 적어도 2ng, 적어도 4ng, 약 6ng, 약 8ng, 적어도 10ng, 적어도 20ng, 적어도 30ng, 적어도 40ng, 적어도 50ng, 적어도 60ng, 적어도 70ng, 적어도 80ng, 적어도 90ng, 적어도 100ng, 적어도 200ng, 적어도 300ng, 적어도 400ng, 적어도 500ng, 적어도 1μg, 적어도 2μg, 적어도 4μg, 적어도 6μg, 적어도 8μg, 적어도 10μg, 적어도 12μg, 적어도 14μg, 적어도 16μg, 적어도 18μg, 적어도 20μg, 적어도 22μg, 적어도 24μg, 적어도 26μg, 적어도 28μg, 적어도 30μg 적어도 32μg, 적어도 34μg, 적어도 36μg, 적어도 38μg, 적어도 40μg, 적어도 42μg, 적어도 44μg, 적어도 46μg, 적어도 48μg, 적어도 50μg, 적어도 52μg, 적어도 54μg, 적어도 56μg, 적어도 58μg, 적어도 60μg, 적어도 62μg, 적어도 64μg, 적어도 66μg, 적어도 68μg, 적어도 70μg, 적어도 72μg, 적어도 74μg, 적어도 76μg, 적어도 78μg, 적어도 80μg, 적어도 82μg, 적어도 84μg, 적어도 86μg, 적어도 88μg, 적어도 90μg, 적어도 92μg, 적어도 94μg, 적어도 96μg, 적어도 98μg, 적어도 100μg, 적어도 102μg, 적어도 104μg, 적어도 106μg, 적어도 108μg, 적어도 110μg, 적어도 112μg, 적어도 114μg, 적어도 116μg, 적어도 118μg, 적어도 120μg, 적어도 122μg, 적어도 124μg, 적어도 126μg, 적어도 128μg, 적어도 130μg 적어도 132μg, 적어도 134μg, 적어도 136μg, 적어도 138μg, 적어도 140μg, 적어도 142μg, 적어도 144μg, 적어도 146μg, 적어도 148μg, 적어도 150μg, 적어도 152μg, 적어도 154μg, 적어도 156μg, 적어도 158μg, 적어도 160μg, 적어도 162μg, 적어도 164μg, 적어도 166μg, 적어도 168μg, 적어도 170μg, 적어도 172μg, 적어도 174μg, 적어도 176μg, 적어도 178μg, 적어도 180μg, 적어도 182μg, 적어도 184μg, 적어도 186μg, 적어도 188μg, 적어도 190μg, 적어도 192μg, 적어도 194μg, 적어도 196μg, 적어도 198μg 또는 적어도 200μg의 적어도 2개의 상이한 벡터의 총 합계량을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 조성물은, 예를 들어, 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화될 수 있다. 의도된 투여 경로의 비제한적인 예는 국소 투여(예를 들어, 달팽이관 내 투여)이다.
일부 실시양태에서, 치료학적 조성물은 지질 나노입자를 포함하도록 제형화된다. 일부 실시양태에서, 치료학적 조성물은 중합체성 나노입자를 포함하도록 제형화된다. 일부 실시양태에서, 치료학적 조성물은 미니-서클(mini-circle) DNA를 포함하도록 제형화된다. 일부 실시양태에서, 치료학적 조성물은 CELiD DNA를 포함하도록 제형화된다. 일부 실시양태에서, 치료학적 조성물은 합성 외림프 용액을 포함하도록 제형화된다. 예시적인 합성 외림프 용액은 20-200mM NaCl; 1-5mM KCl; 0.1-10mM CaCl2; 1-10mM 포도당; pH 약 6 내지 약 9의 2-50mM HEPES를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 조성물을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 고체 조성물(예를 들어, 본원에 기술된 적어도 2개의 상이한 벡터를 포함하는 동결 건조된 조성물) 및 동결 건조된 조성물을 용해시키기 위한 액체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기술된 임의의 조성물을 포함하는 사전 로딩된 주사기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기술된 임의의 조성물(예를 들어, 수성 조성물, 예를 들어, 수성 약제학적 조성물로 제형화됨)을 포함하는 바이알을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기술된 임의의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
장치 및 수술 방법
청력 손실 및/또는 시력 손실(예를 들어, 어셔 증후군 III형, 망막색소변성증)을 치료하기 위한 치료 전달 시스템이 본원에서 제공된다. 한 측면에서, 치료 전달 시스템은 i) 이를 필요로 하는 인간 대상체의 내이의 원창 막에 하나 또는 복수의 절개를 생성할 수 있는 의료 기기 및 ii) 유효 용량의 조성물(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 조성물)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 의료 장치는 복수의 미세니들을 포함한다.
청력 손실을 치료하기 위한 수술 방법(예를 들어, 어셔 증후군 III형)이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 인간 대상체의 달팽이관에 제1 절개 지점에 제1 절개를 도입하는 단계; 및 본원에 제공된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 달팽이관 내로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 제1 절개 지점에서 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 제1 절개부 내로 또는 이를 통해 대상체에게 투여된다.
본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 조성물은 달팽이관 난원창 막 내로 또는 이를 통해 대상체에게 투여된다. 본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 조성물은 달팽이관 원창 막 내로 또는 이를 통해 대상체에게 투여된다. 본원에 기술된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 원창 막에 복수의 절개부를 생성할 수 있는 의료 장치를 사용하여 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 의료 장치는 복수의 미세니들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 의료 장치는 일반적으로 원형의 제1 측면을 포함하는 복수의 미세니들을 포함하며, 각 미세니들은 지름이 적어도 약 10마이크론이다. 일부 실시양태에서, 상기 의료 장치는 상기 조성물을 보유할 수 있는 베이스 및/또는 저장소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 의료 장치는 상기 조성물을 전달할 수 있는 루멘을 개별적으로 포함하는 복수의 중공 미세니들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 의료 장치는 적어도 부분 진공을 생성하기 위한 수단을 포함한다.
시력 손실(예를 들어, 망막색소변성증)의 치료를 위한 수술 방법이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 제공된 임의의 조성물의 치료적 유효량을 안구 내 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 하기 실험 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 기술된다. 이러한 예는 설명 목적으로만 제공되며 달리 명시하지 않는 한 제한하려는 의도가 없다. 따라서, 본 발명은 결코 다음의 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로 명백해지는 임의의, 그리고 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가 설명 없이, 당해 분야의 숙련가는 전술한 설명 및 다음의 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명의 화합물을 만들고 이용할 수 있고 청구된 방법을 실행할 수 있다고 믿어진다. 다음의 실시예는 본 발명의 다양한 측면을 구체적으로 지적하고, 어떠한 방식으로든 본 개시 내용의 나머지 부분을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 바이러스 벡터의 구성
재조합 AAV는 Xiao 등, J. Virol. 73(5):3994-4003, 1999에 사용된 바와 같은 아데노바이러스가 없는 방법으로 형질감염하여 생성한다. AAV ITR이 있는 시스 플라스미드, AAV Rep 및 Cap 유전자가 있는 트랜스 플라스미드, 및 아데노바이러스 게놈으로부터의 필수 영역이 있는 헬퍼 플라스미드를 1:1:2의 비율로 293개의 세포에서 공동 형질감염한다. 여기에 사용된 AAV 벡터는 아래에 기술된 구성체를 사용하여 다중 이중 벡터 전략 하에서 인간 CLRN1 또는 마우스 CLRN1을 발현한다. AAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, rh8, rh10, rh39, rh43 및 Anc80을, Pryadkina 등, Meth. Clin. Devel. 2:15009, 2015에 요약된 바와 같이, 각각 세 세트의 CLRN1 구성체를 캡슐화하여 (i) 연쇄화-트랜스플라이싱(concatemerization-transplicing) 전략, (ii) 하이브리드 인트로닉 상동성 재조합-트랜스플라이싱 전략 및 (iii) 엑소닉 상동성 재조합 전략을 시험하도록 준비한다.
실시예 2: 바이러스 입자 생성 및 정제
Pryadkina 등, Mol. Ther. 2:15009, 2015에 기술된 바와 같이 삼중 형질감염 프로토콜을 사용하여 재조합 AAV-1을 생산하고 2개의 순차적 염화세슘(CsCl) 밀도 구배로 정제한다. 두 번째 원심분리가 끝날 때 500μl의 11개 분획을 CsCl 밀도 구배 튜브에서 회수하고 1× PBS에서 투석을 통해 정제한다. 분획을 도트 블롯으로 분석하여 rAAV 게놈을 함유하는 분획을 결정한다. AAV 벡터 게놈의 ITR 영역에 해당하는 프라이머 및 프로브를 사용하여 정량적 실시간 PCR 기반 적정 방법으로 각 제제의 바이러스 게놈 수(vg)를 결정한다(Bartoli 등, Gene. Ther. 13:20-28, 2006).
실시예 3: 바이러스 입자의 제형
1e14vg/mL의 역가로 생성된 AAV를 인공 외림프 중 3.2e13, 1.0e13, 3.2e12, 1.0e12vg/mL의 희석도로 제조한다. 인공 외림프는 다음 시약을 조합하여 제조한다: NaCl, 120mM; KCl, 3.5mM; CaCl2, 1.5mM; 포도당, 5.5mM; HEPES, 20mM. 인공 외림프는 NaOH로 적정하여 pH를 7.5(총 Na+ 농도 130mM)로 조정한다(Chen 등, J. Controlled Rel. 110:1-19, 2005).
실시예 4: 장치 설명
AAV-CLRN1 제형을 원창 막(RWM)의 일관되고 안전한 침투를 위해 설계된 특화된 미세카테터(microcatheter)를 사용하여 달팽이관에 전달한다. 미세카테터는 전달 절차를 수행하는 외과의가 외이도를 통해 중이강으로 들어가서 미세카테터의 끝 부분과 RWM을 접촉할 수 있도록 형상화된다. 미세카테터의 원위 단부는 지름이 10 내지 1,000마이크론인 하나 이상의 미세니들로 구성되어 있으며, 이는 AAV-CLRN1이 대략 1uL/분의 속도로 고실계(scala tympani)의 달팽이관 외림프에 들어갈 수 있도록 충분한, 그러나 외과적 치료 없이 치유할 수 있을 만큼 작게 RWM에 천공을 생성한다. 미세니들(들)에 인접한 미세카테터의 나머지 부분에는 대략 1e13vg/mL의 역가로 AAV-CLRN1/인공 외림프 제형이 로딩된다. 미세카테터의 근위 말단은 대략 1μL/분의 정밀하고 적은 양의 주입을 허용하는 미세조작기(micromanipulator)에 연결된다.
실시예 5: 동물 모델 1A: 노화된 마우스에서의 수술 방법
인공 외림프에서 제조된 AAV-CLRN1을 Shu 등(Human Gene Therapy, doi:10.1089/hum.2016.053, June 2016)이 기술한 바와 같이 고실계에 투여한다. 6주령 수컷 마우스를, 자일라진(xylazine)(20mg/kg)과 케타민(100mg/kg)의 복강 주사를 사용하여 마취한다. 전기 가열 패드를 사용하여 체온을 37℃로 유지한다. 오른쪽 귀 뒤 부위를 절개하고 고포(tympanic bulla)을 노출한다. 고포를 수술용 바늘로 천공하고 작은 구멍을 확장하여 달팽이관에 접근한다. 고실계의 달팽이관 측벽 뼈를 치과용 드릴로 얇게 하여 막성 측벽이 손상되지 않도록 한다. 유리 미세피펫과 함께 Nanoliter Microinjection System을 사용하여 인공 외림프에서 총 약 300nL의 AAV-CLRN1을 2nL/초의 속도로 고실계에 전달한다. 유리 미세피펫은 주입 후 5분 동안 그 자리에 둔다. 달팽이관 절제(cochleostomy) 및 주입 후, 고포의 구멍을 치과용 시멘트로 봉합하고 근육과 피부를 봉합한다. 마우스가 마취에서 깨어나도록 하고 3일 동안 0.15mg/kg 부프레노르핀 하이드로클로라이드(buprenorphine hydrochloride)로 통증을 조절한다.
실시예 6: 동물 모델 2: 기니피그의 왕복 미세펌프
수술 절차
인공 외림프에서 제조된 AAV-CLRN1을 Tandon 등, Lab Chip, DOI:10.1039/c5lc01396h, 2015에 기술된 바와 같이 왕복 미세펌프를 사용하여 달팽이관 내 전달 후 분포 및 독성을 평가하기 위해 기니피그에 투여한다. 무게가 대략 350g인 수컷 기니피그 각각(n=16)을 펜토바르비탈 나트륨(pentobarbital sodium)(Nembutal; 25mg kg-1, 복강 내 주사), 펜타닐(fentanyl)(0.2mg kg-1, 근육 내) 및 할로페리돌(haloperidol)(10mg kg-1, 근육 내)의 조합으로 마취한다. 에피네프린이 포함된 리도카인을 국소 마취제로서 절개부에 피하로 투여한다. 등쪽(dorsal) 접근 방식을 사용하여 고포에 지름 5mm의 구멍을 만들고 달팽이관 절개부를 원창 막에서 대략 0.5mm 원위로 생성한다. 미세펌프의 캐뉼라(아래에 기술)를 달팽이관 절개부에 삽입하고, 달팽이관에 3mm 치근쪽으로(apically) 연결하고, 일반적인 시아노아크릴레이트 접착제로 고포에 붙인다. 복합 활동 전위(compound action potential)(CAP) 측정을 위해 퍼플루오로알콕시-알칸 절연된 은 와이어 전극(비코팅된 지름 203μm)을 원창 틈새 근처에 삽입되고 고포에 붙인다.
변조이음향방사(distortion product otoacoustic emissions)(DPOAE) 및 CAP 측정 절차를 이전에 Tandon 등, Biomed Microdevices 17:3-21, 2015에 기술된 바와 같이 수행한다. DPOAE는 수술의 결과로 발생하는 임의의 손상을 모니터링하기 위해 달팽이관 절개술 절차 전후에 특성 주파수 32, 24, 16, 12, 8, 5. 6, 4 및 2.78kHz에서 측정한다.
1e14vg/mL의 최대 역가로 AAV-CLRN1을 Tandon 등, Lab Chip, DOI: 10.1039/c5lc01396h, 2015에 기술된 바와 같이 미세펌프를 사용하여 기니피그에 투여한다. 미세펌프 시스템에는 4개의 선택 가능한 포트가 있다. 이 포트는 (i) 인공 외림프 저장에 사용되는 대형 유체 커패시터; (ii) 달팽이관에 연결되는 배출구; (iii) 통합된 AAV-CLRN1 저장소로부터의 배출구; (iv) 통합된 AAV-CLRN1 저장소로의 입구에 연결된다. 각 포트는 중앙 펌프 챔버에 유동적으로 연결되며, 각각은 개별적으로 밸브로 처리된다. 왕복 AAV-CLRN1 전달을 위한 이벤트 순서는 다음과 같다: (i) 내부 AAV-CLRN1 리프레시 루프(refresh loop)를 실행하여 AAV-CLRN1을 AAV-CLRN1 저장소에서 메인 주입-인출 라인(main infuse-withdraw line)으로 전송한다; (ii) AAV-CLRN1을 달팽이관에 주입하고 일부 인공 외림프는 인공 외림프 저장 커패시터로부터 배출한다; (iii) 처음 두 단계는 추가 용량을 위해 여러 번 반복할 수 있다; (iv) AAV-CLRN1이 일정 시간 동안 확산되도록 허용된 후, 단계 (i)-(iii)에서 주입된 부피와 동일한 부피의 외림프를 달팽이관에서 빼내어 인공 외림프 저장 커패시터를 다시 채운다. 이 과정은 달팽이관에 추가된 순(net) 유체 부피가 0인 약물의 순 전달을 초래한다.
미세펌프의 유체 커패시터는 천장이 얇고(25.4μm) 유연한 폴리이미드 막인 원통형 챔버이다. 펌프 챔버의 지름은 3.5mm, 유체 저장 커패시터의 지름은 14mm, 나머지 커패시터의 지름은 모두 4mm이다. 동일한 막이 편향되어 각 밸브에서 흐름을 차단한다. 밸브 챔버의 지름은 3.1mm이다. 약물 저장소를 구성하는 구불구불한(serpentine) 채널은 238μL의 총 부피에 대해 폭 762μm의 정사각형 단면을 갖고 길이는 410mm이다. 펌프의 다른 모든 미세채널은 폭이 400μm이고 높이가 254μm이다.
기니피그에서의 급성 약물 전달
미세펌프에 AAV-CLRN1과 인공 외림프를 로딩하고, 24 및 32kHz의 특징적인 주파수 감도의 위치 사이에서 달팽이관 영역에 만들어진 달팽이관 절개부에 캐뉼라를 삽입하고, 3mm 치근쪽으로 연결하여 12 내지 16kHz 영역에서 종결시킨다. 기준선 DPOAE 및 CAP 청력 검사를 수행한 후 AAV-CLRN1/인공 외림프 주입을 시작한다. 이어서, 펌프를 활성화하고, 대략 1μL의 인공 외림프를, 대략 총 10μL의 인공 외림프가 달팽이관에 전달될 때까지 5분마다 주입한다. 20분의 대기 시간 후, 대략 10μL의 외림프가 달팽이관에서 제거된다. AAV-CLRN1 전달은 대략 총 10μL의 유체가 전달될 때까지 5분마다 약 1μL의 속도로 개시된다.
동물을 치료 후 1주, 1개월, 3개월 및 6개월에 희생시키고(그룹당 n = 4) 달팽이관을 추출하였다. 코르티 기관을 따라 AAV 형질도입 및 CLRN1 발현의 정도를 항-CLRN1 항체로 면역염색을 통해 평가한다. 유모세포(Myo7a) 및 지지 세포(Sox2) 마커에 대한 항체를 사용하여 IHC, OHC, 지지 세포 및 부동섬모 형태(stereocilia morphology)를 정량화한다. 아넥신(annexin) V 염색을 사용하여 달팽이관 감각 상피를 따라 세포에서의 아폽토시스의 증거를 평가하한다.
실시예 7: 동물 모델 3: 양
인공 외림프에서 제조된 AAV-CLRN1을 어린 양에게 투여하여 트랜스-RWM 주입을 통해 달팽이관에 전달한 후 분포 및 독성을 평가한다. 치료 전 내유모세포(IHC) 및 외유모세포(OHC) 기능을 평가하기 위해 기준선 청성뇌간반응(auditory brainstem response)(ABR) 및 변조이음향방사(DPOAE)을 3개월령(n=40)의 암컷 양에서 양측에서 측정한다. 기준선 ABR 및 DPOAE 측정 후, 1.0e14, 3.2e13, 1.0e13 및 3.2e12vg/mL의 역가에서 20uL의 AAV1-CLRN1을 양의 왼쪽 고실계에 주입한다(그룹당 n=10). 각 동물의 오른쪽 귀는 처리되지 않은 대조군으로 남긴다. ABR 및 DPOAE 측정은 수술 후 1일, 5일 및 10일에 양측에서 다시 수행한다. 시술 후 6개월에 모든 동물에서 추가로 양측에서 ABR 및 DPOAE 측정을 수행하고, 이후에 동물을 희생시키고 달팽이관을 제거한다.
희생된 동물의 절반(각 용량 코호트에서 n=5)에서, 면역염색을 수행하여 유모세포 구조를 확인하고 달팽이관 감각 상피를 따라 CLRN1 단백질 발현을 평가한다. 유모세포(Myo7a), 지지 세포(Sox2) 및 CLRN1의 마커에 대한 항체는 이전에 기술한 대로 사용한다(Duncker 등, 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519). 코르티 기관의 기저부, 중간부 및 첨단부(apical turn)에서 유모세포 총 수와 CLRN1을 발현하는 유모세포를 200um 영역 내에서 계산한다.
희생된 동물의 나머지 절반(각 용량 코호트의 나머지 5마리 동물)에서 달팽이관 조직 샘플을 위에서 기술한 것과 동일한 기저부, 중간부 및 첨단부에서 수집하고 CLRN1 mRNA 전사체에 대해 분석한다.
실시예 8: 인간 임상 예(소아 치료)
환자를 전신 마취한다. 외과의는 외이도로부터 고막에 접근하여 고막과 만나는 외이도의 아래쪽 가장자리를 작게 절개하고, 고막을 플랩(flap)으로 들어 올려 중이 공간을 노출시킨다. 수술용 레이저를 사용하여 등골근족판에 작은 개구부(대략 2mm)를 만든다. 이어서, 외과의는 인공 외림프에서 제조된 AAV-CLRN1 용액이 1e13vg/mL의 역가로 로딩된 미세카테터로 원창 막을 관통한다. 미세카테터를 대략 1uL/분의 속도로 약 20uL의 AAV-CLRN1 용액을 주입하는 미세조작기에 연결한다. AAV-CLRN1 주입이 끝나면, 외과의는 미세카테터를 빼내고 등골근족판과 RWM의 구멍을 젤 폼 패치로 패치한다. 상기 절차는 고막 플랩 교체로 끝난다.
실시예 9: CLRN1 돌연변이를 검출하기 위한 모체 혈액의 비침습적 산전 검사
모체 혈액 샘플(20-40mL)을 세포 유리(Cell-free) DNA 튜브에 수집한다. 20분 동안 2,000g, 이어서 30분 동안 3,220g의 이중 원심 분리 프로토콜을 통해 각 샘플에서 최소한 7mL의 혈장을 분리하여 첫 번째 스핀 후 상층액을 옮긴다. QIAGEN QIAmp® 순환 핵산(Circulating Nuclei Acid) 키트를 사용하여 7-20mL 혈장에서 cfDNA를 분리하고 45μL TE 완충액에서 용출한다. 순수한 모체 게놈 DNA를 첫 번째 원심 분리 후 수득한 버피 코트(buffy coat)에서 분리한다.
프로브-프로브 상호작용 가능성을 최소화한 프로브를 선택하기 위해 분석의 열역학적 모델링과 이전에 기술된 증폭 접근법(Stiller 등, Genome Res. 19(10):1843-1848, 2009)을 결합하여 11,000가지 분석을 다중화할 수 있다. 모체 cfDNA 및 모체 게놈 DNA 샘플은 11,000가지 표적 특이적 분석을 사용하여 15주기 동안 사전 증폭하고 부분 표본(aliquot)은 네스티드 프라이머(nested primer)를 사용하여 15주기의 두 번째 PCR 반응으로 전송된다. PCR의 세 번째 12주기 라운드에서 바코드 태그를 추가하여 시퀀싱을 위해 샘플을 준비한다. 이어서, 앰플리콘(amplicon)을 Illumina HiSeq 시퀀서를 사용하여 시퀀싱한다. 게놈 서열 정렬은 상용 소프트웨어를 사용하여 수행한다.
실시예 10: 아데노바이러스(AAV) 트랜스-스플라이싱 전략
적어도 2개의 상이한 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 사용하여 분자간 연쇄화 및 트랜스-스플라이싱 후에 세포 내에서 활성 CLRN1 유전자(예를 들어, 전장 CLRN1 유전자)를 재구성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 전체가 포함된 Yan 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:12; 6716-6721, 2000 참조.
일부 예에서, 2개의 상이한 핵산 벡터가 사용될 것이다. 제1 핵산 벡터는 프로모터(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 프로모터), 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 제1 코딩 서열(예를 들어, 임의의 크기의 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 일부 및/또는 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 임의의 N-말단 부분) 및 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열을 포함할 수 있다. 제2 핵산 벡터는 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분(즉, N-말단 부분에 포함되지 않은 CLRN1 단백질의 전체 부분)(예를 들어, 임의의 크기의 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 일부 및/또는 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 임의의 C-말단 부분)을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단의 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 폴리아데닐화 서열)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이(예를 들어, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산 길이)이고, 암호화된 부분 각각의 아미노산 서열은 다른 암호화된 부분의 서열과 중첩되지 않으며, 상기 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하지 않는다. 포유동물 세포(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 포유동물 세포)에 도입되면 스플라이스 공여체 서열과 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하는 재조합 핵산을 형성한다.
다른 예에서, 3개의 상이한 핵산 벡터가 사용될 수 있다. 제1 핵산 벡터는 프로모터 서열의 일부(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 프로모터 서열), 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 제1 부분을 암호화하는 CLRN1 유전자의 제1 코딩 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 CLRN1 코딩 서열) 및 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 제1 스플라이스 공여체 서열을 포함할 수 있다. 제2 핵산 벡터는 제1 스플라이스 수용체 서열, 상기 제1 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 제2 부분을 암호화하는 CLRN1 유전자의 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 제2 스플라이스 공여체 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 스플라이스 공여체 서열)을 포함할 수 있다. 제2 핵산 벡터의 특징은 자가-스플라이싱이 일어날 수 없다는 것이다(즉, 제2 핵산 벡터의 제2 스플라이스 공여체 서열과 제1 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하지 않을 것임). 일부 실시양태에서, 제1 핵산 벡터의 스플라이스 공여체 서열 및 제2 핵산 벡터의 제2 스플라이스 공여체 서열(예를 들어, 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 스플라이스 공여체 서열)은 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 벡터의 제1 스플라이스 공여체 서열 및 제2 핵산 벡터의 제2 스플라이스 공여체 서열(예를 들어, 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 스플라이스 공여체 서열)은 상이하다. 제3 핵산 벡터는 제2 스플라이스 수용체 서열, 상기 제2 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 제3 부분을 암호화하는 CLRN1 유전자의 제3 코딩 서열 및 상기 제3 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 폴리아데닐화 서열)을 포함할 것이다. 3개의 핵산 벡터가 사용되는 이러한 방법에서, 제1 스플라이스 공여체 서열과 제1 스플라이스 수용체 서열은 함께 조립(재조합)될 수 있고 제2 스플라이스 공여체 서열과 제2 스플라이스 수용체 서열은 함께 조립(재조합)될 수 있으며, 제1, 제2 및 제3 코딩 서열에 의해 암호화되는 CLRN1 단백질 부분은 중첩되지 않으며, 포유동물 세포(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 포유동물 세포)로 도입되면, 제1 스플라이스 공여체 서열과 제1 스플라이스 수용체 서열 사이 및 제2 스플라이스 공여체 서열과 제2 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하는 재조합 핵산을 형성한다. 위에 제공된 전략에 기초하여, 당해 분야의 숙련가는 4개, 5개 또는 6개의 상이한 핵산 벡터를 사용하여 전략을 개발하는 방법을 이해할 것이다.
이들 방법의 임의의 예에서, 암호화된 부분의 아미노산 서열 중 어느 것도 다른 암호화된 부분과 중첩되지 않으며, 단일 벡터는 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하지 않는다.
상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산(예를 들어, 약 30개의 아미노산 내지 약 1200개의 아미노산, 또는 본원에 기술된 이 범위의 임의의 다른 하위 범위)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 코딩 서열 각각은 서열 번호 9의 적어도 하나의 엑손 및 적어도 하나의 인트론(예를 들어, 적어도 2개의 엑손 및 적어도 하나의 인트론, 적어도 2개의 엑손 및 적어도 2개의 인트론. 적어도 3개의 엑손 및 적어도 하나의 인트론, 적어도 3개의 엑손 및 적어도 2개의 인트론, 또는 적어도 3개의 엑손 및 적어도 3개의 인트론)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 중첩되지 않도록 서열 번호 1의 아미노산 서열의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 1의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60% 또는 최대 70%)를 암호화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 다른 것과 중첩되지 않는 한, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 3의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60% 또는 최대 70%)를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 다른 것과 중첩되지 않는 한, 서열 번호 5의 아미노산 서열의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 5의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60% 또는 최대 70%)를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 다른 것과 중첩되지 않는 한, 서열 번호 7의 아미노산 서열의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 7의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60% 또는 최대 70%)를 암호화한다.
상기 적어도 2개의 핵산 벡터 각각은 헤드-투-테일(head-to-tail) 재조합이 가능하도록 역말단 반복서열(ITR)을 추가로 포함할 수 있다. ITR은 이후 스플라이싱을 통해 제거된다. 예를 들어, ITR은 전체 내용이 본원에 포함된 Yan 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97(12):6716-6721, 2000에 기술된 바와 같은 회문구조(palindromic) 이중-D ITR, 또는 Gosh 등, Mol. Ther. 16:124-130, 2008, 및 Gosh 등, Human Gene Ther. 22:77-83, 2011에 기술된 바와 같은 AAV 혈청형-2 ITR일 수 있다. 스플라이스 수용체 및/또는 공여체 서열의 비제한적인 예는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Reich 등, Human Gene Ther. 14(1):37-44, 2003, 및 Lai 등, (2005) Nat. Biotechnol. 23(11):1435-1439, 2005, 2005 참조. 스플라이스 공여체 및 수용체 서열은 유전자(예를 들어, CLRN1 유전자)의 임의의 내인성 인트론 스플라이스 공여체/수용체 서열일 수 있다. 예를 들어, 스플라이스 공여체 서열은 5'-GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCT-3'(서열 번호 22)일 수 있고, 스플라이스 수용체 서열은 5'-GATAGGCACCTATTGGTCTTACTG ACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG-3'(서열 번호 23)일 수 있다(예를 들어, Trapani 등, EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014 참조). 스플라이싱 및 스플라이싱 효율을 평가하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, Lai 등, Nat. Biotechnol. 23(11):1435-1439, 2005 참조).
실시예 11 : 알칼리성 포스파타제(AP) 고도 재조합 생성 외인성 유전자 영역을 사용한 하이브리드 벡터 트랜스-스플라이싱 전략
적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 상이한 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터)는 또한 분자간 연쇄화, 마커 유전자 매개 재조합 및 트랜스-스플라이싱 후 세포 내에서 활성 CLRN1 유전자(예를 들어, 전장 CLRN1 유전자)를 재구성하기 위해 본원에 기술된 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 이 전략은 상동성 재조합 및/또는 트랜스-스플라이싱을 포함하므로 하이브리드 전략이다. 예를 들어, 각각 전체가 본원에 포함된 Gosh 등, Mol. Ther. 16:124-130, 2008; Gosh 등, Human Gene Ther. 22:77-83, 2011; 및 Duan 등, Mol. Ther. 4:383-391, 2001 참조. 본원에서 사용된 바와 같이, 검출 가능한 마커 유전자는 코딩 서열 독립적 재조합을 허용할 고도 재조합 생성 DNA 서열일 수 있다. 검출 가능한 마커 유전자의 비제한적인 예는 알칼리성 포스파타제(AP) 유전자이다. 예를 들어, 검출 가능한 마커 유전자는 길이가 872bp인 인간 태반 AP 상보성 DNA의 중간 1/3일 수 있다(예를 들어, Gosh 등, 2008 참조). 적어도 2개의 상이한 핵산 벡터는 검출 가능한 마커 유전자(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 검출 가능한 마커 유전자)를 함유할 것이다. 하이브리드 벡터는 실시예 10에서 기술한 바와 같이 트랜스-스플라이싱 벡터를 기반으로 구축되므로, ITR 매개 재조합 및 트랜스-스플라이싱 또는 검출 가능한 마커 유전자 매개(예를 들어, AP 유전자 매개) 재조합 및 트랜스-스플라이싱을 사용하여 활성 CLRN1 유전자(예를 들어, 전장 CLRN1 유전자)를 재구성할 수 있다. 트랜스-스플라이싱 후, 활성 CLRN1 유전자(예를 들어, 전장 CLRN1 유전자)는 포유동물 세포(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 포유동물 세포)의 게놈 DNA에서 재구성될 것이다.
일례에서, 2개의 상이한 핵산 벡터가 사용될 것이다. 제1 핵산 벡터는 프로모터(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 프로모터), 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분(예를 들어, 임의의 크기의 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 일부 및/또는 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 임의의 N-말단 부분)을 암호화하는 제1 코딩 서열, 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열 및 상기 스플라이스 공여체 서열의 3'에 위치한 제1 검출 가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 제2 핵산 벡터는 제2 검출 가능 마커 유전자, 상기 제2 검출 가능 마커 유전자의 3'에 위치한 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분(예를 들어, 임의의 크기의 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 일부 및/또는 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 임의의 C-말단 부분)을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단에 있는 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 폴리아데닐화 서열)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이(예를 들어, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산 길이)이고, 상기 암호화된 부분의 아미노산 서열은 중첩되지 않으며, 상기 2개의 다른 벡터의 단일 벡터는 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하지 않는다. 포유동물 세포(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 포유동물 세포)에 도입되면, 스플라이스 공여체 서열과 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하는 재조합 핵산을 형성한다.
다른 예에서, 3개의 상이한 핵산 벡터가 사용될 수 있다. 제1 핵산 벡터는 프로모터 서열의 일부(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 프로모터 서열), 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 제1 부분을 암호화하는 CLRN1 유전자의 제1 코딩 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 CLRN1 코딩 서열), 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 제1 스플라이스 공여체 서열 및 제1 검출 가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 제2 핵산 벡터는 제2 검출 가능 마커 유전자, 상기 제2 검출 가능 마커 유전자의 3'에 위치한 제1 스플라이스 수용체 서열, 상기 제1 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 제2 부분을 암호화하는 CLRN1 유전자의 제2 코딩 서열, 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 제2 스플라이스 공여체 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 스플라이스 공여체 서열) 및 제3 검출 가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 제2 핵산 벡터의 특징은 자가-스플라이싱이 일어날 수 없다는 것이다(즉, 제2 핵산 벡터의 제2 스플라이스 공여체 서열과 제1 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하지 않을 것임). 일부 실시양태에서, 제1 핵산 벡터의 스플라이스 공여체 서열 및 제2 핵산 벡터의 제2 스플라이스 공여체 서열(예를 들어, 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 스플라이스 공여체 서열)은 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 벡터의 제1 스플라이스 공여체 서열 및 제2 핵산 벡터의 제2 스플라이스 공여체 서열(예를 들어, 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 스플라이스 공여체 서열)은 상이하다. 제3 핵산 벡터는 제4 검출 가능 마커 유전자, 상기 제4 검출 가능 마커 유전자의 3'에 위치한 제2 스플라이스 수용체 서열, 상기 제2 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 제3 부분을 암호화하는 CLRN1 유전자의 제3 코딩 서열 및 상기 제3 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 폴리아데닐화 서열)을 포함할 수 있다. 3개의 핵산 벡터가 사용되는 이러한 방법에서, 제1 스플라이스 공여체 서열과 제1 스플라이스 수용체 서열은 함께 조립(재조합)될 수 있고 제2 스플라이스 공여체 서열과 제2 스플라이스 수용체 서열은 함께 조립(재조합)될 수 있으며, 제1, 제2 및 제3 코딩 서열에 의해 코딩되는 CLRN1 단백질의 부분은 서로 중첩되지 않으며, 포유동물 세포(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 포유동물 세포)로 도입되면, 제1 스플라이스 공여체 서열과 제1 스플라이스 수용체 서열 사이 및 제2 스플라이스 공여체 서열과 제2 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하는 재조합 핵산을 형성한다. 당해 분야에서 인식할 수 있는 바와 같이, 3개의 핵산 벡터가 사용되는 경우, 적어도 2개의 상이한 핵산 벡터 중 2개는 검출 가능한 마커 유전자(예를 들어, AP 마커 유전자)를 포함하고 적어도 2개의 상이한 핵산 중 하나는 검출 가능한 마커 유전자를 포함하는 핵산 벡터에서 스플라이스 공여체 서열에 상보적인 스플라이스 수용체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 검출 가능한 마커 유전자(예를 들어, AP 마커 유전자)를 포함할 수 있고, 제3 핵산 벡터는 제2 핵산 벡터에서 스플라이스 공여체 서열에 상보적인 스플라이스 수용체 서열을 포함할 것이고, 제3 핵산 벡터는 검출 가능한 마커 유전자(예를 들어, AP 마커 유전자)를 포함하지 않을 것이다. 다른 예에서, 제2 및 제3 핵산 벡터는 검출 가능한 마커 유전자(예를 들어, AP 마커 유전자)를 포함할 수 있고, 제1 핵산 벡터는 제2 핵산에서 스플라이스 수용체 서열에 상보적인 스플라이스 공여체 서열을 포함할 것이고, 제1 핵산 벡터는 검출 가능한 마커 유전자(예를 들어, AP 마커 유전자)를 포함하지 않을 것이다.
위에 제공된 전략에 기초하여, 당업자는 4개, 5개 또는 6개의 벡터를 사용하여 전략을 개발하는 방법을 이해할 것이다.
상기 적어도 2개의 핵산 벡터(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)에 제공된 CLRN1 코딩 서열은 중첩되지 않을 것이다. 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함할 수 있으며, 암호화된 부분 각각은, 예를 들어, 적어도 30개의 아미노산(예를 들어, 약 30개의 아미노산 내지 약 1600개의 아미노산, 또는 본원에 기술된 이 범위의 다른 하위 범위 중 임의의 것)이다.
일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은 서열 번호 9의 적어도 하나의 엑손 및 적어도 하나의 인트론(예를 들어, 적어도 2개의 엑손 및 적어도 하나의 인트론, 적어도 2개의 엑손 및 적어도 2개의 인트론, 적어도 3개의 엑손 적어도 하나의 인트론, 적어도 3개의 엑손 및 적어도 2개의 인트론, 또는 적어도 3개의 엑손 및 적어도 3개의 인트론)을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 다른 임의의 것과 중첩되지 않는 한, 서열 번호 1의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 1의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%)를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 다른 임의의 것과 중첩되지 않는 한, 서열 번호 3의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 3의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%)를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 상기 2개 이상의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 다른 임의의 것과 중첩되지 않는 한, 서열 번호 5의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 5의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%)를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 상기 2개 이상의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 다른 임의의 것과 중첩되지 않는 한, 서열 번호 7의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 7의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 7의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%)를 암호화한다.
실시예 10에 기술된 바와 같이, 상기 적어도 2개의 핵산 벡터 각각은 헤드-투-테일 재조합이 가능하도록 역말단 반복서열(ITR)을 추가로 포함할 수 있다. ITR은 이후 스플라이싱을 통해 제거된다. ITR 및 스플라이스 수용체 서열 및/또는 스플라이스 공여체 서열의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며 실시예 10에 기술되어 있다.
실시예 12: F1 파지 고도 재조합 생성 외인성 유전자 영역(AK)을 사용한 하이브리드 벡터 트랜스-스플라이싱 전략
적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 상이한 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터)는 또한 분자간 연쇄화, 마커 유전자 매개 재조합 및 트랜스-스플라이싱 후 세포 내에서 활성 CLRN1 유전자(예를 들어, 전장 CLRN1 유전자)를 재구성하기 위해 본원에 기술된 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 이 전략은 상동성 재조합 및/또는 트랜스-스플라이싱을 포함하므로 하이브리드 전략이다. 예를 들어, 전체가 본원에 포함된 Trapani 등, EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014 참조. 본원에서 사용된 바와 같이, F1 파지 재조합 생성 영역(AK)은 코딩 서열 독립적 재조합을 허용하기 위해 사용될 것이다. F1 파지 재조합 생성 영역은 Trapani 등(2014)에 기술된 바와 같이 F1 파지 게놈으로부터의 77bp 재조합 생성 영역일 수 있다. 적어도 2개의 상이한 핵산 벡터는 F1 파지 재조합 생성 영역을 포함할 것이다. 하이브리드 벡터는 실시예 10에 기술된 바와 같이 트랜스-스플라이싱 벡터를 기반으로 구축되므로 F1 파지 재조합 생성 영역 유도된 재조합 및 트랜스-스플라이싱을 이용하여 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하는 핵산을 생성할 수 있다. 트랜스-스플라이싱 후, 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하는 핵산이 포유동물 세포(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 포유동물 세포)에서 생성될 것이다.
일례에서, 2개의 다른 핵산 벡터가 사용될 것이다. 제1 핵산 벡터는 프로모터(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 프로모터), 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분(예를 들어, 임의의 크기의 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 일부 및/또는 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 임의의 N-말단 부분)을 암호화하는 제1 코딩 서열, 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열 및 상기 스플라이스 공여체 서열의 3'에 위치한 F1 파지 재조합 생성 영역을 포함할 수 있다. 제2 핵산 벡터는 F1 파지 재조합 생성 영역, 상기 F1 파지 재조합 생성 영역의 3'에 위치한 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분(임의의 크기의 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 일부 및/또는 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 임의의 C-말단 부분)을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단에 있는 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 폴리아데닐화 서열)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암호화된 부분 각각은 길이가 적어도 30개의 아미노산 잔기(예를 들어, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산 길이)이고, 암호화된 부분 각각의 아미노산 서열은 중첩되지 않으며, 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하지 않는다. 포유동물 세포(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 포유동물 세포)에 도입되면, 스플라이스 공여체 서열과 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하는 재조합 핵산을 형성한다.
다른 예에서, 3개의 상이한 핵산 벡터가 사용될 것이다. 제1 핵산 벡터는 프로모터 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 프로모터 서열), 상기 프로모터의 5'에 위치한 CLRN1 단백질의 제1 부분을 암호화하는 제1 코딩 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 CLRN1 코딩 서열), 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 제1 스플라이스 공여체 서열 및 F1 파지 재조합 생성 영역을 포함할 수 있다. 제2 핵산 벡터는 F1 파지 재조합 생성 영역, 상기 F1 파지 재조합 생성 영역의 3'에 위치한 제1 스플라이스 수용체 서열, 상기 제1 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 제2 부분을 암호화하는 제2 코딩 서열, 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 제2 스플라이스 공여체 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 스플라이스 공여체 서열) 및 F1 파지 재조합 형성 영역을 포함할 수 있다. 제2 핵산 벡터의 특징은 자가-스플라이싱이 일어날 수 없다는 것이다(즉, 제2 스플라이스 공여체 서열과 제2 핵산 벡터의 제1 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하지 않을 것임). 일부 실시양태에서, 제1 핵산 벡터의 스플라이스 공여체 서열 및 제2 핵산 벡터의 제2 스플라이스 공여체 서열(예를 들어, 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 스플라이스 공여체 서열)은 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 벡터의 제1 스플라이스 공여체 서열 및 제2 핵산 벡터의 제2 스플라이스 공여체 서열(예를 들어, 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 임의의 스플라이스 공여체 서열)은 상이하다. 제3 핵산 벡터는 F1 파지 재조합 생성 영역, 상기 F1 파지 재조합 생성 영역의 3'에 위치한 제2 스플라이스 수용체 서열, 상기 제2 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 제3 부분을 암호화하는 제3 코딩 서열 및 상기 제3 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 폴리아데닐화 서열)을 포함할 수 있다. 3개의 핵산 벡터가 사용되는 이러한 방법에서, 제1 스플라이스 공여체 서열과 제1 스플라이스 수용체 서열은 함께 조립(재조합)될 수 있고 제2 스플라이스 공여체 서열과 제2 스플라이스 수용체 서열은 함께 조립(재조합)될 수 있으며, 제1, 제2 및 제3 코딩 서열에 의해 암호화된 CLRN1 단백질 부분은 중첩되지 않으며, 포유동물 세포(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 포유동물 세포)로 도입되면, 제1 스플라이스 공여체 서열과 제1 스플라이스 수용체 사이 및 제2 스플라이스 공여체 서열과 제2 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하는 재조합 핵산을 형성한다. 3개의 핵산 벡터가 사용될 때 당해 분야에서 인식될 수 있는 바와 같이, 상이한 핵산 벡터 중 2개는 F1 파지 재조합 생성 영역을 포함할 수 있고, 상이한 핵산 벡터 중 하나는 F1 파지 재조합 생성 영역을 포함하는 핵산 벡터에서 스플라이스 공여체 서열에 상보적인 스플라이스 수용체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 핵산 벡터는 F1 파지 재조합 생성 영역을 포함할 수 있고, 제3 핵산 벡터는 제2 핵산 벡터에서 스플라이스 공여체 서열에 상보적인 스플라이스 수용체 서열을 포함할 것이며, 제3 핵산 벡터는 F1 파지 재조합 생성 영역(예를 들어, AP 마커 유전자)을 포함하지 않을 것이다. 다른 예에서, 제2 및 제3 핵산 벡터는 F1 파지 재조합 생성 영역을 포함할 수 있고, 제1 핵산 벡터는 제2 핵산 벡터에서 스플라이스 수용체 서열에 상보적인 스플라이스 공여체 서열을 포함할 것이고 제1 핵산 벡터는 F1 파지 재조합 생성 영역을 포함하지 않을 것이다. 위에 제공된 전략에 근거하여, 당해 분야의 숙련가는 4개, 5개 또는 6개의 벡터를 사용하여 전략을 개발하는 방법을 이해할 것이다.
적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 핵산 벡터 각각에 제공된 CLRN1 코딩 서열은 중첩되지 않을 것이다. 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산(예를 들어, 약 30개의 아미노산 내지 약 1600개의 아미노산, 또는 본원에 기술된 이 범위의 하위 범위)이다.
일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은 서열 번호 9의 적어도 하나의 엑손 및 적어도 하나의 인트론(예를 들어, 적어도 2개의 엑손 및 적어도 하나의 인트론, 적어도 2개의 엑손 및 적어도 2개의 인트론, 적어도 3개의 엑손 및 적어도 하나의 인트론, 적어도 3개의 엑손 및 적어도 2개의 인트론, 또는 적어도 3개의 엑손 및 적어도 3개의 인트론)을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 중첩되지 않는 한, 서열 번호 1의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 1의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60% 또는 최대 70%)를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 중첩되지 않는 한, 서열 번호 3의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 3의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60% 또는 최대 70%)를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 중첩되지 않는 한, 서열 번호 5의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 5의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60% 또는 최대 70%)를 암호화한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 중첩되지 않는 한, 서열 번호 7의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 7의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60% 또는 최대 70%)를 암호화한다.
실시예 10에 기술된 바와 같이, 상기 적어도 2개의 핵산 벡터 각각은 헤드-투-테일 재조합이 가능하도록 역말단 반복서열(ITR)을 추가로 포함할 수 있다. ITR은 이후 스플라이싱을 통해 제거된다. ITR 및 스플라이스 수용체 서열 및/또는 스플라이스 공여체 서열의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며 실시예 10에 기술되어 있다.
실시예 13. 2개의 CLRN1 아이소폼을 사용한 하이브리드 벡터 트랜스-스플라이싱 전략
적어도 2개의 상이한 핵산 벡터(예를 들어, AAV 벡터)를 사용하여 분자간 연쇄화 및 트랜스-스플라이싱 후에 세포 내에서 활성 CLRN1 유전자(예를 들어, 전장 CLRN1 유전자)를 재구성할 수 있다. 예를 들어, 전체가 본원에 포함된 Yan 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:12; 6716-6721, 2000 참조.
일부 예에서, 2개의 상이한 핵산 벡터가 사용될 것이다. 제1 핵산 벡터는 프로모터(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 프로모터), 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분(예를 들어, 임의의 크기의 본원에 기재된 CLRN1 단백질의 일부 및/또는 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 임의의 N-말단 부분)을 암호화하는 제1 코딩 서열 및 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열을 포함할 수 있다.
제2 핵산 벡터는 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분(예를 들어, N-말단 부분에 포함되지 않는 CLRN1 단백질의 전체 부분)(예를 들어, 임의의 크기의 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 일부 및/또는 본원에 기술된 CLRN1 단백질의 임의의 C-말단 부분)을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 폴리아데닐화 서열)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이(예를 들어, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 75개의 아미노산 또는 적어도 100개의 아미노산 길이)이고, 2개의 암호화된 부분의 아미노산 서열은 서로 중첩되지 않고; 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼(예를 들어, 서열 번호 3)의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 임의의 다른 것과 중첩되지 않는 한, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 3의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60% 또는 최대 70%)를 암호화한다.
일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 핵산 벡터 중 하나는 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼(예를 들어, 서열 번호 5)을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은, 암호화된 부분 각각이 임의의 다른 것과 중첩되지 않는 한, 서열 번호 5의 아미노산 서열의 최대 80%(예를 들어, 서열 번호 5의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60% 또는 최대 70%)를 암호화한다.
일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 2개의 상이한 핵산 벡터 중 하나는 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다.
포유동물 세포(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 포유동물 세포)에 도입되면, 스플라이스 공여체 서열과 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 활성 CLRN1 단백질(예를 들어, 전장 CLRN1 단백질)을 암호화하는 재조합 핵산을 형성한다.
이러한 벡터의 비제한적인 예는 도 1, 2, 4, 7-10 및 12-24에 도시되어 있다.
실시예 14. HEK293FT 세포에서의 CLRN1 발현
HEK293FT 세포를 예시적인 CLRN 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후 HEK293FT 세포 용해물을 제조하고 CLRN1 단백질 발현을 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다. 도 25 내지 31에서 볼 수 있듯이, 모든 검사 샘플에서 CLRN1 단백질이 검출되었다. 이 결과로 CLRN1 단백질이 본원에 기술된 예시적인 CLRN1 벡터에 의해 발현될 수 있음을 확인하였다.
도 32는 CLRN1-6eGFP 벡터로 형질감염된 HEK293FT 세포가 형질감염 72시간 후 바로 높은 수준의 GFP를 발현함을 보여 주었다. 형질감염 24시간 후, MOI 8.41E+04 및 2.53E+05에서 CLRN1-e6GFP 벡터로 형질감염한 후 소수의 HEK293FT 세포가 GFP를 발현하였다. 형질감염 72시간 후, MOI 2.53E+05에서 CLRN1-e6GFP 벡터로 형질감염된 대부분의 HEK293FT 세포는 GFP를 발현한 반면, MOI 8.41E+04에서 CLRN1-e6GFP 벡터로 형질감염된 일부 HEK293FT 세포는 GFP를 발현하였다. 도 33에 나타낸 바와 같이, CLRN1은 CLRN-0 벡터, CLRN-3 벡터 및 CLRN-13 벡터로 형질감염된 HEK293FT 세포에서 높은 수준으로 발현되었다.
실시예 15. CLRN1 발현 P2 달팽이관 마우스 외식편
WT 마우스로부터의 P2 달팽이관 외식편을 플레이팅 16시간 후에 감염시키고 감염 72시간 후에 RNA 및 면역 형광을 위해 수확하였다. 도 34에서 볼 수 있듯이, CLRN1은 달팽이관 외식편에서 효율적으로 발현되었다. 도 35에서 볼 수 있듯이, P2 달팽이관 외식편의 외유모세포(OHC)와 내유모세포(IHC)는 CLRN-0 벡터(1.3E10 VG/달팽이관), CLRN-3(9.9E09 VG/달팽이관) 및 CLRN-13(1.0E10 VG/달팽이관)으로 형질감염되었을 때 Myo7a를 발현한다. 두 벡터를 사용한 형질감염은 달팽이관의 OHC 또는 IHC의 구조적 무결성을 방해하지 않았다. 따라서, 도 35는 생존 가능하고 조직화된 외유모세포(OHC), 내유모세포(IHC) 및 입체 섬모 다발을 갖는 CLRN1 구성체의 독성 결여를 보여준다. 도 36에 나타낸 바와 같이, CLRN1-3'UTR을 사용한 eGFP 발현은 CAG 프로모터 단독에 비해 형질도입을 특정하는 것으로 나타났다. 1E09 AAV/Anc80.CAG.eGFP로 감염된 달팽이관 외식편은 내유모세포에서 Myo7a를 발현하였다. 1E09 AAV/Anc80.CAG.eGFP.CLRN-3’UTR에 감염된 달팽이관 외식편은 OHC와 IHC 모두에서 My07a를 발현하였다. AAV/Anc80.CAG.eGFP.CLRN-3'UTR에 감염된 달팽이관 외식편의 OHC에서 CLRN1의 더 높은 형질도입 및 공동 발현이 관찰되었다. AAV/Anc80.CAG.eGFP.CLRN-3’UTR로 감염된 달팽이관 외식편에서 GFP 발현은 OHC로 제한되었다.
기타 실시양태
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구항의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이며 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 다른 측면, 장점 및 수정은 다음의 청구항의 범위 내에 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충되는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 섹션 제목과 자료, 방법 및 예에 대한 기술은 설명을 위한 것일 뿐 제한하려는 의도가 아니다.
서열 목록
서열 번호 1 - 인간 전장 야생형 CLRN1 단백질 아이소폼 D
Figure pct00036
서열 번호 2 - 인간 야생형 CLRN1 아이소폼 D cDNA
Figure pct00037
서열 번호 3 - 인간 전장 야생형 CLRN1 단백질 아이소폼 A
Figure pct00038
서열 번호 4 - 인간 야생형 CLRN1 아이소폼 A cDNA
Figure pct00039
서열 번호 5 - 인간 전장 야생형 CLRN1 단백질 아이소폼 C
Figure pct00040
서열 번호 6 - 인간 야생형 CLRN1 아이소폼 C cDNA
Figure pct00041
서열 번호 7 - 인간 전장 야생형 CLRN1 단백질 아이소폼 E
Figure pct00042
서열 번호 8 - 인간 야생형 CLRN1 아이소폼 E cDNA
Figure pct00043
서열 번호 9 - 인간 야생형 CLRN1 게놈 서열
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
서열 번호 10 - 마우스 CLRN1 단백질 아이소폼 1
Figure pct00065
서열 번호 11 - 개 CLRN1 단백질
Figure pct00066
서열 번호 12 - 5' UTR
Figure pct00067
서열 번호 13 - 5' ITR
Figure pct00068
서열 번호 14 - 3' ITR
Figure pct00069
서열 번호 15 - 3' UTR
Figure pct00070
서열 번호 16 - 키메릭 인트론
Figure pct00071
서열 번호 17 - CMV 인핸서
Figure pct00072
서열 번호 18 - CBA 프로모터
Figure pct00073
서열 번호 19 - tGFP
Figure pct00074
서열 번호 20 - 소 성장 호르몬 폴리-A
Figure pct00075
서열 번호 21 - 가용성 뉴로필린-1의 폴리아데닐화 신호
Figure pct00076
서열 번호 22 - 스플라이스 공여체 서열
Figure pct00077
서열 번호 23 - 스플라이스 수용체 서열
Figure pct00078
서열 번호 24 - 3'ITR
Figure pct00079
서열 번호 25 - ITR
Figure pct00080
서열 번호 26 - sh-키메릭 인트론
Figure pct00081
서열 번호 27 - 3'UTR 600A
Figure pct00082
서열 번호 28 - 3'UTR 600B
Figure pct00083
서열 번호 29 - 3'UTR 600C
Figure pct00084
서열 번호 30 - FP
Figure pct00085
서열 번호 31 - T2A
Figure pct00086
서열 번호 32 - eGFP
Figure pct00087
서열 번호 33 - Myc
Figure pct00088
서열 번호 34 - HA
Figure pct00089
서열 번호 35 - 3x FLAG 태그
Figure pct00090
서열 번호 36 - 3'UTR 1357
Figure pct00091
서열 번호 37 - 3'UTR 1406
Figure pct00092
서열 번호 38 - CLRN-1 항체 에피토프
Figure pct00093
서열 번호 39 - CLRN-0
Figure pct00094
Figure pct00095
서열 번호 40 - CLRN-1
Figure pct00096
Figure pct00097
서열 번호 41 - CLRN-2eGFP
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
서열 번호 42 - CLRN-3
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
서열 번호 43 - CLRN-4
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
서열 번호 44 - CLRN-6eGFP
Figure pct00107
Figure pct00108
서열 번호 45 - CLRN-7eGFP
Figure pct00109
Figure pct00110
서열 번호 46 - CLRN-8
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
서열 번호 47 - CLRN-9
Figure pct00114
Figure pct00115
서열 번호 48 - CLRN-10
Figure pct00116
Figure pct00117
서열 번호 49 - CLRN-10myc
Figure pct00118
Figure pct00119
서열 번호 50 - CLRN-10NF
Figure pct00120
Figure pct00121
서열 번호 51 - CLRN-11
Figure pct00122
Figure pct00123
Figure pct00124
서열 번호 52 - CLRN-11myc
Figure pct00125
Figure pct00126
Figure pct00127
서열 번호 53 - CLRN-11NF
Figure pct00128
Figure pct00129
Figure pct00130
서열 번호 54 - CLRN-12
Figure pct00131
Figure pct00132
Figure pct00133
서열 번호 55 - CLRN-13
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
서열 번호 56 - CLRN-14
Figure pct00137
Figure pct00138
Figure pct00139
서열 번호 57 - CLRN-15
Figure pct00140
Figure pct00141
서열 번호 58 - CLRN-16
Figure pct00142
Figure pct00143
서열 번호 59 - CLRN-17
Figure pct00144
서열 번호 60 - CLRN-18
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
SEQUENCE LISTING <110> Akouos Inc. <120> METHODS OF TREATING CLRN1-ASSOCIATED HEARING LOSS AND/OR VISION LOSS <130> 44628-0026WO1 <150> 62/689,660 <151> 2018-06-25 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Ser Gln Gln Lys Lys Ile Ile Phe Cys Met Ala Gly Val Phe 1 5 10 15 Ser Phe Ala Cys Ala Leu Gly Val Val Thr Ala Leu Gly Thr Pro Leu 20 25 30 Trp Ile Lys Ala Thr Val Leu Cys Lys Thr Gly Ala Leu Leu Val Asn 35 40 45 Ala Ser Gly Gln Glu Leu Asp Lys Phe Met Gly Glu Met Gln Tyr Gly 50 55 60 Leu Phe His Gly Glu Gly Val Arg Gln Cys Gly Leu Gly Ala Arg Pro 65 70 75 80 Phe Arg Phe Ser Phe Phe Pro Asp Leu Leu Lys Ala Ile Pro Val Ser 85 90 95 Ile His Val Asn Val Ile Leu Phe Ser Ala Ile Leu Ile Val Leu Thr 100 105 110 Met Val Gly Thr Ala Phe Phe Met Tyr Asn Ala Phe Gly Lys Pro Phe 115 120 125 Glu Thr Leu His Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Leu Leu Ser Phe Ile Ser 130 135 140 Val Ala Leu Trp Leu Pro Ala Thr Arg His Gln Ala Gln Gly Ser Cys 145 150 155 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accaggctca aggctcctgt 480 ggctgtcttg tcatgatatt gtttgcctct gaagtgaaaa tccatcacct ctcagaaaaa 540 attgcaaatt ataaagaagg gacttatgtc tacaaaacgc aaagtgaaaa atataccacc 600 tcattctggg tcattttctt ttgctttttt gttcattttc tgaatgggct cctaatacga 660 cttgctggat ttcagttccc ttttgcaaaa tctaaagacg cagaaacaac taatgtagct 720 gcagatctaa tgtactga 738 <210> 3 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Pro Ser Gln Gln Lys Lys Ile Ile Phe Cys Met Ala Gly Val Phe 1 5 10 15 Ser Phe Ala Cys Ala Leu Gly Val Val Thr Ala Leu Gly Thr Pro Leu 20 25 30 Trp Ile Lys Ala Thr Val Leu Cys Lys Thr Gly Ala Leu Leu Val Asn 35 40 45 Ala Ser Gly Gln Glu Leu Asp Lys Phe Met Gly Glu Met Gln Tyr Gly 50 55 60 Leu Phe His Gly Glu Gly Val Arg Gln Cys Gly Leu Gly Ala Arg Pro 65 70 75 80 Phe Arg Phe Ser Phe Phe Pro Asp Leu Leu Lys Ala Ile Pro Val Ser 85 90 95 Ile His Val Asn Val Ile Leu Phe Ser Ala Ile Leu Ile Val Leu Thr 100 105 110 Met Val Gly Thr Ala Phe Phe Met Tyr Asn Ala Phe Gly Lys Pro Phe 115 120 125 Glu Thr Leu His Gly 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atccttattg tgttaaccat ggtggggaca gccttcttca tgtacaatgc 540 ttttggaaaa ccttttga 558 <210> 9 <211> 46837 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 aggagatact tgaaggcagt ttgaaagact tgttttacag attcttagtc caaagatttc 60 caattaggga gaagaagcag cagaaaagga gaaaagccaa gtatgagtga tgatgaggcc 120 ttcatctact gacatttaac ctggcgagaa ccgtcgatgg tgaagttgcc ttttcagctg 180 ggagctgtcc gttcagcttc cgtaataaat gcagtcaaag aggcagtccc ttcccattgc 240 tcacaaaggt cttgtttttg aacctcgccc tcacagaagc cgtttctcat catgccaagc 300 caacagaaga aaatcatttt ttgcatggcc ggagtgttca gttttgcatg tgccctcgga 360 gttgtgacag ccttggggac accgttgtgg atcaaagcca ctgtcctctg caaaacggga 420 gctctgctcg tcaatgcctc agggcaggag ctggacaagt ttatgggtga aatgcagtac 480 gggcttttcc acggagaggg tgtgaggcag tgtgggttgg gagcaaggcc ctttcggttc 540 tcatgtaagt agcaattgca tttgagttat ttaatgcttt aggcagactc ttcccagtgt 600 tgcgaggaat tatatttgag aattttgccg tgtttactgc aggacttttt aaatcggtgt 660 gaaccatatg aaaaacctat gactctgagc aatttcttct tcctagtttt tattatttta 720 tacttgcttt ttattataat atagagttaa ttcattgtta cataattaag gtttttggaa 780 atattggcaa ttaagatgct taagtattaa tatttatgta aaaaattatg gagtcttttt 840 aaaaaagtaa acttggggaa ataggaaagc tgtaaagaat gatctttatg ctttttgttc 900 tttataaaaa gaaccaaggt catgggctcc gtatttaacc aggttgccac ctttctcatg 960 attttgtttc ctgctcccca ctccctccca ttattcctgc taagaccttt cctgctgcta 1020 aatattcagt tttcattttt aactaatttg gaatcatttg gctatagaaa tttaaaatga 1080 tctgctgtgc taactgggaa agaaatggat gcctatttag tatagaacat tttaaactga 1140 ttgacctgca aatcatgtag agaatatgag agagattttc ttgttgtgat ttttgtgaaa 1200 tggaagtgta atccacagta tttataacct gtttatctta agaagagaat ttttaaaaat 1260 taccatgtga ataggcaact cattaaatga aaattaatag gaagtcattt gttatatctc 1320 ttacaacaca cattcagaag ttattattat ttcagaaggg ctggtttgga acaaccttat 1380 gaagacacag tcagtaaatt actgcataaa tcactcttca ggaaaggagg ttaccaactg 1440 aagcatttaa aatgaattat tattttgccc aggttttttt tttctttcta gtataggtag 1500 aaggctaaat taattgaatt tattattaac atatgcagtg cctaattaaa tttcagtgct 1560 ggtctattta tatttctgca acattcctta tatcttctta gcagtcattg gacaccaacc 1620 ttcagctcac ataggttact aagtgatatg aattttcata gggctccaga aaatttccaa 1680 gaattggttg ttagcttttt aattgatgaa gtggatacca gttcttttca ctgaatggct 1740 tttattcatt aaggtaatgg ggctgttaga gttgcttagt tttcctgggg aaggggaagg 1800 aagaaaacaa agcagaatgt catgtgatat gcaactgtat taaaaaaccg aaaaggaaaa 1860 aagttgagag agatgattta accgtgagtc accggcagcc aaagcgtgag taaagcttct 1920 cacagatgaa tttagacaaa agcggagaag gtactggtga attttctgga gcctttacat 1980 tttctacagt gaaatggaga taaactttac tcatgccata ggacatgttt caaaacaata 2040 ataagatgtt ttctgaacac ttactacata ctaagcactt tatatgcttt gtctcattta 2100 atccttacac agccacattc ttctggggtt tagcgaatga tttttgtggt tgtgtcctat 2160 gcttgtcctg tctaaggatg aagttgttct aattgggtgc ccctcctttt gctttctgtg 2220 aggacttgca gaactggtgg ggtttaaaca gtaccctcac ttatctcaca gaatttcatt 2280 agctcccaga tacccctgac attctccccc tagcctagtg aagaaaatct tccatttact 2340 tgttcattct gcagtgacag ctccatcaat atacaataga ctatacatat taagtgtact 2400 gtatatacta tacatgttaa aaatctcatt cattttggtg aggcccagct aagaatactt 2460 acagtagagc tttttttttt ttcctaagca taaaagtatc tttttcaatg cagcatgaga 2520 cagagttggg aaaaccaaaa taaatagatc caatggactc cccaaagagg ataatattca 2580 tttaaataaa cacccctctc agtgttaaaa ctttctaatc aacatgcctt tgggacacat 2640 tgcaccctca aagtttacac tcccattgca acgcagcttt gtggttcacg ttttttccat 2700 tcagaatgtc attaccctgt caatgatgtt tcatcaacgt ttgcttggat gagaatcctc 2760 tgatattctt cctgatagaa atgtataagc cctgttcata taaatgaata aaagatctaa 2820 ccttactttc tcagtagtgg cttccttgga gcaaaaagca gggacctcca gagagctcag 2880 gtggatgact cttttctgtt tcttccagag ctcaacttac aattagtgca caattcattt 2940 cccagaatgt cttctttctt attgtgcctt tagaaagtta ttaagcaaac atttgaattc 3000 acagaatctt accagtgtaa gaggaatgga aaaggtaact tatcaaggta acaatcactt 3060 cgtggccagt tttttcggct cactgcaact acccctcctg ggttcaagcg attctcctgc 3120 ctcagcctcc caagtagctg ggactacagg cgtgcaccac catgcccagc taattttttt 3180 tttgtatttt tagtaaagac agggtttcac catgtgggcc aggctggtct catggcaagt 3240 tttctttgtg ttgtcatgtt attatcaatt aataggaatt tatatttcag ttctgttagg 3300 tggataaaca ctattttgca tacctaaatg tttcatttat atcagcactg gccaataaaa 3360 atatactata agcaggccgg gtgcagtggc tcacgcctgt aatcccaact tttgggaggc 3420 caacactttg ggaggacaca gggtcaggag atcgagacca tcctggctaa cctggtgaaa 3480 tcccgtctct actaaaaata caaaaaatta gccgggcgtg gcgggggcgc ctgtagtccc 3540 agctacttgg gaggctgagg caggagaatg gcacgaaccc gggaggtgga gcttgcagtg 3600 agccgagatc tcgccactgc actccagcct tggtgacaga gcaagactct gtctcaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatata tatatatata tatatattac aagccacaag 3720 ccacatatgt acttttaaat gtcctagtag ccatattaga aaacaaaagt aaaaaggaat 3780 agatgaaatt aattttaatg atttttttaa acccaagata tccaaaatat tatcatttta 3840 acatataatt aaaaatttat tgagatgttt tacattgttt ttttttttct tgacgctgtc 3900 ttggaaatct agagtgtatt ttacatttac attacatcta attcagtcta gccacatttc 3960 acatgctcat ttttttgtgt gtggttttat ggagcagaga gtttaatagg caagaaagaa 4020 aagagaaggc agaagaaaat ggctcccctg tacagagacg cgggggtggg gcgctccaaa 4080 gccaaaagag gaggtcccta agtatggtag acaccagcca ggaatatatg cagtgtctgg 4140 aggaggggat gtctgatttg catagggtca catgctcatt tttatggcta ctgtattggt 4200 cagtacagat ttagatgggg atttgctctg aacaagttgg tgattgatgg tgttcatatt 4260 ttaattgaat ttttcctggg ttctgctgta cacttgtatg tgtgttagtt tcatgtgcaa 4320 tgcttgtgtc acttttaaaa cccagatata tggcataaca tgagaatgaa aaatggacca 4380 gaaaaatagt ttggcaatgt agtcatgttt gttcctatta aatgttccct attgaccact 4440 ctatctcttt taattataac aagaatctgc cctgccagca tgcccagtta cgctgggaaa 4500 acttctgcct catttactct ggctgattct catccactta tgggtcagtg gttcattttc 4560 tagaggtcac cagcattcat acctagcata caatttcatt cattataatg aaggaatgtt 4620 ttcccttcaa agagacacaa ctagtgggct taatttttct tgatatgtca cctgtaaaat 4680 tttaatgatg atgtttaaac tctaaatgta gccatcaaga caaaaactgc aaattttgag 4740 cctcagtgtg tgtgggtggg tttctgtttc ggtaatttga aacattgcag aatatcatca 4800 aaatatgata cccaagaatc atatggtatc aatcattcct agatatactg atctattcat 4860 tgccaagata gttcaatgag ctggcaaaaa catatggaat tattttctta aaatgtgaaa 4920 aataaaattt aaccaatcat gtatcacagc ttgcaacttt agtcatactt tgaaaagcat 4980 tttaatttgg acctcatgat tgaaaattta taaaaagctg aacagaaatt agttcacttc 5040 atattttaga aaagcagagt ttctttacta aatgaggcat ttgacccaaa ttggagagaa 5100 aatgttgaaa ctacttctgt gagcaagcag gtggcttctc aaacacatgt tgggatgaaa 5160 tggttgggcc tcagggtctc agtgcctgtc actgagagtt ggcactctct atctccatgg 5220 tctcctccaa gtgtgactct tgtctcttgc tgacctgacc tgccccaagt gactcactgg 5280 tcatgaccct gcacaccttg cgtctctcct atcaccctgc cgatggcaga gctacaaagg 5340 tctttgatgt agctctgtct gatatcctgt gtttccccct atggtctgtg tggaagcagg 5400 tatgggggtg tgtaaagggg aagcctatga agttcatctg caaagactac ctggttaggg 5460 gaggagagga agaagctata tgcaccattt caccagcaag catgggctct tctgcctttt 5520 agcttagggg tcctgttgtc tagtctcact cacctattaa aacagtccag caaatagagg 5580 ttttgtttac ctcccattaa aaaaaaagca attaatggaa tagaagataa taatgtatga 5640 gaagcactat tgtgaaagaa aaaccttcaa cttctctcag ccaaataatt gcttcctcct 5700 ctgtccttcc cagaccttga tgtttgctct attatttcaa aacaactata ttataaatat 5760 ttgagaatgt gtatttccct gcaaggagat cttaatcccc aagaaggcag gagctgtgta 5820 ttattcatcc cagtgctcct tcaaaccagg gcctcagaca gtgcatggcc caaagaggta 5880 cttaataaac gtttggtaaa ctgacactat tgaaattaag caacctggat ttgaggtggg 5940 tctctgccac tcacaagaga ttacgctttg agaaaattcc atcacttcat tgattttcag 6000 ttcttgcatc tgtatatggg agacgatact aggtgatttc tgacatctct caccgtttaa 6060 atgctctgtg atctatacaa cgaggggctc gctgttctag acaagttcct tccagcttta 6120 cagttgcata acccttctaa tcttagtcac atgatgactc cactgacaga tttttggcca 6180 ccatcattag acatgctgag ttacgtgtgc ctttgctctg atcctcaaaa ctcatgattt 6240 ttaaagtttt ctgaaatatc taccatttat caggatccag atggatttca tgaccaaagt 6300 ggatgtttct tttctctccc attacaatct tttacttttt gtgtgggaaa ttgcatgtta 6360 aagaaaggga aattgaagaa tgggatgctt tggaattctg gcaagatgga ttagtgggtt 6420 ccagaaagta ggggcagcca caaataccga aataaatgag atcgtattat tgagaaagca 6480 caaatggaag aaggtcaaaa gcaagaagaa gctgacatcc tgcttcctcc aatttttgct 6540 ttctctgttt ttccaagaaa ctcctcttcc aagccttgct gaaaaactcc actttcctaa 6600 atctaacttc ttaaactgat aatggcaaga agttaggaat gaccaatatg tttaacactc 6660 caagagtatt tgttttgttt tgttttgaga ctgggtctca ctctgtcgtc cagcctggag 6720 tgcagtggtg tgatcacagc tcactgcagc cttgacctct cctgcccaag gaatcctccc 6780 acctcagcct cctgagtaga agggaccaca ggcatgtgcc actacacctg gctaactttt 6840 aaaaaatttt tttgtagaga tggggttgcc caggcaggtc tcaaactgct gggctcaagc 6900 aatcctcctg cattggcctc ccaaagtgct ggaattatgg gcataagcca ctacgcctga 6960 cctctccaag ggcattcttt acccagaaga ggaacttggc agaacttatc ctccaattgg 7020 tgaggaatat ggagaaaatg actttaagca aaggaacttc tggttctgcc tacctaatcc 7080 agaaaaagaa gttttatttc tcccttcccc tagtaactat cttcccatat tcacataaaa 7140 aagtacagaa tcaacattgt tcaagaatta taattttact tgtaagcaca tgtgcacacg 7200 cacacccata taccttcctt ccctttaaat catcccacac cctaatagta gtaaaatcat 7260 tgacccgagc atacctggga gaggaagagg agtctgacag gggcaggttc taagtggcac 7320 tcctggaact taaccctggt gtatatgaac tttacctatt gaaggatgac tcctcaactg 7380 ttctcacaat ttgctgctct gctttctttt ctaatttctg aaggtgactc atcttcccca 7440 aggactttca gacttctcag aagaaaaaaa 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Claims (228)

  1. 적어도 2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서,
    상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하고, 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이이고, 상기 암호화된 부분 각각의 아미노산 서열은 암호화된 부분 중 상이한 부분의 아미노산 서열과 선택적으로 부분적으로 중첩될 수 있고;
    상기 적어도 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 전장 CLRN1 단백질을 암호화하지 않으며;
    상기 코딩 서열 중 적어도 하나는 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손(exon)에 걸쳐 있고 상기 2개의 연속 엑손 사이에 인트론 서열(intronic sequence)이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 그리고
    상기 적어도 2개의 상이한 벡터는 포유동물 세포에 도입되면, 서로 상동성 재조합을 거쳐 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 형성하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼(isoform)의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3을 포함하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3으로 구성되는 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 핵산 벡터 중 하나는 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5를 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5로 구성되는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 상이한 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5를 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5로 구성되는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 핵산 벡터 중 하나가 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3을 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3으로 구성되는 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 중 적어도 하나가 5' 비번역 영역(untranslated region)(UTR), 3' UTR 또는 둘 다를 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  23. 제18항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  24. 제18항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  28. 제18항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  29. 제1항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 플라스미드(plasmid), 트랜스포존(transposon), 코스미드(cosmid), 인공 염색체(artificial chromosome) 또는 바이러스 벡터(viral vector)인 조성물.
  30. 제1항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 인간 인공 염색체(human artificial chromosome)(HAC), 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome)(YAC), 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome)(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(P1-derived artificial chromosome)(PAC)인 조성물.
  31. 제1항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus)(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터(adenovirus vector), 렌티바이러스 벡터(lentivirus vector) 또는 레트로바이러스 벡터(retrovirus vector)로부터 선택된 바이러스 벡터인 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각은 AAV 벡터인 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 암호화된 부분 중 어느 것의 아미노산 서열도 상기 암호화된 부분 중 상이한 부분의 아미노산 서열과 중첩되지 않는 조성물.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 암호화된 부분 각각의 아미노산 서열이 상기 암호화된 부분 중 상이한 부분의 아미노산 서열과 부분적으로 중첩되는 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 중첩되는 아미노산 서열이 약 30개의 아미노산 잔기 내지 약 202개의 아미노산 잔기 길이인 조성물.
  36. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 2개의 상이한 벡터를 포함하고, 이들 각각은 상이한 인트론 세그먼트를 포함하고, 상기 인트론은 CLRN1 게놈 DNA에 존재하는 인트론의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 2개의 상이한 인트론 세그먼트는 적어도 100개의 뉴클레오타이드에 의해 순차적으로 중첩되는 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 2개의 상이한 인트론 세그먼트가 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 800개의 뉴클레오타이드에 의해 순차적으로 중첩되는 조성물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각의 전체 뉴클레오타이드 서열이 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드 길이인 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 벡터 각각의 전체 뉴클레오타이드 서열이 500개의 뉴클레오타이드 내지 5,000개의 뉴클레오타이드 길이인 조성물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 내의 상이한 벡터의 수가 2개인 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 2개의 상이한 벡터 중 제1 벡터가 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 N-말단 부분이 30개의 아미노산 내지 202개의 아미노산 길이인 조성물.
  43. 제41항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 N-말단 부분이 60개의 아미노산 내지 170개의 아미노산 길이인 조성물.
  44. 제41항에 있어서, 상기 제1 벡터가 5' UTR 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  49. 제44항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  50. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터가 프로모터(promoter) 및 코작 서열(Kozak sequence) 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함하는 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 제1 벡터가 유도성 프로모터(inducible promoter), 항시성 프로모터(constitutive promoter) 또는 조직 특이적 프로모터인 프로모터를 포함하는 조성물.
  52. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개의 상이한 벡터 중 제2 벡터가 CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 C-말단 부분이 30개의 아미노산 내지 202개의 아미노산 길이인 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 C-말단 부분이 60개의 아미노산 내지 170개의 아미노산 길이인 조성물.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 벡터가 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 벡터가 3' UTR 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  61. 제56항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  62. 단일 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 벡터는 (i) CLRN1 단백질의 제1 아이소폼을 암호화하는 제1 코딩 서열 및 (ii) CLRN1 단백질의 제2 아이소폼을 암호화하는 제2 코딩 서열 중 하나 또는 둘 다를 포함하고,
    상기 제1 및 제2 코딩 서열 중 하나 또는 둘 다는 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손에 걸쳐 있고 2개의 연속 인트론 사이에 인트론 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 단일 핵산 벡터가 상기 제1 코딩 서열을 함유하고 상기 제2 코딩 서열은 함유하지 않는 조성물.
  64. 제62항에 있어서, 상기 단일 핵산 벡터가 상기 제2 코딩 서열을 함유하고 상기 제1 코딩 서열은 함유하지 않는 조성물.
  65. 제62항에 있어서, 상기 단일 핵산 벡터가 상기 제1 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열 둘 다를 함유하는 조성물.
  66. 제62항, 제63항 및 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3을 포함하는 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3으로 구성되는 조성물.
  69. 제62항, 제64항 및 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5를 포함하는 조성물.
  71. 제70항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5로 구성되는 조성물.
  72. 제62항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 핵산 벡터가 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR 또는 둘 다를 추가로 포함하는 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  74. 제73항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  75. 제74항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  76. 제75항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  77. 제72항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  78. 제72항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  82. 제72항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  83. 제62항에 있어서, 상기 단일 핵산 벡터가 플라스미드, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 벡터인 조성물.
  84. 제62항에 있어서, 상기 단일 핵산 벡터가 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)인 조성물.
  85. 제62항에 있어서, 상기 단일 핵산 벡터가 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터인 조성물.
  86. 제85항에 있어서, 상기 단일 핵산 벡터가 AAV 벡터인 조성물.
  87. 제62항에 있어서, 상기 단일 핵산 벡터가 프로모터 및 코작 서열 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함하는 조성물.
  88. 제87항에 있어서, 제1 벡터가 유도성 프로모터, 항시성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터인 프로모터를 포함하는 조성물.
  89. 제87항에 있어서, 상기 단일 핵산 벡터가 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  90. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
  92. 제91항에 있어서, 상기 조성물을 포함하는 사전 로딩된 주사기를 추가로 포함하는 키트.
  93. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 달팽이관에 도입하는 것을 포함하는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 상기 포유동물이 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 확인된 방법.
  96. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조성물을 포유동물 세포에 도입하는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 달팽이관 내유모세포(cochlear inner hair cell) 또는 달팽이관 외유모세포(cochlear outer hair cell)인 방법.
  98. 제96항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 망막 세포인 방법.
  99. 제96항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 인간 세포인 방법.
  100. 제96항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 결정된 방법.
  101. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 달팽이관에 도입하는 것을 포함하는, 포유동물의 달팽이관의 내유모세포, 외유모세포 또는 둘 다에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법.
  102. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 눈에 안내(intraocularly) 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 눈에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법.
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 상기 포유동물이 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 확인된 방법.
  104. 제101항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  105. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 대상체의 달팽이관에 투여하는 것을 포함하는, 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 확인된 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법.
  106. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 확인된 대상체의 시력 손실을 치료하는 방법.
  107. 제105항 또는 제106항에 있어서, 상기 대상체가 어셔 증후군(Usher syndrome) III형을 갖는 방법.
  108. 제105항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
  109. 제105항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계 전에 상기 대상체가 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는지 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  110. 2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서,
    상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제1 핵산 벡터는 프로모터, 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 제1 코딩 서열 및 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열을 포함하고; 그리고
    상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제2 핵산 벡터는 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단의 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며;
    암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이이고, 2개의 암호화된 부분의 아미노산 서열은 서로 중첩되지 않고; 상기 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 전장 CLRN1 단백질을 암호화하지 않으며; 그리고
    포유동물 세포에 도입되면, 상기 스플라이스 공여체 서열과 상기 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 형성하는 조성물.
  111. 제110항에 있어서, 상기 제1 코딩 서열이 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼의 N-말단 부분을 암호화하고, 상기 제2 코딩 서열이 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼의 C-말단 부분을 암호화하는 조성물.
  112. 제111항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  113. 제112항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3을 포함하는 조성물.
  114. 제113항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3으로 구성되는 조성물.
  115. 제111항에 있어서, 제2 핵산 벡터의 제1 핵산 벡터가 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  116. 제115항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  117. 제116항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5를 포함하는 조성물.
  118. 제117항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5로 구성되는 조성물.
  119. 제110항에 있어서, 제1 코딩 서열이 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 N-말단 부분을 암호화하고, 제2 코딩 서열이 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 C-말단 부분을 암호화하는 조성물.
  120. 제119항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  121. 제120항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5를 포함하는 조성물.
  122. 제121항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5로 구성되는 조성물.
  123. 제119항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 또는 상기 제2 핵산 벡터가 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  124. 제123항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  125. 제124항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3을 포함하는 조성물.
  126. 제125항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3으로 구성되는 조성물.
  127. 제110항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 중 하나 또는 둘 다가 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR 또는 둘 다를 포함하는 조성물.
  128. 제127항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  129. 제128항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  130. 제129항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  131. 제130항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  132. 제127항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  133. 제127항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  134. 제133항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  135. 제134항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  136. 제135항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  137. 제127항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  138. 제110항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 플라스미드, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 벡터인 조성물.
  139. 제110항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)인 조성물.
  140. 제110항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터인 조성물.
  141. 제140항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 AAV 벡터인 조성물.
  142. 제110항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코딩 서열 중 적어도 하나는 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손에 걸쳐 있고 상기 2개의 연속 엑손 사이에 인트론 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물.
  143. 2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서,
    상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제1 핵산 벡터는 프로모터, 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 제1 코딩 서열, 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열 및 상기 스플라이스 공여체 서열의 3'에 위치한 제1 검출 가능한 마커 유전자를 포함하고; 그리고
    상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제2 핵산 벡터는 제2 검출 가능한 마커 유전자, 상기 제2 검출 가능한 마커 유전자의 3'에 위치한 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며;
    암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이이고, 상기 암호화된 부분의 아미노산 서열은 서로 중첩되지 않고; 상기 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 전장 CLRN1 단백질을 암호화하지 않으며; 그리고
    포유동물 세포에 도입되면, 상기 스플라이스 공여체 서열과 상기 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여, 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 형성하는 조성물.
  144. 제143항에 있어서, 상기 제1 코딩 서열이 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼의 N-말단 부분을 암호화하고, 상기 제2 코딩 서열이 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼의 C-말단 부분을 암호화하는 조성물.
  145. 제144항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  146. 제145항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3을 포함하는 조성물.
  147. 제146항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3으로 구성되는 조성물.
  148. 제144항에 있어서, 제2 핵산 벡터의 제1 핵산 벡터가 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  149. 제148항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  150. 제149항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5를 포함하는 조성물.
  151. 제150항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5로 구성되는 조성물.
  152. 제143항에 있어서, 상기 제1 코딩 서열이 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 N-말단 부분을 암호화하고, 상기 제2 코딩 서열이 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 C-말단 부분을 암호화하는 조성물.
  153. 제152항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  154. 제153항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5를 포함하는 조성물.
  155. 제154항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5로 구성되는 조성물.
  156. 제152항에 있어서, 제1 핵산 벡터 또는 제2 핵산 벡터가 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  157. 제156항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  158. 제157항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3을 포함하는 조성물.
  159. 제158항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3으로 구성되는 조성물.
  160. 제143항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 중 하나 또는 둘 다가 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR 또는 둘 다를 포함하는 조성물.
  161. 제160항에 있어서, 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  162. 제161항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  163. 제162항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  164. 제163항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  165. 제160항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  166. 제160항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  167. 제166항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  168. 제167항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  169. 제168항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  170. 제160항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  171. 제143항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 플라스미드, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 벡터인 조성물.
  172. 제143항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)인 조성물.
  173. 제143항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터인 조성물.
  174. 제173항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 AAV 벡터인 조성물.
  175. 제143항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코딩 서열 중 적어도 하나가 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손에 걸쳐 있고 상기 2개의 연속 엑손 사이에 인트론 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물.
  176. 제143항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 또는 상기 제2 검출 가능한 마커 유전자가 알칼리성 포스파타제인 조성물.
  177. 2개의 상이한 핵산 벡터를 포함하는 조성물로서,
    상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제1 핵산 벡터는 프로모터, 상기 프로모터의 3'에 위치한 CLRN1 단백질의 N-말단 부분을 암호화하는 제1 코딩 서열, 상기 제1 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 스플라이스 공여체 서열 및 상기 스플라이스 공여체 서열에 대해 3'에 위치한 F1 파지 재조합 생성 영역을 포함하고; 그리고
    상기 2개의 상이한 핵산 벡터의 제2 핵산 벡터는 F1 파지 재조합 생성 영역, 상기 F1 파지 재조합 생성 영역의 3'에 위치한 스플라이스 수용체 서열, 상기 스플라이스 수용체 서열의 3' 말단에 위치한 CLRN1 단백질의 C-말단 부분을 암호화하는 제2 코딩 서열 및 상기 제2 코딩 서열의 3' 말단에 위치한 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하며;
    2개의 암호화된 부분 각각은 적어도 30개의 아미노산 잔기 길이이고, 상기 2개의 암호화된 부분의 아미노산 서열은 서로 중첩되지 않고; 상기 2개의 상이한 벡터의 단일 벡터는 전장 CLRN1 단백질을 암호화하지 않으며; 그리고
    포유동물 세포에 도입되면, 상기 스플라이스 공여체 서열과 상기 스플라이스 수용체 서열 사이에 스플라이싱이 발생하여 전장 CLRN1 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 형성하는 조성물.
  178. 제177항에 있어서, 상기 제1 코딩 서열이 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼의 N-말단 부분을 암호화하고, 상기 제2 코딩 서열이 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼의 C-말단 부분을 암호화하는 조성물.
  179. 제178항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  180. 제179항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3을 포함하는 조성물.
  181. 제180항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3으로 구성되는 조성물.
  182. 제178항에 있어서, 상기 제2 핵산 벡터의 상기 제1 핵산 벡터는 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  183. 제182항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  184. 제183항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5를 포함하는 조성물.
  185. 제184항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5로 구성되는 조성물.
  186. 제177항에 있어서, 상기 제1 코딩 서열이 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 N-말단 부분을 암호화하고, 상기 제2 코딩 서열이 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼의 C-말단 부분을 암호화하는 조성물.
  187. 제186항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  188. 제187항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5를 포함하는 조성물.
  189. 제188항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제2 아이소폼이 서열 번호 5로 구성되는 조성물.
  190. 제186항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 또는 상기 제2 핵산 벡터가 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  191. 제190항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  192. 제191항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3을 포함하는 조성물.
  193. 제192항에 있어서, 상기 CLRN1 단백질의 제1 아이소폼이 서열 번호 3으로 구성되는 조성물.
  194. 제177항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 중 하나 또는 둘 다가 5' 비번역 영역(UTR), 3'UTR 또는 둘 다를 포함하는 조성물.
  195. 제194항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  196. 제195항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  197. 제196항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  198. 제197항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  199. 제194항에 있어서, 상기 5' UTR이 서열 번호 12와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  200. 제194항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  201. 제200항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 20개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  202. 제201항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 50개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  203. 제202항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15 내의 임의의 위치로부터 적어도 80개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  204. 제194항에 있어서, 상기 3' UTR이 서열 번호 15와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 조성물.
  205. 제177항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 플라스미드, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체 또는 바이러스 벡터인 조성물.
  206. 제177항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)인 조성물.
  207. 제177항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터인 조성물.
  208. 제207항에 있어서, 상기 제1 핵산 벡터 및 상기 제2 핵산 벡터 각각은 AAV 벡터인 조성물.
  209. 제177항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코딩 서열 중 적어도 하나는 CLRN1 게놈 DNA의 2개의 연속 엑손에 걸쳐 있고 상기 2개의 연속 엑손 사이에 인트론 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물.
  210. 제110항 내지 제209항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
  211. 제210항에 있어서, 상기 조성물을 포함하는 사전 로딩된 주사기를 추가로 포함하는 키트.
  212. 제110항 내지 제209항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 달팽이관에 도입하는 것을 포함하는 방법.
  213. 제212항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  214. 제212항 또는 제213항에 있어서, 상기 포유동물이 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 확인된 방법.
  215. 제110항 내지 제209항 중 어느 한 항의 조성물을 포유동물 세포에 도입하는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법.
  216. 제215항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 달팽이관 내유모세포 또는 달팽이관 외유모세포인 방법.
  217. 제215항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 망막 세포인 방법.
  218. 제215항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 인간 세포인 방법.
  219. 제215항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 결정된 방법.
  220. 제110항 내지 제209항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 달팽이관에 도입하는 것을 포함하는, 포유동물의 달팽이관 내유모세포, 외유모세포 또는 둘 다에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법.
  221. 제110항 내지 제209항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 포유동물의 눈에 안구 내 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 눈에서 전장 CLRN1 단백질의 발현을 증가시키는 방법.
  222. 제220항 또는 제221항에 있어서, 상기 포유동물이 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 사전에 확인된 방법.
  223. 제220항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  224. 제110항 내지 제209항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 대상체의 달팽이관에 투여하는 것을 포함하는, 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 확인된 대상체의 청력 손실을 치료하는 방법.
  225. 제110항 내지 제209항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함하는, 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는 것으로 확인된 대상체의 시력 손실을 치료하는 방법.
  226. 제224항 또는 제225항에 있어서, 상기 대상체가 어셔 증후군 III형을 갖는 방법.
  227. 제224항 내지 제226항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
  228. 제224항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계 전에 상기 대상체가 결함이 있는 CLRN1 유전자를 갖는지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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