JP2024521713A - Kcnv2変異体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、KCVN2の新規なポリヌクレオチド変異体、それらによってコードされる電位依存性カリウムイオンチャネルポリペプチド、及び例えば光受容体機能を回復させ、網膜障害、例えばCDSRRを有する対象を処置する方法におけるそれらの使用が開示される。【選択図】図1
Description
本出願は、2021年5月20日に出願された米国仮出願第63/191,106号の優先権を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
これは、KCNV2配列などの新規なヌクレオチド及びタンパク質配列、並びに組換え核酸分子及びベクター、並びに対象における錐体ジストロフィーなどの網膜障害を処置するための関連する使用方法に関する。
錐体ジストロフィー、例えば、限定されないが、超正常桿体応答を伴う錐体ジストロフィー[CDSRR]は、例えば、とりわけ、視力不良、視力喪失、光に対する感受性、色覚不良、眼振及び斜視を特徴とし得る常染色体劣性障害である。視力の問題は、小児期初期に始まり、例えば、10代までに20/100以下の視力を有する。患者は後に夜盲を発症することがあり、多くの又はほとんどの患者は近視も発症することがある。視力喪失の進行を軽減又は予防するための具体的な処置は利用できず、患者は予後不良であり、加齢に伴って生活の質が低下する。したがって、治療法を特定する必要がある。
本発明者らは、KCVN2によって示される超正常桿体応答[CDSRR](網膜錐体ジストロフィー3B、OMIM 610356)及び関連する病態を伴う錐体ジストロフィーを処置するための新規な組換え核酸分子、タンパク質、ベクター、及び関連する使用方法を開示する。CDSRRは、視力不良(中心暗点による)、羞明、重度の色覚欠損を特徴とする稀な劣性遺伝性網膜症であり、時折、眼振及び斜視も存在する。一部の患者では、眼底は正常に見えるが、中心窩又は傍中心窩萎縮、黄斑ブルアイ、過蛍光異常、及び全身性微細色素性網膜症が報告されている。視神経にいくらかの時間的な混濁があり得る。
限定されないが、錐体光受容体及び/又は桿体光受容体を含む、網膜細胞において遺伝子を発現するための核酸、転写制御単位(TCU)、最適化された遺伝子配列、発現構築物及びベクターが本明細書に開示される。
非改変KCVN2遺伝子に核酸置換を含む改変KCVN2遺伝子が本明細書に開示され、核酸置換は、ヒトKCVN2遺伝子と配列番号2によって表されるコドン最適化バージョンとのアラインメントによって実証されたものの1つ又は複数であり得る。
光受容体、例えば錐体光受容体及び/又は桿体光受容体において遺伝子を発現させるための、核酸、転写制御単位(TCU)、最適化された遺伝子配列、発現構築物及びベクターも提供される。
核酸分子、並びに核酸分子によってコードされる単離されたKv8.2タンパク質を含有するベクター、例えばアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターも提供される。
TCUの制御下にある変異体ヒトKCVN2遺伝子を含む発現構築物も提供される。変形例では、KCVN2は、光受容体、例えば錐体光受容体又は桿体光受容体において遺伝子を発現するために最適化されたプロモーターの制御下にある。変形例では、変異体ヒトKCVN2遺伝子は、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーターの制御下にあり得る。
したがって、1つの変形例では、以下を提供する。
したがって、1つの変形例では、以下を提供する。
KCVN2遺伝子の発現を指示することができるプロモーター。変形例では、プロモーターは、導入遺伝子発現を光受容体に標的化する。別の変形例では、プロモーターは、発現を光受容体のみに制限する。別の変形例では、プロモーターはロドプシンキナーゼ(RK)プロモーターである。
光受容体において発現される配列。変形例では、本発明は、光受容体特異的に発現される配列を含む発現構築物を提供する。さらなる変形例では、発現される配列は、Kv8.2をコードする遺伝子を含む。さらなる変形例では、発現される配列は配列番号2を含む。
本開示の上記及び他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して進められるいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸及びアミノ酸配列は、37 C.F.R.1.822に定義されているように、ヌクレオチド塩基の標準的な略語及びアミノ酸の三文字表記を使用して示されている。各核酸配列の1つの鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。配列表は、2022年5月18日に作成された「Sequence.txt」(約40kb)という名称のファイルの形態のASCIIテキストファイルとして提出され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
添付の配列表に列挙されている核酸及びアミノ酸配列は、37 C.F.R.1.822に定義されているように、ヌクレオチド塩基の標準的な略語及びアミノ酸の三文字表記を使用して示されている。各核酸配列の1つの鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。配列表は、2022年5月18日に作成された「Sequence.txt」(約40kb)という名称のファイルの形態のASCIIテキストファイルとして提出され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
本発明者らは、KCVN2遺伝子によって示される超正常桿体応答[CDSRR](網膜錐体ジストロフィー3B、OMIM 610356)及び関連する病態を伴う錐体ジストロフィーを処置するための新規な組換え核酸分子、タンパク質、ベクター、及び関連する使用方法を開示する。CDSRRは、視力不良(中心暗点による)、羞明、重度の色覚欠損を特徴とする稀な劣性遺伝性網膜症であり、時折、眼振及び斜視も存在する。一部の患者では、眼底は正常に見えるが、中心窩又は傍中心窩萎縮、黄斑ブルアイ、過蛍光異常、及び全身性微細色素性網膜症が報告されている。視神経にいくらかの時間的な混濁があり得る。
臨床症候は、他の組織又は器官が罹患していない視力喪失に限定され得る。ほとんどの政府機関は、法律上の失明を、最もよく見える目の矯正視力(中心視力)が20/200以下であることと定義している。これは、法的に目の不自由な人が20フィートで見ることができるものを、平均的な人は200フィートではっきりと見ることができることを意味する。CDSRR研究では、視力は人によって異なり得るが平均で約20/160であるが、最終的には法的に盲目のレベルまで進行し得ることが示されている。視力喪失の進行を軽減又は予防するための具体的な処置は利用できず、患者は予後不良であり、加齢に伴って生活の質が低下する。予後は、症状の治癒、処置、又は治る可能性に関連するので、CDSRR及び他のKCVN2関連病変の予後不良は、現在利用可能な治癒又は処置がないため、回復の可能性がほとんどないことを意味する。視力低下補助具及び色付きレンズは、視力喪失症候の改善を試みるために患者が利用可能な唯一の資源である。いくつかの研究は、CDSRR患者における中心視力喪失の進行性の性質を示しているが、大規模な自然歴研究は、疾患進行の完全な程度を評価するためにまだ完了していない。
この疾患の希少性(世界中の罹患者の推定数は100万人に1人である)は、稀少疾患の定義に適格であり、処置又は予防のために新しい医薬品を製造及び販売することに対する民間部門の金銭的インセンティブをほとんど提供しないため、製薬業界によって対処されるのを妨げる。しかしながら、網膜電図検査(ERG)及び遺伝子検査の利用可能性は、正確かつ早期のCDSRR診断を可能にし、この障害の処置の開発を支援する。CDSRR及び緩徐進行性の性質の劣性遺伝様式は、それを、一度限りのウイルスベースの遺伝子治療(遺伝子補充)処置のための良好な候補にする。
CDSRRの原因因子の中には、カリウムチャネル、電位依存性サブファミリーV、メンバー2遺伝子(KCVN2)における突然変異がある。一部のCDSRR患者では、Kv8.2電位依存性カリウム(K+)チャネルサブユニットをコードするKCNV2遺伝子の突然変異が存在する。KCNV2における95を超える異なるCDSRRを引き起こす変異体が現在世界中で同定されており、他の変異体の中には、ミスセンス、ナンセンス、遺伝子内欠失、フレーム外挿入が含まれる。異なる変異体は、Kv8.2に異なる影響を及ぼすことが示されており、いくつかの突然変異は非伝導性チャネルを生成するが、他の突然変異はチャネル形成を完全に妨げた。これは、疾患病理学に関与する異なる機構の存在を示唆するが、すべての変異体が非機能性タンパク質を生成し、CDSRRを遺伝子置換療法のための良好な候補にすることも示唆する
Kv8.2は、それ自体ではチャネルを形成しないが同族パートナーを必要とする「修飾因子/サイレント」チャネルタンパク質の群のメンバーである;Kv8.2の場合、これは、活動電位の再分極の速度を調節する遅延整流電流を生成するサブユニットのShabファミリーのメンバーであるKv2.1(KCNB1によってコードされる)である。眼において、Kv8.2及びKv2.1サブユニットの両方は、錐体及び桿体光受容体細胞の内側セグメントの細胞質膜上に排他的に位置し、細胞は視覚応答の光伝達カスケードを開始する役割を果たす。しかしながら、KCNV2のミスセンス突然変異もまた、ヒトにおいててんかんを引き起こすことが示されており、脳においても発現され得ることを示している。網膜電図(ERG)疾患表現型は、KCNV2の突然変異がKv8.2サブユニットの機能の喪失をもたらし、Kv2.1/Kv8.2ヘテロマーの機能的消滅をもたらすことを示す。最終的に、これは網膜の光に対する感度を変化させ、それによって基本的な生理学的プロセスを変化させ、それによって視覚のダイナミックレンジが異なる照明レベルの下で調節される。
証拠は、KCNV2の突然変異が錐体光受容体と桿体光受容体の両方に影響を及ぼすことを示唆しており、これは両方の光受容体の異常ERG記録に反映され、網膜全体に広がるが、一部の患者では、観察された形態学的変化は錐体でより顕著であるように見える。CDSRR患者におけるスペクトルドメイン光干渉断層撮影(SD-OCT)を使用した網膜の高解像度画像化により、通常は中央網膜の肉眼的形態異常が明らかになった。これらには、内側/外側セグメント(IS/OS)接合部、著しい中心窩深度の減少、錐体が存在しない斑点を伴う錐体光受容体モザイク破壊、及び全体的な錐体密度の減少が含まれる。しかしながら、CDSRR網膜内の光受容体細胞喪失の機構は依然として不明である。さらに、この疾患がどのようにして錐体及び桿体に差次的に影響するかは明らかではない。瞳孔測定によって測定されたCDSRR患者の異常の最近の研究は、網膜内機能が保存され得ることを示している。変形例では、網膜外機能を回復するように設計された治療が成功し得る。
限定されないが、錐体光受容体及び/又は桿体光受容体を含む、網膜細胞において遺伝子を発現するための核酸、転写制御単位(TCU)、最適化された遺伝子配列、発現構築物及びベクターが本明細書に開示される。
非改変KCVN2遺伝子(配列番号12)に核酸置換を含む改変KCVN2遺伝子が本明細書に開示され、核酸置換は、ヒトKCVN2遺伝子と配列番号2によって表されるコドン最適化バージョンとのアラインメントによって実証されたものの1つ又は複数であり得る。
光受容体、例えば錐体光受容体及び/又は桿体光受容体において遺伝子を発現させるための、核酸、転写制御単位(TCU)、最適化された遺伝子配列、発現構築物及びベクターも提供される。
核酸分子、並びに核酸分子によってコードされる単離されたKv8.2タンパク質を含有するベクター、例えばアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターも提供される。
TCUの制御下にある変異体ヒトKCVN2遺伝子(配列番号2)を含む発現構築物も提供される。変形例では、KCVN2は、光受容体、例えば錐体光受容体又は桿体光受容体において遺伝子を発現するために最適化されたプロモーターの制御下にある。変形例では、変異体ヒトKCVN2遺伝子は、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター(配列番号6)の制御下にあり得る。
対応する天然ヒトKCVN2遺伝子(配列番号12)と比較して遺伝子発現が増加したKCVN2遺伝子の変異体、例えば配列番号2も提供される。KCVN2遺伝子の変異体は、野生型と比較して平均約8倍までの遺伝子発現増加、未処置眼と比較してERG陽性b波データのより高い差及び有意な減少、並びに他の生成物によって得られたものと比較してERG陽性b波データのより高い差及び有意な減少を含む発現の改善を含む、改善された治療特性を有する。開示されたKCVN2変異体(例えば、配列番号2)の改善された特性には、対応する天然ヒトKCVN2遺伝子(配列番号12)と比較した発現の増加、対応する野生型KCVN2遺伝子(配列番号12)と比較した発現の増加、及び/又は対応する天然ヒトKCVN2遺伝子(配列番号12)と比較した薬物動態特性の改善が含まれるが、これらに限定されない。改善された特性には、転写物安定性の改善及び異常な転写物スプライシングの最小化が含まれ得る。
また、限定されないがCDSRRを含む網膜障害又はジストロフィーを処置及び/又は予防するために、核酸、転写制御単位(TCU)、最適化された遺伝子配列、発現構築物、及びベクターの1つ又は複数を使用する方法も開示される。
超正常桿体応答を伴うKCNV2関連錐体ジストロフィーのためのAAV媒介遺伝子増強療法も開示される。
したがって、1つの変形例では、以下を提供する。
KCVN2遺伝子の発現を指示することができるプロモーター。変形例では、プロモーターは、導入遺伝子発現を光受容体に標的化する。別の変形例では、プロモーターは、発現を光受容体のみに制限する。別の変形例では、プロモーターはロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター(配列番号6)である。
光受容体において発現される配列。変形例では、本発明は、光受容体特異的に発現される配列を含む発現構築物を提供する。さらなる変形例では、発現される配列は、Kv8.2をコードする遺伝子を含む。さらなる変形例では、発現される配列は配列番号2を含む。
本開示の上記及び他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して進められるいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
用語
特に明記しない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Krebs et al.(eds.),Lewin’s genes XII,published by Jones&Bartlett Learning,2017;Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,2009(ISBN 9780632021826)に見られ得る。単数形の用語「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。「A又はBを含む」とは、A、又はB、又はA及びBを含むことを意味する。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。さらに、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が優先する。本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される。
特に明記しない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Krebs et al.(eds.),Lewin’s genes XII,published by Jones&Bartlett Learning,2017;Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,2009(ISBN 9780632021826)に見られ得る。単数形の用語「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。「A又はBを含む」とは、A、又はB、又はA及びBを含むことを意味する。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。さらに、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が優先する。本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される。
5’及び/又は3’:核酸分子(例えば、DNA及びRNAなど)は、1つのモノヌクレオチドペントース環の5’リン酸がホスホジエステル結合を介して一方向にその隣の3’酸素に結合するように、モノヌクレオチドが反応してポリヌクレオチドを作製するので、「5’末端」及び「3’末端」を有すると言われる。したがって、線状ポリヌクレオチドの一端は、その5’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の3’酸素に結合していない場合、「5’末端」と呼ばれる。ポリヌクレオチドの他端は、その3’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の5’リン酸に結合していない場合、「3’末端」と呼ばれる。1つのモノヌクレオチドペントース環の5’リン酸がその隣の3’酸素に結合しているにもかかわらず、内部核酸配列は5’及び3’末端を有するとも言われ得る。
線状又は環状核酸分子のいずれにおいても、別個の内部エレメントは、「下流」又は3’エレメントの「上流」又は5’と呼ばれる。DNAに関して、この用語は、転写がDNA鎖に沿って5’から3’方向に進行することを反映している。連結された遺伝子の転写を指示するプロモーター及びエンハンサーエレメントは、一般に、コード領域の5’又は上流に位置する。しかしながら、エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメント及びコード領域の3’側に位置する場合であっても、その効果を発揮することができる。転写終結シグナル及びポリアデニル化シグナルは、コード領域の3’又は下流に位置する。
アデノ随伴ウイルス(AAV):ヒト及びいくつかの他の霊長類種に感染する小型の複製欠損無エンベロープウイルス。AAVは疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。AAVを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外状態で存続することができる。これらの特徴は、AAVを遺伝子治療のための魅力的なウイルスベクターにする。現在、11個の認識されているAAVの血清型(AAV1~11)がある。
投与/投与する:任意の有効な経路によって、治療剤(例えば組換えAAV)などの薬剤を対象に提供又は与えること。例示的な投与経路には、注射(例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、及び静脈内)、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣及び吸入経路が含まれるが、これらに限定されない。
cDNA(相補DNA):内部非コードセグメント(イントロン)及び転写を決定する調節配列を欠くDNA片。cDNAは、細胞から抽出されたメッセンジャーRNAからの逆転写によって実験室で合成される。cDNAはまた、対応するRNA分子における翻訳制御を担う非翻訳領域(UTR)を含み得る。
KCNV2:ヒトKCNV2遺伝子(NCBI参照配列:NM_133497.4;Ensembl遺伝子ENSG00000168263.9及び転写物KCNV2-201 ENST00000382082.4)(配列番号1)を選択導入遺伝子とした。KCNV2転写物は、ただ1つのスプライス変異体を有し、2つのエクソンから構成される。転写物の全長は2178塩基対長であり、本発明者らの研究のための塩基として使用されるコード配列(CDS)は1638塩基対長である。
コドン最適化された:「コドン最適化された」核酸とは、コドンが特定の系(特定の種又は種の群など)での発現に最適であるように変更された核酸配列を指す。例えば、核酸配列は、哺乳動物細胞又は特定の哺乳動物種(ヒト細胞など)における発現のために最適化することができる。コドン最適化は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。
対照:参照標準。いくつかの実施形態では、対照は、健康な患者から得られた陰性対照試料である。他の実施形態では、対照は、CDSRRと診断された患者から得られた陽性対照試料である。さらに他の実施形態では、対照は、過去の対照又は標準参照値又は値の範囲(例えば、以前に試験された対照試料、例えば、既知の予後若しくは転帰を有する患者の群、又はベースライン値若しくは正常値を表す試料の群)である。
試験試料と対照との間の差は、増加又は逆に減少であり得る。差は、定性的差又は定量的差、例えば統計的有意差であり得る。いくつかの例では、差は、対照と比較して、少なくとも約5%、例えば少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約150%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、少なくとも約300%、少なくとも約350%、少なくとも約400%、少なくとも約500%、又は500%超の増加又は減少である。
DNA(デオキシリボ核酸):DNAは、ほとんどの生物の遺伝物質を含む長鎖ポリマーである(いくつかのウイルスは、リボ核酸(RNA)を含む遺伝子を有する)。DNAポリマー中の反復単位は4つの異なるヌクレオチドであり、その各々は、リン酸基が結合しているデオキシリボース糖に結合した4つの塩基、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)及びチミン(T)のうちの1つを含む。ヌクレオチドのトリプレット(コドンと呼ばれる)は、ポリペプチド中の各アミノ酸又は停止シグナルをコードする。コドンという用語は、DNA配列が転写されるmRNA中の3つのヌクレオチドの対応する(及び相補的な)配列にも使用される。
別段特定されない限り、DNA分子に対する任意の言及は、そのDNA分子の逆相補体を含むことが意図される。本明細書の本文で一本鎖性が必要とされる場合を除いて、DNA分子は、一本鎖のみを示すように書かれているが、二本鎖DNA分子の両方の鎖を包含する。したがって、特定のタンパク質又はその断片をコードする核酸分子への言及は、センス鎖及びその逆相補体の両方を包含する。例えば、開示される核酸分子の逆相補配列からプローブ又はプライマーを生成することが適切である。
発現:核酸配列の転写又は翻訳。例えば、コード核酸配列(遺伝子など)は、そのDNAがRNA又はRNA断片に転写され、いくつかの例ではmRNAになるようにプロセシングされる場合に発現され得る。コード核酸配列(遺伝子など)はまた、そのmRNAがタンパク質又はタンパク質断片などのアミノ酸配列に翻訳される場合に発現され得る。特定の例では、異種遺伝子は、RNAに転写されるときに発現される。別の例では、異種遺伝子は、そのRNAがアミノ酸配列に翻訳されるときに発現される。発現の調節には、転写、翻訳、RNA輸送及びプロセシング、mRNAなどの中間分子の分解、又は産生された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、区画化若しくは分解による制御が含まれ得る。
発現制御配列:作動可能に連結されている異種核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列は、発現制御配列が核酸配列の転写及び必要に応じて翻訳を制御及び調節する場合、核酸配列に作動可能に連結されている。したがって、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン(ATG)、イントロンのスプライスシグナル、mRNAの適切な翻訳を可能にするその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、及び終止コドンを含み得る。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現に影響を及ぼし得る成分を含むことを意図しており、その存在が有利である追加の成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列も含み得る。発現制御配列はプロモーターを含むことができる。
遺伝子:mRNAであろうとなかろうとRNAの転写に必要な制御配列及びコード配列を含む核酸配列、典型的にはDNA配列。例えば、遺伝子は、プロモーター、1つ又は複数のエンハンサー又はサイレンサー、RNA及び/又はポリペプチドをコードする核酸配列、下流調節配列、並びにおそらくmRNAの発現の調節に関与する他の核酸配列を含み得る。
当技術分野で周知のように、ほとんどの真核生物遺伝子は、エクソン及びイントロンの両方を含有する。「エクソン」という用語は、成熟mRNA転写物への連続配列の寄与が生物情報学的に予測及び/又は実験的に確認された、ゲノムDNAに見られる核酸配列を指す。「イントロン」という用語は、成熟mRNA転写物に寄与せず、むしろ転写物のプロセシング中に「スプライシングされる」と予測及び/又は確認された、ゲノムDNAに見られる核酸配列を指す。
遺伝子治療:1つ又は複数のレシピエント細胞への異種核酸分子の導入であって、レシピエント細胞における異種核酸の発現が細胞の機能に影響を及ぼし、対象において治療効果をもたらすものである。例えば、異種核酸分子は、レシピエント細胞の機能に影響を及ぼすタンパク質をコードし得る。
ハイブリダイゼーション:本明細書で提供される核酸配列と特定レベルの同一性を有する核酸を特徴づけるためのハイブリダイゼーションアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook,Russell「Molecular Cloning,A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(2001);Ausubel,「Current Protocols in Molecular Biology」、Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)を参照のこと。本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェント又は非ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに関し得る。当該ハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook(2001)loc.cit.;Ausubel(1989)loc.cit.,or Higgins and Hames(Eds.)「Nucleic acid hybridization,a practical approach」IRL Press Oxford,Washington D.C.,(1985)に記載されている従来のプロトコルに従って確立され得る。条件の設定は十分に当業者の技術の範囲内であり、当技術分野に記載されたプロトコルに従って決定することができる。したがって、ハイブリダイズ配列の検出は、通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件、例えば、65℃での0.1×SSC、0.1% SDS、又は2×SSC、60℃、0.1% SDSから、例えば、65℃での6×SSC、1% SDSまでの範囲の条件を必要とする。周知のように、プローブの長さ及び決定される核酸の組成は、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメータを構成する。
単離された:「単離された」生物学的構成要素(例えば、核酸分子、タンパク質、ウイルス又は細胞)は、その構成要素が天然に存在する生物の細胞若しくは組織又は生物自体中の他の生物学的構成要素、例えば他の染色体及び染色体外のDNA及びRNA、タンパク質及び細胞から実質的に分離又は精製されている。「単離された」核酸分子及びタンパク質には、標準的な精製方法によって精製されたものが含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸分子及びタンパク質、並びに化学合成された核酸分子及びタンパク質も包含する。
核酸分子:RNA、cDNA、ゲノムDNA、並びに上記の合成形態及び混合ポリマーのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含み得るヌクレオチドのポリマー形態。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの改変形態を指す。本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、特に明記しない限り、通常、少なくとも10塩基長である。この用語は、一本鎖及び二本鎖形態のDNAを含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド結合及び/又は天然に存在しないヌクレオチド結合によって一緒に連結された天然に存在するヌクレオチド及び改変ヌクレオチドのいずれか又は両方を含み得る。「cDNA」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態でmRNAと相補的又は同一であるDNAを指す。「コードする」とは、定義されたヌクレオチドの配列(すなわち、rRNA、tRNA及びmRNA)又は定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして働く、遺伝子、cDNA、又はmRNAなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、並びにそれから生じる生物学的特性を指す。
作動可能に連結された:第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的関係にある場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されたDNA配列は連続しており、2つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、同じ読み枠内にある。
薬学的に許容され得る担体:使用の薬学的に許容され得る担体は従来のものである。Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22nd ed.,London,UK:Pharmaceutical Press,2013には、開示のベクターの医薬送達に適した組成物及び製剤が記載されている。
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的及び生理学的に許容され得る流体をビヒクルとして含む注射用流体を含む。固体組成物(例えば、粉末、丸剤、錠剤又はカプセル剤の形態)の場合、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン又はステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物(ベクター組成物など)は、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤、及びpH緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートなどの少量の非毒性補助物質を含有することができる。特定の実施形態では、対象への投与に適した担体は、滅菌されていてもよく、及び/又は所望の免疫応答を誘導するのに適した組成物の1又は複数の測定された用量を含有する単位剤形に懸濁されていてもよく、そうでなければ含有されていてもよい。それはまた、処置目的で使用するための薬物を伴うことができる。単位剤形は、例えば、滅菌内容物を含有する密封バイアル、又は対象に注射するためのシリンジであってもよく、又はその後の可溶化及び投与のために凍結乾燥されてもよく、又は固体若しくは制御放出投与量であってもよい。
精製:精製されたという用語は、絶対純度を必要としない;むしろ、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製されたタンパク質調製物は、タンパク質(KCVN2タンパク質など)が、細胞内のその天然環境にあるペプチド又はタンパク質よりも濃縮されているものである。一実施形態では、タンパク質が調製物の総タンパク質含有量の少なくとも50%を占めるように調製物を精製する。
ポリペプチド:長さ又は翻訳後修飾(例えば、グリコシル化又はリン酸化)にかかわらず、アミノ酸の任意の鎖。「ポリペプチド」は、天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーを含むアミノ酸ポリマー、並びに1つ又は複数のアミノ酸残基が非天然アミノ酸、例えば対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマーに適用される。「残基」は、アミド結合又はアミド結合模倣物によってポリペプチドに組み込まれたアミノ酸又はアミノ酸模倣物を指す。ポリペプチドは、アミノ末端(N末端)及びカルボキシ末端(C末端)を有する。「ポリペプチド」は、ペプチド又はタンパク質と交換可能に使用され、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーを指すために使用される。
疾患の予防、処置又は改善:疾患(網膜障害など)を「予防する」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置する」とは、疾患又は病的症状が発症し始めた後にその徴候又は症候を改善する治療的介入を指す。「改善する」とは、疾患の徴候又は症候の数又は重症度の減少を指す。
プロモーター:核酸(例えば、遺伝子)の転写を指示/開始するDNAの領域。プロモーターは、転写の開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。典型的には、プロモーターは、それらが転写する遺伝子の近くに位置する。プロモーターはまた、場合により、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位のエンハンサー又はリプレッサーエレメントを含む。組織特異的プロモーターは、主に単一のタイプの組織又は細胞において転写を指示/開始するプロモーターである。例えば、光受容体特異的プロモーターは、他の細胞型よりも実質的に大きな程度まで光受容体細胞における転写を指示/開始するプロモーターである。
タンパク質:遺伝子又は他のコード核酸(例えば、cDNA)によって発現され、アミノ酸から構成される生物学的分子。
精製:「精製された」という用語は、絶対純度を必要としない;むしろ、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス又は他の活性化合物は、天然に関連するタンパク質及び他の汚染物質から全体的又は部分的に単離されたものである。特定の実施形態では、「実質的に精製された」という用語は、細胞、細胞培養培地又は他の粗調製物から単離され、タンパク質、細胞残屑及び他の成分などの初期調製物の様々な成分を除去するために分画に供されたペプチド、タンパク質、ウイルス又は他の活性化合物を指す。
組換え:組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するもの、例えば、1つ又は複数の核酸の置換、欠失又は挿入を含むもの、及び/又は、そうでなければ分離された2つの配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、又はより一般的には、例えば遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって達成することができる。
組換えウイルスは、組換え核酸分子を含むゲノムを含むウイルスである。本明細書で使用される場合、「組換えAAV」は、組換え核酸分子(例えば、Kv8.2をコードする組換え核酸分子)がパッケージングされているAAV粒子を指す。
組換えタンパク質は、天然に存在しない配列を有するか、そうでなければ分離された2つの配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有するものである。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、細菌若しくは真核細胞などの宿主細胞、又は組換えウイルスのゲノムに導入された異種(例えば、組換え)核酸によってコードされる。
網膜:網膜は、網膜色素上皮(RPE)細胞層及び3層の神経感覚細胞;すなわち、(外から内へ)外顆粒層(桿体及び15個の錐体光受容体細胞を含有する)、内顆粒層(双極細胞を含有する)、及び神経節細胞層から構成される。網膜障害又はジストロフィーは、光受容体細胞の進行性喪失及び付随する視力喪失を特徴とする網膜の疾患として定義することができる。網膜障害又はジストロフィーは、遺伝性網膜障害又はジストロフィーであり得る。
配列同一性:2つ以上の核酸配列又は2つ以上のアミノ酸配列間の同一性又は類似性は、配列間の同一性又は類似性に関して表される。配列同一性は、同一性パーセントに関して測定することができる。パーセンテージが高いほど、配列はより同一である。配列類似性は、(保存的アミノ酸置換を考慮に入れた)類似性パーセントに関して測定することができる。パーセンテージが高いほど、配列はより類似している。核酸又はアミノ酸配列のホモログ又はオルソログは、標準的な方法を使用してアライメントした場合、比較的高度の配列同一性/類似性を有する。この相同性は、オーソロガスタンパク質又はcDNAが、より遠縁の種(例えば、ヒト及びC.エレガンス(C.elegans)配列)と比較して、より近縁の種(ヒト及びマウス配列など)に由来する場合に、より有意である。
比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムはSmith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981;Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970;Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988;Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988;Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-3,1989;Corpet et al.,Nuc.Acids Res.16:10881-90,1988;Huang et al.Computer Appls.in the Biosciences 8,155-65,1992;及びPearson et al.,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994.Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990に記載されており、配列アラインメント方法及び相同性計算の詳細な考察が提示されている。
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990)は、配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn及びtblastxに関連して使用するために、National Center for Biological Information(NCBI)及びインターネットを含むいくつかの情報源から入手可能である。さらなる情報は、NCBIのウェブサイトで見つけることができる。
本明細書で使用される場合、「少なくとも90%の同一性」との言及は、特定の参照配列への「少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又はさらには100%の同一性」を指す。
対象:生きている多細胞脊椎動物生物、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含むカテゴリー。
治療有効量:障害又は疾患の症候及び/又は根本原因を予防、処置(予防を含む)、低減及び/又は改善する、例えば網膜障害を予防、阻害及び/又は処置するのに十分な、KCVN2をコードする開示された組換えAAVベクターなどの薬剤の量。例えば、これは、光受容体機能を回復させるのに十分な量のKCVN2を産生する、本明細書に記載の新規KCVN2遺伝子をコードする組換えAAVベクターの量であり得る。
一例では、所望の応答は、例えば網膜電図(ERG)記録によって測定されるように、対象(CDSRRを有する対象など)の光受容体機能を回復することである。ERG記録(A波、b波、c波)は、この方法が有効であるために、CDSRRを有さない正常な健康な対象のERG記録に完全に回復する必要はない。例えば、本明細書に開示されるベクター(KCVN2をコードするベクターなど)の治療有効量の投与は、適切な対照と比較して、所望の量、例えば少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも100%又はそれよりも多く、明所性又は暗所性ERG b波を増加させることができる。
疾患又は症状に対する治療応答を得るためには、治療剤の複数回投与が必要であり得ることが理解される。したがって、治療有効量は、患者において治療結果を達成するための前又は後の投与と組み合わせて寄与する部分用量を包含する。例えば、治療有効量の薬剤を、処置の経過中に単回用量で、又は数回用量で、例えば毎日投与することができる。しかしながら、治療有効量は、処置される対象、処置される症状の重症度及びタイプ、並びに投与様式に依存し得る。薬剤の単位剤形は、治療量で、又は治療量の倍数で、例えば滅菌成分を有するバイアル(例えば、穿刺可能な蓋を有する)又はシリンジに包装することができる。
ベクター:ベクターは、宿主細胞内で複製及び/又は組込みするベクターの能力を破壊することなく外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、複製起点などの宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、1つ又は複数の選択マーカー遺伝子及び他の遺伝要素を含み得る。発現ベクターは、挿入された1つ又は複数の遺伝子の転写及び翻訳を可能にするために必要な調節配列を含むベクターである。本明細書のいくつかの実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはガンマ-レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターである。
新規KCVN2遺伝子
配列番号2として示されるヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%同一の核酸配列を含むKv8.2活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。
配列番号2として示されるヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%同一の核酸配列を含むKv8.2活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が提供される。
配列番号2として示されるヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%同一の核酸配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子が提供される。
配列番号2として示されるヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%同一の核酸配列に対する遺伝暗号の結果として縮重する核酸分子が提供される。
実施例1で論じるように、Kv8.2をコードするヌクレオチド配列を、発現を改善するためにコドン最適化した。例示的な最適化されたKCVN2配列は、配列番号2として提供される。
対応する天然ヒトKCVN2と比較して発現が増加したKCVN2遺伝子の変異体を本明細書に開示する。配列番号2は、配列番号1として開示されるヒト野生型KCVN2遺伝子、配列番号12に開示されるコード領域を含む非改変KCVN2遺伝子と比較して、改善された光受容体治療特性を含む改善された治療特性を有する。開示されたKCVN2変異体の改善された特性には、タンパク質合成の増加、より安定なmRNA、翻訳伸長率の増加、及び/又は改善された薬物動態特性が含まれるが、これらに限定されない。改善された特性には、安定した導入遺伝子及びタンパク質発現、回復の向上、及び視覚機能の改善が含まれ得る。
KCVN2ポリヌクレオチドの変異体は、核酸配列中の天然に存在する変異体を含む、配列番号2の任意の変異体として定義され得る。変異体は、配列番号2と少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有すると定義され得、変異体配列から翻訳されたポリペプチドはその機能性を保持する。変異体は、配列番号2と少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有すると定義することができ、変異体配列、配列番号11から翻訳されたポリペプチドは、光受容体機能をレスキューする能力を有する。特定の変形例では、変異体は、コード配列のコドン最適化バージョンである。
本開示によって企図される発現構築物は、錐体光受容体機能をレスキューし得る。円錐形光受容体機能をレスキューすることは、錐体光受容体機能の少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%を回復させることと定義することができる。錐体光受容体機能は、当業者に公知の任意の適切な標準的な技術によって、例えば網膜応答の網膜電図(ERG)分析によって分析することができる。桿体光受容体機能は、当業者に公知の任意の適切な標準的な技術によって、例えば網膜応答のERG分析によって分析することができる。
感光体機能をレスキューすることは、光受容体の生存を延ばすことと定義することもできる。光受容体の生存を延ばすことは、光受容体(例えば、錐体光受容体及び/又は桿体光受容体)が機能的であるか又は存在する時間を、ジストロフィーに冒された光受容体と比較した場合、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%又は100%超延ばすことと定義することができる。光受容体生存の延長の例には、ERG活性の改善又はERG活性の喪失の遅延、網膜感度の改善又は網膜感度の進行性喪失の遅延/停止、光受容体細胞の喪失の遅延又は停止、網膜外層の菲薄化の遅延又は停止、視力の改善又は視力喪失の遅延/停止も含まれる。
発現構築物は、KCVN2遺伝子に作動可能に連結された1つ又は複数の転写制御単位を含み得る。変形例では、KCVN2遺伝子は配列番号2である。いくつかの変形例では、KCVN2遺伝子はコドン最適化されている。
したがって、Kv8.2をコードする核酸分子(例えば、cDNA又はRNA分子)並びにKv8.2の精製形態が提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、Kv8.2を産生するために宿主細胞(哺乳動物細胞など)で発現され得る。
遺伝暗号は、配列が異なるが同じポリペプチド配列をコードする核酸などの様々な機能的に等価な核酸配列を構築するために使用することができる。
本明細書に開示される核酸分子は、例えば、適切な配列のクローニングを含む任意の適切な方法によって、又は標準的な方法による直接的な化学合成によって調製することができる。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、又は一本鎖を鋳型としてDNAポリメラーゼとの重合によって二本鎖DNAに変換することができる。
例示的な核酸は、クローニング技術によって調製することができる。適切なクローニング及びシーケンシング技術の例は、例えば、Green and Sambrook(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)及びAusubel et al.(Eds.)(Current Protocols in Molecular Biology,New York:John Wiley and Sons,including supplements,2017)に見出すことができる。
核酸は、増幅方法によって調製することもできる。増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、転写に基づく増幅システム(TAS)、及び自立配列複製システム(3SR)が含まれる。
核酸分子は、細菌、植物、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞などの組換え操作された細胞で発現させることができる。本明細書に開示されるDNA配列は、適切な宿主細胞へのDNA移入によってインビトロで発現させることができる。細胞は、原核生物又は真核生物であり得る。大腸菌、他の細菌宿主、酵母、並びにCOS、CHO、HeLa及び骨髄腫細胞株などの様々な高等真核細胞を含むタンパク質の発現に利用可能な多数の発現系を使用して、開示された新規ヌクレオチド配列を発現させることができる。外来DNAが宿主内で連続的に維持されることを意味する安定な移入の方法は、当技術分野で公知である。
開示される核酸の発現は、DNA又はcDNAをプロモーター(構成的又は誘導性のいずれか)に作動可能に連結し、続いて発現カセットに組み込むことによって達成することができる。プロモーターは、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター(配列番号6)などの光受容体特異的プロモーターを含む、目的の任意のプロモーターであり得る。他の例示的なプロモーターとしては、CAG(ハイブリッドCMV初期エンハンサー/ニワトリb-アクチンプロモーター)、CBA(ニワトリb-アクチンプロモーター)、CBh(CBAプロモーターのハイブリッド形態)、CMV(ヒトサイトメガロウイルスプロモーター)、CB(サイトメガロウイルス(CMV)即時初期エンハンサー、第1のイントロン/エクソン接合部を有するニワトリb-アクチンプロモーター、ハイブリッドニワトリb-アクチン及びウサギb-グロブリンイントロン/エクソン接合部から構成される調節エレメント)、CBSB(CBプロモーターよりも短いCMV即時エンハンサー配列を含む)、GRK1(ヒトGタンパク質共役受容体キナーゼ1プロモーター)、pRLBP1(短縮型ヒトレチナールアルデヒド結合タンパク質1(RLBP1)プロモーター、hCAR(ヒト錐体アレスチンプロモーター、PRI.7及びPR2.1(ヒトL-オプシンプロモーターのバージョン)、IRBP(ヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質エンハンサー)、RS/IRBP(ヒトレチノシシン近位プロモーターとヒト光受容体間結合タンパク質エンハンサーの組み合わせ)、pRHO(ロドプシンプロモーター)、及びhPDE6b(短いヒトホスホジエステラーゼ6bプロモーター)が挙げられるが、これらに限定されない。
場合により、調節エレメント、例えば、KOZAKコンセンサス配列(配列番号8)、ウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント(WPRE)(配列番号9)のいずれか1つ又は複数など;及び/又はウシ成長ホルモンポリアデニル化(BGHポリ(A))(配列番号10)が構築物に含まれる。カセットは、原核生物又は真核生物のいずれかにおける複製及び組込みに適し得る。典型的な発現カセットは、タンパク質をコードするDNAの発現の調節に有用な特定の配列を含む。例えば、発現カセットは、適切なプロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン(すなわち、ATG)、イントロンのスプライシングシグナル、mRNAの適切な翻訳を可能にするその遺伝子の正しいリーディングフレームを維持するための配列、及び終止コドンを含み得る。ベクターは、薬物耐性(例えば、アンピシリン耐性又はテトラサイクリン耐性)をコードするマーカーなどの選択マーカーをコードすることができる。
クローニングされた遺伝子の高レベルの発現を得るためには、例えば、転写を指示する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位(例えば、内部リボソーム結合配列)及び転写/翻訳ターミネーターを含む発現カセットを構築することが望ましい。大腸菌の場合、これは、T7、trp、lac又はラムダプロモーターなどのプロモーター、リボソーム結合部位、及び好ましくは転写終結シグナルを含み得る。真核細胞の場合、制御配列は、例えば免疫グロブリン遺伝子、HTLV、SV40又はサイトメガロウイルスに由来するプロモーター及び/又はエンハンサー、並びにポリアデニル化配列を含むことができ、スプライスドナー及び/又はアクセプター配列(例えば、CMV及び/又はHTLVスプライスアクセプター及びドナー配列)をさらに含むことができる。カセットは、大腸菌のための形質転換又はエレクトロポレーション及び哺乳動物細胞のためのリン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション又はリポフェクションなどの周知の方法によって、選択された宿主細胞に移入され得る。カセットによって形質転換された細胞は、amp、GPt、neo及びhyg遺伝子などのカセットに含まれる遺伝子によって付与される抗生物質に対する耐性によって選択することができる。
本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸を、その生物学的活性を低下させることなく改変することができる。標的化分子のクローニング、発現、又は融合タンパク質への組み込みを容易にするために、いくつかの改変を行うことができる。そのような改変には、例えば、終止コドン、好都合に位置する制限部位を作り出すための配列、及び開始部位を提供するためにアミノ末端にメチオニンを付加するための配列、又は精製工程を助けるための追加のアミノ酸(ポリHisなど)が含まれる。
発現されると、開示されたKv8.2は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィーなどを含む当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる(一般に、Simpson et al.(Eds.),Basic methods in Protein Purification and Analysis:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2009を参照のこと)。開示されるポリペプチドは、100%純粋である必要はない。所望により部分的に又は均一に精製されたら、治療的に使用する場合、ポリペプチドはエンドトキシンを実質的に含まないべきである。
組換えベクター及び遺伝子治療用途
現在の実務において、遺伝子治療は、機能性タンパク質が産生されていない機能不全遺伝子を、機能を回復させる野生型コピーで機能的に置換することを意味する。遺伝子治療は、網膜の遺伝性及び一般的な複合障害の処置における有望なアプローチであり、前臨床及び臨床研究は、安全で効率的な遺伝子送達ビヒクルとしてのアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)の使用を検証している。AAV媒介遺伝子置換療法は、肝臓、筋肉、血球及び網膜を含む様々な組織及び系で達成されている。
現在の実務において、遺伝子治療は、機能性タンパク質が産生されていない機能不全遺伝子を、機能を回復させる野生型コピーで機能的に置換することを意味する。遺伝子治療は、網膜の遺伝性及び一般的な複合障害の処置における有望なアプローチであり、前臨床及び臨床研究は、安全で効率的な遺伝子送達ビヒクルとしてのアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)の使用を検証している。AAV媒介遺伝子置換療法は、肝臓、筋肉、血球及び網膜を含む様々な組織及び系で達成されている。
遺伝性光受容体変性のいくつかの動物モデルは、遺伝子補充療法による処置が成功しており、これまでに形態学的、機能的、及び行動レベルで視覚的救済が達成されている。異なる種類の遺伝性網膜障害の遺伝的欠陥を修正する手段としてAAV送達システムを使用しているか使用した、43の進行中又は完了した臨床試験がある(clinicaltrials.gov、検索は2020年11月16日に完了)。別の5つの臨床試験(3つの進行中及び2つの完了)もまた、加齢黄斑変性症のための治療薬を送達するためにAAVを使用しているか又は使用した。
AAVベクターは、効率及び特異性の両方において、光受容体細胞標的化のための許容され得る送達方法であることが実証されている。AAVベクターは、光受容体細胞に対して高い親和性を有すると同時に、非毒性、非病原性及び低免疫原性プロファイルも提供することが示されている。これは、網膜障害及び視力喪失モデルへの遺伝子治療の適用の成功を実証した。現在利用可能な様々なAAV血清型の中で、網膜細胞を標的化するために最も一般的に使用されているものは、AAV2/2、AAV2/8、AAV2/9、AAV2/5、AAV2/7m8、AAV2/Anc80_L065血清型であった。
上記の組換え核酸分子のいずれも、細胞又は対象における発現のためのベクター(AAVベクターなど)に含めることができる。
本明細書に開示される核酸配列は、ベクター(rAAVベクターなど)の産生に有用であり、アンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクター、又はワクチンベクターにも有用である。特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される核酸配列を含む遺伝子送達ベクター及び宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、選択されたベクターは、導入遺伝子を対象に導入するために、静脈内注射、エクスビボ形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速DNA被覆ペレット、ウイルス感染又はプロトプラスト融合を含む任意の適切な方法によって対象に送達され得る。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるKCVN2核酸配列(配列番号2)を含有するウイルス粒子、例えばキャプシドに関する。ウイルス粒子、キャプシド及び組換えベクターは、標的細胞への核酸配列の送達に有用である。核酸は、様々なベクター系、キャプシド及び宿主細胞において容易に利用され得る。特定の実施形態では、核酸は、AAVキャプシドタンパク質vp1、vp2、vp3及び超可変領域を含むcapタンパク質を含むキャプシド内に含まれるベクター中にある。
特定の実施形態では、KCVN2核酸配列は、宿主細胞に送達され得る任意の遺伝要素(ベクター)の一部、例えば裸のDNA、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、非ウイルス送達ビヒクル(例えば、脂質ベースの担体)中のタンパク質、担持している配列を移入するウイルスなどであり得る。
特定の実施形態では、ベクターは、例えばVSVG若しくはGP64偽型又はその両方に由来する核酸配列を有する、レンチウイルスベースの(レンチウイルス遺伝子又は配列を含む)ベクターであり得る。特定の実施形態では、VSVG又はGP64偽型に由来する核酸配列は、遺伝子又は断片に対して50、60、70、80、90、95又は99%を超える同一性を有する、1000、500、400、300、200、100、50又は25を超える連続したヌクレオチド又はヌクレオチド配列の少なくとも1つ又は2つ以上の遺伝子又は遺伝子断片であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸及びプロモーター配列は、AAVベクターの産生に有用である。AAVはパルボウイルス科(Parvoviridae)及びディペンドウイルス属(Dependovirus)に属する。AAVは、線状一本鎖DNAゲノムをパッケージングする小型の無エンベロープウイルスである。AAV DNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方が、等しい頻度でAAVキャプシドにパッケージングされる。AAVゲノムは、2つのオープンリーディングフレーム(ORF)に隣接する2つの逆方向末端反復(ITR)を特徴とする。AAV2ゲノムでは、例えば、ITRの最初の125ヌクレオチドは回文であり、それ自体が折り畳まれて塩基対合を最大化し、T字形ヘアピン構造を形成する。D配列と呼ばれるITRの他の20塩基は、対を形成しないままである。ITRは、AAV DNA複製に重要なシス作用性配列である;ITRは複製起点であり、DNAポリメラーゼによる第2鎖合成のためのプライマーとして働く。この合成中に形成される二本鎖DNAは、複製型モノマーと呼ばれ、第2ラウンドの自己プライミング複製に使用され、複製型二量体を形成する。これらの二本鎖中間体は、鎖置換機構を介してプロセシングされ、パッケージングに使用される一本鎖DNA及び転写に使用される二本鎖DNAをもたらす。ITR内には、Rep結合エレメント及び末端解離部位(TRS)が位置している。これらの特徴は、二本鎖中間体を処理するためにAAV複製中にウイルス調節タンパク質Repによって使用される。AAV複製におけるそれらの役割に加えて、ITRはまた、AAVゲノムパッケージング、転写、非許容条件下での負の調節、及び部位特異的インテグレーションにも不可欠である(Daya and Berns,Clin Microbiol Rev 21(4):583-593,2008)。
AAVベクターは、典型的には、rep遺伝子とcap遺伝子を置換するITR間に導入遺伝子発現カセットを含む。ベクター粒子は、ベクターゲノムを含有するプラスミドと、rep及びcapタンパク質をトランスで発現するパッケージング/ヘルパー構築物とを細胞に同時トランスフェクションすることによって産生される。感染中、AAVベクターゲノムは細胞核に入り、複数の分子状態で存続することができる。1つの一般的な結果は、第2鎖合成又は相補鎖対合によるAAVゲノムの二本鎖環状エピソームへの変換である。
AAVベクターとの関連において、開示されるベクターは、典型的には、以下の構造を含む組換えゲノムを有する:
(5’AAV ITR)-(プロモーター)-(導入遺伝子)-(3’AAV ITR)
(5’AAV ITR)-(プロモーター)-(導入遺伝子)-(3’AAV ITR)
上記のように、これらの組換えAAVベクターは、rep遺伝子とcap遺伝子を置換するITR間に導入遺伝子発現カセットを含む。ベクター粒子は、例えば、組換えベクターゲノムを含有するプラスミドと、rep及びcapタンパク質をトランスで発現するパッケージング/ヘルパー構築物とを細胞に同時トランスフェクションすることによって産生される。
導入遺伝子は、5’Kozak配列及び/又は3’ポリアデニル化シグナルなどの調節配列に隣接することができる。
AAV ITR、及び本明細書に記載の他の選択されたAAV成分は、AAV1、AAV2、AAV2-QuadyF、AAV2.7m8、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、Anc80、AAV7m8、AAVrh10、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.S、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV2.GL、AAV2.NN、AAVAnc80_L065、及びそれらのいずれかの機能変異体を含むがこれらに限定されない任意のAAV血清型の中から容易に選択され得る。これらのITR又は他のAAV成分は、AAV血清型から当業者に利用可能な技術を使用して容易に単離され得る。そのようなAAVは、学術的、商業的、又は公的な情報源(例えば、the American Type Culture Collection,Manassas,Va.)から単離又は取得することができる。あるいは、AAV配列は、文献又はデータベース(例えば、GenBank、PubMedなど)で入手可能な公開配列を参照することによって、合成又は他の適切な手段によって得ることができる。本開示は、まだ同定又は特徴付けされていない他の血清型のAAVゲノムの使用も包含することが理解されよう。
いくつかの実施形態では、組換えAAVベクターゲノムは、ロドプシンキナーゼ(RK)又はその任意の改変などの光受容体特異的プロモーターを有することができる。組換えAAVベクターゲノムは、本明細書に開示されているもの及び/又はKaneshiro,K.,Wu,Z.,Li,T.,Sieving,P.,&Colosi,P.(2011).Evaluation of Viral and Human Retinal Promoters in AAV8 Vectors.Investigative Ophthalmology&Visual Science,52(14),491に開示されているものを含む当技術分野で公知の任意のプロモーターを有することができる。
AAVは現在、遺伝子治療に最も頻繁に使用されるウイルスの1つである。AAVはヒト及びいくつかの他の霊長類種に感染するが、疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。AAVを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂細胞と静止細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外状態で存続する。AAVの有利な特徴のために、本開示は、本明細書に開示される組換え核酸分子及び方法のためのAAVの使用を企図する。
AAVは、標的細胞に結合して入る能力、核に入る能力、長期間核内で発現される能力、及び低い毒性を含む、遺伝子治療ベクターのためのいくつかの望ましい特徴を有する。しかし、AAVゲノムのサイズが小さいと、組み込むことができる異種DNAのサイズが制限される。この問題を最小限に抑えるために、Rep及び組込み効率エレメント(IEE)をコードしないAAVベクターが構築されている。ITRは、パッケージングに必要なシスシグナルであるので保持される(Daya and Berns,Clin Microbiol Rev 21(4):583-593,2008)。
遺伝子治療に適したrAAVを産生する方法は公知であり(例えば、米国特許出願番号2012/0100606;2012/0135515;2011/0229971;及び2013/0072548;並びにGhosh et al.,Gene Ther 13(4):321-329,2006を参照)、本明細書に開示される組換え核酸分子及び方法と共に利用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸は、発現カセット又は導入遺伝子の一部である。例えば、米国特許出願公開第20150139953号を参照のこと。発現カセットは、導入遺伝子及び調節配列、例えばプロモーター並びに5’及び3’AAV逆方向末端反復配列(ITR)から構成される。1つの望ましい実施形態では、AAV血清型2又は8のITRが使用される。しかしながら、他の適切な血清型からのITRが選択され得る。発現カセットは、典型的にはキャプシドタンパク質にパッケージングされ、選択された宿主細胞に送達される。
いくつかの実施形態では、本開示は、AAV血清型キャプシド又はその一部を有する組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)を生成する方法を提供する。そのような方法は、アデノ随伴ウイルス(AAV)血清型キャプシドタンパク質をコードする核酸配列;機能的rep遺伝子;AAV逆位末端反復配列(ITR)及び導入遺伝子から構成される発現カセット;AAVキャプシドタンパク質への発現カセットのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。例えば、米国特許出願公開第20150139953号を参照のこと。
いくつかの実施形態では、本開示は、導入遺伝子と作動可能に組み合わせた光受容体特異的プロモーター核酸配列を含む組換えベクターに関する。導入遺伝子は、本明細書に開示されるKv8.2をコードする導入遺伝子に隣接するベクター配列とは異種の核酸配列であり、場合により1つ又は複数の追加の目的のタンパク質である。核酸コード配列は、宿主細胞における導入遺伝子の転写、翻訳及び/又は発現を可能にする様式で調節成分に作動可能に連結される。
発現カセットは、宿主細胞に送達される任意の適切なベクター、例えばプラスミド上に担持され得る。本開示において有用なプラスミドは、それらが原核細胞、哺乳動物細胞又はその両方における複製及び場合により組込みに適しているように操作され得る。これらのプラスミド(又は5’AAV ITR-異種分子-3’ITRを保有する他のベクター)は、真核生物及び/又は原核生物における発現カセットの複製を可能にする配列並びにこれらの系の選択マーカーを含有する。好ましくは、発現カセットを担持する分子は、一過性に存在し得る細胞にトランスフェクトされる。あるいは、発現カセット(5’AAV ITR-異種分子-3’ITRを担持する)は、染色体として、又はエピソームとして、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。特定の実施形態では、発現カセットは、複数のコピーで存在してもよく、場合により、head-to-head、head-to-tail、又はtail-to-tailコンカテマーで存在してもよい。適切なトランスフェクション技術は公知であり、発現カセットを宿主細胞に送達するために容易に利用することができる。
一般に、発現カセットを含むベクターをトランスフェクションによって送達する場合、選択されたベクター、送達方法及び選択された宿主細胞などの因子を考慮して、ベクター及び宿主細胞に対するベクターDNAの相対量を調整することができる。発現カセットに加えて、宿主細胞は、宿主細胞におけるAAVキャプシドタンパク質の発現を駆動する配列、及び発現カセットに見られるAAV ITRの血清型と同じ血清型、又は交差相補的血清型のrep配列を含む。rep及びcapを提供する分子(複数可)は、一時的に(すなわち、トランスフェクションを介して)宿主細胞に存在し得るが、rep及びcapタンパク質の一方又は両方、並びにそれらの発現を制御するプロモーター(複数可)は、宿主細胞において、例えばエピソームとして、又は宿主細胞の染色体への組み込みによって安定に発現されることが好ましい。
ベクターの宿主細胞への導入は、当技術分野で公知の又は上に開示されるような任意の手段によって達成され得、とりわけ、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速DNA被覆ペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合が挙げられる。アデノウイルス遺伝子の1つ又は複数は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ得るか、エピソームとして安定に発現され得るか、又は一過性に発現され得る。遺伝子産物はすべて、エピソーム上で一過性に発現され得るか、又は安定に組み込まれ得るか、又は遺伝子産物の一部は安定に発現され得るが他は一過性に発現され得る。さらに、各アデノウイルス遺伝子のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は天然のアデノウイルスプロモーターから独立して選択され得る。プロモーターは、例えば、生物又は細胞の特定の生理学的状態によって(すなわち、分化状態によって、又は複製細胞若しくは静止細胞において)、又は外因的に添加された因子によって調節され得る。
AAV技術は、インビトロ、エクスビボ又はインビボ遺伝子送達のためのこれら及び他のウイルスベクターシステムでの使用に適合させることができる。ある特定の実施形態では、本開示は、様々なrAAV及び非rAAVベクター系における本明細書中に開示される核酸及びベクターの使用を意図する。そのようなベクター系には、例えば、とりわけ、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス及びアデノウイルス系が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるウイルス粒子、核酸及びベクターは、治療用タンパク質の遺伝子発現のための治療用分子の送達を含む様々な目的に有用であると考えられる。
本明細書で報告される核酸(例えば、プロモーターと組み合わせて作動可能である)によってコードされる治療用タンパク質には、網膜障害の処置に使用されるものが含まれる。
いくつかの実施形態では、CDSRRを有する対象の網膜機能を回復させる方法が開示される。この方法は、本明細書に記載のKCVN2核酸配列を含む治療有効量のベクター(AAVベクター、レンチウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターなど)を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、網膜障害(例えば、CDSRRなど)を有する対象である。
変形例では、本発明者らは、いくつかの他の既知のキャプシドと比較して最大100倍高い形質導入能力を有することが示されたAAV2/8血清型の新規KCVN2遺伝子を送達する。網膜では、AAV2/8は、AAV2/2及びAAV2/5と比較してより効率的なベクターであることが示されている。それは、特に光受容体において、より速い発現及びより強力でより高い導入遺伝子発現の両方を提供した。
いくつかの実施形態では、本開示は、コドン最適化ヒトKCVN2(カリウム電位依存性チャネル修飾因子サブファミリーVメンバー2)を有するアデノ随伴ウイルス血清型8(AAV2/8)ベクターを使用したCDSRRの処置のための遺伝子導入の方法に関する。さらなる変形例では、本開示は、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーターの発現下でコドン最適化ヒトKCVN2を有するアデノ随伴ウイルス血清型8(AAV2/8)ベクターを使用したCDSRRの処置のための遺伝子導入の方法に関する。このベクターは、本明細書ではAAV2/8.RK.hKCVN2と呼ばれることがある。
導入遺伝子をコードするベクターの送達は、例えば対象への直接投与によるもの、例えばベクターの網膜下注射によるものであり得る。さらなる例では、ベクターの送達は、例えば、任意の疾患ステージの患者の片眼又は両眼への黄斑及び/又は中心窩領域へのベクターの注射によるものであり得る。
さらなる変形例では、導入遺伝子をコードするベクターの送達は、例えば対象への直接投与によるもの、例えばベクターの網膜下注射によるものであり得る。さらなる例では、ベクターの送達は、例えば、任意の疾患ステージの患者の片眼又は両眼への黄斑及び/又は中心窩領域へのベクターの注射によるものであり得る。この変形例では、AAV2/8.RK.hKCVN2は、プルロニック(登録商標)F68(0.001%)、0.10ml、5E9~5E11ベクターゲノムの用量範囲を有する中性リン酸緩衝生理食塩水で送達され得る。
一般に、送達は、本明細書に開示されるように、注射によるベクターなどの核酸の直接網膜、網膜下又は硝子体内送達によるものであり得る。一例では、送達は、網膜、網膜下腔又は硝子体内腔への注射によるものであり得る。
したがって、本発明者らはまた、ジストロフィー、特にCDSRRを、必要とする患者において処置又は予防する方法であって、治療有効量の本明細書に開示されるベクターなどの核酸を直接網膜、網膜下又は硝子体内注射によって患者に投与することを含む方法を提供する。
関連する態様では、本発明は、直接網膜、網膜下又は硝子体内注射によって患者にベクターを投与することによって、ジストロフィー、特にCDSRRなどの網膜障害を処置又は予防する方法における、本明細書に開示されるベクターなどの核酸の使用を提供する。
さらに、本発明者らは、直接網膜、網膜下又は硝子体内注射による、ジストロフィー、特にCDSRRなどの網膜障害を処置又は予防するための医薬品の製造における、本明細書に開示されるベクターなどの核酸の使用を提供する。
本発明はまた、網膜障害、ジストロフィー、特にCDSRRの処置に使用するための本明細書に開示されるベクターなどの核酸を提供し、当該ベクターは網膜、網膜下腔又は硝子体内腔に直接投与される。
本明細書に開示されるベクターなどの核酸の投与は、典型的には直接網膜注射又は網膜下注射によるものである。これには、錐体光受容体細胞及び/又は桿体光受容体細胞への直接送達が含まれる。
場合により、本開示の組成物は、他の薬学的に許容され得る賦形剤、例えば防腐剤又は化学的安定剤を含有し得る。適切な例示的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールが含まれる。適切な化学的安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
組換えウイルス粒子、キャプシド又はベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、過度の有害作用なしに、又は医学的に許容され得る生理学的効果とともに治療上の利益を提供するのに十分なレベルの遺伝子導入及び発現を提供し、これは当業者によって決定され得る。従来の及び薬学的に許容され得る投与経路には、所望の器官(例えば、眼)への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内及び他の親の(parental)投与経路が含まれるが、これらに限定されない。所望であれば、投与経路を組み合わせてもよい。
組換えウイルス粒子、キャプシド又はベクターの投与量は、主に、処置される症状、患者の年齢、体重及び健康状態などの要因に依存し、したがって患者によって異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療有効ヒト投与量は、一般に、約1x109~1x1016ゲノムウイルスベクターの濃度を含む約0.1ml~約100mlの溶液の範囲である。
本開示の組換えウイルスベクターは、生物がタンパク質に対する中和抗体を有する場合であっても、選択されたタンパク質をインビボ又はエクスビボで選択された宿主細胞に送達することができる効率的な遺伝子導入ビヒクルを提供する。1つの実施形態において、本明細書中に開示されるベクター及び細胞は、エクスビボで混合され;感染細胞は、従来の方法を用いて培養され;形質導入された細胞は患者に再注入される。
図1を参照すると、開示されたベクトルが示されている。配列番号2の開示されたコドン最適化KCVN2遺伝子を送達するためのベクターは、以下のエレメントの1つ又は複数を有し得る。
血清型AAV2/8のベクター
ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター(配列番号6)
配列番号2のコドン最適化KCVN2遺伝子
血清型AAV2/8のベクター
ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター(配列番号6)
配列番号2のコドン最適化KCVN2遺伝子
調節エレメントには、プロモーターとKCNV2遺伝子との間のKOZAKコンセンサス配列(配列番号8)、KCNV2遺伝子後のウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント(WPRE)(配列番号9)及びWPRE下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化(BGHポリ(A))(配列番号10)シグナルが含まれる。開示されるベクターは、配列番号3のヌクレオチド配列を有し得る。
図2を参照すると、第2の開示されたベクトルが示されている。配列番号2の開示されたコドン最適化KCVN2遺伝子を送達するためのベクターは、以下のエレメントの1つ又は複数を有し得る。
AAVベクター
ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター(配列番号6)
配列番号2のコドン最適化KCVN2遺伝子
EGFP増強緑色蛍光タンパク質
AAVベクター
ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター(配列番号6)
配列番号2のコドン最適化KCVN2遺伝子
EGFP増強緑色蛍光タンパク質
調節エレメントには、プロモーターとKCNV2遺伝子(配列番号2)との間のKOZAKコンセンサス配列(配列番号8)、KCNV2遺伝子(配列番号2)後のウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント(WPRE)(配列番号9)及びWPRE(配列番号9)下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化(BGHポリ(A))(配列番号10)シグナルが含まれる。
図3を参照すると、第3の開示されたベクトルが示されている。配列番号2の開示されたコドン最適化KCVN2遺伝子を送達するためのベクターは、以下のエレメントの1つ又は複数を有し得る。
AAVベクター
ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター(配列番号6)
配列番号2のコドン最適化KCVN2遺伝子
EGFP増強緑色蛍光タンパク質
AAVベクター
ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター(配列番号6)
配列番号2のコドン最適化KCVN2遺伝子
EGFP増強緑色蛍光タンパク質
調節エレメントには、プロモーターとKCNV2遺伝子(配列番号2)との間のKOZAKコンセンサス配列(配列番号8)、CMVプロモーター(配列番号7)、KCNV2遺伝子後のウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント(WPRE)(配列番号9)及びWPRE(配列番号9)下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化(BGHポリ(A))シグナル(配列番号10)が含まれる。
図4を参照すると、第4の開示されたベクトルが示されている。配列番号2の開示されたコドン最適化KCVN2遺伝子を送達するためのベクターは、以下のエレメントの1つ又は複数を有し得る。
AAVベクター
ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター(配列番号6)
配列番号2のコドン最適化KCVN2遺伝子
EGFP増強緑色蛍光タンパク質
AAVベクター
ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター(配列番号6)
配列番号2のコドン最適化KCVN2遺伝子
EGFP増強緑色蛍光タンパク質
調節エレメントには、プロモーターとKCNV2遺伝子(配列番号2)との間のKOZAKコンセンサス配列(配列番号8)、CMVプロモーター(配列番号7)、lacプロモーター、KCNV2遺伝子後のウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント(WPRE)(配列番号9)及びWPRE(配列番号9)下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化(BGHポリ(A))シグナル(配列番号10)が含まれる。
AAV血清型選択
本発明者らの例示的な開示では、本発明者らは、いくつかの他の既知のキャプシドと比較して最大100倍高い形質導入能力を有することが示されたAAV2/8血清型を選択した。本発明者らはまた、Anc80血清型を選択した。網膜では、AAV2/8は、AAV2/2及びAAV2/5と比較してより効率的なベクターであることが示されている。それは、特に光受容体において、より速い発現及びより強力でより高い導入遺伝子発現の両方を提供した。しかしながら、AAV2/8の代わりにAnc80血清型も使用される。
本発明者らの例示的な開示では、本発明者らは、いくつかの他の既知のキャプシドと比較して最大100倍高い形質導入能力を有することが示されたAAV2/8血清型を選択した。本発明者らはまた、Anc80血清型を選択した。網膜では、AAV2/8は、AAV2/2及びAAV2/5と比較してより効率的なベクターであることが示されている。それは、特に光受容体において、より速い発現及びより強力でより高い導入遺伝子発現の両方を提供した。しかしながら、AAV2/8の代わりにAnc80血清型も使用される。
プロモーター
網膜機能の救済を提供するのに必要なKCNV2遺伝子発現の必要なレベルは不明であるが、KCVN2の発現は錐体及び桿体の両方の光受容体細胞に制限され得ると考えられる。KCNV2遺伝子はチャネルタンパク質をコードするので、異なる網膜細胞における遍在的発現は意図しない結果をもたらし得る。本発明者らの治療用構築物について、導入遺伝子発現を光受容体のみに制限するので、既に公開されているロドプシンキナーゼ(RK)プロモーターを使用することにした。
網膜機能の救済を提供するのに必要なKCNV2遺伝子発現の必要なレベルは不明であるが、KCVN2の発現は錐体及び桿体の両方の光受容体細胞に制限され得ると考えられる。KCNV2遺伝子はチャネルタンパク質をコードするので、異なる網膜細胞における遍在的発現は意図しない結果をもたらし得る。本発明者らの治療用構築物について、導入遺伝子発現を光受容体のみに制限するので、既に公開されているロドプシンキナーゼ(RK)プロモーターを使用することにした。
KCNV2遺伝子
ヒトKCNV2遺伝子(NCBI参照配列:NM_133497.4;Ensemble遺伝子ENSG00000168263.9及び転写物KCNV2-201 ENST00000382082.4)(配列番号1)を本発明者らの構築物の選択導入遺伝子とした。KCNV2転写物は、ただ1つのスプライス変異体を有し、2つのエクソンから構成される。転写物の全長は2178塩基対長であり、本発明者らの研究のための塩基として使用されるコード配列(CDS)は1638塩基対長である(配列番号12)。
ヒトKCNV2遺伝子(NCBI参照配列:NM_133497.4;Ensemble遺伝子ENSG00000168263.9及び転写物KCNV2-201 ENST00000382082.4)(配列番号1)を本発明者らの構築物の選択導入遺伝子とした。KCNV2転写物は、ただ1つのスプライス変異体を有し、2つのエクソンから構成される。転写物の全長は2178塩基対長であり、本発明者らの研究のための塩基として使用されるコード配列(CDS)は1638塩基対長である(配列番号12)。
構築物設計の前に、ヒトKCNV2 CDSのコドン最適化バージョンを、Integrated DNA Technologies(IDT)のコドン最適化ツール(https://sg.idtdna.com)を使用して生成した。この理論的根拠は、コドン使用頻度をtRNA産生に結び付けること、転写物の安定性を改善すること、及び異常な転写物スプライシングから保護することである。使用されるIDTアルゴリズムは、複雑さを低減し、二次構造を最小化するために配列をスクリーニング及びフィルタリングすることによって最良の配列オプションを提供する。
調節エレメント
本発明者らのすべての導入遺伝子構築物はまた、プロモーターとKCNV2遺伝子(配列番号2)との間のKOZAKコンセンサス配列(配列番号8)、KCNV2遺伝子(配列番号2)後のウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント(WPRE)(配列番号9)及びWPRE(配列番号9)下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化(BGHポリ(A))(配列番号10)シグナルも含有していた。KOZAK配列(配列番号8)は、真核生物mRNA転写物におけるタンパク質翻訳開始のために機能する。WPRE(配列番号9)は、転写されると、発現を増強する三次構造を作り出すDNA配列である。これは、ウイルスベクターによって送達される遺伝子の発現を増加させるために使用される。BGHポリ(A)(配列番号10)は、mRNAの3’末端にポリ(A)テールの形成をもたらす、真核細胞におけるタンパク質発現のための特殊な終結配列である。さらに、核内で複製する哺乳動物DNAウイルスは、細胞ポリアデニル化機構を利用する。ポリ(A)テールは、ほとんどのmRNAの安定性、輸送及び翻訳を支援する。
本発明者らのすべての導入遺伝子構築物はまた、プロモーターとKCNV2遺伝子(配列番号2)との間のKOZAKコンセンサス配列(配列番号8)、KCNV2遺伝子(配列番号2)後のウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント(WPRE)(配列番号9)及びWPRE(配列番号9)下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化(BGHポリ(A))(配列番号10)シグナルも含有していた。KOZAK配列(配列番号8)は、真核生物mRNA転写物におけるタンパク質翻訳開始のために機能する。WPRE(配列番号9)は、転写されると、発現を増強する三次構造を作り出すDNA配列である。これは、ウイルスベクターによって送達される遺伝子の発現を増加させるために使用される。BGHポリ(A)(配列番号10)は、mRNAの3’末端にポリ(A)テールの形成をもたらす、真核細胞におけるタンパク質発現のための特殊な終結配列である。さらに、核内で複製する哺乳動物DNAウイルスは、細胞ポリアデニル化機構を利用する。ポリ(A)テールは、ほとんどのmRNAの安定性、輸送及び翻訳を支援する。
ベクターの調製
開示されるベクターは、治療のためのベクターを提供するための当技術分野で公知の標準的な手段によって調製され得る。したがって、十分に確立されたパブリックドメイントランスフェクション、パッケージング及び精製方法を使用して、適切なベクター調製物を調製することができる。
開示されるベクターは、治療のためのベクターを提供するための当技術分野で公知の標準的な手段によって調製され得る。したがって、十分に確立されたパブリックドメイントランスフェクション、パッケージング及び精製方法を使用して、適切なベクター調製物を調製することができる。
構築物を以下の工程によって開発した:
1.構築物の設計
治療用構築物の設計は、所望の発現レベルを達成するためにどのプロモーターを使用すべきか、遺伝子をコドン最適化すべきかどうか、どのポリA部位を使用すべきか、及び他の既知の調節配列を使用すべきかを考慮して行われた。
治療用構築物の設計は、所望の発現レベルを達成するためにどのプロモーターを使用すべきか、遺伝子をコドン最適化すべきかどうか、どのポリA部位を使用すべきか、及び他の既知の調節配列を使用すべきかを考慮して行われた。
2.構築物の組立て
最終構築物のDNA断片をGenewizによって合成し、次いでpAAV骨格プラスミドにクローニングした。
最終構築物のDNA断片をGenewizによって合成し、次いでpAAV骨格プラスミドにクローニングした。
3.AAVへのパッケージング
本発明者らの構築物をpAAV骨格にクローニングしたら、それを精製し、Qiagen製の市販のキットを使用してより多くのプラスミド量を作製した。精製プラスミドをAAVにパッケージングするために送った。AAVの産生は標準プロトコルに従った。本発明者らの治療用プラスミドを使用してAAV2/8のバッチを作製し、ドライアイス中で保存した。
本発明者らの構築物をpAAV骨格にクローニングしたら、それを精製し、Qiagen製の市販のキットを使用してより多くのプラスミド量を作製した。精製プラスミドをAAVにパッケージングするために送った。AAVの産生は標準プロトコルに従った。本発明者らの治療用プラスミドを使用してAAV2/8のバッチを作製し、ドライアイス中で保存した。
以下の実施例は、特定の特徴及び/又は実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、本開示を記載された特定の特徴又は実施形態に限定すると解釈されるべきではない。
選択された治療薬の概念実証研究(PC)-AAV8.RK.hKCNV2遺伝子治療は超正常b波振幅を減少させる
本発明者らの基礎研究からのデータを使用して、試験した3つの潜在的な治療用生成物のうちのどれが本発明者らの選択された生成物になるかについての決定を導いた。野生型と比較して平均8倍の遺伝子発現増加を示した遺伝子発現データ、及び他の生成物と比較して未処置眼と比較してより高い差及び有意な減少を示したERG陽性b波データに基づいて、本発明者らは実施例の治療用生成物として以下のAAV8.RK.hKCNV2ベクターを選択した。しかしながら、AAV Anc80を含むがこれに限定されない他のAAV血清型も意図されていることを理解されたい。以下に、検証データを提供する。
本発明者らの基礎研究からのデータを使用して、試験した3つの潜在的な治療用生成物のうちのどれが本発明者らの選択された生成物になるかについての決定を導いた。野生型と比較して平均8倍の遺伝子発現増加を示した遺伝子発現データ、及び他の生成物と比較して未処置眼と比較してより高い差及び有意な減少を示したERG陽性b波データに基づいて、本発明者らは実施例の治療用生成物として以下のAAV8.RK.hKCNV2ベクターを選択した。しかしながら、AAV Anc80を含むがこれに限定されない他のAAV血清型も意図されていることを理解されたい。以下に、検証データを提供する。
マウスパイロット研究のためのプロトコルは以下である。図11を参照されたい。
1.ウイルス粒子の希釈及び保存
元のストックベクターを-80℃で保存した。作業用ストックを滅菌PBSで1x1012ベクターゲノム(vg)/mlに希釈し、0.2ml滅菌PCRチューブ(SSIbo UltraFlux Flat cap PCRチューブ、カタログ番号3220-00)中の20μlアリコートに等分し、-80℃で保存した。注射日に、希釈したアリコート(複数可)を注射前に氷上(4℃)で解凍した。1日当たりの注射の各バッチごとに新しいアリコートを使用した。注入中、アリコートを氷上に保った。解凍したアリコートからの残りのベクター懸濁液は、この研究での使用から破棄した。
元のストックベクターを-80℃で保存した。作業用ストックを滅菌PBSで1x1012ベクターゲノム(vg)/mlに希釈し、0.2ml滅菌PCRチューブ(SSIbo UltraFlux Flat cap PCRチューブ、カタログ番号3220-00)中の20μlアリコートに等分し、-80℃で保存した。注射日に、希釈したアリコート(複数可)を注射前に氷上(4℃)で解凍した。1日当たりの注射の各バッチごとに新しいアリコートを使用した。注入中、アリコートを氷上に保った。解凍したアリコートからの残りのベクター懸濁液は、この研究での使用から破棄した。
2.網膜下注射
両方の性別のP28-35 K8.2 KOマウスを、ケタミン(100mg/kg)及びキシラジン(20mg/kg)の腹腔内注射による全身麻酔下に置いた。瞳孔を局所1%トロピカミド(MYDRIACYL;Alcon)で拡張させた。
両方の性別のP28-35 K8.2 KOマウスを、ケタミン(100mg/kg)及びキシラジン(20mg/kg)の腹腔内注射による全身麻酔下に置いた。瞳孔を局所1%トロピカミド(MYDRIACYL;Alcon)で拡張させた。
手術顕微鏡下で、30ゲージ針の先端を使用して眼の側頭強膜を通して小さな切開を行った。NanoFilシリンジに取り付けた35ゲージのステンレス鋼の斜角針又は鈍針を切開部を通して挿入し、Ultra-Micro-Pump(World Precision Instrument)(SOP#1.06.08)を用いてウイルス懸濁液/PBSを網膜下腔に注入した。
各処置動物は、一方の眼にrAAV2/8-hGRK1-hKCNV2(1x1012 GC/mL)ベクター(配列番号3)の1μl網膜下注射を受けた(n=10、左眼又は右眼をランダムに割り当て)。他方の眼は注射されないままであった。対照動物は、一方の眼(n=10、左眼又は右眼をランダムに割り当て)に1μlの滅菌1Xリン酸緩衝溶液(PBS)の網膜下注射を受け、他方の眼は注射されずに内部対照としての役割を果たしたままである(n=20)。
その後、水疱性(ブレブ)網膜剥離によって示される注射の位置及び範囲を確認するためにOCT検証を行った。
3.網膜電図検査(ERG)
暗所性ERG試験を、処置後にa波及びb波振幅の改善があったかどうかを判定するために、特定の時間間隔(注射後4、8及び12週間)でKCNV2 KOマウスに対して行った。
暗所性ERG試験を、処置後にa波及びb波振幅の改善があったかどうかを判定するために、特定の時間間隔(注射後4、8及び12週間)でKCNV2 KOマウスに対して行った。
マウスをERG実験の前に一晩(少なくとも8時間)暗順応させ、その後、暗い赤色光下でのみ扱った。ERGを以前に記載されたように行った[6]。イソフルラン吸入麻酔を用いてマウスを麻酔し、局所1%トロピカミド(MYDRIACYL;Alcon)で瞳孔を拡張させた。人工潤滑剤(ヒドロキシプロピルメチルセルロース)を角膜に適用して脱水を回避し、ERG電極を各眼に配置する前に接触を促進した。参考までに、皮下針電極をマウスの各頬内又は顎線に沿って配置し、接地電極を尾の付け根の上の皮下に配置した。
ERG記録は、以下の強度(すべてcd・s m-2)で1-msのフラッシュを提示することによって、暗順応シングルフラッシュ強度シリーズを使用して得た:0.1、0.3、1、3、10、及び25。連続するフラッシュ間の時間間隔及び刺激の繰り返し回数は(その後の平均化のために)、刺激強度に応じて変化させた(0.1-3 cd・s m-2では10秒及び4回の繰り返し、10-25 cd・s m-2では60秒及び1回の繰り返し)。各ライトフラッシュ列の間に60秒のギャップがあった。
明所性ERGを、30 cd.s m-2のバックグラウンド輝度での光順応後、注射後4週目及び12週目に記録した。ERG記録は、以下の強度(すべてcd・s m-2)で1-msのフラッシュを提示することによって、シングルフラッシュ強度シリーズを使用して得た:0.3、1、3、10、及び25。各刺激を(その後の平均化のために)32回繰り返し、フラッシュ間の時間間隔を0.5秒とした。各ライトフラッシュ列の間に60秒のギャップがあった。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる(Collison,F.T.,J.C.Park,G.A.Fishman,E.M.Stone,and J.J.McAnany,Two-color pupillometry in KCNV2 retinopathy.Doc Ophthalmol,2019,139(1),p.11-20.doi:10.1007/s10633-019-09691-w)に詳述されているように、a波及びb波の最大振幅及び暗時(implicit time)をERG応答から抽出した。
4.光干渉断層撮影(OCT)
処置が未処置又は偽処置の眼と比較して網膜層の全体的な厚さを改善したかどうかを評価するために、注射の0~3日後、注射の2週間後及び注射の12週間後にOCTイメージングを行った。
処置が未処置又は偽処置の眼と比較して網膜層の全体的な厚さを改善したかどうかを評価するために、注射の0~3日後、注射の2週間後及び注射の12週間後にOCTイメージングを行った。
前述のようにマウスを麻酔し、瞳孔を拡張させた。OCTは、スペクトルドメイン光干渉断層撮影システム(Bioptigen Envisu R 2200 SD-OCTシステム)を用いて行った。網膜層の厚さは、Bioptigen及びImageJソフトウェアを使用して測定した。
5.組織病理学
5.1 切片化
注射12週間後に、処置マウス及びPBS注射マウスから眼を回収した。簡潔には、眼を氷上で1時間、4% PFAで固定した。角膜及び水晶体を切開し、次いで、眼を20%スクロース中で4℃にて一晩インキュベートした。翌日、眼を最適切断温度化合物で凍結し、切片化の前に-20℃で保存した。網膜切片をスーパーフロストスライド(Hurst)上に収集し、Leica Cryostat CM3050を用いて14μmで切断した。眼を矢状面に切片化し、切片を10枚のスライドにわたって連続的に収集した。切片化後、スライドをさらに分析する前に-20℃で保存した。
5.1 切片化
注射12週間後に、処置マウス及びPBS注射マウスから眼を回収した。簡潔には、眼を氷上で1時間、4% PFAで固定した。角膜及び水晶体を切開し、次いで、眼を20%スクロース中で4℃にて一晩インキュベートした。翌日、眼を最適切断温度化合物で凍結し、切片化の前に-20℃で保存した。網膜切片をスーパーフロストスライド(Hurst)上に収集し、Leica Cryostat CM3050を用いて14μmで切断した。眼を矢状面に切片化し、切片を10枚のスライドにわたって連続的に収集した。切片化後、スライドをさらに分析する前に-20℃で保存した。
5.2 免疫組織化学
処置群、偽注射、非注射KCNV2-/-及び対応する年齢の非注射野生型網膜からの凍結網膜切片において、(Skarnes,W.C.,B.Rosen,A.P.West,M.Koutsourakis,W.Bushell,V.Iyer,A.O.Mujica,M.Thomas,J.Harrow,T.Cox,D.Jackson,J.Severin,P.Biggs,J.Fu,M.Nefedov,P.J.de Jong,A.F.Stewart,and A.Bradley,A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.Nature,2011,474(7351),p.337-42.doi:10.1038/nature10163)で公開されたプロトコルに従って、Kv8.2抗体(Antibodies Inc,USA,Cat 75-435/73-435)を使用して、Kv8.2タンパク質の存在をインサイチュで評価した。ロドプシン(Rho)(Abcam、カタログ番号Ab3424)及び錐体アレスチン(Arr3)(Millipore、カタログ番号AB15282)のインサイチュ発現も評価した。
処置群、偽注射、非注射KCNV2-/-及び対応する年齢の非注射野生型網膜からの凍結網膜切片において、(Skarnes,W.C.,B.Rosen,A.P.West,M.Koutsourakis,W.Bushell,V.Iyer,A.O.Mujica,M.Thomas,J.Harrow,T.Cox,D.Jackson,J.Severin,P.Biggs,J.Fu,M.Nefedov,P.J.de Jong,A.F.Stewart,and A.Bradley,A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.Nature,2011,474(7351),p.337-42.doi:10.1038/nature10163)で公開されたプロトコルに従って、Kv8.2抗体(Antibodies Inc,USA,Cat 75-435/73-435)を使用して、Kv8.2タンパク質の存在をインサイチュで評価した。ロドプシン(Rho)(Abcam、カタログ番号Ab3424)及び錐体アレスチン(Arr3)(Millipore、カタログ番号AB15282)のインサイチュ発現も評価した。
6.0 定性的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)による遺伝子発現
処置マウス及び偽処置マウスの網膜からの全RNAを、Trizol試薬を使用して注射後12週間で抽出し、公開されたプロトコルに従った。次いで、ProtoScript(登録商標)II First Strand cDNA Synthesis Kit(NEB、カタログ番号E6560S)又はQuantiTect Reverse Transcription Kit(Qiagenカタログ番号205311)のいずれかを製造業者の推奨プロトコルに従って使用して、逆転写酵素によってRNA試料を相補的DNA(cDNA)に転写した。次いで、cDNAをqRT-PCR反応の鋳型として使用した。
処置マウス及び偽処置マウスの網膜からの全RNAを、Trizol試薬を使用して注射後12週間で抽出し、公開されたプロトコルに従った。次いで、ProtoScript(登録商標)II First Strand cDNA Synthesis Kit(NEB、カタログ番号E6560S)又はQuantiTect Reverse Transcription Kit(Qiagenカタログ番号205311)のいずれかを製造業者の推奨プロトコルに従って使用して、逆転写酵素によってRNA試料を相補的DNA(cDNA)に転写した。次いで、cDNAをqRT-PCR反応の鋳型として使用した。
KCNV2、錐体アレスチン及びロドプシン発現レベルを、Taqmanベースのアッセイ(Thermo Fisher)及びリアルタイムPCR検出機(Bio-Rad CFX Connect Real-Time System)を使用して評価した。
データの統計分析
OCTイメージングによる網膜層の厚さ、ERG反応によるa波とb波の最大振幅と暗時(implicit time)、組織学による網膜層の厚さ、並びに処置眼、PBS処置眼、未処置眼からのqRT-PCRによるKCNV2、錐体アレスチン、ロドプシンのmRNA発現量を、平均値と標準偏差値を求めることによって比較した。統計的有意性は、適用標準t検定/一元配置ANOVAによって評価した。
OCTイメージングによる網膜層の厚さ、ERG反応によるa波とb波の最大振幅と暗時(implicit time)、組織学による網膜層の厚さ、並びに処置眼、PBS処置眼、未処置眼からのqRT-PCRによるKCNV2、錐体アレスチン、ロドプシンのmRNA発現量を、平均値と標準偏差値を求めることによって比較した。統計的有意性は、適用標準t検定/一元配置ANOVAによって評価した。
図5を参照すると、網膜機能を回復させるための例示的な方法が示されている。例えばKCVN2遺伝子における突然変異に起因する、超正常桿体応答を伴う錐体ジストロフィーが標的症状である。一例では、治療的介入はAAV8.RK.hKCVN2(配列番号3)であり、これはこの場合、配列番号2として開示されているコドン最適化KCVN2である。例示的な投与レジメンは、1回以上の網膜下注射で送達される0.10ml中の5E9-5E11vgとして示されている。本明細書で論じるように、ベクターの設計は、遺伝子発現を光受容体細胞に、より具体的には網膜の黄斑及び/又は中心窩領域での発現に特異的に標的化する。予想される結果は、視覚機能の改善と相関する正のb波振幅の減少である。
図6を参照して、概念実証研究の概要を提供する。ステージ1は、野生型動物に対する基礎研究である。これは、最初に送達アプローチを試験し、網膜下注射(FS1で指定)の有用性を検証することを含む。網膜下腔への液体の注入は、その支持する網膜色素上皮(RPE)の光受容体の時間的及び焦点的分離であるブレブを生成する。ブレブ解像のタイミングは、光受容体機能の指標である。転帰は、注射の日並びに注射の2週間後及び12週間後にOCTイメージングを使用して測定される。光干渉断層撮影(OCT)は、非侵襲的な画像検査である。OCTイメージングは、光波を使用して網膜の断面写真を撮影する。これにより、網膜の特有の層の視覚化が可能になり、層をマッピングし、層の厚さを測定することができる。
送達アプローチの検証後、光受容体への所望のプロモーター標的化が確認される(FS2と命名)。RK及びCMVプロモーターを比較して、それぞれの光受容体を標的とする能力を決定する。この場合、注射後12週目に網膜の組織学的分析によって転帰を測定する。
機能的安全性の評価を実施して、網膜機能に対する網膜下注射の効果を評価する(FS3と呼ばれる)。注入後4、8及び12週での網膜電図(ERG)記録によって転帰を測定する。
ステージIIは、Kv8.2 KO動物に対する研究的生成物選択研究を含む。このステージでは、それぞれ異なるAAV血清型及びプロモーターを有する3つの治療用生成物を比較する。3つの治療用生成物は、例えば、AAV8.RK.hJCVN2、Anc80.RK.hKCVN2、及びAAV8.CMV.hKCVN2である。注射安全性に関する結果を、注射日、注射2週間後及び12週間後にOCTイメージングによって測定する。機能的評価に関する結果を、注射後4、8及び12週でのERG記録によって測定する。遺伝子発現に関する結果を、注射12週間後に網膜KCVN2遺伝子発現分析によって測定する。
図7を参照して、概念実証研究であるステージIIIを概説する。PC1において、本発明者らは、配列番号2の最適化されたKCVN2遺伝子を発現するベクターの有効性を確立する。上記の実施例1に概説される処置プロトコル。対照には、非注射マウス、生成物を網膜下に注射した野生型マウスが含まれる。これらを、処置AAV8.RK.hKCVN2(例えば、配列番号3)を注射したKv8.2 KO動物と比較する。結果を、OCT(注射0、3、及び12週間後)、ERG(注射4、8、及び12週間後)及びKCVN2遺伝子発現データ(注射12週間後)によって測定する。PC2では、視覚機能の回復を評価して、より高用量で処置を送達する効果を調べる。ここで、処置AAV8.RK.hKCVN2(例えば、配列番号3)を、2x10^9vg及び5x10^9vgの2つの投与計画で網膜下に注射する。対照は非注射マウスである。結果を、OCT(注射0、3、及び12週間後)、ERG(注射4、8、及び12週間後)及びKCVN2遺伝子発現データ(注射12週間後)によって測定する。PC3では、安全性及び体内分布が評価される。本発明者らは、Kv8.2 KO動物におけるAAV8.RK.hKCVN2(例えば、配列番号3)の片側網膜下注射の安全性及び体内分布を評価する。網膜下注射による処置を受ける3つの処置群:PBSであるビヒクルのみを受ける群1;1x10^9vg/眼の用量で処置を受ける群2;及び5x10^9vg/眼の用量で処置を受ける群3が存在する。すべての動物はホモ接合Kv8.2 KOである。転帰は、眼科検査、ERG、血液学及び臨床化学、眼組織病理学、並びに主要器官におけるvgの体内分布によって測定される。注射の4週間後及び12週間後に動物を検査する。
全体として、これらの基礎研究からのデータを使用して、どの3つの潜在的な治療用生成物を使用するかの決定を導いた。遺伝子発現データに基づいて、開示された配列番号2は、野生型KCVN2と比較して平均8倍の遺伝子発現増加を示した。ERG陽性b波データは、試験した他の生成物と比較して、未処置眼と比較してより高い差及び有意な減少を示した。したがって、AAV8.RK.hKCVN2ベクター(配列番号3)を治療用処置生成物として選択した。
選択された結果
野生型と比較した処置眼の機能的ERG分析
図8を参照すると、図8は、開示される方法、システム及び核酸配列を使用した処置マウスと未処置マウスとの比較を提供する。対象(CDSRRを有する対象など)における光受容体機能を回復させるための配列番号2及びさらにはベクター配列番号3による処置の有効性を評価するために、処置(Kv8.2動物で表されるCDSRR動物)、未処置(Kv8.2動物で表されるCDSRR動物)、及び野生型の眼(野生型動物)の間で陽性b波ERG振幅を比較した。注射4、8及び12週間後の、AAV8.Rk.hKCNV2で処置したKv8.2 KOマウス(Kv8.2 KO Tx)、未処置Kv8.2 KOマウス(Kv8.2 KO UTx)及び未処置野生型との間の平均陽性b波振幅比較。データは、2つの異なる刺激強度(10及び25cd.s/m2)で示される。データは、平均±SD及び統計学的有意性として示され、Turkeyの補正による二元配置ANOVAによって行われた。*P<0.024;**P<0.003、*** P<0.0003及びP<0.0001。この図8に示すように、配列番号2、さらには配列番号3の1回の網膜下注射は、未処置眼と比較して超正常の陽性b波を有意に減少させるのに十分であった。b波は、フラッシュと、光刺激に応答した網膜の応答又は電気的活動のピークとの間の時間を測定する。このデータは、Kc8.2未処置動物と比較して処置されたKv8.2 KO動物では網膜応答時間が経時的に減少するので、配列番号2及びさらに配列番号3による光受容体機能の回復を支持する。
野生型と比較した処置眼の機能的ERG分析
図8を参照すると、図8は、開示される方法、システム及び核酸配列を使用した処置マウスと未処置マウスとの比較を提供する。対象(CDSRRを有する対象など)における光受容体機能を回復させるための配列番号2及びさらにはベクター配列番号3による処置の有効性を評価するために、処置(Kv8.2動物で表されるCDSRR動物)、未処置(Kv8.2動物で表されるCDSRR動物)、及び野生型の眼(野生型動物)の間で陽性b波ERG振幅を比較した。注射4、8及び12週間後の、AAV8.Rk.hKCNV2で処置したKv8.2 KOマウス(Kv8.2 KO Tx)、未処置Kv8.2 KOマウス(Kv8.2 KO UTx)及び未処置野生型との間の平均陽性b波振幅比較。データは、2つの異なる刺激強度(10及び25cd.s/m2)で示される。データは、平均±SD及び統計学的有意性として示され、Turkeyの補正による二元配置ANOVAによって行われた。*P<0.024;**P<0.003、*** P<0.0003及びP<0.0001。この図8に示すように、配列番号2、さらには配列番号3の1回の網膜下注射は、未処置眼と比較して超正常の陽性b波を有意に減少させるのに十分であった。b波は、フラッシュと、光刺激に応答した網膜の応答又は電気的活動のピークとの間の時間を測定する。このデータは、Kc8.2未処置動物と比較して処置されたKv8.2 KO動物では網膜応答時間が経時的に減少するので、配列番号2及びさらに配列番号3による光受容体機能の回復を支持する。
処置後の網膜遺伝子発現
図9は、野生型(WT)、注射されていない網膜と処置された網膜における錐体(a、錐体アレスチン)及び桿体(B、ロドプシン)マーカーの相対的遺伝子発現を示す(*P<0.05;*P<0.01)。対象(例えば、CDSRRを有する対象)における光受容体機能を回復させるための配列番号2及びさらにはベクター配列番号3による処置の効力を、桿体及び錐体の健康においてさらに評価するために、ロドプシン及び錐体アレスチンについての遺伝子発現のレベルを評価した。ロドプシンは、桿体健康のマーカーである。アレスチンは、錐体健康のマーカーである。図9は、野生型、非注射Kv8.2動物及び注射Kv8.2動物におけるロドプシン及び錐体アレスチンの発現レベルを示す。このデータは、配列番号2及びさらに配列番号3による処置が錐体アレスチンの遺伝子発現をもたらしたことを実証している。錐体アレスチンは、未処置の網膜と比較して、処置後に遺伝子発現レベルの統計学的に有意な増加を示した。ロドプシンレベルは、処置網膜及び未処置網膜の両方においてWTと比較して減少したように見えたが、これは統計学的に有意ではなかった。
図9は、野生型(WT)、注射されていない網膜と処置された網膜における錐体(a、錐体アレスチン)及び桿体(B、ロドプシン)マーカーの相対的遺伝子発現を示す(*P<0.05;*P<0.01)。対象(例えば、CDSRRを有する対象)における光受容体機能を回復させるための配列番号2及びさらにはベクター配列番号3による処置の効力を、桿体及び錐体の健康においてさらに評価するために、ロドプシン及び錐体アレスチンについての遺伝子発現のレベルを評価した。ロドプシンは、桿体健康のマーカーである。アレスチンは、錐体健康のマーカーである。図9は、野生型、非注射Kv8.2動物及び注射Kv8.2動物におけるロドプシン及び錐体アレスチンの発現レベルを示す。このデータは、配列番号2及びさらに配列番号3による処置が錐体アレスチンの遺伝子発現をもたらしたことを実証している。錐体アレスチンは、未処置の網膜と比較して、処置後に遺伝子発現レベルの統計学的に有意な増加を示した。ロドプシンレベルは、処置網膜及び未処置網膜の両方においてWTと比較して減少したように見えたが、これは統計学的に有意ではなかった。
図10を参照すると、ヒトKCVN2ペプチドに対する抗体を使用したKv8.2サブユニットの組織学的分析及び免疫組織化学標識化は、網膜の注射部分内で発現を示したが、未処理領域はKv8.2タンパク質の発現を示さなかった。具体的には、図10は、処置後12週の、配列番号3によって送達された配列番号2を注射したKv8.2 KOマウスの網膜におけるヒトKv8.2サブユニットの網膜発現の代表的な画像を示す。(A)左に処置された領域及び右に未処置の領域を示す網膜切片の広視野図。スケールバー=200μM。(i)ヒトKv8.2の発現を示す処置領域の拡大挿入図。(ii)Kv8.2発現を示さない未処置領域の挿入図。(i)及び(ii)のスケールバー=25μM。
野生型と比較した処置眼の機能的ERG分析
図12及び図13は、開示される方法、システム及び核酸配列を使用した処置マウスと未処置マウスとの比較を提供する。対象(CDSRRを有する対象など)における光受容体機能を回復させるための配列番号2及び配列番号3のベクターで送達される処置の有効性を評価するために、処置(Kv8.2動物で表されるCDSRR動物)、未処置(Kv8.2動物で表されるCDSRR動物)、及び野生型の眼(野生型動物)の間でa波振幅及び陽性b波ERG振幅を比較した。野生型(WT)、Kv8.2 KO未処置(非注射)及び治療用生成物AAV8.RK.hKCNV2(配列番号3)の5e9ウイルスゲノムで網膜下処置したKv8.2 KO眼の暗所(桿体メディテーション)網膜電図(ERG)記録の定量化。記録は、処置の4週間後又は同等の年齢の対照において得た。WT、n=12;非注射、n=11;AAV8.RK.hKCNV2、n=12。テューキーの多重比較検定を用いた二元配置ANOVA、*p<0.05、**p<0.005、*** p<0.0005、**** p<0.0001。データは、配列番号3のベクターで送達された配列番号2による処置が、対象、例えばKv8.2 KO動物によって表されるようなCDSRRを有する対象における光受容体機能を回復させることを実証している。
図12及び図13は、開示される方法、システム及び核酸配列を使用した処置マウスと未処置マウスとの比較を提供する。対象(CDSRRを有する対象など)における光受容体機能を回復させるための配列番号2及び配列番号3のベクターで送達される処置の有効性を評価するために、処置(Kv8.2動物で表されるCDSRR動物)、未処置(Kv8.2動物で表されるCDSRR動物)、及び野生型の眼(野生型動物)の間でa波振幅及び陽性b波ERG振幅を比較した。野生型(WT)、Kv8.2 KO未処置(非注射)及び治療用生成物AAV8.RK.hKCNV2(配列番号3)の5e9ウイルスゲノムで網膜下処置したKv8.2 KO眼の暗所(桿体メディテーション)網膜電図(ERG)記録の定量化。記録は、処置の4週間後又は同等の年齢の対照において得た。WT、n=12;非注射、n=11;AAV8.RK.hKCNV2、n=12。テューキーの多重比較検定を用いた二元配置ANOVA、*p<0.05、**p<0.005、*** p<0.0005、**** p<0.0001。データは、配列番号3のベクターで送達された配列番号2による処置が、対象、例えばKv8.2 KO動物によって表されるようなCDSRRを有する対象における光受容体機能を回復させることを実証している。
図14は、野生型(WT)、Kv8.2 KO未処置(非注射)及び治療用生成物AAV8.RK.hKCNV2の3e9ウイルスゲノムで網膜下処置したKv8.2 KO眼からの25 cd.s/m2での暗所振動電位1(OP1)の定量化を実証する。記録は、処置の12週間後又は同等の年齢の対照において得た。WT、n=10;非注射、n=6;AAV8.RK.hKCNV2、n=6。テューキーの多重比較検定による二元配置ANOVA、****p<0.0001。データは、配列番号3のベクターで送達された配列番号2による処置が、対象、例えばKv8.2 KO動物によって表されるようなCDSRRを有する対象における光受容体機能を回復させることを実証している。
図15は、野生型(WT)、Kv8.2 KO未処置(非注射)及び治療用生成物AAV8.RK.hKCNV2の5e9ウイルスゲノムで網膜下処置したKv8.2 KO眼からのc波の定量化を実証する。記録は、処置の4週間後又は同等の年齢の対照において得た。WT、n=12;非注射、n=9;AAV8.RK.hKCNV2、n=15。テューキーの多重比較検定による二元配置ANOVA、****p<0.0001。データは、配列番号3のベクターで送達された配列番号2による処置が、対象、例えばKv8.2 KO動物によって表されるようなCDSRRを有する対象における光受容体機能を回復させることを実証している。
視運動行動反応
図16及び図17は、処置後12週の、処置されたKv8.2 KOマウスの明所視力及び暗所視力及び暗所コントラスト感度の改善を実証する。処置動物に、3e9ウイルスゲノム用量のAAV8.RK.hKCNV2を網膜下に投与し(n=3~6)、同齢の未処置(非注射、n=3~5)及びWT(n=8)動物と比較した。二元配置ANOVA、シダックの多重比較事後検定、**p=0.0015、****p<0.0001。WT対処置AAV8.RK.hKCNV2は有意ではなかった。
図16及び図17は、処置後12週の、処置されたKv8.2 KOマウスの明所視力及び暗所視力及び暗所コントラスト感度の改善を実証する。処置動物に、3e9ウイルスゲノム用量のAAV8.RK.hKCNV2を網膜下に投与し(n=3~6)、同齢の未処置(非注射、n=3~5)及びWT(n=8)動物と比較した。二元配置ANOVA、シダックの多重比較事後検定、**p=0.0015、****p<0.0001。WT対処置AAV8.RK.hKCNV2は有意ではなかった。
遺伝子及びタンパク質発現データ
図18、図19、及び図20は、処置後12週の処置Kv8.2 KO眼におけるKv8.2タンパク質及びKCNV2遺伝子発現を示す組織学的データである。図18は、ヒトKv8.2サブユニット(緑色)の発現を示す処理領域及びKv8.2発現のない未処理領域を有する網膜下注射眼の網膜切片の概略図である。図19は、Kv8.2発現(緑色)、Kv2.1発現(赤色)及び細胞核(青色)を示す処置領域及び未処置領域の高倍率画像を提供する。スケールバー=50μm。図20は、野生型に対して正規化された処置眼におけるヒトKCNV2遺伝子の発現を示すリアルタイム定量PCRからのデータを提供する。N=3個の眼。
図18、図19、及び図20は、処置後12週の処置Kv8.2 KO眼におけるKv8.2タンパク質及びKCNV2遺伝子発現を示す組織学的データである。図18は、ヒトKv8.2サブユニット(緑色)の発現を示す処理領域及びKv8.2発現のない未処理領域を有する網膜下注射眼の網膜切片の概略図である。図19は、Kv8.2発現(緑色)、Kv2.1発現(赤色)及び細胞核(青色)を示す処置領域及び未処置領域の高倍率画像を提供する。スケールバー=50μm。図20は、野生型に対して正規化された処置眼におけるヒトKCNV2遺伝子の発現を示すリアルタイム定量PCRからのデータを提供する。N=3個の眼。
図21及び図22は、本明細書に開示されるヒトKCVN2コード領域(配列番号12)と最適化されたKCVN2(配列番号2)との比較を示す配列アラインメントを提供する。一番上の列は、ヒトKCVN2の核酸を含む(配列番号12)。一番下の列は、配列番号2の核酸を含む。配列番号2は、ヒト配列番号12と約76%の同一性を共有する。
記載された方法又は組成物の正確な詳細は、記載された実施形態の趣旨から逸脱することなく変更又は改変され得ることは明らかであろう。本発明者らは、以下の特許請求の範囲及び趣旨の範囲内に入るすべてのそのような改変及び変形例を主張する。
Claims (14)
- 配列番号2に示される改変KCVN2ヌクレオチド配列、又は配列番号2と少なくとも85%の配列同一性を有する配列、又は配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有する配列であって、配列番号11のペプチドをコードし、光受容体活性を回復することができる配列。
- 請求項1に記載の改変KCVN2ヌクレオチド配列を含むベクター。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項2に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターがAAVベクターである、請求項3に記載のベクター。
- 前記ベクターがガンマ-レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターである、請求項2に記載のベクター。
- 配列番号3のヌクレオチド配列を有する、請求項4に記載のベクター。
- 配列番号2に作動可能に連結されたRKプロモーターをさらに含む、請求項4に記載のベクター。
- KOZAKコンセンサス配列、ウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント(WPRE)及びウシ成長ホルモンポリアデニル化(BGHポリ(A))シグナルの少なくとも1つをさらに含む、請求項6に記載のベクター。
- 前記エレメントが、以下:前記RKプロモーター、引き続いて前記KOZAK配列、引き続いて配列番号2、引き続いて前記WPRE、引き続いて前記BGHポリ(A)シグナルの順序で、5’から3’に配置されている、請求項7に記載のベクター。
- ストリンジェントな条件下で配列番号2にハイブリダイズし、光受容体活性を有する配列番号11のタンパク質をコードするKCVN2ヌクレオチド配列。
- RKプロモーター、KOZAK配列、WPRE及びBGHポリ(A)シグナルに作動可能に連結された、請求項9に記載のKCVN2ヌクレオチド配列。
- 薬学的に許容され得るビヒクル中に請求項2に記載のベクターを含む医薬組成物。
- 局所(local)投与、全身投与、又は局所(topical)投与のために製剤化される、請求項11に記載の医薬組成物。
- 経口、経鼻、肺、頬側、経皮、皮下、十二指腸内、経腸、非経口、静脈内又は筋肉内投与用に製剤化される、請求項12に記載の医薬組成物。
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