CN114381465B

CN114381465B - 优化的cyp4v2基因及其用途

Info

Publication number: CN114381465B
Application number: CN202111580873.0A
Authority: CN
Inventors: 曹青; 张海; 文圣梅; 蒋立新
Original assignee: Suzhou Nuojiebei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Nuojiebei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2024-01-16
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN118028318A; WO2023116745A1; TW202328454A; CN114381465A; KR20240116854A

Abstract

本公开涉及一种优化的CYP4V2基因及其用途，所述基因涉及一种编码CYP4V2蛋白的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9所示核苷酸序列具有90％或以上同一性的核苷酸序列。本公开还涉及包含所述基因的表达载体，所述表达载体可以实现在眼睛的视网膜色素上皮层中高效，持久且稳定的表达能有效地降低用于治疗BCD的基因治疗药物的剂量和可能的副作用，提高治疗效果。

Description

优化的CYP4V2基因及其用途

技术领域

本公开属于基因治疗领域，具体涉及优化CYP4V2基因表达用于针对Bietti结晶性营养不良（BCD）的基因治疗。

背景技术

Bietti结晶性营养不良（Bietti crystalline dystrophy，BCD，人类孟德尔遗传病OMIM210370)是一种罕见的CYP4V2基因的双等位基因突变的遗传性常染色体隐性疾病。1937年意大利医生G.B.Bietti首次描述该疾病。其特征在于在视网膜的后极存在许多细小闪光的黄白色晶体样沉积物，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)萎缩、色素凝块及脉络膜硬化。该疾病的进展最终导致视力下降，夜盲症，视野丧失和色觉受损。该疾病的发作可发生于青少年时期至三十岁，但也可发生于三十岁以后。随着疾病的进展，周围视力，中枢视力或两者的降低最终导致大多数患者的法律失明(Garcia-Garcia,Martinez-Rubio et al. (2019). "Current perspectives in Bietti crystallinedystrophy." Clin Ophthalmol 13: 1379-1399.)。

BCD是由CYP4V2基因突变引起的。该基因位于人类4号染色体的长臂上，编码细胞色素P450（家族4、亚家族IV、多肽2）的一个重要的525个氨基酸的蛋白质成员，参与脂肪酸代谢(Li, Jiao et al.(2004). "Bietti crystalline corneoretinal dystrophy iscaused by mutations in the novel gene CYP4V2." Am J Hum Genet 74(5): 817-826)。CYP4V2蛋白存在于视网膜和角膜的上皮细胞中，该酶定位于内质网。该酶对中链饱和脂肪酸具有典型的CYP4的ω-羟化酶活性。CYP4V2是视网膜细胞中唯一以显着水平存在的CYP4，它可能是视网膜细胞中多不饱和脂肪酸代谢的重要贡献者。导致CYP4V2催化功能缺陷的基因突变阻断眼部脂质的降解，随后在BCD病人眼中形成积累(Hata, Ikeda et al.(2018). "Reduction of lipid accumulation rescues Bietti's crystallinedystrophy phenotypes." Proc Natl Acad Sci U S A 115(15): 3936-3941; Zhang,Yan et al. (2020). "PSCs Reveal PUFA-Provoked Mitochondrial Stress as aCentral Node Potentiating RPE Degeneration in Bietti's CrystallineDystrophy." Mol Ther 28(12): 2642-2661)。在有些患者的还发现有全身性的脂质包裹体(Lai, Chu et al. (2010). "Alterations in serum fatty acid concentrationsand desaturase activities in Bietti crystalline dystrophy unaffected byCYP4V2 genotypes." Invest Ophthalmol Vis Sci 51(2): 1092-1097)。

BCD估计每67,000人中就有1人发生。它在东亚血统的人群中更为常见，尤其是中国和日本背景的人群。估计中国有21,000名患者，美国约有5,000名患者。BCD可能确诊不足，因为其症状与其他逐渐损害视网膜的眼部疾病的症状相似。目前，没有可用于BCD的治疗方法(Ng, Lai et al. (2016). "Genetics of Bietti Crystalline Dystrophy."Asia Pac J Ophthalmol (Phila) 5(4): 245-252; Wang, Chen et al. (2021). "Newcompound heterozygous CYP4V2 mutations in bietti crystalline corneoretinaldystrophy." Gene 790: 145698.)。

BCD的基因治疗策略正在开发中。在高脂肪喂养(HFD)诱导的BCD小鼠模型中，腺相关病毒(AAV)载体携带的人类CYP4V2基因通过视网膜下腔注射在RPE层表达，有效地恢复了一些生理和功能缺陷，概念验证了基因治疗BCD疾病的有效性(Qu, Wu et al. (2020). "Treating Bietti crystalline dystrophy in a high-fat diet-exacerbated murinemodel using gene therapy." Gene Ther 27(7-8): 370-382)。

目前，AAV介导的CYP4V2基因治疗在多家制药公司处于研究和开发的早期阶段。到目前为止，还没有报告证明能够实现CYP4V2在体内充分和持续表达以达到有效的治疗效果。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本公开的目的在于提供一种优化基因表达的病毒载体，以在眼睛的视网膜RPE层中高效持久且稳定地表达人CYP4V2并用于治疗BCD。

在一方面，本公开提供了一种编码CYP4V2蛋白的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9所示核苷酸序列具有90％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一性的核苷酸列，更优选具有98%或99%以上同一性的核苷酸序列。

在本公开的一些实施方案中，所述多核苷酸如SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ IDNO 7、SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9所示。

在本公开的一些实施方案中，所述多核苷酸如SEQ ID NO 5所示。

在另一方面，本公开提供了一种表达盒，其包含所述的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作连接的启动子。

在另一方面，本公开提供了一种包含前述方面的多核苷酸的载体，其包含所述的多核苷酸或所述的表达盒。

在本公开的一些实施方案中，所述编码CYP4V2蛋白的多核苷酸与所述表达控制元件可操作地连接。

在本公开的一些实施方案中，所述表达控制元件选自转录/翻译控制信号、复制起点、启动子、增强子、内含子、polyA信号、ITR、绝缘子、RNA加工信号、增强mRNA和/或蛋白质的稳定性的元件中的一种或多种。

在另一方面，本公开提供了包含所述表达载体的细胞。

在另一方面，本公开提供了一种病毒颗粒，其包含所述的表达载体。

在另一方面，本公开提供了一种治疗BCD的药物组合物，其包含所述的多核苷酸、所述的表达盒、所述的表达载体和/或所述的病毒颗粒，以及药学上可接受的载体，其中，所述的药物组合物表达野生型或密码子优化的CYP4V2蛋白。

在另一方面，本公开提供了所述的多核苷酸、所述的表达盒、所述的表达载体、所述的病毒颗粒和/或所述的药物组合物在制备治疗Bietti结晶性营养不良（BCD）中的用途。

在另一方面，本公开提供了一种治疗Bietti结晶性营养不良（BCD）的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的所述的多核苷酸、所述的表达盒、所述的表达载体、所述的病毒颗粒和/或所述的药物组合物。

在另一方面，本公开提供了一种构建带有CYP4V2突变的BCD细胞模型的方法，其包括以下步骤：

（1）设计针对CYP4V2基因的sgRNA；

（2）将步骤（1）获得的所述sgRNA构建至Cas9-sgRNA载体，获得Cas9-sgRNA质粒；

（3）将步骤（2）获得的所述Cas9-sgRNA质粒导入细胞，获得的具有CYP4V2基因突变的细胞。

附图说明

图1为本公开的重组AAV(rAAV)载体CYP4V2表达盒的结构示意图。

图2示出了在由质粒转染的HEK293细胞中密码子优化的CYP4V2 opt基因的体外表达。其中，（A）CYP4V2蛋白质Western印迹的代表性图像；（B）CYP4V2蛋白质Western印迹的定量，以检测HEK293细胞中CYP4V2和GFP（质粒转染对照）的表达水平，其中WT或opt基因和GFP用CAG-CYP4V2-WT/opt和CMV-EGFP双质粒表达。等量的质粒转染后2天收获细胞裂解物。通过SDS-PAGE分离等量的总蛋白，然后进行免疫印迹。CYP4V2的表达水平用GFP标准化，并计算为与WT表达水平的比率。

图3示出了在AAV2转染的ARPE-19细胞中密码子优化的CYP4V2的体外表达。其中，(A）CYP4V2蛋白质Western印迹的代表性图像；（B）CYP4V2蛋白质Western印迹的定量，以检测ARPE-19细胞中CYP4V2和GAPDH（内部对照）的表达水平，其中WT或opt基因或EGFP对照用等量的AAV2病毒颗粒（MOI=20000）介导。病毒颗粒侵染后2天收获细胞裂解物。通过SDS-PAGE分离等量的总蛋白，然后进行免疫印迹。CYP4V2的表达水平标准化为GAPDH，并计算为与WT表达水平的比率（和WT表达水平比较：*，p＜0.05；**，p＜0.01；n=3，student检验）。

图4-6示出了AAV2-CYP4V2在BCD细胞模型中的体外药效。

图4示出了HEK293 CYP4V2突变细胞模型的建立和表型鉴定。CYP4V2突变的HEK293细胞表现出有缺陷的细胞表型。其中，(A）使用CRIPSR/Cas9方法生成CYP4V2外显子5突变的示意图。（B）HEK293外显子5突变细胞14号克隆（5-C14）中CYP4V2基因靶向位点的Sanger测序结果。（C）HEK293 WT和突变5-C14细胞在6天的培养过程中细胞增殖率的评估（和WT比较：**，p＜0.01；***，p＜0.005；student检验；n=4）。（D-E）HEK293 WT和突变细胞中在加入或没有加入巴弗洛霉素A1（bafilomycin-A1）（Baf，100nM，2h）处理的情况下自噬标记物LC3B-I/II的评估。（D）蛋白质印迹的代表性图像和（E）LC3B-II蛋白质水平的量化，其被标准化为GAPDH并计算为与WT细胞未加入Baf处理的情况（NT）的比率（*，p＜0.05；ns：无显著差别；student检验；n=3）。

图5示出了CYP4V2突变的ARPE-19细胞模型的建立、表型鉴定和AAV2-CYP4V2 WT和优化基因opt18对ARPE-19突变细胞模型表型的影响。使用CRISPR/Cas9方法生成CYP4V2外显子5突变。其中，（A）ARPE-19细胞中CYP4V2基因靶向位点的Sanger测序。（B）WT和突变5-C13细胞在在6天的培养时间过程中评估细胞增殖率。***，P ＜ 0.01；student检验；n = 6。（C）细胞脂质沉积。WT、突变5-C13细胞、AAV2-CYP4V2 WT或opt18以MOI 20000侵染5-C13细胞。细胞在花生四烯酸（AA）处理后的脂质和DAPI染色。激光共聚焦显微镜的代表性图像。比例尺，25 微米。（D）细胞内脂肪颗粒沉积的量化。AAV2-CYP4V WT和opt18侵染突变细胞后脂肪颗粒沉积明显减少。opt18对脂肪颗粒沉积减少的效应优于WT（***，p＜0.005；****，p＜0.001；n=50，student检验）。（E）WT和突变细胞5-C13的电子显微照片，显示自噬泡（黑色箭头）和空泡（白色箭头）。比例尺，500纳米。

图6示出了AAV2-CYP4V2 WT和优化基因对HEK293 CYP4V2突变细胞模型表型的影响。（A）AAV2-CYP4V2 WT或opt18或EGFP对照以MOI 20000侵染细胞2天后CYP4V2蛋白表达水平的Western印迹检测。（B）侵染后，6天时间过程中细胞增殖率的评估。（C）在第6天，用AAV2-CYP4V2 opt18或EGFP对照以MOI 5000或20000侵染的HEK293突变细胞中的细胞增殖。(D）在第6天，野生型HEK293细胞和用AAV2-CYP4V2 opt18及EGFP对照以MOI 20000侵染的HEK293突变细胞的细胞增殖比较（*，p＜0.05；****，p＜0.001；n=6，student检验）。(E-F）用AAV2-CYP4V2 WT opt18及EGFP对照以MOI 20000侵染的HEK293突变细胞中在加入或没有加入Baf处理的情况下自噬标记物LC3B-I/II的评估。（E）蛋白质印迹的代表性图像和（F）LC3B-II蛋白质水平的量化，其被标准化为GAPDH并计算为EGFP NT情况的比率（*，p＜0.05；**，p＜0.01；ns：无显著差别；student检验；n=3）。

图7示出了通过视网膜下注射的密码子优化的AAV-CYP4V2在小鼠眼中的体内表达。(A）AAV2-CYP4V2野生型和优化基因在小鼠眼部的表达。野生型小鼠眼球通过视网膜下腔注射入1µl 5 × 10¹²vg/ml的AAV2-CYP4V2 WT或opt重组病毒颗粒。4 周后，取眼部组织，分离视网膜，匀浆裂解。通过SDS-PAGE分离等量的总蛋白，然后进行免疫印迹。(A）CYP4V2蛋白质Western印迹的代表性图像；（B）CYP4V2蛋白质Western印迹的定量，以检测CYP4V2和GAPDH（内部对照）的表达水平，CYP4V2的表达水平标准化为GAPDH，并计算为与WT表达水平的比率（和WT表达水平比较：*，p＜0.05；student检验；n=6-9）。Std：纯化的重组人CYP4V2蛋白标准样品。NC：未注射的小鼠眼球阴性对照。

具体实施方式

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文使用本文提及“约”某个值或参数包括(和描述)针对值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。

如本文使用，除非另外表明，单数形式的冠词“一种”、“一个”和“所述”包括复数指代物。

如本文使用的“载体”指包含待递送入宿主细胞(体外或体内)的核酸的重组质粒或病毒。

如本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的聚合形式的核苷酸，其为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单、双或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交物或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰的、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。核酸的骨架可包含糖和磷酸基团(如通常在RNA或DNA中所发现)，或修饰或取代的糖或磷酸基团。可替换地，核酸的骨架可包含合成的亚单元如氨基磷酸的聚合物且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸(P-NH₂)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。此外，双链核酸可从化学合成(通过在适当的条件下合成互补链并退火该链，或使用DNA聚合酶以适当的引物从头开始合成互补链)的单链多核苷酸产物获得。

“重组病毒载体”指包含一种或多种异源序列(即非病毒来源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组AAV载体的情况中，重组核酸侧翼为至少一个，优选两个反向末端重复序列(ITR)。

“重组AAV载体(rAAV载体)”指含有一个或多个异源序列(即非AAV来源的核酸序列)的多核苷酸载体，其侧翼为至少一个，优选两个AAV反向末端重复序列(ITR)。当存在于已经使用适当的辅助病毒(或表达适当的辅助功能)感染并表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中时，该rAAV载体可复制并包装入感染的病毒颗粒。当rAAV载体并入较大多核苷酸(例如，在染色体中或在用于克隆或转染的另一载体如质粒中)时，可将rAAV载体称为“原载体(pro-vector)”，其在AAV包装功能和适当的辅助功能存在下可通过复制和壳体化“援救”。rAAV载体可以是多种形式中的任一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体，其可与脂质体复合、包封在脂质体内，且在实施方案中，包封在病毒颗粒特别是AAV颗粒中。可将rAAV载体包装入AAV病毒衣壳以生成“重组腺伴随病毒颗粒(rAAV颗粒)”。AAV辅助功能(即允许AAV由宿主细胞复制和包装的功能)可以多种形式中的任一种提供，包括但不限于帮助AAV复制和包装的辅助病毒或辅助病毒基因。其他AAV辅助功能为本领域已知。

“rAAV病毒”或“rAAV病毒颗粒”指由至少一种AAV衣壳蛋白和壳体化的rAAV载体基因组组成的病毒颗粒。

“异源”意为源自与其所比较的或其所导入或并入的实体的其余部分在基因型上不同的实体。例如，由基因工程技术引入不同细胞类型的核酸是异源核酸(且当表达时，可编码异源多肽)。相似地，并入病毒载体的细胞序列(例如基因或其部分)相对于载体是异源核苷酸序列。

如指代病毒滴度中使用，术语“基因组颗粒(gp)”、“基因组等价物”或“基因组拷贝”指包含重组AAV DNA基因组的病毒粒数目，不论其感染性或功能性。在特定载体制备中基因组颗粒的数目可通过如本文实施例或例如Clark等人(1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039；Veldwijk等人(2002) Mol. Ther., 6:272-278中所述的方法测量。

如指代病毒滴度中使用，术语“感染单位(iu)”、“感染颗粒”或“复制单位”指如通过感染中心测定所测量的具有感染和复制能力的重组AAV载体颗粒的数目，也称为复制中心测定，如例如McLaughlin等人(1988) J. Virol.,62:1963-1973中所述。

如指代病毒滴度中使用，术语“转导单位(tu)”指导致功能性转基因产物产生的感染性重组AAV载体颗粒的数目，如在功能性测定中所测量，如本文实施例或例如Xiao等人(1997) Exp. Neurobiol.,144:113-124中；或Fisher等人(1996) J. Virol.,70:520-532(LFU测定)中所述。

“反向末端重复”或“ITR”序列是本领域熟知的术语且指代在病毒基因组的末端发现的相对短的序列，其处于相反方向。

“AAV反向末端重复(ITR)”序列是本领域熟知的术语，其为在天然单链AAV基因组两末端存在的约145个核苷酸的序列。ITR的最外面125个核苷酸可以两种可替换的方向中的任一种存在，导致不同AAV基因组间和单AAV基因组的两末端间的异质性。最外面125个核苷酸还包含自身互补的数个较短区(称为A、A'、B、B'、C、C'和D区)，允许在该ITR部分内发生链间碱基配对。

对于AAV的“辅助病毒”指允许AAV(为有缺陷的细小病毒)通过宿主细胞复制并包装的病毒。已识别多种这样的辅助病毒，包括腺病毒、泡疹病毒和痘类病毒如牛痘。腺病毒涵盖多个不同的亚类，尽管亚类C的腺病毒5型(Ad5)是最常用的。已知人、非人哺乳动物和鸟类来源的多种腺病毒且可从保藏机构如ATCC获得。也可从保藏机构如ATCC获得的泡疹病毒家族包括例如单纯泡疹病毒(herpes simplex viruses，HSV)、EB病毒(Epstein-Barrviruses，EBV)、巨细胞病毒(cytomegaloviruses，CMV)和伪狂犬病病毒(pseudorabiesviruses，PRV)。

相对于参照多肽或核酸序列的“百分比(％)序列同一性”定义为对齐序列并引进缺口后(若需要，以实现最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代考虑为序列同一性的部分)，候选序列中与参照多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。出于确定百分比氨基酸或核酸序列同一性的目的的比对可以多种本领域内的方式实现，例如使用公共可获得的计算机软件程序，例如Current ProtocolsinMolecular Biology(Ausubel et al.,eds.,1987),Supp.30,section 7.7.18,表7.7.1中所述的那些，且包括BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。优选的比对软件是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,Pennsylvania)。本领域的技术人员可确定用于测量比对的适当的参数，包括任何在比较的序列全长上需要实现最大比对的算法。就本文而言，给定氨基酸序列A对、与或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可替换地可称为具有或包含对、与或针对给定氨基酸序列B具有一定％氨基酸序列同一性的氨基酸序列A)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是在A和B的程序比对中通过序列比对程序评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中氨基酸残基的总数。可以理解的是其中氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不等，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。就本文而言，给定核酸序列C对、与或针对给定核酸序列D的％核酸序列同一性(其可替换地可称为对、与或针对给定核酸序列D具有或包含一定％核酸序列同一性的给定核酸序列C)如下计算：100乘以分数W/Z，其中W是在C和D的程序比对中通过序列比对程序评分为相同匹配的核苷酸的数目，且其中Z是D中核苷酸的总数。可以理解的是其中核酸序列C的长度不等于核酸序列D的长度，C对D的％核酸序列同一性将不等于D对C的％核酸序列同一性。

“有效量”是足以影响有益的或预期的结果，包括临床结果(例如改善症状、实现临床终点等)的量。有效量可以一次或多次施用。就疾病状态而言，有效量是足以改善、稳定或延迟疾病进展的量。例如，有效量的rAAV颗粒表达预期量的异源核酸如治疗性多肽或治疗性核酸。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如，牛、绵羊(sheep)、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)、兔和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。

如本文使用的“治疗”是用于获得有益或预期的临床结果的方式。就本公开而言，有益或预期的临床结果包括但不限于症状改善、疾病程度的减少、疾病的稳定化(例如未恶化)状态、疾病扩散(例如转移)的防止、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论部分或全部)，无论是可检测的或不可检测的。“治疗”还可意为与未接受治疗的预期生存率相比延长生存率。

在另一方面，本公开提供了一种表达载体，其包含所述的多核苷酸或所述的表达盒。

在本公开的一些实施方案中，所述表达载体包含复制起点；优选地，所述复制起点序列选自f1噬菌体ori、RK2oriV、pUC ori以及pSC101ori。

在本公开的一些实施方案中，所述表达载体还包含5’ITR；优选地，所述5’ITR包含与SEQ ID NO 1所示核苷酸序列具有90％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一性的核苷酸列，更优选具有98%或99%以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述多核苷酸如SEQ ID NO 1所示。

在本公开的一些实施方案中，所述表达载体还包含3’ITR；优选地，所述3’ITR包含与SEQ ID NO 11所示核苷酸序列具有90％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一性的核苷酸列，更优选具有98%或99%以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述多核苷酸如SEQ ID NO 11所示。

在本公开的一些实施方案中，所述表达载体还包含增强子；优选地，所述增强子为CMV增强子；更优选地，所述增强子包含与SEQ ID NO 2所示核苷酸序列具有90％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一性的核苷酸列，更优选具有98%或99%以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述多核苷酸如SEQ IDNO 2所示。

在本公开的一些实施方案中，所述表达载体还包含启动子。在本公开的一些实施方案中，所述启动子为特异性或非特异性启动子。在本公开的一些实施方案中，所述启动子选自CBA启动子、CMV启动子、SV40启动子、hPGK启动子和TRE3GS启动子。在本公开的一些实施方案中，所述启动子为CBA启动子，优选地，所述CBA启动子包含与SEQ ID NO 3所示核苷酸序列具有90％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一性的核苷酸列，更优选具有98%或99%以上同一性的核苷酸序列。在本公开的一些实施方案中，所述多核苷酸如SEQ ID NO 3所示。在本公开的一些实施方案中，所述启动子是可诱导启动子优选地，所述可诱导系统包含四环素调控启动子、醇调控启动子、类固醇调控启动子、金属调控启动子、致病调控启动子、温度/热诱导型启动子和光调控启动子、IPTG诱导型系统中的一种或多种。在本公开的一些实施方案中，所述四环素调控启动子选自Tet on启动子、Tet off的启动子和Tet Activator启动子。在本公开的一些实施方案中，所述醇调控启动子选自醇脱氢酶I(alcA)基因启动子、响应于醇反式激活蛋白(AlcR)的启动子。在本公开的一些实施方案中，所述类固醇调控启动子选自大鼠糖皮质激素受体启动子、人雌激素受体启动子、蛾蜕皮激素受体启动子，类视黄醇启动子和甲状腺受体超家族启动子。在本公开的一些实施方案中，所述金属调控启动子选自酵母、小鼠和人的金属硫蛋白启动子。在本公开的一些实施方案中，所述致病调控启动子选自由水杨酸调控启动子、乙烯调控启动子和苯并噻二唑调控（BTH）启动子。在本公开的一些实施方案中，所述温度/热诱导型启动子选自HSP-70启动、HSP-90启动和大豆热激启动子。在本公开的一些实施方案中，所述光调控启动子是植物细胞的光应答型启动子。

在本公开的一些实施方案中，所述表达载体还包含外显子和内含子。在本公开的一些实施方案中，所述外显子和内含子为鸡β-actin基因的第一个外显子和第一个内含子。在本公开的一些实施方案中，所述外显子和内含子包含与SEQ ID NO 4所示核苷酸序列具有90％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一性的核苷酸列，更优选具有98%或99%以上同一性的核苷酸序列。在本公开的一些实施方案中，所述多核苷酸如SEQ ID NO 4所示。

在本公开的一些实施方案中，所述表达载体还包含polyA信号。在本公开的一些实施方案中，所述polyA信号为牛生长激素poly A（BGH poly A）、短poly A、SV40 polyA、和/或人β珠蛋白poly A。在本公开的一些实施方案中，所述polyA信号包含与SEQ ID NO 10所示核苷酸序列具有90％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一性的核苷酸列，更优选具有98%或99%以上同一性的核苷酸序列。在本公开的一些实施方案中，所述多核苷酸如SEQ ID NO 10所示。

在本公开的一些实施方案中，所述表达载体包含与SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16所示核苷酸序列具有90％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一性的核苷酸列，更优选具有98%或99%以上同一性的核苷酸序列。在本公开的一些实施方案中，所述多核苷酸如SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16所示。

在本公开的一些实施方案中，所述载体包含转录后调节元件。在本公开的一些实施方案中，所述转录后调节元件为土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。

在本公开的一些实施方案中，所述载体还包含编码标志物基因。在本公开的一些实施方案中，所述标志物选自抗生素抗性蛋白质、毒素抗性蛋白质、有色的或荧光的或发光的蛋白质和介导增强的细胞生长和/或基因扩增的蛋白质中的一种或多种。

在本公开的一些实施方案中，所述抗生素选自氨苄青霉素、新霉素、G418、嘌呤霉素和杀稻瘟素。

在本公开的一些实施方案中，所述毒素选自炭疽毒素和白喉毒素。

在本公开的一些实施方案中，所述有色的或荧光的或发光的蛋白质选自绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和萤光素酶。在本公开的一些实施方案中，所述介导增强的细胞生长和/或基因扩增的蛋白质为二氢叶酸还原酶(DHFR)。

在本公开的一些实施方案中，所述表达载体选自质粒、粘粒、病毒载体、RNA载体或线性或圆形DNA或RNA分子。

在本公开的一些实施方案中，所述质粒选自pCI、puc57、pcDNA3、pSG5、pJ603和pCMV。

在本公开的一些实施方案中，所述病毒载体选自逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如，腺伴随病毒）、冠状病毒、负链RNA病毒诸如正粘病毒(例如，流感病毒）、弹状病毒(例如，狂犬病和水疱性口炎病毒）、副粘病毒(例如，麻疼和仙台）、正链RNA病毒诸如小RNA病毒和甲病毒，和双链DNA病毒，所述双链 DNA病毒包括腺病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1和2型、愛泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘病毒、鸡痘病毒和金丝雀痘病毒）、诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多泡病毒、嗜肝DNA病毒、杆状病毒和肝炎病毒。

在本公开的一些实施方案中，所述逆转录病毒选自禽造白细胞组织增生-肉瘤、哺乳动物C-型、B-型病毒、D-型病毒、HTLV-BLV集合、慢病毒和泡沫病毒。

在本公开的一些实施方案中，所述慢病毒载体选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV和绵羊脱髓鞘性脑白质炎慢病毒。

在本公开的一些实施方案中，所述表达载体为腺相关病毒。

在本公开的一些实施方案中，所述腺相关病毒选自AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、禽AAV、牛 AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV等。

在本公开的一些实施方案中，所述表达载体还包含缩短的嵌合内含子和Kozak起始序列。

在本公开的一些实施方案中，所述缩短的嵌合内含子如SEQ ID NO 4所示。

在本公开的一些实施方案中，所述Kozak起始序列如SEQ ID NO 17所示。

在另一方面，本公开提供了一种治疗BCD的药物组合物，其包含所述的多核苷酸、所述的表达盒、任一所述的表达载体和/或所述的病毒颗粒，以及药学上可接受的载体，其中，所述的药物组合物表达野生型或密码子优化的CYP4V2蛋白。

（1）设计针对CYP4V2基因的sgRNA；

（3）将步骤（3）获得的所述Cas9-sgRNA质粒导入细胞，获得具有CYP4V2基因突变的细胞。

在本公开的一些实施方案中，所述方法还包括步骤（4）筛选具有CYP4V2基因突变的细胞。

在本公开的一些实施方案中，所述方法还包括步骤（5）对所述CYP4V2基因突变细胞进行鉴定。

在本公开的一些实施方案中，所述鉴定选自细胞增殖鉴定、自噬变化鉴定及脂肪颗粒沉积鉴定。

在本公开的一些实施方案中，所述sgRNA选自SEQ ID NO 18-21中的一种或多种。

本公开提供腺相关病毒载体表达密码子优化的CYP4V2基因以实现在眼睛的视网膜色素上皮层中高效，持久且稳定的表达。本公开能有效地降低用于治疗BCD的基因治疗药物的剂量和可能的副作用，提高治疗效果。

为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本公开的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。

下面，参考具体实施例更详细地描述本公开，然而，实施例仅用于说明目的，对于本公开不具有限制作用。

实验材料和方法：

CYP4V2表达盒和AAV载体

在本研究中使用的所有DNA序列由金斯瑞合成。密码子优化使用GenSmart codonoptimization tool加以改进进行。AAV载体介导的CYP4V2表达盒如图1所示。表达盒序列克隆至穿梭质粒载体获得含AAV载体介导的表达CYP4V2目的基因的穿梭质粒。

AAV载体生产及纯化方法

AAV载体的生产采用三质粒系统，即用含CYP4V2目的基因的穿梭质粒、带AAV载体repcap基因的pRepCap质粒和辅助质粒pHelper，以PEI为转染试剂，共同转染HEK293细胞，重组包装出AAV病毒载体。转染后48-72小时进行收获，收获液经纯化后获得一定纯度的重组AAV病毒载体。纯化方法如下：

首先对收获液进行预处理：充分裂解HEK293细胞，释放出细胞内的AAV病毒载体，同时加入核酸酶对游离的核酸进行消化，消化结束后，采用深层过滤除去大分子杂质和细胞碎片，深层过滤后滤液用二次过滤得到澄清液用于亲和上样。

亲和层析利用配基与蛋白的特异性吸附捕获收获液中的AAV病毒载体，并除去大部分工艺相关杂质，达到浓缩与除杂的效果。将收集的洗脱液混匀，并用中和缓冲液中和，保存在无菌储液瓶中作为阴离子层析上样液。

阴离子层析利用不同组分的等电点差异分离实心与空壳AAV病毒，同时继续去除残留杂质，洗脱液收集在新的无菌储液瓶中，再经超滤浓缩的方法置换缓冲液为制剂稳定的缓冲液，同时病毒滴度浓缩至约5×10¹²vg/mL，最后除菌过滤分装后备用。

AAV载体储用物的滴度定量

在AAV病毒纯化完成之后，需要对病毒的含量进行测定，基因组滴度是表征AAV物理滴度最经典的标准。通过针对rAAV的基因组序列设计引物探针，然后进行Q-PCR检测是基因组滴度检测最通用的方法。

考虑到本公开中针对ORF编码框进行了密码子优化，涉及到多个载体结构的筛选，为了保证不同载体结构之间定量的稳定性和准确性，选择载体中的共有序列设计引物探针。CMV增强子序列为CAG启动子的一部分，在进行密码子优化过程中，这一部分为不同载体结构的共有部分，因此针对该序列设计引物探针。

在基因组滴度检测过程中，首先要进行标准曲线的建立，阳性标准质粒使用样品稀释液稀释至2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²拷贝/μl，作为标准曲线模板，标准曲线需要控制其线性和扩增效率，一般要求R2＞0.99，扩增效率在90%-110%之间。之后采用预处理完成的rAAV样品稀释后进行QPCR检测，确保样品检测Ct值在标准曲线范围内，根据样品的Ct值代入到标准曲线中进行rAAV样品基因组滴度的计算，对产品的含量进行标识。

体外细胞质粒转染实验

提前一天消化处理HEK293细胞，按7.0*10⁵细胞/孔接种细胞至6孔板中。过夜培养后进行质粒转染实验。按如下用量进行质粒与转染试剂混合：在一个1.5ml离心管中加入125µl opti-MEM培养基（Gibco，31985-070），2µg CYP4V2-opt/WT表达质粒，200ng CMV-EGFP质粒和5µl P3000，混匀，获得质粒管；在另一个1.5ml离心管中加入125µl opti-MEM培养基和5µl Lipo 3000（Thermo，L3000015），混匀，然后加入至质粒管中，室温静置孵育15min。将混合液缓慢滴加至6孔板HEK293细胞中，继续置于CO₂恒温培养箱中培养48h。

体外细胞病毒侵染实验

提前一天消化处理ARPE-19细胞，按3.0*105细胞/孔接种细胞至6孔板中。过夜培养24h后进行AAV2病毒侵染实验。取一个孔的细胞消化后计数，根据20000 MOI感染参数计算所需病毒Vg数，用Opti-MEM培养基将所需病毒量稀释至1ml。接着将接种过夜的6孔板中细胞培养基吸干净，加入1ml已稀释好的病毒液，继续置于CO₂恒温培养箱中培养；4h后补加1ml DMEM完全培养基（DMEM + 10%FBS + 1%双抗培养基（Hyclone，SV30010）），置于CO₂恒温培养箱中培养48h。

带有CYP4V2突变的BCD细胞模型的构建

采用CRISPR-Cas9方法构建带有CYP4V2突变的BCD细胞模型，具体方法如下：提前一天消化处理HEK293或ARPE-19细胞，按7.0*10⁵细胞/孔接种细胞至6孔板中；24h后进行质粒转染实验，质粒样品稀释准备：在1.5ml离心管中加入125µl opti-MEM培养基，2µg Cas9-sgRNA质粒（addgene，#58766）和5µl P3000（Exon7-sgRNA1-HDR修复构建补加3µg CYP4V2-ssDNA），混匀；Lipo 3000（Thermo，L3000015）稀释准备：在1.5ml离心管中加入125µl opti-MEM培养基和5µl Lipo 3000，混匀后加入至质粒样品稀释管中，混匀并室温孵育15min。将混合液缓慢滴加至6孔板待转染细胞中，轻轻摇晃混匀，置于CO₂恒温培养箱中培养。转染48h后荧光拍照确认转染效率，消化6孔板中细胞，加入含5µg/ml嘌呤霉素（Puromycin）的DMEM完全培养基加压培养，期间每天更换培养基，培养基为含5µg/ml嘌呤霉素的DMEM-Fµll培养基；培养72h后，弃掉6孔板中细胞培养基，加入不含嘌呤霉素的DMEM培养基培养。培养48h后，消化细胞并计数，按1个细胞/孔分选细胞至96孔板中（含200µl DMEM+20%FBS+1%双抗培养基）培养。培养2~3周后，观察到克隆斑长大，将克隆斑按96孔板→24孔板→6孔板逐步扩大培养。6孔板细胞长满后，取部分细胞提取细胞基因组DNA（天根，DP304-03），PCR扩增，切胶回收后Sanger测序验证，使用SeqMan软件分析单克隆细胞基因型。剩余部分细胞根据实验需要扩大培养冻存。

Western印迹分析

在接种培养细胞的6孔板的每个孔内加入200μl含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（碧云天生物技术有限公司，P0013B），冰上充分裂解细胞5min。收集细胞裂解液于1.5ml离心管中，冰上放置30min，4℃，15000g离心20min，取上清。将蛋白样品用PBS稀释10倍，充分混匀。用BCA蛋白定量试剂盒（Pierce^TMBCA蛋白检测试剂盒（Thermo Fisher，23225）进行蛋白定量。在蛋白样品中加入5×SDS上样缓冲液，充分混匀。100℃煮沸5min。SDS-PAGE电泳分离30μg蛋白样品后转PVDF膜。用5%脱脂牛奶（PBS配制）室温封闭1h后，抗体孵育，ECL检测。Bio-Rad ChemiDocTM Touch Imaging System进行成像分析。

细胞增殖分析

将CYP4V2突变的细胞与野生型细胞消化，计数。将调整好细胞密度的细胞悬液充分混匀，接种至96孔板内，每个细胞设四个复孔。在体外药效实验中，种板24h之后，进行病毒侵染。从种板后48h开始进行CCK-8检测分析，检测的天数分别为Day2，Day3，Day4，Day5，Day6。检测当天，计算总共需要分析的孔的数量配置适当量的含有CCK-8试剂的DMEM培养基。CCK-8试剂（同仁化学所，CK04）与DMEM培养基的量按照1:10的比例配制，每孔加入100μl含有CCK-8试剂的DMEM培养基，37℃细胞培养箱孵育1.5h后，用多功能酶标仪（BioTek,SYNERGY/LX)在450nm处读板。用Graphpad Prism软件对数据进行统计分析。

自噬体功能检测

野生型和突变细胞及病毒侵染的细胞，分别用含有100nM Bafilomycin-A1（Baf)或者不含有药物的培基处理2h，提取细胞蛋白，用WB检测分析LC3B-Ⅱ/GAPDH的比值，以此确定细胞内自噬流是否通畅。

脂质沉积染色

细胞用160μM花生四烯酸（AA）连续处理4天，用4%多聚甲醛室温固定细胞20min。用3μM BODIPY 493/503，37℃染细胞20min。用5μg/ml DAPI衬染10min。激光共聚焦显微镜拍照。每一个实验组，选取50个细胞，用Image pro plus软件分析细胞内脂质沉积颗粒面积和细胞内单位面积内脂质沉积颗粒的数目。

小鼠视网膜下腔注射

小鼠全身麻醉后充分散瞳，在眼科专用手术显微镜直视下，在角巩膜缘外侧用301/2 gauge的一次性尖针头穿刺巩膜，避免伤及虹膜和晶状体，然后用带33 gauge平针头的微量进样器沿穿刺口进入，针头绕过晶体后到达玻璃体，然后逐渐进针至神经视网膜层和视网膜色素上皮(RPE)层之间的潜在视网膜腔隙并缓慢推注，注射量为1µl。注射载体混悬液中添加0.1％荧光素钠染料(安全浓度)，方便观察注射是否成功，及视网膜脱离范围。注射过程中，眼表滴2.5％羟丙基甲基纤维素以便于随时观察眼底情况。手术显微镜下如清楚看到眼底局部视网膜呈圆形隆起且视网膜隆起下方可见绿色，证明注射成功。一定时间后小泡消失，视网膜局部隆起变平。术中如不能看到视网膜隆起及其下方的绿色或看到视网膜有大出血等并发症，则另选小鼠重新注射。术毕涂1％阿托品眼膏和四环素可的松眼膏，以后每隔1天重复一次，共三次，以减少炎症反应、防止感染。

小鼠眼球视网膜样品提取

取小鼠眼部组织，去除角膜和晶状体，加入100μl ATL溶液（QIAGEN，19076），匀浆2min。DNA样品提取：吸取10μl匀浆液，加入10µl ATL溶液和2µl蛋白酶K（QIAGEN，19133）混匀，加入20µl AL溶液（QIAGEN，19075）混匀后56℃孵育10min，制备获得DNA检测样品；蛋白提取：吸取剩余50µl匀浆液，加入5µl 10*RIPA裂解液（CST）和蛋白酶抑制剂（碧云天）混匀，冰上裂解30min；4℃，15000g，离心30min，收集上清，蛋白定量后进行WB检测。

载体基因组拷贝数分析

取5µl DNA检测样品，加入45µl样品稀释液（1ml无RNA酶的水中加5μl PluronicF68（Gibco，24040032）和2μl tRNA（Ambion，AM7119）；混匀后吸取5µl稀释液，加入45µl样品稀释液混匀，得到100倍稀释的待测DNA样品；以线性化并绝对定量的质粒（pAAV-CMV-EGFP）作为标准品进行标准曲线的绘制。按如下反应体系配制qPCR反应液：Taqman PCR Mix，上游引物（10μM），下游引物（10μM），探针（10μM），DNA模板。按如下反应条件进行qPCR反应：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，30s 40个循环；37℃，2s。反应结束后，根据标准品Ct值制作标准曲线，线性回归计算每个待测样品的Vg数。

小鼠OCT检测

光学相干断层扫描(OCT)检查：将麻醉好的动物置于升降台上，使用复方托吡卡胺滴眼液常规散瞳，并用盐酸丙美卡因滴眼液进行表麻，摆好眼位，待瞳孔散大后将医用卡波姆滴眼液凝胶涂于待测眼角膜上，将眼科超显微成像系统光源调整聚焦，调整镜头焦点至视网膜，而后对视网膜进行光学相干断层扫描(OCT)。每只实验动物双眼均进行拍照。实验完成后用生理盐水清洗双眼，并用左氧氟沙星滴眼液滴眼预防感染。

小鼠ERG检测

将待检测小鼠放置于暗室内饲养3天，到达实验时间点，将小鼠在暗室内进行视网膜电图（ERG）的波形采集，将小鼠麻醉和散瞳后，0.25%羟丙基甲基纤维素溶液点双眼保护角膜，将小鼠放置于有加热垫的操作台上，在小鼠双眼之间的中央处皮肤表皮下插入红色金属丝电极，黑色接地电极插于小鼠尾部表皮下，采用全视网膜眼电图Ganzfeld ERG系统（Micron IV，Phoenix Research Laboratories，Inc）进行ERG图像采集，利用该系统内软件自动分析，得到每个刺激强度a波和b波的平均振幅用于统计分析。视网膜电图的波形可以反映出视网膜神经元传导功能，所测得的波形主要由负向的a波和正向的b波组成，其中a波所反映的是视网膜一级神经元即光感受器细胞的功能，而b波所反应的是视网膜二级神经元即双极细胞的功能。

实施例

实施例1：腺病毒载体的构建和分离纯化

1.1 腺病毒载体的构建

CYP4V2表达盒的结构如图1所示。所述CYP4V2表达盒从5’至3’端依次包含5’ITR、CMV增强子、CBA启动子、CBA外显子1&内含子1、Kozak序列、目的基因：野生型人源CYP4V2基因hCYP4V2 WT或优化的CYP4V2基因hCYP4V2 opt、BGH polyA）和3’ITR。其中：

5’ITR的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；

CMV增强子为巨细胞病毒（CMV）增强子元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；

CBA启动子为鸡β-肌动蛋白基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；

CBA外显子1&内含子1为鸡β-actin基因的第一个外显子和第一个内含子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；

hCYP4V2WT基因源自野生型人源CYP4V2基因（GeneID：285440），其基因序列如SEQID NO 9所示，其编码的野生型hCYP4V2WT蛋白的NCBI登记号为NP_997235.3。

优化的CYP4V2基因hCYP4V2 opt为编码野生型hCYP4V2WT蛋白的密码子优化的基因opt18、opt7、opt8和opt6，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8。

BGH polyA为牛生长激素聚腺苷酸化信号，其核苷酸序列如SEQ ID NO 10所示。

3’ITR的核苷酸序列如SEQ ID NO 11所示。

Kozak序列被插入到CYP4V2 cDNA序列之前,其序列如SEQ ID NO 17。

包含野生型人源CYP4V2基因hCYP4V2WT的表达盒构建为质粒pAAV2-CYP4V2 WT。

包含优化的CYP4V2基因的表达盒构建为质粒pAAV2-CYP4V2 opt。其中，SEQ ID NO12示出了包含密码子优化基因opt6的表达盒的核苷酸序列，SEQ ID NO 13示出了包含密码子优化基因opt7的表达盒的核苷酸序列，SEQ ID NO 14示出了包含密码子优化基因opt8的表达盒的核苷酸序列。SEQ ID NO 15示出了包含密码子优化基因opt18的表达盒的核苷酸序列。SEQ ID NO 16示出了包含CYP4V2 WT的表达盒的核苷酸序列。

CYP4V2表达盒可以包装在rAAV中具有来自任何AAV血清型或其杂交体或变体的衣壳的载体。

病毒载体通过质粒共转染方法获得。将含有AAV2外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和含CYP4V2目的基因表达盒的穿梭质粒pAAV2-CYP4V2 WT或质粒pAAV2-CYP4V2 opt共转染HEK 293T细胞，初步形成重组腺相关病毒载体。

1.2 腺病毒载体的分离和纯化

AAV载体的生产采用三质粒系统，即用含CYP4V2目的基因的穿梭质粒、带AAV载体repcap基因的pRepCap质粒和辅助质粒pHelper，以PEI为转染试剂，共同转染HEK293细胞，重组包装出AAV病毒载体。转染后48-72小时进行收获，收获液经亲和层析纯化后，通过阴离子层析进一步纯化，超滤浓缩，置换缓冲液。纯化后的重组AAV病毒载体测定基因组滴度，除菌过滤分装后备用。

实施例2：密码子优化的CYP4V2 opt的体外表达检测

本实施例在HEK293和ARPE-19两种细胞系中评估了密码子优化的CYP4V2 opt的体外表达水平。其中，HEK293细胞系采用质粒转染的方法，ARPE-19细胞系中采用AAV病毒侵染的方法，将目的基因导入细胞。

在HEK293中，瞬时转染了表达CYP4V2 WT的质粒AAV2-CYP4V2 WT或表达CYP4V2opt的质粒AAV2-CYP4V2 opt，并通过Western印迹分析评估了细胞裂解物中的蛋白质表达(图2)。密码子优化后CYP4V2的基因opt6、opt7、opt8、opt18（SEQ ID NO 8、6、7、5）在HEK293细胞中的表达水平都明显高于野生型人源CYP4V2基因（WT）。

在ARPE-19中，通过质粒AAV2-CYP4V2 WT或质粒AAV2-CYP4V2 opt侵染后，Western印迹分析评估了细胞裂解物中的蛋白质表达(图3)。

由图2和图3可见，和野生型人源CYP4V2 WT基因相比，密码子优化后CYP4V2 opt的基因，尤其是opt18明显表现出更高的表达水平。

实施例3：BCD细胞模型的构建和鉴定

为了评定AAV2-CYP4V2 WT和opt基因在BCD基因疗法中的功效，本实施例用CRISPR-Cas9方法在HEK293和ARPE-19两种细胞系中构建了带有CYP4V2突变的细胞模型（图4和图5）。

细胞模型的构建策略如图4A所示。在外显子5附近设计了Exon5-sgRNA1（其核苷酸序列如表1所示），在外显子7附近设计了Exon7-sgRNA1、Exon7-sgRNA2和Exon7-sgRNA3（其核苷酸序列分别如表1所示），四种sgRNA均构建至Cas9-sgRNA载体（Addgene，#58766），获得Cas9-sgRNA质粒；将所述Cas9-sgRNA质粒分别瞬时转染至HEK293和ARPE-19两种细胞，转染48h后，加入嘌呤霉素去除转染不成功细胞，然后通过有限稀释法将细胞接种96孔培养板中培养，2~3周后PCR鉴定96孔板中单克隆细胞基因型。所用引物序列详见表1。

表1 用CRIPSR/Cas9构建CYP4V2突变细胞所用的sgRNA和引物序列

单克隆细胞筛选扩增后，通过基因测序验证带有正确突变的细胞克隆，结果如图4B和5A所示。对细胞克隆的基因型，蛋白产物的描述见表格2。野生型CYP4V2蛋白全长序列如SEQ ID NO 27所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO 28所示。CYP4V2外显子5的突变细胞在全长序列的223-224aa发生移码突变，外显子7的突变细胞在268-271aa发生移码突变，表达比野生型截短的蛋白。

表2. 用CRIPSR/Cas9构建CYP4V2突变细胞

用通过检测细胞增殖和自噬体功能对HEK293带有CYP4V2突变的细胞进行表型鉴定。文献报导，在由BCD病人的iPSC细胞分化的RPE细胞中存在细胞增殖率降低和自噬体的功能缺失（Hata, M., et al. (2018). "Reduction of lipid accumulation rescuesBietti's crystalline dystrophy phenotypes." Proc Natl Acad Sci U S A 115(15):3936-3941）。本发明人发现，与HEK293 WT细胞相比，HEK293突变细胞的胞增殖率显著降低。本发明人评估了在HEK293 WT和突变细胞中的自噬体标志物微管相关蛋白1轻链3（LC3）的蛋白水平。LC3蛋白的C端处理产生LC3-I。在自噬体的形成过程中引发修饰，使LC3-I变为LC3-II。结果显示LC3-II蛋白的表达水平在HEK293突变细胞中比在HEK293 WT细胞中高。Bafilomycin-A1，一种液泡H+-ATPase抑制剂，能增加WT细胞中的LC3-II蛋白水平，但不能增加突变细胞中的LC3-II蛋白水平。表明突变细胞中自噬体累积但自噬通量受损。这些观察结果显示CYP4V2突变引起细胞正常功能缺失，在HEK293细胞中造成细胞增殖降低和自噬体功能缺陷（图4C-E）。图4以5-C14细胞为代表展示鉴定结果。其他的细胞克隆也有相似的表型结果。

在特征更接近RPE细胞的ARPE-19细胞系中，CYP4V2突变也引起了细胞表型的变化。ARPE-19细胞是源自人视网膜色素上皮细胞，细胞表面表达有RPE细胞的表面标记CRALBP和RPE-65的表达。采用CRISPR-Cas9技术获得CYP4V2突变的ARPE-19细胞(图5A)，与ARPE-19 WT细胞相比，ARPE-19突变细胞的细胞增殖率显著降低（图5B），CYP4V2基因在眼部RPE细胞层编码参与脂肪酸代谢的羟基化酶，维持视网膜多聚不饱和脂肪酸的稳态平衡。在CYP4V2突变的ARPE-19细胞系中，细胞用160μM花生四烯酸（AA）连续处理4天，然后用5μMBODIPY 493/503脂质染色后可见脂肪颗粒沉积显著高于野生型细胞（图5C-5D）。透射电镜观察结果显示，突变细胞中出现了更多数目的自噬泡（图5E）。这些观察结果显示CYP4V2突变引起细胞正常功能缺失，在ARPE-19细胞中造成细胞增殖降低，脂肪代谢异常和自噬体功能缺陷。图5以5-C13细胞为代表展示鉴定结果。

实施例4：密码子优化的AAV2-CYP4V2 opt的在BCD细胞模型中的体外药效评价

在带有CYP4V2突变的HEK293和ARPE-19两种BCD细胞模型中用AAV病毒侵染评估了密码子优化的CYP4V2 opt的体外药效。

AAV2介导的CYP4V2 WT和opt在HEK293 CYP4V2突变的BCD细胞模型中的表达如图6A所示。在相同病毒感染量的条件下，侵染的CYP4V2 opt的表达量高于WT。

CYP4V2 WT和opt的表达在HEK293 BCD细胞模型中修复了突变细胞的细胞增殖率缺陷，并且存在剂量依赖性（图6B-C）。CYP4V2 opt对突变细胞的功能修复后细胞增殖水平仍低于野生型HEK293细胞，表明CYP4V2 opt的表达没有使细胞过度活化（图6D）。

和部分修复细胞增殖降低的结果一致，CYP4V2 WT和opt的表达也部分恢复了突变细胞的自噬体功能缺陷。突变细胞中表达AAV2-CYP4V2 WT或opt和EGFP对照相比，没有显著修复自噬体累积（未加入Baf处理的情况：NT条件下）。但经Bafilomycin-A1（Baf）处理的条件下，有AAV2-CYP4V2 WT或opt表达的突变细胞中自噬通量显著上升，表明自噬功能被部分恢复（图6E-F）。

同样，AAV2介导的CYP4V2 WT和opt在ARPE-19 CYP4V2突变的BCD细胞模型也表现出治疗效果。AAV2-WT与AAV2-opt18病毒侵染ARPE-19突变细胞5-C13，如图5C-5D显示，AAV2-WT和AAV2-opt18病毒侵染的ARPE-19突变细胞5-C13内，和未经侵染的突变细胞比较，脂质沉积颗粒明显减少，达到野生型ARPE-19细胞水平。优化基因opt18降低脂质沉积的效果与WT相比更好，具有明显统计学差异。（图5C-5D）。

图5-6以CYP4V2 opt18为代表展示结果。其他的opt基因的表达也有相似的表型结果。

这些结果表明，在HEK293和ARPE-19BCD细胞模型中观察到的表型缺陷是由CYP4V2基因的功能缺失引起。补充CYP4V2基因的表达能实现恢复这些细胞功能缺陷，具有治疗BCD的效果。

实施例5：密码子优化的CYP4V2 opt的体内表达检测

采用视网膜下腔注射，对4周龄野生型C57BL/6小鼠的眼球注射1µl 1.5×10¹²vg/ml的AAV2-CYP4V2 WT和opt重组病毒颗粒，注射后每隔4周进行眼部组织取样，小鼠眼部组织匀浆后加入RIPA裂解液裂解组织，匀浆裂解。通过SDS-PAGE分离等量的总蛋白，然后进行免疫印迹，蛋白定量后Western检测CYP4V2表达水平。基因的表达水平通过Western印迹检测进行分析。密码子优化后CYP4V2 opt基因的蛋白表达水平和WT进行比较。注射后4周的结果表明，AAV2- CYP4V2 opt基因在小鼠眼部以比WT更高的水平表达（图7）。

实施例6：高脂喂养的CYP4V3 KO BCD小鼠模型的表型鉴定

人源CYP4V2基因在小鼠的同源基因CYP4V3的敲除（knockout，KO）模型与BCD患者相比，具有较少的生理和功能变化，而且表型出现远晚于病人。6个月小鼠（相当于人类20-30岁）有零星眼部脂质沉积，12个月（相当于人类50岁，已经出现眼盲）有明显脂质沉积但没有眼睛ERG功能和视力缺失（Lockhart, C. M., et al. (2014). "Generation andcharacterization of a murine model of Bietti crystalline dystrophy." InvestOphthalmol Vis Sci 55(9): 5572-5581）。给予高脂饮食（high fat diet, HFD）后，视网膜病变的发生在CYP4V3 KO小鼠模型中加速和聚集（Qu, B., et al. (2020). "TreatingBietti crystalline dystrophy in a high-fat diet-exacerbated murine modelusing gene therapy." Gene Ther 27(7-8): 370-382）。本实施例采取了在小鼠出生离乳后进行HFD喂养，4周周龄后每隔4周进行眼底成像观察，OCT和ERG功能检测。

实施例7：密码子优化的AAV2-CYP4V2 opt的在BCD小鼠模型中的体内药效评价

采用视网膜下腔注射，对高脂喂养出现眼底病理变化的CYP4V3 KO BCD小鼠的眼球注射1µl 5e12 vg/ml的AAV2-GFP 或CYP4V2 opt病毒颗粒。注射后每隔4周进行OCT和ERG功能检测，比较分析AAV2-GFP和CYP4V2 opt病毒颗粒的治疗效果。

序列表

<110> 苏州诺洁贝生物技术有限公司

<120> 优化的CPY4V2基因及其用途

<130> MTI21296

<160> 28

<210> 1

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 1

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcct 145

<210> 2

<211> 380

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 2

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg 380

<210> 3

<211> 278

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 3

tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60

ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120

ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 180

cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240

ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcg 278

<210> 4

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 4

ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 60

ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 120

ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 180

agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc 240

gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc 300

tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg 360

ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg 420

tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac 480

ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt 540

ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg 600

gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc 660

ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 720

cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc 780

ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag 840

ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg 900

cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg 960

accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacag 1017

<210> 5

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 5

gctggcctgt ggctgggcct ggtgtggcag aagctgttgc tgtggggggc tgcctctgcc 60

ctgagcctgg ctggggctag cctggtgttg agcctgctgc agagagtggc tagctatgct 120

agaaagtggc agcagatgag acccatcccc acagtggcaa gagcctaccc tctggtgggc 180

catgccctgc tgatgaagcc tgatggcaga gagttctttc agcagatcat agagtacaca 240

gaggagtaca gacacatgcc cctgctgaaa ctgtgggtgg gccctgtgcc catggtggct 300

ctgtacaatg ctgagaatgt ggaggtgatt ctgacaagca gcaagcagat tgacaagagc 360

tccatgtaca agttcctgga gccctggctg ggcctgggac tgctgacaag cactggcaac 420

aagtggagaa gcagaagaaa gatgctgacc cccaccttcc acttcaccat cctggaggac 480

ttcctggaca ttatgaatga gcaagccaac atcctggtga aaaagctgga aaagcacatc 540

aaccaagagg ccttcaactg cttcttctac atcaccctgt gtgccctgga catcatctgt 600

gagacagcca tgggcaagaa catcggggcc cagagcaatg atgactctga gtatgtgaga 660

gctgtgtaca gaatgtctga gatgatcttc agaagaatca agatgccctg gctgtggctg 720

gacctgtggt acctgatgtt caaggagggc tgggagcaca aaaagagcct gcagatcctg 780

cacaccttca ccaactctgt gatcgccgag agagccaatg agatgaatgc caatgaggac 840

tgcagagggg atggcagagg ctctgcccct agcaagaaca agagaagagc cttcctggac 900

ctgttgctgt ctgtgaccga cgatgagggc aacagactga gccatgagga catcagagaa 960

gaggtggaca catttatgtt tgagggccat gacaccacag ctgctgccat aaactggagc 1020

ctgtacctgc tgggcagcaa ccctgaggtg cagaagaagg tggaccatga gctggatgat 1080

gtgtttggca agtctgacag acctgccaca gtggaggacc tgaagaagct gagatacctg 1140

gagtgtgtga tcaaggagac cctgagactg ttcccctctg tgcccctgtt tgctagatct 1200

gtgtctgagg actgtgaggt ggctggctat agagtgctga agggcacaga ggctgtgatc 1260

atcccctatg ccctgcacag agaccctaga tacttcccca accctgagga gtttcagcct 1320

gagagattct tccctgagaa tgcccaaggc agacacccct atgcctatgt gccattctct 1380

gctggcccaa gaaactgcat tgggcagaag tttgctgtga tggaggagaa gaccatcctg 1440

agctgcatct tgagacactt ctggattgag agcaatcaga agagagagga gctgggcctg 1500

gaggggcagc tgatactgag accaagcaat ggcatctgga tcaagctgaa gagaagaaat 1560

gctgatgaga ga 1572

<210> 6

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 6

gctggcctgt ggctgggcct ggtgtggcag aagctgctgc tgtggggagc tgcctctgcc 60

ctgtctctgg ctggagccag cctggtgctg agcctgctgc agagagtggc cagctatgcc 120

aggaaatggc aacagatgag acctatcccc acagtggcca gagcctaccc cctggttggc 180

catgccctgc tgatgaagcc tgatggcaga gagttcttcc agcagatcat tgagtacaca 240

gaagagtaca gacacatgcc tctgctgaag ctgtgggtgg gccctgtgcc catggtggcc 300

ctgtacaatg cagagaatgt ggaagtgatc ctgaccagca gcaagcagat agacaagtcc 360

agcatgtaca agttcctgga accttggctg ggcctgggcc tgctcacctc cacaggcaac 420

aagtggagaa gcagaaggaa gatgctgacc ccaaccttcc acttcaccat cctggaggac 480

tttctggaca tcatgaatga gcaggccaac atcctggtca aaaaactgga aaagcacatc 540

aaccaggaag ccttcaactg cttcttctac atcaccctgt gtgccctgga catcatctgc 600

gagacagcca tgggcaagaa catcggagcc cagagcaatg atgactctga atatgtcagg 660

gcagtgtaca gaatgtctga gatgatcttc cggcggatca agatgccttg gctgtggctg 720

gacctgtggt acctgatgtt caaagagggc tgggagcaca agaagagcct gcagatcctg 780

cacaccttca ccaacagcgt gattgctgag cgggccaatg aaatgaacgc caatgaggac 840

tgcagaggag atggcagagg ctctgccccc agcaagaaca agagaagagc cttcctggac 900

ctgctgctgt ccgtgacaga tgatgagggc aacagactga gccacgagga catcagagag 960

gaagtggaca cctttatgtt tgaaggccat gacaccacag ctgctgccat caactggagc 1020

ctgtacctcc tgggcagcaa ccctgaggtg cagaagaagg tggaccatga gctggatgat 1080

gtgtttggca agtctgacag acctgccaca gtggaagacc tgaagaaact caggtacctg 1140

gaatgtgtga tcaaagagac cctgagactg ttcccaagtg tgcctctgtt tgccagatct 1200

gtctctgagg actgtgaagt ggctggctac agagtgctga agggcacaga ggcagttatc 1260

atcccctatg ccctgcacag agaccccaga tacttcccca accctgaaga gttccagcct 1320

gagagattct tcccagagaa tgcccagggc agacaccctt atgcctatgt gcccttctca 1380

gctggaccta gaaactgcat aggccaaaag tttgcagtga tggaagagaa gaccatcctg 1440

agctgcatcc tgaggcactt ctggattgag agcaaccaga agagagagga actgggcctg 1500

gaaggacagc tgatcctgag gcctagcaat ggcatctgga tcaagctgaa aagaagaaat 1560

gctgatgaga gg 1572

<210> 7

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 7

gctggcctgt ggctgggcct ggtgtggcag aaactgctgc tgtggggagc tgcctctgcc 60

ctgtctctgg ctggagcctc ccttgtcctg tccctcctgc aaagagttgc cagctatgcc 120

agaaagtggc agcagatgag acccatcccc acagtggcca gggcctaccc actggtgggc 180

catgccctgc tgatgaagcc tgatggcaga gaattctttc agcagatcat agagtacaca 240

gaggagtaca gacacatgcc tctgctgaag ctgtgggtgg gccctgtgcc tatggtggcc 300

ctgtacaatg ctgagaatgt ggaagtgatc ctgaccagca gcaagcagat tgacaagagc 360

agcatgtaca agttcctgga gccttggctg ggcctgggcc tgctgaccag cacaggcaac 420

aagtggagaa gcaggagaaa gatgctgacc cccaccttcc acttcaccat cctggaagac 480

ttcctggaca tcatgaatga gcaggccaac atcctggtga aaaagctgga aaaacacatc 540

aaccaggaag ccttcaactg cttcttctac attaccctgt gtgccctgga catcatctgc 600

gagacagcca tgggaaaaaa catcggagct cagagcaatg atgacagcga gtatgtgaga 660

gcagtgtacc ggatgagcga aatgatcttc agacggatca agatgccctg gctgtggctg 720

gacctgtggt acctcatgtt taaggagggc tgggaacaca agaagagcct gcagatcctg 780

cacaccttca caaacagtgt gatcgctgaa agggccaacg agatgaatgc caatgaggat 840

tgcagaggcg atggccgcgg ctccgcccct agcaagaaca agagaagagc cttcctggac 900

ctgctgctgt ctgtcaccga tgacgagggc aaccggctgt ctcatgagga catcagagaa 960

gaggtggaca ccttcatgtt tgagggccac gacaccacag ccgccgccat caactggagc 1020

ctgtacctgc ttggcagcaa ccctgaggtg caaaagaagg tggaccatga gctggatgat 1080

gtttttggca aatctgacag acctgccaca gtggaggacc tgaagaaact gagatacctg 1140

gagtgtgtga tcaaggaaac cctgagactc ttccctagtg tgcctctgtt tgccagatct 1200

gtctcagagg actgtgaggt ggctggctac agagtgctga agggcacaga agcagtgatc 1260

atcccctatg ccctgcacag agaccccaga tacttcccca accctgagga attccagcca 1320

gagaggttct tccctgagaa tgcccaggga agacacccat atgcctatgt gcctttctct 1380

gctggcccca gaaactgcat tggacagaag tttgctgtga tggaggaaaa gaccatcctg 1440

agctgcatcc tgagacactt ctggatagaa agcaaccaga agagggaaga gctgggcctg 1500

gaaggccagc tgatcctgag gcctagcaat ggcatctgga tcaaactgaa gagaagaaat 1560

gcagatgaga ga 1572

<210> 8

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 8

gctggcctgt ggctgggcct ggtgtggcag aagctgctgc tgtggggagc tgcctctgcc 60

ctgtccctgg ctggagcctc tctggtgctg agcctgctgc agagagtggc cagctatgcc 120

aggaaatggc aacagatgag acccatccca acagtggcca gagcctaccc cctggttggc 180

catgccctgc tgatgaagcc tgatggcaga gagttcttcc agcagatcat tgagtacaca 240

gaggaataca gacacatgcc tctgctgaag ctgtgggtgg gccctgtgcc catggtggcc 300

ctgtacaatg cagagaatgt ggaagtgatc ctgacctcca gcaagcagat agacaagagc 360

agcatgtaca agttcctgga accttggctg ggccttggcc tgctcaccag cacaggcaac 420

aagtggagaa gcagaaggaa gatgctgacc cctaccttcc acttcaccat cctggaggac 480

tttctggaca tcatgaatga gcaggccaac atcctggtca aaaagctgga aaagcacatc 540

aaccaggagg ccttcaactg cttcttctac atcaccctgt gtgccctgga catcatctgc 600

gagacagcca tgggcaaaaa catcggagcc cagagcaatg atgactctga gtatgtgcgg 660

gctgtgtacc ggatgagcga aatgatcttc agacggatca agatgccctg gctgtggctg 720

gacctctggt acctgatgtt caaagaaggc tgggagcaca agaagagcct gcagatcctg 780

cacaccttca ccaacagcgt gattgcagaa agagccaatg agatgaatgc caacgaggac 840

tgcagaggag atggcagagg ctctgcccct agcaagaaca agagaagggc ctttctggac 900

ctgctgctgt ctgtcacaga tgatgagggc aacagactga gccacgagga catcagagag 960

gaagtggaca ccttcatgtt tgaaggccat gacaccacag ctgctgccat caactggtcc 1020

ctgtacctgc tgggcagcaa ccctgaggtg cagaagaagg tggaccatga gctggatgat 1080

gtgtttggca agtctgacag acctgccaca gtggaagacc tgaaaaagct gagatacctg 1140

gaatgtgtga tcaaagagac cctgagactg ttcccttctg tgcctctgtt tgccagaagt 1200

gtttctgagg actgtgaagt ggctggctac agagtgctga agggcacaga ggcagtcatc 1260

atcccctatg ccctgcacag agaccccagg tacttcccca accctgagga gttccagcct 1320

gaaagattct tcccagagaa tgcccagggc agacacccat atgcctatgt gcccttctca 1380

gctggaccta gaaactgcat aggacaaaag tttgcagtga tggaagagaa gaccatcctg 1440

agctgcatcc tgaggcactt ctggattgag agcaaccaga aaagagagga actgggcctg 1500

gaaggccagc tgatcctcag gcctagcaat ggcatctgga tcaagctgaa gagaaggaat 1560

gctgatgaga ga 1572

<210> 9

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 9

gcggggctct ggctggggct cgtgtggcag aagctgctgc tgtggggcgc ggcgagtgcc 60

ctttccctgg ccggcgccag tctggtcctg agcctgctgc agagggtggc gagctacgcg 120

cggaaatggc agcagatgcg gcccatcccc acggtggccc gcgcctaccc actggtgggc 180

cacgcgctgc tgatgaagcc ggacgggcga gaattttttc agcagatcat tgagtacaca 240

gaggaatacc gccacatgcc gctgctgaag ctctgggtcg ggccagtgcc catggtggcc 300

ctttataatg cagaaaatgt ggaggtaatt ttaactagtt caaagcaaat tgacaaatcc 360

tctatgtaca agtttttaga accatggctt ggcctaggac ttcttacaag tactggaaac 420

aaatggcgct ccaggagaaa gatgttaaca cccactttcc attttaccat tctggaagat 480

ttcttagata tcatgaatga acaagcaaat atattggtta agaaacttga aaaacacatt 540

aaccaagaag catttaactg ctttttttac atcactcttt gtgccttaga tatcatctgt 600

gaaacagcta tggggaagaa tattggtgct caaagtaatg atgattccga gtatgtccgt 660

gcagtttata gaatgagtga gatgatattt cgaagaataa agatgccctg gctttggctt 720

gatctctggt accttatgtt taaagaagga tgggaacaca aaaagagcct tcagatccta 780

catactttta ccaacagtgt catcgctgaa cgggccaatg aaatgaacgc caatgaagac 840

tgtagaggtg atggcagggg ctctgccccc tccaaaaata aacgcagggc ctttcttgac 900

ttgcttttaa gtgtgactga tgacgaaggg aacaggctaa gtcatgaaga tattcgagaa 960

gaagttgaca ccttcatgtt tgaggggcac gatacaactg cagctgcaat aaactggtcc 1020

ttatacctgt tgggttctaa cccagaagtc cagaaaaaag tggatcatga attggatgac 1080

gtgtttggga agtctgaccg tcccgctaca gtagaagacc tgaagaaact tcggtatctg 1140

gaatgtgtta ttaaggagac ccttcgcctt tttccttctg ttcctttatt tgcccgtagt 1200

gttagtgaag attgtgaagt ggcaggttac agagttctaa aaggcactga agccgtcatc 1260

attccctatg cattgcacag agatccgaga tacttcccca accccgagga gttccagcct 1320

gagcggttct tccccgagaa tgcacaaggg cgccatccat atgcctacgt gcccttctct 1380

gctggcccca ggaactgtat aggtcaaaag tttgctgtga tggaagaaaa gaccattctt 1440

tcgtgcatcc tgaggcactt ttggatagaa tccaaccaga aaagagaaga gcttggtcta 1500

gaaggacagt tgattcttcg tccaagtaat ggcatctgga tcaagttgaa gaggagaaat 1560

gcagatgaac gc 1572

<210> 10

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 10

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225

<210> 11

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 11

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145

<210> 12

<211> 3961

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 12

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcctctcga ggagcttggc ccattgcata cgttgtatcc 180

atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca ttaccgccat gttactagtg 240

tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 300

cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 360

caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 420

gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 480

tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 540

ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 600

attagtcatc gctattacca tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat 660

ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc 720

gatgggggcg gggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg 780

gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 840

tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc 900

gggagtcgct gcgcgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 960

gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 1020

tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga 1080

aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 1140

cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 1200

ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 1260

gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 1320

gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca 1380

cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg 1440

tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 1500

ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg 1560

cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc 1620

gcagggactt cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac 1680

cccctctagc gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga 1740

gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc 1800

gcggggggac ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt 1860

gaccggcggc tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct 1920

cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tcggcgcgcc 1980

gccaccatgg ctggcctgtg gctgggcctg gtgtggcaga agctgctgct gtggggagct 2040

gcctctgccc tgtccctggc tggagcctct ctggtgctga gcctgctgca gagagtggcc 2100

agctatgcca ggaaatggca acagatgaga cccatcccaa cagtggccag agcctacccc 2160

ctggttggcc atgccctgct gatgaagcct gatggcagag agttcttcca gcagatcatt 2220

gagtacacag aggaatacag acacatgcct ctgctgaagc tgtgggtggg ccctgtgccc 2280

atggtggccc tgtacaatgc agagaatgtg gaagtgatcc tgacctccag caagcagata 2340

gacaagagca gcatgtacaa gttcctggaa ccttggctgg gccttggcct gctcaccagc 2400

acaggcaaca agtggagaag cagaaggaag atgctgaccc ctaccttcca cttcaccatc 2460

ctggaggact ttctggacat catgaatgag caggccaaca tcctggtcaa aaagctggaa 2520

aagcacatca accaggaggc cttcaactgc ttcttctaca tcaccctgtg tgccctggac 2580

atcatctgcg agacagccat gggcaaaaac atcggagccc agagcaatga tgactctgag 2640

tatgtgcggg ctgtgtaccg gatgagcgaa atgatcttca gacggatcaa gatgccctgg 2700

ctgtggctgg acctctggta cctgatgttc aaagaaggct gggagcacaa gaagagcctg 2760

cagatcctgc acaccttcac caacagcgtg attgcagaaa gagccaatga gatgaatgcc 2820

aacgaggact gcagaggaga tggcagaggc tctgccccta gcaagaacaa gagaagggcc 2880

tttctggacc tgctgctgtc tgtcacagat gatgagggca acagactgag ccacgaggac 2940

atcagagagg aagtggacac cttcatgttt gaaggccatg acaccacagc tgctgccatc 3000

aactggtccc tgtacctgct gggcagcaac cctgaggtgc agaagaaggt ggaccatgag 3060

ctggatgatg tgtttggcaa gtctgacaga cctgccacag tggaagacct gaaaaagctg 3120

agatacctgg aatgtgtgat caaagagacc ctgagactgt tcccttctgt gcctctgttt 3180

gccagaagtg tttctgagga ctgtgaagtg gctggctaca gagtgctgaa gggcacagag 3240

gcagtcatca tcccctatgc cctgcacaga gaccccaggt acttccccaa ccctgaggag 3300

ttccagcctg aaagattctt cccagagaat gcccagggca gacacccata tgcctatgtg 3360

cccttctcag ctggacctag aaactgcata ggacaaaagt ttgcagtgat ggaagagaag 3420

accatcctga gctgcatcct gaggcacttc tggattgaga gcaaccagaa aagagaggaa 3480

ctgggcctgg aaggccagct gatcctcagg cctagcaatg gcatctggat caagctgaag 3540

agaaggaatg ctgatgagag ataaagatct gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca 3600

tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc 3660

ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 3720

gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct 3780

ggggatgcgg tgggctctat ggatccccta actacaagga acccctagtg atggagttgg 3840

ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 3900

gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 3960

a 3961

<210> 13

<211> 3961

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 13

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcctctcga ggagcttggc ccattgcata cgttgtatcc 180

atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca ttaccgccat gttactagtg 240

tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 300

cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 360

caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 420

gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 480

tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 540

ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 600

attagtcatc gctattacca tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat 660

ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc 720

gatgggggcg gggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg 780

gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 840

tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc 900

gggagtcgct gcgcgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 960

gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 1020

tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga 1080

aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 1140

cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 1200

ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 1260

gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 1320

gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca 1380

cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg 1440

tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 1500

ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg 1560

cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc 1620

gcagggactt cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac 1680

cccctctagc gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga 1740

gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc 1800

gcggggggac ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt 1860

gaccggcggc tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct 1920

cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tcggcgcgcc 1980

gccaccatgg ctggcctgtg gctgggcctg gtgtggcaga agctgctgct gtggggagct 2040

gcctctgccc tgtctctggc tggagccagc ctggtgctga gcctgctgca gagagtggcc 2100

agctatgcca ggaaatggca acagatgaga cctatcccca cagtggccag agcctacccc 2160

ctggttggcc atgccctgct gatgaagcct gatggcagag agttcttcca gcagatcatt 2220

gagtacacag aagagtacag acacatgcct ctgctgaagc tgtgggtggg ccctgtgccc 2280

atggtggccc tgtacaatgc agagaatgtg gaagtgatcc tgaccagcag caagcagata 2340

gacaagtcca gcatgtacaa gttcctggaa ccttggctgg gcctgggcct gctcacctcc 2400

acaggcaaca agtggagaag cagaaggaag atgctgaccc caaccttcca cttcaccatc 2460

ctggaggact ttctggacat catgaatgag caggccaaca tcctggtcaa aaaactggaa 2520

aagcacatca accaggaagc cttcaactgc ttcttctaca tcaccctgtg tgccctggac 2580

atcatctgcg agacagccat gggcaagaac atcggagccc agagcaatga tgactctgaa 2640

tatgtcaggg cagtgtacag aatgtctgag atgatcttcc ggcggatcaa gatgccttgg 2700

ctgtggctgg acctgtggta cctgatgttc aaagagggct gggagcacaa gaagagcctg 2760

cagatcctgc acaccttcac caacagcgtg attgctgagc gggccaatga aatgaacgcc 2820

aatgaggact gcagaggaga tggcagaggc tctgccccca gcaagaacaa gagaagagcc 2880

ttcctggacc tgctgctgtc cgtgacagat gatgagggca acagactgag ccacgaggac 2940

atcagagagg aagtggacac ctttatgttt gaaggccatg acaccacagc tgctgccatc 3000

aactggagcc tgtacctcct gggcagcaac cctgaggtgc agaagaaggt ggaccatgag 3060

ctggatgatg tgtttggcaa gtctgacaga cctgccacag tggaagacct gaagaaactc 3120

aggtacctgg aatgtgtgat caaagagacc ctgagactgt tcccaagtgt gcctctgttt 3180

gccagatctg tctctgagga ctgtgaagtg gctggctaca gagtgctgaa gggcacagag 3240

gcagttatca tcccctatgc cctgcacaga gaccccagat acttccccaa ccctgaagag 3300

ttccagcctg agagattctt cccagagaat gcccagggca gacaccctta tgcctatgtg 3360

cccttctcag ctggacctag aaactgcata ggccaaaagt ttgcagtgat ggaagagaag 3420

accatcctga gctgcatcct gaggcacttc tggattgaga gcaaccagaa gagagaggaa 3480

ctgggcctgg aaggacagct gatcctgagg cctagcaatg gcatctggat caagctgaaa 3540

agaagaaatg ctgatgagag gtaaagatct gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca 3600

tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc 3660

ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 3720

gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct 3780

ggggatgcgg tgggctctat ggatccccta actacaagga acccctagtg atggagttgg 3840

ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 3900

gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 3960

a 3961

<210> 14

<211> 3961

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 14

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcctctcga ggagcttggc ccattgcata cgttgtatcc 180

atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca ttaccgccat gttactagtg 240

tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 300

cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 360

caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 420

gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 480

tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 540

ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 600

attagtcatc gctattacca tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat 660

ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc 720

gatgggggcg gggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg 780

gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 840

tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc 900

gggagtcgct gcgcgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 960

gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 1020

tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga 1080

aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 1140

cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 1200

ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 1260

gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 1320

gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca 1380

cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg 1440

tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 1500

ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg 1560

cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc 1620

gcagggactt cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac 1680

cccctctagc gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga 1740

gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc 1800

gcggggggac ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt 1860

gaccggcggc tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct 1920

cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tcggcgcgcc 1980

gccaccatgg ctggcctgtg gctgggcctg gtgtggcaga aactgctgct gtggggagct 2040

gcctctgccc tgtctctggc tggagcctcc cttgtcctgt ccctcctgca aagagttgcc 2100

agctatgcca gaaagtggca gcagatgaga cccatcccca cagtggccag ggcctaccca 2160

ctggtgggcc atgccctgct gatgaagcct gatggcagag aattctttca gcagatcata 2220

gagtacacag aggagtacag acacatgcct ctgctgaagc tgtgggtggg ccctgtgcct 2280

atggtggccc tgtacaatgc tgagaatgtg gaagtgatcc tgaccagcag caagcagatt 2340

gacaagagca gcatgtacaa gttcctggag ccttggctgg gcctgggcct gctgaccagc 2400

acaggcaaca agtggagaag caggagaaag atgctgaccc ccaccttcca cttcaccatc 2460

ctggaagact tcctggacat catgaatgag caggccaaca tcctggtgaa aaagctggaa 2520

aaacacatca accaggaagc cttcaactgc ttcttctaca ttaccctgtg tgccctggac 2580

atcatctgcg agacagccat gggaaaaaac atcggagctc agagcaatga tgacagcgag 2640

tatgtgagag cagtgtaccg gatgagcgaa atgatcttca gacggatcaa gatgccctgg 2700

ctgtggctgg acctgtggta cctcatgttt aaggagggct gggaacacaa gaagagcctg 2760

cagatcctgc acaccttcac aaacagtgtg atcgctgaaa gggccaacga gatgaatgcc 2820

aatgaggatt gcagaggcga tggccgcggc tccgccccta gcaagaacaa gagaagagcc 2880

ttcctggacc tgctgctgtc tgtcaccgat gacgagggca accggctgtc tcatgaggac 2940

atcagagaag aggtggacac cttcatgttt gagggccacg acaccacagc cgccgccatc 3000

aactggagcc tgtacctgct tggcagcaac cctgaggtgc aaaagaaggt ggaccatgag 3060

ctggatgatg tttttggcaa atctgacaga cctgccacag tggaggacct gaagaaactg 3120

agatacctgg agtgtgtgat caaggaaacc ctgagactct tccctagtgt gcctctgttt 3180

gccagatctg tctcagagga ctgtgaggtg gctggctaca gagtgctgaa gggcacagaa 3240

gcagtgatca tcccctatgc cctgcacaga gaccccagat acttccccaa ccctgaggaa 3300

ttccagccag agaggttctt ccctgagaat gcccagggaa gacacccata tgcctatgtg 3360

cctttctctg ctggccccag aaactgcatt ggacagaagt ttgctgtgat ggaggaaaag 3420

accatcctga gctgcatcct gagacacttc tggatagaaa gcaaccagaa gagggaagag 3480

ctgggcctgg aaggccagct gatcctgagg cctagcaatg gcatctggat caaactgaag 3540

agaagaaatg cagatgagag ataaagatct gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca 3600

tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc 3660

ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 3720

gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct 3780

ggggatgcgg tgggctctat ggatccccta actacaagga acccctagtg atggagttgg 3840

ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 3900

gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 3960

a 3961

<210> 15

<211> 3961

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 15

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcctctcga ggagcttggc ccattgcata cgttgtatcc 180

atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca ttaccgccat gttactagtg 240

tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 300

cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 360

caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 420

gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 480

tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 540

ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 600

attagtcatc gctattacca tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat 660

ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc 720

gatgggggcg gggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg 780

gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 840

tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc 900

gggagtcgct gcgcgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 960

gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 1020

tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga 1080

aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 1140

cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 1200

ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 1260

gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 1320

gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca 1380

cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg 1440

tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 1500

ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg 1560

cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc 1620

gcagggactt cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac 1680

cccctctagc gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga 1740

gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc 1800

gcggggggac ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt 1860

gaccggcggc tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct 1920

cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tcggcgcgcc 1980

gccaccatgg ctggcctgtg gctgggcctg gtgtggcaga agctgttgct gtggggggct 2040

gcctctgccc tgagcctggc tggggctagc ctggtgttga gcctgctgca gagagtggct 2100

agctatgcta gaaagtggca gcagatgaga cccatcccca cagtggcaag agcctaccct 2160

ctggtgggcc atgccctgct gatgaagcct gatggcagag agttctttca gcagatcata 2220

gagtacacag aggagtacag acacatgccc ctgctgaaac tgtgggtggg ccctgtgccc 2280

atggtggctc tgtacaatgc tgagaatgtg gaggtgattc tgacaagcag caagcagatt 2340

gacaagagct ccatgtacaa gttcctggag ccctggctgg gcctgggact gctgacaagc 2400

actggcaaca agtggagaag cagaagaaag atgctgaccc ccaccttcca cttcaccatc 2460

ctggaggact tcctggacat tatgaatgag caagccaaca tcctggtgaa aaagctggaa 2520

aagcacatca accaagaggc cttcaactgc ttcttctaca tcaccctgtg tgccctggac 2580

atcatctgtg agacagccat gggcaagaac atcggggccc agagcaatga tgactctgag 2640

tatgtgagag ctgtgtacag aatgtctgag atgatcttca gaagaatcaa gatgccctgg 2700

ctgtggctgg acctgtggta cctgatgttc aaggagggct gggagcacaa aaagagcctg 2760

cagatcctgc acaccttcac caactctgtg atcgccgaga gagccaatga gatgaatgcc 2820

aatgaggact gcagagggga tggcagaggc tctgccccta gcaagaacaa gagaagagcc 2880

ttcctggacc tgttgctgtc tgtgaccgac gatgagggca acagactgag ccatgaggac 2940

atcagagaag aggtggacac atttatgttt gagggccatg acaccacagc tgctgccata 3000

aactggagcc tgtacctgct gggcagcaac cctgaggtgc agaagaaggt ggaccatgag 3060

ctggatgatg tgtttggcaa gtctgacaga cctgccacag tggaggacct gaagaagctg 3120

agatacctgg agtgtgtgat caaggagacc ctgagactgt tcccctctgt gcccctgttt 3180

gctagatctg tgtctgagga ctgtgaggtg gctggctata gagtgctgaa gggcacagag 3240

gctgtgatca tcccctatgc cctgcacaga gaccctagat acttccccaa ccctgaggag 3300

tttcagcctg agagattctt ccctgagaat gcccaaggca gacaccccta tgcctatgtg 3360

ccattctctg ctggcccaag aaactgcatt gggcagaagt ttgctgtgat ggaggagaag 3420

accatcctga gctgcatctt gagacacttc tggattgaga gcaatcagaa gagagaggag 3480

ctgggcctgg aggggcagct gatactgaga ccaagcaatg gcatctggat caagctgaag 3540

agaagaaatg ctgatgagag ataaagatct gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca 3600

tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc 3660

ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 3720

gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct 3780

ggggatgcgg tgggctctat ggatccccta actacaagga acccctagtg atggagttgg 3840

ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 3900

gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 3960

a 3961

<210> 16

<211> 3961

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 16

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcctctcga ggagcttggc ccattgcata cgttgtatcc 180

atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca ttaccgccat gttactagtg 240

tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 300

cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 360

caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 420

gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 480

tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 540

ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 600

attagtcatc gctattacca tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat 660

ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc 720

gatgggggcg gggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg 780

gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 840

tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc 900

gggagtcgct gcgcgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 960

gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 1020

tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga 1080

aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 1140

cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 1200

ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 1260

gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 1320

gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca 1380

cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg 1440

tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 1500

ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg 1560

cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc 1620

gcagggactt cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac 1680

cccctctagc gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga 1740

gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc 1800

gcggggggac ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt 1860

gaccggcggc tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct 1920

cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tcggcgcgcc 1980

gccaccatgg cggggctctg gctggggctc gtgtggcaga agctgctgct gtggggcgcg 2040

gcgagtgccc tttccctggc cggcgccagt ctggtcctga gcctgctgca gagggtggcg 2100

agctacgcgc ggaaatggca gcagatgcgg cccatcccca cggtggcccg cgcctaccca 2160

ctggtgggcc acgcgctgct gatgaagccg gacgggcgag aattttttca gcagatcatt 2220

gagtacacag aggaataccg ccacatgccg ctgctgaagc tctgggtcgg gccagtgccc 2280

atggtggccc tttataatgc agaaaatgtg gaggtaattt taactagttc aaagcaaatt 2340

gacaaatcct ctatgtacaa gtttttagaa ccatggcttg gcctaggact tcttacaagt 2400

actggaaaca aatggcgctc caggagaaag atgttaacac ccactttcca ttttaccatt 2460

ctggaagatt tcttagatat catgaatgaa caagcaaata tattggttaa gaaacttgaa 2520

aaacacatta accaagaagc atttaactgc tttttttaca tcactctttg tgccttagat 2580

atcatctgtg aaacagctat ggggaagaat attggtgctc aaagtaatga tgattccgag 2640

tatgtccgtg cagtttatag aatgagtgag atgatatttc gaagaataaa gatgccctgg 2700

ctttggcttg atctctggta ccttatgttt aaagaaggat gggaacacaa aaagagcctt 2760

cagatcctac atacttttac caacagtgtc atcgctgaac gggccaatga aatgaacgcc 2820

aatgaagact gtagaggtga tggcaggggc tctgccccct ccaaaaataa acgcagggcc 2880

tttcttgact tgcttttaag tgtgactgat gacgaaggga acaggctaag tcatgaagat 2940

attcgagaag aagttgacac cttcatgttt gaggggcacg atacaactgc agctgcaata 3000

aactggtcct tatacctgtt gggttctaac ccagaagtcc agaaaaaagt ggatcatgaa 3060

ttggatgacg tgtttgggaa gtctgaccgt cccgctacag tagaagacct gaagaaactt 3120

cggtatctgg aatgtgttat taaggagacc cttcgccttt ttccttctgt tcctttattt 3180

gcccgtagtg ttagtgaaga ttgtgaagtg gcaggttaca gagttctaaa aggcactgaa 3240

gccgtcatca ttccctatgc attgcacaga gatccgagat acttccccaa ccccgaggag 3300

ttccagcctg agcggttctt ccccgagaat gcacaagggc gccatccata tgcctacgtg 3360

cccttctctg ctggccccag gaactgtata ggtcaaaagt ttgctgtgat ggaagaaaag 3420

accattcttt cgtgcatcct gaggcacttt tggatagaat ccaaccagaa aagagaagag 3480

cttggtctag aaggacagtt gattcttcgt ccaagtaatg gcatctggat caagttgaag 3540

aggagaaatg cagatgaacg ctaaagatct gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca 3600

tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc 3660

ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 3720

gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct 3780

ggggatgcgg tgggctctat ggatccccta actacaagga acccctagtg atggagttgg 3840

ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 3900

gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 3960

a 3961

<210> 17

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 17

gccacc 6

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 18

agtatgtccg tgcagtttat agg 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 19

catacaggtc atcgctgaac ggg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 20

tcatacaggt catcgctgaa cgg 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 21

gattatcatt caaatcatac agg 23

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 22

gaaatcacac tccaccggga 20

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 23

acctttactg cttaaacaca tgct 24

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 24

caggcagcag aaatcgcaag 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 25

agcctgttcc cttcgtcatc 20

<210> 26

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成核酸

<400> 26

taactagggt gcatccaagt ccaaacagaa gcatgtgatt atcattcaaa gcgaacgggc 60

caatgaaatg aacgccaatg aagactgtag aggtgatggc ag 102

<210> 27

<211> 525

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成蛋白

<400> 27

Met Ala Gly Leu Trp Leu Gly Leu Val Trp Gln Lys Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Gly Ala Ala Ser Ala Leu Ser Leu Ala Gly Ala Ser Leu Val Leu Ser

20 25 30

Leu Leu Gln Arg Val Ala Ser Tyr Ala Arg Lys Trp Gln Gln Met Arg

35 40 45

Pro Ile Pro Thr Val Ala Arg Ala Tyr Pro Leu Val Gly His Ala Leu

50 55 60

Leu Met Lys Pro Asp Gly Arg Glu Phe Phe Gln Gln Ile Ile Glu Tyr

65 70 75 80

Thr Glu Glu Tyr Arg His Met Pro Leu Leu Lys Leu Trp Val Gly Pro

85 90 95

Val Pro Met Val Ala Leu Tyr Asn Ala Glu Asn Val Glu Val Ile Leu

100 105 110

Thr Ser Ser Lys Gln Ile Asp Lys Ser Ser Met Tyr Lys Phe Leu Glu

115 120 125

Pro Trp Leu Gly Leu Gly Leu Leu Thr Ser Thr Gly Asn Lys Trp Arg

130 135 140

Ser Arg Arg Lys Met Leu Thr Pro Thr Phe His Phe Thr Ile Leu Glu

145 150 155 160

Asp Phe Leu Asp Ile Met Asn Glu Gln Ala Asn Ile Leu Val Lys Lys

165 170 175

Leu Glu Lys His Ile Asn Gln Glu Ala Phe Asn Cys Phe Phe Tyr Ile

180 185 190

Thr Leu Cys Ala Leu Asp Ile Ile Cys Glu Thr Ala Met Gly Lys Asn

195 200 205

Ile Gly Ala Gln Ser Asn Asp Asp Ser Glu Tyr Val Arg Ala Val Tyr

210 215 220

Arg Met Ser Glu Met Ile Phe Arg Arg Ile Lys Met Pro Trp Leu Trp

225 230 235 240

Leu Asp Leu Trp Tyr Leu Met Phe Lys Glu Gly Trp Glu His Lys Lys

245 250 255

Ser Leu Gln Ile Leu His Thr Phe Thr Asn Ser Val Ile Ala Glu Arg

260 265 270

Ala Asn Glu Met Asn Ala Asn Glu Asp Cys Arg Gly Asp Gly Arg Gly

275 280 285

Ser Ala Pro Ser Lys Asn Lys Arg Arg Ala Phe Leu Asp Leu Leu Leu

290 295 300

Ser Val Thr Asp Asp Glu Gly Asn Arg Leu Ser His Glu Asp Ile Arg

305 310 315 320

Glu Glu Val Asp Thr Phe Met Phe Glu Gly His Asp Thr Thr Ala Ala

325 330 335

Ala Ile Asn Trp Ser Leu Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Pro Glu Val Gln

340 345 350

Lys Lys Val Asp His Glu Leu Asp Asp Val Phe Gly Lys Ser Asp Arg

355 360 365

Pro Ala Thr Val Glu Asp Leu Lys Lys Leu Arg Tyr Leu Glu Cys Val

370 375 380

Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ser Val Pro Leu Phe Ala Arg

385 390 395 400

Ser Val Ser Glu Asp Cys Glu Val Ala Gly Tyr Arg Val Leu Lys Gly

405 410 415

Thr Glu Ala Val Ile Ile Pro Tyr Ala Leu His Arg Asp Pro Arg Tyr

420 425 430

Phe Pro Asn Pro Glu Glu Phe Gln Pro Glu Arg Phe Phe Pro Glu Asn

435 440 445

Ala Gln Gly Arg His Pro Tyr Ala Tyr Val Pro Phe Ser Ala Gly Pro

450 455 460

Arg Asn Cys Ile Gly Gln Lys Phe Ala Val Met Glu Glu Lys Thr Ile

465 470 475 480

Leu Ser Cys Ile Leu Arg His Phe Trp Ile Glu Ser Asn Gln Lys Arg

485 490 495

Glu Glu Leu Gly Leu Glu Gly Gln Leu Ile Leu Arg Pro Ser Asn Gly

500 505 510

Ile Trp Ile Lys Leu Lys Arg Arg Asn Ala Asp Glu Arg

515 520 525

<210> 28

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成核酸

<400> 28

atggcggggc tctggctggg gctcgtgtgg cagaagctgc tgctgtgggg cgcggcgagt 60

gccctttccc tggccggcgc cagtctggtc ctgagcctgc tgcagagggt ggcgagctac 120

gcgcggaaat ggcagcagat gcggcccatc cccacggtgg cccgcgccta cccactggtg 180

ggccacgcgc tgctgatgaa gccggacggg cgagaatttt ttcagcagat cattgagtac 240

acagaggaat accgccacat gccgctgctg aagctctggg tcgggccagt gcccatggtg 300

gccctttata atgcagaaaa tgtggaggta attttaacta gttcaaagca aattgacaaa 360

tcctctatgt acaagttttt agaaccatgg cttggcctag gacttcttac aagtactgga 420

aacaaatggc gctccaggag aaagatgtta acacccactt tccattttac cattctggaa 480

gatttcttag atatcatgaa tgaacaagca aatatattgg ttaagaaact tgaaaaacac 540

attaaccaag aagcatttaa ctgctttttt tacatcactc tttgtgcctt agatatcatc 600

tgtgaaacag ctatggggaa gaatattggt gctcaaagta atgatgattc cgagtatgtc 660

cgtgcagttt atagaatgag tgagatgata tttcgaagaa taaagatgcc ctggctttgg 720

cttgatctct ggtaccttat gtttaaagaa ggatgggaac acaaaaagag ccttcagatc 780

ctacatactt ttaccaacag tgtcatcgct gaacgggcca atgaaatgaa cgccaatgaa 840

gactgtagag gtgatggcag gggctctgcc ccctccaaaa ataaacgcag ggcctttctt 900

gacttgcttt taagtgtgac tgatgacgaa gggaacaggc taagtcatga agatattcga 960

gaagaagttg acaccttcat gtttgagggg cacgatacaa ctgcagctgc aataaactgg 1020

tccttatacc tgttgggttc taacccagaa gtccagaaaa aagtggatca tgaattggat 1080

gacgtgtttg ggaagtctga ccgtcccgct acagtagaag acctgaagaa acttcggtat 1140

ctggaatgtg ttattaagga gacccttcgc ctttttcctt ctgttccttt atttgcccgt 1200

agtgttagtg aagattgtga agtggcaggt tacagagttc taaaaggcac tgaagccgtc 1260

atcattccct atgcattgca cagagatccg agatacttcc ccaaccccga ggagttccag 1320

cctgagcggt tcttccccga gaatgcacaa gggcgccatc catatgccta cgtgcccttc 1380

tctgctggcc ccaggaactg tataggtcaa aagtttgctg tgatggaaga aaagaccatt 1440

ctttcgtgca tcctgaggca cttttggata gaatccaacc agaaaagaga agagcttggt 1500

ctagaaggac agttgattct tcgtccaagt aatggcatct ggatcaagtt gaagaggaga 1560

aatgcagatg aacgc 1575

Claims

1.一种编码CYP4V2蛋白的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.一种表达盒，其包含权利要求1所述的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作连接的启动子。

3.一种表达载体，其包含权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2所述的表达盒。

4.权利要求3所述的表达载体，其还包含表达控制元件，所述编码CYP4V2蛋白的多核苷酸与所述表达控制元件可操作地连接。

5.权利要求4所述的表达载体，其中，所述表达控制元件选自复制起点、启动子、增强子、内含子、polyA信号、ITR、绝缘子中的一种或多种。

6.权利要求3所述的表达载体，其还包含复制起点。

7.权利要求6所述的表达载体，其中，所述复制起点序列选自f1噬菌体ori、RK2oriV、pUC ori或pSC101ori。

8.权利要求3所述的表达载体，其还包含5’ITR。

9.权利要求8所述的表达载体，其中，所述5’ITR的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

10.权利要求3所述的表达载体，其还包含3’ITR。

11.权利要求10所述的表达载体，其中，所述3’ITR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

12.权利要求3所述的表达载体，其还包含增强子。

13.权利要求12所述的表达载体，其中，所述增强子为CMV增强子。

14.权利要求13所述的表达载体，其中，所述增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

15.权利要求3所述的表达载体，其还包含启动子。

16.权利要求15所述的表达载体，其中，所述启动子为特异性或非特异性启动子。

17.权利要求16所述的表达载体，其中，所述启动子选自CBA启动子、CMV启动子、SV40启动子、hPGK启动子或TRE3GS启动子。

18.权利要求17所述的表达载体，其中，所述启动子为CBA启动子。

19.权利要求18所述的表达载体，其中，所述CBA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

20.权利要求15所述的表达载体，其中，所述启动子是可诱导启动子。

21.权利要求20所述的表达载体，其中，所述可诱导启动子选自四环素调控启动子、醇调控启动子、类固醇调控启动子、金属调控启动子、致病调控启动子、温度/热诱导型启动子、光调控启动子、IPTG诱导型启动子中的一种或多种。

22.权利要求21所述的表达载体，其中，所述四环素调控启动子选自Tet on启动子、Tetoff启动子或Tet Activator启动子。

23.权利要求21所述的表达载体，其中，所述醇调控启动子选自醇脱氢酶I基因启动子、响应于醇反式激活蛋白的启动子。

24.权利要求21所述的表达载体，其中，所述类固醇调控启动子选自大鼠糖皮质激素受体启动子、人雌激素受体启动子、蛾蜕皮激素受体启动子、类视黄醇启动子或甲状腺受体超家族启动子。

25.权利要求21所述的表达载体，其中，所述金属调控启动子选自酵母、小鼠或人的金属硫蛋白启动子。

26.权利要求21所述的表达载体，其中，所述致病调控启动子选自水杨酸调控启动子、乙烯调控启动子或苯并噻二唑调控启动子。

27.权利要求21所述的表达载体，其中，所述温度/热诱导型启动子选自HSP-70启动子、HSP-90启动子或大豆热激启动子。

28.权利要求21所述的表达载体，其中，所述光调控启动子是植物细胞的光应答型启动子。

29.权利要求3所述的表达载体，其还包含外显子和内含子。

30.权利要求29所述的表达载体，其中，所述外显子和内含子为鸡β-actin基因的第一个外显子和第一个内含子。

31.权利要求30所述的表达载体，其中，所述外显子和内含子的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

32.权利要求3所述的表达载体，其还包含polyA信号。

33.权利要求32所述的表达载体，其中，所述polyA信号为牛生长激素poly A、SV40polyA、或人β珠蛋白poly A。

34.权利要求33所述的表达载体，其中，所述polyA信号的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

35.权利要求3所述的表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示。

36.权利要求3所述的表达载体，其还包含转录后调节元件。

37.权利要求36所述的表达载体，其中，所述转录后调节元件为土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。

38.权利要求3所述的表达载体，其还包含编码标志物基因。

39.权利要求38所述的表达载体，其中，所述标志物选自抗生素抗性蛋白质、毒素抗性蛋白质、有色的或荧光的蛋白质中的一种或多种。

40.权利要求39所述的表达载体，其中，所述抗生素选自氨苄青霉素、新霉素、G418、嘌呤霉素或杀稻瘟素。

41.权利要求39所述的表达载体，其中，所述毒素选自炭疽毒素或白喉毒素。

42.权利要求39所述的表达载体，其中，所述有色的或荧光的蛋白质选自绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或萤光素酶。

43.权利要求38所述的表达载体，其中，所述标志物为二氢叶酸还原酶。

44.权利要求4～43任一项所述的表达载体，其中，所述表达载体为质粒。

45.权利要求4～43任一项所述的表达载体，其中，所述表达载体为粘粒。

46.权利要求4～43任一项所述的表达载体，其中，所述表达载体为病毒载体。

47.权利要求4～43任一项所述的表达载体，其中，所述表达载体为RNA载体。

48.权利要求4～43任一项所述的表达载体，其中，所述表达载体为线性或环状DNA或RNA分子。

49.权利要求44所述的表达载体，其中，所述质粒选自pCI、puc57、pcDNA3、pSG5、pJ603或pCMV。

50.权利要求46所述的表达载体，其中，所述病毒载体选自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、冠状病毒、流感病毒、狂犬病病毒、水疱性口炎病毒、麻疼病毒、仙台病毒、甲病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒、牛痘病毒、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多泡病毒、嗜肝DNA病毒、杆状病毒或肝炎病毒。

51.权利要求46所述的表达载体，其中，所述病毒载体是小RNA病毒。

52.权利要求50所述的表达载体，其中，所述逆转录病毒选自哺乳动物C-型病毒、慢病毒或泡沫病毒。

53.权利要求52所述的表达载体，其中，所述慢病毒载体选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或绵羊脱髓鞘性脑白质炎慢病毒。

54.权利要求50所述的表达载体，其为腺相关病毒。

55.权利要求54所述的表达载体，其中，所述腺相关病毒选自AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型。

56.权利要求3所述的表达载体，其还包含缩短的嵌合内含子和Kozak起始序列。

57.权利要求56所述的表达载体，其中，所述缩短的嵌合内含子的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

58.权利要求56所述的表达载体，其中所述Kozak起始序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。

59.一种病毒颗粒，其包含权利要求1所述的多核苷酸、权利要求2所述的表达盒或权利要求3～43、46～48、50～58任一项所述的表达载体。

60.一种治疗Bietti结晶性营养不良的药物组合物，其包含权利要求1所述的多核苷酸、权利要求2所述的表达盒、权利要求3～58任一项所述的表达载体或权利要求59所述的病毒颗粒，以及药学上可接受的载体，其中，所述的药物组合物表达密码子优化的CYP4V2蛋白。

61.权利要求1所述的多核苷酸、权利要求2所述的表达盒、权利要求3～58任一项所述的表达载体、权利要求59所述的病毒颗粒或权利要求60所述的药物组合物在制备治疗Bietti结晶性营养不良的药物中的用途。