JP2024522072A - 視覚機能を増強するための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）をコードするポリヌクレオチド配列を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物を個体に投与することにより、個体の視覚機能を回復させるか又は増強する組成物及び方法を提供する。ＭＷ－オプシンは、個体の網膜細胞において発現され、それにより視覚機能を回復させるか又は増強する。

Description

遺伝性及び加齢性網膜変性疾患は、杆体及び錐体光受容体の進行性消失を引き起こし、それが失明につながる。視覚に必要な感光性細胞の消失にもかかわらず、内網膜の下流の神経細胞は、機能した状態で生存し続けるため、オプトジェネティクス療法の標的がもたらされる。オプトジェネティクス手法は、ａ）微生物オプシン及び化学的に操作された哺乳類受容体の光感受性が極めて低いこと；ｂ）網膜オプシンの反応速度が極めて遅いこと；及びｃ）極めて広い範囲の周辺光レベルにわたって高い感度を有する自然の視覚を与える適応機構が欠けていることを含めて、一定の限界に直面している。
このように、当技術分野では、眼障害の治療に向けた改良されたオプトジェネティクス手法が必要とされている。
本発明の一態様では、本開示は、第１の逆方向末端反復（ＩＴＲ）ポリヌクレオチド配列と、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）トランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターポリヌクレオチド配列と、ポリＡポリヌクレオチド配列と、第２の（ＩＴＲポリヌクレオチド）配列とを含む組換え発現ベクターを提供する。別の態様では、本開示は、第１の逆方向末端反復（ＩＴＲ）ポリヌクレオチド配列と、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）トランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターポリヌクレオチド配列と、エンハンサーポリヌクレオチド配列と、ポリＡポリヌクレオチド配列と、第２のＩＴＲポリヌクレオチド配列とを含む組換え発現ベクターを提供する。別の態様では、本開示は、第１の逆方向末端反復（ＩＴＲ）ポリヌクレオチド配列と、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）トランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターポリヌクレオチド配列と、ポリＡポリヌクレオチド配列と、イントロンポリヌクレオチド配列と、第２のＩＴＲポリヌクレオチド配列とを含む組換え発現ベクターを提供する。別の態様では、本開示は、第１の逆方向末端反復（ＩＴＲ）ポリヌクレオチド配列と、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）トランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターポリヌクレオチド配列と、エンハンサーポリヌクレオチド配列と、ポリＡポリヌクレオチド配列と、イントロンポリヌクレオチド配列と、第２のＩＴＲポリヌクレオチド配列とを含む組換え発現ベクターを提供する。
一実施形態では、第１のＩＴＲポリヌクレオチド配列は、配列番号１の配列を含む。一実施形態では、プロモーターポリヌクレオチド配列は、配列番号２の配列を含む。一実施形態では、ＭＷ－オプシントランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列は、そのＭＷ－オプシントランス遺伝子から翻訳されるＭＷ－オプシンタンパク質が、野生型ＭＷ－オプシントランス遺伝子と比較してより多量に産生されるようにコドン最適化されている。一実施形態では、ＭＷ－オプシントランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３の配列と８５％同一の配列を含む。一実施形態では、ＭＷ－オプシントランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３の配列と９０％同一の配列を含む。一実施形態では、ＭＷ－オプシントランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３の配列を含む。一実施形態では、エンハンサーポリヌクレオチド配列は、配列番号４の配列を含む。一実施形態では、ポリＡポリヌクレオチド配列は、配列番号５の配列を含む。一実施形態では、イントロンポリヌクレオチド配列は、配列番号６の配列を含む。一実施形態では、第２のＩＴＲポリヌクレオチド配列は、配列番号７の配列を含む。一実施形態では、組換え発現ベクターは、抗生物質への耐性を付与するポリヌクレオチド配列を更に含む。具体的な実施形態では、抗生物質は、カナマイシンである。具体的な実施形態では、組換え発現ベクターは、配列番号８の配列を含む。具体的な実施形態では、組換え発現ベクターは、配列番号９の配列を含む。
一実施形態では、組換え発現ベクターは、組換えウイルスベクターである。具体的な実施形態では、組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスベクター又はレトロウイルスベクターである。具体的な実施形態では、組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。更なる具体的な実施形態では、組換えウイルスベクターは、ＡＡＶ２である。更なる実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、野生型アデノ随伴ウイルスカプシドと比較して、網膜細胞への増加した感染力を付与し、且つ／又は内境界膜を通過する増加した能力を付与する変異体カプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。更なる実施形態では、変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１０～１９７からなる群から選択される配列を有する。更なる実施形態では、変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１０～２０からなる群から選択される配列を有する。更なる実施形態では、変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１４の配列を有する。更なる実施形態では、変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１５の配列を有する。更なる実施形態では、変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１６の配列を有する。
本発明の別の態様では、本開示は、個体の視覚機能を回復させるか又は増強する方法であって、個体に上述の組換え発現ベクターを投与することを含む方法を提供し、この投与は、個体の網膜細胞におけるＭＷ－オプシントランス遺伝子の発現及び視覚機能の回復又は増強をもたらす。一実施形態では、網膜細胞におけるＭＷ－オプシントランス遺伝子の発現は、個体によるパターン化された視覚及び画像認識をもたらす。更なる実施形態では、画像認識は、静止画像又はパターンのものである。なおも更なる実施形態では、画像認識は、動的画像又はパターンのものである。一実施形態では、網膜細胞におけるＭＷ－オプシントランス遺伝子の発現は、空間パターン識別アッセイにおいて、垂直線を含む画像と、水平線を含む画像との間の区別をもたらす。別の実施形態では、網膜細胞におけるＭＷ－オプシントランス遺伝子の発現は、空間パターン識別アッセイにおいて、静止している線を含む画像と、動いている線を含む画像との間の区別をもたらす。別の実施形態では、網膜細胞におけるＭＷ－オプシントランス遺伝子の発現は、時間的光パターンアッセイにおいて、点滅光と連続光との間の区別をもたらす。一実施形態では、網膜細胞におけるＭＷ－オプシントランス遺伝子の発現は、画像認識アッセイにおいて、約１０４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度での画像の認識をもたらす。一実施形態では、網膜細胞におけるＭＷ－オプシントランス遺伝子の発現は、光回避アッセイにおいて、白色光のある領域と、白色光のない領域との間の区別をもたらす。一実施形態では、網膜細胞におけるＭＷ－オプシントランス遺伝子の発現は、網膜細胞においてチャネルロドプシンポリペプチドを発現する個体による画像認識をもたらすために必要な光強度の少なくとも１０分の１の光強度での画像認識をもたらす。一実施形態では、網膜細胞におけるＭＷ－オプシントランス遺伝子の発現は、ロドプシンポリペプチドによって網膜細胞に付与される反応速度より少なくとも２倍速い反応速度をもたらす。特定の実施形態では、投与は、眼内注射、硝子体内注射又は網膜下注射を介したものである。
一部の実施形態では、個体は、網膜色素変性症、黄斑変性症、地図状萎縮、加齢黄斑変性症、網膜分離症、レーベル先天性黒内障、錐体杆体ジストロフィー、バルデー・ビードル症候群、コロイデレミア、アッシャー症候群、スタルガルト病及びビエッティ水晶体ジストロフィーから選択される眼疾患を有する。他の実施形態では、個体は、外傷、頭部傷害に起因する又は別の疾患の合併症（例えば、糖尿病性網膜症）としての網膜剥離又は光受容体の消失を経験したことがある。
本発明の別の態様は、上述の組換え発現ベクター及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、生理食塩水を含む。更なる実施形態では、組成物は、無菌である。
別の態様では、本開示は、治療を、それを必要としている対象において行うのに使用するための、上述のとおりの組換え発現ベクター又は上述のとおりの医薬組成物を提供する。一実施形態では、上述のとおりの組換え発現ベクター又は上述のとおりの医薬組成物は、対象の視覚機能を回復させるか又は増強する。別の態様では、本開示は、医薬の製造における使用、又は視覚機能の回復若しくは増強における使用、又は眼疾患の治療における使用のための上述のとおりの組換え発現ベクター又は上述のとおりの医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、上述のとおりの組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。別の態様では、本開示は、上述のとおりの組換え発現ベクターを作成する方法を提供し、この方法は、上述の宿主細胞を培養することと、培養された宿主細胞を溶解させることと、溶解された培養宿主細胞から組換え発現ベクターを抽出及び精製することとを含む。別の態様では、本開示は、上述のとおりの医薬組成物を作成する方法を提供し、この方法は、上述のとおりの宿主細胞を培養することと、培養された宿主細胞の上清を回収することと、回収された上清から組換えウイルスベクターを濃縮及び精製することと、精製された組換えウイルスベクターに薬学的に許容可能な賦形剤を加えることとを含む。
別の態様では、本開示は、網膜色素変性症、黄斑変性症、地図状萎縮、加齢黄斑変性症、網膜分離症、レーベル先天性黒内障、錐体杆体ジストロフィー、バルデー・ビードル症候群、コロイデレミア、アッシャー症候群、スタルガルト病又はビエッティ水晶体ジストロフィーから選択される眼疾患を治療する方法を提供し、この方法は、治療有効量の、上述のとおりの組換え発現ベクター又は上述のとおりの医薬組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む。更なる実施形態では、眼疾患は、網膜色素変性症である。更に別のある実施形態では、眼疾患は、地図状萎縮である。
配列番号１～２のポリヌクレオチド配列を提供する。 配列番号３～５のポリヌクレオチド配列を提供する。 配列番号６～７のポリヌクレオチド配列を提供する。 図４：配列番号８のポリヌクレオチド配列を提供する。 （上記のとおり。） 図５：配列番号９のポリヌクレオチド配列を提供する。 （上記のとおり。） （上記のとおり。） （上記のとおり。） ＲＥＶ＿Ｋａｎをトランスフェクトして、次に免疫組織化学に供した２９３Ｔ細胞の蛍光像を提供する。 ＩＴＲ安定性判定試験の概略図を提供する。 ＸｍａＩ消化後のＲＥＶ＿Ｋａｎベクターを含有するアガロース電気泳動後ゲルの画像化を提供する。ＸｍａＩ制限部位がＲＥＶ＿Ｋａｎ ＩＴＲに存在するとき、３２５７、２７９８及び１７３４ｂｐのサイズを有するＤＮＡ断片が観察される。 アンチセンス及びセンスプローブによるインサイチュハイブリダイゼーションを用いたカニクイザルマカクの眼における例示的ベクター形質導入を示す。アンチセンス及びセンスＩＳＨ（黒色のシグナル）による１例の試験動物（高用量群、４．５×１０１１ｖｇ／眼）の眼切片の代表的な全スライド観察を示す。アンチセンスＩＳＨシグナルは、中心網膜の多焦点領域に存在するが、周辺網膜（＊で指示されるとおり）、毛様体、虹彩、虹彩角膜角、水晶体嚢及び視神経では分布がより一様であることに留意されたい。センスＩＳＨシグナルの局在パターンは、アンチセンスＩＳＨと同様であった。これらの眼切片は、中程度のＰＰＩＢ（内因性対照）及びＤａｐＢ（細菌遺伝子）ｍＲＮＡシグナル陰性を示した（図示せず）。 アンチセンス及びセンスプローブによるインサイチュハイブリダイゼーションを用いた眼の様々な解剖学的領域における例示的ベクター核シグナルを示す。（Ａ）試験動物（高用量群、４．５×１０１１ｖｇ／眼）についての眼の様々な領域からのアンチセンスＩＳＨ局在を示す。アンチセンスＩＳＨシグナルは、黄斑及び中心網膜の多焦点領域、特に神経節細胞、神経線維層、内網状層及び内顆粒層の範囲内に豊富である。場合により、アンチセンスＩＳＨシグナルは、外顆粒層及び光受容体で検出される。ＩＳＨシグナルは、周辺網膜でより一様に検出された。視神経、毛様体、虹彩、虹彩角膜角及び後部水晶体嚢に軽度～中程度のＩＳＨシグナルが存在した。（Ｂ）試験動物（高用量群、１＠４．５×１０１１ｖｇ／眼）についての眼の様々な領域からのセンスＩＳＨ局在を示す。センスＩＳＨシグナルの局在パターンは、アンチセンスＩＳＨと同様である。センスＩＳＨシグナルは、黄斑及び中心網膜の多焦点領域、特に神経節細胞及び内顆粒層細胞の範囲内に豊富である。ＩＳＨシグナルは、周辺網膜でより一様に検出される。毛様体、虹彩、虹彩角膜角及び後部水晶体嚢に軽度～中程度のＩＳＨシグナルが存在する。 カニクイザル眼の様々な領域における（Ａ）アンチセンスＩＳＨシグナル、及び（Ｂ）センスＩＳＨシグナルの半定量的スコア化を提供する。方法の節に記載するとおり、１細胞当たりのＩＳＨシグナルの数及びＩＳＨシグナルを発現する細胞の割合を考慮して修正Ｈスコアを開発した。ＩＳＨシグナルは、低用量群と比較して高用量群で高くなるが、同じ用量群で中間犠牲死動物と終了後犠牲死動物との間に有意差がなかったことに留意されたい。 二重標識ＩＳＨ実験による一部のＧＲＭ６＋双極細胞におけるアンチセンスシグナルを示す。試験動物の眼切片における二重アンチセンス及びＧＲＭ６ ＩＳＨ標識実験。シングルプレックス実験では、ＧＲＭ６（ＯＮ双極細胞のマーカー）ＩＳＨシグナル（パネルＡのシグナル）が内顆粒層の外帯に特異的に見られ、アンチセンスシグナル（パネルＢのシグナル）が神経線維層、神経節細胞、内網状層及び内顆粒細胞に見られる。パネルＣに示されるとおり（丸の囲み線）、アンチセンス及びＧＲＭ６ ＩＳＨシグナルの二重標識を示す細胞は、ほとんどない。 ＡＡＶカプシドタンパク質免疫染色による網膜における例示的ベクター形質導入を示す。周辺網膜の神経節細胞及び内顆粒層の核にＡＡＶカプシド免疫染色が認められ、例示的ベクター形質導入が示唆された。試験動物の切片からの代表的な画像を示す。水晶体嚢及び内境界膜におけるカプシドタンパク質の存在は、これらの膜へのベクターの付着を示唆している。 例示的ベクター被注射カニクイザルマカクの網膜におけるオプシンタンパク質免疫染色を示す。抗赤／緑（別名、長波長／中波長）オプシン免疫染色による試験動物の眼切片からの代表的な画像を示す。抗赤／緑による免疫染色は、中心（黄斑）及び周辺網膜並びに毛様体にＭＷ－オプシンが認められたことを実証する。差込み図は、神経節細胞における点状の免疫染色を示す。周辺網膜の免疫染色は、ミュラー細胞パターンに似て、多焦点領域において神経網膜の厚さ全体にわたっている。毛様体及び非色素上皮は、最小限の染色を示し、しかし、視神経又は他の眼領域に免疫染色はなかった。
本開示は、医薬組成物、眼疾患又は病態の治療方法であって、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含む遺伝子療法、ベクター又はコンストラクトを霊長類（例えば、サル又はヒト）の眼内に眼内注射、硝子体内注射又は網膜下注射によって投与することを含む方法に関する。ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子療法、ベクター又はコンストラクトの眼内注射、硝子体内注射又は網膜下注射に伴い、インビボで標的細胞又は組織においてＭＷ－オプシントランス遺伝子が発現してＭＷ－オプシンタンパク質又は遺伝子産物が発生することにより、治療効果がもたらされる。
以下に、説明のための例示的適用に関連して幾つかの態様を記載する。本明細書に記載される特徴の完全な理解を促すため、数多くの具体的な詳細、関係及び方法が示されることが理解されなければならない。しかしながら、関連する技術分野の当業者は、具体的な詳細の１つ以上がないか又は他の方法であっても、本明細書に記載される特徴を実施し得ることを容易に認識するであろう。一部の行為は異なる順番で及び／又は他の行為又は事象と同時に行うことができるため、本明細書に記載される特徴は、説明されている行為又は事象についての順番に限定されない。更には、本明細書に記載される特徴に従う方法論を実現するために、説明されている行為又は事象の全てが必要というわけではない。本開示の用語法は、詳細な事例を記載することを目的としているに過ぎず、本開示の随伴物、方法及び組成物を限定するように意図するものではない。
本明細書に記載されるとおりの本開示の組成物及び方法は、特に指示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、免疫化学及び眼科技法の従来技術及び記載を利用し得るものであり、それらは、全て当業者の技能の範囲内にある。かかる従来技術には、対象の網膜又は視力の観察及び分析方法、組換えウイルスのクローニング及び増殖、医薬組成物の製剤化並びに生化学的精製及び免疫化学が含まれる。好適な技法の具体的な説明については、本明細書の例を参照することにより得ることができる。しかし、当然のことながら、同等の従来手順を用いることもできる。かかる従来技術及び記載については、Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ）（１９９９）；Ｗｅｉｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００７）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｅｄｓ．，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００３）；Ｂｏｗｔｅｌｌ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ（２００３）；Ｍｏｕｎｔ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００６）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００２）（全てＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ発行）；Ｓｔｒｙｅｒ．Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ Ｅｄ．）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎ．Ｙ．（１９９５）；Ｇａｉｔ，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８４）；Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ，Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）；及びＢｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００２）（これらは、全て本明細書においてあらゆる目的から全体として参照により援用される）などの標準的な実験マニュアルを参照することができる。
本明細書で使用される節の見出しは、編成を目的としているに過ぎず、記載されている主題を限定するものと解釈されてはならない。
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
本明細書で使用される用語法は、詳細な事例を記載することを目的としているに過ぎず、限定を意図するものではない。本明細書で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」には、文脈上特に明確に指示されない限り、複数形も同様に含まれることが意図される。更には、用語「含んでいる」、「含む」、「有している」、「有する」、「～と共に」又はこれらの変化形が詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかで使用される限りにおいて、かかる用語は、用語「含む」と同じように包含的であることが意図される。用語「含む」は、本明細書で使用されるとき、「包含する」又は「含有する」と同義であり、包含的又は非限定的である。
本明細書において「又は」への言及はいずれも、特に指定されない限り「及び／又は」を包含することが意図される。本明細書で使用されるとき、用語「約」ある数とは、その数から±１０％の数を指す。用語「約」ある範囲とは、その最も低い値からマイナス１０％及びその最も大きい値からプラス１０％の範囲を指す。
用語「対象」、「患者」又は「個体」は、非ヒト霊長類、例えばアフリカミドリザル及びアカゲザル並びにヒトを含む霊長類を指す。好ましい実施形態では、対象は、ヒト又はヒト患者である。
用語「治療する」、「治療すること」、「治療」、「改善する」又は「改善すること」及び他の文法上の等価語には、本明細書で使用されるとき、疾患又は病態の症状を軽減すること、和らげること又は改善すること、症状が加わるのを予防すること、症状の根底にある原因を改善すること又は予防すること、疾患又は病態を阻害すること、例えば疾患又は病態の発生を止めること、疾患又は病態を緩和すること、疾患又は病態の退縮を生じさせること、疾患又は病態によって引き起こされる状態を緩和すること又は疾患又は病態の症状を停止させることが含まれる。これらの用語には、治療利益を実現することが更に含まれる。治療利益とは、治療下の基礎疾患の根絶又は改善を意味する。治療利益は、一部の実施形態では患者が依然として基礎疾患に罹患しているにもかかわらず、患者において改良が観察されるような、基礎疾患に関連する生理学的症状の１つ以上の根絶又は改善によっても実現する。特定の態様では、医薬組成物は、予防的利益のために、ある詳細な疾患を発症するリスクがある患者に投与されるか、又は疾患の診断が下りていないとしても、その疾患の生理学的症状の１つ以上を訴える患者に投与される。
用語「投与する」、「投与すること」、「投与」などは、本明細書で使用されるとき、所望の生物学的作用部位への治療用組成物又は医薬組成物の送達を可能にするために用いられる方法を指し得る。そうした方法には、眼への眼内注射、硝子体内注射又は網膜下注射が含まれる。
用語「有効量」、「治療有効量」又は「薬学的に有効な量」は、本明細書で使用されるとき、投与される少なくとも１つの医薬組成物又は化合物が治療下の疾患又は病態の症状の１つ以上をある程度緩和するであろう十分な量を指し得る。
用語「薬学的に許容可能」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に開示される化合物の生物学的活性又は特性を無効にすることのない、比較的非毒性の材料、例えば担体又は希釈剤など（即ちその材料を個体に投与したとき、それが望ましくない生物学的効果を引き起こさず、またそれが含まれている組成物の成分のいずれともそれが有害な方法で相互作用しない）を指し得る。
用語「医薬組成物」又は単に「組成物」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、賦形剤など、少なくとも１つの薬学的に許容可能な化学的成分と任意選択で混合された、生物学的活性のある化合物を指し得る。
「ＡＡＶベクター」又は「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で使用されるとき、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はＡＡＶ起源でないポリヌクレオチド配列（即ち治療用トランス遺伝子、例えばＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列など、ＡＡＶにとって異種のポリヌクレオチド）、典型的には細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つの、概して２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。用語のｒＡＡＶベクターとは、ｒＡＡＶベクター粒子とｒＡＡＶベクタープラスミドとの両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）又は自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれでもあり得る。
「ＡＡＶウイルス」又は「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（典型的には野生型ＡＡＶの全てのカプシドタンパク質による）とポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターとで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（即ち哺乳類細胞に送達しようとするトランス遺伝子など、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」又は単に「ｒＡＡＶベクター」と称される。このように、かかるベクターはｒＡＡＶ粒子内に含まれるため、ｒＡＡＶ粒子の作製には必然的にｒＡＡＶベクターの作製が含まれる。
用語「パッケージング」は、本明細書で使用されるとき、ｒＡＡＶ粒子の集合化及びカプシド形成を生じさせることのできる一連の細胞内イベントを指し得る。ＡＡＶ「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製及びカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐは、本明細書ではＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。
用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質及び天然に存在しないタンパク質（例えば、融合タンパク質）の両方、そのペプチド、断片、突然変異体、誘導体及び類似体を包含し得る。ポリペプチドは、単量体、二量体、三量体又は多量体であり得る。更に、ポリペプチドは、幾つもの異なるドメインを含むことができ、その各々が１つ以上の特徴的差異のある活性を有する。誤解を避けるために言えば、「ポリペプチド」は、２アミノ酸より大きい任意の長さであり得る。
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド変異体」は、その配列にアミノ酸修飾が含まれるポリペプチドを指す。一部の例では、修飾は、天然又は野生型タンパク質など、参照タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列と比較した１つ以上のアミノ酸の挿入、重複、欠失、再配列又は置換であり得る。変異体は、参照タンパク質の配列中、ある位置にある単一のアミノ酸が別のアミノ酸に変更されている１つ以上のアミノ酸点置換、それぞれ１つ以上のアミノ酸が挿入されているか、又は欠失している１つ以上の挿入及び／若しくは欠失並びに／又はアミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか一方若しくは両方におけるアミノ酸配列のトランケーションを有し得る。変異体は、参照タンパク質又は非修飾タンパク質と比較して同じ又は異なる生物学的活性を有し得る。
一部の実施形態では、変異体は、例えば、その対応物である参照タンパク質と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の全体的な配列相同性を有し得、参照タンパク質は、天然に存在するもの又は天然に存在しないもの又は天然に存在するタンパク質の誘導体若しくは変異体であり得る。一部の実施形態では、変異体は、野生型タンパク質と少なくとも約９０％の全体的な配列相同性を有し得る。一部の実施形態では、変異体は、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％又は少なくとも約９９．９％の全体的な配列同一性を呈する。
用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（－））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又は組換えＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドには、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドが含まれる。好ましくは、ポリヌクレオチドには、本明細書に記載される参照配列のいずれか（例えば、配列表を参照されたい）と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド又は変異体が含まれ、典型的には、変異体は、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を保持している。様々な例示的実施形態では、本発明は、一部には、発現ベクター、ウイルスベクター及びトランスファープラスミドを含むポリヌクレオチド並びにそれを含む組成物及び細胞を企図する。
詳細な実施形態では、本発明により、ポリペプチドの少なくとも約５、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、１０００、１２５０、１５００、１７５０若しくは２０００個又はそれを超える連続するアミノ酸残基並びに全ての中間的な長さをコードするポリヌクレオチドが提供される。これに関連して、「中間的な長さ」が、６、７、８、９等；１０１、１０２、１０３等；１５１、１５２、１５３等；２０１、２０２、２０３等など、引用されている値間にある任意の長さを意味することは、容易に理解されるであろう。
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド変異体」は、参照ポリヌクレオチド配列又は以下に定義するストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語には、参照ポリヌクレオチドと比較して１つ以上のヌクレオチドが付加されているか若しくは欠失しているか、又は異なるヌクレオチドに置き換えられているポリヌクレオチドが含まれる。この点において、参照ポリヌクレオチドには、改変したポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能又は活性を保持しているような、突然変異、付加、欠失及び置換を包含するある種の改変が作られ得ることは、当技術分野でよく理解されている。
本明細書で使用されるとき、「組換え」とは、（１）その天然に存在する環境から取り出されているか、（２）自然界でその遺伝子が見られるポリヌクレオチドの全て又は一部と結び付いていないか、（３）自然界では連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているか、又は（４）自然界には存在しない生体分子、例えば遺伝子又はタンパク質を指し得る。用語「組換え」は、クローニングされたＤＮＡ単離物、化学的に合成されたポリヌクレオチド類似体又は異種システムによって生物学的に合成されるポリヌクレオチド類似体並びにかかるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質及び／又はｍＲＮＡを指して使用することができる。このように、例えば、ある微生物によって合成されるタンパク質は、例えば、その細胞に存在する組換え遺伝子から合成されるｍＲＮＡからそれが合成される場合には組換えである。
「配列同一性」又は例えば「～と５０％同一の配列」を含むという記載は、本明細書で使用されるとき、比較ウィンドウにわたって１つずつヌクレオチドを見比べたとき又は１つずつアミノ酸を見比べたときに配列がどの程度同一であるかを指す。このように、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較し、両方の配列に同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）又は同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が現れる位置の数を決定してマッチする位置の数を求め、そのマッチする位置の数を比較ウィンドウにある位置の総数（即ちウィンドウサイズ）で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることによって計算し得る。本明細書に記載される参照配列のいずれかと少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド及びポリペプチドが含まれ、典型的にはそれらのポリペプチド変異体は、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持している。
２つ以上のポリヌクレオチド間又はポリペプチド間の配列関係を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性パーセンテージ」及び「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、少なくとも１２、しかし高頻度で１５～１８及び多くの場合に少なくとも２５のヌクレオチド長及びアミノ酸残基長を含めた単量体単位長である。２個のポリヌクレオチドは、各々が、（１）２個のポリヌクレオチド間で同様の配列（即ち完全ポリヌクレオチド配列の一部分のみ）、及び（２）２個のポリヌクレオチド間で相違した配列を含み得るため、２個（以上の）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、２個のポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して局所的な配列類似性領域を同定し及び比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」とは、少なくとも６個、通例では約５０～約１００個、更に通例では約１００～約１５０個の連続した位置の概念的区間であって、そこである配列が、同じ数の連続した位置の参照配列と、それらの２つの配列を最適にアラインメントした後に比較される区間を指す。比較ウィンドウは、２つの配列の最適アラインメントについて、参照配列（これは付加又は欠失を含まない）と比較して約２０％以下の付加又は欠失（即ちギャップ）を含み得る。比較ウィンドウのアラインメントのための配列の最適アラインメントは、アルゴリズムのコンピュータ化した実装によるか（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は検査及び選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良のアラインメント（即ち比較ウィンドウにわたって最も高いパーセンテージ相同性が得られるもの）により行うことができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されるとおりのＢＬＡＳＴプログラムファミリーも参照し得る。配列解析の詳細な考察については、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４－１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ １５のＵｎｉｔ １９．３を参照することができる。
ポリヌクレオチドの向きを記載する用語には、５’（通常、ポリヌクレオチドのなかで遊離リン酸基を有する末端）及び３’（通常、ポリヌクレオチドのなかで遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有する末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の向き又は３’から５’の向きにアノテートすることができる。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについては、５’から３’への鎖は、その配列がプレメッセンジャー（ｐｒｅｍＲＮＡ）の配列と同一であるという理由で［ＤＮＡにおけるチミン（Ｔ）の代わりの、ＲＮＡにおけるウラシル（Ｕ）を除く］、「センス」、「プラス」又は「コード」鎖と呼ばれる。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写される鎖である相補的な３’から５’への鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」又は「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用されるとき、用語「逆向き」は、３’から５’の向きに書かれる５’から３’の配列又は５’から３’の向きに書かれる３’から５’の配列を指す。
用語「相補的」及び「相補性」は、塩基対合則によって関係付けられるポリヌクレオチド（即ちヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ ３’の相補鎖は、３’Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ ５’である。後者の配列は、５’末端を左側及び３’末端を右側にした逆相補体、５’Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ ３’と書かれることが多い。その逆相補体と等しい配列は、回文配列であると言われる。相補性は「部分的」であり得、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従い一致している。又は、核酸間に「完全な」又は「全面的な」相補性があることもあり得る。
その上、当業者によれば、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるとおりのポリペプチド又はその変異体の断片をコードするヌクレオチド配列が複数あることが理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドの中には、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性のみを有するものもある。それにもかかわらず、コドン使用の違いに起因して異なるポリヌクレオチド、例えばヒト及び／又は霊長類コドン選択に合わせて最適化されるポリヌクレオチドが、本発明により具体的に企図される。更に、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアレルも使用し得る。アレルは、ヌクレオチドの欠失、付加及び／又は置換など、１つ以上の突然変異の結果として変化している内因性遺伝子である。
「作動可能に連結された」又は「作動可能に連結された」又は「カップリングされた」とは、遺伝的エレメントが並んで置かれていて、それらのエレメントが、それらを予想される方法で作動させることを可能にする関係にあることを指し得る。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写の開始を促進する場合、そのコード領域に作動可能に連結されているとし得る。プロモーターとコード領域との間には、その機能的関係が維持されている限り、介在する残基があり得る。
用語「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」又は「カセット」又は「プラスミド」又は単に「ベクター」には、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを有する、そのポリヌクレオチドコード配列の一部又は全部が転写される能力を有し、且つ遺伝子療法に適合しているような、ＡＡＶ又はｒＡＡＶベクターを含めた任意の種類の遺伝子コンストラクトが含まれ得る。転写物は、タンパク質へと翻訳されることができる。ある場合には、それは、部分的に翻訳されても又はされなくてもよい。特定の態様では、発現には、遺伝子の転写及びｍＲＮＡから遺伝子産物への翻訳の両方が含まれる。他の態様では、発現には、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドの転写のみが含まれる。発現ベクターは、標的細胞におけるそのタンパク質の発現を促進するため、コード領域に作動可能に連結された制御エレメントも含み得る。制御エレメントと、それらが発現のため作動可能に連結される１つ又は複数の遺伝子との組み合わせは、ときに「発現カセット」と称され得、その多数は、当技術分野で公知であり、利用可能であるか、又は当技術分野で利用可能な成分から容易に構築することができる。
発現ベクターに存在する「制御エレメント」又は「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写及び翻訳を実行するベクターの非翻訳領域－複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’非翻訳領域－である。かかるエレメントは、その強度及び特異性が様々に異なり得る。利用されるベクターシステム及び宿主に応じて、遍在性プロモーター及び誘導性プロモーターを含め、好適な転写及び翻訳エレメントを幾つでも使用することができる。
用語「プロモーター」は、本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の認識部位を指し、そこにＲＮＡポリメラーゼが結合する。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを惹起し及び転写する。
用語「エンハンサー」は、転写の増強をもたらす能力を有する配列を有し、且つ一部の例では別の制御配列に対するその向きに非依存的に機能することのできるＤＮＡの一区間を指す。エンハンサーは、プロモーター及び／又は他のエンハンサーエレメントと協働的に又は相加的に機能することができる。
用語「異種」とは、ある実体が、それが比較されているその実体の残りの部分と比べて遺伝子型に特徴的差異があることを指し得る。例えば、異なる種に由来するプラスミド又はベクターに遺伝子工学技術によって導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドであり得る。その天然のコード配列から取り出されて、天然では連結して見られないコード配列に作動可能に連結されているプロモーターは、異種プロモーターであり得る。
用語「ＭＷ－オプシン」又は「中波長オプシン」又は「中波長錐体オプシン」とは、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）錐体オプシン１、即ち中波感受性ＯＰＮ１ＭＷ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０００５１３、バージョンＮＭ＿０００５１３．２）、その機能性断片又は機能性誘導体及びそれを含む融合タンパク質を指す。ＭＷ－オプシンは、電磁スペクトルの緑色帯域に約５３０ｎｍのλｍａｘを有する。これは、「緑オプシン」、「Ｍオプシン」又は「ＭＷＳオプシン」とも称される。
範囲：本開示全体を通じて、様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は、単に便宜上の、簡潔にするためのものであり、本開示の範囲についての柔軟性のない限定と解釈されてはならないことが理解されるべきである。それに応じて、範囲の記載は、あらゆる可能な部分的範囲並びにその範囲内にある個々の数値が具体的に開示されていると見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等などの部分的範囲並びにその範囲内にある個々の数、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６が具体的に開示されていると見なされるべきである。別の例として、９５～９９％の同一性などの範囲には、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％といったような同一性が含まれ、及び９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％及び９８～９９％の同一性などの部分的範囲が含まれる。これは、範囲の大きさに関係なく適用される。全ての指定される範囲は、特に指定されない限り端点も含む。
ベクター
遺伝子療法では、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はレトロウイルスを含む様々なウイルスベクターを使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物及び方法は、ＭＷ－オプシントランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ｃＤＮＡ配列）の、それを必要としているヒト対象又は患者（例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜色素変性症と診断された患者）の網膜細胞への送達を提供する。ｒＡＡＶ又はウイルスベクターなどの送達システムを使用した患者への治療用トランス遺伝子のポリヌクレオチドの送達は、遺伝子療法とも称される。
一部の実施形態では、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列の送達は、任意の好適な「ベクター」（「遺伝子送達」又は「遺伝子移入媒体」とも称される）を使用して実施することができる。ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、送達媒体、遺伝子送達媒体又は遺伝子移入媒体には、標的細胞、例えば光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞又は網膜色素上皮細胞を含めた網膜細胞に送達されることになるポリヌクレオチドを含む任意の好適な巨大分子又は分子の複合体が包含され得る。一部の例では、標的細胞とは、ポリヌクレオチド分子又は遺伝子が送達される任意の細胞であり得る。
本開示の組成物及び方法は、ＭＷ－オプシントランス遺伝子ポリヌクレオチド配列を非ヒト霊長類又はヒト対象の眼又は網膜細胞に送達する任意の好適な方法を提供する。具体的な実施形態では、ＭＷ－オプシントランス遺伝子は、配列番号３のポリヌクレオチド配列を有する。配列番号３は、
Figure 2024522072000001
の配列を有する。配列番号３は、例えば、コドン最適化されていないポリヌクレオチド配列によってコードされるヒトＭＷ－オプシンタンパク質の発現と比べると、ヒトＭＷ－オプシンタンパク質の発現を増加させるコドン最適化されたポリヌクレオチド配列である。具体的な実施形態では、ＭＷ－オプシントランス遺伝子は、配列番号３と少なくとも８５％、９０％又は９５％同一のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、例えば、コドン最適化されていないポリヌクレオチド配列によってコードされるヒトＭＷ－オプシンタンパク質の発現と比べると、ヒトＭＷ－オプシンタンパク質の発現を増加させるコドン最適化されたポリヌクレオチド配列である。一部の例では、ポリヌクレオチド又は遺伝子療法の送達は、非ヒト霊長類又はヒト対象の眼への硝子体内注射のために製剤化されるか又はそれに適合される。
一部の実施形態では、好適なベクターとしては、限定はされないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス及びレトロウイルスなどのウイルスベクター、リポソーム、脂質含有複合体、ナノ粒子及び網膜細胞にポリヌクレオチドを送達する能力のある他の巨大分子複合体が挙げられる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された真核生物プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター又は構成的プロモーターを含む。一実施形態では、プロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーターである。具体的な実施形態では、プロモーターは、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％又は１００％同一のポリヌクレオチド配列を有する。配列番号２は、
Figure 2024522072000002
の配列を有する。
別の実施形態では、プロモーターは、ヒトシナプシンｈＳｙｎプロモーター（Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．１０：１２２１）、ＣＡＧプロモーター（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９：２６９）；グルタミン酸代謝型受容体－６（ｇｒｍ６）プロモーター（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：１１７５）；プレアデス（Ｐｌｅｉａｄｅｓ）プロモーター（Ｐｏｒｔａｌｅｓ－Ｃａｓａｍａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１６５８９）；コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）プロモーター（Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０３９２）；ベシクル性グルタミン酸輸送体（Ｖ－ｇｌｕｔ）プロモーター（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１３７７：１）；グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）プロモーター（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１１４４：１９；Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１８：２７）；コレシストキニン（ＣＣＫ）プロモーター（Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１８：２７）；パルブアルブミン（ＰＶ）プロモーター；ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター；ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター；及び血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）プロモーターである。好適なプロモーターとしては、限定はされないが、赤錐体オプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター及びＧｌｕＲプロモーター（例えば、ＧｌｕＲ６プロモーター）が挙げられる。好適なプロモーターとしては、限定はされないが、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）遺伝子プロモーター及び光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子プロモーターが挙げられる。Ｌ７プロモーター（Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３）、ｔｈｙ－１プロモーター、リカバリンプロモーター（Ｗｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｄ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２６：２５）；ＢＥＳＴプロモーター；ＰｒｏＢ４プロモーター（Ｊｕｅｔｔｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：１３４５－１３５６）；ＰｒｏＣ２プロモーター；ＰｒｏＡ１８プロモーター；ＰｒｏＢ２プロモーター；ＰｒｏＡ６プロモーター；ＰｒｏＡ７プロモーター；ＰｒｏＡ１プロモーター；ＰｒｏＡ４プロモーター；ＰｒｏＣ２２プロモーター；ＰｒｏＤ３プロモーター；ＰｒｏＤ４プロモーター；ＰｒｏＤ５プロモーター；ＰｒｏＤ６プロモーター；ＰｒｏＡ１４プロモーター；ＰｒｏＡ３６プロモーター；ＰｒｏＤ１プロモーター；ＰｒｏＡ５プロモーター；ＰｒｏＢ１プロモーター；ＰｒｏＡ２７プロモーター；ＰｒｏＣ２９プロモーター；ＰｒｏＢ１５プロモーター；ＰｒｏＡ９プロモーター；ＰｒｏＣ８プロモーター；ＰｒｏＡ２１プロモーター；ＳＮＣＧプロモーター；ＰｒｏＣ１７プロモーター；ＳｙｎＰ１５６プロモーター；ＰｒｏＡ１８プロモーター；ＰｒｏＢ４プロモーター；ＰｒｏＢ１２プロモーター；及びカルビンジンプロモーターも使用に好適である。詳細な実施形態では、哺乳類細胞で作動するプロモーターは、転写が開始される部位から約２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域及び／又は転写開始点から７０～８０塩基上流に見られる別の配列を含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡは、目的の遺伝子（例えば、ＭＷ－オプシン）の転写物、イントロン、非翻訳領域（ＵＴＲ）、終結配列などを含み得る。他の実施形態では、ＤＮＡは、限定はされないが、プロモーター配列、目的の遺伝子（例えば、ＭＷ－オプシン）、ＵＴＲ、エンハンサー配列、イントロン配列、終結配列、ＩＴＲ配列などの配列を含み得る。具体的な実施形態では、エンハンサーは、配列番号４のポリヌクレオチド配列を有する。配列番号４は、
Figure 2024522072000003
の配列を有する。配列番号４は、規制に準拠するよう合成したものであり、野生型ＷＰＲエンハンサーの変異体である。
具体的な実施形態では、イントロンは、配列番号６のポリヌクレオチド配列を有する。配列番号６は、
Figure 2024522072000004
の配列を有する。配列番号６は、トランス遺伝子を４．５～４．７ｋＢのパッケージサイズ限界近くのままに保つために合成して、組換え発現ベクターに取り込んだ。加えて、組換え発現ベクターに配列番号６を含めると、ナンセンスの／シャッフルされたＤＮＡによってクリプティックなスプライス部位及び代替的なコード領域が生じるリスクが低下する。配列番号６は、ＧＣ含量が最小限となるように設計した。本発明における使用に企図される他のイントロンポリヌクレオチド配列としては、トランス遺伝子を４．５～４．７ｋＢのパッケージサイズ限界近くのままに保つために短縮され、且つ／又はＧＣ含量が最小限となるように適切な数及び種類のヌクレオチド残基で置換されたヒトＳＷ－オプシン、ＭＷ－オプシン及びＬＷ－オプシンイントロンポリヌクレオチド配列のいずれかが挙げられる。
具体的な実施形態では、終結配列は、配列番号５のポリヌクレオチド配列を有する。配列番号５は、
Figure 2024522072000005
の配列を有する。
具体的な実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号１のポリヌクレオチド配列を有する。配列番号１は、
Figure 2024522072000006
の配列を有する。別の具体的な実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号７のポリヌクレオチド配列を有する。配列番号７は、
Figure 2024522072000007
の配列を有する。配列番号１及び７は、数回の増殖／増幅ラウンドにわたって組換え発現ベクターの安定性が確保されるように設計した。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ及び／又はｒＡＡＶウイルスの生成に使用されるプラスミドは、以下のポリヌクレオチドエレメント：第１のＩＴＲ配列；プロモーター配列；ＭＷ－オプシンをコードする配列；エンハンサー配列；ポリＡ／終結配列、イントロン配列；及び第２のＩＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、これらのポリヌクレオチドエレメントの各々間にリンカー配列が使用される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドエレメントは、ｒＡＡＶ及び／又はプラスミドに以下の５’から３’の向きで存在する：第１のＩＴＲ配列；プロモーター配列；ＭＷ－オプシンをコードする配列；エンハンサー配列；ポリＡ／終結配列、イントロン配列；及び第２のＩＴＲ配列。更なる実施形態では、ｒＡＡＶ及び／又はプラスミドは、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含む。配列番号８は、
Figure 2024522072000008
Figure 2024522072000009
Figure 2024522072000010
の配列を有する。
更なる実施形態では、ｒＡＡＶ及び／又はプラスミドは、配列番号９のポリヌクレオチド配列を含む。配列番号９は、
Figure 2024522072000011
Figure 2024522072000012
Figure 2024522072000013
Figure 2024522072000014
Figure 2024522072000015
Figure 2024522072000016
の配列を有する。
一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、第１の逆方向末端反復（ＩＴＲ）ポリヌクレオチド配列、プロモーターポリヌクレオチド配列が作動可能に連結された、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）トランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、エンハンサーポリヌクレオチド配列、ポリＡポリヌクレオチド配列、イントロンポリヌクレオチド配列及び第２のＩＴＲポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、抗生物質への耐性を付与するポリヌクレオチドを更に含む。更に別の実施形態では、その抗生物質は、アンピシリン及び／又はカナマイシンである。
一部の実施形態では、本開示は、対象におけるＭＷ－オプシン又はその任意の機能性の断片若しくは変異体の送達及び発現用ベクターとしての、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）などの組換えウイルスを提供する。
一部の実施形態では、本開示の組成物及び方法での使用に合わせて任意の好適なウイルスベクターを操作又は最適化することができる。例えば、アデノウイルス（Ａｄ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する組換えウイルスベクターは、それがヒト又は霊長類対象において複製欠損となるように改変することができる。一部実施形態では、当業者に公知の方法を用いてハイブリッドウイルスベクターシステムを入手し、それを使用して、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチドを網膜細胞に送達することができる。一部の実施形態では、ウイルス送達システム又は遺伝子療法は、ＭＷ－オプシントランス遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を標的細胞ゲノム（例えば、網膜細胞のゲノム）に組み込むため、長い時間にわたる遺伝子の安定遺伝子発現を得ることができる。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシントランス遺伝子は標的細胞ゲノムに組み込まれず、標的細胞に導入されたプラスミド又はベクターから発現する。
一実施形態では、組換え発現ベクターは、組換えウイルスベクターである。具体的な実施形態では、組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスベクター又はレトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシンのポリヌクレオチド配列を網膜細胞に送達するのに好適なウイルスベクターは、ＡＡＶ又はｒＡＡＶであり、これらは、小型のエンベロープを有しない一本鎖ＤＮＡウイルスである。ｒＡＡＶは、非病原性ヒトパルボウイルスであり、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス及びＣＭＶを含めたヘルパーウイルスに複製が依存的となるようにすることができる。野生型（ｗｔ）ＡＡＶへの曝露は、いかなるヒト病変とも関連付けられていないか又はそれを引き起こすことが知られておらず、且つ一般集団によく見られるため、ＡＡＶ又はｒＡＡＶは、遺伝子療法に好適な送達システムとなる。治療用トランス遺伝子、例えばＭＷ－オプシンの送達のため遺伝子療法に使用されるＡＡＶ及びｒＡＡＶは、任意の血清型であり得る。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物及び方法は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ及びこれらの任意のハイブリッド又はキメラＡＡＶを含め、任意の好適なＡＡＶ血清型の使用を提供する。一部の実施形態では、使用する血清型は、ウイルスの向性又は目的の標的細胞への感染力を基準とする。一部の実施形態では、ＡＡＶ２又はｒＡＡＶ２を使用して、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列が対象の眼又は網膜細胞に眼内注射、硝子体内注射又は網膜下注射によって送達される。
一部の実施形態では、網膜細胞の形質導入を増加させるか又は対象の網膜細胞への遺伝子送達の標的化を高めるため、標的細胞、例えば網膜細胞への感染力が増加した変異体カプシドタンパク質を含むＡＡＶ又はｒＡＡＶウイルス、粒子又はビリオンが使用される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶカプシドタンパク質のカプシドタンパク質ＧＨループ／ループＩＶにアミノ酸修飾を含む。一部の例では、修飾部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループ／ループＩＶの溶媒露出部分である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比べてカプシドタンパク質のＧＨループに５アミノ酸～１１アミノ酸、例えば７アミノ酸配列の挿入を含む変異体ＡＡＶカプシドタンパク質を含み、この変異体カプシドタンパク質は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞への感染力と比較して網膜細胞への感染力の増加を付与する。幾つかのＡＡＶカプシド変異体が、７ｍ８変異体を含め、公知である。他のＡＡＶカプシド変異体は、国際公開第２０１８／０２２９０５号パンフレット（本明細書において全体として参照により援用される）に開示されている。例えば、本発明における使用に企図されるＡＡＶカプシド変異体には、（１）ＬＡＫＤＡＴＫＮＡ（配列番号１０）；（２）ＰＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１）；（３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１２）；（４）ＬＡＴＴＳＱＮＫＰＡ（配列番号１３）；（５）ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号１４）；（６）ＩＡＲＧＶＡＰＳＳＡ（配列番号１５）；（７）ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡ（配列番号１６）；（８）ＬＡＫＧＴＥＬＫＰＡ（配列番号１７）；（９）ＬＡＩＩＤＡＴＫＮＡ（配列番号１８）；（１０）ＬＡＶＤＧＡＱＲＳＡ（配列番号１９）；（１１）ＰＡＰＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号２０）；（１２）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号２１）；（１３）ＬＡＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号２２）；（１４）ＬＡＫＱＱＳＡＳＴＡ（配列番号２３）；（１５）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号２４）；（１６）ＬＳＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号２５）；（１７）ＬＡＡＮＱＰＳＫＰＡ（配列番号２６）；（１８）ＬＡＶＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号２７）；（１９）ＬＡＡＱＧＴＡＫＫＰＡ（配列番号２８）；（２０）ＬＡＰＤＱＴＴＲＮＡ（配列番号２９）；（２１）ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）；（２２）ＬＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３１）；（２３）ＬＡＫＡＤＥＴＲＰＡ（配列番号３２）；（２４）ＬＡＨＱＤＴＡＫＮＡ（配列番号３３）；（２５）ＬＡＨＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号３４）；（２６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＨＡ（配列番号３５）；（２７）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号３６）；（２８）ＬＡＨＱＤＴＴＲＮＡ（配列番号３７）；（２９）ＬＡＨＱＤＴＴＮＡ（配列番号３８）；（３０）ＬＡＨＱＧＴＴＫＮＡ（配列番号３９）；（３１）ＬＡＨＱＶＴＴＫＮＡ（配列番号４０）；（３２）ＬＡＩＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号４１）；（３３）ＬＡＤＡＴＫＴＡ（配列番号４２）；（３４）ＬＡＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号４３）；（３５）ＬＡＫＳＤＱＳＲＰＡ（配列番号４４）；（３６）ＬＡＰＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号４５）；（３７）ＬＡＴＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号４６）；（３８）ＬＡＶＤＧＳＱＲＳＡ（配列番号４７）；（３９）ＬＰＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号４８）；（４０）ＬＰＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号４９）；（４１）ＬＰＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５０）；（４２）ＰＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５１）；（４３）ＱＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５２）；（４４）ＬＡＨＥＴＳＰＲＰＡ（配列番号５３）；（４５）ＬＡＫＳＴＳＴＡＰＡ（配列番号５４）；（４６）ＬＡＤＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５５）；（４７）ＬＡＥＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号５６）；（４８）ＬＡＨＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号５７）；（４９）ＬＡＨＫＴＱＱＫＭ（配列番号５８）；（５０）ＬＡＨＱＤＴＴＥＮＡ（配列番号５９）；（５１）ＬＡＨＱＤＴＴＩＮＡ（配列番号６０）；（５２）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＴ（配列番号６１）；（５３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＤ（配列番号６２）；（５４）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＴ（配列番号６３）；（５５）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＶ（配列番号６４）；（５６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＴＭ（配列番号６５）；（５７）ＬＡＨＱＮＴＴＫＮＡ（配列番号６６）；（５８）ＬＡＨＲＤＴＴＫＮＡ（配列番号６７）；（５９）ＬＡＩＳＤＱＴＮＨＡ（配列番号６８）；（６０）ＬＡＫＱＫＳＡＳＴＡ（配列番号６９）；（６１）ＬＡＫＳＤＱＣＫＰＡ（配列番号７０）；（６２）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＤ（配列番号７１）；（６３）ＬＡＫＳＤＱＳＮＰＡ（配列番号７２）；（６４）ＬＡＫＳＹＱＳＫＰＡ（配列番号７３）；（６５）ＬＡＮＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号７４）；（６６）ＬＡＰＱＮＴＴＫＮＡ（配列番号７５）；（６７）ＬＡＰＳＳＩＱＫＰＡ（配列番号７６）；（６８）ＬＡＱＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号７７）；（６９）ＬＡＹＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号７８）；（７０）ＬＤＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号７９）；（７１）ＬＤＨＱＤＴＴＫＳＡ（配列番号８０）；（７２）ＬＧＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８１）；（７３）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＤ（配列番号８２）；（７４）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＴ（配列番号８３）；（７５）ＬＰＨＱＤＴＴＮＮＡ（配列番号８４）；（７６）ＬＴＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８５）；（７７）ＬＴＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号８６）；（７８）ＬＴＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８７）；（７９）ＬＶＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８８）のタンパク質配列を有するものが含まれる。本発明における使用に企図される他のＡＡＶカプシド変異体には、（１）ＫＤＡＴＫＮ（配列番号８９）；（２）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号９０）；（３）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号９１）；（４）ＴＴＳＱＮＫＰ（配列番号９２）；（５）ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号９３）；（６）ＲＧＶＡＰＳＳ（配列番号９４）；（７）ＰＤＳＴＴＲＳ（配列番号９５）；（８）ＫＧＴＥＬＫＰ（配列番号９６）；（９）ＩＩＤＡＴＫＮ（配列番号９７）；（１０）ＶＤＧＡＱＲＳ（配列番号９８）；（１１）ＰＱＤＴＴＫＫ（配列番号９９）；（１２）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１００）；（１３）ＫＤＡＴＫＴＩ（配列番号１０１）；（１４）ＫＱＱＳＡＳＴ（配列番号１０２）；（１５）ＫＳＤＱＳＫＰ（配列番号１０３）；（１６）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１０４）；（１７）ＡＮＱＰＳＫＰ（配列番号１０５）；（１８）ＶＳＤＳＴＫＡ（配列番号１０６）；（１９）ＡＱＧＴＡＫＫＰ（配列番号１０７）；（２０）ＰＤＱＴＴＲＮ（配列番号１０８）；（２１）ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１０９）；（２２）ＰＱＤＴＴＫＮ（配列番号１１０）；（２３）ＫＡＤＥＴＲＰ（配列番号１１１）；（２４）ＨＱＤＴＡＫＮ（配列番号１１２）；（２５）ＨＱＤＴＫＫＮ（配列番号１１３）；（２６）ＨＱＤＴＴＫＨ（配列番号１１４）；（２７）ＨＱＤＴＴＫＫ（配列番号１１５）；（２８）ＨＱＤＴＴＲＮ（配列番号１１６）；（２９）ＨＱＤＴＴＮ（配列番号１１７）；（３０）ＨＱＧＴＴＫＮ（配列番号１１８）；（３１）ＨＱＶＴＴＫＮ（配列番号１１９）；（３２）ＩＳＤＱＳＫＰ（配列番号１２０）；（３３）ＤＡＴＫＴ（配列番号１２１）；（３４）ＫＤＴＴＫＮ（配列番号１２２）；（３５）ＫＳＤＱＳＲＰ（配列番号１２３）；（３６）ＰＱＤＴＫＫＮ（配列番号１２４）；（３７）ＴＳＤＳＴＫＡ（配列番号１２５）；（３８）ＶＤＧＳＱＲＳ（配列番号１２６）；（３９）ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１２７）；（４０）ＫＤＡＴＫＴＩ（配列番号１２８）；（４１）ＰＱＤＴＴＫＮ（配列番号１２９）；（４２）ＰＱＤＴＴＫＮ（配列番号１３０）；（４３）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１３１）；（４４）ＨＥＴＳＰＲＰ（配列番号１３２）；（４５）ＫＳＴＳＴＡＰ（配列番号１３３）；（４６）ＤＱＤＴＴＫＮ（配列番号１３４）；（４７）ＥＳＤＱＳＫＰ（配列番号１３５）；（４８）ＨＫＤＴＴＫＮ（配列番号１３６）；（４９）ＨＫＴＱＱＫ（配列番号１３７）；（５０）ＨＱＤＴＴＥＮ（配列番号１３８）；（５１）ＨＱＤＴＴＩＮ（配列番号１３９）；（５２）ＨＱＤＴＴＫＫ（配列番号１４０）；（５３）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１４１）；（５４）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１４２）；（５５）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１４３）；（５６）ＨＱＤＴＴＫＴ（配列番号１４４）；（５７）ＨＱＮＴＴＫＮ（配列番号１４５）；（５８）ＨＲＤＴＴＫＮ（配列番号１４６）；（５９）ＩＳＤＱＴＮＨ（配列番号１４７）；（６０）ＫＱＫＳＡＳＴ（配列番号１４８）；（６１）ＫＳＤＱＣＫＰ（配列番号１４９）；（６２）ＫＳＤＱＳＫＰ（配列番号１５０）；（６３）ＫＳＤＱＳＮＰ（配列番号１５１）；（６４）ＫＳＹＱＳＫＰ（配列番号１５２）；（６５）ＮＱＤＴＴＫＮ（配列番号１５３）；（６６）ＰＱＮＴＴＫＮ（配列番号１５４）；（６７）ＰＳＳＩＱＫＰ（配列番号１５５）；（６８）ＱＱＤＴＴＫＮ（配列番号１５６）；（６９）ＹＱＤＴＴＫＮ（配列番号１５７）；（７０）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１５８）；（７１）ＨＱＤＴＴＫＳ（配列番号１５９）；（７２）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１６０）；（８１）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１６１）；（７４）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１６２）；（７５）ＨＱＤＴＴＮＮ（配列番号１６３）；（７６）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１６４）；（７７）ＫＤＡＴＫＴＩ（配列番号１６５）；（７８）ＰＱＤＴＴＫＮ（配列番号１６６）；及び（７９）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１６７）のタンパク質配列を有するものが含まれる。このように、更なる実施形態では、変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１０～１６７からなる群から選択される配列を有する。
本発明における使用に企図される更に他のＡＡＶカプシド変異体は、国際公開第２０２１／２４３０８５号パンフレット（本明細書において全体として参照により援用される）に開示されている。例えば、本発明における使用に企図されるＡＡＶカプシド変異体には、（１）ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１６８）；（２）ＬＧＥＴＴＲＡ（配列番号１６９）；（３）ＨＱＤＴＴＲＰ（配列番号１７０）；（４）ＲＱＤＴＴＫＮ（配列番号１７１）；（５）ＨＱＤＳＴＫＮ（配列番号１７２）；（６）ＨＱＤＡＴＫＮ（配列番号１７３）；（７）ＨＱＤＴＫＫＰ（配列番号１７４）；（８）ＬＳＥＴＴＲＰ（配列番号１７５）；（９）ＨＱＤＴＴＫＫ（配列番号１７６）；（１０）ＬＧＥＡＴＲＰ（配列番号１７７）；（１１）ＬＧＥＴＴＲＴ（配列番号１７８）；（１２）ＬＳＥＡＴＲＰ（配列番号１７９）；（１３）ＫＤＥＴＫＮＳ（配列番号１８０）；（１４）ＬＧＥＴＴＫＰ（配列番号１８１）；（１５）ＨＱＡＴＴＫＮ（配列番号１８２）；（１６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＳ（配列番号１８３）；（１７）ＬＡＬＧＥＴＴＲＡＡ（配列番号１８４）；（１８）ＬＡＨＱＤＴＴＲＰＡ（配列番号１８５）；（１９）ＬＡＲＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１８６）；（２０）ＬＡＨＱＤＳＴＫＮＡ（配列番号１８７）；（２１）ＬＡＨＱＤＡＴＫＮＡ（配列番号１８８）；（２２）ＬＡＨＱＤＴＫＫＰＡ（配列番号１８９）；（２３）ＩＬＳＥＴＴＲＰＡ（配列番号１９０）；（２４）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＣ（配列番号１９１）；（２５）ＬＡＬＧＥＡＴＲＰＡ（配列番号１９２）；（２６）ＬＡＬＧＥＴＴＲＴＡ（配列番号１９３）；（２７）ＬＡＬＳＥＡＴＲＰＡ（配列番号１９４）；（２８）ＬＡＫＤＥＴＫＮＳＡ（配列番号１９５）；（２９）ＬＡＬＧＥＴＴＫＰＡ（配列番号１９６）；及び（３０）ＬＡＨＱＡＴＴＫＮＡ（配列番号１９７）のタンパク質配列を有するものが含まれる。このように、更なる実施形態では、変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１６８～１９７からなる群から選択される配列を有する。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比べてカプシドタンパク質に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９又は少なくとも２０アミノ酸の欠失を含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質に少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５又は少なくとも１００アミノ酸の欠失を含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質に多くても約１００アミノ酸、多くても約２００、多くても約３００又は多くても約４００アミノ酸の欠失を含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質に約１～約１００、約１～約９０、約１～約８０、約１～約７０、約１～約６０、約１～約５０、約１～約４０、約１～約３０、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０又は約１～約５アミノ酸の欠失を含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質に約５アミノ酸～約２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１９アミノ酸、約５アミノ酸～約１８アミノ酸、約５アミノ酸～約１７アミノ酸、約５アミノ酸～約１６アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約５アミノ酸～約１４アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約５アミノ酸～約１２アミノ酸、約５アミノ酸～約１１アミノ酸、約５アミノ酸～約１０アミノ酸、約５アミノ酸～約９アミノ酸、約５アミノ酸～約８アミノ酸、約５アミノ酸～約７アミノ酸又は約５アミノ酸～約６アミノ酸の欠失を含み得る。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比べてカプシドタンパク質に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９又は少なくとも２０アミノ酸の挿入を含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質に少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５又は少なくとも１００アミノ酸の挿入を含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質に多くても約１００アミノ酸、多くても約２００、多くても約３００又は多くても約４００アミノ酸の挿入を含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質に約１～約１００、約１～約９０、約１～約８０、約１～約７０、約１～約６０、約１～約５０、約１～約４０、約１～約３０、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０又は約１～約５アミノ酸の挿入を含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質に約５アミノ酸～約２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１９アミノ酸、約５アミノ酸～約１８アミノ酸、約５アミノ酸～約１７アミノ酸、約５アミノ酸～約１６アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約５アミノ酸～約１４アミノ酸、約５アミノ酸～約１３アミノ酸、約５アミノ酸～約１２アミノ酸、約５アミノ酸～約１１アミノ酸、約５アミノ酸～約１０アミノ酸、約５アミノ酸～約９アミノ酸、約５アミノ酸～約８アミノ酸、約５アミノ酸～約７アミノ酸又は約５アミノ酸～約６アミノ酸の挿入を含み得る。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比べてカプシドタンパク質に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９又は少なくとも２０アミノ酸の置換を含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質に約１アミノ酸～約２０アミノ酸、約１アミノ酸～約１９アミノ酸、約１アミノ酸～約１８アミノ酸、約１アミノ酸～約１７アミノ酸、約１アミノ酸～約１６アミノ酸、約１アミノ酸～約１５アミノ酸、約１アミノ酸～約１４アミノ酸、約１アミノ酸～約１３アミノ酸、約１アミノ酸～約１２アミノ酸、約１アミノ酸～約１１アミノ酸、約１アミノ酸～約１０アミノ酸、約１アミノ酸～約９アミノ酸、約１アミノ酸～約８アミノ酸、約１アミノ酸～約７アミノ酸、約１アミノ酸～約６アミノ酸、約１～約５アミノ酸、約１～約４アミノ酸、約１～約３アミノ酸又は約１～約２アミノ酸の置換を含み得る。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親の非修飾カプシドタンパク質と比べてカプシドタンパク質に挿入、欠失又は置換を合わせて少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９又は少なくとも約２０アミノ酸含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親の非修飾カプシドタンパク質と比べてカプシドタンパク質に挿入、欠失又は置換を合わせて少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５又は少なくとも約１００アミノ酸含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親の非修飾カプシドタンパク質と比べてカプシドタンパク質に挿入、欠失又は置換を合わせて少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００又は少なくとも約４００アミノ酸含み得る。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親の非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質のカプシドタンパク質と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％；少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％相同なアミノ酸配列の変異体カプシドタンパク質を含む。
一部の例では、修飾は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７又は別のＡＡＶ血清型のカプシドサブユニットの対応する残基の後ろであり得る。残基５８７は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質を基準としていることに留意しなければならない。ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）における対応する部位にも修飾を取り込むことができる。当業者であれば、様々なＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づき、いずれか所与のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質においてＡＡＶ２のアミノ酸５８７に対応する修飾部位がどこになるかは分かるであろう。例えば、ＡＡＶ１についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４９５４２；ＡＡＶ５についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ１３７５６；ＡＡＶ６についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ９５４５９；ＡＡＶ７についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１７８；ＡＡＶ８についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１８０；ＡＡＶ９についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４及びＡＡＶ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ４６３３７を参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるカプシドタンパク質のアミノ酸修飾は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞への感染力と比較して眼細胞への感染力の増加を付与することができる。一部の例では、眼細胞は網膜神経節細胞（ＲＧＣ）であり得る。一部の例では、網膜細胞は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であり得る。一部の例では、眼細胞はミュラー細胞であり得る。一部の例では、眼細胞はアストロサイトであり得る。一部の例では、網膜細胞には、アマクリン細胞、双極細胞又は水平細胞が含まれ得る。本開示における使用のためのウイルスベクターには、対象において低毒性及び／又は低免疫原性を呈し、且つ対象、例えばヒト患者において治療上有効な分量のＭＷ－オプシントランス遺伝子を発現するものが含まれ得る。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ変異体の網膜細胞感染力の増加は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％である。一部の実施形態では、動物細胞への感染力の増加は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して５％～１００％、５％～９５％、５％～９０％；５％～８５％、５％～８０％、５％～７５％、５％～７０％、５％～６５％、５％～６０％、５％～５５％、５％～５０％、５％～４５％、５％～４０％、５％～３５％、５％～３０％、５％～２５％、５％～２０％、５％～１５％、５％～１０％の増加である。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ変異体の網膜細胞感染力の増加は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して少なくとも１倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍又は少なくとも２倍である。一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍である。一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍又は少なくとも１００倍である。
一部の実施形態では、網膜細胞感染力の増加は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して１０倍～１００倍、１０倍～９５倍、１０倍～９０倍、１０倍～８５倍、１０倍～８０倍、１０倍～７５倍、１０倍～７０倍、１０倍～６５倍、１０倍～６０倍、１０倍～５５倍、１０倍～５０倍、１０倍～４５倍、１０倍～４０倍、１０倍～３５倍、１０倍～３０倍、１０倍～２５倍、１０倍～２０倍又は１０倍～１５倍である。
一部の実施形態では、網膜細胞感染力の増加は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して２倍～２０倍、２倍～１９倍、２倍～１８倍、２倍～１７倍、２倍～１６倍、２倍～１５倍、２倍～１４倍、２倍～１３倍、２倍～１２倍、２倍～１１倍、２倍～１０倍、２倍～９倍、２倍～８倍、２倍～７倍、２倍～６倍、２倍～５倍、２倍～４倍又は２倍～３倍である。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるカプシドタンパク質のアミノ酸修飾は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが対象の眼における内境界膜（ＩＬＭ）を通過する能力と比較して、霊長類又はヒト対象の眼におけるＩＬＭを通過する増加した能力を付与することができる。一部の実施形態では、ＩＬＭを通過する能力の増加は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％の増加である。一部の実施形態では、ＩＬＭを通過する能力の増加は、親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して５％～１００％、５％～９５％、５％～９０％、５％～８５％、５％～８０％、５％～７５％、５％～７０％、５％～６５％、５％～６０％、５％～５５％、５％～５０％、５％～４５％、５％～４０％、５％～３５％、５％～３０％、５％～２５％、５％～２０％、５％～１５％又は５％～１０％の増加である。
一部の実施形態では、ＩＬＭを通過する能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して少なくとも１倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍又は少なくとも２倍である。一部の実施形態では、ＩＬＭを通過する能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍である。一部の実施形態では、ＩＬＭを通過する能力の増加は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍又は少なくとも１００倍である。
一部の実施形態では、ＩＬＭを通過する能力の増加は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して１０倍～１００倍、１０倍～９５倍、１０倍～９０倍、１０倍～８５倍、１０倍～８０倍、１０倍～７５倍、１０倍～７０倍、１０倍～６５倍、１０倍～６０倍、１０倍～５５倍、１０倍～５０倍、１０倍～４５倍、１０倍～４０倍、１０倍～３５倍、１０倍～３０倍、１０倍～２５倍、１０倍～２０倍又は１０倍～１５倍である。
一部の実施形態では、ＩＬＭを通過する能力の増加は、対応する親又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して２倍～２０倍、２倍～１９倍、２倍～１８倍、２倍～１７倍、２倍～１６倍、２倍～１５倍、２倍～１４倍、２倍～１３倍、２倍～１２倍、２倍～１１倍、２倍～１０倍、２倍～９倍、２倍～８倍、２倍～７倍、２倍～６倍、２倍～５倍、２倍～４倍又は２倍～３倍である。
一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定される。一部の例では、この開示の組換えウイルスの単位用量は、１×１０１０～２×１０１０、２×１０１０～３×１０１０、３×１０１０～４×１０１０、４×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～６×１０１０、６×１０１０～７×１０１０、７×１０１０～８×１０１０、８×１０１０～９×１０１０、９×１０１０～１０×１０１０、１×１０１１～２×１０１１、２×１０１１～３×１０１１、３×１０１１～４×１０１１、４×１０１１～５×１０１１、５×１０１１～６×１０１１、６×１０１１～７×１０１１、７×１０１１～８×１０１１、８×１０１１～９×１０１１、９×１０１１～１０×１０１１、１×１０１２～２×１０１２、２×１０１２～３×１０１２、３×１０１２～４×１０１２、４×１０１２～５×１０１２、５×１０１２～６×１０１２、６×１０１２～７×１０１２、７×１０１２～８×１０１２、８×１０１２～９×１０１２、９×１０１２～１０×１０１２、１×１０１３～２×１０１３、２×１０１３～３×１０１３、３×１０１３～４×１０１３、４×１０１３～５×１０１３、５×１０１３～６×１０１３、６×１０１３～７×１０１３、７×１０１３～８×１０１３、８×１０１３～９×１０１３又は９×１０１３～１０×１０１３のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、この開示のｒＡＡＶは、１０１０～１０１３、１０１０～１０１４、２×１０１１～４×１０１１、３×１０１１～５×１０１１、４×１０１１～６×１０１１、５×１０１１～７×１０１１、６×１０１１～８×１０１１、７×１０１１～９×１０１１、８×１０１１～１０×１０１１、１×１０１２～３×１０１２、２×１０１２～４×１０１２、３×１０１２～５×１０１２、４×１０１２～６×１０１２、５×１０１２～７×１０１２、６×１０１２～８×１０１２、７×１０１２～９×１０１２、８×１０１２～１０×１０１２、１×１０１３～５×１０１３、５×１０１３～１０×１０１３、１０１２～５×１０１２又は５×１０１２～１０×１０１２のベクターゲノムである。
一部の例では、この開示の組換えウイルスは、約１×Ｅ１０、約１．５×Ｅ１０、約２×Ｅ１０、約２．５×Ｅ１０、約３×Ｅ１０、約３．５×Ｅ１０、約４×Ｅ１０、約４．５×Ｅ１０、約５×Ｅ１０、約５．５×Ｅ１０、約６×Ｅ１０、約６．５×Ｅ１０、約７×Ｅ１０、約７．５×Ｅ１０、約８×Ｅ１０、約８．５×Ｅ１０、約９×Ｅ１０、約９．５×Ｅ１０、約１０×Ｅ１０、約１×Ｅ１１、約１．５×Ｅ１１、約２×Ｅ１１、約２．５×Ｅ１１、約３×Ｅ１１、約３．５×Ｅ１１、約４×Ｅ１１、約４．５×Ｅ１１、約５×Ｅ１１、約５．５×Ｅ１１、約６×Ｅ１１、約６．５×Ｅ１１、約７×Ｅ１１、約７．５×Ｅ１１、約８×Ｅ１１、約８．５×Ｅ１１、約９×Ｅ１１、約９．５×Ｅ１１、約１０×Ｅ１１、約１×Ｅ１２、約１．３×Ｅ１２、約１．５×Ｅ１２、約２×Ｅ１２、約２．１×Ｅ１２、約２．３×Ｅ１２、約２．５×Ｅ１２、約２．７×Ｅ１２、約２．９×Ｅ１２、約３×Ｅ１２、約３．１×Ｅ１２、約３．３×Ｅ１２、約３．５×Ｅ１２、約３．７×Ｅ１２、約３．９×Ｅ１２、約４×Ｅ１２、約４．１×Ｅ１２、約４．３×Ｅ１２、約４．５×Ｅ１２、約４．７×Ｅ１２、約４．９×Ｅ１２、約５×Ｅ１２、約５．１×Ｅ１２、約５．３×Ｅ１２、約５．５×Ｅ１２、約５．７×Ｅ１２、約５．９×Ｅ１２、約６×Ｅ１２、約６．１×Ｅ１２、約６．３×Ｅ１２、約６．５×Ｅ１２、約６．７×Ｅ１２、約６．９×Ｅ１２、約７×Ｅ１２、約７．１×Ｅ１２、約７．３×Ｅ１２、約７．５×Ｅ１２、約７．７×Ｅ１２、約７．９×Ｅ１２、約８×Ｅ１２、約８．１×Ｅ１２、約８．３×Ｅ１２、約８．５×Ｅ１２、約８．７×Ｅ１２、約８．９×Ｅ１２、約９×Ｅ１２、約９．１×Ｅ１２、約９．３×Ｅ１２、約９．５×Ｅ１２、約９．７×Ｅ１２、約９．９×Ｅ１２、約１０×Ｅ１２、約１０．１×Ｅ１２、約１０．３×Ｅ１２、約１０．５×Ｅ１２、約１０．７×Ｅ１２、約１０．９×Ｅ１２、約１１×Ｅ１２、約１１．５×Ｅ１２、約１２×Ｅ１２、約１２．５×Ｅ１２、約１３×Ｅ１２、約１３．５×Ｅ１２、約１４×Ｅ１２、約１４．５×Ｅ１２、約１５×Ｅ１２、約１５．５×Ｅ１２、約１６×Ｅ１２、約１６．５×Ｅ１２、約１７×Ｅ１２、約１７．５×Ｅ１２、約１８×Ｅ１２、約１８．５×Ｅ１２、約１９×Ｅ１２、約１９．５×Ｅ１２、約２０×Ｅ１２、約２０．５×Ｅ１２、約３０×Ｅ１２、約３０．５×Ｅ１２、約４０×Ｅ１２、約４０．５×Ｅ１２、約５０×Ｅ１２、約５０．５×Ｅ１２、約６０×Ｅ１２、約６０．５×Ｅ１２、約７０×Ｅ１２、約７０．５×Ｅ１２、約８０×Ｅ１２、約８０．５×Ｅ１２、約９０×Ｅ１２、約９５×Ｅ１２又は約１００×Ｅ１２ベクターゲノムであり、ここで、Ｅは、冪乗の底１０の省略形であり、ｘＥｙは、ｘに１０のｙ乗／指数を乗じたものを指す。一部の実施形態では、組換えウイルスは、１×Ｅ１３ベクターゲノムを含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、少なくとも５×Ｅ１１、少なくとも５．５×Ｅ１１、少なくとも６×Ｅ１１、少なくとも６．５×Ｅ１１、少なくとも７×Ｅ１１、少なくとも７．５×Ｅ１１、少なくとも８×Ｅ１１、少なくとも８．５×Ｅ１１、少なくとも９×Ｅ１１、少なくとも９．５×Ｅ１１、少なくとも１０×Ｅ１１、少なくとも１×Ｅ１２、少なくとも１．３１×Ｅ１２、少なくとも１．５１×Ｅ１２、少なくとも２×Ｅ１２、少なくとも２．１×Ｅ１２、少なくとも２．３×Ｅ１２、少なくとも２．５×Ｅ１２、少なくとも２．７×Ｅ１２、少なくとも２．９×Ｅ１２、少なくとも３×Ｅ１２、少なくとも３．１×Ｅ１２、少なくとも３．３×Ｅ１２、少なくとも３．５×Ｅ１２、少なくとも３．７×Ｅ１２、少なくとも３．９×Ｅ１２、少なくとも４×Ｅ１２、少なくとも４．１×Ｅ１２、少なくとも４．３×Ｅ１２、少なくとも４．５×Ｅ１２、少なくとも４．７×Ｅ１２、少なくとも４．９×Ｅ１２、少なくとも５×Ｅ１２、少なくとも５．１×Ｅ１２、少なくとも５．３×Ｅ１２、少なくとも５．５×Ｅ１２、少なくとも５．７×Ｅ１２、少なくとも５．９×Ｅ１２、少なくとも６×Ｅ１２、少なくとも６．１×Ｅ１２、少なくとも６．３×Ｅ１２、少なくとも６．５×Ｅ１２、少なくとも６．７×Ｅ１２、少なくとも６．９×Ｅ１２、少なくとも７×Ｅ１２、少なくとも７．１×Ｅ１２、少なくとも７．１×Ｅ１２、少なくとも７．３×Ｅ１２、少なくとも７．５×Ｅ１２、少なくとも７．７×Ｅ１２、少なくとも７．９×Ｅ１２、少なくとも８×Ｅ１２、少なくとも８．１×Ｅ１２、少なくとも８．３×Ｅ１２、少なくとも８．５×Ｅ１２、少なくとも８．７×Ｅ１２、少なくとも８．９×Ｅ１２、少なくとも９×Ｅ１２、少なくとも９．１×Ｅ１２、少なくとも９．１×Ｅ１２、少なくとも９．３×Ｅ１２、少なくとも９．５×Ｅ１２、少なくとも９．７×Ｅ１２、少なくとも９．９×Ｅ１２、少なくとも１０×Ｅ１２、少なくとも１０．１×Ｅ１２、少なくとも１０．３×Ｅ１２、少なくとも１０．５×Ｅ１２、少なくとも１０．７×Ｅ１２、少なくとも１０．９×Ｅ１２、少なくとも１１×Ｅ１２、少なくとも１１．５×Ｅ１２、少なくとも１２×Ｅ１２、少なくとも１２．５×Ｅ１２、少なくとも１３×Ｅ１２、少なくとも１３．５×Ｅ１２、少なくとも１４×Ｅ１２、少なくとも１４．５×Ｅ１２、少なくとも１５×Ｅ１２、少なくとも１５．５×Ｅ１２、少なくとも１６×Ｅ１２、少なくとも１６．５×Ｅ１２、少なくとも１７×Ｅ１２、少なくとも１７．５×Ｅ１２、少なくとも１８×Ｅ１２、少なくとも１８．５×Ｅ１２、少なくとも１９×Ｅ１２、少なくとも１９．５×Ｅ１２、少なくとも２０×Ｅ１２、少なくとも２０．５×Ｅ１２、少なくとも３０×Ｅ１２、少なくとも３０．５×Ｅ１２、少なくとも４０×Ｅ１２、少なくとも４０．５×Ｅ１２、少なくとも５０×Ｅ１２、少なくとも５０．５×Ｅ１２、少なくとも６０×Ｅ１２、少なくとも６０．５×Ｅ１２、少なくとも７０×Ｅ１２、少なくとも７０．５×Ｅ１２、少なくとも８０×Ｅ１２、少なくとも８０．５×Ｅ１２、少なくとも９０×Ｅ１２、少なくとも９５×Ｅ１２又は少なくとも１００×Ｅ１２ベクターゲノムの組換えウイルスを含み、ここで、Ｅは、冪乗の底１０の省略形であり、ｘＥｙは、ｘに底１０のｙ乗／指数を乗じたものを指す。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、約１×Ｅ１３ベクターゲノムの組換えウイルスを含む。
一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、感染多重度（ＭＯＩ）を用いて測定される。一部の例では、ＭＯＩとは、ポリヌクレオチドを送達することのできる細胞に対するベクター又はウイルスゲノムの比又は倍数を指す。一部の例では、ＭＯＩは、１×１０６である。一部の例では、本開示の組換えウイルスは、少なくとも１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７及び１×１０１８ＭＯＩであり得る。一部の例では、この開示の組換えウイルスは、１×１０８～１×１０１５ＭＯＩであり得る。一部の例では、本開示の組換えウイルスは、多くても１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７及び１×１０１８ＭＯＩであり得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルスの使用なしに（即ち非ウイルスベクターで）送達され得、ポリヌクレオチドの分量として測定され得る。概して、本開示の医薬組成物及び方法では、任意の好適な量のポリヌクレオチドが使用され得る。
一部の実施形態では、自己相補性ベクター（ｓｃ）を使用することができる。自己相補性ＡＡＶベクターを使用すると、ウイルス第２鎖ＤＮＡ合成の必要性を回避することができ、Ｗｕ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００７，１８（２）：１７１－８２（参照により本明細書に援用される）によって提供されるとおり、トランス遺伝子タンパク質の発現率が高まることにつながり得る。
一部の実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルス及びＨＩＶベースのウイルスが含まれ得る。一部の実施形態では、ＨＩＶベースのウイルスベクターを使用することができ、このＨＩＶベースのウイルスベクターは、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子がＨＩＶゲノムに由来し、ｅｎｖ遺伝子が別のウイルスからのものである少なくとも２つのベクターを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡウイルスベクターが使用され得る。そうしたベクターには、オルソポックス又はアビポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスＩ型ウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター［Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ．Ａ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．；９０：７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８７；１１４９（１９９０）］、アデノウイルスベクター［ＬｅＧａｌ ＬａＳａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６９：２００４（１９９５）］及びアデノ随伴ウイルスベクター［Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）］（参照により全体として本明細書に援用される）が含まれ得る。
一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。本開示における使用のためのレンチウイルスベクターは、ヒト及び非ヒト（ＳＩＶを含む）レンチウイルスに由来し得る。レンチウイルスベクターの例は、ベクター増殖に必要なポリヌクレオチド配列並びにＭＷ－オプシントランス遺伝子に作動可能に連結された組織特異的プロモーターを含むことができる。ポリヌクレオチド配列には、ウイルスＬＴＲ、プライマー結合部位、ポリプリントラクト、ａｔｔ部位及びカプシド形成部位を含み得る。
一部の実施形態では、ベクターは、アルファウイルスベクターであり得る。セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）及びシンドビスウイルス（ＳＩＮ）から作られるものなどのアルファウイルスベースのベクターも本開示で使用され得る。アルファウイルスの使用については、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４３：２４７－２５７，２０００及びＰｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：９８０２－９８０７，２０００（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一部の実施形態では、ベクターは、ポックスウイルスベクターであり得る。ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入し得る。アビポックスウイルスベクターによれば、遺伝子又はポリヌクレオチドは短期間に限り発現することになり得る。本開示の組成物及び方法では、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターを使用し得る。アデノウイルスベクターは、一部の態様ではアデノ随伴ウイルスよりも発現期間が短いこともあり（例えば、約１ヵ月未満）、はるかに長い発現を呈することもある。選ばれる詳細なベクターは、標的細胞及び治療下の病態に依存し得る。
一部の実施形態では、ベクター、例えばネイキッドＤＮＡ又はプラスミドは、細胞、組織又は対象に、ミセル：マイクロエマルション；リポソーム；ナノスフェア；ナノ粒子；ナノカプセル；固体脂質ナノ粒子；デンドリマー；ポリエチレンイミン誘導体及び単層カーボンナノチューブ；及び標的細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介する能力のある他の巨大分子複合体を使用して送達することができる。一部の例では、ベクターは、有機又は無機分子であり得る。一部の例では、ベクターは、小分子（即ち５ｋＤ未満）又は巨大分子（即ち５ｋＤ超）である。
本明細書には、（ａ）変異体ＡＡＶカプシドタンパク質であって、対応する非変異体又は非修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比べて網膜細胞への感染力の増加を付与する変異体カプシドタンパク質；（ｂ）ＭＷ－オプシンポリペプチド又は治療用トランス遺伝子をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む、視覚機能を回復させるか又は増強するための遺伝子療法に適合した組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンも開示される。一部の実施形態では、遺伝子療法に使用されるｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ２である。
一部の実施形態では、本明細書には、（ａ）変異体ＡＡＶカプシドタンパク質であって、カプシドタンパク質の溶媒曝露領域にアミノ酸修飾を含む、且つ対応する非変異体ＡＡＶカプシドタンパク質と比べて網膜細胞への感染力の増加を示す変異体ＡＡＶカプシドタンパク質；及び（ｂ）ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む異種ポリヌクレオチドを含む、視覚機能を回復させるか又は増強するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、霊長類又はヒト対象の眼において有効量のｒＡＡＶを眼内注射、硝子体内注射又は網膜下注射によって投与すると、眼の視覚機能の回復又は増強が生じるｒＡＡＶビリオンが開示される。
本明細書には、（ａ）変異体ＡＡＶカプシドタンパク質であって、ＡＡＶカプシドタンパク質の溶媒曝露領域にアミノ酸修飾を含む変異体ＡＡＶカプシドタンパク質であり、且つ眼の内境界膜（ＩＬＭ）を通過する能力の増加を付与する変異体カプシドタンパク質；及び（ｂ）ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む異種ポリヌクレオチドを含む、視覚機能を回復させるか又は増強するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、霊長類又はヒト対象の眼において有効量のｒＡＡＶを眼内注射、硝子体内注射又は網膜下注射によって投与すると、眼の視覚機能の回復又は増強が生じるｒＡＡＶビリオンも開示される。
本明細書には、眼病態又は疾患の治療のための単位用量形態の遺伝子療法組成物であって、（ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、（ｉ）変異体ＡＡＶカプシドタンパク質であって、カプシドタンパク質の溶媒曝露領域にアミノ酸修飾を含み、且つ対応する非変異体ＡＡＶカプシドタンパク質と比べて網膜細胞への感染力の増加を示す変異体ＡＡＶカプシドタンパク質；及び（ｉｉ）ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む異種ポリヌクレオチドであって、ＭＷ－オプシンが形質導入時に霊長類又はヒト対象の眼の視覚機能を回復させるか又は増強する、異種ポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶビリオンと；（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物も開示され；ｒＡＡＶビリオンは、単位用量として霊長類の眼に眼内注射、硝子体内注射又は網膜下注射によって投与したときに視覚機能を少なくとも部分的に回復させるか又は増強するのに十分な量である。
治療用薬剤
一部の実施形態では、非ヒト霊長類又はヒト対象の眼又は眼の硝子体への投与に好適な又はそれに適合した、ＭＷ－オプシン活性を有する治療用トランス遺伝子が、遺伝子療法を用いて送達される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるカプシド変異体を含むｒＡＡＶは、ＭＷ－オプシンをコードする異種ポリヌクレオチド配列を含み、対象への眼内注射、硝子体内注射又は網膜下注射時にＭＷ－オプシントランス遺伝子の配列を網膜細胞に送達するために使用される。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシントランス遺伝子を含むｒＡＡＶは、遺伝子療法及び硝子体内注射のために製剤化される。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシントランス遺伝子は、その機能性断片又は変異体を指す。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシントランス遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３である。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシントランス遺伝子のポリヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列（例えば、配列番号３）は、インビボでのその活性、発現、安定性及び／又は溶解度を増強するため更に修飾される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子療法又はｒＡＡＶに使用されるＭＷ－オプシントランス遺伝子ポリヌクレオチド配列は、配列番号３の対応するポリヌクレオチド配列と比較され、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％又は１００％の配列相同性を示す。一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子療法又はｒＡＡＶにおいて使用されるポリヌクレオチド配列は、配列番号８又は配列番号９のポリヌクレオチド配列と比較され、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％又は１００％の配列相同性を示す。
本開示は、１つ以上の治療用薬剤を含む本明細書に開示されるとおりの方法及び医薬組成物を企図する。一部の実施形態では、治療用薬剤は、ＭＷ－オプシンポリペプチドである。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシンポリペプチドは、標的細胞、組織又は対象にインビボで送達されるものであるｒＡＡＶベクター又は遺伝子療法から発現する。遺伝子療法には、治療用薬剤、例えばＭＷ－オプシンポリペプチドがインビボで長時間提供されるため、タンパク質ベースの療法の投与と比較して、注射を繰り返す必要性が低下するという利点がある。遺伝子療法のかかる利点は、治療用薬剤のインビボでのより持続的な送達及び発現につながり得るため、現在の標準治療と比べて改善がもたらされる。加えて、遺伝子療法は、治療用薬剤のインビボでの、例えば標的細胞へのより標的化した送達をもたらし、オフターゲット効果を最小限に抑えることもできる。一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子産物は、発現すると対象の眼に視覚機能の回復又は増強を生じさせることのできるＭＷ－オプシンポリペプチドである。一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子産物は、個体の視覚機能を回復させるか又は増強することのできるＭＷ－オプシンポリペプチド又はその断片であり得る。
適応疾患
一部の例では、本明細書に記載されるとおりの、変異体カプシドタンパク質と治療用トランス遺伝子とを含む任意の血清型のｒＡＡＶビリオン又はその医薬組成物は、杆体及び錐体光受容体の消失に関連する眼病態又は疾患を少なくとも部分的に改善することができる。一部の実施形態では、カプシド変異体タンパク質を含むｒＡＡＶビリオンを使用して、ＭＷ－オプシントランス遺伝子がヒト対象の眼に送達される。本開示の方法による治療に好適な個体には、天然の光感受性が消失していて、従って視覚が損なわれている網膜変性病態を有するが、網膜回路の終わりにあるニューロン（例えば脳に出力する双極細胞又はアマクリン介在ニューロン又は神経節細胞）は残されていて、１つ又は複数の錐体オプシンの導入によって光に直接感受性を示すようにすることのできる場合の個体が含まれる。
本明細書に記載される適応疾患には、地図状萎縮、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞及びＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症（ＤＲ）が含まれる。本明細書に記載される他の実施形態には、網膜色素変性症、黄斑変性症、網膜分離症、レーベル先天性黒内障、錐体杆体ジストロフィー、スタルガルト病、バルデー・ビードル症候群、コロイデレミア、アッシャー症候群及びビエッティ水晶体ジストロフィーが含まれる。一部の例では、本明細書に開示される方法及び医薬組成物を使用して、ＭＷ－オプシントランス遺伝子が承認されているか又はそれが適応されている眼病態又は疾患を予防又は治療することができる。一部の実施形態では、遺伝子療法（例えば、ｒＡＡＶベースの遺伝子療法）を使用して、限定はされないが、ＡＭＤ、ＲＶＯ後の黄斑浮腫、ＤＭＥ及びＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症を含め、眼病態／疾患に対する少なくとも１つの現在の標準治療に反応を示す眼病態又は疾患が治療又は予防される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ遺伝子療法を使用して、杆体及び錐体光受容体の消失を特徴とする任意の眼病態又は障害が治療又は予防される。別の態様では、本開示は、例えば：ＡＭＤ、網膜色素変性症、黄斑変性症、網膜分離症、レーベル先天性黒内障、錐体杆体ジストロフィー、バルデー・ビードル症候群、コロイデレミア、アッシャー症候群、ビエッティ水晶体ジストロフィーなどの疾患の治療のための本明細書に提供される医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、眼病態は、網膜色素変性症であり得る。他の実施形態では、個体は、外傷、頭部傷害に起因する又は別の疾患の合併症（例えば、糖尿病性網膜症）としての網膜剥離又は光受容体の消失を経験したことがある。
一部の実施形態では、眼病態は、ＡＭＤであり得る。ＡＭＤは、中心視力の悪化を生じ得る。起こり得る他の症状としては、色覚障害及び変形視症（直線が波打って見えるゆがみ）が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるとおりの方法及び医薬組成物を使用してＡＭＤが治療される。用語「ＡＭＤ」は、特に指定されない場合、萎縮型ＡＭＤ又は滲出型ＡＭＤのいずれでもあり得る。本開示は、ＡＭＤ、滲出型ＡＭＤ及び／又は萎縮型ＡＭＤの治療又は予防を企図する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるとおりの方法及び医薬組成物を使用してＡＭＤが治療される。
使用方法
一部の実施形態では、本開示は、眼疾患の治療方法であって、薬学的に有効な量の本明細書に提供される医薬組成物をかかる治療を必要としているヒト対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患は、網膜色素変性症、黄斑変性症、地図状萎縮、加齢黄斑変性症、網膜分離症、レーベル先天性黒内障、錐体杆体ジストロフィー、バルデー・ビードル症候群、コロイデレミア、アッシャー症候群、ビエッティ水晶体ジストロフィー及びその他、スタルガルト病などの遺伝性網膜ジストロフィーを含む眼疾患の群から選択される。他の実施形態では、個体は、外傷、頭部傷害に起因する又は別の疾患の合併症（例えば、糖尿病性網膜症）としての網膜剥離又は光受容体の消失を経験したことがある。例えば、一部の例では、個体は、爆風傷害（例えば、軍事戦闘での）などの鈍的外傷によって生じるか、又は頭部への衝撃、例えば自動車事故又は頭部への衝撃が生じる他の事故の過程での衝撃によって生じる網膜剥離を経験したことがある。一部の例では、下層のＲＰＥからの網膜の外傷性剥離に起因して光受容体は消失しているが、内側の網膜神経細胞はインタクトである。本開示の方法による治療に好適な個体には、急性光損傷、レーザー曝露又は化学毒性に起因する光受容体の消失が見られる個体が含まれる。
一部の実施形態では、変異体カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ．７ｍ８）及びＭＷ－オプシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む医薬組成物を使用して、萎縮型ＡＭＤ及び滲出型ＡＭＤを含めたＡＭＤが治療又は予防される。一部の実施形態では、変異体カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ．７ｍ８）及びＭＷ－オプシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む医薬組成物を使用して、網膜色素変性症、黄斑変性症、網膜分離症、レーベル先天性黒内障、錐体杆体ジストロフィー、バルデー・ビードル症候群、コロイデレミア、アッシャー症候群及びビエッティ水晶体ジストロフィーが治療又は予防される。
一部の例では、遺伝子療法は、患者の生涯で一回限りの注射のみを要するため又は少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０若しくは５０年に１回より多く与えられることがないため、遺伝子療法ではリスクが低くなる。一部の例では、遺伝子療法の治療効果はより長く持続することができ、且つ１回限りの遺伝子療法注射のコストは、タンパク質の注射を複数回繰り返す合計コストよりも低くなり得るため、本明細書に開示されるとおりのＭＷ－オプシン遺伝子療法による治療は、タンパク質ベースの注射よりも費用効率が高くなり得る。
ノンコンプライアンスは（例えば、患者が１回以上の予定されていた注射を忘れるか又は抜かすと）、視力喪失及び眼疾患又は病態の悪化を招き得るが、遺伝子療法は、注射を繰り返す必要がないことにより、注射を繰り返す必要のある療法に付随する患者コンプライアンス及びアドヒアランスの課題にも対処する。投与のため診療所に繰り返し又は頻繁に出向く必要のある治療レジメンのノンコンプライアンス率及びノンアドヒアランス率は、ＡＭＤの影響を最も多く受ける高齢患者で高くなる。従って、ＭＷ－オプシントランス遺伝子を遺伝子療法により、例えば１回限りの硝子体内注射として患者の眼に送達すれば、患者にとってより利便性の高い治療選択肢が与えられることになり、ノンコンプライアンス及びノンアドヒアランスの問題が対処されることにより患者アウトカムが向上し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＭＷ－オプシン遺伝子療法を使用する方法は、凍結乾燥形態の本明細書に記載される医薬組成物（例えば、ＭＷ－オプシンポリヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶ）を医薬品表示に従い再構成すること及び前記再構成したＭＷ－オプシン遺伝子療法を対象又はヒト患者に投与することを含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ－ＭＷ－オプシンビリオンは、眼内注射を用いるか、硝子体内注射によるか、網膜下注射によるか又は任意の他の好都合な投与様式又は経路によって個体の眼に投与することができる。他の好都合な投与様式又は経路としては、例えば、局所、点眼薬、眼窩周囲、眼内、硝子体内、結膜下、球後、強膜内及び前房間等を挙げることができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法及び医薬組成物には、硝子体内注射による投与が関わる。
「治療有効量」は、本明細書に記載されるとき、臨床試験を通じて決定し得る比較的広い範囲であり得る。眼への直接的な注射又は硝子体内注射については、治療有効用量は、１０１０～１０１３ベクターゲノムといった桁数のＭＷ－オプシン遺伝子療法であり得る。
本明細書には、眼病態又は疾患を治療する方法であって、本明細書に記載されるとおりの、ＭＷ－オプシンを発現させるための遺伝子療法及びポリヌクレオチド配列のインビボ送達に適合したｒＡＡＶビリオンをヒト対象の眼に投与することを含む方法も開示され；ヒト対象は、天然の光感受性が消失しているため、従って視覚が損なわれている網膜病態に関連する眼病態と過去に診断されている。一部の実施形態では、遺伝子療法は、承認されている療法の少なくとも１つ、例えば抗ＶＥＧＦ剤による前治療を受けた患者に投与される。一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子療法は、承認されている療法の少なくとも１つ、例えば抗ＶＥＧＦ剤注射による前治療を受けていて、好転を示さなかった患者に投与される。一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子療法を受ける患者は、眼への注射を複数回繰り返す必要のある療法による患者の治療に不利に働く１つ以上のリスク要因を抱えており、例えば炎症、感染、眼圧亢進及び／又は他の有害作用のリスクが高い。
一部の実施形態では、ＭＷ－オプシン遺伝子療法又はその医薬組成物は、単回用量又は１回限りの用量として投与することができる。一部の実施形態では、様々な間隔の持続的期間にわたって所望の遺伝子発現レベルを実現するため２回以上の投与、例えば少なくとも２年に１回を超えないか又は少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０年若しくはそれを超えて１回が用いられ得る。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシン遺伝子療法の硝子体内注射により、患者は承認されているタンパク質注射を少なくとも１年又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０年又はそれを超えて受ける必要がなくなる。
ＭＷ－オプシントランス遺伝子インビボ遺伝子療法の送達によれば、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む医薬組成物を単回用量又は１回限りの用量で投与することが可能になるであろう。一部の実施形態では、対象に投与される遺伝子療法の総投与回数は、少なくとも１．５年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年又は少なくとも１０年に１回を超えない。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子療法の投与は、１回限りであるか又は患者の生涯に１回である。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子療法の１回限りの投与が、１年より長く続く、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０年又はそれを超える年数より長く続く治療効果を患者にもたらすことができる。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子療法の投与は、少なくとも２年以上、少なくとも３年以上、少なくとも４年以上、少なくとも５年以上、少なくとも６年以上、少なくとも７年以上、少なくとも８年以上、少なくとも９年以上又は少なくとも１０年以上に１回を超えない。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子療法は、少なくとも１つの現在の標準治療又は少なくとも１つの既存の療法、例えば抗ＶＥＧＦＴ剤に当初は反応を示した患者に投与される。一部の実施形態では、遺伝子療法は、遺伝子療法を受ける前に抗ＶＥＧＦ療法による前治療を受けた患者に投与される。
一部の実施形態では、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子療法を１回限り投与することにより、患者は、１年より長い間、１．５年より長い間又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０年又はそれを超える年数より長い間にわたって眼に抗ＶＥＧＦ剤又は任意の他のタンパク質ベースの治療薬又は標準ケア治療を受ける必要性がなくなる。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子療法の注射を受ける患者は、患者の残りの生涯にわたって眼に抗ＶＥＧＦ剤又は任意の他のタンパク質ベースの治療薬又は標準ケア治療のいかなる追加の注射も不要である。他の実施形態では、ＭＷ－オプシン遺伝子療法の１回限りの注射を受ける患者は、遺伝子療法を受けてから少なくとも１．５、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０年又それを超えて経過した後、必要に応じて、抗ＶＥＧＦ剤療法及び／又は任意の他の承認されている治療薬の後に療法を開始し得る。
本開示は、個体の視覚機能を増強する又は回復させる方法であって、本開示の組換えウイルスベクターを含む医薬組成物（又は組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）を個体の眼に投与することを含む方法を提供する。組換えウイルスベクター（又は組換えウイルスベクターを含むウイルス粒子）の投与後、網膜細胞でＭＷ－オプシンが産生される。網膜細胞でＭＷ－オプシンが産生されると、個体の視覚機能の増強又は回復がもたらされる。
個体の網膜細胞でＭＷ－オプシンポリペプチドが発現すると、個体によるパターン化された視覚及び画像認識がもたらされる。画像認識は、静止画像の認識及び／又は動的画像の認識であり得る。
個体の網膜細胞でＭＷ－オプシンポリペプチドが発現すると、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度での画像認識がもたらされる。例えば、一部の例では、個体の網膜細胞でＭＷ－オプシンポリペプチドが発現すると、約１０－２Ｗ／ｃｍ２～約１０－４Ｗ／ｃｍ２、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１Ｗ／ｃｍ２、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０－１Ｗ／ｃｍ２又は約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約５×１０－１Ｗ／ｃｍ２の光強度での画像認識がもたらされる。一部の例では、個体の網膜細胞でＭＷ－オプシンポリペプチドが発現すると、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０－３Ｗ／ｃｍ２、約１０－３Ｗ／ｃｍ２～約１０－２Ｗ／ｃｍ２、約１０－２Ｗ／ｃｍ２～約１０－１Ｗ／ｃｍ２又は約１０－１Ｗ／ｃｍ２～約１Ｗ／ｃｍ２の光強度での画像認識がもたらされる。一部の例では、個体の網膜細胞でＭＷ－オプシンポリペプチドが発現すると、２Ｗ／ｃｍ２以下、３Ｗ／ｃｍ２以下、４Ｗ／ｃｍ２以下、５Ｗ／ｃｍ２以下又は１０Ｗ／ｃｍ２以下の光強度での画像認識がもたらされる。個体の網膜細胞でＭＷ－オプシンポリペプチドが発現すると、５Ｗ／ｃｍ２未満、４Ｗ／ｃｍ２未満、３Ｗ／ｃｍ２未満又は２Ｗ／ｃｍ２未満の光強度での画像認識がもたらされる。
個体の網膜細胞でＭＷ－オプシンポリペプチドが発現すると、網膜細胞においてチャネルロドプシンポリペプチドを発現する個体による画像認識をもたらすのに必要な光強度の少なくとも１０分の１の光強度での個体による画像認識がもたらされる。例えば、個体の網膜細胞でＭＷ－オプシンポリペプチドが発現すると、網膜細胞においてチャネルロドプシンポリペプチドを発現する個体による画像認識をもたらすのに必要な光強度の少なくとも１０分の１、少なくとも２５分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも１５０分の１、少なくとも２００分の１、少なくとも３００分の１、少なくとも４００分の１又は少なくとも５００分の１の光強度での個体による画像認識がもたらされる。
網膜細胞でＭＷ－オプシンポリペプチドが発現すると、ロドプシンポリペプチドによって網膜細胞に付与される反応速度と比べて少なくとも２倍速い反応速度がもたらされる。例えば、網膜細胞でＭＷ－オプシンポリペプチドが発現すると、ロドプシンポリペプチドによって網膜細胞に付与される反応速度と比べて少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍又は１００倍超速い反応速度がもたらされる。
ＭＷ－オプシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターは、組換え発現ベクターの投与前の視覚機能と比較して、個体の視覚機能を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍又は１０倍超増加させるのに有効な量で投与される。視覚機能の検査は、当技術分野で公知であり、視覚機能の評価に任意の公知の検査を適用することができる。
本開示は、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む１つ以上の組換え発現ベクターを含む組成物を提供する。本組成物がそれを必要としている個体に投与されると、ＭＷ－オプシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、それを必要としている対象の眼に発現するため、ＭＷ－オプシンが対象の眼で産生されることになり、１つ以上の有益な臨床アウトカムが結果として生じる。例えば、本組成物がそれを必要としている個体の眼に投与されると、ＭＷ－オプシンをコードする１つ以上のヌクレオチド配列が、それを必要としている対象の眼に発現するため、ＭＷ－オプシンが対象の眼で産生されることになり、１つ以上の有益な臨床アウトカムが結果として生じる。ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列が、それを必要としている対象の眼に発現すると、１つ以上の錐体オプシンが対象の眼で産生されることになり、１つ以上の有益な臨床アウトカムが結果として生じる。
有益な臨床アウトカムとしては、以下が挙げられる：１）対象が空間パターン識別アッセイにおいて、垂直線を含む画像と、水平線を含む画像との間を区別することができる；２）対象が空間パターン識別アッセイにおいて、静止している線を含む画像と、動いている線を含む画像との間を区別することができる；３）対象が時間的光パターンアッセイにおいて、点滅光と連続光との間を区別することができる；４）対象が画像認識アッセイにおいて、約１０４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度での画像を認識することができる；及び５）対象が光回避アッセイにおいて、白色光のある領域と、白色光のない領域との間を区別することができる。
組成物が上述の有益な臨床アウトカムの１つ以上をもたらすかどうかは、当技術分野で公知の検査を用いて決定することができる。例えば、Ｌｅｉｎｏｎｅｎ ａｎｄ Ｔａｎｉｌａ（２０１７）Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｉｉ：Ｓ０１６６－４３２８（１７）３０８７０－７；Ｃａｐｏｒａｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９，１２１２－９；Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１，Ｅ５５７４－８３；Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：１５６２；及びＢｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８：１８６２を参照されたい。
ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む本開示の組成物であり、ｉ）組成物がそれを必要としている個体に投与されると；又はｉｉ）組成物がそれを必要としている個体の眼に投与されると、ポリヌクレオチド配列が、それを必要としている対象の眼に発現するようになり（ＭＷ－オプシンが対象の眼で産生されるようになり）、対象が空間パターン識別アッセイにおいて、垂直線を含む画像と、水平線を含む画像との間を区別することができるようになる。ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む本開示の組成物であり、ポリヌクレオチド配列が、それを必要としている対象の眼に発現すると（ＭＷ－オプシンが対象の眼で産生されるようになると）、対象は空間パターン識別アッセイにおいて、垂直線を含む画像と、水平線を含む画像との間を区別することができる。
ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む本開示の組成物であり、ｉ）組成物がそれを必要としている個体に投与されると；又はｉｉ）組成物がそれを必要としている個体の眼に投与されると、ポリヌクレオチド配列が、それを必要としている対象の眼に発現するようになり（ＭＷ－オプシンが対象の眼で産生されるようになり）、対象が空間パターン識別アッセイにおいて、静止している線を含む画像と、動いている線を含む画像との間を区別することができるようになる。本開示は、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む組成物を提供し、前記ポリヌクレオチド配列が、それを必要としている対象の眼に発現すると（ＭＷ－オプシンが対象の眼で産生されるようになると）、対象は空間パターン識別アッセイにおいて、静止している線を含む画像と、動いている線を含む画像との間を区別することができる。
ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む本開示の組成物であり、ｉ）組成物がそれを必要としている個体に投与されると；又はｉｉ）組成物がそれを必要としている個体の眼に投与されると、ポリヌクレオチド配列が、それを必要としている対象の眼に発現するようになり（ＭＷ－オプシンが対象の眼で産生されるようになり）、対象が時間的光パターンアッセイにおいて、点滅光と連続光との間を区別することができるようになる。本開示は、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む組成物を提供し、前記ポリヌクレオチド配列が、それを必要としている対象の眼に発現すると（ＭＷ－オプシンが対象の眼で産生されるようになると）、対象は時間的光パターンアッセイにおいて、点滅光と連続光との間を区別することができる。
ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む本開示の組成物であり、ｉ）組成物がそれを必要としている個体に投与されると；又はｉｉ）組成物がそれを必要としている個体の眼に投与されると、ポリヌクレオチド配列が、それを必要としている対象の眼に発現するようになり（ＭＷ－オプシンが対象の眼で産生されるようになり）、対象が画像認識アッセイにおいて、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度での画像を認識することができるようになる。本開示は、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む組成物を提供し、前記ポリヌクレオチド配列が、それを必要としている対象の眼に発現すると（ＭＷ－オプシンが対象の眼で産生されるようになると）、対象は、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度（例えば、約１０－４Ｗ／ｃｍ２～約１０－３Ｗ／ｃｍ２、約１０－３Ｗ／ｃｍ２～約１０－２Ｗ／ｃｍ２、約１０－２Ｗ／ｃｍ２～約１０－１Ｗ／ｃｍ２又は約１０－１Ｗ／ｃｍ２～約１Ｗ／ｃｍ２の光強度での画像を認識することができる。一部の例では、個体の網膜細胞でＭＷ－オプシンポリペプチドが発現すると、画像認識アッセイにおいて２Ｗ／ｃｍ２以下、３Ｗ／ｃｍ２以下、４Ｗ／ｃｍ２以下、５Ｗ／ｃｍ２以下又は１０Ｗ／ｃｍ２以下）の光強度での画像認識がもたらされる。
ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む本開示の組成物であり、ｉ）組成物がそれを必要としている個体に投与されると；又はｉｉ）組成物がそれを必要としている個体の眼に投与されると、ＭＷ－オプシンが、それを必要としている対象の眼に発現するようになり（ＭＷ－オプシンが対象の眼で産生されるようになり）、対象が光回避アッセイにおいて、白色光のある領域と、白色光のない領域との間を区別することができるようになる。本開示は、ＭＷ－オプシンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む組成物を提供し、ポリヌクレオチド配列が、それを必要としている対象の眼に発現すると（ＭＷ－オプシンが対象の眼で産生されるようになると）、対象は光回避アッセイにおいて、白色光のある領域と、白色光のない領域との間を区別することができる。
別の態様では、本開示は、治療を、それを必要としている対象において行うのに使用するための、上述のとおりの組換え発現ベクター又は上述のとおりの医薬組成物を提供する。一実施形態では、上述のとおりの組換え発現ベクター又は上述のとおりの医薬組成物は、対象の視覚機能を回復させるか又は増強する。
治療的使用のためのキット
本開示は、本明細書に記載される組成物の使用のためのキットも提供する。例えば、本開示は、本明細書に記載されるとおりの遺伝子療法システム；本明細書に記載されるとおりの遺伝子療法システムを含むウイルス粒子又は一組のウイルス粒子；及び／又は本明細書に記載されるとおりの遺伝子療法システムを含むポリヌクレオチド又は一組のポリヌクレオチドを含むキットを提供する。
一部の実施形態では、本キットは、加えて、本明細書に記載される方法のいずれかにおける使用に関する説明書を含むことができる。この含まれる説明書は、（ｉ）本明細書に記載されるとおりの遺伝子療法システムの送達；本明細書に記載されるとおりの遺伝子療法システムを含むウイルス粒子又は一組のウイルス粒子；及び／又は本明細書に記載されるとおりの遺伝子療法システムを含むポリヌクレオチド又は一組のポリヌクレオチドについての記載を含み得る。
本キットは、対象が治療を必要としているかどうかの同定に基づいて治療に好適な対象を選択することについての記載を更に含み得る。この説明書には、意図される治療についての投薬量、投薬スケジュール及び投与経路に関する情報が含まれ得る。容器は、単回用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）又は部分的単位用量であり得る。本開示のキットに供給される説明書は、典型的には、表示又は添付文書にある書面による説明書である。表示又は添付文書では、その医薬組成物が対象の疾患又は障害の治療、その発生の遅延及び／又はその軽減に使用されることが指示される。
本明細書に提供されるキットは、好適な包装にある。好適な包装には、限定はされないが、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装などが含まれる。注射器など、特定の器具と組み合わせた使用のためのパッケージも企図される。キットは、滅菌アクセスポート（例えば、皮下注射針によって穿刺可能な栓を備えるバイアル）を有し得る。一部の実施形態では、任意選択で、本キットは、シリンジ、フィルターニードル、延長チューブ、カニューレ又は網膜下用注射器など、投与器具を更に含む。
キットは、任意選択で、緩衝液及び解釈上の情報など、追加の構成要素を提供し得る。通常、本キットは、容器と、容器上にある又は容器と関連付けられている表示又は添付文書とを含む。一部の実施形態では、本開示は、上述のキットの内容物を含む製品を提供する。
一般的技法
本開示の実施には、特に指示されない限り、特に指示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術が用いられることになり、それらは、当分野の技術の範囲内にある。かかる技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６；及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）など、文献に十全に説明されている。
医薬組成物
本開示に係る医薬組成物は、用いられる投与様式に従い製剤化される。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、それは、無菌、発熱性物質不含、且つ粒子状物質不含である。等張性製剤が好ましくは使用される。概して、等張にするための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。一部の例では、リン酸緩衝生理食塩水などの等張液が好ましい。安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。一部の実施形態では、製剤には、血管収縮剤が添加される。
一部の実施形態では、本組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤を更に含み得る。薬学的に許容可能な賦形剤は、媒体、補助剤、担体又は希釈剤のような機能性分子であり得る。薬学的に許容可能な賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得、それとしては、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含めたＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンなどのベシクル及びスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン若しくはナノ粒子又は他の公知のトランスフェクション促進剤を挙げることができる。
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めたポリカチオン又は脂質である。トランスフェクション促進剤はポリ－Ｌ－グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ－Ｌ－グルタミン酸は本開示の組成物中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。トランスフェクション促進剤としては、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含めたＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体及びスクアレンなどのベシクル及びスクアレンも挙げることができ、且つヒアルロン酸も遺伝子コンストラクトと併せて使用して投与することができる。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシンポリペプチドをコードするｒＡＡＶビリオン及び／又は組換え発現ベクターを含む医薬組成物には、脂質、レシチンリポソーム又はその他、ＤＮＡ－リポソーム混合物など、当技術分野で公知のリポソーム（例えば、国際公開第９３２４６４０号パンフレットを参照されたい）を含めたリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン若しくはナノ粒子又は他の公知のトランスフェクション促進剤など、トランスフェクション促進剤も含まれる。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めたポリカチオン又は脂質である。本開示の組成物は、任意選択で、医学的作用物質、薬学的作用物質、担体、アジュバント、分散剤、希釈剤などを含み得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドコンストラクトは、投与のために医薬担体中に公知の技法に従って製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｔｈ Ｅｄ．２００５）を参照されたい。医薬組成物の製造では、ｒＡＡＶビリオン及び／又はポリヌクレオチドコンストラクトは、典型的には、とりわけ、許容可能な担体と混合される。担体は、固体（粉末を含む）若しくは液体又は両方であり得、好ましくは化合物と共に単位用量組成物として製剤化され、例えば、それは、化合物の重量基準で０．０１又は０．５％～９５％又は９９％を含有し得る。本開示の組成物中に１つ以上の化合物が取り込まれ得、それらは、製薬学の技術分野で周知の技法のいずれかにより調製することができる。
担体は、例えば、水、生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）及びこれらの任意の組み合わせを含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合に必要な粒径の維持により、且つポリソルベート類（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）、ラウリルジメチルアミンオキシド、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ポリエトキシル化アルコール類、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（商標））、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミン－Ｎ－オキシド、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＴＡＢ）、ポリオキシル１０ラウリルエーテル、Ｂｒｉｊ ７２１（商標）、胆汁酸塩（ナトリウム、デオキシコール酸塩、コール酸ナトリウム）、プルロニック酸（Ｆ－６８、Ｆ－１２７）、ポリオキシルヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標））ノニルフェノールエトキシレート（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標））、シクロデキストリン類及び塩化エチルベンゼトニウム（Ｈｙａｍｉｎｅ（商標））など、界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、クレゾール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール類、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることにより、内部組成物の持続的吸収をもたらすことができる。一部の実施形態では、医薬担体としては、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート及びスクロースが挙げられる。一部の実施形態では、医薬組成物は、界面活性剤、例えばポリソルベート、ポロキサマー又はプルロニックなどの非イオン性界面活性剤を含む。一部の実施形態では、非イオン性界面活性剤を加えると、懸濁液又は溶液中での凝集が減少する。硝子体内投与には、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び／又は等張剤、例えばグリセロールが挙げられる。
いずれの場合にも、医薬組成物は、無菌でなければならず、且つ易通針性又は易注入操作性が存在する程度の流動性があるべきである。それは、製造及び保存条件下で安定していなければならず、且つ細菌及び真菌などの微生物の混入作用を防ぐものでなければならない。一部の実施形態では、医薬組成物は、塩又はグリセロールなどの等張剤を含み得る。一部の実施形態では、凝集を防ぐため、医薬組成物には界面活性剤又は安定剤が加えられる。加えて、アルコール類、ＤＭＳＯ、グリセロール及びＰＥＧなどの凍結保護物質を凍結乾燥の凍結又は乾燥条件下での安定剤として使用するか、又は冷蔵懸濁液の作成のための安定剤として使用することができる。
一実施形態では、本医薬組成物は、本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオン、１つ以上の薬学的に許容可能な塩を約１０ｍＭ～約２００ｍＭのモル濃度で含む。一部の実施形態では、医薬組成物中の１つ以上の薬学的に許容可能な塩は、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ又は２００ｍＭ超の濃度である。一実施形態では、本医薬組成物は、本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオン、１つ以上のポリマーを約０．０００１％～約０．０１％の濃度で含む。一部の実施形態では、医薬組成物中の１つ又は複数のポリマーは、約０．０００１％、約０．０００２％、約０．０００３％、約０．０００４％、約０．０００５％、約０．０００６％、約０．０００７％、約０．０００８％、約０．０００９％、約０．００１％、約０．００２％、０．００３％、０．００４％、約０．００５％、約０．００６％、約０．００７％、約０．００８％、約０．００９％又は約０．０１％の濃度である。一実施形態では、本医薬組成物は、約４．５～約７．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、医薬組成物のｐＨは、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４又は約７．５のｐＨを有する。一実施形態では、本医薬組成物は、本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオン、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１８０ｍＭ塩化ナトリウム、０．００５％ポロキサマー１８８を含み、７．３のｐＨを有する。
一部の実施形態では、凝集を回避するため、単位用量には低値のベクターゲノム量又は範囲が選択される。一部の実施形態では、注射に使用する量を少量化できるように、単位用量には高値のベクターゲノム量又は範囲が選択される。注射容積が少ないほど（例えば、５０、４０、３０、２０、１０又は５μＬ未満）、硝子体内注射に付随する眼圧の変化及び他の有害作用を低減することを促進し得る。一部の実施形態では、高濃度のｒＡＡＶも標的細胞への治療用トランス遺伝子の効率的な送達を確実にすることを促進する。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、霊長類（例えば、非ヒト霊長類及びヒト対象）への眼内注射、硝子体内注射又は網膜下注射による投与のために設計、操作又は適合される。一部の実施形態では、ＭＷ－オプシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶビリオンを含む医薬組成物は、対象の眼内への硝子体内注射のために製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、約２、２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００μＬ以下の容積の硝子体内注射が可能となるような濃度に製剤化される。一部の実施形態では、本明細書に開示される治療方法は、約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０μＬの容積の本明細書に開示されるとおりのＭＷ－オプシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを含む溶液又は懸濁液の硝子体内注射を含む。
上記で考察したとおり、本開示の更なる態様は、対象をインビボで治療する方法であって、対象に、薬学的に許容可能な担体中に本開示のポリヌクレオチドコンストラクトを含む医薬組成物を投与することを含む方法であり、この医薬組成物は、治療有効量で投与される。本開示の化合物のそれを必要としている真核生物対象への投与は、化合物を投与するための当技術分野で公知の任意の手段によることができる。本発明の別の態様は、上述の組換え発現ベクターと薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、生理食塩水を含む。更なる実施形態では、組成物は、無菌である。
別の態様では、本開示は、医薬の製造における使用のための上述のとおりの組換え発現ベクター又は上述のとおりの医薬組成物を提供する。
眼内投与、硝子体内投与又は網膜下投与に好適な本開示の組成物は、本明細書に記載されるｒＡＡＶビリオン及び／又はポリヌクレオチドコンストラクトの滅菌水性及び非水性注射溶液を含み、この調製物は、好ましくは意図される被投与者の硝子体と等張である。こうした調製物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤及び溶質を含有し得、それにより組成物が意図される被投与者の硝子体と等張になる。水性及び非水性滅菌懸濁液は、懸濁剤及び増粘剤を含むことができる。組成物は、単位＼用量又は複数用量容器、例えば密閉したアンプル及びバイアルに提供することができ、使用直前に滅菌液体担体、例えば生理食塩水又は注射用水を加えるのみで済むようなフリーズドライした（凍結乾燥した）状態で保存することができる。
先述した種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から、即時注射溶液及び懸濁液を調製することができる。例えば、本開示の一態様では、本開示のポリヌクレオチド又はｒＡＡＶを含む注射のための安定した無菌組成物が、単位剤形で密閉容器に提供される。一部の実施形態では、凍結乾燥形態の医薬組成物が、投与前にその医薬組成物を再構成するための溶液又は緩衝液と共にキットで提供される。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、溶液、均一溶液、懸濁液又は冷蔵懸濁液として供給される。一部の実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、本明細書に開示される医薬組成物における凝集を防止する界面活性剤を含む。一部の実施形態では、冷蔵懸濁液はキットに提供され、このキットには、シリンジ及び／又は希釈用緩衝液が含まれ得る。一部の実施形態では、冷蔵懸濁液は、プレフィルドシリンジとして提供される。一部の実施形態では、本明細書に開示されるとおりの眼疾患又は病態の治療又は予防方法は、冷蔵懸濁液を室温に加温すること及び／又は患者への投与前又は硝子体内注射前に懸濁液を撹拌して均一な分布を確実にすることを含む。一部の実施形態では、懸濁液は、患者への投与前に希釈される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるとおりのＭＷ－オプシン遺伝子療法を含む凍結乾燥した又は懸濁液の医薬組成物は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００μＬの容積（又は再構成後の容積）を有する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるとおりのＭＷ－オプシン遺伝子療法を含む凍結乾燥した又は懸濁液形態の医薬組成物は、０．１～０．５ｍＬ、０．１～０．２ｍＬ、０．３～０．５ｍＬ、０．５－１．０ｍＬ、０．５－０．７ｍＬ、０．６～０．８ｍＬ、０．８～１ｍＬ、０．９～１．１ｍＬ、１．０～１．２又は１．０～１．５ｍＬの容積を有する。他の実施形態では、再構成後の容積は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４又は１．５ｍＬを超えない。一部の実施形態では、再構成した溶液又は懸濁液は、投与前にろ過される。一部の実施形態では、患者への投与前に医薬組成物をろ過するため、フィルタ又はフィルタシリンジが使用される。
更に、本開示は、本明細書に開示される本開示のポリヌクレオチドコンストラクトのリポソーム製剤を提供する。リポソーム懸濁液を形成する技術は、当技術分野で周知である。従来のリポソーム技術を使用した、水溶液に可溶性の材料として、本開示のポリヌクレオチドコンストラクトを脂質ベシクルに取り込むことができる。そのような例では、化合物が水溶性であることに起因して、化合物はリポソームの親水性の中心又はコアの中に実質的に閉じ込められることになる。利用される脂質層は、任意の従来の組成のものであり得、コレステロールを含有するか又はコレステロールフリーであり得る。リポソームであって、作製されるものは、例えば、標準的な超音波処理及びホモジナイゼーション技法を用いてサイズを低減することができる。本明細書に開示される化合物を含有するリポソーム組成物を凍結乾燥して凍結乾燥物を作製することができ、これは、水などの薬学的に許容可能な担体で再構成して、リポソーム懸濁液を再生することができる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドコンストラクトを含む医薬組成物は、ｐＨ調整添加剤など、他の添加剤を含有し得る。詳細には、有用なｐＨ調整剤としては、塩酸などの酸、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム若しくはグルコン酸ナトリウムなどの塩基又は緩衝液が挙げられる。一部の実施形態では、塩酸及び水酸化ナトリウムを使用して溶液のｐＨが調整される。一部の実施形態では、懸濁液は中性ｐＨであるか、又は６．５～７．５のｐＨである。一部の実施形態では、懸濁液のｐＨは弱塩基性（例えば、ｐＨ約７．５、８、８．２、８．４、８．５又は９）である。一部の実施形態では、懸濁液又は溶液のｐＨは弱酸性（例えば、ｐＨ約６．５、６．３、６．１、６、５．５又は５）である。一部の実施形態では、懸濁液は溶液として冷蔵される。一部の実施形態では、懸濁液は、冷蔵されたミセルを含む。一部の実施形態では、懸濁液は冷蔵され、投与前に撹拌される。
更に、本組成物は、抗菌性保存剤を含有することができる。有用な抗菌性保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン及びベンジルアルコールが挙げられる。当技術分野で周知の他の添加剤としては、例えば、粘着除去剤、消泡剤、抗酸化剤（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）及びトコフェロール類、例えばα－トコフェロール（ビタミンＥ））、保存剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡ）、粘弾性調節剤、等張化剤（例えば、スクロース、ラクトース及び／又はマンニトールなどの糖）、着色剤、着臭剤、乳白剤、懸濁剤、結合剤、充填剤、可塑剤、滑沢剤及びこれらの混合物が挙げられる。かかる添加剤の量については、所望の詳細な特性に応じて当業者が容易に決定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるとおりの医薬組成物における使用のための組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）の生化学的精製では、任意の好適な方法を用いることができる。組換えＡＡＶウイルスは、細胞から直接又は細胞を含む培養培地から回収することができる。ウイルスは、凍結乾燥前又はｒＡＡＶウイルスの懸濁液を作成する前に、ゲルろ過、ろ過、クロマトグラフィー、アフィニティー精製、勾配超遠心又はサイズ排除法など、様々な生化学的手段を用いて精製することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、ヒト患者又は非ヒト霊長類における治療用薬剤としてのＭＷ－オプシンポリペプチドの遺伝子療法又は硝子体内送達に適合されている。一部の実施形態では、医薬組成物の単位用量は、１×１０１０～１×１０１３ウイルスゲノム（ｖｇ）を含む。一部の実施形態では、単位用量は、約２．１×１０１１、約２．１×１０１２又は約２．１×１０１３ベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物の単位用量は、１×１０１０～３×１０１２ベクターゲノムである。一部の例では、本開示の医薬組成物の単位用量は、１×１０９～３×１０１３ベクターゲノムである。一部の例では、本開示の医薬組成物の単位用量は、１×１０１０～１×１０１１ベクターゲノムである。一部の例では、本開示の医薬組成物の単位用量は、１×１０８～３×１０１４ベクターゲノムである。一部の例では、本開示の医薬組成物の単位用量は、少なくとも１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７及び１×１０１８ベクターゲノムである。一部の例では、本開示の医薬組成物の単位用量は、１×１０１０～５×１０１３ベクターゲノムである。一部の例では、本開示の医薬組成物の単位用量は、多くても約１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７及び１×１０１８ベクターゲノムである。
一部の実施形態では、この開示のｒＡＡＶの単位用量は、２×１０１１～８×１０１１又は２×１０１２～８×１０１２のベクターゲノムである。一部の実施形態では、この開示のｒＡＡＶの単位用量は、１０１０～１０１３、１０１０～１０１１、１０１１～１０１２、１０１２～１０１３又は１０１３～１０１４のベクターゲノムである。
一部の例では、ＭＷ－オプシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクターを含む組成物は、緩衝生理食塩溶液中に約１０８～約１０１５ウイルスゲノム（ｖｇ）の量で約５０μＬ～約１００μＬの容積で存在し、本組成物は、リン酸ナトリウム、ポロキサマー１８８を更に含み、７．３のｐＨを有する。
詳細な実施形態では、本開示のポリヌクレオチドコンストラクトは、治療有効量（この用語は上記に定義されるとおり）で対象に投与することができる。薬学的に活性な化合物の投薬量は、当技術分野で公知の方法により決定することができ、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｔｈ Ｅｄ．２００５）を参照されたい。任意の具体的な化合物の治療上有効な投薬量は、所与の開示されるポリヌクレオチドコンストラクト及び患者間で幾らか異なることになり、患者の病態及び送達経路に依存することになる。
更なる詳細なしに、当業者は、上記の記載に基づき、本開示をその最大限の範囲にまで利用することができると考えられる。従って、以下の具体的な実施形態は、単に例示に過ぎず、本開示の残りの部分を決して限定するものではないと解釈されるべきである。本明細書に引用される全ての刊行物は、本明細書において参照される目的又は主題について参照によって援用される。
実施例１
コドン最適化されたヒトＭＷ－オプシンｍＲＮＡの組換え発現ベクター媒介性発現の判定
６ウェルプレートにＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の２９３Ｔ細胞（継代３０代未満）を各ウェル２．０×Ｅ＋６細胞で播種した。１８時間～２４時間後、各ウェルに２μｇのＤＮＡ又はＰＥＩ－Ｍａｘのみ（対照）をトランスフェクトした。トランスフェクションから３日後に細胞及び培地を回収し、細胞を遠心によってペレット化し、処理の準備が完了するまで－８０℃で保存した。各試料について、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓキットで製造者の指示に従いＲＮＡを抽出し、２０μの水で溶出して、ＮａｎｏｄｒｏｐでＲＮＡ濃度を決定した。２μｇの全ＲＮＡを使用して、ＲＮアーゼ阻害薬と併せてＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キットで製造者の指示に従いｃＤＮＡを作成した。ｑＰＣＲについて、各試料（１０ｎｇ）のランはトリプリケートで行った。各ＭＷＯプライマー／プローブ対を以下に提供する。
Figure 2024522072000017
試験下の例示的組換え発現ベクターは、５’から３’の向きに、配列番号１の第１のＩＴＲ配列、配列番号２のプロモーター配列、配列番号３のＭＷ－オプシントランス遺伝子配列、配列番号４のエンハンサー配列、配列番号５のポリＡ／終結配列、配列番号６のイントロン配列及び配列番号７の第２のＩＴＲ配列を有した。例示的組換え発現ベクターは、５’から３’の向きに、第１のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＣＡＧプロモーター配列、ヒトＭＷ－オプシントランス遺伝子配列、ＷＰＲＥ配列、ヒトＭＷ－オプシン遺伝子配列に由来するイントロン配列、ポリＡ／終結配列、第２のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む。一部の実験において、組換え発現ベクターは、アンピシリン耐性を付与するポリヌクレオチド配列を更に含んだ（ＲＥＶ＿Ａｍｐ）。一部の実験において、組換え発現ベクターは、カナマイシン耐性を付与するポリヌクレオチド配列を更に含んだ（ＲＥＶ＿Ｋａｎ）。ｑＰＣＲ後、以下の平均Ｃｔ値が報告された。
Figure 2024522072000018
Ｃｔ（サイクル閾値）は、蛍光シグナルが閾値を超える、即ちバックグラウンドレベルを超えるのに必要なｑＰＣＲサイクルの数として定義される。ここで、１２．２５及び１２．２２の値は、ＲＥＶ＿Ａｍｐベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に、コドン最適化されたヒトＭＷ－オプシンｍＲＮＡが検出されたことを指示している。同様に、１２．１９及び１２．１６の値は、ＲＥＶ＿Ｋａｎベクターをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に、コドン最適化されたヒトＭＷ－オプシンｍＲＮＡが検出されたことを指示している。コドン最適化されたヒトＭＷ－オプシン配列を有するＲＥＶ＿Ｋａｎ及びＲＥＶ＿Ａｍｐベクターは、ミニＣＡＧプロモーター及びコドン最適化されていないヒトＭＷ－オプシンコード配列に頼る同様のベクターと比較して、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、より良好なｍＲＮＡ発現を実証した（ｈＭＷＯで１７．７８の平均Ｃｔ値、ｃｏｈＭＷＯ対１番で３０．２２の平均Ｃｔ値及びｃｏｈＭＷＯ対２番で３０．１０の平均Ｃｔ値）。
実施例２
コドン最適化されたヒトＭＷ－オプシンタンパク質の組換え発現ベクター媒介性発現の判定
２４ウェルプレートにＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の２９３Ｔ細胞（継代３０代未満）を各ウェル２５０，０００細胞で播種した。１８時間～２４時間後、各ウェルに２μｇのＤＮＡ又はＰＥＩ－Ｍａｘのみ（対照）をトランスフェクトした。トランスフェクションから３日後、ウェルから培地を慎重に取り除き、４％パラホルムアルデヒドの新鮮な溶液（４％ＰＦＡ、１ｍＬ／ウェル）を穏やかに回転させながら１０分間補充した。４％ＰＦＡを取り除き、各ウェルをＰＢＳで３回、各５分間洗浄した。細胞をブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００）中にて室温で３０分間、穏やかに回転させながら透過処理した。このインキュベーションの終了時、ブロッキング緩衝液に、１％ＢＳＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００中１：２００希釈の一次抗体を補充した。一次抗体（赤／緑オプシン、ウサギポリクローナル抗体、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ ＡＢ５４０５）とのインキュベーションを暗所下にて穏やかに回転させながら４℃で一晩進行させておいた。翌朝、細胞をＰＢＳで３×５分間リンスした後、二次抗体（１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００中１：１０，０００希釈）との暗所下室温で２時間のインキュベーションを開始した。ＰＢＳで更に３回リンスした後（３×５分間）、ＤＡＰＩ含有マウント剤でスライド上にカバーガラスをマウントし、透明のマニキュア液で密封した。スライドを直ちに画像化し、次に暗所下４℃で保存した。
試験下の例示的組換え発現ベクターは、５’から３’の向きに、配列番号１の第１のＩＴＲ配列、配列番号２のプロモーター配列、配列番号３のＭＷ－オプシントランス遺伝子配列、配列番号４のエンハンサー配列、配列番号５のポリＡ／終結配列、配列番号６のイントロン配列及び配列番号７の第２のＩＴＲ配列を有した。組換え発現ベクターは、カナマイシン耐性を付与するポリヌクレオチド配列を更に含んだ（ＲＥＶ＿Ｋａｎ）。画像化した結果は図６に示す。より低い蛍光が観察された右上のパネルと比較して、右下のパネルに観察される蛍光に基づけば、コドン最適化されたヒトＭＷ－オプシンタンパク質が発現し、ウサギ抗オプシンポリクローナル抗体により検出された。
実施例３
本発明の組換え発現ベクターのＩＴＲ安定性の判定
本発明のＩＴＲポリヌクレオチドを更に最適化することにより、かかるＩＴＲ配列を有しない組換え発現ベクターに優る完全性及び安定性を本発明の組換え発現ベクターに付与しようとした。以下の記載は、ＲＥＶ＿ＫａｎにおけるＩＴＲの安定性の判定を説明する。
製造者の高効率プロトコルに従いＲＥＶ＿Ｋａｎ（１ｎｇ）でＮＥＳｂｔｌ細胞を形質転換した。これらの細菌細胞を５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有する寒天プレートに播き、３７℃で一晩（１２～１６時間）インキュベートした。４つのコロニーをピッキングし、それらを使用して５ｍＬスターター培養物（ＬＢ＋Ｋａｎ ５０ｍｇ／ｍＬ）を接種した。各スターター培養物を３７℃で一晩（１２～１６時間）、２５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした（ラウンド１）。翌朝、５００μＬの各ラウンド１スターター培養物を使用して新しい５ｍＬスターター培養物を接種し（ラウンド２）、残りの培養物（４．５ｍＬ）はペレット化して、Ｑｉａｇｅｎのミニプレップキットを使用して細胞からＤＮＡを抽出した。これを４回繰り返して６ラウンドの培養を完了した。図７を参照されたい。
ラウンド毎に全てのクローンからＤＮＡをＸｍａＩ酵素によって３７℃で２時間消化した。消化が完了次第、１％アガロースゲルに試料をロードし、１５０Ｖで４５分間から流した。ゲルを画像化し、バンディングパターンを調べた。図８を参照されたい。数ラウンドの培養後にＩＴＲ配列がインタクトである場合、予想されるＤＮＡ移動パターンには、３２５７、２７９８、１７３４、１１及び１１ｂｐバンドが含まれる。５’ＩＴＲに欠失が起こった場合、予想されるＤＮＡ移動パターンには、６０４９、１７３４及び１１ｂｐバンドが含まれる。３’ＩＴＲに欠失が起こった場合、予想されるＤＮＡ移動パターンには、４９８５、２７９８及び１１ｂｐバンドが含まれる。６０４９及び４９８５ｂｐにおけるバンドの存在は、ＩＴＲの何らかの組換えが起こったことを指示している。
６ラウンドの培養後（約１２６世代）、全てのクローンについて、ＩＴＲ組換えのエビデンスは検出されなかったことから、回収されたＲＥＶ＿Ｋａｎ組換え発現ベクターのＩＴＲが安定していたことが指示される。
実施例４
１３週間の観察期間としたカニクイザルにおけるコドン最適化ヒトＭＷ－錐体オプシンのベクター媒介性発現の硝子体内注射の分子局在研究
この分子局在研究の目的は、硝子体内（ＩＶＴ）注射によってカニクイザルマカクに投与したときの本発明の例示的ビリオン粒子の眼内分布を決定することであった。動物に５×１０１０又は４．５×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）を１回注射し、４週間（中間犠牲死）及び１３週間（終了後犠牲死）にわたって観察した。試験下のビリオン粒子内にある例示的組換え発現ベクターは、５’から３’の向きに、配列番号１の第１のＩＴＲ配列、配列番号２のプロモーター配列、配列番号３のＭＷ－オプシントランス遺伝子配列、配列番号４のエンハンサー配列、配列番号５のポリＡ／終結配列、配列番号６のイントロン配列及び配列番号７の第２のＩＴＲ配列を有した。例示的組換え発現ベクターには、５’から３’の向きに、第１のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＣＡＧプロモーター配列、ヒトＭＷ－オプシントランス遺伝子配列、ＷＰＲＥ配列、ヒトＭＷ－オプシン遺伝子配列に由来するイントロン配列、ポリＡ／終結配列、第２のＡＡＶ２ ＩＴＲ配列が含まれる。対照動物及び例示的ベクターを注射した動物の両方からの変法ダビッドソン試薬で固定したパラフィン包埋眼にて、ベクター配列のインサイチュハイブリダイゼーション並びにヒト錐体オプシン及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質の免疫染色を実施した。
インサイチュハイブリダイゼーションにより、全ての中間及び終了後屍検動物の試験注射眼に例示的ベクター配列が検出されたが、対側の未注射の眼及び媒体対照動物眼には検出されなかった。例示的核酸シグナルは中心網膜の多焦点領域（黄斑に富む）に局在したが、周辺網膜でより一様に分布した。シグナルは、毛様体、虹彩、虹彩角膜角、水晶体嚢及び視神経にも存在した。網膜では、例示的核酸シグナルは、網膜神経節細胞及び神経線維層の範囲内に豊富にあり、内網状層、内顆粒層の範囲内並びに場合により外顆粒層及び光受容体の範囲内では中程度であった。ＤＮアーゼ及びＲＮアーゼ前処理実験では、網膜にトランス遺伝子ｍＲＮＡの存在が実証された。二重インサイチュハイブリダイゼーション実験により、ほとんどのグルタミン酸代謝型受容体６（ＧＲＭ６）陽性双極細胞に例示的核酸シグナルが局在しないことが示された。例示的核酸シグナルは、低用量群（５×１０１０ｖｇ／眼）と比較して高用量群（４．５×１０１１ｖｇ／眼）で高かったが、同じ用量群では中間犠牲死動物と終了後犠牲死動物との間に有意差はなかった。
免疫組織化学により、ＡＡＶカプシドタンパク質及びヒト中波錐体オプシンの存在が実証され、ベクター投与動物の眼における、それぞれ例示的ベクターの形質導入及びトランス遺伝子産物の存在が確認された。
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＡＣＤ）（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）及びＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｕｃｚｏｎ、ＡＺ）のプローブ及び試薬を使用して、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を実施した。トランス遺伝子［コドン最適化されたヒト中波－錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）］のアンチセンス及びセンスプローブは、ＡＣＤによって例示的ベクター中の配列に基づき設計された。陽性ＰＰＩＢ及び陰性ＤＡＰＢ対照プローブセットを含めることにより、それぞれ、ｍＲＮＡ品質及び特異性を確かめた。
それぞれ、トランス遺伝子－ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ－ｅＧＦＰ及びＭＷ－オプシンを保有するプラスミドをトランスフェクトした陰性対照及び陽性対照細胞株で、例示的ベクターセンス及びアンチセンスプローブの特異性を評価した。これらの細胞株を処理して局在実験のためのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックにした。
全ての研究動物のブロックに対し、アンチセンス及びセンスＩＳＨを実施した。
ハイブリダイゼーション方法は、Ｖｅｎｔａｎａ ｍＲＮＡ赤色又は褐色色原体を用いて、ＡＣＤ及びＶｅｎｔａｎａ ｓｙｓｔｅｍｓによって確立されているプロトコルに従った。簡潔に言えば、５μｍ切片を６０度で６０分間ベーキングしてハイブリダイゼーションに使用した。Ｓａｋｕｒａ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ ＤＲ５染色液を以下のステップで使用して脱パラフィン及び再水和プロトコルを実施した：キシレン各５分を３回；１００％アルコール２分を２回；風乾５分。１×回収緩衝液中９８～１０４℃で１５分間のオフライン手動前処理。初めにＰＰＩＢ及びＤＡＰＢハイブリダイゼーションシグナルを判定し、続いて全てのスライドに同じ条件を用いることにより、最適化を実施した。前処理後、Ｖｅｎｔａｎａ Ｕｌｔｒａ自動染色装置にスライドを移して、プロテアーゼ前処理；４３℃で２時間のハイブリダイゼーションと、続く増幅；並びにＨＲＰ及びヘマトキシリン対比染色による検出を含むＩＳＨ手順を完了した。
例示的ベクターＤＮＡ及びＭＷ－オプシンｍＲＮＡの存在を実証するため、数匹の動物でＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ前処理実験を実施した。パラフィン包埋眼切片の５μｍ切片を脱パラフィンし、水素ペルオキシダーゼによって室温で１０分間処理した後、標的の回収を実施した。次に、スライドをＲＮアーゼＡ（Ｑｉａｇｅｎ カタログ番号１９１０１）によって３７℃で３０分間又はＤＮアーゼＩ（Ｑｉａｇｅｎ カタログ番号７９２５４）によって４０℃で１０分間処理した。次にスライドを上述のとおり処理した。
内顆粒層の双極細胞内における例示的核核酸シグナルの局在を決定するため、僅かな動物に対し、二重標識ＩＳＨ実験を実施した。例示的ベクターアンチセンス及びＧＲＭ６（代謝型グルタミン酸受容体６－ｍＧｌｕＲ６をコードする）プローブのシグナルを２つの異なる発色基質－それぞれ、ＨＲＰ－Ｃ１－Ｔｅａｌ及びＡＰ－Ｃ２－Ｒｅｄによって検出した。
修正半定量的Ｈスコア（以下に記載するとおり）を眼の様々な領域におけるベクター核酸局在のスコア化に適合させた。
半定量的修正Ｈスコア＝（０×「スコア０」細胞のパーセンテージ）＋（１×「スコア１」細胞のパーセンテージ）＋（２×「スコア２」細胞のパーセンテージ）＋（３×「スコア３」細胞のパーセンテージ）。「０」のスコアは、シグナルがないことを表す。１細胞当たり１～３個の点は「１」。１細胞当たり４～１０個の点は「２」、１細胞当たり１０個超の点且つ集塊を伴う細胞が１０％未満は「３」及び各細胞１０個超の点且つ集塊を伴う細胞が１０％超は「４」。
標準Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ試薬（Ｖｅｎｔａｎａ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用してＶｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ自動染色装置でオプシン及びＡＡＶカプシドタンパク質に関する免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を実施した。アッセイに使用した抗体及び濃度を表２に一覧にした。スライドを脱パラフィンし、次に標準的なＶｅｎｔａｎａ回収プロトコルに従いそれらをＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＣＣ１／ｐＨ８）溶液で被覆することにより、熱誘導による抗原回復に供した。以下に指示するとおりの適切なＶｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＯｍｎｉＭａｐ ＨＲＰ試薬、続いてＶｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＣｈｒｏｍｏＭａｐ ３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と共にインキュベートすることにより、可視化を達成した。Ｖｅｎｔａｎａヘマトキシリン及びＶｅｎｔａｎａブルーイング試薬を使用して各４分間対比染色を実施した。スライドを脱水し、清浄化し、且つ合成封入剤を加えてカバーガラスで覆った。各ランに陽性及び陰性対照組織を含めた。
Figure 2024522072000019
Figure 2024522072000020
公知の陽性（ＭＷ－オプシンをトランスフェクトした）及び陰性対照細胞ペレット（ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ－ｅＧＦＰをトランスフェクトした）でアンチセンス及びセンスプローブの特異性を評価した。予想どおり、陽性対照細胞は、アンチセンス及びセンスプローブのある核酸シグナルを十分な数示した一方、陰性細胞はアンチセンス及びセンスプローブに関して陰性であった。両方の細胞株とも中程度のＰＰＩＢシグナル（内因性対照）を示したため、ＩＳＨ条件は満足すべきものであった。
プローブの特異性が確立されたところで、研究眼組織における例示的ベクター核酸分布を更に特徴付けた。ＩＳＨアッセイに使用した眼切片は、中程度のＰＰＩＢ及びＤａｐＢ（細菌遺伝子）ｍＲＮＡシグナルに関して陰性を示したことから、ＲＮＡの完全性及びＩＳＨアッセイ手順の妥当性が確認された。未注射又はアーカイブの対照／媒体対照マカク眼では、例示的ベクター核酸シグナルはなかった。アンチセンスＩＳＨシグナルは中心網膜の多焦点領域に存在し、黄斑に豊富にシグナルがあったが、周辺網膜でより一様に分布した。シグナルは、毛様体、虹彩、虹彩角膜角、水晶体嚢及び視神経にも存在した。センスＩＳＨシグナルの局在パターンは、アンチセンスＩＳＨと同様であった（図９）。網膜の範囲内では、網膜神経節細胞の範囲内にＩＳＨシグナルが豊富であった。神経線維層、内網状層、内顆粒層並びに場合により外顆粒層、光受容体及び血管壁の範囲内に軽度～中程度の例示的ベクター核酸シグナルが認められた（図１０）。角膜、脈絡膜及び結膜にはＩＳＨシグナルはなかった。アンチセンス及びセンスの両方のＩＳＨシグナルとも、低用量群（５×１０１０ｖｇ／眼）と比較して高用量群（４．５×１０１１ｖｇ／眼）で高かったが、中間（投与４週間後）及び終了後（投与１３週間後）犠牲死動物間でＩＳＨシグナルに有意差はなかった（図１１）。
ＲＮアーゼで前処理すると、アンチセンス細胞質シグナルがなくなり、例示的ベクターの形質導入と一致して、網膜（主に神経節細胞の範囲内）、毛様体及び虹彩角膜角の範囲内に核内シグナルが明らかになった。ＤＮアーゼ前処理では、ＭＷ－オプシンの発現と一致して、網膜、視神経、毛様体、虹彩及び虹彩角膜角の核内及び細胞質内ＩＳＨシグナルが保持された。水晶体嚢及び神経線維層におけるＩＳＨシグナルはＤＮアーゼによって取り除かれたが、ＲＮアーゼ処理によっては取り除かれなかったことから、例示的ベクターがこれらの膜に結合することが示唆される。
例示的ベクター核が内顆粒層の双極細胞に局在するかどうかを調べるため、二重アンチセンス及びＧＲＭ６（ＯＮ双極細胞のマーカー）ＩＳＨ実験を実施した。ＧＲＭ６ ｍＲＮＡシグナルは内顆粒層にのみ局在し、既発表の報告と一致した（Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．１９９３；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２００８）。図１２に示されるとおり、ＧＲＭ６ ＩＳＨ陽性双極細胞と共局在したアンチセンスシグナルはほとんどなく、これは黄斑で特に明白であった。
研究眼における例示的ベクター形質導入を更に実証するため、抗ＡＡＶ ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３抗体でＡＡＶカプシドタンパク質の局在を実施した。予想どおり、陽性対照カニクイザル眼組織は、外顆粒層に強力な核免疫染色を示した。陽性対照研究動物では、神経節細胞の核及び周辺網膜の外顆粒層、網膜の内境界膜及び後部水晶体嚢の範囲内にＡＡＶカプシド免疫染色が認められた（図１３）。神経節細胞及び外顆粒層の核染色は、例示的ベクター形質導入を示唆している。水晶体嚢及び内境界膜におけるカプシドタンパク質の存在は、それらの膜へのベクターの付着を示唆しており、これは例示的ベクター核酸検出と一致する。他の眼領域又は他の研究動物に免疫染色がない原因は、変法ダビッドソン試薬に種々の抗体との適合性がないことに伴う組織固定効果にあった（Ｃｈｉｄｌｏｗ ｅｔ ａｌ．２０１１）。
ヒト中波（別名、緑）及び長波（別名、赤）錐体オプシンに対するポリクローナル抗体を使用して、例示的トランス遺伝子産物であるＭＷ－オプシンの発現を決定した。オプシンに関して陽性対照細胞（ヒトＭＷ－錐体オプシントランス遺伝子を含む）は免疫陽性であったが、陰性対照細胞（ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ－ｅＧＦＰトランス遺伝子を含む）は免疫陰性であり、これらの抗体の特異性が実証された。
中心網膜（一様な分布）及び周辺網膜（多焦点的分布）の両方の光受容体が、研究動物からの眼切片において強染色を示したことから、これらのポリクローナル抗体はカニクイザルマカク錐体オプシンと交差反応することが示唆される。光受容体を除けば、例示的ベクター投与動物の未注射の眼及び対照動物は、眼切片の他の範囲に免疫染色を示さなかった。全ての動物の中心及び／又は周辺網膜で、ＭＷ－オプシンに関する免疫染色は最小限（グレード１）乃至軽度（グレード２）であることが認められ（表５）、ベクター形質導入細胞におけるトランス遺伝子の翻訳が確認された。
Figure 2024522072000021
中心網膜の範囲内では、免疫染色は神経節細胞及び神経線維層に検出されたが、一方、周辺網膜は、ミュラー細胞パターンと似た、神経網膜の厚さ全体にわたる多焦点領域に免疫染色を示し（図１４）、これは例示的ベクター核酸局在と一致した。加えて、毛様体及び毛様体突起の非色素上皮は、最小限の免疫染色のみを示した。視神経、虹彩、虹彩角膜角、脈絡膜、水晶体、結膜及び角膜には、ＭＷ－オプシンに関する染色がなかった。ＭＷ－オプシン免疫染色の染色強度は、例示的ベクター核酸局在よりも弱かったが、その原因は、変法ダビッドソン試薬による組織固定効果にあり得る。
パラフィン包埋変法ダビッドソン固定カニクイザル眼の切片にて、アンチセンス及びセンスプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションを用いて例示的ベクター形質導入を実証した。全ての中間及び終了後屍検動物について、被験物質注射眼には例示的ベクター配列が検出されたが、対照動物には検出されなかった。ＩＳＨシグナルは中心網膜の多焦点領域に、特に黄斑に局在した。周辺網膜、毛様体、虹彩、虹彩角膜角、水晶体嚢及び視神経では、ＩＳＨシグナルは一様な分布を示した。予想どおり、ベクター形質導入は網膜神経節細胞に豊富であった。しかしながら、網膜（内顆粒層）、毛様体及び虹彩における他の細胞型も例示的ベクターによって形質導入される。
例示的ベクター核酸シグナルは、低用量群（５×１０１０ｖｇ／眼）と比較して高用量群（４．５×１０１１ｖｇ／眼）で高かった。しかしながら、中間犠牲死動物と終了後犠牲死動物との間に例示的ベクター核シグナル間の差はなかったことが指摘される点は興味深い。この観察は、このベクターが最長１３週間にわたって眼に残り続けることを示唆している。加えて、虹彩角膜角におけるベクター核酸の存在は、このベクターのクリアランス経路を示唆し得る。
二重インサイチュハイブリダイゼーション実験では、ＧＲＭ６陽性ＯＮ双極細胞に例示的ベクター核酸はほとんど局在せず、これは特に黄斑に明白であることが示された。中心及び周辺網膜では、例示的ベクター核酸分布はミュラー細胞パターンを有するように見える。
免疫組織化学により、網膜におけるＡＡＶ核内カプシドタンパク質の存在が実証されたことから、例示的ベクターの形質導入が確認された。更には、中心及び／又は周辺網膜及び毛様体にＭＷ－オプシン免疫染色が実証されたことから、例示的ベクターのトランス遺伝子産物の翻訳が確認された。眼切片においてカプシドタンパク質又はＭＷ－オプシン検出感度が低下した原因は、変法ダビッドソン固定液の使用に伴う抗原の消失にあった（Ｃｈｉｄｌｏｗ ｅｔ ａｌ．２０１１）。

Claims (60)

  1. 第１のＩＴＲポリヌクレオチド配列と、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）トランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターポリヌクレオチド配列と、ポリＡポリヌクレオチド配列と、イントロンポリヌクレオチド配列と、第２のＩＴＲポリヌクレオチド配列とを含む組換え発現ベクター。
  2. 第１のＩＴＲポリヌクレオチド配列と、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）トランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターポリヌクレオチド配列と、エンハンサーポリヌクレオチド配列と、ポリＡポリヌクレオチド配列と、第２のＩＴＲポリヌクレオチド配列とを含む組換え発現ベクター。
  3. 第１のＩＴＲポリヌクレオチド配列と、中波長錐体オプシン（ＭＷ－オプシン）トランス遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターポリヌクレオチド配列と、エンハンサーポリヌクレオチド配列と、ポリＡポリヌクレオチド配列と、イントロンポリヌクレオチド配列と、第２のＩＴＲポリヌクレオチド配列とを含む組換え発現ベクター。
  4. 前記第１のＩＴＲポリヌクレオチド配列は、配列番号１の配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  5. 前記プロモーターポリヌクレオチド配列は、配列番号２の配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  6. コドン最適化されているＭＷ－オプシントランス遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号３の配列と８５％同一の配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  7. ＭＷ－オプシントランス遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号３の配列と９０％同一の配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  8. ＭＷ－オプシントランス遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチドは、配列番号３の配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  9. 前記エンハンサーポリヌクレオチド配列は、配列番号４の配列を含む、請求項２又は４～８のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  10. 前記ポリＡポリヌクレオチド配列は、配列番号５の配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  11. 前記イントロンポリヌクレオチド配列は、配列番号６の配列を含む、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  12. 前記第２のＩＴＲポリヌクレオチド配列は、配列番号７の配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  13. 抗生物質への耐性を付与するポリヌクレオチド配列を更に含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  14. 前記抗生物質は、カナマイシンである、請求項１３に記載の組換え発現ベクター。
  15. 配列番号８の配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  16. 組換えウイルスベクターである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
  17. アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項１６に記載の組換えウイルスベクター。
  18. アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１７に記載の組換えウイルスベクター。
  19. ＡＡＶ２である、請求項１８に記載の組換えウイルスベクター。
  20. 前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、野生型アデノ随伴ウイルスカプシドと比較して、網膜細胞への増加した感染力を付与し、且つ／又は内境界膜を通過する増加した能力を付与する変異体カプシドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の組換えウイルスベクター。
  21. 配列番号９の配列を含む、請求項１９又は２０に記載の組換え発現ベクター。
  22. 前記変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１０～１９７からなる群から選択される配列を有する、請求項２１に記載の組換えウイルスベクター。
  23. 前記変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１０～２０からなる群から選択される配列を有する、請求項２０に記載の組換えウイルスベクター。
  24. 前記変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１４の配列を有する、請求項２０に記載の組換えウイルスベクター。
  25. 前記変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１５の配列を有する、請求項２０に記載の組換えウイルスベクター。
  26. 前記変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１６の配列を有する、請求項２０に記載の組換えウイルスベクター。
  27. 個体の視覚機能を回復させるか又は増強する方法であって、前記個体に、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクターを投与することを含み、前記投与は、前記個体の網膜細胞における前記ＭＷ－オプシントランス遺伝子の発現及び視覚機能の回復又は増強をもたらす、方法。
  28. 前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシントランス遺伝子の発現は、前記個体によるパターン化された視覚及び画像認識をもたらす、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記画像認識は、静止画像又はパターンのものである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記画像認識は、動的画像又はパターンのものである、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシントランス遺伝子の前記発現は、空間パターン識別アッセイにおいて、垂直線を含む画像と、水平線を含む画像との間の区別をもたらす、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシントランス遺伝子の前記発現は、空間パターン識別アッセイにおいて、静止している線を含む画像と、動いている線を含む画像との間の区別をもたらす、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシントランス遺伝子の前記発現は、時間的光パターンアッセイにおいて、点滅光と連続光との間の区別をもたらす、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシントランス遺伝子の前記発現は、画像認識アッセイにおいて、約１０４Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２の光強度での画像の認識をもたらす、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシントランス遺伝子の前記発現は、光回避アッセイにおいて、白色光のある領域と、白色光のない領域との間の区別をもたらす、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシントランス遺伝子の前記発現は、網膜細胞においてチャネルロドプシンポリペプチドを発現する個体による画像認識をもたらすために必要な光強度の少なくとも１０分の１の光強度での画像認識をもたらす、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記網膜細胞における前記ＭＷ－オプシントランス遺伝子の前記発現は、ロドプシンポリペプチドによって網膜細胞に付与される反応速度より少なくとも２倍速い反応速度をもたらす、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記投与は、眼内注射を介したものである、請求項２７～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記投与は、硝子体内注射を介したものである、請求項２７～３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記投与は、網膜下注射を介したものである、請求項２７～３７のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記個体は、網膜色素変性症、黄斑変性症、地図状萎縮、加齢黄斑変性症、網膜分離症、レーベル先天性黒内障、錐体杆体ジストロフィー、バルデー・ビードル症候群、コロイデレミア、アッシャー症候群、スタルガルト病及びビエッティ水晶体ジストロフィーから選択される眼疾患を有する、請求項２７～３７のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記個体は、外傷、頭部傷害に起因する又は別の疾患の合併症としての網膜剥離又は光受容体の消失を経験したことがある、請求項２７～３７のいずれか一項に記載の方法。
  43. ａ）請求項１～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター；及び
    ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤
    を含む医薬組成物。
  44. 前記薬学的に許容可能な賦形剤は、生理食塩水を含む、請求項４３に記載の医薬組成物。
  45. 無菌である、請求項４３又は４４に記載の医薬組成物。
  46. 治療を、それを必要としている対象において行うのに使用するための、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター又は請求項４３～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  47. 対象の視覚機能の回復又は増強における使用のための、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター又は請求項４３～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  48. 眼疾患を治療するための医薬の製造のための、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター又は請求項４３～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
  49. 視覚機能の回復又は増強における使用のための、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター又は請求項４３～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  50. 眼疾患の治療における使用のための、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター又は請求項４３～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  51. 請求項１～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
  52. 請求項１～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクターを作成する方法であって、請求項５１に記載の宿主細胞を培養することと、前記培養された宿主細胞を溶解させることと、前記溶解された培養宿主細胞から前記組換え発現ベクターを抽出及び精製することとを含む方法。
  53. 請求項４３～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物を作成する方法であって、請求項５１に記載の宿主細胞を培養することと、前記培養された宿主細胞の上清を回収することと、前記回収された上清から組換えウイルスベクターを濃縮及び精製することと、前記精製された組換えウイルスベクターに薬学的に許容可能な賦形剤を加えることとを含む方法。
  54. 網膜色素変性症、黄斑変性症、地図状萎縮、加齢黄斑変性症、網膜分離症、レーベル先天性黒内障、錐体杆体ジストロフィー、バルデー・ビードル症候群、コロイデレミア、アッシャー症候群、スタルガルト病又はビエッティ水晶体ジストロフィーから選択される眼疾患を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター又は請求項４３～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む方法。
  55. 前記眼疾患は、網膜色素変性症である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記眼疾患は、地図状萎縮である、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１６８～１７０からなる群から選択される配列を有する、請求項２０に記載の組換えウイルスベクター。
  58. 前記変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１６８の配列を有する、請求項２０に記載の組換えウイルスベクター。
  59. 前記変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１６９の配列を有する、請求項２０に記載の組換えウイルスベクター。
  60. 前記変異体カプシドポリペプチドは、配列番号１７０の配列を有する、請求項２０に記載の組換えウイルスベクター。
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