JP2024521713A - Ｋｃｎｖ２変異体及びその使用 - Google Patents

Abstract

本明細書では、ＫＣＶＮ２の新規なポリヌクレオチド変異体、それらによってコードされる電位依存性カリウムイオンチャネルポリペプチド、及び例えば光受容体機能を回復させ、網膜障害、例えばＣＤＳＲＲを有する対象を処置する方法におけるそれらの使用が開示される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０２１年５月２０日に出願された米国仮出願第６３／１９１，１０６号の優先権を主張し、その全体が参照により組み込まれる。

これは、ＫＣＮＶ２配列などの新規なヌクレオチド及びタンパク質配列、並びに組換え核酸分子及びベクター、並びに対象における錐体ジストロフィーなどの網膜障害を処置するための関連する使用方法に関する。

錐体ジストロフィー、例えば、限定されないが、超正常桿体応答を伴う錐体ジストロフィー［ＣＤＳＲＲ］は、例えば、とりわけ、視力不良、視力喪失、光に対する感受性、色覚不良、眼振及び斜視を特徴とし得る常染色体劣性障害である。視力の問題は、小児期初期に始まり、例えば、１０代までに２０／１００以下の視力を有する。患者は後に夜盲を発症することがあり、多くの又はほとんどの患者は近視も発症することがある。視力喪失の進行を軽減又は予防するための具体的な処置は利用できず、患者は予後不良であり、加齢に伴って生活の質が低下する。したがって、治療法を特定する必要がある。

本発明者らは、ＫＣＶＮ２によって示される超正常桿体応答［ＣＤＳＲＲ］（網膜錐体ジストロフィー３Ｂ、ＯＭＩＭ ６１０３５６）及び関連する病態を伴う錐体ジストロフィーを処置するための新規な組換え核酸分子、タンパク質、ベクター、及び関連する使用方法を開示する。ＣＤＳＲＲは、視力不良（中心暗点による）、羞明、重度の色覚欠損を特徴とする稀な劣性遺伝性網膜症であり、時折、眼振及び斜視も存在する。一部の患者では、眼底は正常に見えるが、中心窩又は傍中心窩萎縮、黄斑ブルアイ、過蛍光異常、及び全身性微細色素性網膜症が報告されている。視神経にいくらかの時間的な混濁があり得る。

限定されないが、錐体光受容体及び／又は桿体光受容体を含む、網膜細胞において遺伝子を発現するための核酸、転写制御単位（ＴＣＵ）、最適化された遺伝子配列、発現構築物及びベクターが本明細書に開示される。

非改変ＫＣＶＮ２遺伝子に核酸置換を含む改変ＫＣＶＮ２遺伝子が本明細書に開示され、核酸置換は、ヒトＫＣＶＮ２遺伝子と配列番号２によって表されるコドン最適化バージョンとのアラインメントによって実証されたものの１つ又は複数であり得る。

光受容体、例えば錐体光受容体及び／又は桿体光受容体において遺伝子を発現させるための、核酸、転写制御単位（ＴＣＵ）、最適化された遺伝子配列、発現構築物及びベクターも提供される。

核酸分子、並びに核酸分子によってコードされる単離されたＫｖ８．２タンパク質を含有するベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターも提供される。

ＴＣＵの制御下にある変異体ヒトＫＣＶＮ２遺伝子を含む発現構築物も提供される。変形例では、ＫＣＶＮ２は、光受容体、例えば錐体光受容体又は桿体光受容体において遺伝子を発現するために最適化されたプロモーターの制御下にある。変形例では、変異体ヒトＫＣＶＮ２遺伝子は、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターの制御下にあり得る。
したがって、１つの変形例では、以下を提供する。

ＫＣＶＮ２遺伝子の発現を指示することができるプロモーター。変形例では、プロモーターは、導入遺伝子発現を光受容体に標的化する。別の変形例では、プロモーターは、発現を光受容体のみに制限する。別の変形例では、プロモーターはロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターである。

光受容体において発現される配列。変形例では、本発明は、光受容体特異的に発現される配列を含む発現構築物を提供する。さらなる変形例では、発現される配列は、Ｋｖ８．２をコードする遺伝子を含む。さらなる変形例では、発現される配列は配列番号２を含む。

本開示の上記及び他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して進められるいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。

第１の構造体の概略マップを示す。 第２の構造体の概略マップを示す。 第３の構造体の概略マップを示す。 第４の構造体の概略マップを示す。 網膜機能を回復させる例示的な方法を示す。 ステージＩ及びステージＩＩの調査プロセスを提供する。 ステージＩＩＩの概念実証研究を提供する。 開示される方法、システム及び核酸配列を使用した処置マウスと未処置マウスとの比較を提供する。 野生型（ＷＴ）、注射されていない網膜と処置された網膜における錐体（ａ、錐体アレスチン）及び桿体（Ｂ、ロドプシン）マーカーの相対的遺伝子発現を示す＊Ｐ＜０．０５；＊Ｐ＜０．０１。 処置後１２週の、配列番号３によって送達された配列番号２を注射したＫｖ８．２ ＫＯマウスの網膜におけるヒトＫｖ８．２サブユニットの網膜発現の代表的な画像を示す。 マウスのパイロット研究のプロトコルを示す表である。 処置マウス対未処置マウスのａ波振幅を表すデータを示す。 処置マウス対未処置マウスの陽性ｂ波振幅を表すデータを示す。 処置マウス及び未処置マウスのＯＣＴデータを示す。 野生型（ＷＴ）、Ｋｖ８．２ ＫＯ未処置（非注射）及びＫｖ８．２ ＫＯ眼からのｃ波の定量化を実証する。 処置後１２週の、処置されたＫｖ８．２ ＫＯマウスの明所視力及び暗所視力及び暗所コントラスト感度の改善を実証する。 処置後１２週の、処置されたＫｖ８．２ ＫＯマウスの明所視力及び暗所視力及び暗所コントラスト感度の改善を実証する。 ヒトＫｖ８．２サブユニット（緑色）の発現を示す処理領域及びＫｖ８．２発現のない未処理領域を有する網膜下注射眼の網膜切片の概略図である。 Ｋｖ８．２発現（緑色）、Ｋｖ２．１発現（赤色）及び細胞核（青色）を示す処置領域及び未処置領域の高倍率画像を提供する。スケールバー＝５０μｍ。’ 野生型に対して正規化された処置眼におけるヒトＫＣＮＶ２遺伝子の発現を示すリアルタイム定量ＰＣＲからのデータを提供する。 合わせて、ヒトＫＣＶＮ２（配列番号１１）及び配列番号２のコドン最適化変異体の配列アラインメントを示す。 合わせて、ヒトＫＣＶＮ２（配列番号１１）及び配列番号２のコドン最適化変異体の配列アラインメントを示す。

配列表
添付の配列表に列挙されている核酸及びアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されているように、ヌクレオチド塩基の標準的な略語及びアミノ酸の三文字表記を使用して示されている。各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。配列表は、２０２２年５月１８日に作成された「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」（約４０ｋｂ）という名称のファイルの形態のＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、これは参照により本明細書に組み込まれる。

本発明者らは、ＫＣＶＮ２遺伝子によって示される超正常桿体応答［ＣＤＳＲＲ］（網膜錐体ジストロフィー３Ｂ、ＯＭＩＭ ６１０３５６）及び関連する病態を伴う錐体ジストロフィーを処置するための新規な組換え核酸分子、タンパク質、ベクター、及び関連する使用方法を開示する。ＣＤＳＲＲは、視力不良（中心暗点による）、羞明、重度の色覚欠損を特徴とする稀な劣性遺伝性網膜症であり、時折、眼振及び斜視も存在する。一部の患者では、眼底は正常に見えるが、中心窩又は傍中心窩萎縮、黄斑ブルアイ、過蛍光異常、及び全身性微細色素性網膜症が報告されている。視神経にいくらかの時間的な混濁があり得る。

臨床症候は、他の組織又は器官が罹患していない視力喪失に限定され得る。ほとんどの政府機関は、法律上の失明を、最もよく見える目の矯正視力（中心視力）が２０／２００以下であることと定義している。これは、法的に目の不自由な人が２０フィートで見ることができるものを、平均的な人は２００フィートではっきりと見ることができることを意味する。ＣＤＳＲＲ研究では、視力は人によって異なり得るが平均で約２０／１６０であるが、最終的には法的に盲目のレベルまで進行し得ることが示されている。視力喪失の進行を軽減又は予防するための具体的な処置は利用できず、患者は予後不良であり、加齢に伴って生活の質が低下する。予後は、症状の治癒、処置、又は治る可能性に関連するので、ＣＤＳＲＲ及び他のＫＣＶＮ２関連病変の予後不良は、現在利用可能な治癒又は処置がないため、回復の可能性がほとんどないことを意味する。視力低下補助具及び色付きレンズは、視力喪失症候の改善を試みるために患者が利用可能な唯一の資源である。いくつかの研究は、ＣＤＳＲＲ患者における中心視力喪失の進行性の性質を示しているが、大規模な自然歴研究は、疾患進行の完全な程度を評価するためにまだ完了していない。

この疾患の希少性（世界中の罹患者の推定数は１００万人に１人である）は、稀少疾患の定義に適格であり、処置又は予防のために新しい医薬品を製造及び販売することに対する民間部門の金銭的インセンティブをほとんど提供しないため、製薬業界によって対処されるのを妨げる。しかしながら、網膜電図検査（ＥＲＧ）及び遺伝子検査の利用可能性は、正確かつ早期のＣＤＳＲＲ診断を可能にし、この障害の処置の開発を支援する。ＣＤＳＲＲ及び緩徐進行性の性質の劣性遺伝様式は、それを、一度限りのウイルスベースの遺伝子治療（遺伝子補充）処置のための良好な候補にする。

ＣＤＳＲＲの原因因子の中には、カリウムチャネル、電位依存性サブファミリーＶ、メンバー２遺伝子（ＫＣＶＮ２）における突然変異がある。一部のＣＤＳＲＲ患者では、Ｋｖ８．２電位依存性カリウム（Ｋ^＋）チャネルサブユニットをコードするＫＣＮＶ２遺伝子の突然変異が存在する。ＫＣＮＶ２における９５を超える異なるＣＤＳＲＲを引き起こす変異体が現在世界中で同定されており、他の変異体の中には、ミスセンス、ナンセンス、遺伝子内欠失、フレーム外挿入が含まれる。異なる変異体は、Ｋｖ８．２に異なる影響を及ぼすことが示されており、いくつかの突然変異は非伝導性チャネルを生成するが、他の突然変異はチャネル形成を完全に妨げた。これは、疾患病理学に関与する異なる機構の存在を示唆するが、すべての変異体が非機能性タンパク質を生成し、ＣＤＳＲＲを遺伝子置換療法のための良好な候補にすることも示唆する

Ｋｖ８．２は、それ自体ではチャネルを形成しないが同族パートナーを必要とする「修飾因子／サイレント」チャネルタンパク質の群のメンバーである；Ｋｖ８．２の場合、これは、活動電位の再分極の速度を調節する遅延整流電流を生成するサブユニットのＳｈａｂファミリーのメンバーであるＫｖ２．１（ＫＣＮＢ１によってコードされる）である。眼において、Ｋｖ８．２及びＫｖ２．１サブユニットの両方は、錐体及び桿体光受容体細胞の内側セグメントの細胞質膜上に排他的に位置し、細胞は視覚応答の光伝達カスケードを開始する役割を果たす。しかしながら、ＫＣＮＶ２のミスセンス突然変異もまた、ヒトにおいててんかんを引き起こすことが示されており、脳においても発現され得ることを示している。網膜電図（ＥＲＧ）疾患表現型は、ＫＣＮＶ２の突然変異がＫｖ８．２サブユニットの機能の喪失をもたらし、Ｋｖ２．１／Ｋｖ８．２ヘテロマーの機能的消滅をもたらすことを示す。最終的に、これは網膜の光に対する感度を変化させ、それによって基本的な生理学的プロセスを変化させ、それによって視覚のダイナミックレンジが異なる照明レベルの下で調節される。

証拠は、ＫＣＮＶ２の突然変異が錐体光受容体と桿体光受容体の両方に影響を及ぼすことを示唆しており、これは両方の光受容体の異常ＥＲＧ記録に反映され、網膜全体に広がるが、一部の患者では、観察された形態学的変化は錐体でより顕著であるように見える。ＣＤＳＲＲ患者におけるスペクトルドメイン光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）を使用した網膜の高解像度画像化により、通常は中央網膜の肉眼的形態異常が明らかになった。これらには、内側／外側セグメント（ＩＳ／ＯＳ）接合部、著しい中心窩深度の減少、錐体が存在しない斑点を伴う錐体光受容体モザイク破壊、及び全体的な錐体密度の減少が含まれる。しかしながら、ＣＤＳＲＲ網膜内の光受容体細胞喪失の機構は依然として不明である。さらに、この疾患がどのようにして錐体及び桿体に差次的に影響するかは明らかではない。瞳孔測定によって測定されたＣＤＳＲＲ患者の異常の最近の研究は、網膜内機能が保存され得ることを示している。変形例では、網膜外機能を回復するように設計された治療が成功し得る。

限定されないが、錐体光受容体及び／又は桿体光受容体を含む、網膜細胞において遺伝子を発現するための核酸、転写制御単位（ＴＣＵ）、最適化された遺伝子配列、発現構築物及びベクターが本明細書に開示される。

非改変ＫＣＶＮ２遺伝子（配列番号１２）に核酸置換を含む改変ＫＣＶＮ２遺伝子が本明細書に開示され、核酸置換は、ヒトＫＣＶＮ２遺伝子と配列番号２によって表されるコドン最適化バージョンとのアラインメントによって実証されたものの１つ又は複数であり得る。

光受容体、例えば錐体光受容体及び／又は桿体光受容体において遺伝子を発現させるための、核酸、転写制御単位（ＴＣＵ）、最適化された遺伝子配列、発現構築物及びベクターも提供される。

核酸分子、並びに核酸分子によってコードされる単離されたＫｖ８．２タンパク質を含有するベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターも提供される。

ＴＣＵの制御下にある変異体ヒトＫＣＶＮ２遺伝子（配列番号２）を含む発現構築物も提供される。変形例では、ＫＣＶＮ２は、光受容体、例えば錐体光受容体又は桿体光受容体において遺伝子を発現するために最適化されたプロモーターの制御下にある。変形例では、変異体ヒトＫＣＶＮ２遺伝子は、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター（配列番号６）の制御下にあり得る。

対応する天然ヒトＫＣＶＮ２遺伝子（配列番号１２）と比較して遺伝子発現が増加したＫＣＶＮ２遺伝子の変異体、例えば配列番号２も提供される。ＫＣＶＮ２遺伝子の変異体は、野生型と比較して平均約８倍までの遺伝子発現増加、未処置眼と比較してＥＲＧ陽性ｂ波データのより高い差及び有意な減少、並びに他の生成物によって得られたものと比較してＥＲＧ陽性ｂ波データのより高い差及び有意な減少を含む発現の改善を含む、改善された治療特性を有する。開示されたＫＣＶＮ２変異体（例えば、配列番号２）の改善された特性には、対応する天然ヒトＫＣＶＮ２遺伝子（配列番号１２）と比較した発現の増加、対応する野生型ＫＣＶＮ２遺伝子（配列番号１２）と比較した発現の増加、及び／又は対応する天然ヒトＫＣＶＮ２遺伝子（配列番号１２）と比較した薬物動態特性の改善が含まれるが、これらに限定されない。改善された特性には、転写物安定性の改善及び異常な転写物スプライシングの最小化が含まれ得る。

また、限定されないがＣＤＳＲＲを含む網膜障害又はジストロフィーを処置及び／又は予防するために、核酸、転写制御単位（ＴＣＵ）、最適化された遺伝子配列、発現構築物、及びベクターの１つ又は複数を使用する方法も開示される。

超正常桿体応答を伴うＫＣＮＶ２関連錐体ジストロフィーのためのＡＡＶ媒介遺伝子増強療法も開示される。

したがって、１つの変形例では、以下を提供する。

ＫＣＶＮ２遺伝子の発現を指示することができるプロモーター。変形例では、プロモーターは、導入遺伝子発現を光受容体に標的化する。別の変形例では、プロモーターは、発現を光受容体のみに制限する。別の変形例では、プロモーターはロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター（配列番号６）である。

光受容体において発現される配列。変形例では、本発明は、光受容体特異的に発現される配列を含む発現構築物を提供する。さらなる変形例では、発現される配列は、Ｋｖ８．２をコードする遺伝子を含む。さらなる変形例では、発現される配列は配列番号２を含む。

本開示の上記及び他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して進められるいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。

用語
特に明記しない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｌｅｗｉｎ’ｓ ｇｅｎｅｓ ＸＩＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，２０１７；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，２００９（ＩＳＢＮ ９７８０６３２０２１８２６）に見られ得る。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。「Ａ又はＢを含む」とは、Ａ、又はＢ、又はＡ及びＢを含むことを意味する。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。さらに、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が優先する。本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される。

５’及び／又は３’：核酸分子（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡなど）は、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がホスホジエステル結合を介して一方向にその隣の３’酸素に結合するように、モノヌクレオチドが反応してポリヌクレオチドを作製するので、「５’末端」及び「３’末端」を有すると言われる。したがって、線状ポリヌクレオチドの一端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合していない場合、「５’末端」と呼ばれる。ポリヌクレオチドの他端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に結合していない場合、「３’末端」と呼ばれる。１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がその隣の３’酸素に結合しているにもかかわらず、内部核酸配列は５’及び３’末端を有するとも言われ得る。

線状又は環状核酸分子のいずれにおいても、別個の内部エレメントは、「下流」又は３’エレメントの「上流」又は５’と呼ばれる。ＤＮＡに関して、この用語は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’方向に進行することを反映している。連結された遺伝子の転写を指示するプロモーター及びエンハンサーエレメントは、一般に、コード領域の５’又は上流に位置する。しかしながら、エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメント及びコード領域の３’側に位置する場合であっても、その効果を発揮することができる。転写終結シグナル及びポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’又は下流に位置する。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：ヒト及びいくつかの他の霊長類種に感染する小型の複製欠損無エンベロープウイルス。ＡＡＶは疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外状態で存続することができる。これらの特徴は、ＡＡＶを遺伝子治療のための魅力的なウイルスベクターにする。現在、１１個の認識されているＡＡＶの血清型（ＡＡＶ１～１１）がある。

投与／投与する：任意の有効な経路によって、治療剤（例えば組換えＡＡＶ）などの薬剤を対象に提供又は与えること。例示的な投与経路には、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、及び静脈内）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣及び吸入経路が含まれるが、これらに限定されない。

ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）：内部非コードセグメント（イントロン）及び転写を決定する調節配列を欠くＤＮＡ片。ｃＤＮＡは、細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡからの逆転写によって実験室で合成される。ｃＤＮＡはまた、対応するＲＮＡ分子における翻訳制御を担う非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み得る。

ＫＣＮＶ２：ヒトＫＣＮＶ２遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿１３３４９７．４；Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＥＮＳＧ０００００１６８２６３．９及び転写物ＫＣＮＶ２－２０１ ＥＮＳＴ０００００３８２０８２．４）（配列番号１）を選択導入遺伝子とした。ＫＣＮＶ２転写物は、ただ１つのスプライス変異体を有し、２つのエクソンから構成される。転写物の全長は２１７８塩基対長であり、本発明者らの研究のための塩基として使用されるコード配列（ＣＤＳ）は１６３８塩基対長である。

コドン最適化された：「コドン最適化された」核酸とは、コドンが特定の系（特定の種又は種の群など）での発現に最適であるように変更された核酸配列を指す。例えば、核酸配列は、哺乳動物細胞又は特定の哺乳動物種（ヒト細胞など）における発現のために最適化することができる。コドン最適化は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。

対照：参照標準。いくつかの実施形態では、対照は、健康な患者から得られた陰性対照試料である。他の実施形態では、対照は、ＣＤＳＲＲと診断された患者から得られた陽性対照試料である。さらに他の実施形態では、対照は、過去の対照又は標準参照値又は値の範囲（例えば、以前に試験された対照試料、例えば、既知の予後若しくは転帰を有する患者の群、又はベースライン値若しくは正常値を表す試料の群）である。

試験試料と対照との間の差は、増加又は逆に減少であり得る。差は、定性的差又は定量的差、例えば統計的有意差であり得る。いくつかの例では、差は、対照と比較して、少なくとも約５％、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、又は５００％超の増加又は減少である。

ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）：ＤＮＡは、ほとんどの生物の遺伝物質を含む長鎖ポリマーである（いくつかのウイルスは、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む遺伝子を有する）。ＤＮＡポリマー中の反復単位は４つの異なるヌクレオチドであり、その各々は、リン酸基が結合しているデオキシリボース糖に結合した４つの塩基、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）のうちの１つを含む。ヌクレオチドのトリプレット（コドンと呼ばれる）は、ポリペプチド中の各アミノ酸又は停止シグナルをコードする。コドンという用語は、ＤＮＡ配列が転写されるｍＲＮＡ中の３つのヌクレオチドの対応する（及び相補的な）配列にも使用される。

別段特定されない限り、ＤＮＡ分子に対する任意の言及は、そのＤＮＡ分子の逆相補体を含むことが意図される。本明細書の本文で一本鎖性が必要とされる場合を除いて、ＤＮＡ分子は、一本鎖のみを示すように書かれているが、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖を包含する。したがって、特定のタンパク質又はその断片をコードする核酸分子への言及は、センス鎖及びその逆相補体の両方を包含する。例えば、開示される核酸分子の逆相補配列からプローブ又はプライマーを生成することが適切である。

発現：核酸配列の転写又は翻訳。例えば、コード核酸配列（遺伝子など）は、そのＤＮＡがＲＮＡ又はＲＮＡ断片に転写され、いくつかの例ではｍＲＮＡになるようにプロセシングされる場合に発現され得る。コード核酸配列（遺伝子など）はまた、そのｍＲＮＡがタンパク質又はタンパク質断片などのアミノ酸配列に翻訳される場合に発現され得る。特定の例では、異種遺伝子は、ＲＮＡに転写されるときに発現される。別の例では、異種遺伝子は、そのＲＮＡがアミノ酸配列に翻訳されるときに発現される。発現の調節には、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送及びプロセシング、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解、又は産生された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、区画化若しくは分解による制御が含まれ得る。

発現制御配列：作動可能に連結されている異種核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列は、発現制御配列が核酸配列の転写及び必要に応じて翻訳を制御及び調節する場合、核酸配列に作動可能に連結されている。したがって、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（ＡＴＧ）、イントロンのスプライスシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、及び終止コドンを含み得る。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現に影響を及ぼし得る成分を含むことを意図しており、その存在が有利である追加の成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列も含み得る。発現制御配列はプロモーターを含むことができる。

遺伝子：ｍＲＮＡであろうとなかろうとＲＮＡの転写に必要な制御配列及びコード配列を含む核酸配列、典型的にはＤＮＡ配列。例えば、遺伝子は、プロモーター、１つ又は複数のエンハンサー又はサイレンサー、ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードする核酸配列、下流調節配列、並びにおそらくｍＲＮＡの発現の調節に関与する他の核酸配列を含み得る。

当技術分野で周知のように、ほとんどの真核生物遺伝子は、エクソン及びイントロンの両方を含有する。「エクソン」という用語は、成熟ｍＲＮＡ転写物への連続配列の寄与が生物情報学的に予測及び／又は実験的に確認された、ゲノムＤＮＡに見られる核酸配列を指す。「イントロン」という用語は、成熟ｍＲＮＡ転写物に寄与せず、むしろ転写物のプロセシング中に「スプライシングされる」と予測及び／又は確認された、ゲノムＤＮＡに見られる核酸配列を指す。

遺伝子治療：１つ又は複数のレシピエント細胞への異種核酸分子の導入であって、レシピエント細胞における異種核酸の発現が細胞の機能に影響を及ぼし、対象において治療効果をもたらすものである。例えば、異種核酸分子は、レシピエント細胞の機能に影響を及ぼすタンパク質をコードし得る。

ハイブリダイゼーション：本明細書で提供される核酸配列と特定レベルの同一性を有する核酸を特徴づけるためのハイブリダイゼーションアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照のこと。本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェント又は非ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに関し得る。当該ハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２００１）ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９）ｌｏｃ．ｃｉｔ．，ｏｒ Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ（Ｅｄｓ．）「Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，（１９８５）に記載されている従来のプロトコルに従って確立され得る。条件の設定は十分に当業者の技術の範囲内であり、当技術分野に記載されたプロトコルに従って決定することができる。したがって、ハイブリダイズ配列の検出は、通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件、例えば、６５℃での０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、又は２×ＳＳＣ、６０℃、０．１％ ＳＤＳから、例えば、６５℃での６×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳまでの範囲の条件を必要とする。周知のように、プローブの長さ及び決定される核酸の組成は、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメータを構成する。

単離された：「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸分子、タンパク質、ウイルス又は細胞）は、その構成要素が天然に存在する生物の細胞若しくは組織又は生物自体中の他の生物学的構成要素、例えば他の染色体及び染色体外のＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質及び細胞から実質的に分離又は精製されている。「単離された」核酸分子及びタンパク質には、標準的な精製方法によって精製されたものが含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸分子及びタンパク質、並びに化学合成された核酸分子及びタンパク質も包含する。

核酸分子：ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、並びに上記の合成形態及び混合ポリマーのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含み得るヌクレオチドのポリマー形態。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの改変形態を指す。本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、特に明記しない限り、通常、少なくとも１０塩基長である。この用語は、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド結合及び／又は天然に存在しないヌクレオチド結合によって一緒に連結された天然に存在するヌクレオチド及び改変ヌクレオチドのいずれか又は両方を含み得る。「ｃＤＮＡ」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態でｍＲＮＡと相補的又は同一であるＤＮＡを指す。「コードする」とは、定義されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして働く、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、並びにそれから生じる生物学的特性を指す。

作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、同じ読み枠内にある。

薬学的に許容され得る担体：使用の薬学的に許容され得る担体は従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２^ｎｄ ｅｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１３には、開示のベクターの医薬送達に適した組成物及び製剤が記載されている。

一般に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的及び生理学的に許容され得る流体をビヒクルとして含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤又はカプセル剤の形態）の場合、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン又はステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物（ベクター組成物など）は、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートなどの少量の非毒性補助物質を含有することができる。特定の実施形態では、対象への投与に適した担体は、滅菌されていてもよく、及び／又は所望の免疫応答を誘導するのに適した組成物の１又は複数の測定された用量を含有する単位剤形に懸濁されていてもよく、そうでなければ含有されていてもよい。それはまた、処置目的で使用するための薬物を伴うことができる。単位剤形は、例えば、滅菌内容物を含有する密封バイアル、又は対象に注射するためのシリンジであってもよく、又はその後の可溶化及び投与のために凍結乾燥されてもよく、又は固体若しくは制御放出投与量であってもよい。

精製：精製されたという用語は、絶対純度を必要としない；むしろ、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製されたタンパク質調製物は、タンパク質（ＫＣＶＮ２タンパク質など）が、細胞内のその天然環境にあるペプチド又はタンパク質よりも濃縮されているものである。一実施形態では、タンパク質が調製物の総タンパク質含有量の少なくとも５０％を占めるように調製物を精製する。

ポリペプチド：長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）にかかわらず、アミノ酸の任意の鎖。「ポリペプチド」は、天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーを含むアミノ酸ポリマー、並びに１つ又は複数のアミノ酸残基が非天然アミノ酸、例えば対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマーに適用される。「残基」は、アミド結合又はアミド結合模倣物によってポリペプチドに組み込まれたアミノ酸又はアミノ酸模倣物を指す。ポリペプチドは、アミノ末端（Ｎ末端）及びカルボキシ末端（Ｃ末端）を有する。「ポリペプチド」は、ペプチド又はタンパク質と交換可能に使用され、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーを指すために使用される。

疾患の予防、処置又は改善：疾患（網膜障害など）を「予防する」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置する」とは、疾患又は病的症状が発症し始めた後にその徴候又は症候を改善する治療的介入を指す。「改善する」とは、疾患の徴候又は症候の数又は重症度の減少を指す。

プロモーター：核酸（例えば、遺伝子）の転写を指示／開始するＤＮＡの領域。プロモーターは、転写の開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。典型的には、プロモーターは、それらが転写する遺伝子の近くに位置する。プロモーターはまた、場合により、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位のエンハンサー又はリプレッサーエレメントを含む。組織特異的プロモーターは、主に単一のタイプの組織又は細胞において転写を指示／開始するプロモーターである。例えば、光受容体特異的プロモーターは、他の細胞型よりも実質的に大きな程度まで光受容体細胞における転写を指示／開始するプロモーターである。

タンパク質：遺伝子又は他のコード核酸（例えば、ｃＤＮＡ）によって発現され、アミノ酸から構成される生物学的分子。

精製：「精製された」という用語は、絶対純度を必要としない；むしろ、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス又は他の活性化合物は、天然に関連するタンパク質及び他の汚染物質から全体的又は部分的に単離されたものである。特定の実施形態では、「実質的に精製された」という用語は、細胞、細胞培養培地又は他の粗調製物から単離され、タンパク質、細胞残屑及び他の成分などの初期調製物の様々な成分を除去するために分画に供されたペプチド、タンパク質、ウイルス又は他の活性化合物を指す。

組換え：組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するもの、例えば、１つ又は複数の核酸の置換、欠失又は挿入を含むもの、及び／又は、そうでなければ分離された２つの配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、又はより一般的には、例えば遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって達成することができる。

組換えウイルスは、組換え核酸分子を含むゲノムを含むウイルスである。本明細書で使用される場合、「組換えＡＡＶ」は、組換え核酸分子（例えば、Ｋｖ８．２をコードする組換え核酸分子）がパッケージングされているＡＡＶ粒子を指す。

組換えタンパク質は、天然に存在しない配列を有するか、そうでなければ分離された２つの配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有するものである。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、細菌若しくは真核細胞などの宿主細胞、又は組換えウイルスのゲノムに導入された異種（例えば、組換え）核酸によってコードされる。

網膜：網膜は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞層及び３層の神経感覚細胞；すなわち、（外から内へ）外顆粒層（桿体及び１５個の錐体光受容体細胞を含有する）、内顆粒層（双極細胞を含有する）、及び神経節細胞層から構成される。網膜障害又はジストロフィーは、光受容体細胞の進行性喪失及び付随する視力喪失を特徴とする網膜の疾患として定義することができる。網膜障害又はジストロフィーは、遺伝性網膜障害又はジストロフィーであり得る。

配列同一性：２つ以上の核酸配列又は２つ以上のアミノ酸配列間の同一性又は類似性は、配列間の同一性又は類似性に関して表される。配列同一性は、同一性パーセントに関して測定することができる。パーセンテージが高いほど、配列はより同一である。配列類似性は、（保存的アミノ酸置換を考慮に入れた）類似性パーセントに関して測定することができる。パーセンテージが高いほど、配列はより類似している。核酸又はアミノ酸配列のホモログ又はオルソログは、標準的な方法を使用してアライメントした場合、比較的高度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、オーソロガスタンパク質又はｃＤＮＡが、より遠縁の種（例えば、ヒト及びＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）配列）と比較して、より近縁の種（ヒト及びマウス配列など）に由来する場合に、より有意である。

比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムはＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７－４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１－９０，１９８８；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ．ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８，１５５－６５，１９９２；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７－３１，１９９４．Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０に記載されており、配列アラインメント方法及び相同性計算の詳細な考察が提示されている。

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及びインターネットを含むいくつかの情報源から入手可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトで見つけることができる。

本明細書で使用される場合、「少なくとも９０％の同一性」との言及は、特定の参照配列への「少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はさらには１００％の同一性」を指す。

対象：生きている多細胞脊椎動物生物、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含むカテゴリー。

治療有効量：障害又は疾患の症候及び／又は根本原因を予防、処置（予防を含む）、低減及び／又は改善する、例えば網膜障害を予防、阻害及び／又は処置するのに十分な、ＫＣＶＮ２をコードする開示された組換えＡＡＶベクターなどの薬剤の量。例えば、これは、光受容体機能を回復させるのに十分な量のＫＣＶＮ２を産生する、本明細書に記載の新規ＫＣＶＮ２遺伝子をコードする組換えＡＡＶベクターの量であり得る。

一例では、所望の応答は、例えば網膜電図（ＥＲＧ）記録によって測定されるように、対象（ＣＤＳＲＲを有する対象など）の光受容体機能を回復することである。ＥＲＧ記録（Ａ波、ｂ波、ｃ波）は、この方法が有効であるために、ＣＤＳＲＲを有さない正常な健康な対象のＥＲＧ記録に完全に回復する必要はない。例えば、本明細書に開示されるベクター（ＫＣＶＮ２をコードするベクターなど）の治療有効量の投与は、適切な対照と比較して、所望の量、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも１００％又はそれよりも多く、明所性又は暗所性ＥＲＧ ｂ波を増加させることができる。

疾患又は症状に対する治療応答を得るためには、治療剤の複数回投与が必要であり得ることが理解される。したがって、治療有効量は、患者において治療結果を達成するための前又は後の投与と組み合わせて寄与する部分用量を包含する。例えば、治療有効量の薬剤を、処置の経過中に単回用量で、又は数回用量で、例えば毎日投与することができる。しかしながら、治療有効量は、処置される対象、処置される症状の重症度及びタイプ、並びに投与様式に依存し得る。薬剤の単位剤形は、治療量で、又は治療量の倍数で、例えば滅菌成分を有するバイアル（例えば、穿刺可能な蓋を有する）又はシリンジに包装することができる。

ベクター：ベクターは、宿主細胞内で複製及び／又は組込みするベクターの能力を破壊することなく外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、複製起点などの宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、１つ又は複数の選択マーカー遺伝子及び他の遺伝要素を含み得る。発現ベクターは、挿入された１つ又は複数の遺伝子の転写及び翻訳を可能にするために必要な調節配列を含むベクターである。本明細書のいくつかの実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはガンマ－レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターである。

新規ＫＣＶＮ２遺伝子
配列番号２として示されるヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の核酸配列を含むＫｖ８．２活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。

配列番号２として示されるヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の核酸配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子が提供される。

配列番号２として示されるヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一の核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重する核酸分子が提供される。

実施例１で論じるように、Ｋｖ８．２をコードするヌクレオチド配列を、発現を改善するためにコドン最適化した。例示的な最適化されたＫＣＶＮ２配列は、配列番号２として提供される。

対応する天然ヒトＫＣＶＮ２と比較して発現が増加したＫＣＶＮ２遺伝子の変異体を本明細書に開示する。配列番号２は、配列番号１として開示されるヒト野生型ＫＣＶＮ２遺伝子、配列番号１２に開示されるコード領域を含む非改変ＫＣＶＮ２遺伝子と比較して、改善された光受容体治療特性を含む改善された治療特性を有する。開示されたＫＣＶＮ２変異体の改善された特性には、タンパク質合成の増加、より安定なｍＲＮＡ、翻訳伸長率の増加、及び／又は改善された薬物動態特性が含まれるが、これらに限定されない。改善された特性には、安定した導入遺伝子及びタンパク質発現、回復の向上、及び視覚機能の改善が含まれ得る。

ＫＣＶＮ２ポリヌクレオチドの変異体は、核酸配列中の天然に存在する変異体を含む、配列番号２の任意の変異体として定義され得る。変異体は、配列番号２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有すると定義され得、変異体配列から翻訳されたポリペプチドはその機能性を保持する。変異体は、配列番号２と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有すると定義することができ、変異体配列、配列番号１１から翻訳されたポリペプチドは、光受容体機能をレスキューする能力を有する。特定の変形例では、変異体は、コード配列のコドン最適化バージョンである。

本開示によって企図される発現構築物は、錐体光受容体機能をレスキューし得る。円錐形光受容体機能をレスキューすることは、錐体光受容体機能の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％ ９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を回復させることと定義することができる。錐体光受容体機能は、当業者に公知の任意の適切な標準的な技術によって、例えば網膜応答の網膜電図（ＥＲＧ）分析によって分析することができる。桿体光受容体機能は、当業者に公知の任意の適切な標準的な技術によって、例えば網膜応答のＥＲＧ分析によって分析することができる。

感光体機能をレスキューすることは、光受容体の生存を延ばすことと定義することもできる。光受容体の生存を延ばすことは、光受容体（例えば、錐体光受容体及び／又は桿体光受容体）が機能的であるか又は存在する時間を、ジストロフィーに冒された光受容体と比較した場合、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％又は１００％超延ばすことと定義することができる。光受容体生存の延長の例には、ＥＲＧ活性の改善又はＥＲＧ活性の喪失の遅延、網膜感度の改善又は網膜感度の進行性喪失の遅延／停止、光受容体細胞の喪失の遅延又は停止、網膜外層の菲薄化の遅延又は停止、視力の改善又は視力喪失の遅延／停止も含まれる。

発現構築物は、ＫＣＶＮ２遺伝子に作動可能に連結された１つ又は複数の転写制御単位を含み得る。変形例では、ＫＣＶＮ２遺伝子は配列番号２である。いくつかの変形例では、ＫＣＶＮ２遺伝子はコドン最適化されている。

したがって、Ｋｖ８．２をコードする核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ分子）並びにＫｖ８．２の精製形態が提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、Ｋｖ８．２を産生するために宿主細胞（哺乳動物細胞など）で発現され得る。

遺伝暗号は、配列が異なるが同じポリペプチド配列をコードする核酸などの様々な機能的に等価な核酸配列を構築するために使用することができる。

本明細書に開示される核酸分子は、例えば、適切な配列のクローニングを含む任意の適切な方法によって、又は標準的な方法による直接的な化学合成によって調製することができる。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、又は一本鎖を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼとの重合によって二本鎖ＤＮＡに変換することができる。

例示的な核酸は、クローニング技術によって調製することができる。適切なクローニング及びシーケンシング技術の例は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４^ｔｈ ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，２０１７）に見出すことができる。

核酸は、増幅方法によって調製することもできる。増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）、及び自立配列複製システム（３ＳＲ）が含まれる。

核酸分子は、細菌、植物、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞などの組換え操作された細胞で発現させることができる。本明細書に開示されるＤＮＡ配列は、適切な宿主細胞へのＤＮＡ移入によってインビトロで発現させることができる。細胞は、原核生物又は真核生物であり得る。大腸菌、他の細菌宿主、酵母、並びにＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及び骨髄腫細胞株などの様々な高等真核細胞を含むタンパク質の発現に利用可能な多数の発現系を使用して、開示された新規ヌクレオチド配列を発現させることができる。外来ＤＮＡが宿主内で連続的に維持されることを意味する安定な移入の方法は、当技術分野で公知である。

開示される核酸の発現は、ＤＮＡ又はｃＤＮＡをプロモーター（構成的又は誘導性のいずれか）に作動可能に連結し、続いて発現カセットに組み込むことによって達成することができる。プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター（配列番号６）などの光受容体特異的プロモーターを含む、目的の任意のプロモーターであり得る。他の例示的なプロモーターとしては、ＣＡＧ（ハイブリッドＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリｂ－アクチンプロモーター）、ＣＢＡ（ニワトリｂ－アクチンプロモーター）、ＣＢｈ（ＣＢＡプロモーターのハイブリッド形態）、ＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルスプロモーター）、ＣＢ（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期エンハンサー、第１のイントロン／エクソン接合部を有するニワトリｂ－アクチンプロモーター、ハイブリッドニワトリｂ－アクチン及びウサギｂ－グロブリンイントロン／エクソン接合部から構成される調節エレメント）、ＣＢＳＢ（ＣＢプロモーターよりも短いＣＭＶ即時エンハンサー配列を含む）、ＧＲＫ１（ヒトＧタンパク質共役受容体キナーゼ１プロモーター）、ｐＲＬＢＰ１（短縮型ヒトレチナールアルデヒド結合タンパク質１（ＲＬＢＰ１）プロモーター、ｈＣＡＲ（ヒト錐体アレスチンプロモーター、ＰＲＩ．７及びＰＲ２．１（ヒトＬ－オプシンプロモーターのバージョン）、ＩＲＢＰ（ヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質エンハンサー）、ＲＳ／ＩＲＢＰ（ヒトレチノシシン近位プロモーターとヒト光受容体間結合タンパク質エンハンサーの組み合わせ）、ｐＲＨＯ（ロドプシンプロモーター）、及びｈＰＤＥ６ｂ（短いヒトホスホジエステラーゼ６ｂプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。

場合により、調節エレメント、例えば、ＫＯＺＡＫコンセンサス配列（配列番号８）、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号９）のいずれか１つ又は複数など；及び／又はウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨポリ（Ａ））（配列番号１０）が構築物に含まれる。カセットは、原核生物又は真核生物のいずれかにおける複製及び組込みに適し得る。典型的な発現カセットは、タンパク質をコードするＤＮＡの発現の調節に有用な特定の配列を含む。例えば、発現カセットは、適切なプロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするその遺伝子の正しいリーディングフレームを維持するための配列、及び終止コドンを含み得る。ベクターは、薬物耐性（例えば、アンピシリン耐性又はテトラサイクリン耐性）をコードするマーカーなどの選択マーカーをコードすることができる。

クローニングされた遺伝子の高レベルの発現を得るためには、例えば、転写を指示する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位（例えば、内部リボソーム結合配列）及び転写／翻訳ターミネーターを含む発現カセットを構築することが望ましい。大腸菌の場合、これは、Ｔ７、ｔｒｐ、ｌａｃ又はラムダプロモーターなどのプロモーター、リボソーム結合部位、及び好ましくは転写終結シグナルを含み得る。真核細胞の場合、制御配列は、例えば免疫グロブリン遺伝子、ＨＴＬＶ、ＳＶ４０又はサイトメガロウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサー、並びにポリアデニル化配列を含むことができ、スプライスドナー及び／又はアクセプター配列（例えば、ＣＭＶ及び／又はＨＴＬＶスプライスアクセプター及びドナー配列）をさらに含むことができる。カセットは、大腸菌のための形質転換又はエレクトロポレーション及び哺乳動物細胞のためのリン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション又はリポフェクションなどの周知の方法によって、選択された宿主細胞に移入され得る。カセットによって形質転換された細胞は、ａｍｐ、ＧＰｔ、ｎｅｏ及びｈｙｇ遺伝子などのカセットに含まれる遺伝子によって付与される抗生物質に対する耐性によって選択することができる。

本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸を、その生物学的活性を低下させることなく改変することができる。標的化分子のクローニング、発現、又は融合タンパク質への組み込みを容易にするために、いくつかの改変を行うことができる。そのような改変には、例えば、終止コドン、好都合に位置する制限部位を作り出すための配列、及び開始部位を提供するためにアミノ末端にメチオニンを付加するための配列、又は精製工程を助けるための追加のアミノ酸（ポリＨｉｓなど）が含まれる。

発現されると、開示されたＫｖ８．２は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィーなどを含む当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（一般に、Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｂａｓｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００９を参照のこと）。開示されるポリペプチドは、１００％純粋である必要はない。所望により部分的に又は均一に精製されたら、治療的に使用する場合、ポリペプチドはエンドトキシンを実質的に含まないべきである。

組換えベクター及び遺伝子治療用途
現在の実務において、遺伝子治療は、機能性タンパク質が産生されていない機能不全遺伝子を、機能を回復させる野生型コピーで機能的に置換することを意味する。遺伝子治療は、網膜の遺伝性及び一般的な複合障害の処置における有望なアプローチであり、前臨床及び臨床研究は、安全で効率的な遺伝子送達ビヒクルとしてのアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の使用を検証している。ＡＡＶ媒介遺伝子置換療法は、肝臓、筋肉、血球及び網膜を含む様々な組織及び系で達成されている。

遺伝性光受容体変性のいくつかの動物モデルは、遺伝子補充療法による処置が成功しており、これまでに形態学的、機能的、及び行動レベルで視覚的救済が達成されている。異なる種類の遺伝性網膜障害の遺伝的欠陥を修正する手段としてＡＡＶ送達システムを使用しているか使用した、４３の進行中又は完了した臨床試験がある（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、検索は２０２０年１１月１６日に完了）。別の５つの臨床試験（３つの進行中及び２つの完了）もまた、加齢黄斑変性症のための治療薬を送達するためにＡＡＶを使用しているか又は使用した。

ＡＡＶベクターは、効率及び特異性の両方において、光受容体細胞標的化のための許容され得る送達方法であることが実証されている。ＡＡＶベクターは、光受容体細胞に対して高い親和性を有すると同時に、非毒性、非病原性及び低免疫原性プロファイルも提供することが示されている。これは、網膜障害及び視力喪失モデルへの遺伝子治療の適用の成功を実証した。現在利用可能な様々なＡＡＶ血清型の中で、網膜細胞を標的化するために最も一般的に使用されているものは、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７ｍ８、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０＿Ｌ０６５血清型であった。

上記の組換え核酸分子のいずれも、細胞又は対象における発現のためのベクター（ＡＡＶベクターなど）に含めることができる。

本明細書に開示される核酸配列は、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）の産生に有用であり、アンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクター、又はワクチンベクターにも有用である。特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される核酸配列を含む遺伝子送達ベクター及び宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、選択されたベクターは、導入遺伝子を対象に導入するために、静脈内注射、エクスビボ形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染又はプロトプラスト融合を含む任意の適切な方法によって対象に送達され得る。

特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＫＣＶＮ２核酸配列（配列番号２）を含有するウイルス粒子、例えばキャプシドに関する。ウイルス粒子、キャプシド及び組換えベクターは、標的細胞への核酸配列の送達に有用である。核酸は、様々なベクター系、キャプシド及び宿主細胞において容易に利用され得る。特定の実施形態では、核酸は、ＡＡＶキャプシドタンパク質ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３及び超可変領域を含むｃａｐタンパク質を含むキャプシド内に含まれるベクター中にある。

特定の実施形態では、ＫＣＶＮ２核酸配列は、宿主細胞に送達され得る任意の遺伝要素（ベクター）の一部、例えば裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、非ウイルス送達ビヒクル（例えば、脂質ベースの担体）中のタンパク質、担持している配列を移入するウイルスなどであり得る。

特定の実施形態では、ベクターは、例えばＶＳＶＧ若しくはＧＰ６４偽型又はその両方に由来する核酸配列を有する、レンチウイルスベースの（レンチウイルス遺伝子又は配列を含む）ベクターであり得る。特定の実施形態では、ＶＳＶＧ又はＧＰ６４偽型に由来する核酸配列は、遺伝子又は断片に対して５０、６０、７０、８０、９０、９５又は９９％を超える同一性を有する、１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０又は２５を超える連続したヌクレオチド又はヌクレオチド配列の少なくとも１つ又は２つ以上の遺伝子又は遺伝子断片であり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸及びプロモーター配列は、ＡＡＶベクターの産生に有用である。ＡＡＶはパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）及びディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に属する。ＡＡＶは、線状一本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージングする小型の無エンベロープウイルスである。ＡＡＶ ＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方が、等しい頻度でＡＡＶキャプシドにパッケージングされる。ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に隣接する２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を特徴とする。ＡＡＶ２ゲノムでは、例えば、ＩＴＲの最初の１２５ヌクレオチドは回文であり、それ自体が折り畳まれて塩基対合を最大化し、Ｔ字形ヘアピン構造を形成する。Ｄ配列と呼ばれるＩＴＲの他の２０塩基は、対を形成しないままである。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＤＮＡ複製に重要なシス作用性配列である；ＩＴＲは複製起点であり、ＤＮＡポリメラーゼによる第２鎖合成のためのプライマーとして働く。この合成中に形成される二本鎖ＤＮＡは、複製型モノマーと呼ばれ、第２ラウンドの自己プライミング複製に使用され、複製型二量体を形成する。これらの二本鎖中間体は、鎖置換機構を介してプロセシングされ、パッケージングに使用される一本鎖ＤＮＡ及び転写に使用される二本鎖ＤＮＡをもたらす。ＩＴＲ内には、Ｒｅｐ結合エレメント及び末端解離部位（ＴＲＳ）が位置している。これらの特徴は、二本鎖中間体を処理するためにＡＡＶ複製中にウイルス調節タンパク質Ｒｅｐによって使用される。ＡＡＶ複製におけるそれらの役割に加えて、ＩＴＲはまた、ＡＡＶゲノムパッケージング、転写、非許容条件下での負の調節、及び部位特異的インテグレーションにも不可欠である（Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１（４）：５８３－５９３，２００８）。

ＡＡＶベクターは、典型的には、ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子を置換するＩＴＲ間に導入遺伝子発現カセットを含む。ベクター粒子は、ベクターゲノムを含有するプラスミドと、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をトランスで発現するパッケージング／ヘルパー構築物とを細胞に同時トランスフェクションすることによって産生される。感染中、ＡＡＶベクターゲノムは細胞核に入り、複数の分子状態で存続することができる。１つの一般的な結果は、第２鎖合成又は相補鎖対合によるＡＡＶゲノムの二本鎖環状エピソームへの変換である。

ＡＡＶベクターとの関連において、開示されるベクターは、典型的には、以下の構造を含む組換えゲノムを有する：
（５’ＡＡＶ ＩＴＲ）－（プロモーター）－（導入遺伝子）－（３’ＡＡＶ ＩＴＲ）

上記のように、これらの組換えＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子を置換するＩＴＲ間に導入遺伝子発現カセットを含む。ベクター粒子は、例えば、組換えベクターゲノムを含有するプラスミドと、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をトランスで発現するパッケージング／ヘルパー構築物とを細胞に同時トランスフェクションすることによって産生される。

導入遺伝子は、５’Ｋｏｚａｋ配列及び／又は３’ポリアデニル化シグナルなどの調節配列に隣接することができる。

ＡＡＶ ＩＴＲ、及び本明細書に記載の他の選択されたＡＡＶ成分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２－ＱｕａｄｙＦ、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ９、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ２．ＧＬ、ＡＡＶ２．ＮＮ、ＡＡＶＡｎｃ８０＿Ｌ０６５、及びそれらのいずれかの機能変異体を含むがこれらに限定されない任意のＡＡＶ血清型の中から容易に選択され得る。これらのＩＴＲ又は他のＡＡＶ成分は、ＡＡＶ血清型から当業者に利用可能な技術を使用して容易に単離され得る。そのようなＡＡＶは、学術的、商業的、又は公的な情報源（例えば、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から単離又は取得することができる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献又はデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなど）で入手可能な公開配列を参照することによって、合成又は他の適切な手段によって得ることができる。本開示は、まだ同定又は特徴付けされていない他の血清型のＡＡＶゲノムの使用も包含することが理解されよう。

いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶベクターゲノムは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）又はその任意の改変などの光受容体特異的プロモーターを有することができる。組換えＡＡＶベクターゲノムは、本明細書に開示されているもの及び／又はＫａｎｅｓｈｉｒｏ，Ｋ．，Ｗｕ，Ｚ．，Ｌｉ，Ｔ．，Ｓｉｅｖｉｎｇ，Ｐ．，＆Ｃｏｌｏｓｉ，Ｐ．（２０１１）．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ＡＡＶ８ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５２（１４），４９１に開示されているものを含む当技術分野で公知の任意のプロモーターを有することができる。

ＡＡＶは現在、遺伝子治療に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。ＡＡＶはヒト及びいくつかの他の霊長類種に感染するが、疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外状態で存続する。ＡＡＶの有利な特徴のために、本開示は、本明細書に開示される組換え核酸分子及び方法のためのＡＡＶの使用を企図する。

ＡＡＶは、標的細胞に結合して入る能力、核に入る能力、長期間核内で発現される能力、及び低い毒性を含む、遺伝子治療ベクターのためのいくつかの望ましい特徴を有する。しかし、ＡＡＶゲノムのサイズが小さいと、組み込むことができる異種ＤＮＡのサイズが制限される。この問題を最小限に抑えるために、Ｒｅｐ及び組込み効率エレメント（ＩＥＥ）をコードしないＡＡＶベクターが構築されている。ＩＴＲは、パッケージングに必要なシスシグナルであるので保持される（Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１（４）：５８３－５９３，２００８）。

遺伝子治療に適したｒＡＡＶを産生する方法は公知であり（例えば、米国特許出願番号２０１２／０１００６０６；２０１２／０１３５５１５；２０１１／０２２９９７１；及び２０１３／００７２５４８；並びにＧｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３（４）：３２１－３２９，２００６を参照）、本明細書に開示される組換え核酸分子及び方法と共に利用することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸は、発現カセット又は導入遺伝子の一部である。例えば、米国特許出願公開第２０１５０１３９９５３号を参照のこと。発現カセットは、導入遺伝子及び調節配列、例えばプロモーター並びに５’及び３’ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）から構成される。１つの望ましい実施形態では、ＡＡＶ血清型２又は８のＩＴＲが使用される。しかしながら、他の適切な血清型からのＩＴＲが選択され得る。発現カセットは、典型的にはキャプシドタンパク質にパッケージングされ、選択された宿主細胞に送達される。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＡＶ血清型キャプシド又はその一部を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生成する方法を提供する。そのような方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型キャプシドタンパク質をコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）及び導入遺伝子から構成される発現カセット；ＡＡＶキャプシドタンパク質への発現カセットのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。例えば、米国特許出願公開第２０１５０１３９９５３号を参照のこと。

いくつかの実施形態では、本開示は、導入遺伝子と作動可能に組み合わせた光受容体特異的プロモーター核酸配列を含む組換えベクターに関する。導入遺伝子は、本明細書に開示されるＫｖ８．２をコードする導入遺伝子に隣接するベクター配列とは異種の核酸配列であり、場合により１つ又は複数の追加の目的のタンパク質である。核酸コード配列は、宿主細胞における導入遺伝子の転写、翻訳及び／又は発現を可能にする様式で調節成分に作動可能に連結される。

発現カセットは、宿主細胞に送達される任意の適切なベクター、例えばプラスミド上に担持され得る。本開示において有用なプラスミドは、それらが原核細胞、哺乳動物細胞又はその両方における複製及び場合により組込みに適しているように操作され得る。これらのプラスミド（又は５’ＡＡＶ ＩＴＲ－異種分子－３’ＩＴＲを保有する他のベクター）は、真核生物及び／又は原核生物における発現カセットの複製を可能にする配列並びにこれらの系の選択マーカーを含有する。好ましくは、発現カセットを担持する分子は、一過性に存在し得る細胞にトランスフェクトされる。あるいは、発現カセット（５’ＡＡＶ ＩＴＲ－異種分子－３’ＩＴＲを担持する）は、染色体として、又はエピソームとして、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。特定の実施形態では、発現カセットは、複数のコピーで存在してもよく、場合により、ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ、ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ、又はｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌコンカテマーで存在してもよい。適切なトランスフェクション技術は公知であり、発現カセットを宿主細胞に送達するために容易に利用することができる。

一般に、発現カセットを含むベクターをトランスフェクションによって送達する場合、選択されたベクター、送達方法及び選択された宿主細胞などの因子を考慮して、ベクター及び宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量を調整することができる。発現カセットに加えて、宿主細胞は、宿主細胞におけるＡＡＶキャプシドタンパク質の発現を駆動する配列、及び発現カセットに見られるＡＡＶ ＩＴＲの血清型と同じ血清型、又は交差相補的血清型のｒｅｐ配列を含む。ｒｅｐ及びｃａｐを提供する分子（複数可）は、一時的に（すなわち、トランスフェクションを介して）宿主細胞に存在し得るが、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質の一方又は両方、並びにそれらの発現を制御するプロモーター（複数可）は、宿主細胞において、例えばエピソームとして、又は宿主細胞の染色体への組み込みによって安定に発現されることが好ましい。

ベクターの宿主細胞への導入は、当技術分野で公知の又は上に開示されるような任意の手段によって達成され得、とりわけ、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合が挙げられる。アデノウイルス遺伝子の１つ又は複数は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ得るか、エピソームとして安定に発現され得るか、又は一過性に発現され得る。遺伝子産物はすべて、エピソーム上で一過性に発現され得るか、又は安定に組み込まれ得るか、又は遺伝子産物の一部は安定に発現され得るが他は一過性に発現され得る。さらに、各アデノウイルス遺伝子のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は天然のアデノウイルスプロモーターから独立して選択され得る。プロモーターは、例えば、生物又は細胞の特定の生理学的状態によって（すなわち、分化状態によって、又は複製細胞若しくは静止細胞において）、又は外因的に添加された因子によって調節され得る。

ＡＡＶ技術は、インビトロ、エクスビボ又はインビボ遺伝子送達のためのこれら及び他のウイルスベクターシステムでの使用に適合させることができる。ある特定の実施形態では、本開示は、様々なｒＡＡＶ及び非ｒＡＡＶベクター系における本明細書中に開示される核酸及びベクターの使用を意図する。そのようなベクター系には、例えば、とりわけ、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス及びアデノウイルス系が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるウイルス粒子、核酸及びベクターは、治療用タンパク質の遺伝子発現のための治療用分子の送達を含む様々な目的に有用であると考えられる。

本明細書で報告される核酸（例えば、プロモーターと組み合わせて作動可能である）によってコードされる治療用タンパク質には、網膜障害の処置に使用されるものが含まれる。

いくつかの実施形態では、ＣＤＳＲＲを有する対象の網膜機能を回復させる方法が開示される。この方法は、本明細書に記載のＫＣＶＮ２核酸配列を含む治療有効量のベクター（ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターなど）を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、網膜障害（例えば、ＣＤＳＲＲなど）を有する対象である。

変形例では、本発明者らは、いくつかの他の既知のキャプシドと比較して最大１００倍高い形質導入能力を有することが示されたＡＡＶ２／８血清型の新規ＫＣＶＮ２遺伝子を送達する。網膜では、ＡＡＶ２／８は、ＡＡＶ２／２及びＡＡＶ２／５と比較してより効率的なベクターであることが示されている。それは、特に光受容体において、より速い発現及びより強力でより高い導入遺伝子発現の両方を提供した。

いくつかの実施形態では、本開示は、コドン最適化ヒトＫＣＶＮ２（カリウム電位依存性チャネル修飾因子サブファミリーＶメンバー２）を有するアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ２／８）ベクターを使用したＣＤＳＲＲの処置のための遺伝子導入の方法に関する。さらなる変形例では、本開示は、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターの発現下でコドン最適化ヒトＫＣＶＮ２を有するアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ２／８）ベクターを使用したＣＤＳＲＲの処置のための遺伝子導入の方法に関する。このベクターは、本明細書ではＡＡＶ２／８．ＲＫ．ｈＫＣＶＮ２と呼ばれることがある。

導入遺伝子をコードするベクターの送達は、例えば対象への直接投与によるもの、例えばベクターの網膜下注射によるものであり得る。さらなる例では、ベクターの送達は、例えば、任意の疾患ステージの患者の片眼又は両眼への黄斑及び／又は中心窩領域へのベクターの注射によるものであり得る。

さらなる変形例では、導入遺伝子をコードするベクターの送達は、例えば対象への直接投与によるもの、例えばベクターの網膜下注射によるものであり得る。さらなる例では、ベクターの送達は、例えば、任意の疾患ステージの患者の片眼又は両眼への黄斑及び／又は中心窩領域へのベクターの注射によるものであり得る。この変形例では、ＡＡＶ２／８．ＲＫ．ｈＫＣＶＮ２は、プルロニック（登録商標）Ｆ６８（０．００１％）、０．１０ｍｌ、５Ｅ９～５Ｅ１１ベクターゲノムの用量範囲を有する中性リン酸緩衝生理食塩水で送達され得る。

一般に、送達は、本明細書に開示されるように、注射によるベクターなどの核酸の直接網膜、網膜下又は硝子体内送達によるものであり得る。一例では、送達は、網膜、網膜下腔又は硝子体内腔への注射によるものであり得る。

したがって、本発明者らはまた、ジストロフィー、特にＣＤＳＲＲを、必要とする患者において処置又は予防する方法であって、治療有効量の本明細書に開示されるベクターなどの核酸を直接網膜、網膜下又は硝子体内注射によって患者に投与することを含む方法を提供する。

関連する態様では、本発明は、直接網膜、網膜下又は硝子体内注射によって患者にベクターを投与することによって、ジストロフィー、特にＣＤＳＲＲなどの網膜障害を処置又は予防する方法における、本明細書に開示されるベクターなどの核酸の使用を提供する。

さらに、本発明者らは、直接網膜、網膜下又は硝子体内注射による、ジストロフィー、特にＣＤＳＲＲなどの網膜障害を処置又は予防するための医薬品の製造における、本明細書に開示されるベクターなどの核酸の使用を提供する。

本発明はまた、網膜障害、ジストロフィー、特にＣＤＳＲＲの処置に使用するための本明細書に開示されるベクターなどの核酸を提供し、当該ベクターは網膜、網膜下腔又は硝子体内腔に直接投与される。

本明細書に開示されるベクターなどの核酸の投与は、典型的には直接網膜注射又は網膜下注射によるものである。これには、錐体光受容体細胞及び／又は桿体光受容体細胞への直接送達が含まれる。

場合により、本開示の組成物は、他の薬学的に許容され得る賦形剤、例えば防腐剤又は化学的安定剤を含有し得る。適切な例示的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールが含まれる。適切な化学的安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。

組換えウイルス粒子、キャプシド又はベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、過度の有害作用なしに、又は医学的に許容され得る生理学的効果とともに治療上の利益を提供するのに十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供し、これは当業者によって決定され得る。従来の及び薬学的に許容され得る投与経路には、所望の器官（例えば、眼）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内及び他の親の（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与経路が含まれるが、これらに限定されない。所望であれば、投与経路を組み合わせてもよい。

組換えウイルス粒子、キャプシド又はベクターの投与量は、主に、処置される症状、患者の年齢、体重及び健康状態などの要因に依存し、したがって患者によって異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療有効ヒト投与量は、一般に、約１ｘ１０^９～１ｘ１０^１６ゲノムウイルスベクターの濃度を含む約０．１ｍｌ～約１００ｍｌの溶液の範囲である。

本開示の組換えウイルスベクターは、生物がタンパク質に対する中和抗体を有する場合であっても、選択されたタンパク質をインビボ又はエクスビボで選択された宿主細胞に送達することができる効率的な遺伝子導入ビヒクルを提供する。１つの実施形態において、本明細書中に開示されるベクター及び細胞は、エクスビボで混合され；感染細胞は、従来の方法を用いて培養され；形質導入された細胞は患者に再注入される。

図１を参照すると、開示されたベクトルが示されている。配列番号２の開示されたコドン最適化ＫＣＶＮ２遺伝子を送達するためのベクターは、以下のエレメントの１つ又は複数を有し得る。
血清型ＡＡＶ２／８のベクター
ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター（配列番号６）
配列番号２のコドン最適化ＫＣＶＮ２遺伝子

調節エレメントには、プロモーターとＫＣＮＶ２遺伝子との間のＫＯＺＡＫコンセンサス配列（配列番号８）、ＫＣＮＶ２遺伝子後のウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号９）及びＷＰＲＥ下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨポリ（Ａ））（配列番号１０）シグナルが含まれる。開示されるベクターは、配列番号３のヌクレオチド配列を有し得る。

図２を参照すると、第２の開示されたベクトルが示されている。配列番号２の開示されたコドン最適化ＫＣＶＮ２遺伝子を送達するためのベクターは、以下のエレメントの１つ又は複数を有し得る。
ＡＡＶベクター
ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター（配列番号６）
配列番号２のコドン最適化ＫＣＶＮ２遺伝子
ＥＧＦＰ増強緑色蛍光タンパク質

調節エレメントには、プロモーターとＫＣＮＶ２遺伝子（配列番号２）との間のＫＯＺＡＫコンセンサス配列（配列番号８）、ＫＣＮＶ２遺伝子（配列番号２）後のウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号９）及びＷＰＲＥ（配列番号９）下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨポリ（Ａ））（配列番号１０）シグナルが含まれる。

図３を参照すると、第３の開示されたベクトルが示されている。配列番号２の開示されたコドン最適化ＫＣＶＮ２遺伝子を送達するためのベクターは、以下のエレメントの１つ又は複数を有し得る。
ＡＡＶベクター
ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター（配列番号６）
配列番号２のコドン最適化ＫＣＶＮ２遺伝子
ＥＧＦＰ増強緑色蛍光タンパク質

調節エレメントには、プロモーターとＫＣＮＶ２遺伝子（配列番号２）との間のＫＯＺＡＫコンセンサス配列（配列番号８）、ＣＭＶプロモーター（配列番号７）、ＫＣＮＶ２遺伝子後のウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号９）及びＷＰＲＥ（配列番号９）下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨポリ（Ａ））シグナル（配列番号１０）が含まれる。

図４を参照すると、第４の開示されたベクトルが示されている。配列番号２の開示されたコドン最適化ＫＣＶＮ２遺伝子を送達するためのベクターは、以下のエレメントの１つ又は複数を有し得る。
ＡＡＶベクター
ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター（配列番号６）
配列番号２のコドン最適化ＫＣＶＮ２遺伝子
ＥＧＦＰ増強緑色蛍光タンパク質

調節エレメントには、プロモーターとＫＣＮＶ２遺伝子（配列番号２）との間のＫＯＺＡＫコンセンサス配列（配列番号８）、ＣＭＶプロモーター（配列番号７）、ｌａｃプロモーター、ＫＣＮＶ２遺伝子後のウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号９）及びＷＰＲＥ（配列番号９）下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨポリ（Ａ））シグナル（配列番号１０）が含まれる。

ＡＡＶ血清型選択
本発明者らの例示的な開示では、本発明者らは、いくつかの他の既知のキャプシドと比較して最大１００倍高い形質導入能力を有することが示されたＡＡＶ２／８血清型を選択した。本発明者らはまた、Ａｎｃ８０血清型を選択した。網膜では、ＡＡＶ２／８は、ＡＡＶ２／２及びＡＡＶ２／５と比較してより効率的なベクターであることが示されている。それは、特に光受容体において、より速い発現及びより強力でより高い導入遺伝子発現の両方を提供した。しかしながら、ＡＡＶ２／８の代わりにＡｎｃ８０血清型も使用される。

プロモーター
網膜機能の救済を提供するのに必要なＫＣＮＶ２遺伝子発現の必要なレベルは不明であるが、ＫＣＶＮ２の発現は錐体及び桿体の両方の光受容体細胞に制限され得ると考えられる。ＫＣＮＶ２遺伝子はチャネルタンパク質をコードするので、異なる網膜細胞における遍在的発現は意図しない結果をもたらし得る。本発明者らの治療用構築物について、導入遺伝子発現を光受容体のみに制限するので、既に公開されているロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターを使用することにした。

ＫＣＮＶ２遺伝子
ヒトＫＣＮＶ２遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿１３３４９７．４；Ｅｎｓｅｍｂｌｅ遺伝子ＥＮＳＧ０００００１６８２６３．９及び転写物ＫＣＮＶ２－２０１ ＥＮＳＴ０００００３８２０８２．４）（配列番号１）を本発明者らの構築物の選択導入遺伝子とした。ＫＣＮＶ２転写物は、ただ１つのスプライス変異体を有し、２つのエクソンから構成される。転写物の全長は２１７８塩基対長であり、本発明者らの研究のための塩基として使用されるコード配列（ＣＤＳ）は１６３８塩基対長である（配列番号１２）。

構築物設計の前に、ヒトＫＣＮＶ２ ＣＤＳのコドン最適化バージョンを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）のコドン最適化ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ）を使用して生成した。この理論的根拠は、コドン使用頻度をｔＲＮＡ産生に結び付けること、転写物の安定性を改善すること、及び異常な転写物スプライシングから保護することである。使用されるＩＤＴアルゴリズムは、複雑さを低減し、二次構造を最小化するために配列をスクリーニング及びフィルタリングすることによって最良の配列オプションを提供する。

調節エレメント
本発明者らのすべての導入遺伝子構築物はまた、プロモーターとＫＣＮＶ２遺伝子（配列番号２）との間のＫＯＺＡＫコンセンサス配列（配列番号８）、ＫＣＮＶ２遺伝子（配列番号２）後のウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号９）及びＷＰＲＥ（配列番号９）下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨポリ（Ａ））（配列番号１０）シグナルも含有していた。ＫＯＺＡＫ配列（配列番号８）は、真核生物ｍＲＮＡ転写物におけるタンパク質翻訳開始のために機能する。ＷＰＲＥ（配列番号９）は、転写されると、発現を増強する三次構造を作り出すＤＮＡ配列である。これは、ウイルスベクターによって送達される遺伝子の発現を増加させるために使用される。ＢＧＨポリ（Ａ）（配列番号１０）は、ｍＲＮＡの３’末端にポリ（Ａ）テールの形成をもたらす、真核細胞におけるタンパク質発現のための特殊な終結配列である。さらに、核内で複製する哺乳動物ＤＮＡウイルスは、細胞ポリアデニル化機構を利用する。ポリ（Ａ）テールは、ほとんどのｍＲＮＡの安定性、輸送及び翻訳を支援する。

ベクターの調製
開示されるベクターは、治療のためのベクターを提供するための当技術分野で公知の標準的な手段によって調製され得る。したがって、十分に確立されたパブリックドメイントランスフェクション、パッケージング及び精製方法を使用して、適切なベクター調製物を調製することができる。

構築物を以下の工程によって開発した：

１．構築物の設計
治療用構築物の設計は、所望の発現レベルを達成するためにどのプロモーターを使用すべきか、遺伝子をコドン最適化すべきかどうか、どのポリＡ部位を使用すべきか、及び他の既知の調節配列を使用すべきかを考慮して行われた。

２．構築物の組立て
最終構築物のＤＮＡ断片をＧｅｎｅｗｉｚによって合成し、次いでｐＡＡＶ骨格プラスミドにクローニングした。

３．ＡＡＶへのパッケージング
本発明者らの構築物をｐＡＡＶ骨格にクローニングしたら、それを精製し、Ｑｉａｇｅｎ製の市販のキットを使用してより多くのプラスミド量を作製した。精製プラスミドをＡＡＶにパッケージングするために送った。ＡＡＶの産生は標準プロトコルに従った。本発明者らの治療用プラスミドを使用してＡＡＶ２／８のバッチを作製し、ドライアイス中で保存した。

以下の実施例は、特定の特徴及び／又は実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、本開示を記載された特定の特徴又は実施形態に限定すると解釈されるべきではない。

選択された治療薬の概念実証研究（ＰＣ）－ＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＮＶ２遺伝子治療は超正常ｂ波振幅を減少させる
本発明者らの基礎研究からのデータを使用して、試験した３つの潜在的な治療用生成物のうちのどれが本発明者らの選択された生成物になるかについての決定を導いた。野生型と比較して平均８倍の遺伝子発現増加を示した遺伝子発現データ、及び他の生成物と比較して未処置眼と比較してより高い差及び有意な減少を示したＥＲＧ陽性ｂ波データに基づいて、本発明者らは実施例の治療用生成物として以下のＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＮＶ２ベクターを選択した。しかしながら、ＡＡＶ Ａｎｃ８０を含むがこれに限定されない他のＡＡＶ血清型も意図されていることを理解されたい。以下に、検証データを提供する。

マウスパイロット研究のためのプロトコルは以下である。図１１を参照されたい。

１．ウイルス粒子の希釈及び保存
元のストックベクターを－８０℃で保存した。作業用ストックを滅菌ＰＢＳで１ｘ１０^１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍｌに希釈し、０．２ｍｌ滅菌ＰＣＲチューブ（ＳＳＩｂｏ ＵｌｔｒａＦｌｕｘ Ｆｌａｔ ｃａｐ ＰＣＲチューブ、カタログ番号３２２０－００）中の２０μｌアリコートに等分し、－８０℃で保存した。注射日に、希釈したアリコート（複数可）を注射前に氷上（４℃）で解凍した。１日当たりの注射の各バッチごとに新しいアリコートを使用した。注入中、アリコートを氷上に保った。解凍したアリコートからの残りのベクター懸濁液は、この研究での使用から破棄した。

２．網膜下注射
両方の性別のＰ２８－３５ Ｋ８．２ ＫＯマウスを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射による全身麻酔下に置いた。瞳孔を局所１％トロピカミド（ＭＹＤＲＩＡＣＹＬ；Ａｌｃｏｎ）で拡張させた。

手術顕微鏡下で、３０ゲージ針の先端を使用して眼の側頭強膜を通して小さな切開を行った。ＮａｎｏＦｉｌシリンジに取り付けた３５ゲージのステンレス鋼の斜角針又は鈍針を切開部を通して挿入し、Ｕｌｔｒａ－Ｍｉｃｒｏ－Ｐｕｍｐ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＳＯＰ＃１．０６．０８）を用いてウイルス懸濁液／ＰＢＳを網膜下腔に注入した。

各処置動物は、一方の眼にｒＡＡＶ２／８－ｈＧＲＫ１－ｈＫＣＮＶ２（１ｘ１０^１２ ＧＣ／ｍＬ）ベクター（配列番号３）の１μｌ網膜下注射を受けた（ｎ＝１０、左眼又は右眼をランダムに割り当て）。他方の眼は注射されないままであった。対照動物は、一方の眼（ｎ＝１０、左眼又は右眼をランダムに割り当て）に１μｌの滅菌１Ｘリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）の網膜下注射を受け、他方の眼は注射されずに内部対照としての役割を果たしたままである（ｎ＝２０）。

その後、水疱性（ブレブ）網膜剥離によって示される注射の位置及び範囲を確認するためにＯＣＴ検証を行った。

３．網膜電図検査（ＥＲＧ）
暗所性ＥＲＧ試験を、処置後にａ波及びｂ波振幅の改善があったかどうかを判定するために、特定の時間間隔（注射後４、８及び１２週間）でＫＣＮＶ２ ＫＯマウスに対して行った。

マウスをＥＲＧ実験の前に一晩（少なくとも８時間）暗順応させ、その後、暗い赤色光下でのみ扱った。ＥＲＧを以前に記載されたように行った［６］。イソフルラン吸入麻酔を用いてマウスを麻酔し、局所１％トロピカミド（ＭＹＤＲＩＡＣＹＬ；Ａｌｃｏｎ）で瞳孔を拡張させた。人工潤滑剤（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）を角膜に適用して脱水を回避し、ＥＲＧ電極を各眼に配置する前に接触を促進した。参考までに、皮下針電極をマウスの各頬内又は顎線に沿って配置し、接地電極を尾の付け根の上の皮下に配置した。

ＥＲＧ記録は、以下の強度（すべてｃｄ・ｓ ｍ^－２）で１－ｍｓのフラッシュを提示することによって、暗順応シングルフラッシュ強度シリーズを使用して得た：０．１、０．３、１、３、１０、及び２５。連続するフラッシュ間の時間間隔及び刺激の繰り返し回数は（その後の平均化のために）、刺激強度に応じて変化させた（０．１－３ ｃｄ・ｓ ｍ^－２では１０秒及び４回の繰り返し、１０－２５ ｃｄ・ｓ ｍ^－２では６０秒及び１回の繰り返し）。各ライトフラッシュ列の間に６０秒のギャップがあった。

明所性ＥＲＧを、３０ ｃｄ．ｓ ｍ^－２のバックグラウンド輝度での光順応後、注射後４週目及び１２週目に記録した。ＥＲＧ記録は、以下の強度（すべてｃｄ・ｓ ｍ^－２）で１－ｍｓのフラッシュを提示することによって、シングルフラッシュ強度シリーズを使用して得た：０．３、１、３、１０、及び２５。各刺激を（その後の平均化のために）３２回繰り返し、フラッシュ間の時間間隔を０．５秒とした。各ライトフラッシュ列の間に６０秒のギャップがあった。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる（Ｃｏｌｌｉｓｏｎ，Ｆ．Ｔ．，Ｊ．Ｃ．Ｐａｒｋ，Ｇ．Ａ．Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｅ．Ｍ．Ｓｔｏｎｅ，ａｎｄ Ｊ．Ｊ．ＭｃＡｎａｎｙ，Ｔｗｏ－ｃｏｌｏｒ ｐｕｐｉｌｌｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ＫＣＮＶ２ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．Ｄｏｃ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，２０１９，１３９（１），ｐ．１１－２０．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０６３３－０１９－０９６９１－ｗ）に詳述されているように、ａ波及びｂ波の最大振幅及び暗時（ｉｍｐｌｉｃｉｔ ｔｉｍｅ）をＥＲＧ応答から抽出した。

４．光干渉断層撮影（ＯＣＴ）
処置が未処置又は偽処置の眼と比較して網膜層の全体的な厚さを改善したかどうかを評価するために、注射の０～３日後、注射の２週間後及び注射の１２週間後にＯＣＴイメージングを行った。

前述のようにマウスを麻酔し、瞳孔を拡張させた。ＯＣＴは、スペクトルドメイン光干渉断層撮影システム（Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ Ｅｎｖｉｓｕ Ｒ ２２００ ＳＤ－ＯＣＴシステム）を用いて行った。網膜層の厚さは、Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ及びＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した。

５．組織病理学
５．１ 切片化
注射１２週間後に、処置マウス及びＰＢＳ注射マウスから眼を回収した。簡潔には、眼を氷上で１時間、４％ ＰＦＡで固定した。角膜及び水晶体を切開し、次いで、眼を２０％スクロース中で４℃にて一晩インキュベートした。翌日、眼を最適切断温度化合物で凍結し、切片化の前に－２０℃で保存した。網膜切片をスーパーフロストスライド（Ｈｕｒｓｔ）上に収集し、Ｌｅｉｃａ Ｃｒｙｏｓｔａｔ ＣＭ３０５０を用いて１４μｍで切断した。眼を矢状面に切片化し、切片を１０枚のスライドにわたって連続的に収集した。切片化後、スライドをさらに分析する前に－２０℃で保存した。

５．２ 免疫組織化学
処置群、偽注射、非注射ＫＣＮＶ２－／－及び対応する年齢の非注射野生型網膜からの凍結網膜切片において、（Ｓｋａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｃ．，Ｂ．Ｒｏｓｅｎ，Ａ．Ｐ．Ｗｅｓｔ，Ｍ．Ｋｏｕｔｓｏｕｒａｋｉｓ，Ｗ．Ｂｕｓｈｅｌｌ，Ｖ．Ｉｙｅｒ，Ａ．Ｏ．Ｍｕｊｉｃａ，Ｍ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｈａｒｒｏｗ，Ｔ．Ｃｏｘ，Ｄ．Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｓｅｖｅｒｉｎ，Ｐ．Ｂｉｇｇｓ，Ｊ．Ｆｕ，Ｍ．Ｎｅｆｅｄｏｖ，Ｐ．Ｊ．ｄｅ Ｊｏｎｇ，Ａ．Ｆ．Ｓｔｅｗａｒｔ，ａｎｄ Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７４（７３５１），ｐ．３３７－４２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０１６３）で公開されたプロトコルに従って、Ｋｖ８．２抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎｃ，ＵＳＡ，Ｃａｔ ７５－４３５／７３－４３５）を使用して、Ｋｖ８．２タンパク質の存在をインサイチュで評価した。ロドプシン（Ｒｈｏ）（Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ａｂ３４２４）及び錐体アレスチン（Ａｒｒ３）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＡＢ１５２８２）のインサイチュ発現も評価した。

６．０ 定性的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）による遺伝子発現
処置マウス及び偽処置マウスの網膜からの全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して注射後１２週間で抽出し、公開されたプロトコルに従った。次いで、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｅ６５６０Ｓ）又はＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２０５３１１）のいずれかを製造業者の推奨プロトコルに従って使用して、逆転写酵素によってＲＮＡ試料を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写した。次いで、ｃＤＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。

ＫＣＮＶ２、錐体アレスチン及びロドプシン発現レベルを、Ｔａｑｍａｎベースのアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及びリアルタイムＰＣＲ検出機（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して評価した。

データの統計分析
ＯＣＴイメージングによる網膜層の厚さ、ＥＲＧ反応によるａ波とｂ波の最大振幅と暗時（ｉｍｐｌｉｃｉｔ ｔｉｍｅ）、組織学による網膜層の厚さ、並びに処置眼、ＰＢＳ処置眼、未処置眼からのｑＲＴ－ＰＣＲによるＫＣＮＶ２、錐体アレスチン、ロドプシンのｍＲＮＡ発現量を、平均値と標準偏差値を求めることによって比較した。統計的有意性は、適用標準ｔ検定／一元配置ＡＮＯＶＡによって評価した。

図５を参照すると、網膜機能を回復させるための例示的な方法が示されている。例えばＫＣＶＮ２遺伝子における突然変異に起因する、超正常桿体応答を伴う錐体ジストロフィーが標的症状である。一例では、治療的介入はＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＶＮ２（配列番号３）であり、これはこの場合、配列番号２として開示されているコドン最適化ＫＣＶＮ２である。例示的な投与レジメンは、１回以上の網膜下注射で送達される０．１０ｍｌ中の５Ｅ９－５Ｅ１１ｖｇとして示されている。本明細書で論じるように、ベクターの設計は、遺伝子発現を光受容体細胞に、より具体的には網膜の黄斑及び／又は中心窩領域での発現に特異的に標的化する。予想される結果は、視覚機能の改善と相関する正のｂ波振幅の減少である。

図６を参照して、概念実証研究の概要を提供する。ステージ１は、野生型動物に対する基礎研究である。これは、最初に送達アプローチを試験し、網膜下注射（ＦＳ１で指定）の有用性を検証することを含む。網膜下腔への液体の注入は、その支持する網膜色素上皮（ＲＰＥ）の光受容体の時間的及び焦点的分離であるブレブを生成する。ブレブ解像のタイミングは、光受容体機能の指標である。転帰は、注射の日並びに注射の２週間後及び１２週間後にＯＣＴイメージングを使用して測定される。光干渉断層撮影（ＯＣＴ）は、非侵襲的な画像検査である。ＯＣＴイメージングは、光波を使用して網膜の断面写真を撮影する。これにより、網膜の特有の層の視覚化が可能になり、層をマッピングし、層の厚さを測定することができる。

送達アプローチの検証後、光受容体への所望のプロモーター標的化が確認される（ＦＳ２と命名）。ＲＫ及びＣＭＶプロモーターを比較して、それぞれの光受容体を標的とする能力を決定する。この場合、注射後１２週目に網膜の組織学的分析によって転帰を測定する。

機能的安全性の評価を実施して、網膜機能に対する網膜下注射の効果を評価する（ＦＳ３と呼ばれる）。注入後４、８及び１２週での網膜電図（ＥＲＧ）記録によって転帰を測定する。

ステージＩＩは、Ｋｖ８．２ ＫＯ動物に対する研究的生成物選択研究を含む。このステージでは、それぞれ異なるＡＡＶ血清型及びプロモーターを有する３つの治療用生成物を比較する。３つの治療用生成物は、例えば、ＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＪＣＶＮ２、Ａｎｃ８０．ＲＫ．ｈＫＣＶＮ２、及びＡＡＶ８．ＣＭＶ．ｈＫＣＶＮ２である。注射安全性に関する結果を、注射日、注射２週間後及び１２週間後にＯＣＴイメージングによって測定する。機能的評価に関する結果を、注射後４、８及び１２週でのＥＲＧ記録によって測定する。遺伝子発現に関する結果を、注射１２週間後に網膜ＫＣＶＮ２遺伝子発現分析によって測定する。

図７を参照して、概念実証研究であるステージＩＩＩを概説する。ＰＣ１において、本発明者らは、配列番号２の最適化されたＫＣＶＮ２遺伝子を発現するベクターの有効性を確立する。上記の実施例１に概説される処置プロトコル。対照には、非注射マウス、生成物を網膜下に注射した野生型マウスが含まれる。これらを、処置ＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＶＮ２（例えば、配列番号３）を注射したＫｖ８．２ ＫＯ動物と比較する。結果を、ＯＣＴ（注射０、３、及び１２週間後）、ＥＲＧ（注射４、８、及び１２週間後）及びＫＣＶＮ２遺伝子発現データ（注射１２週間後）によって測定する。ＰＣ２では、視覚機能の回復を評価して、より高用量で処置を送達する効果を調べる。ここで、処置ＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＶＮ２（例えば、配列番号３）を、２ｘ１０＾９ｖｇ及び５ｘ１０＾９ｖｇの２つの投与計画で網膜下に注射する。対照は非注射マウスである。結果を、ＯＣＴ（注射０、３、及び１２週間後）、ＥＲＧ（注射４、８、及び１２週間後）及びＫＣＶＮ２遺伝子発現データ（注射１２週間後）によって測定する。ＰＣ３では、安全性及び体内分布が評価される。本発明者らは、Ｋｖ８．２ ＫＯ動物におけるＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＶＮ２（例えば、配列番号３）の片側網膜下注射の安全性及び体内分布を評価する。網膜下注射による処置を受ける３つの処置群：ＰＢＳであるビヒクルのみを受ける群１；１ｘ１０＾９ｖｇ／眼の用量で処置を受ける群２；及び５ｘ１０＾９ｖｇ／眼の用量で処置を受ける群３が存在する。すべての動物はホモ接合Ｋｖ８．２ ＫＯである。転帰は、眼科検査、ＥＲＧ、血液学及び臨床化学、眼組織病理学、並びに主要器官におけるｖｇの体内分布によって測定される。注射の４週間後及び１２週間後に動物を検査する。

全体として、これらの基礎研究からのデータを使用して、どの３つの潜在的な治療用生成物を使用するかの決定を導いた。遺伝子発現データに基づいて、開示された配列番号２は、野生型ＫＣＶＮ２と比較して平均８倍の遺伝子発現増加を示した。ＥＲＧ陽性ｂ波データは、試験した他の生成物と比較して、未処置眼と比較してより高い差及び有意な減少を示した。したがって、ＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＶＮ２ベクター（配列番号３）を治療用処置生成物として選択した。

選択された結果
野生型と比較した処置眼の機能的ＥＲＧ分析
図８を参照すると、図８は、開示される方法、システム及び核酸配列を使用した処置マウスと未処置マウスとの比較を提供する。対象（ＣＤＳＲＲを有する対象など）における光受容体機能を回復させるための配列番号２及びさらにはベクター配列番号３による処置の有効性を評価するために、処置（Ｋｖ８．２動物で表されるＣＤＳＲＲ動物）、未処置（Ｋｖ８．２動物で表されるＣＤＳＲＲ動物）、及び野生型の眼（野生型動物）の間で陽性ｂ波ＥＲＧ振幅を比較した。注射４、８及び１２週間後の、ＡＡＶ８．Ｒｋ．ｈＫＣＮＶ２で処置したＫｖ８．２ ＫＯマウス（Ｋｖ８．２ ＫＯ Ｔｘ）、未処置Ｋｖ８．２ ＫＯマウス（Ｋｖ８．２ ＫＯ ＵＴｘ）及び未処置野生型との間の平均陽性ｂ波振幅比較。データは、２つの異なる刺激強度（１０及び２５ｃｄ．ｓ／ｍ^２）で示される。データは、平均±ＳＤ及び統計学的有意性として示され、Ｔｕｒｋｅｙの補正による二元配置ＡＮＯＶＡによって行われた。＊Ｐ＜０．０２４；＊＊Ｐ＜０．００３、＊＊＊ Ｐ＜０．０００３及びＰ＜０．０００１。この図８に示すように、配列番号２、さらには配列番号３の１回の網膜下注射は、未処置眼と比較して超正常の陽性ｂ波を有意に減少させるのに十分であった。ｂ波は、フラッシュと、光刺激に応答した網膜の応答又は電気的活動のピークとの間の時間を測定する。このデータは、Ｋｃ８．２未処置動物と比較して処置されたＫｖ８．２ ＫＯ動物では網膜応答時間が経時的に減少するので、配列番号２及びさらに配列番号３による光受容体機能の回復を支持する。

処置後の網膜遺伝子発現
図９は、野生型（ＷＴ）、注射されていない網膜と処置された網膜における錐体（ａ、錐体アレスチン）及び桿体（Ｂ、ロドプシン）マーカーの相対的遺伝子発現を示す（＊Ｐ＜０．０５；＊Ｐ＜０．０１）。対象（例えば、ＣＤＳＲＲを有する対象）における光受容体機能を回復させるための配列番号２及びさらにはベクター配列番号３による処置の効力を、桿体及び錐体の健康においてさらに評価するために、ロドプシン及び錐体アレスチンについての遺伝子発現のレベルを評価した。ロドプシンは、桿体健康のマーカーである。アレスチンは、錐体健康のマーカーである。図９は、野生型、非注射Ｋｖ８．２動物及び注射Ｋｖ８．２動物におけるロドプシン及び錐体アレスチンの発現レベルを示す。このデータは、配列番号２及びさらに配列番号３による処置が錐体アレスチンの遺伝子発現をもたらしたことを実証している。錐体アレスチンは、未処置の網膜と比較して、処置後に遺伝子発現レベルの統計学的に有意な増加を示した。ロドプシンレベルは、処置網膜及び未処置網膜の両方においてＷＴと比較して減少したように見えたが、これは統計学的に有意ではなかった。

図１０を参照すると、ヒトＫＣＶＮ２ペプチドに対する抗体を使用したＫｖ８．２サブユニットの組織学的分析及び免疫組織化学標識化は、網膜の注射部分内で発現を示したが、未処理領域はＫｖ８．２タンパク質の発現を示さなかった。具体的には、図１０は、処置後１２週の、配列番号３によって送達された配列番号２を注射したＫｖ８．２ ＫＯマウスの網膜におけるヒトＫｖ８．２サブユニットの網膜発現の代表的な画像を示す。（Ａ）左に処置された領域及び右に未処置の領域を示す網膜切片の広視野図。スケールバー＝２００μＭ。（ｉ）ヒトＫｖ８．２の発現を示す処置領域の拡大挿入図。（ｉｉ）Ｋｖ８．２発現を示さない未処置領域の挿入図。（ｉ）及び（ｉｉ）のスケールバー＝２５μＭ。

野生型と比較した処置眼の機能的ＥＲＧ分析
図１２及び図１３は、開示される方法、システム及び核酸配列を使用した処置マウスと未処置マウスとの比較を提供する。対象（ＣＤＳＲＲを有する対象など）における光受容体機能を回復させるための配列番号２及び配列番号３のベクターで送達される処置の有効性を評価するために、処置（Ｋｖ８．２動物で表されるＣＤＳＲＲ動物）、未処置（Ｋｖ８．２動物で表されるＣＤＳＲＲ動物）、及び野生型の眼（野生型動物）の間でａ波振幅及び陽性ｂ波ＥＲＧ振幅を比較した。野生型（ＷＴ）、Ｋｖ８．２ ＫＯ未処置（非注射）及び治療用生成物ＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＮＶ２（配列番号３）の５ｅ９ウイルスゲノムで網膜下処置したＫｖ８．２ ＫＯ眼の暗所（桿体メディテーション）網膜電図（ＥＲＧ）記録の定量化。記録は、処置の４週間後又は同等の年齢の対照において得た。ＷＴ、ｎ＝１２；非注射、ｎ＝１１；ＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＮＶ２、ｎ＝１２。テューキーの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１。データは、配列番号３のベクターで送達された配列番号２による処置が、対象、例えばＫｖ８．２ ＫＯ動物によって表されるようなＣＤＳＲＲを有する対象における光受容体機能を回復させることを実証している。

図１４は、野生型（ＷＴ）、Ｋｖ８．２ ＫＯ未処置（非注射）及び治療用生成物ＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＮＶ２の３ｅ９ウイルスゲノムで網膜下処置したＫｖ８．２ ＫＯ眼からの２５ ｃｄ．ｓ／ｍ２での暗所振動電位１（ＯＰ１）の定量化を実証する。記録は、処置の１２週間後又は同等の年齢の対照において得た。ＷＴ、ｎ＝１０；非注射、ｎ＝６；ＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＮＶ２、ｎ＝６。テューキーの多重比較検定による二元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。データは、配列番号３のベクターで送達された配列番号２による処置が、対象、例えばＫｖ８．２ ＫＯ動物によって表されるようなＣＤＳＲＲを有する対象における光受容体機能を回復させることを実証している。

図１５は、野生型（ＷＴ）、Ｋｖ８．２ ＫＯ未処置（非注射）及び治療用生成物ＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＮＶ２の５ｅ９ウイルスゲノムで網膜下処置したＫｖ８．２ ＫＯ眼からのｃ波の定量化を実証する。記録は、処置の４週間後又は同等の年齢の対照において得た。ＷＴ、ｎ＝１２；非注射、ｎ＝９；ＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＮＶ２、ｎ＝１５。テューキーの多重比較検定による二元配置ＡＮＯＶＡ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。データは、配列番号３のベクターで送達された配列番号２による処置が、対象、例えばＫｖ８．２ ＫＯ動物によって表されるようなＣＤＳＲＲを有する対象における光受容体機能を回復させることを実証している。

視運動行動反応
図１６及び図１７は、処置後１２週の、処置されたＫｖ８．２ ＫＯマウスの明所視力及び暗所視力及び暗所コントラスト感度の改善を実証する。処置動物に、３ｅ９ウイルスゲノム用量のＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＮＶ２を網膜下に投与し（ｎ＝３～６）、同齢の未処置（非注射、ｎ＝３～５）及びＷＴ（ｎ＝８）動物と比較した。二元配置ＡＮＯＶＡ、シダックの多重比較事後検定、＊＊ｐ＝０．００１５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＷＴ対処置ＡＡＶ８．ＲＫ．ｈＫＣＮＶ２は有意ではなかった。

遺伝子及びタンパク質発現データ
図１８、図１９、及び図２０は、処置後１２週の処置Ｋｖ８．２ ＫＯ眼におけるＫｖ８．２タンパク質及びＫＣＮＶ２遺伝子発現を示す組織学的データである。図１８は、ヒトＫｖ８．２サブユニット（緑色）の発現を示す処理領域及びＫｖ８．２発現のない未処理領域を有する網膜下注射眼の網膜切片の概略図である。図１９は、Ｋｖ８．２発現（緑色）、Ｋｖ２．１発現（赤色）及び細胞核（青色）を示す処置領域及び未処置領域の高倍率画像を提供する。スケールバー＝５０μｍ。図２０は、野生型に対して正規化された処置眼におけるヒトＫＣＮＶ２遺伝子の発現を示すリアルタイム定量ＰＣＲからのデータを提供する。Ｎ＝３個の眼。

図２１及び図２２は、本明細書に開示されるヒトＫＣＶＮ２コード領域（配列番号１２）と最適化されたＫＣＶＮ２（配列番号２）との比較を示す配列アラインメントを提供する。一番上の列は、ヒトＫＣＶＮ２の核酸を含む（配列番号１２）。一番下の列は、配列番号２の核酸を含む。配列番号２は、ヒト配列番号１２と約７６％の同一性を共有する。

記載された方法又は組成物の正確な詳細は、記載された実施形態の趣旨から逸脱することなく変更又は改変され得ることは明らかであろう。本発明者らは、以下の特許請求の範囲及び趣旨の範囲内に入るすべてのそのような改変及び変形例を主張する。

Claims (14)

1. 配列番号２に示される改変ＫＣＶＮ２ヌクレオチド配列、又は配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、又は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列であって、配列番号１１のペプチドをコードし、光受容体活性を回復することができる配列。
2. 請求項１に記載の改変ＫＣＶＮ２ヌクレオチド配列を含むベクター。
3. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２に記載のベクター。
4. 前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項３に記載のベクター。
5. 前記ベクターがガンマ－レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターである、請求項２に記載のベクター。
6. 配列番号３のヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載のベクター。
7. 配列番号２に作動可能に連結されたＲＫプロモーターをさらに含む、請求項４に記載のベクター。
8. ＫＯＺＡＫコンセンサス配列、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨポリ（Ａ））シグナルの少なくとも１つをさらに含む、請求項６に記載のベクター。
9. 前記エレメントが、以下：前記ＲＫプロモーター、引き続いて前記ＫＯＺＡＫ配列、引き続いて配列番号２、引き続いて前記ＷＰＲＥ、引き続いて前記ＢＧＨポリ（Ａ）シグナルの順序で、５’から３’に配置されている、請求項７に記載のベクター。
10. ストリンジェントな条件下で配列番号２にハイブリダイズし、光受容体活性を有する配列番号１１のタンパク質をコードするＫＣＶＮ２ヌクレオチド配列。
11. ＲＫプロモーター、ＫＯＺＡＫ配列、ＷＰＲＥ及びＢＧＨポリ（Ａ）シグナルに作動可能に連結された、請求項９に記載のＫＣＶＮ２ヌクレオチド配列。
12. 薬学的に許容され得るビヒクル中に請求項２に記載のベクターを含む医薬組成物。
13. 局所（ｌｏｃａｌ）投与、全身投与、又は局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与のために製剤化される、請求項１１に記載の医薬組成物。
14. 経口、経鼻、肺、頬側、経皮、皮下、十二指腸内、経腸、非経口、静脈内又は筋肉内投与用に製剤化される、請求項１２に記載の医薬組成物。
    
    

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