TW202313981A - 用於增強視覺功能之組成物和方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供了藉由向個體投與包含重組腺相關病毒（rAAV）載體的藥物組成物來恢復或增強該個體的視覺功能之組成物和方法，該重組腺相關病毒（rAAV）載體具有編碼中波長視錐視蛋白（MW-視蛋白）的多核苷酸序列。MW-視蛋白在該個體的視網膜細胞中表現，從而恢復或增強視覺功能。

Description

用於增強視覺功能之組成物和方法
遺傳性和年齡相關性視網膜變性疾病引起視桿和視錐光感受器的進行性喪失，從而導致失明。儘管喪失了視覺所需的感光細胞，但內視網膜的下游神經元仍然以功能狀態存活，為光遺傳學療法提供了靶標。光遺傳學方法具有某些限制，包括：a) 在微生物視蛋白和化學工程化的哺乳動物受體中的光敏性非常低；b) 在視網膜視蛋白中的動力學非常緩慢；以及c) 缺少在非常寬的環境光水平範圍內以高靈敏度提供自然視覺的適應機制。
因此，本領域需要治療眼部障礙之改善的光遺傳學方法。
在本發明之一個方面，本揭露提供了一種重組表現載體，其包含第一反向末端重複（ITR）多核苷酸序列、與編碼中波長視錐視蛋白（MW-視蛋白）轉基因的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。在另一方面，本揭露提供了一種重組表現載體，其包含第一反向末端重複（ITR）多核苷酸序列、與編碼中波長視錐視蛋白（MW-視蛋白）轉基因的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子多核苷酸序列、增強子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。在另一方面，本揭露提供了一種重組表現載體，其包含第一反向末端重複（ITR）多核苷酸序列、與編碼中波長視錐視蛋白（MW-視蛋白）轉基因的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列、內含子多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。在另一方面，本揭露提供了一種重組表現載體，其包含第一反向末端重複（ITR）多核苷酸序列、與編碼中波長視錐視蛋白（MW-視蛋白）轉基因的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子多核苷酸序列、增強子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列、內含子多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。
在一個實施方式中，第一ITR多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的序列。在一個實施方式中，啟動子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2的序列。在一個實施方式中，編碼MW-視蛋白轉基因的多核苷酸序列經過密碼子優化，使得與野生型MW-視蛋白轉基因相比，從該MW-視蛋白轉基因翻譯的MW-視蛋白以更大的量產生。在一個實施方式中，編碼MW-視蛋白轉基因的多核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 3的序列85%相同的序列。在一個實施方式中，編碼MW-視蛋白轉基因的多核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 3的序列90%相同的序列。在一個實施方式中，編碼MW-視蛋白轉基因的多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 3的序列。在一個實施方式中，增強子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4的序列。在一個實施方式中，多聚A多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5的序列。在一個實施方式中，內含子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6的序列。在一個實施方式中，第二ITR多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7的序列。在一個實施方式中，重組表現載體進一步包含賦予抗生素抗性的多核苷酸序列。在特定的實施方式中，抗生素係康黴素。在特定的實施方式中，重組表現載體包含SEQ ID NO: 8的序列。在特定的實施方式中，重組表現載體包含SEQ ID NO: 9的序列。
在一個實施方式中，重組表現載體係重組病毒載體。在特定的實施方式中，重組病毒載體係腺相關病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒載體或反轉錄病毒載體。在特定的實施方式中，重組病毒載體係腺相關病毒載體。在另一特定的實施方式中，重組病毒載體係AAV2。在另一實施方式中，重組腺相關病毒載體包含編碼變體殼體多肽的核苷酸序列，與野生型腺相關病毒殼體相比，該變體殼體多肽賦予增加的視網膜細胞感染性和/或賦予增加的穿過內界膜之能力。在另一實施方式中，變體殼體多肽具有選自由SEQ ID NO: 10-197組成之群組的序列。在另一實施方式中，變體殼體多肽具有選自由SEQ ID NO: 10-20組成之群組的序列。在另一實施方式中，變體殼體多肽具有SEQ ID NO: 14的序列。在另一實施方式中，變體殼體多肽具有SEQ ID NO: 15的序列。在另一實施方式中，變體殼體多肽具有SEQ ID NO: 16的序列。
在本發明之另一方面，本揭露提供了一種恢復或增強個體的視覺功能之方法，該方法包括向該個體投與上述重組表現載體，其中該投與提供了MW-視蛋白轉基因在個體的視網膜細胞中的表現以及視覺功能的恢復或增強。在一個實施方式中，MW-視蛋白轉基因在視網膜細胞中的表現提供了個體的模式化視覺和圖像識別。在另一實施方式中，圖像識別係靜態圖像或模式的圖像識別。在又另一實施方式中，圖像識別係活動圖像或模式的圖像識別。在一個實施方式中，MW-視蛋白轉基因在視網膜細胞中的表現提供了在空間模式辨別測定中區分包含垂直線的圖像和包含水平線的圖像。在另一個實施方式中，MW-視蛋白轉基因在視網膜細胞中的表現提供了在空間模式辨別測定中區分包含靜態線的圖像和包含移動線的圖像。在另一個實施方式中，MW-視蛋白轉基因在視網膜細胞中的表現提供了在時間光模式測定中區分閃光和恒定光。在一個實施方式中，MW-視蛋白轉基因在視網膜細胞中的表現提供了在圖像識別測定中在約10 4W/cm 2至約10 W/cm 2的光強度下識別圖像。在一個實施方式中，MW-視蛋白轉基因在視網膜細胞中的表現提供了在避光測定中區分具有白光的區域和沒有白光的區域。在一個實施方式中，MW-視蛋白轉基因在視網膜細胞中的表現提供了在如下光強度下的圖像識別，該光強度比在視網膜細胞中表現通道視紫紅質多肽的個體提供圖像識別所需的光強度低至少10倍。在一個實施方式中，MW-視蛋白轉基因在視網膜細胞中的表現提供了如下動力學，該動力學比視紫紅質多肽賦予視網膜細胞的動力學快至少2倍。在某些實施方式中，經由眼內、玻璃體內或視網膜下注射來投與。
在一些實施方式中，個體患有選自以下的眼部疾病：色素性視網膜炎、黃斑點退化、地圖樣萎縮、年齡相關性黃斑點退化、視網膜劈裂症、萊伯氏先天性黑蒙（Leber's Congenital Amaurosis）、視錐視桿營養不良、Bardet Biedl二氏症候群（Bardet Biedl syndrome）、無脈絡膜症、厄舍綜合症（Usher syndrome）、眼底黃色斑點症（Stargardt disease）和別蒂結晶樣營養障礙（Bietti crystalline dystrophy）。在其他實施方式中，個體由於創傷、頭部損傷或作為另一種疾病的併發症（例如糖尿病性視網膜病變）經歷視網膜脫落或光感受器喪失。
本發明之另一方面提供了一種包含上述重組表現載體和藥學上可接受的賦形劑的藥物組成物。在一個實施方式中，藥學上可接受的賦形劑包含鹽水。在另一實施方式中，組成物係無菌的。
在另一方面，本揭露提供了如上所描述的重組表現載體或如上所描述的藥物組成物，其用於治療有需要的受試者。在一個實施方式中，如上所描述的重組表現載體或如上所描述的藥物組成物恢復或增強受試者的視覺功能。在另一方面，本揭露提供了如上所描述的重組表現載體或如上所描述的藥物組成物，其用於製造藥物、或用於恢復或增強視覺功能、或用於治療眼部疾病。
在另一方面，本揭露提供了包含如上所描述的重組表現載體的宿主細胞。在另一方面，本揭露提供了一種製備如上所描述的重組表現載體之方法，其中該方法包括培養如上所描述的宿主細胞、裂解培養的宿主細胞、和從裂解的培養的宿主細胞中提取和純化重組表現載體。在另一方面，本揭露提供了一種製備如上所描述的藥物組成物之方法，其中該方法包括培養如上所描述的宿主細胞、收集培養的宿主細胞的上清液、從收集的上清液中濃縮和純化重組病毒載體、以及向純化的重組病毒載體中添加藥學上可接受的賦形劑。
在另一方面，本揭露提供了一種治療眼部疾病之方法，該眼部疾病選自色素性視網膜炎、黃斑點退化、地圖樣萎縮、年齡相關性黃斑點退化、視網膜劈裂症、萊伯氏先天性黑蒙、視錐視桿營養不良、Bardet Biedl二氏症候群、無脈絡膜症、厄舍綜合症、眼底黃色斑點症或別蒂結晶樣營養障礙，其中該方法包括向有需要的受試者投與治療有效量的如上所描述的重組表現載體或如上所描述的藥物組成物。在另一實施方式中，眼部疾病係色素性視網膜炎。在又另一實施方式中，眼部疾病係地圖樣萎縮。
本揭露關於藥物組成物、治療眼部疾病或病症之方法，該方法包括藉由眼內、玻璃體內或視網膜下注射將包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列（例如cDNA）的基因療法、載體或構建體投與到靈長類動物（例如猴或人）的眼中。在眼內、玻璃體內或視網膜下注射包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列的基因療法、載體或構建體時，MW-視蛋白轉基因在靶細胞或組織中體內表現以產生MW-視蛋白或基因產物，從而產生治療效果。
以下參考用於說明之實例應用來描述若干方面。應理解，闡述了許多具體細節、關係和方法以提供對本文描述的特徵的全面理解。然而，相關領域的普通技術者將容易認識到，可以在沒有一或多個具體細節的情況下或利用其他方法來實踐本文描述的特徵。本文描述的特徵不受限於所示出的動作或事件的順序，因為一些動作能以不同的順序發生和/或與其他動作或事件同時發生。此外，並非需要所有示出的動作或事件來實現根據本文描述的特徵的方法。本揭露的術語僅用於描述特定情況，而不旨在限制本揭露的伴隨物、方法和組成物。
除非另有說明，否則如本文所描述的本揭露之組成物和方法可以使用分子生物學（包括重組技術）、細胞生物學、生物化學、免疫化學和眼科技術的常規技術和描述，其在熟悉該項技術者的技能範圍內。這樣的常規技術包括用於觀察和分析受試者的視網膜或視力、選殖和繁殖重組病毒、配製藥物組成物以及生化純化和免疫化學之方法。可以藉由參考本文之實例來獲得合適技術的具體說明。然而，當然也可使用等效的常規程序。這樣的常規技術和描述可以在標準實驗室手冊中找到，例如Green等人編輯, Genome Analysis: A Laboratory Manual Series[基因組分析：實驗室手冊系列] (卷I-IV) (1999)；Weiner等人編輯, Genetic Variation: A Laboratory Manual[遺傳變異：實驗室手冊] (2007)；Dieffenbach, Dveksler編輯, PCR Primer: A Laboratory Manual[PCR引物：實驗室手冊] (2003)；Bowtell和Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual[DNA微陣列：分子選殖手冊] (2003)； Mount Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis[安裝生物資訊學：序列和基因組分析] (2004)；Sambrook和Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual[來自分子選殖的精編方案：實驗室手冊] (2006)；以及Sambrook和Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊] (2002)（所有來自冷泉港實驗室出版社）；Stryer. L., Biochemistry [生物化學] (第4版) W.H. Freeman [W.H. 弗裡曼出版社], N.Y. (1995)；Gait, 「O ligonucleotide Synthesis: A Practical Approach[寡核苷酸合成：實用方法]」 IRL Press [IRL出版社], 倫敦 (1984)；Nelson和Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry[生物化學原理], 第3版, W.H. Freeman Pub.[W.H. 弗裡曼出版社], 紐約 (2000)；以及Berg等人, Biochemistry[生物化學], 第5版, W.H. Freeman Pub.[W.H. 弗裡曼出版社], 紐約 (2002)，所有該等出於所有目的藉由引用以其全文併入本文。
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除非另有說明，否則本文中對「或」的任何提及旨在涵蓋「和/或」。如本文所用的，術語「約」數值係指該數值加上或減去該數值的10%。術語「約」範圍係指該範圍減去其最低值的10%並加上其最大值的10%。
術語「受試者」、「患者」或「個體」係指靈長類動物，包括非人靈長類動物，例如非洲綠猴和恒河猴、以及人類。在較佳的實施方式中，受試者係人類或人類患者。
如本文所用的術語「治療（treat）」、「治療（treating）」、「治療（treatment）」、「改善（ameliorate）」或「改善（ameliorating）」和其他語法等同物包括緩解、消除或改善疾病或病症症狀，預防另外的症狀，改善或預防症狀的基礎病因，抑制疾病或病症，例如，阻滯疾病或病症的發展，減輕疾病或病症，引起疾病或病症的消退，減輕由疾病或病症引起的狀況，或終止疾病或病症之症狀。術語還包括實現治療益處。治療益處係指根除或改善所治療的基礎疾病。此外，治療益處藉由根除或改善與基礎疾病相關的一或多種生理症狀來實現，使得在患者中觀察到改善，儘管在一些實施方式中，患者仍患有基礎疾病。在某些方面，為了預防益處，將藥物組成物投與於處於發生特定疾病的風險的患者，或投與於報告疾病的一或多種生理症狀的患者，即使尚未進行疾病的診斷。
如本文所用的術語「投與（administer）」、「投與（administering）」、「投與（administration）」等可以指用於使治療組成物或藥物組成物能夠遞送至期望的生物作用部位之方法。該等方法包括眼內、玻璃體內或視網膜下注射到眼中。
如本文所用的術語「有效量」、「治療有效量」或「藥學有效量」可指所投與的至少一種藥物組成物或化合物的足夠量，其將在一定程度上緩解所治療的疾病或病症的一或多種症狀。
如本文所用的術語「藥學上可接受的」可以指不消除本文揭露的化合物之生物活性或性質並且相對無毒的材料，例如載劑或稀釋劑（即，當將該材料投與於個體時，其既不引起不期望的生物效應，也不會以有害的方式與包含其的組成物之任何組分相互作用）。
如本文所用的術語「藥物組成物」或簡稱為「組成物」可指視需要與至少一種藥學上可接受的化學組分混合的生物活性化合物，該化學組分例如但不限於載劑、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑、賦形劑等。
如本文所用的「AAV載體」或「rAAV載體」係指腺相關病毒（AAV）載體或重組AAV（rAAV）載體，其包含非AAV來源的多核苷酸序列（即，與AAV異源的多核苷酸，例如編碼治療性轉基因（例如MW-視蛋白）的多核苷酸序列），通常是用於細胞遺傳轉化之目的序列。通常，異源多核苷酸的側翼為至少一個，通常為兩個AAV反向末端重複序列（ITR）。術語rAAV載體涵蓋rAAV載體顆粒和rAAV載體質體。rAAV載體可為單股的（ssAAV）或自身互補的（scAAV）。
「AAV病毒」或「AAV病毒顆粒」或「rAAV載體顆粒」係指由至少一種AAV殼體蛋白（通常為野生型AAV的所有殼體蛋白）和多核苷酸rAAV載體組成的病毒顆粒。如果顆粒包含異源多核苷酸（即不同於野生型AAV基因組的多核苷酸，例如要遞送至哺乳動物細胞的轉基因），則其通常稱為「rAAV載體顆粒」或簡稱為「rAAV載體」。因此，rAAV顆粒的產生必然包括rAAV載體的產生，因為這樣的載體包含在rAAV顆粒中。
如本文所用的術語「包裝」可指可導致rAAV顆粒之組裝和殼體化的一系列細胞內事件。AAV「rep」和「cap」基因係指編碼腺相關病毒的複製和殼體化蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中稱為AAV「包裝基因」。
術語「多肽」可涵蓋天然存在的和非天然存在的蛋白質（例如融合蛋白），其肽、片段、突變體、衍生物和類似物。多肽可為單體的、二聚體的、三聚體的或多聚體的。此外，多肽可以包含許多不同的結構域，每個結構域具有一或多種不同的活性。為了避免疑問，「多肽」可為兩個以上胺基酸的任何長度。
如本文所用，「多肽變體」係指其序列含有胺基酸修飾的多肽。在一些情況下，與參考蛋白或多肽（例如天然或野生型蛋白）的胺基酸序列相比，修飾可為一或多個胺基酸的插入、複製、缺失、重排或取代。變體可以具有一或多個胺基酸點取代（其中在一個位置處的單個胺基酸已經改變為另一個胺基酸）、一或多個插入和/或缺失（其中在參考蛋白質的序列中分別插入或缺失一或多個胺基酸）、和/或在胺基或羧基末端的任一個或兩個處截短胺基酸序列。與參考蛋白或未修飾蛋白相比，變體可具有相同或不同的生物活性。
在一些實施方式中，變體可例如與其對應物參考蛋白具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%整體序列同源性，其中該參考蛋白可為天然存在的或非天然存在的、或天然存在的蛋白之衍生物或變體。在一些實施方式中，變體可與野生型蛋白質具有至少約90%整體序列同源性。在一些實施方式中，變體表現出至少約95%、至少約98%、至少約99%、至少約99.5%或至少約99.9%整體序列同一性。
術語「多核苷酸」或「核酸」係指傳訊RNA（mRNA）、RNA、基因組RNA（gRNA）、正股RNA（RNA(+)）、負股RNA（RNA(-)）、基因組DNA（gDNA）、互補DNA（cDNA）或重組DNA。多核苷酸包括單股和雙股多核苷酸。較佳的是，多核苷酸包括與本文描述的任何參考序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多核苷酸或變體（參見例如序列表），通常其中變體保持參考序列的至少一種生物活性。在各種說明性實施方式中，本發明部分地考慮了包含多核苷酸的表現載體、病毒載體和轉移質體，以及包含它們的組成物和細胞。
在特定實施方式中，本發明提供了編碼多肽的至少約5、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、500、1000、1250、1500、1750或2000個或更多個連續胺基酸殘基以及所有中間長度的多核苷酸。容易理解，在本文中，「中間長度」係指引用值之間的任何長度，例如6、7、8、9等；101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。
如本文所用，「多核苷酸變體」係指與參考多核苷酸序列顯示基本序列同一性的多核苷酸，或在下文定義的嚴格條件下與參考序列雜交的多核苷酸。該等術語包括如下多核苷酸，該等多核苷酸與參考多核苷酸相比，添加或缺失一或多個核苷酸，或被不同的核苷酸替換。在這點上，本領域中充分理解，可以對參考多核苷酸進行包括突變、添加、缺失和取代的某些改變，由此改變的多核苷酸保留參考多核苷酸的生物學功能或活性。
如本文所用，「重組」可指生物分子，例如基因或蛋白質，其 (1) 已從其天然存在的環境中去除，(2) 不與自然界中發現基因的多核苷酸的全部或一部分締合，(3) 可操作地連接到其在自然界中不連接的多核苷酸，或 (4) 在自然界中不存在。術語「重組」可用於指選殖的DNA分離物、化學合成的多核苷酸類似物、或藉由異源系統生物合成的多核苷酸類似物、以及由這樣的多核苷酸編碼的蛋白質和/或mRNA。因此，例如，由微生物合成的蛋白質係重組的，例如，如果它係由細胞中存在的重組基因合成的mRNA合成的。
如本文所用的表述「序列同一性」或例如包含「50%相同的序列」係指在比較窗口上序列在逐個核苷酸基礎上或逐個胺基酸基礎上相同的程度。因此，「序列同一性百分比」可以如下進行計算：在比較窗口上比較兩個最佳比對的序列，確定相同核酸鹼基（例如，A、T、C、G、I）或相同胺基酸殘基（例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met）在兩個序列中出現的位置之數量以產生匹配位置的數量，將匹配位置的數量除以比較窗口中位置的總數（即窗口大小），並將結果乘以100以產生序列同一性百分比。包括與本文描述的任何參考序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽變體保持參考多肽的至少一種生物活性。
用於描述兩個或更多個多核苷酸或多肽之間的序列關係的術語包括「參考序列」、「比較窗口」、「序列同一性」、「序列同一性百分比」和「基本同一性」。「參考序列」的長度為至少12個，但通常為15至18個，通常為至少25個單體單元，包括核苷酸和胺基酸殘基。因為兩個多核苷酸可以各自包含 (1) 在兩個多核苷酸之間相似的序列（即，僅完整多核苷酸序列的一部分），和 (2) 在兩個多核苷酸之間差異的序列，兩個（或更多個）多核苷酸之間的序列比較通常藉由在「比較窗口」上比較兩個多核苷酸的序列以鑒定和比較序列相似性的局部區域來進行。「比較窗口」係指至少6個連續位置，通常約50至約100，更通常約100至約150的概念區段，其中在兩個序列最佳比對後將序列與相同數量的連續位置的參考序列進行比較。比較窗口可以包含與參考序列（其不包含添加或缺失）相比約20%或更少的添加或缺失（即，缺口），用於兩個序列的最佳比對。用於比對比較窗口的序列的最佳比對可藉由演算法的電腦化實現（Wisconsin遺傳學套裝軟體版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，美國威斯康辛州麥迪森科學大道575號遺傳學電腦組（Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., USA））或藉由檢查和藉由所選擇的各種方法中之任一種產生的最佳比對（即，導致比對窗口上的最高百分比同源性）來進行。也可參考BLAST家族程序，例如Altschul等人, 1997, Nucl. Acids Res.[核酸研究] 25:3389中揭露的。序列分析的詳細討論可參見Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學中的當前方案], John Wiley & Sons Inc [約翰威利父子公司], 1994-1998, 第15章的第19.3單元。
描述多核苷酸取向的術語包括：5'（通常是具有游離磷酸基團的多核苷酸的末端）和3'（通常是具有游離羥基（OH）基團的多核苷酸的末端）。多核苷酸序列能以5'至3'方向或3'至5'方向注釋。對於DNA和mRNA，5'至3'股被指定為「有義」股，「正」股或「編碼」股，因為其序列與前信使（premRNA）的序列相同[除了RNA中的尿嘧啶（U），而不是DNA中的胸腺嘧啶（T）]。對於DNA和mRNA，作為由RNA聚合酶轉錄的股的互補3'至5'股被指定為「範本」股、「反義」股、「負」股或「非編碼」股。如本文所用，術語「反向取向」係指以3'至5'取向書寫的5'至3'序列或以5'至3'取向書寫的3'至5'序列。
術語「互補」和「互補性」係指藉由鹼基配對規則相關的多核苷酸（即，核苷酸序列）。例如，DNA序列5' A G T C A T G 3'的互補鏈係3' T C A G T A C 5'。後一序列通常被寫為左5'端和右3'端的反向互補序列，5' C A T G A C T 3'。與其反向互補序列相同的序列被稱為迴文序列。互補性可為「部分的」，其中僅一些核酸的鹼基根據鹼基配對規則匹配。或者，核酸之間可以存在「完全」或「全部」互補性。
此外，熟悉該項技術者可以理解，由於遺傳密碼的簡並性，存在許多編碼如本文所描述的多肽或其變體片段的核苷酸序列。該等多核苷酸中的一些與任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。然而，本發明特別考慮了由於密碼子使用的差異而變化的多核苷酸，例如針對人和/或靈長類密碼子選擇而優化的多核苷酸。此外，還可以使用包含本文提供的多核苷酸序列的基因之等位基因。等位基因係由於一或多個突變如核苷酸的缺失、添加和/或取代而改變的內源基因。
「可操作地連接（Operatively linked或operably linked）」或「偶合」可指遺傳元件的並置，其中該等元件處於允許它們以預期方式操作的關係。例如，如果啟動子有助於啟動編碼序列的轉錄，則啟動子可以可操作地連接到編碼區。只要保持這種功能關係，在啟動子和編碼區之間就可以存在插入殘基。
術語「表現載體」或「表現構建體」或「盒」或「質體」或簡單地「載體」可包括任何類型的遺傳構建體，包括AAV或rAAV載體，其含有編碼基因產物的多核苷酸，其中部分或全部多核苷酸編碼序列能夠被轉錄並適用於基因療法。轉錄物可被翻譯成蛋白質。在一些情況下，它可以被部分地翻譯或不翻譯。在某些方面，表現包括基因轉錄和mRNA翻譯成基因產物。在其他方面，表現僅包括編碼目的基因的多核苷酸的轉錄。表現載體還可以包含可操作地連接到編碼區以促進蛋白質在靶細胞中表現的控制元件。控制元件和與其可操作地連接用於表現的一或多個基因的組合有時可稱為「表現盒」，大量表現盒係本領域已知和可獲得的、或可容易地由本領域可獲得的組分構建。
存在於表現載體中的「控制元件」或「調節序列」係載體的那些非翻譯區--複製起點、選擇盒、啟動子、增強子、內含子、聚腺苷酸化序列、5'和3'非翻譯區--其與宿主細胞蛋白相互作用以進行轉錄和翻譯。這樣的元件的強度和特異性可以不同。根據所用的載體系統和宿主，可以使用任何數量的合適的轉錄和翻譯元件，包括普遍存在的啟動子和誘導型啟動子。
如本文所用的術語「啟動子」係指與RNA聚合酶結合的多核苷酸（DNA或RNA）的識別位點。RNA聚合酶啟動並轉錄與啟動子可操作連接的多核苷酸。
術語「增強子」係指DNA區段，其含有能夠提供增強的轉錄的序列，並且在一些情況下可以獨立於它們相對於另一個控制序列的方向而起作用。增強子可以與啟動子和/或其他增強子元件協同或累加地起作用。
術語「異源」可指在基因型上不同於與之比較的實體的其餘部分之實體。例如，藉由基因工程技術導入衍生自不同物種的質體或載體中的多核苷酸可為異源多核苷酸。從其天然編碼序列中去除並可操作地連接到與其天然不連接的編碼序列的啟動子可為異源啟動子。
術語「MW-視蛋白」或「中波長視蛋白」或「中波長視錐視蛋白」係指智人視錐視蛋白1，即中波敏感的OPN1MW（NCBI RefSeq登錄號NM_000513，版本NM_000513.2），其功能片段或功能衍生物，以及包含它們的融合蛋白。MW-視蛋白在電磁光譜的綠色區域中具有約530 nm的λ max。它也被稱為「綠色視蛋白」、「M視蛋白」或「MWS視蛋白」。
範圍：在整個本揭露中，各個方面能以範圍形式呈現。應該理解的是，範圍形式的描述僅僅是為了方便以及簡潔，不應該被理解為對本揭露範圍的不靈活的限制。因此，範圍的描述應當被認為是具有確切揭露的所有可能的子範圍以及該範圍內的單獨數值。例如，範圍如從1至6的描述應當被認為是具有確切揭露的子範圍，如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及該範圍內的單獨數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作為另一個實例，範圍如95%-99%同一性包括具有95%、96%、97%、98%或99%同一性，並且包括如96%-99%、96%-98%、96%-97%、97%-99%、97%-98%和98%-99%同一性的子範圍。無論範圍的寬度如何，這都適用。除非另有說明，否則所有指定的範圍還包括端點。 載體
各種病毒載體可用於基因療法，包括腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、單純皰疹病毒或反轉錄病毒。
在一些實施方式中，本揭露的藥物組成物和方法提供將編碼MW-視蛋白轉基因的多核苷酸序列（例如，cDNA序列）遞送至有需要的人類受試者或患者（例如，診斷患有年齡相關性黃斑點退化（AMD）、色素性視網膜炎的患者）的視網膜細胞。使用遞送系統如rAAV或病毒載體將治療性轉基因的多核苷酸遞送至患者也稱為基因療法。
在一些實施方式中，編碼多核苷酸序列的MW-視蛋白之遞送可以使用任何合適的「載體」（也稱為「基因遞送」或「基因轉移媒介物」）進行。載體（例如rAAV）、遞送媒介物、基因遞送媒介物或基因轉移媒介物可涵蓋包含要遞送至靶細胞的多核苷酸之任何合適的大分子或分子複合物，該靶細胞係例如視網膜細胞，包括光感受器、視網膜神經節細胞、繆勒氏細胞、雙極細胞、無軸突細胞、水平細胞或視網膜色素上皮細胞。在一些情況下，靶細胞可為遞送多核苷酸分子或基因的任何細胞。
本揭露的組成物和方法提供了用於將MW-視蛋白轉基因多核苷酸序列遞送到非人靈長類動物或人類受試者的眼或視網膜細胞中之任何合適的方法。在特定的實施方式中，MW-視蛋白轉基因具有SEQ ID NO: 3的多核苷酸序列。SEQ ID NO: 3具有以下序列：
Figure 02_image001
。SEQ ID NO: 3係密碼子優化的多核苷酸序列，其增加人MW-視蛋白的表現，例如，相對於由未經密碼子優化的多核苷酸序列編碼的人MW-視蛋白之表現。在特定的實施方式中，MW-視蛋白轉基因具有與SEQ ID NO: 3至少85%、90%或95%相同的多核苷酸序列，該序列係密碼子優化的多核苷酸序列，其增加人MW-視蛋白的表現，例如相對於由未經密碼子優化的多核苷酸序列編碼的人MW-視蛋白之表現。在一些情況下，多核苷酸的遞送或基因療法被配製或適用於玻璃體內注射到非人靈長類動物或人類受試者的眼中。
在一些實施方式中，合適的載體包括但不限於病毒載體，例如腺病毒、腺相關病毒（AAV）、慢病毒、單純皰疹病毒和反轉錄病毒、脂質體、含脂質複合物、奈米顆粒和能夠將多核苷酸遞送至視網膜細胞的其他大分子複合物。在一些實施方式中，病毒載體包含與多核苷酸可操作連接的真核啟動子，例如巨細胞病毒（CMV）啟動子或組成型啟動子。在一個實施方式中，啟動子係雞β-肌動蛋白啟動子。在特定的實施方式中，啟動子具有與SEQ ID NO: 2至少85%、90%、95%或100%相同的多核苷酸序列。SEQ ID NO: 2具有以下序列：
Figure 02_image003
Figure 02_image005
。
在另一個實施方式中，啟動子係人突觸蛋白hSyn啟動子（Berry等人 (2019) Nat. Comm.[自然通訊] 10:1221）、CAG啟動子（Miyazaki等人 (1989) Gene[基因] 79:269）；麩胺酸代謝型受體-6（grm6）啟動子（Cronin等人 (2014) EMBO Mol. Med.[EMBO分子醫學] 6:1175）；昴星團啟動子（Portales-Casamar等人 (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國科學院院報] 107:16589）；膽鹼乙醯轉移酶（ChAT）啟動子（Misawa等人 (1992) Biol. Chem.[生物化學] 267:20392）；囊泡麩胺酸轉運蛋白（V-glut）啟動子（Zhang等人 (2011) Brain Res.[大腦研究] 1377:1）；麩胺酸脫羧酶（GAD）啟動子（Rasmussen等人 (2007) Brain Res.[大腦研究] 1144:19；Ritter等人 (2016) J. Gene Med.[基因醫學雜誌] 18:27）；膽囊收縮素（CCK）啟動子（Ritter等人 (2016) J. Gene Med.[基因醫學雜誌] 18:27）；小清蛋白（PV）啟動子；生長抑素（SST）啟動子；神經肽Y（NPY）啟動子；和血管活性腸肽（VIP）啟動子。合適的啟動子包括但不限於紅視錐視蛋白啟動子、視紫紅質啟動子、視紫紅質激酶啟動子和GluR啟動子（例如，GluR6啟動子）。合適的啟動子包括但不限於卵黃樣黃斑營養不良2（VMD2）基因啟動子和光感受器間類類視色素結合蛋白（IRBP）基因啟動子。還適合使用的係L7啟動子（Oberdick等人 (1990) Science[科學] 248:223）、thy-1啟動子、恢復蛋白啟動子（Wiechmann和Howard (2003) Curr. Eye Res.[現代眼科研究雜誌] 26:25）；BEST啟動子；ProB4啟動子（Jüttner, J.等人, (2019) Nat. Neurosci.[自然神經科學] 22:1345-1356）；ProC2啟動子；ProA18啟動子；ProB2啟動子；ProA6啟動子；ProA7啟動子；ProA1啟動子；ProA4啟動子；ProC22啟動子；ProD3啟動子；ProD4啟動子；ProD5啟動子；ProD6啟動子；ProA14啟動子；ProA36啟動子；ProD1啟動子；ProA5啟動子；ProB1啟動子；ProA27啟動子；ProC29啟動子；ProB15啟動子；ProA9啟動子；ProC8啟動子；ProA21啟動子；SNCG啟動子；ProC17啟動子；SynP156啟動子；ProA18啟動子；ProB4啟動子；ProB12啟動子；和鈣結合蛋白啟動子。在特定實施方式中，在哺乳動物細胞中可操作的啟動子包含位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處的富含AT的區域和/或在轉錄起始處上游70至80個鹼基處發現的另一序列。
在一些實施方式中，RNA可包括目的基因（例如MW-視蛋白）的轉錄物、內含子、非翻譯區（UTR）、終止序列等。在其他實施方式中，DNA可包括但不限於序列如啟動子序列、目的基因（例如MW-視蛋白）、UTR、增強子序列、內含子序列、終止序列、ITR序列等。在特定的實施方式中，增強子具有SEQ ID NO: 4的多核苷酸序列。SEQ ID NO: 4具有以下序列：
Figure 02_image007
。SEQ ID NO: 4的合成符合法規要求，並且係野生型WPR增強子的變體。
在特定的實施方式中，內含子具有SEQ ID NO: 6的多核苷酸序列。SEQ ID NO: 6具有以下序列：
Figure 02_image009
。合成SEQ ID NO: 6並將其摻入重組表現載體中，以保持轉基因接近4.5-4.7kB的包裝大小限制。此外，在重組表現載體中包含SEQ ID NO: 6降低了產生隱蔽剪接位點和替代編碼區的無義/改組DNA的風險。設計SEQ ID NO: 6以使GC含量最小化。預期用於本發明之其他內含子多核苷酸序列包括人SW-視蛋白、MW-視蛋白和LW-視蛋白內含子多核苷酸序列中的任一種，該等序列被縮短以保持轉基因接近4.5-4.7 kB的包裝大小限制，和/或用合適數量和類型的核苷酸殘基取代以最小化GC含量。
在特定的實施方式中，終止序列具有SEQ ID NO: 5的多核苷酸序列。SEQ ID NO: 5具有以下序列：
Figure 02_image011
。
在特定的實施方式中，5' ITR具有SEQ ID NO: 1的多核苷酸序列。SEQ ID NO: 1具有以下序列：
Figure 02_image013
。在另一特定的實施方式中，3' ITR具有SEQ ID NO: 7的多核苷酸序列。SEQ ID NO: 7具有以下序列：
Figure 02_image015
。設計SEQ ID NO: 1和7以確保重組表現載體在幾輪增殖/擴增中的穩定性。
在一些實施方式中，用於產生rAAV病毒的rAAV和/或質體包含以下多核苷酸元件：第一ITR序列；啟動子序列；編碼MW-視蛋白的序列；增強子序列；多聚A/終止序列、內含子序列；和第二ITR序列。在一些實施方式中，在該等多核苷酸元件的每一個之間使用連接子序列。在一些實施方式中，多核苷酸元件以下列5'至3'方向存在於rAAV和/或質體中：第一ITR序列；啟動子序列；編碼MW-視蛋白的序列；增強子序列；多聚A/終止序列、內含子序列；和第二ITR序列。在另一實施方式中，rAAV和/或質體包含SEQ ID NO: 8的多核苷酸序列。SEQ ID NO: 8具有以下序列：
Figure 02_image017
Figure 02_image019
Figure 02_image021
。
在另一實施方式中，rAAV和/或質體包含SEQ ID NO: 9的多核苷酸序列。SEQ ID NO: 9具有以下序列：
Figure 02_image023
Figure 02_image025
Figure 02_image027
Figure 02_image029
Figure 02_image031
Figure 02_image033
。
在一些實施方式中，重組表現載體包含第一反向末端重複（ITR）多核苷酸序列、與編碼中波長視錐視蛋白（MW-視蛋白）轉基因的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子多核苷酸序列、增強子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列、內含子多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。在一些實施方式中，重組表現載體進一步包含賦予抗生素抗性的多核苷酸。在又另一實施方式中，該抗生素係胺苄青黴素和/或康黴素。
在一些實施方式中，本揭露提供了重組病毒，例如重組腺相關病毒（rAAV），其作為用於在受試者中遞送和表現MW-視蛋白或其任何功能性片段或變體的載體。
在一些實施方式中，可以工程化或優化任何合適的病毒載體以用於本揭露的組成物和方法。例如，可以改變衍生自腺病毒（Ad）或腺相關病毒（AAV）的重組病毒載體，使其在人類或靈長類受試者中具有複製缺陷。在一些實施方式中，雜交病毒載體系統可以使用熟悉該項技術者已知的方法獲得，並用於將編碼MW-視蛋白的多核苷酸遞送至視網膜細胞。在一些實施方式中，病毒遞送系統或基因療法可將包含MW-視蛋白轉基因的多核苷酸序列整合到靶細胞基因組（例如，視網膜細胞的基因組）中並導致基因隨時間穩定的基因表現。在一些實施方式中，MW-視蛋白轉基因不整合到靶細胞基因組中，而是由導入靶細胞的質體或載體表現。
在一個實施方式中，重組表現載體係重組病毒載體。在特定的實施方式中，重組病毒載體係腺相關病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒載體或反轉錄病毒載體。在一些實施方式中，用於將MW-視蛋白之多核苷酸序列遞送至視網膜細胞的合適的病毒載體係AAV或rAAV，它們係小的無包膜單股DNA病毒。rAAV係非致病性人類細小病毒，並且可以依賴於輔助病毒（包括腺病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒和CMV）進行複製。暴露於野生型（wt）AAV不相關或已知引起任何人病理學，並且在一般群體中係常見的，使得AAV或rAAV成為用於基因療法的合適遞送系統。用於遞送治療性轉基因（例如，MW-視蛋白）的基因療法的AAV和rAAV可為任何血清型。在一些實施方式中，本揭露的藥物組成物和方法提供任何合適的AAV血清型（包括AAV1、AAV2、AAV2.5、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、AAV-DJ和其任何雜交或嵌合AAV）之用途。在一些實施方式中，所使用的血清型基於病毒的向性或目的靶細胞的感染性。在一些實施方式中，AAV2或rAAV2用於經由眼內、玻璃體內或視網膜下注射將編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列遞送到受試者的眼或視網膜細胞中。
在一些實施方式中，包含具有增加的靶細胞（例如視網膜細胞）感染性的變體殼體蛋白之AAV或rAAV病毒、顆粒或病毒粒子用於在受試者中增加視網膜細胞的轉導或增加基因靶向遞送至視網膜細胞。在一些實施方式中，rAAV病毒粒子在AAV殼體蛋白的殼體蛋白GH環/環IV中包含胺基酸修飾。在一些情況下，修飾位點係AAV殼體蛋白的GH環/環IV的溶劑可及部分。在一些實施方式中，rAAV病毒粒子包含變體AAV殼體蛋白，相對於相應的親本AAV殼體蛋白，該變體AAV殼體蛋白在殼體蛋白的GH環中包含5個胺基酸至11個胺基酸、例如7個胺基酸序列的插入，並且其中與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白的AAV病毒粒子對視網膜細胞的感染性相比，該變體殼體蛋白賦予增加的視網膜細胞感染性。已知幾種AAV殼體變體，包括7m8變體。其他AAV殼體變體揭露於WO 2018/022905中，其藉由引用以其全文併入本文。例如，預期用於本發明之AAV殼體變體包括具有以下蛋白序列的那些：(1) LAKDATKNA（SEQ ID NO:10）；(2) PAHQDTTKNA（SEQ ID NO:11）；(3) LAHQDTTKNA（SEQ ID NO:12）；(4) LATTSQNKPA（SEQ ID NO:13）；(5) LAISDQTKHA（SEQ ID NO:14）；(6) IARGVAPSSA（SEQ ID NO:15）；(7) LAPDSTTRSA（SEQ ID NO:16）；(8) LAKGTELKPA（SEQ ID NO:17）；(9) LAIIDATKNA（SEQ ID NO:18）；(10) LAVDGAQRSA（SEQ ID NO:19）；(11) PAPQDTTKKA（SEQ ID NO:20）；(12) LPHQDTTKNA（SEQ ID NO:21）；(13) LAKDATKTIA（SEQ ID NO:22）；(14) LAKQQSASTA（SEQ ID NO:23）；(15) LAKSDQSKPA（SEQ ID NO:24）；(16) LSHQDTTKNA（SEQ ID NO:25）；(17) LAANQPSKPA（SEQ ID NO:26）；(18) LAVSDSTKAA（SEQ ID NO:27）；(19) LAAQGTAKKPA（SEQ ID NO:28）；(20) LAPDQTTRNA（SEQ ID NO:29）；(21) LAASDSTKAA（SEQ ID NO:30）；(22) LAPQDTTKNA（SEQ ID NO:31）；(23) LAKADETRPA（SEQ ID NO:32）；(24) LAHQDTAKNA（SEQ ID NO:33）；(25) LAHQDTKKNA（SEQ ID NO:34）；(26) LAHQDTTKHA（SEQ ID NO:35）；(27) LAHQDTTKKA（SEQ ID NO:36）；(28) LAHQDTTRNA（SEQ ID NO:37）；(29) LAHQDTTNA（SEQ ID NO:38）；(30) LAHQGTTKNA（SEQ ID NO:39）；(31) LAHQVTTKNA（SEQ ID NO:40）；(32) LAISDQSKPA（SEQ ID NO:41）；(33) LADATKTA（SEQ ID NO:42）；(34) LAKDTTKNA（SEQ ID NO:43）；(35) LAKSDQSRPA（SEQ ID NO:44）；(36) LAPQDTKKNA（SEQ ID NO:45）；(37) LATSDSTKAA（SEQ ID NO:46）；(38) LAVDGSQRSA（SEQ ID NO:47）；(39) LPISDQTKHA（SEQ ID NO:48）；(40) LPKDATKTIA（SEQ ID NO:49）；(41) LPPQDTTKNA（SEQ ID NO:50）；(42) PAPQDTTKNA（SEQ ID NO:51）；(43) QAHQDTTKNA（SEQ ID NO:52）；(44) LAHETSPRPA（SEQ ID NO:53）；(45) LAKSTSTAPA（SEQ ID NO:54）；(46) LADQDTTKNA（SEQ ID NO:55）；(47) LAESDQSKPA（SEQ ID NO:56）；(48) LAHKDTTKNA（SEQ ID NO:57）；(49) LAHKTQQKM（SEQ ID NO:58）；(50) LAHQDTTENA（SEQ ID NO:59）；(51) LAHQDTTINA（SEQ ID NO:60）；(52) LAHQDTTKKT（SEQ ID NO:61）；(53) LAHQDTTKND（SEQ ID NO:62）；(54) LAHQDTTKNT（SEQ ID NO:63）；(55) LAHQDTTKNV（SEQ ID NO: 64）；(56) LAHQDTTKTM（SEQ ID NO: 65）；(57) LAHQNTTKNA（SEQ ID NO: 66）；(58) LAHRDTTKNA（SEQ ID NO: 67）；(59) LAISDQTNHA（SEQ ID NO: 68）；(60) LAKQKSASTA（SEQ ID NO: 69）；(61) LAKSDQCKPA（SEQ ID NO: 70）；(62) LAKSDQSKPD（SEQ ID NO: 71）；(63) LAKSDQSNPA(SEQ ID NO: 72）；(64) LAKSYQSKPA（SEQ ID NO: 73）；(65) LANQDTTKNA（SEQ ID NO: 74）；(66) LAPQNTTKNA（SEQ ID NO: 75）；(67) LAPSSIQKPA（SEQ ID NO: 76）；(68) LAQQDTTKNA（SEQ ID NO: 77）；(69) LAYQDTTKNA（SEQ ID NO: 78）；(70) LDHQDTTKNA（SEQ ID NO: 79）；(71) LDHQDTTKSA（SEQ ID NO: 80）；(72) LGHQDTTKNA（SEQ ID NO:81）；(73) LPHQDTTKND（SEQ ID NO: 82）；(74) LPHQDTTKNT（SEQ ID NO: 83）；(75) LPHQDTTNNA（SEQ ID NO: 84）；(76) LTHQDTTKNA（SEQ ID NO: 85）；(77) LTKDATKTIA（SEQ ID NO: 86）；(78) LTPQDTTKNA（SEQ ID NO:87）；(79) LVHQDTTKNA（SEQ ID NO: 88）。預期用於本發明之其他AAV殼體變體包括具有以下蛋白序列的那些：(1) KDATKN（SEQ ID NO:89）；(2) HQDTTKN（SEQ ID NO:90）；(3) HQDTTKN（SEQ ID NO:91）；(4) TTSQNKP（SEQ ID NO:92）；(5) ISDQTKH（SEQ ID NO:93）；(6) RGVAPSS（SEQ ID NO:94）；(7) PDSTTRS（SEQ ID NO:95）；(8) KGTELKP（SEQ ID NO:96）；(9) IIDATKN（SEQ ID NO:97）；(10) VDGAQRS（SEQ ID NO:98）；(11) PQDTTKK（SEQ ID NO:99）；(12) HQDTTKN（SEQ ID NO:100）；(13) KDATKTI（SEQ ID NO:101）；(14) KQQSAST（SEQ ID NO:102）；(15) KSDQSKP（SEQ ID NO:103）；(16) HQDTTKN（SEQ ID NO:104）；(17) ANQPSKP（SEQ ID NO:105）；(18) VSDSTKA（SEQ ID NO:106）；(19) AQGTAKKP（SEQ ID NO:107）；(20) PDQTTRN（SEQ ID NO:108）；(21) ASDSTKA（SEQ ID NO:109）；(22) PQDTTKN（SEQ ID NO:110）；(23) KADETRP（SEQ ID NO:111）；(24) HQDTAKN（SEQ ID NO:112）；(25) HQDTKKN（SEQ ID NO:113）；(26) HQDTTKH（SEQ ID NO:114）；(27) HQDTTKK（SEQ ID NO:115）；(28) HQDTTRN（SEQ ID NO:116）；(29) HQDTTN（SEQ ID NO:117）；(30) HQGTTKN（SEQ ID NO:118）；(31) HQVTTKN（SEQ ID NO:119）；(32) ISDQSKP（SEQ ID NO:120）；(33) DATKT（SEQ ID NO:121）；(34) KDTTKN（SEQ ID NO:122）；(35) KSDQSRP（SEQ ID NO:123）；(36) PQDTKKN（SEQ ID NO:124）；(37) TSDSTKA（SEQ ID NO:125）；(38) VDGSQRS（SEQ ID NO:126）；(39) ISDQTKH（SEQ ID NO:127）；(40) KDATKTI（SEQ ID NO:128）；(41) PQDTTKN（SEQ ID NO:129）；(42) PQDTTKN（SEQ ID NO:130）；(43) HQDTTKN（SEQ ID NO:131）；(44) HETSPRP（SEQ ID NO:132）；(45) KSTSTAP（SEQ ID NO:133）；(46) DQDTTKN（SEQ ID NO:134）；(47) ESDQSKP（SEQ ID NO:135）；(48) HKDTTKN（SEQ ID NO:136）；(49) HKTQQK（SEQ ID NO:137）；(50) HQDTTEN（SEQ ID NO:138）；(51) HQDTTIN（SEQ ID NO:139）；(52) HQDTTKK（SEQ ID NO:140）；(53) HQDTTKN（SEQ ID NO:141）；(54) HQDTTKN（SEQ ID NO:142）；(55) HQDTTKN（SEQ ID NO: 143）；(56) HQDTTKT（SEQ ID NO: 144）；(57) HQNTTKN（SEQ ID NO: 145）；(58) HRDTTKN（SEQ ID NO: 146）；(59) ISDQTNH（SEQ ID NO: 147）；(60) KQKSAST（SEQ ID NO: 148）；(61) KSDQCKP（SEQ ID NO: 149）；(62) KSDQSKP（SEQ ID NO: 150）；(63) KSDQSNP（SEQ ID NO: 151）；(64) KSYQSKP（SEQ ID NO: 152）；(65) NQDTTKN（SEQ ID NO: 153）；(66) PQNTTKN（SEQ ID NO: 154）；(67) PSSIQKP（SEQ ID NO: 155）；(68) QQDTTKN（SEQ ID NO: 156）；(69) YQDTTKN（SEQ ID NO: 157）；(70) HQDTTKN（SEQ ID NO: 158）；(71) HQDTTKS（SEQ ID NO: 159）；(72) HQDTTKN（SEQ ID NO:160）；(81) HQDTTKN（SEQ ID NO: 161）；(74) HQDTTKN（SEQ ID NO: 162）；(75) HQDTTNN（SEQ ID NO: 163）；(76) HQDTTKN（SEQ ID NO: 164）；(77) KDATKTI（SEQ ID NO: 165）；(78) PQDTTKN（SEQ ID NO: 166）；和 （79) HQDTTKN（SEQ ID NO: 167）。因此，在另一實施方式中，變體殼體多肽具有選自由SEQ ID NO: 10-167組成之群組的序列。
預期用於本發明之又其他AAV殼體變體揭露於WO 2021/243085中，其藉由引用以其全文併入本文。例如，預期用於本發明之AAV殼體變體包括具有以下蛋白序列的那些：(1) HQDTTKN（SEQ ID NO:168）；(2) LGETTRA（SEQ ID NO:169）；(3) HQDTTRP（SEQ ID NO:170）；(4) RQDTTKN（SEQ ID NO:171）；(5) HQDSTKN（SEQ ID NO:172）；(6) HQDATKN（SEQ ID NO:173）；(7) HQDTKKP（SEQ ID NO:174）；(8) LSETTRP（SEQ ID NO:175）；(9) HQDTTKK（SEQ ID NO:176）；(10) LGEATRP（SEQ ID NO:177）；(11) LGETTRT（SEQ ID NO:178）；(12) LSEATRP（SEQ ID NO:179）；(13) KDETKNS（SEQ ID NO:180）；(14) LGETTKP（SEQ ID NO:181）；(15) HQATTKN（SEQ ID NO:182）；(16) LAHQDTTKNS（SEQ ID NO:183）；(17) LALGETTRAA（SEQ ID NO: 184）；(18) LAHQDTTRPA（SEQ ID NO: 185）；(19) LARQDTTKNA（SEQ ID NO: 186）；(20) LAHQDSTKNA（SEQ ID NO: 187）；(21) LAHQDATKNA（SEQ ID NO: 188）；(22) LAHQDTKKPA（SEQ ID NO: 189）；(23) ILSETTRPA（SEQ ID NO: 190）；(24) LAHQDTTKKC（SEQ ID NO: 191）；(25) LALGEATRPA（SEQ ID NO: 192）；(26) LALGETTRTA（SEQ ID NO: 193）；(27) LALSEATRPA（SEQ ID NO: 194）；(28) LAKDETKNSA（SEQ ID NO: 195）；(29) LALGETTKPA（SEQ ID NO: 196）；和 (30) LAHQATTKNA（SEQ ID NO: 197）。因此，在另一實施方式中，變體殼體多肽具有選自由SEQ ID NO: 168-197組成之群組的序列。
在一些實施方式中，相對於相應的親本AAV殼體蛋白，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中缺失至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個或至少20個胺基酸。在一些實施方式中，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中缺失至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個或至少100個胺基酸。在一些實施方式中，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中缺失至多約100個胺基酸、至多約200個、至多約300個或至多約400個胺基酸。在一些實施方式中，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中缺失約1至約100個、約1至約90個、約1至約80個、約1至約70個、約1至約60個、約1至約50個、約1至約40個、約1至約30個、約1至約20個、約1至約15個、約1至約10個或約1至約5個胺基酸。在一些實施方式中，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中缺失約5個胺基酸至約20個胺基酸、約5個胺基酸至約19個胺基酸、約5個胺基酸至約18個胺基酸、約5個胺基酸至約17個胺基酸、約5個胺基酸至約16個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約5個胺基酸至約14個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約5個胺基酸至約12個胺基酸、約5個胺基酸至約11個胺基酸、約5個胺基酸至約10個胺基酸、約5個胺基酸至約9個胺基酸、前約5個胺基酸至約8個胺基酸、約5個胺基酸至約7個胺基酸、或約5個胺基酸至約6個胺基酸。
在一些實施方式中，相對於相應的親本AAV殼體蛋白，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中插入至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個或至少20個胺基酸。在一些實施方式中，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中插入至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個或至少100個胺基酸。在一些實施方式中，rAAV病毒粒子在殼體蛋白中插入至多約100個胺基酸、至多約200個、至多約300個或至多約400個胺基酸。在一些實施方式中，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中插入約1至約100個、約1至約90個、約1至約80個、約1至約70個、約1至約60個、約1至約50個、約1至約40個、約1至約30個、約1至約20個、約1至約15個、約1至約10個、或約1至約5個胺基酸。在一些實施方式中，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中插入約5個胺基酸至約20個胺基酸、約5個胺基酸至約19個胺基酸、約5個胺基酸至約18個胺基酸、約5個胺基酸至約17個胺基酸、約5個胺基酸至約16個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約5個胺基酸至約14個胺基酸、約5個胺基酸至約13個胺基酸、約5個胺基酸至約12個胺基酸、約5個胺基酸至約11個胺基酸、約5個胺基酸至約10個胺基酸、約5個胺基酸至約9個胺基酸、約5個胺基酸至約8個胺基酸、約5個胺基酸至約7個胺基酸、或約5個胺基酸至約6個胺基酸。
在一些實施方式中，相對於相應的親本AAV殼體蛋白，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中取代至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個或至少20個胺基酸。在一些實施方式中，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中取代約1個胺基酸至約20個胺基酸、約1個胺基酸至約19個胺基酸、約1個胺基酸至約18個胺基酸、約1個胺基酸至約17個胺基酸、約1個胺基酸至約16個胺基酸、約1個胺基酸至約15個胺基酸、約1個胺基酸至約14個胺基酸、約1個胺基酸至約13個胺基酸、約1個胺基酸至約12個胺基酸、約1個胺基酸至約11個胺基酸、約1個胺基酸至約10個胺基酸、約1個胺基酸至約9個胺基酸、約1個胺基酸至約8個胺基酸、約1個胺基酸至約7個胺基酸、約1個胺基酸至約6個胺基酸、約1至約5個胺基酸、約1至約4個胺基酸、約1至約3個胺基酸、或約1至約2個胺基酸。
在一些實施方式中，相對於相應的親本未修飾殼體蛋白，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中插入、缺失或取代總共至少約1個、至少約2個、至少約3個、至少約4個、至少約5個、至少約6個、至少約7個、至少約8個、至少約9個、至少約10個、至少約11個、至少約12個、至少約13個、至少約14個、至少約15個、至少約16個、至少約17個、至少約18個、至少約19個、或至少約20個胺基酸。在一些實施方式中，相對於相應的親本未修飾殼體蛋白，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中插入、缺失或取代總共至少約20個、至少約25個、至少約30個、至少約35個、至少約40個、至少約45個、至少約50個、至少約55個、至少約60個、至少約65個、至少約70個、至少約75個、至少約80個、至少約85個、至少約90個、至少約95個、或至少約100個胺基酸。在一些實施方式中，相對於相應的親本未修飾殼體蛋白，rAAV病毒粒子可以在殼體蛋白中插入、缺失或取代總共至少約100個、至少約200個、至少約300個或至少約400個胺基酸。
在一些實施方式中，rAAV病毒粒子包含具有與親本未修飾AAV殼體蛋白的殼體蛋白至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%；至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%同源的胺基酸序列的變體殼體蛋白。
在一些情況下，修飾可在AAV2的胺基酸587之後，或在另一種AAV血清型的殼體亞基的相應殘基之後。應當注意，殘基587基於AAV2殼體蛋白。也可以在除AAV2之外的AAV血清型（例如，AAV8、AAV9等）中的相應位點摻入修飾。基於各種AAV血清型的殼體蛋白的胺基酸序列之比較，熟悉該項技術者將知道，其中對應於AAV2的胺基酸587的修飾位點將在任何給定AAV血清型的殼體蛋白中。參見，例如，AAV1的GenBank登錄號NP_049542；AAV5的GenBank登錄號AAD13756；AAV6的GenBank登錄號AAB95459；AAV7的GenBank登錄號YP_077178；AAV8的GenBank登錄號YP_077180；AAV9的GenBank登錄號AAS99264和AAV10的GenBank登錄號AAT46337。
在一些實施方式中，與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白的AAV病毒粒子對視網膜細胞之感染性相比，本文描述的殼體蛋白的胺基酸修飾可使眼細胞的感染性增加。在一些情況下，眼細胞可為視網膜神經節細胞（RGC）。在一些情況下，視網膜細胞可為視網膜色素上皮（RPE）細胞。在一些情況下，眼細胞可為繆勒氏細胞。在一些情況下，眼細胞可為星形膠質細胞。在一些情況下，視網膜細胞可包括無軸突細胞、雙極細胞或水平細胞。用於本揭露的病毒載體可以包括在受試者中表現出低毒性和/或低免疫原性並且在受試者（例如人類患者）中表現治療有效量的MW-視蛋白轉基因的那些。
在一些實施方式中，與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白之AAV病毒粒子相比，rAAV變體的視網膜細胞感染性增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。在一些實施方式中，與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白之AAV病毒粒子相比，動物細胞的感染性增加5%至100%、5%至95%、5%至90%；5%至85%、5%至80%、5%至75%、5%至70%、5%至65%、5%至60%、5%至55%、5%至50%、5%至45%、5%至40%、5%至35%、5%至30%、5%至25%、5%至20%、5%至15%、5%至10%。
在一些實施方式中，與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白之AAV病毒粒子相比，rAAV變體的視網膜細胞感染性增加至少1倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或至少2倍。在一些實施方式中，與包含相應的親本AAV殼體蛋白的AAV病毒粒子相比，感染性增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些實施方式中，與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白之AAV病毒粒子相比，感染性增加至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少65倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少85倍、至少90倍或至少100倍。
在一些實施方式中，與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白之AAV病毒粒子相比，視網膜細胞感染性增加10倍至100倍、10倍至95倍、10倍至90倍、10倍至85倍、10倍至80倍、10倍至75倍、10倍至70倍、10倍至65倍、10倍至60倍、10倍至55倍、10倍至50倍、10倍至45倍、10倍至40倍、10倍至35倍、10倍至30倍、10倍至25倍、10倍至20倍、或10倍至15倍。
在一些實施方式中，與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白之AAV病毒粒子相比，視網膜細胞感染性增加2倍至20倍、2倍至19倍、2倍至18倍、2倍至17倍、2倍至16倍、2倍至15倍、2倍至14倍、2倍至13倍、2倍至12倍、2倍至11倍、2倍至10倍、2倍至9倍、2倍至8倍、2倍至7倍、2倍至6倍、2倍至5倍、2倍至4倍、或2倍至3倍。
在一些實施方式中，與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白之AAV病毒粒子在受試者眼中穿過ILM的能力相比，本文描述的殼體蛋白的胺基酸修飾可賦予靈長類或人類受試者眼中穿過內界膜（ILM）的能力增加。在一些實施方式中，與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白之AAV病毒粒子相比，穿過ILM的能力增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。在一些實施方式中，與親本或未修飾的AAV殼體蛋白相比，穿過ILM的能力增加5%至100%、5%至95%、5%至90%、5%至85%、5%至80%、5%至75%、5%至70%、5%至65%、5%至60%、5%至55%、5%至50%、5%至45%、5%至40%、5%至35%、5%至30%、5%至25%、5%至20%、5%至15%、或5%至10%。
在一些實施方式中，與包含相應的親本AAV殼體蛋白的AAV病毒粒子相比，穿過ILM的能力增加至少1倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或至少2倍。在一些實施方式中，與包含相應的親本AAV殼體蛋白的AAV病毒粒子相比，穿過ILM的能力增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些實施方式中，與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白之AAV病毒粒子相比，穿過ILM的能力增加至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少65倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少85倍、至少90倍或至少100倍。
在一些實施方式中，與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白之AAV病毒粒子相比，穿過ILM的能力增加10倍至100倍、10倍至95倍、10倍至90倍、10倍至85倍、10倍至80倍、10倍至75倍、10倍至70倍、10倍至65倍、10倍至60倍、10倍至55倍、10倍至50倍、10倍至45倍、10倍至40倍、10倍至35倍、10倍至30倍、10倍至25倍、10倍至20倍、或10倍至15倍。
在一些實施方式中，與包含相應的親本或未修飾的AAV殼體蛋白之AAV病毒粒子相比，穿過ILM的能力增加2倍至20倍、2倍至19倍、2倍至18倍、2倍至17倍、2倍至16倍、2倍至15倍、2倍至14倍、2倍至13倍、2倍至12倍、2倍至11倍、2倍至10倍、2倍至9倍、2倍至8倍、2倍至7倍、2倍至6倍、2倍至5倍、2倍至4倍或2倍至3倍。
在一些實施方式中，本揭露的病毒載體被測定為載體基因組。在一些情況下，本揭露的重組病毒的單位劑量包含1 x 10 10至2 x 10 10、2 x 10 10至3 x 10 10、3 x 10 10至4 x 10 10、4 x 10 10至5 x 10 10、5 x 10 10至6 x 10 10、6 x 10 10至7 x 10 10、7 x 10 10至8 x 10 10、8 x 10 10至9 x 10 10、9 x 10 10至10 x 10 10、1 x 10 11至2 x 10 11、2 x 10 11至3 x 10 11、3 x 10 11至4 x 10 11、4 x 10 11至5 x 10 11、5 x 10 11至6 x 10 11、6 x 10 11至7 x 10 11、7 x 10 11至8 x 10 11、8 x 10 11至9 x 10 11、9 x 10 11至10 x 10 11、1 x 10 12至2 x 10 12、2 x 10 12至3 x 10 12、3 x 10 12至4 x 10 12、4 x 10 12至5 x 10 12、5 x 10 12至6 x 10 12、6 x 10 12至7 x 10 12、7 x 10 12至8 x 10 12、8 x 10 12至9 x 10 12、9 x 10 12至10 x 10 12、1 x 10 13至2 x 10 13、2 x 10 13至3 x 10 13、3 x 10 13至4 x 10 13、4 x 10 13至5 x 10 13、5 x 10 13至6 x 10 13、6 x 10 13至7 x 10 13、7 x 10 13至8 x 10 13、8 x 10 13至9 x 10 13、或9 x 10 13至10 x 10 13個載體基因組。在一些實施方式中，本揭露的rAAV具有10 10至10 13、10 10至10 14、2 x 10 11至4 x 10 11、3 x 10 11至5 x 10 11、4 x 10 11至6 x 10 11、5 x 10 11至7 x 10 11、6 x 10 11至8 x 10 11、7 x 10 11至9 x 10 11、8 x 10 11至10 x 10 11、1 x 10 12至3 x 10 12、2 x 10 12至4 x 10 12、3 x 10 12至5 x 10 12、4 x 10 12至6 x 10 12、5 x 10 12至7 x 10 12、6 x 10 12至8 x 10 12、7 x 10 12至9 x 10 12、8 x 10 12至10 x 10 12、1 x 10 13至5 x 10 13、5 x 10 13至10 x 10 13、10 12至5 x 10 12、或5 x 10 12至10 x 10 12個載體基因組。
在一些情況下，本揭露的重組病毒具有約1 x E10、約1.5 x E10、約2xE10、約2.5 x E10、約3 x E10、約3.5 x E10、約4 x E10、約4.5 x E10、約5 x E10、約5.5 x E10、約6 x E10、約6.5 x E10、約7 x E10、約7.5 x E10、約8 x E10、約8.5 x E10、約9 x E10、約9.5 x E10、約10 x E10、約1 x E11、約1.5 x E11、約2 x E11、約2.5 x E11、約3 x E11、約3.5 x E11、約4 x E11、約4.5 x E11、約5 x E11、約5.5 x E11、約6 x E11、約6.5 x E11、約7 x E11、約7.5 x E11、約8 x E11、約8.5 x E11、約9 x E11、約9.5 x E11、約10 x E11、約1 x E12、約1.3 x E12、約1.5 x E12、約2 x E12、約2.1 x E12、約2.3 x E12、約2.5 x E12、約2.7 x E12、約2.9 x E12、約3 x E12、約3.1 x E12、約3.3 x E12、約3.5 x E12、約3.7 x E12、約3.9 x E12、約4 x E12、約4.1 x E12、約4.3 x E12、約4.5 x E12、約4.7 x E12、約4.9 x E12、約5 x E12、約5.1 x E12、約5.3 x E12、約5.5 x E12、約5.7 x E12、約5.9 x E12、約6 x E12、約6.1 x E12、約6.3 x E12、約6.5 x E12、約6.7 x E12、約6.9 x E12、約7 x E12、約7.1 x E12、約7.3 x E12、約7.5 x E12、約7.7 x E12、約7.9 x E12、約8 x E12、約8.1 x E12、約8.3 x E12、約8.5 x E12、約8.7 x E12、約8.9 x E12、約9 x E12、約9.1 x E12、約9.3 x E12、約9.5 x E12、約9.7 x E12、約9.9 x E12、約10 x E12、約10.1 x E12、約10.3 x E12、約10.5 x E12、約10.7 x E12、約10.9 x E12、約11 x E12、約11.5 x E12、約12 x E12、約12.5 x E12、約13 x E12、約13.5 x E12、約14 x E12、約14.5 x E12、約15 x E12、約15.5 x E12、約16 x E12、約16.5 x E12、約17 x E12、約17.5 x E12、約18 x E12、約18.5 x E12、約19 x E12、約19.5 x E12、約20 x E12、約20.5 x E12、約30 x E12、約30.5 x E12、約40 x E12、約40.5 x E12、約50 x E12、約50.5 x E12、約60 x E12、約60.5 x E12、約70 x E12、約70.5 x E12、約80 x E12、約80.5 x E12、約90 x E12、約95 x E12、或約100 x E12個載體基因組，其中E係以10為底取冪的簡寫，並且xEy係指x乘以10的y次冪/指數。在一些實施方式中，重組病毒包含1 x E13個載體基因組。
在一些實施方式中，本文揭露的藥物組成物包含具有至少5 x E11、至少5.5 x E11、至少6 x E11、至少6.5 x E11、至少7 x E11、至少7.5 x E11、至少8 x E11、至少8.5 x E11、至少9 x E11、至少9.5 x E11、至少10 x E11、至少1 x E12、至少1.31 x E12、至少1.51 x E12、至少2 x E12、至少2.1 x E12、至少2.3 x E12、至少2.5 x E12、至少2.7 x E12、至少2.9 x E12、至少3 x E12、至少3.1 x E12、至少3.3 x E12、至少3.5 x E12、至少3.7 x E12、至少3.9 x E12、至少4 x E12、至少4.1 x E12、至少4.3 x E12、至少4.5 x E12、至少4.7 x E12、至少4.9 x E12、至少5 x E12、至少5.1 x E12、至少5.3 x E12、至少5.5 x E12、至少5.7 x E12、至少5.9 x E12、至少6 x E12、至少6.1 x E12、至少6.3 x E12、至少6.5 x E12、至少6.7 x E12、至少6.9 x E12、至少7 x E12、至少7.1 x E12、至少7.1 x E12、至少7.3 x E12、至少7.5 x E12、至少7.7 x E12、至少7.9 x E12、至少8 x E12、至少8.1 x E12、至少8.3 x E12、至少8.5 x E12、至少8.7 x E12、至少8.9 x E12、至少9 x E12、至少9.1 x E12、至少9.1 x E12、至少9.3 x E12、至少9.5 x E12、至少9.7 x E12、至少9.9 x E12、至少10 x E12、至少10.1 x E12、至少10.3 x E12、至少10.5 x E12、至少10.7 x E12、至少10.9 x E12、至少11 x E12、至少11.5 x E12、至少12 x E12、至少12.5 x E12、至少13 x E12、至少13.5 x E12、至少14 x E12、至少14.5 x E12、至少15 x E12、至少15.5 x E12、至少16 x E12、至少16.5 x E12、至少17 x E12、至少17.5 x E12、至少18 x E12、至少18.5 x E12、至少19 x E12、至少19.5 x E12、至少20 x E12、至少20.5 x E12、至少30 x E12、至少30.5 x E12、至少40 x E12、至少40.5 x E12、至少50 x E12、至少50.5 x E12、至少60 x E12、至少60.5 x E12、至少70 x E12、至少70.5 x E12、至少80 x E12、至少80.5 x E12、至少90 x E12、至少95 x E12、或至少100 x E12個載體基因組的重組病毒，其中E係以10為底取冪的簡寫，並且其中xEy係指x乘以10為底的y次冪/指數。在一些實施方式中，本文揭露的藥物組成物包含具有約1 x E13個載體基因組的重組病毒。
在一些實施方式中，使用感染複數（MOI）測定本揭露的病毒載體。在一些情況下，MOI係指載體或病毒基因組與可遞送多核苷酸的細胞的比率或倍數。在一些情況下，MOI為1 x 10 6。在一些情況下，本揭露的重組病毒可以具有至少1 x 10 1、1 x 10 2、1 x 10 3、1 x 10 4、1 x 10 5、1 x 10 6、1 x 10 7、1 x 10 8、1 x 10 9、1 x 10 10、1 x 10 11、1 x 10 12、1 x 10 13、1 x 10 14、1 x 10 15、1 x 10 16、1 x 10 17和1 x 10 18MOI。在一些情況下，本揭露的重組病毒可以具有1 x 10 8至1 x 10 15MOI。在一些情況下，本揭露的重組病毒可以具有至多1 x 10 1、1 x 10 2、1 x 10 3、1 x 10 4、1 x 10 5、1 x 10 6、1 x 10 7、1 x 10 8、1 x 10 9、1 x 10 10、1 x 10 11、1 x 10 12、1 x 10 13、1 x 10 14、1 x 10 15、1 x 10 16、1 x 10 17、和1 x 10 18MOI。
在一些實施方式中，多核苷酸可以在不使用病毒（即，使用非病毒載體）的情況下遞送，並且可以作為多核苷酸的量來測量。通常，任何合適量的多核苷酸可與本揭露的藥物組成物和方法一起使用。
在一些實施方式中，可以使用自互補載體（sc）。使用自互補的AAV載體可以繞過病毒第二股DNA合成的需要，並且可以導致轉基因蛋白的更高表現率，如Wu, Hum Gene Ther.[人類基因療法] 2007, 18(2):171-82提供的，其藉由引用併入本文。
在一些實施方式中，載體可為反轉錄病毒載體。反轉錄病毒載體可以包括莫洛尼鼠白血病病毒和基於HIV的病毒。在一些實施方式中，可以使用基於HIV的病毒載體，其中基於HIV的病毒載體包含至少兩種載體，其中gag和pol基因來自HIV基因組，而env基因來自另一種病毒。在一些實施方式中，可以使用DNA病毒載體。該等載體可包括痘病毒載體（如正痘病毒或禽痘病毒載體）、皰疹病毒載體（如單純皰疹病毒I型（HSV）載體[Geller, A. I.等人, J. Neurochem[神經化學雜誌], 64:487 (1995)；Lim, F.等人, DNA Cloning: Mammalian Systems[DNA選殖：哺乳動物系統], D. Glover編輯 (Oxford Univ. Press. Oxford England [牛津大學出版社，英格蘭牛津]) (1995)；Geller. A. I.等人, Proc Natl. Acad, Sci.: U.S.A.[美國科學院院報]; 90:7603 (1993)；Geller, A. I.等人, Proc Natl. Acad. Sci. USA[美國科學院院報]: 87;1149 (1990)]）、腺病毒載體[LeGal LaSalle等人, Science.[科學] 259:988 (1993)；Davidson等人, Nat. Genet.[自然遺傳] 3:219(1993)；Yang等人, J. Virol[病毒學雜誌] 69:2004 (1995)]和腺相關病毒載體[Kaplitt, M. G.等人, Nat Genet.[自然遺傳] 8:148 (1994)]，它們藉由引用以其全文併入文中。
在一些實施方式中，載體可為慢病毒載體。用於本揭露的慢病毒載體可衍生於人和非人（包括SIV）慢病毒。慢病毒載體之實例可包括載體增殖所需的多核苷酸序列以及與MW-視蛋白轉基因可操作連接的組織特異性啟動子。多核苷酸序列可包括病毒LTR、引物結合位點、多聚嘌呤束、att位點和殼體化位點。
在一些實施方式中，載體可為甲病毒載體。基於甲病毒的載體（如由塞姆利基森林病毒（SFV）和辛得比斯病毒（SIN）製備的那些）也可用於本揭露。甲病毒的用途描述於Lundstrom, K., Intervirology[國際病毒學] 43:247-257, 2000和Perri等人, Journal of Virology[病毒學雜誌] 74:9802-9807, 2000中，其藉由引用以其全文併入本文。
在一些實施方式中，載體可為痘病毒載體。痘病毒載體可以將基因導入細胞的細胞質。禽痘病毒載體僅可導致基因或多核苷酸的短期表現。腺病毒載體、腺相關病毒載體和單純皰疹病毒（HSV）載體可與本揭露的組成物和方法一起使用。在一些方面，腺病毒載體可以導致比腺相關病毒更短期的表現（例如，少於約一個月），並且可以表現出長得多的表現。所選擇的特定載體可取決於靶細胞和所治療的病症。
在一些實施方式中，可以使用膠束、微乳液、脂質體、奈米球、奈米顆粒、奈米膠囊、固體脂質奈米顆粒、樹狀大分子、聚乙烯亞胺衍生物和單壁碳奈米管、以及能夠介導多核苷酸遞送至靶細胞的其他大分子複合物將載體（例如裸DNA或質體）遞送到細胞、組織或受試者中。在一些情況下，載體可為有機分子或無機分子。在一些情況下，載體係小分子（即 ＜ 5 kD）或大分子（即 ＞ 5 kD）。
本文還揭露了適用於基因療法以恢復或增強視覺功能的重組腺相關病毒（rAAV）病毒粒子，其包含：(a) 變體AAV殼體蛋白，其中該變體殼體蛋白賦予相對於包含相應的非變體或未修飾的AAV殼體蛋白之AAV病毒粒子增加的視網膜細胞感染性；(b) 編碼MW-視蛋白多肽或治療性轉基因的異源多核苷酸序列。在一些實施方式中，用於基因療法的rAAV係rAAV2。
在一些實施方式中，本文揭露了用於恢復或增強視覺功能的重組腺相關病毒（rAAV）病毒粒子，其包含：(a) 變體AAV殼體蛋白，其中該變體AAV殼體蛋白在該殼體蛋白的溶劑暴露區中包含胺基酸修飾，並且相對於相應的非變體AAV殼體蛋白顯示出增加的視網膜細胞感染性；和 (b) 包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列的異源多核苷酸，並且其中藉由眼內、玻璃體內或視網膜下注射在靈長類或人類受試者的眼中投與有效量的rAAV導致恢復或增強眼的視覺功能。
本文還揭露了用於恢復或增強視覺功能的重組腺相關病毒（rAAV）病毒粒子，其包含：(a) 變體AAV殼體蛋白，其中該變體AAV殼體蛋白在該AAV殼體蛋白的溶劑暴露區中包含胺基酸修飾，並且其中該變體殼體蛋白賦予增加的在眼中穿過內界膜（ILM）的能力；和 (b) 包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列的異源多核苷酸，並且其中藉由眼內、玻璃體內或視網膜下注射在靈長類或人類受試者的眼中投與有效量的rAAV導致恢復或增強眼的視覺功能。
本文還揭露了用於治療眼部病症或疾病的單位劑量形式的基因療法組成物，其包含：(a) 重組腺相關病毒（rAAV）病毒粒子，其包含：(i) 變體AAV殼體蛋白，其中該變體AAV殼體蛋白在該殼體蛋白的溶劑暴露區中包含胺基酸修飾，並且相對於相應的非變體AAV殼體蛋白顯示出增加的視網膜細胞感染性；和 (ii) 包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列的異源多核苷酸，其中該MW-視蛋白當被轉導時恢復或增強靈長類或人類受試者的眼中的視覺功能；和 (b) 藥學上可接受的賦形劑；其中該rAAV病毒粒子的量足以在藉由眼內、玻璃體內或視網膜下注射以單位劑量投與於靈長類動物眼中時至少部分恢復或增強視覺功能。 治療劑
在一些實施方式中，使用基因療法來遞送具有MW-視蛋白活性的治療性轉基因，該治療性轉基因適於或適用於投與於非人靈長類動物或人類受試者的眼或眼的玻璃體。在一些實施方式中，包含本文描述殼體變體的rAAV包含編碼MW-視蛋白的異源多核苷酸序列，其用於在眼內、玻璃體內或視網膜下注射至受試者後將MW-視蛋白轉基因的序列遞送至視網膜細胞中。在一些實施方式中，將包含MW-視蛋白轉基因的rAAV配製用於基因療法和玻璃體內注射。在一些實施方式中，MW-視蛋白轉基因係指其功能片段或變體。在一些實施方式中，MW-視蛋白轉基因的多核苷酸序列係SEQ ID NO: 3。在一些實施方式中，MW-視蛋白轉基因的多核苷酸序列和/或胺基酸序列（例如，SEQ ID NO: 3）被進一步修飾以增強其體內活性、表現、穩定性和/或溶解性。
在一些實施方式中，將用於本文揭露的基因療法或rAAV的MW-視蛋白轉基因多核苷酸序列與SEQ ID NO: 3的相應多核苷酸序列相比較，並顯示出至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或100%序列同源性。在一些實施方式中，將用於本文揭露的基因療法或rAAV的多核苷酸序列與SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9的多核苷酸序列相比較，並顯示出至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或100%序列同源性。
本揭露考慮了如本文所揭露的包含一或多種治療劑的方法和藥物組成物。在一些實施方式中，治療劑係MW-視蛋白多肽。在一些實施方式中，MW-視蛋白多肽由rAAV載體或基因療法表現，其在體內被遞送到靶細胞、組織或受試者中。基因療法具有在體內長時間提供治療劑（例如，MW-視蛋白多肽）的優點，其與投與基於蛋白質的療法相比，減少了重複注射的需要。基因療法的這樣的優勢可以導致治療劑在體內更持續的遞送和表現，這提供了優於當前護理標準的改善。另外，基因療法還可以在體內提供治療劑的更靶向遞送，例如，遞送至靶細胞，並使脫靶效應最小化。在一些實施方式中，本文揭露的基因產物係MW-視蛋白多肽，其在表現時可導致恢復或增強受試者眼的視覺功能。在一些實施方式中，本文揭露的基因產物可為能恢復或增強個體的視覺功能的MW-視蛋白多肽或其片段。 適應症
在一些情況下，如本文所描述的包含變體殼體蛋白和治療性轉基因的任何血清型之rAAV病毒粒子或其藥物組成物可以至少部分改善與視桿和視錐光感受器喪失相關的眼部病症或疾病。在一些實施方式中，包含殼體變體蛋白的rAAV病毒粒子用於將MW-視蛋白轉基因遞送到人類受試者的眼中。適合用本揭露的方法治療的個體包括患有視網膜變性病症的個體，其中自然光敏感性喪失並且因此視力受損，但是其中視網膜回路中晚期的神經元（例如，輸出到大腦的雙極細胞或無軸突中間神經元或神經節細胞）被保留並且可以藉由引入一或多個視錐視蛋白而直接對光敏感。
本文描述的適應症包括患有DME的患者的地圖樣萎縮、年齡相關性黃斑點退化（AMD）、視網膜靜脈阻塞（RVO）後的黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫（DME）、視網膜靜脈阻塞和糖尿病性視網膜病變（DR）。本文描述的其他實施方式包括色素性視網膜炎、黃斑點退化、視網膜劈裂症、萊伯氏先天性黑蒙、視錐視桿營養不良、眼底黃色斑點症、Bardet Biedl二氏症候群、無脈絡膜症、厄舍綜合症、和別蒂結晶樣營養障礙。在一些情況下，本文揭露的方法和藥物組成物可用於預防或治療MW-視蛋白轉基因被批准或指示使用的眼部病症或疾病。在一些實施方式中，使用基因療法（例如，基於rAAV的基因療法）來治療或預防眼部病症或疾病，該眼部病症或疾病對針對其的至少一種當前護理標準有反應的眼部病症或疾病，包括但不限於患有DME的患者的AMD、RVO後的黃斑水腫、DME和糖尿病性視網膜病變。在一些實施方式中，rAAV基因療法用於治療或預防以視桿和視錐光感受器喪失為特徵的任何眼部病症或障礙。在另一方面，本揭露提供了本文提供的藥物組成物，其用於治療疾病，例如：AMD、色素性視網膜炎、黃斑點退化、視網膜劈裂症、萊伯氏先天性黑蒙、視錐視桿營養不良、Bardet Biedl二氏症候群、無脈絡膜症、厄舍綜合症、別蒂結晶樣營養障礙等。在一些實施方式中，眼部病症可為色素性視網膜炎。在其他實施方式中，個體由於創傷、頭部損傷或作為另一種疾病的併發症（例如糖尿病性視網膜病變）經歷視網膜脫落或光感受器喪失。
在一些實施方式中，眼部病症可為AMD。AMD可造成中央視覺惡化。可能出現的其他症狀包括顏色紊亂和視物變形（扭曲，其中直線呈現波浪狀）。在一些實施方式中，如本文所揭露的方法和藥物組成物用於治療AMD。如果沒有另外說明，術語「AMD」可為乾性AMD或濕性AMD。本揭露考慮治療或預防AMD、濕性AMD和/或乾性AMD。在一些實施方式中，如本文所揭露的方法和藥物組成物用於治療AMD。 使用方法
在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療眼部疾病之方法，該方法包括向需要這樣的治療的人類受試者投與藥學有效量的本文提供的藥物組成物。在一些實施方式中，疾病選自眼部疾病，包括色素性視網膜炎、黃斑點退化、地圖樣萎縮、年齡相關性黃斑點退化、視網膜劈裂症、萊伯氏先天性黑蒙、視錐視桿營養不良、Bardet Biedl二氏症候群、無脈絡膜症、厄舍綜合症、別蒂結晶樣營養障礙和其他遺傳性視網膜營養不良如眼底黃色斑點症。在其他實施方式中，個體由於創傷、頭部損傷或作為另一種疾病的併發症（例如糖尿病性視網膜病變）經歷視網膜脫落或光感受器喪失。例如，在一些情況下，個體經歷了由鈍傷例如爆炸傷（例如，在軍事戰鬥中）引起的視網膜脫落，或者由對頭部的衝擊（例如在車禍或導致對頭部造成衝擊的其他事故的過程中）引起的視網膜脫落。在一些情況下，光感受器由於視網膜從下面的RPE的創傷性脫離而喪失，但是內部視網膜神經元係完整的。適合用本揭露的方法治療的個體包括由於急性光損傷、雷射暴露或化學毒性而導致光感受器喪失的個體。
在一些實施方式中，含有包含變體殼體蛋白（例如，rAAV.7m8）和編碼MW-視蛋白多肽的多核苷酸序列的rAAV的藥物組成物用於治療或預防AMD，包括乾性AMD和濕性AMD。在一些實施方式中，含有包含變體殼體蛋白（例如，rAAV.7m8）和編碼MW-視蛋白多肽的多核苷酸序列的rAAV之藥物組成物用於治療或預防色素性視網膜炎、黃斑點退化、視網膜劈裂症、萊伯氏先天性黑蒙、視錐視桿營養不良、Bardet Biedl二氏症候群、無脈絡膜症、厄舍綜合症和別蒂結晶樣營養障礙。
在一些情況下，基因療法的風險較低，因為其在患者一生中僅需要注射一次，或在至少2、5、10、20、30、40或50年內注射不超過一次。在一些情況下，用如本文所揭露的MW-視蛋白基因療法的治療可以比基於蛋白質的注射更具成本效益，因為基因療法的治療效果可以持續更長時間，並且一次性基因療法注射的成本可能低於多次重複注射蛋白質的組合成本。
此外，由於不需要重複注射，基因療法解決了與需要重複注射的療法相關的患者依從性和遵守性挑戰，因為不依從性（例如，當患者忘記或錯過一次或多次預定注射時）可導致視力喪失和眼部疾病或病症的惡化。在受AMD影響最大的老年患者中，不依從和不遵守需要反復或頻繁地往返到醫療機構進行投與的治療方案的比率較高。因此，經由基因療法，例如一次性玻璃體內注射，將MW-視蛋白轉基因遞送到患者的眼中，可以為患者提供更方便的治療選擇，並經由解決不依從性和不遵守性問題來改善患者結果。
在一些實施方式中，本文描述的MW-視蛋白基因療法之使用方法包括根據藥物標籤重構本文描述的藥物組成物的凍乾形式（例如，包含MW-視蛋白多核苷酸序列的rAAV），並將所述重構的MW-視蛋白基因療法投與於受試者或人類患者。
在一些實施方式中，rAAV-MW-視蛋白病毒粒子可經由眼內注射、經由玻璃體內注射、經由視網膜下注射或經由任何其他方便的投與方式或途徑投與到個體的眼。其他方便的投與方式或途徑可包括例如局部、滴眼劑、眼周、眼內、玻璃體內、結膜下、眼球後、進入鞏膜和眼房間等。在一些實施方式中，本文揭露的方法和藥物組成物涉及藉由玻璃體內注射進行投與。
如本文所描述的「治療有效量」可為可通過臨床試驗確定的相對寬的範圍。對於直接注射到眼或玻璃體內注射，MW-視蛋白基因療法的治療有效劑量可為約10 10至10 13個載體基因組。
本文還揭露了治療眼部病症或疾病至方法，該方法包括向人類受試者的眼投與適用於基因療法的rAAV病毒粒子並體內遞送如本文所描述的用於表現MW-視蛋白的多核苷酸序列；其中該人類受試者先前已被診斷患有與視網膜病症相關的眼部病症，其中自然光敏感性喪失且因此視力受損。在一些實施方式中，將基因療法投與於用至少一種批准的療法（例如抗VEGF藥劑）預治療的患者。在一些實施方式中，將本文揭露的基因療法投與於用至少一種批准的療法（例如抗VEGF藥劑注射）預治療並且未顯示改善的患者。在一些實施方式中，接受本文揭露的基因療法的患者具有一或多種不利於用需要多次重複注射至眼的療法治療患者的風險因素，例如炎症、感染、眼內壓升高和/或其他不良作用的風險增加。
在一些實施方式中，MW-視蛋白基因療法或其藥物組成物可以作為單劑量或一次性劑量投與。在一些實施方式中，可以採用多於一次的投與以在不同間隔的持續時間段內實現期望的基因表現水平，例如在至少2年、或至少3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年內不多於一次。在一些實施方式中，玻璃體內注射MW-視蛋白基因療法消除了患者接受批准的蛋白質注射至少1年或2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30年或更多年的需要。
對於遞送MW-視蛋白轉基因體內基因療法，能夠以單劑量或一次性劑量投與包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列的藥物組成物。在一些實施方式中，投與給受試者的基因療法的劑量總數在至少1.5年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年或至少10年內不多於一次。在一些實施方式中，投與包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列的基因療法在患者的一生中僅一次或一次。在一些實施方式中，一次性投與包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列的基因療法可在患者中產生持續超過1年，超過2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多年的治療效果。在一些實施方式中，在至少2年或以上、至少3年或以上、至少4年或以上、至少5年或以上、至少6年或以上、至少7年或以上、至少8年或以上、至少9年或以上、或至少10年或以上時間內向患者投與包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列的基因療法不多於一次。在一些實施方式中，將包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列的基因療法投與給最初對至少一種當前護理標準或至少一種現有療法（例如抗VEGFT藥劑）有反應的患者。在一些實施方式中，將基因療法投與給在接受基因療法之前接受用抗VEGF療法的預治療的患者。
在一些實施方式中，包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列的基因療法之一次性投與消除了患者在眼中接受抗VEGF藥劑或任何其他基於蛋白質的治療劑或護理標準治療超過一年、超過1.5年、或超過2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多年的需要。在一些實施方式中，接受包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列的基因療法的注射之患者不需要在患者餘生在眼中進行抗VEGF藥劑或任何其他基於蛋白質的治療劑或護理標準治療的任何額外注射。在其他實施方式中，接受一次性注射MW-視蛋白基因療法的患者可以在抗VEGF藥劑療法和/或任何其他批准的治療劑之後（根據需要，在接受基因療法後已過去至少1.5、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多年之後）開始療法。
本揭露提供了一種增強或恢復個體的視覺功能之方法，該方法包括向個體的眼投與包含本揭露的重組病毒載體（或包含該重組病毒載體的病毒顆粒）的藥物組成物。投與重組病毒載體（或包含該重組病毒載體的病毒顆粒）後，在視網膜細胞中產生MW-視蛋白。視網膜細胞中MW-視蛋白的產生在個體中提供增強的或恢復的視覺功能。
MW-視蛋白多肽在個體的視網膜細胞中的表現提供了個體的模式化視覺和圖像識別。圖像識別可為靜態圖像和/或活動圖像。
MW-視蛋白多肽在個體的視網膜細胞中之表現提供了在約10 -4W/cm 2至約10 W/cm 2的光強度下的圖像識別。例如，在一些情況下，MW-視蛋白多肽在個體的視網膜細胞中之表現提供了在約10 -2W/cm 2至約10 -4W/cm 2、約10 -4W/cm 2至約1 W/cm 2、約10 -4W/cm 2至約10 -1W/cm 2、或約10 -4W/cm 2至約5 x 10 -1W/cm 2的光強度下的圖像識別。在一些情況下，MW-視蛋白多肽在個體的視網膜細胞中之表現提供了在約10 -4W/cm 2至約10 -3W/cm 2、約10 -3W/cm 2至約10 -2W/cm 2、約10 -2W/cm 2至約10 -1W/cm 2、或約10 -1W/cm 2至約1 W/cm 2的光強度下的圖像識別。在一些情況下，MW-視蛋白多肽在個體的視網膜細胞中之表現提供了在高達2 W/cm 2、高達3 W/cm 2、高達4 W/cm 2、高達5 W/cm 2、或高達10 W/cm 2的光強度下的圖像識別。MW-視蛋白多肽在個體的視網膜細胞中之表現提供了在小於5 W/cm 2、小於4 W/cm 2、小於3 W/cm 2、或小於2 W/cm 2的光強度下的圖像識別。
MW-視蛋白多肽在個體的視網膜細胞中之表現提供了在如下光強度下的個體的圖像識別，該光強度比在視網膜細胞中表現通道視紫紅質多肽的個體提供圖像識別所需的光強度低至少10倍。例如，MW-視蛋白多肽在個體的視網膜細胞中之表現提供了在如下光強度下的個體的圖像識別，該光強度比在視網膜細胞中表現通道視紫紅質多肽的個體提供圖像識別所需的光強度低至少10倍、低至少25倍、低至少50倍、低至少100倍、低至少150倍、低至少200倍、低至少300倍、低至少400倍、或低至少500倍。
MW-視蛋白多肽在視網膜細胞中的表現提供了如下動力學，該動力學比視紫紅質多肽賦予視網膜細胞的動力學快至少2倍。例如，MW-視蛋白多肽在視網膜細胞中的表現提供了如下動力學，該動力學比視紫紅質多肽賦予視網膜細胞的動力學快至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍、或100倍以上。
包含編碼MW-視蛋白多肽的多核苷酸序列的重組表現載體以如下量投與，與投與重組表現載體前的視覺功能相比，該量有效增加個體的視覺功能至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少2倍、至少5倍、至少10倍或10倍以上。視覺功能的測試在本領域中係已知的，並且可以應用任何已知的測試來評估視覺功能。
本揭露提供了包含一或多種重組表現載體的組成物，該等重組表現載體包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列。當將組成物投與給有需要的個體時，編碼MW-視蛋白多肽的多核苷酸序列在有需要的受試者的眼中表現，使得該受試者的眼中產生MW-視蛋白，出現一或多種有益的臨床結果。例如，當將組成物投與給有需要的個體的眼時，編碼MW-視蛋白的一或多種核苷酸序列在有需要的受試者之眼中表現，使得該受試者的眼中產生MW-視蛋白，出現一或多種有益的臨床結果。當編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列在有需要的受試者之眼中表現，使得受試者的眼中產生一或多種視錐視蛋白時，出現一或多種有益的臨床結果。
有益的臨床結果包括：1) 受試者可以在空間模式辨別測定中區分包含垂直線的圖像和包含水平線的圖像；2) 受試者可以在空間模式辨別測定中區分包含靜態線的圖像和包含移動線的圖像；3) 受試者可以在時間光模式測定中區分閃光和恒定光；4) 受試者可以在圖像識別測定中在約10 4W/cm 2至約10 W/cm 2的光強度下識別圖像；和5) 受試者可以在避光測定中區分具有白光的區域和沒有白光的區域。
組成物是否提供一或多種上述有益的臨床結果可以使用本領域已知的測試來確定。參見例如，Leinonen和Tanila (2017) Behavioural Brain Research[行為大腦研究] pii: S0166-4328(17)30870-7；Caporale等人 (2011) Molecular Therapy[分子療法] 19, 1212-9；Gaub等人 (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國科學院院報] 111, E5574-83；Gaub等人 (2015) Molecular Therapy[分子療法] 23:1562；以及Berry等人 (2017) Nat. Commun.[自然通訊] 8:1862。
本揭露組成物包含重組表現載體，該等重組表現載體包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列，其中，在以下情況下：i) 將該組成物投與於有需要的個體；或 ii) 將該組成物投與於有需要的個體的眼，使得該多核苷酸序列在有需要的受試者的眼中表現（使得該受試者的眼中產生MW-視蛋白），該受試者可以在空間模式辨別測定中區分包含垂直線的圖像和包含水平線的圖像。本揭露提供了包含重組表現載體的組成物，該等重組表現載體包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列，其中當該多核苷酸序列在有需要的受試者的眼中表現時（使得該受試者的眼中產生MW-視蛋白），該受試者可以在空間模式辨別測定中區分包含垂直線的圖像和包含水平線的圖像。
本揭露組成物包含重組表現載體，該等重組表現載體包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列，其中，在以下情況下：i) 將該組成物投與於有需要的個體；或 ii) 將該組成物投與於有需要的個體的眼，使得該多核苷酸序列在有需要的受試者的眼中表現（使得該受試者的眼中產生MW-視蛋白），該受試者可以在空間模式辨別測定中區分包含靜態線的圖像和包含移動線的圖像。本揭露提供了包含重組表現載體的組成物，該等重組表現載體包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列，其中當所述多核苷酸序列在有需要的受試者的眼中表現時（使得該受試者的眼中產生MW-視蛋白），該受試者可以在空間模式辨別測定中區分包含靜態線的圖像和包含移動線的圖像。
本揭露組成物包含重組表現載體，該等重組表現載體包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列，其中，在以下情況下：i) 將該組成物投與於有需要的個體；或 ii) 將該組成物投與於有需要的個體的眼，使得該多核苷酸序列在有需要的受試者的眼中表現（使得該受試者的眼中產生MW-視蛋白），該受試者可以在時間光模式測定中區分閃光和恒定光。本揭露提供了包含重組表現載體的組成物，該等重組表現載體包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列，其中當所述多核苷酸序列在有需要的受試者的眼中表現時（使得該受試者的眼中產生MW-視蛋白），該受試者可以在時間光模式測定中區分閃光和恒定光。
本揭露組成物包含重組表現載體，該等重組表現載體包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列，其中，在以下情況下：i) 將該組成物投與於有需要的個體；或 ii) 將該組成物投與於有需要的個體的眼，使得該多核苷酸序列在有需要的受試者的眼中表現（使得該受試者的眼中產生MW-視蛋白），該受試者可以在圖像識別測定中在約10 -4W/cm 2至約10 W/cm 2的光強度下識別圖像。本揭露提供了包含重組表現載體的組成物，該等重組表現載體包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列，其中當所述多核苷酸序列在有需要的受試者的眼中表現時（使得該受試者的眼中產生MW-視蛋白），該受試者可以在約10 -4W/cm 2至約10 W/cm 2的光強度下（例如，約10 -4W/cm 2至約10 -3W/cm 2、約10 -3W/cm 2至約10 -2W/cm 2、約10 -2W/cm 2至約10 -1W/cm 2、或約10 -1W/cm 2至約1 W/cm 2的光強度下）識別圖像。在一些情況下，MW-視蛋白多肽在個體的視網膜細胞中的表現提供了在圖像識別測定中在高達2 W/cm 2、高達3 W/cm 2、高達4 W/cm 2、高達5 W/cm 2、或高達10 W/cm 2的光強度下的圖像識別。
本揭露組成物包含重組表現載體，該等重組表現載體包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列，其中，在以下情況下：i) 將該組成物投與於有需要的個體；或ii) 將該組成物投與於有需要的個體的眼，使得MW-視蛋白在有需要的受試者的眼中表現（使得該受試者的眼中產生MW-視蛋白），該受試者可以在避光測定中區分具有白光的區域和沒有白光的區域。本揭露提供了包含重組表現載體的組成物，該等重組表現載體包含編碼MW-視蛋白的多核苷酸序列，其中當該多核苷酸序列在有需要的受試者的眼中表現時（使得該受試者的眼中產生MW-視蛋白），該受試者可以在避光測定中區分具有白光的區域和沒有白光的區域。
在另一方面，本揭露提供了如上所描述的重組表現載體或如上所描述的藥物組成物，其用於治療有需要的受試者。在一個實施方式中，如上所描述的重組表現載體或如上所描述的藥物組成物恢復或增強受試者的視覺功能。 用於治療用途的套組
本揭露還提供了用於本文描述的組成物的套組（kit）。例如，本揭露提供了包含如本文所描述的基因療法系統的套組；包含如本文所描述的基因療法系統的病毒顆粒或病毒顆粒組；和/或包含如本文所描述的基因療法系統的多核苷酸或多核苷酸組。
在一些實施方式中，套組可另外包含用於本文描述的任何方法的說明書。所包含的說明書可包括以下說明：(i) 遞送如本文所描述的基因療法系統；包含如本文所描述的基因療法系統的病毒顆粒或病毒顆粒組；和/或包含如本文所描述的基因療法系統的多核苷酸或多核苷酸組。
套組可以進一步包括基於鑒定受試者是否需要治療來選擇適合於治療的受試者的說明書。說明書可包括關於預期治療的劑量、給藥方案和投與途徑的資訊。容器可為單位劑量、散裝包裝（例如，多劑量包裝）或亞單位劑量。本揭露的套組中提供的說明書通常是標籤或包裝插頁上的書面說明書。標籤或包裝插頁指示藥物組成物用於治療、延遲發作和/或減輕受試者的疾病或障礙。
本文提供的套組採用合適的包裝。合適的包裝包括但不限於小瓶、瓶、罐、軟包裝等。還考慮了與特定裝置例如注射器結合使用的包裝。套組可具有無菌入口（例如，具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶）。在一些實施方式中，視需要，套組進一步包含用於投與的裝置，例如注射器、過濾針、延長管、插管或視網膜下注射器。
套組視需要可以提供另外的組分，例如緩衝液和解釋性資訊。通常，套組包括容器和在容器上或與容器相關聯的標籤或包裝插頁。在一些實施方式中，本揭露提供包含上述套組的內容物的製品。 一般技術
除非另有說明，否則本揭露的實踐將使用分子生物學（包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，其在本領域的技術範圍內。在文獻中充分解釋了這樣的技術，該等文獻係例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊], 第二版（Sambrook等人, 1989） Cold Spring Harbor Press [冷泉港出版社]；Oligonucleotide Synthesis [寡核苷酸合成]（M. J. Gait編輯 1984）；Methods in Molecular Biology [分子生物學方法], Humana Press [胡瑪納出版社]；Cell Biology: A Laboratory Notebook [細胞生物學：實驗室筆記本]（J. E. Cellis編輯, 1989） Academic Press [學術出版社]；Animal Cell Culture [動物細胞培養]（R. I. Freshney編輯 1987）；Introduction to Cell and Tissue Culture [細胞和組織培養介紹]（J. P. Mather和P. E. Roberts, 1998）Plenum Press [普萊紐姆出版社]；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures [細胞和組織培養：實驗室程序](A. Doyle, J. B. Griffiths和D. G. Newell編輯 1993-8）J. Wiley and Sons [約翰·威利父子出版社]；Methods in Enzymology [酶學方法]（Academic Press, Inc. [學術出版公司]）；Handbook of Experimental Immunology [實驗免疫學手冊]（D. M. Weir和C. C. Blackwell編輯）: Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells [用於哺乳動物細胞的基因轉移載體]（J. M. Miller和M. P. Calos編輯, 1987）；Current Protocols in Molecular Biology [分子生物學現代方案]（F. M. Ausubel等人編輯 1987）；PCR: The Polymerase Chain Reaction [PCR：聚合酶鏈反應]（Mullis等人編輯 1994）；Current Protocols in Immunology [免疫學現代方法]（J. E. Coligan等人編輯, 1991）；Short Protocols in Molecular Biology [分子生物學中的短程序]（Wiley and Son [約翰·威利父子出版社], 1999）；Immunobiology [免疫生物學]（C. A. Janeway和P. Travers, 1997）；Antibodies [抗體]（P. Finch, 1997）；Antibodies: a practice approach [抗體：實用方法]（D. Catty.編輯, IRL Press [IRL出版社], 1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach [單株抗體：實用方法]（P. Shepherd和C. Dean編輯, Oxford University Press [牛津大學出版社], 2000）；Using antibodies: a laboratory manual [使用抗體：實驗室手冊]（E. Harlow和D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], 1999）；The Antibodies [抗體]（M. Zanetti和J. D. Capra編輯 Harwood Academic Publishers [哈伍德學術出版社], 1995）；DNA Cloning: A practical Approach [DNA選殖：實用方法], 第I和II卷（D. N. Glover編輯 1985）；Polynucleotide Hybridization [多核苷酸雜交]（B. D. Hames & S. J. Higgins編輯 (1985)；Transcription and Translation [轉錄和翻譯]（B. D. Hames & S. J. Higgins編輯 (1984)；Animal Cell Culture [動物細胞培養]（R. I. Freshney編輯 (1986)；Immobilized Cells and Enzymes [固定化細胞和酶] (IRL Press [IRL出版社], (1986)；以及B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning [分子選殖的實踐指南] (1984)；F. M. Ausubel等人 (編輯)。 藥物組成物
根據要使用的投與模式來配製根據本揭露的藥物組成物。在藥物組成物係可注射藥物組成物的情況下，它們係無菌的、無熱原的和無顆粒的。較佳的是使用等滲配製物。通常，用於等滲性的添加劑可以包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情況下，等滲溶液如磷酸鹽緩衝鹽水係較佳的。穩定劑包括明膠和白蛋白。在一些實施方式中，向配製物中添加血管收縮劑。
在一些實施方式中，組成物可進一步包含藥學上可接受的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑可為作為媒介物、佐劑、載劑或稀釋劑的功能分子。藥學上可接受的賦形劑可為轉染促進劑，其可以包括界面活性劑，例如免疫刺激複合物（ISCOMS）、弗氏不完全佐劑、LPS類似物（包括單磷醯脂質A）、胞壁醯肽、醌類似物、囊泡（例如角鯊烯和角鯊烯）、透明質酸、脂質、脂質體、鈣離子、病毒蛋白、聚陰離子、聚陽離子或奈米顆粒、或其他已知的轉染促進劑。
轉染促進劑係聚陰離子、聚陽離子，包括聚-L-麩胺酸（LGS）或脂質。轉染促進劑係聚-L-麩胺酸，並且更較佳的是，聚-L-麩胺酸以小於6 mg/ml的濃度存在於本揭露的組成物中。轉染促進劑還可以包括界面活性劑，例如免疫刺激複合物（ISCOMS）、弗氏不完全佐劑、LPS類似物（包括單磷醯脂質A）、胞壁醯肽、醌類似物和囊泡（例如角鯊烯和角鯊烯）、並且透明質酸也可以與基因構建體一起投與。在一些實施方式中，包含編碼MW-視蛋白多肽的rAAV病毒粒子和/或重組表現載體的藥物組成物還可以包括轉染促進劑，例如脂質、脂質體，包括卵磷脂脂質體或本領域已知的其他脂質體，作為DNA-脂質體混合物（參見例如WO 9324640）、鈣離子、病毒蛋白、聚陰離子、聚陽離子或奈米顆粒，或其他已知的轉染促進劑。較佳的是，轉染促進劑係聚陰離子、聚陽離子，包括聚-L-麩胺酸（LGS）或脂質。本揭露的組成物可視需要包含醫藥劑、藥劑、載劑、佐劑、分散劑、稀釋劑等。
在一些實施方式中，本揭露的多核苷酸構建體可以根據已知技術在藥物載劑中配製用於投與。參見例如，Remington, The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓，藥學科學與實踐] (第21版. 2005)。在藥物組成物的製造中，rAAV病毒粒子和/或多核苷酸構建體通常與尤其是可接受的載劑混合。載劑可為固體（包括粉末）或液體或兩者，並且較佳的是與化合物一起配製為單位劑量組成物，例如，其可以含有按重量計0.01%或0.5%至95%或99%的化合物。可將一或多種化合物摻入本揭露的組成物中，該等組成物可藉由任何熟知的藥學技術製備。
載劑可為含有例如水、鹽水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）及其任何組合的溶劑或分散介質。可以例如藉由使用包衣（如卵磷脂），藉由在分散體的情況下維持所需粒度和藉由使用界面活性劑來維持適當的流動性，該等界面活性劑係例如聚山梨醇酯（例如，Tween TM、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80）、十二烷基硫酸鈉（月桂基硫酸鈉）、月桂基二甲基氧化胺、溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯山梨聚糖、辛苯聚醇（Triton X100 TM）、N,N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物、溴化十六烷基三甲基銨（HTAB）、聚氧乙烯10月桂基醚、Brij 721 TM、膽汁鹽（鈉、去氧膽酸鹽、膽酸鈉）、普朗尼克酸（F-68、F-127）、聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor TM）、壬基酚乙氧基化物（Tergitol TM）、環糊精和乙基氯化本索寧（Hyamine TM）。可藉由各種抗細菌劑和抗真菌劑（例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、甲酚、抗壞血酸、硫柳汞等）來防止微生物的作用。在許多情況下，將較佳的是在組成物中包含等滲劑，例如糖、多元醇（如甘露醇或山梨糖醇）和氯化鈉。可以藉由在組成物中包含延遲吸收的藥劑（例如單硬脂酸鋁和明膠）來實現內部組成物的長時間吸收。在一些實施方式中，藥物載劑包括磷酸鈉、氯化鈉、聚山梨醇酯和蔗糖。在一些實施方式中，藥物組成物包含界面活性劑，例如非離子界面活性劑如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或普朗尼克。在一些實施方式中，添加非離子界面活性劑減少在懸浮液或溶液中的聚集。對於玻璃體內投與，合適的載劑包括生理鹽水、抑菌水、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）和/或等滲劑，例如甘油。
在所有情況下，藥物組成物必須是無菌的並且必須具有達到易於灌注或注射的程度的流動性。它在製造和儲存條件下必須穩定並且必須抗諸如細菌和真菌的微生物污染作用而保存。在一些實施方式中，藥物組成物可以包括等滲劑，例如鹽或甘油。在一些實施方式中，將界面活性劑或穩定劑添加到藥物組成物中以防止聚集。另外，冷凍保護劑如醇、DMSO、甘油和PEG可在凍乾的冷凍或乾燥條件下用作穩定劑，或用作製備冷凍懸浮液的穩定劑。
在一個實施方式中，藥物組成物包含本文揭露的rAAV病毒粒子、莫耳濃度為約10 mM至約200 mM的一或多種藥學上可接受的鹽。在一些實施方式中，藥物組成物中的一或多種藥學上可接受的鹽的濃度為約10 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM、約50 mM、約60 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM、約100 mM、約110 mM、約120 mM、約130 mM、約140 mM、約150 mM、約160 mM、約170 mM、約180 mM、約190 mM、約200 mM、或多於200 mM。在一個實施方式中，藥物組成物包含本文揭露的rAAV病毒粒子、濃度為約0.0001%至約0.01%的一或多種聚合物。在一些實施方式中，藥物組成物中的一或多種聚合物的濃度為約0.0001%、約0.0002%、約0.0003%、約0.0004%、約0.0005%、約0.0006%、約0.0007%、約0.0008%、約0.0009%、約0.001%、約0.002%、0.003%、0.004%、約0.005%、約0.006%、約0.007%、約0.008%、約0.009%或約0.01%。在一個實施方式中，藥物組成物具有約4.5至約7.5的pH。在一些實施方式中，藥物組成物的pH具有約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4或約7.5的pH。在一個實施方式中，藥物組成物包含本文揭露的rAAV病毒粒子、10 mM磷酸鈉、180 mM氯化鈉、0.005%泊洛沙姆188，並且具有7.3的pH。
在一些實施方式中，對於單位劑量選擇較低量或範圍的載體基因組以避免聚集。在一些實施方式中，對於單位劑量選擇較高量或範圍的載體基因組，使得可以使用較小體積進行注射。較小體積（例如，小於50、40、30、20、10或5 µL）的注射可有助於減少眼壓變化和與玻璃體內注射相關的其他不良作用。在一些實施方式中，更高濃度的rAAV也有助於確保將治療性轉基因有效遞送到靶細胞中。
在一些實施方式中，本文揭露的藥物組成物被設計、工程化或適用於經由眼內、玻璃體內或視網膜下注射投與到靈長類動物（例如，非人靈長類動物和人類受試者）。在一些實施方式中，將含有包含編碼MW-視蛋白多肽的多核苷酸序列的rAAV病毒粒子之藥物組成物配製用於玻璃體內注射到受試者的眼中。在一些實施方式中，將藥物組成物配製為允許玻璃體內注射體積不超過約2、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200 µL的濃度。在一些實施方式中，本文揭露的治療方法包括玻璃體內注射體積為約2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150 µL含有包含如本文所揭露的編碼MW-視蛋白多肽的多核苷酸序列的rAAV之溶液或懸浮液。
如上所討論的，本揭露的另一方面係體內治療受試者之方法，該方法包括向受試者投與藥物組成物，該藥物組成物在藥學上可接受的載劑中包含本揭露的多核苷酸構建體，其中該藥物組成物以治療有效量投與。可以藉由本領域已知的用於投與化合物的任何方式向有需要的真核受試者投與本揭露的化合物。本發明之另一方面提供了一種包含上述重組表現載體和藥學上可接受的賦形劑的藥物組成物。在一個實施方式中，藥學上可接受的賦形劑包含鹽水。在另一實施方式中，組成物係無菌的。
在另一方面，本揭露提供了如上所描述的重組表現載體或如上所描述的藥物組成物，其用於製造藥物。
適於眼內、玻璃體內或視網膜下投與的本揭露的組成物包含本文描述的rAAV病毒粒子和/或多核苷酸構建體的無菌水性和非水性注射溶液，該等製劑較佳的是與預期接受者的玻璃體等滲。該等製劑可以含有抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑和溶質，其使組成物與預期接受者的玻璃體等滲。水性和非水性無菌懸浮液可包括懸浮劑和增稠劑。組成物可以存在於單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，並且可以儲存在冷凍乾燥（凍乾）條件下，僅需要在臨用前添加無菌液體載劑，例如鹽水或注射用水。
臨時注射溶液和懸浮液可以由前述種類的無菌粉末、顆粒和片劑製備。例如，在本揭露的一個方面，提供了密封容器中的單位劑型的包含本揭露的多核苷酸或rAAV之可注射的、穩定的、無菌組成物。在一些實施方式中，凍乾形式的藥物組成物與用於在投與之前重構藥物組成物的溶液或緩衝液一起提供在套組中。在一些實施方式中，本文揭露的藥物組成物作為溶液、均勻溶液、懸浮液或冷凍懸浮液提供。在一些實施方式中，藥學上可接受的賦形劑包含防止本文揭露的藥物組成物中聚集的界面活性劑。在一些實施方式中，冷凍懸浮液提供在套組中，該套組可包括注射器和/或用於稀釋的緩衝液。在一些實施方式中，冷凍懸浮液作為預填充的注射器提供。在一些實施方式中，如本文所揭露的治療或預防眼部疾病或病症之方法包括將冷凍懸浮液溫熱至室溫和/或攪動懸浮液以確保在向患者投與或玻璃體內注射之前均勻分佈。在一些實施方式中，在投與給患者之前稀釋懸浮液。
在一些實施方式中，包含如本文所揭露的MW-視蛋白基因療法的凍乾或懸浮液形式的藥物組成物具有約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000 µL的體積（或重構體積）。在一些實施方式中，包含如本文所揭露的MW-視蛋白基因療法的凍乾或懸浮液形式的藥物組成物具有0.1至0.5 mL、0.1至0.2 mL、0.3至0.5 mL、0.5至1.0 mL、0.5至0.7 mL、0.6至0.8 mL、0.8至1 mL、0.9至1.1 mL、1.0至1.2或1.0至1.5 mL的體積。在其他實施方式中，重構體積不超過約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5 mL。在一些實施方式中，在投與之前過濾重構的溶液或懸浮液。在一些實施方式中，過濾器或過濾注射器用於在投與給患者之前過濾藥物組成物。
此外，本揭露提供了本文揭露的本揭露多核苷酸構建體的脂質體配製物。形成脂質體懸浮液的技術係本領域熟知的。作為水溶性材料，使用常規脂質體技術，可以將本揭露的多核苷酸構建體摻入到脂質囊泡中。在這樣的情況下，由於化合物的水溶性，化合物將基本上被夾帶在脂質體的親水中心或核心內。所用的脂質層可為任何常規的組成物，並且可以含有膽固醇或可以不含膽固醇。所產生的脂質體可以通過使用例如標準超音波處理和均質化技術來減小尺寸。可以將含有本文揭露的化合物的脂質體組成物凍乾以產生凍乾物，可以用藥學上可接受的載劑如水重構該凍乾物，以再生脂質體懸浮液。
在一些實施方式中，包含本揭露的多核苷酸構建體的藥物組成物可以含有其他添加劑，例如pH調節添加劑。特別地，有用的pH調節劑包括酸如鹽酸、鹼或緩衝液如乳酸鈉、乙酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉或葡萄糖酸鈉。在一些實施方式中，使用鹽酸和氫氧化鈉調節溶液的pH。在一些實施方式中，懸浮液處於中性pH，或處於6.5至7.5之間的pH。在一些實施方式中，懸浮液的pH係微鹼性的（例如，pH約7.5、8、8.2、8.4、8.5或9）。在一些實施方式中，懸浮液或溶液的pH係微酸性的（例如，pH約6.5、6.3、6.1、6、5.5或5）。在一些實施方式中，將懸浮液冷凍為溶液。在一些實施方式中，懸浮液包含冷凍膠束。在一些實施方式中，在投與前將懸浮液冷凍並攪動。
此外，組成物可含有微生物防腐劑。有用的微生物防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯和苯甲醇。本領域熟知的其他添加劑包括例如防黏劑、消泡劑、抗氧化劑（例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基羥基苯甲醚（BHA）、丁基羥基甲苯（BHT）和生育酚，例如α-生育酚（維生素E））、防腐劑、螯合劑（例如EDTA和/或EGTA）、黏度調節劑、張力調節劑（例如糖，如蔗糖、乳糖和/或甘露糖醇）、著色劑、氣味劑、遮光劑、懸浮劑、黏合劑、填充劑、增塑劑、潤滑劑及其混合物。這樣的添加劑的量可由熟悉該項技術者根據所需的特定性質容易地確定。
在一些實施方式中，任何合適的方法可用於如本文所描述的藥物組成物中使用的重組病毒（例如rAAV）的生化純化。重組AAV病毒可直接從細胞或從包含細胞的培養基收穫。在凍乾或製備rAAV病毒的懸浮液之前，可以使用各種生化方式（例如，凝膠過濾、過濾、層析、親和純化、梯度超速離心或粒徑排阻方法）純化病毒。
在一些實施方式中，本文揭露的藥物組成物適用於基因療法或用於在人類患者或非人靈長類動物中玻璃體內遞送作為治療劑的MW-視蛋白多肽。在一些實施方式中，藥物組成物的單位劑量包含1 x 10 10至1 x 10 13個病毒基因組（vg）。在一些實施方式中，單位劑量包含約2.1 x 10 11、約2.1 x 10 12或約2.1 x 10 13個載體基因組。在一些實施方式中，本揭露的藥物組成物的單位劑量係1 x 10 10至3 x 10 12個載體基因組。在一些情況下，本揭露的藥物組成物的單位劑量係1 x 10 9至3 x 10 13個載體基因組。在一些情況下，本揭露的藥物組成物的單位劑量係1 x 10 10至1 x 10 11個載體基因組。在一些情況下，本揭露的藥物組成物的單位劑量係1 x 10 8至3 x 10 14個載體基因組。在一些情況下，本揭露的藥物組成物的單位劑量係至少1 x 10 1、1 x 10 2、1 x 10 3、1 x 10 4、1 x 10 5、1 x 10 6、1 x 10 7、1 x 10 8、1 x 10 9、1 x 10 10、1 x 10 11、1 x 10 12、1 x 10 13、1 x 10 14、1 x 10 15、1 x 10 16、1 x 10 17和1 x 10 18個載體基因組。在一些情況下，本揭露的藥物組成物的單位劑量係1 x 10 10至5 x 10 13個載體基因組。在一些情況下，本揭露的藥物組成物的單位劑量係至多約1 x 10 8、1 x 10 9、1 x 10 10、1 x 10 11、1 x 10 12、1 x 10 13、1 x 10 14、1 x 10 15、1 x 10 16、1 x 10 17和1 x 10 18個載體基因組。
在一些實施方式中，本揭露的rAAV的單位劑量係2 x 10 11至8 x 10 11或2 x 10 12至8 x 10 12個載體基因組。在一些實施方式中，本揭露的rAAV的單位劑量係10 10至10 13、10 10至10 11、10 11至10 12、10 12至10 13、或10 13至10 14個載體基因組。
在一些情況下，含有包含編碼MW-視蛋白多肽的多核苷酸序列的重組病毒表現載體之組成物以在約50 μL至約100 μL的體積中約10 8至約10 15個病毒基因組（vg）的量存在於緩衝鹽水溶液中，其中該組成物進一步包含磷酸鈉、泊洛沙姆188且具有7.3的pH。
在特定實施方式中，本揭露的多核苷酸構建體能以治療有效量投與給受試者，該術語如上文定義。藥物活性化合物的劑量可以藉由本領域已知的方法確定，參見例如，Remington, The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓，藥學科學與實踐] (第21版. 2005)。任何特定化合物的治療有效劑量對於給定的揭露的多核苷酸構建體和患者之間會在一定程度上變化，並且將取決於患者的病症和遞送途徑。
在沒有進一步詳細描述的情況下，據信熟悉該項技術者基於以上描述可以最大程度地利用本揭露。因此，以下特定實施方式應解釋為僅是說明性的，而不以任何方式限制本揭露的其餘部分。本文引用的所有出版物出於本文引用之目的或主題藉由引用併入。 實例 實例 1 重組表現載體介導的密碼子優化的人 MW- 視蛋白 mRNA 表現之評價
在DMEM + 10% FBS中用293T細胞（傳代 ＜ 30次）以2.0 x E ＋ 6個細胞/孔接種6孔板。18小時至24小時後，每孔僅用2 μg的DNA或PEI-Max（對照）轉染。轉染後3天，回收細胞和培養基，藉由離心使細胞沈澱並儲存在-80℃下直至準備處理。對於每個樣本，按照製造商的說明書用RNeasy Plus套組提取RNA，在20 μL水中洗脫並用Nanodrop測定RNA濃度。根據製造商的說明書，用具有RNA酶抑制劑的高容量cDNA反轉錄套組，使用2 μg總RNA產生cDNA。對於qPCR，每個樣本（10 ng）用以下提供的每種MWO引物/探針對一式三份運行：
描述 來源 產物細節
人MW-視蛋白引物/探針 （hMWO） IDT 正向： GTCTGAATCCACCCAGAAGG 反向： TGCGAAGAAGGCGTATGG 探針： TGATGGTCCTGGCATTCTGCTTCT
密碼子優化的人MW-視蛋白引物/探針對1 （cohMWO對#1） IDT 正向： TCACTTACACCAACTCCAACTC 反向： GAAGATCATCCACACGCTAGTC 探針：TTATCACATTGCGCCGAGATGGGT
密碼子優化的人MW-視蛋白引物/探針對2 （cohMWO對#2） IDT 正向： GTCCGCGACCATCTACAATC 反向： ATCCGTCGTCCACTTTCTTTC 探針： CGAAGAGTTGCAGGATGCAGTTGC
[ 表 1]
所測試的示例性重組表現載體在5'至3'方向上具有SEQ ID NO: 1的第一ITR序列、SEQ ID NO: 2的啟動子序列、SEQ ID NO: 3的MW-視蛋白轉基因序列、SEQ ID NO: 4的增強子序列、SEQ ID NO: 5的多聚A/終止序列、SEQ ID NO: 6的內含子序列和SEQ ID NO: 7的第二ITR序列。示例性重組表現載體在5'至3'方向上包括第一AAV2 ITR序列、CAG啟動子序列、人MW-視蛋白轉基因序列、WPRE序列、衍生自人MW-視蛋白基因序列的內含子序列、多聚A/終止序列、第二AAV2 ITR序列。在一些實驗中，重組表現載體進一步包含賦予胺苄青黴素抗性的多核苷酸序列（REV_Amp）。在一些實驗中，重組表現載體進一步包含賦予康黴素抗性的多核苷酸序列（REV_Kan）。qPCR後，報告了以下平均Ct值：
平均 Ct 值
樣本名稱 hMWO cohMWO 對 #1 cohMWO 對 #2 GAPDH （對照）
單獨 PEI 31.10 31.10 31.10 17.08
REV_Amp 29.65 12.25 12.22 17.85
REV_Kan 29.37 12.19 12.16 17.65
[ 表 2]
Ct（循環閾值）定義為螢光信號越過閾值（即超過背景水平）所需的qPCR循環數。此處，12.25和12.22的值表明在用REV_Amp載體轉染的293T細胞中檢測到密碼子優化的人MW-視蛋白mRNA。同樣，12.19和12.16的值表明在用REV_Kan載體轉染的293T細胞中檢測到密碼子優化的人MW-視蛋白mRNA。與依賴mini-CAG啟動子和編碼人MW-視蛋白的非密碼子優化序列的類似載體相比，具有密碼子優化的人MW-視蛋白序列的REV_Kan和REV_Amp載體在轉染的293T細胞中表現出更好的mRNA表現（使用hMWO的平均Ct值為17.78，使用cohMWO對#1的平均Ct值為30.22，使用cohMWO對#2的平均Ct值為30.10）。 實例 2 重組表現載體介導的密碼子優化的人 MW- 視蛋白表現之評價
在DMEM + 10% FBS中用293T細胞（傳代 ＜ 30次）以250,000個細胞/孔接種24孔板。18小時至24小時後，每孔僅用2 μg的DNA或PEI-Max（對照）轉染。轉染後3天，小心地從孔中除去培養基並用新鮮的4%多聚甲醛溶液（4% PFA，1 mL/孔）替換10分鐘，同時輕輕旋轉。除去4% PFA並用PBS洗滌各孔3次，每次5分鐘。將細胞在封閉緩衝液（1% BSA，0.1% Triton-X100）中在室溫下透化30分鐘，同時輕輕旋轉。在孵育結束時，用在1% BSA、0.1% TritonX-100中以1 : 200稀釋的一抗替換封閉緩衝液。使與一抗（紅色/綠色視蛋白，兔多株抗體，Millipore Sigma AB5405）的孵育在4℃下在輕輕旋轉下在黑暗中進行過夜。第二天早晨，用PBS沖洗細胞3 × 5分鐘，然後開始在黑暗中在室溫下與二抗（在1% BSA、0.1% Triton-X100中以1 : 10,000稀釋）孵育2小時。用PBS再沖洗3次（3 x 5分鐘）後，將蓋玻片用含有DAPI的封固培養基封固在載玻片上並用透明指甲油密封。立即對載玻片成像，然後在4℃下在黑暗中儲存。
所測試的示例性重組表現載體在5'至3'方向上具有SEQ ID NO: 1的第一ITR序列、SEQ ID NO: 2的啟動子序列、SEQ ID NO: 3的MW-視蛋白轉基因序列、SEQ ID NO: 4的增強子序列、SEQ ID NO: 5的多聚A/終止序列、SEQ ID NO: 6的內含子序列和SEQ ID NO: 7的第二ITR序列。重組表現載體進一步包含賦予康黴素抗性的多核苷酸序列（REV_Kan）。成像結果如圖6所示。基於右下小圖中觀察到的螢光與右上小圖中觀察到的較低螢光相比，表現密碼子優化的人MW-視蛋白，並用兔抗視蛋白多株抗體檢測。 實例 3 本發明之重組表現載體的 ITR 穩定性的評價
本發明之ITR多核苷酸被進一步優化以賦予本發明之重組表現載體相對於不具有這樣的ITR序列的重組表現載體的完整性和穩定性。以下描述解釋了REV_Kan中ITR穩定性的評價。
根據製造商的高效方案，將REV_Kan（1 ng）轉化到NESbtl細胞中。將細菌細胞鋪在含有50 mg/mL康黴素的瓊脂平板上，並在37℃孵育過夜（12-16 h）。挑取四個菌落並用於接種5 mL起始培養物（LB + Kan 50 mg/mL）。將每種起始培養物在37℃下以250 rpm振盪（第1輪）孵育過夜（12-16 h）。第二天早上，使用500 μL的每個第1輪起始培養物接種新的5 mL起始培養物（第2輪），使剩餘的培養物（4.5 mL）沈澱，並且使用Qiagen的小量製備套組（miniprep kit）從細胞中提取DNA。重複4次，完成6輪培養。參見圖7。
將來自每輪所有殖株的DNA用XmaI酶在37℃消化2小時。消化完成後，將樣本加載到1%瓊脂糖凝膠上並在150 V下運行45分鐘。將凝膠成像，並檢查條帶圖案。參見圖8。當ITR序列在幾輪培養後完整時，預期的DNA遷移圖案包括3257、2798、1734、11和11 bp條帶。如果在5' ITR中發生缺失，預期的DNA遷移圖案包括6049、1734和11 bp條帶。如果在3' ITR中發生缺失，預期的DNA遷移圖案包括4985、2798和11 bp條帶。6049和4985 bp處條帶的存在表明ITR發生了一些重組。
在六輪培養（約126代）後，沒有檢測到所有殖株的ITR重組證據，表明回收的REV_Kan重組表現載體的ITR係穩定的。 實例 4 在石蟹獼猴中玻璃體內注射載體介導的密碼子優化的人 MW- 視錐視蛋白表現的分子定位研究，觀察期 13 週
該分子定位研究之目的係確定當經由玻璃體內（IVT）注射投與給石蟹獼猴時，本發明之示例性病毒粒子的眼部分佈。動物用5×10 10或4.5×10 11個載體基因組（vg）注射一次，觀察4週（中期處死）和13週（終末處死）。所測試的病毒粒子內的示例性重組表現載體在5'至3'方向上具有SEQ ID NO: 1的第一ITR序列、SEQ ID NO: 2的啟動子序列、SEQ ID NO: 3的MW-視蛋白轉基因序列、SEQ ID NO: 4的增強子序列、SEQ ID NO: 5的多聚A/終止序列、SEQ ID NO: 6的內含子序列和SEQ ID NO: 7的第二ITR序列。示例性重組表現載體在5'至3'方向上包括第一AAV2 ITR序列、CAG啟動子序列、人MW-視蛋白轉基因序列、WPRE序列、衍生自人MW-視蛋白基因序列的內含子序列、多聚A/終止序列、第二AAV2 ITR序列。對來自對照和示例性載體注射動物的在改良的大衛森試劑（Modified Davidson’s reagent）中固定的石蠟包埋的眼進行載體序列的原位雜交和人視錐視蛋白和腺相關病毒（AAV）殼體蛋白的免疫染色。
原位雜交在所有中期和終末屍檢動物的測試注射眼中檢測了示例性載體序列，但在對側未注射的和媒介物對照動物眼中未檢測。示例性核酸信號位於中央視網膜的多灶性區域（大量存在於黃斑中），但在周邊視網膜中分佈更均勻。在睫狀體、虹膜、虹膜角膜角、晶狀體囊和視神經中也存在信號。在視網膜中，示例性核酸信號大量存在於視網膜神經節細胞和神經纖維層中，在內網層、內核層中和偶爾在外核層和光感受器中的水平中等。DNA酶和RNA酶預處理實驗表明視網膜中存在轉基因mRNA。雙重原位雜交實驗顯示示例性核酸信號在少數麩胺酸代謝型受體6（GRM6）陽性雙極細胞中的定位。與低劑量組（5×10 10vg/眼）相比，高劑量組（4.5×10 11vg/眼）的示例性核酸信號更高，但同一劑量組的中期和終末處死動物之間沒有顯著差異。
免疫組織化學表明在載體給藥的動物眼中AAV殼體蛋白和人中波視錐視蛋白的存在，分別證實了示例性載體的轉導和轉基因產物的存在。
使用ACD公司（Advanced Cell Diagnostics，ACD）（海沃德，加利福尼亞州）和文塔納醫療系統公司（Ventana Medical Systems）（圖森，亞利桑那州）的探針和試劑進行原位雜交（ISH）。用於轉基因[密碼子優化的人中波視錐視蛋白（MW-視蛋白）]的反義探針和有義探針由ACD基於示例性載體中的序列設計。陽性PPIB和陰性DAPB對照探針組包括在內，以分別確保mRNA品質和特異性。
用分別用攜帶轉基因-ChrimsonR-eGFP和MW-視蛋白的質體轉染的陰性對照和陽性對照細胞系評估示例性載體正義探針和反義探針的特異性。將細胞系加工成福馬林固定石蠟包埋（FFPE）塊用於定位實驗。
對所有研究動物的塊進行反義和有義ISH。
雜交方法遵循由ACD和文塔納系統公司（Ventana systems）建立的使用Ventana mRNA Red或Brown色原的方案。簡而言之，將5 µm切片在60度烘烤60分鐘並用於雜交。使用Sakura組織-Tek DR5染色器進行脫蠟和再水化方案，步驟如下：3次二甲苯，每次持續5分鐘；2次100%乙醇，持續2分鐘；空氣乾燥5分鐘。在98至104攝氏度下在1X修復緩衝液中進行離線手動預處理15分鐘。藉由首先評估PPIB和DAPB雜交信號，隨後對所有載玻片使用相同的條件來進行優化。預處理後，將載玻片轉移至Ventana Ultra自動染色器，以完成ISH程序，包括蛋白酶預處理；在43攝氏度雜交2小時，隨後進行擴增；以及用HRP和蘇木精複染進行檢測。
對少數動物進行RNA酶和DNA酶預處理實驗以證明示例性載體DNA和MW-視蛋白RNA的存在。將5 μm石蠟包埋的眼切片脫蠟，並在室溫下用過氧化氫酶處理10分鐘，然後進行靶標檢索。然後，將載玻片用RNA酶（Qiagen目錄號19101）在37℃下處理30分鐘，或用DNA酶I（Qiagen目錄號79254）在40℃下處理10分鐘。然後如上所描述處理載玻片。
對少數動物進行雙重標記ISH實驗以確定示例性核酸信號在內核層的雙極細胞內的定位。分別藉由兩種不同的顯色底物HRP-C1-Teal和AP-C2-Red檢測示例性載體反義和GRM6（編碼代謝型麩胺酸受體6-mGluR6）探針的信號。
改良的半定量H評分（如下所描述）適於對在眼不同區域的載體核酸定位進行評分。
半定量改良的H評分 =（0 ×「分數0」細胞的百分比）+（1 ×「分數1」細胞的百分比）+（2 ×「分數2」細胞的百分比）+（3 ×「分數3」細胞的百分比）。分數「0」表示無信號。「1」表示1-3個點/細胞。「2」表示4-10個點/細胞，「3」表示 ＞ 10個點/細胞且少於10%的成簇細胞，「4」表示 ＞ 10個點/細胞或多於10%的成簇細胞。
在Ventana Discovery XT自動染色儀上，使用標準Ventana Discovery XT試劑（文塔納公司（Ventana），印弟安納波里斯，印第安那州）對視蛋白和AAV殼體蛋白進行免疫組織化學（IHC）染色。用於測定的抗體和濃度列於表2中。將載玻片脫蠟，然後根據標準文塔納公司修復方案，用細胞調節（Cell Conditioning）1（CC1/pH8）溶液覆蓋載玻片進行熱誘導抗原修復。藉由與如下所示的適當的Ventana Discovery OmniMap HRP試劑孵育，隨後與Ventana Discovery ChromoMap 3,3’-二胺基聯苯胺（DAB）孵育，獲得視覺化。使用文塔納公司的蘇木精和文塔納公司的發藍試劑（Bluing reagent）進行複染，每者4分鐘。將載玻片脫水，清潔，並用合成的封固培養基封片。每次運行都包括陽性和陰性對照組織。 原位雜交探針 –[ 表 3]
探針 靶標 供應商 目錄號 注釋
DapB 二氫吡啶二羧酸還原酶 ACD公司 312039 陰性對照探針（細菌基因）
Mfa-PPIB 肽基脯胺醯異構酶B ACD公司 424149 石蟹獼猴陽性對照持家基因探針
反義 人MW-視蛋白mRNA和AAV基因組 ACD公司 1080809 -
正義 AAV基因組 ACD公司 1080879 -
Mfa-GRM6 代謝型麩胺酸受體6 ACD公司 1155679 ON型雙極細胞標記
免疫組織化學抗體 –[ 表 4]
靶標 供應商 目錄號 注釋
AAV VP1、VP2、VP3 普羅根公司（Progen） 65158 -
紅/綠視蛋白 西格瑪公司（Sigma） AB5405 針對中長波視蛋白的多株抗體
用已知的陽性（用MW-視蛋白轉染）和陰性對照細胞沈澱（用ChrimsonR-eGFP轉染）評估反義探針和有義探針的特異性。正如所預期的，陽性對照細胞顯示具有反義探針和有義探針的大量核酸信號，而陰性細胞對於反義探針和有義探針呈陰性。ISH條件係令人滿意的，因為兩種細胞系都顯示出中等水平的PPIB信號（內源對照）。
確定了探針的特異性後，進一步表徵了研究眼組織中的示例性載體核酸分佈。用於ISH測定的眼切片顯示出中等水平的PPIB且對於DapB（細菌基因）mRNA信號呈陰性，這證實了RNA完整性和ISH測定程序。在未注射的或存檔的對照/媒介物對照獼猴眼中沒有示例性載體核酸信號。反義ISH信號存在於中央視網膜的多灶性區域中，在黃斑中信號豐富，但在周邊視網膜中分佈更均勻。在睫狀體、虹膜、虹膜角膜角、晶狀體囊和視神經中也存在信號。有義ISH信號的定位模式與反義ISH相似（圖9）。在視網膜內，ISH信號在視網膜神經節細胞內係豐富的。在神經纖維層、內網層、內核層以及偶爾在外核層、光感受器和血管壁中注意到輕度至中度水平的示例性載體核酸信號（圖10）。在角膜、脈絡膜和結膜中無ISH信號。與低劑量組（5×10 10vg/眼）相比，高劑量組（4.5×10 11vg/眼）中的反義和有義ISH信號均較高，但在中期（給藥後4週）和終末（給藥後13週）處死動物之間ISH信號沒有顯著差異（圖11）。
用RNA酶預處理消除了反義細胞質信號，並揭示了與示例性載體的轉導一致的視網膜（主要在神經節細胞內）、睫狀體和虹膜角膜角內的核內信號。DNA酶預處理保留了與MW-視蛋白表現一致的視網膜、視神經、睫狀體、虹膜和虹膜角膜角的核內和胞漿內ISH信號。晶狀體囊和神經纖維層中的ISH信號藉由DNA酶去除，但不是藉由RNA酶處理，表明示例性載體結合該等膜。
為了研究示例性載體核酸是否定位於內核層的雙極細胞中，進行雙重反義和GRM6（ON雙極細胞的標記物）ISH實驗。GRM6 mRNA信號僅定位於內核層，與已發表的報導一致（Nakajima等人 1993；Kim等人 2008）。如圖12所示，幾乎沒有反義信號與GRM6 ISH陽性雙極細胞共定位，這在黃斑中特別明顯。
為了進一步證明研究眼中的示例性載體轉導，用抗AAV VP1/VP2/VP3抗體進行AAV殼體蛋白的定位。正如所預期的，陽性對照石蟹獼猴眼組織在外核層中顯示出強的核免疫染色。在陽性對照研究動物中，在神經節細胞核和周圍視網膜的外核層、視網膜的內界膜和晶狀體後囊內觀察到AAV殼體免疫染色（圖13）。神經節細胞和外核層的核染色表明示例性載體轉導。晶狀體囊和內界膜中殼體蛋白的存在表明載體黏附於該等膜，與示例性載體核酸檢測一致。在眼的其他區域或其他研究動物中沒有免疫染色歸因於組織固定效應，因為改良的大衛森試劑與多種抗體不相容（Chidlow等人 2011）。
針對人中波（又名綠色）和長波（又名紅色）視錐視蛋白的多株抗體用於證明MW-視蛋白表現（示例性轉基因產物）。對於視蛋白，陽性對照細胞（具有人MW-視錐視蛋白轉基因）呈免疫陽性，但陰性對照細胞（具有ChrimsonR-eGFP轉基因）呈免疫陰性，表明抗體的特異性。
中央（均勻分佈）和周邊視網膜（多灶性分佈）中的光感受器在來自研究動物的眼切片中顯示強染色，表明多株抗體與石蟹獼猴視錐視蛋白交叉反應。除了光感受器，示例性載體給藥的動物和對照動物的未注射的眼沒有顯示在眼切片的其他區域具有免疫染色。在所有動物的中央和/或周邊視網膜中觀察到針對MW-視蛋白的最小（1級）至輕度（2級）免疫染色（表5），證實了轉基因在載體轉導的細胞中的翻譯。 示例性載體注射的石蟹獼猴的視網膜中的視蛋白免疫染色 –[ 表 5]
   中期處死（4週） 終末處死（13週）
   5 x 10 10vg/眼 4.5 x 10 11vg/眼 5 x 10 10vg/眼 4.5 x 10 11vg/眼
動物/部位 P0101 P0102 P0401 P0201 P0202 P0501 P0103 P0402 P0403 P0302 P0502 P0503
視網膜，中央 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1
視網膜，周邊 2 2 1 2 2 1 1 1 1 2 2 2
視神經 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
脈絡膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
睫狀體和睫狀突 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1
虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
虹膜角膜角 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
在中央視網膜內，在神經節細胞和神經纖維層中檢測到免疫染色，而周邊視網膜在跨越視神經視網膜整個厚度的多灶性區域中顯示免疫染色，類似繆勒氏細胞模式（圖14），與示例性載體核酸定位一致。此外，睫狀體和睫狀突的無色素上皮顯示最小的免疫染色。在視神經、虹膜、虹膜角膜角、脈絡膜、晶狀體、結膜和角膜中沒有MW-視蛋白染色。MW-視蛋白免疫染色的染色強度低於示例性載體核酸定位的染色強度，並且可歸因於使用改良的大衛森試劑的組織固定效應。
與反義探針和有義探針的原位雜交用於證明石蠟包埋的改良大衛森固定的石蟹獼猴眼切片中的示例性載體轉導。在測試物注射的眼中檢測到示例性載體序列，但在所有中期和終末屍檢動物的對照動物中未檢測到。ISH信號位於中央視網膜的多灶性區域，特別是在黃斑中。ISH信號在周邊視網膜、睫狀體、虹膜、虹膜角膜角、晶狀體囊和視神經中均勻分佈。如所預期的，載體轉導在視網膜神經節細胞中係豐富的。然而，視網膜（內核層）、睫狀體和虹膜中的其他細胞類型也被示例性載體轉導。
與低劑量組（5×10 10vg/眼）相比，高劑量組（4.5×10 11vg/眼）的示例性載體核酸信號更高。然而，有趣的是，注意到在中期和終末處死動物之間的示例性載體核酸信號之間沒有差異。該觀察表明載體在眼中持續長達13週。此外，虹膜角膜角中載體核酸的存在可表明載體的清除途徑。
雙重原位雜交實驗顯示示例性載體核酸在少數GRM6陽性ON雙極細胞中的定位，並且在黃斑中特別明顯。在中央和周邊視網膜中，示例性載體核酸分佈似乎具有繆勒（Mueller）細胞模式。
免疫組織化學證明了在視網膜中存在AAV核內殼體蛋白，證實了示例性載體的轉導。此外，在中央和/或周邊視網膜和睫狀體中證明了MW-視蛋白免疫染色，證實了示例性載體的轉基因產物的翻譯。在眼切片中殼體蛋白或MW-視蛋白檢測的敏感性降低歸因於使用改良的大衛森固定劑造成的抗原損失（Chidlow等人 2011）。
無
[圖1]提供了SEQ ID NO: 1-2的多核苷酸序列。
[圖2]提供了SEQ ID NO: 3-5的多核苷酸序列。
[圖3]提供了SEQ ID NO: 6-7的多核苷酸序列。
[圖4A-4B]提供了SEQ ID NO: 8的多核苷酸序列。
[圖5A-5D]提供了SEQ ID NO: 9的多核苷酸序列。
[圖6]提供了用REV_Kan轉染，然後進行免疫組織化學的293T細胞之螢光圖像。
[圖7]提供了ITR穩定性評價研究之示意圖。
[圖8]提供了XmaI消化後含有REV_Kan載體的成像的瓊脂糖電泳凝膠。當XmaI限制性位點存在於REV_Kan ITR中時，觀察到大小為3257、2798和1734 bp的DNA片段。
[圖9]示出了使用與反義探針和有義探針的原位雜交在石蟹獼猴眼中的示例性載體轉導。顯示了來自一隻測試動物（高劑量組，@4.5×10 11vg/眼）的具有反義和有義ISH（黑色信號）的眼切片之代表性全載玻片視圖。注意反義ISH信號存在於中央視網膜的多灶性區域，但更均勻分佈在周邊視網膜（如*所示）、睫狀體、虹膜、虹膜角膜角、晶狀體囊和視神經中。有義ISH信號的定位模式與反義ISH相似。眼切片顯示出中等水平的PPIB（內源性對照）和DapB（細菌基因）mRNA信號陰性（未顯示）。
[圖10]示出了使用與反義探針和有義探針的原位雜交在眼的各種解剖區域中之示例性載體核酸信號。(A) 顯示了測試動物（高劑量組，@4.5×10 11vg/眼）中眼的不同區域的反義ISH定位。反義ISH信號在黃斑和中央視網膜的多灶性區域中係豐富的，特別是在神經節細胞、神經纖維層、內網層和內核層中。有時，在外核層和光感受器中檢測到反義ISH信號。在周邊視網膜中更均勻地檢測到ISH信號。輕度至中度水平的ISH信號存在於視神經、睫狀體、虹膜、虹膜角膜角和晶狀體囊後部中。(B) 顯示了測試動物（高劑量組，1@4.5 x 10 11vg/眼）中眼的不同區域的有義ISH定位。有義ISH信號模式的定位與反義ISH相似。有義ISH信號在黃斑和中央視網膜的多灶性區域中係豐富的，特別是在神經節細胞和內核層細胞內。在周邊視網膜中更均勻地檢測到ISH信號。輕度至中度水平的ISH信號存在於睫狀體、虹膜、虹膜角膜角和晶狀體囊後部中。
[圖11]提供了石蟹獼猴眼的不同區域中 (A) 反義ISH信號和 (B) 有義ISH信號之半定量評分。如方法部分中所描述，考慮每個細胞的ISH信號數和表現ISH信號的細胞百分比，開發了改進的H評分。注意到，高劑量組的ISH信號高於低劑量組，但同一劑量組的中期和終末處死動物之間沒有顯著差異。
[圖12]示出了雙重標記ISH實驗中一些GRM6+雙極細胞中的反義信號。測試動物的眼切片中的雙重反義和GRM6 ISH標記實驗。單叢實驗顯示GRM6（ON型雙極細胞的標記）ISH信號（小圖A中的信號）特異性地在內核層的外部條帶中，而反義信號（小圖B中的信號）在神經纖維層、神經節細胞、內網層和內核細胞中。如小圖C（圓圈）所示，少數細胞顯示反義和GRM6 ISH信號的雙重標記。
[圖13]示出了藉由AAV殼體蛋白免疫染色在視網膜中的示例性載體轉導。在神經節細胞核和周圍視網膜的內核層注意到AAV殼體免疫染色，表明示例性載體轉導。顯示的測試動物切片之代表性圖像。晶狀體囊和內界膜中殼體蛋白的存在表明載體黏附於該等膜。
[圖14]示出了示例性載體注射的石蟹獼猴的視網膜中之視蛋白免疫染色。顯示了來自具有抗紅/綠（又名長/中波）視蛋白免疫染色的測試動物的眼切片之代表性圖像。用抗紅/綠免疫染色證明在中央（黃斑）和周邊視網膜以及睫狀體中觀察到MW-視蛋白。插圖顯示神經節細胞中的點狀免疫染色。周邊視網膜中的免疫染色跨越多灶性區域中的視神經視網膜之整個厚度，類似繆勒氏（Muller）細胞模式。睫狀體和無色素上皮染色最少，但在視神經或眼的其他區域沒有免疫染色。
無
 

          <![CDATA[<110> 瑞士商諾華公司（NOVARTIS AG）]]>
          <![CDATA[<120> 用於增強視覺功能之組成物和方法]]>
          <![CDATA[<130> PAT059037-WO-PCT]]>
          <![CDATA[<140>]]>
          <![CDATA[<141>]]>
          <![CDATA[<150> 63/292,746]]>
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          <![CDATA[<170> PatentIn 3.5版]]>
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          <![CDATA[<400> 1]]>
          cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc       60
          gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca      120
          actccatcac taggggttcc t                                                141
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          gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc       60
          catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca      120
          acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga      180
          ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc      240
          aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct      300
          ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat      360
          tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct      420
          cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga      480
          tgggggcggg gggggggggg gggccccccc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg      540
          gcggggcgag gcggaaaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc      600
          cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg      660
          gagtcgttgc gcgctgcctt ccccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc      720
          cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc      780
          cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa      840
          gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg      900
          tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct      960
          gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg     1020
          gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt     1080
          gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc     1140
          cccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg     1200
          gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg     1260
          ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg aaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc     1320
          ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg     1380
          cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc     1440
          ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag     1500
          ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg     1560
          cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg     1620
          accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacag        1677
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 3]]>
          atggcccaac aatggtccct tcaacgactc gccggtagac acccacagga ctcctacgaa       60
          gattcgaccc agtcatccat tttcacttac accaactcca actccactcg cggccccttc      120
          gagggcccga attatcacat tgcgccgaga tgggtgtacc acctgactag cgtgtggatg      180
          atcttcgtcg tgatcgccag cgtgttcact aacggactgg tgctggccgc gaccatgaag      240
          ttcaagaagc tgaggcaccc tctgaactgg attcttgtga acctggccgt ggccgacctg      300
          gccgaaacag tgatcgcctc aaccatctcc gtggtcaacc aggtctacgg ttactttgtg      360
          cttggacatc ctatgtgcgt gctcgagggc tacaccgtgt cgctgtgcgg gatcactgga      420
          ttgtggtccc tggccattat ctcgtgggag cggtggatgg ttgtgtgcaa gcccttcggc      480
          aacgtgcgct tcgatgcaaa gctggctatc gtgggaatcg cgttttcctg gatctgggcc      540
          gccgtctgga ccgctccccc tattttcggt tggtcccggt actggcccca cgggctcaag      600
          acctcctgtg gtcccgacgt gttcagcgga tcgtcgtacc ctggggtgca gtcctacatg      660
          attgtgctga tggtcacttg ctgtatcacg ccgctgtcta ttatcgtgct gtgctacctc      720
          caagtctggt tggccatccg ggctgtggcc aaacagcaga aggagtccga gagcacccag      780
          aaagccgaaa aggaagtgac ccggatggtc gtcgtgatgg tgctggcatt ctgcttctgt      840
          tggggcccgt acgctttctt tgcctgcttt gcggctgcga acccgggcta cccattccat      900
          cctctcatgg ccgccctccc ggccttcttc gccaagtccg cgaccatcta caatcccgtg      960
          atctatgtgt tcatgaaccg gcagttccgc aactgcatcc tgcaactctt cggaaagaaa     1020
          gtggacgacg gatccgaact gtcgagcgcc tcaaagaccg aagtcagctc ggtgtcatcc     1080
          gtgagcccag cataa                                                      1095
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 590]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          aatcaacctc tggattacaa aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc       60
          tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg      120
          tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt      180
          gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac      240
          tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc      300
          tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct      360
          gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaggtc tgctgagact cggggctgct      420
          cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct      480
          caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct      540
          tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc                 590
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 208]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc       60
          tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc      120
          tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt      180
          gggaagacaa tagcaggcat gctgggga                                         208
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 502]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          ctcatttcat ctgtgacccc tccactaccc tttcttcctg attcttggaa gcaaatccaa       60
          gacatcacac ccttccctct gtaaatcttt actatgttcc tctaggagaa aagggctctt      120
          ctcaatacat aaccacaagt catcatcaca ccgacaagtg taacagtatt tcctgaatag      180
          cttcaaatat cctagtagtg ttcaaaaaat gtcatacgta ttttcagtct gcttgaatca      240
          gggctcaaat aaggtccaca cattcagatt gactgatatg ccttttgact acctttgaat      300
          ctagaggttc cctttctatc tccctgcaat ttatttgtgg aagcaagcaa gtcgttcatg      360
          acgtagccta acaggcccct ctgacgttgt tcattatgat ttttctgtaa attggtagtt      420
          gatctgagga tctggccaga ggcaggttgg atttgttggt gtgttttggc aaggagagtg      480
          tctcttttct ggggtgttgg ca                                               502
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 141]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg       60
          ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc      120
          gagcgcgcag ctgcctgcag g                                                141
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 4638]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc       60
          gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca      120
          actccatcac taggggttcc ttgtagttaa tacgcatgga gctagttatt aatagtaatc      180
          aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgggtaccga cattgattat      240
          tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt      300
          tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc      360
          cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac      420
          gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata      480
          tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc      540
          agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta      600
          ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc      660
          cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg      720
          gggggggggg gcccccccca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc      780
          ggaaaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga      840
          ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgttgcgc      900
          gctgccttcc ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac      960
          tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt     1020
          agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc     1080
          tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg     1140
          tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg     1200
          cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc     1260
          ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt     1320
          gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag     1380
          ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg     1440
          ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg     1500
          ccggggaggg ctcgggggaa ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc     1560
          gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct     1620
          ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg     1680
          cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg     1740
          tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc     1800
          tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct     1860
          agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg     1920
          ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattct ggccaccatg gcccaacaat     1980
          ggtcccttca acgactcgcc ggtagacacc cacaggactc ctacgaagat tcgacccagt     2040
          catccatttt cacttacacc aactccaact ccactcgcgg ccccttcgag ggcccgaatt     2100
          atcacattgc gccgagatgg gtgtaccacc tgactagcgt gtggatgatc ttcgtcgtga     2160
          tcgccagcgt gttcactaac ggactggtgc tggccgcgac catgaagttc aagaagctga     2220
          ggcaccctct gaactggatt cttgtgaacc tggccgtggc cgacctggcc gaaacagtga     2280
          tcgcctcaac catctccgtg gtcaaccagg tctacggtta ctttgtgctt ggacatccta     2340
          tgtgcgtgct cgagggctac accgtgtcgc tgtgcgggat cactggattg tggtccctgg     2400
          ccattatctc gtgggagcgg tggatggttg tgtgcaagcc cttcggcaac gtgcgcttcg     2460
          atgcaaagct ggctatcgtg ggaatcgcgt tttcctggat ctgggccgcc gtctggaccg     2520
          ctccccctat tttcggttgg tcccggtact ggccccacgg gctcaagacc tcctgtggtc     2580
          ccgacgtgtt cagcggatcg tcgtaccctg gggtgcagtc ctacatgatt gtgctgatgg     2640
          tcacttgctg tatcacgccg ctgtctatta tcgtgctgtg ctacctccaa gtctggttgg     2700
          ccatccgggc tgtggccaaa cagcagaagg agtccgagag cacccagaaa gccgaaaagg     2760
          aagtgacccg gatggtcgtc gtgatggtgc tggcattctg cttctgttgg ggcccgtacg     2820
          ctttctttgc ctgctttgcg gctgcgaacc cgggctaccc attccatcct ctcatggccg     2880
          ccctcccggc cttcttcgcc aagtccgcga ccatctacaa tcccgtgatc tatgtgttca     2940
          tgaaccggca gttccgcaac tgcatcctgc aactcttcgg aaagaaagtg gacgacggat     3000
          ccgaactgtc gagcgcctca aagaccgaag tcagctcggt gtcatccgtg agcccagcat     3060
          aagcggaagc ttccgtaatc aacctctgga ttacaaaaat ttgtgaaaga ttgactggta     3120
          ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc     3180
          atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt     3240
          ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg     3300
          ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt     3360
          tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct     3420
          ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aaggtctgct     3480
          gagactcggg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct     3540
          acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc     3600
          ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct     3660
          ccccgccagc ctgctagccg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct     3720
          cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg     3780
          aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc     3840
          aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggag aacgcgaccg     3900
          gtgatctgct catttcatct gtgacccctc cactaccctt tcttcctgat tcttggaagc     3960
          aaatccaaga catcacaccc ttccctctgt aaatctttac tatgttcctc taggagaaaa     4020
          gggctcttct caatacataa ccacaagtca tcatcacacc gacaagtgta acagtatttc     4080
          ctgaatagct tcaaatatcc tagtagtgtt caaaaaatgt catacgtatt ttcagtctgc     4140
          ttgaatcagg gctcaaataa ggtccacaca ttcagattga ctgatatgcc ttttgactac     4200
          ctttgaatct agaggttccc tttctatctc cctgcaattt atttgtggaa gcaagcaagt     4260
          cgttcatgac gtagcctaac aggcccctct gacgttgttc attatgattt ttctgtaaat     4320
          tggtagttga tctgaggatc tggccagagg caggttggat ttgttggtgt gttttggcaa     4380
          ggagagtgtc tcttttctgg ggtgttggca tgtcgacctg attttgtata accacttgcg     4440
          gtgatctaga gcatggctat gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg     4500
          aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg     4560
          ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag     4620
          cgcgcagctg cctgcagg                                                   4638
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 8270]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc       60
          gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca      120
          actccatcac taggggttcc ttgtagttaa tacgcatgga gctagttatt aatagtaatc      180
          aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgggtaccga cattgattat      240
          tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt      300
          tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc      360
          cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac      420
          gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata      480
          tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc      540
          agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta      600
          ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc      660
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          ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgttgcgc      900
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          tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt     1020
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          tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg     1140
          tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg     1200
          cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc     1260
          ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt     1320
          gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag     1380
          ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg     1440
          ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg     1500
          ccggggaggg ctcgggggaa ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc     1560
          gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct     1620
          ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg     1680
          cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg     1740
          tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc     1800
          tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct     1860
          agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg     1920
          ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattct ggccaccatg gcccaacaat     1980
          ggtcccttca acgactcgcc ggtagacacc cacaggactc ctacgaagat tcgacccagt     2040
          catccatttt cacttacacc aactccaact ccactcgcgg ccccttcgag ggcccgaatt     2100
          atcacattgc gccgagatgg gtgtaccacc tgactagcgt gtggatgatc ttcgtcgtga     2160
          tcgccagcgt gttcactaac ggactggtgc tggccgcgac catgaagttc aagaagctga     2220
          ggcaccctct gaactggatt cttgtgaacc tggccgtggc cgacctggcc gaaacagtga     2280
          tcgcctcaac catctccgtg gtcaaccagg tctacggtta ctttgtgctt ggacatccta     2340
          tgtgcgtgct cgagggctac accgtgtcgc tgtgcgggat cactggattg tggtccctgg     2400
          ccattatctc gtgggagcgg tggatggttg tgtgcaagcc cttcggcaac gtgcgcttcg     2460
          atgcaaagct ggctatcgtg ggaatcgcgt tttcctggat ctgggccgcc gtctggaccg     2520
          ctccccctat tttcggttgg tcccggtact ggccccacgg gctcaagacc tcctgtggtc     2580
          ccgacgtgtt cagcggatcg tcgtaccctg gggtgcagtc ctacatgatt gtgctgatgg     2640
          tcacttgctg tatcacgccg ctgtctatta tcgtgctgtg ctacctccaa gtctggttgg     2700
          ccatccgggc tgtggccaaa cagcagaagg agtccgagag cacccagaaa gccgaaaagg     2760
          aagtgacccg gatggtcgtc gtgatggtgc tggcattctg cttctgttgg ggcccgtacg     2820
          ctttctttgc ctgctttgcg gctgcgaacc cgggctaccc attccatcct ctcatggccg     2880
          ccctcccggc cttcttcgcc aagtccgcga ccatctacaa tcccgtgatc tatgtgttca     2940
          tgaaccggca gttccgcaac tgcatcctgc aactcttcgg aaagaaagtg gacgacggat     3000
          ccgaactgtc gagcgcctca aagaccgaag tcagctcggt gtcatccgtg agcccagcat     3060
          aagcggaagc ttccgtaatc aacctctgga ttacaaaaat ttgtgaaaga ttgactggta     3120
          ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc     3180
          atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt     3240
          ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg     3300
          ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt     3360
          tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct     3420
          ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aaggtctgct     3480
          gagactcggg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct     3540
          acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc     3600
          ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct     3660
          ccccgccagc ctgctagccg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct     3720
          cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg     3780
          aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc     3840
          aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggag aacgcgaccg     3900
          gtgatctgct catttcatct gtgacccctc cactaccctt tcttcctgat tcttggaagc     3960
          aaatccaaga catcacaccc ttccctctgt aaatctttac tatgttcctc taggagaaaa     4020
          gggctcttct caatacataa ccacaagtca tcatcacacc gacaagtgta acagtatttc     4080
          ctgaatagct tcaaatatcc tagtagtgtt caaaaaatgt catacgtatt ttcagtctgc     4140
          ttgaatcagg gctcaaataa ggtccacaca ttcagattga ctgatatgcc ttttgactac     4200
          ctttgaatct agaggttccc tttctatctc cctgcaattt atttgtggaa gcaagcaagt     4260
          cgttcatgac gtagcctaac aggcccctct gacgttgttc attatgattt ttctgtaaat     4320
          tggtagttga tctgaggatc tggccagagg caggttggat ttgttggtgt gttttggcaa     4380
          ggagagtgtc tcttttctgg ggtgttggca tgtcgacctg attttgtata accacttgcg     4440
          gtgatctaga gcatggctat gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg     4500
          aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg     4560
          ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag     4620
          cgcgcagctg cctgcaggcc cccccccccc cccccggcga ttctcttgtt tgctccagac     4680
          tctcaggcaa tgacctgata gcctttgtag agacctctca aaaatagcta ccctctccgg     4740
          catgaattta tcagctagaa cggttgaata tcatattgat ggtgatttga ctgtctccgg     4800
          cctttctcac ccgtttgaat ctttacctac acattactca ggcattgcat ttaaaatata     4860
          tgagggttct aaaaattttt atccttgcgt tgaaataaag gcttctcccg caaaagtatt     4920
          acagggtcat aatgtttttg gtacaaccga tttagcttta tgctctgagg ctttattgct     4980
          taattttgct aattctttgc cttgcctgta tgatttattg gatgttggaa tcgcctgatg     5040
          cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt     5100
          acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac actatggtgc     5160
          actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca     5220
          cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg     5280
          accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga     5340
          cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct     5400
          tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc     5460
          taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa     5520
          tattgaaaaa ggaagagtat gagccatatt caacgggaaa cgtcgaggcc gcgattaaat     5580
          tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca     5640
          ggtgcgacaa tctatcgctt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat     5700
          ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg     5760
          gaatttatgc cacttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta     5820
          ctcaccactg cgatccccgg aaaaacagcg ttccaggtat tagaagaata tcctgattca     5880
          ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcactc gattcctgtt     5940
          tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgcctcg ctcaggcgca atcacgaatg     6000
          aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa     6060
          caagtctgga aagaaatgca taaacttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat     6120
          ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat     6180
          gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc     6240
          ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct     6300
          gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaact gtcagaccaa     6360
          gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag     6420
          gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac     6480
          tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc     6540
          gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat     6600
          caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat     6660
          actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct     6720
          acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt     6780
          cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg     6840
          gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta     6900
          cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg     6960
          gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg     7020
          tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc     7080
          tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg     7140
          gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat     7200
          aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc     7260
          agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg     7320
          cgttggccga ttcattaatg cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct     7380
          tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgattcc gttgcaatgg ctggcggtaa     7440
          tattgttctg gatattacca gcaaggccga tagtttgagt tcttctactc aggcaagtga     7500
          tgttattact aatcaaagaa gtattgcgac aacggttaat ttgcgtgatg gacagactct     7560
          tttactcggt ggcctcactg attataaaaa cacttctcag gattctggcg taccgttcct     7620
          gtctaaaatc cctttaatcg gcctcctgtt tagctcccgc tctgattcta acgaggaaag     7680
          cacgttatac gtgctcgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg     7740
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          taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa     7920
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          ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac     8040
          tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt     8100
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          Leu Ala Lys Asp Ala Thr Lys Asn Ala 
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          <![CDATA[<400> 11]]>
          Pro Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 
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          Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 
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          Leu Ala Thr Thr Ser Gln Asn Lys Pro Ala 
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          Leu Ala Pro Asp Ser Thr Thr Arg Ser Ala 
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          Leu Ala Lys Gly Thr Glu Leu Lys Pro Ala 
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          Leu Ala His Glu Thr Ser Pro Arg Pro Ala 
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 54]]>
          Leu Ala Lys Ser Thr Ser Thr Ala Pro Ala 
          1               5                   10  
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          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 55]]>
          Leu Ala Asp Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 
          1               5                   10  
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          Leu Ala Glu Ser Asp Gln Ser Lys Pro Ala 
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          Leu Ala His Lys Asp Thr Thr Lys Asn Ala 
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          <![CDATA[<400> 60]]>
          Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Ile Asn Ala 
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 61]]>
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          <![CDATA[<400> 63]]>
          Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Thr 
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 64]]>
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          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 65]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 67]]>
          Leu Ala His Arg Asp Thr Thr Lys Asn Ala 
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 68]]>
          Leu Ala Ile Ser Asp Gln Thr Asn His Ala 
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          <![CDATA[<211> 10]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 69]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 70]]>
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          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 71]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 72]]>
          Leu Ala Lys Ser Asp Gln Ser Asn Pro Ala 
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 73]]>
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          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 74]]>
          Leu Ala Asn Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 
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          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 75]]>
          Leu Ala Pro Gln Asn Thr Thr Lys Asn Ala 
          1               5                   10  
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          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 76]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 77]]>
          Leu Ala Gln Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 
          1               5                   10  
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt; 人工序列]]&gt;
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成肽]]&gt;
          <br/>
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          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 79]]>
          Leu Asp His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 80]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 80]]>
          Leu Asp His Gln Asp Thr Thr Lys Ser Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 81]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 81]]>
          Leu Gly His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 82]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 82]]>
          Leu Pro His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Asp 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 83]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 83]]>
          Leu Pro His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Thr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 84]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 84]]>
          Leu Pro His Gln Asp Thr Thr Asn Asn Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 85]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 85]]>
          Leu Thr His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 
          1               5                   10  
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          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 86]]>
          Leu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Thr Ile Ala 
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          Leu Thr Pro Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 
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          Leu Val His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala 
          1               5                   10  
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          <![CDATA[<400> 90]]>
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          His Gln Asp Thr Thr Lys Asn 
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          His Gln Asp Thr Thr Lys Lys 
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          His Gln Asp Thr Thr Arg Asn 
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          His Gln Asp Thr Thr Asn 
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          Ile Ser Asp Gln Ser Lys Pro 
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          <![CDATA[<400> 138]]>
          His Gln Asp Thr Thr Glu Asn 
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          <![CDATA[<211> 7]]>
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> ]]>人工序列的描述：合成肽
          <![CDATA[<400> 139]]>
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          <![CDATA[<400> 140]]>
          His Gln Asp Thr Thr Lys Lys 
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          His Gln Asp Thr Thr Lys Asn 
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          His Gln Asp Thr Thr Lys Asn 
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          Lys Ser Asp Gln Ser Lys Pro 
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          <![CDATA[<400> 152]]>
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          <![CDATA[<400> 154]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 155]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 156]]>
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          His Gln Asp Thr Thr Lys Asn 
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          <![CDATA[<400> 172]]>
          His Gln Asp Ser Thr Lys Asn 
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          <![CDATA[<400> 173]]>
          His Gln Asp Ala Thr Lys Asn 
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          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 174]]>
          His Gln Asp Thr Lys Lys Pro 
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 175]]>
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          <![CDATA[<400> 178]]>
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          <![CDATA[<400> 179]]>
          Leu Ser Glu Ala Thr Arg Pro 
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          Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Arg Pro Ala 
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          Leu Ala His Gln Asp Ser Thr Lys Asn Ala 
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          Leu Ala His Gln Asp Ala Thr Lys Asn Ala 
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          <![CDATA[<400> 191]]>
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          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 192]]>
          Leu Ala Leu Gly Glu Ala Thr Arg Pro Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 193]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 193]]>
          Leu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Arg Thr Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 194]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 194]]>
          Leu Ala Leu Ser Glu Ala Thr Arg Pro Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 195]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 195]]>
          Leu Ala Lys Asp Glu Thr Lys Asn Ser Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 196]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 196]]>
          Leu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Lys Pro Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 197]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 197]]>
          Leu Ala His Gln Ala Thr Thr Lys Asn Ala 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 198]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成]]>引物
          <![CDATA[<400> 198]]>
          gtctgaatcc acccagaagg                                                   20
          <![CDATA[<210> 199]]>
          <![CDATA[<211> 18]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成引物]]>
          <![CDATA[<400> 199]]>
          tgcgaagaag gcgtatgg                                                     18
          <![CDATA[<210> 200]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成探針]]>
          <![CDATA[<400> 200]]>
          tgatggtcct ggcattctgc ttct                                              24
          <![CDATA[<210> 201]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成引物]]>
          <![CDATA[<400> 201]]>
          tcacttacac caactccaac tc                                                22
          <![CDATA[<210> 202]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成引物]]>
          <![CDATA[<400> 202]]>
          gaagatcatc cacacgctag tc                                                22
          <![CDATA[<210> 203]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成探針]]>
          <![CDATA[<400> 203]]>
          ttatcacatt gcgccgagat gggt                                              24
          <![CDATA[<210> 204]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成引物]]>
          <![CDATA[<400> 204]]>
          gtccgcgacc atctacaatc                                                   20
          <![CDATA[<210> 205]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成引物]]>
          <![CDATA[<400> 205]]>
          atccgtcgtc cactttcttt c                                                 21
          <![CDATA[<210> 206]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列的描述：合成探針]]>
          <![CDATA[<400> 206]]>
          cgaagagttg caggatgcag ttgc                                              24
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (58)

  1. 一種重組表現載體，其包含第一ITR多核苷酸序列、與編碼中波長視錐視蛋白（MW-視蛋白）轉基因的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列、內含子多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。
  2. 一種重組表現載體，其包含第一ITR多核苷酸序列、與編碼中波長視錐視蛋白（MW-視蛋白）轉基因的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子多核苷酸序列、增強子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。
  3. 一種重組表現載體，其包含第一ITR多核苷酸序列、與編碼中波長視錐視蛋白（MW-視蛋白）轉基因的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子多核苷酸序列、增強子多核苷酸序列、多聚A多核苷酸序列、內含子多核苷酸序列和第二ITR多核苷酸序列。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之重組表現載體，其中該第一ITR多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的序列。
  5. 如請求項1-3中任一項所述之重組表現載體，其中該啟動子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2的序列。
  6. 如請求項1-3中任一項所述之重組表現載體，其中該編碼密碼子優化的MW-視蛋白轉基因的多核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 3的序列85%相同的序列。
  7. 如請求項1-3中任一項所述之重組表現載體，其中該編碼MW-視蛋白轉基因的多核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 3的序列90%相同的序列。
  8. 如請求項1-3中任一項所述之重組表現載體，其中該編碼MW-視蛋白轉基因的多核苷酸包含SEQ ID NO: 3的序列。
  9. 如請求項2所述之重組表現載體，其中該增強子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 4的序列。
  10. 如請求項1-3中任一項所述之重組表現載體，其中該多聚A多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 5的序列。
  11. 如請求項3所述之重組表現載體，其中該內含子多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6的序列。
  12. 如請求項1-3中任一項所述之重組表現載體，其中該第二ITR多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7的序列。
  13. 如請求項1-3、9和11中任一項所述之重組表現載體，其中該重組表現載體進一步包含賦予抗生素抗性的多核苷酸序列。
  14. 如請求項13所述之重組表現載體，其中該抗生素係康黴素。
  15. 如請求項1-3、9和11中任一項所述之重組表現載體，其中該重組表現載體包含SEQ ID NO: 8的序列。
  16. 如請求項1-3、9和11中任一項所述之重組表現載體，其中該重組表現載體係重組病毒載體。
  17. 如請求項16所述之重組病毒載體，其中該重組病毒載體係腺相關病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒載體或反轉錄病毒載體。
  18. 如請求項17所述之重組病毒載體，其中該重組病毒載體係腺相關病毒載體。
  19. 如請求項18所述之重組病毒載體，其中該重組病毒載體係AAV2。
  20. 如請求項18所述之重組病毒載體，其中該重組腺相關病毒載體包含編碼變體殼體多肽的核苷酸序列，與野生型腺相關病毒殼體相比，該變體殼體多肽賦予增加的視網膜細胞感染性和/或賦予增加的穿過內界膜之能力。
  21. 如請求項19所述之重組表現載體，其中該重組表現載體包含SEQ ID NO: 9的序列。
  22. 如請求項21所述之重組病毒載體，其中該變體殼體多肽具有選自由SEQ ID NO: 10-197組成之群組的序列。
  23. 如請求項20所述之重組病毒載體，其中該變體殼體多肽具有選自由SEQ ID NO: 10-20組成之群組的序列。
  24. 如請求項20所述之重組病毒載體，其中該變體殼體多肽具有SEQ ID NO: 14的序列。
  25. 如請求項20所述之重組病毒載體，其中該變體殼體多肽具有SEQ ID NO: 15的序列。
  26. 如請求項20所述之重組病毒載體，其中該變體殼體多肽具有SEQ ID NO: 16的序列。
  27. 如請求項1-26中任一項所述之重組表現載體在製造用於恢復或增強個體的視覺功能的藥物中之用途，其中所述用途提供了MW-視蛋白轉基因在該個體的視網膜細胞中的表現以及視覺功能的恢復或增強。
  28. 如請求項27所述之用途，其中該MW-視蛋白轉基因在該視網膜細胞中的表現提供了該個體的模式化視覺和圖像識別。
  29. 如請求項28所述之用途，其中該圖像識別係靜態圖像或模式的圖像識別。
  30. 如請求項28所述之用途，其中該圖像識別係活動圖像或模式的圖像識別。
  31. 如請求項27-30中任一項所述之用途，其中該MW-視蛋白轉基因在該視網膜細胞中的表現提供了在空間模式辨別測定中區分包含垂直線的圖像和包含水平線的圖像。
  32. 如請求項27-30中任一項所述之用途，其中該MW-視蛋白轉基因在該視網膜細胞中的表現提供了在空間模式辨別測定中區分包含靜態線的圖像和包含移動線的圖像。
  33. 如請求項27-30中任一項所述之用途，其中該MW-視蛋白轉基因在該視網膜細胞中的表現提供了在時間光模式測定中區分閃光和恒定光。
  34. 如請求項27-30中任一項所述之用途，其中該MW-視蛋白轉基因在該視網膜細胞中的表現提供了在圖像識別測定中在約10 4W/cm 2至約10 W/cm 2的光強度下識別圖像。
  35. 如請求項27-30中任一項所述之用途，其中該MW-視蛋白轉基因在該視網膜細胞中的表現提供了在避光測定中區分具有白光的區域和沒有白光的區域。
  36. 如請求項27-30中任一項所述之用途，其中該MW-視蛋白轉基因在該視網膜細胞中的表現提供了在如下光強度下的圖像識別，該光強度比在視網膜細胞中表現通道視紫紅質多肽的個體提供圖像識別所需的光強度低至少10倍。
  37. 如請求項27-30中任一項所述之用途，其中該MW-視蛋白轉基因在該視網膜細胞中的表現提供了如下動力學，該動力學比視紫紅質多肽賦予視網膜細胞的動力學快至少2倍。
  38. 如請求項27-30中任一項所述之用途，其中所述藥物經由眼內注射投與。
  39. 如請求項27-30中任一項所述之用途，其中所述藥物經由玻璃體內注射投與。
  40. 如請求項27-30中任一項所述之用途，其中所述藥物經由視網膜下注射投與。
  41. 如請求項27-30中任一項所述之用途，其中該個體患有選自以下的眼部疾病：色素性視網膜炎、黃斑點退化、地圖樣萎縮、年齡相關性黃斑點退化、視網膜劈裂症、萊伯氏先天性黑蒙、視錐視桿營養不良、Bardet Biedl二氏症候群、無脈絡膜症、厄舍綜合症、眼底黃色斑點症和別蒂結晶樣營養障礙。
  42. 如請求項27-30中任一項所述之用途，其中該個體由於創傷、頭部損傷或作為另一種疾病的併發症經歷視網膜脫落或光感受器喪失。
  43. 一種藥物組成物，其包含： a)  如請求項1-26中任一項所述之重組表現載體；和 b) 藥學上可接受的賦形劑。
  44. 如請求項43所述之藥物組成物，其中該藥學上可接受的賦形劑包含鹽水。
  45. 如請求項43-44中任一項所述之藥物組成物，其中該組成物係無菌的。
  46. 如請求項1-26中任一項所述之重組表現載體或如請求項43-45中任一項所述之藥物組成物在製造用於恢復或增強受試者的視覺功能的藥物中之用途。
  47. 如請求項1-26中任一項所述之重組表現載體或如請求項43-45中任一項所述之藥物組成物在製造用於治療眼部疾病的藥物中之用途。
  48. 一種宿主細胞，其包含如請求項1-26中任一項所述之重組表現載體。
  49. 一種製備如請求項1-26中任一項所述之重組表現載體的方法，所述方法包括培養如請求項48所述之宿主細胞、裂解培養的宿主細胞、和從所述裂解的培養的宿主細胞中提取和純化該重組表現載體。
  50. 一種製備如請求項43-45中任一項所述之藥物組成物之方法，所述方法包括培養如請求項48所述之宿主細胞，收集培養的宿主細胞的上清液，從所收集的上清液中濃縮和純化重組病毒載體，以及向所純化的重組病毒載體中添加藥學上可接受的賦形劑。
  51. 如請求項1-26中任一項所述之重組表現載體或如請求項43-45中任一項所述之藥物組成物在製造用於治療眼部疾病的藥物中之用途，該眼部疾病選自：色素性視網膜炎、黃斑點退化、地圖樣萎縮、年齡相關性黃斑點退化、視網膜劈裂症、萊伯氏先天性黑蒙、視錐視桿營養不良、Bardet Biedl二氏症候群、無脈絡膜症、厄舍綜合症、眼底黃色斑點症或別蒂結晶樣營養障礙。
  52. 如請求項51所述之用途，其中該眼部疾病係色素性視網膜炎。
  53. 如請求項51所述之用途，其中該眼部疾病係地圖樣萎縮。
  54. 如請求項51所述之用途，其中該重組表現載體或該藥物組成物處於治療有效量。
  55. 如請求項20所述之重組病毒載體，其中該變體殼體多肽具有選自由SEQ ID NO: 168-170組成之群組的序列。
  56. 如請求項20所述之重組病毒載體，其中該變體殼體多肽具有SEQ ID NO: 168的序列。
  57. 如請求項20所述之重組病毒載體，其中該變體殼體多肽具有SEQ ID NO: 169的序列。
  58. 如請求項20所述之重組病毒載體，其中該變體殼體多肽具有SEQ ID NO: 170的序列。
TW111118711A 2021-05-21 2022-05-19 用於增強視覺功能之組成物和方法 TW202313981A (zh)

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